CN114836382B - 一种尼罗罗非鱼星形胶质细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种尼罗罗非鱼星形胶质细胞系及其构建方法和应用，涉及生物细胞模型技术领域。本发明针对尼罗罗非鱼脑组织，采用胰酶消化法分离脑组织细胞，再利用差速贴壁法能进一步减少成纤维细胞的干扰，能更大程度保留脑组织中的胶质细胞进行原代培养，荧光免疫组化检测GFAP信号呈阳性，成功构建罗非鱼脑星形胶质细胞系，可连续传至100代以上，还能维持良好的生长状态，可冷冻保存。本发明所述尼罗罗非鱼脑星形胶质细胞系可以直接用于罗非鱼湖病毒(TiLV)的病原特征分析及疫苗开发研究，还可运用于罗非鱼无乳链球菌脑膜炎机制及鱼源链球菌病的渔药开发研究。

Description

一种尼罗罗非鱼星形胶质细胞系及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物细胞模型技术领域，具体涉及一种尼罗罗非鱼星形胶质细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
尼罗罗非鱼是我国重要的淡水经济鱼，其生长温度为16～38℃，适温22～35℃，主要养殖于我国南方地区，以两广地区最为集中。目前高密度集约化养殖过程中，罗非鱼链球菌病时有发生，该病主要由无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)引起，其中无乳链球菌是一种人畜渔共患的革兰氏阳性菌，也是罗非鱼链球菌病中最为常见的致病菌。罗非鱼链球菌病的死亡率可达70％，严重阻碍罗非鱼养殖业的健康可持续发展。无乳链球菌能够突破尼罗罗非鱼的血脑屏障感染中枢神经系统，目前对于无乳链球菌穿过罗非鱼血脑屏障引起脑膜炎的机制一直不清楚，理解这一机制对于无乳链球菌鱼药及疫苗开发具有重要意义。
星形胶质细胞是哺乳动物大脑中最丰富的细胞类型。尽管星形胶质细胞变性的结果和个体方面可能有所不同，GAFP现在被认为是星形胶质细胞的一种标记物。GFAP蛋白在整个脊椎动物系统发育过程中表现出显著保守性，多个脊椎动物类群的GFAP与哺乳动物GFAP抗体均有交叉反应。星形胶质细胞将外周血液循环与高度受控的中枢神经系统微环境分开，对维持大脑的生理功能至关重要，如各种突触神经递质清除、神经元能量供应、血管张力调节、血脑屏障(BBB)功能维持。在脊椎动物的中枢神经系统中，实现微环境的方法是通过血管和神经元室之间的屏障，即血脑屏障。在大多数脊椎动物的血脑屏障由内皮细胞的紧密连接形成。然而在脊椎动物进化中的血脑屏障最初是由神经胶质细胞组成的，在板鳃类研究中发现了胶质的血脑屏障。在硬骨鱼的大脑中，最常见的细胞类型是径向胶质细胞，在硬骨鱼类中枢神经系统发育过程中最开始出现的细胞类群是放射状胶质细胞，随后这些细胞转化为星形胶质细胞。星形胶质细胞在哺乳动物和鱼类血脑屏障的组成中都起着重要作用。最近的研究证实，无乳链球菌菌毛蛋白PilA和Srr-1与宿主细胞外基质(ECM)成分结合，刺激血脑屏障破坏和增强脑膜炎症反应。体内研究显示细菌对中枢神经系统和血脑屏障的渗透与中性粒细胞浸润增加有关。许多脑细胞，如神经胶质细胞、星形胶质细胞等在被细菌感染后会分泌促炎因子和细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和趋化因子)。促炎细胞因子和趋化因子可能是无乳链球菌破坏血脑屏障完整性的重要致病因子，但是目前没有合适的模型存在，无法确认无乳链球菌引起鱼类脑膜炎的机制。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种尼罗罗非鱼星形胶质细胞系及其构建方法和应用，所述细胞系可稳定传代并可冷冻保存，且对罗非鱼湖病毒(TiLV)具有敏感性，还能作为罗非鱼血脑屏障的体外模型，可运用于罗非鱼无乳链球菌脑膜炎机制及鱼源链球菌病的渔药开发研究。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种尼罗罗非鱼星形胶质细胞系的构建方法，包括以下步骤：利用胰酶对尼罗罗非鱼的脑组织进行消化，分离细胞后利用差速贴壁法纯化细胞，收集纯化的细胞进行原代培养和传代培养，得尼罗罗非鱼星形胶质细胞系。
