JPH02273180A - ２本鎖組織型プラスミノゲンアクチベータの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ｔ−ＰＡ遺伝子含有ベクターによってトラン
スフェクトされた真核細胞の培養によって２本鎖ｔ・Ｐ
Ａを製造する方法に関する。

〔従来の技術分野〕

組織型−プラスミノゲンアクチベータ−（１−ＰＡ）は
一種の分子量６８，０００ダルトンを有するセリンプロ
テアーゼである。この機能はプラスミノゲンを、同様に
広い作用スペクトルを有するセリンプロテアーゼである
プラスミンに変換することにある。他のセリンプロテア
ーゼ類と同じ（、ｔ−ＰＡも、−本のポリペプチド鎖と
して合成され、次いで２５７／２５８番目の部位での開
裂によって２本鎖形に転換される。２本鎖型における双
方の鎖は、ジスルフィド橋によって結合される。これら
のうちの軽い方の鎖は、酵素的に活性の部分を含み、一
方重い方の鎖は、いわゆるフィンガー　ＥＧＦ−及び輪
状領域を有する。アミノ酸の２５７番目の部位のアルギ
ニンを除去する実験によって、この部位での開裂は酵素
の活性にとって不可欠であることが確認された（Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、Ｍｅｔｈ、３　（１９８６）４４９−４５
７）。従来周知の製造形おいては、１本鎖及び２本鎖ｔ
−ＰＡの混合物が製造されている。併し乍ら治療目的に
使用するためには、遊離の純粋な１本鎖又は２本鎖ｔ−
ＰＡを分解生産物から多大の出費を伴うことなく製造で
きることが有利である。

１重鎖ｔ−ＰＡの製造法は、例えば欧州特許（ＥＰ）第
１５１　９９６　　Ａ２号明細書及び旧ｏｃｈｅｍ、Ｊ
、２２６　（１９８５）　６３１−６３６に公知である
が、その際組換え１重鎖ｔ−ＰＡは真核細胞中で、アプ
ロチニンの存在のもとで製造されている。この際殆んど
完全に１本鎖のｔ−ＰＡが得られる。同様に、欧州特許
（ＥＰ）第１５１９９６　　Ａ２号明細書から、殆ど完
全に２本鎖型のｔ−ＰＡを製造することも知られている
。このために、組み換えｔ−ＰＡが産生される真核細胞
の培養上澄みを酵素処理、すなわちプラスミン、カリク
レイン、トリプシン、活性化■又は■因子により処理す
る。１重鎖ｔ−ＰＡの混入は、多くの使用法に対してそ
の純度は十分である程度に僅少である。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら治療に使用するためには、純粋な１本鎖型
又は純粋な２本鎖型でｔ−ＰＡを産生できることの可能
性が必然的に要求される。純粋な一本鎖型のｔ−ＰＡの
製造は西ドイツ特許（ＤＨ）第３８　２９　２４４号の
明細書に記載されている。本発明は２本鎖ｔ−ＰＡの純
粋な形での製法を可能とすることを課題とする。

［課題を解決するための手段］ 本発明によれば、本課題は、ｔ　−ＰＡ遺伝子を含有す
るベクターでトランスフェクトされた真核細胞の培養に
よる２本鎖ｔ−ＰＡの製造法によって解決され、この方
法は、細胞の定常増殖期到達の後に培養物又は培養上澄
みを馬、牛又は牛脂児の血清又は血漿及びフィブリノゲ
ン誘導体を含有するインキュベーション培地とともにイ
ンキュベートし、この培地からｔ−ＰＡを取得すること
よりなる。

本発明は、定常増殖期到達後の培養物に又は１本鎖及び
２本鎖ｔ−ＰＡの混合物を含有する培養上澄みに、牛、
馬又は牛脂児の血清又は血漿及びフイプリノゲン誘導体
を添加することによりインキュベーション後に、純粋な
形で２本鎖ｔ−ＰＡが製造されることの意想外な確認に
基づく。

この際本発明の範囲で、例えば西ドイツ特許（ＤＥ）第
３８　２９　２４４号明細書に従って製造された純粋な
１重鎖ｔ−ＰＡを、牛、馬、又は牛脂児の血清又は血漿
及びフイプリノゲン誘導体で処理することによって、純
粋な２本鎖型に変えることも可能である。従って、本発
明の範囲で、“培養上澄み“の概念は、純粋の１本鎖１
−ＰＡをも包含する。更に本発明の範囲においては、ｔ
−ＰＡの概念には、突然変異蛋白質（Ｍｕｔｅｉｎｓ）
もしくは蛋白質の誘導体も入る。従って本発明法では、
このような突然変異蛋白質もしくは誘導体を製造するた
めに、相応するそれをコードする遺伝子をトランスフェ
クトする。

