CN104535764B - 一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法 - Google Patents

一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104535764B
CN104535764B CN201410745718.3A CN201410745718A CN104535764B CN 104535764 B CN104535764 B CN 104535764B CN 201410745718 A CN201410745718 A CN 201410745718A CN 104535764 B CN104535764 B CN 104535764B
Authority
CN
China
Prior art keywords
csfv
vaccine
recombinant adenovirus
adenovirus vector
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410745718.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104535764A (zh
Inventor
张恒
范根成
杜元钊
孙永科
刘蕾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Original Assignee
Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd filed Critical Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority to CN201410745718.3A priority Critical patent/CN104535764B/zh
Publication of CN104535764A publication Critical patent/CN104535764A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104535764B publication Critical patent/CN104535764B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • G01N2333/183—Flaviviridae, e.g. pestivirus, mucosal disease virus, bovine viral diarrhoea virus, classical swine fever virus (hog cholera virus) or border disease virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的目的是提供一种用于猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫中病毒含量测定方法，可以更灵敏、更特异的检测到该疫苗中的活病毒的含量，从而弥补现有技术的不足。本发明通过构建CSFV的荧光免疫试剂盒，将猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗接种HEK293细胞，采用间接免疫荧光检测技术进行该疫苗病毒含量检测。本发明的检测方法能够具体检测到猪瘟活病毒粒子感染的单个细胞，通过计算活病毒粒子感染单个细胞的数目来评价新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗中病毒的含量，该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点。