优选的，所述脑组织在进行消化前，还包括将无菌解剖出的罗非鱼脑组织，在含有青霉素、链霉素和两性霉素B的PBS中涮洗，剪碎后进行所述消化。
优选的，所述消化包括将所述脑组织置于含有EDTA的胰酶溶液中，待消化结束后过滤收集细胞。
优选的，所述过滤包括将消化后的液体过细胞筛，筛下的液体再离心，收集细胞；
所述离心的离心力为400g，离心的时间为3min。
优选的，所述差速贴壁法包括将分离得到的细胞与无血清罗非鱼脑细胞培养液混合制成第一细胞悬液，转入细胞培养瓶中第一静置培养30min，收集第一未贴壁细胞；
将收集的第一未贴壁细胞与无血清罗非鱼脑细胞培养液混合制成第二细胞悬液，转入新的细胞培养瓶，第二静置培养30min，收集第二未贴壁细胞，得到纯化的细胞。
优选的，所述无血清罗非鱼脑细胞培养液为含青霉素、链霉素和两性霉素B的L-15培养基，pH值为7.0～7.4；
所述无血清罗非鱼脑细胞培养液中青霉素的含量为0.1kU/ml，链霉素的含量为0.1mg/ml，两性霉素B的含量为0.25μg/ml。
优选的，对利用所述差速贴壁法进行纯化后的细胞进行原代培养，所述原代培养包括将所述纯化的细胞与罗非鱼脑细胞培养液混合，28℃培养。
优选的，所述罗非鱼脑细胞培养液为含有胎牛血清、青霉素、链霉素和两性霉素B的L-15培养基，pH值为7.0～7.4；
所述罗非鱼脑细胞培养液中胎牛血清的质量百分含量为20％；
所述罗非鱼脑细胞培养液中青霉素的含量为0.1kU/ml，链霉素的含量为0.1mg/ml，两性霉素B的含量为0.25μg/ml。
优选的，所述传代培养时所利用的培养液包括罗非鱼脑细胞培养液，所述罗非鱼脑细胞培养液中胎牛血清的质量百分含量为10～20％；
所述罗非鱼脑细胞培养液中青霉素的含量为0.1kU/ml，链霉素的含量为0.1mg/ml，两性霉素B的含量为0.25μg/ml。
本发明还提供了利用上述构建方法得到的尼罗罗非鱼星形胶质细胞系。
本发明还提供了上述尼罗罗非鱼星形胶质细胞系在制备罗非鱼湖病毒病原分析试剂和/或疫苗研发中的应用。
本发明还提供了上述尼罗罗非鱼星形胶质细胞系在作为罗非鱼血脑屏障的体外模型中的应用。
有益效果：本发明提供了一种尼罗罗非鱼星形胶质细胞系的构建方法，针对尼罗罗非鱼脑组织，采用胰酶消化法分离脑组织细胞，可以在一定程度上减少上皮细胞，再利用差速贴壁法能进一步减少成纤维细胞的干扰，能更大程度保留脑组织中的胶质细胞进行原代培养，荧光免疫组化检测GFAP信号呈阳性，成功构建罗非鱼脑星形胶质细胞系，可连续传至100代以上，还能维持良好的生长状态，可冷冻保存。本发明所述尼罗罗非鱼脑星形胶质细胞系可以直接用于罗非鱼湖病毒(TiLV)的病原特征分析及疫苗开发研究，因为所述细胞系对TiLV具有敏感性，病毒接种后出现细胞病变，电镜观察可发现增殖的病毒粒子，感染病毒的细胞经巢式PCR检测结果检测呈阳性。在本发明实施例中，还利用所述细胞系为模型细胞，在Trans-well insert中培养，尼罗罗非鱼星形胶质细胞系在Trans-well模型中表现出良好的屏障特性，能作为罗非鱼血脑屏障的体外模型，使用无乳链球菌感染星形胶质细胞模拟的血脑屏障，能更清楚、准确反映无乳链球菌穿透血脑屏障的特性。本发明细胞系可运用于罗非鱼无乳链球菌脑膜炎机制及鱼源链球菌病的渔药开发研究。
附图说明
