JP2620299B2 - 新規プロテアーゼ及び該プロテアーゼ産生細胞株 - Google Patents
新規プロテアーゼ及び該プロテアーゼ産生細胞株Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は血液凝固系の主要タンパク質であるフィブリ
ンを加水分解により切断する新規プロテアーゼ、該プロ
テアーゼを産生する細胞株及び該プロテアーゼの製造法
に関する。
ンを加水分解により切断する新規プロテアーゼ、該プロ
テアーゼを産生する細胞株及び該プロテアーゼの製造法
に関する。
従来の技術 ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター
等のプラスミノーゲンアクチベーターはフィブリン分解
においてプラスミノーゲンを必要とする。また、プラス
ミンの関与しないフィブリン分解酵素としては、Ohlsso
n,K.等、Eur.J.Biochem.42,519−527（1974）;Baugh,R.
J.等Biochemistry,15,836−841（1976）;Plow,E.F.Bioc
him.Biophys.Acata.630,47−56（1980）;Andersson,K.
K.等、J.Chromatogr.192,236−239（1980）;Okamoto,U.
等、Thrombos.Haemostas.45,180−185（1981）；および
Nagamatsu,Y.等、Thrombos.Haemostas.51,243−247（19
84）に記載されているが、これらの酵素はいずれも基質
特異性、各種酵素阻害剤に対する応答性、および種々の
物理化学的性質において本発明の酵素と異なっている。
等のプラスミノーゲンアクチベーターはフィブリン分解
においてプラスミノーゲンを必要とする。また、プラス
ミンの関与しないフィブリン分解酵素としては、Ohlsso
n,K.等、Eur.J.Biochem.42,519−527（1974）;Baugh,R.
J.等Biochemistry,15,836−841（1976）;Plow,E.F.Bioc
him.Biophys.Acata.630,47−56（1980）;Andersson,K.
K.等、J.Chromatogr.192,236−239（1980）;Okamoto,U.
等、Thrombos.Haemostas.45,180−185（1981）；および
Nagamatsu,Y.等、Thrombos.Haemostas.51,243−247（19
84）に記載されているが、これらの酵素はいずれも基質
特異性、各種酵素阻害剤に対する応答性、および種々の
物理化学的性質において本発明の酵素と異なっている。
発明が解決しようとする課題 周知のごとく、血液中のフィブリン分解においてプラ
スミン系は重要な役割を担っており、またプラスミンの
前駆体であるプラスミノーゲンからプラスミンを生成す
る酵素であるプラスミノーゲンアクチベーター（ウロキ
ナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター）が血栓
溶解剤として臨床上利用されている。一方、フィブリン
分解活性と癌の転移とが関連していることも明らかにな
りつつある。また、近年ヒト等哺乳類の白血球および脾
臓中には蓄積するフィブリンを分解する、非プラスミン
系フィブリン分解酵素が存在することも判明してきた。
これらのことより、新たなフィルブリン溶解作用を有す
る酵素や癌の侵潤転移等の診断・治療に寄与する酵素の
開発が期待されている。
スミン系は重要な役割を担っており、またプラスミンの
前駆体であるプラスミノーゲンからプラスミンを生成す
る酵素であるプラスミノーゲンアクチベーター（ウロキ
ナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター）が血栓
溶解剤として臨床上利用されている。一方、フィブリン
分解活性と癌の転移とが関連していることも明らかにな
りつつある。また、近年ヒト等哺乳類の白血球および脾
