DE3926948A1 - Verfahren zur herstellung von zweikettigem t-pa - Google Patents
Verfahren zur herstellung von zweikettigem t-paInfo
- Publication number
- DE3926948A1 DE3926948A1 DE19893926948 DE3926948A DE3926948A1 DE 3926948 A1 DE3926948 A1 DE 3926948A1 DE 19893926948 DE19893926948 DE 19893926948 DE 3926948 A DE3926948 A DE 3926948A DE 3926948 A1 DE3926948 A1 DE 3926948A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- chain
- fibrinogen
- incubation
- culture
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von zweikettigem t-PA durch Kultivierung von eukaryon
tischen Zellen, die mit einem das t-PA-Gen enthaltenden
Vektor transfiziert sind.
Der Gewebetyp-Plasminogenaktivator t-PA ist eine Serin
protease mit einem Molekulargewicht von 68 000 Dalton.
Ihre Funktion liegt in der Umwandlung von Plasminogen
zu Plasmin, das ebenfalls eine Serinprotease mit einem
breiten Wirkungsspektrum ist. Wie andere Serinproteasen
auch wird t-PA als eine einzige Polypeptidkette synthe
tisiert und dann durch Spaltung an Position 257/258 in
eine zweikettige Form umgewandelt. Die beiden Ketten
der zweikettigen Form werden durch eine Disulfidbrücke
zusammengehalten. Die leichtere Kette enthält den
enzymatisch aktiven Teil, während die schwerere Kette
die sogenannten Finger-, EGF- und Kringeldomänen ent
hält. Durch Untersuchungen, bei denen das Arginin an
der Aminosäureposition 257 eliminiert wurde, wurde
festgestellt, daß die Spaltung an dieser Stelle für die
enzymatische Aktivität essentiell ist (Mol. Biol. Meth.
3 (1986) 449-457). Bei den bisher bekannten Herstel
lungsformen wird eine Mischung aus ein- und zweiketti
gem t-PA hergestellt. Für eine therapeutische Anwendung
ist es jedoch vorteilhaft, von Abbauprodukten freies
reines entweder ein- oder zweikettiges t-PA ohne großen
Aufwand herstellen zu können.
Verfahren zur Herstellung von einkettigem t-PA sind
beispielsweise aus EP 1 51 996 A2 und Biochem. J. 226
(1985) 631-636 bekannt, wobei rekombinanter einkettiger
t-PA in eukaryontischen Zellen in Gegenwart von Apro
tinin hergestellt wird. Hierbei wird nahezu vollstän
dig einkettiger t-PA erhalten. Ebenfalls aus der
EP 1 51 996 A2 ist es bekannt, t-PA in nahezu voll
ständig zweikettiger Form herzustellen. Hierzu wird der
Kulturüberstand von Eukaryontenzellen, in denen rekom
binanter t-PA hergestellt wird, einer Enzymbehandlung,
nämlich einer Behandlung mit Plasmin, Kallikrein,
Trypsin, aktiviertem Faktor XI oder XII unterworfen.
Die Beimischungen an einkettigem t-PA sind so gering,
daß die Reinheit für viele Anwendungsarten ausreicht.
Für eine therapeutische Anwendung ist jedoch unbedingt
zu fordern, daß t-PA entweder in reiner einkettiger
Form oder in reiner zweikettiger Form hergestellt
werden kann. Die Herstellung von t-PA in reiner einket
tiger Form ist in der DE 38 29 244 beschrieben. Der
vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, es zu
ermöglichen, zweikettigen t-PA in reiner Form herzu
stellen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein
Verfahren zur Herstellung von zweikettigem t-PA durch
Kultivierung von eukaryontischen Zellen, die mit einem
das t-PA-Gen enthaltenden Vektor transfiziert sind,
welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man nach Er
reichen der stationären Wachstumsphase der Zellen die
Kultur oder den Kulturüberstand mit einem Nachinku
bationsmedium, welches Serum oder Plasma von Pferd,
Rind oder foetalem Kalb und ein Fibrinogenderivat
enthält, inkubiert und den t-PA aus dem Medium gewinnt.
