CN110540954A - 对三种猪肠道冠状病毒易感的猪回肠上皮细胞株 - Google Patents

对三种猪肠道冠状病毒易感的猪回肠上皮细胞株 Download PDF

Info

Publication number
CN110540954A
CN110540954A CN201910420946.6A CN201910420946A CN110540954A CN 110540954 A CN110540954 A CN 110540954A CN 201910420946 A CN201910420946 A CN 201910420946A CN 110540954 A CN110540954 A CN 110540954A
Authority
CN
China
Prior art keywords
porcine
cells
ipi
cell
tgev
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910420946.6A
Other languages
English (en)
Inventor
方六荣
肖少波
汪训磊
刘康
王荡
方谱县
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN201910420946.6A priority Critical patent/CN110540954A/zh
Publication of CN110540954A publication Critical patent/CN110540954A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物工程技术领域。具体涉及对三种猪肠道冠状病毒均易感的猪回肠上皮细胞株。通过对IPI‑2I细胞的克隆筛选，获得了一株对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均敏感的细胞株IPI‑FX，该细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：C2019115。PEDV、PDCoV和TGEV均能在IPI‑FX细胞上有效增殖，增殖滴度均高于106.0TCID50/mL。为深入开展猪肠道冠状病毒的免疫与致病机制及混合感染等的研究提供了有用的细胞，在IPI‑FX细胞上开展相关研究能更好地反映猪体感染时的真实情况。

Description

对三种猪肠道冠状病毒易感的猪回肠上皮细胞株
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及对三种猪肠道冠状病毒(包括PEDV、TGEV、PDCoV) 易感的猪回肠上皮细胞株。
背景技术
冠状病毒(Coronaviruses,CoV)是不分节段的单股正链RNA病毒，分为α冠状病毒属 (Alphacoronavirus,α-CoV)，β冠状病毒属(Betacoronavirus,β-CoV)，γ冠状病毒属(Gammacoronavirus,γ-CoV)和δ冠状病毒属(Deltacoronavirus,δ-CoV)4个属(Su etal.Epidemiology,genetic recombination,and pathogenesis of coronaviruses.Trends Microbiol.2016 24(6):490-502)。猪肠道冠状病毒是引起仔猪腹泻的主要病毒，迄今为止，已报道的能引起猪群大规模腹泻的猪肠道冠状病毒主要包括传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)，猪流行性腹泻病毒(porcine epidemicdiarrhea virus,PEDV)和猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)。其中TGEV 和PEDV属于α-CoVs(Carstens EB.Ratification vote on taxonomic proposals to theinternational committee on taxonomy of viruses(2009).Arch Virol.2010,155(1):133-146；Pensaert et al.A new coronavirus-like particle associated withdiarrhea in swine.Arch Virol.1978,58(3):243-247.)，而PDCoV属于δ-CoVs(Woo etal.Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses in the genusdeltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source ofalphacoronavirus and betacoronavirus and avian coronaviruses as the genesource of gammacoronavirus and deltacoronavirus. J Virol.2012,86(7):3995-4008.)