臓中には蓄積するフィブリンを分解する、非プラスミン
系フィブリン分解酵素が存在することも判明してきた。
これらのことより、新たなフィルブリン溶解作用を有す
る酵素や癌の侵潤転移等の診断・治療に寄与する酵素の
開発が期待されている。
課題を解決するための手段 発明者らはフィブリン分解活性を有する新規なプロテ
アーゼの探索を目的として種々のヒト癌由来細胞株の無
血清培養上清について探索した結果、例えば、ヒト膵癌
由来細胞株（HPC−YO）がその培養上清中に、フィブリ
ンを分解する新規なプロテアーゼを産生する事実を見出
し、この知見に基いて本発明を完成した。
アーゼの探索を目的として種々のヒト癌由来細胞株の無
血清培養上清について探索した結果、例えば、ヒト膵癌
由来細胞株（HPC−YO）がその培養上清中に、フィブリ
ンを分解する新規なプロテアーゼを産生する事実を見出
し、この知見に基いて本発明を完成した。
（本発明酵素の性質） （１）作 用 フィブリンアガロースゲル中のフィブリンを分解す
る。
る。
（２）基質特異性 例えば、次に示すペプチド中の矢印で示した部分を切
断する。
断する。
インシュリンＢ鎖（ウシ、酸化型） 成長ホルモン放出因子（ヒト） （３）分子量及び等電点 ゲル過法により測定した分子量は約17万、SDS電気
泳動法により測定した分子量は約8.3万である。また、
等電点は6.0である。
泳動法により測定した分子量は約8.3万である。また、
等電点は6.0である。
（４）至適pH及び安定pH範囲 至適pHはpH6.0〜7.4であり、pHは5.0〜8.6の範囲で安
定である。
定である。
（５）至適温度 至適温度は約37℃である。
（６）熱安定性 56℃、５分で失活する。
（７）各種の酵素阻害剤に対する応答 フィブリンプレート法ではカルボキシルプロテアー
ゼ阻害剤であるペプスタチンＡにより25μg/mlで阻害さ
れる。
ゼ阻害剤であるペプスタチンＡにより25μg/mlで阻害さ
れる。
セリンプロテアーゼ阻害剤である弗化フェニルメチ
ルスルホニル（PMSF）により1mMのの濃度で阻害されな
い。
ルスルホニル（PMSF）により1mMのの濃度で阻害されな
い。
チオールプロテアーゼ阻害剤であるｐ−クロロ安息
香酸第二水銀（PCMB）、ヨードアセトアミドおよびエポ
キシサクシニル−Ｌ−ロイシルアミド（４−グアニド）
ブタン（Ｅ−64）によりそれぞれ1mM、1mMおよび280μ
Ｍの濃度で阻害されない。
香酸第二水銀（PCMB）、ヨードアセトアミドおよびエポ
キシサクシニル−Ｌ−ロイシルアミド（４−グアニド）
ブタン（Ｅ−64）によりそれぞれ1mM、1mMおよび280μ
Ｍの濃度で阻害されない。
金属キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（ED
TA）およびｏ−フェナントロリンにより1mMの濃度で阻
害されない。
TA）およびｏ−フェナントロリンにより1mMの濃度で阻
害されない。
一般的トリプシン阻害剤である大豆トリプシンイン
ヒビターおよびロイペプチンによりそれぞれ1mg/mlおよ
び0.5mg/mlの濃度で阻害されない。
ヒビターおよびロイペプチンによりそれぞれ1mg/mlおよ
び0.5mg/mlの濃度で阻害されない。
銅イオン（Cu2+）により1mMの濃度で阻害される。
これらの結果から、本発明のプロテアーゼは、カルボ
キシルプロテアーゼ型に属する可能性はあるが、ペプシ
ン、レニン、カテブシンＤおよびカテプシンＥ等とは異
なる。
キシルプロテアーゼ型に属する可能性はあるが、ペプシ
ン、レニン、カテブシンＤおよびカテプシンＥ等とは異
なる。
以上の性質から、本発明のプロテアーゼは、新規な酵
素である。
素である。
（製造方法） 本発明のプロテアーゼの製造に使用する細胞は、本発
明のプロテアーゼを産生するものであればいずれでもよ
く、例えばヒト膵癌由来細胞株・HPC−YOを挙げること
ができる。HPC−YOは、工業技術院微生物工業技術研究
所に昭和63年４月26日付で寄託され、受託番号：微工研
菌寄第10003号（FERMP−10003）が付与されている。
