NO169497B

NO169497B - Fremgangsmaate for fremstilling av en serumavhengig human cellelinje

Info

Publication number: NO169497B
Application number: NO83834866A
Authority: NO
Inventors: Elaine Lynette Wilson
Original assignee: Bio Response Inc
Priority date: 1982-12-30
Filing date: 1983-12-29
Publication date: 1992-03-23
Also published as: IL70573A0; PT77897B; US4798796A; DK607083D0; ES8600389A1; FI81377B; ES528570A0; EP0113319A3; EP0113319B1; KR840006825A; DE3382390D1; PH26514A; DK607083A; KR900008740B1; NO169497C; EP0113319A2; HU197766B; GR78779B; PT77897A; NZ206699A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av en serum-uavhengig human cellelinje. Disse humane cellelinjene er følgelig istand til å formere seg i et fravær av serum eller andre makromolekylære vekstfaktorer.

Med utviklingen av rekombinant DNA teknologi og cellekultur-teknikk i de senere år, har det vært mulig å få en kontroll-

ert biologisk fremstilling av anvendbare og farmakologisk interessante forbindelser, da spesielt proteiner så som inter-feron, insulin og forskjellige antigener. Det har vært et økende behov for utvikling av biologiske systemer som sikrer en produksjon i stor skala av andre proteiner som er av biologisk og spesielt farmakologisk interesse.

Ved begrepet "protein" slik det brukes her, forstås polypeptider med høy molekylvekt, d.v.s. over 34 000, og polypeptider med lavere molekylvekt, f.eks. under ca. 34 000, og derivater av slike forbindelser, f.eks. glykosylerte, fosfaterte og sulfaterte derivater.

Med utviklingen av rekombinant DNA teknologi har det vært

mulig å innføre de gener som koder for et ønsket .protein inn i forskjellige typer mikroorganismer, og deretter kan man indusere nevnte mikroorganismer til å syntetisere proteinet. Mange biologisk viktige molekyler kan imidlertid ikke synti-tiseres ved hjelp av denne teknologi. Dette gjelder spesielt de molekyler hvis struktur ikke er kjent. I de fleste tilfeller vil de proteiner som skilles ut av de genetisk modi-fiserte mikroorganismer ikke være en tro kopi av de auten-

tiske molekyler, men skiller seg fra sistnevnte med hensyn til N og C sluttgruppene i aminosyresekvensen. Dette skyldes selve eksperimentmetodikken som brukes under den rekombinante DNA teknologien. Videre kan glykosylerte proteiner ikke

fremstilles av mikroorganismer så som bakterier og til en viss grad også gjær, som mangler det nødvendige cellemaskineri. I mange slike tilfeller kan man med fordel bruke forskjellige celle- og vevskulturteknikker. Etter som cellekulturene stammer fra intakte organismer, så vil de proteiner som fremstilles av cellekulturene tilsvare de naturlige forekommende proteiner i alle henseende.

Det har imidlertid vist seg at kultiveringen av celler fra høyere organismer, f.eks. fra pattedyr, i en stor skala er et meget vanskelig problem. De næringskrav som stilles av slike celler er meget strengere enn de som man finner for de fleste mikroorganismer som kan oppformeres på kunstige media. Det vekstmedium som man hittil har brukt for de fleste typer pattedyrceller har innbefattet serum som er meget kostbart. Prisen på serumet bestemmer i høy grad cellekultur-teknikkens økonomi og vil begrense dens anvendbarhet for fremstilling av proteiner som ellers ikke er tilgjengelig. Enkelte celler kan dyrkes i et serumfritt medium tilsatt hor-moner eller vekstfaktorer så som transferrin, insulin, epider-mal, fibroblast eller andre nervevekstfaktorer. I de fleste tilfeller vil imidlertid cellene ikke formere seg i det uende-lige i disse serumfrie media.

Cellelinjer som formerer seg i et serumfritt medium er av spesiell viktighet for fremstilling av slike proteiner som lett brytes ned eller forurenses av serum' eller andre tilsatte vekstfaktorer. Slike proteiner er f.eks. pro-vevsplasminogenaktivator (pro-TPA).

Det har i den senere tid vært utført mye forskning omkring

de såkalte plasminogenaktivatorer og man har kunnet påvise at de klinisk kan anvendes på oppløsning av blodklumper. Blodklumper er sammensatt av fibrin som er dannet fra sin oppløslige forløper fibrinogen under påvirkning av enzymet trombin. Slike blodklumper er en vesentlig årsak til dødsfall hos mennesker, og det er meget vanskelig å oppløse blodklumpene uten sideeffekter.

Pattedyrplasma inneholder et enzymatisk system som er i stand til å oppløse fibrinet i blodklumpene. En komponent i det fibrinolytiske systemet består av enzymene, plasminogenaktivatorer, som omdanner plasminogen (en inaktiv proenzymform av plasmin) til det proteolytiske enzymet plasmin. Plasmin vil deretter nedbryte fibrinnettverket i klumpene og danne oppløslige produkter. I de tilfeller hvor kroppens trombolytiske potensial er utilstrekkelig til å fjerne de dannete intravaskulære tromber, f.eks. hos pasienter som lider av tromboembolisme eller har komplikasjoner i forbindelse med operasjoner, så kan det være uomgjengelig nødvendig å tilføre ekstra trombolytiske midler.

Det er to aktivatorer for humant plasminogen som er kommersielt tilgjengelig for trombolytisk terapi, d.v.s. urokinase som er en serinprotease som isoleres fra menneskeurin eller dyrket nyreceller, og streptokinase, som er et bakterieprotein som oppnås fra forskjellige typer streptokokker. Etter som ingen av enzymene har spesiell affinitet for fibrin, så vil en trombolyse med disse forbindelsene ofte være forbundet med en systemisk aktivering av plasminogen som så kan gi en indi-skriminerende nedbrytning av koaguleringsproteiner og dermed får man en betydelig øket risiko for indre blødning under behandlingen. En annen ulempe ved urokinase er at forbindelsen har et meget kort såkalt halvliv etter injeksjon i pasi-entene. P.g.a. dette er det nødvendig med meget høye doser av urokinase for å få en effektiv fibrinolyse. Streptokinase er et protein som er fremmed for menneskekroppen, og det gir lett opphav til fremstilling av nøytraliserende antistoffer som blokkerer streptokinasens virkning, foruten at man ofte får allergiske reaksjoner som kan være meget skadelige og i visse tilfeller også fatale.

En annen gruppe plasminogenaktivatorer, såkalt vevsplasminogen-aktivatorer (heretter betegnet TPAs) er kjent fra de fleste humane vevstyper. TPA som stammer fra forskjellige typer vev har antagelig forskjellige molekylære egenskaper, men de opptrer immunologisk på samme måte. De skiller seg fra urokinase med hensyn til sine kjemiske og immunologiske egenskaper, og de har en sterkt forbedret fibrinolytisk virkning i nærvær av fibrin foruten at de har høy affinitet for denne forbindelsen (konferer S. Thorsen et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 28, 65-74 (1972), D.C. Riijken og D. Coilen, J. Biol. Chem. 256, 7035-7041 (1981)). P.g.a. sin høye affinitet for fibrin, så er virkningen av nevnte TPA begrenset til selve blodklumpen, hvorved man i vesentlig grad reduserer faren for ukontrollert blødning.

Det følgende skjema viser forholdet mellom plasminogen, plasmin, fibren og forskjellige plasminogenaktivatorer.

Nylig ble to pasienter som led av koagulasjonsforstyrrelser med godt resultat behandlet med et TPA isolert fra vevsvæsken fra en human melanomacellelinje (konferer W. Weimar et al., The Lancet (1981), 1018-1020). Det er to molekylære former av TPA: den aktive to-kjedete formen og en inaktiv enkjedet form (forløper TPA eller "pro-TPA"; for referanse se D.C. Rijken og D. Coilen, loe. eit.; D.C. Rijken et al., J. Biol. Chem. 257, 2920-2925 (1982) og P. Wallén et al., Progr. Fibrin. 5, 16-23 (1982)).. Pro-TPA kan omdannes til aktivt TPA ved inkubering med fibrin eller ved hjelp av plasmin som så ved en kaskadelignende reaksjon utløser sin egen syntese.