图1为尼罗罗非鱼星形胶质细胞形态，其中A：传代10代，B：传代30代，C：传代50代，D：传代65代；
图2为尼罗罗非鱼星形胶质细胞荧光免疫组化结果；
图3为尼罗罗非鱼星形胶质细胞培养条件的优化，其中A：28℃条件下不同血清浓度对细胞生长的影响；B：温度对细胞生长的影响；
图4为尼罗罗非鱼星形胶质细胞对TiLV病毒敏感性实验结果；
图5为巢式PCR检测TiLV感染的尼罗罗非鱼星形胶质细胞，其中泳道1：健康的尼罗罗非鱼星形胶质细胞RNA；泳道2：感染TiLV的尼罗罗非鱼星形胶质细胞RNA；泳道3：TiLV阳性对照；泳道4：阴性对照；
图6为透射电镜检测感染TiLV的尼罗罗非鱼星形胶质细胞病毒颗粒；
图7为尼罗罗非鱼星形胶质细胞在Trans-well insert聚酯膜上的形态观察及细胞电阻测定，其中A：Trans-well insert聚酯膜；B：尼罗罗非鱼星形胶质细胞生长于聚酯膜(中央)；C：尼罗罗非鱼星形胶质细胞在聚酯膜(边缘)；D：7天连续测定尼罗罗非鱼星形胶质细胞的电阻值；
图8为尼罗罗非鱼星形胶质细胞在Trans-well insert聚酯膜上的形态观察及细胞电阻测定，其中A：无乳链球菌感染聚酯膜上的TA-02细胞的形态学观察；B：24孔板中无乳链球菌感染后的尼罗罗非鱼星形胶质细胞形态；C：大肠杆菌和无乳链球菌对尼罗罗非鱼星形胶质细胞聚酯膜的穿透率。
具体实施方式
本发明提供了一种尼罗罗非鱼星形胶质细胞系的构建方法，包括以下步骤：利用胰酶对尼罗罗非鱼的脑组织进行消化，分离细胞后利用差速贴壁法纯化细胞，收集纯化的细胞进行原代培养和传代培养，得尼罗罗非鱼星形胶质细胞系。
本发明采用胰酶消化法分离脑组织细胞，可以在一定程度上减少上皮细胞，本发明所述脑组织在进行消化前，优选还包括将无菌解剖出的罗非鱼脑组织，在含有青霉素、链霉素和两性霉素B的PBS中涮洗，剪碎后进行所述消化。本发明对所述无菌解剖的方法并没有特殊限定，优选包括于无菌超净工作台中，无菌解剖取出罗非鱼脑组织。本发明对无菌解剖出的罗非鱼脑组织进行涮洗，所述涮洗优选包括在含有青霉素、链霉素和两性霉B的PBS中涮洗3次，每次3min。在本发明中，所述青霉素、链霉素和两性霉素B优选以混合液的形式存在，称之为青霉素-链霉素-两性霉素B溶液，本发明优选配制100X的母液，在使用时进行相应倍数的稀释即可。本发明所述青霉素-链霉素-两性霉素B溶液(100X)的配制方法，优选包括：用0.9％氯化钠配制，青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml，两性霉素B的含量为25μg/ml。本发明所述涮洗的PBS溶液中优选青霉素-链霉素-两性霉素B溶液的终浓度优选为5X。
本发明将经涮洗的脑组织剪碎后置于含有EDTA的胰酶溶液中，待消化结束后过滤收集细胞。本发明所述胰酶溶液中EDTA的质量百分含量优选为0.25％，所述消化优选在室温下进行，所述室温优选为23～25℃；所述消化的时间优选为25min。本发明过滤并收集消化后的细胞，所述过滤优选使用无菌细胞筛(40μm)过滤，将筛下的液体再离心，所述离心的离心力优选为400g，所述离心的时间优选为3min。
本发明对过滤并收集消化的细胞进行差速贴壁，所述差速贴壁能进一步减少成纤维细胞的干扰，能更大程度保留脑组织中的胶质细胞进行原代培养，并且星形胶质细胞贴壁慢，通过差速贴壁法可达到纯化细胞的效果。
本发明所述差速贴壁法，优选包括将分离得到的细胞与无血清罗非鱼脑细胞培养液混合制成第一细胞悬液，转入细胞培养瓶中第一静置培养30min，收集第一未贴壁细胞；
将收集的第一未贴壁细胞与无血清罗非鱼脑细胞培养液混合制成第二细胞悬液，转入新的细胞培养瓶，第二静置培养30min，收集第二未贴壁细胞，得到纯化的细胞。