明のプロテアーゼを産生するものであればいずれでもよ
く、例えばヒト膵癌由来細胞株・HPC−YOを挙げること
ができる。HPC−YOは、工業技術院微生物工業技術研究
所に昭和63年４月26日付で寄託され、受託番号：微工研
菌寄第10003号（FERMP−10003）が付与されている。
本発明のプロテアーゼを産生するHPC−YOは人の膵臓
の腺癌から樹立された。この上皮様細胞は、例えば、10
％ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地で増加・維持で
きる。細胞の増殖温度は34〜39℃が好ましい。本細胞
は、通常頻用される、ジメチルスルフォキシドを５〜15
％およびウシ胎児血清を10〜20％、増殖培地に添加した
凍結保護剤を使用して、液体窒素容器で凍結保存出来
る。
の腺癌から樹立された。この上皮様細胞は、例えば、10
％ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地で増加・維持で
きる。細胞の増殖温度は34〜39℃が好ましい。本細胞
は、通常頻用される、ジメチルスルフォキシドを５〜15
％およびウシ胎児血清を10〜20％、増殖培地に添加した
凍結保護剤を使用して、液体窒素容器で凍結保存出来
る。
本発明のプロテアーゼの製造の際に使用する培地は、
前記の細胞が生育して、本発明のプロテアーゼを産生す
るものであればどのようなものでもよいが、酵素を容易
に精製するためには、無血清培地を使用することが好ま
しい。
前記の細胞が生育して、本発明のプロテアーゼを産生す
るものであればどのようなものでもよいが、酵素を容易
に精製するためには、無血清培地を使用することが好ま
しい。
（酵素活性の測定方法） フィブリノーゲン（ポバイト社）ウシ血漿由来プラス
ミノーゲンフリー）2gを100mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH
6.41）に溶解する。この溶液に100mlの純水を加え、４
℃にて一晩放置する。生成した沈澱を室温で過し、透
明な溶液を得る。
ミノーゲンフリー）2gを100mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH
6.41）に溶解する。この溶液に100mlの純水を加え、４
℃にて一晩放置する。生成した沈澱を室温で過し、透
明な溶液を得る。
この溶液に対して三分の一の容量の飽和硫安水溶液を
室温で、かきまぜながら徐々に加える。生成してきた白
い沈澱を遠心分離して、60mlの0.3MKCl水溶液に溶解
し、アンモニア水でpHを7.4に調整する。この水溶液を
４℃で0.3M KCl水溶液に対して三日間透析し、フィブリ
ノーゲンIIを得る。
室温で、かきまぜながら徐々に加える。生成してきた白
い沈澱を遠心分離して、60mlの0.3MKCl水溶液に溶解
し、アンモニア水でpHを7.4に調整する。この水溶液を
４℃で0.3M KCl水溶液に対して三日間透析し、フィブリ
ノーゲンIIを得る。
寒天（ディフコ社 特製）を42℃で純水に１％に溶解
したもの7mlと上記のフィブリノーゲンII水溶液2mlを混
合し、これにトロンビン（持田製薬社）10単位、20μ
を加えてすばやく撹拌する。直径10cmのシャーレに注ぎ
込み静置して固化させる。この白く固化したフィブリン
プレート上に直径7mmの穴を開け試料を入れる。試料を
穴に入れ37℃で24時間インキュベートしたのち、透明に
なったゾーンを観察する。
したもの7mlと上記のフィブリノーゲンII水溶液2mlを混
合し、これにトロンビン（持田製薬社）10単位、20μ
を加えてすばやく撹拌する。直径10cmのシャーレに注ぎ
込み静置して固化させる。この白く固化したフィブリン
プレート上に直径7mmの穴を開け試料を入れる。試料を
穴に入れ37℃で24時間インキュベートしたのち、透明に
なったゾーンを観察する。
次に、本発明を更に具体的に説明するために実施例を
記載する。
記載する。
実施例 １ 人の膵線癌原発巣からの腫瘍組織片を、カナマイシン
