DK164941B - Gaerhybridvektor, transformeret gaercelle samt fremgangsmaade til fremstilling af vaevsplasminogenaktivitor (tpa) - Google Patents

Description

i

DK 164941 B

Den foreliggende opfindelse angår fremstillingen af vævspi asminogenaktivator i gær under anvendelse åf rekombi-nant DNA-teknologi. Nærmere betegnet angår opfindelsen 5 gærhybridvektorer, som indeholder en DNA-sekvens, der koder for en vævspiasminogenaktivator (pro-TPA), der er operabelt koblet til PH05-promotoren, gærceller, som er transformeret med hybridvektorerne, eller som indeholder et chromosomalt integreret gen for væsplasminogenaktiva-10 tor, samt en fremgangsmåde til fremstilling af vævsplas-minogenaktivatoren.

Blodpropper er hovedårsagen til sygdom og dødsfald hos mennesker i den industrialiserede del af verdenen. Blodpropper består af fibrin, som er dannet ud fra den opløselige precurser 15 fibrinogen under indvirkning af enzymet thrombin. En række enzymer og andre stoffer sikrer, at blodpropper normalt kun dannes, når og hvor de er nødvendige for at forhindre blodtab.

Pattedyrplasma indeholder et enzymsystem, som kan opløse fibrinet i blodpropper. En komponent i det fibrinolytiske sy-20 stem er en gruppe enzymer, som kaldes plasminogenaktivatorer, og som omdanner plasminogen (en inaktiv proenzymform af plasmin) til det proteolytiske enzymplasmin. Plasmin nedbryder derefter fibrinnetværket i blodpropperne under dannelse af opløselige produkter. I de tilfælde, hvor legemets thrombolytiske potential 25 er utilstrækkeligt til at fjerne dannede intravaskulære thrombi, f.eks. i patienter med thromboembolismer eller post-kirurgiske komplikationer, kan det være absolut nødvendigt at anvende exogent administrerede thrombolytiske midler.

To aktivatorer for humant plasminogen til thrombolytisk terapi 30 kan fås i handelen. Disse er urokinase, som er en serinprotease isoleret fra human urin eller dyrkede nyreceller, og streptokinase, som er et bakterieprotein, som kan udvindes fra streptokokker. Da ingen af disse enzymer har specifik affinitet til fibrin, er thrombolyse med disse stoffer forbundet med systemisk 35 aktivering af plasminogen, som kan fremkalde vilkårlig fordø- 2

DK 164941 B

jelse af koagulationsproteiner og signifikant forøge risikoen for indre blødninger (haemorrhage) under behandlingen. Endvidere er streptokinase et fremmedprotein i mennesker, og den stimulerer derfor dannelsen af neutraliserende antistoffer, som 5 blokerer dens virkning og fører til allergiske reaktioner, som er skadelige og eventuelt kan fremkalde dødsfald. En anden gruppe plasminogenaktivatorer, som kaldes vævsplasminogenakti-vatorer (som i det følgende forkortes "TPAs", findes i de fleste humane væv. TPAs, som stammer fra forskellige væv, afviger 10 sandsynligvis fra hinanden med hensyn til deres molekylære egenskaber, men de er ens i immunologisk henseende. De er forskellige fra urokinase med hensyn til kemiske og immunologiske egenskaber, deres stærkt forøgede fibrinolytiske virkning i nærværelse af fibrin samt deres store affinitet til fibrin 15 t(1), (2)]. Som følge af deres store affinitet til fibrin er virkningen af TPAs begrænset til området omkring blodproppen, hvorved risikoen for ukontrolleret blødning formindskes væsentligt.

TPA forekommer i to molekylformer, nemlig den aktive to-kæde-20 form, der betegnes TPA, og en inaktiv en-kædeform, som betegnes precursor-TPA eller "pro-TPA", jf. f.eks. litteraturstederne (2), (3) og (4). Pro-TPA kan omdannes til aktivt TPA ved inkubering med katalytiske mængder plasmin fortrinsvis i nærværelse af fibrin. Plasmin udløser eller initierer så-25 ledes sin egen syntese.

Kilder for humant TPA indbefatter f.eks. ekstrakter af forskellige humane væv, som ikke er kommercielt tilgængelige, og forskellige humane tumorceller, som frigør TPAs i forskellig grad [(5), (6)].

30 I beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 41.766 beskrives et TPA, som har en molekylvægt på 72.000, og som er isoleret fra en dyrket human melanomacellelinie (Bowes).

Det er imidlertid klart, at anvendelsen af transformerede, cancerfremkaldende cellelinier, såsom melanomaceller, nød- 3

DK 164941 B

vendigvis må begrænse anvendelsen af TPAs isoleret fra sådanne celler som terapeutiske midler. Det har endvidere vist sig at være vanskeligt at dyrke pattedyrceller i stor målestok, hvilket er nødvendigt for billig og økonomisk fremstilling 5 af proteiner udskilt af disse celler. Dannelsestiden for pattedyrceller er betydeligt større end for mikroorganismeceller, og der kræves således en længere fermenteringsperiode for at opnå en tilstrækkeligt stor celletæthed. Endvidere er den celletæthed, som kan opnås ved dyrkningen af pattedyr-10 celler, væsentligt mindre end den celletæthed, der sædvanligvis kan opnås ved dyrkning af mikroorganismer i industriel målestok. Det er tillige vanskeligere at forbedre stammer i tilfælde af pattedyrceller end ved mikroorganismer.

Det er således fordelagtigt at fremstille TPA ved hjælp af 15 mikroorganismer under anvendelse af den veludviklede teknologi i den industrielle mikrobiologi og nyudviklingen indenfor re-kombinant DNA-teknologien.

For nylig har man foretaget kloning og ekspression i Escherichia coli af cDNA for human vævstypeplasminogenaktivator afledt af 20 en human melanomacellelinie [ (7), (8)]. I et tilfælde (7) har det udtrykte polypeptid de fibrinolytiske egenskaber, som er karakteristiske for ægte humant TPA.

Der forekommer imidlertid ofte kontaminerende endotoxiner i proteiner fremstillet ud fra Escherichia coli, og det er nød-25 vendigt at fjerne disse ved hjælp af dyre rensningstrin for at fremstille et anvendeligt farmaceutisk produkt.

Da alle eukaryoter har den egenskab, at de udtrykker genetisk information, kan ekspressionen af eukaryotiske gener forløbe mere effektivt i en eukaryotisk vært end i Escherichia 30 coli. Blandt de eukaryote organismer, som er egnede til anvendelse, er gær den letteste at arbejde med. Sekretionssystemet i gær ligner systemet i celler i højere dyr, og det er kendt, at gærceller kan bearbejde proteiner ved at spalte signalsekvensen (uladet N-terminaldel i et protein, sædvanligvis fra- 4

DK 164941 B

spaltning under sekretionstransporten) (9). Det ser endvidere ud til, at proteiner, som træder ind i og gennemløber det sekretoriske system i en eukaryotvært, sandsynligvis danner tertiærstruktur i høj grad sammenlignet med proteiner, 5 som dannes i cytoplasmaet. Det er interessant at bemærke, at prokaryoter, såsom Escherichia coli, ikke synes at have store proteiner med højere strukturorden. Sekretionssystemet er forbundet med glycosyleringssystemet. Grundtrinene, som fører til glycosylerede proteiner, er ens i alle eukaryoter, og det an-10 tages,at gærceller i modsætning til prokaryote celler, såsom Escherichi coli, kan danne proteiner, som er glycosylerede (selv om nogle sluttrin i gærglycosyleringssysternet afviger fra trinene i pattedyrceller og muligvis må modificeres i gær) .

15 Da gær er en mikroorganisme, er gærceller lette at dyrke. Den cellemasse, som kan opnås pr. rumfang fermenteringsvæske, er betydeligt større for gær end for Escherichia coli. Endvidere er gærs fermenteringsforhold klarlagt, og betingelserne for fermentering i stor målestok findes allerede. Dertil kommer, 20 at gærceller ikke indeholder endotoxiner.

Der kendes flere fremgangsmåder til fremstilling af vævsplasmi-nogenaktivatorer ved hjælp af celledyrkningsteknik eller ved anvendelse af rekombinant DNA-teknologi under anvendelse af Escherichia coli som værtsorganismen. Fremgangsmåden til 25 fremstilling af TPA ved hjælp af gær, som kombinerer fordelen ved en mikroorganisme, der let kan håndteres og dyrkes, og fordelen ved en eukariot mekanisme er ikke beskrevet i litteraturen. Det er således formålet med opfindelsen at tilvejebringe en sådan fremgangsmåde. Det er tillige formålet med opfin-30 delsen at tilvejebringe gærvektorsystemer, som effektivt kan udtrykke en indsat TPA-kodningssekvens.

Opfindelsen beskrives mere detaljeret i det følgende.

1. Hybridvektorer indeholdende en TPA-kodningssekvens

Den foreliggende opfindelse angår gærhybridvektorer, som er 5

DK 164941 B

kendetegnet ved at indeholde gær-PH05-promotoren operativt forbundet med en DNA-sekvens forbundet i ramme med den for human vævspiasminogenaktivator (pro-TPA) kodende 5 region og en DNA-sek- vens, der indeholder transkrip-tionstermineringssignaler for et gaergen.

TPA-DNA'et, som er en del af gærhybridvektorerne ifølge den foreliggende opfindelse, kan være afledt af en vilkårlig human celle, som er i stand til at producere TPA.

10 Sådanne celler kan stamme fra kræftceller eller celler, som ikke er kræftceller, og er fortrinsvis afledt af en etableret cellelinie.

Eksempler på egnede celler omfatter melanomaceller, såsom Bowes-celler eller Malme-celler, fibrosarcoma-, epidermale 15 carcinoma-, blærecarcinoma-, hypernephroma- eller liposarcoma-celler, endvidere HeLa-celler, fibroblaster, lymphocyter, ke-ratocyter eller brystepithelceller eller embryoniske nyreceller. Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen anvendes HeLa-celler. TPA-DNA'et kan være kromosomalt DNA eller 20 cDNA. Kromosomalt TPA-DNA kan isoleres fra en gensamling, som indeholder TPA-genet, og TPA-cDNA kan fremstilles over mRNA'et under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Det er også muligt at anvende fragmenter af TPA-kodningssekvensen eller mutantvarianter af genet, som kan have identiske eller ændrede 25 proteolytiske egenskaber og/eller aktiveringsforhold under omdannelsen af pro-TPA til aktivt TPA. Nogle af disse genprodukter kan have nye ønskede egenskaber.

Den reducerbare PH05-promotor kan tilkobles eller frakobles efter ønske ved blot at forøge eller formindske koncentrationen af uorganisk phosphat i mediet. Promotoren kan således frakobles under gærens eksponentielle vækstfase og kan tilkobles udelukkende under den tidlige stationære fase ved maksimal celletæthed, hvilket muliggør ekspression af TPA-genet.

6

DK 164941 B

Hybridvektorerne ifølge opfindelsen omfatter en signalsekvens. Egnede signalsekvenser er PH05-signalsekvensen eller TPA-signalsekvensen. Andre signalsekvenser, såsom 5 sekvenser fra gærinvertase- eller α-faktor-generne, kan også anvendes. Alternativt kan sammensmeltede signalsekvenser konstrueres ved ligering af en del af PH05-signalsekvensen med en del af TPA-signalsekvensen. Man foretrækker de kombinationer, som muliggør en præcis 10 spaltning mellem signalsekvensen og den modne TPA-aminosyresekvens. Andre sekvenser, såsom pro- eller spacer-sekvenser, som eventuelt kan bære specifikke proces-signaler, kan også indgå i konstruktionen for at lette nøjagtig behandling af præcusor-moleky-15 ler. Der kan eventuelt dannes sammensmeltede proteiner, som indeholder interne proces-signaler, der tillader korrekt modning in vivo eller in vitro. Fortrinsvis indeholder proces-signalerne en Lys-Arg-rest, som erkendes eller identificeres ved hjælp af en gærendopeptidase, der findes i Golgi-20 membranerne.

Efter ekspression af TPA-genet går genproduktet ind i sekretionssystemet og transporteres til det periplasmatiske rum.

Hvis der kan opnås yderligere udskillelse gennem cellevæggen til dyrkningsmediet, kan der opnås en betydelig forøgelse af 25 udbyttet. Endvidere kan udvindingsprocessen forenkles, når cellerne ikke skal lukkes op. Desuden kan TPA udvindes uden en yderligere methioninrest ved N-terminalen, da der ikke er brug for et ATG som et translationsstartsignal foran den modne kodningssekvens. Da glycosylering er forbundet med sekre-30 tionssystemet antages det, at det dannede TPA er glycosyleret. Der er forskellige forhold, som bevirker, at glycosyleret TPA er fordelagtigt i forhold til ikke-glycosyleret TPA. Glycosy-leret TPA har således større lighed med det ægte TPA fra pattedyrceller end ikke-glycosyleret TPA. Endvidere er tertiær-35 strukturen i proteiner som TPA sandsynligvis i en vis grad afhængig af tilstedeværelsen af glycosylrester. Det antages, at kulhydratrester i TPA-molekylerne har en fordelagtig indflydelse på den kemiske stabilitet og den farmakologiske virkning.

7

DK 164941 B

Foruden en gærpromotor og TPA-kodningsområdet indeholder hybridvektorerne ifølge opfindelsen andre DNA-sekvens(er), som ikke er væsentlige eller har mindre betydning for promotorens funk-5 tion, dvs. for ekspressionen af TPA-kodningsområdet, men som kan udføre vigtige funktioner, f.eks. ved propageringen af gærcellerne, som er transformeret med hybridvektorerne. Den eller de yderligere DNA-sekvenser kan være afledt af prokaryote og/eller eukaryote celler og kan omfatte kromosomale og/el-10 ler ekstrakromosomale DNA-sekvenser. De øvrige DNA-sekvenser kan eksempelvis stamme fra (eller bestå af) plasmid-DNA, såsom bakteriel eller eukaryotisk plasmid-DNA, virus-DNA og/eller kromosomal-DNA, såsom bakteriel, gær eller højere eukaryotisk kromosomal DNA. Foretrukne hybridvektorer indeholder yder-15 ligere DNA-sekvenser afledt af bakterieplasmider, især

Escherichia coli-plasmid pBR322 eller beslægtede plasmider, bakteriofag-λ, gær-2μ-plasmid, og/eller kromosomal DNA fra gær.

Fortrinsvis bærer de yderligere DNA-sekvenser et gærreplika-20 tionsområde og en selektiv genetisk markør for gær. Hybridvektorer, som indeholder et gærreplikationsområde, f.eks. et kromosomalt, autonomt kopierende segment (ars), opretholdes ekstrakromosomalt i gærcellen efter transformeringen og kopieres autonomt efter mitosis. Hybridvektorer, som indeholder 25 sekvenser, der er homologe til gær-2y-plasmid DNA, kan ligeledes anvendes. Disse hybridvektorer vil blive integreret ved rekombination i 2y-plasmider, som allerede forekommer i cellen, eller vil kopieres autonomt. 2y-sekvenser er særligt egnede til højfrekvens trans formationsplasmider og forårsager høje 30 kopital.

Endvidere kan hybridvektorerne ifølge opfindelsen indeholde en DNA-sekvens som del af et gen, der findes i værtsgærkromosomet (f.eks. PH05-genet eller dets promotor bundet til TPA-kodningsområdet) . På grund af den homologe sekvens, som bør 35 udgøre et stræk på ca. 20-100deoxynucleotider, kan hele vektoren eller lineære fragmenter deraf inkorporeres stabilt i værtskromosomet ved rekombination. Under propageringen vil dattercellerne således bevare det indførte genetiske materiale, selv uden selektionstryk. Eksempelvis kan TPA-genet il »nrnmAfΛν·ΛτηΓS^/Q4- af Ω+· TrvnmAonma Ί + πλτ*- 8

DK 164941 B

gen ved 5'-enden og (en del af) 31-flankeringsregionen i genet ved 3'-enden, integreres stabilt på stedet for det kromosomale gen. I en foretrukket udførelsesform for opfin-5 delsen anvendes et lineært DNA-segment, som indeholder PH05-promotoren, TPA-kodningsområdet og PH05-3'-flankeringsområdet til at integrere TPA-genet i det pågældende gærkromosom, nemlig gærkromosom II, på PH05-stedet.

Hvad angår den selektive gen-markør for gær kan der anvendes 10 et vilkårligt markørgen, som letter selektionen af transfor-manter som følge af den phenotypiske ekspression af markøren. Egnede markører for gær er især sådanne, som udtrykker antibiotisk resistens eller, i tilfælde af auxotrofe gærmutanter, gener, som kompletterer værtslæsioner. Tilsvarende gener bi-15 bringer eksempelvis resistens overfor antibiotikumet cyclo-heximid eller tilvejebringer prototrofi i en auxotrof gærmutant, f.eks. URA3-, LEU2-, HIS3- eller TRPl-genet. Som markører er det også muligt at anvende strukturgener, som er forbundet med et autonomt kopierende segment, forudsat at 20 værten, som skal transformeres, er auxotrof for det produkt, som udtrykkes ved hjælp af markøren.

Det er fordelagtigt, at de yderligere DNA-sekvenser, som findes i hybridvektorerne ifølge opfindelsen, også indeholder et replikationsområde og en selektiv genetisk markør for en 25 bakterievært, f.eks. Escherichia coli. Der opnås fordele ved tilstedeværelsen af et Escherichia coli-replikationsområde og en Escherichia coli-markør i en gærhybridvektor. For det første kan der opnås store mængder hybridvektor-DNA ved vækst og forstærkning i Escherichia coli, og for det andet gennemfø-30 føres dannelsen af hybridvektorer hensigtsmæssigt i Escherichia coli under anvendelse af alle sider af kloningsteknologien baseret på Escherichia coli. Escherichia coli-plasmider, såsom pBR322 og lignende, indeholder både Escherichia coli-replikationsområdet og Escherichia coli-genetiske markører, 35 som tilvejebringer resistens mod antibiotika, f.eks. tetra-cyclin og ampicillin, og de anvendes med fordel som en del af gærhybridvektorerne.

9

DK 164941 B

Det foretrækkes endvidere, at gærhybridvektorerne ifølge opfindelsen indeholder en 31-flankeringssekvens fra et gærgen, som indeholder de rigtige signaler for transkriptionstermine-5 ring og polyadenylering. Egnede 3'-flankeringssekvenser er f.eks. flankeringssekvenserne fra PH05-genet.

Den yderligere DNA-sekvens, som f.eks. indeholder replikations-origin og genetiske markører for gær og en bakterievært (se ovenfor), betegnes i det følgende som "vektor-DNA”, som sam-10 men med gær-promotoren og TPA-kodningsområdet danner en hybridvektor ifølge opfindelsen.

Hybridvektorerne fremstilles under anvendelse af kendte fremgangsmåder, f.eks. ved at indføre en gær-PH05-promotor og et TPA-kodningsområde, som kontrolleres af promotoren, i et vektor-15 DNA.

Der kan anvendes hensigtsmæssigt planlagt (mapped) lineært eller fortrinsvis cirkulært vektor-DNA, f.eks. bakteriel plasmid-DNA eller lignende (se ovenfor), som har mindst ét restriktionssted, fortrinsvis to eller flere restriktionssteder.

20 Det er en fordel, at vektor-DNA'et i forvejen indeholder kopieringsområder og gen-markører for gær og/eller en bakterievært. Vektor-DNA'et spaltes ved anvendelse af en passende restriktionsendonuclease. Det spaltede DNA bindes til det DNA-fragment, som indeholder gær-PH05-promotoren, og til DNA-25 segmentet, som koder for TPA. Inden eller efter bindingen til promotoren og TPA-kodningsområdet (eller samtidigt dermed), er det også muligt at indføre replikationsområder og/eller markører for gær eller en bakterievært. I alle tilfælde skal restriktions- og anelleringsbetingelserne vælges således, at 30 der ikke sker nogen forstyrrelse i de væsentlige funktioner i vektor-DNA'et og promotoren. Hybridvektoren kan opbygges 10

DK 164941 B

ved ligering af to DNA-segmenter, der indeholder alle de sekvenser, som har interesse.

Der kan anvendes forskellige teknikker til sammenknytning af DNA-segmenter in vitro. Korte ender (fuldstændigt base-parre-5 de ENA-duplekser) dannet ved hjælp af visse restriktionsendo-nucleaser kan ligeres direkte med T4-DNA-ligase. Det er mere almindeligt, at DNA-segmenter bindes gennem deres enkeltstrengede, cohæsive ender og lukkes covalent ved hjælp af en DNA-ligase, f.eks. T4-DNA-ligase. Sådanne enkeltstrengede cohæsive 10 ender kan dannes ved at spalte DNA med en anden type endonuclease, som danner forskudte eller enkeltstrengede ender (de to strenge i DNA-duplékset spaltes forskellige steder i en afstand på nogle få nucleotider). Enkeltstrenge kan også dannes ved addition af nucleotider til korte ender eller for-15 skudte eller enkeltstrengede ender under anvendelse af terminaltrans ferase ("homopolymeric tailing") eller ved simpelthen at fjerne én streng fra et DNA-segment med kort ende med en egnet exonuclease, såsom λ-exonuclease. En anden metode til fremstilling af forskudte eller enkeltstrengede ender be-20 står i, at der til DNA-segmentet med korte ender ligeres eller bindes et kemisk fremstillet linker-DNA, som indeholder et genkendelsessted eller identifikationssted for en endonuclease, der danner forskudte eller enkeltstrengede ender, hvorefter det dannede DNA fordøjes med den pågældende endo-25 nuclease.

For at opnå effektiv ekspression skal TPA-genet være rigtigt anbragt med hensyn til sekvenserne, som indeholder transkrip-tions- (gær-promotoren) og translationsfunktionerne (ribosombindingsstederne) . For det første skal bindingen af DNA-seg-30 mentet indeholdende PH05-promotoren med TPA-kodningsområdet dannes i den rigtige orientering. Hvis to orienteringer er mulige, fastlægges den korrekte ved hjælp af konventionel restriktionsanalyse. Hybridvektorer, som indeholder et indsat TPA-gen med for kort orientering, kan reorienteres ved f jer-35 nelse af det indsatte gen med en egnet restriktionsendo- nuclease, hvorefter genet atter bindes med hybridvektorfrag-

XI

DK 164941 B

mentet. I alle tilfælde kan forkert orientering undgås ved ligering af to DNA-segmenter, som hver især har forskellige restriktionssteder for enderne. Endvidere bør konstruktionen af hybridvektoren gennemføres på en sådan måde, at der kan 5 opnås korrekt transkriptionsinitiering og -terminering.

Hvad angår det sidste, skal transkriptet fortrinsvis ende i en DNA-sekvens afledt af kromosomalt gær-DNA eller gær-2y-plasmid. Fordelagtigt slutter transkriptet i en DNA-sekvens, som indeholder transkriptionstermineringssignaler fra et gær-10 gen, f.eks. fra PH05 eller TRPl. For det andet skal der dannes et korrekt aflæsningssystsn. Da nucleotidsekvensen i promotorområdet og TPA-kodningsområdet sædvanligvis er kendt, er der ikke problemer med tilvejebringelsen af det korrekte aflæsningssystem.

15 Intermediære produkter, såsom vektorer, der stadig mangler en eller flere vigtige funktioner, samt de færdige hybridvektorer ifølge opfindelsen kan eventuelt transformeres til en bakterievært, især Escherichia coli, af de ovenfor anførte årsager (f.eks. fremstilling af store mængder af henholdsvis 20 intermediære produkter og hybridplasmider). Bakterievektorer, såsom Escherichia coli-plasmidet pBR322, og de fragmenter deraf, som indeholder et bakteriereplikationsområde og en eller flere gen-markører, er de mest foretrukne vektorer af denne grund. Ved anvendelse af en sådan bakterievektor omfatter 25 sluttrinene ved fremstillingen af gærhybridvektorer fortrinsvis også indføringen af en genetisk markør og et kopieringsområde for gær.

2. Transformation af gær med hybridvektorer, som indeholder en TPA-kodningssekvens__

Brugbar gær omfatter arter af slægterne Saccharomyces, Schizo-saccharomyces, Torulopsis og beslægtede slægter [jf. (11)], især stammer af Saccharomyces cerevisiae.

12

DK 164941 B

Transformeringen af gær med hybridvektorerne kan gennemføres under anvendelse af kendte fremgangsmåder beskrevet i litteraturen, f.eks. i overensstemmelse med fremgangsmåden beskre-5 vet af Hinnen et al. (12). Denne fremgangsmåde kan opdeles i tre trin: (1) Fjernelse af gærcellevæggen.

(2) Behandling af de "nøgne" gærceller (sfæroplaster) med transformering-DNA'et i nærværelse af PEG (polyethylen-2+ 10 glycol) og Ca -ioner.

(3) Regenerering af cellevæggen og udvælgelse af de transformerede celler på et fast agarlag.