本发明所述无血清罗非鱼脑细胞培养液优选为含青霉素、链霉素和两性霉素B的L-15培养基，pH值为7.0～7.4；所述无血清罗非鱼脑细胞培养液中青霉素的含量为0.1kU/ml，链霉素的含量为0.1mg/ml，两性霉素B的含量为0.25μg/ml，实施例中以含青霉素-链霉素-两性霉素B溶液(1X)的L-15培养基进行表示。本发明对所述L-15培养基的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售商品即可。本发明所述第一未贴壁细胞和第二未贴壁细胞优选均通过离心的方式进行收集，所述离心优选包括在400g离心5min。在本发明中，两次贴壁培养的温度并不相同，所述第一静置培养的温度优选为24～26℃，第二静置培养的温度优选为28℃。
本发明对经所述差速贴壁法进行纯化后的细胞进行原代培养，所述原代培养优选包括将所述纯化的细胞与罗非鱼脑细胞培养液混合，28℃培养。本发明所述罗非鱼脑细胞培养液优选为含有胎牛血清、青霉素、链霉素和两性霉素B的L-15培养基，pH值为7.0～7.4，所述罗非鱼脑细胞培养液中胎牛血清的质量百分含量为20％；所述罗非鱼脑细胞培养液中青霉素的含量为0.1kU/ml，链霉素的含量为0.1mg/ml，两性霉素B的含量为0.25μg/ml；实施例中以罗非鱼脑细胞培养液(含有20％胎牛血清，青霉素-链霉素-两性霉素B溶液(1X)的L-15培养基，pH为7.0～7.4)进行表示。
本发明在所述细胞初次贴壁后每隔2～3天吸走一半体积的培养液，补充所述罗非鱼脑细胞培养液；当原代细胞长满培养瓶底时，移除细胞培养液，用无菌PBS润洗细胞瓶内的贴壁细胞，移除PBS，加入含0.25％EDTA胰酶，置于37℃培养箱消化5～7min，轻轻拍击细胞培养瓶使细胞脱落，400g离心5min收集细胞，去上清，加入罗非鱼脑细胞培养液(含有10～20％胎牛血清，青霉素-链霉素-两性霉素B溶液(1X)的L-15培养基，pH为7.0～7.4)重悬细胞，将重悬细胞进行传代培养。
本发明在所述传代培养时，优选于10代之前选用含有20％胎牛血清的罗非鱼脑细胞培养液，10代之后胎牛血清的含量降低至10％。30代之前传代培养为半换液方式，收集旧培养液(原代细胞长满培养瓶底时的细胞培养液，800g离心5min，收集上清)，传代过程在细胞悬液中补充总体积一半的旧培养基。本发明在进行上述培养时，无需添加生长因子，在胰酶消化和差速贴壁筛选后，原代细胞中内皮细胞很少，后续传代后剩下的主要为胶质细胞，因此未考虑添加生长因子。
本发明还提供了利用上述构建方法得到的尼罗罗非鱼星形胶质细胞系。
本发明所述尼罗罗非鱼星形胶质细胞系，原代培养过程中，30代之前以纤细的纤维样形态为主，30代后成纤维样细胞逐渐凋亡，被生长稳定，形态规则的扁平上皮样细胞替代(图1)，荧光免疫组化检测SOX2、Notch1、HES1、E-cadherin、Occlding、Sox10和GFAP蛋白信号呈现阳性(图2)，证实尼罗罗非鱼星形胶质细胞系成功构建。本发明成功构建的尼罗罗非鱼星形胶质细胞系对罗非鱼湖病毒具有敏感性，病毒接种后出现细胞病变，电镜观察可发现增殖的病毒粒子，感染病毒的细胞经巢式PCR检测结果检测呈阳性。本发明细胞系可以直接用于TiLV的病原特征分析及疫苗开发研究。
本发明实施例中，还以尼罗罗非鱼脑星形胶质细胞系为模型细胞，在Trans-wellinsert中培养，尼罗罗非鱼星形胶质细胞系在Trans-well模型中表现出良好的屏障特性，能作为罗非鱼血脑屏障的体外模型。使用无乳链球菌感染星形胶质细胞模拟的血脑屏障，能更清楚、准确反映无乳链球菌穿透血脑屏障的特性。本发明细胞系可运用于罗非鱼无乳链球菌脑膜炎机制及鱼源链球菌病的渔药开发研究。
本发明还提供了上述尼罗罗非鱼星形胶质细胞系在制备罗非鱼湖病毒病原分析试剂和/或疫苗研发中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