50μg/mlを添加したRPMI1640培地でよく洗い、細かくき
ざんだ。細切した組織片をステンレスチールメンシュ＃
80上におき、押し潰すことにより、単細胞にした。次に
ガーゼで過し、1200rpm,10分間遠心して、細胞を採取
した。10％ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地（ペニ
シリン100u/ml、ストレプトマイシン100μg/mlを含む）
に上記で得られた細胞を分散させ、37℃、５％CO2イン
キュベーター中で培養した。約３カ月間細胞を培養した
ところ、上皮様の細胞が得られた。この細胞からコロニ
ー形成法でクローンを分割し、ヒト膵癌由来細胞株HPC
−YOを得た。
50μg/mlを添加したRPMI1640培地でよく洗い、細かくき
ざんだ。細切した組織片をステンレスチールメンシュ＃
80上におき、押し潰すことにより、単細胞にした。次に
ガーゼで過し、1200rpm,10分間遠心して、細胞を採取
した。10％ウシ胎児血清を添加したRPMI1640培地（ペニ
シリン100u/ml、ストレプトマイシン100μg/mlを含む）
に上記で得られた細胞を分散させ、37℃、５％CO2イン
キュベーター中で培養した。約３カ月間細胞を培養した
ところ、上皮様の細胞が得られた。この細胞からコロニ
ー形成法でクローンを分割し、ヒト膵癌由来細胞株HPC
−YOを得た。
実施例 ２ 10.6g/のHAM−F12培地用粉末（FLOW社製および日水
製薬製）、ペニシリン100u/ml、ストレプトマイシン100
μg/ml、亜セレン酸ナトリウム10-8M/Iおよび重曹1.7g/
を含む液体培地を調製した。ヒト膵癌由来細胞株HPC
−YOを上記の培地中で、37℃、５％CO2インキュベータ
ー中で培養した。５日後、培養上清を採取し、0.45μｍ
のメンブランフィルターで過後、精製に使用するまで
−20℃で保存した。
製薬製）、ペニシリン100u/ml、ストレプトマイシン100
μg/ml、亜セレン酸ナトリウム10-8M/Iおよび重曹1.7g/
を含む液体培地を調製した。ヒト膵癌由来細胞株HPC
−YOを上記の培地中で、37℃、５％CO2インキュベータ
ー中で培養した。５日後、培養上清を採取し、0.45μｍ
のメンブランフィルターで過後、精製に使用するまで
−20℃で保存した。
実施例 ３ 上記の培養で得た培養上清10Lをラボカセット（日本
ミリポア社）により、分子量１万以下切捨てのメンブラ
ンフィルターで濃縮し、250mlとした。
ミリポア社）により、分子量１万以下切捨てのメンブラ
ンフィルターで濃縮し、250mlとした。
ペプスタチンＡ−AH−セファロース4Bを20cm×1.5cm
のカラムに充填し、0.2Mの食塩を含むpH7.4の20mMトリ
ス塩酸緩衝液で十分に緩衝化を行った。その後前述の濃
縮試料40mlをカラムに添加した。上述の緩衝液でカラム
を洗浄した後、1Mの食塩を含むpH8.5の20mMトリス塩酸
緩衝液および1Mの食塩を含むpH5.0の20mMリン酸緩衝液
で溶出された分画にフィブリン溶解活性があった。この
分画を集め濃縮した。図１に溶出の経過を示す。上記で
得た濃縮液を、0.2Mの食塩を含むpH7.4の20mMトリス塩
酸緩衝液で平衡化したTSK gel G 3000 SWカラム（東ソ
ー社、0.75×60cm、流速0.5ml/分）に添加し、ゲルクロ
マトグラフィーを行った。フィブリン溶解活性のある分
画を集めた。分子量を分子量マーカー（オリエンタル
社）のキャリブレーションカーブから求めると17万とな
った。図２に溶出の経過を示す。
のカラムに充填し、0.2Mの食塩を含むpH7.4の20mMトリ
ス塩酸緩衝液で十分に緩衝化を行った。その後前述の濃
縮試料40mlをカラムに添加した。上述の緩衝液でカラム
を洗浄した後、1Mの食塩を含むpH8.5の20mMトリス塩酸
緩衝液および1Mの食塩を含むpH5.0の20mMリン酸緩衝液
で溶出された分画にフィブリン溶解活性があった。この
分画を集め濃縮した。図１に溶出の経過を示す。上記で
