CN107603952A - 一种大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：(1)组织处理器械消毒；(2)选取2～3月的雄性SD大鼠，麻醉处死，用手术剪分离嗅黏膜组织，将组织放入预冷无菌含双抗的PBS液中洗涤数次除去血渍和外膜；(3)剪碎组织，并用预热的中性酶和胰蛋白酶分别消化；(4)终止消化，离心，弃上清；(5)人工贴壁法接种到包被后的培养瓶；(6)孵育1～2h后，置于37℃、5％CO₂环境中培养；(7)细胞纯化(8)细胞形态学观察；(9)细胞传代培养；(10)细胞计数及存活率测定；(11)免疫学鉴定。本发明提供的一种大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法，操作简单，所得细胞数量多，成活率高，是一种理想的大鼠嗅鞘细胞原代分离与培养方法，为实验提供可靠的细胞资源。

Description

一种大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法

技术领域

本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法。

背景技术

嗅黏膜是一种假复层柱状上皮，内含多种细胞成分，主要有嗅神经元、支持细胞等。嗅黏膜中有成纤维细胞、上皮细胞、嗅鞘细胞。嗅鞘细胞(olfactoryensheathing cells，OECs)是一种独特的中枢神经胶质细胞，分布于嗅球和鼻腔嗅黏膜。在功能上介于施旺细胞和少突胶质细胞之间。嗅鞘细胞具有抑制胶质生长、神经营养、瘢痕形成、成鞘作用等。为轴突的生长提供适宜的微环境，是促进中枢神经再生的理想候选细胞之一。

大量实验证实嗅鞘细胞不仅能够桥接脊髓损伤的两断端，使轴突再生连接并髓鞘化，而且能够分泌大量的促进神经生长的因子，促进轴突的生长和抑制胶质瘢痕的形成。这些研究为脊髓损伤的修复带来希望，是中枢神经损伤修复研究的热点之一。

嗅黏膜由源于外胚层的嗅板和位于其底部的间充质发育、分化而来，由上皮和固有层组成。上皮内的嗅鞘细胞是初级嗅觉神经元，成体嗅黏膜内的嗅鞘细胞终生处于不断凋亡、更新之中。Devon和Doucete于1992年首次证实嗅鞘细胞可在体外培养条件下形成髓鞘。研究报道嗅鞘细胞移植到受损的成年大鼠皮质脊髓束可以促进轴突再生，脊髓功能得以改善。近年来从嗅粘膜中提取、纯化嗅鞘细胞，以其独特优势和临床应用价值，越来越受到重视。

目前已经建立的大鼠嗅鞘细胞分离培养方法多以酶消化法为主，分离得到的细胞纯度不高，并且培养时间较长。关于嗅鞘细胞的培养，目前国内外介绍的方法存在重复性差或复杂等问题，不利于实际应用。本发明旨在提供一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的大鼠嗅鞘细胞的方法，建立一套完善可靠的大鼠嗅鞘细胞体外培养技术。

发明内容

根据上述问题，本发明提供了一种大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法，该方法操作简单，细胞产量和成活率高，是一种较为理想的大鼠嗅鞘细胞原代培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。

本发明采用的的技术方案如下：

(1)将组织处理器械浸泡于浓度75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；

(2)选取2～3月的雄性SD大鼠，5％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，置于体积分数75％的乙醇中浸泡2min；

(3)将大鼠腹面向上固定于板上，头部局部乙醇消毒，无菌条件下经双侧鼻孔沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤及鼻骨，暴露鼻中隔黏膜，用眼科剪取1/3鼻中隔鼻黏膜，呈黄色与呼吸道黏膜有明显区别；

(4)用无菌镊取出组织，放入预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)PBS液(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中，培养皿置于冰上洗涤除去血渍、外膜；

(5)无菌条件下，在预冷的PBS(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中用眼科剪将嗅鞘细胞组织剪成1mm×1mm×1mm的碎块，置于无菌试管中；

(6)用37℃预热的中性酶和胰蛋白酶分别消化，每隔10min吹打一次；

(7)用10mi含10％大鼠血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、4～6μg/ml胰岛素的DMEM/F12(1∶1)混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液250～350g离心10min，去掉上清液，保留沉淀；

(8)人工贴壁法接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的培养瓶中；

(9)倒置在37℃、5％CO₂培养箱中培养1～2h，使其贴壁，沿孔边缓慢加入混合培养基，置于37℃、5％CO₂环境中继续培养，每2～3d换液一次；

(10)细胞纯化：差速贴壁法结合酶消化法。在进行两次24h差速贴壁筛选后，在倒置相差显微镜的观察下用0.25％胰蛋白酶消化纯化，去除嗅黏膜组织中的成纤维细胞和上皮细胞；

