CN109666638A - 将外周血单个核细胞诱导为cik的试剂及其所用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了将外周血单个核细胞诱导为CIK的试剂及其所用组合物。将外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物由抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL‑2、IL‑15和IL‑12组成。将外周血单个核细胞诱导为CIK的试剂包括该组合物和冻存外周血单个核细胞复苏液。将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物与对照组合物相比，从不同健康志愿者获得的CIK细胞中CD3+CD56+细胞的含量提高了72‑76％，CD3+CD8+细胞的含量提高了20‑21％。该冻存外周血单个核细胞复苏液与常规复苏液相比，可显著提高冻存人外周血单个核细胞的细胞活率，使从冻存人PBMC得到的CIK中的CD3+CD56+细胞含量提高47％。

Description

将外周血单个核细胞诱导为CIK的试剂及其所用组合物
技术领域
本发明涉及生物医药领域中将外周血单个核细胞诱导为CIK的试剂及其所用组合物。
背景技术
肿瘤免疫治疗是一种利用人体自身免疫细胞来对抗肿瘤的治疗手段，被视为抗肿瘤领域中继手术、放疗、化疗之外的第四大治疗手段。1991年，Schmidt等用多种细胞因子(IFN-γ、IL-2和抗CD3抗体)在体外联合诱导培养人外周血单个核细胞后获得一群异质细胞，该群细胞具有高效、广谱杀伤肿瘤细胞的功能，命名为细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer，CIK)。CIK为一群异质细胞，其亚群中包含了CD3+CD8+、CD3+CD56+等杀伤细胞，其中CD3+CD56+细胞是CIK中主要的效应细胞，具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀瘤的优点。与其他过继性免疫治疗细胞相比，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点。特别是对于术后清除微小转移灶、防止癌的扩散和复发、提高患者自身抗肿瘤免疫能力有重要作用。
为了获得更高纯度的CIK，并满足临床上灵活的治疗需求。需要对细胞库内冻存的人外周血单个核细胞进行复苏，并经过多因子的激活诱导和扩增，获得大量的CIK。现在冷冻保存细胞的复苏技术，通常使用含胎牛血清的培养基或单纯的基础培养基作为复苏液。由于胎牛血清为动物来源，不适于细胞产品的临床应用，而基础培养基复苏后的细胞活率较低，通常低于90％。目前IL-2，抗CD3抗体是CIK扩增中最常用的因子，但是目前存在细胞纯度低，效应细胞数量少等问题。常规技术中所扩增的CIK中效应细胞CD3+CD56+的百分数一般介于10％-40％之间，含量较低。因此，摸索一种将冻存外周血单个核细胞复苏并激活诱导为高纯度的CIK的方法，成为目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何从外周血单个核细胞特别是冻存的外周血单个核细胞中获得效应细胞含量高的细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。
为了解决以上技术问题，本发明提供了将外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物。
本发明所提供的将外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物由抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、IL-15和IL-12这五种细胞因子组成。
上述将外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物中，抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、IL-15和IL-12的配比可为40ng-60ng抗CD3抗体：40ng-60ng抗CD28抗体：300U-500U IL-2：10ng-30ng IL-15：10ng-30ng IL-12，如50ng抗CD3抗体：50ng抗CD28抗体：300U IL-2：20ngIL-15：20ng IL-12。
上述将外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物中，各细胞因子可以混合在一起，也可以各自独立包装，使用时再混合在一起。
