CN112870343A - 一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法 - Google Patents

一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112870343A
CN112870343A CN202110151509.6A CN202110151509A CN112870343A CN 112870343 A CN112870343 A CN 112870343A CN 202110151509 A CN202110151509 A CN 202110151509A CN 112870343 A CN112870343 A CN 112870343A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
ace2
hatching
new coronavirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202110151509.6A
Other languages
English (en)
Inventor
翁炳焕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN202110151509.6A priority Critical patent/CN112870343A/zh
Publication of CN112870343A publication Critical patent/CN112870343A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
    • C12N5/0689—Stem cells; Progenitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Abstract

一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法，根据新冠病毒通过ACE2受体感染宿主细胞并易在表达ACE2的宿主细胞中繁殖的机制，从产前诊断后废弃的细胞中分离肺干细胞，转染ACE2和SV40LT基因，开发易使新冠病毒进入细胞内繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，使病毒与孵化细胞共培养时能随孵化细胞的扩增而大量繁殖，孵化所得病毒液经滤器过滤、超滤浓缩、层析纯化、除菌过滤、甲醛灭活、纯度检测、中和抗体及残留蛋白和DNA检测合格后，制成灭活疫苗。本发明不使用异种动物或细胞扩增病毒而是以同种人类永生干细胞制备的孵化细胞扩增新冠病毒，使所制新冠疫苗不会残留具有免疫原或致瘤等风险的异种动物蛋白或基因片段，疫苗接种理论上较安全。

Description

一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法
技术领域
本发明涉及一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法，属于生物医学领域的传染病防治技术。
背景技术
在新冠病毒病(COVID-19)的防控、治疗或研究中，通常需要大量的新冠病毒作为科研材料，所以需要一种可以大规模培养新冠病毒的基质或方法，以获得所需新冠病毒。
在常用的病毒培养方法中，鸡胚培养技术比组织培养容易成功，也比组织培养方法中的动物来源容易，培养过程中无饲养管理及隔离等的特殊要求，而且鸡胚相对无病毒隐性感染，对于生产企业而言，它的敏感范围很广，能适应多种病毒，因此，是目前比较常用的一种培养动物病毒的方法。鸡胚培养法是将病毒接种于鸡胚中进行病毒培养的一种方法，该方法适用于某些对鸡胚敏感的动物病毒，近年来随着细胞培养技术和组织培养技术的迅速发展，使得鸡胚培养技术在某些方面已被其他技术所取代。
WHO于1982年批准以1962年建立的非洲绿猴肾细胞系(Vero细胞)作为基质细胞培养病毒，用于狂犬病疫苗、轮状病毒疫苗、流行性乙型脑炎病毒疫苗、流感病毒疫苗、肠道病毒71型疫苗等病毒疫苗的研究和生产。WHO同时也规定在用Vero细胞生产的疫苗产品中Vero细胞残余DNA含量不能超过100pg/剂，因为Vero细胞本质为猴肾细胞系，用Vero细胞生产的疫苗产品中可能残留的Vero细胞成分对人类来说是异种物质，如果超标就可能会影响疫苗的安全性。如美国食品药品监督管理局(FDA)报道，制备流感疫苗的基质细胞(MDCK细胞)残留的大于200bp的基因片段可能具有致癌作用。所以，如果以人细胞系作为基质细胞制备新冠病毒，进而制备灭活病毒疫苗，所残留的基质细胞成分应该影响更少。
文献报道，人间充质干细胞在体外传代至15-30代就会出现衰老或死亡，其他组织细胞的传代时间更短，而经猿猴病毒40大T抗原基因(SV40LT)和/或人端粒酶逆转录酶(hTERT)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。这为将人类羊水干细胞或肺组织细胞改造为可用于大规模培养病毒的永生化干细胞系提供了依据。
