JPH01256385A - 組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造法に
関する。

〔従来の技術〕

現在、血栓症の治療薬としては、人尿から精製したウロ
キナーゼ、ヒト腎臓細胞の培養液から精製した組織培養
ウロキナーゼ、及び微生物の培養液から精製したストレ
プトキナーゼが用いられている。

しかし、これらの線維素溶解摩素を血栓を完全に溶かす
ため多量投与すると出血傾向の副作用がみられる。また
、ストレプトキナーゼはヒトにとっては異種たん白であ
るため抗原性があり、再度投与するとショックを起こす
など好ましからぬ性質がある。

そこでヒトに投与しても出血傾向の副作用がなく、かつ
抗原性の心配のない有効な血栓溶解剤が強く望まれてい
た。このような状況のなかで、ヒト黒色腫（メラノーマ
）細胞の培養液からウロキナーゼとは物理化学的にも免
疫化学的にも異なる組織型プラスミノーゲン活性化因子
が単離・精製され、この組織型プラスミノーゲン活性化
因子がウロキナーゼやストレプトキナーゼに代わる血栓
溶解剤の可能性を示唆されたので一躍注目されることと
なった〔ジャーナル　オブ　バイオロジカルケミストリ
ー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）　、　２５６巻。

７０３５〜７０４１頁（１９８１年）〕。しかしながら
メラノーマは腫瘍細胞の一種であるため、培養液あるい
は最終精製物に未知の危険因子が混入する恐れがある。

したがって、メラノーマ由来の組織型プラスミノーゲン
活性化因子は医療用としては決して適当なものであると
は言えない。

このような理由で、　Ｉｔ！瘍細胞ではなく安全性の高
い正常細胞を培養し、その培養液から組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子を採取する試みがいくつかなされてい
る。例えばヒト胎児正常肺細胞由来の線維芽細胞の１種
ＩＭＲ９０が抗ウロキナーゼ抗体により活性を阻害され
ない分子量７３，０００のプラスミノーゲン活性化因子
と抗ウロキナーゼ抗体により活性を阻害される分子量５
０，０００〜６０．０００のウロキナーゼ型プラスミノ
ーゲン活性化因子を産生ずることが見出されている〔ジ
ャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、）　、　２５４巻、５７５〜
５７８頁１９７９年及び同誌、２５５巻、　３６６５〜
３６７２頁（１９８０年）〕。

また、８週令のヒト胎児正常肺線維芽細胞が抗ウロキナ
ーゼ抗体によって活性を阻害されない分子量約７０，０
００のプラスミノーゲン活性化因子と抗ウロキナーゼ抗
体によって活性を阻害される分子量約６０，０００のウ
ロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を産生ずるこ
とが報告されている〔キャンサー　リサーチ（Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｒｅｓ、　）　４０巻、９３３〜９３８頁（１９
８０年）〕。しかし、これらの抗ウつキナーゼ抗体によ
って活性を阻害されないプラスミノーゲン活性化因子は
単離・精製がなされておらず、その物性が明らかにされ
ていないため。

メラノーマ細胞由来の組織型プラスミノーゲン活性化因
子と同一物質であるか不明であった。

さらに、ヒト胎児正常節あるいは正常腎臓由来の線維芽
細胞の組織培養液から、たん白質化学において通常使用
される方法、すなわち亜鉛キレートセファロースカラム
、コンカナバリンＡセファロースカラム、アルギニンセ
ファロースカラム。

抗ウロキナーゼポリクローナル抗体カラム等の方法の組
合せによって抗ウロキナーゼ抗体と反応しない組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子が得られることが知られてい
る（特開昭５９−５１２２０号公報。

特開昭６０−１５８１１６号公報、特開昭６０−１５８
１１７号公報）。

これらヒト正常組織由来の線維芽細胞が産生ずる組織型
プラスミノーゲン活性化因子の生産に関して、最近いく
つかの方法が提案されている。

例えば、生産物収量を向上させる培養方法として、上記
正常細胞を細胞接着面いっばいに増殖させたのち、生産
誘導培地として血清を含まず、動物肉酵素分解のペプト
ン類を含む培地を用いる方法（特開昭５９−１３４７３
３号公報）、及び上記誘導培地としてペプトン類あるい
はラクトアルブミン加水分解物含有液を用いる方法（特
開昭６１−２４９９２６号公報）、あるいは上記細胞を
ペプトン類とホスホリパーゼＡ２　（またはりポキシゲ
ナーゼ）賦活物質を添加した無血清培地で培養する方法
（特開昭６２−２０５７８４号公報）などが知られてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

ヒト胎児正常肺細胞が産生ずる組織型プラスミノーゲン
活性化因子の製造上の問題点は第１に細胞が組織培養液
中に分泌する組織型プラスミノーゲン活性化因子の量が
微量であること、及び第２に−たん増殖した細胞を血清
を含まない誘導物質含有培地で培養すると、細胞の活性
保持に必須な血清成分を欠くため細胞の死滅が早まり、
貴重な細胞を最大限に利用することができないことにあ
る。