上述将外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物，与常规组合物相比，获得的CIK中CD3+CD56+细胞的含量提高了72％-76％，CD3+CD8+细胞的含量提高了19％-21％；所述常规组合物由IL-2和抗人CD3抗体组成，所述常规组合物中，IL-2和抗人CD3抗体的配比可为300U IL-2：50ng抗CD3抗体。
含有上述将外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物的试剂或试剂盒也属于本发明的保护范围。所述试剂或试剂盒用于将外周血单个核细胞诱导为CIK。
上述所述试剂或试剂盒还可包括IFN-γ。
上述试剂或试剂盒中，所述IFN-γ与所述将外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物的配比可满足1000U IFN-γ：50ng抗CD3抗体。
上述试剂或试剂盒中，所述试剂或试剂盒还可包括KBM581培养基。
上述试剂或试剂盒中，所述试剂或试剂盒还可包括使冻存的人外周血单个核细胞复苏的组合物，所述使冻存的人外周血单个核细胞复苏的组合物由人血白蛋白和低分子量肝素钠组成，所述使冻存的人外周血单个核细胞复苏的组合物中，人血白蛋白和低分子量肝素钠的配比可为4mg-12mg人血白蛋白：10U低分子量肝素钠，如8mg人血白蛋白：10U低分子量肝素钠。
上述试剂或试剂盒中，所述使冻存的人外周血单个核细胞复苏的组合物中，人血白蛋白和低分子量肝素钠可以混合在一起，也可以各自独立包装，使用时再混合在一起。
上述试剂或试剂盒中，所述试剂或试剂盒还可包括冻存外周血单个核细胞复苏液，所述冻存外周血单个核细胞复苏液由KBM581培养基、人血白蛋白和低分子量肝素钠组成，所述冻存外周血单个核细胞复苏液中，人血白蛋白的含量可为8mg/ml，低分子量肝素钠的含量可为10U/ml。
上述试剂或试剂盒中，所述试剂或试剂盒还可包括扩增培养基，所述扩增培养基由KBM581培养基、IL-2、IL-15和IL-12组成，所述扩增培养基中，IL-2的含量可为200U-500U/ml、IL-15的含量可为10ng/ml-30ng/ml和IL-12的含量可为10ng/ml-30ng/ml，如IL-2的含量可为300U/ml、IL-15的含量可为20ng/ml和IL-12的含量可为20ng/ml。
上述将外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物在制备将外周血单个核细胞诱导为CIK的产品(试剂或试剂盒)中的应用也属于本发明的保护范围。
上述试剂或试剂盒在制备将外周血单个核细胞诱导为CIK的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上文中，所述外周血单个核细胞可为冻存的外周血单个核细胞。
上文中，所述外周血单个核细胞可为人外周血单个核细胞。
本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物与对照组合物相比，从不同健康志愿者获得的CIK细胞中CD3+CD56+细胞的含量为60％-63％、提高了72％-76％，CD3+CD8+细胞的含量为75％-79％、提高了20％-21％，所得细胞纯度较高。本发明的冻存外周血单个核细胞复苏液与KBM581培养基相比，可以显著提高冻存人外周血单个核细胞的细胞活率，可使从冻存人外周血单个核细胞得到的CIK中的CD3+CD56+细胞含量提高46.67％。本发明中的CIK来源于细胞库中冻存的免疫细胞，这对基于生物样本库的免疫细胞储存，提供了产业化发展的技术支撑和路径，更重要的是可为肿瘤病人和亚健康人群的治疗需求提供资源。
附图说明
图1为本发明A组复苏人外周血单个核细胞使用本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物经过14天的诱导培养所获得的CIK形态图。
图2为本发明A组复苏人外周血单个核细胞使用本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物经过14天的诱导培养所获得的CIK细胞经流式细胞仪检测CD3+CD8+、CD3+CD56+的百分含量。
图3为本发明A组复苏人外周血单个核细胞使用对照组合物经过14天的诱导培养获得的CIK细胞经流式细胞仪检测CD3+CD8+、CD3+CD56+的百分含量。
图4为作为对照的C组复苏人外周血单个核细胞使用本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物经过14天的诱导培养获得的CIK细胞经流式细胞仪检测CD3+CD8+、CD3+CD56+的百分含量。
图5为本发明的CIK细胞对K562的杀伤实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的冻存人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclearcell，PBMC)来自健康志愿者血液，采用密度梯度离心法分离获得，在北京弘润天源基因生物技术有限公司细胞库用液氮冻存3年。