Description

一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法
技术领域
本发明属于家畜病毒检测技术领域，具体涉及一种新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法。
背景技术
猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病，死亡率极高，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪瘟已被世界动物卫生组织(OIE)列为家畜A类传染病，我国也将其列为一类动物疫病。临床以稽留高烧、皮肤和黏膜出现大量出血点为特征。多年的实践经验证明，疫苗接种是预防和控制动物疫病的主要手段。20世纪60年代，我国研制出经人工诱变获得的猪瘟兔化弱毒株(又称C株)疫苗在CSFV防控中起到了决定性作用，有效的控制了猪瘟在我国乃至世界范围内大规模的流行。因此，疫苗的质量至关重要，疫苗效价是评价疫苗质量的关键指标。
到目前为止，对于猪瘟活疫苗中病毒含量测定还没有一种稳定性、重复性好的定量方法，还不能进行病毒含量测定。过去，一直采用兔体定型热反应法来检测疫苗效力。但是该方法周期长，兔体个体的反应会影响结果的稳定性。近几年，一些学者采用实时荧光定量PCR方法快速检测猪瘟活疫苗中病毒含量(HoffmannB,etal.Validationofareal-timeRT-PCRassayforsensitiveandspecificdetectionofclassicalswinefever.JVirolMethods，2005，130(1-2)：36-44；高博,等.快速检测猪瘟兔化弱毒疫苗株的TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立应用。西南民族大学学报：自然科学版，2009，35(1)：92-97)和RT-PCR方法(罗廷荣,等.RT-PCR诊断CSFV的应用研究.中国预防兽医学报，2003，25(3):219-222),这些方法虽然灵敏度很高，但都不能进行完全定量，并且不能区分活疫苗中有复制能力的活病毒粒子和死亡的病毒粒子，因此，实时荧光定量PCR方法和RT-PCR方法不能对疫苗中活病毒进行定量。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫中病毒含量测定方法，可以更灵敏、更特异的检测到该疫苗中的活病毒的含量，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种用于检测猪瘟病毒的荧光免疫检测试剂盒，包含有如下的组分：
1)一抗：用于检测CSFV的单因子血清抗体；
2)二抗：FITC标记的山羊抗兔IgG；
3)阳性对照样品：猪瘟兔化弱毒株(C株)；
4)固定液：按丙酮与甲醇体积比1：1配置固定液；
5)PBS洗液:Nacl8.0g/L；Kcl0.2g/L；Na2HPO43.58g/L；KH2PO40.24g/L。
其中兔抗CSFV蛋白的单因子血清抗体，其制备方法如下：将CSFV基因重组腺病毒载体疫苗强化免疫SPF兔后，用猪瘟兔化弱毒株进行攻毒，选择攻毒后无反应热的SPF兔采集血清制备的。
上述的试剂盒用于检测猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗中的病毒含量；其一种具体操作步骤如下：通过将猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗进行连续10倍梯度稀释，在培养板每孔逐滴取100μl稀释的疫苗液接种于在5％CO2、37℃孵育2～3小时的HEK293细胞上，继续培养48小时后，利用构建的检测CSFV的荧光免疫检测试剂盒进行间接免疫荧光检测，通过计算显微镜下视野中阳性(出现绿色荧光)细胞的平均个数计算疫苗中的病毒含量。
其中计算病毒含量的方法如下：
1)计算显微镜下视野中阳性细胞的平均个数。选择一个梯度，此梯度视野中有5-50个阳性细胞，随机选择至少5个区域计数；
2)计算24孔板中每孔视野数；
对于多数显微镜，标准10×目镜与10×物镜所观察到的视野直径为1.8mm，因此：每个视野的面积＝3.14×(D/2)2＝3.14×0.92＝2.54mm2；对于一个标准24孔板，培养面积为2.0cm2，因此：每孔视野数＝2.0cm2/2.54mm2＝2.0cm2/2.54×10-2cm2＝79；
3)按疫苗病毒滴度(IFU/ml)＝(平均阳性细胞数/每孔视野数)×(稀释比例)/(0.1ml)进行计算疫苗中病毒含量。
本发明通过构建CSFV的荧光免疫试剂盒，将猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗接种HEK293细胞，采用间接免疫荧光检测技术(IFA)进行该疫苗病毒含量检测。本发明方法能够具体检测到猪瘟活病毒粒子感染的单个细胞(出现特异性绿色荧光)，通过计算活病毒粒子感染单个细胞(出现特异性绿色荧光)的数目来评价新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗中病毒的含量，具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。
实施例1：用于检测CSFV的荧光免疫试剂盒的构建