本発明は、このような問題点を解決するものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、ヒト正常肺組織由来の線維芽細胞を血清及び
ペプトン類を含む培地で培養し、培養液を精製すること
を特徴とする組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造
法に関する。

ヒト正常肺組織由来の線維芽細胞は、正常２倍体細胞で
あって、ＩＭＲ−９０（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ１８６）　。

ＨＥＬ２９９　（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ１３７）　、　ＷＩ
−３８（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ７５）等のよく知られたもの
が使用でき、さらに、出願人が微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第９９７８号として寄託している細胞Ｃ４６
０を使用することができ、常法に従ってヒト胎児節から
分離されたものであればよい。

ヒト正常肺組織由来の線維芽細胞は、血清及びペプトン
類を含む培地（以下、「生産誘導培地」という）で培養
される（以下、これを「生産培養」という）。該血清と
しては、牛胎児血清、子牛血清、成牛血清、馬血清、鶏
血清など、動物の血清を用いることができる。ペプトン
類としては、牛乳カゼイン、動物肉、ダイズタンパク質
等のタンパク質をペプシン、トリプシン、パパインなど
のタンパク質分解酵素で部分的に加水分解して得られる
もの、該タンパク質を酸で部分的加水分解して得られる
ものなどを用いることができる。

基礎となる培地としては、イーグルの最小培地。

ダルベツコの最小培地、１９９培地、ハムＦ１２培地、
　ＲＰＭＩ　１６４０培地などを用いることができる。

血清は生産誘導培地中に、０．５〜２％（Ｖ／Ｖ）含ま
れるのが好ましい。血清が存在すると細胞の寿命の向上
及び組織型プラスミノーゲン活性化因子の収量の向上に
効果がある。血清の量が少なすぎると細胞の寿命が短か
くなる。血清は２％（Ｖ／Ｖ）までで充分であるが、こ
れを超えて使用してもよく、この場合は゛、高価な血清
を多く使用することになる。

ペプトン類は生産誘導培地中に、０．２〜５％（Ｗ／Ｖ
）含まれるのが好ましい。ペプトン類の量は少なすぎて
も多すぎても組織型プラスミノーゲン活性化因子の収量
は少なくなる傾向がある。

生産培養は１〜３日間行なうのが好ましく、このあと培
養液（培地）は回収され、細胞の培養は新しい生産誘導
培地で継続する。

以上の生産培養及び培養液回収のサイクルを、細胞がも
はや組織型プラスミノーゲン活性化因子を分泌できなく
なるまで繰返す。通常、生産培養−培養液回収のサイク
ルは３０〜１００日間継続することができる。

好ましい培養温度は３５〜３８℃、雰囲気は４〜８％の
炭酸ガスを含む空気で満たすのが好ましい。培養器は一
般的に用いられているプラスチック製、ガラス製等の培
養フラスコ、ローラボトル。

ビーズ懸濁培養器などが使用できる。

この生産培養によって、著量の組織型プラスミノーゲン
活性化因子と共にウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活
性化因子が細胞から分泌される。

細胞は、上記の生産培養に先立って、増殖させるのが好
ましい。増殖させるための培地（以下、増殖培地という
）は、血清を２〜２０％（Ｖ／Ｖ）含むのが好ましい＝
血清が少なすぎると細胞の増殖がみられないか、あるい
は少ない。血清は２０％（Ｖ／Ｖ）までで充分であるが
、これを超えて使用してもよく、この場合には高価な血
清を多量に使用することとなる。

細胞の増殖に使用される血清、基礎となる培地。

温度、雰囲気、培養器等は前記培養の場合と同様である
が、ペプトン等の誘導物質は使用されない。

細胞の増殖は、培養器の細胞接着面にいっばいになるま
で４〜１０日間培養し、細胞の増殖が旺盛で栄養源が不
足気味な場合は、途中で培地を新鮮なものと交換するの
が好ましい。細胞の増殖がピークに達したときに細胞培
養液を全量取り除き。

前記した生産培養を行なうのが好ましい。

培養液から組織型プラスミノーゲン活性化因子を分離精
製するためには、コンカナバリンＡを固定化したアガロ
ースゲル、リジンを固定化したアガロースゲル等を用い
るアフイニテイクロマトグラフイー、特に組織型プラス
ミノーゲン活性化因子に対するモノクローナル抗体を固
定した担体を用いるアフイニテイクロマトグラフイーを
用いることができる。該モノクローナル抗体としては、
正常細胞から得られる組織型プラスミノーゲン活性化因
子に対するモノクローナル抗体だけでなく。

