CN105462931B - 一种猪肠道上皮细胞系及其应用 - Google Patents

一种猪肠道上皮细胞系及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪肠道上皮细胞系及其应用，属于生物技术领域。本发明的猪上皮细胞系，其保藏号为：CGMCC NO.11496。本发明构建的能稳定传代的猪肠道上皮细胞系对PEDV高度敏感、PEDV感染的毒价可以达到104.9TCID50/mL以上，在流行毒株培养方面优于Vero细胞。能用于PEDV的分离和培养，也能用于PEDV细胞受体和致病机制的研究。PEDV易感的猪肠道上皮细胞系的建立，避免了原代猪肠道上皮细胞制备繁琐、稳定性差、难于培养的一系列缺点，为PEDV的培养提供了一个备选细胞系，为PEDV的深入研究提供了靶细胞，对PEDV疫苗生产具有重要意义。

Description

一种猪肠道上皮细胞系及其应用
技术领域
本发明涉及一种猪肠道上皮细胞系及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，各种年龄的猪均易感。猪流行性腹泻病毒(PEDV)为冠状病毒科冠状病毒属的成员。病毒形态略呈球形，有囊膜，囊膜上有花瓣状纤突，呈皇冠状。PEDV核酸为线性单股正链RNA，长为27000～33000个核苷酸(nt)。该病毒不能凝集人、兔、猪、鼠、犬、马、羊、牛的红细胞。对外界抵抗力弱，对乙醚、氯仿敏感，一般消毒药物都可将其杀灭。病毒在60℃ 30min，可失去感染力，但在50℃条件下相对稳定。病毒在4℃，pH 5.0～9.0或在37℃，pH 6.5～7.5时稳定。
2010年以来，全国大部分地区的猪场开始大规模爆发PED，这次爆发中初生仔猪死亡率达90%，全国仔猪死亡估计有上千万头。给我国养猪业造成巨大的经济损失们，已经引起政府和社会的高度关注。当前PEDV的研究主要在猴源的Vero细胞上开展，利用非猪源细胞进行研究，得到的研究结果不能够真实的反映自然宿主细胞的感染状况。猪肠道上皮细胞为PEDV的靶细胞，国内外尚无猪肠道上皮细胞系细胞，因此每次实验均需从肠道重新分离培养，制备过程繁琐，代价高，且不能保证不同批次之间的稳定性。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术中的空白，建立一种稳定传代的猪肠道上皮细胞系（Porcine small intestinal epithelial cell line，PIEC）及其应用。
技术方案
一种猪肠道上皮细胞系，其保藏号为：CGMCC NO.11496。该猪肠道上皮细胞系能用于PEDV的分离和培养。PEDV感染的毒价可以达到104.9TCID50/mL以上。
本发明的猪上皮细胞系是通过下述方式获得的：
在人源293细胞中扩增全长的Tert分子cDNA。将扩增产物连入PLV-puro慢病毒表达载体，构建重组表达载体P-TERT。将构建好的重组表达载体P-TERT与包装辅助质粒pSPAX2和pMG2G共转染人源293细胞，获得重组慢病毒。将该重组慢病毒侵染原代猪上皮细胞，通过嘌呤霉素加压筛选，从而获得了一株可稳定传代的猪肠道上皮细胞系。
通过PEDV 流行毒株MY1401感染实验，证实本发明的猪肠道上皮细胞系对PEDV高度敏感、PEDV感染的毒价可以达到104.9TCID50/mL以上，在流行毒株培养方面优于Vero细胞。所以，本发明的猪肠道上皮细胞系能够用于PEDV的分离和培养，也可以用于PEDV细胞受体和致病机制的研究。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明构建的能稳定传代的猪肠道上皮细胞系可以用于PEDV的分离和培养，也可以用于PEDV细胞受体和致病机制的研究。PEDV易感的猪肠道上皮细胞系的建立，避免了原代猪肠道上皮细胞制备繁琐、稳定性差、难于培养的一系列缺点，为PEDV的培养提供了一个备选细胞系，为PEDV的深入研究提供了靶细胞，对PEDV疫苗生产具有重要意义。
附图说明
图1为PEDV病毒感染PIEC细胞系后免疫荧光图，一抗：PEDV S蛋白单抗；二抗：FITC标记兔抗鼠抗体；
图2为PEDV滴度测定免疫荧光图，其中A、B、C、D，分别是PEDV MY01病毒液10、100、1000和10000倍稀释后，感染PIEC细胞系的免疫荧光图；一抗：PEDV S蛋白单抗；二抗：FITC标记兔抗鼠。
保藏信息
保藏时间：2015年11月11日；
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏编号：CGMCC NO.11496 ；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
分类命名：仔猪肠道上皮细胞。
具体实施方式
准备培养基：
（1） 细胞培养基
10%（体积百分数） 新生牛血清的DMEM：取500ml液体DMEM培养基，按照10%的体积加入新生牛血清，充分混匀后备用；
（2）选择性培养基
嘌呤霉素含量为含800ng/mL的细胞培养基：向细胞培养基添加嘌呤霉素而成；其中，每mL细胞培养基添加800ng嘌呤霉素；
（3）病毒培养用培养基
2%（体积百分数）新生牛血清的DMEM：取500ml液体DMEM培养基，按照2%的体积加入新生牛血清，充分混匀后备用。
实施例1
人TERT cDNA全长的克隆
提取293细胞总RNA，利用TERT特异性引物进行RT-PCR扩增。扩增产物的序列如SEQID NO.1所示，全长为3363bp；经对比，与GenBank中的序列（ID:BC172541.1）同源性为100%。
所述TERT特异性引物：
F：aagtctagaatgccgcgcgctccccgctgc；（如SEQ ID NO.2所示）
R：tcagaattcttagtccaggatggtcttgaagtc；（如SEQ ID NO.3所示）。
实施例2
重组表达载体P-TERT的构建及重组慢病毒的包装
