JP2534020B2

JP2534020B2 - 血清不含培地による組織プラスミノ―ゲン活性化物質の製造方法

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Publication number: JP2534020B2
Application number: JP5191357A
Authority: JP
Inventors: リネットウィルソンエライン
Original assignee: Bio Response Inc
Current assignee: Bio Response Inc
Priority date: 1982-12-30
Filing date: 1993-08-02
Publication date: 1996-09-11
Anticipated expiration: 2011-09-11
Also published as: AU2296383A; KR900008740B1; ES8606396A1; PH26514A; US5147790A; CA1267620A; ES528570A0; AU579812B2; FI834830A0; JPH0632607B2; FI81377B; HU197766B; ES543559A0; NO834866L; NZ206699A; EP0113319A3; EP0113319B1; DE3382390D1; DK607083D0; GR78779B

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、血清（ｓｅｒｕｍ）
又は外来性巨大分子増殖因子（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｍ
ａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｒｏｕｔｈｆａｃｔ
ｏｒ）の非存在下で増殖し得るヒトセルラインを用いて
組織プラスミノーゲン活性化物質（ｔｉｓｓｕｅｐｌ
ａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖｅｔｏｒ；ＴＰＡ）
又はプロ組織プラスミノーゲン活性化物質（プロＴＰ
Ａ）を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】最近における組換ＤＮＡ技法及び細胞培
養技法の出現に伴って、有用で薬理学的に興味ある化合
物、特に蛋白質、例えばインターフェロン、インスリン
及び抗原の制御された生物学的製造が可能となった。生
物学的に、特に薬理学的に興味ある種々の蛋白質の大規
模製造を確実にする生物学的方式を開発する必要性が増
加している。

【０００３】この明細書において使用する「蛋白質」な
る語は高分子量、例えば約３４，０００より大きな分子
量のポリペプチド、及び低分子量、例えば約３４，００
０より小さい分子量のポリペプチド、並びにこれらの誘
導体、グリコシル化、燐酸化及び硫酸化された誘導体を
含める意味に用いる。組換ＤＮＡ技法における利点は、
目的蛋白質をコードする遺伝子を微生物に導入し、そし
て次にこの微生物による蛋白質の合成を誘導することが
可能となることである。しかしながら、多くの生物学的
に重要な分子はこの技法によって合成することができな
い。構造がまだ知られていない分子の場合、特にそうで
ある。ほとんどの場合、遺伝的に変性された微生物によ
り分泌される蛋白質は真正な分子の正確な複製ではな
く、アミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端に関し真正な分子
と異る。

【０００４】この事実は、組換ＤＮＡ技法における実験
的過程に由来する。さらに、グリコシル化蛋白質を微生
物、例えば細菌によって製造することはできず、酵母に
ついてもある程度そうである。これらは必要な細胞機構
を有しないからである。多くの場合、細胞培養技法及び
組織培養技法が有利に使用される。細胞培養物は手を加
えてない生物（ｉｎｔａｃｔｏｒｇａｎｉｓｍ）に由
来するから、この細胞培養物により生産される蛋白質は
すべての点において天然の蛋白質に相当する。

【０００５】しかしながら、高等生物の細胞、例えば哺
乳動物細胞の培養には困難な問題が存在する。これらの
細胞の栄養要求は、人工培地中で増殖するほとんどの微
生物のそれに比べて厳格である。今まで記載されている
ほとんどの哺乳動物細胞の増殖培地は、非常に高価な血
清を含有しなければならない。血清の価格が細胞培養技
法の経済的実施可能性を大きく左右し、そして細胞培養
以外の方法によっては製造し得ない蛋白質の製造へのこ
の方法の適用を大きく限定するであろう。若干の細胞
は、ホルモン又は増殖因子、例えばトランスフェリン、
インスリン、表皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子又は神
経生長因子を補給した血清不含培地中で培養することが
できる。しかしながら、ほとんどの場合、細胞はこれら
の血清不含培地において無限に増殖することはないであ
ろう。

【０００６】血清不含培地において増殖するセルライン
は、血清又は外から添加された増殖因子による分解又は
汚染に敏感な蛋白質の製造のために特に重要である。こ
のような蛋白質は、例えばプロ−組織プラスミノーゲン
活性化物質（プロ−ＴＰＡ）である。いわゆるプラスミ
ノーゲン活性化物質は科学的研究の対象となり、この研
究により血液凝塊（凝血）の溶解においてこの物質が臨
床的に適用可能であることが明らかに示された。血液凝
塊はフィブリンから成り、このフィブリンは酵素スロビ
ンの作用のもとでその可溶性前駆体であるフィブリノー
ゲンから形成される。これらは、ヒトの疾病及び死亡の
主要な原因の１つであり、そして副作用を伴わないでこ
れを溶解することは困難である。

【０００７】哺乳動物の血漿は、血液凝塊中のフィブリ
ンを溶解することができる酵素系を含む。フィブリン分
解系の１つの成分は酵素、プラスミノーゲン活性化物質
からなり、この物質はプラスミノーゲン（プラスミンの
不活性なプロ酵素形）を蛋白質分解性酵素プラスミンに
転換する。次に、プラスミンが凝塊中のフィブリンネッ
トワームを破壊して可溶性産物を生成する。体の血栓溶
解能が、形成される血管内血栓を除去するのに不十分な
場合、例えば血栓塞栓症又は手術後合併症の患者におい
て、血栓溶解剤を外部的に投与して使用することが絶対
に必要である。

【０００８】血栓溶解治療のために商業的に入手し得る
ヒトプラスミノーゲン活性化物質が２種類存在する。ヒ
トの尿又は培養腎細胞から分離されるセリンプロテアー
ゼであるウロキナーゼ、及びストレプトコッカスから得
られる細菌蛋白質であるストレプトキナーゼである。い
ずれの酵素もフィブリンに対して特異的に親和性ではな
いから、これらの物質による血栓溶解にはプラスミノー
ゲンの全身的活性化が伴い、この活性化により凝固蛋白
質の無差別的消化が生ずる可能性があり、そして治療中
における内出血（ヘモラージ）の危険性が有意に上昇す
る。

【０００９】ウロキナーゼのそのほかの欠点はヒトに注
射した後の有効半減期が非常に短いことである。このた
め、効果的なフィブリン分解を達成するためには多量の
ウロキナーゼを投与する必要があり、このためにその作
用を遮断する中和抗体の生産が起こり、そして有害で死
亡の可能性を伴うアレルギー反応が生ずる。組織プラス
ミノーゲン活性化物質（以後、「ＴＰＡ」と称する）と
呼ばれるその他の種類のプラスミノーゲン活性化物質が
ヒトのほとんどの組織に存在することが知られている。
おそらく、異る組織に由来するＴＰＡは、その分子的性
質においては相互に異るが免疫的には類似しているであ
ろう。

【００１０】これらは、その化学的及び免疫的性質の観
点から、フィブリンの存在下でフィブリン分解作用が非
常に強化される点において、そしてスロンビンに対する
親和性が非常に高い〔Ｓ．Ｔｈｏｒｓｅｎ等、Ｔｈｒｏ
ｍｂ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａｅｍｏｒｒｈ．２８，６５〜７
４（１９７２）；Ｄ．Ｃ．Ｒｉｊｋｅｎ及びＤ．Ｃｏｌ
ｌｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，７０３５〜
７０４１（１９８１）〕。これらの物質はフィブリンに
対する親和性が高いためにＴＰＡの作用が凝血の存在場
所に限定され、このために制御されない出血の危険が有
意に低下する。

【００１１】次の系統はプラスミノーゲン、プラスミ
ン、フィブリン及び種々のプラスミノーゲン活性化物質
の関係を示す。

【００１２】

【表１】

【００１３】最近、凝固異常に罹患した２人の患者が、
ヒト黒色腫セルラインの培養液から分離したＴＰＡによ
り成功裏に治療された〔Ｗ．Ｗｅｉｍａｒ等、Ｔｈｅ
Ｌｏｎｃｅｔ（１９８１），１０１８〜１０２０〕。Ｔ
ＰＡには２種類の分子形、すなわち活性２−鎖形及び不
活性１−鎖形がある〔前駆体ＴＰＡ又はプロ−ＴＰＡ；
Ｄ．Ｃ．Ｒｉｊｋｅｎ及びＤ．Ｃｏｌｌｅｎ、前記引用
文；Ｄ．Ｃ．Ｒｉｊｋｅｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５７，２９２０〜２９２５（１９８２）；及び
Ｐ．Ｗａｌｌｅｎ等、Ｐｒｏｇｒ．Ｆｉｂｒｉｎ，５，
１６〜２３（１９８２）〕。プロ−ＴＰＡは、フィブリ
ンとのインキュベーションにより、又はプラスミンの影
響で活性ＴＰＡに転換される。このプラスミンはこのカ
スケード状反応により自らの合成を触発する。