本发明还提供了上述尼罗罗非鱼星形胶质细胞系在作为罗非鱼血脑屏障的体外模型中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种尼罗罗非鱼星形胶质细胞系及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
所用材料及试剂来源：L-15培养液(GIBCO)，胎牛血清(GIBCO)，含0.25％EDTA胰酶(Sigma)；
青霉素-链霉素-两性霉素B溶液(100X)：用0.9％氯化钠配制，青霉素的含量为10kU/ml，链霉素的含量为10mg/ml，两性霉素B的含量为25μg/ml。
一、尼罗罗非鱼脑星形胶质细胞系的构建方法，包括以下步骤：
组织消化：于无菌超净工作台中，无菌解剖取出罗非鱼脑组织，在含有青霉素、链霉素和两性霉(5X)的PBS中涮洗3次，每次3min，剪碎后放入含0.25％EDTA胰酶中室温消化25min，使用无菌细胞筛(40μm)过滤，400g离心3min收集消化过滤后的细胞。
差速贴壁：将上述收集到的细胞加入无血清罗非鱼脑细胞培养液(含青霉素-链霉素-两性霉素B溶液(1X)的L-15培养基，pH为7.0～7.4)制成细胞悬液，转入25cm2细胞培养瓶中，24～26℃细胞培养箱中静置30min。离心收集未贴壁细胞，将收集的细胞加入无血清罗非鱼脑细胞培养液制成细胞悬液，转入新的25cm2细胞培养瓶，28℃细胞培养箱中静置30min。收集未贴壁细胞，加入罗非鱼脑细胞培养液(含有20％胎牛血清，青霉素-链霉素-两性霉素B溶液(1X)的L-15培养基，pH为7.0～7.4)于另一新的25cm2细胞培养瓶，28℃细胞培养箱中进行原代培养。
传代培养：初次贴壁后每隔2～3天吸走一半体积的培养液，补充罗非鱼脑细胞培养液。当原代细胞长满培养瓶底时，移除细胞培养液，用无菌PBS润洗细胞瓶内的贴壁细胞，移除PBS，加入含0.25％EDTA胰酶，置于37℃培养箱消化5～7min，轻轻拍击细胞培养瓶使细胞脱落，400g离心5min收集细胞，去上清，加入罗非鱼脑细胞培养液(含有10～20％胎牛血清，青霉素-链霉素-两性霉素B溶液(1X)的L-15培养基，pH为7.0～7.4)重悬细胞，将重悬细胞进行传代培养。10代之前的罗非鱼脑细胞培养液应含有20％胎牛血清。10代之后将罗非鱼脑细胞培养液血清含量减少至10％。30代之前传代培养为半换液方式，收集旧培养液(原代细胞长满培养瓶底时的细胞培养液，800g离心5min，收集上清)，传代过程在细胞悬液中补充总体积一半的旧培养基。
二、罗非鱼脑星形胶质细胞系的冻存与复苏
细胞冻存：用胰酶消化法收集1瓶25cm2细胞培养瓶中处于对数生长期的罗非鱼脑星形胶质细胞，400g离心5min后弃上清，用2mL冻存保护液(含90％胎牛血清和10％DMSO)将细胞重悬后置于冻存管中，将冻存管置于细胞冻存盒中于-80度过夜，最后保存至液氮(-196℃)中。
细胞复苏：从液氮罐中取出一管细胞，迅速置于37℃水浴锅中解冻，加入2mL罗非鱼脑细胞培养液混匀，400g离心5min，去上清。用2mL完全培养培养基重悬细胞，移入25cm2培养瓶，补充2mL罗非鱼脑细胞培养液，置于28℃培养箱中培养，24h后更换新鲜完全培养基，继续培养。
本发明中培养的尼罗罗非鱼星形胶质细胞，原代培养过程中，30代之前以纤细的纤维样形态为主，30代后成纤维样细胞逐渐凋亡，被生长稳定，形态规则的扁平上皮样细胞替代(图1)，能液氮冻存后能够复苏，适用于后续研究。
三、罗非鱼脑星形胶质细胞系生长特性测定
(1)罗非鱼脑星形胶质细胞系标准生长曲线