Kilder for humant TPA innbefatter ekstrakter av forskjellige humane vevstyper (som ikke er tilgjengelig for kommersiell utnyttelse) og for forskjellige humane kreftceller som har vist seg å frigjøre TPA i varierende grad (E.L. Wilson et al., Cancer Research 40, 933-938 (1980); E.L. Wilson et al.,

Blood 61, 568-574 (1983)). I en nylig innsendt patentsøknad

(EP 41766 oppfinner D. Coilen, D.C. Rijken og 0. Matsuo)

er det beskrevet et TPA med en molekylvekt på 72 000 og som ble isolert fra en kultivert human melanomacellelinje (Bowes), og som antagelig er identisk med det TPA som allerede er beskrevet av E.L. Wilson et al. (Cancer Research 40, 933-938

(1980)). På samme måte som andre hittil kjente cellelinjer så krever denne humane melanomacellelinjen, (Bowes) et nærvær av serum for vekst, f.eks. serum fra kalvefostre. Et slikt serum er imidlertid meget kostbart og inneholder dessuten proteinaktige komponenter som forurenser det fremstilte TPA og hindrer at man kan isolere store mengder av pro-TPA. Dette fører til en meget kostbar og arbeidskrevende rensing av enten TPA eller pro-TPA.

Foreliggende oppfinnelse unngår de ulemper som man hittil har hatt i kjente cellelinjer og gjør det mulig å fremstille nye humane cellelinjer som gror i et fravær av serum eller andre ekstra tilsatte makromolekylære vekstfaktorer.

Fremstilling av serumuavhenglge humane cellelin. ler Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåte for fremstilling av nye humane cellelinjer. Disse kan dyrkes i et fravær av serum eller andre ekstra tilsatte makromolekylære vekstfaktorer så som insulin, transferrin, epidermale vekstfaktorer etc. Cellene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse er i stand til å feste seg til vevskaret selv i et fravær av serum eller fibronektin. Hovedfordelene ved de nye cellelinjer er: det er en enorm reduksjon av prisen ettersom serum, f.eks. serum fra kalvefostre, er meget kostbart,

man får en meget enkel og billig rensing av produktene fremstilt ved hjelp av de nye cellelinjer ettersom det ikke er noen serumforurensninger i mediet, og produktet kan lett renses fra det serumfrie mediet, og

det er mulig å fremstille proteiner som på grunn av et nærvær av proteaser i serum ikke kan oppnås eller fremstilles (eller som bare kan fremstilles i meget dårlig utbytte) fra serum-avhengige cellelinjer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av en serumuavhengig human cellelinje, kjennetegnet ved at man: a. fjerner serumholdig medium fra en kultur av en serumavhengig human melanoma-cellelinje som er en TPA og/eller pro-TPA produserende Bowes I cellelinje og erstatter nevnte medium med et serumfritt medium,

b. lar cellene vokse inntil det er etablert én serumuavhengig Bowes II cellelinje, idet det serumfrie medium er fritt for eksogene makromolekylære vekstfaktorer.

Ved begrepet "serumfritt medium" forstås her et medium som ikke bare er renset for serum, men også eventuelle andre makromolekylære vekstfaktorer. En cellelinje som følgelig gror i et fravær av både serum og andre eksogene makromolekylære vekstfaktorer vil følgelig bli betegnet som "en serum-uavhengig cellelinje".

Den serumavhengige humane cellelinje som brukes som "utgangs-material" i overnevnte fremgangsmåte, er spesielt en kontinuerlig cellelinje og kan stamme fra humant neoplasma, så som melanoma, ondartet teratoma, sarkoma, glioblastoma, meningi-oma, neuroblastoma, lipoma, adenoma, karsinoma fra bryst eller karsinoma fra blæren. Foretrukne cellelinjer er de som fremstiller TPA og/eller pro-TPA. I en foretrukken ut-førelse av foreliggende oppfinnelse bruker man en human melanoma cellelinje da spesielt Bowes melanoma cellelinje (i det etterfølgende betegnet "Bowes I" cellelinje). Man kan også bruke cellelinjer avledet fra normalt humant vev som "ut-gangsmaterial", skjønt disse har en begrenset livslengde (veksten stopper vanligvis nokså raskt etter f.eks. 50 celle-delinger) , men disse er mindre viktige i foreliggende oppfinnelse .

Det serumfrie mediet er f.eks. et kommersielt tilgjengelig medium, så som et minimalt Eagle<1>s medium (MEM), MEM-Spinners medium, Dulbecco<1>s modifisert Eagle 1s medium (DMEM) eller Roswell Park Memorial Institute kulturmedium (RPMI)-1640.

Man kan også bruke andre ekvivalente media. Detserumfrie mediet kan inneholde en tilstrekkelig mengde av et buffrings-middel, så som natriumhydrogenkarbonat for å opprettholde en stabil pH. Etter som cellene i kulturen ikke har et inn-viklet immunforsvarssystem som er en integral del av den intakte organismen, så kan man også tilsette antibiotika så

som penicillin, streptomycin, tylocin og lignende for å

hindre en infeksjon av kulturen.

Normale humane celler vil vanligvis bare gro når de fester

seg til en overflate, mens svulstceller ofte lettere lar seg dyrke i suspensjon. Laboratoriekar for såkalte tilkoblingsavhengige celler er velkjente i industrien. De kan variere fra "mikro-brønn" plater til flatbunnete petriskåler til vevskolber av forskjellige størrelser eller sylinderiske flasker, som ofte kalles rulleflasker, som roterer kontinuerlig. Tilkoblingsuavhengige celler kan dyrkes i kultiveringskar som omrøres mekanisk eller hvor man opprettholder en homogen suspensjon ved blanding ved hjelp av en gasstrøm.

Foreliggende fremgangsmåte kan f.eks. gjennomføres i en vevskulturkolbe som inneholder et sammenløpende eller nesten sammenløpende monolag av en human cellelinje, f.eks. en human melanomacellelinje, da spesielt melanoma Bowes I, som er dyrket i et serumholdig næringsmedium. Den videre fremgangsmåten utføres i en fuktig atmosfære inneholdende karbondioksyd, f.eks. i'en fuktig atmosfære med ca. 95% luft og ca. 5% C02 ved temperaturer mellom 35 og 40°C, da spesielt ca. 37°C. Det serumholdige medium kastes og erstattes med et serumfritt medium, f.eks. RPMI-1640 eller DMEM. Etter et par døgn vil cellene begynne å løsne seg fra overflaten på kolben og flyte fritt i mediet. Etter et par uker vil mesteparten av cellene være døde i et medium som ikke inneholder serum eller eventuelt andre vekstfaktorer. For å holde cellene i levende tilstand tilsettes behandlet medium til kulturene under tilpasnings-perioden til det serumfrie mediet. Behandlet medium kan oppsamles fra en tilsvarende cellekultur som f.eks. holdes i et tidsrom på 24 timer i et serumfritt medium. Serumfritt medium inneholdende behandlet medium må byttes med jevne mellomrom, f.eks. fra hvert 3 til hvert 7 døgn inntil celletallet har økt tilstrekkelig, d.v.s. ca. 1/3 av karoverflaten er dekket.

På dette trinn er det ikke nødvendig med et behandlet medium lenger, og cellene tilføres serumfritt medium alene. Når man har fått dannet et sammenflytende monolag, kan cellene over-føres, f.eks. ved kraftig banking på karet hvorved de fleste cellene vil løsne fra overflaten, eller ved hjelp av etylen-diamintetraeddiksyre (EDTA) i det man tar hensyn til at re-inokkuleringen av friske kulturkolber utføres ved en tilstrekkelig høy celletetthet til at man sikrer overlevning. Vekst og overføring av cellene ved sammenløpning fortsettes inntil cellene vokser som et stabilt tilfestet monolag. På denne måten vil man i løpet av et tidsrom fra 1 til 6 måneder, mer spesielt fra 1 til 3 måneder kunne etablere en serumuavhengig cellelinje.

Som et alternativ kan en serumuavhengig cellelinje etableres uten tilsetning av behandlet medium oppsamlet fra en tilsvarende serumavhengig cellekultur, forutsatt at celletettheten er tilstrekkelig høy. I dette tilfelle vil cellene selv modifisere sitt eget medium. Celletettheten kan holdes høyt ved at man ikke kaster ikke-tilfestete celler. Etter et par døgn i det serumfrie mediet vil størstedelen av cellene løsne fra selve vevskulturkolben, og de vil flyte fritt i mediet som beskrevet ovenfor. De cellene som er tilfestet veggen vil forbli i levende tilstand så lenge de holdes ved en tilstrekkelig høy tetthet. Hvis det serumfrie mediet inneholdende ikke-tilf estete, men levende celler sentrifugeres, hvoretter celle-pelleten tas opp i friskt serumfritt medium og tilsettes kolben inneholdende de få tilfestete cellene, så vil disse cellene igjen begynne å vokse. I dette tilfelle vil cellene i suspensjonen sammen med tilfestete celler selv modifisere sitt eget medium.