得た濃縮液を、0.2Mの食塩を含むpH7.4の20mMトリス塩
酸緩衝液で平衡化したTSK gel G 3000 SWカラム（東ソ
ー社、0.75×60cm、流速0.5ml/分）に添加し、ゲルクロ
マトグラフィーを行った。フィブリン溶解活性のある分
画を集めた。分子量を分子量マーカー（オリエンタル
社）のキャリブレーションカーブから求めると17万とな
った。図２に溶出の経過を示す。
上記で得たフィブリン溶解活性のある分画を、0.2Mの
食塩を含むpH7.4の20mMトリス塩酸緩衝液で平衡化したM
onoQ HR 5/5陰イオン交換カラム（ファルマシア社、0.5
×5cm、流速0.8ml/分）に添加した。0.2〜1.0Mの食塩を
含むpH7.4の20mMトリス塩酸緩衝液で、濃度勾配法によ
り溶出した。フィブリン溶解活性のある分画を集めた。
図３に溶出の経過を示す。
食塩を含むpH7.4の20mMトリス塩酸緩衝液で平衡化したM
onoQ HR 5/5陰イオン交換カラム（ファルマシア社、0.5
×5cm、流速0.8ml/分）に添加した。0.2〜1.0Mの食塩を
含むpH7.4の20mMトリス塩酸緩衝液で、濃度勾配法によ
り溶出した。フィブリン溶解活性のある分画を集めた。
図３に溶出の経過を示す。
上記の方法で得たプロテアーゼはポリアクリルアミド
−SDSグル電気泳動で分析した結果8.3万の分子量を示し
た。
−SDSグル電気泳動で分析した結果8.3万の分子量を示し
た。
こうして、10Lの培養上清より、0.45mgのプロテアー
ゼを得た。
ゼを得た。
実施例 ４ 上記で得た精製酵素の、50mM食塩を含む50mMトリス塩
酸緩衝液（pH7.4）溶液（全体積2ml）の81μ（酵素濃
度0.225mg/ml）に、前記「酵素の性質の項，（７）各種
の酵素阻害剤に対する応答」に於ける各酵素阻害剤水溶
液９μを最終濃度が各々記載のように加えて室温（約
25℃）にて20分放置した。本混合液80μをとり、フィ
ブリンプレートの穴に入れ37℃、20時間インキュベート
した後、透明になったゾーンの有無により阻害の有無を
判定した。
酸緩衝液（pH7.4）溶液（全体積2ml）の81μ（酵素濃
度0.225mg/ml）に、前記「酵素の性質の項，（７）各種
の酵素阻害剤に対する応答」に於ける各酵素阻害剤水溶
液９μを最終濃度が各々記載のように加えて室温（約
25℃）にて20分放置した。本混合液80μをとり、フィ
ブリンプレートの穴に入れ37℃、20時間インキュベート
した後、透明になったゾーンの有無により阻害の有無を
判定した。
実施例 ５ 前記「酵素の性質」の項，（２）基質特異性に於ける
各々の基質ペプチド2nmoleを、50mMトリス塩酸緩衝液
（pH7.4）35μに溶解し、実施例３で得た精製酵素の5
0mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）を酵素と基質の重量比が
１対25となるように加えて37℃、１または２時間インキ
ュベートした後、反応混合物の５分の１を分取した。た
だちに0.1％トリフルオロ酢酸を加えてpHを約３とし酵
素反応を停止した。本反応混合液を0.1％トリフルオロ
酢酸で平衡化しておいたTSKgelODS−120Tカラム（東ソ
ー社、0.46×25cm、流速1ml/分）に添加し、0.1％トリ
フルオロ酢酸を含む０〜60％のアセトニトリル水溶液で
濃度勾配法により溶出した。かく切断断片に対応するピ
ークを分取し、アミノ酸分析（ピコタグ法）により、各
々のアミノ酸組成を調べ、アミノ酸配列既知である分解
前の各基質ペプチドとの比較にり切断箇所を決定した。
各々の基質ペプチド2nmoleを、50mMトリス塩酸緩衝液
（pH7.4）35μに溶解し、実施例３で得た精製酵素の5
0mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）を酵素と基質の重量比が
１対25となるように加えて37℃、１または２時間インキ
ュベートした後、反応混合物の５分の１を分取した。た
だちに0.1％トリフルオロ酢酸を加えてpHを約３とし酵