0.25％EDTA胰酶消化细胞后，400g离心5min，加入10％FBS的L-15培养液重悬细胞；血球计数板计数后，10倍梯度稀释7次，加入96孔板中，加入CCK-8试剂于28℃培养箱中孵育2h，测定OD450，绘制标准曲线。
(2)罗非鱼脑星形胶质细胞系最适培养基和血清浓度确定
分别配置FBS浓度为5％、10％、15％、20％的L-15培养液和FBS浓度为10％的DMEM培养液。调整细胞密度为1×105/个/mL，不同血清浓度的L-15培养液和FBS浓度为10％的DMEM培养液按以按照100μL/孔的量接种于96孔板，于28℃培养箱中培养。每日从实验组中取出3孔细胞，更换对应的培养液，加入CCK-8试剂于28℃培养箱中孵育2h后测定细胞孔OD450，根据标准曲线绘制细胞生长曲线(见图3中A)。
(3)罗非鱼脑星形胶质细胞系最适合培养温度确定
选择18℃，23℃，28℃，33℃，37℃五个不同培养温度。使用FBS浓度为10％的L-15培养液。调整细胞密度为1×105/个/mL，FBS浓度为10％的L-15培养液按照100μL/孔的量接种于96孔板，于不同温度培养箱中培养。每日从实验组中取出3孔细胞，更换新鲜的FBS浓度为10％的L-15培养液，加入CCK-8试剂于不同温度培养箱中孵育2h后测定细胞孔OD450，根据标准曲线绘制细胞生长曲线(见图3中B)。
实施例2
荧光免疫组化鉴定实施例1得到的尼罗罗非鱼脑星形胶质细胞系抗体信息：Anti-SOX2 Antibody(BA3292)，anti-notch1-antibody(BA2743-2)，Anti-SOX10Antibody(A00758-1)购于武汉博士德生物工程有限公司，HES1 RabbitpAb(A11718)，E-CadherinRabbitpAb(A11492)，Occludin Rabbit pAb(A2601)，GFAP Rabbit pAb(A0237)，FITC GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)(AS011)购于武汉爱博泰克生物科技有限公司。
(1)在24孔板中加入细胞爬片。调整罗非鱼脑星形胶质细胞密度为1×105/个/mL，FBS浓度为10％的L-15培养液按照500μL/孔的量接种于24孔板，于28℃培养箱中培养72h。
(2)将细胞培养液体从24孔板中吸出，使用PBS清洗爬片3次，每次1min。吸走PBS后加入冰冻的4％多聚甲醛固定30min。PBS清洗样本3次，每次2min。
(3)加入95℃预热的抗原修复液(上海碧云天生物有限公司)，95℃烘箱中孵育20min。从烘箱取出，待抗原修复液自然冷却到室温，弃上清，使用PBS清洗三次，每次2min。0.5％Triton X-100孵育20min。PBS清洗样本，每次2min。
(4)使用抗体封闭液(上海碧云天生物有限公司)封闭30min。
(5)按1:200比例用PBS稀释一抗，每孔加入200uL稀释后的抗体。室温孵育3h，阴性对照加入PBS。
(6)吸走一抗，用PBS清洗3次，每次5min。
(7)按1：200比例用PBS稀释FITC GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)二抗，每孔加入200μL稀释后的抗体。室温孵育1h。
(8)移除二抗，用PBS清洗3次，每次5min。
(9)将细胞爬片从24孔板中夹出，在载玻片中滴加一滴带DAPI的封片剂，封片后置于荧光显微镜下观察。
检测结果如图2所示，SOX2、Notch1、HES1、E-cadherin、Occlding、Sox10和GFAP蛋白信号呈现阳性。
实施例3
实施例1得到的尼罗罗非鱼脑星形胶质细胞系对病毒的感染实验