メラノーマから得られる組織型プラスミノーゲン活性化
因子に対するモノクローナル抗体を用いることができる
。モノクローナル抗体の製造及び担体への固定化は常法
により行なうことができる。

また、上記分離Ｍ長は、アフイニテイクロマトグラフイ
ー以外に、カルボキシメチル基結合担体等を用いるイオ
ン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム等を用い
る分別沈殿法、ゲルろ過法等を利用して行なうことがで
きる。以上の分離精製の手段は、適宜組み合わせて利用
することができる。上記したモノクローナル抗体を固定
した担体を用いるアフイニテイクロマトグラフイーを利
用するのが、分離精製が簡単で効率がよいので好ましい
。

本発明によって得られる組織型プラスミノーゲン活性化
因子は、抗ウロキナーゼポリクローナル抗体によって活
性が阻害されないことによって特徴づけられる。

本発明において、精製法を適当に選択することによって
（特に、組織型プラスミノーゲン活性化因子に対するモ
ノクローナル抗体を固定した担体を用いるアフイニテイ
クロマトグラフイーを利用することによって）、新規な
組織型プラスミノーゲン活性化因子を製造することがで
きる。この組織型プラスミノーゲン活性化因子は、次の
性質によって特徴づけられる。

ａ）分子量：　６７．０００±１０，０００ｂ）等電点
：主に６，８〜８゜０の範囲内に分布する Ｃ）抗つロキナ・−ゼボリクローナル抗体による活性の
阻害：阻害されない Ｎｏ、−２ＨＣＱＬ：、対する解離定数：約４．Ｘ１０
−’モル／Ｑ ｆ）熱安定性二６０℃で１０時間の加熱により約６０％
が失活する 上記ａ）乃至ｆ）の性質は１次の方法により、測定した
ものである。

ａ）分子量 セファデックスＧ−１５０を用いるゲルろ過法でカラム
は内径３゜２ｃｍ、長さ９０ａｎのものを用いた。試料
４０，０ＯＯＩυ（たん白質として約０．０８　　ｍ　
ｇ）を分子量標準物質である牛血清アルブミン（分子量
６７．０００）　５　ｍ　ｇ　、卵白アルブミン（分子
量４５．０００）　６　ｍ　ｇ及びブルーデキストラン
２０００　（平均分子量２，０００，０００　）ととも
に展開溶媒（０，１Ｍ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ。

０．１　Ｍアルギニン及び０．１　　％ポリオキシエチ
レンソルビタンモノオレエートを含むｏ、ｏｉＭリン酸
緩衝液）１０ｒｎＱに溶かし、この全量をカラムに負荷
して、上記の展開溶媒を用いてゲルろ過する。

ｂ）等電点 試料をＰ　Ｈ３，５〜１０のアンホライン〔ファルマシ
ア・ファイン・ケミカルズ社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆ
ｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ）製〕を用いポリア
クリルアミドゲル等電点分離法でディスクゲル中に分離
した。分離後、ゲルを３ｒｍ等間隔にスライスし、直ち
にそのスライス片のＰ　Ｈを微小ＰＨ主電極（株）富士
化学計測製〕で測定したのち、スライス片をフィブリン
平板上に置き、３７℃で１６時間保温して溶解窓の大き
さを測定する。

Ｃ）抗ウロキナーゼポリクローナル抗体による活　　性
の阻害 ウサギをウロキナーゼで感作し、その抗血清から硫安分
画及びＤＥＡＥ・セルロースクロマトグラフィーを組合
わせる常法で抗ウロキナーゼポリクローナル抗体を調製
する。生理食塩液に溶かした試料（１，０ＯＯＩＵ／ｍ
Ｑ）と抗ウロキナーゼポリクローナル抗体（０，１＋ｎ
ｇ／ｍＱ）を等量混合し、３７℃で３０分保温したのち
、世界保健機構（ＷＨＯ）の組織型プラスミノーゲン活
性化因子標準品を比較物質としてフィブリン平板法で溶
解窓の大きさを測定する。なお、生理食塩液に溶かした
ウロキナーゼ（１ｏＯＩＵ／ｍｆｆ）と抗ウロキナーゼ
ポリクローナル抗体（０，１ｍｇ／ｍＱ）を等量混合し
、３７℃で３０分保温したのち、ＷＨＯのウロキナーゼ
標準品を比較物質としてフィブリン平板法で溶解窓の大
きさを測定したところ、ウロキナーゼの活性は完全に阻
害された。

ｄ）還元処理に対する挙動： 試料（約０　、５　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑ　）　１容に対
し、β−メルカプトエタノール０．２５容を加え。

１００℃で５〜１０分還元処理したものと、還元処理し
ないものについて、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動し、クーマシーブリリアントブルーでたん白質を
染色した。