【００１４】ヒト−ＴＰＡの分離源には、種々のヒト組
織（これらは商業的利用のために入手することはできな
い）、及び種々の程度でＴＰＡを遊離することが知られ
ている種々のヒト腫瘍細胞が含まれる〔Ｅ．Ｌ．Ｗｉｌ
ｓｏｎ等、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ４０，９
３３〜９３８（１９８０）；Ｅ．Ｌ．Ｗｉｌｓｏｎ等、
Ｂｌｏｏｄ６１，５６８〜５７４（１９８３）〕。

【００１５】最近出願された特許出願（ＥＰ４１７６
６、発明者Ｄ．Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．Ｒｉｊｋｅｎ及
びＯ．Ｍａｔｓｕｏ）において、分子量７２，０００の
ＴＰＡが開示されており、このＴＰＡはヒト黒色腫セル
ライン〔ボウエス（Ｂｏｗｅｓ）〕から分離され、おそ
らくＥ．Ｌ．Ｗｉｌｓｏｎ等〔ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅ
ａｒｃｈ４０，９３３〜９３８（１９８０）〕により
すでに記載されているＴＰＡと同一であろう。

【００１６】今までに記載されている他のセルラインと
同様に、このヒト黒色腫セルライン、ボウエスは、増殖
のために血清、例えばウシ胎児血清の存在を必要とす
る。しかしながら、血清は非常に高価であり、そして生
産されたＴＰＡを汚染しそしてプロ−ＴＰＡの分離を妨
げる多量の蛋白性成分を含有している。このためＴＰＡ
又はプロ−ＴＰＡを得るために退屈で面倒な精製工程を
必要とする。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】この発明は従来から知
られているセルラインの欠点を克服し、そして血清又は
外来性巨大分子増殖因子の非存在下で増殖する新規なヒ
トセルラインの製造を可能にする。このような血清非依
存性セルラインにより分泌される新規な薬理学的に活性
な蛋白質、例えばヒト組織プラスミノーゲン活性化物質
及び特にプロ−活性化物質を提供することも又この発明
の目的である。

【００１８】

【課題を解決するための手段】血清非依存性ヒトセルラインの製造この発明は、血清、又は外来性巨大分子増殖因子、例え
ばインスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子等の非
存在下で増殖する新規なヒトセルラインを用いる。この
発明の細胞は、血清又はフィブロネクチンの非存在下に
おいても培養容器に付着することができる。

【００１９】この新規なセルラインの大きな利点は、血
清、例えばウシ胎児血清は非常に高価であるが故にこれ
を使用しないことによりコストが大幅に低下すること；
培地に血清の汚染がなくそして生成物が血清不含培地か
ら容易に精製され得るのでこの新規なセルラインにより
生産される生成物の精製が非常に安価で且つ簡単である
こと；及び血清中にプロテアーゼが存在するために血清
依存性セルラインによっては得られない（又は低い収量
でしか得られない）蛋白質を製造することが可能である
こと；である。

【００２０】この新規な血清非依存性ヒトセルラインの
製造方法は、次の段階すなわち、（ａ）血清依存性ヒト
セルラインの培養物から血清含有培地を除去し、そして
これを血清不含培地で置換し、（ｂ）付着細胞又は非付
着細胞に血清不含培地を供給し、そして（ｃ）血清非依
存性セルラインが確立されるまで細胞を増殖せしめる、
段階を含んで成る。

【００２１】この明細書において「血清不含培地」なる
語は血清のみならずいかなる巨大分子増殖因子も含有し
ない培地を示称する。従って、血清及び外来性巨大分子
増殖因子の両者非存在下で増殖するセルラインを「血清
非依存性セルライン」と称する。前記の方法において
「出発材料」として使用する血清依存性ヒトセルライン
は特に連続セルラインであり、そしてヒト新生物、例え
ば黒色腫、悪性奇形腫、肉腫、膠芽、髄膜腫、神経芽細
胞腫、脂肪腫、腺腫、乳癌又は膀胱癌に由来するもので
ある。好ましいセルラインはＴＰＡ及び／又はプロ−Ｔ
ＰＡを生産するものである。

【００２２】この発明の好ましい態様においては、ヒト
黒色腫セルライン、特にボウエス黒色腫セルライン（以
後、「ボウエスＩ」セルラインと称する）が使用され
る。ヒトの正常組織から誘導されたセルラインを「出発
材料」として使用することもできるが、これらは試験管
内で限られた寿命を有し（例えば、約５０回細胞分裂を
行った後増殖を停止する）、この発明の観点からは重要
ではない。

【００２３】血清不含栄養培地は、例えば、商業的に入
手し得る培地、例えば最少イーグル培地（ＭＥＭ）、Ｍ
ＥＭ−スピンナー培地、ドゥルベコ変形イーグル培地
（ＤＭＥＭ）、又はロスウェル・パーク・メモリアルイ
ンスティテュート（ＲｏｓｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍ
ｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地（ＲＰＭＩ）−
１６４０である。他の同等の培地を使用することもでき
る。

【００２４】血清不含培地は安定pHを維持するために十
分量の緩衝剤、例えば炭酸水素ナトリウムを含有するこ
とができる。培養中の細胞は、手を加えてない生物の一
体部分である精巧な免疫防御系を有しないので、抗生物
質、例えばペニシリン、ストレプトマイシン、タイロシ
ン等を加えて培養物の汚染を防止するのが好ましい。ヒ
ト正常細胞は通常表面に付着した場合のみ増殖するが、
腫瘍細胞は、懸濁状態でもしばしば容易に増殖する。固
体依存細胞用の実験室容器は当業界においてよく知られ
ている。これらには、「ミクロウェル」プレート、平底
ペトリ皿、種々の大きさのフラスコ、又はローラーボル
トと称され連続回転する円筒ビンがある。非依存性細胞
は、機械的に攪拌される、又は均一懸濁液が気体流によ
る混合によって維持される培養容器中に増殖せしめるこ
とができる。

【００２５】例えば、この発明の方法は、コンフルエン
トの又はコンフルエント近い単層のヒトセルライン、例
えばヒト黒色腫セルライン、特に血清含有培地中で増殖
する黒色腫ボウエスＩを含有する組織培養フラスコ中で
実施することができる。その後の工程は、二酸化炭素を
含有する湿潤雰囲気中、例えば約９５％の空気と約５％
のＣＯ₂から成る湿潤雰囲気中で、約３５℃〜約４０
℃、特に約３７℃において行う。

【００２６】血清含有培地を除去し、そして血清不含培
地、例えばＲＰＭＩ−１６４０又はＤＭＥＭにより置換
する。数日後、細胞がフラスコの表面から離脱し始め、
そして培地中に自由浮遊する。数週間後、細胞の大多数
が血清又はいかなる増殖因子も含有しない培地中で死滅
しているであろう。細胞の生存を維持するために、血清
不含培地への適応期間中、条件調節された培地を培養物
に加える。条件調節された培地は、例えば２４時間血清
不含培地に保持された仲間細胞の培養物（ｃｏｍｐａｎ
ｉｏｎｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ）から収集すること
ができる。

【００２７】条件調節された培地を含有する血清不含培
地は、例えば３〜７日間隔で、細胞数が十分に増加する
まで、例えば容器表面の約３分の１が覆われるまで取り
替えなければならない。この段階において条件調節され
た培地はもはや必要ではなく、細胞に血清不含培地のみ
を供給する。コンフルエント単層が形成されたとき、容
器を激しくたたくことにより、又はエチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）を用いてほとんどの細胞を表面から離
脱させ、そして生存を保証するのに十分に高い細胞濃度
において新たな培養フラスコに再接種するように留意し
ながらパッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）を行う。

【００２８】細胞の増殖、及びコンフルエンスにおける
細胞のパッセージを、細胞が安定な付着性単層として増
殖するようになるまで継続する。このようにして、例え
ば１〜６箇月、特に１〜３箇月かかって血清非依存性セ
ルラインが確立される。前記の方法に代えて、細胞密度
が十分に高い場合には、仲間の血清依存性細胞培養物か
ら収集した条件調節された培地を加えることなく血清非
依存性セルラインを確立することができる。この場合に
は、細胞が自らの培地を条件調節する。非付着細胞を除
去しないことにより細胞密度を高く維持することができ
る。

【００２９】例えば前記のごとく、数日後、血清不含培
地中で大多数の細胞が組織培養容器から離脱し、そして
培地中に自由浮遊する。離脱した細胞は、それらが十分
に高い密度に維持される限り生存し続ける。付着はして
いないが生存している細胞を含有する血清不含培地を遠
心分離し、そして細胞ペレットを新鮮な血清不含培地に
入れ、そしてまばらな付着細胞を含有するフラスコに返
却すれば付着細胞が増殖を開始するであろう。この場
合、懸濁細胞は付着細胞と一緒になってそれ自体の培地
を条件調節する。

