JPH01256384A - 組織型プラスミノーゲン活性化因子及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な組織型プラスミノーゲン活性化因子及び
その製造法に関する。

〔従来の技術〕

現在、血栓症の治療薬としては、人尿から精製したウロ
キナーゼ、ヒト腎臓細胞の培養液から精製した組織培養
ウロキナーゼ、及び微生物の培養液から精製したストレ
プトキナーゼが用いられている。

しかし、これらの線維製溶解酵素を血栓を完全に溶かす
ため多量投与すると出血傾向の副作用がみられる。また
、ストレプトキナーゼはヒトにとっては異種たん白であ
るため抗原性があり、再度投与するとショックを起こす
など好ましからぬ性質がある。

そこでヒトに投与しても出血傾向の副作用がなく、かつ
抗原性の心配のない有効な血栓溶解剤が強く望まれてい
た。このような状況のなかで、ヒト黒色腫（メラノーマ
）細胞の培養液からウロキナーゼとは物理化学的にも免
疫化学的にも異なる組織型プラスミノーゲン活性化因子
が単離・精製され、この組織型プラスミノーゲン活性化
因子がウロキナーゼやストレプトキナーゼに代わる血栓
溶解剤の可能性を示唆されたので一躍注目されることと
なった［ジャーナル　オブ　バイオロジカルケミストリ
ー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２５６巻、７０３５
〜７０４１頁（１９８１年）］。しかしながらメラノー
マは腫瘍細胞の一種であるため、培養液あるいは、最終
精製物に未知の危険因子が混入する恐れがある。したが
って、メラノーマ由来の組織型プラスミノーゲン活性化
因子は医療用としては、決して適当なものであるとは言
えない。

このような理由で、腫瘍細胞ではなく安全性の高い正常
細胞を培養し、その培養液から組織型プラスミノーゲン
活性化因子を採取する試みがいくつかなされている。例
えば、ヒト胎児正常肺細胞由来の線維非細胞の１種ＩＭ
Ｒ−９０が抗ウロキナーゼ抗体により活性を阻害されな
い分子量７３．０００　のプラスミノーゲン活性化因子
と抗ウロキナーゼ抗体により活性を阻害される分子量５
０、ＯＯＯ〜６ｏ、ＯｏＯのウロキナーゼ型プラスミノ
ーゲン活性化因子を産生ずることが見出されている［ジ
ャーナル　オブ　バイオロジカルケミストリー（Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２５４巻、５７５〜５７８頁１
９７９年及び同誌、２５５巻。

３６６５〜３６７２頁（１９８０年）］。また、８週令
のヒト胎児正常肺線維芽細胞が抗ウロキナーゼ抗体によ
って活性を阻害されない分子量約７０．０００　のプラ
スミノーゲン活性化因子と抗ウロキナーゼ抗体によって
活性を阻害される分子量約６０，０００　　のウロキナ
ーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を産生ずることが報
告されている。

［キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　
４０巻。

９３３〜９３８頁（１９８０年）］。しかし、これらの
抗ウつキナーゼ抗体によって活性を阻止されないプラス
ミノーゲン活性化因子は単離・精製がなされておらず、
その物性が明らかにされていないため、メラノーマ細胞
由来の組織型プラスミノーゲン活性化因子と同一物質で
あるか不明であった。

さらに、ヒト胎児正常肺あるいは正常腎臓由来の線維非
細胞の組織培養液から、たん白質化学において通常使用
される方法、すなわち亜鉛キレートセファロースカラム
、コンカナバリンＡセファロースカラム、アルギニンセ
ファロースカラム。

抗ウロキナーゼポリクローナル抗体カラム等の方法の組
合せによって抗ウロキナーゼ抗体によって活性を阻害さ
れない組織型プラスミノーゲン活性化因子が得られるこ
とが知られている（特開昭５９−５１２２０号公報、特
開昭６０−１５８１１６号公報、特開昭６０−１．５８
１１７号公報）。

正常線維芽細胞の培養液から組織型プラスミノーゲン活
性化因子を精製・分離する方法としては、該培養液をイ
オン交換クロマトグラフィーで処理し、次いでＰ−アミ
ノベンツアミジンまたはε−アミノカプロイルベンツア
ミジンをリガンドしたアフィニティークロマトグラフィ
ーで精製する方法（特開昭６１−２４６１３１号公報）
などが知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