Ｎｏ２−２ＨＣＱ　（Ｓ−２２８８） 試料の濃度を２００１Ｕ／ｍＱとし、上記合成基質Ｓ−
２２８８（カビ・ビトラム社（ＫａｂｌＶｉｔｒｕｍ　
ＡＢ）製〕の濃度をＯ〜１　、２５　ｍ　Ｍの範囲で変
動させ、３７℃におけるＳ−２２８８の分解速度（４０
５ｎｍにおける吸光度変化）を測定した。　Ｌｉｎｅｗ
ｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋの逆数プロットにより、Ｓ−２２
８８に対するＫｍを求める。なお上記反応で緩衝液は０
．１ＭＮａＣＱ及び０．０１％ポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレエートを含む０．１　Ｍトリス・塩酸緩
衝液を用いる。

ｆ）熱安定性 生理食塩液に溶解した試料（２０００ＩＵ／ｍＱ）にヒ
ト血清アルブミンを１ｍｇ／ｍＱとなるように加え、６
０℃で１０時間加熱処理し、残存活性（ＩＵ／ｍＱ）を
調べる。

また、各種合成基質に対する加水分解活性を。

第１表に示す。測定は次のｇ）の方法によって行なった
。

ｇ）各種合成基質に対する加水分解活性０．１　　ｍＭ
各種合成基質〔（株）ペプチド研究新製〕及び０．１　
　ｍＭ塩化ナトリウムを含む０．０５ＭトＩＪＸ−塩酸
緩衝液（ｐ　Ｈ８、０）４５０μ桑に組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子（２０００ＩＵ／ｍＱ）　５０ｐＱを
加え、３７℃で１５分間反応させる。反応後、２０％酢
酸０．５＋ｎｆｉを加えて反応を停止させ、生じたアミ
ノメチルクマリンを励起波長３７０　ｎ　ｍ　ｗ蛍光波
長４６０ｎｍで測定し、加水分解活性を求めた。その結
果を第１表に示した。

第　　　１　　　表 ＊１μＭのアミノメチルクマリンの蛍光強度を１００と
する メラノーマ由来の組織型プラスミノーゲン活性化因子に
対するモノクローナル抗体を固定した担体を用いるアフ
ィニティクロマトグラフィーを利用した組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子の培養液からの分離方法について説
明する。

上記モノクローナル抗体の作製は常法に従って行なえば
よいが、例えば次の方法により行なうことができる。

（ｉ）モノクローナル抗体を産生ずる融合細胞株の育種 ケーラー、ミルシュタインの方法〔ネイチャー　（Ｎａ
ｔｕｒｅ）　、　２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕
を基礎として、その接種々の改良が加えられた方法（岩
崎辰夫はが３名：単りローン抗体、＆ｌ！談社、　１９
８３年）で行うことができる。すなわちメラノーマ由来
の組織型プラスミノーゲン活性化因子をマウスに免疫し
、マウスの肺細胞とミエローマ細胞をポリエチレングリ
コールで細胞融合する。次いでヒポキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン含有培地（以下ＨＡＴ培地という）
で牌細胞とミエローマの融合細胞だけを選択的に生育さ
せる。

更に融合細胞が組織型プラスミノーゲン活性化因子に対
する抗体を生産していることを酵素抗体はうで確認した
のち、クローン化を繰返し、均一な融合細胞を取得する
。

（ｉｉ）組織型プラスミノーゲン活性化因子に対するモ
ノクローナル抗体の分離・精製 ４〜６週令のＢ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｅマウスの腹腔内に
抗体産生性の融合細胞株の生着率を高めるためにあらか
じめプリスタン（２，６，１０゜１４−テトラメチルペ
ンタデカン）を注射し、１〜３週間後に３　Ｘ　１０’
〜５　Ｘ　１０’個の融合細胞をリン酸緩衝化食塩液に
懸濁してマウスａ腔内に接種する。１〜２週間後に腹腔
内に腹水が貯まるので１〜２日ごとに腹水を採取する。

腹水からモノクローナル抗体を精製するには、硫安沈殿
、ジエチルアミノエチル（Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　）　セルロ
ースクロマトグラフィー。

プロティンＡクロマトグラフィーなどの通常の方法を単
独または組合わせて行えばよい。

このようにして得られる組織型プラスミノーゲン活性化
因子に対するモノクローナル抗体はＣＮＢｒＮＢｒ活性
化アゲロスゲルシル活性化アガロースゲル等〔例えば、
ＣＮＢ　ｒ活性化セファロース４Ｂ、トレシル活性化セ
ファロース４Ｂ（いずれも。

ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）等〕と反応
させて固定化し、カラムに充填して用いることができる
。例えば、トレシル活性化セファロースの乾燥ゲルを１
ｍＭ＠酸に懸濁して膨潤させ、次いでゲルを０．５Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８，０）で緩衝化する。次いで膨潤ゲル１ｍＱに
対し抗体２〜８ｍｇを加え、室温で数時間反応させると
抗体はアガロースゲルに固定化される。余分の活性基を
不活化するためトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン−ＨＣＱ緩衝液（０，１Ｍ、ＰＩ（８，０）を過剰量
加え、抗体を固定化したアガロースゲルをカラムに充て
んし、アフイニテイクロマトグラフイーに供する。

一方、細胞培養液は先ず遠心分離またはろ過により細胞
破片などの不溶物を取り除く。得られた清澄液を上で述
べた抗体カラムに通す。抗体カラムには組織型プラスミ
ノーゲン活性化因子及びその関連物質だけが特異的に吸
着され、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子や
種々雑多なたん白質や他の有機物は吸着させず素通りす
る。ついで、ＰＨ６〜９の緩衝液からなる洗浄液で抗体
カラムを洗浄する。洗浄液は、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンアルキルフ
ェノールエーテル等のノニオン系界面活性剤及び塩化ナ
トリウム、塩化カリウム等の塩類を適当量含有する酢酸
緩衝液、リン酸緩衝液等を使用することができる。次に
、ｐ　Ｈ２〜３．５の緩衝液からなる溶出液で抗体カラ
ムに吸着した組織型プラスミノーゲン活性化因子を溶出
する。

溶出液としては、洗浄液と同様の成分を含む緩衝液を使
用することができる。溶出液は直ちにアルカリ溶液、例
えばトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン溶液で
ｐ　Ｈを約７に中和する。この液の中にはウロキナーゼ
型プラスミノーゲン活性化因子や不純たん白質は含まれ
ない。

このようにして得られる第１の発明に係る組織型プラス
ミノーゲン活性化因子は、その関連たん白質を含み、分
子量が均一ではない。そこで、次に、上記溶出液を限外
濃縮器などで濃縮したのち、分子篩にかけるのが好まし
い。分子篩は、デキストラン、アガロース、ポリアクリ
ルアミド等の多孔性ゲル粒子〔例えば、セファクリルＳ
−２００゜セファデックスＧ１５０　（いずれもファル
マシア・ファイン・ケミカルズ社製）等〕をカラム材と
し、ｐＨ６〜９の緩衝液からなる展開液を用いて行なわ
れる。

展開液は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエー
ト、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル等
のノニオン系界面活性剤及び塩化ナトリウム、チオシア
ン酸カリウム等の塩類を適当量含有するトリス緩衝液、
リン酸緩衝液等を使用することができる。２８０ｎｍの
吸光度（Ａ、、、）及びフィブリン平板法による組織型
プラスミノーゲン活性化因子の量を測定し、組織型プラ
スミノーゲン活性化因子の濃度が高く、かつ比活性〔組
織型プラスミノーゲンの濃度（ＩＵ／ｍｌ／Ａ２．。Ｘ
ｏ、７３８　（ｍｇ／ｍｆｆ））の高い分画を集める。

かくして、極めて純度の高い組織型プラスミノーゲン活
性化因子が得られる。

なお１本明細書において、組織型プラスミノーゲン活性
化因子の活性（Ｉ　Ｕ　／　ｍ　Ｑ　）は、世界保健機
構（ＷＨＯ）の組織型プラスミノーゲン活性化因子標準
品を比較物質としてフィブリン平板法で測定したもので
ある。

（実施例） 次に、本発明の実施例を示す。

実施例１ ヒト胎児肺細胞由来線維芽細胞Ｃ４６０（＊１研菌寄第
９９７８号）を７５ｃｄプラスチック製培養フラスコ３
本にそれぞれ１０”個の細胞及び増殖培地１５ｍＱ　（
細胞濃度は６．７　Ｘ　１０’個／ｍＱ）を加え、３７
℃、５％炭酸ガスの雰囲気下で培養した。増殖培地は１
０％牛脂児血清を含むダルベツコ最少培地を用いた。培
養開始後３日目に。

培地を全量、新鮮なものと交換し、更に４日間培養を続
けた６培養開始後７日目に、培養フラスコのうち１本を
とり出し、細胞数を常法により計数するとフラスコ当り
５．４Ｘ１０“個であった。残りの２本のうち、１本に
は生産誘導物質のプロテオースペプトン１％を含むダル
ベツコ最少培地７゜５　　ｍＱを、他の１本には子牛血
清１％及び生産誘導物質のプロテオースペプトン１％を
含むダルベツコ最少培地７．５　ｍＱを加え、培養を続
けた。

翌日にはそれぞれの培養フラスコから細胞培養液を回収
し、培養フラスコには上記のそれぞれの生産誘導培地を
加えて培養を続けた。生産培養−培養液回収のサイクル
を６０日間継続した。回収した細胞培養液中の組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子の量を経口的に測定した結果
を第１図に示す。

また、この時のピーク時及び培養６０日間の平均の組織
型プラスミノーゲン活性化因子の産生量を第２表に示す
。

生産誘導培地としてプロテオースペプトン（１％）のほ
かに血清（１％）を加えたものを用いれば、ピーク時の
組織型プラスミノーゲン活性化因子の産生量が高まるう
え、組織型プラスミノーゲン活性化因子の産生量を高く
維持したまま長期間にわたり培養を継続できる。

なお、培養液中の組織型プラスミノーゲン活性化因子は
次のようにして測定した。先ずウサギにウロキナーゼを
免疫して得た抗ウロキナーゼポリクローナル抗体で検体
（細胞培養液）を前処理（３７℃、１時間）し、検体中
のウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の活性を
完全に阻害した。次いで、プラスミノーゲンに富んだウ
シフィブリノーゲン〔９０％凝固性、マイルス・ラボラ
トリーズ社（Ｍｉｌｅｓ　Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
　Ｉｎｃ、　）　Ｊｌ）　）０．１　　％、アガロース
ＧＰ−３６（牛丼化学薬品（株）製）０．３　％、及び
トロンビン（持出製薬（株）製）２単位／ｍＱで作成し
たフィブリン平板にＷＨＯから入手したヒト組織型プラ
スミノーゲン活性化因子標準品Ｌｏｔ８３１５１７）を
希釈して調製した標準溶液２５０，５００及び１０００
ＩＵ／ｍＱと先に前処理した検体液をそれぞれ１０μＱ
をのせ、３７℃で１６時間保温したのち、生じるフィブ
リン溶解窓の大きさを測定し、標準溶液の溶解窓の大き
さと比較することによって検体液中の組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子の量を測定した。なお、検体または標
準品の希釈液としては、ｐＨ７，５の０．１Ｍリン酸緩
衝液にゼラチンを０．１　％加温溶解したものを用いた
。

以下余白 参考例１ 組織型プラスミノーゲン活性化因子に対するモノクロー
ナル抗体の作製 （１）　［ｌａ　Ｑ　ｂ／　Ｃ７ウスノ１雌のＢａＱｂ
／ｃマウス（５週令）を完全なフロイントのアジュバン
ト・とともにメラノーマ由来の組織型プラスミノーゲン
活性化因子〔−本鎖、アメリカン・ダイアグノスティッ
ク社（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｉｎｃ
、　）製）５０μｇで背中の皮下に注射した。更に７日
目に同様に組織型プラスミノーゲン活性化因子５０μｇ
を皮下に追加投与し、２６日目に組織型プラスミノーゲ
ン活性化因子２５μｇを腹腔内に注射した。

（２）主玉且ユヱム豊亙 ミエローマはＰ３−ＮＳ　Ｉ／１−Ａｇ４１−Ａｇ４−
１（を使用した。通常の培養は８−アザグアニン２μｇ
　／　ｍ　Ｑ及び牛脂児血清１０％を含むＲＰＭ１１６
４０培地１０ｍＱの入った２５ｃＪの培養フラスコで行
った。継代は３〜４日ごとに行い、０．５〜１ｍＱの細
胞浮遊液を新しい培地の入った２５ａ（培養フラスコへ
接種した。融合に用いる１週間前から８−アザグアニン
を含まない培地で培養した。

（３）亙厨鬼査 免疫したマウスの肺臓を摘出し、ステンレスメツシュ上
でつぶして細胞浮遊液とし、牛脂児血清を含まないＲＰ
Ｍ１１６４０培地に懸濁した。一方、ミエローマも牛脂
児血清を含まない培地に懸濁した。

肺細胞５　Ｘ　１０’個とミエローマ５　Ｘ　１０’個
を１５ｍＱの遠沈管にとって混合し、１１０００ｒｐで
５分間遠心分離したのち、上清を捨てた。

遠沈管の中の沈殿した細胞をほぐし、ポリエチレングリ
コール４０００を含む融合剤（ＲＰＭ１１６４０で４０
％Ｗ／Ｗに希釈した）１ｍＱを１分間かけて加えた。更
に血清を含まないＲＰ　Ｍ−Ｉ培地２ｒｎＱを攪拌しな
がら２分間かけて加え、更に同培地１０　ｍ　Ｑを３分
間かけて加えた。その後、１１０００ｒｐで５分間遠心
分離して上清を捨て、１０％牛脂児血清を含むＲＰＭ１
１６４０培地１０ｍｕに培地１得 ト１枚に０．１　　ｍＱ／ウェルずつ接種した。

（４）翔涜］■１久這韮２友込穐亙 牌細胞とミエローマの融合細胞だけが増殖できるＨＡＴ
培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含
む培地）で融合細胞を選択した．すなわち、上述の９６
ウエル細胞培養プレートに接種した細胞をそのまま５％
ＣＯ２雰囲下、３７℃で培養を続け、１日後にＨＡＴ培
地に置換し，更に数週間（ＨＡＴ培地は３〜４日ごとに
交換）、時々倒立型顕微鏡で細胞の状態を１ｉｉｊ！察
しながら培養を継続した。

融合細胞のコロニーが直径１〜２ｎｎに成長したところ
で、培養上清中の抗組織型プラスミノーゲン活性化因子
抗体を酵素抗体法で検出した。

酵素抗体法で陽性のウェル中の融合細胞を次に２４ウエ
ル細胞培養プレートに移し、ＨＴ培地（Ｈ　Ａ　Ｔ培地
からアミノプテリンを除いた培地）で同様に培養した。

融合細胞が培養容器の器壁いっばいに増殖したところで
、再び培養上清中に抗組織型プラスミノーゲン活性化因
子抗体が産生されていることをチエツクし、次に限界希
釈法で融合細胞をクローン化した。すなわち、あらかじ
めフィーダー細胞としてマウスの胸腺細胞を増殖させた
９６ウエル細胞培養プレートに、ウェル当り０．５　〜
１個の細胞が含まれるように融合細胞を接種し、ＨＴ培
地で培養した。

ウェル当り、コロニーが１つしかないことを確認し、そ
のウェルから融合細胞を２４ウエル細胞培養プレートに
移し、細胞を増やした。上記のクローニング操作を繰返
し、細胞を純化し、細胞を液体窒素中に保存した。

かくして組織型プラスミノーゲン活性化因子に対する抗
体を産生する融合細胞株５ＥＯ１−ＧＯ５−ＢＯ６（微
工研菌寄第９９７７号）を得た。

（５）五本立止艮 抗体を多量得るためマウスの腹水に融合細胞株５ＥＯ１
−ＧＯ５−ＢＯ６を接種し、接種後１〜２週間後にマウ
ス腹腔から復水を採取した。

腹水を遠心分離して細胞やにごりを取除き、抗体に豊ん
だ上清液を得た。次いで上清液に４０％飽和となるよう
に硫安を加え冷蔵庫内で一晩放置したのち遠心分離して
沈殿（抗体）を得た。本モノクローナル抗体は、ＩｇＧ
１に分類され、ウロキナーゼと交差反応しないものであ
った。

参考例２ モノクローナル抗体カラムの作製 参考例１で得た抗体をトレシル活性化セファロース４Ｂ
に固定化した。すなわちトレシル活性化セファロース４
Ｂ２０ｇを１ｍＭＨＣ（Ｉに懸濁して膨潤させ１次いで
０　、５　ＭＮａＣＱを０　、　Ｉ　ＭＮａｌｌＣＯｉ
緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したのち、上記抗体約４
００ｍｇを加え、室温でゆっくりかき混ぜながら４時間
反応させた。反応後抗体を固定化したゲルをカラムにつ
め、０．１　　Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）をカ
ラム容量の２０倍量流し。

ゲル中の活性基を不活化した。

実施例２ ４９０ｄロ一ラボトル１０本にそれぞれ５％ウシ胎児血
清を含むダルベツコ最少培地各１００ｍＱを注ぎ、ヒト
胎児正常肺由来線維芽細胞０４６０（微工研菌寄第９９
７８号）をローラボトル１本当り６　Ｘ　１０’個植付
けたのち、ローラボトル培養装置上、３７℃で、毎分０
．５　回転の速さでローラボトルを回転しながら培養し
た。培養開始後４日目には培養液を同量の新鮮なものと
交換し、更に培養を続けた。培養開始後７日目には細胞
はローラボトルの器壁にほぼいっばいの状態で増殖して
いた。培養液を取除き、次に、それぞれのローラボトル
に１％トリプトン及び子牛血清１％を含むダブルベツコ
最少培地（生産誘導培地）各１００ｍＱを加え、更に２
日間培養する。該培養液を回収し、再び同量の上記の生
産誘導培地を加え、更に２日間同様に培養した。このよ
うにして培養液の回収・生産誘導のサイクルを合計２０
回（４０日間の誘導生産）繰返した。回収した培養液を
プールするとその液量は２０Ｑで、その培養液中の組織
型プラスミノーゲン活性化因子の活性を実施例１と同様
に測定したところ９００ＩＵ／ｍＱであった。

このようにして得られた培養液２０Ｑを、参考例２で得
たモノクローナル抗体カラムに通塔した。

カラムを０．１　％ポリオキシエチレンソルビタンモノ
オレエート及び０．５ＭＮａｃＱを含む０．２Ｍ酢酸ナ
トリウム溶液で十分洗浄し、次いでカラムに０．１　　
％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート及び０．
５ＭＮａＣＱを含む０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３，０）
を流し、吸着たん白質を溶出した。溶出液をトリス（ヒ
ドロキシルメチル）アミノメタンでＰＨを約７に中和し
たのち、限外濃縮器で濃縮し、次いであらかじめＰＨ７
，５のバッファで平衡化したセファクリル５２００に負
荷し、ゲルろ過した。展開液は０．１　　％ポリオキシ
エチレンソルビタンモノオレエート、１．６ＭＫＳＣＮ
を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７。