【００３０】２〜３週間後、すでに懸濁状態にある細胞
は培養容器表面への付着を開始し、やがてこれらの細胞
は付着状態となり、そして一旦コンフルエント状態にな
った後、前記のごとく激しくたたくか又はＥＤＴＡを用
いてパッセージすることができるであろう。付着細胞の
存在下で「条件調節された培地」を調製する他の方法
は、血清不含培地の一部分、その約半分を新鮮な血清不
含培地により置換し、そしてこの操作を２４〜７２時間
毎に、十分に高い細胞密度が得られる（約３週間後）ま
で反復することから成る。次にこの細胞を、例えばＥＤ
ＴＡを用いて、パッセージする。

【００３１】第１パッセージにおいて、新鮮な血清不含
培地に、ＥＤＴＡ処理に先立って培養物から取り出した
約４０％の条件調節された培地を補給する。この後、細
胞は条件調節された培地の非存在下で分裂を続けるであ
ろう。細胞密度は十分に高く、約３０％、好ましくは約
６０〜７０％のコンフルエンシーであるべきである。細
胞密度が低い場合、例えば約２０％のコンフルエンシー
の場合、又は懸濁培養の場合には約１×１０⁵細胞／ml
の場合、細胞は増殖のために条件調節された培地を必要
とする。細胞密度が高い場合、例えば約６０〜約７０％
のコンフルエンシーの場合、又は懸濁培養の場合には約
２×１０⁵〜５×１０⁵細胞／ml又はこれ以上の場合、
条件調節された培地を添加しないで血清不含培地中で成
育しそして増殖するであろう。

【００３２】血清非依存性セルラインは、例えば実験室
容器の内壁において付着培養物として、又は懸濁培養物
として増殖することができる。この発明はさらに、血清
不含培地において、特にこの発明の方法によって調製さ
れた場合に、増殖が可能である新規なヒトセルライン、
特にヒト黒色腫セルラインに関する。

【００３３】この発明はさらに、この発明のセルライン
から得られ、そして血清不含培地において増殖すること
が可能な変異セルラインに関する。変異体は自然に形成
され、又はそれ自体公知の方法によって製造することが
できる。例えば、変異体は化学的な手段、例えば変異
剤、例えばＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジンもしくはマスタード油により、又は照射、例え
ば紫外線もしくはＸ線の照射により得られる。

【００３４】この発明の好ましい血清非依存性セルライ
ン及び変異セルラインは、ＴＰＡ及び／又はプロ−ＴＰ
Ａを生産するセルラインである。この発明の新規なヒト
セルライン及び該セルラインから得られる変異セルライ
ンは、無限の寿命を有し、そしてもとの血清依存性セル
ラインと同様にして、例えば、生物学的に活性な化合
物、例えば蛋白質、例えばインターフェロン、抗原、脈
管形成因子（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｆａｃｔｏｒ）そ
して特にプラスミノーゲン活性化物質の商業的製造のた
めに、血清不含条件下で、あるいはハイブリドーマセル
ラインの製造のために使用することができる。

【００３５】すでに述べたように、組織プラスミノーゲ
ン活性化物質を高レベルで分泌することが知られている
黒色腫セルライン・ボウエスＩ（ＥＰ４１７６６参照）
を、この発明の方法の「出発材料」として使用するのが
好ましい。得られる血清非依存性の新規なセルライン
（以後、「ボウエスII」と称する）、特にその実質的に
純粋な培養物、及びこれらの製造方法も又この発明の対
象である。

【００３６】この発明はさらに、ボウエスIIセルライン
から得られそして組織プラスミノーゲン活性化物質を分
泌することができる血清非依存性変異セルライン、及び
その製造方法にも関する。この新規な血清非依存性セル
ラインは、血清に依存性である対応する親セルラインと
多くの点で異る。例えば、ボウエスII細胞は、親細胞で
あるボウエスＩ黒色腫細胞とその形態学的外観において
異る。異相差顕微鏡で観察した場合、ボウエスII細胞に
おいては血清を奪われたボウエスＩ細胞における場合に
比べて有糸分裂が顕著に頻繁である。ボウエスII細胞に
血清を加えることにより顕著な形態学的変化が生ずる。

【００３７】この発明の好ましい血清非依存性セルライ
ン、特にボウエスIIセルラインは、組織プラスミノーゲ
ン活性化物質を高レベルで分泌し、この物質は、親であ
る血清依存性セルライン、例えばボウエスＩセルライン
に比べてプロ−活性化物質として多く存在する。ＴＰＡ
及びプロ−ＴＰＡのほかに、この新規なセルラインは他
の薬理学的に価値ある物質を生産する。

【００３８】例えばボウエスIIセルラインはそれ自体の
増殖因子及び腫瘍壊死因子を生産する。これらの蛋白質
及びその製造、並びに新規な血清非依存性セルライン、
特にボウエスIIセルラインから得られる収得液も又この
発明の対象である。血清非依存性ヒト細胞の培養及び培養液の収得血清非依存性ヒト細胞は本質上上記のようにして増殖せ
しめることができる。例えば、ボウエスII細胞を、生存
を保証するのに十分な細胞密度において組織培養フラス
コに接種し、そして抗生物質を補給した血清不含培地、
例えばＲＰＭＩ−１６４０中で、約３５℃〜約４０℃、
特に約３７℃の温度において、約５％のＣＯ₂を含有す
る空気の湿潤雰囲気下で増殖せしめる。収得液の回収
を、細胞が付着するとすぐに開始し、そして例えば２４
時間の間隔で反復する。毎日の収得液の回収を、単層が
コンフルエンスとなり新鮮な培養容器へのパッセージが
必要となるまで継続することができる。

【００３９】血清不含培地に培養されたボウエスII細胞
の増殖速度が非常に低く（親細胞であるボウエスＩ黒色
腫細胞の倍化時間が約１日であるのに対してボウエスII
細胞の倍化時間は６日である）、そして１本のフラスコ
から収得液を約３〜６箇月間にわたって収集することが
でき、このため相当な時間と努力が節約でき、そして液
の収集作業が容易になる。場合によっては、増殖因子、
例えばインスリンを培地に加えることによりボウエスII
細胞の増殖速度を上昇せしめることもできる。

【００４０】ペトリ皿、組織培養フラスコ及び実験室的
研究に有用な他の容器は、表面に付着した血清非依存性
細胞の実際的な大規模培養のために十分大きな表面積対
容積の比率をもたらさない。大規模製造のために、当業
界において知られている種々の手段により面積対容積の
比率を増加せしめることができる。例えば、細胞をスポ
ンジ状ポリマー、薄層重層体、小粒ビーズ等の上で増殖
せしめることができる。

【００４１】上記の方法に代えて、新規な血清非依存性
セルライン、例えばボウエスIIは懸濁して増殖せしめる
こともできる。懸濁培養に適する大型発酵槽は当業界に
おいてよく知られており、そして単細胞微生物用の発酵
槽に変更を加えることによって開発された。細胞を培地
中に均一に懸濁保持し、そして溶存ガス（例えば酸素）
を均等に分布せしめるために攪拌が必要である。この攪
拌は、常用のタービン攪拌機、海中プロペラ型攪拌機、
垂直に移動する振動ミキサー等を用いて行うことができ
る。細胞が損傷を受けるのを防止するために低速で攪拌
するのが好ましい。気体流を培養液に通すことによって
も均一攪拌を維持することができる。

【００４２】血清非依存性ヒト細胞、例えばボウエスII
細胞から得られた収得液は、離脱した細胞及び細胞破片
を除去するために、遠心分離しなければならないだろ
う。細胞により分泌されたＴＰＡ、プロ−ＴＰＡ及びそ
のほかの価値ある物質が容器の表面に吸着するのを防止
し、そして酵素活性を保存するために培地に非イオン性
洗剤を加えるのが好ましい。

【００４３】好ましくは、非イオン性洗剤、例えばトリ
トン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（商標）又はトゥイー
ン（Ｔｗｅｅｎ）８０（商標）を、最終濃度が約０．０
１〜０．１％になるように加える。pH５．５〜６．０に
おいて最も高い活性が維持されるので、収得液を弱酸、
例えば低級アルカン酸、例えば酢酸により前記のpHに酸
性化し、その後で低温、例えば約４℃において４８時間
貯蔵し、又は−２０℃において長時間貯蔵することがで
きる。

【００４４】収得液中のＴＰＡ、プロ−ＴＰＡ及びその
他の価値ある物質の含量は、常用の技法を用いて測定す
ることができる。例えばＴＰＡ含量は¹²⁵Ｉ−フィブリ
ン測定、又は螢光測定により測定することができる。第
１に、プラスチックウェルの表面上の不溶性被覆物とし
て付着せしめた¹²⁵Ｉ−標識フィブリンからの放射線フ
ィブリン分解ペプチドのプラスミノーゲンに依存する放
出を経時的に測定する〔Ｅ．Ｌ．Ｗｉｌｓｏｎ及びＥ．
Ｂｏｗｄｌｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２２，３９
０〜３９９（１９７８）参照〕。

