CN112898418A - 一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法，其特征在于，因有报道某些病毒进入宿主后产生的非中和抗体或亚中和抗体反而增强易感性或加重病情，接种新冠病毒抗原是否有这种被称为抗体依赖性感染增强(ADE)的副作用尚未定论。本发明将新冠病毒易感基因ACE2和永生化基因SV40LT转染干细胞以制备永生化新冠病毒孵化细胞，使新冠病毒与孵化细胞共同培养时随孵化细胞的无限生长而大量繁殖，用以产业化制备新冠病毒、灭活病毒，进而免疫动物制备杂交瘤细胞及(单克隆)抗体，可在体外筛选后去除有ADE风险的非中和或亚中和抗体，选择无ADE的抗体作为被动免疫抗体疫苗用于紧急预防或治疗，以防抗原疫苗接种后少数体质在体内产生有ADE风险的非中和或亚中和抗体。

Description

一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法，属于生物医学领域的传染病防治技术。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的多克隆或单克隆抗体在新冠病毒病(COVID-19)的诊断、防治及研究中具有重要的作用。
文献报道康复者恢复期血浆(抗体)疗法可用于严重COVID-19病例的紧急治疗，其中的抗体是血浆疗法的有效成分，已利用单细胞测序技术从COVID-19康复者血浆中成功分离出多种有效的中和抗体，这些抗体的抗病毒疗效也在病毒感染小鼠模型中得到验证，并达到预防效果。从COVID-19康复者血浆中分离得到的单克隆抗体能够干扰SARS-CoV-2与ACE2受体之间的相互作用，体外实验显示具有较强的SARS-CoV-2特异性中和活性，其治疗和预防效果也在恒河猴模型中得到了验证。但血浆疗法受到供体和受体条件的多种限制，血浆中的大分子蛋白或细胞因子可能导致严重的过敏反应，同时血液制品质量要求高，工序繁琐，所以即使血浆疗法真实具有较好的疗效，也仍然需要更严格、更大规模的临床验证。
因为临床治疗的需要，恢复期血浆治疗已经纳入《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》，在第七版中得到进一步细化、完善。当今恢复期血浆疗法主要用于病情进展较快、重型或危重型感染者的抢救，是挽救生命的有效治疗手段。为了更好地利用好恢复期血浆救治COVID-19患者，恢复期血浆从采集、制备、贮存到临床应用都有严格的质量监控，以确保血浆捐献者和救治者的安全。利用血浆里的中和抗体中和病毒，在特异性治疗方法和有效疫苗研制成功之前不失为治疗COVID-19的好方法，同时为利用血浆抗体研制SARS-CoV-2疫苗和单克隆抗体疫苗提供了新的方向。
鉴于新冠肺炎恢复期血浆疗法的可行性及其疗效的本质是血浆中的新冠病毒抗体，而血浆中的大分子蛋白或细胞因子可能导致受者严重的过敏反应，所以如果制备新冠病毒单克隆抗体进行被动免疫，应能避免这种血浆大分子蛋白或细胞因子引起的过敏反应以及减少血制品工序繁琐、供体和受体条件等限制
在医学上有一种现象被称为抗体依赖性感染增强(antibody dependentenhancement，ADE)，ADE主要指病毒感染后产生的特异性抗体对病毒感染不但没有起到抑制作用反而起促进作用。文献报道ADE普遍存在于呼吸道合胞病毒、登革病毒、SARS COV、MERS COV等多科、属病毒感染中。ADE是SARS COV和MERS COV入侵免疫细胞的重要方式，发现高浓度SARS COV抗血清可中和SARS COV感染，高度稀释后的抗血清则触发ADE。ADE还可以诱发病毒通过胎盘引起母婴垂直传播。恢复期抗体滴度降低后的亚中和抗体可能助长ADE的发生。因为SARS-COV-2与SARS COV和MERS COV一样，均属于β冠状病毒，SARS-COV-2与SARS COV基因序列相似度高达79.5％，与MERS COV相似度约为40％，所以有文献报道，推测SARS-COV-2也可能存在ADE，如SARS-COV-2感染者二次感染、垂直传播都有过报道，其轻型及无症状感染者是否会产生大量的非中和抗体或亚中和抗体，从而易引发二次感染并易产生ADE而发生严重的感染，均值得COVID-19防治及疫苗研究的关注。
因此，当接种主动免疫的抗原性疫苗时，某些体质可能因产生低滴度抗体、非中和抗体或亚中和抗体而助长ADE的发生，而在人体外制备单克隆抗体，经筛选去除可能引发ADE的非中和抗体或亚中和抗体后进行被动免疫接种时，应该能避免ADE的发生。
文献报道，人间充质干细胞在体外传代至15-30代就会出现衰老或死亡，其他组织细胞的传代时间更短，而经猿猴病毒40大T抗原基因(SV40LT)和/或人端粒酶逆转录酶(hTERT)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。文献也报道，SARS-CoV能在血管紧张素转换酶2(ACE2)基因转染的293T细胞中复制，但不能在模拟转染(不含ACE2)的293T细胞中复制，SARS-CoV-2与SARS-CoV一样，也通过ACE2受体感染细胞。
综上，应以SV40LT和ACE2基因转染制备能产业化培养新冠病毒的孵化细胞，将培养的病毒制备灭活病毒，然后制备疫苗，可进而免疫动物制备杂交瘤、单克隆抗体，以用于紧急预防或治疗，减少ADE的发生，减轻血浆疗法中大分子蛋白和细胞因子等的副作用。
发明内容
鉴于上述情况，本发明人提出了本发明。
本发明的目的是要公开一种基于人造永生化新冠病毒孵化细胞的灭活病毒、灭活疫苗及单克隆抗体疫苗的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
(1)基于SV40LT和/或hTERT基因转染制备人造新冠病毒孵化细胞
①采集产前诊断后剩余羊水细胞，分离梭形细胞或肺组织细胞，转染SV40LT和/或hTERT基因，以G418和/或嘌呤霉素筛选永生化细胞系，经细胞系生物学鉴定、肺干细胞标志物检测获得永生化羊水间充质干细胞系或肺干细胞系。