Der foretrækkes følgende fremgangsmåder: ad (1)i Gærcellevæggen fjernes enzymatisk under anvendelse af 15 forskellige glucosidasepræparåter, f.eks. snegletarmsaft (f.eks. "Glusulase"® eller "Helicase"®) eller enzymblandinger fremstillet ud fra mikroorganismer (f.eks. "Zymolyase"®) i osmotisk stabiliserede opløsninger (f.eks. 1 M sorbitol).

ad (2): Gær-sfæroplasterne klumper sammen i nærværelse af 20 PEG, og der induceres lokale fusioner af cytoplasmamembranerne. Dannelsen af sandsynlige sammensmeltningsbetingelser ("fusion-like") er af afgørende betydning, og mange transformerede gærceller vil blive diploide eller endog triploide under transformationsprocessen. Fremgangsmåder, som tillader 25 selektion af sammensmeltede sfæroplaster, kan anvendes til koncentrering af transformanter, dvs. at der let kan screenes for transformerede celler blandt pre-selekterede fusionsproduk ter.

ad (3): Da gærceller uden cellevæg ikke deler sig, er det 30 nødvendigt at cellevæggen regenereres. Denne regenerering gennemføres hensigtsmæssigt ved indlejring med sfæroplaster-ne i agar. Eksempelvis blandes smeltet agar (ca. 50°C) med sfæroplasterne. Ved afkøling af opløsningen til gærdyrkningstemperaturer (ca. 30°C) dannes der et fast lag. Dette 35 agarlag skal forhindre hurtig diffusion og tab af vigtige makromolekyler fra sfæroplasterne og derved lette regenereringen af cellevæggen. Imidlertid kan regenereringen af cellevæggen også opnås (dog med lavere effektivitet) ved at anbrin-cre sfæror>lasterne overfladen af uræformede acarlaa.

13

DK 164941 B

Det foretrækkes at fremstille regenereringsagaren på en sådan måde, der tillader regenerering og udvælgelse af transformerede celler på samme tid. Da gærgener, som koder for enzymer 5 ved biosyntetisk aminosyresyntese, sædvanligvis anvendes som selektive markører (jf. kap. 1) , gennemføres regenereringen fortrinsvis i gærminimalmediumagar. Hvis der imidlertid kræves en meget høj grad af regenerering,kan der med fordel anvendes følgende to-trinsmetode: (1) regenerering af cellevæg-10 gen i et rigt komplekst medium, og (2) udvælgelse af de transformerede celler ved kopiplettering af cellelaget på selektive agarplader.

Hvis hybridvektoren ikke indeholder noget markør-gen, kan de transformerede celler også identificeres ved hjælp af 15 andre fremgangsmåder. Sådanne fremgangsmåder indbefatter f.eks. in situ hybridisering med et mærket DNA-fragment, som er homologt med hensyn til sekvenser i hybridvektoren [f.eks. ifølge Hinnen et al. (12)], in situ immunoanalyse, forudsat at antistoffet for produktet fra det introducerede 20 gen er tilgængeligt, eller andre screeningsmetoder, som bestemmer genprodukter, der er indkodet ved hjælp af det eller de transformerende plasmider.

Eventuelt kan gæren co-transformeres med en hybridvektor ifølge opfindelsen, og en anden vektor, som indeholder en gene-25 tisk markør for gær. Hvis de to forskellige vektorer har DNA-sekvenser til fælles (disse kan være bakteriesekvenser, som forekommer i vektorerne), kan der foregå rekombinering, som fører til det sammensmeltede hydbridmolekyle, som kan selekte res.

30 Gæren kan også være co-transformeret med et lineært DNA-segment, som indeholder TPA-genet flankeret af PH05-pro-motoren og PH05-terminatorsekvenserne og en vektor indeholdende en selektiv markør for gær. Co-transformeringen tillader opkoncentrering af de gærceller, som har optaget 35 DNA, der ikke direkte kan selekteres for. Da kompetente 14

DK 164941 B

celler optager alle typer DNA, vil en stor procentdel celler transformeret med en selektiv vektor også optage alt yderligere DNA (såsom det lineære segment indeholden-5 de TPA-genet med andre flankeringssekvenser (50). Som følge af tilstrækkeligt lange homologe sekvenser (f.eks. med en længde på ca. 20-100 deoxynucleotider) vil TPA-genet være stabilt integreret i værtchromosomet ved stedet for PH05-genet, nemlig i gærchromosom II.

10 Et lineært DNA-segment indeholdende en gær-PH05-promotor operativt forbundet med en DNA-sekvens, der består af PH05-signalsekvensen forbundet i ramme med genet for vævspiasminogenaktivator, og en DNA-sekvens indeholdende transkriptionsterminerings signal er for gær-PH05-gen er 15 også omfattet af den foreliggende opfindelse.

Opfindelsen angår endvidere transformerede gærstammer, der er kendetegnet ved at være valgt blandt gruppen bestående af gærstammer transformeret med en hybridvektor indeholdende gær-PH05-promotoren og et pro-TPA-20 kodningsområde, som er kontrolleret af promotoren, og gærværter med et gen for vævsplasminogenaktivator (pro-TPA) stabilt integreret i et gærchromosom og kontrolleret af en chromosomal gær-promotor.

3. Dyrkning af transformerede gærceller og isolering af 25 det udtrykte TPA_

Det primære produkt ved TPA-gen-ekspressionen i gær ifølge den foreliggende opfindelse er det enstrengede precursorprotein for TPA ("pro-TPA"). Hvis der imidlertid findes proteaser enten i gærværtcellen, i det peri-30 plasmiske rum eller i dyrkningsvæsken, kan det primært 15

DK 164941 B

udtrykte pro-TPA i det mindste delvis omdannes til dobbeltstrenget TPA. Det faktisk isolerede produkt kan derfor bestå af TPA, pro-TPA eller blandinger deraf. Da 5 der forud for TPA-kodningsområdet findes en signalsekvens i hybridvektorerne ifølge opfindelsen, er udskillelse forbundet med i det mindste delvis glycosylering. Det dannede produkt kan derfor også indeholde glycosylerede og ikke-glycosylerede proteiner.

10 Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af TPA og pro-TPA eller blandinger deraf, hvori TPA og pro-TPA foreligger i glycosyleret eller ikke-glycosyle-ret form eller i en blanding af disse former, og fremgangsmåde ifølge opfindelsen er kendetegnet ved at omfat-15 te følgende trin: Dyrkning af en gærstamme transformeret med en hybridvektor indeholdende en gær-PH05-promotor operativt forbundet med en DNA-sekvens bestående af en signalsekvens forbundet i ramme med kodningsområdet for human vævspiasminogenaktivator (pro-TPA) og en DNA-se-20 kvens indeholdende transkriptionstermineringssignalerne for et gærgen eller en gærstamme med genet for human vævspiasminogenaktivator (pro-TPA) stabilt integreret i gærchromosomet og under kontrol af en chromosomal gær-PH05-promotor under passende næringsbetingelser og 25 isolering og rensning af proteinerne og, om ønsket, adskillelse af en dannet blanding af TPA og pro-TPA i de enkelt komponenter og, til fremstilling af TPA uden indhold af pro-TPA, omdannelse af det dannede pro-TPA til TPA og, om ønsket, adskillelse af de dannede glycosyle-30 rede produkter fra ikke-glycosylerede produkter i en blanding og, til fremstilling af ikke-glycosyleret protein, som ikke indeholder glycosyleret protein, fjernelse af glycosylrester i de dannede proteiner.

16

DK 164941 B

a. Dyrkning af transformerede gærceller

De transformerede gærceller ifølge den foreliggende opfindelse dyrkes i et flydende substrat, som indeholder assimiler-5 bare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte.

Der kan anvendes forskellige carbonkilder. Som eksempler på foretrukne carbonkilder kan nævnes assimilerbare kulhydrater, såsom glucose, maltose, mannitol eller lactose, eller et acetat, som kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Egnede ni-10 trogenkilder indbefatter f.eks. aminosyrer, såsom casamino-syrer, peptider og proteiner og deres nedbrydningsprodukter, såsom trypton, pepton eller kødekstrakt, endvidere gærekstrakt, maltekstrakt, majstøbevand samt ammoniumsalte, såsom ammo-niumchlorid, ammoniumsulfat eller ammoniumnitrat, som kan 15 anvendes alene eller i passende blandinger. Uorganiske salte kan endvidere eksempelvis indeholde sulfater, chlorider, phosphater og carbonater af natrium, kalium, magnesium og calcium. Desuden kan dyrkningsmediet også indeholde vækstfremmende stoffer, såsom f.eks. sporelementer, såsom jern, zink, mangan 20 og lignende, eller individuelle aminosyrer.

Gærceller transformeret med autonomt kopierende plasmider, f.eks. plasmider indeholdende gær-2y-plasmid-DNA, har i varierende grad tendens til at miste det indførte hybridplasmid [jf. (13)]. Af denne grund skal sådanne gærceller dyrkes 25 under selektive betingelser, dvs. betingelser, som kræver ekspressionen af et plasmidkodende gen for vækst. De fleste selektive markører, som anvendes for tiden, er gener, der koder for enzymer for aminosyre eller purinbiosyntese. Dette gør det nødvendigt at anvende syntetiske minimalmedier, som 30 mangler den tilsvarende aminosyre eller purinbase. Imidlertid kan nogle gener, som bibringer resistens overfor et passende biocid, anvendes lige så godt [f.eks. gener, som bibringer resistens overfor cycloheximid, overfor aminoglycosid G 418 (14), overfor et tungmetal eller lignende]. Gærceller trans-35 formeret med vektorer, som indeholder antibiotiske resistensgener, dyrkes i komplekse medier, der indeholder det tilsvarende antibiotikum, hvorved der opnås større væksthastigheder og højere celletætheder.

17

DK 164941 B

Gærceller transformeret med DNA integreret i kromosomerne kræver ikke selektive vækstbetingelser. Disse transformerede celler er tilstrækkeligt stabile til, at der opstår vækst uden 5 selektionstryk. Af ovennævnte årsag dyrkes disse celler fordelagtigt i komplekse medier.

Gærceller indeholdende hybridplasmider med en konstitutiv promotor, f.eks. PH03 eller ADHI, udtrykker TPA-genet knyttet til promotoren uden inducering. Da TPA-genet er under kontrol af den 10 regulerede PH05-promotor> må dyrkningsmediets sammensætning tilpasses med henblik på opnåelse af maksimale koncentrationer af mRNA-transkripter, dvs. at vækstmediet må indeholde lave •koncentrationer af uorganisk phosphat for- tilkobling af denne promotor.

15 Dyrkningen gennemføres under anvendelse af konventionel dyrkningsteknik. Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur, pH-værdien af mediet og fermenteringstiden, vælges på en sådan måde, at der opnås maksimale koncentrationer af TPA. En valgt gærstamme dyrkes fortrinsvis under aerobe betingelser i sub-20 mers kultur med rystning eller omrøring ved en temperatur på ca. 25 til ca. 35°C, fortrinsvis ved ca. 30°C, ved en pH-vær-di på 4-8, f.eks. ved en pH-værdi på ca. 7, og i fra ca. 4 til ca. 20 timer, fortrinsvis indtil der er opnået maksimalt udbytte af proteiner.

25 b. Isolering og rensning af det udtrykte TPA

Når de transformerede gærceller er dyrket til en tilfredsstillende celletæthed, består det første trin til udvinding af det udtrykte protein i frigørelse af proteinet fra det indre af cellen. Ved de fleste metoder fjernes cellevæggen først ved 30 enzymatisk fordøjelse med glucosidaser (jf. afsnit .2). Derpå behandles de dannede sfæroplaster med detergenter, såsom "Triton"·. Eventuelt kan der til oplukning af cellerne anvendes mekaniske kræfter, såsom forskydningskræfter (f.eks. X-presse, fransk presse) eller rystning med glasperler. I den » 18

DK 164941 B

dannede proteinblanding opkoncentreres TPA på konventionel måde, f.eks. ved fjernelse af størsteparten af detikke-'protein-holdige materiale ved behandling med polyethylenimin, fæld-5 ning af proteinerne ved mætning af opløsningen med ammonium-sulfat eller trichloreddikesyre, gelelektroforese, dialyse, kromatografi, f.eks. ionbytterkromatografi, størrelsesudelukkelseskromatografi, HPLC eller HPLC med omvendt fase, mo-lekylsortering på en egnet "Sephadex"®-søjle eller lignende.

10 Den endelige rensning af det forrensede produkt kan f.eks. opnås ved affinitetskromatografi, f.eks. antistofaffinitetskromatografi, især monoklonalt antistofaffinitetskromatografi under anvendelse af monoklonale anti-TPA-antistoffer fæstnet på en uopløselig matrix på i og for sig kendt måde og lig-15 nende metoder.

Andre foretrukne fremgangsmåder til isolering af TPA fra fermenteringsvæsker består i selektiv adsorption af TPA på et bærestof med specifik affinitet for opløselige fibrinfrag-menter, som er covalent bundet på en uopløselig matrix, f.eks.

20 dextran [f.eks. (15)] eller, især en DE-3 "Sepharose"®-søjle.

De-3 er en trypsininhibitor, som findes i frøene fra Erythrina latissima (16). Det har vist sig, at DE-3 også er i stand til at inhibere TPA-aktivitet. Den rensede DE-3-inhibitor kan således kobles til en uopløselig matrix, f.eks. BrCN-aktiveret 25 "Sepharose"®, under anvendelse af standardmetoder. TPA adsor-beres til inhibitormatrixen og kan elueres med en puffer, som indeholder et chaotropt middel.

Ved en foretrukket udførelsesform for den foreliggende opfindelse ledes dyrkningsmediet, eventuelt efter rensning 30 under anvendelse af et eller flere af de ovenfor anførte rensningstrin, ved stuetemperatur gennem en søjle bestående BrCN-aktiveret "Sepharose"®, hvortil DE-3-inhibitoren er koblet. Efter vaskning af søjlen elueres den adsorberede vævsplasminogenaktivator ved behandling af søjlen med en 35 pufferopløsning, f.eks. phosphatpufret natriumchloridopløs-ning, med en pH-værdi på ca. 5,5-6,0 og indeholdende et chaotropt middel, såsom KSCN, i en mængde på fra ca. 1,4 19

DK 164941 B

til ca. 2,0 mol pr. liter, fortrinsvis 1,6 mol pr. liter. Eventuelt kan benzamidin eller arginin vælges .som frigørelsesmiddel. Med fordel sættes et detergent, især et ikke-iono-5 gent detergent, såsom "Triton"® X-lOO eller "Tween"® 80, til alle pufferopløsninger, som anvendes ved rensningstrinene for at forhindre adsorptionen af vævsplasminogenaktivator til beholderoverflader og for at opnå forbedret stabilitet. Detergentet kan tilsættes til en s lutkoncentration på 0,01 10 til 0,1%.

I det tilfælde, hvor vævsplasminogenaktivatoren udskilles af gærcellen i det periplasmiske rum, kan der anvendes en simplificeret metode: Proteinet udvikles uden lysering af cellerne ved enzymatisk fjernelse af cellevæggen eller ved behandling 15 med kemiske midler, f.eks. thiolreagenser eller EDTA, som fremkalder beskadigelser af cellevæggen, hvilket muliggør frigørelse af det dannede ΤΡΑ. I det tilfælde, hvor TPA udskilles i fermenteringsvæsken, kan det udvindes direkte derfra.

Dyrkning af gærceller, som indeholder et kromosomalt integre-20 ret ΤΡΑ-gen og isolering og rensning af det udtrykte TPA, gennemføres på sammen måde som beskrevet ovenfor.

Til fremstilling af TPA, som praktisk taget ikke indeholder pro-ΤΡΑ, omdannes pro-ΤΡΑ enzymatisk til TPA, f.eks. ved indvirkning af plasmin eller et enzym, som har en tilsvarende 25 virkning på pro-TPA. Til fremstilling af pro-ΤΡΑ, som praktisk taget ikke indeholder TPA, anvendes der fordelagtigt en proteaseinhibitor, såsom aprotinin ("Trasylol"®) eller basisk pancreastrypsininhibitor, ved rensningsmetoden for at inhibere spor af proteaser, som kan forekomme, og som kan 30 fremkalde (partiel) omdannelse af pro-TPA til TPA. Den endelige rensning opnås derefter ved kromatografi på en søjle, som indeholder et selektivt affinitetsreagens, såom DE-3, i nærværelse af en inhibitor, der selektivt binder udelukkende TPA og ikke pro-TPA, som f.eks. diisopropylfluorphosphat 35 (DFP) eller nitrophenylguanidinobenzoat. Disse reagenser 20

DK 164941 B

forhindrer, at TPA adsorberes til affinitetssøjlen. TPA vil derfor passere gennem DE-3-søjlen, hvorimod pro-TPA adsorberes til søjlen og kan elueres som beskrevet ovenfor.

-5 En blanding af glycosylerede og ikke-glycosylerede proteiner kan adskilles f.eks. ved kromatografi på en concanavalin-A-sepharose-søjle. Ikke-glycosylerede produkter vil passere gennem søjlen, hvorimod glycosylerede produkter adsorberes selektivt, hvorpå de kan elueres på konventionel måde, f.eks.

10 med oc-methylmannosid i kombination, med et chaotropt middel, såsom KSCN.

Det er også muligt at fjerne glycosyIrester ad enzymatisk vej, f.eks. ved indvirkning af endoglycosidase H. Denne metode muliggør fremstilling af ikke-glycosylerede produkter i 15 praktisk taget ren form.

TPAs og pro-TPAs, som fremstilles ifølge den foreliggende opfindelse, har værdifulde farmakologiske egenskaber. Disse proteiner kan således anvendes i analogi til kendte plasmino-genaktivatorer i mennesker til forebyggelse eller behandling 20 af thrombose eller andre tilstande, hvor det er ønskeligt at fremkalde lokal fibrinolytisk eller proteolytisk aktivitet via mekanismen med plasminogenaktivering, såsom arteriosclerosis, myocardial og cerebral infarkt, venøs thrombosis, thromboembolisme, post-kirurgisk thrombose, thrombophlebitis 25 og diabetisk vasculopathies.

..Opfindelsen angår hybridvektorerne, de transformerede gærstammer samt fremgangsmåder til fremstilling af TPAs, pro-TPAs eller blandinger deraf som beskrevet i eksemplerne.

21

DK 164941 B

Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningen:

Fig. 1 viser en partiel restriktionsendonucleaseplan for plasmiderne pJDB207/PH05, PH03 og pBR322/PH05Bam-Sal 5 anvendt som kilder for henholdsvis PH05-genet og DNA- sekvensering.

Fig. 2 viser lokaliseringen af PH05 og PH03 sin: phosphatase-generne i et 5/1 kb BamHI-fragment isoleret fra en gærgensamling.

10 Fig. 3a og 3b viser DNA-sekvenserne i promotorområdet for henholdsvis PH05 og PH03,

Fig. 4 er et skematisk diagram, som viser konstruktionen af hybridplasmidet p30.

Fig. 5 viser skematisk konstruktionen af plasmid p31, som 15 indeholder et PH05-termineringsfragment.

Fig. 6 viser nucleotidsekvensen i Sau3A-PstI PH05-transkrip-tionstermineringsfragmentet.

Fig. 7 viser skematisk fremgangsmåden til sletning af PH05-signalsekvensen i ekspressionsplasmid p31 og speci-20 fikt dannelsen af plasmid p31/R.

Fig. 8 viser skematisk klonsamlingen dannet ved den i fig. 7 viste fremgangsmåde.

Fig. 9 og 10 viser nucleotidsekvenserne for BamHI-EcoRI-restriktionsfragmenterne, som indeholder PH05/R og 25 PH05/Y-promotorområderne.

Fig. 11 viser DNA'et og de tilsvarende aminosyresekvenser TPA cDNA-klonen isoleret fra HeLa-celler.

Fig. 12 viser skematisk fremstillingen af kloningsmidlet Ml3mp 9/PHO5-TPA.

30 Fig. 13 illustrerer fremstillingen af plasmidet pJDB207/PH05-TPA (1A), som indeholder PH05-signalsekvensen.

Fig. 14 viser skematisk fremstillingen af plasmidet 22

DK 164941 B

pJDB207/PH05-TPAA, som indeholder et forkortet PH05-transkriptionstermineringsfragment.

Fig. 15 viser sekvensen for det forkortede PH05-transkrip-tionstermineringsfragment.

5 Fig. 16 illustrerer dannelsen af hybridplasmidet p3lRL/TPA (12-2) uden signalsekvens. Kodningssekvensen for modent TPA ligeres til PH05-promotoren.

Fig. 17 er et skematisk diagram, som viser dannelsen af. plasmidet pJDB207R/PH05-TPA (12-2).

10 Fig. 18 viser dannelsen af plasmidet p31/PH05-TPAl8.

Fig. 19 viser sammenføjningen af PH05-signalsekvensen og kodningsområdet for modent TPA i plasmidet p31/PH05-TPAl8.

Fig. 20 viser skematisk isoleringen af DNA-fragment er, som 15 indeholder dele af prepro-TPA-kodningsområdet.

Fig. 21 viser dannelsen af plasmidet p31R/SS-TPAA2.

Fig. 22 viser dannelsen af det intermediære plasmid pBR322/PH05Bam-Rsa 637.

Fig. 23 viser dannelsen af plasmider med PH05-signalsekven-20 sen forlænget til PH05-kodningsområdet.

Fig. 24 viser skematisk bindingen af PH05-promotoren og en del af PH05-kodningssekvensen til. kodningssekvensen i modent TPA over binder A, B eller C.

Fig.' 25 viser skematisk den kromosomale ombytning af PH05-genet 25 med TPA-genet.

Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler.

I eksemplerne anvendes følgende forkortelser: BSA: okseserumalbumin DTT: 1,4-dithiothreitol (1,4-dimercapto-2,3-butandiol) 30 EDTA: ethylendiamintetraeddikesyre SDS: natriumdodecylsulfat TNE: opløsning indeholdende 100 mM NaCl, 10 mM tris'HCl

(pH-værdi 7,5) og 1 mM EDTA

Tris ·Η02: tris- (hydroxymethyl) -aminomethan, pH-værdi indstillet 35 med HC1 23

DK 164941 B

TE: opløsning indeholdende 10 mM tris*HCl (pH-værdi

7,5) og 1 mM EDTA

MOPS: 3-morpholin-propan-l-sulfonsyre.

24

Eksempel 1

DK 164941 B

Dannelse af en gar-gen-samling 30 ug gær DNA med total høj molekylvægt (17) fra vildtype Saccharomyces cerevisiae stamme S288C inkuberes i 30 mi-5 nutter ved 37°C med 2 enheder EcoRI methylase (New England Biolabs) i 250 yl EcoRI methyleringspuffer som anbefalet af leverandøren. DNA fældes med ethanol, resuspenderet i 500 yl 25 mM Tris.HCl pH 8,5, 2 mM MgCl2 (EcoRI*puffer) (18) og nedbrydes med EcoRI (Boehringer), indtil størrel-10 sesfordelingen for DNA-fragmenterne har et maksimum i området 30-50 kb (en Xhol nedbrydning af λ DNA giver omtrentlig 33 kb og 17 kb markører) . Gær DNA'et nedbrudt under EcoRI*betingelser fraktioneres med hensyn til størrelse på en saccharose-gradient (5-20% saccharose i 10 mM Tris.HCl 15 pH 7,5, 1 mM EDTA) i 6 timer ved 38.000 omdrejninger pr. minut i en SW 40 rotor. 30 fraktioner, hver på 0,4 ml, udtages fra toppen af gradienten. Fraktion 16 indeholder DNA-fragmenter med en størrelse på 30-40 kb. DNA'et i denne fraktion (3 yg) fældes med ethanol og bindes i 16 timer ved 20 15°C i samlet rumfang på 15 yl til 1 y,g kosmid vektor pYcl (19) , lineariseret med EcoRI. Bindingen gennemføres med 300 U T4 DNA ligase (New England Biolabs) under anvendelse af puffersystemet beskrevet af leverandøren. DNA*et indføres in vitro i bakteriofag λ (20) , og de samlede fager anven- 25 des til at transducere Escherichia coli stamme HB101 (rj^, m^, leu , pro”, recA-). Effektiviteten ved transduceringen er ca. 5000 ampicillinresistente kolonier pr. yg pYcl vek-tor. 3000 amp kolonier udtages og dyrkes hver for sig i hullerne i mikrotiterplader i LB medium [10 g Bacto-Trypton 30 (Difco), 5 g Bacto gærekstrakt (Difco), 10 g NaC2] indeholdende 100 yg/ml ampicillin.

Eksempel 2

Isolering af det regulerede sure phosphatase gen PH05

Kopier af gen-samlingen dyrkes på LB agarplader (LB medium 35 plus 15 g/1 agar) indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Cellematerialet fra 500 kolonier vaskes af pladerne og samles.

25

DK 164941 B

Derefter isoleres DNA fra de individuelle væskesamlinger på følgende måde:

Cellerne isoleres ved centrifugering (Sorvall, GSA rotor, 10 minutter ved 6000 o/m, 4°C), resuspenderes i 100 ml 5 TE (10 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) og centrifugeres atter under de ovenfor anførte betingelser. Cellematerialet resuspenderes i 3 ml Tsuc (50 mM Tris.HCl, pH 7,5, 25% (vægt/rumfang) saccharose) og overføres til SS-34 polypropylen Sorvall-rør. Alle de efterfølgende trin gennem-10 føres på is: 0,3 ml lysozymopløsning (10 mg/ml, indkøbt fra Worthington, 11.000 enheder/mg) tilsættes. Efter 5 minutter tilsættes 1,2 ml EDTA (500 mM, pH 8,0), og efter yderligere 5 minutter tilsættes 4,8 ml detergent (0,1% "Triton X-l00"Θ(Merck), 50 mM EDTA, 50 mM Tris.HCl, pH 8,0).