(11)细胞形态观察，3～4d细胞发生突变，长出突起，贴壁7d后形成细胞群，形态多呈双极、三极、多极，培养10～14d细胞进一步增多，细胞均质透明，胞体清亮，折光性好；

(12)细胞传代培养：弃去培养基，用PBS(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)洗涤2～3次，用0.08％的胰蛋白酶消化3～5min，倒置显微镜下观察，当细胞脱壁，回缩呈圆形，折光度降低时加入混合培养基终止消化，用吸管轻轻吹打，制成细胞悬液，按1∶3比例进行传代，记为P₁；

(13)细胞计数及存活率的测定，锥虫蓝排斥实验计算P1代细胞活细胞百分比；

(14)嗅鞘细胞免疫学鉴定，取P₁代细胞，进行GFAP和P75双染。

其中，步骤(2)所选的小鼠体重200±5g，2～3月雄性SD大鼠。

其中，步骤(4)(5)所述的PBS已4℃预冷，PBS浓度为0.01M，PH为7.2～7.4，培养皿置于无菌操作台内的冰上，是为了使组织处于无菌、低温的环境。

其中，步骤(6)所述消化环境为37℃，5％CO₂培养箱，0.1％～0.2％的中性酶消化1～2h和0.1％～0.2％的胰蛋白酶消化30～40min。

其中，步骤(6)所用的胰蛋白酶含0.01％的二乙烯四乙酸二钠以吸收组织中的Ca²⁺、Mg²⁺，从而进一步促进细胞分离。

其中，步骤(7)所述培养基为DMEM/F12(1∶1)培养基，含10％大鼠血清，100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素的双抗，5μg/ml的胰岛素。

其中，步骤(8)所述人工贴壁法是将组织均匀铺在培养瓶中。

其中，步骤(9)所述加入培养基过程应缓慢，勿使组织块漂起。

其中，步骤(10)所述酶消化纯化时当嗅鞘细胞回缩，趋于变圆时应立即吸取消化液。

有益效果

本发明建立了一种简单、高效的分离培养大鼠嗅鞘细胞的方法，所得原代细胞经细胞形态学观察与鉴定：数量多、纯度高、活性好，细胞成活率达95％以上，细胞纯度达96％以上。

本发明采用SD大鼠为材料，来源广泛。采用酶消化法和人工贴壁法相结合的分离方法，与单独贴壁法相比，其细胞迁出的速度更快，与单独的酶消化法细胞，其细胞纯度更高。两种酶分别消化，使组织得到充分消化，对细胞的损伤降到最低，有利于嗅鞘细胞贴壁和后期生长。

与单纯的酶消化法、差速贴壁法、药物法相比，本发明采用差速贴壁法联合酶消化法的纯化方法，经过两次24h的差速贴壁可以有效的去处成纤维细胞和上皮细胞，得到的嗅鞘细胞纯度在70％左右，再经过胰蛋白酶消化纯化，嗅鞘细胞通常先于成纤维细胞被消化下来，从而实现对嗅鞘细胞的纯化，本发明所得嗅鞘细胞数量多、质量稳定、重复性好。

与自然贴壁法相比较，人工贴壁法能够使嗅鞘细胞更均匀更牢固的贴附在培养瓶壁，增强了其成活能力。自然贴壁的嗅鞘细胞容易脱离培养瓶，或分散不均匀造成细胞失活。

本发明采用多聚赖氨酸包被培养瓶，细胞生长状态好，可满足大鼠嗅鞘细胞实验的要求，多聚赖氨酸包被比APES包被制作更简单，更易保存；本方法经济实用，简便易行，有利于建立体外实验模型细胞，研究嗅鞘细胞的特性，为后续的实验提供可靠的细胞资源，并且为临床开展不同类型嗅鞘细胞功能结构变化以及治疗等方面的研究提供基础。

附图说明

图1培养7d的大鼠嗅鞘细胞图片，200×

图2培养7d的大鼠嗅鞘细胞图片，400×

图3培养7d的大鼠嗅鞘细胞免疫荧光图片，200×

图4培养7d的大鼠嗅鞘细胞核染色图片，200×

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合附图和实例对本发明进行详细说明，本发明的保护内容不限于下述实施例。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