文献报道，SARS-CoV能在血管紧张素转换酶2(ACE2)基因转染的293T细胞中复制，但不能在模拟转染(不含ACE2)的293T细胞中复制，SARS-CoV-2也与SARS-CoV一样，通过ACE2受体感染细胞。SARS-CoV-2含有刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)，其中S蛋白包括N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N端的结构域(S1-NTD)和受体结合域(S1-RBD)组成，S1-RBD负责识别并结合细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，S2亚基介导病毒包膜和细胞膜融合，使病毒通过受体ACE2进入细胞从而引起感染。所以不管人体细胞对新冠病毒是否易感，均可通过慢病毒转染的方法将ACE2整合到永生化干细胞系DNA上进行表达，以增强干细胞系对新冠病毒的易感性或使易感性由弱变强，制备成新冠病毒孵化细胞，使新冠病毒更易进入这种过表达ACE2的永生化的新冠病毒孵化细胞内繁殖，以用于产业化制备新冠病毒，用于新冠病毒灭活疫苗的制备以及其他相关应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明人提出了本发明。
本发明的目的是要公开一种人造新冠病毒孵化细胞的方法以及基于人造新冠病毒孵化细胞的新冠肺炎灭活疫苗制备方法。
本发明的目的是这样实现的：(1)采集产前诊断后剩余羊水细胞，分离梭形羊水细胞或肺组织细胞，转染SV40LT和/或hTERT基因，以G418和/或嘌呤霉素筛选永生化细胞系，经细胞系生物学鉴定、肺干细胞标志物检测获得永生化羊水间充质干细胞系或肺干细胞系，命名为MSC-SV40LT/hTERT。(2)将血管紧张素转换酶II即ACE2基因连接到慢病毒表达载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU中，分别构建重组质粒pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，将重组质粒pHBLV-OE-ACE2和包装质粒(psPAX2和pMD2G)或将重组质粒pGC-FU-ACE2和包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)分别共转染293FT细胞，包装携带ACE2的重组慢病毒，再将重组慢病毒转染MSC-SV40LT/hTERT，使ACE2整合到永生化干细胞DNA上，经过筛选和鉴定，获得易使新冠病毒感染和繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，作为制备新冠病毒灭活疫苗的基质细胞，命名为NCIC细胞(Novel Coronavirus Incubate Cells)。(3)将孵化细胞分装于安瓶内，每个安瓶10×106个细胞，收藏于-196℃液氮细胞库中。(4)取细胞库中的孵化细胞，经传代培养至所需细胞量时转种到内含3-5g/L微载体的DMEM细胞培养液的生物反应器中，在37℃、5％CO2、pH值7.2、搅拌速度50±20rpm的条件下培养，使细胞在微载体表面形成60％汇合度，然后换上病毒维持液，接种0.01～0.3MOI量的新冠病毒液，在33℃、5％CO2、pH值7.4、搅拌速度50±20rpm的条件下培养48～96小时，至细胞完全病变时收获病毒液。(5)病毒液经75μm、0.45μm和0.22μm滤器过滤、100KD超滤膜超滤浓缩、Sepharose CL-6B凝胶过滤层析纯化、0.22μm滤器除菌过滤、92.5μg/ml甲醛灭活、灭活效果验证、病毒液纯度检测、中和抗体检测以及病毒液蛋白和DNA残留量检测，制成新冠病毒灭活疫苗。
本发明的有益效果在于：
本发明根据新冠病毒通过ACE2受体感染宿主细胞并易在表达ACE2的宿主细胞中繁殖的机制，从产前诊断后剩余的胎儿细胞中分离肺干细胞，进行ACE2和SV40LT基因转染，获得因表达ACE2和SV40LT而易使新冠病毒进入细胞内繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，使新冠病毒与孵化细胞共同培养时能随孵化细胞的无限扩增而大量繁殖，所制孵化细胞可作为与人类同种的基质细胞制备新冠病毒，所制新冠病毒可用于制备灭活疫苗。
WHO于1982年批准Vero细胞可作为研究乙脑、脊灰等病毒疫苗的基质细胞，但Vero细胞为猴肾细胞系，对人体来说属于异种细胞，在疫苗制备中残留的Vero细胞成分对人体来说属于异种蛋白或基因，WHO规定在用Vero细胞生产的疫苗产品中Vero细胞残余DNA含量不能超过100pg/剂，美国食品药品监督管理局(FDA)报道在制备流感疫苗时其基质细胞(MDCK细胞)残留的大于200bp的基因片段可能具有致癌作用，而以本发明的孵化细胞作为基质细胞制备灭活疫苗，所残留的孵化细胞成分不是人类异种抗原或异种基因组，甚至可以选用与疫苗使用人的ABO血型或组织分型相同的孵化细胞扩增新冠病毒，由此制备的灭活疫苗即使残留有少量的孵化细胞成分，因其同种同型所以抗原性较弱、疫苗使用较安全。
附图说明
图1是以G418筛选得到的永生化干细胞克隆图。
图2是永生化干细胞的传代培养图。