素反応を停止した。本反応混合液を0.1％トリフルオロ
酢酸で平衡化しておいたTSKgelODS−120Tカラム（東ソ
ー社、0.46×25cm、流速1ml/分）に添加し、0.1％トリ
フルオロ酢酸を含む０〜60％のアセトニトリル水溶液で
濃度勾配法により溶出した。かく切断断片に対応するピ
ークを分取し、アミノ酸分析（ピコタグ法）により、各
々のアミノ酸組成を調べ、アミノ酸配列既知である分解
前の各基質ペプチドとの比較にり切断箇所を決定した。
実施例 ６ 至適pHは以下のような実験から求めた。実施例３で得
た精製酵素の水溶液（酵素濃度0.225mg/ml）30μを各
々30μの0.1Mクエン酸・塩酸緩衝液（pH3.4）、0.1M
リン酸緩衝液（pH6.0）、0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.
4）、0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、および0.1Mトリ
ス塩酸緩衝液（pH8.5）に加えた。
た精製酵素の水溶液（酵素濃度0.225mg/ml）30μを各
々30μの0.1Mクエン酸・塩酸緩衝液（pH3.4）、0.1M
リン酸緩衝液（pH6.0）、0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.
4）、0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）、および0.1Mトリ
ス塩酸緩衝液（pH8.5）に加えた。
本混合液50μを前記（酵素活性の測定方法）に於け
るフィブリンプレートの穴に入れ37℃、24時間インキュ
ベートした後、透明になったゾーンの面積を測定した。
るフィブリンプレートの穴に入れ37℃、24時間インキュ
ベートした後、透明になったゾーンの面積を測定した。
実施例 ７ 至適温度は以下のような実験から求めた。実施例３で
得た精製酵素の50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）溶液
（酵素濃度0.225mg/ml）80μを各々前記（酵素活性の
測定方法）に於けるフィブリンプレートの穴に入れ、25
℃、37℃、および56℃で24時間インキュベートした後、
透明になったゾーンの面積を測定した。
得た精製酵素の50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）溶液
（酵素濃度0.225mg/ml）80μを各々前記（酵素活性の
測定方法）に於けるフィブリンプレートの穴に入れ、25
℃、37℃、および56℃で24時間インキュベートした後、
透明になったゾーンの面積を測定した。
実施例 ８ 熱安定性は以下のような実験から求めた。実施例３で
得た精製酵素の50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）溶液
（酵素濃度0.225mg/ml）80μを各々56℃で、５、10、
15、20、および30分予めインキュベートした。本液を前
記（酵素活性の測定方法）に於けるフィブリンプレート
の穴に入れ、37℃で24時間インキュベートした後、透明
になったゾーンの面積を測定した。
得た精製酵素の50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）溶液
（酵素濃度0.225mg/ml）80μを各々56℃で、５、10、
15、20、および30分予めインキュベートした。本液を前
記（酵素活性の測定方法）に於けるフィブリンプレート
の穴に入れ、37℃で24時間インキュベートした後、透明
になったゾーンの面積を測定した。
実施例 ９ 安定pH範囲はカラムクロマトグラフィーの溶出条件よ
り求めた。
り求めた。
第１図は本発明のプロテアーゼのペプスタチンＡ−AH−
セファロース4Bを用いるカラムクロマトグラフィーにお
ける溶出経過を示す。第２図はTSKgel3000SWカラムを用
いる高速ゲルクロマトグラフィーにおける溶出経過を示