15 Efter 5 minutters forløb centrifugeres lysatet i en forafkølet SS-34 rotor i 40 minutter ved 4°C. Supernatanten fjernes omhyggeligt, og der tilsættes fast CsCl (8,3 g CsCl til 8,7 ml supernatant). Efter tilsætning af ethidiumbromid (Sigma) (slutkoncentration 1 mg/ml supernatant) overføres 20 opløsningen til 13,5 ml Quick Seal polyallomer-rør (Beckman) og centrifugeres i en Beckman Ti50 rotor i 40 timer ved 40.000 o/m. To fluorescerende bånd kan gøres synlige med langbølget ultraviolet lys (366 nm). Det nederste bånd indeholder overspiralformet (supercoiled) plasmid DNA, som 25 opsamles ved at perforere røret fra siden med en 2 ml injektionssprøjte (18G nål). Ethidiumbromidet fjernes ved ekstraktion 5 gange med lige store rumfang isopropanol (mættet med CsCl), og produktet overføres til 30 ml Corex-rør.

2,5 rumfang TE tilsættes, og DNA'et fældes med ethanol. Op-30 løsningen henstår derpå i 12-15 timer ved -20°C. Det udfældede DNA opsamles ved centrifugering i en Sorvall HB-4 rotor i 30 minutter ved 12.000 o/m ved 0°C og genopløses i 200 yl TE. 50-100 yg hybridplasmid DNA udvindes fra en 100 ml kultur.

35 Plasmid DNA fra disse samlinger anvendes til at transformere S. cerevisiae stamme AH216 (a, his3, leu2, pho3, pho5) 26

DK 164941 B

under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Hinnen et al. (12). Gærtransformanter kopieringspletteres på lav -minimal medium [som "Difco yeast minimal medium without amino acids" tilsat 20 g/1 glucose, men fremstillet ud 5 fra bestanddelene i overensstemmelse med Difco's recept (Difco Manual, Difco Laboratories, Detroit, USA), idet der dog er anvendt 0,03 g/1 KH2P04 plus 1 g/1 KC1 i stedet for 1 g/1 KH2P0^] og farves for sur phosphatase-aktivitet ved overlejring med farvningsagar [1% Difco agar i 100 mM 10 acetatpuffer pH 4,0, 2 mg/ml Fast Blue B Salt (Serva) og 0,2 mg/ml α-naphthylphosphat (Serva)]. Kolonier med et funktionelt PH05 gen farver rødt ved ikke-undertrykning af genet på lavt P^-medium. Ved gentagen opsamling (21) af gen-samlingen fås 3 selvstændige kloner, som udviser sur 15 phosphatase-aktivitet, der kan slukkes eller undertrykkes.

En af disse kloner (pG7) underkastes yderligere analyse. Hybridplasmidet har en størrelse på 42 kb. EcoRI og BamHI fragmenter af pG7 underklones i henholdsvis pBR322/HIS3 (13) og pJDB207 (22) . Restriktionsnedbrydningerne gennem-20 føres som anbefalet af leverandøren (New England Biolabs), og bindinger (ligations) udføres i 20 yl med 150 E T4 DNA ligase (New England Biolabs) og 20 yg/ml af de enkelte nedbrudte plasmider (betingelser som foreslået af New England Biolabs) . Et 1,5 kb BamHI fragment,, som er en del af 25 et 8 kb EcoRI fragment, underklones i gærvektor pJDB207, og efter transformering af gærstamme AH216 udløser dette hybrid-plasmid (pJDB207/PHO5,PHO3, se fig, 1) høj phosphatase-aktivitet under ikke-slukkede eller ikke-undertrykte (lav P^)betingelser (PH05 gen) og lave aktivitetsniveauer 30 i normalt gær minimal medium (kopiering af PH03 genet).

Eksempel 3

Lokalisering af PHQ5 og PH03 generne og DNA sekvensanalyse a. PH05 genet

Til lokalisering af PH03 og PH05 i BamHI fragmentet udnyttes 35 mønsteret for Sau3A restriktionssteder og et enkelt PstI

27

DK 164941 B

sted. Nedbrydning af BamHI fragmentet med restriktionsendo-nuklease Sau3A (New England Biolabs) danner 6 fragmenter (A-F, fig. 2) . Underkloning af et partielt Sau3A nedbrydningsprodukt til BamHI stedet i den selvkopierende gær-5 vektor pJDB207 fører til plasraider med forskellige kombinationer af Sau3A fragmenter. Disse plasmider anvendes derefter til pho3,pho5 mutant gær S. cerevisiae AH216. Trans-formanteme kontrolleres for sur phosphatase-aktivitet efter dyrkning på enten lave P^- eller normale minimal 10 medium plader. Kloner indeholdende mindst Sau3A fragmenter A og B (fig. 2, nr. 1-4) kopierer sur phosphatase i samme mængde (kvalitative bedømmelser efter overlejring med sur phosphatase farvnings-agar, som beskrevet i eksempel 2) som hele 5,1 kb BamHI fragmentet. Kopieringen reguleres sæd-15 vanligvis ved hjælp af koncentrationen af uorganisk phos-phat i mediet. Kloner, som kun har Sau3A-fragment A (fig. 2, nr. 5, 6), kopierer lave koncentrationer af sur phosphatase, som ikke påvirkes af koncentrationen af uorganisk phosphat i mediet. Dette indicerer, at information, som bæres af 20 Sau3A-fragment A, er tilstrækkelig til strukturel sur phosphatase (PH03) kopiering. Sau3A-fragment B (fig. 2, nr. 7) alene fører ikke til nogen kopiering (expression) af sur phosphatase, hverken under udslukkede eller ikke-udsluk-kede betingelser. En underklon med den fuldstændige sekvens 25 mellem BamHI- og Pstl-stederne (fig. 2, nr. 10) udviser reguleret, men ikke strukturel (constitutive) syntese af sur phosphatase. Denne underklon må derfor indeholde gær PH05 genet (13).

Den nøjagtige lokalisering af PH05 genet bestemmes ved hjælp 30 af DNA sekvensering under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Maxam og Gilbert (10). Et 623bp BamHI-Sall restriktionsfragment klones i plasmid pBR322 (se fig. 1), under ombytning af BamHI-Sall fragmentet, som strækker sig fra stilling 375 til 650 (pBR322 nomenklatur), under anvendelse af 35 nedbrydnings- og bindingsbetingelser som beskrevet ovenfor (alle enzymer er fra New England Biolabs). DNA-fragmenter fra det indsatte BamHI-Sall DNA mærkes asymmetrisk ved 5'- 28

DK 164941 B

enderne på følgende steder: BamHI(-541), Sau3A(-200) og Sall(+82), (angående nummerering se fig. 3a). Nukleotid-sekvensen for det indsatte 623bp BamHI-Sall DNA er vist i fig. 3a. Dette viser, at den indsatte del indeholder PH05-praro-5 toramrådet og en del af PH05 phosphatase protein-kodningscmrådet.

b. PH03 genet

Den nøjagtige lokalisering af PH03 genet bestemmes ved hjælp af DNA sekvensanalyse i overensstemmelse med håndbogen "Ml3 cloning and DNA sequencing system” udgivet- af New 10 England Biolabs. Et 416bp (5')Pstl-Rsal(3') fragment under-klones i vektorer M13mp8 og M13mp9 (23) under anvendelse af entydige PstI og Smal restriktionssteder. Nukleotid-sekvensen i det indsatte 416 bp Pstl-Rsal DNA er vist i fig. 3b. Den viser, at den indsatte del indeholder PH03 15 promotorområdet og dele af PH03 sur phosphatase protein kodnings s ekvensen.

Eksempel 4

Dannelse af plasmid p30 (se fig. 4) a) Eliminering af Ball restriktionsstedet, i plasmid pBR322 20 3 yg pBR322 nedbrydes fuldstændigt med restriktionsendonukle- aserne Ball (BRL) og PvuII (Biolabs) i overensstemmelse med forskrifterne fra leverandøren. Ball/PvuII-dobbeltnedbrydningen af pBR322 resulterer i to restriktionsfragmenter med en størrelse på 3738 bp og 622 bp. De to fragmenter adskil-25 les på en 1%‘si lavtsmeltende agarose gel (Sigma) i TBE (90 mM) Tris.HCl pH 8,3, 2,5 mM EDTA, 90 mM borsyre) puffer. DNA båndene farves med ethidiumbromid og gøres synlige ved belysning med langbølget ultraviolet lys ved 366 nm. Det stykke agarose, som indeholder 3738 bp fragmentet, udskæres 30 fra gelen, bringes på væskeform ved 65°C, indstilles på 500 mM NåCl og inkuberes ved 65°C i 20 minutter. Der tilsættes 1 rumfang phenol (bragt i ligevægt med 10 mM Tris.

HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl). Den vandige fase gen-ektraheres to gange med phenol og én gang med chloroform.

35 DNA'et fældes med 2,5 rumfang koldt absolut ethanol og op-

OQ DK 164941 B

2. y samles ved centrifugering. DNA-massen vaskes med koldt 80%·s ethanol og tørres derpå i vakuum. DNA'et resuspenderes i TE i en koncentration på 0,15 mg/ml.

Det isolerede 3738 bp DNA-fragment har to såkaldte korte 5 eller dobbeltstrengede ender som følge af dobbeltnedbrydningerne med Ball og PvuII. DNA'et cycliseres ved sammenbinding af de dobbeltstrengede ender. 0,6 yg DNA inkuberes natten over ved stuetemperatur i 30 yl 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgC^, 10 mM DTT, 4 mM ATP og 900 enheder 10 T4 DNA ligase (Biolabs). 5 yl alikvoter af bindingsblandingen blandes med 50 yl calciumbehandlet, transformationskompetente Escherichia coli HB101 celler, fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Mandel et al. (24). Blandingen holdes på is i 5 minutter, hvorefter den inku-15 beres i 2 minutter ved 37°C og henstår i 10 minutter ved stuetemperatur, inden den anbringes på LB agarplader inde-

R

holdende 100 yg/ml ampicillin. 6 amp kolonier udtages og dyrkes hver for sig i 100 ml LB-medium (som ovenfor, men uden agar) indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA 20 fremstilles ud fra cellerne under anvendelse af den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde. Restriktionsnedbrydninger med Haelll (fra Biolabs, nedbrydningsbetingelser som anbefalet af leverandøren), PvuII og Ball af plasmiderne analyseres på en 1,5%'s agarose-gel i TBE puffer. Restrik-25 tionsmønsteret og den beregnede størrelse af det nyligt dannede samlingsfragment indicerer, at plasmiderne er identiske og indeholder alle pBR322 sekvenserne bortset fra Ball-PvuII fragmentet. Disse plasmider mangler Ball restriktionsstedet og betegnes derfor som pBR322ABalI.

30 b) Kloning af et gær 5,1 kb BamHI restriktionsfragment indeholdende PH05 og PH03 i PBR322A Ball_ pJDB207/PHO5,PHO3 (se fig. 1) indeholder en gær 5,1 BamHI indsætningsdel med generne for reguleret og strukturmæssig gær sur phosphatase (PH05 og PH03). pJDB207/PHO5,PHO3 samt 35 plasmid pBR322ABalI nedbrydes med restriktionsendonuklease

30 DK 164941 B

_ a

BamHI. Efter fuldstændig nedbrydning inaktiveres enzymet 1 2 minutter ved 65°C. Begge DNA'er fældes med ethanol og resuspenderes i 10 mM Tris-HCl pH 8,0 ved en koncentration på 0,2 mg/ml. 0,5 yg af de to BamHI-nedbrudte 5 DNA'er kombineres og bindes i 20 yl bindingspuffer (som anbefalet af New England Biolabs) indeholdende 300 enheder T4 DNA ligase i 20 timer ved 15°C. 5 yl alikvoter af bindingsblandingen sættes til 50 yl calciumbehandlet E. coli HB101 celler, og transformeringen gennemføres på samme 10 måde som beskrevet i eksempel 4a. De transformerede Escherichia coli-celler testes for resistens mod ampicillin og tetracyclin. 8 amp , tet kolonier isoleres og dyrkes i 100 ml LB medium indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA isoleres fra cellerne (se eksempel 2). Restriktions-15 nedbrydninger med BamHI viser, at 4 plasmider indeholder en 5,1 kb indsat del foruden 3,7 kb vektorfragmentet (pBR322ABalI). Restriktionsnedbrydninger med Sall (New England Biolabs) fastlægger orienteringen af det indsatte 5,1 kb fragment: 2 plasmider har den indsatte del orienteret som vist i 20 fig. 4. Et af disse betegnes som p30. Transskriptionsretningen i PH05, PH03 generne i 5,1 kb indsætningsdelen er mod uret som vist i fig. 4.

Eksempel 5

Dannelse af et ekspressionsplasmid indeholdende PH05 promo-25 toren og PH05 transskriptionsterminerinqssignaler (se fig. 5) a) Elimering af EcoRI restriktionsstedet i plasmid p30: 5 yg p30 DNA (se eksempel 4) fordøjes fuldstændigt med re-striktionsendonukleasen EcoRI (Boehringer). Til udfyldning af de fremkomne klæbrige ender inkuberes 1 yg EcoRI-fordø-30 jet p30 i 50 yl 50 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,25 mM dATP og 0,25 mM dTTP i 30 minutter ved 37°C med 1 enhed DNA polymerase (Klenow stort fragment, BRL). DNA'et, som udvindes ved ethanolfældning, ligeres på sædvanlig måde og anvendes til transformationen af 35 kompetente Escherichia coli HB101 celler som beskrevet i eksempel 4. Kloner, som er resistente overfor fordøjelse 31

DK 164941 B

p med EcoRI, betegnes p30(EcoRI ).

b) Isolering af et 0,37 kb Sau3A-PstI PH05 transskrip-tionstermineringsfragment;_ PH05 transkriptet er blevet kortlagt ved hjælp af SI nukle-5 asespaltning (25) . Signalerne for transkriptionstermine-ringen findes i et 0,37 kb Sau3A-PstI fragment af PH05 genet. Nukleotidsekvensen for Sau3A-PstI fragmentet er anført i fig. 6.

5 yg pJDB207/PHO5,PHO3 DNA (jfr. eksempel 2) fordøjes 10 fuldstændigt med restriktionsendonukleaserne Sau3A og

Pstl. Restriktionsfragmenterne separeres på en lodret 1,5%'s lavtsmeltende agarosegel i TBE-puffer. 0,37 kb Sau3A-Pstl fragmentet lokaliseres ved farvning med ethidium-bromid, og der udskæres et gelstykke så lille som muligt 15 indeholdende dette DNA fragment.

c) Kloning af Sau3A-PstI PH05 fragmentet i M13mp9:

Ml3mp9 fag DNA er en nyttig kloningsvektor med en gruppe entydige restriktionssteder (23). 5 ug M13mp9 DNA fordøjes fuldstændigt med restriktionsendonukleaserne BamHI og Pstl.

20 Det store 7,1 kb DNA fragment separeres fra et meget lille (8 bp) på en 0,8%/s lavtsmeltende agarosegel. Gelblokken, som indeholder det store DNA fragment, udskæres af gelen. Gelblokke med 0,37 kb Sau3A-PstI fragmentet af pJDB207/PHO5, PH03 (jfr. eksempel 5b) og 7,2 kb BamHI-Pstl fragmentet 25 af Ml3mp9 smeltes ved 65°C, blandes i ca. ækvimolære mængder og fortyndes med vand til nedsættelse af agarosekon-centrationen til 0,3%. Ligeringen gennemføres i en 200 μΐ opløsning indeholdende 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2/ 10 mM DTT, 1 mM ATP og 600 enheder T4 DNA ligase (Biolabs).

30 Der gennemføres transduktion af kompetente celler af

stammen Escherichia coli JM101 (Ca++) i overensstemmelse med håndbogen "M13 cloning and DNA sequencing system” fra New England Biolabs. Fager fra en række hvide belægninger dyrkes og analyseres fra størrelsen af de indsatte DNA

32

DK 164941 B

dele ved spaltning med restriktionsendonukleaserne EcoRI og Pstl.

En Ml3mp9 afledt klon indeholdende Sau3A-PstI PH05 tran-skriptionstermineringsfragmentet isoleres og betegnes 5 Ml3mp9/PH05(Sau3A-PstI).

d) Kloning af PH05 transkriptionstermineringsfragmentet i p30(EcoRIR)_

Det oprindelige PH05 transkriptionstermineringsfragment klonet i fag M13mp9 (M13mp9/PH05(Sau3A-Pstl)) reklones som et 10 Haelll-Hindlll fragment i plasmid p30(EcoRI ) spaltet med Ball og Hindlll: Ml3mp9/PH05(Sau3A-PstI) DNA spaltes fuldstændigt med restriktionsendonukleaserne Haelll og Hindlll.

De dannede 2 DNA fragmenter adskilles på en 1/5%'s lodret lavtsmeltende agarosegel i TBE-puffer. 0,39 kb fragmentet o 15 isoleres i en gelblok udskåret af gelen. p30(EcoRI ) DNA fordøjes med Ball og Hindlll. Det store 3,98 kb fragment separeres på en 0,8%'s lavtsmeltende agarosegel i TBE-puffer og isoleres ved udskæring af en gelblok indeholdende DNA fragmentet.

20 Gelblokke med 0/39 kb Haelll-Hindlll PH05 transkriptions- termineringsfragmentet og 3,98 kb Ball-Hindlll fragmentet R o af p30 (EcoRI ) smeltes ved 65 C og blandes i omtrentlig ækvimolære mængder. Der foretages ligering og transformation af kompetente Escherichia coli HB101 celler som 25 beskrevet i eksempel 4. DNA fra transformerede celler analyseres og betegnes p31 (se fig. 5) .

Ekspressionsplasmid p31 indeholder PH05 promotorregionen med en del af signalsekvensen fra PH05 og i nabostilling til et DNA fragment med PH05 transkriptionsterminering-30 signalerne. Fremmede kodningssekvenser, som skal udtrykkes i denne vektor, kan hensigtsmæssigt indsættes mellem promotor- og transkriptionstermineringssekvenser.

33

DK 164941 B

Eksempel 6

Sletning af PH05 signalsekvensen i ekspressionsplasmidet p31 (se fig. 7)_

Ekspressionsplasmid p31 indeholder PH05 promotorsekvensen 5 inklusive mRNA startstederne, translationstartkodonet ATG fra sur phosphatase og yderligere 40 nukleotider, som koder for en del af den sure phosphatasesignalsekvens.

Ved denne fremstilling elimineres nukleotiderne for signalsekvensen og ATG'et ved fordøjelse med Bal31. EcoRI bin-10 dere indføres med henblik på binding af PH05 promotoren til en moden TPA kodningssekvens.

a) Bal31 fordøjelse af Ball spaltet plasmid p30 20 ug p30 DNA (se eksempel 4b) fordøjes med restriktions-endonuklease Ball, hvorved der fås to fragmenter på 3,7 og 15 5,1 kb. Efter ekstraktion med phenol/chloroform fældes DNA'et med ethanol. DNA'et resuspenderes i 10 mM Tris pH 8,0 ved en koncentration på 0,5 ug/ml. 9 ug Ball-spaltet p30 DNA fordøjes med 2 E exonuklease Bal31 (BRL) i 100 ul 20 mM Tris pH 8,0, 199 mM NaCl, 12 mM MgCl2, 12 mM CaCl2 og 1 mM 20 EDTA. Alikvoter på 2 ug DNA udtages efter en inkubationstid på 15 sek., 30 sek., 45 sek. og 60 sek. ved 30°c, og alikvoterne blandes straks med 50 μΐ phenol og 60 μΐ TNE.

Efter ekstraktion med phenol/chloroform og fældning med ethanol resuspenderes DNA'et i 10 mM Tris pH 8,0 i en 25 koncentration på 100 ug/ml. Til analysering af graden af exonukleolytisk spaltning med Bal31 nedbrydes 0,5 ug DNA fra hvert af de ovenfor anførte tidspunkter med endonukle-ase BamHI og analyseres på en 1,5%'s agarosegel i Tris-bo-ratpuffer pH 8,3. Gennemsnitlig er 70 bp fjernet fra hver 30 ende af fragmentet efter fordøjelse med Bal31 i 45 sek.

Til yderligere forsøg anvendes DNA fra inkuberingen i et tidsrum på 45 sek.

b) Addition af EcoRI bindere til det Bal31-behandlede DNA

2 A260 enheder af EcoRI bindere (5'-GGAATTCC-31, BRL) resus-35 penderes i 250 ul 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA. 2 ug EcoRI

34

DK 164941 B

bindere kinasebehandles i 75 yl 60 mM Tris pH 7,5/ 10 mM MgCl2, 15 mM DDT, 10 ym ATP og 33 E T4 polynukleotid-kinase (Boehringer). Efter 1 time ved 37°C henstår blandingen til afkøling ved stuetemperatur, hvorefter den op-5 bevares ved -20°C.

De anellerede, dobbeltstrengede EcoRI-bindere ligeres med deres korte ender til de Bal31-behandlede DNA fragmenter.

1/2 yg Bal31-behandlet DNA (se eksempel 6a) inkuberes i 16 timer ved stuetemperatur med et 5O-dobbelt overskud af 10 kinasebehandlede EcoRI-bindere i 20 yl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2/ 10 mM DTT, 4 mM ATP og 600 E T4 DNA ligase (Biolabs). Efter inaktivering af T4 DNA ligasen (10 minutter ved 65°C) spaltes overskuddet af EcoRI-binderne med 50 E EcoRI (Boehringer) i et rumfang på 50 yl. DNA'et ekstra-15 heres med phenol/chloroform, fældes med ethanol og re-suspenderes i 10 mM Tris, 1 mM EDTA.

Restriktionsendonukleasen EcoRI spalter ikke blot de terminalt bundne EcoRI-bindere i begge Ball fragmenter (3,7 kb og 5,1 kb), men også ved et internt EcoRI-sted i 5,1 kb 20 fragmentet, hvorved der dannes et fragment på 3,9 kb og et fragment på 1,2 kb. 3,7 kb fragmentet og 3,9 kb fragmentet separeres fra 1,2 kb fragmentet på en 0,8%'s lavtsmeltende agarosegel (Sigma) i 90 mM Tris-HCl pH 8,3, 90 mM borsyre og 2,5 mM EDTA. DNA-båndene farves med ethidiumbromid og 25 gøres synlige under langbølget UV-lys ved 366 nm. De to store DNA fragmenter på 3,7 kb og 3,9 kb er ikke separerede.

De skæres ud af gelen i en enkelt blok og ekstraheres som beskrevet i eksempel 4a.

De lineære fragmenter, som ender i EcoRI klæbrige ender, 30 ligeres til ringformede stykker. Ca. 0,25 yg fragmenter ligeres i 100 yl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP og 600 E T4 DNA ligase i 4 timer ved 15°C.

Alikvoter på 10 yl af ligeringsblandingen sættes til 100 yl calciumbehandlede, transformationskompetente Escherichia 35

DK 164941 B

R

coli HB101 celler (se eksempel 4a) . 35 amp -kolonier dyrkes hver for sig i LB-medium indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Holmes et al. (26) og analyseres ved EcoRI/BamHI-5 dobbeltnedbrydning.

c) Nukleotidsekvensanalyse til bestemmelse af positionen for EcoRI binderadditionen_

Størsteparten af de 35 kloner vil afvige indbyrdes med hensyn til stillingen af EcoRI binderaddtionen i PH05 promotor-10 området afhængigt af graden af Bal31 nedbrydning af de enkelte DNA molekyler. Til nukleotidsekvensanalyse fordøjes plasmid DNA med EcoRI. Efter ekstraktion med phenol/chloro-form fældes det behandlede DNA med ethanol. DNA'et dephos-phoryleres og mærkes 5'-terminalt. De mærkede DNA frag-15 menter spaltes med en anden restriktionsendonuklease, nemlig BamHI. Produkterne adskilles på en 8,0%'s lavtsmeltende agarosegel. Det 0,5-0,6 kb 5'-mærkede EcoRI-BamHI-frag-ment isoleres fra lavtsmeltende agarose som beskrevet i eksempel 4a. Til bestemmelse af nukleotidsekvensen i nabo-20 stilling til EcoRI-binderen nedbrydes de forskellige DNA-fragmenter kemisk, og produkterne adskilles ved polyacryl-amidgelelektroforese som beskrevet af Maxam og Gilbert (10) .

De forskellige kloner og stillingen af det tilsvarende sidste nukleotid i PH05-sekvensen (der efterfølges af en EcoRI 25 binder) er anført i nedenstående tabel 1 (se også fig. 8).

Tabel 1

Klon Stilling for det sidste nukleotid i PH05-sekvensen pE +25 pG +16 pe +15 30 pd +12 pY -4 pR -10 pP -16 .36

DK 164941 B

tabel 1 (fortsat)

Klon Stilling for det sidste nukleotid i PH05-sekvensen pV -18 pL -21 5 pN -22 pC -24 pH -27 pS -28 pk -29 10 pi -38 pM -50 pO -53 pF -59 pm -67 15 pK -73 pi -81 ph -137 d) Isolering af et 0,53 kb BamHI-EcoRI fragment indeholdende PHQ5R promotoren:_ 20 Plasmid pR indeholder PH05R promotoren på et 534 bp BamHI-EcoRI fragment. I overensstemmelse med nummereringen i fig. 3a dækker fragmentet PH05 promotorsekvenserne fra nukleotid 541 (BamHI sted) til nukleotid 10. En EcoRI binder, som er ligeret til nukleotid 10 (se eksempel 6b) 25 bidrager med 2 G-rester efter spaltning med EcoRI.