本实验所用的实验仪器与试剂如下：

外科手术器械一套，倒置显微镜(XDS-1A，上海)，荧光显微镜(Leica，美国)，低温离心机(TD24B-WS，上海)，超低温冰箱(中科美菱)，移液枪(Eppendorf，美国)，电子分析天平(Sartorius，美国)，超净工作台(HJ-CJ-1D，上海)，CO₂细胞培养箱(SANYO MCO-17AI，日本)。

P75抗体购于Sigma公司，山羊抗兔IgG购于Sigma公司，DMEM/F12(1∶1)购于Corning公司，EDTANa₂购于Sigma公司，青霉素-链霉素双抗于Gibco购买，大鼠血清购买于Bioind公司，多聚赖氨酸购买于美国Gibco公司，Thy1.1抗体购于Sigma公司，PBS自制(8.0gNal、0.2gKCl、0.2gKH₂PO₄、1.44gNa₂HPO₄溶于1000ml去离子水中，调整PH为7.2～7.4，非特殊指出，本专利所用的PBS皆为此配方)，中性酶和胰蛋白酶购买于德国Serva公司，细胞培养瓶、离心管购于美国Corning公司，锥虫蓝购买于美国Biofer。

本发明提供的技术方案包括如下步骤：

1.将组织处理器械浸泡于体积分数75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干，选取2～3月的雄性SD大鼠，5％戊巴比妥钠麻醉处死，置于体积分数75％的乙醇中浸泡2min；

2.将大鼠腹面向上固定于板上，头部局部乙醇消毒，无菌条件下经双侧鼻孔沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤及鼻骨，暴露鼻中隔黏膜，用眼科剪取1/3鼻中隔鼻黏膜，呈黄色，与呼吸道黏膜有明显区别；

3.将组织放入预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)PBS液(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中，培养皿置于冰上洗涤除去血渍，去除外膜；

4.在无菌条件下，在预冷的PBS(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中用眼科剪将嗅鞘组织剪成1mm×1mm×1mm的碎块，置于无菌试管中；

5.用37℃预热的0.15g/l的中性酶于37℃，CO₂培养箱消化1.5h，中性酶消化过程中每隔15min吹打一次，再用含二乙烯四乙酸二钠(0.01％EDTANa₂)的0.15g/l的胰蛋白酶消化35min，胰蛋白酶消化过程中每隔10min吹打一次；

6.加入10ml含10％大鼠血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、5μg/ml胰岛素、pH为7.4的DMEM/F12(1∶1)混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液300g离心10min，去掉上清液，保留沉淀；

7.人工贴壁法将沉淀细胞接种至铺多聚赖氨酸包被的的培养瓶中，用玻璃棒将组织细胞均匀贴于培养瓶底部，使之牢固的黏附在培养瓶底部；

8.在37℃、5％CO₂培养箱中培养1～2h，使其贴壁，沿孔边缓慢加入DMEM/F12(1∶1)混合培养基，置于37℃、5％CO₂环境中继续培养，每隔2～3d换一次培养液，通过换液去除未贴壁的组织块；

9.细胞纯化：差速贴壁法结合酶消化法。将消化好的细胞悬液种植于培养皿中，37℃静置24h，轻轻振荡平皿后用吸管将未贴壁的细胞悬液吸出，重新种植于另一平皿，在进行两次24h差速贴壁筛选后，在倒置相差显微镜的观察，在无杂质细胞的区域做标记，用吸管在上面滴少量0.25％胰蛋白酶消化，当嗅鞘细胞突起回缩，胞体趋于变圆时，立即洗去消化液，加入DMEM/F12(1∶1)混合培养基，吹打细胞，300g离心5min，弃上清加入DMEM/F12(1∶1)混合培养基吹打，接种后正常培养；

10.细胞形态及生长情况观察：3～4d细胞发生突变，长出突起，贴壁7d后形成细胞群，形态多呈双极、三极、多极，培养10～14d细胞进一步增多，细胞均质透明，胞体清亮，折光性好；

11.细胞传代培养：当大鼠嗅鞘连续成片时可进行传代，弃去混合培养基，用PBS(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)洗涤2～3次，用0.08％的胰蛋白酶消化3～5min，倒置显微镜下观察，当细胞脱壁，回缩呈圆形，折光度降低时加入混合培养基终止消化，用吸管轻轻吹打，制成细胞悬液，按1∶3比例进行传代，记为P1，以后同样方法进行传代；