フイブリノゲン誘導体とは、本発明の範囲ではフイプリ
ノゲンの分解産物であり、これは例えばＥｕｒ、Ｊ、Ｂ
ｉｏ−ｃｈｅｗ、　ｌ　７２　（１９８８）　、３９９
−４０４、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｏ、２６２　（１９８７
）５９４４−５９４６及びＥｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｙ
＋＋、　ｌ　６６（１９８７）３９３−３９７又はＢＢ
Ａ７４８（１９８３）８６−９２に記載されている。本
発明の特に有利な実施形においては、前記文献にＰＣＢ
２と記載されるフィブリノゲンの７ラグメントが使用さ
れる。

真核細胞の培養のための培地として、本発明の範囲では
、真核細胞の培養に好適な、全ての血清含有又は血清不
含の培地例えばＲＰＭＩＩ６４０（Ｈ，Ｊ、Ｍｏｒｔｏ
ｎ、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ６　（１９７０）　８９）、Ｄ　
Ｍ　Ｅ　Ｍ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ−改変最小必須培地、
Ｊ、１１１．Ｇｏｏｄｉｎｇ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ３９　（１９８０）２８５）又はＦ　ｌ　
２　（Ｒ，Ｇ、Ｈａｍ、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ５３　（１９６５）　２８８
）又は西ドイツ特許（ＤＥ）第３８０１２３６号明細書
（血清を含む又は含まず）記載の培地を使用することが
できる。

本発明の範囲においては、ＤＭＥＭ及びＦ１２培地の例
えばｌ：ｌの割合の混合物が特に有利に使用される。西
ドイツ特許（ＤＥ）第３８０１　２３６号明細書記載の
培地が特に有利である。

細胞のプラスミド形質転換の安定性を維持するために、
有利に、付加的に該ｔ−ＰＡ遺伝子にたいして選択可能
な遺伝子を含有するベクターを使用し、かつその培地に
このベクターに相応する選択剤を添加する。好適な選択
剤は例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ミコフ
ェノール酸、ピポキサンチン、キサンチン、アミノプテ
リンまにはメトトレキサート及びそれらの誘導体である
。アプロチニンは、技術水準の思想に反して、生成ｔ−
ＰＡの被刺戟性に不利に作用することが確認されたので
、本発明によって使用される培地には、アプロチニンを
含有しないのが有利である。培地交換及び培養条件は、
専門家に周知であり、慣用法で実施することが可能であ
る。

定常増殖期到達後、即ち、最高の細胞密度に到達した後
に、培養物又は培養上澄みを牛、馬又は牛胎児の血清又
は血漿及びフイブリノゲン誘導体を含有する後インキュ
ベージコン培地と共にインキュベートする。牛脂児血清
を使用するのが有利である。該血清又は血漿に培養物又
は培養上澄みを０゜０１〜２０％の量で添加するのが有
利である。

本発明の範囲でフイブリノゲン誘導体を５〜１００１９
１１２の量で添加する。このフイブリノゲン誘導体によ
る処理は、４〜４０℃で実施するのが有利である。この
際特に、フイブリノゲン誘導体の量が比較的大きい場合
には、低温でこれに反してフイブリノゲン誘導体の量が
少ない場合には、比較的高温で操作する。

この際このインキュベージ１２時間は、同様に温度及び
添加される血清又は血漿及びフイブリノゲン誘導体の量
に依存する。ｔ−ＰＡの２本鎖性は、公知の免疫プロッ
ト法によって容易に検査され、それにより最適インキュ
ベーション時間が決定される。

本発明による方法において、有利な実施形では、真核細
胞培養のために、後インキュベーション培地と同じ培地
を使用する。

この後インキュベーション用培地及び丁度今述べた実施
形の場合にも、培養培地は、有利に牛脂児血清を殊に０
．０１〜２０％の量、有利には０．０１−１０％の量で
含有する。