图3是嘌呤霉素筛选得到的新冠病毒孵化细胞克隆图。
图4是新冠病毒孵化细胞的传代培养图。
图5是新冠病毒孵化细胞与新冠病毒共培养5天的细胞生长状态。
在图1中，因被SV40LT重组载体成功转染的干细胞DNA整合了G418抗性基因，所以不会被G418杀死而存活，存活的单个细胞生长后形成细胞克隆。
在图2中，因被SV40LT重组载体成功转染的干细胞DNA整合了SV40LT基因，所以获得了永久生存、无限扩增的特性，永生化干细胞在反复传代中呈梭形贴壁生长，生长旺盛。
在图3中，因被ACE2重组载体成功转染的永生化干细胞DNA整合了嘌呤霉素抗性基因，所以不会被嘌呤霉素杀死而存活，存活的单个细胞即新冠病毒孵化细胞生长后形成细胞克隆。
在图4中，定量的新冠病毒孵化细胞培养5天时，细胞呈梭形贴壁生长，生长旺盛。
在图5中，与图4相同量的新冠病毒孵化细胞与定量的新冠病毒共培养5天时，细胞呈圆形、漂浮、死亡状态，说明孵化细胞内ACE2基因的表达有利于将病毒吸入胞内并在胞内繁殖，最后使孵化细胞死亡，并检测到大量的病毒含量。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方法作详细的描述，但这些为启发公共关注和投入防控研究的范例性描述并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
1.间充质干细胞(MSC)的采集
1.1.羊水间充质干细胞的采集
按产前诊断流程采集待检孕妇的羊水细胞，进行细胞培养和产前诊断，在倒置显微镜下从产前诊断后剩余的羊水细胞中筛选出贴壁生长的梭形间充质干细胞。
1.2.脐带间充质干细胞的采集
从液氮罐中取出冻存的脐带，置37℃水浴快速解冻，以无菌PBS清洗，去除残留的血迹，将脐带剪成大小约1mm3的组织块，置于铺有胎牛血清的培养皿中，在37℃放置6h后，加入10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃5％CO2培养箱中培养，观察贴壁组织周围的细胞生长情况，当细胞达到80％-90％融合度时，用胰酶消化传代，获得间充质干细胞。
1.3.肺间充质干细胞的采集
无菌取流产胎儿肺脏组织，机械离散，0.25％胰蛋白酶消化后，用孔径为100μm的纱布过滤，1000r/min离心5min，弃上清液，添加DMEM培养液(0.1umol β-巯基乙醇，100UI/mL青链霉素，10％胎牛血清)。在37℃、5％CO2条件下培养。45min后换液，以去除尚未贴壁的细胞，后每48h换液。待细胞汇合度达80％后，0.25％胰蛋白酶消化传代。
2.间充质干细胞的永生化(构建MSC-SV40LT)
2.1.SV40LT/pLXSN的构建
以SV40DNA(strain 766)为模板，上游引物为5’-GCCCAGGATCCTTAACAACAACAACAAT-3’，下游引物为5’-ACGCTGAATTCCCTCTGAGCTAT-3’，进行SV40LT高保真长片段的PCR扩增；SV40 LT的PCR产物与pLXSN反转录病毒载体均经EcoR I/BamH I酶切、连接、转化、筛选和测序验证，获得含SV40LT/pLXSN重组反转录病毒载体。
2.2.将SV40LT转染间充质干细胞
将待转染的间充质细胞配成约8×105个细胞浓度接种，置5％CO2和37℃培养，24h后用含SV40LT基因的重组逆转录病毒感染(Polybrene浓度为8ug/mL)，1周后用500ug/mL的G418筛选4周，获得永生化间充质干细胞(MSC-SV40LT)克隆(见图1)。或参照有关文献以hTERT转染的方法制备hTERT转染间充质干细胞。
2.3.MSC-SV40LT的鉴定
2.3.1.MSC-SV40LT的生物学特性鉴定
包括①细胞系为梭形、成纤维状。②Western检测可见分别在相对分子质量为120000和93000处出现白色条带。③细胞系的生长曲线呈典型的“S”生长特征。④细胞系的染色体核型为二倍体。⑤细胞系不能在软琼脂中生长。⑥裸鼠致瘤试验呈阴性。
2.3.2.MSC-SV40LT的表面分子检测
用流式细胞仪检测细胞膜表面分子，阳性分子包括CD73-APC、CD90-FITC、CD44-PE、CD105-Cy5.5；阴性分子包括CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE。通过鉴定，获得能在体外永久传代的永生化间充质干细胞。图2为传至第35代的永生干细胞。
2.3.3.永生肺干细胞(肺MSC-SV40LT)的鉴定
人肺干细胞系需符合：①相差显微镜观察：呈梭形生长，排列成漩涡或栏栅状。②流式细胞仪检测：细胞表面标志物CD45、CD1 1a、CD14、CD90、CD34、CD71、CD25、CD105、CD117、CD166和CD44为阳性。③共聚焦技术检测：角蛋白表达呈阴性，干性相关因子c-Myc、Oct4、Nanog和Nestin呈阳性。④间接免疫荧光检测：波形蛋白、III型胶原、纤维连接蛋白表达呈阳性，而表面活性蛋白C前体、血管性血友病因子及α平滑肌肌动蛋白表达呈阴性。
3.MSC-SV40LT的ACE2基因装配(构建MSC-SV40LT/ACE2)
3.1.慢病毒表达载体pHBLV-ACE2或pGC-FU-ACE2的构建和鉴定