12.细胞计数及成活率测定：锥虫蓝排斥实验，吸取0.2mlP₁代细胞悬液加入0.2ml的0.4％锥虫蓝溶液，吹打均匀，然后吸取少量悬液沿细胞计数板上盖片边缘缓缓滴入，至盖片下刚好充满悬液，在倒置显微镜下观察，若细胞核未被染色则提示大鼠嗅鞘细胞存活，如细胞核被染蓝，提示大鼠嗅鞘细胞死亡，计数四个大格子细胞数(四大格细胞总数/4×10⁴)，计算细胞成活率：活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100％；

13.嗅鞘细胞免疫学鉴定，取P₁代细胞，进行GFAP和P75双染。将培养10d的嗅鞘细胞培养瓶中的培养液洗去，用PBS(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)洗涤2～3次，加入体积分数10％的甲醛固定细胞，室温下放置30min，洗去甲醛液，用PBS振荡洗涤3次，5min/次，在盖玻片细胞表面滴加体积分数10％正常羊血清封闭非特异性抗原60min，封闭完成后将羊血清吸出，分别加入GFAP和P75的第一抗体，GFAP第一抗体的滴度为1∶200，P75第一抗体滴度为1∶50，在37℃温箱中孵育2h或4℃下过夜，再用PBS振荡洗涤3次，5min/次，吸干后加入抗兔和抗小鼠荧光第二抗体，滴度均为1∶400，37℃下孵育60min，再用PBS振荡洗涤3次，5min/次，吸干后明胶封固。

高倍下计数300个细胞，大鼠嗅鞘细胞纯度为96％以上。

本发明所得到的，大鼠嗅鞘细胞数量多，P₁代细胞成活率达95％以上，细胞纯度达96％以上。

本发明分离所得大鼠嗅鞘细胞可大量增殖，并且可以原代培养2～3代，为后续的实验提供可靠的细胞资源。

以上所述，仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此实施实例。任何在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将组织处理器械浸泡于浓度75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；

(2)选取2～3月的雄性SD大鼠，戊巴比妥麻醉处死，置于体积分数75％的乙醇中浸泡2min；

(3)将大鼠腹面向上固定于板上，头部局部乙醇消毒，无菌条件下经双侧鼻孔沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤及鼻骨，暴露鼻中隔黏膜，用眼科剪取1/3鼻中隔鼻黏膜，呈黄色，与呼吸道黏膜有明显区别；

(4)将组织放入预冷无菌含双抗PBS液中，培养皿置于冰上洗涤除去血渍，外膜，无菌条件下在预冷的PBS中用眼科剪将嗅鞘组织剪成1mm×1mm×1mm的碎块；

(5)用37℃预热的中性酶和含二乙烯四乙酸二钠的胰蛋白酶分别消化，每隔10min吹打一次；

(6)用含大鼠血清、双抗、胰岛素的混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液250～350g离心10min，去掉上清液，保留沉淀；

(7)人工贴壁法接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的培养瓶中；

(8)倒置在37℃、5％CO₂培养箱中培养1～2h，使其贴壁，沿孔边缓慢加入混合培养基，置于37℃、5％CO₂环境中继续培养，每2～3d换一次液；

(9)细胞纯化：差速贴壁法结合酶消化法；

(10)细胞形态及生长情况观察；

(11)细胞传代培养；

(12)细胞计数及存活率的测定；

(13)嗅鞘细胞免疫学鉴定。

2.根据权利要求1所述的大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法，其特征在于所用预冷的PBS浓度为0.01M，PH为7.2～7.4。

3.根据权利要求1所述的大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)所述消化环境为37℃，5％CO₂培养箱，0.1％～0.2％的中性酶消化1～2h，再用0.1％～0.2％的胰蛋白酶消化30～40min。

4.根据权利要求3所述的大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)所述0.15％的中性酶消化1.5h，再用含0.15％的胰蛋白酶消化35min。

5.根据权利要求4所述的大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)所述的0.15％的胰蛋白酶含有0.01％的二乙烯四乙酸二钠(EDTANa₂)。

6.根据权利要求1所述的大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(6)所述的培养基为含10％大鼠血清、含100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的双抗、4～6μg/ml胰岛素的DMEM/F12(1∶1)培养基，pH为7.4。

7.根据权利要求1所述的大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(7)所述的培养瓶用3～4μg/cm²的多聚赖氨酸包被，培养条件为37℃、5％CO₂培养箱。

8.根据权利要求1所述的大鼠嗅鞘细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(8)所述的细胞纯化方法先用两次24h差速贴壁法纯化再用0.25％胰蛋白酶消化纯化。