５）である。ゲルろ過液は約３ｍＱずつ分取し、分取液
の２８０ｎｍの吸光度とフィブリン平板法による組織型
プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）の活性値を求め
、活性の高い両分をプールした。

活性の高い両分の液量は５０ｍ＜１．たん白質の濃度は
０．４０ｍｇ／　ｍ　Ｑ　、　Ｔ　Ｐ　Ａの濃度は２０
８　、０００丁Ｕ／ｍＱ　　、比活性は５２０，０００
　Ｉ　Ｕ　／　ｍ　ｇであった。

得られたＴＰＡは前記したａ）乃至ｆ）及びｇ）の性質
を満足するものであった。特に、分子量については、上
記ゲルろ過の結果を第２図に示す。

第２図中、ピーク３はブルーデキストラン２０００のピ
ーク、ピーク４は牛血清アルブミンのピーク、ピーク５
は卵白アルブミンのピーク及びピーク６は実施例２で得
られたＴＰＡのピークである。等電点測定の結果を第３
図に示す。還元処理に対する挙動において還元処理しな
いものは分子量約６７０００に単一のたん白質がａｍさ
れたが、還元処理したものは分子量約６７．０００　に
たん白質はほとんどみとめられず、分子量３０，０００
付近に二つのたん白質を認めた。

上記組織型プラスミノーゲン活性化因子について、各種
合成基質に対する比活性及び血栓溶解能を次のとおり測
定した。

（ｉ）比活性： 実施例２で得たたん白質（２８０ｎｍの吸光度に係数０
．７３８　　を乗じてたん白質の濃度とした）と組織型
プラスミノーゲン活性化因子の活性（ＩＵ）を測定し１
両者の比から比活性を求めると４００，０００　Ｉ　Ｕ
　／　ｍ　ｇ　であった。

（ｉｉ）血栓溶解能： 血栓溶解能をチャンドラ−・ループ法 （Ｃｈａｎｄｌｅｒ、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７
巻、１１０〜１１４頁（１９５８年）参照〕により測定
した。

血液はヒト新鮮血を用い、血栓形成時間は３０分、血栓
溶解時間は４時間で行ったところ、血栓を５０％溶解す
る実施例２のＴＰＡの濃度は０．１５　μｇ　／　ｍ　
Ｑであるのに対し、ウロキナーゼでは０．８５　μｇ　
／　ｍ　Ｑで、実施例２のＴＰＡの血栓溶解能はウロキ
ナーゼに比べ約５倍強力であることがわかった。

〔発明の効果〕

本発明によると、ヒト正常肺組織由来の線維芽細胞の培
養により、組織型プラスミノーゲン活性化因子を収率よ
く取り出すことができ、−たん増殖させた貴重な正常細
胞を短期の使い捨てではなく、１〜３力月間もの長期に
わたり繰返し、組織型プラスミノーゲン活性化因子の生
産用に使用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、血清及び生産誘導物質を含む培地で組織型プ
ラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）を生産したときと
、比較として生産誘導物質は含むが血清を含まない培地
でＴＰＡを生産させたときのＴＰＡ生産量の経口変化を
プロット及びグラフ示し、第２図は実施例２で得られた
ＴＰＡの分子量を測定した結果を示し、及び第３図は実
施例２で得られたＴＰＡの等電点を測定した結果を示す
。 １・・・生産誘導物質は含むが血清を含まない培地、２
・・・血清及び生産誘導物質を含む培地、３・・・ブル
ーデキストラン２０００．４・・・牛血清アルブミン、
５・・・卵白アルブミン、６・・・本発明物質。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト正常肺組織由来の線維芽細胞を血清及びペプト
   ン類を含む培地で培養し、培養液を精製することを特徴
   とする組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造法。 ２、ヒト正常肺組織由来の線維芽細胞が血清を含む培地
   で増殖させたものである特許請求の範囲第１項記載の組
   織型プラスミノーゲン活性化因子の製造法。 ３、組織型プラスミノーゲン活性化因子が次の性質を有
   するものである特許請求の範囲第１又は第２項記載の組
   織型プラスミノーゲン活性化因子の製造法。 ａ）分子量：６７，０００±１０，０００ ｂ）等電点：主に６．８〜８．０の範囲内に分布する ｃ）抗ウロキナーゼポリクローナル抗体による活性の阻
   害：阻害されない ｄ）還元処理に対する挙動：分解 ｅ）合成基質▲数式、化学式、表等があります▼に対す
   る解離定数：約４×１０＾−＾４モル／ｌ ｆ）熱安定性：６０℃で１０時間の加熱により約６０％
   が失活する