根据PLV-puro(慢病毒表达载体)载体的多克隆酶切位点序列，选用XbaI和EcoRI将PLV-puro载体线性化，将实施例1的扩增产物插入PLV-puro载体，获得重组表达载体；将该重组表达载体命名为P-TERT(重组慢病毒表达载体)。将构建好的重组表达载体P-TERT与包装辅助质粒pSPAX2和pMG2G（购自Addgene，并由本实验室保存）共转染293细胞。于转染后24和48小时收取含有重组慢病毒的细胞培养上清，-80℃保存（所述含有重组慢病毒的细胞培养上清是指，被重组表达载体P-TERT成功转染的293细胞培养上清）。转染后24小时或48小时所收取的样品，无任何差异。
实施例3
原代猪肠道上皮细胞的制备
按照肠绒毛消化法制备原代猪肠道上皮细胞。具体步骤简述如下：取1日龄未哺乳的仔猪肠道，经反复冲洗后纵向剪开，是腔面朝上，用玻璃片轻轻挂下肠粘膜；收取刮取液，用0.1%的胶原酶II 37℃消化15min，期间不时反复吹吸；终止消化后过200目细胞筛网，收集滤液中的细胞，置于37℃、5%（体积分数，下同）CO2培养箱培养或冻存。
实施例4
稳定传代猪肠道上皮细胞系的建立
将实施例2得到的含有重组慢病毒的细胞培养上清在助转剂 polybrene（5µg/ml）帮助下侵染原代猪肠道上皮细胞；侵染后48小时，用选择性培养基加压筛选转染的细胞，每24小时更换一次。经过14天左右的筛选，未被嘌呤霉素杀死的细胞，获得具有嘌呤霉素抗性的肠道细胞。然后利用有限稀释法进一步对具有嘌呤霉素抗性的肠道细胞进行亚克隆（本发明的亚克隆操作及试剂是细胞培养方面的常规操作及常规试剂），即可得到稳定传代的猪肠道上皮细胞系。
实施例5
猪肠道稳定传代上皮细胞系的体外传代培养
待稳定传代的猪肠道上皮细胞长满培养器皿底部后，使用PBS磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，而后加入适量0.25%的胰蛋白酶消化，待细胞变圆回缩时，加入细胞培养基终止消化，反复吹打使细胞悬浮并解离，然后转移至新的培养器皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
实施例6
PEDV分离及传代实验
将可稳定传代的猪肠道上皮细胞系（以下简称“细胞”）接种至六孔板中，待细胞生长至80-90%融合时，接种PEDV阳性病料，37℃感作2h后，弃感作液（感作液是指含有病料的培养基，其成分属于公知），然后加入病毒培养基并置于培养箱中培养，至细胞出现明显病变（约36h）后，反复冻融2次收取病毒液。
将收取的病毒液按照MOI=0.01接种80-90%融合度的猪肠道上皮细胞，感作2h后，更换为病毒培养基并培养36h，而后反复冻融两次收取病毒液。检测病毒含量（检测细胞培养基中病毒粒子的数量，由此判定病毒增殖情况），病毒液按照10倍进行连续稀释后接种猪肠道上皮细胞，接种后24h使用质量含量为4％多聚甲醛溶液固定，利用PEDV S蛋白特异性单抗检测细胞中病毒含量（如图2所示），并按照Reed & Muench法计算病毒含量。当PEDV病毒传至第10代时，病毒滴度达到104.9TCID50/mL以上，解决了PEDV流行毒株难以分离的难题。
<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120>一种猪肠道上皮细胞系及其应用
<160>3
<210>1
<211>3363
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60
gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120
cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180
gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240
gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300
ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360
agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420
ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480
ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540
gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600
cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660
gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt 720
ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc 780
aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa 840
gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc 900
cgccagcacc acgcgggccc cccatccaca tcgcggccac cacgtccctg ggacacgcct 960
tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag 1020
ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc 1080
gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc 1140
cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac 1200
gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc 1260
ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag 1320
gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag 1380
gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc 1440
aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat 1500
gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg 1560
cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc 1620
ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc 1680
ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc 1740
tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag 1800
ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 1860
ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg 1920
ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca 1980
ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg 2040
ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100
gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gacaggctca cggaggtcat cgccagcatc 2160
atcaaacccc agaacacgta ctgcgtgcgt cggtatgccg tggtccagaa ggccgcccat 2220
gggcacgtcc gcaaggcctt caagagccac gtctctacct tgacagacct ccagccgtac 2280
atgcgacagt tcgtggctca cctgcaggag accagcccgc tgagggatgc cgtcgtcatc 2340
gagcagagct cctccctgaa tgaggccagc agtggcctct tcgacgtctt cctacgcttc 2400
atgtgccacc acgccgtgcg catcaggggc aagtcctacg tccagtgcca ggggatcccg 2460
cagggctcca tcctctccac gctgctctgc agcctgtgct acggcgacat ggagaacaag 2520
ctgtttgcgg ggattcggcg ggacgggctg ctcctgcgtt tggtggatga tttcttgttg 2580
gtgacacctc acctcaccca cgcgaaaacc ttcctcagga ccctggtccg aggtgtccct 2640
gagtatggct gcgtggtgaa cttgcggaag acagtggtga acttccctgt agaagacgag 2700
gccctgggtg gcacggcttt tgttcagatg ccggcccacg gcctattccc ctggtgcggc 2760
ctgctgctgg atacccggac cctggaggtg cagagcgact actccagcta tgcccggacc 2820
tccatcagag ccagtctcac cttcaaccgc ggcttcaagg ctgggaggaa catgcgtcgc 2880
aaactctttg gggtcttgcg gctgaagtgt cacagcctgt ttctggattt gcaggtgaac 2940
agcctccaga cggtgtgcac caacatctac aagatcctcc tgctgcaggc gtacaggttt 3000
cacgcatgtg tgctgcagct cccatttcat cagcaagttt ggaagaaccc cacatttttc 3060
ctgcgcgtca tctctgacac ggcctccctc tgctactcca tcctgaaagc caagaacgca 3120
gggatgtcgc tgggggccaa gggcgccgcc ggccctctgc cctccgaggc cgtgcagtgg 3180
ctgtgccacc aagcattcct gctcaagctg actcgacacc gtgtcaccta cgtgccactc 3240
ctggggtcac tcaggacagc ccagacgcag ctgagtcgga agctcccggg gacgacgctg 3300
actgccctgg aggccgcagc caacccggca ctgccctcag acttcaagac catcctggac 3360
taa 3363
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
aagtctagaa tgccgcgcgc tccccgctgc 30
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tcagaattct tagtccagga tggtcttgaa gtc 33

Claims (2)

1.一种对PEDV高度敏感的猪肠道上皮细胞系，其保藏号为：CGMCC NO.11496；所述PEDV感染的毒价能达到104.9TCID50/mL以上。
2.一种权利要求1所述的猪上皮细胞系用于PEDV的分离和培养。
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