(1)TiLV病毒悬液解冻后，用无血清培养基进行10倍稀释。接种到生长约24h内长满单层细胞的96孔细胞板中，每种病毒接三个孔，每孔25μL，25℃吸附1h后，加入75μL完全细胞培养基，置于25℃培养箱中。实验中包三孔空白对照(未接种任何病毒的细胞)。7d内每天用100倍倒置显微镜观察。
(2)用戊二醛固定后电镜观察。
(3)使用TiLV特异性引物(Nested-1(SEQ ID NO.1)：TATGCAGTACTTTCCCTGCC，ME1(SEQ ID NO.2)：GTTGGGCACAAGGCATCCTA，ME2(SEQ ID NO.3)：TATCACGTGCGTACTCGTTCAGT)进行巢式PCR检测。
一轮条件如下：2×PreMix ExTaq 25μL，cDNA模板2μL，Nested-1/ME1各2μL，ddH2O19μL，Total 50μL。PCR程序为94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，32个循环；72℃10min，4℃forever。
二轮条件：2×PreMix ExTaq 25μL，一轮产物1μL，ME1/ME2各2μL，ddH2O 20μL，Total 50μL。PCR程序为94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，4℃forever。
检测结果如图4～6所示，与未感染TiLV的尼罗罗非鱼星形胶质细胞相比较，感染TiLV后的尼罗罗非鱼湖病毒出现了明显的细胞病变效应CPE(图4)，尼罗罗非鱼星形胶质细胞出现空泡样，细胞皱缩脱落。利用TiLV特异性引物做巢式PCR检测，结果显示感染TiLV的尼罗罗非鱼星形胶质细胞呈现信号的条带(图5)。将感染TiLV的尼罗罗非鱼星形胶质细胞做电镜切片观察，可以观察到样品中存在TilV晶状病毒粒子(如图6)。上述结果说明本发明制备的尼罗罗非鱼星形胶质细胞可用于罗非鱼湖病毒(TiLV)的培养。
实施例4
Trans-well培养实施例1得到的罗非鱼脑星形胶质细胞系模拟血脑屏障
(1)Trans-well培养罗非鱼脑星形胶质细胞系：提前一晚拿出基质胶，放冰上置于4℃冰箱融化。使用预冷的枪头按1:8的比例用预冷的无血清L-15培养基稀释基质胶。将稀释好的基质胶，每孔50μL添加到Trans-well insert的聚酯纤维膜上，置于37℃，4h，凝固后膜变白色。
接种细胞前，用完全培养基润洗一下铺有基质胶的聚酯纤维膜。每孔按1×104的量接种细胞，接种细胞24h后换液。将Trans-well insert聚酯纤维膜小心剪下，4％甲醛室温固定30min。用PBS洗剂三次，每次2min。使用0.4％的结晶紫染色15min，15min后用PBS洗剂三次，每次2min。将染色后的聚酯纤维膜置于载玻片上，树脂封片，显微镜观察。
(2)细胞电阻值测定：提前一晚拿出基质胶，放冰上置于4℃冰箱融化。使用预冷的枪头按1:8的比例用预冷的无血清L-15培养基稀释基质胶。将稀释好的基质胶，每孔50μL添加到Trans-well insert的聚酯纤维膜上，置于37℃，4h，凝固后膜变白色。接种细胞前，用完全培养基润洗铺有基质胶的聚酯纤维膜。调整细胞密度为1×105个/mL，每孔按100μL的量接种细胞，接种细胞24h后换液。换液后使用细胞电阻仪器每日测量细胞电阻值变化，对照孔为无细胞但是铺有基质胶的聚酯纤维膜。