下述实施例中的KBM581培养基为康宁公司产品，产品目录号为88-581-CM。人血白蛋白为奥克特珐玛AB公司(瑞典)产品，注册证号S20160037；低分子量肝素钠为辉瑞制药有限公司产品，产品目录号为国药准字J20171060；γ干扰素(IFN-γ)为peprotech产品，产品目录号为300-02。白细胞介素2(IL-2)为上海华新生物高技术有限公司的产品，产品目录号为国药准字S10970044；白细胞介素15(IL-15)为北京同立海源生物科技有限公司产品，产品目录号为TL-202；白细胞介素12(IL-12)为peprotech产品，产品目录号为200-12H；抗CD28抗体为北京同立海源生物科技有限公司产品，产品目录号为TL-102；抗CD3抗体为北京同立海源生物科技有限公司产品，产品目录号为TL-101。
实施例1、将冻存的人外周血单个核细胞诱导为CIK
本实施例提供了将冻存的人外周血单个核细胞诱导为CIK的成套试剂，该成套试剂包括各自独立包装的试剂1、试剂2、试剂3和试剂4。
试剂1是KBM581培养基。
试剂2是本发明的使冻存的人外周血单个核细胞复苏的组合物，该组合物由各自独立包装的人血白蛋白和低分子量肝素钠组成，试剂2中人血白蛋白和低分子量肝素钠的配比为8mg人血白蛋白：10U低分子量肝素钠。使用时，将本发明的使冻存的人外周血单个核细胞复苏的组合物加入KBM581培养基中得到本发明的冻存人外周血单个核细胞复苏液。本发明的冻存人外周血单个核细胞复苏液中，人血白蛋白的含量为8mg/ml，低分子量肝素钠的含量为10U/ml。
试剂3是本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物，由抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、IL-15和IL-12组成。该组合物中，抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、IL-15和IL-12的配比为50ng抗CD3抗体：50ng抗CD28抗体：300U IL-2：20ng IL-15：20ng IL-12。
试剂4是扩增培养基，该扩增培养基是向KBM581培养基中加入IL-2、IL-15和IL-12得到的液体，该扩增培养基中，IL-2的含量为300U/ml、IL-15的含量为20ng/ml和IL-12的含量为20ng/ml。
1.冻存人外周血单个核细胞的复苏
将装有编号为D1的健康志愿者的用液氮冻存3年的人外周血单个核细胞的冻存管从液氮中取出后，迅速置于40℃水浴锅中快速融化。将同一冻存管的细胞分为平等两部分，分别转至本发明的冻存人外周血单个核细胞复苏液(A组)和对照复苏液(该对照复苏液是KBM581培养基)(C组)中，细胞悬液与本发明的冻存人外周血单个核细胞复苏液或对照复苏液的体积比均为1：9。然后进行离心(300g，5min)，分别得到A组复苏人外周血单个核细胞和C组复苏人外周血单个核细胞，用KBM581培养基重悬细胞沉淀，分别得到A组复苏人外周血单个核细胞悬液和C组复苏人外周血单个核细胞悬液，台盼蓝拒染法计数细胞及活率。复苏结果如表1所示，表明采用本发明的冻存人外周血单个核细胞复苏液复苏的人外周血单个核细胞，复苏后的细胞活率高于常规组C组，两组比较具有显著性差异(p＜0.05)。
表1、A组与C组复苏后的细胞活率
2.将复苏的人外周血单个核细胞诱导为CIK实验设以下三个处理：
2.1对A组复苏人外周血单个核细胞使用本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物进行诱导
2.1.1将步骤1得到的A组复苏人外周血单个核细胞用KBM581培养基稀释至细胞密度为2.0×106个细胞/ml，接种至培养瓶内，添加IFN-γ至IFN-γ的含量为1000U/ml，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养24小时后，向培养体系中加入本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物诱导细胞，使培养体系中抗CD3抗体的含量为50ng/ml、抗CD28抗体的含量为50ng/ml、IL-2的含量为300U/ml、IL-15的含量为20ng/ml，IL-12的含量为20ng/ml。
2.1.2第4天，添加1倍体积的扩增培养基补液，继续置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
2.1.3第5-14天，每天观察细胞，将细胞转移至T175细胞培养瓶中培养，补充扩增培养基，使细胞密度保持在1-3×106个/ml，培养体积大于200ml时转入细胞培养袋。