Etter 2 til 3 uker vil celler som tidligere var i suspensjonen igjen begynne å feste seg til overflaten av kulturkolben,

og disse celler vil etter hvert bli tilfestet og kan overføres så snart de begynner å flyte sammen til et monolag ved kraftig banking eller ved hjelp av EDTA som beskrevet ovenfor.

En annen fremgangsmåte for fremstilling av "modifisert eller justert medium" i nærvær av tilfestete celler, består i at man erstatter en del av det serumfrie mediet, ca. halvparten, med friskt serumfritt medium og gjentar denne fremgangsmåten hver 24. til 72. time inntil man har oppnådd tilstrekkelig høy celletetthet (dette skjer etter ca. 3 uker). Cellene kan så overføres, f.eks. ved hjelp av EDTA. Ved første overføring vil det friske serumfrie mediet suppleres med ca. 40% av det justerte medium fjernet fra en kultur før EDTA-behandlingen, hvoretter cellene fortsatt vil dele seg i et fravær av det justerte medium. Celletettheten må være tilstrekkelig høy, d.v.s. 30% eller mer, fortrinnsvis ca. 60 til 70% av sammenløpning.

Ved lav celletetthet, d.v.s. ca. 20% av sammenløpning eller ved ca. 1 x 10"<*> celler pr. ml i forbindelse med suspensjonskulturer, så vil cellene trenge justert medium for vekst.

Ved høy celletetthet, d.v.s. fra ca. 60 til ca. 70% av sammen-5 5

løpning eller fra ca. 2 x 10 til 5 x 10 eller flere celler pr. ml i forbindelse med suspensjonskulturer, så vil cellene vokse og dele seg i et serumfritt medium uten tilsetning av såkalt justert medium.

De serumuavhengige cellelinjene kan dyrkes som tilfestete kulturer, f.eks. på innerveggen av et laboratoriekar, eller som suspensjonskulturer.

Mutante cellelinjer kan oppnås fra cellelinjer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, og disse er i stand til å formere seg i et serumfritt kulturmedium. Mutanter dannes spontant eller kan fremstilles på en i seg selv kjent måte. F.eks. kan mutanter oppnås på kjemisk måte, f.eks. ved påvirkning av et mutagen så som N-metyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin eller åkersennepsoljer, eller ved bestråling, f.eks. ved ultrafiolette stråler eller ved røntgenstråler.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for å dyrke den serum cellelinjen Bowes II, som produserer TPA og/eller pro-TPA, kjennetegnet ved at dyrkingen utføres i fravær av serum og i fravær av eksogene makromolekylære vekstfaktorer, og eventuelt omdannes det pro-TPA som er tilstede i den fremstilte blandingen enzymatisk til TPA, og eventuelt tilsettes en proteaseinhibitor under isolering og rensing, og den siste rensingen utføres i nærvær av en inhibitor som selektivt hemmer TPA.

Foretrukne serumuavhengige cellelinjer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, er de som fremstiller TPA og/eller pro-TPA.

De nye humane cellelinjer og mutante cellelinjer som kan fremstilles ved hjelp av foreliggende oppfinnelse, har ubegrenset livslengde og kan brukes på samme måte som de opprinnelige serumavhengige cellelinjer, f.eks. for kommersiell produksjon av biologisk aktive forbindelser så som proteiner, f.eks. interferoner, antigener, angiogeniske faktorer og da spesielt plasminogenaktivatorer, under serumfrie betingelser eller for fremstilling av hybridomacellelinjer.

Som nevnt ovenfor er det foretrukket at de melanomacellelinjer Bowes I som er kjent for å utskille store mengder vevsplasminogenaktivator (konfr. EP 41766) brukes som "utgangsmateri-aie" for fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

De nye serumuavhengige cellelinjene skiller seg fra de tilsvarende foreldrecellelinjene som er serumavhengige på mange måter. F.eks. skiller Bowes II cellene seg fra de forutgående Bowes I melanomceliene ved sitt morfologiske utseende.

Når de undersøkes under fasekontrastmikroskop fremgår det at mitosene er langt mer frekvente i Bowes II cellene enn i Bowes I cellene som er blitt dyrket uten serum. Tilsetning av serum til Bowes II celler gir en markert morfologisk forandring.

De foretrukne serumuavhengige cellelinjer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, da spesielt nevnte Bowes II cellelinjer, utskiller store mengder vevsplasminogenaktivator, som i motsetning til de serumavhengige cellelinjer som var forløperen, f.eks. Bowes I-cellelinjer, i alt vesentlig foreligger i proaktivatorformen. Foruten TPA og pro-TPA vil de nye cellelinjene også fremstille andre farmakologisk verdifulle forbindelser. F.eks. har det vist seg at Bowes II cellelinjen produserer sin egen vekstfaktor og en svulst-nekrotisk faktor.

Dyrking av serum- uavhengige humane celler og innhøsting

av kultiveringsvæsker

Serumuavhengige humane celler ble i alt vesentlig dyrket

som beskrevet ovenfor. F.eks. ble Bowes II celler tilsatt vevskulturkolber i tilstrekkelig celletetthet til at man sikret en overleving, hvoretter de ble dyrket i et serumfritt medium, f.eks. RPMI-1640 tilsatt antibiotika, og ved en temperatur mellom 35 og 40°, mer spesielt 37°C i en fuktig atmosfære av luft inneholdende ca. 5% karbondioksyd. Inn-høstingen av væskene startet så snart cellene begynte å feste seg, og kan gjentas f.eks. med 24 timers mellomrom. Daglig innsamling av væskene kan fortsette inntil sammenløpningen av monolagene gjør det nødvendig å overføre kulturen til nye kar. Etter som formeringshastigheten på Bowes II celler dyrket i et serumfritt medium er meget lav(doblingstiden er ca. 6 døgn sammenlignet med en doblingstid på ca. 1 døgn for foreldre Bowes I melanomceller), så er overføring bare nødvendig med visse mellom ( d.v.s. med ca. 4 til 6 ukers mellomrom) og de innhøstete væsker kan oppsamles fra en kolbe i et tidsrom på fra 3 til 6 måneder, hvorved man besparer betydelig tid og omkostninger og gjør innsamlingen av væskene til en relativt enkel oppgave. Det er også mulig å bedre fra tid til annen formeringshastigheten på Bowes II cellene ved å tilsette en vekstfaktor, f.eks. insulin til dyrkningsmediet.

Petriskåler, vevskulturkolber og andre kar som kan brukes i laboratoriet vil vanligvis ikke ha et tilstrekkelig stort forhold mellom overflateareal og volum til at man praktisk kan utvikle en kultur i stor skala av de serumuavhengige cellene festet til overflaten. For produksjon i stor skala vil man måtte øke areal til volumforholdet på forskjellige måter som er velkjente. F.eks. kan cellene dyrkes på svamp-aktige polymerer, på stabler av tynne plater, på små perler o. 1.

Alternativt kan de nye serumuavhengige cellelinjene, så som Bowes II, dyrkes i suspensjon. Det er velkjent at man kan bruke fermenteringskar i stor skala for kultivering i suspensjon, og slike fermenteringskar er utviklet for enkelt-cellemikroorganismer. For å holde cellene jevnt suspendert i mediet og for å fordele de oppløst gasser ( f.eks. oksygen) jevnt i hele mediet, er det nødvendig med omrøring. Dette kan f.eks. utføres ved hjelp av vanlige turbinrørere, propell-rørere eller lignende, vibroblandere som oscillerer verti-kalt o.l. Langsom omrøring er foretrukket for å hindre at cellene blir ødelagt. Homogen omrøring kan også opprettholdes ved å føre en gasstrøm gjennom kulturen.