Die Erfindung beruht auf der überraschenden Feststel
lung, daß durch Zugabe von Serum oder Plasma von Rind,
Pferd oder foetalem Kalb und einem Fibrinogenderivat
zur Kultur, nachdem die stationäre Wachstumsphase er
reicht ist, oder zum Kulturüberstand, der eine Mischung
aus ein- und zweikettigem t-PA enthält, nach Inkubation
zweikettigen t-PA in reiner Form hergestellt werden
kann. Es ist hierbei im Rahmen der Erfindung auch
möglich, reinen einkettigen t-PA, der z.B. gemäß der
DE 38 29 244 hergestellt wurde, durch Behandlung mit
Serum oder Plasma von Rind, Pferd oder foetalem Kalb
und mit einem Fibrinogenderivat in die reine zweiket
tige Form zu überführen. Im Rahmen der Erfindung umfaßt
der Begriff "Kulturüberstand" daher auch reinen ein
kettigen t-PA. Weiter sind im Rahmen der Erfindung
unter dem Begriff t-PA auch Muteine bzw. Derivate des
Proteins zu verstehen. Zur Herstellung solcher Muteine
bzw. Derivate wird dann im erfindungsgemäßen Verfahren
ein entsprechendes, dafür kodierendes Gen transfiziert.
Unter Fibrinogenderivaten sind im Rahmen der Erfindung
Spaltprodukte des Fibrinogens zu verstehen, die bei
spielsweise in Eur. J. Biochem. 172 (1988), 399-404,
J. Biochem. 262 (1987) 5944-5946 und Eur. J. Biochem.
166 (1987) 393-397 oder BBA 748 (1983) 86-92 beschrie
ben sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungs
form der Erfindung wird ein Fibrinogenfragment verwen
det, das in den genannten Literaturstellen als FCB2
bezeichnet wird.
Als Medien zur Kultivierung der eukaryontischen Zellen
können im Rahmen der Erfindung alle serumhaltigen oder
serumfreien Medien verwendet werden, die zur Züchtung
von Eukaryonten geeignet sind, z.B. RPMI 1640 (H.J.
Morton, In Vitro 6 (1970) 89), DMEM (Dulbecco - modifi
ziertes minimal- essentielles Medium, J.W. Gooding, J.
Immunol. Methods 39 (1980) 285) oder F12 (R. G. Ham,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53 (1965), 288) oder ein
Medium nach DE 38 01 236 (mit oder ohne Serum).
Besonders bevorzugt wird im Rahmen der Erfindung eine
Mischung von DMEM- und F12-Medium etwa im Verhältnis
1:1 eingesetzt. Ganz besonders bevorzugt wird das in
der deutschen Patentanmeldung DE 38 01 236 der gleichen
Anmelderin beschriebene Medium verwendet.
Zur Aufrechterhaltung der Stabilität der Plasmidtrans
formation der Zellen wird vorzugsweise ein Vektor
verwendet, der zusätzlich zu dem t-PA-Gen ein selek
tionierbares Gen enthält, und dem Medium ein dem Vektor
entsprechendes Selektionsmittel hinzugefügt. Geeignete
Selektionsmittel sind beispielsweise Neomycin, Hygro
mecin, Macophenolsäure, Hypoxanthin, Xanthin, Aminopterin
oder aber auch Methotrexat und Derivate davon. Das
erfindungsgemäß verwendete Medium enthält vorzugsweise
kein Aprotinin, da festgestellt wurde, daß Aprotinin im
Gegensatz zu den Lehren des Standes der Technik sich
nachteilig auf die Stimulierbarkeit des gebildeten t-PA
auswirkt. Mediumwechsel und Kulturbedingungen sind dem
Fachmann bekannt und können in an sich üblicher Weise
durchgeführt werden.
Nach Erreichen der stationären Wachstumsphase, d.h.
wenn die maximale Zelldichte erreicht ist, wird die
Kultur oder der Kulturüberstand mit einem Nachinku
bationsmedium inkubiert, welches Serum oder Plasma von
Rind, Pferd oder foetalem Kalb sowie ein Fibrinogen
derivat enthält. Vorzugsweise wird foetales Kälberserum
verwendet. Das Serum oder Plasma wird vorzugsweise in
einer Menge von 0,01 bis 20% der Kultur oder dem
Kulturüberstand zugesetzt.