Plasmid pR fordøjes med restriktionsendonukleaserne BamHI og EcoRI. 0,53 kb BamHI-EcoRI fragmentet separeres på en 0,8%'s lavtsmeltende agarosegel og isoleres som beskrevet i eksempel 4a. Nukleotidsekvensen er vist i fig. 9.

30 På analog måde fordøjes plasmid pY, og der isoleres et 0,53 kb BamHI-EcoRI fragment indeholdende PH05Y promotoren. Nukleotidsekvensen er vist i fig. 10.

37

DK 164941 B

e) Ombytning af Sall-EcoRI fragmentet i plasmid p31 med et Sall-EcoRI fragment fra de nye konstruktioner 5 yg plasmid p31 (jfr. eksempel 5d) fordøjes med restrik-tionsendonukleasen Sall. Det spaltede DNA fældes med 5 ethanol og resuspenderes i 50 μΐ 100 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgC^· DNA'et fordøjes fuldstændigt med EcoRI. Restriktionsfragmenterne separeres på en 0,8%1 s lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3.

Et 3,5 kb DNA fragment isoleres i en lille gelblok 10 indeholdende DNA-båndet.

5 yg af hver af klonerne pR og pY (jfr. tabel 1 og fig. 8) fordøjes med Sall og EcoRI på samme måde som beskrevet ovenfor. 0,8 kb DNA fragmenterne isoleres i små blokke lavtsmeltende agarosegel.

15 0,67 yg af 3,5 kb Sall-EcoRI fragmentet fra vektor p31 li geres til .0,34 yg af 0,8 kb Sall-EcoRI fragmentet af hhv. plasmid pR og pY. Passende gelblokke, som indeholder DNA fragmenterne, blandes og smeltes ved 65°C. Den smeltede gel fortyndes tre gange. Ligeringen gennemføres i et 20 samlet rumfang af 240 yl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP med 750 E T4 DNA ligase (Biolabs) natten over ved 15°C. En 2 yl alikvot af hver af ligeringsblandingerne sættes til 100 yl calcium-behandlede, transformationskompetente Escherichia coli HB101 celler 25 (se eksempel 4a).

p 8 transformerede amp -kolonier dyrkes hver for sig i LB medium indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA analyseres ved restriktionsanalyse. Klonerne i hver gruppe er identiske. En klon anvendes i det følgende og betegnes hhv.

30 p3lR og p3lY (se fig. 7).

2 '38

DK 164941 B

ΈΚΞβπιρβΙ 7

Fremstilling af TPA-genet

a. Fremstilling af mRNA

Falcon-celledyrkningskolber (175 cm ) podes med et primært 5 inokuleringsmateriale på 10 x 10 HeLa celler og holdes i 25 ml Dulbecco's modificeret Eagle's medium (DME) tilsat 5% føtaJtkalveserum. Mediet udskiftes hver 3. dag, indtil der opnås sammenflydning.

Sammenflydende monolagkulturer vaskes to gange med PBS 10 (phosphatpufret saltopløsning: 80 g NaCl, 2 g KC1, 14,4 g Na2HPC>4 og 2 g K^PO^ pr. liter opløsning), hvorefter kulturerne holdes i 16 timer i DME tilsat 100 ng/ml TPA.

Total RNA ekstraheres som beskrevet (27), idet der sættes lyseringspuffer direkte til cellemonolagene. Sekvenser med 15 stort indhold af poly(A) isoleres fra total RNA under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Nagamine et al. (28).

Der foretages saccharosegradientcentrifugering i en Beckman-ultracentrifuge forsynet med en SW-41 rotor. 100 ug poly(A) RNA i 200 μΐ E^O centrifugeres gennem en 15-30%'s saccharo-20 segradient i 0,02 M Tris.HCl, pH 7,4, 0,1% SDS, 0,01 M EDTA, 0,04 M NaCl ved 30.000 o/m i 12 timer ved en temperatur på 18°C. Gradienten fraktioneres fra bunden i 36 fraktioner, og RNA fældes ved tilsætning af NaCl til 0,2 M og 2,5 rumfang ethanol. Efter inkubering natten over ved -2Q°C.

25 isoleres RNA ved centrifugering og opløses i 20 μΐ ^0.

Trin 6 oocyter udvælges visuelt, holdes i modificeret Barth's medium og injiceres med mRNA fra saccharosegra-dientfraktionerne på i alt væsentligt samme måde som beskrevet (29). Plasminogenaktivatorudskillelse af injice-30 rede oocyter påvises ved radial caseinolyse som beskrevet af Nagamine et al.·(28). Maksimal TPA udskillelse konstateres i oocyter injiceret med 21-23S fraktionerne.

39

DK 164941 B

b. cDNA syntese og molekylær kloning

HeLa poly(A) RNA med stort indhold af TPA mRNA kopieres til cDNA. 8 yg 50 mM Tris.HCl, pH 8,3, 75 mM KCl, 8 mM MgCl2,

1% r/r ethanol, 0,2 mM EDTA, 25 yg/ml oligo dT^2_^g, mM

5 dNTP og 0,5 mM 12 yCi [a32P]dCTP (New England Nuclear).

Opløsningen afkøles til 0°C, og der tilsættes 3 mM natrium- pyrophosphat, 1 mM DTT og 144 enheder revers transkriptase

(Life Sciences Ltd.). Efter 60 minutters forløb ved 39°C

tilsættes yderligere 32 enheder revers transkriptase.

10 Efter 100 minutters inkubering afbrydes reaktionen ved tilsætning af SDS til 0,2%, EDTA til 15 mM. Inkorpore-32 ring af [a P]dCTP i CDNA bestemmes ved hjælp af trichlor-eddikesyrefældning i alikvoter af reaktionsblandingen. 1,5 yg cDNA er syntetiseret ud fra 8 yg RNA (14,4% kopi). Der fore-15 tages to ekstraktioner med chloroform-isoamylalkohol (24:1 r/r), hvorpå den vandige fase afsaltes på en 4 ml søjle (5 x 0,5 cm) med "Sephadex"® G50 fine ved centrifugering i 20 mM Tris. HCl, pH 9, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA. Udtagne fraktioner hældes sammen, og der tilsættes NaOH til 0,3 N. Efter 12 timer 20 ved 20°C tilsættes HCl til 0,3 N, og nukleinsyrerne fældes ved tilsætning af 3 rumfang ethanol. Syntese af den anden streng gennemføres i en 200 yl opløsning indeholdende 200 mM N-(2-hydroxyethyl)-piperazin-N'-ethan-2-sulfonsyre (Hepes), pH 6,9, 30 mM KCl, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2, 0,5 mM 25 af hhv. dATP, dCTP og dTTP og 25 enheder Klenow fragment pr. yg cDNA. Efter 2 timers inkubering ved 25°C afbrydes reaktionen ved tilsætning af SDS til 0,1%, og opløsningen af-saltes på en 4 ml søjle med "Sephadex"® G50 fine ved centrifugering i 30 mM natriumacetat, pH 4,5, 0,2 mM NaCl, 30 3 mM ZnCl2, 0,1% SDS. 2,5 enheder/ml nuklease Si sættes til de udtagne fraktioner, og opløsningen inkuberes ved 37°C i 30 minutter. Opløsningen ekstraheres med phenol-chloroform-isoamylalkohol (24:24:1, r/r) og nukleinsyrerne i den vandige fase fældes med 0,3 M NaCl og 3 rumfang ethanol.

32 35 76% af [a P]dCTP inkorporeret i den første streng kan fæl des med trichloreddikesyre efter Sl-fordøjelse, og analyse på en basisk agarosegel (30) giver dobbeltstrenget cDNA i størrelsesområdet fra 500 til over 3000 bp. ds cDNA'et 40

DK 164941 B

fraktioneres med hensyn til størrelse på en 5-20%'s saccha-rosegradient i 10 mM Tris.HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS. Efter centrifugering i 10 timer ved 12°C i en SW-41 rotor ved 39K sammenblandes de fraktioner, som 5 indeholder det største cDNA (43% af den samlede prøve), og der fældes ved tilsætning af NaCl til 0,3 M, 5 yg/ml ESA og 3 rumfang ethanol. 25 ng cDNA fraktioneret med hensyn til størrelse forsynes med dC-haler som beskrevet (31) i 85 μΐ reaktionsblanding indeholdende 450 enheder/ml 10 terminaltransferase, 0,1 M kaliumcacodylat, pH 7,5, 2 mM CoCl2, 1 mM EDTA, 0,1 mM DTT og 5 μΜ [a32P]dCTP (20 μΟί) .

Efter 3 minutters forløb i 30°C afbrydes reaktionen ved tilsætning af EDTA til 10 itiM, SDS til 0,2% v/r og tRNA til 100 μg/ml. Opløsningen ekstraheres to gange med chloro-15 form-isoamylalkohol og afsaltes på en 5 ml søjle af "Sephadex"® G50 fine i 20 mM Tris.HCl, pH 9, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA. De udtagne fraktioner hældes sammen, og nukleinsyre fældes ved tilsætning af NaCl til 0,3 M, 25 μg/ml tRNA og 3 rumfang EtOH. 20 ng cDNA med ds-haler anelleres 20 til 60 ng pBR322 med dG-haler ved Pstl stedet (32) i 20 μΐ 0,4 M NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA i 10 minutter ved 65°C, i 2 timer ved 45°C, i 2 timer ved 22°C, hvorpå blandingen langsomt afkøles til 4°C natten over. Det anellerede cDNA blandes ved 0°C med 100 μΐ suspension af 25 kompetente Escherichia coli HB101/LM1035 (33) .

Efter 15 minutters inkubering ved 0°C og 5 minutter ved 37°C tilsættes 1,9 ml LB til bakteriesuspensionen, og inkuberingen fortsættes ved 37°C i 2 timer. Cellerne fordeles på LB agarplader indeholdende 10 ug/ml tetracyclin.

30 Der fås 100 transformanter/ng vektor med en baggrundsfrekvens for reanelleret vektor på 13%. 5400 transformanter udtages fra isolerede kolonier og anbringes i 96-hullers mikrotiterplader indeholdende 200 μΐ LB og 10 yg/ml tetracyclin, hvorefter der dyrkes natten over ved 37°C, hvorpå 35 der afkøles til -80°C efter tilsætning af glycerol til 5% r/r.

41

DK 164941 B

c· Screening for TPA DNÅ-sekvenser To syntetiske oligonukleotider med sekvenserne d5'-GGCAAAGATGGCAGCCTGCAAG-3' og d5'-GCTGTACTGTCTCAGGCCGCAG-3' fra human vævspla:sminogenaktivator cDNA (34) syntetiseres 5 ved anvendelse af den modificerede triestermetode (35), renses ved HPLC med omvendt fase og præparativ polyacryl- 32 amidelektroforese. 01igonukleotiderne mærkes med [γ P]ATP (new England Nuclear) på 5'-enden under anvendelse af T4 C.

kinase til en specifik aktivitet på 1 x 10 cpm (Cherenkov)/ 10 pmol (10).

Mikrotiterplader optøs, og transformantkulturer overføres i et 6 x 8 gittermønster til 82 mm millipore HATF nitrocellulosefiltre, dyrkes i 18 timer på LB agarplader indeholdende 10 yg/ml tetracyclin, og plasmiderne forstærkes 15 i 12 timer på LB agarplader indeholdende 10 yg/ml tetracyclin, 10 yg/ml chloramphenicol. DNA fikseres til filtrene ved aftrykning af hvert filter på Whatman 3M-papir mættet med 10% SDS i 3 minutter, 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl i 5 minutter, 0,5 M Tris.HCl, pH 8, 1,5 M NaCl i 5 minutter 20 og 2 x SSPE (SSPE: 0,15 M NaCl, 10 mM NaH2P04, pH 7,4, 1 mM EDTA) i 5 minutter (42).

Filtrene lufttørres, hvorefter de opvarmes i vakuum ved 80°C i 2 timer. De varmebehandlede filtre vaskes i 2 timer ved 37°C i 50 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 1 M 25 NaCl, 1% SDS til fjernelse af vedhængende bakterierester. Hybridisering og vaskning gennemføres som beskrevet af Wallace et al. (1981) under anvendelse af de empiriske forhold mellem nukleotidlængde, G+C-indhold og Tm, som er bestemt af Suggs et al. (45) og Smith (46). Filtrene præ-30 hybridiseres (2 timer) og hybridiseres (12 timer) ved 60°C i 1,6 ml filter af 900 mM NaCl, 60 mM NaH2P04, pH 7,4, 7,2 mM EDTA (6 x SSPE), 0,1% v/r af hhv. BSA, poly- vinylpyrrolidon og Ficoll 400 (5 x Denhardt's opløsning), 3 2 200 yg/ml tKNA og 0,1% v/r SDS. En blanding af de to P- 42

DK 164941 B

mærkede oligonukleotider ved 0,3 pmol/ml sættes til præ-hybridiseringsopløsningen. Efter hybridisering vaskes filtrene i 6 x SSC (SSC: 0,15 mM NaCl, 15 mM brinatrium-citrat) i 3 x 10 minutter ved 4°c og i 3 x 10 minutter ved 5 60°C. De tørrede filtre eksponeres ved Kodak XB5 røntgen film med en forstærkerskærm fra Dupont i 36 timer ved -70°c. Mikrotiterhullerne, som giver positive hybridiseringsr signaler, identificeres, og enkelte kolonier fra disse kulturer screenes atter som beskrevet ovenfor, duplikat-10 filtrene hybridiseres separat for hver prøve, idet der anvendes en temperatur på 63°C til hybridisering og vask-ning af filtrene. Kolonier med positive signaler ved begge sæt prøver udtages fra hovedfilteret og dyrkes natten over ved 37°c i LB indeholdende 10 ug/ml tetracyclin.

15 En af disse kolonier betegnes pW349F. Der dannes plasmid-præparater under anvendelse af den modificerede basiske lyseringsmetode (36) efterfulgt af CsCl-ligevægtscentrifu-gering.

DNA fra plasmid pW349F analyseres ved fordøjelse med re-20 striktionsendonukleaserne PstI og Bglll. Restriktionsfragmenterne har de forventede størrelser. Det kan derfor konkluderes, at plasmid pW349F (7,1 kb) indeholder det komplette strukturgen for human vævsplasminogenaktivator.

d. DNA-sekvens i TPA cDNA-klonen (jfr. fig. 11) 25 Under anvendelse af en kombination af fremgangsmåden ifølge Maxam og Gilbert (10) og Sanger (53) sekvenser es TPA cDNA-klonen. Resultaterne er anført i fig. 11 . Ved sammenligning af de fremkomne sekvensdata med de data, som er publiceret af Pennica et al. (7), kan der kun konstateres 30 én ændring, som findes ved nukleotidpositionen 113 og forårsager en ændring i den stille (silent) position for en aminosyre i præ sekvensen for TPA (CTG —^ CTA) .

43

DK 164941 B

Eksempel 8

Dannelse af plasmiderne pJDB207/PHO5-TPA (1A) .og pJDB207/PHQ5-TPAA (fiq. 12-15)_ PH05 promotoren og PH05 signalsekvensen sammenbindes i 5 struktur til kodnings sekvensen for modent TPA. Et PH05-transkriptionstermineringssignal indbefattes også i konstruktionen.

a) Dannelse af M13mp9/PH05Bam-Sal (se fig. 12)

Et 623 bp BamHI-Sall fragment indeholdende PH05 promotoren 10 (eksempel 3a, fig. 3a) fremstilles ved at spalte 2 yg pBR322/PH05Bam-Sal (se fig. 1) med restriktionsendonukle-aserne BamHI og Sall (begge fra Biolabs) under de betingelser, som angives af leverandøren. 2 yg kopieret form (RF) af den enkeltstrengede fagvektor Ml3mp9 (23) fordøjes 15 med de samme enzymer. Begge DNA præparaterne anbringes på en 0,6%'s blød agarosegel som beskrevet i eksempel 5.

Et 623 bp fragment afledt af plasmid pBR322/PH05Bam-Sal og et 7,2 kb bånd afledt af M13mp9 ekstraheres på samme måde som beskrevet i eksempel 5c. 150 ng af 623 bp frag-20 mentet og 150 ng af 7,2 kb M13mp9 DNA fragmentet ligeres med 200 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) i 4 timer ved 15°C i 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP.

Escherichia coli-stamme JM101 transformeres som beskrevet 25 af Messing (23), og 12 hvide belægninger udtages og analyseres ved hjælp af restriktionsanalyse for RF plasmidet (38). Alle de analyserede kloner indeholder 623 bp fragmentet indsat i Bam-Sal-stedet i M13mp9. Et enkelt iso-lat udvælges og betegnes M13mp9/PH05Bam-Sal (se fig. 12) .

30 b) Binding af TPA proteinkodningssekvensen til PH05-sig-nalsekvensen (se fig. 12)_ 2 yg plasmid pW349F (jfr. eksempel 7) fordøjes med Bglll endonuklease (New England Biolabs) under de betingelser, som anføres af leverandøren. DNA'et fældes med ethanol og 44

DK 164941 B

resuspenderes i 6 mM Tris.HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 6 mM MgC^· De slukkede (recessed) 3'-ender i DNA'et udfyldes under anvendelse af Klenow-fragmentet af Escherichia coli DNA-polymerase. Reaktionen gennemføres i et samlet rum-5 fang på 50 μΐ med 2 enheder enzym i nærværelse af 80 ;uM dATP, dGTP/ dCTP og dTTP i 30 minutter ved 37°C. Inkuberingen afbrydes ved ekstraktion med phenol/ og DNA'et fældes med ethanol.

2 ug RF plasmid Ml3mp9/PH05Bam-Sal fordøjes med restrik-10 tionsendonuklease Kpnl (Biolabs) under anvendelse af leverandørens forskrifter. DNA'et fældes med ethanol og resuspenderes i 10 yl 200 mM NaCl/ 1 mM ZnSO^ og 60 mM Na-acetat/ pH 4,6. En enhed exonuklease tilsættes, og blandingen inkuberes i 60 minutter ved 37°C. Reaktionen afbry-15 des ved ekstraktion med phenol, DNA'et fældes med ethanol og resuspenderes i 50 μΐ 50 mM Tris.HCl, pH 7,5, 1 mM MgCl2. 10 enheder alkalisk phosphatase fra kalvetarm (Boehringer) tilsættes, og blandingen inkuberes i 60 minutter ved 37°C og derpå i 60 minutter ved 65°C. DNA'et 20 renses ved ionbytterkromatografi på DE52 (Whatman) (se eksempel 9Aa), hvorpå der fældes med ethanol.

1,5 yg Bglll-fordøjet plasmid pW349F behandlet med Klenow DNA- polymerase (se ovenfor) ligeres til 0,5 yg KpnI-spaltet, S-^-fordøjet og phosphatasebehandlet Ml3mp9/PH05Bam-Sal i et 25 rumfang på 10 yl under anvendelse af 900 enheder T4 DNA ligase i en puffer som beskrevet ovenfor, idet der dog anvendes 4 mM ATP, og inkuberingen gennemføres i 18 timer ved stuetemperatur. Escherichia coli JM101 celler transformeres, seks hvide belægninger udvælges, og den enkelt-30 strengede fagtemplat fremstilles som beskrevet (38) . DNA-sekvensering af bindingen mellem 2,0 kb Bglll fragmentet og M13mp9 vektoren gennemføres under anvendelse af dide-oxykædetermineringsmetoden (39). Der anvendes følgende oligodeoxynucleotidprimer: 35 5' AGTATGGCTTCATCTCTC 3' 45

DK 164941 B

Oligodeoxynucleotidet er fremstillet ved hjælp af phospho-triestermetoden (40/41). Det hybridiserer i PH05 promotoren og tillader forlængelse ved hjælp af Klenow fragmentet fra Escherichia coli DNA polymerase tværs over det ønskede 5 DNA bindingspunkt. Der fås et korrekt isolat, som har nedenstående DNA-sekvensarrangement (begyndende fra ATG'et i PH05 proteinkodningssekvensen) :

ATG TTT AAA TCT GTT GTT TAT TCA ATT TTA GCC GCT TCT TTG GCC AAT GCA GGA TCT_TAC_CAA_GTG

_ PH05 proteinkodningssekvens 10 ----- TPA proteinkodningssekvens

Denne konstruktion betegnes M13mp9/PH05-TPA (se fig. 12).

c) Fremstilling af et afkortet PH05 transkriptionstermi-neringsfraqment (se fig. 13)_ 10 yg p31R plasmid DNA (se fig. 7) fordøjes med restriktions-15 enzymet Smal, og DNA*et ekstraheres med phenol og fældes med ethanol. DNA'et resuspenderes i 10 mM Tris.HCl/ pH 8,0 ved en koncentration på 0,5 mg/ml. 10 yg af det Smal-spal-tede DNA fordøjes med 2 E endonuclease Bal31 (BRL) i 100 yl 20 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, 12 mM MgCl2, 12 mM CaCl2 20 og 1 mM EDTA.

Der udtages alikvoter på 3 yg DNA efter inkubering i hhv.

90, 120 og 150 sek. ved 30°C, og alikvoterne blandes straks med 50 yl phenol og 60 yl TNE. Efter ekstraktion med phenol/ chloroform og fældning med ethanol resuspenderes DNA'et i 25 10 mM Tris.HCl, pH 8,0, ved en koncentration på 100 yg/ml.

Til analysering af den exonucleolytiske fordøjelse af Bal31 fordøjes alikvoter på 0,7 yg DNA fra hvert tidspunkt med Hindlll og analyseres ved agarosegelelektroforese. Til yderligere analyse anvendes DNA'et fra 90 sek. inkuberings-30 tidspunktet. 2,2 yg af plasmid DNA'et inkuberes i 1 time ved 37°C med 2,8 E Klenow DNA polymerase (stort fragment af polymerase I, BRL) i 35 yl 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM

46

DK 164941 B

MgCJ-2 og 0,1 mM dNTPs*.

3 yg Xhol binder (5'-CCTCGAGG-3', Collaborative Research) kinasebehandles i 50 yl 6 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 54 mM DTT, 0,5 mM ATP og 35 E T4 polynucleotidkinase 5 (Boehringer) i 30 minutter ved 37°C.

0,67 yg kinasebehandlede Xhol bindere og 0,4 yg Bal31 behandlede DNA med korte ender fra plasmid p3lR ligeres natten over ved stuetemperatur i 25 yl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP og 450 E T4 DNA ligase.

10 Det ligerede DNA adskilles fra overskud af bindere ved fældning med isopropanol i nærværelse af 10 mM EDTA, 0,3 M natriumacetat, pH 6,0, og 0,54 rumfang isopropanol. Efter inkubering i 35 minutter ved stuetemperatur aflejres DNA'et ved centrifugering.. Det aflejrede materiale tørres i luf-15 ten og resuspenderes i 17 yl 6 mM Tris pH 7,9, 150 mM NaCl, 6 mM MgCl2 og 6 mM mercaptoethanol. Xhol binderne ligeret til DNA'et spaltes med Xhol, DNA'et fældes med isopropanol som beskrevet ovenfor og ligeres til ringform. Efter 6 timers ligering ved 15°C i 50 yl 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 20 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP og 600 E T4 DNA ligase sættes 10 yl af hver ligeringsblanding til 100 yl calciumbehandlede, transformantkompetente Escherichia coli HB101 celler (se eksempel 4a).

R

24 amp kolonier dyrkes hver for sig i LB medium indehol-25 dende 100 mg/1 ampicillin. Plasmid DNA [p31R(XhoI)] isoleres og analyseres ved fordøjelse med Haelll. Der udvælges 2 plasmider, og nucleotidsekvensen i nabostilling til Xhol-stedet i terminatorfragmentet bestemmes ved teknikken ifølge Maxam og Gilbert (10). Sekvensen er vist 30 i fig. 15.

47

DK 164941 B

d) Overføring af PH05-TPA hybridgenet til gærvektoren PJDB207 (se fig. 13)_

Der foretages en RF plasmidpræparering af M13mp9/PH05-TPA som beskrevet ovenfor. 2 ug af dette DNA fordøjes med re-5 striktionsendonucleasen BamHI (Biolabs) og Sall (Biolabs), og 2,6 kb fragmentet isoleres ved elektroforese på en lavtsmeltende agarosegel (se eksempel 5c). På tilsvarende måde fremstilles 100 ng 134 bp Hindlll-Xhol fragmentet af plasmid p3lR(XhoI) indeholdende PH05 terminatoren. End-10 videre fordøjes 1 yg plasmid pJDB207 (22) med BamHI og Hindlll, og 6,5 kb fragmentet isoleres ved elektroforese på en lavtsmeltende agarosegel.

0/5 yg af hver af disse 3 fragmenter ligeres i 20 yl 60 mM Tris.HCl/ pH 7,5, 10 mM MgCl2/ 10 mM DTT, 1 mM ATP med 15 200 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) natten over ved 15°C.