有利に使用される条件は、培養物又は培養上澄み中ノ５
〜２０　ｍｙ／　ｒａＱｆ）　ｔ−ＰＡ濃度にもあテハ
まる。前記の条件の保持下に、ｔ−ＰＡの濃度が上昇す
ると、同時に１本鎖ｔ−ＰＡの含有量も上昇する。

本発明の範囲の細胞としては、ｔ−ＰＡを産生できるす
べての培養可能な真核細胞がこれに該当する。この有利
な例は、ＣＨｏ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞
）である。

［実施例１ 次の例で本発明を更に詳述する： 例　　１ ａ）ＣＨＯ細胞内へのｔ−ＰＡ遺伝子含有ベクターのト
ランスフェクション Ｒ：Ｋａｕｆｍａｎ及びｐ、５ｈａｒｐ、Ｊ、Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、ｌ　５　（１９８２）　　６０１−６２１の
記載のように、ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞（ＥＣＡＣＣ８８
０７２１０３）に、プラスミドｐＳＶｔＰＡ−ｄｈｆｒ
（Ｇｅｎｅ６６．１９３−２０３　（１９８８））をト
ランスフェクトし、安定な形質転換体を単離する。

ｂ）細胞培養 単離されたコロニーを牛脂児血清（Ｆ　Ｋ　Ｓ。

０．０１〜５％）含有又は血清不含の慣用の培地（ＤＭ
ＥＭとＦ１２を１：ｌの割合）中でインキュベートした
。このインキュベート時間は、ｔ−ＰＡが、通例２４時
間後から理論的には無期限に培地中に定量的に検出可能
量で存在するように、選択した。ｔ−ＰＡの単離のため
に、ｔ−ＰＡ産生細胞及びｔ−ＰＡ含有培地を相互に分
けた。つづいて。ｔ−ＰＡ含有培地に牛脂児血清を加え
これを１定期間細胞不合でインキュベートした。このイ
ンキュベーションは２０時間実施し、第１表に１本鎖及
び２重鎖ｔ−ＰＡの収率を示す。このために、免疫染色
によるウェスタンプロット法を実施した。これから、２
重鎖ｔ−ＰＡを誘導するためには微量濃度の牛脂児血清
（０，０１％）ですでに十分であることが推測できる。

１本−及び２本鎖−ｔ−ＰＡの比は、これらの条件のも
とでは比較的一定に維持される。

第　　１　　表 ＦＫＳ　％　　　　　　　　ｔ　−ＰＡ１本鎖重鎖　２
本鎖 ０　　　　　　＋ ０．０１　　　　＋　　　　　　＋ ０．０５　＋　十 Ｑ、ｌ　　　　　＋　　　　　　＋ ０．５　　　　　＋　　　　　　＋ １．９　　　　　＋　　　　　　＋ ２．５　　　　　＋　　　　　　＋ ５、Ｑ　　　　　＋　　　　　　＋ 血清不合で培養したＣ　ＨＯ−ｔ−ＰＡ細胞の４８時間
培養上澄みに、引続き、５％ＦＫＳ及び上昇濃度のフイ
ビリノゲンのＢｒＣＮ−分解産物を添加し、２２℃でイ
ンキエペートした。培養上澄み中に存在するｔ−ＰＡの
２本鎖性を免疫染色によるウェスタンプロット法に従っ
て検査した。結果をインキュベーション時間と関連させ
て第２表に示す。これらのデータに基づき、血清含有培
養上澄みにフイビリノゲン誘導体を添加することによっ
て、実質的には、もっばら２本鎖１−ＰＡだけが誘導さ
れることが明白である。

第　　２　　表 時　（時間） フイビリノ ゲン誘導体　ｌ （ｍｇ／ｍｆｆ）　　１本 ０　　　＋ １０　　　　＋ ３０　　　　（＋） １本　２本　１本　２本　１本　２本 ＋＋＋（÷） 十−＋ 十−＋ ＋−＋ ＋−＋ 最後に、フィブリノゲンー及びＦＫＳ添加及びこれに続
く２２℃でのインキュベーションによって、ｔ−ＰＡの
消失が確証されるか否かを検討した。この目的のために
インキュベーション後のフイブリノゲン含有上澄みのＬ
−ＰＡ量を、ＥＬＩＳＡ法によって検査した。これらの
結果を第３表に示す。

第　　３　　表 フイブリノゲン誘導体及びＦＫＳの存在下でのｔ−ＰＡ
のインキュベーションがｔ−ＰＡ濃度に何ら重大な相異
をもならさなったことはこれらの結果から明白である。