Innhøstete væsker fra de serumuavhengige humane celler, så som Bowes II celler, må sentrifugeres for å fjerne løsnete celler og celleavfall. Det er fordelaktig å tilsette et ikke-ionisk overflateaktivt middel eller vaskemiddel til mediet for å hindre en absorbsjon av TPA, pro-TPA og andre verdifulle forbindelser som utskilles av cellene, til karets overflate og for å sikre den enzymatiske aktiviteten. Det ikke-ioniske overflateaktive middel så som Triton X-100<®> eller Tween 80^ kan tilsettes til en sluttkonsentrasjon på ca. 0,01 til 0,1%. Ettersom man oppnår den høyeste aktiviteten ved en pH på mellom 5,5 og 6,0, så bør de innhøstete væsker surrøres med en svak syre så som en lavere alkanoidsyre, f.eks. eddiksyre til denne pH før lagring ved lav temperatur, f.eks.

ved 4° i 48 timer eller i et forlenget tidsrom ved -20°C.

Innholdet av TPA, pro-TPA og andre verdifulle forbindelser i de innhøstete væsker kan bestemmes ved hjelp av vanlig kjent teknikk. F.eks. kan TPA innholdet måles ved hjelp av den kjente <125>I-fibrinprøven eller ved en fluorometrisk prøve.

I den første måler man tidsutviklingen for en plasminogen-avhengig frigjøring av radioaktivt fibrin-nedbrytningspeptider fra 125 I-merket fibrin avsatt som et uoppløslig lag på o overflaten av plastbrønner [konfr. E.L. Wilson og E. Dowdle,

Int. J. Cancer 22, 390-399 (1978)]. I den andre prøven måler , man økningen av fluorisensen som et resultat av en amidolyse av et passende syntetisk substrat så som Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC (AMC: aminometyl kumarinrest) eller Boc-Val-Gly-Arg-AMC [konfr. M. Zimmerman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 750-753 (1978)]. Mens nevnte <1>25I-fibrinprøve gir den totale enzymatisk aktivitet for både TPA og pro-TPA, så kan den fluorimetriske prøven utføres slik at man bare bestemmer TPA aktiviteten, eller alternativt etter at man har behandlet den innhøstete væsken med plasmin som omdanner pro-TPA til TPA, så kan man få målt både TPA og pro-TPA ved hjelp av denne prøven også.

Ved hjelp av nevnte TPA prøve er det vist at de innhøstete væsker fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder pro-TPA i høy konsentrasjon. Dette skyldes antagelig at kulturmediet mangler plasmin eller andre proteaser som kan omdanne pro-TPA til TPA. Dominansen av pro-TPA i de inn-høstete væsker f.eks. fra dyrkete Bowes II celler, står i sterk motsetning til hva man finner i væsker oppnådd ved hjelp av Bowes I melanomaceller som bare inneholder mindre mengder pro-TPA.

Isolering og rensing av proteiner utskilt av serumuavhengige celler

Isolering av ■ de ønskede proteiner fra kulturvæske fremstilt ved hjelp av serumuavhengige celler, så som Bowes II celler, og deres rensing kan i prinsipp utføres på en hver egnet måte som er kjent fra proteinkjemien, f.eks. ved fraksjonert ut-felning, f.eks. ved hjelp av uorganiske salter, gelfiltrering ved hjelp av tverrbundet dekstraner eller agarose, gelelektro-forese eller kromatografisk, f.eks. ved absorbsjonskromato-grafi, ioneutbytningskromatografi eller affinitetskromatografi. For isolering og rensing av TPA og pro-TPA kan man f.eks. bruke en eller flere av de etterfølgende fremgangsmåter: - Kromatografi på sink-chelat-agarose, konkanavalin A-agarose og Sephadex G-15 [konfr. D.C. Rijken og D. Coilen, J. Biol. Chem. 256, 7035-7041 (1981)]. Den innhøstete væsken føres gjennom en sink-chelat-agarosekolonne. Det absorberte enzymet ellueres med et imidazol inneholdende buffer. Den oppnådde oppløsningen påføres en konkanavalin A-agarosekolonne. Eluering kan utføres med metylmannosid og KSCN. I det siste trinnet blir enzymet gelfiltrert på en Sephadex G-150^ kolonne.

- Kromatografi på Affi-gel blå® og aminobenzamidin-Sepharose<®>

[konfr. L.C. Gilbert og J. T. Wachsman, Biochim. Biophys. Acta 704, 450-460 (1982)1. Enzymet blir suksessivt absorbert til Affi-Gel blå o(E> og aminobenzamidin-Sepharose^. Desorp-sjonen kan utføres med en buffer inneholdende arginin.

- Selektiv absorbsjon av TPA og pro-TPA på et underlag med spesefik affinitet for oppløslige fibrinfragmenter som ko-valent blir bundet på en uoppløslig matrise, f.eks. dekstran (konfr. Europeisk Patent nr. 23 860). Det absorberte enzymet kan elueres med en eddiksyrebuffer med en pH på 4,2. - Kromatografi på en immunoaffinitetskolonne av anti-TPA antistoffer, da spesielt monoklonale anti-TPA antistoffer bundet til en uoppløslig matrise, så som Affi-gel eller Sephadex-4B - Affinitetskromatografi på DE-3 Sepharose fis. Frøene av erte-planten Erythrina latissima inneholder en trypsininhibitor som kalles DE-3 [F.J. Joubert et al., Hoppe-Seyler's Zeitschr. Physiol. Chem. 302, 531-538 (1981)]. Man har funnet at DE-3 også er i stand til å hemme TPA aktiviteten. Således kan den rensete DE-3 inhibitoren kobles til en uoppløslig matrise ved hjelp av standardmetoder. Mediet som inneholder TPA og pro-TPA vil absorberes og kan så elueres med buffer inneholdende et katropisk middel, f.eks. KSCN. - Elektroforese på polyakrylamidgeler inneholdende SDS (SDS-PAGE). Denne fremgangsmåten er spesielt mye brukt for ana-lytiske formål og for bestemmelsen av molekylvekter.

For.å oppnå et tilstrekkelig rent produkt kan man bruke en enkelt fremgangsmåte eller flere påfølgende rensningstrinn. Videre kan det være nødvendig å anvende ytterligere rensningstrinn, f.eks. dialyse i en passende bufferblanding, revers-

fase høytrykksvæskekromatografi o.l.

F.eks. kan de innhøstete væsker underkastes en kromatografi på sink-chelat-agarose, konkanavalin A-agarose og Sephadex G-150® som et første isolasjonstrinn (som også kan tjene til

å konsentrere det forønskete protein som er tilstede i store volumer av innhøstet væske), og det anrikte protein kan så renses ved affinitetskromatografi.

I en foretrukken utførelse av den foreliggende oppfinnelse blir den innhøstete væsken oppnådd fra serum-uavhengige humane celler, så som Bowes II celler, og som inneholder TPA og pro-TPA, sentrifugert for å fjerne hele celler og celleavfall, og føres så ved romtemperatur gjennom en kolonne som inneholder en uoppløslig matrise som er tilkoblet en affinitetsreagens som er selektiv for TPA og pro-TPA, f.eks. BrCN aktivert

(R)

Sepharose^, og som er tilkoblet nevnte DE-3 inhibitor. Etter vasking med kolonnen blir det absorberte TPA og pro-TPA des-orbert ved at kolonnen blir behandlet med en bufferoppløsning, f.eks. fosfatbufret saltoppløsning med en pH på mellom 5,5 og 6,0, og som kan inneholde et kaotropisk middel så som KSCN

i en konsentrasjon på 1,4 til 2,0 molar, fortrinnsvis 1,6 molar. Alternativt kan benzamidin eller arginin brukes som et desorbsjonsmiddel.

I en alternativ fremgangsmåte kan TPA og pro-TPA isoleres

ved hjelp av kromatografi på en monoklonal antistoffkolonne som er preparert ved å f.eks. koble monoklonalt anti-TPA anti-stoff til Affi-Gel^.

Med fordel kan et overflateaktivt middel eller et vaskemiddel, da spesielt et ikke-ionisk vaskemiddel, så som Triton X-100® eller Tween 80® tilsettes alle bufferoppløsninger som brukes i rensningen, noe som gjøres for å hindre en absorbsjon av TPA og pro-TPA til karoverflåtene og for å bedre stabiliteten. Dette middel kan tilsettes til en sluttkonsentrasjon på mellom 0,01 og 0,1%.

Den resulterende rensete oppløsningen inneholder TPA cg pro-TPA. For fremstilling av TPA som er fritt for pro-TPA, kan nevnte pro-TPA enzymatisk omdannes til TPA, f.eks. ved hjelp av plasmin eller et enzym som har tilsvarende effekt på pro-TPA.