Der foretages transformation af Escherichia coli HB 101 som beskrevet i eksempel 4a, idet der selekteres for ampi-cillinresistente kolonier. Der udvælges 4 kolonier, plasmid DNA fremstilles (under anvendelse af fremgangsmåden be-20 skrevet i eksempel 2), og DNA'et analyseres under anvendelse af følgende restriktionssteder som kendemærker: BamHI, Hindlll, BstEII. Alle isolaterne viser sig at være korrekte. Et af plasmiderne betegnes pJDB207/PHO5-TPA(lA).

e) Dannelse af pJDB207/PHQ5-TPAA (se fig. 14) 25 10 yg dobbeltstrenget DNA fra M13mp9/PH05-TPA fordøjes med

Sall. Efter phenolekstraktion og fældning med ethanol re-suspenderes DNA'et i 10 mM Tris.HCl, pH 8,0, ved en koncentration på 0,5 mg/ml. Bal31 fordøjelser foretages på praktisk taget samme måde som beskrevet i eksempel 8c), 30 og der tilsættes Xhol bindere. Efter transformering til Escherichia coli JM101 isoleres RF DNA, og stillingen for Xhol binderen bestemmes ved dideoxysekvenseringsmetoden (39) under anvendelse af oligodeoxynucleotidprimeren 5'-GAACGGTAGGTATTGATTG-3'.

48

DK 164941 B

M13 derivaterne indeholdende Xhol binderne i forskellige positioner betegnes M13mp9/PH05-TPA (Xhol-l) M13mp9/PH05-TPA (Xhol-2) 5 Ml3mp9/PH05-TPA (XhoI-3)

Ml3mp9/PH05~TPA (XhoI-4)

Position 1-4 i Xhol binderne er vist nedenfor.

2 cgaccg( tga~|ccaggaacacccgactcctcaaaagcaaatgagatcc^ cgcctcttcttcttca λ 3 4

GAAGACACTGJ'CAAAGG'l' CGCAGTGl CTTCTCT

TGA translationsstopcodon for TPA

10 1, 2, 2, 4 stillinger for Xhol binder (.51-CCTCGAGG-3·) 2 ug EF DNA fra hvert af de fire ovenfor beskrevne M13 derivater [M13mp9/PH05-TPA (Xhol-l til 4)] fordøjes med BamHI og Xhol, og 2,5 kb fragmenterne isoleres ved elektroforese på lavtsmeltende agarosegel (se eksempel 5c). På tilsva-15 rende måde fordøjes 2 yg p3lR(XhoI) med Xhol og Hindlll, og 134 bp fragmentet isoleres. 2 yg .gærplasmid pJDB207 fordøjes med BamHI og Hindlll, og 6,5 kb DNA fragmentet isoleres som beskrevet ovenfor. De tre fragmenter ligeres ved 15°C i 15 timer, og Escherichia coli HB101 transfor-20 meres til ampicillinresistens. Plasmid DNA isoleres fra 12 kolonier, og konstruktionerne verificeres ved restriktionsanalyse med Hindlll, Xhol og BamHI restriktionsendonucleaser. Isolater fra de fire kloningsforsøg udtages og betegnes 49

DK 164941 B

pJDB 2 O 7/PHO 5-ΤΡΑΔ1, pJDB207/PHO5-TPAA2, pJDB207/PHO5-TPAA3 , pJDB2 O 7/PH05-ΤΡΑΔ 4.

5 Eksempel 9

Dannelse af plasmid p31RL/TPA(12-2) (fig.16)

Sammenbindingen af PH05 promotoren og kodningssekvensen for modent TPA gennemføres ved hjælp af et syntetisk oligo-deoxynucleotid. Et plasmid indeholdende denne oligodeoxynu-10 cleotidbinder ved 3'-enden i PH05-promotoren anvendes som et acceptor DNA til kloning af kodningssekvensen for modent TPA.

A. Fremstilling af acceptorplasmid p31RL (fig. 16); a) Fordøjelse af plasmid p31R med EcoRI og alkalisk phos-15 - phatase;_ 3 ug plasmid p3lR DNA (se eksempel 6e) fordøjes med 6 enheder restriktionsendonuclease EcoRI i 60 minutter ved 37°C under de betingelser, som anbefales af leverandøren (Boehringer). Efter fuldstændig fordøjelse opvarmes prø-20 ven i 10 minutter til 65°C til inaktivering af enzymet.

0,05 rumfang 1 M Tris.HCl, pH 8,0, og 2 enheder alkalisk phosphatase fra kalvetarm (Boehringer) tilsættes. Blandingen inkuberes i 60 minutter ved 37°C og derefter i 1 time ved 65°C til varmeinaktivering af phosphatasen. DNA1 et 25 renses ved ionby tterkroma tograf i på DE52 (Whatman) . DNA'et adsorberes på DE52 (100 μΐ lagrumfang pakket i en silicone-behandlet Pasteur-pipette) i lavsaltpuffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) og elueres med en højsaltpuf feropløsning (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA).

30 Det eluerede DNA fældes med ethanol og resuspenderes i 10 mM Tris.HCl, pH 8,0 ved en koncentration på 0,15 mg/ml.

50

DK 164941 B

b) Ligering af kemisk syntesiseret DNA binder til p3lR ·' fordøjet med EcoRI og alkalisk phosphatase;_

Et oligodeoxynucleotid med formlen 5'-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3' 5 fremstilles ved anvendelse af phosphotriestermetoden (Ita-kura et al. (40), de Rooij et al (41)). Sekvensen for oligodeoxynucleotidet er selvkomplementær. Ved anellering fås en dobbeltstrenget DNA binder på 24 basepar. 5 yg af det syntetiske oligodeoxynucleotid phosphoryleres ved 10 5'-enderne med 7,5 yCi [γ-32Ρ]-ΑΤΡ (5000 Ci.mmol-1, Amersham) i 50 yl 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2/ 4 mM DTT, 0,5 mM ATP og 35 enheder T4 polynucleotidkinase (Boehringer) i 30 minutter ved 37°C. Blandingen inkuberes derefter i 5 minutter ved 75°C, hvorpå den henstår til afkøling til 15 stuetemperatur og opbevares ved -20°C.

2,5 yg af det radioaktivt phosphorylerede, anellerede binder DNA selvligeres i 50 yl 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT og 2000 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) ved 6°C natten over. T4 DNA ligasen inaktiveres ved 65°C i 10 20 minutter. De fremkomne multimerer af binder DNA1et fordøjes med restriktionsendonuclease EcoRI i 60 yl 100 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2/ 50 mM NaCl og 55 enheder EcoRI (Boehringer) i 60 minutter ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved frysning af prøven i flydende nitrogen.

25 0,5 yg phosphoryleret, EcoRI-spaltet binder DNA ligeres til p3lR fordøjet med EcoRI og alkalisk phosphatase i 10 yl 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 5 mM DTT og 300 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) ved 15°C i 3 timer. Alikvoter på 4 yl af ligeringsblandingen sættes 30 til 100 yl calciumbehandlede, transformationskompetente Escherichia coli HB101 celler (se eksempel 4a).

Fire transformerede amp kolonier dyrkes hver for sig i LB medium indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA

51

DK 164941 B

fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Holmes et al. (26) og analyseres ved fordøjelse med Kpnl og Smal/BamHI.

En klon, som kan spaltes ved restriktionsendonucleasen 5 Kpnl, og som giver de forventede restriktionsfragmenter efter Smal/BamHI dobbeltnedbrydning, vælges til den videre fremstilling og betegnes p3lRL.

Plasmid p31R kan erstattes med plasmid p31Y eller et vilkårligt af følgende plasmider anført i eksempel 6c: p31p, 10 p31V, p3lL, p3lN, p3lC, p3lH, p31S, p31k, p311. EcoRI- spaltet, dephosphoryleret p3lY DNA ligeres til phosphoryle- ret EcoRI-spaltet binder DNA. Der foretages transformering

R

og analyse af amp kolonier som beskrevet ovenfor. En klon med de forventede restriktionsfragmenter vælges og 15 betegnes p3lYL.

B. Indsætning af TPA DNA i plasmid p31RL (fig. 16): a) Fordøjelse af plasmid p3lRL med Ncol: 5 yg p31RL DNA fordøjes med restriktionsendonucleasen Ncol under de af leverandøren (Biolabs) anbefalede betingelser.

20 Efter fuldstændig fordøjelse deproteiniseres opløsningen ved ekstraktion med phenol/chloroform, og DNA'et koncentreres ved fældning med ethanol. DNA1et genopløses i 10 mM Tris.HCl, pH 8, ved en koncentration på 0,25 mg/ml.

b) Reaktion af Klenow DNA polymerase med Ncol-spaltet 25 p3lRL DNA:_ 5 yg p31RL DNA spaltet med Ncol inkuberes i 100 pi 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 0,4 yM dATP, 30 yCi[a-32P]-dATP, 0,1 mM dTTP, 0,1 mM dCTP, 0,1 mM dGTP og 8 enheder Klenow DNA polymerase (stort fragment, BRL). Efter 15 mi-30 nutter ved stuetemperatur forøges koncentrationen af umærket dATP til 0,1 mM. Inkuberingen fortsættes i yderligere 45 minutter ved stuetemperatur. Reaktionen afbrydes ved ekstraktion med phenol/chloroform. DNA'et koncentreres 52

DK 164941 B

ved fældning med ethanol og genopløses i 10 mM Tris.HCl, pH 8/0/ ved en koncentration på 0,25 mg/ml.

Som et alternativ til reaktionerne a) og b) kan p31RL DNA også behandles med restriktionsendonuclease Kpnl og T4 DNA 5 polymerase som beskrevet i reaktion c) og d): c) Fordøjelse af plasmid p3lRL med Kpnl: 10 ug p31RL DNA fordøjes fuldstændigt som foreskrevet af leverandøren (Biolabs). Blandingen ekstraheres med phenol/ chloroform. DNA*et fældes med ethanol og genopløses i 10 10 mM Tris.HCl, pH 8, 0,1 mM EDTA, ved en koncentration på 0/4 mg/ml.

d) Reaktion af T4 DNA polymerase med KpnI-spaltet p31RL DNA: 9 ug p31RL DNA spaltet med Kpnl inkuberes ved 37°C i 2,5 minutter med 10 enheder T4 DNA polymerase (42) i 100 μΐ 15 33 mM Tris-acetat, pH 7,9, 66 mM kaliumacetat, 10 mM magnesiumacetat og 0,5 mM DTT (trimmetrin). Genfremstilling af den trimmede DNA-streng gennemføres i et større rumfang på 200 ul i nærværelse af 33 mM Tris-acetat, pH 7,9, 66 mM kalium-acetat, 10 mM magnesium-acetat, 0,5 mM DTT,

20 0,4 μΜ dATP, 30 uCi[a-32P]-dATP, 0,1 mM dTTP, 0,1 mM dCTP

og 0,1 mM dGTP. Efter 18 minutter ved'! 37°C hæves koncentrationen af ikke-mærket dATP til 0,1 mM og inkuberin-gen fortsættes i yderligere 35 minutter ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved ekstraktion med phenol/chloroform.

25 DNA’et fældes med ethanol og genopløses i 10 mM Tris.HCl, pH 8, ved en koncentration på 0,4 mg/ml.

e) Fordøjelse med Smal af det lineære, DNA polymerase- behandlede p3lRL plasmid DNA:_ 4/5 ug p31RL DNA behandlet med Ncol og Klenow DNA polymera-30 se (eksempel 9Bb) eller 4 ug p31RL DNA inkuberet med Kpnl og T4 DNA polymerase (eksempel 9Bd) fordøjes fuldstændigt med restriktionsendonucleasen Smal. Reaktionerne afbrydes ved ekstraktion med phenol/chloroform. DNA'et fældes 53

DK 164941 B

med ethanol og resuspenderes i 100 yl 50 mM Tris.HCl, pH 8,0.

f) Dephosphorylering og isolering af de 4,3 kb store DNA fragmenter:_ 5 1,4 enheder alkalisk phosphatase fra kalvetarm (Boehringer) sættes til hver DNA prøve. Der inkuberes i 1 time ved 37°C og derefter i 1 time ved 65°C til inaktivering af enzymet. Saltkoncentrationen i blandingerne indstilles på 150 mM NaCl, og DNA'et renses ved ionbytterkromatografi på DE52 10 som beskrevet i eksempel 9 Aa, DNA1et udfældes med ethanol og genopløses i 45 yl 10 mM Tris.HCl, pH 8.

De store 4,3 kb DNA fragmenter isoleres på en præparativ 0,8%'s agarosegel i Tris-borat-EDTA, pH 8,3 ved udskæring af små gelblokke, som indeholder DNA'et. DNA'et fra hver 15 enkelt blok elektroelueres separat i en dialysepose fyldt med 1,5 ml 5-dobbelt fortyndet Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. De lukkede poser neddyppes i Tris-borat-EDTA-puffer, pH 8,3. Efter 30 minutters forløb ved 100 mA vendes strømretningen i 45 sekunder for at fjerne DNA'et fra dialyse-20 membranen. Pufferen, som omgiver gelblokken i dialyseposen, genvindes, indstilles på 150 mM NaCl og ledes gennem en ion-byttersøjle af DE52 (Whatman). DNA1et elueres med en højsaltpuffer (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 8,0, og 1 mM EDTA), fældes med ethanol og genopløses i 10 mM Tris, 25 pH 8,0, ved en koncentration på 0,2 mg/ml. DNA fragmenterne betegnes p3lRLA.

Reaktionerne a) til f) kan gennemføres på analog måde under anvendelse af p3lYL DNA i stedet for p3lRL DNA til dannelse af p31YLADNA fragmenter.

30 g) Ball fordøjelse af plasmid pW349F;

Plasmid pW349F indeholder strukturgenet for human vævsspecifik plasminogenaktivator klonet i PstI stedet i pBR322 (se eksempel 7c).

54

DK 164941 B

Til fremstilling af plasmid DNA anvendes en enkelt koloni Escherichia coli HB101 transformeret med plasmid pW349F til inokulering af 100 ml LB medium, som indeholder 10 mg/1 tetracyclin. Kulturen rystes natten over ved en temperatur 5 på 37°C ved 200 o/m. Plasmidfremstillingen gennemføres som beskrevet i eksempel 2.

10 ug pW349F plasmid DNA fordøjes med 10 enheder restriktion s endonuclease Ball (BRL) i 200 yl 6 mM Tris.HCl, pH 7,5, 6 mM NaCl, 6 mM MgCl2/ 6 mM 2-mercaptoethanol og 0,1 mg/ml 10 okseserumalbumin i 2 timer ved 37°C. Efter fuldstændig fordøjelse deproteiniseres opløsningen ved ekstraktion med phenol/chloroform. DNA'et udfældes med ethanol og resus-penderes i 10 mM Tris.HCl, pH 8,0, ved en koncentration på 0,2 mg/ml.

15 Ligering af Xhol bindere til de korte ender af det Ball-spaltede DNA er et muligt trin til tilvejebringelse af et hensigtsmæssigt kloningssted for yderligere konstruktioner.

h) Fordøjelse af Ball-spaltet pW349F DNA med Bglll: 20 4 ug Ball-spaltet pW349F DNA fordøjes med restriktions- endonuclease Bglll som anbefalet af leverandøren (Biolabs).

Efter fuldstændig fordøjelse ekstraheres proteiner med phenol/chloroform. DNA'et fældes med ethanol og genopløses i H20 ved en koncentration på 0,2 mg/ml.

25 i) Begrænset reaktion af Klenow DNA polymerase og nuclease S·^ ved Bglll restriktionsstedet:_ 4 ug pW349F DNA spaltet med Ball og Bglll inkuberes i 100 ul 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP med 8 enheder Klenow DNA polymerase i 30 minut-30 ter ved stuetemperatur. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA til en slutkoncentration på 10 mM. Protein ékstra-heres med phenol/chloroform. DNA'et fældes med ethanol og resuspenderes i H20 til en koncentration på 0,2 mg/ml.

55

DK 164941 B

Til yderligere spaltning med nuclease inkuberes DNA'et i 50 yl 30 mM natriumacetat, pH 4,6, 200 mM NaCl, 1 mM ZnSO^ og 1,5 enheder nuclease (Sigma) i 30'minutter ved 37°C. Der ekstraheres med phenol/chloroform, hvorpå 5 DNA'et fældes med ethanol og genopløses i 45 yl 10 mM Tris.HCl, pH 8,0.

k) Isolering af et 1,86 kb Bglll-Ball restriktionsfragment:_ 1,86 kb Bglll-Ball DNA fragmentet med Bglll-restriktions-10 stedet omdannet til en kort ende ved hjælp af Klenow DNA polymerase og nuclease som beskrevet ovenfor isoleres på en præparativ 0,8%'s agarosegel i Tris-borat-EDTA, pH 8,3. DNA'et udvindes fra gelblokkene ved elektroeluering som beskrevet i eksempel 9 Bf.

15 1) Kloning af 1,86 kb DNA fragmentet i et egnet acceptor DNA: 0,3 yg af 1,86 kb DNA fragmentet med kort ende (se eksempel 9 Bk) ligeres til 0,6 yg p3lRLA (se eksempel 9 Bf). Reaktionen gennemføres i 10 yl 60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 10 mM MgC^, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP med 400 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) 20 i løbet af 20 timer ved 15°C.

Alikvoter på 3 yl eller 6 yl af ligeringsblandingerne sættes til 100 μΐ calciumbehandlede, transformationskompetente Escherichia coli HB101 celler (se eksempel 4a).

R

48 transformerede amp kolonier dyrkes hver for sig i LB 25 medium indeholdende 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Holmes et al. (26) og analyseres ved fordøjelse med EcoRI. 12 kloner har 1,86 kb DNA fragmentet klonet i den rigtige orientering. Disse kloner underkastes yderligere analyse ved sekven-30 sering af DNA'et ved bindingen mellem PH05 promotoren og TPA strukturgenet. Der anvendes et syntetisk oligodeoxy-nucleotid, som hybridiserer tæt ved mRNA startstedet for PH05 promotoren og tillader sekvensering af nedstrøms-bindingsområdet. Der anvendes M13 revers priming betin- 56

DK 164941 B

gelser (43) til denaturering af dobbeltstrenget plasmid DNA og hybridisering af det syntetiske oligodeoxynucleo-tid. DNA sekvenseringen gennemføres som beskrevet (39).

To kloner har følgende korrekte bindingssekvens * PH05 tnRNA

G AAT AIAGAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGGAATTCC ATG TCT TAC C AA.....

5 Met Ser Tyr Gin........

* PH05 mRNA start

_ PH05 DNA

........ binder DNA

-------- TPA DNA

Disse kloner er identiske og betegnes p31RL/TPA(12-2).

10 Eksempel 10

Underkloning af genkonstruktioner i gærvektoren pJDB207 med højt kopital (jfr. fig. 17)_

Konstruktionen beskrevet i eksempel 9 indeholder PH05 promotoren uden dens signalsekvens, TPA kodningsområdet og PH05 15 transkriptionsterminalsignalerne i et tandemmønster indsat 1 en pBR322 afledt vektor. Til ekspression i gær subklones hele den indsatte del i gærvektor pJDB207 (22), som tillader selektion for leucinprototrope kolonier.

2 yg p31RL/TPA(12-2) DNA fordøjes med resfriktionsendonu-20 cleaserne Sall og Hindlll. Restriktionsfragmenterne adskilles på en præparativ 0,8%'s lavtsmeltende agarosegel, og det lille 2,8 kb fragment udskæres af gelen.

i 57

DK 164941 B

5 ug pJDB207 DNA fordøjes med restriktionsendonucleaserne Sall og Hindlll. Det store 6,2 kb fragment isoleres fra en præparativ 0,8%'s lavtsmeltende agarosegel'. Gelblokke indeholdende DNA fragmenterne smeltes ved 65°C og for-5 tyndes med H20 for at sænke agarosekoncentrationen til ca. 0,3%.

2,8 kb Sall-Hindlll fragmentet af plasmid p3lRL/TPA(12-2) blandes med en ækvimolær mængde af 6,2 kb Hindlll-Sall fragmentet af pJDB207. Der foretages ligeringer i 100 μΐ 10 i 4 timer ved 15°C. 10 ul af hver enkelt ligeringsblanding anvendes til transformering af kompetente Escherichia col i T> HB101 celler som beskrevet i eksempel 4a. Flere amp kolonier fra hvert forsøg dyrkes individuelt i LB medium indeholdende 100 ug/ml ampicillin. Plasmid DNA'et analyseres 15 for størrelsen af den indsatte del ved spaltning med restriktionsendonucleaserne Hindlll og Sall. En enkelt klon med den korrekte indsatte del betegnes pJDB207R/ PH05-TPA(12-2) .

Eksempel 11 20 Transformering af Saccharomyces cerevisiae GRF18

Plasmiderne pJDB207/PHO5-TPA(lA) , pJDB207/PHO5-TPAål, pJDB207/PHO5-TPAA2, pJDB207/PHO5-TPAA3, pJDB207/PHO5-TPAA4 og pJDB207R/PHO5-TPA(12-2) indføres hver for sig i Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18, (a, his3-ll, his3-15, p 25 leu2-3, leu2-112, can ) under anvendelse af transformerings metoden beskrevet af Hinnen et al. (12) . 1 ug plasmid DNA sættes til 100 yl sfæroplast suspension, og blandingen behandles med polyethylenglycol. .Sfæroplasterne blandes med 10 ml regenereringsagar og udspredes på gærminimal 30 mediumplader uden leucin. Efter inkubering i 3 dage ved 30°C fås ca. 200 transformerede celler.

Der udtages en enkelt gærkoloni for hver af gærtransformationerne. De forskellige kolonier har følgende betegnelser: m 58

DK 164941 B

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-TPA(1A),

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-TPA /\ 1,-Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-TPA/\ 2,

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-TPA/\ 3, 5 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-TPA /\ 4 og!

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TPA(12-2).

Gærcellerne dyrkes ved 30°C i 10 ml gærminimalmedium i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe ved omrystning i 24 timer, η indtil der er opnået en celletæthed på ca. 2-3 x 10 10 celler pr ml. Cellerne vaskes én gang med 20 ml lav P^ minimal medium. 3 ml af de resuspenderede celler anvendes til inokulering af hhv. 300 ml lav-P^ minimal medium og 300 ml normal minimal medium i 1000 ml Erlen-meyer-kolber. Inkuberingen gennemføres ved 30°C og 160 o/m.

15 Indføringen af PH05 promotoren følges ved at måle forekomsten af sur phosphataseaktivitet i hele celler som beskrevet af Toh-e et al. (44) . Cellerne dyrkes til en tæthed på ca. 1-2 x 107 celler/ml (26-30 timers inkubering).

59

DK 164941 B

Eksempel 12

Fremstilling af gærcelleekstrakter og bestemmelse af TPA-_aktiviteten_ Gærceller fra 35 ml lav P^ dyrkningsmedium (48) med en 5 celletæthed på 1 - 2 x 10*7/ml samles ved centrifugering i en Sorvall SS34 rotor i 10 minutter ved 3000 omdrejninger pr. minut. Cellerne vaskes i en puffer indeholdende saltkomponenterne i dyrkningsmediet (dvs. uden aminosyrer, glucose, vitaminer og sporelementer). Cellerne cen-10 trifugeres ved stuetemperatur i 5 minutter ved 3000 omdrejninger pr. minut. De sedimenterede celler resuspen-deres i et samlet rumfang på 4 ml kold 66 mM natriumphos-phatpuffer, pH-værdi 7,4, og 0,1% (r/r) "Triton"®X-100. Cellesuspensionen overføres til et 30 ml Corex-rør, der 15 tilsættes 8 g glasperler (diameter 0,4 mm), hvorpå suspensionen rystes på en Vortex-blander (Scientific Instruments Inc., USA) med fuld hastighed i 4 minutter, hvorpå suspensionen afkøles i et isbad. Mere end 90% af cellerne er sønderdelt ved denne behandling. Cellerester og glas-20 perler sedimenteres ved centrifugering i 10 minutter ved 8000 omdrejninger pr. minut ved en temperatur på 4°C i en Sorvall HB-4 rotor. Supernatanten overføres til Eppen-dorfrør, fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -60°C.

TPA-aktiviteten bestemmes under anvendelse af fremgangsmå-25 den ifølge Rånby (49) med nogle mindre ændringer. D-Val--Leu-Lys-pNA (Kabi S-2251) anvendes som substrat. Absorptionen ved 405 nm korrigeres for uspecifik spaltning og sammenlignes med en urokinasestandard. Resultaterne er anført i nedenstående tabel II.

60

DK 164941 B

Tabel II

TPA aktivitet i Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 transformeret med forskellige rekombinantplasmider: TPA aktivitet (enh./l gærcelle-5 kultur/OD600) frakoblet tilkoblet

Plasmid (høj Pi) (lav Pi) pJDB207R/PHo5-TPA(12-2) - 60 pJDB207/PH05-TPA(lA) 20 625 10 pJDB207/PH05-TPAAl - 600 pJDB207/PHO 5-ΤΡΑΔ 2 - 700 pJDB207/PHO 5-TPΑΔ 3 - 650 pJDB207/PH05-ΤΡΑΔ 4 - 625

Eksempel 13 15 Dannelse af et plasmid med en præcis samling mellem PH05 signalsekvensen og kodningsregionen for modent TPA (fig. 18)

Denne konstruktion tilvejebringer en korrekt samling mellem PH05 signalsekvensen og kodnings sekvensen fra modent 20 TPA under anvendelse af et syntetisk oligodeoxynucleotid.