2.1.4第14天，收获细胞：在细胞培养的第14天，镜下观察细胞的形态并收获，并留取适量细胞进行细胞的免疫表型检测和细胞杀伤能力的检测。
该细胞的形态如图1所示，培养14天的CIK细胞悬浮生长，折光性高，呈圆形或椭圆形集落样生长，为典型的培养后期CIK细胞形态。
2.2对A组复苏人外周血单个核细胞使用对照组合物进行诱导
该步骤中使用作为对照的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物(简称对照组合物)由IL-2和抗人CD3抗体组成。
2.2.1将步骤1得到的A组复苏人外周血单个核细胞用KBM581培养基稀释至细胞密度为2.0×106个细胞/ml，接种至培养瓶内，添加IFN-γ至IFN-γ的含量为1000U/ml，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养24小时后，向培养体系中加入对照组合物诱导细胞，使培养体系中抗CD3抗体的含量为50ng/ml和IL-2的含量为300U/ml。
2.2.2同2.1.2。
2.2.3同2.1.3。
2.2.4同2.1.4。
2.3对C组复苏人外周血单个核细胞使用本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物进行诱导
2.3.1将步骤1得到的C组复苏人外周血单个核细胞用KBM581培养基稀释至细胞密度为2.0×106个细胞/ml，接种至培养瓶内，添加IFN-γ至IFN-γ的含量为1000U/ml，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养24小时后，向培养体系中加入本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物诱导细胞，使培养体系中抗CD3抗体的含量为50ng/ml、抗CD28抗体的含量为50ng/ml、IL-2的含量为300U/ml、IL-15的含量为20ng/ml，IL-12的含量为20ng/ml。
2.3.2同2.1.2。
2.3.3同2.1.3。
2.3.4同2.1.4。
3.NK细胞免疫表型检测
从各组中取诱导扩增14天的CIK细胞，PBS清洗两遍，调整好细胞浓度为1×106-1×107个/ml，每管取100ul细胞悬液于流式管。向每个流式管加入CD8-PE、CD56-PE-Cy7、CD3-PerCP-Cy5.5(均购自BD biosciences)，对照管内加同型对照抗体。常温避光孵育20min，PBS洗涤2遍后上机，流式细胞仪检测各组细胞CD3、CD8、CD56的表达。
步骤2.1的流式检测结果如图2所示，步骤2.2的流式检测结果如图3所示，步骤2.3的流式检测结果如图4所示，表明对A组复苏人外周血单个核细胞使用本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物进行诱导所获得的CIK细胞中，CD3+CD8+的表达率达到了79.2％，CD3+CD56+的表达率达到了63.5％；对A组复苏人外周血单个核细胞使用对照组合物进行诱导所获得的CIK细胞中，CD3+CD8+的表达率为65.3％，CD3+CD56+的表达率为36.0％；对C组复苏人外周血单个核细胞使用本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物进行诱导所获得的CIK细胞中，CD3+CD8+的表达率达到了81.3％，CD3+CD56+的表达率为52.8％。可见，本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物与对照组合物相比，使CIK细胞中CD3+CD56+细胞的含量提高了76.39％，使CIK细胞中CD3+CD8+细胞的含量提高了21.29％，所得细胞纯度较高。本发明的冻存外周血单个核细胞复苏液与KBM581培养基相比，可以显著提高冻存人外周血单个核细胞的细胞活率，可使从冻存人外周血单个核细胞得到的CIK中的CD3+CD56+细胞含量提高46.67％。
4.杀伤能力的检测
按照同仁化学研究所乳酸脱氢酶(LDH)法检测试剂盒说明书进行操作，以髓系白血病肿瘤细胞(K562)为靶细胞，将2.1获得的CIK与K562分别按照效靶比16：1、8：1、4：1、2：1、1：1、0.5：1、0(未处理组)共培养4个小时，同时设相应的靶细胞孔、效应细胞孔和培养液空白对照孔。然后使用酶标仪检测样品在490nm的OD值，根据实验结果计算K562细胞的凋亡率。凋亡率(％)＝[(样品的吸光度-低对照的吸光度)/(高对照的吸光度-低对照的吸光度)]×100，结果见图5，本发明所获得的CIK细胞在效靶比＞2时对肿瘤细胞K562具有显著的杀伤能力，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