ヒト胎児正常肺細胞が産生する組織型プラスミノーゲン
活性化因子の製造上の問題点は細胞培養液には組織型プ
ラスミノーゲンのほかに、ウロキナーゼ型プラスミノー
ゲン活性化因子や細胞の分泌する種々のたく白質、血清
由来のたん白質などが含まれているため、従来の技術で
は、これらの細胞培養液の中から組織型プラスミノーゲ
ンだけを純粋にとり出す簡単な精製法がないことである
。

本発明者らは、これらの上記問題を解決するため鋭意努
力した結果メラノーマ細胞由来の組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子に対するモノクローナル抗体を一般的な方
法で多種創製し、その中から該組織型プラスミノーゲン
活性化因子の分離・精製に好適な抗体をスクリーニング
した結果、ある種のものが該組織型プラスミノーゲンを
純粋な形で収率良く回収するため非常に好適であること
、また、かくして得られた組織型プラスミノーゲン活性
化因子は物性的にメラノーマ由来の組織型プラスミノー
ゲン活性化因子と明瞭に異なること、及び特開昭５９−
５１２２０号公報、特開昭６０−１５８１１６号公報及
び特開昭６０−１５８１１７号公報に記載されたいずれ
の組織型プラスミノーゲン活性化因子とも異なる新規な
ものであることを見出し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明はヒト正常肺細胞由来の線維非細胞
を利用して、血栓症の治療に有効な新規の組織型プラス
ミノーゲン活性化因子及びその経済的な製造方法を提供
するものである。

〔課題を解決するための手段〕

第１の発明は、ヒト正常肺組織由来の線維非細胞の培養
液から得られ、下記の性質を有する組織型プラスミノー
ゲン活性化因子に関する。

ａ）分子量：６７，０００±１０，０００ｂ）等電点：
主に６．８〜８．０の範囲内に分布する。

Ｃ）抗ウロキナーゼポリクローナル抗体による活性の阻
害：阻害されない。

ｄ）還元処理に対する挙動：分解 ｅ）合成基質 に対する解難定数：約４Ｘ１０−’モル／Ｑｆ）熱安定
性：６０’Ｃで１０時間の加熱により約６０％が失活す
る。

上記ヒト正常肺組織由来の線維非細胞としては、正常２
倍体細胞であって、Ｉ　ＭＲ−９０（ＡＴＣＣ。

ＣＣＬ　１８６）、ＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ１
３７）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ７５）ことがで
き、常法に従ってヒト胎児節から分離されたものであれ
ば使用できる。

上記細胞の培養は、適当な培地（生産培地）中で培養さ
れる（以下、生産培養という）。

生産培地としては、イーグルの最小培地、ダルベツコの
最小培地、１９９培地、ハムＦ１２培地。

ＲＰＭ１１６４０培地などを用いることができる。

上記生産培地には牛乳カゼイン、動物肉、ダイズタンパ
ク質等のタンパク質をペプシン、トリプシン、パパイン
等のタンパク質分解酵素で部分的に加水分解して得られ
るペプトン類、該タンパク質を酸で部分的に加水分解し
て得られるペプトン類等を含んでいてもよい。ペプトン
類は組織型プラスミノーゲン活性化因子の収量を向上さ
せる誘導物質の役目を果たし、生産培地中に０．２〜５
％（ｗ／ｖ）含まれるのが好ましい。ペプトン類の量は
少なすぎても多すぎても組織型プラスミノーゲンの収量
は少なくなる。

また、上記生産培地は血清を含んでいてもよい。

血清としては牛胎児血清、子牛血清、成牛血清。

馬血清、鶏血清等があり、生産培地に０．５〜２％（ｖ
／ｖ）含まれるのが好ましい。

生産培地中に血清が存在すると細胞の寿命の向上及び組
織型プラスミノーゲン活性化因子の収量の向上に効果が
ある。血清は２％（ｖ／ｖ）までで充分であるが、２％
（ｖ／ｖ）を超えて使用してもよい、この場合には、高
価な血清を多量使用することになる。

生産培養は１〜３日間行なうのが好ましく、この後、培
養液（培地）は回収され、細胞の培養は新しい生産培地
で継続される。以上の生産培養及び培養液回収のサイク
ルを、細胞がもはや組織型プラスミノーゲン活性化因子
を分泌できなくなるまで繰返す。通常、生産培養−培養
液回収のサイクルは３０〜１００日間継続することがで
きる。

好ましい培養温度は３５〜３８℃、雰囲気は４〜８％の
炭酸ガスを含む空気で満たすのが好ましい。培養器は一
般的に用いられているプラスチック製、ガラス製等の培
養フラスコ、ローラボトル。