【００４５】第２に、適当な合成基質、例えばCbz-Gly-
Gly-Arg-ＡＭＣ（ＡＭＣはアミノメチルクマリン残基で
ある）又はBoc-Val-Gly-Arg-ＡＭＣのアミド分解により
生ずる螢光の増加を測定する〔Ｍ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ
等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７５，７５０〜７５３（１９７８）参照〕。¹²⁵Ｉ−フ
ィブリン測定によりＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡの両者の総
酵素活性が得られるのに対して、螢光測定によりＴＰＡ
活性のみを測定することができ、あるいはこれとは異
り、収得液をプラスミンで処理してプロ−ＴＰＡをＴＰ
Ａに転換した後ＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡの両者を測定す
ることができる。

【００４６】上記のＴＰＡ測定を用いて、この発明に従
って得られる収得液はプロ−ＴＰＡを高い比率で含有す
ることを示すことができる。これはおそらく、使用した
培地にプロ−ＴＰＡをＴＰＡに転換するプラスミン又は
他のプロテアーゼが欠けているためであろう。例えばボ
ウエスIIの培養により得られた収得液中にプロ−ＴＰＡ
が多いことは、ボウエスＩ黒色腫細胞から得られる収得
液にプロ−ＴＰＡが少量含まれていることと対照的であ
る。

【００４７】血清非依存性細胞から分泌された蛋白質の
分離と精製血清非依存性細胞、例えばボウエスII細胞から得られた
培養液からの所望の蛋白質の分離、及びその精製は、原
則として蛋白質化学において共通な任意の適当な方法に
より、例えば、無機塩等を用いる分別沈澱、ゲル濾過、
例えば架橋デキストランもしくはアガロース上でのゲル
濾過、ゲル電気泳動又はクロマトグラフ的手段、例えば
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ーもしくはアフィニティークロマトグラフィーにより行
うことができる。ＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡの分離及び精
製のために、例えば次のような方法が用いられる。

【００４８】◎ 亜鉛−キレート−アガロース、コンカ
ナバリンＡ−アガロース及びセファデックスＧ−１５０
（商標）によるクロマトグラフィー〔Ｄ．Ｃ．Ｒｉｊｋ
ｅｎ及びＤ．Ｃｏｌｌｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５６，７０３５〜７０４１（１９８１）参照〕。収得
液を亜鉛−キレート−アガロースカラムに通す。吸着さ
れた酵素をイミダゾール含有緩衝液により溶出する。得
られた溶液をコンカナバリンＡ−アガロースカラムに適
用する。溶出をメチルマンノシド及びＫＳＣＮで行うこ
とができる。最後の段階において、酵素をセファデック
スＧ−１５０（商標）カラムによりゲル濾過する。

【００４９】◎ アフィ−ゲル・ブルー（Ａｆｆｉ−Ｇ
ｅｌＢｌｕｅ）（商標）及びアミノベンズアミジン−
セファロース（商標）によるクロマトグラフィー〔Ｌ．
Ｃ．Ｇｉｌｂｅｒｔ及びＪ．Ｔ．Ｗａｃｈｓｍａｎ，Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ７０４，４
５０〜４６０（１９８２）参照〕。酵素を、アフィ−ゲ
ル・ブルー（商標）及びアミノベンズアミジン−セファ
ロース（商標）に次々と吸着せしめる。アルギニンを含
有する緩衝液により脱着を行う。

【００５０】◎ 不溶性マトリクス、例えばデキストラ
ンに共有結合的に固体された可溶性フィブリン断片から
なる支持体上での、ＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡの特異的親
和性に基く選択吸着〔ヨーロッパ特許出願No. ２３８６
０参照〕。吸着された酵素はpH４．２の酢酸塩緩衝液に
より溶出することができる。 ◎ 不溶性マトリクス、例えばアフィ−ゲル（商標）又
はセファデックス（商標）に結合した抗−ＴＰＡ抗体、
モノクローナル抗−ＴＰＡ抗体のイムノアフィニティー
カラムによるクロマトグラフィー。

【００５１】◎ ＤＥ−３セファロース（商標）により
アフィニティークロマトグラフィー。豆科植物エリスリ
ナ・ラティシマ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａｌａｔｉｓｓｉ
ｍａ）の種子はＤＥ−３と称されるトリプシン阻害物質
を含有する〔Ｆ．Ｊ．Ｔｏｕｂｅｒｔ等、Ｈｏｐｐｅ−
Ｓｅｙｌｅｒ’ｓＺｉｉｔｓｈｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．３０２，５３１〜５３８（１９８１）〕。Ｄ
Ｅ−３も又ＴＰＡ活性を阻害することができることが見
出されている。

【００５２】精製したＤＥ−３阻害物質を、標準的方法
を用いて不溶性マトリクスに結合せしめることができ
る。媒体中のＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡを吸着せしめそし
てチャオトロピック・エーゼント（ｃｈａｏｔｒｏｐｉ
ｃａｇｅｎｔ）例えばＫＳＣＮを含有する緩衝液によ
り溶出することができる。 ◎ ＳＤＳを含有するポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）による電気泳動。この方法は特に分析目的
に、又は分子量の測定のために使用される。

【００５３】十分に純粋な生成物を得るために、単一の
方法又幾つかの逐次精製段階を選択することができる。
さらに、追加の精製段階、例えば適当な緩衝液合物中で
の透析、逆相ＨＰＬＣ等を必要とする場合があろう。例
えば、第１段階として、収得液を亜鉛−キレート−アガ
ロース、コンカナバリンＡ−アガロース及びセファデッ
クスＧ−１５０（商標）を用いるクロマトグラフィーで
処理し（この段階は大容量の収得液中に存在する目的蛋
白質を濃縮するためにも役立つ）、そして最後に、得ら
れた濃縮蛋白質をアフィニティ−クロマトグラフィーに
より精製することができる。

【００５４】この発明の好ましい態様においては、血清
非依存性ヒト細胞、例えばボウエスII細胞から得られ
た、ＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡを含有する収得液を遠心分
離して完全細胞及び細胞破片を除去し、そして次に室温
において、ＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡに対して選択的なア
フィニティ試薬が結合している不溶性マトリクス、例え
ばＤＥ−３阻害物質が結合しているＢｒＣＮ活性化セフ
ァロース（商標）から成るカラムに通す。

【００５５】このカラムを洗浄した後、約５．５〜６．
０のpHを有しそして約１．４〜約２０モル、好ましくは
１．６モルのチャオトロピック・エーゼント（ｃｈａｏ
ｔｒｏｐｉｃａｇｅｎｔ）、例えばＫＳＣＮを含有す
る緩衝液、例えば燐酸緩衝塩溶液によりカラムを処理す
ることにより、吸着されたＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡを溶
解する。この方法に代えて、ベンズアミジン又はアルギ
ニンを脱着剤として選択することもできる。

【００５６】他の方法においては、モノクローナル抗Ｔ
ＰＡ抗体を例えばアフィ−ゲル（商標）に結合せしめる
ことによって調製したモノクローナル抗体カラムを用い
てクロマトグラフ処理することによりＴＰＡ及びプロ−
ＴＰＡを分離する。得られた精製溶液はＴＰＡ及びプロ
−ＴＰＡを含有する。プロ−ＴＰＡを全く含有しないＴ
ＰＡを製造するために、プロ−ＴＰＡを酵素的に、例え
ばプラスミン又はプロ−ＴＰＡに対してこれと同等の作
用をする酵素の作用により、ＴＰＡに転換する。

【００５７】この発明の好ましい態様においては、プロ
−ＴＰＡを、ＴＰＡを含有しない実質上純粋な形で分離
する。プロ−ＴＰＡは真のプロ−酵素である。すなわち
このものはＴＰＡの酵素的に不活性な形である。プロ−
ＴＰＡはＴＰＡよりよくフィブリンに吸着し、そしてそ
のために、フィブリン分解を行う場合にＴＰＡより選択
的である。なぜならプロ−ＴＰＡはまずフィブリンに結
合し、そしてそのあとでのみＴＰＡに転換されるのに対
して、ＴＰＡは、局在した作用が望まれるフィブリンに
おいてではなく血流中で若干のプラスミノーゲンを活性
化する可能性が多少存在するからである。

【００５８】実質上ＴＰＡを含有しないプロ−ＴＰＡを
製造するためには、精製過程において、プロテアーゼ阻
害物質、例えばアプロチニン又は塩基性膵臓トリプシン
阻害物質を存在せしめることにより、存在しそしてプロ
−ＴＰＡを（部分的に）ＴＰＡに転換するであろう少量
のプロテアーゼを阻害するのが好ましい。次に、選択的
アフィニティー試薬、例えばＤＥ−３を含有するカラム
上で、ＴＰＡのみに選択的に結合しそしてプロ−ＴＰＡ
には結合しない阻害剤、例えばジイソプロピルフルオロ
ホスフェート又はニトロフェニルグアニジノベンゾエー
トの存在下で最終精製を行う。これらの試薬は、ＴＰＡ
がアフィニティーカラムに吸着するのを防止する。従っ
て、結合ＴＰＡはＤＥ−３カラムを通過し、他方プロ−
ＴＰＡはカラムに吸着し、そして前記のようにして溶出
され得る。従って、ＴＰＡ、プロ−ＴＰＡ又はこれらの
混合物を生産することができる血清非依存性ヒト細胞、
又はその変異体、例えばボウエスII細胞を血清不含培地
中で培養し、そして所望の蛋白質を収得液から分離し、
そして所望により、蛋白質の混合物を個々の化合物に分
離し、又は個々の化合物に転換することを特徴とする、
ＴＰＡ、プロ−ＴＰＡ又はこれらの混合物を製造する方
法を提供することもこの発明の目的である。