(3)细菌穿透实验：在Trans-well板中接种细胞，使用无双抗L-15培养基。提前一晚拿出基质胶，放冰上置于4℃冰箱融化。使用预冷的枪头按1:8的比例用预冷的无血清L-15培养基稀释基质胶。将稀释好的基质胶，每孔50μL添加到Trans-well insert的聚酯纤维膜上，置于37℃，4h，凝固后膜变白色。接种细胞前，用完全培养基润洗铺有基质胶的聚酯纤维膜。调整细胞密度为1×105个/mL，每孔按100μL的量接种细胞，接种细胞24h后换液。取过夜培养的无乳链球菌ZQ0910和大肠杆菌DH5α，用PBS洗剂三次，调整细菌密度为5×105CFU/mL，在Trans-well insert的聚酯纤维中央加入5μL稀释的细菌悬液，置于28℃培养箱中。分别在1h、2h和4h，将聚酯纤维膜小心剪下，4％甲醛室温固定30min。用PBS洗剂三次，每次2min。使用0.4％的结晶紫染色15min，15min后用PBS洗剂三次，每次2min。将染色后的聚酯纤维膜置于载玻片上，树脂封片，显微镜观察。同时分别在1h、2h和4h，吸取10μL于Trans-well chamber的培养基，涂布于不含抗性的BHI和LB平板中，平板置于28℃培养12h后开始菌落计数。细菌穿透率＝平板菌落数×50/细菌接种量，细菌穿透率以均数±标准差(SD)表示。采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义(P<0.01，极显著)。
(4)无乳链球菌ZQ0910对尼罗罗非鱼星形胶质细胞系的细胞毒性实验：调整罗非鱼脑星形胶质细胞密度为1×105/个/mL，FBS浓度为10％的L-15培养液按照500μL/孔的量接种于24孔板，于28℃培养箱中培养48h。更换新鲜的FBS浓度为10％的L-15培养液，取过夜培养的无乳链球菌ZQ0910，用PBS洗剂三次，调整细菌密度为5×105CFU/mL，在24孔板中加入5μL稀释的细菌悬液。分别在1h、2h和4h观察细胞形态。
检测结果如图7～8所示，在Trans-well insert内添加基质胶后，尼罗罗非鱼星形胶质细胞系能形成致密的细胞连接(图7中ABC)，并表现出明显的电阻特征(图7中D)。Transwell-TA-02模拟的血脑屏障，对大肠杆菌DH5α具有明显的阻拦作用，阻拦的效果达到90％，长有尼罗罗非鱼星形胶质细胞系的Trans-well insert，大肠杆菌DH5α透过率低于2.5％，而在未有细胞的Trans-well insert中，大肠杆菌透过率为72.31％(图8中C)。从1h开始，无乳链球菌ZQ0910可以穿透Trans-well insert上的的细胞层，细菌穿透率由29.47％提高到80.63％，与对照组无显著差异。将Trans-well insert内膜剪下，染色在显微镜下观察，结果显示无乳链球菌感染后，细胞之间的紧密连接结构产生明显的裂隙(图8中A)。在24孔板中无乳链球菌ZQ0910对尼罗罗非鱼星形胶质细胞能产生明显的细胞毒性作用，表现为细胞膨大，细胞之间紧密连接消失，细胞脱落(图8中B)。上述结果说明尼罗罗非鱼星形胶质细胞系在Trans-well模型中表现出良好的屏障特性，能作为罗非鱼血脑屏障的体外模型。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东海洋大学
<120> 一种尼罗罗非鱼星形胶质细胞系及其构建方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tatgcagtac tttccctgcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgggcaca aggcatccta 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatcacgtgc gtactcgttc agt 23

Claims (2)

1.尼罗罗非鱼星形胶质细胞系在制备罗非鱼湖病毒病原分析试剂和/或疫苗研发中的应用。
2.尼罗罗非鱼星形胶质细胞系在作为罗非鱼血脑屏障的体外模型中的应用。
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