ビーズ懸濁培養器などが使用できる。

この生産培養によって、多くの場合、組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子と共にウロキナーゼ型のプラスミノー
ゲン活性化因子が細胞から分泌される。

細胞は、上記の生産培養に先立って、増殖させるのが好
ましい。増殖させるための培地（以下、増殖培地という
）は、血清を２〜２０％（ｖ／ｖ）含むのが好ましい。

血清が少なすぎると細胞の増殖がみられないか、あるい
は少ない。血清は２０％（ｖ／ｖ）までで充分であるが
、これを超えて使用してもよい。この場合には高価な血
清を多量に使用することとなる。

細胞の増殖に使用される血清、基礎となる培地。

温度、雰囲気、培養器等は前記培養の場合と同様である
が、ペプトン等の誘導物質は使用されない。

細胞の増殖は、培養器の細胞接着面にいっばいになるま
で４〜１０日間培養し、細胞の増殖が旺盛で栄養源が不
足気味な場合は、途中で培地を新鮮なものと交換するの
が好ましい。細胞の増殖がピークに達したときに細胞培
養液を全量取り除き、前記した生産培養を行なうのが好
ましい。

培養液から組織型プラスミノーゲン活性化因子を分離精
製するためには、コンカナバリンＡを固定化したアガロ
ースゲル、リジンを固定化したアガロースゲル等を用い
るアフイニテイクロマトグラフイー、特に組織型プラス
ミノーゲン活性化因子に対するモノクローナル抗体を固
定した担体を用いるアフイニテイクロマトグラフイーを
用いることができる。該モノクローナル抗体としては、
正常細胞から得られる組織型プラスミノーゲン活性化因
子に対するモノクローナル抗体だけでなく、メラノーマ
から得られる組織型プラスミノーゲン活性化因子に対す
るモノクローナル抗体を用いることができる。モノクロ
ーナル抗体の製造及び担体への固定化は常法により行な
うことができる。

また、上記分離精製は、アフイニテイクロマトグラフイ
ー以外に、カルボキシメチル基結合担体等を用いるイオ
ン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム等を用い
る分別沈殿法、ゲルろ適法等を利用して行なうことがで
きる。以上の分離精製の手段は、適宜組み合わせて利用
することができる。上記したモノクローナル抗体を固定
した担体を用いるアフイニテイクロマトグラフイーを利
用するのが、分離精製が簡単で効率がよいので好ましい
。

本発明によって得られる組織型プラスミノーゲン活性化
因子は、前記した性質によって特徴づけられるが、この
物質を確実に精製分離するためには、第２の発明によっ
て行なわれるのが好ましい。

すなわち、前記した培養液から組織型プラスミノーゲン
活性化因子に対するモノクローナル抗体を固定した担体
を用いるアフイニティクロマトグラフイーを利用して組
織型プラスミノーゲン活性化因子を分離する。

上記モノクローナル抗体を作製するには、常法に従って
行なえばよいが、例えば次の方法により行なうことがで
きる。

（ｉ）　　モノクローナル抗体を産生ずる融合細胞株の
育種 ケーラー、ミルシュタインの方法［ネイチャー（ｎａｔ
ｕｒｅ）　、　２５６巻、４９５頁（１９７５年）コを
基礎として、その接種々の改良が加えられた方法（岩崎
辰夫はか３名：単りローン抗体、講談社。

１９８３年）で行うことができる。

すなわちメラノーマ由来の組織型プラスミノーゲン活性
化因子をマウスに免疫し、マウスの牌細胞とミエローマ
細胞をポリエチレングリコールで細胞融合する。次いで
ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン含有培地（
以下ＨＡＴ培地という）で牌細胞とミエローマの融合細
胞だけを選択的に生育させる。更に融合細胞が組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子に対する抗体を生産している
ことを酵素抗体法で確認したのち、クローン化を繰返し
、均一な融合細胞を取得する。

（ｉｌ）組織型プラスミノーゲン活性化因子に対するモ
ノクローナル抗体の分離・精製 ４〜６週令のＢ　ａ　１　ｂ　／　ｃマウスの腹腔内に
抗体産生性の融合細胞株の生着率を高めるためにあらか
じめブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン）を注射し、１〜３週間後に３Ｘ１０Ｂ〜５
Ｘ１０’個の融合細胞をリン酸緩衝化食塩液に懸濁して
マウス腹腔内に接種する。