I en foretrukken utførelse av oppfinnelsen blir pro-TPA isolert i alt vesentlig i en ren form, fri for TPA. Pro-TPA er et virkelig proenzym, d.v.s. at det er en enzymatisk inaktiv form av TPA. Pro-TPA absorberes til fibrin i større grad enn TPA, og det er derfor mer selektivt enn TPA med hensyn til

å frembringe en fibrinolyse, fordi det først knytter seg til fibrin og deretter blir omdannet til TPA, mens det med TPA

er en viss mulighet for at det vil aktivere noe av plasmino-genet i blodstrømmen enn i fibrinet hvor det er ønskelig med en lokal virkning. For fremstilling av pro-TPA som i alt vesentlig er fritt for TPA, så kan man innbefatte en proteaseinhibitor, så som aprotinin eller en basisk pankreatisk trypsininhibitor, under rensingen for å hindre spor av proteaser som måtte være tilstede og som kan frembringe en hel eller delvis omdannelse av pro-TPA til TPA. Den endelige rensingen blir så utført ved hjelp av kromatografi på en kolonne som inneholder en selektiv affinitetsreagens, så som DE-3, i nærvær av en inhibitor som selektivt bare binder TPA og ikke pro-TPA, f.eks. diisopropylfluorfosfat eller nitro-fenylguanidinbenzoat. Disse reagenser hindrer TPA til å bli absorbert til affinitetskolonnen. Bundet TPA vil således gå gjennom DE-3 kolonnen mens pro-TPA vil bli absorbert av kolonnen og kan så elueres som beskrevet ovenfor.

Farmasøytiske preparater

De nye proteiner, da spesielt TPA og pro-TPA, som f.eks. oppnås fra dyrkete Bowes II-celler, har verdifulle farmakolo-giske egenskaper. Således kan TPA og pro-TPA fra Bowes II-celler "brukes i analogi til kjente plasminogenaktivatorer i mennesker for å hindre eller behandle trombose eller andre tilstander hvor det er ønskelig å frembringe en lokal fibrinolytisk eller proteolytisk aktivitet via mekanismen for plasminogenaktivering så som arteriesklerose, myokardial og cerebralt infarkt, venøs trombose, tromboembolisme, post-kirurgisk trombose, tromboflebitis og diabetisk vaskulopatis.

Farmasøytiske preparater kan opparbeides i enhetsdoseformer, f.eks. som ampuller inneholdende fra 1 til 2.000 mg av et farmasøytisk akseptabelt bærestoff pr. enhetsdose og fra 1 til 20 mg, fortrinnsvis fra 3 til 15 mg av den aktive ingrediensen (TPA, pro-TPA eller blandinger av disse) pr. enhetsdose.

Avhengig av den type sykdom som skal behandles, alder og tilstand på pasienten, vil den daglige dose som tilføres en pasient som f.eks. veier ca. 70 kg, ligge i området fra 3 til 15 mg, fortrinnsvis fra 5 til 10 mg pr. døgn.

TPA har også sin aktivitet i behold in vitro. De kan følgelig brukes som fibrinolytiske midler sammen med plasminogen, f.eks. i vasking og rensingsmidler.

De følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse, uten at denne er begrenset til disse.

EKSPERIMENTELL DEL

Forkortelser som er brukt i den eksperimentelle del

EKSEMPEL 1: ETABLERING AV EN SERUM-UAVHENGIG CELLELINJE BOWES II

a. Etablering av Bowes II cellelinjen ved hjelp av et justert

medium oppsamlet fra Bowes I celle

En human melanomacellelinje [Bowes-RPMI 7272; beskrevet av D.C. Rijken og D. Coilen, J. Biol. Chem. 256, 7035-7041 (1981)] ble oppnådd fra dr. E. Reich, Rockfeller University, New York. Cellelinjen ble dyrket i vevskulturkolber (150 cm 2, Costar) ved 37°C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% karbondioksyd. Cellene vokste som tilfestete monolag i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium-1640 (Gibco) tilsatt natriumbikarbonat (2 g/l), antibiotika (300 ug/ml penicillin;

200 ug/ml streptomysin; 10 pg/ml tylosin), og 10% varme-inaktivert (56°C; 30 minutter) kalvefosterserum (FCS).

En vevskulturkolbe inneholdende et tilfestet monolag av celler ble tatt ut. Ved sammenløpning ble det serumholdige mediet fjernet og erstattet med 50 ml RPMI-1640 medium tilsatt de ovennevnte antibiotika. Ingen andre additiver ble tilsatt dette medium. Cellene ble holdt på 37°C i fuktig atmosfærisk luft tilsatt 5% C02. Mediet ble fornyet hver 24 time.

I begynnelsen var cellene friske og forble tilfestet. Etter 12 døgn begynte cellene å løsne fra kulturkolben og begynte å flyte fritt i mediet. Etter 14 døgn var mesteparten av cellene løsnet og bare mindre fraksjon av levende celler var fremdeles festet til kolbens vegg. Mediet inneholdende de løsnete celler ble så fjernet. Den sparsomme tilfestete kulturen av melanomceller som hadde nå vært uten serum i et lengre tidsrom, ble dekket med 50 ml nytt medium som inneholdt et "justert medium" fortynnet med et tilsvarende volum RPMI-1640. Det "justerte medium" ble oppnådd på følgende måte: Serumholdig medium ble fjernet fra sammenløpende serumavhengige melanomaceller Bowes-RPMI 7272 og erstattet med RPMI-1640 medium alene. 24 timer senere ble mediet innhøstet, sentrifugert ved 2 000 omdreininger pr. min. i 5 minutter og ført gjennom et 0,45 pm Milliporefilter. Den resulterende oppløsningen ble kalt "et justert medium" og ble umiddelbart fortynnet med tilsvarende volum RPMI-1640.

"Det justerte medium" fortynnet med frisk RPMI-1640 ble tilsatt kulturen med visse mellomrom over 4 til 5 døgn i en periode på 3 måneder. Etter dette tidspunkt var celletallet økt betydelig og den serumfrie kulturen hadde nå ikke lenger noe behov for "justert medium". Kulturen ble deretter bare tilsatt RPMI-1640 medium alene.

De serumuavhengige celler oppnådd som beskrevet ovenfor ble dyrket i vevskulturkolber (150 m 2 , Costar) og måotte startes med en tetthet på ca. 10 celler pr. ml medium for å sikre en overleving. Cellene ble typisk tilsatt 5 x 10 7 celler pr.

50 ml RPMI-1640:150 cm <2>kolbe. Cellene vokser meget langsomt

i det serumfrie mediet og har en generasjonstid på ca. 6

døgn (sammenlignet med en generasjonstid på ca. 24 timer for den serumavhengige cellelinjen Bowes-RPMI 7272). Ved sammen-løpning ble cellene overført ved å riste flasken kraftig for å løsne tilfestete celler over i mediet. Cellene som var løsnet på den mekaniske måten ble suspendert i RPMI-1640 til en konsentrasjon på ca. 10 celler pr. ml og ble brukt for inokkulering av friske vevskulturkolber. De celler som ikke var løsnet ved ristingen eller bankingen ble tilsatt nytt RPMI-1640 medium. På denne måten fikk man over en total periode på 5 måneder etablert en kultur av den serumuavhengige cellelinjen Bowes II.

b. Etablering av Bowes II cellelinjen i fravær av justert

medium oppsamlet fra Bowes I celler

4 ml av et frosset lager av den serumavhengige melanomacellelinjen Bowes-RPMI 7272 (2,5 x IO<6> celler pr. ml i DMEM) inneholdende 15% kalvefosterserum og 10% DMSO ble opptint og tilsatt 15 ml serumfritt forvarmet DMEM i en 7 5 cm 2 vevkultur-kolbe. Cellene ble inkubert over natten ved 37°C i en fuktig atmosfære av luft tilsatt 5% C02. Deretter ble hele mediet innbefattende de ikketilfestete cellene fjernet og erstattet med 15 ml serumfritt DMEM. Inkubering ble fortsatt inntil cellene var blitt granulære under mikroskopet(24 til 72 timer), hvoretter 50% av mediet ble fjernet og erstattet med friskt serumfritt DMEM. Denne fremgangsmåte ble gjentatt hver 2.

til 3. dag etter behov (mikroskopisk utseende av cellene, pH-forandring på mediet), i det man gradvis økte det totale volum av mediet til 3 0 ml. Da man nådde 60 til 70% sammenløpning (ca. 3 uker) ble cellene overført til 2 nye kolber med lik størrelse i det man brukte 0,02% EDTA for å løsne cellene fra overflaten på kulturskålen. Ved første overføring ble det serumfrie DMEM tilsatt 40% medium som var fjernet fra kulturen før EDTA behandlingen. På dette tidspunkt var den serum-

frie linjen etablert, og cellene fortsetter å dele seg i et fravær av justert medium hvis man opprettholder tilstrekkelig høy celletetthet, d.v.s. i det minste 30% sammenløpning.