【００５９】特にこの発明は、得られた混合物中に存在
するプロ−ＴＰＡを酵素的にＴＰＡに転換することを特
徴とする、プロ−ＴＰＡを含有しないＴＰＡの製造方法
を提供する。特にこの発明は、分離及び精製過程にプロ
テアーゼ阻害物質を存在せしめ、そして最終精製をＴＰ
Ａを選択的に阻害する阻害物質の存在下で行うことを特
徴とする、ＴＰＡを含有しないプロ−ＴＰＡの製造方法
を提供する。

【００６０】例えば前記の方法に従って、血清非依存性
ヒト細胞、特にボウエスII細胞から得られるＴＰＡとプ
ロ−ＴＰＡとの混合物、並びに実質上純粋な形のＴＰＡ
及びプロ−ＴＰＡは、新規でありそしてこの発明の対象
である。医薬製剤この発明に従って、例えば培養したボウエスII細胞から
得られる新規な蛋白質、特にＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡ
は、価値ある薬理学的性質を示す。すなわち、ボウエス
II細胞からのＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡは、公知のプラス
ミノーゲン活性化物質と同様に、ヒトにおいて、血栓
症、又はプラスミノーゲンの活性化を介して局所的フィ
ブリン分解活性又は蛋白質分解活性を得ることが好まし
い他の状態、例えば動脈硬化、心筋梗塞及び脳梗塞、静
脈血栓症、血栓塞栓症、手術後血栓症、血栓性静脈炎、
及び糖尿病性血管疾患の予防及び治療に使用することが
できる。

【００６１】この発明はさらに、医薬として有効な量の
活性成分（特にＴＰＡ、プロ−ＴＰＡ又はこれらの混合
物）を、非経口的、例えば筋肉内、皮下又は腹腔内投与
に適し、そして活性成分と有害な相互作用を行わない無
機又は有機の固体又は液体の医薬として許容される担体
と共に含んで成る医薬に関する。これらは特に注入溶
液、好ましくは水性溶液又は懸濁液であり、使用前に、
例えば、活性成分のみを、又は担体、例えばマンニトー
ル、ラクトース、グルコース、アルブミン等と共に含有
する凍結乾燥品から調製することができる。この医薬は
無菌化することができ、そして所望により、助剤、例え
ば防腐剤、安定剤、乳化剤、溶解剤、緩衝剤及び／又は
浸透圧調整塩を含有することができる。無菌化は小孔サ
イズ（０．４５μｍ以下の直径）の濾材を通す無菌濾過
により行い、所望によりこの後で凍結乾燥することがで
きる。無菌貯蔵を助けるために抗生物質を加えることも
できる。

【００６２】この発明の医薬は単位投与型、例えば単位
投与量当り、１〜２０００mgの医薬として許容される担
体及び単位投与当り約１〜２０mg、好ましくは約３〜１
５mgの活性成分（ＴＰＡ、プロ−ＴＰＡ、又はこれらの
混合物）を含んで成る単位投与型に配合する。病気のタ
イプ並びに患者の年齢及び状態に依存して、約７０kgの
患者の治療のための日用量は、２４時間当り３〜１５m
g、好ましくは５〜１０mgである。

【００６３】この発明はさらに、この発明の生物学的に
活性な蛋白質を医薬として許容される担体と混合するこ
とを特徴とする医薬の製造方法に関する。ヒトの予防的
及び治療的処置のための新規な蛋白質の使用もこの発明
の対象である。凝血をこの発明に従って得られたＴＰ
Ａ、プロ−ＴＰＡ、又はこれらの混合物に暴露すること
から成る、ヒトにおける凝血溶解方法もこの発明の対象
である。

【００６４】この発明のＴＰＡは又、試験管内において
もその活性を表わす。従ってこれらは、例えば洗浄剤又
は浄化剤において、プラスミノーゲンと共にフィブリン
分解剤として使用することができる。この発明は又、こ
の発明の方法によって製造されるすべての蛋白質に関す
る。この発明はまた、この明細書に記載した方法に従っ
て製造されるすべての血清非依存性ヒトセルライン、例
えば黒色腫セルラインに関する。

【００６５】この発明はさらに、この明細書に記載した
血清非依存性ヒトセルライン、例えば黒色腫セルライン
から得られたすべての生物学的に活性な化合物に関す
る。この発明はさらに、この明細書に記載した血清非依
存性ヒトセルラインの、血清不含条件下での生物学的に
活性な化合物の製造のための使用に関する。この発明は
又、血清不含条件下で生物学的に活性な化合物を製造す
るためのボウエスII培養物の使用に関する。

【００６６】この発明は特に、例に記載した蛋白質及び
その製造方法に関する。次に例によりこの発明をさらに
詳細に説明するが、これによりこの発明の範囲を限定す
るものではない。実験の部実験の部で使用する略号は次の意味を有する。

【００６７】

【表２】

【００６８】例１．血清非依存性セルラインボウエス
（Ｂｏｗｅｓ）IIの確立（ａ）ボウエスＩ細胞から収集した条件調節された培地
を用いるボウエスIIセルラインの確立ヒト黒色腫セルライン〔Ｂｏｗｅｓ−ＲＰＭＩ７２７
２；Ｄ．Ｃ．Ｒｉｊｋｅｎ及びＤ．Ｃｏｌｌｅｎ，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，７０３５〜７０４１（１
９８１）に記載〕を、ニューヨーク、ロックフェラー大
学Ｄｒ．Ｅ．Ｒｅｉｃｈより得た。

【００６９】このセルラインを、組織培養フラスコ（１
５０cm²、コスタール）中で、３７℃において、空気９
５％及びＣＯ₂５％の湿潤雰囲気下で培養する。炭酸水
素ナトリウム（２ｇ／ｌ）、抗生物質（ペニシリン３０
０μｇ／ml、ストレプトマイシン２００μｇ／ml、タイ
ロシン１０μｇ／ml）、及び１０％熱不活性化（５６
℃、３０分）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補給したＲｏｓ
ｗｅｌｌＰａｒｋＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔ
ｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地−１６４０（ギブコ）中で付着
単層として増殖せしめる。

【００７０】細胞の付着単層を有する組織培養フラスコ
１個を選択する。コンフルエンスにおいて、血清含有培
地を除去し、そして抗生物質（前記参照）を補給したＲ
ＰＭＩ−１６４０培地５０mlにより置換する。この培地
にはそのほかの添加物は含めない。細胞を、３７℃にお
いて、５％のＣＯ₂を補給した湿潤空気中に保持する。
培地を２４時間毎に取り代える。最初細胞は健全であり
そして付着したままである。

【００７１】１２日後、細胞は培養容器から離脱しそし
て自由浮遊を始める。１４日後、大多数の細胞が離脱
し、そして生存細胞の小部分のみがなおフラスコに付着
し続ける。離脱細胞を含有する培地を除去する。長時間
にわたって血清を奪われた黒色腫細胞のまばらな付着培
養物を、同量のＲＰＭＩ−１６４０により稀釈した「条
件調節された培地」から成る新鮮培地５０mlにより覆
う。「条件調節された培地」は次のようにして調製す
る。

【００７２】コンフルエントな、血清依存性黒色腫細胞
Ｂｏｗｅｓ−ＲＰＭＩ７２７２から血清含有培地を除去
し、そしてＲＰＭＩ−１６４０培地のみにより置換す
る。２４時間後、この培地を回収し、そして２０００rp
m で５分間遠心分離し、そして０．４５μｍのミリポア
フィルターを通す。こうして得られた溶液を「条件調節
された培地」と称し、そしてただちに同量のＲＰＭＩ−
１６４０により稀釈する。

【００７３】新鮮なＲＰＭＩ−１６４０により稀釈した
「条件調節された培地を、４〜５日の間隔で３箇月にわ
たり培養物に加える。この時以後、細胞数が相当に増加
し、そして血清不含培地はもはや「条件調節された培
地」を必要としない。そして培養物にＲＰＭＩ−１６４
０培地のみを供給する。こうして得られた血清非依存性
細胞を組織培養フラスコ（１５０cm²、コスター）中で
培養し、そして生存を保証するため約１０⁶細胞／ml培
地の密度で接種しなければならない。細胞は典型的に
は、５×１０⁷細胞／５０ml ＲＰＭＩ−１６４０／１
５０cm²フラスコの密度で接種する。細胞は、血清不含
培地中で非常にゆっくり増殖し、そして約６日の世代時
間を有する（血清依存性セルラインＢｏｗｅｓ−ＲＰＭ
Ｉ７２７２の世代時間約２４時間と比較）。