For nemheds skyld underklones det relevante område af plasmid pJDB207/PH05-TPAA2 (se eksempel 8e) i plasmid P31 (se eksempel 5).

a) Isolering, af plasmid ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ2 25 2 pg af hver af plasmiderne pJDB207/PH05-TPAA2 og p31 (se eksempel 8e og 5) fordøjes med restriktionsendonucleaser-ne Hindlll og Sall. Efter fuldstændig fordøjelse separeres DNA-fragmenterne på en 0,6%'s lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTAf pH-værdi 8,3. 2,6 kb Hindlll-Sall 30 fragmentet af pJDB207/PH05-TPAA2 og 3,1 kb Hindlll-Sall 61

DK 164941 B

fragmentet af p31 udskæres fra gelen. Gelblokkene smeltes ved 65°C og fortyndes med vand til en agarosekoncentra-tion på 0,3%. Ækvimolære mængder af de to fragmenter blandes og ligeres i 100 μΐ i 4 timer ved 15°C. 10 yl af lige-5 ringsblandingen anvendes til transformering af kompetente Escherichia coli HBlOl-celler. Der foretages analyse af adskillige amp -kolonier. En enkelt klon med den korrekte indsatte del betegnes ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ2.

Den samme konstruktion gennemføres med plasmiderne 10 pJDB207/PH05-TPAål, pJDB207/PH05-TPAA 3 og pTOB207/PH05-TPA Δ4 (se eksempel 8e). De dannede plasmider betegnes ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ1, ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ3 og ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ4.

b) Dannelse af plasmid p31/PH05-TPA18 (fig. 18) 30 yg plasmid ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ2 fordøjes med restriktions-15 endonucleasen Xhol. Det lineariserede DNA ekstraheres med phenol/chloroform, fældes med ethanol og genopløses i 10 mM Tris*HCl, pH-værdi 8, ved en koncentration på 0,5 mg/ml (ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ2·Χ1ιοΙ).

5 yg af det Xho-spaltede DNA fordøjes yderligere med 20 Ball. Efter fuldstændig fordøjelse ekstraheres DNA'et en gang med phenol/chloroform, fældes med 2,5 rumfang ethanol og resuspenderes i 10 mM Tris*HCl, pH-værdi 8. Restriktionsfragmenterne separeres på en 1,2%'s agarose-gel i Tris-borat-EDTA-puffer med pH-værdi 8,3. Det store 25 3,9 kb Xhol-Ball-fragment udskæres af gelen i en lille gelblok. DNA'et (fragment A, jf. fig. 18) udvindes fra gelblokken ved elektroeluering og ionbytterkromatogra-fi med DE52 som beskrevet i eksempel 9Bf. DNA'et koncentreres ved fældning med ethanol og genopløsning i 10 mM 30 Tris'HCl, pH-værdi 8, ved en koncentration på 0,2 mg/ml.

20yg ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ2·ΧΐιοΙ (se ovenfor) fordøjes delvis med restriktionsendonuclease PstI (0,75 enheder/yg DNA) 62

DK 164941 B

i 200 μΐ 10 mM Tris*HCl, pH-værdi 7,5, 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 6 mM mercapto-ethanol og 0,01 mg/ml ethidiumbromid i 45 minutter ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved ekstraktion med phenol/chloroform. DNA'et fældes med ethanol og 5 genopløses i 10 mM Tris*HCl, pH-værdi 8. Restriktionsfragmenterne separeres på en 1,2%'s agarosegel i Tris-borat-EDTA, pH-værdi 8,3. Et 1,6 kb Xhol-Pstl-fragment (fragment B, jf. fig. 18), som indeholder størsteparten af kodningsområdet for modent TPA, udvindes fra en gelblok ved elek-10 troeluering som beskrevet ovenfor. DNA'et fældes med ethanol og genopløses i 10 mM Tris*HCl, pH-værdi 8 ved en koncentration på 40 yg/ml.

Den korrekte samling mellem PH05 signalsekvensen og kodningsområdet for modent TPA tilvejebringes ved hjælp af 15 en syntetisk binder med formlen [C] 5'-CCAATGCATCTTACCAAGTGATCTGCA-3' [D] 3'-GGTTACGTAGAATGGTTCACTAG -5'

Otte nucleotider ved 5'-enden af binderen (5'-CCAATGCA....) repræsenterer en del af PH05 signalsekvensen fra Ball-sted-20 et til enden, og 19 nucleotider kompletterer sekvensen for modent TPA fra 5'-enden i kodningsområdet til det første PstI sted (se fig. 19). 01igodeoxynucleotiderne C og D syntetiseres ved hjælp af phosphotriestermetoden. De phos-phoryleres hver for sig ved 5'-enderne, blandes i lige sto-25 re mængder og anelleres som beskrevet i eksempel 9Ab.

60 ng (4 pmol) phosphoryleret, anelleret binder DNA ligeres til 0,4 ug (0,4 pmol) af 1,6 kb Xhol-PstI fragmentet (fragment B, se ovenfor) i 15 yl 60 mM Tris*HCl pH-værdi 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 5 mM DTT og 600 enh. T4 DNA ligase 30 ved 15°C i 16 timer. Ligasen inaktiveres i 10 minutter ved 85°C. Overskud af bindere fjernes ved fældning af DNA'et i nærværelse af 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat, pH-værdi 6,0, og 0,54 rumfang isopropanol. Multipla af binder DNA'et og DNA-fragmentet genopløses ved fordøjelse med Ball og Xhol.

63

DK 164941 B

Som følge af additionen af binderen ved PstI stedet er 1,6 kb Xhol-PstI fragmentet omdannet til et -Xhol-Ball fragment.

0,4 yg af dette 1,6 kb Xhol-Ball DNA fragment og 1 yg af 5 3,9 kb Xhol-Ball fragmentet (fragment A, se ovenfor) li geres i 10 yl 60 mM TriS'HCl, pH-værdi 7,5, 10 mM MgCl2, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT og 400 enh. T4 DNA ligase ved stuetemperatur i 16 timer. Alikvoter på 3 yl og 7 yl af ligeringsblandingen sættes til 100 yl calcium-behandlede, 10 transformationskompetente Escherichia coli HB 101 celler (se eksempel 4a). Ti transformerede, amp -kolonier dyrkes hver for sig i LB medium indeholdende 100 yg/ml ampi-cillin. Plasmid DNA fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Holmes et al. (26). Klonerne analyseres 15 ved sekvensering over binderområdet.

En klon, som viser den korrekte rammebinding mellem PH05-signalsekvensen og kodningsområdet for modent TPA (se fig. 19), betegnes p31/PH05-TPA18.

Plasmid ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ2 kan ombyttes med ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ1, 20 ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ3 eller ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ4. Konstruktionerne gennemføres på samme måde som beskrevet ovenfor. Specielt betegnes en klon afledt af plasmid ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ3 som p31/PH05-TPA42.

Eksempel 14 25 Plasmidkonstruktioner med DNA-kodning for prepro-TPA (fig. 20, 21) ......

PH05-promotoren bindes til DNA-sekvenserne, der koder for prepro-TPA. Nucleotidsekvensen for 35 aminosyrer i prepro-området efterfølges af sekvensen, som koder for modent 30 TPA.

64

DK 164941 B

a) Isolering af en del af TPA-kodningsområdet, som omfat-ter TPA-signalsekvensen (se fig. 20). _ 30 yg plasmid pW349F spaltes med restriktionsendonuclea-se Bgll. Efter ekstraktion med phenol/chloroform og fæld-5 ning med ethanol fordøjes DNA'et yderligere med EcoRI og BamHI. Restriktionsfragmenterne separeres på en 1%'s aga-rosegel i Tris-borat-EDTA, pH-værdi 8,3. 0,9 kb Bgll-EcoRI lokaliseres på gelen og skæres ud. DNA'et udvindes ved elektroeluering som beskrevet i eksempel 9Bf.

10 3,5 yg af 0,9 kb Bgll-EcoRI-fragmentet fordøjes fuldstæn digt med Hgal, hvorved der dannes tre fragmenter. Blandingen ekstraheres med phenol/chloroform, og DNA-fragmen-terne fældes med ethanol. De klæbrige ender i fragmenterne dannet ved fordøjelse med Hgal udfældes ved reaktion 15 med Klenow DNA polymerase (1 enh./yg DNA) indeholdende 60 mM Tris*HCl, pH-værdi 7,5, 10 mM MgCl2/ 0,1 mM TTP, 0,1 mM dCTP og 0,1 mM dGTP. Efter 60 minutter ved 20°C afbrydes reaktionen ved fældning med ethanol. DNA-fragmenterne med korte ender blandes med den 40-dobbelte mol-20 mængde phosphoryleret og anelleret EcoRI binder (Biolabs).

Der foretages ligering i 56 μΐ 60 mM Tris*HCl, pH-værdi 7,5, 10 mM MgCl2, 5mM DTT, 3,5 mM ATP og 2000 enh. T4 DNA ligase i 16 timer ved 15°C. Overskud af bindermolekyler fjernes ved fældning af DNA'et i nærværelse af 10 mM EDTA, 25 pH-værdi 7,5, 300 mM natriumacetat, pH-værdi 6,0, og 0,54 rumfang isopropanol. Blandingen af DNA-fragmenterne fordøjes med EcoRI til fjernelse af overskud af binder og med Narl. Efter fuldstændig fordøjelse separeres restriktionsfragmenterne på en 1%'s agarosegel i Tris-borat-30 EDTA, pH-værdi 8,3. 446 bp EcoRI/[Hgal]-Narl fragmentet udskæres af gelen, og DNA'et udvindes ved elektroeluering (se eksempel 9Bf).

65

DK 164941 B

b) Isolering af et DNA-fragment indeholdende 3'-delen af TPA kodningssekvensen og gærtranskriptionsterminerings-signalerne (se fig. 20)_ 10 pg plasmid ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ2 fordøjes med Hindlll. Efter 5 ekstraktion med phenol/chloroform og fældning af DNA'et med ethanol genopløses DNA’et i H20 ved en koncentration på 0,1 mg/ml og fordøjes med Narl. Restriktionsfragmenterne separeres på en 1%'s agarosegel i Tris-borat-EDTA, pH-værdi 8,3. 1,4 kb Narl-Hindlll fragmentet isoleres og 10 udvindes fra en agarosegelblok ved elektroeluering (se eksempel 9Bf).

c) Isolering af et DNA fragment indeholdende vektorsekven- ser og PH05 promotoren (se fig. 21)__ 5 jig plasmid p31R fordøjes med restriktionsendonuclease 15 Hindlll og EcoRI. Restriktionsfragmenterne adskilles på en 1%'s agarosegel i Tris-borat-EDTA, pH-værdi 8,3. 3,9 kb Hindlll-EcoRI DNA fragmentet isoleres og udvindes fra aga-rosegelblokken ved elektroeluering.

d) Ligering af fragmenter (se fig. 21) 20 0,3 pmol af 3,9 kb Hindlll-EcoRI fragmentet, 0,3 mol af 1,4 kb Narl-Hindlll fragmentet og 0,6 pmol af 446 bp EcoRI-Narl fragmentet ligeres i 12 μΐ 60 mM Tris *HC1, pH-værdi 7,5, 10 mM MgCl2, 1 raM ATP, 5 mM DTT og 480 enh. T4 DNA ligase ved 15°C i 6,5 timer. Alikvoter på 5 μΐ og 7 μΐ 25 af ligeringsblandingen sættes til 100 μΐ calciumbehandlede, transformationskompetente Escherichia coli HB 101 celler (se eksempel 4a).

R

23 transformerede, amp kolonier dyrkes hver for sig i LB medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin. Plasmid DNA fra 30 forskellige kloner analyseres ved restriktion med Pstl. En af klonerne med det forventede mønster af restriktionsfragmenter betegnes p31R/SS-TPAA2.

66

DK 164941 B

Plasmid ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ2 kan erstattes med ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ3 eller en af de andre kloner anført i eksempel _13a. Konstruktionerne gennemføres som beskrevet ovenfor. Én klon afledt af plasmid ρ31/ΡΗ05-ΤΡΑΔ3 betegnes p3lR/SS-TPAA3.

5 Eksempel 15

Plasmidkonstruktioner med PH05-signalsekvensen forlænget ind i PH05-kodningsområdet (se fig. 22-24)._ Når fremmed DNA bindes til PH05 signalsekvensen, er den dannede aminosyresekvens i omegnen af signalpeptidspalt-10 ningsstedet forskelligt fra aminosyresekvensen i det ægte PH05 protein. Ændringer i aminosyresekvensen kan påvirke effektiviteten ved behandling af proteinet ved hjælp af signalpeptidasen. Derfor anvendes der i følgende DNA konstruktioner PH05 signalsekvens med forlængelser ind i 15 kodningsområdet for moden sur phosphatase. Kun ved varierende afstande efter signalsekvensen bindes kodningsområdet for modent TPA i struktur via syntetiske oligodeoxy-nucleotidbindere, som indeholder bearbejdningssteder for en gærendopeptidase. Spaltning ved disse steder forhindrer 20 dannelsen af sammensmeltede proteiner.

a) Underkloning af PH05-sekvenser, som strækker sig ind i kodningsområdet for moden sur phosphatase' (fig. 22)

Der isoleres DNA fragmenter, som indeholder PH05 promotoren, PH05 signalsekvensen og varierende længde af kodnings-25 sekvens for moden sur phosphatase. Rsal restriktionssteder findes i stillingerne 595, 637, 811 og 1312 fra et modstrøms BamHI sted (48). Da PH05 signalsekvensen når frem til stilling 592, findes de forskellige Rsal steder ved henholdsvis stilling 3, 45, 219 og 720 baser i kodnings-30 sekvensen for moden, sur phosphatase. BamHI-Rsal fragmenter subklones via et syntetisk oligodeoxynucleotid under ændring af Rsal stedet til et Xbal sted.

67

DK 164941 B

Plasmid DNA af pJDB207/PH05,PH03 (se eksempel 2) spaltes med BamHI og Hpal, og det dannede 3,9 kb fragment, som indeholder PH05- og PH03-generne, isoleres ved præparativ geleléktrophorese. 3,9 kb HamHI-Hpal fragmentet underklo-5 nes i vektoren pBR322, som er blevet spaltet med BamHI og PvuII. Det dannede plasmid med PH05- og PH03-generne som indsatte dele betegnes p29.

30 yg plasmid p29 fordøjes med restriktionsendonucleaser BamHI og EcoRI. Efter fuldstændig fordøjelse ekstraheres 10 DNA'et med phenol/chloroform, hvorpå det fældes med ethanol. DNA'et genopløses i 10 mM Tris*HCl, pH-værdi 8,0 ved en koncentration på 0,5 mg/ml.

15 yg BamHI, EcoRI spaltet p29 fordøjes partielt med Rsal (0,9 enh./yg DNA) i 300 yl 10 mM Tris*HCl, pH-værdi 8,0, 15 6 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 6 mM mercaptoethanol og 5 yg/ml ethidiumbromid i 45 minutter ved 37°C. Fordøjelsen afbrydes ved ekstraktion med phenol. DNA'et udfældes med ethanol og genopløses i vand ved en koncentration på 1 mg/ml.

Et oligodeoxynucleotid med formlen 20 5'-CTAGATCTAG-31 phosphoryleres ved dets 5'-ende og det selvanelleres som beskrevet i eksempel 9Ab. 4 yg (1400 pmol) phosphoryleret og anelleret binder DNA ligeres til 14 yg (140 pmol) begrænset p29 DNA (se ovenfor) i 80 yl 60 mM Tris*HCl, 25 pH-værdi 7,5, 10 mM MgCl2, 3,5 mM ATP, 5 mM DTT og 3200 enh. T4 DNA ligase ved 20°C i 16 timer. T4 DNA ligase in-aktiveres ved opvarmning i 10 minutter til 65°C. Et overskud af bindere fjernes ved fældning i nærværelse af 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat, pH-værdi 6,0, og 54 rum-30 fang isopropanol. Fordøjelse af DNA'et med BamHi og Xbal (4 enh./yg DNA) giver mange strukturer og fører til Xbal klæbrige ender. Som følge af binderadditionen ved Rsal stederne med korte ender og efterfølgende Xbal spaltning 68

DK 164941 B

af binderen omdannes alle p29 BamHI-Rsal restriktionsfragmenter til BamHI-Xbal fragmenter. De adskilles på en 1%’s lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA, pH-værdi 8,3. Gelblokke, som indeholder BamHI-Xbal-fragmenterne 5 med en størrelse på 595 bp, 637 bp, 811 bp eller 1312 bp udskæres af gelen.

Plasmid pBR322/PH05 Eco-Bam afledes af plasmid pG7 (eksempel 2). pG7 spaltes med restriktionsendonucleaserne EcoRI og BamHI. De dannede DNA fragmenter separeres ved 10 pr&parativ gelelektroforese. Der isoleres et 2,1 kb

EcoRI-BamHI fragment, som har flankeringssekvenser modstrøms for PH05 BamHI stedet. 2,1 kb fragmentet ligeres til et 4 kb EcoRI-BamHI fragment af vektor pBR322. Det dannede plasmid betegnes 15 pBR322/PH05 Eco-Bam.

Plasmid pBR322/PH05 Eco-Bam indeholder et 2,1 kb EcoRI-BamHI fragment, som har flankeringssekvenser modstrøms for PH05 BamHI stedet. 15 jig plasmid DNA fordøjes med BamHI og Xbal. Restriktionsfragmenterne separeres 20 på en 0,6%'s lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA, pH-værdi 8,3. 4,25 kb BamHI-Xbal fragmentet udskæres fra gelen.

Gelblokke indeholdende DNA fragmenterne smeltes ved 65°C og fortyndes med vand for at formindske agarosekoncen-25 trationen til 0,3%. Ækvimolære mængder af 637 bp BamHI-Xbal fragmentet og 4,25 kb BamHI-Xbal vektorfragmentet blandes og ligeres i 125 μΐ 60 mM Tris^HCl, pH-værdi 7,5, 10 mM MgC^, 5 nMDTT, 1 mM ATP og 600 enh. T4 DNA ligase ved 15°C i 16 timer.

30 10 μΐ af ligeringsblandingen sættes til 100 μΐ transforma tionskompetente Escherichia coli HB 101 celler som beskre-

R

vet i eksempel 4a. 5 amp kolonier dyrkes hver for sig i 69

DK 164941 B

LB medium indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA'et analyseres med hensyn til størrelsen af den „indsatte del ved spaltning med restriktionsendonucleaser EcoRI og BamHI. En enkelt klon med den korrekte indsatte del be-5 tegnes PBR32 2/PH05Bam-Rsa 637.

637 bp BamHI-Xbal fragmentet kan erstattes med BamHI-Xbal fragmenter med en størrelse på 595 bp, 811 eller 1312 bp. Enkelte kloner med en indsat del af den forventede stør-10 relse betegnes pBR322/PH05Bam-Rsa 595, pBR322/PH05Bam-Rsa 811 og pBR322/PH05Bam-Rsa 1312.

b) Addition af syntetiske oligodeoxynucleotider; 637 bp BamHI-Xbal fragmentet indeholder PH05 promotoren og PH05 signalsekvensen med en forlængelse ind i kodnings-15 sekvensen for moden sur phosphatase op til Rsal stedet ved stilling 637. DNA fragmentet samles i struktur med kodningssekvensen for modent TPA over en syntetisk oligo-deoxynucleotid binder, som koder for aminosyresekvensen Leu-Glu-Gly-Val-Ser-Leu-Asp-Lys-Arg. Denne sekvens fin-20 des også modstrøms for kodningssekvensen for gær α faktor (54).

5 yg plasmid pBR322/PH05Bam~Rsa 637 fordøjes med restriktions endonuclease Xbal. Efter fuldstændig fordøjelse ekstraheres DNA'et med phenol/chloroform, hvorpå det fæl-25 des med ethanol. DNA*et genopløses i 50 mM Tris*HCl, pH-værdi 8,0 ved en koncentration på 50 yg/ml og fordøjes med 11 enheder alkaliphosphatase fra kalvetarm (Boehringer) i 1 time ved 37°C. Enzymet inaktiveres ved opvarmning til 65°C i 1 time. DNA'et renses ved ionbytterchromatogra-30 fi på DE52 (Whatman) og fældning med ethanol som beskrevet i eksempel 9Aa.

70

DK 164941 B

To syntetiske oligodeoxynucleotider med formlen 5' - CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA -3'" 3'- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5' phosphoryleres hver for sig ved 5'-enderne som beskre-5 vet i eksempel 9Ab. De phosphorylerede oligodeoxynucleotider blandes i ækvimolære mængder. Blandingen opvarmes i 10 minutter til 75°C, hvorefter den henstår til langsom afkøling til stuetemperatur og opbevares ved -20°C. Denne binder betegnes som binder C.

10 1 yg (120 pmol) phosphory leret, anelleret binder C og 5 yg (1,5 pmol) Xbal-spaltet, dephosphoryleret pBR322/PH05 Bam-Rsa 637 ligeres i 40 yl 60 mM Tris»HCl, pH-værdi 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 1600 enh. T4 DNA ligase ved en temperatur på 15°C i 20 timer. DNA ligasen inakti-15 veres ved opvarmning til 85°C i 10 minutter, og overskud af bindere fjernes ved fældning med isopropanol. DNA'et genopløses i vand ved en koncentration på 0,25 mg/ml.

Multiple bindere fjernes ved fordøjelse med restriktions-endonuclease Bglll. DNA'et fældes med ethanol, genopløses 20 og fordøjes yderligere med BamHI. Restriktionsfragmenterne separeres på en 0,6%'s lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA, pH-værdi 8,3. 662 bp BamHI-Bglll fragmentet (afledt af 637 bp BamHI-Rsal fragmentet) lokaliseres og udskæres af gelen.

25 c) Isolering af et vektorfragment indeholdende kodnings-sekvensen for modent TFA (fig. 23)..... ..

5 yg plasmid p31R/SS-TPAA2 fordøjes med restriktionsendo-nucleaserne BamHI og Bglll. Efter fuldstændig fordøjelse fældes DNA'et med ethanol, hvorpå det resuspenderes i 30 50 mM Tris*HCl, pH-værdi 8,0, ved en koncentration på 75 yg/ml. DNA fragmenterne dephosphoryleres ved 5'-enderne ved fordøjelse med 1 enhed alkalisk phosphatase fra kalvetarm (Boehringer) i 60 yl 50 mM Tris*HCl, pH-værdi 8,0, i 1 time ved 37°C. Phosphatasen inaktiveres ved in- 71

DK 164941 B

kubering ved 65°C i 1,5 timer. DNA'et renses ved ionbytter-chromatografi på DE52 (Whatman) som beskrevet i eksempel 9Aa. DNA'et fældes med ethanol, genopløses i 10 mM Tris-HC1, pH-værdi 8,0, og sættes til en 0,6%'s lavtsmeltende 5 agarosegel. Det 5,2 kb store BamHI-BgIII fragment udskæres af gelen.

d) Ligering af isolerede DNA-fragmenter og transformation af Escherichia coli HB 101 (se fig. 23 og 24)_

To lavtsmel tende agarosegelblokke indeholdende 0,1 pmol 10 af henholdsvis 5,2 kb BamHI-BgIII fragmentet af p31R/SS-ΤΡΑΔ2 og 0,2 pmol af 662 bp BamHI-BgIII fragmentet af pBR322/PH05Bam-Rsa 637 blandes, smeltes ved 65°C og fortyndes til en agarosekoncentration på 0,3%. Ligeringen gennemføres i 150 yl 60 mM Tris*HCl, pH-værdi 7,5, 10 mM 15 Mgci2, 5ml!lDTT, 1 mM ATP og 800 enh. T4 DNA ligase (Biolabs) ved en temperatur på 15°C i 16 timer. 10 yl og 30 yl alikvoter blandes med 100 yl transformationskompetente Escherichia coli HB101 celler som beskrevet i eksem-pel 4a. 6 amp , transformerede kolonier dyrkes hver for 20 sig i LB medium indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA analyseres efter størrelse og orientering af den indsatte del ved spaltning med restriktionsendonuclease BamHI. En enkelt klon med den korrekte orientering af det indsatte stykke betegnes p31/PH05 637C-TPA (se fig. 23).

25 Plasmid pBR322/PH05Bam-Rsa 637 erstattes også med pBR322/PH05Bam-Rsa 595, pBR322/PH05Bam-Rsa 811 og pBR322/PH05-Bam-Rsa 1312. Under anvendelse af samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor isoleres enkelte kloner med indsatte stykker af forventet størrelse og orientering, og de be-30 tegnes p31/PH05 595C-TPA, p31/PH05 811C-TPA og p31/PH05 1312C-TPA.

Binder C ombyttes endvidere med binder B med formlen 72

DK 164941 B

5'- CTAGATAAGAGATCTGC -3' 3'- TATTCTCTAGACG -5' . '

Der gennemføres phosphorylering af de syntetiske oligo-deoxynucleotider, anellering og ligering til de tilsva-5 rende DNA-fragmenter som beskrevet ovenfor for binder C.

De dannede kloner markeres med bogstavet B og betegnes p31/PH05 595B-TPA, p31/PH05 637B-TPA, p31/PH05 811B-TPA og p31/PH05 1312B-TPA. I disse konstruktioner koder binder B for aminosyresekvensen Leu-Asp-Lys-Arg.

10 Binder C erstattes endvidere med binder A med formlen 5 *- AAGAGATCTGC -3' 3'- TTCTCTAGACG -51 som koder for Lys-Arg i den færdige konstruktion (fig. 24). Phosphorylering af de syntetiske oligodeoxynucleotider og 15 anellering gennemføres på samme måde som beskrevet for binder C.