EKSEMPEL 2: DYRKING AV BOWES II CELLER I NEDSENKET KULTUR

Bowes II celler som er dyrket til sammenløpning i vevskulturkolber i et serumfritt medium RPMI-1640 ble løsnet ved at man for hånd banket kolbene, hvoretter det hele ble slått sammen til 0,6 1 suspensjon 1 inneholdende 2 x 10 5 celler pr.

ml og overført til et treliters dampsterilisert glasskår. Cellesuspensjonen ble langsomt omrørt med en mekanisk rører

(40 omdreininger pr. min.). Temperaturen ble justert til 37 + 0,1°C, og kulturen tilsatt oksygen ved overflategjennom-luftning med luft inneholdende 5% karbondioksyd i en mengde på 0,2 1 pr. min. PH ble hindret fra å falle under 6,9 ved å gå tilbake til ren luft. Under den første tilpasnings-perioden på 1 uke ble friskt serumfritt medium tilsatt for å hindre en uttapning av glukose. Det endelige kulturvolumet var 1 liter. Da celletettheten nådde 3 til 4 x 10 celler pr. ml, begynte man en periodevis uttagning av kulturvæske.

Hver 2. til 4. dag ble omrøringen stoppet i 3 timer for å la

de mest levedyktige cellene segmentere seg, mens den øvre 50% delen av det brukte mediet ble tatt ut og erstattet med friskt serumfritt medium. Den innhøstete væske ble sentrifugert ved 2 000 omdreininger pr. minutt (ca. 300 g) i 5

min. for å fjerne hele celler og cellulært avfall. Oppløs-ningene ble stabilisert med Triton X-100® til en konsentrasjon på 0,1% og surgjort med eddiksyre til pH 5,5 til 6,0

før lagring ved -f20°C.

EKSEMPEL 3: DYRKING AV BOWES II CELLER I VEVSKULTURKOLBER

OG INNHØSTING AV VÆSKER

Den serumuavhengige cellelinjen Bowes II ble inokkulert i

en mengde på 5 x 10 <7> celler/150 cm <2>vevskulturkolber (Costar)

i 50 ml RPMI-1640 tilsatt antibiotika (se eksempel 1) ved 37°C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% C02. Da cellene hadde festet seg ble mediet oppsamlet fra cellene og erstattet med friskt RPMI-1640 supplert med antibiotika. Uttak av serumfritt innhøstete væsker ble gjentatt hver 24. time inntil en

sammenløpning av monolaget nødvendiggjorde en overføring.

Man nådde vanligvis en sammenløpning etter ca. 5 uker. Overføringen ble utført som beskrevet i eksempel 1. Den innhøstete væsken ble bearbeidet som beskrevet i eksempel 2.

EKSEMPEL 4: BESTEMMELSE AV INNHOLD AV TPA OG PRO-TPA I-

DE INNHØSTETE VÆSKER

De innhøstete væsker inneholdende TPA og pro-TPA ble behandlet med <3>H-DFP (diisopropylfluorfosfat) med kjent spesifikk aktivitet. Etter inkubering ble de merkete enzymer innvunnet og befridd for uomsatt radioaktivt DFP ved utfelling og vasking med trikloreddiksyre i det man brukt de fremgangsmåter som er anbefalt i litteraturen for serinproteaser [j.A. Cohen et al., Methods in Enzymology, Vol.XI, p. 868

(1967)]. Denne aktive posisjonstitreringen av aktivatoren fastslo at de innhøstete væsker oppsamlet fra de serumuavhengige Bowes II cellene inneholdt ca. 10 til 20 nmol totalt TPA pr. liter.

Frigjøringen av total TPA (TPA og pro-TPA) av Bowes I og Bowes II cellene over 4 påfølgende dager kan bestemmes på følgende måte: Innhøstete væsker fra Bowes I melanomaceller dyrket i 75 cm<2 >vevskulturkolber (1,3 x 10 5 celler pr. cm 2, 20 ml/kolbe)

2

eller Bowes II celler som ble dyrket i 150 cm kolber (4 x 10 5 celler pr. cm 2, 50 ml/kolbe) ble tatt ut hver 24. time over 4 døgn. Plasminogenaktivatoraktiviteten ble målt ved hjelp av nedenforstående 12 5 I-fibrinprøve. TPA frigjøringen forble konstant over hele 4 døgns perioden for Bowes II,

mens for Bowes I melanomacellene økte TPA aktiviteten noe i løpet av de 3 første døgn, men antok så på det 4. døgn.

På dette tidspunkt hadde mange av cellene løsnet fra overflaten, og RPMI supplert med 10% FCS måtte tilsettes for igjen å få festet cellene (konfr. Tabell 1).

125

Ovennevnte I-fibrinprøve [E.L. Wilson og E. Dowdle, Int. J. Cancer 22, 390-399 (1978)] blir et fast fasesubstrat

125

tilveiebragt ved at radioaktivt I-fibrinogen/fibrin blir avsatt som et tynt lag' på bunnen av de indre overflater av vevskulturbrønner i et plastkar. Prøver av de innhøstete væsker som skal undersøkes tilsettes brønnene, og man måler TPA aktiviteten som en plasminogen-avhengig oppløslighets-gjøring av radioaktivitet som en funksjon av tiden. Etter som 12 5 I-fibrinprøven måo ler båode TPA og pro-TPA aktiviteten, så er de resultater som er angitt for TPA aktivitet i tabell 1 for det totale enzym.

Tabell 1: Total TPA frigjøring av serum-avhengige Bowes I melanomaceller og serum-uavhengige Bowes II celler i vevskulturkolber uttrykt i internasjonale urokinase (UK) enheter.

I tillegg til dette blir kulturvæskene for både de serumavhengige Bowes melanomacellene og de serumuavhengige Bowes II cellene bedømt for individuelt innhold av TPA og pro-TPA: Bowes I melanomacellene ble utstrøket med 5 x 10 <5>celler pr. replikat 35 mm petriskåler i 2 ml RPMI inneholdende 10%

FCS. Etter 24 timer ble mediet erstattet med serumfritt

RPMI og 24 timers innhøstete væsker ble oppsamlet i 3 påfølgende døgn. Etter hver 24 timers periode talte man celletallet pr.

plate.

Bowes II cellene ble utstrøket i 3 x 10 g celler pr. 35 mm petriskål i 2 ml RPMI.

Plasminogenaktivatoraktiviteten ble bestemt ved den fluorimetriske prøven med Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC som substrat.

Den direkte aminolytiske virkningen av TPA kan måles fluori-metrisk ved å følge økningen med hensyn til fluorisensen ved 455 nm som oppstår på grunn av en amidolytisk frigjøring av aminometylkumarin (AMC) fra det fluorogene substrat [konfr.

M. Zimmerman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75, 750-753

(1978)]. 1 FU representerer den mengde enzym som hydroly-serer 10 pmol av substratet i 1 minutt i den amidolytiske prøven. Resultatene er angitt i tabell 2.

Tabell 2: Frigjøring av TPA og pro-TPA av serumavhengige Bowes I melanomaceller og serumuavhengige Bowes II celler.

(a) Total TPA aktivitet målt etter inkubering av 295 ul innhøstet væske med 5 ul plasmin (0,1 mg/ml) i 1 time ved romtemperatur. Plasmin blir hemmet ved hjelp av Trasylol i denne prøven. (b) Mengden av proaktivator (pro-TPA) ble bestemt ved å trekke den aktiviteten man målte uten plasminaktivering fra den totale aktivitet.

Det fremgår fra tabell 2 at ca. 10% av det TPA som skilles

ut av de serumuavhengige Bowes II cellene er i form av det aktive enzym mens ca. 90% er i form av pro-enzym (pro-TPA).

I motsetning til dette inneholdt det medium som ble oppsamlet fra de serumavhengige Bowes I melanomcellene ca. 90% TPA og ca. 90% pro-TPA.