す。第３図はMonoQ HR 5/5陰イオン交換カラムを用いる
クロマトグラフィーにおける溶出経過を示す。
セファロース4Bを用いるカラムクロマトグラフィーにお
ける溶出経過を示す。第２図はTSKgel3000SWカラムを用
いる高速ゲルクロマトグラフィーにおける溶出経過を示
す。第３図はMonoQ HR 5/5陰イオン交換カラムを用いる
クロマトグラフィーにおける溶出経過を示す。
Claims (2)
- 【請求項１】次の性質を有するプロテアーゼ： （１）作用 フィプリンアガロースゲル中のフィブリンを分解する。 （２）基質特異性 次に示すペプチド中の矢印で示した部分を切断する。 インシュリンＢ鎖（ウシ、酸化型） 成長ホルモン放出因子（ヒト） （３）分子量及び等電点 ゲル過法により測定した分子量は約17万、SDS電気泳
動法により測定した分子量は約8.3万である。 （４）至適pH及び安定pH範囲 至適pHはpH6.0〜7.4であり、pH5.0〜8.6の範囲である。 （５）至適温度 至適温度は約37℃である。 （６）熱安定性 56℃、５分で失活する。 （７）各種の酵素阻害剤に対する応答 フィブリンプレート法ではカルボキシルプロテアーゼ
阻害剤であるペプスタチンＡにより25μg/mlで阻害され
る。 セリンプロテアーゼ阻害剤である弗化フェニルメチル
スルホニルにより1mMの濃度で阻害されない。 チオールプロテアーゼ阻害剤であるｐ−クロロ安息香
酸第二水銀、ヨードアセトアミドおよびエポキシサクシ
ニル−Ｌ−ロイシルアミド（４−グアニド）ブタンによ
りそれぞれ1mM、1mMおよび280μＭの濃度で阻害されな
い。 金属キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸および
ｏ−フェナントロリンにより1mMの濃度で阻害されな
い。 一般的トリプシン阻害剤である大豆トリプシンインヒ
ビターおよびロイペプチンによりそれぞれ1mg/mlおよび
0.5mg/mlの濃度で阻害されない。 - 【請求項２】ヒト膵癌由来細胞株HPC−YO。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63106138A JP2620299B2 (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | 新規プロテアーゼ及び該プロテアーゼ産生細胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63106138A JP2620299B2 (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | 新規プロテアーゼ及び該プロテアーゼ産生細胞株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01277487A JPH01277487A (ja) | 1989-11-07 |
| JP2620299B2 true JP2620299B2 (ja) | 1997-06-11 |
Family
ID=14426014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63106138A Expired - Lifetime JP2620299B2 (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | 新規プロテアーゼ及び該プロテアーゼ産生細胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2620299B2 (ja) |
-
1988
- 1988-04-28 JP JP63106138A patent/JP2620299B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01277487A (ja) | 1989-11-07 |
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