Til binderaddition fordøjes 5 jig Xbal-spaltet pBR322/PH05 Bam-Rsa 637 med to enheder nuclease (Sigma) i 50 yl 30 mM natriumacetat, pH-værdi 4/6, 200 mM natriumchlorid 20 og 1 mM ZnSO^ i 40 minutter ved 37°C til dannelse af korte ender (se fig. 23). Efter ekstraktion med phenol/chlo-roform fældes DNA'et med ethanol, hvorpå det genopløses i vand ved en koncentration på 0,25 mg/ml. 0,4 yg (120 p-mol) phosphoryleret, anelleret binder A og 5 yg (1,5 pmol) 25 Xbal/S-^-spaltet pBR322/PH05Bam-Rsa 637 ligeres med de korte ender som beskrevet for binder C, idet der dog anvendes 3,5 mM ATP. Der gås i øvrigt frem som beskrevet ovenfor.

De dannede kloner identificeres ved hjælp af bogstavet A og betegnes p31/PH05 595A-TPA, p31/PH05 637A-TPA, 30 P31/PH05 811A-TPA og p31/PH05 1312A-TPA.

73

DK 164941 B

Eksempel 16

Underkloning af genkonstruktioner i høj kopi antal gærvektoren pJDB207 og transformation af Saccharomyces cere-_visiae GRF18_ 5 Konstruktionerne beskrevet i eksempel 13-15 indeholder PH05 promotoren med eller uden forlængelser ind i kodningsområdet for PH05 genet, TPA kodningsområdet med eller uden prepro-sekvensen og PH05 transkriptionstermine-ringssignalerne i et tandemmønster, alle indsat i en 10 pBR322 afledt vektor. BamHI-Hindlll fragmenter indeholdende den fuldstændige opstilling ligeres til 6,4 kb BamHI-Hindlll fragmentet af pJDB207 som beskrevet for en analog reaktion i eksempel 10. Kompetente Escherichia co-li HB101 celler tranformeres, og flere amp kolonier fra 15 hvert forsøg dyrkes individuelt i LB medium med 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA analyseres ved spaltning med re-striktionsendonucleaser Hindlll, BamHI og Pstl.

Ud fra plasmiderne p31/PH05-TPA18, p31/PH05-TPA42, p3lR/SS-TPAA2, p3lR/SS-TPAå3, p31/PH05 595C-TPA, 20 p31/PH05 637C-TPA, p31/PH05 811C-TPA, p31/PH05 1312C-TPA, p31/PH05 595B-TPA, p31/PH05 637B-TPA, p31/PH05 811B-TPA, p31/PH05 1312B-TPA, p31/PH05 595A-TPA, p31/PH05 637A-TPA, p31/PH05 811A-TPA og p31/PH05 1312A-TPA fås følgende kloner med de korrekte indsatte stykker;

25 pJDB207/PH05-TPAl8 pJDB207/PH05~TPA42 pJDB207R/PH05-SS-TPAA2 pJDB207R/PH05-SS-TPAA3 pJDB207/PH05 595C-TPA 30 pJDB207/PH05 637C-TPA pJDB207/PH05 811C-TPA PJDB207/PH05 1312C-TPA pjDB207/PH05 595B-TPA pjDB207/PH05 637B-TPA 35 pj DB207/PH05 811B-TPA

74

DK 164941 B

PJDB207/PH05 1312B-TPA pJDB207/PH05 595A-TPA pJDB207/PH05 637A-TPA pJDB207/PH05 811A-TPA 5 PJDB207/PHO5 1312A-TPA

Disse plasmider indføres i Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 som beskrevet i eksempel 11.

En enkelt gærkoloni fra hver af gærtransformationerne udtages. De dannede kloner betegnes som følger:

10 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05-TPAl8 Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PH05-TPA42 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-SS-TPΑΔ2 Saccharomyces cerevisiae GRF18/ pJDB207R/PH05-SS~TPAA3 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 595C-TPA

15 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 637C-TPA

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 811C-TPA

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 1312C-TPA

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 595B-TPA

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 637B-TPA

20 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 811B-TPA

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 1312B-TPA

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PH05 595A-TPA

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PH05 637A-TPA Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 811A-TPA 25 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05 1312A-TPA

Gærceller dyrkes, høstes og ekstraheres som beskrevet i eksempel 11 og 12. TPA aktiviteten i celleekstrakter analyseres som beskrevet i eksempel 12. Resultaterne er anført i tabel III.

75

DK 164941 B

Tabel III

TPA-aktivitet for gærstamme Saccharomyces cérevisiae GRF18 transformeret med forskellige plasmider og analyseret under tilkoblede betingelser (lav P^): ^ TPA aktivitet (enh./l gærcelle-

Plasmid kultur/ODg00) PJDB207/PH05-TPA18 750 pJDB207/PH05-TPA42 700 pJDB207R/PHO 5-SS-TPΑΔ 2 600 10 pJDB207R/PH05-SS-TPAA3 650 pJDB207/PH05 595C-TPA 900

Eksempel 17

Chromosomal ombytning af PH05 genet med genet for TPA (se fig. 25)_ 15 TPA proteinkodningsområdet anbringes i gærchromosom II i stillingen for proteinkodningsområdet for PH05. Dette foretages eksperimentelt ved cotransformering.

Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 cotransformeres med 25 yg plasmid p31/PH05-TPAl8 lineariseret ved spaltning 20 med BamHI- og HIndlll-restriktionsenzymer, og 3 yg gær-plasmid Yepl3 (51). Ud af 24 fremkomne Leu+ kolonier er én PH05*", og den danner samtidig ca. 35 enheder TPA/liter gærkultur/ODgQQ. Ved dyrkning af denne transformant på et leucinholdigt medium (YPD, 10 g/liter Bacto gærekstrakt, 25 20 g/liter Bacto pepton, 20 g/liter glucose) i 10 gene rationer, fås Leu” segreganter ved en frekvens på 10-20%, hvor plasmid Yepl3 formentlig er gået tabt. Ved Southern-analyse af total gær DNA isoleret fra Leu segreganter (52) eftervises på DNA-niveauet, at TPA proteinkodnings-30 sekvenserne har erstattet PH05 proteinkodningssekvenserne, idet flankeringssekvenserne på chromosom II er uændrede, og at stammerne ikke indeholder Yepl3 plasmid DNA. Én 0 76

DK 164941 B

stamme udvælges og betegnes Saccharomyces cerevisiae GRF18 (pho5-TPA) .

5 Eksempel 18

Fremstilling af TPA ved hjælp af en rekombinansstamme af gæren Saccharomyces cerevisiae i 30 liter målestok_

Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18/pJDB207/PH05-TPA(lA) 10 bærer et plasmid, som indeholder en leucinmarkør, der tillader selektiv opretholdelse af plasmidet i værtsorganismen, et strukturgen for human TPA og sur phosphatase PH05 promotoren, som tillader ekspression af TPA-genet i medier med begrænsede mængder uorganisk phosphat (tilkob-15 lede betingelser).

Stammen holdes på agarskrårørskulturer fremstillet med et bestemt medium, som ikke indeholder aminosyren leucin for at sikre tilbageholdelse af plasmidet. Frisk inokulerede 20 skrårør inkuberes i 24 timer ved 30°C. Overfladekulturen på et skrårør suspenderes i 3 ml prædyrkningsmedium, som derefter overføres til en første rystefcolbeforkultur.

500 ml kolben har en enkelt prelplade og indeholder 100 ml forkulturmedium I med følgende sammensætning i g/liter: 25 L-asparagin, 2,0, L-histidin, 0,02, glucose, 10, KH2P04, 1,0, MgS04«7 H20, 0,5, NaCl, 0,1, CaCl2*2 H20, 0,1, vitaminopløsning, 5 ml/liter og sporelementopløsning, 5 ml/li-ter.

30 Mediet indstilles på pH-værdien 7,2 under anvendelse af NaOH inden sterilisering. Glucosen, vitaminerne og sporelementerne steriliseres separat og tilsættes mediet.

S tamopløsningerne for vitaminer og sporelementer har følgende sammensætninger i g/liters Vitaminer-biotin, 35 0,0002, calcium-D-pantothenat, 0,04, folinsyre, 0,0002, 77

DK 164941 B

O

nicotinsyre, 0,04, p-aminobenzoesyre, 0,02, pyridoxin--hydrochlorid, 0/04, riboflavin, 0,02, thiamin-hydrochlo-rid, 0,04 og inositol, 0,2 il liter deioniseret vand, sporelementer-borsyre, 0,05, CuS04«5H20, 0,004, Kl, 0,01, 5 FeCl3*6H20, 0,02, MnS04*4H20, 0,04, Na2Mo04*2H20, 0,02 og ZnS04*7H20, 0,04 i 1 liter deioniseret vand. Mediet fremstilles under anvendelse af deioniseret vand.

Den første forkultur inkuberes i 24 timer ved 30°C på et 10 orbitalrysteapparat med en vandring på 5 cm og med 250 omdrejninger pr. minut.

Den første forkulturkolbe giver podematerialet til de næste forkulturkolber. Disse kolber tilsættes podemateriale 15 i en mængde på 1% r/r. De indeholder 100 ml forkulturmedium II med følgende sammensætning i g/liter: Gærekstrakt (Difco), 10,0, L-asparagin, 6,6, KH2P04, 1,0, MgS04*7H20, 1,0, L-histidin, 0,02 og D-glucose (monohydrat), 33,0.

20 Mediet, som er fremstillet under anvendelse af deioniseret vand, har en pH-værdi på ca. 6,0. Glucosen er steriliseret separat. Inkuberingsbetingelserne er de samme som ved den første forkultur. Fermenteringsvæsken fra tre sådanne kolber hældes samen til dannelse af et 1% r/r podemateri-25 ale til i hovedproduktions fermenteringsbeholderen.

Produktionsfermenteringsbeholderen har et samlet rumfang på ca. 45 liter, indeholder 4 prelplader og en seksbla-det pladeturbineomrører med en diameter på 115 mm. Omrø-30 ringshastigheden er 600 omdrejninger pr. minut, overtrykket er 0,3 bar,og beluftningen er 0,5 rumfang/rumfang/min.

Fermenteringsbeholderen indeholder 30 liter medium med følgende sammensætning i g/liter: L-asparagin, 2,0, L-histidin, 0,02, KH2P04, 0,03, MgS04’7H20, 0,5, NaCl, 78

DK 164941 B

O

0,1, CaCl2*2H20, 0,1, KCl, 1,0, D-glucose (monohydrat), 20.0, vitaminopløsning, 5 ml/liter og sporelementopløsning, 5 ml/liter. Mediet indstilles på pH-værdien 7,2 under anvendelse af natriumhydroxid inden steriliserin- 5 gen. Glucosen, vitaminerne og sporelementerne steriliseres hver for sig og sættes til mediet. Stamopløsninger af vitaminer og sporelementer har samme sammensætning som beskrevet ovenfor i forbindelse med forkulturmedium I.

10 Fermenterings temperaturen er 30°C. pH-Værdien falder til 5.0, hvor den reguleres med natriumhydroxid. Efter fermentering i ca. 20 timer nås det maksimale udbytte af TPA. Den optiske tæthed, der antager en værdi på 2-3 enheder, og sur phosphataseaktiviteten er nyttige indikatio- 15 ner for forløbet af fermenteringen. Fermenteringsvæsken afkøles til 10°C,inden gærcellerne høstes.

Eksempel 19

Udvinding og rensning af TPA og pro-TPA ved monoclonalt 20 anti-TPA antistofkromatoqrafi. _ a) Celleekstraktion

Dyrkningsvæsken (pH-værdi 4) fra 30 liters fermenteringen (jf. eksempel 18 ) afkøles til-10°C og centrifugeres under 25 anvendelse af en Alfa-Laval BRPX-207 slamf jernercentrifu-ge. De adskilte celler resuspenderes i 2 liter lyseringspuffer A (20 mM NaH2P04, 80 mM K2HP04, 150 mM NaCl, 0,01% "Tween", 10 mM benzamidin og 10 mM EDTA. Opløsningen afkøles til 5°C og ledes gennem en "Dyno" ® mølle (type 30 „ , - KDL-pilot) ved en tilførselshastighed pa 10 liter/time.

Møllen er forsynet med 500 ml glasperler med en diameter på 0,5-0,75 mm og kører med 3000 omdr./min. Inden tilsætning af de suspenderede celler vaskes glasperlerne med 35 79

DK 164941 B

300 ml lyseringspuffer A indeholdende 30 mg BSA. Den oplukkede cellesuspension centrifugeres (Sorvall rotor 653, 40 minutter, 9000 omdrejninger pr. minut) , og det faste materiale kastes bort.

5 b) DNA fordøjelse og ammoniumsulfatfraktionering 5 mg DNAse sættes til 2 liter klar suspension, og blandingen omrøres i 30 minutter ved 4°C. Derefter bringes opløsningen på en mætningsgrad på 35% med hensyn til ammoniumsulfat (vægt/rumfang), og der omrøres i 1 time ved 4°C. Op-10 løsningen centrifugeres som beskrevet ovenfor, og det faste materiale, som indeholder al TPA-aktiviteten resuspen-deres i 1 liter puffer A, som indeholder 1% "Tween" og 0,1% SDS. Suspensionen omrøres i mindst 1 time ved 4°C.

cj Immunoaffinitets kromatografi 15 I) Rensning af anti-TPA antistof 5 ml kanin anti-TPA antiserum (fra Dr. E. Reich, Fried-rich-Miescher-Institut, Basel) ledes gennem en lysinse-pharosesøjle til fjernelse af plasminogenet fra serumet.

Søjlen vaskes med 1-2 rumfang PBS, pH-værdi 7,4, som in-20 deholder 100 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 8,1 mM Na2HP04 og 1,5 mM KH2P04. Væsken og vaskevæskerne hældes sammen. Anti-serumet, hvorfra plasminogenet er fjernet, fældes ved tilsætning af fast arnmoniumsulfat til en s lutkoncentration på 50% (v/r) . Opløsningen henstår natten over ved 25 4°C, hvorefter den centrifugeres (Sorvall GSA rotor, 12000 omdrejninger pr. minut i 20 minutter). Bundfaldet opløses i et lille rumfang PBS og dialyseres mod PBS indeholdende 0,1% NaN^. IgG'et fra denne dialyserede opløsning renses på en protein A sepharosesøjle (55).

80

DK 164941 B

II) Fremstilling af en anti-TPA antistofsøj le 13 mg renset anti-TPA antistof dialyseres mod 0,1 M Mops, pH-værdi 7,0. Antistoffet kobles til 5 ml aktiveret Affi-gel 10 (Biorad) under anvendelse af producentens vejled-5 ning. Gelmatrixen ækvilibreres med PBS indeholdende 1% "Tween" 80, 0,1% SDS, 0,2 M NaCl, 10 mM benzamidin og 0,1% NaNg. Derefter anbringes matrixen i en 5 ml søjle.

III) Rensning af TPA ved immunoaffinitetskroma tograf i

Det genopløste faste stof fra ammoniumsulfatfraktione-10 ringen centrifugeres til fjernelse af partikelformet materiale (Sorvall GSA rotor, 30 minutter, 12.000 omdrejninger pr. minut), hvorefter det sættes til affinitetssøjlen ved en strømningshastighed på ca. 10 ml/time ved 4°C. Når al væsken har passeret søjlen, vaskes denne med 15 10 søjlerumfang PBS indeholdende 0,05% "Tween" 80. Søj len elueres med 0,1 M glycin-HCl, pH-værdi 2,5, indeholdende 0,1% "Tween". Fraktioner på 2 ml udtages og analyseres for TPA aktivitet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Rånby (49). D-Val-Leu-Lys-pNA (Kabi S-2251) 20 anvendes som substrat. Fraktioner med-den største aktivitet hældes sammen, neutraliseres med 1 M Tris og koncentreres ved ultrafiltrering under anvendelse af en Amicon fladtlagsmembran YMlO. Det på denne måde fremstillede TPA har en renhedsgrad på ca. 90% og foreligger overvejende på 25 enkeltkaedeformen (pro-TPA), hvilket påvises ved hjælp af SDS-PAGE under reducerende betingelser. Den tilsyneladende molekylvægt under ikke-reducerende betingelser er ca.

60.000 på SDS-PAGE (se fig. A).

Fig. A og B: SDS polyacrylamidgelelektrophorese af gær 30 TPA-genproduktet (fig. A) og dets enzymatiske aktivitet på aktivitetsgel (caseinplader) (fig. B).

DK 164941 B

81 A: SDS-gel B: aktivitetsgel 1 ' 2 3 4 5 6 1 2 .... ·.*'··>»· B— -?·· " y «.

:^·μ 5*?r S^K *« 92,5 k - . . T i - ·····. ff»*·

67 K - 'm If n ! -II

- \ ‘ ff ' . V+ ? V · ’:: '.': ·: . ' V'·'. _ ." (· ' ' /*' '.'.

- · ..· · · ·« .-.

21»5 Κ _ ·ν - ,.\;Χ> ·;; : - ΐ4,4 κ- -¾^ ' ν: ^..,: :·' '-·' . ·- ' -· ''. - ··?;:. ···. ; : > >V^£V. y^y ν>;«Λ,?'·>·· ?*·\' ·' .·' - · -·.-'· .· .-" · ·. ·;'·*·.' ·* .·· -*" '. ·«- -..

'-<♦ '. *.· ’· ·*.···. · - '»^.v. ** · ': · " ” *- ' ' .. ... · . ' · '. ·>.-*. >_.·. .. Γ* >·*.. ·. .· ·. .... ' · · ad fig. A (SDS-PAGE):

10 bane 1 og 4: standardproteiner (størrelsesmarkører) bane 2 og 5: melanoma TPA bane 3 og 6: gær TPA

bane 1-3 under reducerende betingelser bane 4-6 under ikke-reducerende betingelser 15 Prøverne gennemføres på en 12,5%'s gel og farves for protein under anvendelse af Coomassie brillant blue.

ad fig. B (aktivitetsgel, jf. eksempel 22): bane 1: melanoma TPA bane 2: gær TPA

20 Casein-agar-plasminogen-overlag (reference 56).

Eksempel 20

Udvinding og rensning af TPA og pro-TPA ved DE-3 affini-__ tetskromatografi_ a. Fremstilling af en DE-3 'Sepharose1' ® søjle 25 26 mg renset DE-3 inhibitor fra Erythrina latissima (16) koblestil 5 ml cyanogenbromidaktiveret "Sepharose" 4b ^ 82

DK 164941 B

(Pharmacia) i overensstemmelse med producentens anvisnin ger. Matrixen ækvilibreres med phosphatpufret saltopløsning ("PBS"), pH-værdi 7,4, indeholdende 0,4 M NaCl, 0,1% "Triton" ν'X-100 og 0,02% natriumazid. Derefter pak-5 kes matrixen i en 5 ml søjle.

b) Kromatografisk rensning af TPA og pro-TPA på DE-3 "Sepharose" 4b R _._

Celleekstrakter (jf. eksempel 19a.) indstilles på 0,4 M med hensyn til NaCl og 0,1% med hensyn til "Triton"^ X-100 10 og filtreres gennem en 0,45 ym membran (Millipore). Derpå sættes opløsningen til DE-3 "Sepharose"®søjlen (se ovenfor) med en strømningshastighed på 45 ml pr. time ved stuetemperatur, og eluenten kastes bort. Når al væskeekstrakten har passeret søjlen, vaskes denne med ca. 50 ml 15 PBS indeholdende 0,4 M NaCl og 0,1% "Triton" ®X-100, og der udtages 2 ml fraktioner ved 4°C. Proteinindholdet i de enkelte fraktioner bestemmes ved måling af UV-absorptio-nen ved 280 nm. Det absorberede protein viser sig at være elueret som en skarp top. Fraktioner indeholdende den 20 største UV-absorbans og den højeste fibrinolytiske aktivi- . 125 tet bestemt ved hjælp af I-fibrin-analysen (47) hældes sammen, hvorved der fås 8 ml opløsning, som opbevares ved -20°C.

Denne opløsning repræsenterer ca. 70-80% af den totale aktivitet, som er sat til søjlen. Fraktioner indeholdende 25 lavere aktivitet hældes sammen. Den samlede aktivitetsudvinding er sædvanligvis 90-100%.

c) Kromatografisk rensning af pro-TPA på DE-3 "Sepharose" ®4b i nærværelse af en proteinaseinhibitor _

Der foretages kromatografering af gærcelleekstrakter på 30 samme måde som beskrevet i eksempel 2d.b, idet der dog anvendes basisk pancreatisk trypsininhibitor (BPTI) i en mængde på 0,1 KIE/ml. Ved anvendelse af den fluorometri-ske analyse med Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC som substrat (37) be- 83

DK 164941 B

stemmes indholdet af TPA og pro-TPA i den rensede opløsning. 90% af TPA'et foreligger på pro-enzymformen, og 10% på den aktive form. Omdannelsen af pro-TPA til TPA under rensningen inhiberes således af BPTI.

5 Eksempel 21

Adskillelse af pro-TPA fra TPA

Opløsningen af TPA og pro-TPA fremstillet som beskrevet ovenfor i eksempel 20c indstilles på pH-værdien 8,0 med 0,1 M Tris*HCl indeholdende 0,1% "Triton" ® X-100 og 10 indstilles på 1 mM med hensyn til diisopropylfluorphos-phat. Efter inkubering ved 37°C i 4 timer ledes blandin-gen gennem en 5 ml DE-3 "Sepharose" ^søjle (jf. eksempel 20a). Afgangsvæsken indeholder det irreversibelt inhibe-rede TPA og kastes bort. Søjlen vaskes med 6 søjlerumfang 15 PBS indeholdende 0,4 M NaCl og 0,1% "Triton"®X-100, hvorpå den elueres med PBS indeholdende 1,6 M KSCN, 0,4 M NaCl og 0,1% "Triton"®X-100 som beskrevet i eksempel 20 b. Fraktionerne med den kraftigste UV-absorbans hældes sammen. De sammenblandede fraktioner indeholder pro-TPA i 20 praktisk taget ren form, da der ikke kan påvises amidoly-tisk aktivitet ved den fluorometriske analyse under anvendelse af Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC (37) som substrat. Den amido-lytiske såvel som den fibrinolytiske aktivitet kan genetableres ved behandling med plasmin, som omdanner pro-25 TPA til det aktive enzym.

Eksempel 22

Egenskaber ved gær-TPA-genproduktet a. Enzymatiske egenskaber Gær-TPA-genproduktet fremstillet ifølge eksempel 18 og 30 renset ved DE-3 affinitetskromatografi (jf. eksempel 20b) har enzymatisk aktivitet, nvilket påvises ved spaltningen af zymogenplasminogen til plasmin i fraværelse og i nærværelse af fibrin. Enzymatisk aktivitet kan påvises ved de 84

DK 164941 B

colorimetriske analyser beskrevet af Rånby (49) (jf.

eksempel 12) og af Verheijen et al. (60) på -caseinplader 125 og fibrinplader (56) og ved en I-fibrinogen-fastfase-analyse (47). Den enzymatiske aktivitet på casein-plader 5 er vist i fig. B (jf. eksempel 19’cIII).

Det dannede TPA's enzymatiske aktivitet stimuleres kraftigt af fibrin. TPA'et, som er delvis renset ved DE-3 affinitetskromatografi, analyseres ved en parabolanalyse (jf. Rånby (49)). Ved anvendelse af reaktionshastig-2 10 heden ΔΕ mod At mellem 3-5 minutter som et udtryk for enzymaktiviteten er stimuleringen ved optimale fibrin-koncentrationer (ca. 100 yg/ml) 10-20 gange. Virkningen kan iagttages med fibrinfragmenter dannet ved CNBr fordøjelse (57) eller med bathr oxobinbehandlet fibrinogen 15 (58). Når urokinase testes under de samme betingelser, optræder der ingen stimulering af dets aktivitet med fibrinfragmenter .

b) Binding af TPA til fibrinplader

Under anvendelse af fibrinbindingstesten beskrevet af 20 Rijken et al. (2) viser det sig, at det dannede TPA, som er renset ved DE-3 affinitetskromatografi, binder i stor udstrækning til fibrinpropper. I modsætning dertil bindes urokinase ikke i væsentlig grad til fibrin. En slående forskel mellem det dannede gær-TPA-genprodukt og urokina-25 se er derfor, at førstnævnte absorberer til fibrin, hvilket resulterer i en udtalt forøgelse af plasminogenakti-veringen (59).

Eksempel 23

Glycosyleringstrin i gær-TPA-genproduktet 30 Til bestemmelse af glycosyleringstilstanden i TPA'et dannet ved hjælp af gær undersøges dets opførsel på en con-canavalin-A "Sepharose"®søjle (2).

85

DK 164941 B

Der anvendes en TPA fraktion/ som er delvis renset ved affinitetskromatografi på DE-3 "Sepharose" ®-søjlen (se eksempel 20b). Denne fraktion har en aktivitet på 11,5 FE/ ml/ hvilket svarer til 2/1 pg/ml TPA protein.

5 Den aktive fraktion (3 ml) sættes til en concanavalin-A "Sepharose" ®-søjle (0,5 ml lag rumfang) ækvilibreret med 0/1 M Tris*HCl, pH-værdi 7,5, indeholdende 1 M NaCl og 0. 01. (r/r) "Tween" ® 80.