EKSEMPEL 5: INNVINNING OG RENSING AV TPA OG PRO-TPA

a. Fremstilling av en DE- 3 sepharose kolonne

26 mg renset DE-3 inihibitor fra Erythrina latissima [F.J. Joubert et al., Hoppe-Seyler's Zeitschr. Physiol. Chem. 302, 531-538 (1981) ] ble koblet til 5 ml cyanogenbromidaktivert

(r)

Sepharose 4b~^ (Pharmacia) ifølge fabrikkens instruksjoner. Matrisen ble ekvilibrert med fosfatbuffret saltoppløsning ("PBS") pH 7,4 inneholdende 0,4 M NaCl, 0,1% Triton X-100<®>

og 0,02% natriumazid. Matrisen ble så pakket i en 5 ml kolonne.

b. Kromatografisk rensing av TPA og pro-TPA holdige inn-høstete væsker på 1 DE- 3 Sepharose 4b<S5>

To liter innhøstet væske fremstilt ved hjelp av serumuavhengige Bowes II celler (se eksempel 3) ble gjort 0,4 M med hensyn til NaCl og 0,1% medhensyn til Triton X-100® og filtrert gjennom en 0,45 nm membran (Millipore). Væsken ble så påsatt ovennevnte DE-3 Sepharose til)kolonne i en mengde på 4 5 1 pr. time ved romtemperatur, og den utstrømmende væsken ble kastet. Etter at hele væskevolumet var ført gjennom kolonnen, ble denne vasket med ca. 50 ml PBS inneholdende 0,4 M NaCl og 0,1% Triton X-100<®>. Absorberte proteiner ble så elluert

ved at man brukte PBS inneholdende 1,6 M KSCN, 0,4 M NaCl og 0,1% Triton X-IOCP' og 2 ml fraksjoner ble oppsamlet ved 4°C. Proteininnholdet i være fraksjon ble bestemt ved å måle UV-absorbsjonen ved 280 nm. Man fant at det absorberte proteinet

ble elluert som en skarp topp. De fraksjoner som inneholdt den høyeste UV-absorbsjonen og den høyeste fibrinolytiske

125 aktiviteten slik denne kunne bestemmes ved nevnte I-fibnn-prøven, ble slått sammen til 8 ml oppløsning som ble lagret ved -r20°C. Dette representerer ca. 70 til 80% av den totale aktivitet som var påsatt kolonnen. Fraksjoner inneholdende lavere aktivitet ble slått sammen separat. Den totale innvinning av aktivitet i begge de sammenslåtte væskevolumer utgjorde vanligvis mellom 90 og 100%.

Det ble så tatt ut en prøve. Proteinet ble utfelt ved å tilsette trikloreddiksyre til en sluttkonsentrasjone på 10% hvoretter proteinet ble underkastet en SDS polyacrylamidgelelektro-forese. Elektroforettogrammet viste et enkelt proteinbånd med en molekylvekt på ca. 73 000 dalton slik dette kunne bestemmes ved hjelp av fremgangsmåten til Weber og Osborne [J.Biol. Chem. 244, 4406-4412 (1969)], i det man samtidig utførte en elektroforese med markørproteiner med kjent molekylvekt .

TPA og pro-TPA innholdet i det samlete volum ble bestemt ved hjelp av den fluorometriske prøven med Cbs-Gly-Gly-Arg-AMC som substrat (konfr. eksempel 4). Total TPA aktivitet ble målt etter inkubering med plasmin som ble hemmet ved hjelp av Trasylol® for prøven. Mengden av pro-TPA ble beregnet ved å substrahere den aktivitet som ble målt uten plasminaktivering fra den totale aktivitet. Det kan fastslås at rensing av plasminogenaktivator fra mediet fra Bowes II cellene gir en blanding av TPA og pro-TPA i omtrent like deler. Således ble pro-TPA delvis omdannet til aktivt enzym under isoleringen, etter som man i ubearbeidete væsker oppsamlet fra Bowes II cellene har et innhold av TPA på 10% og pro-TPA er 90% (konfr. eksempel 4 tabell 2).

Behandling av væskene fra den serumuavhengige Bowes II cellelinjen med lave konsentrasjonen av kalvefosterserum (0,01%) resulterer i en omdannelse av pro-TPA til TPA. Dette skyldes antagelig nærværet av plasmin i FCS.

c. Kromatografisk rensing av TPA og pro- TPA holdige væsker på DE- 3 Sepharose 4b i nærvær av en proteinaseinhibitor Kromatografi av væsker oppnådd fra serumuavhengige Bowes II celler ble utført som beskrevet i eksempel 5b, bortsett fra at man i denne fremgangsmåten tilsatte en basisk pankreatisk trypsininhibitor (BPTI) i en mengde på 0,1 KIU/ml. Ved å bruke den fluorometriske prøven med Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC som substrat (se ovenfor) bestemte man at innholdet av TPA og pro-TPA i den rensete oppløsningen var 90% TPA i proenzymformen og 10% i den aktive formen. således blir omdannelsen av pro-TPA til TPA under rensingen hemmet av BPTI. EKSEMPEL 6: BEVIS FOR ET NÆRVÆR AV ENKJEDET PRO-TPA I RENSETE TPA PREPARATER Innhøstete væsker fremstilt ved hjelp av serumuavhengige cellelinjer Bowes II ble renset ved affinitetskromatografi på DE-3 Sepharose<®> som beskrevet i eksempel 5c. I den resulterende rensete oppløsningen var ca. 90% av det foreliggende TPA i proenzymformen og ca. 10% i form av aktivt enzym slik dette kunne påvises ved den amidolytiske prøven før og etter plasminbehandling. Oppløsningen ble dialysert over i T-T (0,1). Prøvene av oppløsningen ble blandet med like volumer PBS eller PBS inneholdende 5 yg/ml plasmin. Etter inkubering i 16 timer ved 20°C ble SDS tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,1%, og proteinene ble utfylt med 6% TCA. Bunnfallet fra 200 <y>l prøver av den opprinnelige enzymoppløsningen ble vasket i aceton og gjenoppløst i 20 <y>l 0,06M Tris-HCl pH 6,8 inneholdende 1% SDS og 10% glycerol. Når det var nødvendig ble prøvene på dette trinnet redusert ved hjelp av 2 <y>l IM DTT og inkubert ved 37°C i en ^ time. Alle prøvene ble så kokt i 1 minutt, hvoretter man utførte en elektroforese på 20 yl fra hver prøve på en 5 til 15% poly-akrylamidgel inneholdende 0,1% SDS. Etter elektroforesen ble gelen merket med Coomassie brilliant blåt-c^ og deretter vasket på vanlig måte. Elektroforesesporene inneholdt (a) molekyl-vektsmarkører, (d) ubehandlet og ikke-redusert TPA oppløsning (c) ubehandlet og redusert TPA oppløsning og (d) plasmin-behandlet og redusert TPA oppløsning.

Spor b viser bare et proteinbånd med en molekylvekt på ca.

73 000. Under reduserende betingelser (spor c) vil mesteparten av TPA også vandre inn i området med ca. 73 000 dalton. Man kan imidlertid observere ytterligere svake bånd i 35 000 dalton området. Plasminbehandling og reduksjon med DTT omdanner 73 000 dalton proteinet til 2 underenheter med molekylvekter på ca. 35 000 dalton og 38 000 dalton hhv. Disse eksperimenter viser at enkeltkjedet pro-TPA har en molekylvekt på 73 000 dalton og omdannes ved hjelp av plasminbehandling til den S-S-forbundete tokjedete formen (TPA).

TPA kan så spaltes under reduserende betingelser til de to underenheter.

EKSEMPEL 7: BESTEMMELSE AV ENZYMATISK AKTIVITET FOR PRO-TPA

Prøver på 500 1 av et TPA preparat inneholdende ca. 20 FU/ ml total aktivator (TPA og pro-TPA) i T-T (0,1) ble inkubert i et nærvær (a og b) eller i et fravær (c og d) av 5 mM

DFP i en time ved 20°C. Fritt DFP ble fjernet ved hjelp

av fremgangsmåten til H.S. Penefsky [J.Biol. Chem. 252, 2891-2899 (1977)] ved at man sentrifugerte 100 <y>l prøver av reaksjonsblandingene gjennom 1 ml kolonner inneholdende Sephadex G25® finekvilibrert med T-T (0,1). Volumer på

3 ul av 0,5 mg/ml plasmin (b og d) eller 3 ul PBS (a og c) ble tilsatt disse prøvene som så ble inkubert i en h time ved 20°C. 50 mikroliter av hver prøve ble så fjernet fra opp-løsningen og tilsatt 10 ul BPTI (1 000 KIU/ml) for å hemme plasminaktivitet. Den amidolytiske aktiviteten i hver prøve ble bestemt ved hjelp av den fluorometriske prøve. Resultatene er angitt i tabell 3.