【００７４】コンフルエンスにおいて、フラスコを激し
くたたいて付着細胞を培地中に離脱せしめることにより
パッセージを行う。この機械的方法により離脱した細胞
を約１０⁶細胞／mlの濃度でＲＰＭＩ−１６４０に懸濁
し、そして新たな組織培養フラスコに再接種するのに使
用する。たたいても離脱しない細胞には新鮮なＲＰＭＩ
−１６４０培地を供給する。このようにして、合計５箇
月間かけて、血清非依存性セルラインボウエスIIの培養
を確立する。

【００７５】（ｂ）ボウエスＩ細胞から収集した条件調
節された培地の非存在下でのボウエスIIセルラインの確
立１５％のウシ胎児血清及び１０％のＤＭＳＯを含有する
血清依存性黒色腫セルラインボウエス（Ｂｏｗｅｓ）−
ＲＰＭＩ７２７２（２．５×１０⁶細胞／mlＤＭＥＭ
中）の凍結ストック４mlを解凍し、そしてこれを、７５
cm²の組織培養フラスコ中１５mlのあらかじめ加温した
血清不含ＤＭＥＭに加える。この細胞を、５％のＣＯ₂
を補給した湿潤空気中で３７℃にて一夜インキュベート
する。

【００７６】この期間の後、非付着細胞を含有する培地
全体を除去し、そして、１５mlの血清不含培地で置換す
る。顕微鏡下で細胞が粒状化するまで（２４〜７２時
間）インキュベーションを続け、この時点で５０％の培
地を除去し、そして新鮮な血清不含ＤＭＥＭで置換す
る。この操作を２〜３日に１回繰り返し、必要であれば
（細胞の顕微鏡的形状、培地のpHの変化）培地の合計容
積を徐々に３０mlまで増加する。

【００７７】６０〜７０％のコンフルエンスに達したと
き（約３週間）、血の表面から細胞を離脱せしめるため
に０．０２％のＥＤＴＡを用いながら同じ大きさの２個
の新たなフラスコに細胞をパッセージする。最初のパッ
セージにおいて、血清不含培地に、ＥＤＴＡ処理に先立
って培養物から取り出した培地を４０％補給する。この
時点で血清非依存性セルラインが確立され、そして細胞
は、十分に高い細胞密度、すなわち少なくとも３０％の
コンフルエンシーに維持されれば、条件調節された培地
の非存在下で分裂を続けるであろう。例２．ボウエスII細胞の液中培養組織培養フラスコ中の血清不含培地ＲＰＭＩ−１６４０
中で増殖したボウエスII細胞を、フラスコを手で激しく
たたくことによって離脱せしめ、一緒にして２×１０⁵
細胞／mlを含有する０．６ｌの懸濁液を得、そして蒸気
殺菌した３ｌのガラス容器に入れる。細胞懸濁物を機械
的攪拌機によりゆっくり（４０r.p.m.）攪拌する。温度
を３７±０．１℃に調節し、そして５％のＣＯ₂を含有
する空気を０．２ｌ／分の速度で表面通気することによ
り酸素を供給する。

【００７８】純粋な空気に戻すことによりpHが６．９よ
り低くならないようにする。約１週間の最初の適応期間
中、新鮮な血清不含培地を加えることによりグルコース
の涸渇を防止する。最終培養容積を１ｌとする。細胞密
度が３〜４×１０⁵細胞／mlに達した時、培養液の定期
的取出しを開始する。２〜４日ごとに三時間攪拌を停止
して生存細胞のほとんどを沈澱せしめ、そして上方５０
％のスペント培地を取り出し、そして新鮮な血清不含培
地で置換する。収得液を２０００rpm （〜３００Ｇ）で
５分間遠心分離して完全細胞及び細胞破片を除去する。
この溶液を、トリトンＸ−１００（商標）を最終濃度
０．１％まで加えることによって安定化し、そして酢酸
でpH５．５〜６．０として後−２０℃にて貯蔵する。例３．組織培養フラスコ中でのボウエスII細胞の培養及
び収得溶液の回収血清非依存性セルラインボウエスIIを、抗生物質（例１
参照）を補給した５０mlのＲＰＭＩ−１６４０に、３７
℃，９５％の空気と５％のＣＯ₂とから成る湿潤雰囲気
中で、５×１０⁷細胞／１５０cm²組織培養フラスコ
（コスター）の密度で接種する。

【００７９】細胞が付着したとき、細胞から培地を回収
し、そして抗生物質補充した新鮮なＲＰＭＩ−１６４０
により置換する。血清不含収得液の回収を２４時間の間
隔で、単層のコンフルエンスがパッセージを必要とする
まで反復する。約５週間後にコンフルエンスに達する。
パッセージは例１に記載したのと同様にして行う。収得
液は例２に記載したのと同様にして処理する。例４．収得溶液中のＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡの含量の測
定ＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡを含有する収得液を既知比活性
の³Ｈ−ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェー
ト）で処理する。インキュベーションの後、ラベルされ
た酵素を回収し、そして沈澱によって未反応の放射性Ｄ
ＦＰを除去し、そしてセリンプロテアーゼに関して文献
中に推奨されている方法〔Ｊ．Ａ．Ｃｏｈｅｎ等、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．X
I，８６８頁（１９６７）〕によりトリフルオロ酢酸を
用いて洗浄する。

【００８０】活性化物質のこの活性部位力価測定によ
り、血清非依存性ボウエスIIから集めた収得液は、１ｌ
当り約１０〜２０ｎモルの合計ＴＰＡを含有しているこ
とが確定される。ボウエスＩ細胞及びボウエスII細胞に
よる連続する４日間にわたる合計ＴＰＡ（ＴＰＡ及びプ
ロ−ＴＰＡ）の放出は次のようにして測定することがで
きる。

【００８１】７５cm²の組織培養フラスコ（１．３×１
０⁵細胞／cm²；２０ml／フラスコ）中に増殖したボウ
エスＩ黒色腫細胞からの収得液、又は１５０cm²フラス
コ（４×１０⁵細胞／cm²；５０ml／フラスコ）中に増
殖したボウエスII細胞からの収得液を、２４時間ごとに
４日間にわたって回収する。プラスミノーゲン活性化物
質の活性を¹²⁵Ｉ−フィブリン測定（下記）により測定
する。

【００８２】ＴＰＡの放出は、ボウエスII細胞の場合４
日間にわたって一定であり、他方、ボウエスＩ黒色腫細
胞の場合、ＴＰＡ活性は最初の３日間にわずかに上昇す
るが４日目には低下する。この時点までに細胞の多くは
表面から離脱し、そして付着を回復するために１０％の
ＦＣＳを補充したＲＰＭＩを加えなければならなかった
（第１表参照）。

【００８３】¹²⁵Ｉ−フィブリン測定〔Ｅ．Ｌ．Ｗｉｌ
ｓｏｎ及びＥ．Ｄｏｗｄｌｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅ
ｒ２２，３９０〜３９９（１９７８）〕において、プ
ラスチック製組織培養ウェルの内部底表面上の薄層とし
て放射性¹²⁵Ｉ−フィブリノーゲン／フィブリンを付着
せしめることにより固相支持体を得る。測定すべき収得
液の試料をこのウェルに加え、そしてプラスミノーゲン
に依存する放射能の可溶化を時間の関数として測定しＴ
ＰＡ活性を求める。¹²⁵Ｉ−フィブリン測定によってＴ
ＰＡ及びプロ−ＴＰＡの両者の活性が測定されるから、
第１表においてＴＰＡ活性と称するのは全酵素の活性を
示す。

【００８４】

【表３】

【００８５】さらに、血清依存性ボウエス黒色腫細胞及
び血清非依存性ボウエスII細胞のそれぞれの培養液のＴ
ＰＡ及びプロ−ＴＰＡの個々の含有量を測定する。ボウ
エスＩ黒色腫細胞を１０％のＦＣＳを含有する２mlのＲ
ＰＭＩ中にレプリケート３５mm皿当り５×１０⁵細胞で
プレートする。２４時間後、培地を血清不含ＲＰＭＩで
置換し、そして連続３日間にわたって２４時間収得液を
回収する。各２４時間の終点においてプレート当りの細
胞数を計測する。

【００８６】ボウエスII細胞は、２mlのＲＰＭＩ中に３
５mmの皿当り３×１０⁶細胞でプレートする。プラスミ
ノーゲン活性化物質の活性を、基質としてCbz-Gly-Gly-
Arg-ＡＭＣを用いる螢光測定により測定する。ＴＰＡの
直接アミド分解作用を、螢光源性物質からのアミノメチ
ルクマリン（ＡＭＣ）のアミド分解による放出の結果で
ある４５５nmにおける螢光の増加を追跡することによっ
て螢光法的に測定する〔Ｍ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ等、Ｐ
ｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５，
７５０〜７５３（１９７８）〕。ＩＦＵはアミド分解測
定において１分間に１０ｐモルの基質を加水分解する酵
素の量を表わす。結果を第２表に示す。