例　　２ 例１と同様に主要の培養を実施し、定常期に到達後、細
胞上澄みを取得し、この細胞上澄みを、増加性のプラス
ミンの存在で又はフイブリノゲンのＢｒＣＮ−分解産物
１００１１９／　ｍＱ及び５容量％のＦＫＳの存在下で
３７℃でインキュベーショ 第４表は、フイブリノゲン分解物及びＦＫＳの添加によ
って、ｔ−ＰＡは分解されず、これによって消失を伴な
わない１本鎖から２重鎖Ｌ−ＰＡへの転換が可能である
ことを示している。これに反してプラスミンを転換のた
めに使用した場合には、ｔ−ＰＡは分解される。

第　　４　　表 添 加 インキュベーション時間 （ｈ）後のｔ−ＰＡの総活性（μ／ＩＩＩＱ）ブラスミ
ン１．０μ／ｍＱ プラスミン０．１μ／ｒａ（１ プラスミン０．０１μ／ｍＱ プラスミン０．００１μ／ｌｌ１１２ ５％ＦＫＳ＋フイブリノゲン 分解産物１００ｍｇ／ｒＱ　　　２８５　　２７９　　
２８１例　　３ ａ）突然変異蛋白質遺伝子含有ベクターによるＣＨＯＪ
ａｌ胞のｔ−ＰＡＩ−ランス７エクシヨンプラスミドｐ
ｅＰａｌ　４４　（欧州特許（ＥＰＡ）第０２４２８３
６号明細書記載の例２に従って製造）を、例１ａ）の記
載のようにしてＣＨＯ細胞に導入する。

この細胞の培養は、例１ｂ）の記載のように行う。同様
に、実質的にはもっばら２本鎖ｔ−ＰＡ突然変異蛋白質
のみが得られる。

例　　４ ａ）　　ｔ−ＰＡ突然変異蛋白質遺伝子含有ベクターに
よるＣＨＯｄｈｆｒｍ胞のトランスフェクションｔ−Ｐ
Ａ突然変異蛋白質として西ドイツ特許（ＤＥ）第３８　
２５　３５３ＡＩ明細書記載のΔに２及びΔ（Ｋ２＋Ｅ
ＧＦ）を使用する。

ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞（ＥＣＡＣＣ８８０７２１０３）
を、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ　、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｏｃ。

ＵＳＡ７７　（１９８０）、４２１６−４２２０による
記載に従って培養し、増殖させた。ＤＮＡのトランスフ
ェクションのために、Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ　ｄｅｒ
　Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２　（１９７３）　、４５
６−４６７の記載により、ｐＳＶ　（△に２）−ｄｈｆ
ｒ（ＤＳＭ４７２１）及びｐＳＶΔ（Ｋ　＋　Ｅ　Ｇ　
Ｆ）　−ｄｈｆｒ（ＤＳＭ４７２０）を有する燐酸カル
シウム沈澱物を４ｍＱの量で製造した。該沈澱物１＋ｎ
ｆｆを９ｃｍの培養皿中の１０ｍ１２の培地の中の３×
１０５〜１Ｘ１６６個の細胞に添加した。該細胞をこの
沈澱物と共に８〜１６時間インキユベートシ、次いで該
培地を除き、該細胞を、ＴＢＳ　（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
２５　ｍ　ｍｏｌ／　Ｑ、　ｐＨ７，４、ＮａＣ１１３
７ｍ　ｍｏｌ／Ｉ２、ＫＣＩ　５　ｒｓ　ｍｏｌ／　４
２．　Ｎａ２ＨＰＯ４０，６ｍ　ｍｏｌ／　Ｑ）１０　
ｙａＱで洗浄した。

該細胞の培養は、例１ｂ）記載の方法によって行う。同
様に、実質的にはもっばら２重鎖ｔ−ＰＡ−突然変異蛋
白質が得られる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、遺伝子含有ベクターによってトランスフェクトされ
   た真核細胞の培養により２本鎖ｔ−ＰＡを製造する場合
   に、細胞の定常増殖相到達の後にこの培養物または培養
   上澄みを馬、牛又は牛胎児の血清又は血漿及びフイブリ
   ノゲン誘導体を含有する後インキュベーション培地と共
   にインキュベートし、該培地からｔ−ＰＡを取得するこ
   と特徴とする２本鎖ｔ−ＰＡを製造する方法。