实施例2、将不同健康志愿者的冻存的人外周血单个核细胞诱导为CIK
将实施例1中的编号为D1的健康志愿者的用液氮冻存3年的人外周血单个核细胞分别替换为编号为D2、D3、D4和D5的健康志愿者的用液氮冻存3年的人外周血单个核细胞，其它操作均与实施例1相同。
本实施例提供了将冻存的人外周血单个核细胞诱导为CIK的成套试剂，该成套试剂包括各自独立包装的试剂1、试剂2、试剂3和试剂4。
试剂1是KBM581培养基。
试剂2是本发明的使冻存的人外周血单个核细胞复苏的组合物，该组合物由各自独立包装的人血白蛋白和低分子量肝素钠组成，试剂2中人血白蛋白和低分子量肝素钠的配比为8mg人血白蛋白：10U低分子量肝素钠。使用时，将本发明的使冻存的人外周血单个核细胞复苏的组合物加入KBM581培养基中得到本发明的冻存人外周血单个核细胞复苏液。本发明的冻存人外周血单个核细胞复苏液中，人血白蛋白的含量为8mg/ml，低分子量肝素钠的含量为10U/ml。
试剂3是本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物，由抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、IL-15和IL-12组成。该组合物中，抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、IL-15和IL-12的配比为50ng抗CD3抗体：50ng抗CD28抗体：300U IL-2：20ng IL-15：20ng IL-12。
试剂4是扩增培养基，该扩增培养基是向KBM581培养基中加入IL-2、IL-15和IL-12得到的液体，该扩增培养基中，IL-2的含量为300U/ml、IL-15的含量为20ng/ml和IL-12的含量为20ng/ml。
1.冻存人外周血单个核细胞的复苏
将装有编号为D2-D5的健康志愿者的用液氮冻存3年的人外周血单个核细胞的冻存管从液氮中取出后，迅速置于40℃水浴锅中快速融化。分别将同一冻存管的细胞分为平等两部分，分别转至本发明的冻存人外周血单个核细胞复苏液(A组)和对照复苏液(该对照复苏液是KBM581培养基)(C组)中，细胞悬液与本发明的冻存人外周血单个核细胞复苏液或对照复苏液的体积比均为1：9。然后进行离心(300g，5min)，分别得到A组复苏人外周血单个核细胞和C组复苏人外周血单个核细胞，用KBM581培养基重悬细胞沉淀，分别得到A组复苏人外周血单个核细胞悬液和C组复苏人外周血单个核细胞悬液，台盼蓝拒染法计数细胞及活率。
冻存的人外周血单个核细胞的复苏结果如表2所示，表明采用本发明的冻存人外周血单个核细胞复苏液复苏的人外周血单个核细胞，复苏后的细胞活率高于常规组C组，两组比较具有显著性差异(p＜0.05)。
表2、各健康志愿者的A组与C组复苏后的细胞活率
2.将复苏的人外周血单个核细胞诱导为CIK实验设以下两个处理：
2.1对A组复苏人外周血单个核细胞使用本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物进行诱导
2.1.1将步骤1得到的A组复苏人外周血单个核细胞用KBM581培养基稀释至细胞密度为2.0×106个细胞/ml，接种至培养瓶内，添加IFN-γ至IFN-γ的含量为1000U/ml，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养24小时后，向培养体系中加入本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物诱导细胞，使培养体系中抗CD3抗体的含量为50ng/ml、抗CD28抗体的含量为50ng/ml、IL-2的含量为300U/ml、IL-15的含量为20ng/ml，IL-12的含量为20ng/ml。
2.1.2第4天，添加1倍体积的扩增培养基补液，继续置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
2.1.3第5-14天，每天观察细胞，将细胞转移至T175细胞培养瓶中培养，补充扩增培养基，使细胞密度保持在1-3×106个/ml，培养体积大于200ml时转入细胞培养袋。
2.1.4第14天，收获细胞：在细胞培养的第14天，镜下观察细胞的形态并收获，并留取适量细胞进行细胞的免疫表型检测和细胞杀伤能力的检测。
该细胞的形态如图1所示，表明培养14天的CIK细胞悬浮生长，折光性高，呈圆形或椭圆形集落样生长为典型的CIK细胞，收获的细胞为CIK。
2.2对A组复苏人外周血单个核细胞使用对照组合物进行诱导
该步骤中使用作为对照的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物(简称对照组合物)由IL-2和抗人CD3抗体组成。