Prøven har et totalt TPA innhold på 17,48 FU/ml (d) hvorav 6,25 FU/ml er tilstede i den aktive enzymformen (c). Det aktive enzym hemmes til et upåvisbart nivå ved behandling med DFP (a). Etter behandling med DFP kan det aktive enzym igjen genereres ved inkubering med plasmin (b), som viser at pro-TPA er resistent over for DFP behandling og mangler mål-bar enzymatisk aktivitet.

EKSEMPEL 8: SEPARASJON AV PRO-TPA FRA TPA

O

En oppløsning av TPA (10%) og pro-TPA (90%) fremstilt som beskrevet i eksempel 5c, ble justert til pH 8,0.med 0,IM Tris.HCl inneholdende 0,1% Triton X-10 «Pc gjort ImM med hensyn til DFP. Etter inkubering ved 37°C i 4 timer ble blandingen ført gjennom 5 ml DE-3 Sepharose(^ r) kolonne (konfr. eksempel 5a). Den væsken som inneholdt det irreversibelt hemmete TPA ble så kastet. Kolonnen ble vasket med 6 kolonne-volumer PBS inneholdende 0,4 M NaCl og 0,1% Triton X-100® og deretter elluert med PBS inneholdende 1,6M KSCN, 0,4M NaCl og 0,1% Triton X-100® som beskrevet i eksempel 5b. De fraksjoner som viste den høyeste UV-absorbsjon ble slått sammen. Denne oppløsningen inneholdt pro-TPA i en i alt vesentlig form etter som ingen amidolytisk aktivitet lot seg påvise i den fluorometriske prøven hvor man brukte Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC som substrat. Den amidolytiske såvel som den fibrinolytiske aktiviteten kan reetableres ved behandling med plasmin som omdanner pro-TPA til det aktive enzym.

EKSEMPEL 9: BINDING AV TPA OG PRO-TPA TIL ULØSLIGGJORT FIBRIN

Fem prøver inneholdende TPA og pro-TPA i forskjellige mengder ble fremstilt som beskrevet i eksempel 5c eller ved delvis å omdanne pro-TPA til TPA i en slik oppløsning. Innholdet av aktivt TPA og pro-TPA ble bestemt fra resultatene av den fluorometriske prøven før og etter plasminbehandling som beskrevet i eksempel 4. Prøvene ble så fortynnet i T-T (0,1) slik at 0,2 ml i nærvær av 2 ug plasminogen ville frigjøre ca. 30 til 50% av 12 5I-fibrinlaget på bunnen av Linbrobrønner i løpet av 1 time.

Prøver (0,2 ml) av oppløsningene ble så tilsatt i fire paralleller

125

til Linbrobrønner belagt med I-fibrin (30 ug; 100 000 cpm). Etter inkubering i 1 time ved 0° ble to brønner fra de fire parallellene vasket tre ganger med T-T (0,1) som fjerner ubundet TPA proteiner.

Bundet aktivitet ble målt som den mengde av 12 5I-fibrin som

ble oppløsliggjort i løpet av 1 time etter tilsetning av 0,3

ml Tris.HCl pH 8,1 inneholdende 2 ug plasminogen og 80 ug BSA. Total TPA aktivitet tilsatt brønnene ble målt som den mengde

125

I-fibrin som ble oppløsliggjort i 1 time etter tilsetning

av 2 ug plasminogen og 80 yg BSA (0,3 ml i den samme buffer)

til brønner som ikke var vasket.

Resultatene er angitt i tabell 4.

Tabell 4 indikerer at en stor prosentsats av det totale TPA enzym blir bundet til uløsliggjort fibrin når TPA preparatet er i pro-aktivatorformen.

EKSEMPEL 10: FARMASØYTISK PREPARAT FOR PARENTERAL TILFØRSEL

En TPA og/eller pro-TPA holdig oppløsning fremstilt som beskrevet i eksempel 5b, 5c eller 8, ble dialysert mot en 0,3 molar natriumkloridoppløsning inneholdende 0,01% Tween 80^ og lagret ved ^80°C. Før tilførsel ble konsentrasjonen justert til 75 ug pr. ml totalt TPA (d.v.s. TPA eller pro-TPA eller TPA pluss pro-TPA) og 0,3 molar NaCl. Oppløsningen ble steri-lisert ved filtrering gjennom et 0,22 pm membranfilter.

Denne fremgangsmåte er godt egnet for fremstilling av oppløs-ninger av TPA, pro-TPA eller TPA pluss pro-TPA for parenteral tilførsel, f.eks. intravenøs tilførsel.

EKSEMPEL 11: VALG AV EN MUTANT AV DEN SERUM-UAVHENGIGE CELLELINJEN BOWES II SOM ER I STAND TIL Å PRODUSERE ØKENDE MENGDER TPA

5% kalvefosterserum ble tilsatt en petriskålkultur av serumuav-

hengige Bowes II celler for å øke veksthastigheten på cellene og for å sikre at flere celler vil være i S-fasen på et spesielt tidspunkt. Da cellene var under rask deling og i den eksponensielle vekstfasen og når de var ca. 70% sammenløpende, tilsatte man kulturen 0,1 mM N-metyl-N-nitro-N<1->nitrosoguanidin (MNNG). Denne konsentrasjonen gjør at fra 70 til 80% av cellene dør. Etter 36 timer blir de igjenværende levende celler fjernet fra petriskålen ved trypsinisering. Cellene blir igjen tilsatt med en tetthet på 1.10 celler/60 mm petriskål. 2 uker senere blir koloniene observert på bunnen av petriskålen, og hver koloni representerer et avkom av en enkelt celle som overlevde mutagenesen. Disse kolonier blir så dekket med 1 ml av en overliggende oppløsning som inneholder:

50 ul plasminogen (lmg/ml),

300 yl 8% kasein i isotonisk saltoppløsning,

600 yl 2,5% agar i isotonisk saltoppløsning og

800 yl RPMI-1640 medium.

Man vil kunne observere områder med oppløsning omkring kloner som produserer TPA, og man ser de største områder omkring de kloner som produserer mest TPA. Den mutantklonen som gir det høyeste nivå av TPA blir så isolert og dyrket på en petriskål .

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en serumuavhengig human cellelinje, karakterisert ved at man: a. fjerner serumholdig medium fra en kultur av en serumavhengig human melanoma-cellelinje som er en TPA og/eller pro-TPA produserende Bowes I cellelinje og erstatter nevnte medium med et serumfritt medium, b. lar cellene vokse inntil det er etablert en serumuavhengig Bowes II cellelinje, idet det serumfrie medium er fritt for eksogene makromolekylære vekstfaktorer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det serumfrie mediet er et kondisjonert medium hvor man lar cellene vokse inntil det ikke er nødvendig med nevnte kondisjonerte medium, og der det serumfrie kondisjonerte medium er blitt oppsamlet fra en tilsvarende serumavhengig cellekultur, - dyrket i et serumfritt medium i et tidsrom på ca. 24 timer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at cellene dyrkes til 30$ sammenløpning eller mer i fravær av kondisjonert eller justert medium.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det serumfrie mediet fremstilles ved å isolere mediet inneholdende ikke-adherente celler, skiller ikke-adherente celler fra mediet og tilsetter disse tilbake til de adherente celler sammen med nytt serumfritt medium.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det serumfrie mediet fremstilles ved å erstatte en del av det serumfrie mediet med ferskt serumfritt medium med 24 til 72 timers mellomrom.

6. Fremgangsmåte for å dyrke den serumuavhengige cellelinjen Bowes II, fremstilt ifølge kravene 1-5, som produserer TPA og/eller pro-TPA, karakterisert ved at dyrkingen utføres i fravær av serum og i fravær av eksogene makromolekylære vekstfaktorer, og eventuelt omdannes det pro-TPA som er tilstede i den fremstilte blandingen enzymatisk til TPA, og eventuelt tilsettes en proteaseinhibitor under isolering og rensing, og den siste rensingen utføres i nærvær av en inhibitor som selektivt hemmer TPA.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at man fremstiller blandinger av vevsplasminogenaktivator og pro-vevsplasminogenaktivator.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at man fremstiller en blanding av vevsplasminogenak-tivatorer hvor 90% er i pro-enzymformen og 10% i den aktive enzymformen.