。这三种病毒均能感染不同日龄的猪，导致感染猪出现以呕吐、腹泻和脱水为主要特征的临床症状，其中对7日龄以内仔猪的危害最为严重，死亡率高达100％，给养猪业造成了巨大的经济损失(Gerdts and Zakhartchouk.Vaccines for porcine epidemic diarrheavirus and other swine coronaviruses.Vet Microbiol.2017, 206:45-51.)。深入研究猪肠道冠状病毒的免疫与致病机制、及混合感染机制，对有效预防控制其感染具有重要意义。
目前用于TGEV研究的细胞主要是猪睾丸传代细胞系(ST)和猪肾上皮传代细胞系(PK-15) (Ding et al.Transmissible gastroenteritis virus infection induces NF-kappaB activation through RLR-mediated signaling.Virology.2017,507:170-178.)，用于 PEDV研究的细胞主要是非洲绿猴肾传代细胞系(Vero)(Hofmann andWyler.Propagation of the virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture.JClin Microbiol.1988,26(11): 2235-2239.)，用于PDCoV研究的细胞主要是ST细胞和另一种猪肾上皮传代细胞系(LLC-PK1) (Hu et al.Isolation and characterization ofporcine deltacoronavirus from pigs with diarrhea in the United States.J ClinMicrobiol.2015,53(7):1537-1548.)。但TGEV、 PEDV和PDCoV感染的靶器官主要是猪小肠的空肠段和回肠段，上述4种细胞系均不是来源于猪小肠，在这些非肠道细胞上进行病毒的免疫与致病机制及混合感染等研究，往往难以反映动物机体感染时的真实情况。
已有文献报道，猪空肠上皮传代细胞系IPEC-J2对PEDV、TGEV和PDCoV均敏感，可以用于这三种病毒的分离、培养及感染等相关研究(Lin et al.Differential proteinanalysis of IPEC-J2 cells infected with porcine epidemic diarrhea viruspandemic and classical strains elucidates the pathogenesis ofinfection.J.Proteome Res.2017,16: 2113-2120；Jung et al.Susceptibility ofporcine IPEC-J2intestinal epithelial cells to infection with porcinedeltacoronavirus(PDCoV)and serum cytokine responses of gnotobiotic pigs toacute infection with IPEC-J2cell culture-passaged PDCoV.Vet Microbiol.2018,221:49-58；Zhao et al.Transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemicdiarrhoea virus infection induces dramatic changes in the tight junctions andmicrofilaments of polarized IPEC-J2 cells.Virus Res.2014,192: 34-45.)，但目前尚无关于猪回肠细胞对PEDV、TGEV和PDCoV敏感性的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，对来源于猪回肠上皮的传代细胞系IPI-2I(购自中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC))的生物材料进行克隆，获得一株对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均易感的细胞株IPI-FX。
本发明通过有限稀释法对IPI-2I细胞进行克隆，对获得的克隆分别用PDCoV、TGEV和PEDV 进行感染，再通过细胞病变观察、间接免疫荧光检测等方法筛选对3种病毒均敏感的细胞克隆，将获得的细胞克隆命名为IPI-FX。
申请人通过制备，获得一种对三种猪肠道冠状病毒均易感的猪回肠上皮细胞株IPI-FX，于2019年5月16日送交中国武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2019115。
