JPH02163084A - ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（以
後ｔＰＡと略す）の製法に関する。

ｔＰＡは、血管内皮細胞及び種々の組繊細胞から生産さ
れ血栓の本体であるフィブリンを溶解し、血栓症の治療
薬として有効なものである。

〔従来の技術〕

ｔＰＡを製造する方法は、既に数々の方法が堤案されて
いる。その代表的方法としては、例えば、ｔＰＡのＤＮ
Ａ配列を適当なプロモーターに接続し、この配列を発現
ヘククーに組み込んで宿主細胞を形質転換した組み換え
生産細胞を、ｊ閂切な培地で培養しｔＰＡ生産を行い、
培地中に蓄積されたＬＰＡをアフィニティ力ラムおよび
ゲル濾過カラム等で精製してｔＰＡを得ている。

このような方法において、ｔＰＡを産生させる培地は、
通常、無機塩、アミノ酸、ビタミンなどを添加した例え
ばイーグルの基本培地（ＭＥＭ）、ダルペンコ変法イー
グル培地（ＤＭＥＭ）などを基本として、Ｌ−グルタミ
ン酸及び牛胎児血清（Ｆｅ２）を１〜１０％並びに重炭
酸ナトリウムを１〜２ｇ７Ｎを加えてｐｉを６．５〜７
．５に調整したものが用いられる。

例えば、変法イーグル培地を用いて牛胎児血清を１０％
、重炭酸ナトリウムを１．２ｇ＃！及びＬ−グルタミン
を適量添加して培養せしめた後、血清を除いた同一組成
の培地で洗浄し、血清を除いた培地にアプロチニンを加
えて生産させる方法（ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ルケミストリー　２５巻、　ｐ、７０３５〜）が知られ
ている。

また例えば、ヒト正常細胞由来ＬＰＡをコードするＤＮ
Ａ配列をヒトメタロチオネインをプロモーターとしてＢ
ＰＶ由来プラスミドの一部及びｐＢｒ１３２２プラスミ
ドの一部及び転写停止に必要なりＮＡ配列などを組み込
んで構築したプラスミドを、マウスＣ−１２７細胞に形
質転換して得られたｈＴ３８２株を用いて、ＤＭＥＭに
牛胎児血清を１０％添加したもので培養せしめた後、同
一の組成で塩化亜鉛を１０μＭ及びｐ−アミノメチル安
息香酸を１０−”Ｍを加えた培地でｔＰＡを生産させれ
る方法がある（特願昭６３−１２２６４４　’）。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記のような技術によれば、単位細胞あたりのｔＰＡ生
産量はいずれにおいても極めて少なく、生産性が劣り、
市場に安定に供給する方法としては製造コストの高いも
のとなっていた。

ｔＰＡの生産性を向上させる添加物として主に１本鎖の
ＬＰＡのみを効率良く取得するためにεアミノカプロン
酸、トラネキサム酸など低分子の抗プラスミン剤を添加
する方法が提案されている（特開昭６２−４２３３　、
特表昭６３−５０２７２６）。また、ｔＰＡ自体の生産
性を向上させるためにレクチンなどを添加する方法（Ｆ
ｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　１（２）、１９８７ｐ、１０
３〜１０８）、ｃＡＭＰ（アデノシフ３’、５’　サイ
クリックモノフォスフェート）あるいはＤＢｃＡＭＰ（
シフ゛チルアデノシン３゛、５“サイクリックモノフォ
スフェート）などの蓄積により著しくｔｐＡの生産性が
向上することが報告されている（キャンサーリサーチ　
４３．１９８３．　ｐ、５９２２〜５９３０　）。

低分子の抗プラスミン剤を添加する方法は、１末鎖ｔＰ
Ａの比率を高めるものの生産量を大幅に高めるものでは
ない。

また、レクチン、ｃＡＭＰ　　ＤＢｃＡＭＰなどを直接
添加する方法はコスト的に見ても工業的生産方法とは言
い難い。

本発明の課題は、単位細胞光たりのｔＰＡの生産能力の
高い生産方法を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

このような発明の課題を解決するために本発明者らは鋭
意検討した結果、ｔＰＡ生産においてその培地に短鎖飽
和脂肪酸を添加することによりその生産性を大きく向上
させることができるのを見出し、本発明を完成するに到
った。

すなわち本発明は、一般弐　ＣＨｓ　（ＣＨ２）　、、
Ｃ００ＩＩ（ｎ−０〜５）で表される短鎖飽和脂肪酸を
培地中に添加することを特徴とする、細胞を使ったヒト
組織型プラスミノーゲン活性化因子の製造方法である。

本発明の方法において培地中に添加される短鎖飽和脂肪
酸の量は１０−’Ｍ−１０−’Ｍであり、好ましくは１
０弓Ｍ〜１０）Ｍである。

短鎖飽和脂肪酸の種類は特に制限はないが、プロピオン
酸、ｎ−酪酸、ｎ−吉草酸が好ましく用いられる。また
短鎖飽和脂肪酸は、例えばＮａ塩などのアルカリ金属塩
、Ｃａ塩などのアルカリ土類金属塩の形態で、あるいは
そのエステルの形態で使用することも可能である。さら
に短鎖飽和脂肪酸に他の添加物、例えばアプロチニン、
トラネキサム酸などの抗プラスミン剤あるいは界面活性
剤などを同時に添加して使用することも可能である。

本発明において、短鎖飽和脂肪酸を添加することにより
ｔＰＡの生産性が大幅に向上する理由については必ずし
もち明らかでないが、本物質の添加によりｃ　Ａ　Ｍ　
Ｐ　類のレヘルが調整されてｔＰＡの生産を誘発するか
らではないかと推測される。

本発明において使用されるＬＰＡ生産細胞としては、例
えば、ヒト正常細胞由来ヒト組織型プラスミノーゲン活
性化因子をコードするＤＮＡ配列をヒト由来メタロチオ
ネインのプロモーターに接続し、ＢＰＶ由来プラスミド
の一部及びｐＢＲ３２２プラスミドの一部および転写停
止に必要なりＮＡ配列などを組み込んで構築したプラス
ミドを、マウスＣ−１２７細胞に形質転換して得られた
ｔＰＡ生産株、ｈＴ−３８２株などが使用できる（特開
昭６２−１２６９７８）。また、例えば、ヒト正常細胞
由来ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子をコードす
るＤＮＡ配列を５Ｖ−４０の初期プロモ−ターを接続し
たＤＮＡ配列とジヒドロ葉酸還元酵素をコードするＤＮ
Ａ配列からなるプラスミドで、ＣＨＯ（チャイニーズハ
ムスター卵巣）１．ＩＩＪ胞を形質転換し、更にメソト
ロキサートを含む培地で遺伝子の増幅した細胞を選択し
て得られたｔＰＡ生産株、ＳＶ−２１−Ｍ２．５に７株
などが使用できる（特開昭６２−１２６９７８）、もち
ろん、突然変異、馴化などの手段を併用したもの、また
はウィルス等により形質転換された細胞などいずれもｔ
ＰＡ生産株であれば使用できる。

使用する培地は、ＤＭＥＭ、ＭＥＭなどに予め不活性化
させた牛胎児血清（ギプコ社製）を１０％程度添加した
物が使用されるが、成分濃度などは必要に応して変更で
きる。また、必要に応して界面活性剤など第三成分を添
加してもよい。

生産培地を使用する場合、ｔＰＡの生産を誘導する物質
として亜鉛、カドミウムもしくはその塩を添加する。添
加量は１〜１００μｇ／ｌである。

生産方法は、特に限定されるものではなく、例えば、次
のような方法で行われる。ルーフラスコに培地を仕込み
、細胞の適切量をうえつけて、適温、適切な時間、炭酸
ガスインキュヘーター中で増殖させ、コンフレンドに達
した後、生産培地と切り換え同じく炭酸ガスインキュヘ
ーター中で適温、適時ｔＰＡの生産を行う。具体的６−
は、７５ｃＪのルーフラスコを使用してＤＭＥＭに牛胎
児血清を１０％ならびに重炭酸ナトリウムを１〜２ｇ／
２を加えてｐｕを６．５〜７．５に調整した培地を２０
ｍ１仕込み、細胞を１〜２×ｌＯＳケ／　ｍｌを植え付
け、３７°Ｃ１１〜３日間培養後無菌的に培養液を抜き
だし、上記培地に亜鉛を５０　）ｔ　ｇ　／　ｍｌおよ
び抗プラスミン剤を適量および短鎖飽和脂肪酸を適量加
えた培地２０戚にて生産せしめる。

（発明の効果〕 本発明の方法によれば、短鎖飽和脂肪酸を培地中に添加
させることによりｔＰＡの生産量を大幅に向上させるこ
とができる。

〔実施例〕

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１ ｔＰＡの生産に用いた細胞は、ヒトメタロチオネインを
プロモーターとしてＢＰＶ由来プラスミドの一部および
転写停止に必要なりＮＡ配列などを組み込んで構築した
プラスミドをマウスＣ−１２７細胞に形質転換して得ら
れたｈＴ−３８２株を使用した。

７５ｃＪのルーフラスコにＤＭＥＭ　（ギブコ社製）お
よび予め不活性化させた牛胎児血清を１０％添加したも
のを２０ｍ１仕込み、ｌＸＩＯ３ケ／　ｍｌとなるよう
に植えた。

炭酸ガスインキュヘーター中で３７“Ｃ１４日間培養し
、コンフレンド（細胞数１０　Ｘ　１０５ケ／ｍりに達
した時点で培地を捨て、同一の組成で塩化亜鉛ヲ１０μ
Ｍ、アプロチニン４０Ｋ　ＩＩＪとなるように、及び表
１に示す各濃度でプロピオン酸、ｎ−酪酸を添加した培
地を２０ｄずつ加えて炭酸ガスインキュヘーター中で３
７゛Ｃ１２日間ｔＰＡを生産させ、その時点での生産培
地中でのｔＰＡｆｉ度を分析し、表１のような結果を得
た。なおｔＰＡｆｉ度の分析は注１の方法によった。

表１ 実施例２゜ ｔＰＡの生産に用いた細胞は、ｔＰＡをコードするＤＮ
Ａ配列をＳＶ−４０の初期ブローモーターを接続したＤ
ＮＡ配列と、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードするＤＮＡ
配列からなるプラスミドでＣＨＯ（チャイニーズハムス
ター卯１）細胞を形質転換し５、さらにメソトロキサー
トを含む培地で遺伝子の増幅した細胞を選択して得られ
たＳＶ２１−Ｍ２．５に７株を使用した。

実施例１と同様な培地（ただし塩化亜鉛は添加せず）で
同様な方法で行い、表２のような結果を得た。

表２゜ ン主１ 実施例における培地中の１木鎖ｔＰＡの分析方法（ＥＬ
ＩＳＡ法）を以下に示す。

■ＥＬＩＳＡ専用プレート（コーニング社９６　ｗｅｌ
ｌ）を用い、１木鎮ｔＰＡに対するモノクロナール抗体
（ＰＡＭＩ　　アメリカンダイアゴノティカ社）をコー
ト溶液で希釈してほぼ１０μｇ７ｍｌとし、各プレート
の−ｅｌｌに５０μβずつ加え室温で２時間放置後、ｗ
ｅｌｌ内の液を捨てる。

■洗浄液で洗浄後、各−ｅｌｆをプロンキング溶液で満
たし、室温で３０分以上放置する。　１０００〜２００
０倍に希釈したサンプル及びスタンダード（０、■、２
．４．１３　ｎｇ／ｍｅ）を各５０μｆずつ各−ｅｌｆ
に加えて２時間放置する。

■洗浄液で洗浄した後、抗ｔＰＡウサギ抗体を添加する
。

■洗浄液で洗浄後、Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ　Ｒａｂｉｔ　
［ｇＧ、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅ　（シグマ社〕を５００倍に希釈して各
ｗｅｌｌに５０μ２ずつ添加し１時間放置す■洗浄液で
洗浄後、基Ｍ溶液（ｐ−ｎｉｔｒｏ　ｐｈｅｎｙｌｐｈ
ｏＳｕｐｈａ　Ｌｅ　　シグマ社）を各−ｅｌｆに５０
ｕｌずつ加えて３０分間放置する。

■各−ｅｌｌに５０ｕｅずつ３Ｎ　Ｍａｉｌ（を加えて
酵素反応を停止する。

■４０５ｎｍにおける吸収を市販のＥＬＩＳＡ　　ＲＥ
ＡＤＥＲで読み取る。

■スタンダードより検量線を作製し、サンプル中のＬＰ
Ａ濃度を測定する。

■計算法 ｌ＊鎖　ｔＰＡ量−ＰＡＭＩ測定量 特許出願人　三井東圧化学株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式ＣＨ＿３（ＣＨ＿２）＿ｎＣＯＯＨ（ｎ＝
   ０〜５）で表される短鎖飽和脂肪酸を培地中に添加する
   ことを特徴とする、細胞を使ったヒト組織型プラスミノ
   ーゲン活性化因子の製造方法。
2. （２）短鎖飽和脂肪酸が、プロピオン酸、ｎ−酪酸、ｎ
   −吉草酸より選ばれた１種以上である請求項１記載の方
   法。