JPS6336782A - ヒト組織プラスミノゲン活性化因子の産生法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、培養細胞を用いたヒト組織プラスミノゲン活
性化因子（以下、ＴＰＡと略記する）の産生法に係る。

更に詳しくは、本発明は６−アミノヘキサン酸、トラン
キサム酸或いはＬ−リジン等のω−アミノ酸を添加した
培地を用いることを特徴としたＴＰＡの高度産生法（こ
係る。

ＴＰＡは血液中に存在するプラスミノゲンをプラスミン
に変換する作用を有し、種々の血栓症の治療薬として用
いられている。

（従来の技術） １’　Ｉ’　Ａの製造法として、本因子を生産する細胞
株を培養し、培養液から精製する方法がある〔Ｄ。

Ｃ３ｌｉ　ｊｋｅｎとり、Ｃｏｌ　Ｉｅｎ（１９８１年
〕ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、
２５６巻、７ｏ３５頁〕。またＴＩ’ＡのＤＮＡ配列に
５ｖ４ｏの初期プロモーターを接続したＤＮＡ配列とジ
ヒドロ葉酸還元酵素をコードするＤＮＡ配列から成るブ
ラヌミドでｃｔ−ｔ　Ｏ（チャイニーズ　ハムスター卵
巣）細胞を形質転換し、更にメントロキセートを含む培
地で遺伝子の増幅した細胞を選択し、その細胞を利用し
てＴ　Ｐ　Ａを生産する方法が知られている（′Ｉ、シ
開昭５９−４２３２１）。カウフマンら（Ｋａｕｆｍａ
ｎ。

ＩＮ、Ｊ、ら（１９８５年）モレキュラー・アンド・セ
ルラー・バイオロジー、５巻、１７５０ｉ）は、同様な
方法によって得たＴＰＡの高度産生ＣＨＯ細胞が、自ら
分泌するＴ　Ｐ　Ａによって培地中に含まれる血／ｉ！
ｆ成分であるプラスミノゲンからプラスミンを生成し、
更にこのプラスミンが細胞の形態変化、培養器壁からの
細胞の剥離を起すことを報告している。この細胞の形態
変化、培養器壁からの剥離は、培地にアプロチニン等の
プロテアーゼインヒビターを加えること、或いは培地に
加える血清からプラスミノゲンを除去することにより防
ぐことが可能であると報告している。

（発明が解決しようとする問題点） Ｔ　Ｐ　Ａの産生細胞がＴＰＡの作用によって生成した
プラスミンによって形態変化を起し、培養器壁から剥離
するということは、その細胞の生育が器壁への付着と強
い連関がある略合、細胞の生育の低下、Ｔ　Ｐ　Ａ産生
能の低下、更には細胞の死滅へとつながっていく。

本発明者らは、ＴＰＡ発現ベクターの導入によって高Ｉ
ＣＣにＴ　Ｐ　Ａを産生ずるようになった細胞が、培養
を＆ｃし高密度に生育した時、細胞の形態変化、培養器
壁からの剥離及び生育の低下、史にはＴＰＡ生産性の低
下を起すことを観察した。これらのことはＴＩ’Ａの生
産−り大きな問題点である。

Ｋａｕｆｍａｎらはアプロチニンの培地への添加やプラ
スミノゲンを除去した血清を用いることにより、上記細
胞の形態変化や器壁からの剥＝＋１等の問題を解決しよ
うとしたが、アプロチニンは高価な物質でありまた血清
からプラスミノゲンを除去することは煩雑な操作が必要
である。

本発明者らは−Ｆ記問題点を解決する為に研究を行った
結果、プラスミノゲンのリジン結合部位に親和性を有す
るω−アミノ酸類（ｙｉｏｌａｎｄ。

１３、Ｌ、ら（１９７８年）ザ・ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー、２５３巻、５３９５頁〕
を添加した培地を用いることにより、細胞の形態変化、
器壁からの剥離、ＴＩ’Ａ生産性の低下を防ぐことを見
い出し、本発明に至った。

本発明によって産生されたＴＰＡは精製の結果、一本箱
ＴＰＡであることが見い出された。このことはｍ−アミ
ノ酸類の培地への添加は、一本箱ＴＩ’Ａの生産上にも
効果的な方法と推定される。

（問題点を解決するための手段） ’１’　Ｐ　Ａ高生産株の形態変化、培養器壁からの剥
離及びＴＰＡ生産性の低下の抑制の為に培地に添加する
０ノーアミノ酸は、４−アミツブクン酸、５−アミノペ
ンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７−アミツブクン酸
、８−７ミノオクタン酸、トランキサム酸或いはＬ−リ
ジンが適切であるが、池にプラスミノゲンのフィブリン
結合部位と親和性を有するω−アミノ酸ならどのような
ω−アミノ酸でも良い。添加するω−アミノ酸の適切な
濃度は、それぞれのω−アミノ酸ごとに異なるが、細胞
の生育が保持できる濃度であればどのような濃度でも良
い。例えば６−アミノへキサン酸は０、０’　５　ｍ　
Ｍ乃至７ＱｍＭの終濃度を与えるように加えるのが好ま
しい。Ｌ　−リジンは通常細胞の培養に用いられている
培地に含まれているが、それらの培坤に含まれている濃
度ではＴＰＡ高生産株のＴ　Ｐ　ｋの生産性の低下を抑
えることはできない。

従って、ＴＰＡの生産性の低下を抑制する為には、Ｌ−
’Ｊリジン培地に更に添加する必要がある。効果的なＬ
−リジンの添加量は終濃度１０ｍＭ以上にあると思われ
る。

（１７−アミノ酸はプラスミノゲンのリジン結合部位に
結合することにより、ＴＰＡの生産性の低下抑制効果を
発揮するが、別の作用を持つアプロチニン等のプロテア
ーゼインヒビターと併用することにより更にその効果を
高めることができる。またリジン−セファロース等で部
分的にプラスミノゲンを除いた血清を用いた培地に添加
すること番こよってもその添加効果を高めることができ
る。

１’　ｌ’　Ａの生産に用いる細胞は実施例に示したよ
うに、遺伝子組換えの手法を用いたＴ　Ｐ　Ａ生産性形
質転換細胞のみならず、突然変異によってＴＩ’Ａの高
生産株になった細胞、ウィルスやウイルスＤ　Ｎ　Ａ或
いは発癌遺伝子その他によって形質転換された細胞とそ
れらの親株細胞等、ＴＰＡを生産するどのような細胞で
も用いることができる。

実施例に示したように、ω−アミノ酸を添加した培地で
細胞を培養した結果産生されたＴＰＡは、精製の結果、
−末鎖ＴＰＡであることが判明した。

このことはω−アミノ酸の培地への添加が一本鎖ＴＰＡ
の生産に効果的であることを示している。

（実施例） 以下に実施例船こより本発明を説明する。

実施例１ ω−アミノ酸添加培地をこよるＴＩ’Ａの産生１”ＰＡ
ｃ７）産生に用いた細胞は、ＣＩ（Ｏｄｈｆｒ−株（Ｕ
ｒｌａｕｂ、Ｑ、とＣｈａｓｉｎ、Ｌ。

（１９８０年）プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミ−・オプ・サイエンス・ニーニスニー、
７７巻、４２１６頁〕をＴＰＡ発現ベクターＴ）ＳＶｅ
Ｉ’Ａ−１とＩ）ＳＶ２ｄｈ　ｆ　ｒ（Ｓｕｂｒａｍａ
ｎｉ、　Ｓ、ら（１９８１年）モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー。

１巻、８５４頁〕でコトランスフエクションした細胞を
更を３１００ｍＭのメソトロ午セードを含む培地で選択
した細胞Ｄ０１３９９１である。

ｐｓＶｅＰＡ−１の構造とその形質１販換細胞の取得法
については特願昭６０−１５２８１０に記述した。

Ｔ　Ｉ）Ａ生産株ＤＯ１３９９１をω−アミノ酸、５％
牛脂児血ｒｎを含むヌクレオシド含有Ｍ　Ｅ　Ｍα培地
（ＯＩ　１０００社製）を用い、１２穴マルチウエルプ
レート（４，５Ｃｍ／ｗ　ｅ　ｌ　Ｉ　）に４ＸＩＯ５
細胞／ｗｅｌｌ／２ｃｃ培地で植えた。３７°Ｃ４日間
培養後、毎１］培地を更新し更（こ３目間培養した。

各培養時の培地に含まれるＴＩ’Ａ活性と生細胞数彎 を測定した。表１に示したようにＯｆ−アミン　添加し
ないコントロールに比べ、６−アミツヘキザン酸、トラ
ンキサム酸或いは高濃度のＬ　−’Ｊリジン添加した培
地ではＴＰＡの産生及び生細胞数のいずれもが高かった
。

尚ＴＰＡ活性はプラスミノゲン含有フィブリン平板を用
いて測定した（Ｍａｃｋｉｅ、５１．ら（１９８１年）
ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー、４
７巻、７７頁〕。活性はウロキナーゼ（ミドリ十字）の
活性に換算してユニットで示した。

Ｃ以下余白） 実施例２ ’Ｉ’　Ｐ　Ａの精製 Ｔ　Ｉ）　Ａ生産株ＤＯ１３９９］を１０ｆｆＢｖ［６
−アミノヘキサン酸、２５Ｕ／Ｍｔアプロチニン、５％
牛脂ｌ／、４血清を含むヌクレオシド含有Ｍ　Ｅ　Ｍα
培地を用い培養し、培養液１４を得た。亜鉛キレ−ティ
ングセファロース、Ｃ０ｎＡ−セファロース、リジン−
セファロース、七フアクリルＳ−２００（以上ファルマ
シア社製）によるクロマトグラフィー（こよりＴＰＡを
精製した。精製したＴ　Ｐ　Ａを２−メルカプトエタノ
ールで還元後、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行った結果、分子量６５，０００のバンドが検出さ
れ、精製されたＴ　ｌ）ノ〜が一本鎖ＴＰＡであること
が明らかとなつｔこ。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ω−アミノ酸を添加した培地で細胞を培養し、ヒ
   ト組織プラスミノゲン活性化因子を生成させることを特
   徴とするヒト組織プラスミノゲン活性化因子の産生法。
2. （２）ω−アミノ酸が、Ｌ−リジン、４−アミノブタン
   酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、７
   −アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸或いはトラ
   ンキサム酸の何れかである特許請求の範囲第１項記載の
   産生法。
3. （３）細胞が、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子発現
   ベクターによつて形質転換された細胞である特許請求の
   範囲第１項または第２項記載の産生法。