上述三种猪肠道冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒。
本发明的对三种猪肠道冠状病毒均易感的猪回肠上皮细胞株IPI-FX可在猪肠道冠状病毒培养，研究与开发中应用。
猪回肠上皮细胞株IPI-FX具有以下特征：
(1)猪回肠上皮细胞株IPI-FX与其母细胞IPI-2I具有相似的形态特征。
(2)猪回肠上皮细胞株IPI-FX保留了其母细胞IPI-2I对PDCoV和TGEV的敏感性，显著提高了对PEDV的敏感性。
(3)PDCoV感染IPI-2I和IPI-FX细胞的特征性病变一致，主要表现为：细胞圆缩、聚集，合胞体形成，最后裂解脱落；TGEV感染IPI-2I和IPI-FX细胞的特征性病变一致，主要表现为：细胞圆缩、裂解脱落；PEDV感染IPI-FX细胞的特征性病变主要表现为：细胞圆缩、聚集，合胞体形成，最后裂解脱落。
本发明的技术方案如下所述：
1.利用IPI-2I细胞对PDCoV、TGEV和PEDV的敏感性检测
1)病毒接种与培养
PDCoV和PEDV的接种和培养：将IPI-2I细胞接种24孔细胞培养板，待细胞长满单层后，用含2.5μg/mL胰酶的无血清DMEM培养液洗两次，接种PDCoV或PEDV，4℃感作1h后，吸弃接种物，用含2.5μg/mL胰酶的无血清DMEM培养液洗两次，补足含2.5μg/mL胰酶的无血清DMEM培养液，于37℃5％CO2培养箱培养。并以同样处理但不接毒的细胞作对照。
TGEV的接种和培养：将IPI-2I细胞接种24孔细胞培养板，待细胞长满单层后，用DMEM 培养液洗两次，接种TGEV，4℃感作1h后，吸弃接种物，用DMEM培养液洗两次，补足含2％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃5％CO2培养箱培养。并以同样处理但不接毒的细胞作对照。
2)间接免疫荧光检测
于培养后6、12、18、24和30h观察细胞病变的情况，同时固定细胞，进行间接免疫荧光实验，观察荧光变化。
2.对PDCoV、TGEV和PEDV均易感的IPI-FX细胞通过以下方法构建
1)IPI-2I细胞有限稀释法克隆培养
将生长状态良好的IPI-2I细胞，用胰酶消化后制成单细胞悬液，细胞计数后，按有限稀释法进行连续梯度稀释，然后分别接种于96孔细胞培养板，37℃，5％CO2的培养箱中培养。每3-5天更换一次新鲜的细胞培养液，逐日观察，并对有单个细胞克隆生长的细胞孔进行标记，当单细胞克隆长至约占细胞孔孔底面积的1/3时，用胰酶消化后，将细胞接种到48孔细胞培养板中进行培养，并依次将细胞扩大培养到24孔细胞培养板、6孔细胞培养板、T25小细胞瓶，获得亚克隆细胞株。
2)对PDCoV、TGEV和PEDV均易感的IPI-2I细胞株的筛选
选择细胞状态比较好的24株克隆细胞株，分别接种24孔细胞培养板，待细胞长满单层后，按“步骤1”所述的方法进行病毒的接种与培养及间接免疫荧光检测。挑选3种毒感染均能形成细胞病变且荧光强度较强的细胞株进行传代，获得IPI-FX细胞株，扩大培养后进行冻存。
3.PDCoV、TGEV和PEDV在IPI-2I和IPI-FX细胞上增殖特性的比较
按“步骤1”所述的方法将病毒分别接种IPI-2I和IPI-FX细胞，于接种后6、12、18、24和30h分别收样，测定各样品的TCID50，绘制病毒的增殖曲线。由增殖曲线可知，PDCoV 在IPI-2I和IPI-FX细胞上均于感染后30h达到增殖高峰，增殖滴度分别为106.3TCID50/ml和106.2TCID50/ml；TGEV在IPI-2I和IPI-FX细胞上分别于24h和30h达到增殖高峰，最高增殖滴度分别为107.5TCID50/ml和106.8TCID50/ml；PEDV不感染IPI-2I细胞，在IPI-FX细胞上于感染后30h达到增殖高峰，最高增殖滴度为106.8TCID50/ml。
附图说明
图1：实施例1中，PDCoV、TGEV和PEDV感染的IPI-2I细胞图片。
图2：实施例1中，PDCoV、TGEV和PEDV感染IPI-2I细胞的荧光图片。
图3：实施例2中的细胞克隆筛选流程。
图4：实施例2中，PDCoV、TGEV和PEDV感染IPI-FX细胞的细胞病变图片和荧光图片。
图5：实施例3中，PDCoV、TGEV和PEDV在IPI-2I及IPI-FX细胞上的增殖曲线比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：IPI-2I细胞对PDCoV、TGEV和PEDV的敏感性检测
1.病毒的接种和培养
PDCoV的接种和培养：将生长良好的IPI-2I细胞用胰酶消化后接种24孔细胞培养板，每孔200μL，细胞密度为3×105个/mL，待细胞长满单层后，用含2.5μg/mL胰酶的无血清DMEM培养液洗细胞单层两次，按0.1MOI的量接种PDCoV CHN-HN-2014株，4℃感作1h后，吸弃接种物，用含2.5μg/mL胰酶的无血清DMEM培养液洗细胞两次，每孔加1mL含2.5μg/mL 胰酶的无血清DMEM培养液，于37℃5％CO2培养箱培养。并以同样处理但不接毒的细胞作对照。