1.1针对CSFV单因子血清抗体的制备方法
用于检测CSFV的荧光免疫试剂盒主要成分为兔抗CSFV蛋白的单因子血清抗体，是将云南农大构建、青岛易邦生物工程有限公司技术中心繁殖保存的重组猪瘟病毒基因腺病毒载体疫苗颈部皮下注射免疫7只SPF兔，每只1ml(3.95×106TCID50/只)；14d后用进行第二次免疫，1ml/只；再经14d后第三次免疫(方法同第二次)，其中3只未免疫SPF兔作为阴性对照组。第三次免疫后10d，用猪瘟兔化弱毒耳静脉注射1ml进行攻毒，攻毒后72小时之内未出现稽留热反应(而对照兔出现稽留热反应)，将7只免疫兔心脏采血致死，析出的血清-20℃保存。其制备出的抗体能够与CSFV发生特异性反应。以此单因子血清构建的CSFV的荧光免疫检测试剂盒，可以检测猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗中的抗原，判定该疫苗的病毒含量，也可以检测临床上CSFV感染猪病料组织中的抗原，判定是否感染CSFV，其特异性强、灵敏度高、可重复性好且检测速度快，与以往的RT-PCR、实时荧光定量PCR及动物回归试验检测方法相比，利用该试剂盒通过IFA检测更方便、更准确。
1.2间接免疫荧光(IFA)鉴定单因子血清
1.2.1选取状态良好的HEK293细胞(商品化专门用来繁殖猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗)，使用完全培养基重悬细胞，制备成2.5×105/ml的细胞悬液，24孔板中接入1ml，37℃5％CO2培养2～3小时。
1.2.2将该疫苗(3.95×106TCID50/ml)按10-2接种比例加入HEK293细胞中，37℃5％CO2感染2天。
1.2.3轻轻去除培养液，沿24孔板侧壁缓缓加入-20℃预冷的固定液0.5ml(枪头不要触及到细胞)，-20℃固定20min。
1.2.4使用1mlPBS轻轻冲洗细胞3次，每次5min(切忌将细胞冲起)。
1.2.5按0.3ml/孔加入含1％BSA的PBS37℃封闭1小时。
1.2.6将析出的兔血清分别用PBS按1:50、1:100、1:200、1:500作4个稀释度加到固定好的HEK293细胞上，37℃湿盒孵育1小时。
1.2.7使用1mlPBS轻轻冲洗细胞3次，每次5min(切忌将细胞冲起)。
1.2.8加入FITC标记的山羊抗兔IgG荧光二抗(Sigma),100μl/孔，37℃湿盒孵育1小时。
1.2.9使用1mlPBS轻轻冲洗细胞3次，每次5min(切忌将细胞冲起)。
1.2.10在倒置显微镜下用蓝色激发光(波长490nm)放大100×～200×观察。
1.2.11结果判定当待检孔中出现特异性绿色荧光，阴性对照空未出现特异性绿色荧光时，试验成立。待检孔被判为阳性。
1.2.12结果单因子血清可与CSFV基因重组腺病毒载体疫苗发生特异性反应，并且因子血清在1：100倍稀释效果较好。
1.3以此单因子血清为基础构建的CSFV荧光免疫检测试剂盒主要成分包括：
(1)用于检测CSFV的单因子血清抗体(兔源)，工作浓度100倍稀释；
(2)二抗：FITC标记的山羊抗兔IgG，工作浓度200倍稀释；
(3)阳性对照样品：猪瘟兔化弱毒C株；
(4)固定液：按丙酮与甲醇体积比1：1配置固定液；
(5)PBS洗液：磷酸盐缓冲液，按Nacl8.0g；Kcl0.2g；Na2HPO43.58g；KH2PO40.24g定容至1L。
实施例2：猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗中病毒含量测定方法及结果
2.1病毒滴度测定
随机选择不同批次冻干的2瓶猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗(20头份/瓶，分别命名为疫苗1和疫苗2)进行连续10倍梯度稀释，共稀释5个梯度(10-3～10-7)，每个梯度接种4个孔(24孔细胞培养板)，每孔取100μl稀释的疫苗液接种于2.5×105个细胞/孔5％CO237℃孵育2～3小时的HEK293细胞上，，剩余4个培养孔作为阴性对照，继续培养48小时后，利用构建的检测CSFV的荧光免疫检测试剂盒进行IFA，计算显微镜下视野中阳性细胞(出现特异性绿色荧光)的个数。
2.2病毒滴度计算方法
2.2.1选择10-4稀释梯度，此梯度视野中至少有5个阳性细胞，随机选择至少5个区域计数。
2.2.2每孔视野数计算标准10×目镜与10×物镜所观察到的视野直径为1.8mm，因此：每个视野的面积＝3.14×(D/2)2＝3.14×0.92＝2.54mm2对于一个标准24孔板，培养面积为2.0cm2，因此：每孔视野数＝2.0cm2/2.54mm2＝2.0cm2/2.54×10-2cm2＝79。
2.2.3疫苗病毒滴度疫苗病毒滴度(IFU/ml)＝(阳性细胞数/区域)×(稀释比例)/(0.1ml)，疫苗1在显微镜下5个视野中计算的平均阳性细胞平均数为7，此孔疫苗稀释了105倍，则疫苗病毒滴度＝7×79×105/0.1＝5.53×107TCID50/ml，详见下表1；疫苗2在显微镜下5个视野中计算的阳性细胞平均数为6，此孔疫苗稀释了105倍，则疫苗病毒滴度＝6×79×105/0.1＝4.74×107TCID50/ml，详见表2。
表1：疫苗1不同稀释梯度下每个视野中的平均阳性细胞数
表2疫苗2不同稀释梯度下每个视野中的平均阳性细胞数