【００８７】

【表４】

【００８８】注（ａ）全ＴＰＡ活性は、２９５μｌの収
得溶液を５μｌのプラスミン（０．１mg／ml）と共に室
温にて６０分間インキュベートした後に測定する。測定
のためにプラスミンをトラシロール（Ｔｒｏｓｙｌｏ
ｌ）（商標）により阻害する。（ｂ）プロ−活性化物質（プロ−ＴＰＡ）の量は全活性
からプラスミンを用いないで測定した活性を差引くこと
により算定する。

【００８９】第２表からわかるように、血清非依存性ボ
ウエスII細胞により分泌されたＴＰＡの約１０％が活性
酵素形であり約９０％がプロ−酵素（プロ−ＴＰＡ）の
形である。これに対して、血清依存性ボウエスＩ黒色腫
細胞から収集した培地は９０％のＴＰＡと約１０％のプ
ロ−ＴＰＡを含有する。例５．ＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡの回収及び精製（ａ）ＤＥ−３セファロース（商標）カラムの調製エ
リスリナ・ラティシマ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａｌａｔｉ
ｓｓｉｍａ）から得られた精製ＤＥ−３阻害物質〔Ｆ．
Ｊ．Ｊｏｕｂｅｒｔ等、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒｓ
Ｚｅｉｓｃｈｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３０
２，５３１〜５３８（１９８１）〕２６mgを、製造者の
指示に従ってシアノゲンブロミド活性化セファロース４
ｂ（商標）（ファルマシア社）５mlに結合せしめる。こ
のマトリクスを、０．４ＭＨＣｌ０．１％のトリトン
Ｘ−１００（商標）及び０．０２％のナトリウムアジド
を含有する燐酸緩衝塩（ＰＢＳ）pH７．４により平衡化
する。次にこのマトリクスを５mlのカラムに充填する。

【００９０】（ｂ）ＤＥ−３セファロース４ｂによる
ＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡを含有する収得液のクロマトグ
ラフ的精製血清非依存性ボウエスII細胞から得られた収得液（例３
参照）２ｌに、０．４ＭのＮａＣｌ及び０．１％のトリ
トンＸ−１００を加え、そして０．４５μｍの膜（ミリ
ポア）を通して濾過する。次に収得液をＤＥ−３セファ
ロースカラム（上記参照）に、４５ml／時の流速で室温
において適用し、そして流出液を廃棄する。収得液の全
量を通した後、カラムを、０．４ＭＮａＣｌ及び０．
１％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ約５０mlに
より洗浄する。

【００９１】次に、吸着した蛋白質を１．６ＭＫＳＣ
Ｎ，０．４ＭＮａＣｌ及び０．１％のトリトンＸ−１
００を含有するＰＢＳを用いて溶出し、そして４℃にて
２mlの分画を集める。各分画の蛋白質含量を、２８０nm
におけるＵＶ吸収を測定することにより決定する。吸着
した蛋白質がするどいピークとして溶出するのが観察さ
れる。最大ＵＶ吸収及び¹²⁵Ｉ−フィブリン測定におけ
る最大フィブリン分解活性を有する分画を集めて８mlの
溶液を得、これを−２０℃にて貯蔵する。この溶液はカ
ラムに適用した全活性の約７０〜８０％を含む。低い活
性を含む分画は別に集める。両溶液の合計回収活性は通
常９０〜１００％である。

【００９２】前記の溶液から試料を採取する。トリクロ
ロ酢酸を最終濃度１０％になるように加えることにより
蛋白質を沈澱せしめ、そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかける。電気泳動図は、既知分子量を
有する同時電気泳動標識蛋白質を用いるＷｅｂｅｒ及び
Ｏｓｂｏｒｎｅの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４
４，４４０６〜４４１２（１９６９）〕に従って測定し
た場合、約７３，０００ダルトンの分子量を有する蛋白
質の単一バンドを示す。

【００９３】一緒にした溶液のＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡ
含量を、基質としてCbz-Gly-Gly-Arg-ＡＭＣを用いる螢
光測定（例４参照）により測定する。プラスミンと共に
インキュベートし、プラスミンをトラシロールにより阻
害した後に全ＴＰＡ活性を測定する。全活性からプラス
ミン活性化を行わないで測定した活性を差引くことによ
りプロ−ＴＰＡの量を算定する。ボウエスII細胞からの
プラスミノーゲン活性化物質を精製することにより、お
よそ同量ずつのＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡの混合物が得ら
れることが確認される。ボウエスII細胞からの未処理収
得液においてはＴＰＡが１０％、プロ−ＴＰＡが９０％
の比率であり（例４、第２表参照）、プロ−ＴＰＡは分
離の過程で部分的に活性酵素に転換される。

【００９４】血清非依存性ボウエス（II）セルラインか
ら得られた収得液を低濃度のウシ胎児血清（０．０１
％）で処理することによりプロ−ＴＰＡがＴＰＡへ転換
する。これはおそらく、ＦＣＳ中にプラスミンが存在す
るためであろう。（ｃ）ＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡを含有する収得液の、
ＤＥ−３セファロース４ｂによる、蛋白質分解酵素阻害
物質の存在下でのクロマトグラフ的精製血清非依存性ボウエスII細胞から得られた収得液のクロ
マトグラフィーを例５ｂに記載したのと同様にして行
う。但し、この方法において、０．１KIU ／mlの塩基性
膵臓トリプシン阻害剤を存在せしめる。

【００９５】基質としてCbz-Gly-Gly-Arg-ＡＭＣを用い
る螢光測定により、精製溶液中のＴＰＡ及びプロ−ＴＰ
Ａ含量を測定する。ＴＰＡの９０％がプロ−酵素形であ
り、そして１０％が活性形である。従って、精製過程に
おけるプロ−ＴＰＡからＴＰＡへの転換がＢＰＴＩによ
り阻害される。例６．精製したＴＰＡ標品中における１鎖プロ−ＴＰＡ
の存在の証明血清非依存性セルラインボウエスIIから得られた収得液
を、例５ｃに記載したのと同様にしてＤＥ−３セファロ
ースを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより
精製する。得られた精製溶液中、ＴＰＡの約９０％がプ
ロ−酵素形であり、そして約１０％が活性酵素形であ
る。このことはプラスミン処理の前後におけるアミド分
解測定により判断される。溶液をＴ−Ｔ（０．１）中に
透析する。

【００９６】この溶液の試料を同量のＰＢＳ、又は５μ
ｇ／mlのプラスミン含有ＰＢＳと混合する。２０℃にて
１６時間インキュベートした後、ＳＤＳを最終濃度０．
１まで加え、そして６％のＴＣＡにより蛋白質を沈澱せ
しめる。もとの酵素溶液の試料２００μｌからの沈澱を
アセトンで洗浄し、そして１％のＳＤＳ及び１０％のグ
リセリンを含有する０．０６ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ pH
６．８溶液２０μｌに溶解する。必要であればこの段階
において、これらの試料を、２μｌの１ＭのＤＴＴを添
加しそして３７℃にて３０分間インキュベートすること
により還元する。

【００９７】次にすべての試料を１分間煮沸し、そして
各々の２０μｌを、０．１％のＳＤＳを含有する５〜１
５％のポリアクリルアミド平板ゲル中で電気泳動する。
電気泳動した後、クーマシー・ブリリアントブルー（Ｃ
ｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅ）
（商標）によりゲルを染色し、そして通常通り脱色す
る。電気泳動トラックには（ａ）分子量標識、（ｂ）未
処理未還元ＴＰＡ溶液、（ｃ）未処理還元ＴＰＡ溶液、
及び（ｄ）プラスミン処理未還元ＴＰＡ溶液を含める。

【００９８】トラック（ｂ）は分子量約７３，０００の
唯一の蛋白質バンドを示す。還元条件下（トラックｃ）
においてもほとんどのＴＰＡが７３００ダルトン領域に
移行する。しかしながら、これ以外の弱いバンドが３
５，０００ダルトン領域に観察される。プラスミン処理
及びＤＴＴを用いる還元により７３，０００ダルトンの
蛋白質が、それぞれ見かけ上３５，０００ダルトン及び
３８，０００ダルトンの分子量を有する２つのサブユニ
ットに転換される。

【００９９】これらの実験により、７３，０００ダルト
ンの分子量を有する単鎖プロ−ＴＰＡが、プラスミン処
理によりＳ−Ｓ連結された２鎖形（ＴＰＡ）に転換され
ることが証明される。次に、ＴＰＡが還元条件下で２つ
のサブユニットに開裂する。例７．プロ−ＴＰＡの酵素活性の測定Ｔ−Ｔ（０．１）中全活性（ＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡ）
約２０FU／mlを含有するＴＰＡ標品の試料（５００μ
ｌ）を、５mM ＤＦＰの存在下（ａ及びｂ）又は非存在
下（ｃ及びｄ）で、２０℃にて６０分間インキュベート
する。Ｈ．Ｓ．Ｐｅｎｅｆｓｋｙ〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２５２，２８９１〜２８９９（１９７７）〕の方
法に従って、反応混合物の試料１００μｌを、Ｔ−Ｔ
（０．１）で平衡化したセファテックスＧ２５を充填し
た１mlのカラムを通して遠心分離することにより遊離の
ＤＦＰを除去する。