②将ACE2连接到慢病毒表达载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU中，分别构建重组质粒pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，将重组质粒pHBLV-OE-ACE2和包装质粒(psPAX2和pMD2G)或将重组质粒pGC-FU-ACE2和包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)分别共转染293FT细胞，包装携带ACE2的重组慢病毒，再将重组慢病毒转染永生化干细胞系，使ACE2整合到永生化干细胞DNA上，经过筛选和鉴定，获得易使新冠病毒感染和繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，作为制备新冠病毒灭活疫苗及抗体疫苗的基质细胞，命名为NCIC细胞。
③将孵化细胞分装于安瓶内，每个安瓶10×106个细胞，收藏于-196℃液氮细胞库备用，使用时取出孵化细胞，经传代培养至所需细胞量时使用。
(2)基于孵化细胞培养新冠病毒制备灭活病毒或灭活疫苗
①从细胞库中取出孵化细胞，培养至所需细胞量，冻存所需的种子细胞后，其余细胞转种到内含3-5g/L微载体的DMEM的生物反应器中，在37℃、5％CO2、pH值7.2、搅拌速度50±20rpm的条件下培养，使细胞在微载体表面形成60％汇合度，然后换上病毒维持液，接种0.01～0.3MOI量的新冠病毒液，在33℃、5％CO2、pH值7.4、搅拌速度50±20rpm的条件下培养48～96小时，至细胞完全病变时收获病毒液。
②病毒液经75μm、0.45μm和0.22μm滤器过滤、100KD超滤膜超滤浓缩、SepharoseCL-6B凝胶过滤层析纯化、0.22μm滤器除菌过滤、92.5μg/ml甲醛灭活、灭活效果验证、病毒液纯度检测，动物试验，制成灭活病毒或灭活疫苗，用于人体或动物接种。
(3)基于灭活病毒或灭活疫苗制备单克隆抗体疫苗
①将灭活病毒或灭活病毒疫苗免疫小鼠或其他动物，提取小鼠免疫脾细胞，进行细胞融合，制备杂交瘤细胞。包括直接从动物中提取多克隆抗体，制备抗体疫苗。
②筛选能分泌高特异性和高中和活性的McAb的杂交瘤细胞，去除分泌低浓度抗体、非中和抗体及亚中和抗体的杂交瘤细胞。
③通过McAb特异性、中和活性、亲和力、滴度、识别抗原表位、Ig类及亚类的体外鉴定，去除具有抗体依赖性感染增强(ADE)危害的低浓度抗体、非中和抗体及亚中和抗体，筛选高效价、高特异性、高中和活性的无ADE的新冠病毒单克隆抗体。
④将所筛选的McAb稀释成梯度，并配制试验病毒液、选择试验小鼠，将抗体试验组接种McAb和病毒液、抗体对照组接种McAb和病毒稀释液、阳性对照组接种抗体稀释液和病毒液，阴性对照组接种抗体稀释液和病毒稀释液，根据小鼠病变判断McAb疫苗的效果及安全性。
本发明的有益效果在于：
本发明根据新冠病毒通过ACE2受体感染宿主细胞并易在表达ACE2的宿主细胞中繁殖以及SV40LT可使人类成纤维细胞永生化的机制，通过基因转染将ACE2和SV40LT整合到干细胞DNA上，获得因表达ACE2和SV40LT而易使新冠病毒进入细胞内繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，使新冠病毒与孵化细胞共同培养时能随孵化细胞的无限扩增而大量繁殖，用于制备新冠病毒，进而制备灭活病毒、灭活疫苗或单克隆抗体疫苗。
与现有的基质细胞相比，以本发明的孵化细胞作为基质细胞制备的灭活疫苗，所残留的孵化细胞成分不是人类异种抗原或异种基因组，所以抗原性较弱、疫苗使用较安全。
与新冠病毒感染者恢复期血浆抗体疗法相比，以本发明的孵化细胞孵化的灭活病毒免疫动物后制备的单克隆抗体进行被动免疫，可以避免血制品制备条件的限制、供者和受者条件的限制，以及可以避免血浆大分子蛋白或细胞因子导致的严重过敏反应后果。
主动免疫可能使有些体质产生低滴度抗体、非特异性抗体、非中和抗体或亚中和抗体，文献报道这些抗体不但不能抑制病毒感染反而起促进感染作用(ADE)，这种ADE是否也存在于COVID-19还无定论，而本发明可通过所制McAb的特异性、中和活性、亲和力、滴度等鉴定去除具有ADE风险的低浓度抗体、非中和抗体及亚中和抗体，从而筛选出高效价、高特异性、高中和活性的无ADE的单克隆抗体，进而通过动物试验等制备单克隆抗体疫苗，所以可减少ADE的发生，使用较安全，可用于紧急预防或治疗。
附图说明
图1是以G418筛选得到的永生化干细胞克隆图。
图2是永生化干细胞的传代培养图。
图3是嘌呤霉素筛选得到的新冠病毒孵化细胞克隆图。
图4是新冠病毒孵化细胞的传代培养图。
图5是新冠病毒孵化细胞与新冠病毒共培养5天的细胞生长状态。
在图1中，因被SV40LT重组载体成功转染的干细胞DNA整合了G418抗性基因，所以不会被G418杀死而存活，存活的单个细胞生长后形成细胞克隆。
在图2中，因被SV40LT重组载体成功转染的干细胞DNA整合了SV40LT基因，所以获得了永久生存、无限扩增的特性，永生化干细胞在反复传代中呈梭形贴壁生长，生长旺盛。
在图3中，因被ACE2重组载体成功转染的永生化干细胞DNA整合了嘌呤霉素抗性基因，所以不会被嘌呤霉素杀死而存活，存活的单个细胞即新冠病毒孵化细胞生长后形成细胞克隆。
在图4中，定量的新冠病毒孵化细胞培养5天时，细胞呈梭形贴壁生长，生长旺盛。
在图5中，与图4相同量的新冠病毒孵化细胞与定量的新冠病毒共培养5天时，细胞呈圆形、漂浮、死亡状态，说明孵化细胞内ACE2基因的表达有利于将病毒吸入胞内并在胞内繁殖，最后使孵化细胞死亡，并检测到大量的病毒含量。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方法作详细的描述，但这些为启发公共关注和投入防控研究的范例性描述并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
1.间充质干细胞(MSC)的采集
1.1.羊水间充质干细胞的采集
按产前诊断流程采集待检孕妇的羊水细胞，进行细胞培养和产前诊断，在倒置显微镜下从产前诊断后剩余的羊水细胞中筛选出贴壁生长的梭形间充质干细胞。
1.2.脐带间充质干细胞的采集
从液氮罐中取出冻存的脐带，置37℃水浴快速解冻，以无菌PBS清洗，去除残留的血迹，将脐带剪成大小约1mm3的组织块，置于铺有胎牛血清的培养皿中，在37℃放置6h后，加入10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃5％CO2培养箱中培养，观察贴壁组织周围的细胞生长情况，当细胞达到80％-90％融合度时，用胰酶消化传代，获得间充质干细胞。