Claims (6)

1.一种用于检测猪瘟病毒的荧光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有如下的组分：
1)一抗：用于检测CSFV的单因子血清抗体；
2)二抗：FITC标记的山羊抗兔IgG；
3)阳性对照样品：猪瘟兔化弱毒株；
4)固定液：按丙酮与甲醇体积比1：1配置；
5)PBS洗液:Nacl8.0g/L；Kcl0.2g/L；Na2HPO43.58g/L；KH2PO40.24g/L；
所述的检测CSFV的单因子血清抗体，其制备方法如下：将CSFV基因重组腺病毒载体疫苗强化免疫SPF兔后，用猪瘟兔化弱毒株进行攻毒，选择攻毒后无反应热的SPF兔采集血清制备而成。
2.权利要求1所述的试剂盒在检测猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗中的病毒含量的应用。
3.一种检测猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗中的病毒含量的方法，其特征在于，所述的方法是将猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗进行连续10倍梯度稀释，在培养板每孔逐滴取100μl稀释的疫苗液接种于在5％CO2、37℃孵育2～3小时的HEK293细胞上，继续培养48小时后，利用构建的检测CSFV的荧光免疫检测试剂盒进行间接免疫荧光检测，通过计算显微镜下视野中阳性细胞的平均个数计算疫苗中的病毒含量。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的阳性细胞为出现绿色荧光的细胞。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的计算疫苗中的病毒含量的步骤如下：
1)计算显微镜下视野中阳性细胞的平均个数,选择一个梯度，此梯度视野中有5-50个阳性细胞，随机选择至少5个区域计数；
2)计算24孔板中每孔视野数；
3)按疫苗病毒滴度(IFU/ml)＝(平均阳性细胞数/每孔视野数)×(稀释比例)/(0.1ml)进行计算疫苗中病毒含量。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的24孔板中每孔视野数为79。
CN201410745718.3A 2014-12-07 2014-12-07 一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法 Active CN104535764B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410745718.3A CN104535764B (zh) 2014-12-07 2014-12-07 一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410745718.3A CN104535764B (zh) 2014-12-07 2014-12-07 一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104535764A CN104535764A (zh) 2015-04-22
CN104535764B true CN104535764B (zh) 2016-05-18

Family

ID=52851332

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410745718.3A Active CN104535764B (zh) 2014-12-07 2014-12-07 一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104535764B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106940371A (zh) * 2017-04-13 2017-07-11 中国兽医药品监察所 一种瘟病毒培养及活毒定量检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103336116B (zh) * 2010-06-22 2016-01-13 普莱柯生物工程股份有限公司 一种猪瘟活疫苗效力检验方法
CN101966341B (zh) * 2010-09-30 2012-06-27 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗及其应用
CN102816863A (zh) * 2011-06-08 2012-12-12 山东绿都生物科技有限公司 猪瘟兔化弱毒疫苗病毒含量定量检测试剂盒及检测方法
CN103698518A (zh) * 2013-12-30 2014-04-02 山东滨州博莱威生物技术有限公司 一种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104535764A (zh) 2015-04-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Meng Hepatitis E virus: animal reservoirs and zoonotic risk
Batten et al. Bluetongue virus serotype 26: Infection kinetics and pathogenesis in Dorset Poll sheep
CN105821006A (zh) 变异猪流行性腹泻病毒弱毒yn150株及其应用
Allan et al. Rapid diagnosis of infectious bursal disease infection by immunofluorescence on clinical material
CN104330561A (zh) 一种利用间接免疫荧光法检测牛病毒性腹泻病毒的方法
CN103616505B (zh) 一种猪瘟兔化弱毒活疫苗效力检测方法
CN108384762A (zh) 猪α肠道冠状病毒及其培养方法和应用
CN113406065B (zh) 一种非洲猪瘟病毒抗体的血清学检测方法
Terregino et al. Conventional diagnosis of Newcastle disease virus infection
CN104726392A (zh) 一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法、及其制备的细胞系和应用
CN103698518A (zh) 一种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法
CN104535764B (zh) 一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法
Wang et al. Dose-dependent pathogenicity of a pseudorabies virus variant in pigs inoculated via intranasal route
Nollens et al. New recognition of Enterovirus infections in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus)
Shen et al. Development and application of an indirect immunohistochemical method for the detection of duck plague virus vaccine antigens in paraffin sections and localization in the vaccinated duckling tissues
CN103864931B (zh) 一种伪狂犬病标准阳性血清的制备及其冻干保存方法
CN102286638A (zh) 一种鸡传染性支气管炎病毒的鉴定方法
CN103160475B (zh) 一种肠道病毒71型病毒株及其用途、疫苗和制备方法
CN105445457A (zh) 猪圆环病毒2型竞争elisa抗体检测试剂盒
CN102533673B (zh) 鸡传染性法氏囊病超强毒的细胞适应株及其应用
Manu et al. Evaluation of an alternative method for determination of Protective Dose50 of Classical swine fever vaccines
Yang et al. Incidence and sero-survey of canine adenovirus type 2 in various animal species
CN101423821A (zh) 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株及其应用
Worwa et al. Detection of neutralizing antibodies against bluetongue virus serotype 8 by an optimized plasma neutralization test
Balyshev et al. Seroimmunological affiliation of African swine fever virus isolated in the Russian Federation

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant