KR20120102788A - 부착성 세포를 배양하는 방법 - Google Patents

부착성 세포를 배양하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 부착성 세포를 배양 배지에 미세캐리어를 포함하는 배양 용기 내로 도입하고, 이 동일한 용기 내에서 수차례의 연속적 세포 계대를 수행하며, 매 회 계대 시 후속 세포 계대를 수행하기 위해 선행 세포 계대의 세포 집단의 전부 또는 일부를 사용하는, 부착성 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생물학적 제제의 생산, 특히 백신 또는 약물의 제조를 위한 이 방법의 용도에 관한 것이다.

Description

부착성 세포를 배양하는 방법{Method for culturing adherent cells}
본 발명은 부착성 세포를 배양 배지에 미세캐리어를 포함하는 배양 용기 내로 도입하고, 이 동일한 용기 내에서 수차례의 연속적 세포 계대를 수행하며, 매 회 계대 시 후속 세포 계대를 수행하기 위해 선행 세포 계대의 세포 집단의 전부 또는 일부를 사용하는, 부착성 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생물학적 제제의 생산, 특히 백신 또는 약물의 제조를 위한 이 방법의 용도에 관한 것이다.
1980년대에, 미세캐리어 상에서 세포를 배양하는 기술의 개발은 부착성 세포의 대규모 생산 및 그로 인한 생물학적 제제의 생산을 용이하게 하였다. 그럼에도 불구하고 약학적 용도를 위한 생물학적 제제의 생산을 목적으로 하는 부착성 세포의 생산은 특정 횟수의 조절 요건들, 특히 세포의 형태학적 및/또는 생물학적 변형의 위험으로 인해 특정 횟수의 "세포 계대"를 벗어난 부착성 세포의 사용을 규제하는 요건들을 준수해야만 한다. 이는 베로 세포주의 경우에 더욱 그러하다.
미국특허 제4,664,912호는 운영 중인 세포 은행으로부터 유래하는 세포 종자로부터 1 회분의 부착성 세포를 생산하기 위해 산업적 규모로 사용되는 방법을 기술한다. 이 방법은 다른 생물반응기 내에서 각 회차가 진행되는 연속적 세포 계대를 근거로 하는데, 이의 작업 부피는 연속적 세포 계대 과정 내내 증가한다. 이는 각 회차에서 미세캐리어의 양을 증가시킴과 동시에 일반적으로 1과 5 g/L 사이인 배양 배지 내 미세캐리어의 최적 농도를 유지시킨다. 따라서 세포 바이오매스는 목적하는 산업적 회분의 세포가 수득될 때까지 연속적 세포 계대에 걸쳐서 증가한다. 한 생물반응기로부터 다른 생물반응기로의 세포의 이동은 트립신 처리에 의해 부착성 세포를 탈착시킨 후 세포의 온전성 (integrity)을 가능한 보존하기 위해 배지 내에 혈청 단백질 또는 혈청을 도입하여 효소의 작용을 차단한 후에 수행된다. 그 후에 수득된 세포 부유액을 다량의 새로운 미세캐리어를 포함하는 더 큰 생물반응기 내로 (사용된 미세캐리어의 존재 또는 부재 하에서) 옮긴다. 그러나, 이 방법은 부착성 세포의 산업적 생산을 위해 다량의 재료의 사용 및 취급을 요구하고, 이는 생물학적 제제의 생산비에 영향을 미친다.
생물학적 제제의 생산에 사용하고자 하는 부착성 세포의 생산비를 절감하기 위하여, 유럽특허 제1060241호는 더 이상 매 회마다 운영 중인 은행으로부터 입수된 세포 종자로부터 다시 시작할 필요가 없어 산업적 회분의 세포를 생산하는데 바람직한 더 신속한 생산 방법을 제안한다. 이 방법은 세포 바이오매스를 계속 증폭하고 산업적 생산 회분의 세포를 구성하기 위해 각각의 세포 계대 후, 세포의 대부분 (세포 바이오매스의 80 내지 90%)을 하나 이상의 다른 생물반응기로 옮기면서, 나머지 10 내지 20%의 세포는 후속 회분의 세포가 생산될 수 있는 "피더 세포"의 스톡 (stock)을 보존하기 위해 유지하는 것으로 구성된다. 그럼에도 불구하고 이 방법은 하기의 결점을 갖는다:
- 이들이 모두 동일한 횟수의 세포 계대를 갖지 않는 한 생산된 세포 회분은 약간의 이질성을 나타낸다;
- 각각의 이동 작업 시점에서 배양액 내 "피더" 스톡의 유지는, 수행된 횟수의 세포 계대와 직접적으로 연관되는 세포의 "노화"를 불가피하게 야기하게 되고, 따라서 이미 언급된 바와 같은 조절 요인들로 인해 제한된 기간 동안에만 사용될 수 있다.
트립신과 같이 세포의 온전성에 유해한 단백질 분해효소의 사용을 생략하기 위해서, 올슨 등 (Ohlson et al., in Cytotechnology (1994), vol. 14, pages 67-80)은 임의의 효소적 처리의 부재 하에서 미세캐리어에서 미세캐리어로 부착성 세포의 이동 기술을 기술한다. 부착성 세포로 뒤덮인 미세캐리어와 빈 미세캐리어 사이의 근접 접촉은 세포가 증폭될 수 있는 빈 미세캐리어 상으로 세포의 이동을 촉진하므로, 빈 미세캐리어를 부착성 세포로 뒤덮인 미세캐리어를 포함하는 배양 배지에 첨가하고 미세캐리어들간의 접촉을 촉진하기 위해 배양 배지의 간헐적 교반을 수행한다. 그럼에도 불구하고, 생산된 세포 집단은 세포들이 다양한 단계의 세포 주기에 있기 때문에 "비동기화된 (desynchronized)" 상태이고, 이는 생물학적 제제의 생산에 주된 결점일 수 있다.
생산비를 절감하기 위해, 부착성 세포의 대규모 생산 및 또한 이로부터 유래하는 생물학적 제제의 생산을 위한 방법의 최적화가 여전히 요구된다.
이러한 취지로, 본 발명의 목적은,
하기에 따르는, 부착성 세포를 생산하는 방법이다:
a) 부착성 세포를 배양 배지 내에 미세캐리어를 포함하는 배양 용기 내로 도입하는 단계;
b) 상기 세포를 동일한 배양 용기 내에서 연속적 세포 계대를 수행하여 증폭시키는 단계로, 첫 번째 세포 계대 이후의 각각의 세포 계대가:
i) 미세캐리어로부터 세포를 탈착하기 위해 세포 집단을 효소적 처리에 적용한 후에, 선행 세포 계대 동안에 수득된 세포 집단의 전부 또는 일부를 사용하고,
ii) 배양 배지 및 증가한 양의 미세캐리어의 도입에 의해 수행되는 단계;
c) 미세캐리어로부터 세포를 탈착하기 위해 선택적으로 세포 집단을 효소적 처리에 적용한 후에 최종 세포 계대 동안에 생성된 세포 집단을 수득하는 단계.
본 발명의 목적은 또한,
하기에 따르는, 부착성 세포에 의해 생성된 생물학적 제제를 생산하는 방법이다:
a) 부착성 세포를 배양 배지 내에 미세캐리어를 포함하는 배양 용기 내로 도입하는 단계;
b) 상기 세포를 동일한 배양 용기 내에서 수차례의 연속적 세포 계대를 수행하여 증폭시키는 단계로, 첫 번째 세포 계대 이후의 각각의 세포 계대가:
i) 미세캐리어로부터 세포를 탈착하기 위해 세포 집단을 효소적 처리에 적용한 후에, 선행 세포 계대 동안에 수득된 세포 집단의 전부 또는 일부를 사용하고,
ii) 배양 배지 및 증가한 양의 미세캐리어의 도입에 의해 수행되는 단계;
c) 최종 세포 계대 동안에 생성된 세포 집단을 이들이 생물학적 제제를 생성하도록 처리하는 단계로, 상기 처리가 세포를 증폭하는데 사용한 바와 동일한 배양 용기 내에서 수행되는 것인 단계; 및
d) 생물학적 제제를 회수하는 단계.
생물학적 제제를 생산하는 방법의 한 측면에 따라서, 생물학적 제제는 감염성 제제이고 세포 집단의 처리는 최종 세포 계대 동안에 생산된, 세포 집단을 감염 배지 내 상기 감염성 제제로 감염시킴으로써 수행된다.
하나의 특정 양태에 따라서, 감염성 제제는 광견병 바이러스이고 감염 배지는 동물 기원의 임의의 산물을 포함하지 않는 바이러스 감염 배지이다.
일반적으로, 동일한 배양 용기 내에서 수행되는 세포 계대의 횟수는 2회, 3회 또는 4회이다.
최초 세포 계대 동안 배양 배지 내 미세캐리어의 농도는 일반적으로 < 1 g/L이고, 바람직하게는 ≤ 0.5 g/L이다.
더욱 바람직하게는, 효소적 처리는 단백질 분해효소, 예컨대 트립신을 포함하는 용액을 사용한다.
본 발명에 따른 방법의 다른 양태에 따라서, 최초 세포 계대 이후 각각의 세포 계대는 배양 배지의 부피를 증가시키면서 수행된다.
바람직하게는, 최초 세포 계대는 배양 용기 작업 부피의 1/5과 1/2 사이인 배양 배지 부피에서 수행된다.
본 발명에 따른 방법의 다른 실시양태에서, 배양 배지는 동물 기원의 혈청을 포함하지 않는다.
바람직하게는, 배양 배지는 동물 기원의 산물을 포함하지 않는다.
다른 양태에 따라서, 배양 배지 내 단백질 농도는 ≤15 mg/L이다.
또 다른 양태에 따라서, 배양 배지는 또한 세포 보호제를 포함한다.
바람직하게는, 세포 보호제는 폴리비닐피롤리돈 또는 폴록사머이다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에 따라서, 배양 용기는 3과 3000 리터 사이, 바람직하게는 20과 1000 리터 사이, 더욱 바람직하게는 20과 500 리터 사이의 작업 부피를 갖는 생물반응기이다.
또 다른 실시양태에서, 배양 용기는 1회용 생물반응기이다.
본 발명에 따른 방법의 하나의 특정 양태에서, 부착성 세포는 베로 세포이다.
일반적으로, 수득된 세포 집단은 초기에 배양 용기 내로 도입된 세포 양의 60배를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기에 따르는, 부착성 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다:
a) 부착성 세포의 스톡을 해동하는 단계;
b) 해동된 부착성 세포를 본 발명의 방법에 따른 실시양태 중 하나에 적용하는 단계.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라서 첫 번째 배양 용기에서 부착성 세포를 생산한 후에, 하기에 따르는 부착성 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다:
a) 미세캐리어로부터 세포를 탈착하기 위해 세포 집단을 효소적 처리에 적용한 후에 수득된 세포 집단을 더 큰 작업 부피를 갖고 첫 번째 배양 용기에서 수행된 최종 세포 계대 동안에 존재했던 미세캐리어의 양보다 더 많은 양의 미세캐리어를 포함하는 배양 배지를 포함하는 두 번째 배양 용기로 옮기는 단계; 및
b) 본 발명의 방법의 실시양태 중 하나를 두 번째 용기에서 실행하는 단계.
하나의 특정 양태에서, 본 발명에 따른 방법의 실시양태 중 하나는 두 번째 배양 용기의 작업 부피보다 더 큰 작업 부피를 갖는 세 번째 배양 용기 내에서 반복된다.
본 발명은 또한 생물학적 제제의 생산을 위한, 본 발명의 방법에 따라 생산된 세포의 용도에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 배양 배지에 미세캐리어를 포함하는 배양 용기에서 부착성 세포를 생산하는 방법에 관한 것으로, 이 방법에 따라서 하나의 동일한 배양 용기 내에서 연속적 세포 계대를 수행함으로써 생산된 세포의 양이 ≥ 60배 증가한다.
도 1은 연속적 세포 계대에 의해 미세캐리어에 부착된 세포를 증폭하는 2개의 방법을 나타내는데: a) 통상적인 방법에 따라서, 연속적 세포 계대가 증가하는 작업 부피를 갖는 다른 배양 용기들 내에서 수행되고, b) 본 발명의 방법 (올-인-원 방법)에 따라서, 연속적 세포 계대가 하나의 동일한 배양 용기 내에서 수행된다. 세포는 단계 0에서 냉동된 형태이다. 단계 0→1은 해동된 세포의 생물반응기로의 이동에 해당한다. 단계 1은 첫 번째 세포 계대에 해당한다. 단계 1→2는 미세캐리어로부터 세포를 탈착하기 위하여 단백질 분해효소로 처리한 후 첫 번째 세포 계대의 말기에 수득된 세포 집단의, 방법 a)의 경우에는, 더 큰 작업 부피를 갖는 두 번째 생물반응기로의 이동, 또는 방법 b)의 경우에는, 동일한 배양 용기로의 이동에 해당한다. 단계 2는 두 번째 세포 계대에 해당한다. 방법 b)의 경우에, 두 번째 세포 계대는 일반적으로 더 높은 농도의 미세캐리어의 존재 하에서 더 큰 배양 배지 내에서 수행된다. 단계 2→3은 미세캐리어로부터 세포를 탈착하기 위하여 단백질 분해효소로 처리한 후 두 번째 세포 계대의 말기에 수득된 세포 집단의, 방법 a)의 경우에는, 더 큰 작업 부피를 갖는 두 번째 생물반응기로의 이동, 또는 방법 b)의 경우에는, 동일한 배양 용기로의 이동에 해당한다. 단계 3은 세 번째 세포 계대에 해당한다. 방법 b)의 경우에, 세 번째 세포 계대는 일반적으로 두 번째 세포 계대 동안보다 더 높은 농도의 미세캐리어의 존재 하에서 더 큰 배양 배지 내에서 수행된다.