1.3.肺间充质干细胞的采集
无菌取流产胎儿肺脏组织，机械离散，0.25％胰蛋白酶消化后，用孔径为100μm的纱布过滤，1000r/min离心5min，弃上清液，添加DMEM培养液(0.1umol β-巯基乙醇，100UI/mL青链霉素，10％胎牛血清)。在37℃、5％CO2条件下培养。45min后换液，以去除尚未贴壁的细胞，后每48h换液。待细胞汇合度达80％后，0.25％胰蛋白酶消化传代。
2.间充质干细胞的永生化(构建MSC-SV40LT)
2.1.SV40LT/pLXSN的构建
以SV40DNA(strain 766)为模板，上游引物为5’-GCCCAGGATCCTTAACAACAACAACAAT-3’，下游引物为5’-ACGCTGAATTCCCTCTGAGCTAT-3’，进行SV40LT高保真长片段的PCR扩增；SV40 LT的PCR产物与pLXSN反转录病毒载体均经EcoR I/BamH I酶切、连接、转化、筛选和测序验证，获得含SV40LT/pLXSN重组反转录病毒载体。
2.2.将SV40LT转染间充质干细胞
将待转染的间充质细胞配成约8×105个细胞浓度接种，置5％CO2和37℃培养，24h后用含SV40LT基因的重组逆转录病毒感染(Polybrene浓度为8ug/mL)，1周后用500ug/mL的G418筛选4周，获得永生化间充质干细胞(MSC-SV40LT)克隆(见图1)。或参照有关文献以hTERT转染的方法制备hTERT转染间充质干细胞。
2.3.MSC-SV40LT的鉴定
2.3.1.MSC-SV40LT的生物学特性鉴定
包括①细胞系为梭形、成纤维状。②Western检测可见分别在相对分子质量为120000和93000处出现白色条带。③细胞系的生长曲线呈典型的“S”生长特征。④细胞系的染色体核型为二倍体。⑤细胞系不能在软琼脂中生长。⑥裸鼠致瘤试验呈阴性。
2.3.2.MSC-SV40LT的表面分子检测
用流式细胞仪检测细胞膜表面分子，阳性分子包括CD73-APC、CD90-FITC、CD44-PE、CD105-Cy5.5；阴性分子包括CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE。通过鉴定，获得能在体外永久传代的永生化间充质干细胞。图2为传至第35代的永生干细胞。
2.3.3.永生肺干细胞(肺MSC-SV40LT)的鉴定
人肺干细胞系需符合：①相差显微镜观察：呈梭形生长，排列成漩涡或栏栅状。②流式细胞仪检测：细胞表面标志物CD45、CD11a、CD14、CD90、CD34、CD71、CD25、CD105、CD117、CD166和CD44为阳性。③共聚焦技术检测：角蛋白表达呈阴性，干性相关因子c-Myc、Oct4、Nanog和Nestin呈阳性。④间接免疫荧光检测：波形蛋白、III型胶原、纤维连接蛋白表达呈阳性，而表面活性蛋白C前体、血管性血友病因子及α平滑肌肌动蛋白表达呈阴性。
3.MSC-SV40LT的ACE2基因装配(构建MSC-SV40LT/ACE2)
3.1.慢病毒表达载体pHBLV-ACE2或pGC-FU-ACE2的构建和鉴定
PCR扩增质粒pc-DNA3.1-hygro(+)-mACE2中的ACE2(或从肺组织细胞中提取RNA，逆转录为cDNA，再PCR扩增ACE2)。根据GenBank的人ACE2 mRNA序列，设计PCR引物序列，人ACE2扩增的外端引物：F1(F out)5’-GAT GGA GTA CCG ACT GGA GTC-3’，R1(Rout)5’-CTAATA TCG ATG GAG GCA TAA-3’，产物547bp；内端引物：F2(F in)5’-GAG GAG GAT GTG CGAGTG GCT A-3’，R2(R in)5’-CCA ACC ACT ATC ACT CCC ATC A-3’，产物269bp。人β-actin的扩增引物序列：F 5’-GCT CGT CGT CGA CAA CGG CTC-3’，R 5’-CAA ACA TGA TCTGGGTCATCTTCT-3’，产物353bp。PCR条件：94℃ 5min，然后94℃变性30s、55℃退火30s、68℃延伸5min，循环30次，最后于68℃延伸10min。
用BamH I和EcoRI分别酶切载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro和上述PCR产物，或用AgeI和EcoRI分别酶切pGC-F和上述PCR产物，用琼脂糖电泳纯化，将线性化的载体DNA、酶切回收的PCR产物、T4噬菌体DNA连接酶及其缓冲液、ddH2O置16℃连接过夜，将连接液转化感受态细胞，阳性克隆用PCR和测序鉴定。用LB培养液扩增转化菌，用质粒提取试剂盒提取pHBLV-ACE2-OE或pGC-FU-ACE2，采用Lipofectamine 2000转染293FT细胞，转染72h后用Western-Blot检测ACE2基因的表达。
3.2.携带ACE2慢病毒的包装及其滴度测定
将慢病毒表达载体(pHBLV-ACE2)、包装质粒(psPAX2载体和pMD2G)或将pGC-FU-ACE2、包装质粒(pHelper 1.0和pHelper 2.0)分别共转染293T细胞，获得携带ACE2基因的重组慢病毒(Lentiviral-ACE)。同时将pHBLV空载(含GFP基因)、包装质粒(psPAX2载体和pMD2G)共转染另一组293T细胞，所获得的仅携带GFP基因的空载体(NC-GFP)作为对照。
转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒的细胞上清液，4℃，4000g离心10min，再以0.45μm滤器过滤上清液，除去细胞碎片，离心，得到高滴度的慢病毒。以待鉴定的慢病毒原液感染293T细胞，4d后抽提RNA，Real-Time PCR测定慢病毒滴度。
3.3.Lentiviral-ACE转染MSC-SV40LT
以每孔1×106个细胞密度将MSC-SV40LT接种于6孔板，分为目的基因过表达(OE-ACE2)组、空载体(NC-GFP)对照组、空白组，每组2孔，待细胞汇合至30％时，慢病毒组加入5倍稀释的慢病毒原液(Lentiviral-ACE)，空载体组加入5倍稀释的空载体原液，培养24h后更换10％FBS的DMEM液，并加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素(2.50μg·mL-1)，维持嘌呤霉素浓度，隔天换液，直至空白对照组细胞完全死亡，筛选结束。未被嘌呤霉素杀死的MSC-SV40LT即为已被重组慢病毒转染并已在DNA上整合了ACE2基因的干细胞系MSC-SV40LT/ACE2，即为预制的新冠病毒孵化细胞。
3.4.MSC-SV40LT/ACE2的ACE2基因检测
3.4.1.RT-PCR检测ACE2基因的mRNA转录
以1×106个细胞密度将MSC-AT2R/ACE2接种于6孔板，培养4d后用荧光显微镜观察荧光，用RT-PCR检测ACE2的转录，上游引物为CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’；下游引物为EF1-Rn：5’-GCCAGTACACGACATCACTT-3’；β-actin上游和下游分别为：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’、5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。以ACE2/B-actin积分光密度值(IOD)比较和统计分析，计算试验组和对照组的mRNA表达量，筛选ACE2高效表达的MSC-SV40LT/ACE2。
3.4.2.Western-Blot检测ACE2的蛋白表达
抽提各组细胞裂解液的蛋白，BAC法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％SDS-PAGE分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗VDR抗体为一抗，用ECL化学发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。观察试验组和对照组的ACE2蛋白表达，筛选ACE2高效表达的MSC-SV40LT/ACE2。
4.MSC-SV40LT/ACE2的功能检测
4.1.样本采集
取COVID-19确诊患者的咽拭，按100∶1的比例加入双抗(10000IU的青霉素和10000μg的链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100IU和100μg，置4℃过夜，备用。
4.2.病毒培养和分离
将Vero-E6接种至含10％FBS的DMEM的12.5cm2培养瓶中，置36℃、5％CO2培养箱中培养成30％汇合度的单层细胞，吸去培养液，用DMEM清洗细胞2遍，然后在培养瓶中加入0.5mL经过双抗处理的COVID-19患者样本，置36℃、5％CO2培养箱中吸附90min后，吸去样本，加入3.5mL DMEM培养液(10％胎牛血清)，每天观察细胞病变效应(CPE)，经培养5～7d后，取病变细胞上清液蔗糖梯度超速离心分离，用培养液配成103～105TCID50/ml病毒液。
4.3.MSC-SV40LT/ACE2与病毒共培养
设立Vero组、MSC-SV40LT组、MSC-SV40LT/ACE2组，每组接种12孔板，使每孔含有2×105个细胞、2mL DMEM培养液(10％胎牛血清)，置36℃、5％CO2培养箱中培养至30％汇合度时，每孔加病毒液0.5mL，继续培养。然后分别于培养1小时、6小时、24小时和72小时后每组各取3孔的上清液，混合后以1∶4、1∶12、1∶36、1∶108、1∶324、1∶972、1∶2916、1∶8748倍稀释，进行RT-PCR检测。
4.4.实时荧光RT-PCR检测病毒RNA
核酸提取试剂盒(批号：2019004)、2019新型冠状病毒(ORF1ab/N)核酸检测试剂盒(批号：20200123)和DA3200核酸提取仪，购自中山大学达安基因股份有限公司，ABI 7500型PCR仪器购自美国Thermo Fisher Scientific。按试剂盒说明书操作，扩增反应条件为：50℃15min；95℃ 15min；94℃ 15s；55℃ 45s；共45个循环，在55℃采集荧光信号。
根据试剂盒说明，结果判断标准如下：①如果检测样本在ORF1ab和N基因通道无扩增曲线或Ct值＞38，判为SARS-CoV-2阴性；②如果检测样品在ORF1ab和N基因通道Ct值≤38，且有明显的扩增曲线，判为SARS-CoV-2阳性；③如果检测样品在ORF1ab或者N基因通道Ct值≤38，另一通道无扩增曲线，复检结果与原来结果一致，判为SARS-CoV-2阳性。
4.5.病毒RNA检测结果
在表1中，当细胞系和病毒混合培养1小时后，各组培养液病毒RNA检测阳性的稀释度均为1∶4，被认为是外源加入到培养液中的病毒在基本未复制时的检测结果。在表2～3中，当细胞系和病毒混合培养6小时后，MSC-SV40LT/ACE2组和Vero细胞组的培养液及细胞内RNA检测阳性的效价均为1∶36，与MSC-SV40LT组相比提高了3倍。在表4中，当细胞系和病毒混合培养24小时后，MSC-SV40LT/ACE2组和Vero细胞组的培养液RNA检测阳性的效价均为1∶972，与MSC-SV40LT组相比提高了27倍。在表5～6中，当细胞系和病毒混合培养72小时后，MSC-SV40LT/ACE2组的培养液及细胞内RNA检测阳性的效价均为1∶26244以上。
说明MSC-SV40LT/ACE2即新冠病毒孵化细胞与WHO于1982年推荐的Vero细胞均能使新冠病毒在细胞内大量复制，可作为病毒繁殖的宿主细胞，应用于制备新冠病毒。
表1细胞系与分离的新冠病毒共培养1小时培养液中病毒RNA检测结果
Figure BSA0000232852450000081
表2细胞系与分离的新冠病毒共培养6小时的培养液病毒RNA检测结果
Figure BSA0000232852450000082
Figure BSA0000232852450000091
表3细胞系与分离的新冠病毒共培养6小时的细胞内病毒RNA检测结果
Figure BSA0000232852450000092
表4细胞系与分离的新冠病毒共培养24小时培养液的病毒RNA检测结果
Figure BSA0000232852450000093
表5细胞系与分离的新冠病毒共培养72小时培养液的病毒RNA检测结果
Figure BSA0000232852450000094
表6细胞系与分离的新冠病毒共培养72小时的细胞内病毒RNA检测结果
Figure BSA0000232852450000095
4.6.新冠病毒孵化细胞的贮存
按供者姓名和/或组织分型，将新冠病毒孵化细胞分装于安瓶内，每个安瓶10×106个细胞，收藏于-196℃液氮细胞库中。
5.基于新冠病毒孵化细胞的灭活病毒制备
5.1.器材
生物反应器：可用荷兰Applicon公司生产，包括7升、75升和550升，由电脑自动控制，可进行在位灭菌，自动控制溶氧、pH值、温度和搅拌速度等发酵参数；澄清过滤设备：可使用PALL公司生产的过滤器进行多级过滤，不锈钢滤筒中放入过滤柱，清洗后高压灭菌备用；超滤浓缩设备：可使用Millipore公司的Pelicon 2系统，聚醚砜超滤膜，100万分子截留量；层析纯化设备：使用GE公司AKTA Primer层析纯化系统，BPG100/950和BPG200/450层析柱；DMEM培养基、M199培养基和胎牛血清均选用Gibco公司；微载体选用美国GE Healthcare公司；
5.2.新冠病毒毒株采集
采用权威机构分离收藏的指定流行毒株，或取COVID-19确诊患者的咽拭，按100∶1的比例加入双抗(10000IU的青霉素和10000μg的链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100IU和100μg，置4℃过夜，备用。
5.3.孵化细胞培养
取细胞库中的1支或数支安瓶孵化细胞，接种培养瓶培养，传代扩增，待细胞培养至单层，经胰酶消化后，接种到生物反应器中进行细胞培养。经过生物反应器灌流培养方式培养，再经75L生物反应器再循环培养，最终用550L生物反应器批培养。每级生物反应器的培养条件均为：3-5g/L的Cytodexl微载体，DMEM细胞培养液，培养温度37℃±0.5℃，溶解氧50％士20％，pH值7.2士0.2，搅拌速度50±20rpm，培养4～7天。细胞在微载体颗粒上长成单层后用胰蛋白酶消化，分散成均匀的细胞悬液，接种于下一级发酵罐放大培养；在550升扩增至适宜数量的生产用细胞(不低于0.8×106细胞/ml)，用于病毒接种。
5.4.病毒培养
550升微载体培养细胞达到一定浓度后，弃细胞培养液，换上病毒维持液，接种单一型别病毒工作种子，接种量为0.01～0.3MOI。培养条件为：温度33℃士0.5℃，溶解氧25％±10％，pH值7.4+0.2，搅拌速度50±20rpm。病毒培养时间48～96小时，至孵化细胞完全病变时收获病毒悬液。
5.5.病毒液收获和过滤
完全病变的病毒液经75μm、75μm加硅藻土助滤剂、0.45μm和0.22μm不同孔径组合的滤器澄清过滤，除去微载体和细胞碎片。
5.6.病毒液浓缩
澄清后病毒收获液用超滤浓缩设备经截留分子量为100KD的超滤膜超滤浓缩200-400倍。
5.7.病毒液纯化
病毒浓缩液先经Sepharose CL-6B凝胶过滤层析纯化，洗脱缓冲液为PBS(pH7.0-4-0.2)，每次上样量应不超过柱体积的10％，流速为0.35±0.2cm/min，检测波长为280nm，收集第一峰。经凝胶过滤收集的病毒液，再用DEAE Sepharose F.F.离子交换层析纯化。缓冲液为PBS(pH7.0±0.2)，洗脱液为1mol/L NaCl，流速为0.5±0.15cm/min，第一峰为纯化病毒峰。
5.8.病毒液过滤和灭活
病毒纯化液经0.22μm孔径的滤器除菌过滤，滤过后的病毒液在2～8℃保存不超过72小时进行灭活。过滤后的纯化液用M199稀释后以甲醛灭活，各型病毒纯化液应在蛋白含量低于150μg/ml的条件下灭活。加入甲醛至终浓度为92.5μg/ml，于37℃±0.5℃灭活至第6天，用0.22μg孔径的滤器再过滤灭活液，37℃士0.5℃继续灭活至第12天终止。
5.9.病毒灭活验证
采用细胞培养法进行病毒灭活验证：分别于灭活第9天和终止时取两份样品，每次取样量为1500剂量，每份样品分别进行病毒灭活验证检测，样品接种到单层孵化细胞或Vero细胞上，于35.5℃士0.5℃培养21天(原始培养)，并于14天和21天取培养上清液分别进行传代培养各14天，原始培养和传代培养应均无CPE发生，表示灭活彻底，无活病毒存在。
5.10.灭活病毒液纯度检测
用HPLC水溶性凝胶柱或其它适宜的色谱柱进行检测：取灭活纯化病毒液样品100μl进行检测，流动相为0.1mol/L磷酸盐-0.1mol/L氯化钠缓冲液(pH 7.0士0.20)，流速为0.3ml/min，检测波长为280nm，运行时间40分钟；用面积归一法进行分析，灭活病毒液纯度应不低于95％。
5.11.蛋白含量检测
此法的原理是利用碱性环境中蛋白质能把2价铜(Cu+2)还原为1价铜(Cu+1)(双缩脲反应)，然后再利用试剂中所含有的羟乙基甘氨酸与l价铜离子螯合，而产生紫色的可溶性产物，该产物在562nm波长处的光吸收峰与蛋白质含量(20-2000ug/ml)呈线性关系的原理进行检测，具体参照有关试剂盒，残留蛋白含量应低于国家规定的标准。
5.12.DNA残留量检测
在反应体系中用无放射性的地高辛体系标记单链DNA探针，与待测样品中具有共同序列的DNA单链在低于Tm 20-30℃时，根据碱基互补配对原则可合成双链结构。然后通过显色检测特定的核苷酸片断，按显色深浅及面积大小判读样品中DNA的含量，具体参照有关试剂盒，DNA残留量应低于规定标准。
6.基于灭活病毒的新冠病毒单克隆抗体制备方法
6.1.免疫方案
选用6～10周龄的BaLb/c小鼠及福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂，将灭活新冠病毒和佐剂等体积混合，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上呈小滴状不易马上扩散，表明已达到油包水状态。初次免疫为Ag1～50μg、加福氏完全佐剂皮下多点注射(一般0.8～1ml 0.2ml/点)。3周后进行第二免疫，加福氏不完全佐剂，剂量同初次免疫。2～3周后加强免疫，剂量为50～500μg，3天后取脾融合。
6.2.饲养细胞
在单克隆抗体制备的杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养中，需加入饲养细胞(以与免疫小鼠相同的品系制备)。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞、小鼠胸腺细胞或经放射线照射后的小鼠成纤维细胞系3T3。
6.3.骨髓瘤细胞
采用NS1、SP2/0或X63Ag8.653骨髓瘤细胞，骨髓瘤细胞系应和免疫动物品系相同，以提高杂交融合率，便于将杂交瘤细胞接种在相同品系的小鼠腹腔内，达到高产McAb。在准备融合前两周复苏骨髓瘤细胞，在含10～20％小牛血清的RPMI1640或DMEM培养基中扩大培养，使骨髓瘤细胞处于对数生长期，形态良好，活细胞计数高于95％。
6.4.免疫脾细胞
免疫脾细胞是指处于免疫状态的脾脏B淋巴母细胞，一般取最后加强免疫3天以后的脾脏(此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高)，在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常的2倍，细胞数为2×108个左右。
6.5.细胞融合
6.5.1.取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
6.5.2.同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
6.5.3.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟，弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动，在室温下融合。
6.5.4.在30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek，分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌，作用90秒钟(冬天室温较低时可延长至120秒钟)。
6.5.5.加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml；离心6分钟(800rpm)，弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
6.5.6.根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液(每块96孔板10ml)，将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，37℃、5％CO2孵箱中培养。
6.6.HAT选择杂交瘤
在培养12～24小时后，按试剂盒说明书加HAT选择培养液，HAT选择培养1～2周后，改用HT培养液，再维持培养1～2周，改用一般培养液(细菌、霉菌和支原体的污染、PEG有毒性或作用时间过长、牛血清的质量太差、支原体污染骨髓瘤细胞及HAT质量问题均可致融合后杂交瘤不生长)
6.7.抗体的检测
通过选择性培养筛选的杂交瘤细胞系，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体，在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。可按试剂盒说明书选用ELISA(检测可溶性抗原、细胞和病毒的McAb)、RIA(检测可溶性抗原、细胞的McAb)、FACS(检测细胞表面抗原的McAb)、IFA(检测细胞和病毒的McAb)。
6.8.杂交瘤的克隆化
经过HAT筛选后的杂交瘤克隆可能每个克隆中含有多种细胞，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需抗体(特异性抗体)分泌细胞或无关抗体分泌细胞，所以要尽早克隆化，筛选出能分泌对新冠肺炎防治有效的细胞克隆，去除能分泌引发ADE抗体、无关抗体或不分泌抗体的无用细胞克隆，以免竞争抑制有效细胞克隆生长。
6.8.1.有限稀释法
制备饲养细胞悬液(同融合前准备)，计数阳性孔细胞，并调细胞数在1～5×103/ml。取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞的完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排，每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100μl/孔，加D、E、F三排，每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100μl/孔，加G、H两排，每孔0.5个细胞。培养4～5天后，在倒置显微镜下可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔。第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测(初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT)。
6.8.2.软琼脂法
用含20％FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640配制1％琼脂水溶液，高压灭菌，42℃预热。由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制0.5％琼脂，置42℃保温。用上述0.5％琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。按100/ml，500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。1ml0.5％琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。
6.9.杂交瘤细胞的冻存
用细胞冻存液(50％小牛血清、40％不完全培养液和10％DMSO)按常规冻存。要及时冻存原始孔和每次克隆化得到的亚克隆细胞，以免污染、抗体分泌能力突变等原因致前功尽弃。
6.10.单克隆抗体的大量生产
6.10.1.旋转培养管法
体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清获取单克隆抗体。但产量低、费用高。
6.10.2.实体瘤法
对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml，共2～4点。待肿瘤达到一定大小后采血，从血清中获得单克隆抗体，含量可达到1-10mg/ml。
6.10.3.腹水制备法
常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb/c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，小鼠将死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般每只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml，这是目前最常用方法，还可冻存腹水细胞，复苏后转种小鼠腹腔。
6.11.单克隆抗体鉴定
6.11.1.抗体特异性及滴度鉴定
除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，如①ELISA检测新冠病毒IgG：按试剂盒操作，每孔加入1∶10稀释的100μl待检样本，放37℃温箱孵育30min，用洗涤液充分洗涤；加入100μl HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶500)，放37℃温箱孵育30min，用洗涤液充分洗涤；加入底物液，放37℃温箱孵育10min，最后加入终止液50μl，在450nm波长下测定OD值。②ELISA检测新冠病毒IgM：按试剂盒操作，每孔加入1∶10稀释的100μl待检血清，放37℃温箱孵育30min，用洗涤液充分洗涤；加入100μl HRP标记的羊抗鼠IgM(1∶500)，放37℃温箱孵育30min，用洗涤液充分洗涤：加入底物液，放37℃温箱孵育10min，最后加入终止液50μl，在450nm波长下测定OD值。
6.11.2.McAb Ig类与亚类鉴定
当用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已基本确定抗体的Ig类型。如果用酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。
6.11.3.McAb中和活性及滴度鉴定
用动物或细胞保护实验来确定McAb的生物学活性。如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感动物或细胞，观察是否得到抗体的保护。如将试验样本倍比稀释为1∶2，1∶4，1∶8……。然后将新冠病毒液稀释成每个细胞孔1/2接种量中含100TCID50，将稀释好的病毒液按每管200μl加入等量的稀释好的试验样本，充分混匀后，37℃水浴作用120min。每个样品4个复孔接种VeroE6细胞，除阴性细胞对照孔外，每孔100μl病毒-血清混合物。阳性细胞对照为50μl病毒稀释液+50μl病毒+100μl细胞。阴性细胞对照为加100μl病毒稀释液。37℃，5％CO2培养箱孵育，逐日观察细胞病变效应(CPE)，判断新冠病毒单克隆抗体的中和新冠病毒感染能力。
6.11.4.McAb识别抗原表位鉴定
用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别表位是否相同，排除非中和抗体或亚中和抗体。
6.11.5.McAb亲和力鉴定
用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。
6.12.单克隆抗体疫苗试验
6.12.1.筛选能产生高效价、高特异性、高中和活性McAb的杂交瘤细胞株
经McAb特异性、中和活性、亲和力、效价和识别抗原表位等鉴定，排除产生低浓度抗体、非中和抗体或亚中和抗体的杂交瘤细胞株，筛选能产生高效价、高特异性、高中和活性的McAb的杂交瘤细胞株制备McAb，然后再作McAb鉴定，调配成合适效价，进行动物试验。
6.12.2.McAb的动物试验
①将上述制备的高特异性、高中和活性的McAb稀释成梯度效价(如1∶3、1∶9、1∶27)；选择试验小鼠(6-8周龄、40克左右的SPF级雌性BALB/c)，分为阳性对照组、阴性对照组、抗体对照组和抗体试验组(又分1∶3、1∶9、1∶27组)，每组10只；将新冠病毒试验毒株配成合适浓度的病毒液(103～105TCID50/ml)。抗体试验组小鼠经鼻接种0.5mL梯度效价的McAb(分为1∶3、1∶9、1∶27组)和0.5mL病毒液；抗体对照组小鼠经鼻接种0.5mL梯度效价的McAb和0.5mL病毒稀释液，阳性对照组小鼠经鼻接种0.5mL抗体稀释液和0.5mL病毒液，阴性对照组小鼠经鼻接种0.5mL抗体稀释液和0.5mL病毒稀释液。按常规试验观察。
②在上述试验方法的基础上，先给试验小鼠接种新冠病毒液，在感染发病后再接种不同稀释度的McAb，观察McAb的紧急治疗效果，或改用其他动物进行常规疫苗动物试验。
7.获得新型冠状病毒单克隆抗体疫苗
依次经过新冠病毒孵化细胞制备、新冠病毒培养、灭活新冠病毒制备、免疫动物、细胞融合和杂交瘤细胞制备、分泌低浓度抗体和非中和抗体及亚中和抗体的杂交瘤细胞筛除、分泌高特异性和高中和活性McAb的杂交瘤细胞筛选以及动物试验，可以在体外鉴别、去除具有抗体依赖性感染增强(ADE)危害的低浓度抗体和非中和抗体及亚中和抗体，筛选出无ADE的高效价、高特异性、高中和活性的新冠病毒单克隆抗体(McAb)疫苗。

Claims (9)

1.一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法，其特征在于，根据新冠病毒通过ACE2受体感染宿主细胞并易在表达ACE2的宿主细胞中繁殖以及SV40LTAg可使人类成纤维细胞永生化的机制，通过基因转染将ACE2和SV40LTAg整合到产前诊断后剩余胎儿干细胞DNA上，从而开发出因过表达ACE2和SV40LTAg而易使新冠病毒进入干细胞内繁殖的人造永生化新冠病毒孵化细胞，然后通过所述孵化细胞和新冠病毒的共同培养产业化制备新冠病毒，进而制备浓缩、纯化的灭活病毒，继之以灭活病毒免疫动物，进行免疫脾细胞提取、细胞融合、杂交瘤细胞筛选及克隆化培养，以去除分泌具有ADE风险的低浓度抗体、非中和抗体及亚中和抗体的杂交瘤，获得仅分泌目标抗体的单株杂交瘤以用于产业化制备目标单克隆抗体，所制单克隆抗体经过抗体特异性、中和活性、亲和力、滴度、识别抗原表位、Ig类及亚类的体外鉴定获得高效价、高特异性、高中和活性的无ADE风险的单克隆抗体，最终经小鼠动物等试验后获得可用于紧急预防或治疗的能避免ADE风险的McAb疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述SV40LTAg使人类成纤维细胞永生化包括以hRERT制备永生化新冠病毒孵化细胞。
3.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述ACE2基因转染指将ACE2基因连接到慢病毒表达载体中，构建重组质粒，将重组质粒和包装质粒共转染293FT细胞，包装携带ACE2的重组慢病毒，再将重组慢病毒转染永生化干细胞，经过筛选和鉴定，获得易使新冠病毒感染和繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞。
4.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述干细胞包括源自临床或实验的脐血、脐带、胎盘、肺组织细胞及间充质细胞。
5.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述孵化细胞和新冠病毒共同培养指两者在含3-5g/L微载体的DMEM的生物反应器中，在37℃、5％CO2、pH值7.2、搅拌速度为50±20rpm的条件下培养，使细胞在微载体表面形成60％汇合度，然后换上病毒维持液，接种0.01～0.3MOI量的新冠病毒液，在33℃、5％CO2、pH值7.4、搅拌速度为50±20rpm的条件下培养48～96小时，至细胞完全病变时收获病毒液。
6.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述灭活病毒液是指经75μm、0.45μm和0.22μm滤器过滤、100KD超滤膜超滤浓缩、Sepharose CL-6B凝胶过滤层析纯化、0.22μm滤器除菌过滤、92.5μg/ml甲醛灭活、灭活效果验证、病毒液纯度检测后制成，所述免疫动物指用所述灭活病毒免疫获得单克隆和多克隆抗体。
7.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法，其特征在于，包括使用Vero细胞制备新冠病毒或灭活新冠病毒，继之制备McAb疫苗。
8.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法，其特征在于，所述小鼠动物试验指将所筛选的McAb稀释成梯度，并配制试验病毒液、选择试验小鼠，将抗体试验组接种McAb和病毒液、抗体对照组接种McAb和病毒稀释液、阳性对照组接种抗体稀释液和病毒液，阴性对照组接种抗体稀释液和病毒稀释液，判断McAb疫苗的效果及安全性。
9.根据权利要求1所述的一种新冠肺炎单克隆抗体疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集产前诊断后剩余羊水细胞，分离梭形羊水细胞或肺组织细胞，转染SV40LT和/或hTERT基因，以G418和/或嘌呤霉素筛选永生化细胞系，经细胞系生物学鉴定、肺干细胞标志物检测获得永生化羊水间充质干细胞系或肺干细胞系，命名为MSC-SV40LT/hTERT。
(2)将ACE2基因连接到慢病毒表达载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU中，分别构建重组质粒pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，将重组质粒pHBLV-OE-ACE2和包装质粒(psPAX2和pMD2G)或将重组质粒pGC-FU-ACE2和包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)分别共转染293FT细胞，包装携带ACE2的重组慢病毒，再将重组慢病毒转染MSC-SV40LT/hTERT，使ACE2整合到永生化干细胞DNA上，经过筛选和鉴定，获得易使新冠病毒感染和繁殖的永生化新冠病毒孵化细胞，作为制备新冠病毒灭活疫苗的基质细胞，命名为NCIC细胞(Novel Coronavirus Incubate Cells)。
(3)将孵化细胞分装于安瓶内，每个安瓶10×106个细胞，收藏于-196℃液氮细胞库备用，使用时取出孵化细胞，经传代培养至所需细胞量时转种到内含3-5g/L微载体的DMEM细胞培养液的生物反应器中，在37℃、5％CO2、pH值7.2、搅拌速度50±20rpm的条件下培养，使细胞在微载体表面形成60％汇合度，然后换上病毒维持液，接种0.01～0.3MOI量的新冠病毒液，在33℃、5％CO2、pH值7.4、搅拌速度50±20rpm的条件下培养48～96小时，至细胞完全病变时收获病毒液。
(4)病毒液经75μm、0.45μm和0.22μm滤器过滤、100KD超滤膜超滤浓缩、Sepharose CL-6B凝胶过滤层析纯化、0.22μm滤器除菌过滤、92.5μg/ml甲醛灭活、灭活效果验证、病毒液纯度检测，制成灭活新冠病毒。
(5)将灭活病毒免疫小鼠，提取小鼠免疫脾细胞，进行细胞融合，制备杂交瘤细胞。
(6)筛选能分泌高特异性和高中和活性的McAb的杂交瘤细胞，去除分泌低浓度抗体、非中和抗体及亚中和抗体的杂交瘤细胞。
(7)通过McAb特异性、中和活性、亲和力、滴度、识别抗原表位、Ig类及亚类的体外鉴定，去除具有抗体依赖性感染增强(ADE)危害的低浓度抗体、非中和抗体及亚中和抗体，筛选高效价、高特异性、高中和活性的无ADE的新冠病毒单克隆抗体。
(8)将所筛选的McAb稀释成梯度，并配制试验病毒液、选择试验小鼠，将抗体试验组接种McAb和病毒液、抗体对照组接种McAb和病毒稀释液、阳性对照组接种抗体稀释液和病毒液，阴性对照组接种抗体稀释液和病毒稀释液，判断McAb疫苗的效果及安全性。
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