PCR扩增质粒pc-DNA3.1-hygro(+)-mACE2中的ACE2(或从肺组织细胞中提取RNA，逆转录为cDNA，再PCR扩增ACE2)。根据GenBank的人ACE2mRNA序列，设计PCR引物序列，人ACE2扩增的外端引物：F1(F out)5’-GAT GGA GTA CCG ACT GGA GTC-3’，R1(Rout)5’-CTAATA TCG ATG GAG GCA TAA-3’，产物547bp；内端引物：F2(F in)5’-GAG GAG GAT GTG CGAGTG GCT A-3’，R2(R in)5’-CCA ACC ACT ATC ACT CCC ATC A-3’，产物269bp。人β-actin的扩增引物序列：F 5’-GCT CGT CGT CGA CAA CGG CTC-3’，R 5’-CAA ACA TGA TCTGGGTCATCTTCT-3’，产物353bp。PCR条件：94℃ 5min，然后94℃变性30s、55℃退火30s、68℃延伸5min，循环30次，最后于68℃延伸10min。
用BamH I和EcoRI分别酶切载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro和上述PCR产物，或用AgeI和EcoRI分别酶切pGC-F和上述PCR产物，用琼脂糖电泳纯化，将线性化的载体DNA、酶切回收的PCR产物、T4噬菌体DNA连接酶及其缓冲液、ddH2O置16℃连接过夜，将连接液转化感受态细胞，阳性克隆用PCR和测序鉴定。用LB培养液扩增转化菌，用质粒提取试剂盒提取pHBLV-ACE2-OE或pGC-FU-ACE2，采用Lipofectamine 2000转染293FT细胞，转染72h后用Western-Blot检测ACE2基因的表达。
3.2.携带ACE2慢病毒的包装及其滴度测定
将慢病毒表达载体(pHBLV-ACE2)、包装质粒(psPAX2载体和pMD2G)或将pGC-FU-ACE2、包装质粒(pHelper 1.0和pHelper 2.0)分别共转染293T细胞，获得携带ACE2基因的重组慢病毒(Lentiviral-ACE)。同时将pHBLV空载(含GFP基因)、包装质粒(psPAX2载体和pMD2G)共转染另一组293T细胞，所获得的仅携带GFP基因的空载体(NC-GFP)作为对照。
转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒的细胞上清液，4℃，4000g离心10min，再以0.45μm滤器过滤上清液，除去细胞碎片，离心，得到高滴度的慢病毒。以待鉴定的慢病毒原液感染293T细胞，4d后抽提RNA，Real-Time PCR测定慢病毒滴度。
3.3.Lentiviral-ACE转染MSC-SV40LT
以每孔1×106个细胞密度将MSC-SV40LT接种于6孔板，分为目的基因过表达(OE-ACE2)组、空载体(NC-GFP)对照组、空白组，每组2孔，待细胞汇合至30％时，慢病毒组加入5倍稀释的慢病毒原液(Lentiviral-ACE)，空载体组加入5倍稀释的空载体原液，培养24h后更换10％FBS的DMEM液，并加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素(2.50μg·mL-1)，维持嘌呤霉素浓度，隔天换液，直至空白对照组细胞完全死亡，筛选结束。未被嘌呤霉素杀死的MSC-SV40LT即为已被重组慢病毒转染并已在DNA上整合了ACE2基因的干细胞系MSC-SV40LT/ACE2，即为预制的新冠病毒孵化细胞。
3.4.MSC-SV40LT/ACE2的ACE2基因检测
3.4.1.RT-PCR检测ACE2基因的mRNA转录
以1×106个细胞密度将MSC-AT2R/ACE2接种于6孔板，培养4d后用荧光显微镜观察荧光，用RT-PCR检测ACE2的转录，上游引物为CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’；下游引物为EF1-Rn：5’-GCCAGTACACGACATCACTT-3’；β-actin上游和下游分别为：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’、5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。以ACE2/B-actin积分光密度值(IOD)比较和统计分析，计算试验组和对照组的mRNA表达量，筛选ACE2高效表达的MSC-SV40LT/ACE2。
3.4.2.Western-Blot检测ACE2的蛋白表达
抽提各组细胞裂解液的蛋白，BAC法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％SDS-PAGE分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗VDR抗体为一抗，用ECL化学发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。观察试验组和对照组的ACE2蛋白表达，筛选ACE2高效表达的MSC-SV40LT/ACE2。
4.MSC-SV40LT/ACE2的功能检测
4.1.样本采集
取COVID-19确诊患者的咽拭，按100∶1的比例加入双抗(10000IU的青霉素和10000μg的链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100IU和100μg，置4℃过夜，备用。
4.2.病毒培养和分离
将Vero-E6接种至含(10％胎牛血清)DMEM培养液的12.5cm2培养瓶中，置36℃、5％CO2培养箱中培养成30％汇合度的单层细胞，吸去培养液，用DMEM清洗细胞2遍，然后在培养瓶中加入0.5mL经过双抗处理的COVID-19患者样本，置36℃、5％CO2培养箱中吸附90min后，吸去样本，加入3.5mL DMEM培养液(10％胎牛血清)，每天观察细胞病变效应(CPE)，经培养5～7d后，取病变细胞上清液蔗糖梯度超速离心，分离新冠病毒，用培养液配成103～105TCID50/ml病毒液。
4.3.MSC-SV40LT/ACE2与病毒共培养
设立Vero组、MSC-SV40LT组、MSC-SV40LT/ACE2组，每组接种12孔板，使每孔含有2×105个细胞、2mL DMEM培养液(10％胎牛血清)，置36℃、5％CO2培养箱中培养至30％汇合度时，每孔加病毒液0.5mL，继续培养。然后分别于培养1小时、6小时、24小时和72小时后每组各取3孔的上清液，混合后以1∶4、1∶12、1∶36、1∶108、1∶324、1∶972、1∶2916、1∶8748倍稀释，进行RT-PCR检测。
4.4.实时荧光RT-PCR检测病毒RNA
核酸提取试剂盒(批号：2019004)、2019新型冠状病毒(ORF1ab/N)核酸检测试剂盒(批号：20200123)和DA3200核酸提取仪，购自中山大学达安基因股份有限公司，ABI 7500型PCR仪器购自美国Thermo Fisher Scientific。按试剂盒说明书操作，扩增反应条件为：50℃15min；95℃ 15min；94℃ 15s；55℃ 45s；共45个循环，在55℃采集荧光信号。
根据试剂盒说明，结果判断标准如下：①如果检测样本在ORF1ab和N基因通道无扩增曲线或Ct值＞38，判为SARS-CoV-2阴性；②如果检测样品在ORF1ab和N基因通道Ct值≤38，且有明显的扩增曲线，判为SARS-CoV-2阳性；③如果检测样品在ORF1ab或者N基因通道Ct值≤38，另一通道无扩增曲线，复检结果与原来结果一致，判为SARS-CoV-2阳性。
4.5.病毒RNA检测结果
在表1中，当细胞系和病毒混合培养1小时后，各组培养液病毒RNA检测阳性的稀释度均为1∶4，被认为是外源加入到培养液中的病毒在基本未复制时的检测结果。在表2～3中，当细胞系和病毒混合培养6小时后，MSC-SV40LT/ACE2组和Vero细胞组的培养液及细胞内RNA检测阳性的效价均为1∶36，与MSC-SV40LT组相比提高了3倍。在表4中，当细胞系和病毒混合培养24小时后，MSC-SV40LT/ACE2组和Vero细胞组的培养液RNA检测阳性的效价均为1∶972，与MSC-SV40LT组相比提高了27倍。在表5～6中，当细胞系和病毒混合培养72小时后，MSC-SV40LT/ACE2组的培养液及细胞内RNA检测阳性的效价均为1∶26244以上。
说明MSC-SV40LT/ACE2即新冠病毒孵化细胞与WHO于1982年推荐的Vero细胞均能使新冠病毒在细胞内大量复制，可作为病毒繁殖的宿主细胞，应用于制备灭活疫苗。
表1细胞系与分离的新冠病毒共培养1小时培养液中病毒RNA检测结果
Figure BSA0000232852400000071
Figure BSA0000232852400000081
表2细胞系与分离的新冠病毒共培养6小时的培养液病毒RNA检测结果
Figure BSA0000232852400000082
表3细胞系与分离的新冠病毒共培养6小时的细胞内病毒RNA检测结果
Figure BSA0000232852400000083
表4细胞系与分离的新冠病毒共培养24小时培养液的病毒RNA检测结果
Figure BSA0000232852400000084
表5细胞系与分离的新冠病毒共培养72小时培养液的病毒RNA检测结果
Figure BSA0000232852400000085
表6细胞系与分离的新冠病毒共培养72小时的细胞内病毒RNA检测结果
Figure BSA0000232852400000086
4.6.新冠病毒孵化细胞的贮存
按供者姓名和/或组织分型，将新冠病毒孵化细胞分装于安瓶内，每个安瓶10×106个细胞，收藏于-196℃液氮细胞库中。
5.基于新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法
5.1.器材
生物反应器：可用荷兰Applicon公司生产，包括7升、75升和550升，由电脑自动控制，可进行在位灭菌，自动控制溶氧、pH值、温度和搅拌速度等发酵参数；澄清过滤设备：可使用PALL公司生产的过滤器进行多级过滤，不锈钢滤筒中放入过滤柱，清洗后高压灭菌备用；超滤浓缩设备：可使用Millipore公司的Pelicon 2系统，聚醚砜超滤膜，100万分子截留量；层析纯化设备：使用GE公司AKTA Primer层析纯化系统，BPG100/950和BPG200/450层析柱；DMEM培养基、M199培养基和胎牛血清均选用Gibco公司；微载体选用美国GE Healthcare公司；
5.2.新冠病毒毒株采集
采用分离收藏的权威机构指定的流行毒株制备灭活疫苗，或取COVID-19确诊患者的咽拭，按100∶1的比例加入双抗(10000IU的青霉素和10000μg的链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100IU和100μg，置4℃过夜，备用。
5.3.孵化细胞培养
取细胞库中的1支或数支安瓶孵化细胞，接种培养瓶培养，传代扩增，待细胞培养至单层，经胰酶消化后，接种到生物反应器中进行细胞培养。经过生物反应器灌流培养方式培养，再经75L生物反应器再循环培养，最终用550L生物反应器批培养。每级生物反应器的培养条件均为：3-5g/L的Cytodexl微载体，DMEM细胞培养液，培养温度37℃±0.5℃，溶解氧50％士20％，pH值7.2士0.2，搅拌速度50±20rpm，培养4～7天。细胞在微载体颗粒上长成单层后用胰蛋白酶消化，分散成均匀的细胞悬液，接种于下一级发酵罐放大培养；在550升扩增至适宜数量的生产用细胞(不低于0.8×106细胞/ml)，用于病毒接种。
5.4.病毒培养
550升微载体培养细胞达到一定浓度后，弃细胞培养液，换上病毒维持液，接种单一型别病毒工作种子，接种量为0.01～0.3MOI。培养条件为：温度33℃士0.5℃，溶解氧25％±10％，pH值7.4+0.2，搅拌速度50±20rpm。病毒培养时间48～96小时，至完全病变收获病毒悬液。
5.5.病毒液收获和过滤
完全病变的病毒液经75μm、75μm加硅藻土助滤剂、0.45μm和0.22μm不同孔径组合的滤器澄清过滤，除去微载体和细胞碎片。
5.6.病毒液浓缩
澄清后病毒收获液用超滤浓缩设备经截留分子量为100KD的超滤膜超滤浓缩200-400倍。
5.7.病毒液纯化
病毒浓缩液先经Sepharose CL-6B凝胶过滤层析纯化，洗脱缓冲液为PBS(pH7.0-4-0.2)，每次上样量应不超过柱体积的10％，流速为0.35±0.2cm/min，检测波长为280nm，收集第一峰。经凝胶过滤收集的病毒液，再用DEAE Sepharose F.F.离子交换层析纯化。缓冲液为PBS(pH7.0±0.2)，洗脱液为1mol/L NaCl，流速为0.5±0.15cm/min，第一峰为纯化病毒峰。
5.8.病毒液过滤和灭活
病毒纯化液经0.22μm孔径的滤器除菌过滤，滤过后的病毒液在2～8℃保存不超过72小时进行灭活。过滤后的纯化液用M199稀释后以甲醛灭活，各型病毒纯化液应在蛋白含量低于150μg/ml的条件下灭活。加入甲醛至终浓度为92.5μg/ml，于37℃±0.5℃灭活至第6天，用0.22μg孔径的滤器再过滤灭活液，37℃士0.5℃继续灭活至第12天终止。
5.9.病毒灭活验证试验
采用细胞培养法进行病毒灭活验证：分别于灭活第9天和终止时取两份样品，每次取样量为1500剂量，每份样品分别进行病毒灭活验证检测，样品接种到Vero单层细胞上，于35.5℃士0.5℃培养至21天(原始培养)，并于14天和21天取原始培养上清液分别进行传代培养各14天，原始培养和传代培养应均无CPE发生，表示病毒灭活彻底，无活病毒存在。
5.10.病毒液纯度检测
用HPLC水溶性凝胶柱或其它适宜的色谱柱进行检测：取新冠病毒灭活疫苗纯化液样品100μl进行检测，流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液(pH 7.0士0.20)，流速为0.3ml/min，检测波长为280nm，运行时间40分钟；用面积归一法进行分析，疫苗原液纯度应不低于95％。
5.11.疫苗的中和抗体检测
5.11.1.疫苗的稀释和接种
将疫苗稀释成原液、1∶3、1∶9、1∶27四个组，每组和阴性对照组用10只大白鼠，雌雄各半，大白鼠于免疫前采血，每只1ml，分离血清作为免疫前血清对照。每只大白鼠双后肢大腿部肌肉注射样品0.5ml，阴性对照组每只接种M199稀释液0.5ml。于第一次免疫后21天采血，测定中和抗体。
5.11.2.中和抗体的测定
血清于56℃灭活30分钟，用Vero细胞在微量培养板上检测中和抗体。血清按1∶2连续稀释至适宜稀释度，检测起始稀释度为1∶4。病毒用量分别为100TCID50/孔。中和条件为37℃ 3小时，此后再经2～8℃放置18小时，于35～36℃培育7天后，判读结果，抗体滴度≥1∶4为阳性。
5.11.3.结果观察与计算
病毒接种后的第二天在显微镜下观察细胞生长情况，第四天观察细胞病变情况，第七天最终判定结果。血清对照应无明显毒性，正常细胞对照成立。用Reed Muench或Karber法计算中和终点(将血清稀释度转化为对数)，即能够保护50％细胞不受100CCID50攻击病毒感染的血清最高稀释度就是该血清的抗体滴度，血清滴度的结果以倒数表示。中和抗体效价＜1∶4为阴性，≥1∶4为阳性。
5.12.蛋白含量检测
此法的原理是利用碱性环境中蛋白质能把2价铜(Cu+2)还原为1价铜(Cu+1)(双缩脲反应)，然后再利用试剂中所含有的羟乙基甘氨酸与l价铜离子螯合，而产生紫色的可溶性产物，该产物在562nm波长处的光吸收峰与蛋白质含量(20-2000ug/ml)呈线性关系的原理进行检测，具体参照有关试剂盒，残留蛋白含量应低于国家规定的标准。
5.13.孵化细胞DNA残留量检测
在反应体系中用无放射性的地高辛体系标记单链DNA探针，与待测样品中具有共同序列的DNA单链在低于Tm 20-30℃时，根据碱基互补配对原则可合成双链结构。然后通过显色检测特定的核苷酸片断，按显色深浅及面积大小判读样品中DNA的含量，具体参照有关试剂盒，DNA残留量应低于规定标准。
5.14.类毒素絮状实验
依据类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度、反应时间等条件下，可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼可见的絮状凝集反应，按试剂盒和文献报道进行检测。
5.15.灭活疫苗的应用
经上述测试合格并经进一步临床试验后，可获得基于人类同种孵化细胞制备的灭活疫苗。

Claims (4)

1.一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法，其特征在于，根据新冠病毒通过ACE2受体感染宿主细胞并易在表达ACE2的宿主细胞中繁殖以及SV40LTAg可使人类成纤维细胞永生化的机制，通过基因转染将ACE2和SV40LTAg整合到源自产前诊断后剩余胎儿细胞的干细胞DNA上，开发出因过表达ACE2和SV40LTAg而易使新冠病毒进入细胞内繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，使新冠病毒与所述孵化细胞在含有3～5g/L微载体的DMEM培养液的生物反应器内并在37℃、5％CO2、pH值7.2、搅拌速度为50±20rpm的条件下共同培养时能随孵化细胞的无限扩增而大量繁殖，然后收集含有大量繁殖病毒的培养物，进行75μm、0.45μm和0.22μm滤器过滤、100KD超滤膜超滤浓缩、Sepharose CL-6B凝胶过滤层析纯化、0.22μm滤器除菌过滤、92.5μg/ml甲醛灭活、灭活效果验证、病毒液纯度检测、中和抗体检测、病毒液蛋白和DNA残留量检测以及动物试验合格后产业化制备成新冠病毒灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法，其特征在于，所述SV40LTAg使人类成纤维细胞永生化包括以hRERT制备永生化新冠病毒孵化细胞。
3.根据权利要求1所述的一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法，其特征在于，所述干细胞包括源自临床或实验的脐血、脐带、胎盘、肺组织细胞及间充质细胞。
4.根据权利要求1所述的一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集产前诊断后剩余羊水细胞，分离梭形羊水细胞或肺组织细胞，转染SV40LT和/或hTERT基因，以G418和/或嘌呤霉素筛选永生化细胞系，经细胞系生物学鉴定、肺干细胞标志物检测获得永生化羊水间充质干细胞系或肺干细胞系，表达为MSC-SV40LT/hTERT。
(2)将ACE2基因连接到慢病毒表达载体即pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU中，构建重组质粒pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，然后将pHBLV-OE-ACE2和包装质粒psPAX2、pMD2G或将pGC-FU-ACE2和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0分别共转染293FT细胞，包装携带ACE2的重组慢病毒Lentiviral-ACE，再将重组慢病毒转染MSC-SV40LT/hTERT，使ACE2整合到永生化干细胞DNA上，经过筛选和鉴定，获得易使新冠病毒感染和繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，作为制备新冠病毒灭活疫苗的基质细胞，表达为NCIC细胞。
(3)将永生化新冠病毒孵化细胞(NCIC细胞)分装于安瓶内，标明组织来源和分型，每个安瓶10×106个细胞，收藏于-196℃液氮的新冠病毒孵化细胞库中。
(4)取细胞库中的孵化细胞，经传代培养至所需细胞量时转种到含有3～5g/L微载体的DMEM细胞培养液的生物反应器中，在37℃、5％CO2、pH值7.2、搅拌速度50±20rpm的条件下培养，使细胞在悬浮于培养基中的微载体表面粘附生长成60％汇合度，然后换上病毒维持液，接种0.01～0.3MOI量的新冠病毒液，在33℃、5％CO2、pH值7.4、搅拌速度为50±20rpm的条件下培养48～96小时，至孵化细胞完全病变时收获病毒液。
(5)病毒液经75μm、0.45μm和0.22μm滤器过滤、100KD超滤膜超滤浓缩、Sepharose CL-6B凝胶过滤层析纯化、0.22μm滤器除菌过滤、92.5μg/ml甲醛灭活、灭活效果验证、病毒液纯度检测、中和抗体检测以及病毒液蛋白和DNA残留量检测合格并经进一步临床试验后，制成所需的新冠病毒灭活疫苗。
CN202110151509.6A 2021-01-27 2021-01-27 一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法 Withdrawn CN112870343A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110151509.6A CN112870343A (zh) 2021-01-27 2021-01-27 一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110151509.6A CN112870343A (zh) 2021-01-27 2021-01-27 一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112870343A true CN112870343A (zh) 2021-06-01

Family

ID=76057099

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110151509.6A Withdrawn CN112870343A (zh) 2021-01-27 2021-01-27 一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112870343A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4243349B2 (ja) インフルエンザウイルスの複製のための動物細胞および方法
KR20120024464A (ko) 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법
CN101695570A (zh) 一种手足口病单、双价灭活疫苗及其制备方法
US20190345441A1 (en) Preparation and application of immortalized alpha-1,3-galactosyltransferase gene knockout pig hepatocyte cell line
CN109790521A (zh) 在基本上无血清的培养基中大规模产生细小病毒h-1的优化的方法
CN112641938A (zh) 一种dna重组干细胞载体新冠疫苗
AU2020102162A4 (en) Pig tonsil cell line susceptible to jev and construction method thereof
CN110129272B (zh) 稳定表达map3k8蛋白的pk-15细胞株及其构建和应用
CN112852751A (zh) 一种新冠肺炎核酸检测质控病毒的制备及质控方法
US20120190068A1 (en) Drain down and re-feed of microcarrier bioreactor
CN112870343A (zh) 一种基于人造新冠病毒孵化细胞的灭活疫苗制备方法
CN113122501A (zh) 适合大规模临床级病毒载体制备的培养基及其应用
CN111019904A (zh) 适应羊口疮病毒增殖的永生化羊睾丸细胞系的构建方法
Arnstein et al. Recovery of murine xenotropic type-C virus from C57L mice
KR20120027381A (ko) 일본뇌염 백신 및 그것의 제조 방법
US20100143889A1 (en) Rhabdoviridae virus preparations
CN112779294A (zh) 一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法
CN113943693A (zh) 一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法
CN112553164A (zh) 一种治疗covid-19的基因改造干细胞
CN112898418A (zh) 一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法
CN112646780A (zh) 一种hACE2敲除的新冠病毒基因沉默干细胞
WO2022071966A1 (en) Bioreactor production of virus from adherent cells
CN112553163A (zh) 一种hACE2敲入的新冠病毒RNA干扰干细胞
CN112048477A (zh) Ebv病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法
CN101787359B (zh) 靶向诱导成骨分化细胞凋亡的重组慢病毒及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20210601

WW01 Invention patent application withdrawn after publication