2.2.1将步骤1得到的A组复苏人外周血单个核细胞用KBM581培养基稀释至细胞密度为2.0×106个细胞/ml，接种至培养瓶内，添加IFN-γ至IFN-γ的含量为1000U/ml，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养24小时后，向培养体系中加入对照组合物诱导细胞，使培养体系中抗CD3抗体的含量为50ng/ml和IL-2的含量为300U/ml。
2.2.2同2.1.2。
2.2.3同2.1.3。
2.2.4同2.1.4。
3.NK细胞免疫表型检测
从各组中取诱导扩增14天的CIK细胞，PBS清洗两遍，调整好细胞浓度为1×106-1×107个/ml，每管取100ul细胞悬液于流式管。向每个流式管加入CD8-PE、CD56-PE-Cy7、CD3-PerCP-Cy5.5(均购自BD biosciences)，对照管内加同型对照抗体。常温避光孵育20min，PBS洗涤2遍后上机，流式细胞仪检测各组细胞CD3、CD8、CD56的表达。结果如表3所示，表明，本发明的将人外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物与对照组合物相比，从不同健康志愿者获得的CIK细胞中CD3+CD56+细胞的含量提高了72％-76％，CD3+CD8+细胞的含量提高了20％-21％，所得细胞纯度较高。
表3、各健康志愿者的两种处理培养14天的CIK细胞表型
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.将外周血单个核细胞诱导为CIK的组合物，其特征在于：所述组合物由抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、IL-15和IL-12组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物中，抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、IL-15和IL-12的配比为40ng-60ng抗CD3抗体：40ng-60ng抗CD28抗体：300U-500U IL-2：10ng-30ng IL-15：10ng-30ng IL-12，如50ng抗CD3抗体：50ng抗CD28抗体：300U IL-2：20ng IL-15：20ng IL-12。
3.含有权利要求1或2所述的组合物的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于将外周血单个核细胞诱导为CIK。
4.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒包括IFN-γ。
5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒包括KBM581培养基。
6.根据权利要求4或5所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒包括使冻存的人外周血单个核细胞复苏的组合物，所述使冻存的人外周血单个核细胞复苏的组合物由人血白蛋白和低分子量肝素钠组成，所述使冻存的人外周血单个核细胞复苏的组合物中，人血白蛋白和低分子量肝素钠的配比为8mg人血白蛋白：10U低分子量肝素钠。
7.根据权利要求4或5所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒包括冻存外周血单个核细胞复苏液，所述冻存外周血单个核细胞复苏液由KBM581培养基、人血白蛋白和低分子量肝素钠组成，所述冻存外周血单个核细胞复苏液中，人血白蛋白的含量为8mg/ml，低分子量肝素钠的含量为10U/ml。
8.根据权利要求4-7中任一所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂或试剂盒包括扩增培养基，所述扩增培养基由KBM581培养基、IL-2、IL-15和IL-12组成，所述扩增培养基中，IL-2的含量为200U-500U/ml、IL-15的含量为10ng/ml-30ng/ml和IL-12的含量为10ng/ml-30ng/ml，如IL-2的含量为300U/ml、IL-15的含量为20ng/ml和IL-12的含量为20ng/ml。
9.权利要求1或2所述的组合物在制备将外周血单个核细胞诱导为CIK的产品中的应用。
10.权利要求3-8中任一所述的试剂或试剂盒在制备将外周血单个核细胞诱导为CIK的产品中的应用。
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CN111676193A (zh) * 2020-06-19 2020-09-18 珠海贝索细胞科学技术有限公司 一种冻存人pbmc复苏液及复苏方法

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