TGEV的接种和培养：将生长良好的IPI-2I细胞用胰酶消化后接种24孔细胞培养板，每孔200μL，细胞密度为3×105个/mL，待细胞长满单层后，用无血清DMEM培养液洗细胞单层两次，按0.1MOI的量接种TGEV WH-1株，4℃感作1h后，吸弃接种物，用无血清DMEM培养液洗两次，每孔加1mL含2％胎牛血清的DMEM培养液，于37℃5％CO2培养箱培养。并以同样处理但不接毒的细胞作对照。
PEDV的接种和培养：将生长良好的IPI-2I细胞用胰酶消化后接种24孔细胞培养板，每孔200μL，细胞密度为3×105个/mL，待细胞长满单层后，用含2.5μg/mL胰酶的无血清DMEM 培养液洗细胞单层两次，按5MOI的量接种PEDV AJ1102株，4℃感作1h后，吸弃接种物，用含2.5μg/mL胰酶的无血清DMEM培养液洗两次，每孔加1mL含2.5μg/mL胰酶的无血清DMEM培养液，于37℃5％CO2培养箱培养。并以同样处理但不接毒的细胞作对照。
2.病毒接种细胞的病变观察
分别在培养后6、12、18、24和30h于倒置显微镜下观察细胞病变的情况并拍照，结果显示，PDCoV接种的IPI-2I细胞在感染后12h，细胞开始圆缩，聚集，并有合胞体形成，随着时间的延长，病变的细胞逐渐增多，并开始裂解脱落(图1中的A图)；TGEV接种的IPI-2I 细胞也是在感染后12h开始出现细胞病变，主要表现为细胞圆缩、裂解脱落，随着时间的延长，裂解脱落的细胞逐渐增多(图1中的B图)；PEDV接种的IPI-2I细胞和未接种病毒的IP-2I 细胞均正常，未发现细胞病变(图1中的C图)。
3.病毒接种细胞的间接免疫荧光检测
按上述“步骤1”所述方法进行病毒的接种和培养，并于接毒后6、12、18、24和30h分别收样，进行间接免疫荧光检测。
间接免疫荧光检测的具体操作步骤为：
1)用磷酸盐缓冲液，即PBS(pH7.2，PBS配方为：称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO41.42g， KH2PO4 0.27g于800ml ddH2O中，溶解后用ddH2O定容至1000ml)。
)洗细胞单层3次，每次于摇床低速振摇洗5min；
2)吸弃洗液，每孔加500μL 4％多聚甲醛，室温固定15min；
3)吸弃多聚甲醛，用PBS(pH7.2)洗细胞单层3次，每次于摇床低速振摇洗5min；
4)吸弃洗液，每孔加500μL-20℃预冷的甲醇，于室温透化10min；
5)吸弃甲醇，用PBS(pH7.2)洗细胞单层3次，每次于摇床低速振摇洗5min；
6)吸弃洗液，每孔加500μL含5％牛血清白蛋白的PBS，37℃封闭1h或4℃封闭过夜；
7)吸弃封闭液，用PBS(pH7.2)洗细胞单层3次，每次于摇床低速振摇洗5min；
8)吸弃洗液，用PBS(pH7.2)按体积比为1:300分别对PDCoV S蛋白单抗、TGEV N蛋白单抗和PEDV N蛋白单抗进行稀释；
9)于PDCoV接种孔及对照孔中加入稀释的PDCoV S蛋白单抗，于TGEV接种孔及对照孔中加入稀释的TGEV N蛋白单抗，于PEDV接种孔及对照孔中加入稀释的PEDV N蛋白单抗，每孔300μL，37℃孵育1h；
10)吸弃孔中溶液，用PBS(pH7.2)洗细胞单层3次，每次于摇床低速振摇洗5min；
11)吸弃洗液，每孔加入1:500稀释的FITC标记的羊抗小鼠IgG(Santa CruzBiotechnology)，每孔500μL，37℃避光孵育1h；
12)吸弃孔中溶液，用PBS(pH7.2)洗细胞单层3次，每次于摇床低速振摇洗5min；
13)吸弃洗液，加入1:3000稀释的DAPI(Beyotime Biotechnology)，每孔500μL，室温避光染色15min；
14)吸弃染液，用PBS(pH7.2)洗细胞单层3次，每次于摇床低速振摇洗5min；
15)吸弃洗液，每孔加500μL PBS(pH7.2)，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。
结果：PDCoV感染的IPI-2I细胞于感染后12h开始出现绿色荧光，随着时间的延长，发绿色荧光的细胞逐渐增多(图2中的A图)；TGEV感染的IPI-2I细胞于感染后6h即开始出现绿色荧光，至感染后12h，80％以上的细胞都可观察到绿色荧光(图2中的B图)，而PEDV 感染的IPI-2I细胞只在感染后24h观察到有零星的细胞发荧光，且荧光很弱(图2中的C图)，对照细胞均无荧光(图2)，表明IPI-2I细胞对PDCoV和TGEV易感性较高，但对PEDV不易感。
实施例2：对PDCoV、TGEV和PEDV均易感的IPI-2I细胞的克隆与筛选
1.IPI-2I细胞有限稀释法克隆培养