Im Rahmen der Erfindung wird das Fibrinogenderivat in
einer Menge von 5 bis 100 mg/l zugesetzt. Die Behand
lung mit dem Fibrinogenderivat wird vorzugsweise bei 4
bis 40°C durchgeführt. Dabei wird vorzugsweise bei
größeren Fibrinogenderivat-Mengen bei niedriger Tempe
ratur, bei kleinen Fibrinogenderivatmengen dagegen bei
höherer Temperatur gearbeitet.
Die Inkubationsdauer ist dabei ebenfalls von Temperatur
und Menge an zugesetztem Serum oder Plasma und Fibrino
genderivat abhängig. Die Zweikettigkeit von t-PA kann
leicht durch an sich bekannte Immunoblotting-Techniken
überprüft werden und danach die optimale Inkubationsdauer
bestimmt werden.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird in einer bevorzugten
Ausführungsform ein mit dem Nachinkubationsmedium
identisches Medium zur Kultivierung der eukaryontischen
Zellen verwendet.
Das Nachinkubationsmedium, und im Falle der gerade eben
genannten Ausführungsform auch das Kulturmedium, enthält
vorzugsweise foetales Kälberserum, insbesondere in
einer Menge von 0,01 bis 20%, vorzugsweise in einer
Menge von 0,01 bis 10%.
Die vorzugsweise verwendeten Bedingungen gelten für
t-PA-Konzentrationen in der Kultur oder im Kulturüber
stand von 5 bis 20 mg/l. Steigt die t-PA-Konzentration
bei Beibehaltung der genannten Bedingungen, so steigt
gleichzeitig auch der Gehalt an einkettigem t-PA an.
Als Zellen kommen im Rahmen der Erfindung alle in Kul
tur züchtbaren eukaryontischen Zellen in Betracht,
welche t-PA produzieren können. Bevorzugte Beispiele
hierfür sind CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary Zellen).
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:
- a) Transfektion eines das t-PA-Gen enthaltenden Vek
tors in CHO-Zellen
CHO dhfr-Zellen (ECACC 8 80 72 103) werden, wie von R. Kaufmann und P. Sharp, J.Mol.Biol. 15 (1982) 601-621, mit dem Plasmid pBT 95 (DSM 3611P, DE-A 35 45 126) transfektiert und stabile Transformanten isoliert. - b) Zellkultur
Die isolierten Kolonien wurden in herkömmlichem Medium (DMEM/F12 im Verhältnis 1 : 1) mit foetalem Kälberserum (FKS, 0,01 bis 5%) oder auch serumfrei inkubiert. Die Zeitspanne der Inkubation wurde dabei so gewählt, daß t-PA in quantitativ nachweisbaren Mengen im Medium vorlag, in der Regel erstmals nach 24 Stunden bis theoretisch unbegrenzt. Zur Isolierung von t-PA wurden die t-PA produzierenden Zellen und das t-PA enthalten de Medium voneinander getrennt. Anschließend wurde das t-PA enthaltende Medium mit foetalem Kälberse rum (FKS) versetzt und für eine bestimmte Zeitspan ne zellfrei inkubiert. Die Inkubation wurde für 20 Stunden durchgeführt, in Tabelle 1 sind die Ausbeu ten an ein- und zweikettigem t-PA dargestellt. Hierzu wurde ein Westernblot mit Immunfärbung durchgeführt. Es kann hieraus entnommen werden, daß bereits eine geringe Konzentration an foetalem Kälberserum (0,01%) ausreicht, um zweikettiges t-PA zu induzieren. Das Verhältnis von ein- und zweikettigem t-PA bleibt unter diesen Bedingungen relativ konstant.
Zu einem 48 Stunden Kulturüberstand von CHO-t-PA-Zellen,
die serumfrei kultiviert waren, wurden anschließend 5%
FKS und steigende Konzentrationen von BrCN-Spaltproduk
ten von Fibrinogen zugegeben und bei 22°C inkubiert.
Das im Kulturüberstand vorhandene t-PA wurde nach
Westernblot durch Immunfärbung auf Zweikettigkeit
überprüft. Die Resultate sind in Tabelle 2 in Abhängig
keit von der Inkubationszeit dargestellt. Aufgrund
dieser Daten ist es ersichtlich, daß durch Fibrinogen
derivatzugabe zu serumhaltigen Kulturüberständen die
Bildung von praktisch ausschließlich zweikettigem t-PA
induziert wird.
Schließlich wurde untersucht, ob durch Fibrinogen- und
FKS-Zugabe und anschließende Inkubation bei 22°C ein
Verlust an t-PA nachweisbar ist. Zu diesem Zweck wurden
fibrinogenhaltige Überstände nach Inkubation auf ihre
t-PA-Menge durch ELISA untersucht. Die Resultate sind
in Tabelle 3 dargestellt.
Aus diesen Ergebnissen wird deutlich, daß die Inkubation
von t-PA in Gegenwart von Fibrinogenderivaten und FKS
zu keinen gravierenden Unterschieden in der t-PA-Konzen
tration führte.
Es wurde analog Beispiel 1 die Hauptkultur durchgeführt,
Zellüberstand nach Erreichen der stationären Phase
gewonnen und dieser Zellüberstand bei 37°C in Gegenwart
von steigenden Mengen Plasmin oder in Gegenwart von
100 mg/l BrCN-Spaltprodukten von Fibrinogen und 5 Vol-%
FKS inkubiert.
Tabelle 4 zeigt, daß durch Zusatz von Fibrinogenspalt
produkten und FKS t-PA nicht abgebaut wird und
damit eine verlustfreie Umwandlung von einkettigem
in zweikettigen t-PA möglich ist. Bei Verwendung
von Plasmin zur Umwandlung wird dagegen t-PA
abgebaut.
- a) Transfektion von CHO-Zellen mit einem Vektor, der
ein t-PA-Muteingen enthält.
Plasmid pePa144 (hergestellt nach Beispiel 2 von EP A 02 42 836) wird, wie in Beispiel 1a) beschrie ben, in CHO-Zellen eingeführt.
Die Kultur der Zellen erfolgt wie in Beispiel 1b) beschrieben. Es wird ebenfalls praktisch ausschließ lich zweikettiges t-PA-Mutein erhalten.
- a) Transfektion von CHO dhfr--Zellen mit einem Vektor,
der ein t-PA-Muteingen enthält.
Als t-PA-Muteine werden verwendet ΔK2 und Δ(K2+EGF), beschrieben in DE 38 25 253 A1.
CHO dhfr⁻-Zellen, ECACC 8 80 72 103, wurden wie von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Soc. USA 77 (1980), 4216-4220 beschrieben, gezüchtet und vermehrt. Zur DNA-Transfektion wurden Calciumphos phat-Präzipitate mit 20 µg pSV (ΔK2)-dhfr (DSM 4721) und pSVΔ (K2+EGF)-dhfr (DSM 4720), wie von Graham and Van der Eb, Virology 52 (1973), 456-467 beschrieben, in einem Volumen von 4 ml hergestellt. 1 ml des Präzipitats wurde zu 3×105 bis 1×106 Zellen in 10 ml Medium in 9 cm Kulturschalen zugegeben. Die Zellen wurden 8 bis 16 Stunden mit dem Präzipitat inkubiert, dann das Medium entfernt und die Zellen mit 10 ml TBS (25 mmol Tris-HCl, pH 7,4, 137 mmol NaCl, 5 mmol KCl, 0,6 mmol Na2HPO4) gewaschen.
Die Kultivierung der Zellen erfolgt wie in Beispiel 1b) beschrieben. Es werden ebenfalls praktisch ausschließlich zweikettige t-PA-Muteine erhalten.
pBT95 wird, wie in Beispiel 1a) beschrieben, in CHO-Zel
len (ATCC CCL 61, CHO K1) eingebracht und, wie in
Beispiel 1b) beschrieben, kultiviert. Auch in diesen
Zellinien wird praktisch ausschließlich zweikettiges
t-PA erhalten.