１〜２週間後に腹腔内に腹水が貯まるので１〜２日ごと
に腹水を採取する。腹水からモノクローナル抗体を精製
するには、硫安沈殿、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ
）−セルロースクロマトグラフィー、プロティンＡクロ
マトグラフィーなどの通常の方法を単独または組合わせ
て行えばよい。

このようにして得られる組織型プラスミノーゲン活性化
因子に対するモノクローナル抗体はＣＮＢｒ活性化アガ
ロースゲル、トレシル活性化アガロースゲル等［例えば
、ＣＮＢ　ｒ活性化セファロース４Ｂ、　トレシル活性
化セファロース４Ｂ（いずれも、ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ社−ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ−製）等］と反応させて固定化し
。

カラムに充填して用いることができる。例えば、トレシ
ル活性化セファロースの乾燥ゲルを１ｍＭ塩酸に懸濁し
て膨潤させ、次いでゲルを０．５Ｍ塩化ナトリウムを含
む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）で
緩衝化する。次いで膨潤ゲル１ｍＱに対し抗体２〜８ｍ
ｇを加え、室温で数時間反応させると抗体はアガロース
ゲルに固定化される。余分の活性基を不活化するためト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣ１２緩衝
液（０，１Ｍ、ｐＨ８，０）を過剰量加え、抗体を固定
化したアガロースゲルをカラムに充てんし、アフイニテ
イクロマトグラフイーに供する。

一方、細胞培養液は先ず遠心分離またはろ過により細胞
破片などの不溶物を取り除く。得られた清澄液を上で述
べた抗体カラムに通す。抗体カラムには組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子及びその関連物質だけが特異的に吸
着され、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子や
種々雑多なたん白質や他の有機物は吸着されず素通りす
る。ついで、ｐＨ６〜９の緩衝液からなる洗浄液で抗体
カラムを洗浄する。洗浄液は、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンアルキルフ
ェノールエーテル等のノニオン系界面活性剤及び塩化ナ
トリウム、塩化カリウム等の塩類を適当量含有する酢酸
緩衝液、リン酸緩衝液等を使用することができる。次に
、ｐＨ２〜３．５の緩衝液からなる溶出液で抗体カラム
に吸着した組織型プラスミノーゲン活性化因子を溶出す
る。

溶出液としては、洗浄液と同様の成分を含む緩衝液を使
用することができる。溶出液は直ちにアルカリ溶液、例
えばトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン溶液で
ＰＨを約７に中和する。この液の中にはウロキナーゼ型
プラスミノーゲン活性化因子や不純たん白質は含まれな
い。

このようにして得られる第１の発明に係る組織型プラス
ミノーゲン活性化因子は、その関連たん白質を含み１分
子量が均一ではない。そこで、次に、上記溶出液を限外
濃縮器などで濃縮したのち、分子篩にかけるのが好まし
い。分子篩は、デキストラン、アガロース、ポリアクリ
ルアミド等の多孔性ゲル粒子［例えば、セファクリルＳ
−２００、セファデックスＧ１５０　（いずれも、ファ
ルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）等コをカラム材
とし、ｐＨ６〜９の緩衝液からなる展開液を用いて行な
われる。展開液は、ポリオキシエチレンソルビタンモノ
オレエート、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエ
ーテル等のノニオン系界面活性剤及び塩化ナトリウム、
チオシアン酸カリウム等の塩類を適当量含有するトリス
緩衝液、リン酸緩衝液等を使用することができる。

２８０ｎｍの吸光度（Ａ２＋１０）及びフィブリン平板
法による組織型プラスミノーゲン活性化因子の量を測定
し、組織型プラスミノーゲン活性化因子の濃度が高く、
かつ比活性［組織型プラスミノーゲンの濃度（ＩＵ／ｍ
Ｑ）／Ａ２８０Ｘ０．７３８（■／ｍｕ）］の高い分画
を集める。かくして、極めて純度の高い新規な組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子が得られる。

前記したａ）乃至ｆ）の性質は、次の方法により、測定
したものである。

ａ）分子量 セファデックスＧ−１５０を用いるゲルろ適法でカラム
は内径３．２ｃｍ、長さ９０印のものを用いた。本発明
物質４０，０ＯＯＩＵ（たん白質として約０．０８■）
を分子量標準物質である牛血清アルブミン（分子量６７
．０００）５■、卵白アルブミン（分子量４５，０００
）５■及びブルーデキストラン２０００（平均分子量２
，０００，０００）とともに展開溶媒（０，１Ｍ　ＥＤ
ＴＡ　・２Ｎａ、０．１Ｍアルギニン及び０．１％ポリ
オキシエチレンソルビタンモノオレエートを含む０．Ｏ
ＩＭ　　リン酸緩衝液）１０ｍＱに溶かし、この全量を
カラムに負荷して、上記の展開溶媒を用いてゲルろ過し
た。