将生长状态良好的IPI-2I细胞，用胰酶消化后制成单细胞悬液，细胞计数后，按有限稀释法进行连续梯度稀释，然后分别接种于96孔细胞培养板，37℃5％CO2培养箱培养。每3-5 天更换一次新鲜的细胞培养液，逐日观察，并对有单个细胞克隆生长的细胞孔进行标记，当单细胞克隆长至约占细胞孔孔底面积的1/3时，用0.25％胰酶消化3-5min，用灭菌的断黄枪头吹散细胞后接种到48孔细胞培养板中进行培养，并依次将细胞扩大培养到24孔细胞培养板、6孔细胞培养板、T25小细胞瓶，获得亚克隆细胞株(图3)。
2.对PDCoV、TGEV和PEDV均易感的IPI-2I细胞株的筛选
选择细胞状态比较好的24株克隆细胞，分别接种于24孔细胞培养板，待细胞长满单层后，按“实施例1步骤1”所述方法进行病毒的接种与培养，并于病毒接种后24h按“实施例1步骤3”所述方法进行间接免疫荧光检测。结果PDCoV、TGEV和PEDV均可感染其中1株克隆，并出现典型的细胞病变，其中PDCoV和TGEV所引起的细胞病变与其在IPI-2I细胞上引起的细胞病变特征一致，PEDV引起的细胞病变主要表现为细胞圆缩、聚集，形成合胞体，最后裂解脱落。间接免疫荧光检测显示PDCoV、TGEV和PEDV感染的这株克隆细胞均出现了较强的特异性绿色荧光(图4中的A图、图4中的B图、图4中的C图)，表明该细胞克隆对 PDCoV、TGEV和PEDV均易感，于是将该克隆命名为IPI-FX，随后将其扩大培养后进行了冻存。
3.PDCoV、TGEV和PEDV在IPI-2I与IPI-FX细胞株上的增殖特性比较
按实“施例1”所述方法在IPI-2I细胞和IPI-FX细胞上进行PDCoV和TGEV的接种与培养，由于IPI-2I细胞对PEDV不敏感，所以只在IPI-FX细胞上进行了PEDV的接种与培养。于接毒后6、12、18、24和30h分别收样。将收取的样品反复冻融三次，1000r/min离心5min，取上清，测定TCID50，根据TCID50绘制三种病毒的增殖曲线。具体操作如下：
1)PDCoV TCID50测定与增殖曲线的绘制：选用目前最常用于PDCoV研究的LLC-PK1细胞进行TCID50的测定。将LLC-PK1细胞接种96孔细胞培养板，每孔200μL，细胞密度为3×105个/mL，待细胞长满单层后，用含7.5μg/mL胰酶的无血清DMEM培养液洗两次，将上述处理的不同时间点的PDCoV样品分别用含7.5μg/mL胰酶的无血清DMEM培养液作连续10倍稀释，从10-1-10-8，将各稀释度的病毒分别接种到96孔板中，每孔100μL，每个稀释度接8孔，同时设不接毒的细胞对照8孔。培养2-3天后，观察细胞病变，待细胞病变稳定后，记录病变的孔数，按Reed-Muench法计算各样品的TCID50。每个时间点的样品重复检测三次。根据TCID50结果绘制病毒的增殖曲线。
2)TGEV TCID50测定与增殖曲线的绘制：选用目前最常用于TGEV研究的ST细胞进行TCID50的测定。将ST细胞接种96孔细胞培养板，每孔200μL，细胞密度为3×105个/mL，待细胞长满单层后，将上述处理的不同时间点的TGEV样品分别用含2％胎牛血清的DMEM培养液作连续10倍稀释，从10-1-10-8，将各稀释度的病毒分别接种到96孔板中，每孔100μL，每个稀释度接8孔，同时设不接毒的细胞对照8孔。培养2-3天后，观察细胞病变，待细胞病变稳定后，记录病变的孔数，按Reed-Muench法计算各样品的TCID50。每个时间点的样品重复检测三次。根据TCID50结果绘制病毒的增殖曲线。
3)PEDV TCID50测定与增殖曲线的绘制：选用目前最常用于PEDV研究的Vero细胞进行 TCID50的测定。将Vero细胞接种96孔细胞培养板，每孔200μL，细胞密度为3×105个/mL，待细胞长满单层后，用含7.5μg/mL胰酶的无血清DMEM培养液洗两次，将上述处理的不同时间点的PEDV样品分别用含7.5μg/mL胰酶的无血清DMEM培养液作连续10倍稀释，从10-1-10-8，将各稀释度的病毒分别接种到96孔板中，每孔100μL，每个稀释度接8孔，同时设不接毒的细胞对照8孔。培养2-3天后，观察细胞病变，待细胞病变稳定后，记录病变的孔数，按 Reed-Muench法计算各样品的TCID50。每个时间点的样品重复检测三次。根据TCID50结果绘制病毒的增殖曲线。
结果：PDCoV在IPI-2I和IPI-FX细胞上的增殖曲线一致，增殖滴度也无明显差异，都是在感染后30h达到增殖高峰，增殖滴度分别为106.3TCID50/ml和106.2TCID50/ml(图5)；TGEV 在IPI-2I和IPI-FX细胞上的增殖曲线相似，都是在感染后6h可检测到低滴度的病毒，随着感染时间的延长，病毒滴度逐渐升高，但TGEV在IPI-2I细胞上的增殖较快，于感染后24h 达到增殖高峰，病毒滴度为107.5TCID50/ml，TGEV在IPI-FX细胞上于感染后30h达到增殖高峰，病毒滴度为106.8TCID50/ml(图5)；PEDV感染IPI-FX细胞6h即可检测到低滴度的病毒，随着感染时间的延长，病毒滴度逐渐升高，并于感染后30h达到增殖高峰，病毒滴度为106.8TCID50/ml(图5)。
本发明的对三种猪肠道冠状病毒易感的猪回肠上皮细胞株IPI-FX可在猪肠道冠状病毒培养，研究与开发中应用