【０１００】これらの試料に３μｌの０．５mg／mlプラ
スミン（ｂ及びｄ）又は３μｌのＰＢＳ（ａ及びｃ）を
加える。次にこれらの溶液から５０μｌずつの試料を採
取し、１０μｌのＢＰＴＩ（１０００KIU ／ml）に加え
てプラスミン活性を阻害する。各試料のアミド分解活性
を螢光測定により決定する。結果を第３表に示す。

【０１０１】

【表５】

【０１０２】試料は１７．４８FU／mlの全ＴＰＡ含量を
有し（ｄ）、この内６．２５FU／mlが活性酵素形（ｃ）
として存在する。活性酵素はＤＦＰによる処理によって
検出できないレベルまで阻害される（ａ）。ＤＦＰによ
り処理した後プラスミンと共にインキュベートすること
により活性酵素が再生成し、このことはプロ−ＴＰＡが
ＤＦＰ処理に対して耐性であり、そして測定しうる酵素
活性を有しないことを示している。例８．ＴＰＡからのプロ−ＴＰＡの分離例５ｃに記載した方法により得られたＴＰＡ（１０％）
及びプロ−ＴＰＡ（９０％）から成る溶液を、０．１％
のトリトンＸ−１００を含有する０．１ＭＴｒｉｓ・
ＨＣｌによりpH８．０に調整し、そしてＤＦＰ濃度を１
mMとする。３７℃にて４時間インキュベートした後、こ
の混合物を５mlのＤＥ−３セファロースカラム（例５ａ
参照）に通す。不可逆的に阻害されたＴＰＡ含有する溶
出液を廃棄する。

【０１０３】カラムを、０．４ＭＮａＣｌ及び０．１
％のトリトンＸ−１００を含有する６カラム容量のＰＢ
Ｓにより洗浄し、そして次に例５ｂに記載したようにし
て、１．６ＭＫＳＣＮ，０．４ＭＮａＣｌ及び０．
１％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳにより溶出
する。溶出液は実質上純粋な形でプロ−ＴＰＡを含有
し、基質としてCbz-Gly-Gly-Arg-ＡＭＣを用いる螢光測
定においてアミド分解活性は検出されない。プロ−ＴＰ
Ａを活性酵素に転換するプラスミンで処理することによ
り、アミド分解活性及びフィブリン分解活性を再度生成
せしめることができる。例９．不溶化されたフィブリンへのＴＰＡ及びプロ−Ｔ
ＰＡの結合異なる比率でＴＰＡ及びプロ−ＴＰＡを含有する５種類
の試料を、例５ｃに記載した方法により、又はこの方法
により得た溶液中のプロ−ＴＰＡを部分的にＴＰＡに転
換することにより得る。これらの試料の活性ＴＰＡ及び
プロ−ＴＰＡの含有量を、例４に記載したように、プラ
スミン処理の前後における螢光測定の結果から決定す
る。

【０１０４】次にこれらの試料をＴ−Ｔ（０．１）中に
稀釈して、その０．２mlが２μｇのプラスミノーゲンの
存在下で、リンブロウェルの底に被覆された¹²⁵Ｉ−フ
ィブリンの約３０〜５０％を１時間で遊離せしめるよう
にする。次に、これらの試料のアリコート（０．２ml）
を、¹²⁵Ｉ−フィブリン（３０μｇ；１００，０００cp
m ）を被覆したリンブロウェル４個に加える。０℃にて
１時間インキュベートした後、４個の内の２個のウェル
をＴ−Ｔ（０．１）により３回洗浄することにより未結
合ＴＰＡ蛋白質を除去する。

【０１０５】２μｇのプラスミノーゲン及び８０μｇの
ＢＳＡを含有するＴｒｉｓ・ＨＣｌpH８．０溶液０．３
mlを加えた後、１時間で可溶化する¹²⁵Ｉ−フィブリン
の量として結合した活性を測定する。ウェルに加えた全
ＴＰＡ活性は、２μｇのプラスミノーゲン及び８０μｇ
のＢＳＡ（０．３mlの同じ緩衝液）を洗浄してないウェ
ルに加えた後、１時間で可溶化された¹²⁵Ｉ−フィブリ
ンの量として測定する。

【０１０６】結果を第４表に示す。

【０１０７】

【表６】

【０１０８】第４表は、ＴＰＡ標品がプロ−活性化物質
形である場合に、全ＴＰＡ酵素のより多くの部分が不溶
化フィブリンに結合することを示す。例１０．非経口的投与のための医薬例５ｂ，５ｃ又は８に記載した方法により得られたＴＰ
Ａ及び／又はプロ−ＴＰＡ含有溶液を、０．０１％のト
ウイーン８０を含有する０．３モル塩化ナトリウム溶液
に対して透析し、そして−８０℃において貯蔵する。

【０１０９】投与に先立って、濃度を７５μｇ／mlの全
ＴＰＡ（すなわち、ＴＰＡ、プロ−ＴＰＡ、又はＴＰＡ
＋プロ−ＴＰＡ）、及び０．３ＭＮａＣｌに調整す
る。この溶液を、０．２２μｍのメンブランフィルター
を通して濾過することにより無菌化する。この方法は、
非経口投与、例えば静脈内投与のためのＴＰＡ溶液、プ
ロ−ＴＰＡ溶液、又はＴＰＡ＋プロ−ＴＰＡ溶液を調製
するのに適当である。例１１．血清非依存性セルラインボウエスIIの上昇した
レベルでＴＰＡを生産することができる変異体の分離血清非依存性ボウエスIIセルラインのペトリ皿培養物に
５％のウシ胎児血清を加えることにより、細胞の増殖速
度を上昇せしめ、そしてより多くの細胞がある特定の時
間にｓ相にあることを保証する。細胞が急速に分裂しつ
つあり、指数増殖期にあり、そしておよそ７０％のコン
フルエンスにあるときに、培養物に０．１mMのＮ−メチ
ル−Ｎ−ニトロ−Ｎ′−ニトロソグアニジン（ＭＮＮ
Ｇ）を加える。

【０１１０】この濃度により約７０〜８０％の細胞が死
滅する。３６時間後、残っている生存細胞をトリプシン
処理することによりペトリ皿から取り出す。細胞を、１
×１０⁵細胞／６０mmペトリ皿の密度で再接種する。２
週間後、細胞のコロニーを皿の底において観察する。各
コロニーは変異処理に対して生き残った単一細胞の子孫
である。次にこれらのコロニーを１mlの上層溶液で覆
う。この溶液は次の組成を有する。

【０１１１】プラスミノーゲン（１mg／ml）５０μｌ等張塩溶液中８％カゼイン３００μｌ等張塩溶液中２．５％寒天６００μｌＲＰＭＩ−１６４０培地８００μｌＴＰＡを生産するコロニーの周囲に溶解領域が生じ、最
も大きな溶解領域が最も多くのＴＰＡを生産するコロニ
ーの周囲に見られる。最も高いレベルでＴＰＡを生産す
る変異コロニーを分離し、そしてペトリ皿に拡げる。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】組織プラスミノーゲン活性化物質（ＴＰ
Ａ）及び／又はプロ組織プラスミノーゲン活性化物質
（プロ−ＴＰＡ）を生産することができ且つ血清不含培
地で増殖し得る血清非依存性ヒト細胞を血清不含培地中
で培養し、そして収得液から所望の蛋白質を分離し、そ
して所望により得られたＴＰＡとプロ−ＴＰＡの混合物
を分離し、又は個々の成分に分離することを特徴とする
ＴＰＡ、プロ−ＴＰＡ又はその混合物の製造方法。
【請求項２】血清非依存性ヒト細胞がボウエスII細胞
又はその変異体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】得られた混合物中のプロ−ＴＰＡを酵素
的にＴＰＡに転換することを特徴とするプロ−ＴＰＡを
含有しないＴＰＡを製造するための請求項１に記載の方
法。
【請求項４】分離及び精製工程においてプロテアーゼ
阻害剤を存在せしめ、そして最終精製をＴＰＡを選択的
に阻害する阻害物質の存在下で行うことを特徴とするＴ
ＰＡを含有しないプロ−ＴＰＡを製造するための請求項
１に記載の方法。
【請求項５】ＴＰＡとプロ−ＴＰＡとの混合物の製造
のための請求項１に記載の方法。
【請求項６】９０％がプロ−酵素形でありそして１０％
が活性酵素形である組織プラスミノーゲン活性化物質混
合物の製造のための請求項５に記載の方法。