ｂ）等電点 本発明物質をｐＨ３，５〜１０　のアンホライン（ファ
ルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）を用いポリアク
リルアミドゲル等電点分離法でディスクゲル中に分難し
た。分離後、ゲルを３ｎｗｎ等間隔にスライスし、直ち
にそのスライス片のｐＨを微小ｐＨ電極［（株）富士化
学計測製コで測定したのち、スライス片をフィブリン平
板上に置き。

３７℃で１６時間保温して溶解窓の大きさを測定する。

Ｃ）抗ウロキナーゼポリクローナル抗体による活性の阻
害 ウサギをウロキナーゼで感作し、その抗血清から硫安分
画及びＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーを組合
わせる常法で抗ウロキナーゼポリクローナル抗体を調製
する。生理食塩液に溶かした本発明物質（１００ＯＩＵ
／ｍ＋２）と抗ウロキナーゼポリクローナル抗体（０，
１■／　ｍ　Ｑ　）を等量混合し、３７°Ｃで３０分保
温したのち、世界保健機構（ＷＨＯ）の組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子標準品を比較物質としてフィブリン
平板法で溶解窓を測定する。なお、生理食塩液に溶かし
たウロキナーゼ（１００工Ｕ／ｍ１２）と抗ウロキナー
ゼポリクローナル抗体（０，１■／　ｍ　Ｑ　）を等量
混合し、３７℃で３０分保温したのち、世界保健機構（
ＷＨＯ）のウロキナーゼ標準品を比較物質としてフィブ
リン平板法で測定したところウロキナーゼの活性は完全
に阻害された。

ｄ）還元処理に対する挙動 本発明物質（約０．５■／ｍＱ）１容に対し、β−メル
カプトエタノ−・ル０．２５　容を加え、１００℃で５
〜１０分還元処理したものと、還元処理しないものにつ
いて、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ク
ーマシーブリリアントブルーでたん白質を染色する。本
発明物質は、還元処理しないときは分子量約６７，００
０　付近に単一のたん白質が観察されたが、還元処理し
たときは約６７．０００　付近にたん白質がほとんどみ
られず、分子量３０，０００　付近に二つのたん白質を
認めた。

ｅ）合成基質 （Ｓ−２２８８）に対するに、値 本発明物質の濃度を２００　Ｉ　Ｕ　／　ｍ　Ｑとし１
合成基質Ｓ−２２８８［カビ・ビトラム社（ＫａｂｉＶ
ｊ、ｔｒｕｍ　ＡＢ）製コの濃度をＯ−１、２５ｍ　Ｍ
の範囲で変動させ、３７℃におけるＳ−２２８８の分解
速度（４０５ｎｍにおける吸光度変化）を測定した。Ｌ
ｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋの逆数プロットにより、
Ｓ−２２８８に対する本発明物質のＫｍを求める。

なお上記反応で用いた緩衝液はＯ，ｉＭＮａＣＱ及び０
．０１％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート
を含む０．１Ｍ　トリス−塩酸緩衝液を用いる。

ｆ）熱安定性 生理食塩液に溶解した試料（２００ＯＩＵ／ｍＱ）にヒ
ト血清アルブミンを１　ｆｆＦｇ／　ｍ　Ｑとなるよう
に加え、６０℃で１０時間加熱処理し、残存活性（ＩＵ
／ｍＱ）を調べ、活性の低下率（％）を表示する。

なお、本明細書において、組織型プラスミノーゲン活性
化因子の活性（ＩＵ／ｍＱ）は、世界保健機構（ＷＨＯ
）の組織型プラスミノーゲン活性化因子標準品を比較物
質としてフィブリン平板法で測定したものである。

本発明に係る組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰ
Ａ）の合成基質に対する加水分解活性を表１に示す。測
定は次のｇ）の方法によって行なった。

ｇ）各種合成基質に対する加水分解活性０．１ｍＭ各種
合成基質［（株）ペプチド研究所要］及び０．１ｍＭ塩
化ナトリウムを含む０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）４５０μＱに上記ＴＰＡ　（２００ＯＩＵ／
ｍｕ）５０μｆｆを加え、３７℃で１５分間反応させる
。反応後、２０％酢酸０　、５　ｍ　Ｑ　　を加えて反
応を停止させ、生じたアミノメチルクマリンを励起波長
３７０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで測定し、加水分解活
性を求めた。その結果を第１表に示した。

表１　合成基質に対する氷解活性 本　１μＭのアミノメチルクマリンの蛍光強度を１００
とする。

参考例１ 組織型プラスミノーゲン活性化因子に対するモノクロー
ナル抗体の作製 （１）　Ｂ　ａ　ｌ　ｂ／ｃマウスの免疫雌のＢ　ａ　
ｌ　ｂ　／　ｃマウス（５週令）を完全なフロイントの
アジュバントとともにメラノーマ由来の組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子［−本鎖：アメリカン・ダイアグノ
スティック社（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ
　Ｉｎｃ、）製］　５０μｇで背中の皮下に注射した。

更に７口重に同様に組織型プラスミノーゲン活性化因子
５０μｇを皮下に追加投与し、２６日目に組織型プラス
ミノーゲン活性化因子２５μｇを腹腔内に注射した。

（２）ミエローマの培養 ミエローマはＰ３−ＮＳ　１／１−Ａｇ４−１（ＡＴＣ
ＣＴｌＢ１８）を使用した。通常の培養は８−アザグア
ニン２μｇ　／　ｍ　Ｑ及び牛脂児血清１０％を含むＲ
ＰＭ１１６４０培地１０＋ｎＱの入った２５ｄの培養フ
ラスコで行った。継代は３〜４日ごとに行い、０．５〜
１ｍＱ　の細胞浮遊液を新しい培地の入った２５ａｌ培
養フラスコへ接種した。融合に用いる１週間前から８−
アザグアニンを含まない培地で培養した。

（３）細胞融合 免疫したマウスの肺臓を摘出し、ステンレスメツシュ上
でつぶして細胞浮遊液とし、牛脂児血清を含まないＲＰ
Ｍ１１６４０培地に懸濁した。−方、ミエローマも牛脂
児血清を含まない培地に懸濁した。

肺細胞５×１０７個とミエローマ５×１０６個を１５ｍ
Ｑの遠沈管にとって混合し、１１０００ｒｐで５分間遠
心分離したのち、上清を捨てた。

遠沈管の中の沈殿した細胞をほぐし、ポリエチレングリ
コール４０００を含む融合剤（ＲＰＭ１１６４０で４０
％ｗ／ｗに希釈した）１ｍＱを１分間かけて加えた。更
に血清を含まないＲＰＭＩ培地２培地２攪Ｑしながら２
分間かけて加え、更に同培地１０ｍＱを３分間かけて加
えた。その後、１１０００ｒｐで５分間遠心分離して上
清を捨て、１０％牛脂児血清を含むＲＰＭ１１６４０培
地１０ｍＤに培地１勇 プレート１枚に０．１ｍＱ／ウェルずつ接種した。

（４）融合細胞の選択及び培養 肺細胞とミエローマの融合細胞だけが増殖できるＨＡＴ
培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン。

チミジンを含む培地）で融合細胞を選択した。すなわち
、上述の９６ウエル細胞培養プレートに接種した細胞を
そのまま５％ＣＯ２雰囲下、３７℃で培養を続け、１日
後にＨＡＴ培地に置換し、更に数週間（ＨＡＴ培地は３
〜４日ごとに変換）、時々倒立型顕微鏡で細胞の状態を
観察しながら培養を継続した。

融合細胞のコロニーが直径１〜２ｍに成長したところで
、培養上清中の抗組織型プラスミノーゲン活性化因子抗
体を酵素抗体法で検出した。酵素抗体法で陽性のウェル
中の融合細胞を次に２４ウエル細胞培養プレートに移し
、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培
地）で同様に培養した。融合細胞が培養容器の器壁いっ
ばいに増殖したところで，再び培養上滑中に抗組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子抗体が産生されていることを
チエツクし、次に限界希釈法で融合細胞をクローン化し
た。すなわち、あらかじめフィーダー細胞としてマウス
の胸腺細胞を増殖させた９６ウエル細胞培養プレートに
、ウェル当り０．５〜１個の細胞が含まれるように融合
細胞を接種し、ＨＴ培地で培養した６ウエル当り、コロ
ニーが１つしかないことを確認し、そのウェルから融合
細胞を２４ウエル細胞培養プレートに移し、細胞を増や
した。上記のクローニング操作を繰返し、細胞を純化し
、細胞を液体窒素中に保存した。

かくして組織型プラスミノーゲン活性化因子に対する抗
体を産生ずる融合細胞株　５ＥＯ１−Ｇ０５−ＢＯ６（
微工研菌寄第９９７７号）を得た。

（５）抗体の作製 抗体を多量得るためマウスの腹水に融合細胞株５ＥＯ１
−ＧＯ５−ＢＯ６を接種し、接種後１〜２週間後にマウ
ス腹腔から腹水を採取した。腹水を遠心分離して細胞や
にごりを取除き、抗体に富んだ上清液を得た。次いで上
清液に４０％飽和となるように硫安を加え、冷蔵庫内で
一晩放置したのち遠心分離して沈殿（抗体）を得た。本
モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１に分類され、ウロキナ
ーゼと交差反応しないものであった。

参考例２ モノクローナル抗体カラムの作製 参考例１で得た抗体をトレシル活性化セファロース４Ｂ
に固定化した。

すなわちトレシル活性化セファロース４Ｂ２０ｇを１ｍ
ＭＨＣＱ、に懸濁して膨潤させ、次いで、０．５ＭＮａ
ＣＱを０　、１　Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣ０３（ｌ衝液（ｐＨ
８，０）で平衡化したのち、上記抗体約１１００■を加
え、室温でゆっくりかき混ぜながら４時間反応させた。

反応後抗体を固定化したゲルをカラムにつめ、ｏ、１Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）をカラム容量の２０倍
量流し、ゲル中の活性基を不活化した。

実施例１ ４９０ｃｏｆロ一ラボトル１０本にそれぞれ５％つ（微
工研菌寄第９９７８号）をローラボトル１本当り６　Ｘ
　１０’個植付けたのち、ローラボトル培養装置上、３
７℃で、毎分０．５　回転の速さでローラボトルを回転
しながら培養した。培養開始後４日目には培養液を同量
の新鮮なものと交換し。

更に培養を続けた。培養開始後７日目には細胞はローラ
ボトルの器壁にほぼいっばいの状態で増殖していた。培
養液を取除き、次に、それぞれのローラボトルに１％ト
リプトン及び子牛血清１％を含むダルベツコ最少培地（
生産誘導培地）各１００ｍＱを加え、更に２日間培養し
た。該培養液を回収し、再び同量の上記の生産誘導培地
を加え、更に２日間同様に培養した。このようにして、
培養液の回収・生産誘導のサイクルを合計２０回（４０
日間の誘導生産）繰返した。回収した培養液をプールす
るとその液量は２０Ｑで、その培養液中の組織型プラス
ミノーゲン活性化因子の活性は９００ＩＵ／ｍＱであっ
た。この活性の測定は次のようにして行なった。

先ず、ウサギにウロキナーゼを免疫して得た抗ウロキナ
ーゼポリクローナル抗体で検体（細胞培養液）を前処理
（３７℃、１時間）し、検体中のウロキナーゼ型プラス
ミノーゲン活性化因子の活性を完全に阻害した。次いで
、プラスミノーゲンに富んだウシフィブリノーゲン（９
０％凝固性。

マイルス・ラボラトリーズ社（ＭｉｌｅｓＬａｂｏｒａ
ｆｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、）製］０．１％、アガロースＧ
Ｐ−３６（牛丼化学薬品（株）製）０．３％、及びトロ
ンビン（持出製薬（株）製）２単位／ｍＱで作製したフ
ィブリン平板にＷＨＯから入手したヒト組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子標準品（Ｌｏｔ８３１５１７）を希
釈した調製した標準溶液２５０，５００及び１００ＯＩ
Ｕ／ｍＱと先に前処理した検体液をそれぞれ１０μＱを
のせ、３７℃で１６時間保温したのち、生じるフィブリ
ン溶解窓の大きさを測定し、標準溶液の溶解窓の大きさ
と比較することによって検体液中の組織型プラスミノー
ゲン活性化因子の量を測定した。なお、検体または標準
品の希釈液としては、ＰＨ７，５のＯ，１Ｍ　リン酸緩
衝液にゼラチンを０．１％加温溶解したものを用いた。

このようにして得られた培養液２０Ｑを、参考例２で得
たモノクローナル抗体カラムに通塔した。

カラムを０．１％ポリオキシエチレンソルビタンモノオ
レエート及び０．５ＭＮａＣＱを含む０．２Ｍ酢酸ナト
リウム溶液で十分洗浄し、次いでカラムに０．１％ポリ
オキシエチレンソルビタンモノオレート及びＱ、５ＭＮ
ａＣＱを含む０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，０）を流し
、吸着たん白質を溶出した。

溶出液をトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタンで
ｐＨを約７に中和したのち、限外濃縮器で濃縮し、次い
であらかじめｐＨ７，５のバッファで平衡化したセファ
クリル５２００に負荷し、ゲルろ過した。展開液は０．
１％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、１
．６Ｍ　ＫＳＣＮを含む０．ＯＩＭ　　リン酸緩衝液（
ｐＨ７，５）である。ゲルろ過液は約３ｍＱずつ分取し
、分取液の２８０ｎｍの吸光度とフィブリン平板法によ
る組織型プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）の活性
値を求め、活性の高い両分をプールした。活性の高い両
分の液量は５０ｍＱ、たん白質の濃度は０．４０ｍｇ／
ｍＱ　、ＴＰＡの濃度は２０８，０００　ＩＵ／　ｍ　
Ｑ　、比活性は５２０，０ＯＯＩＵ／ｍｇであった。

得られたＴＰＡは前記したａ）乃至ｆ）及びｇ）の性質
を満足するものであった。特に、分子量については、上
記ゲルろ過の結果を第１図に示す。

第１図中、ピーク１はブルーデキストラン２０００のピ
ーク、ピーク２は牛血清アルブミンのピーク、ピーク３
は卵白アルブミンのピーク及びピーク４は本発明物質の
ピークである。等電点測定の結果を第２図に示す。還元
処理に対する挙動において還元処理しないものは分子量
約６７，０００　に単一のたん白質がｍ察されたが、還
元処理したものは約６７，０００　　にたん白質はほと
んどみとめられず、分子量３０，０００　付近に二つの
たん白質を認めた。

上記組織型プラスミノーゲン活性化因子について、各種
合成基質に対する比活性及び血栓溶解能を次のとおり測
定した。

（ｉ）　　比活性 上記ＴＰＡのたん白質（２８０ｎｍの吸光度に係数０．
７３８　　を乗じてたん白質の濃度とした）と組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子の活性（ＩＵ）を測定し１両
者の比から比活性を求めると、４００，０００　Ｉ　Ｕ
／ｍｇ　テｔｏツｔ＝。

（ｉｉ）　　血栓溶解能 血栓溶解能をチャンドラ−・ループ法 ［Ｃｈｏｎｄｌｅｒ、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ、　７巻、
１１０〜１１４頁（１９８５年）参照］により測定した
。血液はヒト新鮮血を用い、血栓形成時間は３０分、血
栓溶解時間は４時間で行ったところ、血栓を５０％溶解
する上記ＴＰＡの濃度は０　、１５　μｇ　／　ｍ　１
２　であるのに対し、ウロキナーゼでは、ｏ、８５μｇ
／　ｍ　Ｑで１本発明物質の血栓溶解能はウロキナーゼ
に比べ約５倍強力であることがわかった。

〔発明の効果〕

本発明に係る組織型プラスミノーゲン活性化因子は新規
であり、精製が容易であって、血栓溶解能に優れる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明物質の分子量をゲルろ適法で測定した
結果を示し、第２図は本発明物質の等電点を測定した結
果を示す。 １・・・ブルーデキストラン２０００．２・・・牛血清
ア第　１　口 ワーフフシ３ンＤｉ−（＋フクノノヨンニ、：Ｉｖ＋ｉ
）乎　２　図 Ｈ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト正常肺組織由来の線維芽細胞の培養液から得ら
   れ、下記の性質を有する組織型プラスミノーゲン活性化
   因子。 ａ）分子量：６７，０００±１０，０００ ｂ）等電点：主に６．８〜８．０の範囲内に分布するｃ
   ）抗ウロキナーゼポリクローナル抗体による活性の阻害
   ：阻害されない ｄ）還元処理に対する挙動：分解 ｅ）合成基質 ▲数式、化学式、表等があります▼ に対する解離定数：約４×１０＾−＾４モル／ｌｆ）熱
   安定性：６０℃で１０時間の加熱により約６０％が失活
   する。 ２、ヒト正常肺組織由来の線維芽細胞の培養液から、メ
   ラノーマ由来組織型プラスミノーゲン活性化因子に対す
   るモノクローナル抗体を固定した担体を用いるアフイニ
   テイクロマトグラフイーにより、請求項１記載の組織型
   プラスミノーゲン活性化因子を分離することを特徴とす
   る組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造法。