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种对三种猪肠道冠状病毒易感的猪回肠上皮细胞株IPI-FX，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2019115。
2.如权利要求1所述的对三种猪肠道冠状病毒易感的猪回肠上皮细胞株IPI-FX，其特征在于，所述的三种猪肠道冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒。
3.权利要求1或2所述的对三种猪肠道冠状病毒易感的猪回肠上皮细胞株IPI-FX在猪肠道冠状病毒培养、研究与开发中的应用。
CN201910420946.6A 2019-05-21 2019-05-21 对三种猪肠道冠状病毒易感的猪回肠上皮细胞株 Pending CN110540954A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910420946.6A CN110540954A (zh) 2019-05-21 2019-05-21 对三种猪肠道冠状病毒易感的猪回肠上皮细胞株

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910420946.6A CN110540954A (zh) 2019-05-21 2019-05-21 对三种猪肠道冠状病毒易感的猪回肠上皮细胞株

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110540954A true CN110540954A (zh) 2019-12-06

Family

ID=68702727

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910420946.6A Pending CN110540954A (zh) 2019-05-21 2019-05-21 对三种猪肠道冠状病毒易感的猪回肠上皮细胞株

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110540954A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2306334C2 (ru) * 2005-08-18 2007-09-20 ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) МЕЖВИДОВАЯ ЛИНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ОВЦЫ (Ovis aries) С ЛИМФОЦИТАМИ КРОЛИКА (ПО-TK-×ЛК) ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
CN101491673A (zh) * 2008-12-26 2009-07-29 天津瑞普生物技术股份有限公司 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联疫苗
CN105462931A (zh) * 2015-12-16 2016-04-06 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种猪肠道上皮细胞系及其应用
CN108676780A (zh) * 2018-07-24 2018-10-19 华中农业大学 一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2306334C2 (ru) * 2005-08-18 2007-09-20 ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) МЕЖВИДОВАЯ ЛИНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ОВЦЫ (Ovis aries) С ЛИМФОЦИТАМИ КРОЛИКА (ПО-TK-×ЛК) ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ - БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
CN101491673A (zh) * 2008-12-26 2009-07-29 天津瑞普生物技术股份有限公司 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和猪轮状病毒的三联疫苗
CN105462931A (zh) * 2015-12-16 2016-04-06 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种猪肠道上皮细胞系及其应用