도 2는 a) 올-인-원 방법 또는 b) 비드-투-비드 이동 방법 (작업 조건에 대해서는 실시예 2 참조)을 실행하여 8일간 베로-세포를 배양한 후 현미경 하 (×20 배율)에서 미세비드의 외양을 나타낸다.
본 발명은 세포를 증폭하고 산업적 회분의 세포를 형성하기 위하여, 수차례의 연속적 세포 계대를 하나의 동일한 세포 배양 용기에서 수행함에 따르는, 부착성 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에 따르면, 사용되는 배양 용기의 개수가 감소하고 생산된 세포들이 동일한 횟수의 세포 계대를 갖기 때문에 세포의 회분이 균일하다. 이 방법은 또한 생물학적 제제의 생산에 적합하다.
본 발명의 목적을 위하여, "세포 계대"는 부착성 세포의 부유액이 배양 배지 내 미세캐리어와 접촉하는 시점에서 개시되어 통상 부착성 세포가 효소적 처리에 의해 이들의 미세캐리어로부터 분리되는 시점에서 종결되며 배양 배지 내에서 다시 부유액의 형태가 된다. 세포 계대는 통상 하기 시기를 포함한다:
- 배양 배지 내에서 미세캐리어와 접촉하게 되는 세포가 미세캐리어에 부착되는 동안의 시기에 해당하는, 미세캐리어 집락화기;
- 집락화된 미세캐리어의 유용 표면의 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과가 세포에 의해 뒤덮일 때까지 세포가 증식하는 동안의 시기에 해당하는, 미세캐리어에 부착된 세포의 증폭기. 군집화된 미세캐리어의 유용 표면의 70% 초과를 세포가 뒤덮을 때, 부착성 세포가 "실질적으로 융합성"이거나 "융합 단계"에 도달한 것으로 간주한다;
단시간 동안 (일반적으로 30분 미만이고 주로 20분 미만의 기간)에 이들의 지지체로부터 최대한의 세포가 탈착되도록 (일반적으로 80% 초과이고 바람직하게는 90% 초과) 효소적 처리에 의해 미세캐리어로부터 실질적으로 융합성인 세포의 탈착기. 이후에 세포 집단은 본질적으로 이들의 미세캐리어로부터 분리된 (또는 이들의 미세캐리어로부터 탈착된) 세포의 부유액 형태이다.
본 발명의 경우에, 생산된 부착성 세포의 용도에 따라서, 배양 용기에서 수행된 최종 세포 계대는 탈착기를 포함하거나 포함하지 않는다.
본 발명의 범주 내에서, 연속적 세포 계대는 후속 세포 계대를 수행하기 위해 선행 세포 계대 동안에 수득된 세포 집단의 전부 또는 일부를 사용하여 하나의 동일한 배양 용기 내에서 수행된다. 일반적으로 선행 세포 계대에서 수득된 세포 집단의 적어도 80%가 후속 세포 계대를 수행하기 위해 사용된다. 바람직하게는, 최대량의 세포를 생산하기 위하여, 연속적 세포 계대는 각 회차에서 후속 세포 계대를 수행하기 위해 선행 세포 계대에서 수득된 세포 집단의 전부를 사용함으로써 수행된다. 비록, 각 세포 계대의 말기에, 세포들이 효소적 처리에 의해 이들의 미세캐리어로부터 분리 (탈착)된다고 하더라도, 선행 기술에서 권고되는, 세포 증폭을 계속하기 위하여 세포 바이오매스를 하나 이상의 다른 세포 배양 용기들로 이동시키지 않는다. 본원에서 세포 바이오매스의 증폭은 하나의 동일한 배양 용기 내에서 수행된다. 이 과정은 여러 배양 용기의 사용 및 취급 없이 동량의 세포가 같은 기간에 생산되어 산업적 양의 세포를 생산하는데 요구되는 공간을 줄이고 결과적으로 생산비를 실질적으로 절감할 수 있어 매우 유리하다. 놀랍게도, 세포 바이오매스의 증폭이 각 세포 계대에서 효소적 처리를 요구하지 않는다고 하더라도, 본 발명에 따른 방법의 실행 말기에 생산된 세포의 양은 통상적인 "미세캐리어에서 미세캐리어로의 이동" 기술을 사용하여 수득된 것보다 상당히 더 많다 (실시예 2 참조).
첫 번째 세포 계대에 후속하는 세포 계대에 해당하는 각각의 세로운 세포 계대는 동일한 배양 용기에서 수행된다. 첫 번째 세포 계대에 후속하는 계대를 개시하기 위하여, 유용한 세포 지지체 표면을 증가시키기 위해 배양 배지 및 선행 세포 계대 동안에 도입되었던 것보다 더 많은 양의 미세캐리어가 도입된다. 용어 "새로운 세포 계대" 또는 "첫 번째 세포 계대에 후속하는 계대"는 그 배양 용기에서 수행되었던 세포 계대에 이어지는 세포 계대를 나타내는 것으로 이해된다. 또한 배양 용기 내로 미세캐리어의 도입 또는 첨가는 빈 (bare) 미세캐리어의 도입에 해당하는 것으로 이해된다. 바람직하게는, 미사용 미세캐리어가 부착성 세포의 부착을 용이하게 하기 위하여 사용된다. 보통 배양 배지의 부피가 첫 번째 세포 계대에 후속하는 각 계대에서 부수적으로 증가하더라도, 미세캐리어 양의 증가는 일반적으로 배지 부피의 증가보다 비례적으로 더 크고, 이는 일반적으로 연속적 세포 계대 동안 배양 배지 내 미세캐리어 농도의 점진적 증가를 초래한다. 예를 들어, 상품명 사이토덱스 (사이토덱스™ 1, 2 또는 3)로 판매되는 덱스트란 미세비드가 미세캐리어로 사용되는, 최종 세포 계대 동안, 배양 배지 내 미세캐리어 농도는 일반적으로 1과 7　g/L 사이이지만, 10 내지 15　g/L에 이를 수 있다. 하나의 동일한 배양 용기 내에서 연속적 세포 계대에 의해 세포 바이오매스가 증가하는 본 발명의 방법은 "올-인-원 방법 (all-in-one process)"으로 불린다 (도 1b 참조).
일반적으로, 2회 세포 계대, 3회 세포 계대 또는 4회 세포 계대가 동일한 배양 용기 내에서 수행된다. 그의 제조되는 후속 용도에 따라서, 본 발명에 따른 방법의 실행 말기에 수득되는 세포 집단은 이들의 미세캐리어로부터 분리된 세포의 부유액의 형태 (이 경우, 세포 탈착 단계를 포함하여 최종 세포 계대가 수행됨)이거나 미세캐리어에 부착된 세포의 부유액의 형태 (이 경우, 세포 탈착 단계를 생락하여 최종 세포 계대가 수행됨)일 수 있다. 부착성 세포를 생산하는 방법이 하나의 동일한 배양 용기 내에서 수행되는 2회의 연속적 세포 계대를 포함할 때, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 실행하는 것에 해당한다:
a) 배양 배지, 미세캐리어 및 부착성 세포를 배양 용기 내로 도입하는 단계;
b) 세포가 미세캐리어 상에 부착하여 증식하게 하는 배양 조건에 세포를 적용하는 단계;
c) 세포를 효소적 처리에 의해 미세캐리어로부터 탈착하고 세포의 일부를 배양 용기로부터 선택적으로 제거하는 단계;
d) 도입되는 미세캐리어의 양이 이전에 도입되었던 미세캐리어의 양보다 많도록 배양 배지 및 미세캐리어를 다시 도입하는 단계;
e) 세포가 미세캐리어 상에 부착하여 증식하게 하는 배양 조건에 세포를 다시 적용하는 단계; 및
f) 수득된 세포 집단을 효소적 처리에 의해 미세캐리어로부터 선택적으로 세포를 탈착한 후에 수확하는 단계로,
단계 a) 내지 e)는 하나의 동일한 배양 용기 내에서 수행됨.
단계 a) 내지 c)는 첫 번째 세포 계대에 해당하고 단계 d) 내지 f)는 세포의 수확으로 종결되는 두 번째 세포 계대에 해당한다.
2회 초과의 연속적 세포 계대가 동일한 용기 내에서 수행될 때, 이는 세포를 수확하는 단계 f)를 실행하기 전에, 동일한 배양 용기 내에서 단계 e) 후에 단계 c), d) 및 e)를 다시 반복하는 것에 해당한다. 보통, 단계 c), d) 및 e)를 단계 e) 후에 1회 반복하는데, 이는 3회 연속적 세포 계대를 수행하는 것에 해당하며, 또는 단계 c), d) 및 e)를 단계 e) 후에 3회 반복하는데, 이는 4회 연속적 세포 계대를 수행하는 것에 해당한다. 바람직하게는, 단계 c) (미세캐리어로부터 세포의 탈착에 해당함)는 세포가 실질적으로 융합성일 때 실행된다. 일반적으로, 배양 배지의 부피는 또한 미세캐리어가 첨가될 때마다 증가한다 (단계 d).
본 발명에 따른 방법의 실행 말기에 수확되는 세포 집단이 세포의 스톡을 형성하는데 사용될 때, 최종 세포 계대는 일반적으로 동일한 배양 용기 내에서 수행되는 효소적 처리에 의해 세포를 탈착하는 단계를 일반적으로 포함한다. 그 후에 세포 집단은 본질적으로 이들의 미세캐리어로부터 분리된 세포 부유액의 형태이다.
세포 집단이 생물학적 제제의 생산에 사용될 때, 최종 세포 계대는 종종 세포 탈착 단계를 포함하지 않고 수행된다. 이어서 미세캐리어에 부착된 세포의 부유액의 형태로, 생산된 세포 집단은 이것이 목적하는 생물학적 제제를 생산하도록 동일한 배양 용기 내에서 직접적으로 처리된다. 용어 "생물학적 제제"는 부착성 세포에 의해 생산될 수 있는 임의의 물질 또는 유기체를 의미하는 것으로 의도된다. 구체적으로 이들은 바이러스 또는 단백질 (항체, 항원, 효소 등)이다. 부착성 세포에 의해 생산되는 생물학적 제제를 생산하는 방법이 동일한 배양 용기에서 수행되는 2회의 연속적 세포 계대를 포함할 때, 따라서 본 발명에 따른 방법은 하기 단계를 수행하는 것에 해당한다:
a) 배양 배지, 미세캐리어 및 부착성 세포를 배양 용기 내로 도입하는 단계;
b) 세포가 미세캐리어 상에 부착하여 증식하게 하는 배양 조건에 세포를 적용하는 단계;
c) 세포를 효소적 처리에 의해 미세캐리어로부터 탈착하고 세포의 일부를 배양 용기로부터 선택적으로 제거하는 단계;
d) 새롭게 도입되는 미세캐리어의 양이 이전에 도입되었던 미세캐리어의 양보다 많도록 배양 배지 및 미세캐리어를 다시 도입하는 단계;
e) 세포가 미세캐리어 상에 부착하여 증식하게 하는 배양 조건에 세포를 다시 적용하는 단계;
f) 수득된 세포 집단이 생물학적 제제를 생산하는 방식으로 이를 처리하는 단계; 및
g) 생물학적 제제를 수확하는 단계로,
단계 a) 내지 f)는 하나의 동일한 배양 용기에서 수행됨.
2회 초과의 연속적 세포 계대가 동일한 용기 내에서 수행될 때, 이는 세포를 수확하는 단계 f)를 실행하기 전에, 동일한 배양 용기 내에서 단계 e) 후에 단계 c), d) 및 e)를 다시 반복하는 것에 해당한다. 보통, 단계 c), d) 및 e)를 단계 e) 후에 1회 반복하는데, 이는 3회 연속적 세포 계대를 수행하는 것에 해당하며, 또는 단계 c), d) 및 e)를 단계 e) 후에 3회 반복하는데, 이는 4회 연속적 세포 계대를 수행하는 것에 해당한다. 바람직하게는, 단계 c) (미세캐리어로부터 세포의 탈착에 해당함)는 세포가 실질적으로 융합성일 때 실행된다. 일반적으로, 배양 배지의 부피는 또한 미세캐리어가 첨가될 때마다 증가한다 (단계 d).
예를 들어 사이토카인, 항체 또는 백신 단백질과 같은 재조합 단백질의 생산이 과제일 때, 세포 부유액을 적합한 생산 배지를 사용해 이 단백질의 생산을 촉진하는 배양 조건 하에 놓는다. 예를 들면, CHO 및 베로 세포에 의한 재조합 단백질의 생산과 관련하여 유럽특허 제0354129호에 기술된 배지가 언급될 수 있다.
생물학적 제제가 감염성 제제일 때, 일반적으로 배양 배지를 감염 배지로 교환한 후 배양 용기 내로 감염성 제제 (세균, 바이러스, 기생충 등)를 도입함으로써 미세캐리어에 부착된 세포의 부유액을 감염시킨다. 구체적으로 감염성 생물학적 제제는, 예를 들어, 광견병 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 폴리오바이러스 등과 같은 재조합 바이러스 (재조합 폭스바이러스, 재조합 아데노바이러스) 또는 바이러스들일 수 있다. 생물학적 제제는 통상 1회 이상의 단계에서 배양 상등액을 제거함으로써 수확된다 (실시예 7 참조). 그 대신에 생물학적 제제가 비-용해성 바이러스인 경우와 같이, 세포 내일 때는 종종 상등액 및 세포를 수확하는 것이 유리하고, 이는 그 후에 세포용해제로 처리된다.
생물학적 제제의 생산용 배지, 특히 광견병 바이러스와 같은 바이러스의 생산에 사용되는 감염성 배지는 유리하게는 동물 기원의 혈청, 동물 기원의 단백질, 또는 동물 기원의 임의의 산물까지도 포함하지 않는 것일 수 있다.
본 발명의 목적에 적합한 미세캐리어는 일반적으로 미세비드의 형태로, 이는 효소의 작용을 용이하게 하기 위해 다공성인 것이 바람직하다. 이들은 일반적으로 90과 250　㎛ 사이의 직경을 갖는다. 이들의 밀도는 단순 침강에 의해 이들의 회수를 용이하게 하기 위해 배양 배지의 밀도보다 약간 더 높지만, 동시에 일단 배지가 온건한 교반에 적용되면 미세비드의 완벽한 재부유을 달성하기에 너무 높아서도 않된다. 표준 배양 조건 하에서, 미세캐리어의 밀도는 일반적으로 1.020과 1.050　g/ml 사이이다. 미세비드의 표면은 세포의 부착을 용이하게 하도록 선택된다. 미세캐리어의 기질은 미세비드들간에 충돌이 일어났을 때 세포들의 보다 나은 보존을 제공하기 위해 딱딱하지 않은 것이 바람직하다. 세포의 부착을 위한 평균 유용 표면은 일반적으로 4000과 5000　㎠/g 미세비드 사이이다. 이러한 특징은 특히 상품명 사이토덱스™ (사이토덱스　1, 사이토덱스　2, 사이토덱스　3)으로 판매되는 가교된 덱스트란 기질을 갖는 미세비드에서 발견되지만, 그의 기질이 가교된 폴리스티렌에 근거한 다른 미세비드 (비오실론, 슬로힐) 또는 유리 미세비드 (시그마 알드리치)에서도 발견될 수 있다.
본 발명의 범주 내에서, 특히 사이토덱스™ 1 미세비드와 같은 사이토덱스™ 미세비드가 미세캐리어로 사용될 때, 첫 번째 세포 계대 동안의 미세캐리어 농도는 일반적으로 농도 <1　g/L의 농도로 감소하는 반면, 선행기술에서, 미세캐리어는 1과 5　g/L의 농도로 사용된다. 이는 일반적으로 ≤0.5　g/L이고; 더욱 특별히, 이는 0.1과 0.4　g/L 사이이고 더욱 구체적으로 이는 0.1과 0.3　g/L 사이이다. 이 농도는 사실상 배양 용기 내로 세포의 도입 후 배양 배지 내 미세캐리어의 초기 농도에 해당한다. 따라서, 이는 < 1　g/L, 바람직하게는 ≤0.5　g/L이고; 구체적으로 이는 0.1과 0.4　g/L 사이이고 더욱 특별하게 이는 0.1과 0.3　g/L 사이이다.
배양 용기 내로 도입되는 세포의 초기 양은 80% 초과의 미세캐리어가 세포에 의해 집락화되도록 선택된다. 이러한 수준의 집락화 형성을 달성하기 위하여, 통상적으로 배양 배지 내에 존재하는 미세캐리어의 양보다 5 내지 10배 많은 세포의 초기 양이 배양 용기 내로 도입된다. 예를 들어, 베로 세포 생산의 경우, 배양 용기 내로 도입되는 세포의 초기 양은 일반적으로 5×103과 5×104 세포/㎠ 사이토덱스™ 미세비드 사이인데, 이는 대략 미세비드 당 5개 세포와 50개 세포 사이를 나타낸다. 사실상, 첫 번째 세포 계대 동안 배양 배지 내 미세캐리어의 농도가 선행기술에서 통상적으로 사용되는 농도보다 낮기 때문에, 이는 결과적으로 초기 세포 농도 또한 낮은 결과를 수반한다.
각 세포 계대의 말기에, 단기간 동안 (일반적으로 30분 미만이고 바람직하게는 15분 미만)에 세포를 단백질분해 활성을 갖는 효소 용액 (프로테아제)로 처리함으로써 미세캐리어로부터 세포를 탈착시킨다. 본 발명의 범주 내에서, 세포는 일반적으로 연속적 세포 계대를 수행하는데 사용된 배양 용기 내에서 미세캐리어로부터 탈착되는데, 이는 모든 세포 배양 시기 및 연속적 계대 동안에 세포에 수행되는 모든 처리가 하나의 동일한 배양 용기 내에서 수행되는 것을 의미한다. 효소적 처리가 일어나는 2차 용기 내로 세포를 옮긴 후에 미세캐리어로부터 세포를 탈착한 후 이어서 수득된 세포 부유액을 연속적 세포 계대가 일어나는 단일 배양 용기 내로 재도입하는 것이 선택적으로 가능하다. 이 방법은 이동 작업 도중에 세포의 손실을 초래하기 때문에 유리하지 않다.
단백질 분해효소 용액은 일반적으로 트립신, 프로네이즈® 또는 디스파아제®와 같은 세린 프로타아제를 포함한다. 미세캐리어가 사이토덱스　3 미세비드일 때 파파인, 피신 또는 콜라게나아제가 또한 사용될 수 있다. 트립신 용액은 사이토덱스™ 미세비드로부터 부착성 세포를 탈착하기 위해 통상적으로 사용된다. 바람직하게는, 프로테아제는 비-동물성 기원인데, 이는 이것이 동물 기원의 물질을 사용하지 않는 방법을 이용하여 생산되었음을 나타낸다. 프로테아제는, 예를 들어, 식물성 물질을 사용하여, 화학적 합성에 의해, 또는 세균, 효모, 진균류 또는 식물을 이용한 유전적 재조합에 의해 생산된다. 예를 들어, 상품명 트립LE 셀렉트 (TrypLE™ Select) 또는 트립LE 익스프레스 (TrypLE™ Express)로서 인비트로젠에 의해 판매되는, 동물 기원의 임의의 산물을 포함하지 않는 효소 용액이 사용될 수 있다. 그의 단백질 서열이 국제특허 제WO　94/25583호에 기술되어 있는, 이 프로테아제는 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) DSM 2672 균주의 발효에 의해 생산되거나 유전적 재조합에 의해 생산된다. 이는 트립신과 유사한 효소 활성을 갖는다. 세포의 탈착을 용이하게 하기 위해, 예를 들어, EDTA, EGTA 또는 시트레이트와 같이, 칼슘 이온에 결합하는 킬레이트화제가 효소 용액에 첨가될 수 있고, 또는 선택적으로, 부착성 세포는 효소적 처리를 수행하기 전에 킬레이트화제로 처리될 수 있다. 배지 내 프로테아제 및, 선택적으로, 킬레이트화제의 농도 및 또한 세포의 효소적 처리가 수행되는 온도 (일반적으로 20과 38℃ 사이)는 짧은 기간 동안 (≤30분)에 80% 초과의 세포가 이들의 지지체로부터 탈착되도록 설정된다. 실질적인 효소적 처리 전에, 일반적으로 배양 배지의 적어도 절반이 제거된다. 일반적으로 대략 배양 배지의 2/3이 제거된다. 그 후에 단백질분해 활성은 일반적으로 프로테아제의 작용을 중화시키는 펩타이드 또는 단백질 기원의 억제제를 배지에 첨가함으로써 중화된다. 바람직하게는, 억제제의 조성물은 동물 기원의 임의의 오염물을 포함하지 않는다. 예를 들어, 이 억제제는 재조합 아프로티닌, 또는 대두 또는 라이머콩으로부터 유래하는 트립신 (워딩턴 바이오케미칼)을 함유하는 추출물 또는 정제 분획이다. 배지는, 배양 배지가 제거되는 동안을 제외하고, 일반적으로 미세캐리어로부터 세포의 탈착기 내내 교반 상태가 유지된다.
일반적으로 수득된 세포 부유액은 또한 세포 생존율을 결정할 수 있는 통상적인 계수 시스템을 사용하여 정량된다. 세포가 너무 많이 성장하였을 때 세포 집단의 일부를 배양 용기로부터 제거한다 하더라도, 전체 세포 집단이 동일한 용기 내에서 일어나는 첫 번째 세포 계대에 후속하는 세포 계대를 개시시키기 위해 종종 사용된다. 연속적 계대 동안 세포 바이오매스를 증가시키기 위해, 첫 번째 세포 계대에 후속하는 각 계대의 초기에 (이는 효소적 처리를 이용한 세포 탈착 단계 후에 개시됨) 배양 용기 내로 이전에 도입된 미세캐리어의 양보다 더 많은 양의 미세캐리어를 도입하는 것이 필요하다. 만약 동일한 부피의 배양 배지가 연속적 세포 계대 동안에 유지된다면, 이는 첫 번째 세포 계대에 후속하는 각 세포 계대에서 미세캐리어 농도가 증가하는 것에 상응한다. 반면, 만약 배양 배지의 부피가 각각의 새로운 세포 계대에서 동일한 비율로 증가한다면 동일한 미세캐리어 농도가 연속적 세포 계대 동안에 유지될 수 있다. 매우 바람직하게는, 첫 번째 세포 계대에 후속하는 각 세포 계대의 개시 시에, 세포의 최대 증폭을 달성하기 위해 배양 배지 부피 및 미세캐리어 농도 모두가 배양 용기 내에서 증가한다. 지표로서, 각 새로운 세포 계대에서, 이전 계대 동안에 세포가 포함되어 있던 부피보다 1.2와 3배 사이의 더 많은 배양 배지 부피에서 세포를 배양한다. 유사하게, 각 새로운 세포 계대에서, 배양 배지 내 미세캐리어 농도는 선행 세포 계대 동안에 존재했던 것보다 2와 10배 사이 더 높다. 본 발명의 범주 내에서, 각 세포 계대의 말기 (즉, 세포 탈착 단계의 말기)에 사용된 미세캐리어를 제거하는 것은 일반적으로 유용하지 않다. 상기 미세캐리어가 세포에 의해 재-집락화될 수 있을지라도, 선행 세포 계대로부터 유래하는 사용된 미세캐리어의 양은 각 새로운 세포 계대의 초기에 도입되는 미세캐리어의 양을 계산하는데 일반적으로 고려되지 않는다. 미세캐리어에의 세포 부착기는 일반적으로 세포의 유형에 따라서 1과 10시간 사이이다. 부착기 이후, 미세캐리어를 침강시킨 후 배양 배지의 전부 또는 일부를 제거하고 미세캐리어에 부착된 세포의 증식을 촉진하기 위해 이를 새로운 배지를 교환해주는 것이 유리할 수 있다.
본 발명의 목적에 적합한 배양 배지는 동물 기원의 혈청이 보충된 통상적인 세포 배양 배지일 수 있다. 유리하게는, 배양 배지는 혈청 또는 혈청 단백질을 포함하지 않는다. 배양 배지는 특히 동물 기원의 임의의 단백질 또는 동물 기원의 임의의 산물조차 포함하지 않을 수 있다. 용어 "동물 기원의 단백질 또는 산물"은 동물 또는 인간으로부터 유래하는 물질이 사용된 적어도 하나의 단계를 포함하는 생산 방법의 단백질 또는 산물을 의미하는 것으로 의도된다. 특히 유리하게는, 세포를 배양하는데 사용되는 배지는 임의의 단백질을 포함하지 않거나 재조합 단백질 또는 식물 (콩, 쌀 등) 또는 효모로부터 추출된 단백질을 매우 소량으로 포함할 수 있다. 이들 대부분은 일반적으로 매우 낮은 농도로 저-분자량 단백질 (≤　10　KD) (소위 폴리펩타이드로도 불림)을 포함한다. 이들 배양 배지 내 총 단백질 농도는 일반적으로 브래드포드 방법에 의해 측정된 ≤　15　mg/L이다. 이는 특히 인비트로젠사에 의해 시판되는 VP SFM 배지의 경우에 그러한데, 이 배지는 본 발명에 따른 방법에, 특히 베로 세포를 배양하는데 적합하다. 동물 기원의 임의의 산물을 포함하지 않고 거의 단백질을 포함하지 않는 옵티 프로™ 무혈청(인비트로젠), 에피세르프(인비트로젠), Ex-세포 MDCK(시그마-알드리치), Ex-세포™ 베로 (SAFC 바이오사이언스) MP-BHK® 무혈청 (MP　바이오메디칼즈), SFC-10 BHK 익스프레스 무혈청 (프로모 셀), SFC-20 BHK 익스프레스 무-단백질 (프로모 셀), HyQ PF 베로 (하이클론 참조: SH30352.02), 하이클론 SFM4 메가비르, MDSS2 배지 (악셀 바이오테크놀러지), 이스코브즈 변형 DMEM 배지 (하이클론), 햄즈 영양 배지 (Ham-F10, Ham-F12), 레이보비츠 L-15 배지 (하이클론), 프로 베로 배지 (론자) 및 파워 MDCK 배지 (론자)가 언급될 수 있다.
배양 배지가 동물 혈청 또는 동물 단백질을 포함하지 않거나 농도 <　15　mg/L (브래드포드)의 총 단백질 농도로 포함하는 경우, 배지가 교반될 때 발휘되는 전단력으로부터 세포를 보호하기 위한, 세포 보호제가 일반적으로 첨가된다. 대부분의 세포 보호제는 통상 계면활성제 특성을 갖는다. 이들은 구체적으로 폴리비닐 알코올 (PVAs)로도 알려진, 비닐 알코올 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 (PEGs)로도 알려진, 에틸렌 글리콜 중합체, 폴리비닐-피롤리돈 (PVP)으로도 알려진, 1-비닐-2-피롤리돈 중합체, 또는 화학식 HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH (여기서 a는 에틸렌 옥사이드 단위의 개수를 나타내고, b는 프로필렌 옥사이드 단위의 개수를 나타냄)를 갖는 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 "블록 공중합체"인 폴록사머이다. 이러한 세포 보호제는 일반적으로 배양 배지 내에 0.001% 내지 2% (w/v) 범위의 농도로 사용된다. 특히 바람직한 세포 보호제들 중에서, 폴록사머 188 및 PVP를 언급할 수 있다. 폴록사머 188은 대략 8400 달톤의 평균 분자량을 가지며 일반적으로 0.05와 0.2% (w/v) 사이의 농도로 배양 배지에 사용된다. PVP는 또한, 국제특허 제WO 01/40443호에 기술된 바와 같이, 세포 성장을 촉진하기 때문에 권고된다. 일반적으로 PVP는 20　KDa과 360　KDa 사이의 평균 분자량 범위로, 바람직하게는 20　KDa과 40　KDa 사이의 평균 분자량 범위로, 배양 배지 내 0.01%과 2% (w/v)사이의 농도, 바람직하게는 0.05%와 0.5% (w/v) 사이의 농도로 사용된다. PVP는 또한 더 이상 단지 그의 분자량에 의해서가 아니라 PVP의 평균 분자량과 또한 평균치의 양측에 있어서 분자량의 변이를 고려하는 K 값에 따라 특정될 수 있다. K 값의 계산을 위하여, 문헌 [Cryobiology, 8, 453-464 (1971)]에 정의된 바와 같은 방적식이 참고되며, K 값은 하기 식에 따라서 PVP의 1% 용액의 상대 점도를 기준으로 계산된다:
Log η rel/C= 75K0 2/ (1+1.5 K0C) + K0
K= 1000 K0
C는 100　ml의 배지 당 그램으로 나타낸 PCP 농도를 의미한다.
η rel은 용매의 점도 대비 용액의 점도이다.
본 발명의 목적에 적합한 PVP는 일반적으로 18과 60 사이, 바람직하게는 26과 35 사이의 K 값을 갖는다. 지표로서, 본 발명의 방법에 따라서 베로 세포의 원액을 제조하기 위하여, 세포 보호제로서 약 30의 K 값을 갖는 PVP를 0.1% (w/v)의 농도로 포함하거나 폴록사머 188을 0.1% (w/v)의 농도로 포함하는 인비트로젠으로부터 시판되는 VPSFM에 근거한 배양 배지가 동물 기원의 임의의 산물을 포함하지 않고 매우 낮은 단백질 함량 (브래드포드 방법에 의해 ＜ 15 mg/L)을 갖는 배양 배지로 사용될 수 있다.
일반적으로, 배양 배지의 조성은 연속적 세포 계대 동안에 동일하지만, 요구되는 바와 같이, 글루코스 및/또는 글루타민과 같은 영양 보충제를 제공하는 것이 유용한 것으로 입증될 수 있다. 연속적 세포 계대 동안에, 세포에 의해 요구되는 바와 같은 배양 배지의 전부 또는 일부를 세포 증식기 도중에 새것으로 바꾸는 것이 유용할 수도 있다. 이는 통상의 기술자의 처분 시 글루코스, 글루타민, 젖산, 암모늄 이온 수준의 측정과 같은 통상적인 검사 방법에 의해 평가된다. 본 발명의 범주 내에서, 배양 배지는, 배양 배지의 전부 또는 일부가 제거되는 때를 제외하고, 배양 배지 내 미세캐리어를 계속 부유 상태로 유지하기에 딱 충분한 강도로 일반적으로 계속 교반된다.
첫 번째 세포 계대 동안 배양 배지의 부피는 일반적으로 배양 용기 작업 부피의 1/12과 1/5 사이를 나타낸다. 큰 용량 (100 리터 초과의 생물반응기)과, 작은 부피에서 미세캐리어에 부착된 세포의 배양을 가능케 하는 특정 형상 (예컨대, 예를 들어, 원뿔형-바닥의 침강 구역이 구비된 생물반응기)을 갖는 배양 용기의 경우, 배양 배지의 부피는 작거나 (생물반응기 작업 부피의 1/6과 1/10 사이) 더 작을 수 있고, 생물반응기 작업 부피의 단 1/20을 나타낼 수도 있다. 앞서 지시된 바와 같이, 배양 배지의 부피는 일반적으로 연속적 세포 계대의 기간에 걸쳐서 증가하고, 종종 최종 세포 계대는 용기 작업 부피의 적어도 70%에 해당하는 배양 배지 부피의 존재 하에서 수행된다.
배양 용기는 세포 배양 배지 내에서 미세캐리어를 부유 상태로 유지하기 위해 교반 시스템 (기계적, 기류에 의해 등)이 구비되고, 배양의 필요에 따라서 배지를 새것으로 교체해 줄 수단 및/또는 온도, pH, 산소 압력, 선택적으로 질소 또는 공기를 이용한 가스 처리, 및 대사물 또는 영양분 (젖산, 글루코스, 글루타민, 암모늄 이온, 등)을 검사하고 조절하기 위한 수단을 갖는다. 이러한 장치는 사용된 용기의 크기 및 형상에 따라서 이들을 어떻게 사용해야 하는지를 아는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예시로서, 본 발명에 따른 배양 용기는 교반기 또는 생물반응기의 형태일 수 있다. 용기의 작업 부피가 ≥　2　리터인 경우에는, 통상적으로 재사용 가능한 유리 탱크 또는 금속 탱크의 형태일 수 있는 생물반응기를 사용하는 것이 일반적이고, 또는 생물반응기가 1회용 생물반응기인 경우에는, 특히 상품명 누엘코 (Nucleo) PG-ATMI™으로 피. 구에린 (P. Guerin)에 의해 시판되는 1회용 백의 형태인 용기를 사용하는 것이 일반적이다. 예시로서, 제네랄 일렉트릭스에 의해 시판되는 바이오웨이브 시스템 (웨이브 생물반응기™), STR 1회용 생물반응기™ 시스템 (사르토리우스), SUB™ 시스템 (하이클론), 또는 세포 레디 시스템 (밀리포어)가 또한 사용될 수 있다. 산업적 규모로 세포 회분을 생산하는 것이 주된 목적인, 본 발명에 따른 방법의 범주 내에서, 작업 부피가 3 리터와 1000 리터 사이인 생물반응기가 사용되지만, 더욱 일반적으로는, 작업 부피가 20 리터와 500 리터 사이인 생물반응기가 사용된다.
본 발명의 목적을 위하여, "부착성 세포"는 동물 또는 인간의, 건강한 조직 또는 종양 조직의 직접적인 추출의 결과로서 세포주 또는 세포로 확립된 세포이며, 이는 사용된 배양 조건 하에서, 정상적으로 증식하고 발생하기 위해 고체 지지체를 요구한다. 이들은 일반적으로 접촉 억제 현상으로 인해 그들의 지지체 상에 단일-세포층을 형성한다. 따라서, 사용된 배양 조건 하에서, 증식에 고체 지지체를 요구하지 않고 배양 배지 내에서 부유 상태로 성장할 수 있는 세포는 사실상 배제된다. 부착성-세포주는 건강한 세포 또는 종양 세포의 일차 배양으로부터 유래할 수 있지만, 또한 PER.C6 세포주의 경우에서와 같이, 불멸화제를 사용한 세포의 변형에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 목적에 적합한 부착성-세포주의 예시로서, 3T3, NTCT 또는 WEHI 세포주와 같은 생쥐 세포주, BHK 세포주 (특히 BHK21 세포주) 또는 CHO 세포주와 같은 햄스터 세포주, MDCK 세포주와 같은 개 세포주, PK15 세포주와 같은 돼지 세포주, MDBK 세포주와 같은 소 세포주, 베로, LLC-MK2, FRHL2 또는 MA104 세포주와 같은 원숭이 세포주, 및 MRC5, 293, PER.C6, 헬라, ECV 또는 A 431 세포주와 같은 인간 세포주가 언급된다. 이들 부착성-세포주는 또한 이들의 재조합 단백질의 생산에 의도되는 경우 재조합 벡터 (플라스미드, 바이러스 등)로 형질전환된 세포주의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 의하여, 부착성 세포의 집단은 하나의 동일한 배양 용기 내에서 연속적 세포 계대를 수행함으로써 적어도 40배, 바람직하게는 적어도 60배 및 특히 바람직하게는 적어도 100배 증가한다. 이는 본 발명에 따른 방법이 이러한 단일 용기 내에서 수행되는 연속적 세포 계대 동안에 세포의 표면적을 5와 40배 사이, 바람직하게는 10과 30배 사이로 증가시킬 수 있기 때문에, 이것이 달성될 수 있다. 종래 기술의 방법에서는, 이러한 배수의 세포 증폭은 적어도 2개의 용기, 그러나 일반적으로는 다른 크기의 3개의 배양 용기를 사용하여 관찰된다 (실시예 5 참고). 본 발명에 따른 방법은 종래 기술의 방법으로 수득된 바와 동일한 산업적 양의 세포가 또한 동일한 기간에 생산되면서, 그와 동시에 이러한 세포 회분을 생산하는데 요구되는 배양 용기 및 공간의 사용 및 유지와 관련된 비용을 절감할 수 있어서 매우 유리하다.
본 발명에 따른 부착성 세포를 생산하는 방법은, 배양 배지 내 ≤ 0.5　g/L 농도의 사이토덱스™ 미세비드의 존재 하에서 배양하고/하거나, 혈청을 포함하지 않거나 극소량의 단백질 (≤　15　mg/L)을 포함하는 배지에서 배양하는 것과 같은 더 까다로운 배양 조건에 세포를 "적응"시키기 위해 통상적으로 권고되는 적응 기간에 의존하지 않으면서, 배양 용기 내로 막 해동된 세포를 직접 도입하여 수행되는 것이 유리할 수 있다. 이 경우에 실제로, 부착성 세포의 스톡을 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 절차에 따라서 해동한 후, 본 발명에 기술된 바와 같은 방법을 수행하기 위해 해동된 세포의 부유액을 배양 배지 내에 미세캐리어를 포함하는 배양 용기 내로 직접 도입한다. 앞서 언급된 바와 같이, 특히 사이토덱스™ 미세비드가 미세캐리어로 사용되는 경우, 첫 번째 세포 계대 동안에 배양 배지 내 미세캐리어 농도는 일반적으로 ≤0.5　g/L의 농도로 감소하고; 이는 일반적으로 0.1과 0.4　g/L 사이이고 더욱 구체적으로 이는 0.1과 0.3　g/L 사이이다. 배양 배지는 또한 혈청 또는 혈청 단백질을 포함할 필요가 없다. 배양 배지는 심지어 전혀 단백질을 포함하지 않을 수 있거나 극소량의 총 단백질 함량 (≤15　mg/L)을 가질 수 있다. 냉동된 세포의 스톡은 바이알 (이 경우, 세포의 양은 일반적으로 상대적으로 낮아 107 내지 5×108 세포임)로부터 유래할 수 있고, 또는 유리하게는 최대 100배 더 많은 세포를 포함하는 백으로부터 유래할 수 있다. 해동된 백의 함량은 큰 용량의 배양 용기 내로 직접 접종될 수 있기 때문에 대규모의 세포 생산 공정이 특히 촉진된다.
본 발명의 방법을 사용하여 생산된 부착성 세포의 스톡이 충분하지 않은 경우, 하나의 동일한 세포 배양 용기로부터 수득된 세포 바이오매스가 세포 집단을:
o 통상적으로 연속적 세포 계대를 수행하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 배양 용기 내로 이전시킴으로써, 즉 각 세포 계대 후, 수득된 세포 바이오매스를 다른 더 큰 배양 용기 내로 이전시킴으로써;
또는 더욱 유리하게는,
o 더 큰 작업 부피 (첫 번째 용기보다 일반적으로 적어도 10배 더 큰, 가장 일반적으로는 10과 50배 사이로 더 큰 부피)를 갖는 두 번째 배양 용기 내로 이전하여 다시 본 발명에 따른 방법을 이 두 번째 용기 내로 이전된 세포에 적용함으로써 더욱 증가될 수 있다. 이러한 방식으로 방법을 수행함으로써, 세포의 산업적 회분을 생산하기 위해 사용되는 배양 용기의 개수, 및 또한 요구되는 공간은 더욱 더 상당히 감소한다.
산업적-규모의 부착성 세포 생산의 범주 내에서 본 발명에 따른 방법의 실행의 경제적 이점을 평가하기 위하여, 문헌 [Reviews of Infectious Diseases, vol　6, supplement 2, S341-S344 (1984)]에 기재된 바와 같은, 폴리오바이러스의 생산에 의도된 베로 세포의 산업적 생산을 위한 통상적인 계획이 참조될 수 있다. 통상적인 계획은 5회의 연속적 세포 계대를 포함하는데, 첫 번째는 1-리터 생물반응기에서, 두 번째는 5-리터 생물반응기에서, 세 번째는 20-리터 생물반응기에서, 네 번째는 150-리터 생물반응기에서, 마지막으로 다섯 번째는 1000-리터 생물반응기에서 수행된다. 본 발명에 따른 방법에 의하여, 단일 20-리터 생물반응기에서 처음 3회의 세포 계대를 수행한 후, 세포를 150-리터 생물반응기 및 이어서 1000-리터 생물반응기로 옮겨 통상적으로 마지막 2회의 계대를 수행할 수 있다. 단일 20-리터 생물반응기에서 처음 3회의 세포 계대를 수행한 후 수득된 세포를 마지막 2회 세포 계대가 수행되는 단일 500-리터 또는 1000-리터 생물반응기로 직접 옮기는 본 발명에 따른 방법을 2회 반복하는 것이 또한 가능하다. 두 경우 모두, 통상적인 계획이 적용된 경우에 수득된 바와 동일한 배수의 세포 양이 동일한 기간 내에 생산되지만, 첫 번째 경우에는, 생물반응기 2개 (1 리터 및 5 리터)의 절약이 가능하고, 두 번째 경우에는, 생물반응기 3개 (1 리터, 5 리터 및 150 리터)의 절약이 가능하다 (실시예 5 참조).
경제적 관점에서 특히 유리한 부착성 세포를 생산하는 방법은 매우 다른 크기의 2개 배양 용기 내에서 본 발명에 따른 방법을 반복하는 데 있다. 이러한 취지로, 따라서 본 발명의 목적은 하기이다:
하기에 따르는, 부착성 세포를 생산하는 방법:
a) 부착성 세포를 배양 배지 내에 미세캐리어를 포함하는 첫 번째 배양 용기 내로 도입하는 단계;
b) 첫 번째 배양 용기 내에서 수차례의 연속적 세포 계대를 수행하여 세포를 증폭하는 단계로, 매회 선행 세포 계대 동안에 수득된 세포 집단의 전부 또는 일부를 사용하고 세포가 효소적 처리에 의해 미세캐리어로부터 탈착되고, 매회 배양 배지 및 증가하는 양의 미세캐리어를 첨가하여, 첫 번째 세포 계대에 후속하는 각 세포 계대를 수행하는 단계;
c) 이 첫 번째 배양 용기 내에서 수행된 최종 세포 계대 동안에 수득된 세포 집단을 효소적 처리에 의해 미세캐리어로부터 세포를 탈착시킨 후 수확하는 단계;
d) 수확된 세포 집단을 더 큰 작업 부피를 갖고 첫 번째 배양 용기 내에서 수행된 최종 세포 계대 동안에 존재하는 미세캐리어의 양보다 더 많은 양의 미세캐리어를 함유하는 배양 배지를 포함하는 두 번째 배양 용기로 옮기는 단계;
e) 이 두 번째 배양 용기 내에서 수차례의 연속적 세포 계대를 수행하여 세포를 증폭하는 단계로, 매회 선행 세포 계대 동안에 수득된 세포 집단의 전부 또는 일부를 사용하고 세포가 효소적 처리에 의해 미세캐리어로부터 탈착되고, 매회 배양 배지 및 증가하는 양의 미세캐리어를 첨가하여, 첫 번째 세포 계대에 후속하는 각 세포 계대를 수행하는 단계;
f) 이 두 번째 배양 용기 내에서 수행된 최종 세포 계대 동안에 수득된 세포 집단을 효소적 처리에 의해 미세캐리어로부터 세포를 선택적으로 탈착시킨 후 수확하는 단계, 및, 선택적으로,
g) 더 더욱 큰 작업 부피를 갖는 세 번째 배양 용기 내에서 단계 d) 내지 f)를 다시 반복하는 단계.
일반적으로, 두 번째 배양 용기의 작업 부피는 첫 번째 배양 용기의 것보다 20 내지 50배 더 크다.
유리하게는, 방법의 단계 a)에 도입되는 부착성 세포는 냉동된 세포의 스톡으로부터 유래하고, 이는 첫 번째 배양 용기 내로 도입되기 직전에 해동되었다.
본 발명에 따른 방법의 반복은 또한 생물학적 제제를 생산하기 위해 실행될 수 있다. 이러한 취지로, 따라서 본 발명의 목적은 하기이다:
하기에 따르는, 미세캐리어에 부착된 세포에 의해 생산된 생물학적 제제를 생산하는 방법:
a) 부착성 세포를 배양 배지 내에 미세캐리어를 포함하는 첫 번째 배양 용기 내로 도입하는 단계;
b) 이 첫 번째 배양 용기 내에서 수차례의 연속적 세포 계대를 수행하여 세포를 증폭하는 단계로, 매회 선행 세포 계대 동안에 수득된 세포 집단의 전부 또는 일부를 사용하고 세포가 효소적 처리에 의해 미세캐리어로부터 탈착되고, 매회 배양 배지 및 증가하는 양의 미세캐리어를 첨가하여, 첫 번째 세포 계대에 후속하는 각 세포 계대를 수행하는 단계;
c) 이 첫 번째 배양 용기 내에서 수행된 최종 세포 계대 동안에 수득된 세포 집단을 효소적 처리에 의해 미세캐리어로부터 세포를 탈착시킨 후 수확하는 단계;
d) 수확된 세포 집단을 더 큰 작업 부피를 갖고 첫 번째 배양 용기 내에서 수행된 최종 세포 계대 동안에 존재하는 미세캐리어의 양보다 더 많은 양의 미세캐리어를 포함하는 배양 배지를 포함하는 두 번째 배양 용기로 옮기는 단계;
e) 이 두 번째 배양 용기 내에서 수차례의 연속적 세포 계대를 수행하여 세포를 증폭하는 단계로, 매회 선행 세포 계대 동안에 수득된 세포 집단의 전부 또는 일부를 사용하고 세포가 효소적 처리에 의해 미세캐리어로부터 탈착되고, 매회 배양 배지 및 증가하는 양의 미세캐리어를 첨가하여, 첫 번째 세포 계대에 후속하는 각 세포 계대를 수행하는 단계;
f) 두 번째 배양 용기 내에서 수행된 최종 세포 계대 동안에 생산된 세포 집단을 생물학적 제제를 생산하도록 처리하는 단계로, 상기 단계 f)가 단계 d) 및 e)를 수행하는데 사용한 바와 동일한 배양 용기 내에서 수행되는 단계; 및
g) 생물학적 제제를 수확하는 단계.
선택적으로, 단계 d) 및 e)는 생물학적 제제를 생산하도록 세포 집단을 처리하기 전에 세 번째 배양 용기 내에서 반복될 수 있다.
앞서 언급된 바와 같이, 생산되는 생물학적 제제는, 예를 들어, 재조합 단백질 또는 광견병 바이러스와 같은 바이러스일 수 있다.
본 발명의 목적은 또한 생물학적 제제의 생산을 위한, 본 발명에 따른 방법들 중 어느 하나에 의해 생산된 세포의 용도이다.
마지막으로, 본 발명은 세포 집단을 ≥　40배, ≥　60배 및 특히 바람직하게는 ≥　120배 증가시키기 위해 연속적 세포 계대를 하나의 동일한 배양 용기 내에서 수행하는 것에 따르는, 미세캐리어를 포함하는 배양 배지 내 부착성 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 사용된 배양 용기는 바람직하게는 적어도 20 리터의 작업 부피를 갖는 생물반응기이다.
본 발명의 범주 내에서 언급된 바와 같이, 배양 배지는 혈청이 보충된 통상적인 배지일 수 있지만, 바람직하게 배지는 동물 기원의 혈청을 포함하지 않는다. 특히 바람직하게는, 동물 기원의 임의의 산물을 포함하지 않고 그의 단백질 농도가 ≤　15　mg/L인 배지가 사용된다.
본 발명은, 그러나 그의 내용을 제한하지 않으면서, 본 발명을 설명하기 위해 제공되는 하기 실시에에 비추어 더욱 명확하게 이해될 것이다.
실시예 1: 하나의 동일한 2-리터 생물반응기 내에서 3회 연속적 세포 계대의 수행에 의한 베로 세포의 증폭
본 실시예에서는, 세포 성장에 대한 초기 미세캐리어 농도, 배양 배지 내 혈청의 존재 또는 부재 및 세포 보호제의 성질과 같은 다양한 매개변수의 역할을 연구하였다.
1.1) 사용된 재료
생물반응기:
상품명 셀레디 (모비우스)로 밀리포어에 의해 판매되고, 2.4　리터의 용량을 갖는 1회용 생물반응기 내에서 실험을 수행하였다. 이는 pH 탐침, pO2 탐침 및 온도 탐침 및 해양 프로펠러 교반 패들이 구비되어 있다.
미세캐리어:
GE 헬쓰케어에 의해 공급되는 사이토덱스 1 미세비드를 사용하였다. 각 세포 계대를 수행하는데 요구되는 양을 제거한 후 미세비드를 인산염 완충액 (1×C PBS, pH
Figure pct00001
7.4) 중에서 24시간 동안 수화시켰다. 이어서 이들을 동일한 완충액으로 3회 세척한 후 오토클레브에 의해 멸균하였다. 생물반응기 내로 도입하기 직전에, 미세비드를 침강시킨 후 멸균 완충액을 동일 부피의 배양 배지와 교환하였다. 1　g의 미세비드는 대략 4400　㎠의 부착 표면을 나타낸다..
검사된 배양 배지
VPSFM/K30: VPSFM 배지 (인비트로젠), 무혈청 및 동물 기원의 산물 무 함유, ISP에 공급되는 0.1% w/v의 폴리비닐피롤리돈 (PVP) K30 보충.
VPSFM/F68: VPSFM 배지 (인비트로젠), 무혈청 및 동물 기원의 산물 무 함유, BASF에 의해 공급되는 0.1% w/v의 폴록사머 188 보충.
VPSFM/K30/SVF: 4% 보체제거된 (decomplemented) 송아지 혈청이 보충된 VPSFM/K30 배지.
세포:
냉동 세포용 튜브 (눈크 튜브 참조: 430663, 5 ml)에 10% 다이메틸 설폭사이드를 포함하는 무혈청 배지 내에 50×106 세포/ml로 냉동 형태로 보관된 세포 은행으로부터 유래한 베로 세포.
1.2) "올-인-원 방법"에서 초기 미세캐리어 농도 및 세포 보호제에 관한 매개변수를 평가하기 위해 사용된 조작 프로토콜
이들 2개의 매개변수를 연구하는데 동일한 조작 프로토콜을 사용하였다.
베로 세포 성장에 대하여 첫 번째 세포 계대 동안 극소량의 미세캐리어 농도의 효과를 평가하기 위해 0.1　g/L 및 0.3　g/L의 농도를 검사하였다.
7.2-7.5의 pH, 37℃의 온도 및
Figure pct00002
25%의 pO2와 같은 생물반응기 조절 매개변수를 조정한 후 0.6　g의 미세캐리어를 포함하는 2 리터의 VPSFM/K30 배지 내 66×106 세포를 생물반응기 1 (바이오 1) (이는 25,000 세포/㎠ 부착 표면의 양에 대응하고 0.3　g/L의 초기 미세비드 농도를 나타냄) 내로 도입하였다.
0.2　g의 미세캐리어를 포함하는 2 리터의 VPSFM/K30 배지 내 22×106 세포를 생물반응기 2 (바이오 2) (이는 25,000 세포/㎠ 부착 표면의 양에 대응하고 0.1　g/L의 초기 미세비드 농도를 나타냄) 내로 도입하였다.
배양 배지를 재생하거나 배양 배지 부피를 줄이는데 사용되는 미세비드 침강기를 제외하고 세포 배양기간 전체에 걸쳐서, 배양 배지를 지속적인 교반에 적용하였다.
3일째 (D3)에, 세포를 다음과 같은 프로토콜에 따라서 트립신으로 처리하였다:
미세비드를 침강시킨 후,
Figure pct00003
300　ml의 VPSFM/K30 배양 배지를 생물반응기 내에 남겨둔 후 칼슘 및 마그네슘 부재의 인산염 완충액 내 600　mg의 재조합 트립신 (참조: 로쉐 04618734)을 포함하는
Figure pct00004
300　ml의 0.025 M 시트르산나트륨 용액을 첨가하였다. 배지를 온건한 교반 하에 유지하였다. 검사 시료를 이용해, 세포가 실제로 탈착되었음을 입증한 후 (일반적으로, 이러한 탈착은 15와 30분 사이의 기간에 일어남), 1　mg/ml의 트립신 억제제 (참조: 시그마 T6522)를 포함하는
Figure pct00005
300　ml의 VPSFM/K30 용액을 첨가함으로써 트립신의 작용을 중단시켰다. 세포 계수 후, 두 번째 세포 계대를 수행하기 위해 2 리터 배양 배지 총 부피 내에 2.4　g의 미세캐리어 (바이오 1), 또는 0.6　g의 미세캐리어 (바이오 2)를 도입한 후 대략 25×103 세포/㎠ 부착 표면이 되도록 세포 부유액의 일부를 제거하여 세포의 잔여량을 조정하였다. 그 후에 조절 매개변수를 다시 첫 번째 세포 계대 동안과 같이 조정하였다. 4 내지 6시간 후, 배지를 새로운 배양 배지로 교환한 후, 24 내지 48시간의 배양 후 다시 한번 선택적으로 재생하였다. 7일째 (D7)에, 3일째 (D3)에 사용되었던 바와 동일한 프로토콜에 따라서 세포를 트립신으로 다시 처리하였다. 세포 계수 후, 세포 부유액의 일부를 또한 세 번째 세포 계대를 수행하기 위해 2 리터 배양 배지의 총 부피 내에 6　g의 미세캐리어 (바이오 1), 또는 2.4　g의 미세캐리어 (바이오 2)를 도입한 후 대략
Figure pct00006
25×103 세포/㎠ 부착 표면이 되도록 세포 부유액의 일부를 제거하여 세포의 잔여량을 조정하였다. 그 후에 생물반응기 조절 매개변수를 다시 조정하였다. 4 내지 6시간 후, 배지를 새로운 배양 배지로 교환하였고, 이어서 24 내지 48시간의 배양 후 다시 한번 선택적으로 재생하였다. 10일째 (D10)에, 배양 용기 내 초기 미세캐리어의 농도에 따른 세포 증폭의 정도를 평가하기 위해 세포를 수확하였다.
세포 보호제의 역할을 평가하기 위하여, 폴록사머 188 및 폴리비닐피롤리돈 (PVP) K30을 0.3　g/L의 초기 미세캐리어 농도로 동일한 조작 프로토콜을 사용하여 검사하였다.
1.3) "올-인-원" 방법에서 혈청의 역할을 평가하기 위해 사용된 조작 프로토콜
하기 특징을 갖는 항목 1.2에서 기술된 바와 동일한 조작 프로토콜을 사용하였다:
- VPSFM/K30/SVF 배지가 검사됨,
- 초기 미세캐리어 농도는 0.3　 g/L임,
- 트립신 처리를 5일째 (D5) 및 8일째 (D8)에 수행하였음. 각 트립신 처리 전에, 혈청을 제거하기 위해, 세정, 침강 및 세정 완충액의 제거를 포함하는 연속적 단계에 의해 미세비드의 부유액을 600　ml의 세정 완충액 (인산염 완충액 (1×C PBS))으로 3회 "세정"하였다.
1.4) 결과
세포 성장에 대해 연구된 다양한 매개변수들의 역할을 평가하기 위하여, 세포 농도를 뉴클레오카운터 (Nucleocounter, Chemometec®) 계수 시스템을 사용하여 일정한 간격으로 측정하였고 누적된 세포 세대의 개수를 계산하였다. 각 회차에서, 미세비드 부유액의 2개 시료를 수집하였다. 표시된 값은 분석된 각 시점에서 수집된 2개 시료의 평균값을 나타낸다.
배양 동안에 관찰된 세포의 양 및 누적 세포 세대의 개수를 연구된 매개변수 각각에 대해서 하기 3개의 표에 나타내었다.
1.4.1) "초기 미세캐리어 농도" 매개변수
Figure pct00007
*: 트립신 처리 전
**: 트립신 처리 및 25×103 세포/㎠ 부착 표면으로의 세포 농도 조정 후
***: 누적 세대 개수의 측정을 위해, 연속적 세포 계대 동안에 이루어진 가능한 세포 농도 조정을 고려하였고 하기 일반식이 사용되었음:
log10 {최종 [세포]/초기 [세포]}
세대의 개수 = ---------------------------------------------
Log102
최종 [세포]: 조사 중인 날짜의 세포 농도에 해당함
초기 [세포]: 0일째 (D0) 세포 농도에 해당함
3회 연속적 세포 계대 후에 생산된 세포의 양이 초기 미세캐리어 농도가 0.1　g/L인 생물반응기에서 더 적을지라도, 이에 반해, 세포 집단의 배가 시간은 관찰된 누적 세포 세대의 개수가 검사 동안 내내 더 높기 때문에 이 생물반응기에서 약간 더 빠르다.
놀랍게도, 첫 번째 세포 계대 (
Figure pct00008
0.1　g/L) 동안에 매우 낮은 미세캐리어 농도는 세포 성장에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 반대로, 세포는 이들이 더 높은 미세캐리어 농도 (0.3　g/L)를 포함하는 생물반응기 내일 때보다 더 더욱 활발하게 분열하는 경향을 갖는다.
1.4.2) "세포 보호제" 매개변수
Figure pct00009
*: 트립신 처리 전
**: 트립신 처리 및 25×103 세포/㎠ 부착 표면으로의 세포 농도 조정 후
결과는 무혈청 배양 배지에 폴록사머 188 또는 PVP(K30)의 첨가가 올-인-원 방법에 따라서 수행된 세포 증폭에 전반적으로 동등한 효과를 나타냄을 보여준다.
1.4.3) "혈청" 매개변수
Figure pct00010
*: 트립신 처리 전
**: 트립신 처리 후
이들 결과는 "올-인-원" 방법이 또한 혈청을 함유하는 배양 배지에서 배양된 미세캐리어에 부착된 세포에 적용될 수 있음을 보여준다.
실시예 2: 본 발명에 따른 방법 ("올-인-원 방법")을 사용하거나 미세캐리어의 단순 첨가에 의한 방법 (" 비드 -투- 비드 이동" 기술)을 사용하여 수득된 베로 세포 생산의 비교
"올-인-원 방법"에 따라 또는 "비드-투-비드 이동" 기술을 사용하여 수행된 2회 연속적 세포 계대 후 세포 생산을 비교하였다.
상품명 콰트로 (Quattro)로 사르토리우스에 의해 시판되는, 4리터의 용량을 갖는 유리 생물반응기 내에서 연구를 수행하였다. 이 반응기는 pH, pO2 및 온도 탐침 및 교반 패들을 구비하고 있다.
2.1) "올-인-원 방법"을 실행하는데 사용된 조작 프로토콜
"올-인-원 방법"을 위해, 하기 특징을 갖는 항목 1.2에서 기술된 바와 동일한 원리를 적용하였다:
- VPSFM/K30 배지를 배양 배지로 사용하였다.
- 배양 배지의 부피는 2회 연속적 세포 계대 동안에 일정하게 유지하고 4 리터였다.
- 0.3　g/L의 미세비드 농도를 사용하고 50,000 세포/㎠ 부착 표면이 되도록 세포의 양을 도입하여 첫 번째 세포 계대를 수행하였다.
- 배양 배지를 3일째 (D3)에 재생하였다.
- 4일째 (D4)에, 세포를 항목 1.2에 기술된 바와 동일한 과정에 따라서 트립신으로 처리하였다. 트립신 처리 및 세포의 계수 후, 두 번째 세포 계대를 수행하기 위해 4 리터 배양 배지의 총 부피에 4.8　g의 미세비드 (즉, 1.2　g/L의 농도)를 도입한 후 세포의 잔여량을 25,000 세포/㎠ 부착 표면으로 조정하기 위해 세포 부유액 부피의 2/3을 제거하였다.
- 배양 배지를 2회 재생하였는데: 첫 번째는 미세비드의 도입 후 4 내지 6시간이고 그 후 두 번째는 6일째 (D6)였다.
- 8일째 (D8)에, 세포를 수확하고 세포 증폭 수준을 평가하기 위해 계수하였다. 세포에 의한 미세비드의 뒤덮임 정도를 평가하기 위하여 미세비드 부유액의 일정 부분을 또한 현미경 하에서 관찰하였다.
2.2) " 비드 -투- 비드 이동" 방법을 실행하는데 사용된 조작 프로토콜
4일째 (D4)에 세포를 트립신으로 처리하는 것을 제외하고는, 항목 2.1에서 기술된 바와 동일한 조작 프로토콜을 적용하였다. 4일째 (D4)에, "올-인-원" 방법에 사용된 바와 동일한 배양 조건이 되도록 동일한 비율의 세포 및 미세비드를 제거하는 방식으로 미세비드 부유액 부피의 2/3을 제거하였다. 이어서 4 리터 세포 배양 배지의 총 부피에 4.8　g의 사이토덱스 1 (즉, 1.2　g/L의 농도)을 포함하는 미세비드 부유액을 도입하였다. 그 후의 조작 프로토콜은 항목 2.1에 기술된 바와 동일하다.
2.3) 결과
검사된 2개의 방법 동안에 세포 성장을 비교하기 위하여, 세포 농도를 항목 1.4에 기술된 바와 동일한 절차에 따라서 일정한 간격으로 측정하였다.
배양 동안에 관찰된 세포의 양 및 누적 세포 세대의 수를 하기 표에 나타내었다.
Figure pct00011
*: 세포 농도 조정 전
**: 세포 농도 조정 및 선택적으로 트립신 처리 ("올-인-원" 방법의 경우) 후
첫 번째 세포 계대 (D0 내지 D3) 동안에는, 세포 성장이 2개의 생물반응기에서 유사하다. 반면, 두 번째 세포 계대 (D3 내지 D8) 동안에는, 세포 증폭이 "비드-투-비드 이동" 기술이 수행된 생물반응기 내에서 훨씬 약하다. 8일째 (D8)에, 수확된 세포의 양은 "올-인-원" 방법이 수행된 생물반응기에서 수확된 것의 대략 절반이다. 누적 세포 세대의 수에 있어서의 변화에 관한 결과와 동일한 선상이다. 8일째 (D8)에, 누적 세포 세대의 수는 올-인-원 방법에 따라 증폭된 세포의 경우에는 > 6이다. "비드-투-비드 이동" 기술에 따라 증폭된 세포의 경우에는 5이다. 따라서 "올-인-원" 방법에 따라 증폭된 세포는 더욱 활발하게 증식한다. "올-인-원" 방법이 세포에 대해 연속적 세포 계대를 수행하기 위해, 세포 온전성에 불리한 것으로 알려진, 트립신의 사용을 요구하는 한 이러한 결과는 놀라운 것이다.
이러한 결과는 동일한 작업 조건 하에서 수행된 2회의 독립적 실험에서 확인되었다. 8일째 (D8)에 누적 세포 세대의 수에 대한 변화의 분석은 유의미한 차이를 나타낸다 (p=0.0137).
8일째 (D8)에 미세비드의 현미경 분석은 올-인-원 방법이 수행된 경우에 미세비드의 거의 대부분이 세포로 뒤덮임을 보여준다 (도 2a 참조). 반면, "비드-투-비드 이동" 기술이 수행된 경우에는 미세비드의 일부만이 세포로 뒤덮인다. 4일째 (D4)에 사이토덱스 1 미세비드의 첨가 후 배지의 연속적 교반 또는 배지의 간헐적 교반 (5분간의 교반에 이어서 20분의 휴지기를 포함하는 2시간 주기의 반복에 의함)은 실질적으로 결과를 변경하지 않는다 (도 2b 참조).
실시예 3: 하나의 동일한 20-리터 생물반응기 내에서 2회 연속적 세포 계대를 수행함에 의한 베로 세포의 증폭
3.1) 사용된 재료
생물반응기:
상품명 뉴클레오-20 (Nucleo-20)으로 ATMI에 의해 판매되는, 1회용 백 형태의 20-리터 생물반응기를 사용하였다. 평형화에 이어 오토클레브 처리에 의한 멸균 후, 탐침 홀더 백에 의한, pH, pO2 및 온도 탐침을 표준 ATMI 프로토콜에 따라 백에 장착하였고: 한쪽은 백 위에 다른 한쪽은 탐침 위에 위치한 클린팩 (Kleenpack®) 연결을 연결한 후 이렇게 형성된 연결을 통해 탐침을 생물반응기 내로 도입하였다.
미세캐리어: GE 헬쓰케어에 의해 공급된 사이토덱스 1 미세비드 (항목 1.1 참조).
배양 배지:　 VPSFM/K30　배지 (항목 1.1 참조).
세포: 베로 세포 (항목 1.1 참조).
3.2) 조작 프로토콜
6 리터의 VPSFM/K30 배양 배지를 뉴클레오-20 내로 도입한 후 4　g의 사이토덱스 1 (이는 세포의 첨가 후 0.5　g/L의 초기 미세비드 농도를 나타냄)을 포함하는 1 리터의 미세비드 부유액을 첨가하였다. 37℃의 온도, 7.2-7.4의 pH 및
Figure pct00012
25%의 pO2와 같이 뉴클레오-20 내부의 조절 매개변수를 조절하고 배양 배지 내 비드를 재-부유시키기 위해 배지를 온건한 교반에 적용한 후, 해동시켜 1 리터의 VPSFM/K30 배양 배지에 첨가한 500×106　세포를 뉴클레오에 도입하였다. 조작 프로토콜의 기간 내내, 배양 배지를 재생하거나 배양 배지의 부피를 줄이기 위해 수행되는 미세비드 침강기 동안을 제외하고는, 배양 배지를 연속 교반에 적용하였다.
2일째 (D2) (배양 상태에 놓인 지 2일째)에, 배지를 새로운 VPSFM/K30 배지로 교환하였다.
5일째 (D5)에, 하기 프로토콜에 따라 세포를 트립신으로 처리하였다:
교반, pH 조절 및 pO2 조절을 중단하였다. 온도 조절만을 유지하였다. 미세비드의 침강 후,
Figure pct00013
3 리터의 VPSFM/K30 배양 배지를 생물반응기 내에 남기고 칼슘 및 마그네슘 부재의 인산염 완충액에 600　mg의 재조합 트립신 (참조: 로쉐 04618734)을 포함하는
Figure pct00014
3　리터의 0.025 M 시트르산나트륨 용액을 첨가하였다. 그 후에 배지를 다시 온건하게 교반하였다. 검사 시료를 취하여 (일반적으로, 이러한 탈착은 15와 30분 사이의 기간에 일어남) 세포가 실제로 탈착되었음을 확인한 후, 1　mg/ml의 트립신 억제제 (참조: 시그마 T6522)를 포함하는
Figure pct00015
3　리터의 VPSFM/K30 용액을 첨가하여 트립신의 작용을 중단시켰다. 28　g의 사이토덱스　1을 함유하는 미세비드 부유액을 이어서 첨가하였고, 이는 VPSFM/K30 배양 배지를 이용해 배양 배지의 부피를 20 리터로 조절한 후 배지 내 대략 1.4　g/L의 미세비드 농도를 나타낸다. 그 후에 뉴클레오-20 내부의 조절 매개변수를 다시 첫 번째 세포 계대 동안과 같이 조정하였다. 미세비드를 도입하고 4 내지 6시간 후, 배지를 새로운 배양 배지로 교환하였다. 새로운 배양 배지로 배양 배지의 두 번째 교환은 7일째 (D7)에 수행하였다. 9일째 (D9)에, 세포는 실질적으로 융합성이었다. 그 후에 이들을 5일째 (D5)에 사용된 바와 동일한 프로토콜에 따라 트립신으로 처리하였다. 동일한 생물반응기 내에서 형성된 2회 세포 계대 후 수득된 세포 증폭의 수준을 수득된 세포 부유액으로부터 결정하였다.
3.3) 결과
수득된 세포 증폭 수준을 측정하기 위하여, 세포 농도를 항목 1.4에 기술된 바와 동일한 절차에 따라서 일정한 간격으로 측정하였다.
배양 동안에 관찰된 세포 양 및 농도를 하기 표 I에 나타내었다:
Figure pct00016
*: 트립신 처리 전
**: 트립신 처리 및 세포 부착 후
***: 접종된 생존 가능 세포의 초기 양을 나타냄
2회의 연속적 세포 계대를 동일한 20-리터 생물반응기에서 수행한 후, 배양 9일째에 세포 집단은 68배 증가한 반면, 세포 지지체의 표면은 7배 증가하였다.
실시예 4: 하나의 동일한 20-리터 생물반응기 내 3회 연속 계대의 수행에 의한 베로 세포의 증폭
4.1) 사용된 재료
사용된 재료는 실시예 3의 과정에 기술된 재료와 동일하였다.
4.2) 조작 프로토콜
하기와 같이 변화시키면서, 항목 3.2에 기재된 바와 동일한 프로토콜에 따라 세포 계대를 수행하였다:
- 2　g의 사이토덱스 1 미세비드를 포함하는 8 리터의 VPSFM/K30 배양 배지 (이는 0.25　g/L의 미세비드 농도를 나타냄) 내로 250×106 세포를 도입하여 첫 번째 계대를 수행하였다;
- 5일째 (D5)에, 첫 번째 트립신 처리 후, 두 번째 세포 계대를 수행하기 위해, 14　g의 사이토덱스　1을 포함하는 미세비드 부유액을 첨가하였고, 이는 VPSFM/K30 배양 배지를 이용해 배양 배지 부피를 13 리터로 조정한 후 대략 1.07　g/L의 미세비드 농도를 나타낸다;
- 9일째 (D9)에, 두 번째 트립신 처리 후, 세 번째 세포 계대를 수행하기 위해, 60　g의 사이토덱스 1을 포함하는 미세비드 부유액을 첨가하였고, 이는 VPSFM/K30 배양 배지를 이용해 배양 배지 부피를 20 리터로 조정한 후 대략 3　g/L의 미세비드 농도를 나타낸다.
12일째 (D12)에, 세포는 실질적으로 융합성이었다. 그 후에 이들을 5일째 (D5)에 사용된 바와 동일한 프로토콜에 따라 트립신으로 처리하였다.
동일한 생물반응기 내에서 수행된 3회의 세포 계대 후 수득된 세포 증폭 수준을 수득된 최종 세포 부유액을 사용하여 측정하였다.
4.3) 결과
배양 동안에 관찰된 세포 양 및 농도를 하기 표에 나타내었다:
Figure pct00017
*: 트립신 처리 전
**: 트립신 처리 및 세포 부착 후
동일한 20-리터 생물반응기 내에서 베로 세포의 3회의 연속적 세포 계대를 수행한 후, 세포 집단은 배양 12일 후 126배 증가한 반면, 세포 지지체의 표면은 30배 증가하였다.
실시예 5: 본 발명에 따른 방법 (연속적 세포 계대가 하나의 동일한 생물반응기 내에서 수행됨) 또는 통상적인 세포 증식 방법 (연속적 세포 계대가 매회 더 큰 크기의 다른 생물반응기 내에서 수행됨)을 사용한 배로 세포 생산의 비교
5.1) 조작 프로토콜
실시예 4에 기재된 프로토콜에 따라 단일 20-리터 생물반응기 내에서 3회 연속적 세포 계대를 냉동 세포 은행으로부터 직접적으로 유래하는 250×106 세포의 초기 양을 사용하여 수행하거나, 또는 다른 스테인리스제의 생물반응기, 즉 첫 번째는 2-리터 생물반응기에서, 두 번째는 7-리터 생물반응기에서, 세 번째는 28-리터 생물반응기에서 3회의 연속적 세포 계대를 수행함으로써 베로 세포의 생산을 연구하고 비교하였다. 사용된 통상적 방법의 실험 조건은 하기와 같다:
해동 후 2 리터의 VPSFM/K30 배양 배지 내로 40×103 세포/㎠ 부착 표면을 도입하여 세포 팩토리 (CF10)에서 초기 계대를 수행함으로써 베로 세포를 먼저 이들의 배양 조건에 적응시켰다. 배양 5일 후, 수득된 세포 집단을 트립신 처리 단계 후 수확하였다. 수확된 세포 집단을 2 리터의 VPSFM/K30 배양 배지 내에 2　g의 사이토덱스　1 미세비드 부유액 (농도 1　g/L)을 포함하는 2 리터 작업 부피를 갖는 생물반응기에 접종하는데 사용하였다. 조절 매개변수를 검사하고 조정하고 37℃의 온도, 7.2-7.4의 pH 및
Figure pct00018
25%의 pO2로 설정하고 배지를 온건한 교반에 적용시킨 후, 2-리터 생물반응기에 평균적으로 220×106 세포를 접종하였다. 3일째 (D3)에, 배양 배지를 새로운 배양 배지로 교체하였다. 4일째 (D4)에, 실질적으로 융합성인 세포를 트립신으로 처리한 후 사용된 미세캐리어와 함께 14　g의 사이토덱스　1 미세비드가 미리 첨가된 7 리터의 VPSFM/K30 배양 배지 (이는 대략 2　g/L의 미세비드 농도를 나타냄)를 포함하는 7-리터 생물반응기로 옮겼다. 6일째 (D6)에, 배양 배지를 새로운 배양 배지로 교체하였다. 8일째 (D8)에, 실질적으로 융합성인 세포를 트립신으로 처리한 후 동일한 방식으로 70　g의 사이토덱스　1 미세비드가 미리 첨가된 28 리터의 VPSFM/K30 배양 배지 (이는 대략 2.5　g/L의 미세비드 농도를 나타냄)를 포함하는 28-리터 생물반응기로 옮겼다. 10일째 (D10)에, 배양 배지를 새로운 배양 배지로 교체하였다. 11일째 (D11)에, 실질적으로 융합성인 세포를 트립신으로 처리한 후 수확하여 계수하였다.
5.2) 결과
검사된 2가지 방법 동안 세포 성장을 모니터하기 위하여, 세포 농도를 항목 1.4에 기재된 바와 동일한 절차에 따라서 일정한 간격으로 측정하였다.
배양 동안에 관찰된 세포의 양 및 증폭 수준을 하기 표에 나타내었다:
Figure pct00019
*: 표시된 양은 수행된 8회의 다른 실험에서 수득된 평균값이다.
**: 표시된 양은 수행된 3회의 다른 실험에서 수득된 평균값이다.
"올-인-원" 방법을 사용하면, 평균 25300만의 직접 해동된 세포가 20-리터 생물반응기 내로 도입되고 12일의 배양 후에 평균적으로 290억 이상의 세포가 달성되었는데, 즉 세포 증폭의 평균 수준은 115이다. 통상적 방법을 사용하면, 평균적으로 22000만의 세포가 2-리터 생물반응기 내로 도입되고 11일의 배양 후에 평균적으로 320억의 세포가 달성되었는데, 즉 세포 증폭의 평균 수준은 145이다. 이용가능한 세포 지지체 표면이 2개 방법에서 30배 증가하였지만, 통상적인 방법의 경우 3개의 생물반응기의 사용을 요구한다. 통상적인 방법으로 수득된 세포의 양이 약간 더 높다. 이는 "올-인-원" 방법과 통상적인 방법을 실행하기 위해 사용된 세포들이 동일한 생리학적 상태가 아니었다는 사실에 기인한다. "올-인-원" 방법의 경우에 20-리터 생물반응기의 접종에 사용되었던 세포는 바로 해동된 것인 반면, 2-리터 생물반응기의 접종에 사용되었던 세포는 이들이 세포 팩토리에서 미리 배양되었기 때문에 훨씬 더 왕성하였다. 1일째 (D1) 결과는 매우 명확하게 이를 보여주는데; 올-인-원 방법에서, 1일째 (D1) 세포 개수에서 약 40%의 감소는 통상적인 "해동-후 지연 (post-thaw lag)" 현상의 결과이다. 동일한 기간 동안에, 세포 팩토리에서 미리 배양되었던 세포는 통상적인 과정으로 증식하였다 (세포 집단이 두 배가 됨). "올-인-원" 방법에 명백히 불리한 초기 배양 조건에도 불구하고, 배양 말기에, 결국에는 2개의 방법에서 수확된 세포의 양 사이에 매우 적은 차이가 있음이 주목된다. 만약 초기 배양 조건이 검사된 2개의 방법에서 동일하였다면, 동일한 양의 세포 및 동일한 수준의 세포 증폭이 달성되었을 것으로 추정된다. 따라서 경제적인 수단으로, 동일한 기간 동안에 동일한 양의 세포가 생산되기 때문에 "올-인-원" 방법은 통상적인 방법에 비해 매우 유리하다.
실시예 6: 하나의 동일한 200-리터 생물반응기 내 3회 연속적 세포 계대의 수행에 의한 베로 세포의 증폭
6.1) 사용된 재료
본 실시예의 경우에, 상품명 뉴클레오-200으로 ATMI에 의해 시판된 200-리터 1회용 백인 생물반응기를 제외하고는, 사용된 재료가 실시예 3에 기재된 바와 동일하다.
6.2) 조작 프로토콜
사용된 조작 프로토콜은 하기와 같이 변형시키면서, 실시예 3에 기재된 바와 유사하다:
해동시킨 베로 세포를 40×103 세포/㎠ 부착 표면 및 CF10 당 2 리터의 배양 배지의 비율로 2개의 세포 팩토리 (CF10)에서 미리 배양 상태에 두었다. 배양 5일 후, 세포 집단을 트립신 처리 단계 후 수확하고 이어서 뉴클레오-200을 접종하는데 사용하였다.
뉴클레오-200 내에서 첫 번째 세포 계대는 25　g의 사이토덱스 1 미세비드를 포함하는 50 리터의 VPSFM/K30 배양 배지 (이는 0.5　g/L의 미세비드 농도를 나타냄) 내로 2.2×109 세포를 도입하여 수행하였다. 3일째 (D3)에, 배양 배지를 새로운 배양 배지로 교체하였다. 4일째 (D4)에, 세포를 실시예 3의 프로토콜에 따라 트립신으로 처리하고, 뉴클레오 내에
Figure pct00020
20 리터의 배지를 남긴 후 칼슘 또는 마그네슘 모두를 포함하지 않는 인산염 완충액 중에 3000　mg의 재조합 트립신을 포함하는
Figure pct00021
20　리터의 0.025 M 시트르산나트륨 용액을 첨가하였다. 세포의 탈착 후, 1　mg/ml의 트립신 억제제를 포함하는 20 리터의 VPSFM/K30 용액을 첨가하여 트립신의 작용을 중단시켰다.
130　g의 사이토덱스　1을 포함하는 미세비드의 부유액을 수득된 전체 세포 집단에 첨가하여 두 번째 세포 계대를 동일한 뉴클레오-200 내에서 수행하였는데, 이는 배지의 총 부피를 VPSFM/K30 배양 배지를 이용해 130 리터로 조정한 후 대략 1　g/L의 미세비드 농도를 나타낸다. 배양 배지를 2회 재생하였는데: 첫 번째는 미세비드에의 세포의 흡착 후이고, 두 번째는 6일째 (D6)이다. 7일째 (D7)에, 세포를 4일째 (D4)에 사용된 바와 동일한 프로토콜에 따라 다시 트립신으로 처리하였다.
VPSFM/K30 배양 배지를 이용해 180 리터로 조정된 배지의 총 부피에 450　g의 사이토덱스　1 미세비드를 도입한 후 20,000　세포s/㎠ 부착 표면의 농도가 되도록 세포 집단을 조정함으로써 동일한 뉴클레오-200 내에서 세 번째 세포 계대를 수행하였다. 유사하게, 배양 배지를 2회 재생하였는데: 미세비드에의 세포의 흡착 직후 및 10일째 (D10)이다. 그 후에 동일한 생물반응기 내에서 수행된 3회의 연속적 세포 계대 후 수득된 세포 집단을 정량하였다. 세포 증폭의 수준을 그 후에 측정하였다.
6.3) 결과
배양 동안에 관찰된 세포 양 및 농도를 하기 표에 나타내었다:
Figure pct00022
*: 트립신 처리 전
**: 트립신 처리 및 세포의 부착 후
***: 트립신 처리 및 20,000 세포/㎠ 부착 표면의 농도로 세포 집단의 조정 후
동일한 200-리터 생물반응기 내에서 베로 세포의 3회 연속적 세포 계대 후, 세포 집단은 11일간의 배양 후 140배로 증가한 반면 세포 지지체 표면은 18배 증가하였다.
상품명 뉴클레오-2000으로 ATMI에 의해 시판된 단일 500-리터 1회용 생물반응기 내에서 특히 2회 연속적 세포 계대를 수행함으로써 "올-인-원" 방법에 따른 베로 세포의 증폭을 또한 검사하였다. 수득된 세포 증폭의 수준은 200-리터 생물반응기에서 수득된 바와 유사하였고, 이는 본 발명의 방법이 대단히 큰 규모에 적합함을 명백히 보여준다.
실시예 7: 하나의 동일한 200-리터 생물반응기 내에서 3회 연속적 세포 계대의 수행에 의해 수득된 세포의 회분으로부터 광견병 바이러스의 생산
실시예 6에 기술된 바와 동일한 프로토콜을 사용하여 세포의 회분을 생산하였다.
11일째 (D11)에, 배양 배지를 VPSFM-계 바이러스 감염 배지로 교체하고 세포를 위스타 연구소 (Wistar institute)로부터 유래하는 광견병 바이러스의 피트만 무어 (Pitman Moore) 균주를 0.01의 감염다중도로 감염시켰다. 세포 배양에 사용되었던 온도, pH, pO2 및 배지의 온건한 교반과 관련해 동일한 조절 매개변수를 계속 유지하고 바이러스 생산을 위해 조정하였다. 바이러스 감염 배지를 바이러스 감염 후 3일째 (D3)에 재생한 후, 바이러스 감염 후 7일 (D7), 10일 (D10) 및 14일 (D14) 째에 감염 역가를 측정하기 위해 배양 상등액을 수확하였다. 각각의 바이러스 수확 후, 새로운 바이러스 감염 배지를 다시 첨가하였다. 배양 상등액 내 감염 역가를 BHK21 세포를 대상으로 통상적인 면역형광 검사를 이용해 측정하였다. 검사된 배양 상등액 각각에 대해 일련의 희석액을 제조한 후 각각의 희석액을 96-웰 마이크로플레이트의 10개 웰에 분주하였다. 2회 연속 검사를 동시에 수행하였다. 그 후에 BHK21 세포의 부유액을 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 5% CO2 하의 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 웰은 세포층으로 뒤덮였고, 이를 그 후에 아세톤으로 고정하였다. 아세톤을 제거하고 마이크로플레이트를 건조시킨 후, 광견병 바이러스에 대한 단일클론 항체의 1/70배 희석액의 50　㎕ (FDI 후지리바이오 다이어그노스틱스 - 참조 800092)를 첨가하였다. 1시간 배양하고 일련의 세정 후, 마이크로플레이트를 형광 현미경으로 분석하였다. 적어도 하나의 세포에서 특정 형광이 관찰되면 이 웰은 양성인 것으로 간주된다. 광견병 바이러스의 부재 하에서 배양된 BHK21 세포를 음성 대조군으로 사용하고, 참조 광견병 바이러스 균주의 존재 하에서 배양된 BHK21 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 검사된 배양 상등액 내에 포함된 광견병 바이러스의 감염 역가를 스피어만-카버 (Spearman-Karber) 방법에 따라 결정하고 log10 세포 배양 감염 용량 50% (CCID 50) 단위로 표시하였다. 관찰된 배양 상등액 내에서 수득된 감염 역가는 약 7.0 log10 CCID 50이었다.

Claims (23)

  1. 하기에 따르는, 부착성 세포를 제조하는 방법:
    a) 부착성 세포를 배양 배지 내에 미세캐리어를 포함하는 배양 용기 내로 도입하는 단계;
    b) 상기 세포를 동일한 배양 용기 내에서 수차례의 연속적 세포 계대를 수행하여 증폭시키는 단계로, 첫 번째 세포 계대 이후의 각각의 세포 계대가:
    i. 미세캐리어로부터 세포를 탈착하기 위해 세포 집단을 효소적 처리에 적용한 후에, 선행 세포 계대 동안에 수득된 세포 집단의 전부 또는 일부를 사용하고,
    ii. 배양 배지 및 증가한 양의 미세캐리어를 도입하여 수행하는 단계;
    c) 미세캐리어로부터 세포를 탈착하기 위해 세포 집단을 선택적으로 효소적 처리에 적용한 후에 최종 세포 계대 동안에 생성된 세포 집단을 수득하는 단계.
  2. 하기에 따르는, 부착성 세포에 의해 생성된 생물학적 제제를 제조하는 방법:
    a) 부착성 세포를 배양 배지 내에 미세캐리어를 포함하는 배양 용기 내로 도입하는 단계;
    b) 상기 세포를 동일한 배양 용기 내에서 수차례의 연속적 세포 계대를 수행하여 증폭시키는 단계로, 첫 번째 세포 계대 이후의 각각의 세포 계대가:
    i. 미세캐리어로부터 세포를 탈착하기 위해 세포 집단을 효소적 처리에 적용한 후에, 선행 세포 계대 동안에 수득된 세포 집단의 전부 또는 일부를 사용하고,
    ii. 배양 배지 및 증가한 양의 미세캐리어를 도입하여 수행하는 단계;
    c) 최종 세포 계대 동안에 생성된 세포 집단이 생물학적 제제를 생성하도록 이들을 처리하는 단계로, 상기 처리가 동일한 배양 용기 내에서 세포를 증폭하기 위해 사용된 바와 같이 수행되는 것인 단계; 및
    d) 생물학적 제제를 수득하는 단계.
  3. 제2항에 있어서, 생물학적 제제가 감염성 제제이고 단계 c)에서 세포 집단의 처리가 세포 집단을 감염 배지 내에서 상기 감염성 제제로 감염시켜 수행되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 감염성 제제가 광견병 바이러스이고 감염 배지가 동물 기원의 임의의 산물을 포함하지 않는 바이러스 감염 배지인 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 배양 용기 내에서 수행되는 세포 계대의 횟수가 2회, 3회 또는 4회인 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 세포 계대 동안 배양 배지 내 미세캐리어의 농도가 < 1　g/L이고, 바람직하게는 ≤ 0.5　g/L인 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소적 처리가 단백질 분해효소를 포함하는 용액을 사용하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 후속 세포 계대가 배양 배지의 부피를 증가시키면서 수행되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 세포 계대가 배양 용기의 작업 부피의 1/5와 1/2 사이인 배양 배지 부피로 수행되는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 동물 기원의 혈청을 포함하지 않는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 동물 기원의 임의의 산물을 포함하지 않는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지 내 단백질 농도가 ≤15　mg/L인 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지가 또한 세포 보호제를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 세포 보호제가 폴리비닐피롤리돈 또는 폴록사머인 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 용기가 3과 3000 리터 사이, 바람직하게는 20과 1000 리터 사이, 더욱 바람직하게는 20과 500 리터 사이의 작업 부피를 갖는 생물반응기인 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 배양 용기가 1회용 생물반응기인 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 부착성 세포가 베로 세포인 것인 방법.
  18. 제1항 및 제5항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)에서 수득되는 세포 집단이 상기 방법의 단계 a)에서 초기에 도입된 세포 양의 적어도 60배를 포함하는 것인 방법.
  19. 하기에 따르는, 부착성 세포를 생산하는 방법:
    a) 부착성 세포의 스톡을 해동하는 단계;
    b) 해동된 부착성 세포를 제1항 및 제5항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 방법에 적용하는 단계.
  20. 제1항 및 제5항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따라서 첫 번째 배양 용기에서 부착성 세포를 생산한 후에, 하기에 따르는 부착성 세포를 생산하는 방법:
    a) 세포를 미세캐리어로부터 탈착하기 위해 세포 집단을 효소적 처리에 적용한 후에 수득된 상기 세포 집단을 더 큰 작업 부피를 갖고 첫 번째 배양 용기에서 수행된 최종 세포 계대 동안에 존재했던 미세기공의 양보다 더 많은 양의 미세기공을 포함하는 배양 배지를 포함하는 두 번째 배양 용기로 옮기는 단계; 및
    b) 제1항 및 제5항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법의 단계 b) 및 c) 이 두 번째 용기에서 실행하는 단계.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제20항의 단계 a) 및 b)가 두 번째 배양 용기의 작업 부피보다 큰 작업 부피를 갖는 세 번째 배양 용기에서 다시 반복되는 것인 방법.
  22. 생물학적 제제의 생산을 위한, 제1항 및 제5항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라서 생산된 세포의 용도.
  23. 단일 배양 용기 내에서 연속적 세포 계대에 의해 생산된 세포의 양이 ≥ 60 증가하도록, 배양 배지에 미세캐리어를 포함하는 배양 용기에서 부착성 세포를 생산하는 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014151901A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Improvement of mammalian cell culture performance through surfactant supplementation of feed media
CN103289949A (zh) * 2013-06-28 2013-09-11 四川省华派生物制药有限公司 一种从克氏瓶直接到生物反应器的细胞培养方法
JP6655548B2 (ja) * 2014-03-25 2020-02-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド 細胞培養培地における使用のためのポロキサマーを調製する方法
SG11201610143VA (en) * 2014-06-04 2017-01-27 Amgen Inc Methods for harvesting mammalian cell cultures
KR20220130248A (ko) 2016-06-24 2022-09-26 론자 리미티드 가변 직경 생물 반응기
CN106754672A (zh) * 2016-11-30 2017-05-31 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种贴壁细胞的培养方法
US20210254010A1 (en) * 2018-06-14 2021-08-19 Abraham J And Phyllis Katz Cord Blood Foundation Isolation of Mesenchymal Stromal Cells
CN116036257A (zh) * 2022-12-29 2023-05-02 瑞普（保定）生物药业有限公司 一种猪瘟活疫苗的制备方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4664912A (en) 1984-10-01 1987-05-12 Wiktor Tadeusz J Process for the large scale production of rabies vaccine
FR2635008B1 (fr) 1988-08-05 1990-11-16 Sanofi Sa Agent activateur de la productivite specifique des cellules animales recombinantes a base de polyvinylpyrrolidone et milieu de culture defini le contenant
DK52393D0 (ko) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
US5714375A (en) * 1995-06-05 1998-02-03 Nobl Laboratories, Inc. Ileal symbiont intracellularis propagation in suspended host cells
US6020182A (en) * 1996-07-12 2000-02-01 Connaught Laboratories Limited Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation
AU3431397A (en) * 1996-07-12 1998-02-09 Connaught Laboratories Limited Two-step immunization procedure against the pyramyxoviridae family of viruses using attenuated viral strains and subunit protein preparation
US6168944B1 (en) * 1997-01-31 2001-01-02 Schering Corporation Methods for cultivating cells and propagating viruses
PL196042B1 (pl) 1997-12-24 2007-11-30 Duphar Int Res Sposób przygotowania komórek linii komórkowej MDCK do wytwarzania preparatów wirusowych
FR2801900B1 (fr) 1999-12-03 2004-02-27 Pasteur Merieux Serums Vacc Methode de production de cellules animales adherentes
US6670184B2 (en) * 2000-06-23 2003-12-30 Basf Ag Method for producing a lipid emulsion for use in insect cell culture
US6855535B2 (en) * 2001-12-10 2005-02-15 Baxter Healthcare S.A. Method of large scale production of Hepatitis A virus
US6951752B2 (en) * 2001-12-10 2005-10-04 Bexter Healthcare S.A. Method for large scale production of virus antigen
DE102004043256B4 (de) * 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
CN101265464B (zh) * 2008-05-13 2010-06-16 中国人民解放军第二军医大学 一种猪骨髓内皮祖细胞的分离和培养方法

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