Proteinerne i den gennemstrømmende væske opsamles i kun 10 en fraktion (ca. 3 ml). Efter vaskning af søjlen med 6 ml ækvilibreringspuffer foretages elueringen af de til matrixen bundne proteiner i 4 trin med α-methylmannosid og KSCN sat til ækvilibreringspufferen. De fire trin gennemføres efter hinanden med 0,5 ml af hver af følgende opløs-15 ninger: 1. 50 mM α-methylmannosid + 0,25 M KSCN i ækvilibreringspuffer 2. 100 mM α-methylmannosid + 0,50 M KSCN i ækvilibrerings puffer 20 3. 200 mM α-methylmannosid + 1 M KSCN i ækvilibrerings puffer 4. 300 mM α-methylmannosid + 2 M KSCN i ækvilibrerings puffer.

Der udvindes en signifikant TPA aktivitet i trin 2 og 3, 25 men der frigøres ingen aktivitet med lave koncentrationer af salt og sukkerart (trin 1).

Endvidere findes noget TPA i gennemstrømningsfraktionen (se ovenfor).

Disse resultater viser, at TPA er glycosyleret i gær. Der 30 forekommer imidlertid også aktivitet i gennemstrømningsfraktionen, hvilket indicerer, at ikke alt det TPA, som er 86

DK 164941 B

dannet i gær, er fuldstændig glycosyleret, hvilket kan skyldes overproduktionssituationen i lavt P medium.

Eksempel 24

Farmaceutiske præparater til parenteral indgift 5 En TPA- og/eller pro-TPA-holdig opløsning fremstillet som beskrevet i eksempel 19-21 dialyseres mod 0,3 M natrium-chloridopløsning indeholdende 0,01% "Tween" ®80 og opbevares ved -80°C. Inden indgift justeres koncentrationen til 75 yg/ml totaltTPA (dvs. TPA eller pro-TPA eller TPA 10 plus pro-TPA) og 0,3 M NaCl. Opløsningen steriliseres ved filtrering gennem et 0,22 ym membranfilter.

Denne fremgangsmåde er egnet til fremstilling af opløsninger af TPA, pro-TPA eller TPA plus pro-TPA til parenteral indgift, såsom intravenøs indgift.

15 Eksempel 25 I. Stammer og plasmid

Til fermenteringsundersøgelser anvendes de utransformerede forældrestammer Saccharomyces cerevisiae GRF 18 og H426. Begge stammer transformeres med plasmidet pJDB207/PH05-20 TPA(IA) (jf. eksempel 8d) ved anvendelse af standard-transformationsprotokollen [Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978)]. pJDB207/PH05-TRA(lA) indeholder LEU2-genet som udvælgelig markør. De fremkomne transformanter isoleres som leucinuafhængige kolonier. De 25 betegnes henholdsvis GRF18/pJDB207/PH05-TPA(lA) og 423/pJDB207/PH05-TPA(1A).

II. Fremgangsmåder og resultater ·' 1. Fermentering og titer

De to forældrestammer og de respektive transformanter 30 dyrkes i to prækulturer og en hovedkultur. I den første 87

DK 164941 B

prækultur inokuleres 10 ml medium med højt phosphatindhold bestående af (g/1): Gærnitrogenbase 6,8 [indeholder 1 g/1 KH2PO4; 5 uden aminosyrer (Difco) ] asparagin -10,0 glucose 20,0 histidin 0,1 med ca. 1 x 10^ celler og dyrkes i 48 timer ved 30°C og 10 180 o/m. Kulturer af de to forældrestammer suppleres desuden altid med 0,1 g/1 leucin. Den anden prækultur, 50 ml af samme medium som ovenfor, inokuleres med 10% (r/r) af den første prækultur og dyrkes i 24 timer under samme fermenteringsbetingelser.

15 Efter 24 timer pelleteres cellerne ved centrifugering ved 3000 o/m i 10 minutter, vaskes to gange med 0,9% natrium-chlorid og resuspenderes i en celletæthed på 7*107 celler pr. ml i 50 ml medium med lavt phosphatindhold. En portion på 5 ml fjernes (Oh prøve) og holdes på is indtil yderli-20 gere behandling. Mediet er sammensat af nøjagtig de samme bestanddele som mediet med højt phosphatindhold (ovenfor), bortsat fra at phosphatindholdet er nedsat til 30 mg/1 kaliumdihydrogenphosphat.

Eftersom t-PA ekspression i konstruktionen PH05-TPA(1A) er 25 under kontrol af ΡΗ05-promotoren, tilkobles t-PA

ekspression i mediet med lavt phosphatindhold.

Efter dyrkning i hovedkulturen i 5 timer ved 30eC og 180 o/m er PH05-promotoren tilstrækkelig tilkoblet målt ved 12 ganges forøgelse af aktiviteten af sur phosphatase af 30 aliquoter med hele celler af S.cerevisiae GRF18. Til bestemmelse af denne phosphataseaktivitet anvendes den af Toh-e beskrevne fremgangsmåde [Toh-e, A. et al. J. Bacte-riol. 113, 727 (1973). En anden 5 ml aliquot (5 h prøve) 88

DK 164941 B

udtages. Cellerne i 5 h prøven pelletteres ved centrifugering og resuspenderes i 5 ml 60 mM phosphatpuffer pH

7,0, 4 mM Zeittergent® (Calbiochem), 10 g glasperler 5 tilsættes, og cellerne nedbrydes ved omrøring ved høj hastighed i 5 minutter på en Vortex blander. Suspensionen af nedbrudte celler centrifugeres ved 12.000 o/m i 3 minutter, og den fremkomne cellelysat-supernatant undersøges for t-PA aktivitet. Til sammenligning under-10 kastes 0 h prøven (se ovenfor) samme procedure.

Til bestemmelse af t-PA aktiviteten anvendes Verheijen's fremgangsmåde [Verheijen, J.H. et al., Thrombosis

Haemostasis 48, 266 (1982) ]. I denne analyse tjener t-PA (humant melanom t-PA referencestandard: Lot 83/517 NIBSC, 15 Holly Hill, London, England) som standard. Rent t-PA’s · specifikke aktivitet er bestemt til 480.000-500.000 IE/mg [produkt III, American Diagnostica, Greenwich, USA; Dodd, I. et al. FEBS Letters 209, 13 (1986) ]. t-PA titerne i gær-fermenteringen er følgende: 20 t-PA (/tg/1)

Stamme Oh 5 h S. cerevisiae GRF 18 <0,1 <0,1 S. cerevisiae H 426 <0,1 <0,1 25 GRFl8/pJDB207/PH05-TPA(lA) 4 55 423/pJDB207/PH05-TPA(lA) 11 218

Den af S. cerevisiae producerede t-PA er overvejende (omkring eller mere end 90%) på den enkeltkædde (proenzym) form som bestemt ved metoden ifølge M. Zimmerman et al.

30 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 750 (1978)].

89

DK 164941 B

2. Sammenligning af de specifikke aktiviteter af gær-rekombinant t-PA og humant melanom t-PA_ Gær-rekombinant t-PA fremstilles ud fra 30 liters fermen-5 tering af stammen 423/pJDB207/PH05-TPA(lA) med lavt phos-phatindhold. t-PA renses ved DE-3 affinitetskromatografi som beskrevet for humant melanom t-PA (jf. europæisk offentliggørelsesskrift nr. 112.122 og eksempel 20 ovenfor). Renheden af det gær-rekombinante t-PA efter 2 10 påfølgende kromatograferinger på DE-3 er større end 90% bestemt ved SDS-gelelektroforese og HPLC. Tilsvarende isoleres t-PA fra en human Bowes melanom-cellelinie (jf. europæisk offentliggørelsesskrift nr. 113.319). De to præparaters proteinindhold bestemmes ifølge M.M. Bradford 15 [Anal. Biochem. 72, 248 (1976)]. De to t-PA præparaters biologiske virkninger sammenlignes i tre uafhængige analyser in vitro.

Der findes følgende specifikke aktiviteter:

Specifik Gær- humant 20 aktivitet rekombinant melanom

mg protein t-PA t-PA

FU1 133.000 129.000 VIU2 648.000 477.000 25 CIU3 497.000 510.000

Fluorometrisk analyse, FU = fluorometriske enheder M. Zimmerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 75, 750 (1978) 2

Modificeret Verheijen-analyse, VIU = internationale 30 enheder i Verheijen-analysen [J.H. Verheijen et al.,

Thrombosis Haemostasis 48, 266 (1982) ] 3

Blodpropspaltningsanalyse, CIU = internationale enheder i blodpropspaltningsanalysen [P.J. Gaffney et al., Thrombosis Haemostasis 53, 134 (1985)].

90

DK 164941 B

De tre analyser er beskrevet af P.F. Fauquex [i Kluft, C. et al. (udg), Leiden Fibrinolysis Workshop on assays of plasminogen activators and their inhibitors, Gaubius-TNO, 5 Leiden (NL), 30-32 (1986) ]. I fravær af bromcyan-spalt-ningsprodukter af fibrin udviser både gær-rekombinant t-PA og humant melanom t-PA specifikke aktiviteter (VIU/mg) på 3000-5000.

Resultaterne viser klart, at gær-rekombinant t-PA er 10 mindst lige så aktiv om ikke mere aktiv end originalt humant melanom t-PA ved tre uafhængige biologiske analyser. Endvidere stimuleres gær t-PA af fibrinfragmenter i samme grad som humant melanom t-PA (jf. Verheijen-analysen i fravær eller nærvær af fibrinfragmenter). Derfor er 15 foldningen af strukturdomæner, der rummer forskellige biologiske funktioner, sandsynligvis korrekt i tilfælde af gær-rekombinant t-PA i sammenligning med den originale humane t-PA.

3. Glycosylerlngstilstand af gær-rekombinant t-PA

20 1 mg af hver af renset gær-rekombinant t-PA og humant melanom t-PA underkastes kvantitativ GC-MS sukkeranalyse (under anvendelse af rhamnose som intern standard). Sukkeranalysen udføres i overensstemmelse med de af R.G. Spiro et al. [J. Biol. Chem. 249, 5704-5717 (1974)] og 25 C.C. Sweeley et al. [ J. Am. Chem. Soc. 85, 2497 (1963)].

Følgende mannoseindhold findes: mannose _(mol/mol protein) humant melanom t-PA 12 30 gær-rekombinant t-PA 52 91

DK 164941 B

Desuden fordøjes 1 μg renset gær-rekombinant t-PA opløst i 100 μΐ 50 mM citratpuffer natten over ved 30eC med 0,01 enhed endoglycosidase H ifølge Trimble et al. [Anal.

5 Biochem. 141, 515-522 (1984)]. Prøven påføres standard SDS-polyacrylamid-gelelektroforese sammen med en t-PA prøve før fordøjelse. Efter kørslen overlejres gelen med l^Sj-konkanavaiin a ifølge Barth, F. et al. [Electrophoresis 7, 372 (1986) ]. Det radiomærkede lectin konkanavalin 10 A, som specifikt binder til mannoserester i glycoprotei-ner, reagerer kun med t-PA før fordøjelse, dvs. giver et bånd efter autoradiografi.

Dette viser klart, at alle mannoserester i gær t-PA er tilknyttet proteinet via N-acetylglycosamin til asparagin 15 (N-bundet glycan) ifølge endonuclease H's spaltningsspecificitet (ovenfor, Trimble). t-PA indeholder 3 asparagin-rester, der er tilgængelige for N-bundet glycosylering.

Proteiner udskilt af gær og cellevægsproteiner i gær er sædvanligvis sammensat af mindst 50, normalt mellem 100 og 20 200 mannoserester pr. asparagin-glycosyleringssted [Kukuruzinska, M.A. et al. Ann. Rev. Biochem. 56, 916 (1987)].

Det har uventet vist sig, at gær-rekombinant t-PA kun indeholder ca. 17 mannoserester pr. glycosyleringssted 25 (52 divideret med 3 steder). Dette gør molekylet meget lignende, men stadig forskelligt fra humant melanom t-PA med anslået 4 mannoserester pr. sted.

4. Ekspression af t-PA i transformerede E. coli-celler (EP 93.619) 30 I europæisk offentliggørelsesskrift nr. 93.619 (side 27 og 38) beskrives fermenteringstitere i E. coli på 20 enhe-der/10^ celler. Denne værdi ville svarer til en fermenteringstiter på 44 μg/l, når beregningen er baseret på en 92

DK 164941 B

omdannelsesfaktor på 90.000 Ploug-enheder/mg t-PA protein (side 38).

1 Ploug-enhed svarer til 1,35 internationale enheder 5 [ Colman et al., Hemostasin and Thrombosin: Basic Prin ciples and Clinical Practise, J.B. Lippincott Co. Philadelphia, p. 1030 (1982) ]. De nyeste publikationer om mere rensede præparater definerer t-PA's specifikke aktivitet til ca. 500.000 internationale enheder/mg protein [Dodd, 10 I. et al. FEBS Letters 209, 13 (1986) ]. Omregningen af E. coli-fermenteringstiteren ifølge den nye specifikke aktivitet på 370.000 Ploug-enheder/mg protein korrigerer derfor mængden af t-PA fremstillet ved E. coli fermentering til ca. 11 pg/l.

15 For rekombinant t-PA udtrykt i E. coli er ingen data om specifikke aktiviteter blevet publiceret. Imidlertid antager forfatterne til det ovennævnte europæiske offentliggørelsesskrift nr. 93.619 [i D. Pennica et al. Nature 301, 214 (1983) ], at "t-PA syntetiseret af E. coli kan 20 have en specifik aktivitet forskellig fra autentisk t-PA" (sammesteds side 220). Desuden tager de den mulighed i betragtning, at E. coli-celler producerer en blanding af funktionelt aktivt og inaktivt (dvs. ukorrekt foldet) materiale. Der henvises til sydafrikansk patentskrift nr.

25 868.012, side la-4.

Under arbejde med t-PA udtrykt i gær [pJDB207/PH05-TPA(IA) ] har man aldrig iagttaget noget tegn på funktionelt inaktivt materiale, der akkumuleres under fermenteringen.

30 Selv om t-PA fremstillet af E. coli kan aktiveres ved omfoldningsmetoder til at give proteolytisk aktiv t-PA, viser dette ingen målelig stimulatabilitet i nærvær af fibrinfragmenter. Dets virkning er derfor ikke begrænset til den ønskede lokalitet (blodpropper), hvorved risikoen 93

DK 164941 B

for ukontrolleret hæmorrhagi stiger signifikant (jf. sydafrikansk patentskrift nr. 868.012, side 3, linie 14 til side 4, linie 23).

5 På grundlag af de offentliggjorte data [europæisk patent-skrift nr. 63.619 og Pennica, D. et al. Nature, 301, 214 (1983) ] er ekspression af t-PA i gær klart overlegen over for ekspression af t-PA i E. coli. Ikke blot kan der opnås 20 gange højere fermenteringstitere, men gær-rekombinant 10 t-PA*s biologiske virkninger gør molekylet meget lignende autentisk human t-PA. Det sidstnævnte er ikke påvist for t-PA udtrykt i E. coli. Desuden afviger t-PA fra E. coli fra gær-t-PA ved, at det ikke er glycosyleret.

94

DK 164941 B

Referencer 1. S. Thorsen et al., Thromb. Diath. Haemorrh. 2j), 65 (1972) 2. D.C. Rijken og D. Collen, J. Biol. Chem. 256, 7035 (1981) 3. D.C. Rijken et al., J. Biol. Chem. 257, 2920 (1982) 5 4. P. Wallén et al., Progr. Fibrin. j5, 16 (1982) 5. E.L. Wilson et al., Cancer Res. 40, 933 (1980) 6. E.L. Wilson et al., Blood 61, 568 (1983) 7. D. Pennica et al., Nature 301, 214 (1983) 8. T. Edlund et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 349 (1983) 10 9. Perlman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 781 (1982) 10. A.M. Maxam et al., i "Methods in Enzymology", bd. 65, side 499, New York 1980.

11. J. Lodder, "The Yeasts", Amsterdam 1971.

12. A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA Ί5, 1929 (1978) 15 13. A. Hinnen et al., Curr. Top. Microbiol. Immun. 9j5, 101 (1982) 14. A. Jimenez et al., Nature 287, 869 (1980) 15. Europæisk patentansøgning nr. 23860 16. F.J. Joubert et al., Hoppe-Seyler1 s Zeitschr. Physiol. Chem. 302, 531 (1981) 20 17. M.V. Olson et al., J. Mol. Biol. 132, 387 (1979) 18. H. Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1978) 19. B. Hohn et al., i "Genetic Engineering", bd. 2, side 169,

New York 1980 20. B. Hohn i "Methods in Enzymology", bd. 68, side 299, 25 New York 1979 21. A. Hinnen et al., i "Eukaryotic Gene Regulation", bd. 14, side 43, New York 1979 22. J.D. Beggs i "Genetic Engineering", bd. 2, side 175,

New York 1981 30 23. J. Messing, i "3rd Cleveland Symposium on Macromolecules:

Recombinant DNA" (red. A. Walton), Elsevier, Amsterdam 1981, side 143 24. M. Mandel et al., J. Mol. Biol. J^3, 159 (1970) 25. A.J. Berk et al., Cell 12, 721 (1977) 35 26. D.S. Holmes et al., Anal. Biochem. 144, 193 (1981) 27. P.M. Lizardi et al., Anal. Biochem. j)6, 116 (1979) 28. Y. Nagamine et al., Cell 32[, 1181 (1983) 95

DK 164941 B

29. J.B. Gurdon et al., J. Embryol. Exp. Morphol. 36, 523 (1976) 30. M.W. McDonnel et al., J. Mol. Biol. 110, Γ19 (1977) 31. G. Deng et al., Nucl. Acids- Res. 9, 4173 (1981) 5 32. L. Villa-Komaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3727 (1978) 33. D.A. Morrison i "Methods in Enzymology", bd. _68, 326 (1979) 34. T. Edlund et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 349 10 (1983) 35. Η. Ito et al., Nucl. Acids Res. 10, 1755 (1982) 36. H.C. Birnboim et al., Nucl. Acids Res. 1_, 1513 (1979) 37. M. Zimmerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA T5, 750 (1978) 15 38. J. Messing i "M13 cloning/dideoxy Sequencing" (EMBO-course manual), 1981 39. Håndbog "M13 cloning and DNA sequencing system", New England Biolabs 40. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 9T_, 7327 (1975) 20 41. J.F.M. de Rooij et al., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 98./ 537 (1979) 42. "Molecular cloning". En laboratoriehåndbog (udg. T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook) , Cold Spring Harbor Lab. 1982, side 177 25 43. G.F. Hong, Bioscience Reports 1, 243 (1981) 44. A. Toh-e et al., J. Bacteriol. 113, 727 (1973) 45. S.V, Suggs et al., i "Developmental biology using purified genes", ICN-UCLA symposium on molecular and cellular biology, bd. 23 (udg. D.D. Brown og D.F. Fox), side 683 (1981) 30 46. M. Smith, i "Methods af RNA and DNA sequencing" (udg. S.M.

Weissmann), Praeger Scientific, New York 1983 47. E.L. Wilson et al., Int. J. Cancer 22, 390 (1978) 48. B. Meyhack et al., Embo Journal 1, 675 (1982) 49. M. Rånby, Biochim. Biophys. Acta 704, 461 (1982) 35 50. Hicks et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative

Biology, bd. XLIII, side 1305 (1979) 51. Broach et al., Gene j3, 121 (1979) 52. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA T6_, 1035 (1979) 96

DK 164941 B

•53. F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA J74, 5463 (1977) 54. J. Kurjan et al., Cell 30, 933 (1982) 55. P.L. Ey et al., Immunochem. 15, 429 (1978) 5 56. J. Jespersen et al., Haemostasis 18, 301 (1983) 57. C. Zamarron et al., J. Biol. Chem. 259, 2080 (1984) 58. J. Chmielewska et al., Thrombosis Research 31, 427 (1983) 59. P. Wallén, Progr. Chem. Fibrinolysis Thrombolysis 3, 167 (1978) 10 60. J.H. Verheijen et al., Thromb. Haemost. 48, 266 (1982) 61. D. Pennica et al., Nature 301, 214 (1983) 62. R.W. Colman et al., Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practise, J.B. Lippincott Co. Philadelphia, p. 1030 (1982) 63. I. Dodd et al., FEBS Letters 209, 13 (1986) 64. Sydafrikansk patent nr. 868012 (Boehringer)

Claims (15)

1. Gærhybridvektor, kendetegnet ved, at den omfatter gær-PH05-promotoren operativt forbundet med en DNA-sekvens 5 bestående af en signalsekvens forbundet i ramme med kodningsområdet for den humane vævspi asminogenakt i vator (pro-TPA) og en DNA-sekvens indeholdende et gærgens transkriptionstermineringssignaler.

2. Gærhybridvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at den omfatter PH05-signalsekvensen forbundet i ramme med kodningsområdet for human pro-TPA.

3. Gærhybridvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at TPA-signalsekvensen er forbundet i ramme med kodningsområdet for human pro-TPA. 15

4. Gærhybridvektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at gær-PH05-promotoren er forlænget ind i PH05-kodnings-området, som er forbundet med kodningsområdet for human pro-TPA via et syntetisk forbindelsesstykke indeholdende behandlingssteder for en gær-endopeptidase.

5. DNA-segment ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det omfatter gær-PH05-promotoren operativt forbundet med en DNA-sekvens bestående af PH05-signalsekvensen forbundet i ramme med genet for human vævsplasminogenaktivator (pro-TPA) og en DNA-sekvens indeholdende gær-PH05-genets 25 transkriptionstermineringssignaler.

6. Transformeret gærstamme kendetegnet ved at være valgt blandt gruppen bestående af en gærstamme transkri-beret med en hybridvektor omfattende gær-PH05-promotoren operativt forbundet med en DNA-sekvens bestående af en 30 signalsekvens forbundet i ramme med kodningsområdet for human vævsplasminogenaktivator (pro-TPA) og en DNA-sekvens indeholdende et gærgens transkriptionsterminerings- DK 164941 B signaler og en gærstamme med genet for human vævsplasmino-genaktivator (pro-TPA) stabilt integreret i-gærkromosomet og stående under kontrol af den kromosomale gær-PH05- j [ 5 promotor. ‘ i i i

7. Gær ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den er i transformeret med en hybridvektor ifølge ethvert af kravene 1-4.

8. Transformeret gær ifølge krav 6, kendetegnet ved, 10 at gæren er Saccharomyces cerevisiae.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af TPA, pro-TPA eller blandinger deraf, hvor TPA'et og pro-TPA'et foreligger i glycosyleret eller ikke-glycosyleret form eller i en blanding af disse former, kendetegnet ved, at en 15 gærstamme transformeret med en hybridvektor indeholdende gær-PH05-promotoren operativt forbundet med en DNA-sekvens bestående af en signalsekvens forbundet i ramme med kodningsområdet for human vævspiasminogenaktivator (pro-TPA) og en DNA-sekvens indeholdende et gærgens transkriptions-20 termineringssignaler, eller en gærstammé med genet for human vævsplasminogenaktivator (pro-TPA), som er stabilt integreret i gærchromosomet, og som er under kontrol af den kromosomale gær-PH05-promotor, dyrkes under passende næringsbetingelser, hvorpå proteinerne isoleres og renses 25 og, om ønsket, en blanding af dannet TPA og pro-TPA adskilles i de enkelte komponenter og, til fremstilling af TPA, som ikke indeholder pro-TPA, det dannede pro-TPA omdannes til TPA, og, om ønsket, glycosylerede og ikke-glycosylerede produkter dannet i en blanding adskilles 30 fra hinanden, og, til fremstilling af ikke-glycosyleret protein, som ikke indeholder glycosyleret protein, glycosylrester fjernes fra de dannede proteiner.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9 til fremstilling af TPA, pro-TPA eller blandinger deraf, hvor TPA'et og DK 164941 B pro-TPA'et foreligger i glycosyleret eller ikke-glycosyle-ret form eller i en blanding af disse former, kendetegnet ved, at en gærstamme transformeret med en hybridvektor 5 indeholdende gær-PH05-promotoren operativt forbundet med en DNA-sekvens bestående af en signalsekvens forbundet i ramme med kodningsområdet for human vævsplasminogenakti-vator (pro-TPA) og en DNA-sekvens indeholdende et gærgens transkriptionstermineringssignaler dyrkes under passende 10 næringsbetingelser, hvorpå proteinerne isoleres og renses og, om ønsket, en blanding af dannet TPA og pro-TPA adskilles i de enkelte komponenter og, til fremstilling af TPA, som ikke indeholder pro-TPA, det dannede pro-TPA omdannes til TPA, og, om ønsket, glycosylerede og ikke-15 glycosylerede produkter dannet i en blanding adskilles fra hinanden, og, til fremstilling af ikke-glycosyleret protein, som ikke indeholder glycosyleret protein, glycosylrester fjernes fra de dannede proteiner.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9 eller 10, kendetegnet 20 ved, at gæren er Saccharomyces cerevisiae.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at TPA og pro-TPA og blandinger deraf isoleres fra dyrkningsvæsker ved selektiv adsorption på en DE-3 "Sepha-rose"-søjle.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at TPA og pro-TPA og blandinger deraf isoleres fra dyrkningsvæsker ved affinitetskromatografi under anvendelse af monoclonale antistoffer.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at 30 der ved rensningen anvendes en proteaseinhibitor, og at der foretages kromatografi på en DE-3 ”Sepharose"-søjle i nærværelse af en inhibitor, som selektivt kun binder TPA, til fremstilling af pro-TPA, som praktisk taget ikke indeholder TPA. DK 164941 B

15. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at dannede glycosylerede og ikke-glycosylerede produkter adskilles ved kromatografi på en concanavalin-A "Sepha-5 rose"-søjie·