Claims (8)
1. Verfahren zur Herstellung von zweikettigem t-PA
durch Kultivierung von eukaryontischen Zellen, die
mit einem das t-PA-Gen enthaltenden Vektor trans
fiziert sind, dadurch
gekennzeichnet, daß man nach
Erreichen der stationären Wachstumsphase der
Zellen die Kultur oder den Kulturüberstand mit
einem Nachinkubationsmedium, welches Serum oder
Plasma von Pferd, Rind oder foetalem Kalb und ein
Fibrinogenderivat enthält, inkubiert und den t-PA
aus dem Medium gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß bei der
Nachinkubation das Serum oder Plasma in einer
Menge von 0,01 bis 20% vorhanden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als Fibrinogen-Derivat Spaltprodukte von
Fibrinogen verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, daß man das
Spaltprodukt FCB2 verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß man das Fibrinogenderivat in einer Menge von 5
bis 100 mg/l einsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Inkubation mit dem Fibrinogenderivat
bei 4 bis 40°C vornimmt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß zur Kultivierung der Zellen und als Nachinku
bation das gleiche Medium verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Nachinkubationsmedium und gegebenenfalls
auch das Kulturmedium 0,01 bis 10% foetales
Kälberserum enthält.
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19893926948 DE3926948A1 (de) | 1989-03-07 | 1989-08-14 | Verfahren zur herstellung von zweikettigem t-pa |
CA002011548A CA2011548A1 (en) | 1989-03-07 | 1990-03-06 | Process for the production of two-chain t-pa |
EP19900104291 EP0391080A3 (de) | 1989-03-07 | 1990-03-06 | Verfahren zur Herstellung von zweikettigem t-PA |
JP5390190A JPH02273180A (ja) | 1989-03-07 | 1990-03-07 | 2本鎖組織型プラスミノゲンアクチベータの製造法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3907304 | 1989-03-07 | ||
DE19893926948 DE3926948A1 (de) | 1989-03-07 | 1989-08-14 | Verfahren zur herstellung von zweikettigem t-pa |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3926948A1 true DE3926948A1 (de) | 1990-09-13 |
Family
ID=25878530
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19893926948 Withdrawn DE3926948A1 (de) | 1989-03-07 | 1989-08-14 | Verfahren zur herstellung von zweikettigem t-pa |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3926948A1 (de) |
-
1989
- 1989-08-14 DE DE19893926948 patent/DE3926948A1/de not_active Withdrawn
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69032600T3 (de) | Rekombinanter abkömmling des menschlichen faktors iii | |
DE3789664T3 (de) | Neue thrombolytische proteine. | |
DE69434332T2 (de) | Thrombin mutanten | |
DE3752372T2 (de) | Verfahren zur regulierung der metabolischen stabilität von proteinen | |
DE69333727T2 (de) | Protein-C-Derivat | |
EP0986644B1 (de) | Herstellung von erythropoietin durch endogene genaktivierung mit viralen promotoren | |
DE69634819T2 (de) | Reguliertes autokrines wachstum von säugerzellen | |
DE3730599A1 (de) | Verfahren zur kontinuierlichen herstellung von heterologen proteinen in eukaryontischen wirtszellen | |
EP0966536A1 (de) | Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle | |
EP0325190A2 (de) | Pentosansulfat-Medium | |
EP0242836A1 (de) | Gewebs-Plasminogen-Aktivator (tPA) - Derivat und seine Herstellung | |
EP1012303A1 (de) | Faktor x-deletionsmutanten und analoge davon | |
DE60127561T2 (de) | Phagen-abhängige superproduktion biologisch aktiver proteine und peptide | |
DE60038312T2 (de) | Faktor x-analog mit einer verbesserten fähigkeit, aktiviert zu werden | |
EP0513738A2 (de) | Serumfreies Medium zur Kultivierung von Säugerzellen | |
EP0287075B1 (de) | Verfahren zur Konstruktion einer animalen Zellinie für die Herstellung von humanem Interferon-beta | |
EP0315782B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Proteinen | |
DE3926948A1 (de) | Verfahren zur herstellung von zweikettigem t-pa | |
EP1169461B1 (de) | Verwendung von pankreatischer Procarboxypeptidase B zur Herstellung von Insulin | |
EP0391080A2 (de) | Verfahren zur Herstellung von zweikettigem t-PA | |
EP0544293B1 (de) | Verfahren zur gentechnologischen Herstellung von biologisch aktivem beta-NGF | |
EP0356965A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von einkettigem t-PA | |
DE3723992A1 (de) | Verfahren zur herstellung von proteinen in loeslicher form | |
DE3636287A1 (de) | Verfahren zur gentechnologischen herstellung von stoffwechselprodukten in eukaryontenzellen | |
EP0256302B1 (de) | Verfahren zur Herstellung von humanem Antithrombin-III (ATIII) und dafür geeignete Vektoren |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |