CN113943693A - 一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法 - Google Patents

一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞生物学技术领域，公开了一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，所述罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法包括：进行细胞培养基的配置；进行罗非鱼腹鳍细胞块的预处理；进行罗非鱼腹鳍细胞的原代培养；进行罗非鱼腹鳍细胞的传代培养。本发明提供的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，针对罗非鱼腹鳍细胞的特征，优化出适合该细胞生长增殖的培养基及适宜的培养条件，成功构建得到罗非鱼腹鳍细胞系，该细胞繁殖能力强，可应用于细胞生物学、分子生物学、病毒学、毒理学、肿瘤学、遗传学和免疫学等相关功能基因的重要研究，为分子细胞水平上展开鱼类病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗等提供了基础。

Description

一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，尤其涉及一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法。
背景技术
目前，鱼类细胞系经过多年的发展，各种淡水、海水鱼类细胞系已成为多种学科领域重要的体外研究体系，许多重要实验和新技术都需要在鱼类细胞系的基础上进行进一步研究。鱼类细胞系的应用范围日益广泛，已从最初的病毒分离、提纯、鉴定、体外繁殖扩展到环境污染物致毒机理及其监测、鱼类免疫、种质改良、资源保护等诸多领域。鱼类细胞系不但可作为在细胞生物学、鱼类病毒学、鱼类生理学、鱼类免疫学、环境毒理学、鱼类遗传学、药理学等多种学科进行基础研究的良好的体外研究体系，还可在鱼类病毒疫苗研制，环境污染物毒性检测，鱼类基因工程育种，鱼类组织胚胎研究，珍稀鱼类资源保护，天然活性物质开发等领域进行应用研究。无论在理论研究方面，还是实际应用方面，都具有深远意义。
细胞培养技术是生命科学领域，细胞工程、基因工程和生物医学工程主要的研究手段。鱼类细胞系的构建为鱼类病毒性疾病的病原学研究和病毒的疫苗研究提供了基础的生物学材料具有重要的研究价值。通过细胞株来鉴定和分离敏感病毒株是世界动物卫生组织Office International Des Epizooties(OIE)推荐的最有效方法，通过建立不同种类的鱼类细胞株为鱼类病毒筛选敏感细胞系提供了丰富的生物学材料。目前，现有技术中关于罗非鱼腹鳍细胞系的构建尚未见报道。因此，亟需一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，以弥补现有技术的空白。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中关于罗非鱼腹鳍细胞系的构建尚未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法。
本发明是这样实现的，一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，所述罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法包括以下步骤：
步骤一，进行细胞培养基的配置：取M199培养基粉末，利用无菌去离子水溶解后，分别进行抽滤和分装；取少量培养液进行无菌测试后，置于4℃条件下保存，得基础细胞培养基；向基础培养基内依次加入胎牛血清、维生素C、碳酸氢钠、表皮生长因子和双抗，混合均匀，进行pH的调节和灭菌处理，即可制得完全细胞培养基，备用；
所述灭菌处理包括：通过具有0.2μm直径微孔的滤膜进行过滤灭菌；
步骤二，进行罗非鱼腹鳍细胞块的预处理：取健康已被处死的罗非鱼，量体长，称重，浸入75％的乙醇中，进行体表消毒和麻醉，立即解剖；剪取罗非鱼腹鳍组织，于青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡，消毒，冲洗，于无菌条件下将罗非鱼腹鳍细胞块剪成0.5～1.5mm3的组织块；将组织块浸泡在0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA中消化10～25min后，再用0.5％的透明质酸酶消化0.5～2.5h，即得预处理后的罗非鱼腹鳍细胞块，备用；
所述青霉素-链霉素双抗溶液制备方法包括：将青霉素、链霉素与一定量的三蒸水混合即可得所述青霉素-链霉素双抗溶液；
步骤三，进行罗非鱼腹鳍细胞的原代培养：将预处理后的罗非鱼腹鳍细胞块移植到装有基础细胞培养基的25cm2细胞培养瓶中，保持26℃培养；去除基础细胞培养基，加入2mL胰酶进行消化处理，终止消化反应，过滤消化产物，离心，重悬细胞沉淀；移植至另一25cm2细胞培养瓶中，补充完全细胞培养基，置于28℃细胞培养箱中静置培养，每天半量更换培养基一次；
步骤四，进行罗非鱼腹鳍细胞的传代培养：待原代培养细胞长成单层后，吸出培养基，加入PBS漂洗细胞，加入含0.25％EDTA的胰蛋白酶进行静置消化；于显微镜观察下待细胞变圆即吸弃胰酶，加入新鲜完全细胞培养基制备细胞悬液，按照1:3的比例接种至两个25cm2细胞培养瓶中在28℃培养箱中进行静置传代培养，传代培养50代即得罗非鱼腹鳍细胞系。
进一步，步骤一中，所述胎牛血清占细胞培养基总体积的10～20％，所述维生素C的浓度为1～50μg/ml，所述碳酸氢钠的浓度为1～100μg/L，所述表皮生长因子的浓度为5～100ng/ml。
进一步，步骤一中，所述双抗包括青霉素150～200U/mL，链霉素0.05～0.2mg/mL。
进一步，步骤一中，所述完全细胞培养基的pH为7.5～8。
进一步，步骤二中，所述浸泡，消毒，冲洗，包括：
将罗非鱼腹鳍组织于浓度为1000IU/mL青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡30～45min，以75％的酒精进行消毒处理，用浓度为2.5ug/mL的两性霉素B的D-PBS冲洗3～5次。
进一步，步骤三中，所述消化处理的时间为15～30min。
进一步，步骤三中，所述离心的方法为：于1000～1500rpm的条件下离心10～15min。
进一步，步骤三中，所述补充完全细胞培养基，包括：
于移植后的第15h加入2～5mL的完全细胞培养基，于第24h加入3～6mL的完全细胞培养基。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法构建得到的罗非鱼腹鳍细胞系。
本发明的另一目的在于提供一种所述的罗非鱼腹鳍细胞系在细胞工程、基因工程或生物医学工程中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，针对罗非鱼腹鳍细胞的特征，优化出适合该细胞生长增殖的培养基及适宜的培养条件，成功构建得到罗非鱼腹鳍细胞系，该细胞繁殖能力强，可应用于细胞生物学、分子生物学、病毒学、毒理学、肿瘤学、遗传学和免疫学等相关功能基因的重要研究，为分子细胞水平上展开鱼类病毒感染途径、感染机理以及研制病毒疫苗等提供了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法流程图。
图2是本发明实施例提供的进行细胞培养基配置的方法流程图。
图3是本发明实施例提供的进行罗非鱼腹鳍细胞块预处理的方法流程图。
图4是本发明实施例提供的进行罗非鱼腹鳍细胞原代培养的方法流程图。
图5是本发明实施例提供的进行罗非鱼腹鳍细胞传代培养的方法流程图。
图6是本发明实施例提供的罗非鱼腹鳍细胞形态图。
图7是本发明实施例提供的罗非鱼腹鳍细胞原代培养细胞形态图。
图8是本发明实施例提供的罗非鱼腹鳍细胞50代细胞形态图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法包括以下步骤：
S101，进行细胞培养基的配置；
S102，进行罗非鱼腹鳍细胞块的预处理；
S103，进行罗非鱼腹鳍细胞的原代培养；
S104，进行罗非鱼腹鳍细胞的传代培养。
如图2所示，本发明实施例提供的步骤S101中，所述进行细胞培养基的配置，包括：
S201，取M199培养基粉末，利用无菌去离子水溶解后，分别进行抽滤和分装；
S202，取少量培养液进行无菌测试后，置于4℃条件下保存，得基础细胞培养基；
S203，向基础培养基内依次加入胎牛血清、维生素C、碳酸氢钠、表皮生长因子和双抗，混合均匀，进行pH的调节和灭菌处理，即可制得完全细胞培养基。
本发明实施例提供的胎牛血清占细胞培养基总体积的10～20％，所述维生素C的浓度为1～50μg/ml，所述碳酸氢钠的浓度为1～100μg/L，所述表皮生长因子的浓度为5～100ng/ml。
本发明实施例提供的灭菌处理包括：通过具有0.2μm直径微孔的滤膜进行过滤灭菌。
本发明实施例提供的双抗包括青霉素150～200U/mL，链霉素0.05～0.2mg/mL。
本发明实施例提供的完全细胞培养基的pH为7.5～8。
如图3所示，本发明实施例提供的步骤S102中，所述进行罗非鱼腹鳍细胞块的预处理，包括：
S301，取健康罗非鱼，量体长，称重，浸入75％的乙醇中，进行体表消毒和麻醉，立即解剖；
S302，剪取罗非鱼腹鳍组织，于青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡，消毒，冲洗，于无菌条件下将罗非鱼腹鳍细胞块剪成0.5～1.5mm3的组织块；
S303，将组织块浸泡在0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA中消化10～25min后，再用0.5％的透明质酸酶消化0.5～2.5h，即得预处理后的罗非鱼腹鳍细胞块。
本发明实施例提供的青霉素-链霉素双抗溶液制备方法包括：将青霉素、链霉素与一定量的三蒸水混合即可得所述青霉素-链霉素双抗溶液。
本发明实施例提供的浸泡，消毒，冲洗，包括：将罗非鱼腹鳍组织于浓度为1000IU/mL青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡30～45min，以75％的酒精进行消毒处理，用浓度为2.5ug/mL的两性霉素B的D-PBS冲洗3～5次。
如图4所示，本发明实施例提供的步骤S103中，所述进行罗非鱼腹鳍细胞的原代培养，包括：
S401，将预处理后的罗非鱼腹鳍细胞块移植到装有基础细胞培养基的25cm2细胞培养瓶中，保持26℃培养；
S402，去除基础细胞培养基，加入2mL胰酶进行消化处理，终止消化反应，过滤消化产物，离心，重悬细胞沉淀；
S403，移植至另一25cm2细胞培养瓶中，补充完全细胞培养基，置于28℃细胞培养箱中静置培养，每天半量更换培养基一次。
本发明实施例提供的消化处理的时间为15～30min。
本发明实施例提供的离心的方法为：于1000～1500rpm的条件下离心10～15min。
本发明实施例提供的补充完全细胞培养基，包括：于移植后的第15h加入2～5mL的完全细胞培养基，于第24h加入3～6mL的完全细胞培养基。
如图5所示，本发明实施例提供的步骤S104中，所述进行罗非鱼腹鳍细胞的传代培养，包括：
S501，待原代培养细胞长成单层后，吸出培养基，加入PBS漂洗细胞，加入含0.25％EDTA的胰蛋白酶进行静置消化；
S502，于显微镜观察下待细胞变圆即吸弃胰酶，加入新鲜完全细胞培制备细胞悬液；
S503，按照1:3的比例接种至两个25cm2细胞培养瓶中在28℃培养箱中进行静置传代培养，传代培养50代即得罗非鱼腹鳍细胞系。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，所述罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法包括以下步骤：
步骤一，进行细胞培养基的配置：取M199培养基粉末，利用无菌去离子水溶解后，分别进行抽滤和分装；取少量培养液进行无菌测试后，置于4℃条件下保存，得基础细胞培养基；向基础培养基内依次加入胎牛血清、维生素C、碳酸氢钠、表皮生长因子和双抗，混合均匀，进行pH的调节和灭菌处理，即可制得完全细胞培养基，备用；
所述灭菌处理包括：通过具有0.2μm直径微孔的滤膜进行过滤灭菌；
步骤二，进行罗非鱼腹鳍细胞块的预处理：取健康已被处死的罗非鱼，量体长，称重，浸入75％的乙醇中，进行体表消毒和麻醉，立即解剖；剪取罗非鱼腹鳍组织，于青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡，消毒，冲洗，于无菌条件下将罗非鱼腹鳍细胞块剪成0.5～1.5mm3的组织块；将组织块浸泡在0.25％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA中消化10～25min后，再用0.5％的透明质酸酶消化0.5～2.5h，即得预处理后的罗非鱼腹鳍细胞块，备用；
所述青霉素-链霉素双抗溶液制备方法包括：将青霉素、链霉素与一定量的三蒸水混合即可得所述青霉素-链霉素双抗溶液；
步骤三，进行罗非鱼腹鳍细胞的原代培养：将预处理后的罗非鱼腹鳍细胞块移植到装有基础细胞培养基的25cm2细胞培养瓶中，保持26℃培养；去除基础细胞培养基，加入2mL胰酶进行消化处理，终止消化反应，过滤消化产物，离心，重悬细胞沉淀；移植至另一25cm2细胞培养瓶中，补充完全细胞培养基，置于28℃细胞培养箱中静置培养，每天半量更换培养基一次；
步骤四，进行罗非鱼腹鳍细胞的传代培养：待原代培养细胞长成单层后，吸出培养基，加入PBS漂洗细胞，加入含0.25％EDTA的胰蛋白酶进行静置消化；于显微镜观察下待细胞变圆即吸弃胰酶，加入新鲜完全细胞培养基制备细胞悬液，按照1:3的比例接种至两个25cm2细胞培养瓶中在28℃培养箱中进行静置传代培养，传代培养50代即得罗非鱼腹鳍细胞系。
2.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述胎牛血清占细胞培养基总体积的10～20％，所述维生素C的浓度为1～50μg/ml，所述碳酸氢钠的浓度为1～100μg/L，所述表皮生长因子的浓度为5～100ng/ml。
3.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述双抗包括青霉素150～200U/mL，链霉素0.05～0.2mg/mL。
4.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤一中，所述完全细胞培养基的pH为7.5～8。
5.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤二中，所述浸泡，消毒，冲洗，包括：
将罗非鱼腹鳍组织于浓度为1000IU/mL青霉素-链霉素双抗溶液中浸泡30～45min，以75％的酒精进行消毒处理，用浓度为2.5ug/mL的两性霉素B的D-PBS冲洗3～5次。
6.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述消化处理的时间为15～30min。
7.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述离心的方法为：于1000～1500rpm的条件下离心10～15min。
8.如权利要求1所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法，其特征在于，步骤三中，所述补充完全细胞培养基，包括：
于移植后的第15h加入2～5mL的完全细胞培养基，于第24h加入3～6mL的完全细胞培养基。
9.一种应用如权利要求1～8任意一项所述的罗非鱼腹鳍细胞系的构建方法构建得到的罗非鱼腹鳍细胞系。
10.一种如权利要求9所述的罗非鱼腹鳍细胞系在细胞工程、基因工程或生物医学工程中的应用。
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CN114836382B (zh) * 2022-05-23 2023-10-27 广东海洋大学 一种尼罗罗非鱼星形胶质细胞系及其构建方法和应用

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