CN108676780A (zh) * 2018-07-24 2018-10-19 华中农业大学 一种高效分离猪肠道冠状病毒的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KWONIL JUNG 等: "Susceptibility of porcine IPEC-J2 intestinal epithelial cells to infection with porcine deltacoronavirus (PDCoV) and serum cytokine responses of gnotobiotic pigs to acute infection with IPEC-J2 cell culture-passaged PDCoV", 《VET MICROBIOL》 *
XUNLEI WANG 等: "Susceptibility of porcine IPI-2I intestinal epithelial cells to infection with swine enteric coronaviruses", 《VET MICROBIOL》 *
韦学雷 等: "猪Delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用", 《中国兽医学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102250843B (zh) 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程标记弱毒疫苗株及应用
CN101148661B (zh) 人乳头瘤病毒16型外壳蛋白病毒样颗粒及其制备方法和用途
CN102988974B (zh) 一种用传代鸡胚成纤维细胞制备猪伪狂犬活疫苗的方法
CN111632137A (zh) 猫杯状病毒病、猫传染性鼻气管炎和猫泛白细胞减少症三联疫苗及其制备方法和应用
CN113528453B (zh) 一种永生化猪巨噬细胞株及其构建方法和应用
CN104330561A (zh) 一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法
CN101928728B (zh) 肠病毒类病毒颗粒的制备方法及其应用
Tyrrell et al. Direct electron-microscopy of organ cultures for the detection and characterization of viruses
CN103952369B (zh) 一株草鱼鱼鳔上皮样细胞系及其应用
AU2007282612B2 (en) Method for production of live smallpox vaccine
CN110540954A (zh) 对三种猪肠道冠状病毒易感的猪回肠上皮细胞株
CN114591885B (zh) 一种适应无血清悬浮培养的LLC-PK1Sa细胞驯化方法和应用
CN103864931B (zh) 一种伪狂犬病标准阳性血清的制备及其冻干保存方法
CN103160475B (zh) 一种肠道病毒71型病毒株及其用途、疫苗和制备方法
Dahling Detection and enumeration of enteric viruses in cell culture
CN105734007A (zh) 一种筛选对牛病毒性腹泻/黏膜病毒敏感的mdbk细胞系的方法
CN113406065B (zh) 一种非洲猪瘟病毒抗体的血清学检测方法
CN113049816B (zh) 一种新城疫病毒滴度的测定方法
CN103160474B (zh) 肠道病毒71型病毒株、疫苗、动物模型建立方法
Richmond et al. Characterisation of a polyomavirus in two foetal rhesus monkey kidney cell lines used for the growth of hepatitis A virus
CN105950571A (zh) 一种基于鲤鱼上皮瘤细胞epc的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒isknv的增殖方法
CN105154390A (zh) 重组腺病毒疫苗株高适应性hek293克隆细胞株及其应用
Tiwari et al. Permissibility of different cell types for the growth of avian metapneumovirus
CN104535764B (zh) 一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法
CN106085947B (zh) Mdck克隆细胞株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20191206

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication