JPS59501572A - クルイベロミセス属酵母およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プレプロソーマチンの表現用に修正したクルイベロミセス属の酵母又はその各種 対立・修正型あるいはその成熟型、およびその表現により得られろタン白質 本発明は、組換えＤＮＡ技術で可能となったプレプロソーマチン及び関連化合物 の微生物学的製造法に関する。いずれも１９８２年６月２６日に公告されたヨー ロッパ特許出願（Ａ２）０　０’５４　３３０号及び００５４６６１号にはプレ プロソーマチンの種々の対立型、プレソーマチン、プロソーマチン及びソーマチ ンの様なその成熟型及びそれ等の誘導型を暗号づけるＤＮＡ配列又該ＤＮ、Ａ配 列より成るクローニングビヒクル（伝播体）、又それ等の微生物特にエシェリヒ ア　コ！ｊ　−（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）を形質転換するための使用及びソーマチン 様蛋白質の製造法が記載されている。

商業的に魅力ある生産のためには、エシェリヒアコ！Ｊ　−（Ｅ、　ｃｏｌｉ　 ）について得られる収量は充分でないので、ソーマチン様蛋白質をはるかに高い 量生産出来る微生物系の必要性が存在する。ソーマチン様蛋白質とは、プレプロ ソーマチン、その種々の対立型又は誘導型及びプレソーマチン、プロソーマチン 及びソーマチンの様なそれ等の成熟型を意味する。

上記のヨー０ソバ特許出願に記載された構造遺伝子１ａｃｔｉｓ　）　（いわゆ るＫＡＲ３）起源の自律的に複製する配列、講釈マーカー、及びプラスミド中へ の酵母レギユロンと組み合され、そのプラスミドはクルイベロミセス属の酵母ａ 胞中に導入され次いでソーマチン様蛋白質を生産し得る様になることが分った。

この方法で酵母細胞中のソーマチン様蛋白質の表現が成功した。

従って、本発明は： （１）　プレプロソーマチン又はその各種の対立型、又は修飾型又はそれ等の成 熟型を暗号つける構造遺伝子、１ａｃｔｉｅ　（いわゆるＫＡＲ８）起源の自律 的複製配列、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグリセルアルデヒド３−ノリン酸テヒドロ ケ゛ナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子から誘導された酵母レギユロン及び （ＩＶ）ｔｒｐ−ｉ又は１ａｃ−４遺伝子の様な講釈マーカーより成る組換えＤ ＮＡプラスミドを含むクルイベロミセス属の酵母を提供するものである。

この方法で、希望する蛋白質の大きく改良された表現が得られ、従って商業的応 用はずっと近付いて来ている。

望ましくはプラスミドは酵母より誘導された転写停止暗号及び／又は動原体及び ／又は酵母から誘導された複製領域を含むものである。

同様に効果的である可能性は充分である。構造遺伝子は好ましくは上述のヨーロ ッパ特許出願中に開示されている構造遺伝子より成る群から選択されたものであ る。

以下に記載する様に満足すべぎＫＡＲ８−配列が野生ン遺伝子（ｔｒｐ　−１） 及びクルイベロミセス　ラクテイス（Ｋ、　１ａｃｔｉｓ　）に起因するラクタ ーセ゛遺伝子（１ａｃ　−４）の様なベクター上の選択可能なマーカーの使用が 望ましい。此等のＤＮＡ配列は選択マーカーとしてのみならず其の後の増殖中に システムに選択圧力を働かせる点においても効果的である。

もし転写停止暗号が使用される場合、こり、は好ましくはサツカロミセス　セレ ビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）の２ミク０７　ＤＮＡベクターのＨ ｉｎｄ　ｌｌｌ−、ＢＣＯ，、、Ｒｌ断片に起因する停止配列及びサツカロミセ ス　セレビシェ−（ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）のＧＡＰＤＨ遺云子から誘 導される停止配列より成る群より選ばれる。

動原体又は例えばサツカロミセス　セレビジエー（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 　）又はクルイベロミセス　ラフティ製領域の存在は本発明に従うプラスミドの 安定注乞改良する。

本発明は更に、上記の様にクルイベロミセス属の酵母の製造法を提供するもので あって、その方法は上記構造遺伝子をＫＡ）（Ｓ−配列及び構造遺伝子の上流に 酵ｆひＧＡＰＤＨレギユロン、及び選択マーカー又任意には酵１ｉｔの染色体か らあ４された動原体又は複製領域又任意には構造遺伝子の下流に酵母から誘導さ れた転写停止暗号を組み合せる組み換えＤＮＡプラスミドの調製とこれに続いて この様に調製したプラスミドをクルイベロミセス属の酵母中への導入より成って いる。

最終的に、本発明はプレン０ロノーマチン又はその各種の対立型又は修飾型又は 上述めヨーロッパ特許出願中に開示されたそれ等の成熟型及びその様に調製した 蛋白質の微生物学的調製法を提供し、その方法は上記のクルイベロミセス属の酵 母を培養し次いで＃母により生産されたソーマチン又はソーマチン様蛋白質を採 月叉することより成る。

本発明を以下に詳述する。

クルイベロミセス属の酵母を、これ等の微生物は食品や医薬品の製造に使用出来 る多（の無害な微生物群より成っているという理由により選んだ。例えばクル及 びクルイベロミセス　フラジリス（ｘｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｏｓ（ＧＲＡＳ　＝ 一般的に安全と認めら凡る）（／Ｕ−記載さ几℃いる安全な種である。醗酵工程 におけるクルイベロミセス　ラクテイス（Ｋ、　］、ａｃｔｉｓ　）の行動はエ シェリヒア　コリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）についてよりもよく知られていて全（ 管理可能である。醗酵液から酵母の分離は例えばエシェリヒア　コリー（Ｅ、　 ｃｏｌｉ　）の場合より好ましく、酵母はしばしばエシェリヒア　コリー（Ｆ２ ゜ｃｃｌｉ　）よりも大量の（細胞外又はベリプラスム）蛋好適である。

現在迄のところ、クルイベロミセスのためのベクターは全く知られていない。

した細胞中で自律的に複製する新しいベクターが発見中の複製と維持の機能を制 御する。此等の複製配列はクルイペロミセ４　ラクティス（ＫＡＲ３）に起源を もつ配列を自律的に複製する。

その高い形質転換頻度の故にＫＡＲ８型のベクターが使用される。

最も好適な代表は既知ザソカロミセス　セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉ ｃｅ　）プラスミドＹＲｐ　７　（５ｔｏｕｈ１等Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ］、、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７６　、　１０３５　１０３９　）中に挿入したＫＡＲ ８−２配列を含むクルイベロミセスドフ０ラスミド（雑４重）０ラスミド）であ る１）ＫＡＲ８２で゛ある。

ベクター上には更に遺伝子クローニングを可能にするための通切な制限部位があ る。

好適なホストである。その場合アンピシリン耐性遺伝子（Ａｔｎｐ　Ｒ）も又ベ クター上の選択可能なマーカーである。プラスミドは好ましくは増加させられ、 エシェリヒア　コ＋）　−（Ｅ、　ｃｏｌｉ、　）細胞中に貯蔵される。形質転 換した株はアンピシリンを含む（１００マイクログラム／ミリリツター）Ｌ−ゾ ロス上で選択的に生育する。形質転換した株の１つ即ちエシェリヒア　コリ（Ｉ ［、ＣＯ］］、　）　、丁Ａ　２２１　（ＩＩＩＫＡＲ８１２）はオランダのＳ Ｋ　Ｂａａ、ｒｎろ７４２　、０ｏｓｔｅｒｓｔｒａａｔ　１にあるＯｓ　ｎｔ ｒａｌＢｕｒｅａｎ　ＶＯＯＲＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌ−ｔｕｒｅｓにＣＢ５３ ５３．８２（＝　ＬＭ：ｏ　３２．２０　）の番号で１９８２年５月１９日に寄 託された。プラスミドは例えばカノツ等の方法で、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｏｌ　１１ ４（１９７３）５７７菌体から分離出来る。

酵母ホストのプロｔ・ノラスト（原形質体）はトリス、塩化カルシウム及び分子 量が２，０００から６，０００の範囲好ましくば４，０００のポリエチレングリ コールを含む通常のインキュベーション培唯の中で前述のベクターにより形質転 換される。

ＫＡＲ８−型プラスミドを使用すると、形質転換物にトリプトファン原栄養体を 選択する可能性がある。

形質転換細胞中のＫＡＲ８−含有プラスミドの自律的存在はＤＮＡ分析により示 さ、Ｉする。形質転換物の未分解微小溶解物ｐＫＡＲＳプラスミドの細菌部であ る標識ｐＢＲ６２２とのハイブリダイゼーション（雑種形成）によりすず−ン法 に従って分析した。

非形質転換タルイベロミセス　ラクテイスｌａｃ　−４変異菌の微小溶解物と精 製プラスミド調製物の比較電気泳動は形質転換物にのみ、形質転換に使用したプ ラスミドの高次コイル及び開環型に相当する電気泳動移動度ヲ持つハイブリッド 形成バンドの存在を示した。

形質転換細胞中のプラスミドの存在は酵母形質転換物から調製したＤＮＡによる Ｅ、　ｃｏｌｊ、の形質転換と生じたＥ、　ｃｏｌｉ形質転換物から同じプラス ミドを分離することにより更に確められた。

特に有用なホストはクルイベロミセス　ラクテイスの変異菌Ｓ　Ｄ　１１１ａｃ 　−４ｔｒｐ　−１及びＳ　Ｄ　６９　ｉａｃ　−４であり、これ等は野生株Ｃ ＢＳ　２３６０から誘導されオランダ国３２４２　ＳＫ　Ｂａａ、ｒｎ　、０ｏ ｓｔｅｒｓｔｒａａ、ｔ　１のＣｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕｒｅａｎ　ｖｏｏｒ　Ｓ ｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｗｅに夫々ＣＢ５８０９２及びＣＢＳＦ３　Ｄ　９５と いう寄託番号で１９８２年５月１９日に寄託された。

通常、形質転換するプラスミドはホスト細胞中に自律的に複製及び表現可能な独 立゛した存在として止まる。

しかしながらこヌでプラスミド（複製配列はあってもな（でも）上に存在する遺 伝子は引き続いて細胞の染色体ＤＮＡ中にも組み込まれるということが指摘され る。

本発明をプレプロノーマチンの生産に関する詳紐な記述により例示する。然し本 発明の方法はノーマチノ一様蛋白質を暗号つけるその他の遺伝子のクロー二／グ と表現にも又応用出来る。

本発明の菌株を大量生産に適用する時は、ベクタープラスミドからすべての細菌 ＤＮＡ配列を除去することが望ましい。

遺伝子は細胞中に導入された後、自律的に複製するプラスミド上に止まり得るか 又はホスト細胞中染色体ＤＮＡ中に組み込むことができる。

ＫＡＲＳ−配列の分離、その組み換えＤＮＡプラスミドへの取り込み及びそれ等 のクルイベロミセス　ラクテプラスミドＹＲｐ７　（５ｔｒｕｈ１等Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ７６１０ろ５−３９．１９７９）５マイクログラムを制限酵素Ｓａｌ　Ｉ で分解した。野生株クルイベロミセス　ラクティス（Ｋ、　１ａｃｔｉｓ　）　 ＣＢＳ　２ろ６ｏからのＤＮＡ　１４マイクログラムを酵素ＸｈＯＪで分解した 。

プラスミドの断片とクルイベロミセス　フクティス（ｘ、　１ａＣｔｉｓ　）の ＤＮＡ　ｉモル比１．３の割合で混合し、ＤＮＡ断片混合物を得た。

制限酵素を失活後、溶液をＤＮＡ濃度２５マイクログラム／ｍｌにし、標準条件 （ベーリンガー）の下でＴ４−リガーゼと共にインキュベートＬ７’、−０通常 条件下で、リガーゼ処理混合物によるエシェリヒア　コｙ〜（Ｅ、　ｃｏｌｉ　 ）　Ｄ　Ｇ　７５の形質転換により４．５　Ｘ　１０５ＡｍｐＲ形質転換物の混 合物を生じ、そのテトラサイクリンに対する感受性がら推論して、その中９　Ｘ 　１０３はクルイベロミセス　ラクティス（Ｋ、　１ａｃｔｉｓ）挿入物欠含ん でいた。

テトラサイクリン−感受性細胞の割合はサイクロセリン処理により８５％迄増加 させ得る（　ＢＯｌｉＶａｒ　Ｆ２４５〜２６７）。Ｋａｔｚ等の方法に従い（ Ｅｘ、　ｉ参照）、１４の異なったプラスミドを分離した、これ等ＹｐＫＡＲ８ １−１４と称する。これ等のすべてはクルイベロミセスラクｙイス（Ｋ、　１ａ ｃｔｉｓ　）　Ｓ　Ｄ　１１１ａｃ　−４ｔｒｐ−１株をＤＮＡマイクロダラム 当り１０３〜１０４の頻度でＴｒｐ＋表現型に形質転換する能力があった。プラ スミドｐＫＡＲ８−１，２ハＤＮＡマイクロクｙ人当す３　Ｘ　１０’の形質転 換頻度を示したが、−１−で２−４ミドｐＫＡＲ８−２の方がその後の工程にお いてもつと便利であることが分った。

得られた組み換えプラスミドは又エシェリヒア　コリ　−　（Ｋ、　ｃｏｌｉ　 ）　、ＴＡ２２１　（ｔｒｐＫ５．　１ｅｕＢ＜）。

］、ａｃ　Ｙ　、ｒｅＣＡ　、ｈｓａ　Ｍ″、ｈ、ｓｄＲ）にも転移することが ０出来るであろう。

クルイベロミセス　ラクテイス（Ｋ、　］−ａｃｔ工ｅ）ＳＤｌｌ　］。ａｃ− ４ｔｒｐ”１株の菌体を酵母エキス１％、ペプト７２％及びグルコース２％を含 む生育培地（ＰＨ６，８）中に懸濁させた。指数期（６〜５・１０′？細胞／ｍ ｅ）に達する迄生育を続げた。陣・母菌体を遠沈により集め、水洗し、１．２ｍ ｏｌ／７３のソルビトール、２５ｍｍｏ］、／７３のＥＤＴＡ及び０．２ｍｏ： ｈ／ｌの新しいメルカプトエタノールを含む浴液（ｐＨ８，０）中に再懸濁した 。

１０分間６０°Ｃてインキュベートした後、菌体を遠沈、１．２ｍｏｌ／７２の ンルビト−ル溶液で２度洗滌し、１．２ｍ０１／ｌのソルビトール、１０　ｍ　 ｍｏｌ／ＡのＥＤＴＡ　。

０、１　ｍｏ１／　ｌのクエン酸ノーダ及び１０〜のヘリケースを含む溶液（ｐ Ｈ５，８）　２０　ｒｎｌ、中に懸濁した。

プロトプラストが生じ、１５〜２０分後、これ等を遠沈（〜、１．２ｍ０１／ｌ のソルビトールで６回洗滌し、１０ｍ　ｍｏｌ　／　ｌの０ａＣ１２とｉ、２ｍ ｏ１／１１のソルビトールを含む溶液Ｑ、　ｉ　ｍｌ中にｍｌ当り約５．１０１ ０菌体の濃度で再懸濁した。

１０マイクログラムのｐＫＡＲ８−１２のＤＮＡを加え、混合物を２５°Ｃで１ ５分間インキュベートした。その後、Ｉ　Ｑ　ｍ　ｍｏｌ／７のトリス、１０　 ｍ　ｍｏｌ／ｌのＣａＣｔ２及び２０％（Ｗ／Ｖ）のポリエチレングリコール４ ０００を含む溶液Ｑ、５ｍｌを加え、其後２０分間インキュベートした。

プロトプラストを遠沈で沈澱さぜ、７ｍｍｏ１／ｌの０ａ０７２．１．２ｍｏｌ ／ＩＪのソルビＩ・−ル、Ｑ　、　５　ｍｇ　／　ｍ１３の酵母エキス、１１ｎ ｑ　／　ｍ１３のペプトン及び２　ｒｎｇ　／　ｍｌのグルコースを含む溶液（ ｐＨ６，８）中にｍｌ、当り約５　、１０１０プロトプラスト濃度で再懸濁させ た。

Ｔｒｐ″形質転換を選択可能にするため、１．１０９プロトプラストをグルコー ス２％、ＫＣｔｏ、６　ｍｏｌ　／β欠含む２％寒天最小平板培地（６％の寒天 型１〜）上に移した。

４〜５日中にコロニーが現れた。グルコースを炭素源とする０、６ｍｏｌ／７１ のＫＣ１平板上でのゾロドプラストの再生は通常０．５〜１．５％である。ｐＫ ＡＲ８１２ＤＮＡのマイクログラム当り、３４　Ｘ　１０’　Ｔｒｐ″形質転換 物が得られた。

ＤＮＡの調製ば５ｔｒｕｈ、１等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ。

ＵＳＡムロ　１０３５〜１０３９．１９７９）に従った。

０、ＫＡＲＳ−型プラスミドによるＴｒｐ＋に形質転換されたクルイベロミセス 　ラクテイス５Ｄ６９　１ａｃ−４Ｂに記載された方法と類似した方法により他 の臥に一型プ′ラスミドについての形質転換実験を行うことが出来る。実験の結 果を以下の表に要約する。

５Ｄｉ１］、ａ、ｃ　−４ｔｒｐ−１ｐＫＡＲ８１１，５ＸＩＤ”　２−２４Ｓ Ｉ）１１　１．ａｃ　−４ｔｒｐ−ｉ　ｐＫＡＲ８２５Ｘ１０３１．２４ＳＤ） １１　］、ａｃ−４ｔｒｐ−１ｐＫＡＲ８７１Ｑ３２．３ＳＤｉｉ　１ａＣ−４ ｔｒｐ−１ｐＫＡＲ８８５Ｘ１０”　１−８５８Ｄ１１　］、ａｃ　−４ｔｒｐ −１ｐＫＡＲ３１０２４Ｘ１０’　３．１５ＳＤ１ｉ　１ａｃ−／ｌ　ｔｒｐ− １ｐＫＡＲ３１２ろ、４Ｘ１Ｄ４　、　５．０ｓＤ１１　：Ｌａｃ　−４ｔｒｐ −１ｐＫＡＲ８ｉろ　１．５Ｘ１０４　２．０８Ｄ１ｉ　］、ａｃ　−４ｔｒｐ ｌ　ｐＫＡＲ８１４Ｌ８Ｘ１０’　２．１５ｐＫＡＲＳプラスミドの分子量はＥ ｃｏＲｌ及びＨｉｎｄ　ｌｌ［エンドヌクレアーゼで分解後、０．８％のアガロ ースゲルと通常の分子量マーカーを用いて測定した。

以下の詳述はＧＡＰＤＨレギョロンの分離と、そのプレプロソーマーグーン暗号 づけシラスミドへの導入についのクリセルアルデヒド−６−リン酸デヒトログナ −特に別記しない限り、すべての酵素インキュベーションは供給者の記載する条 件で実施した。酵素はアマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）、ベーリンガ（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　）、ＢＲＬ又はバイオラプス（Ｂ１０１ａｂｓ　）より入手 した。

１４５−１５４．１９８２）が記載したのと類似の方法により雑種エシェリヒア 　コリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　−酵母プラスミドｐＦ１ｉ　（Ｍ、ＲＣｈｅｖ ａｌｌｉｅｒ　Ｗ、Ｇｅｎｅ　Ｉ　Ｌ１１〜１９．１９８０）中に調製した。精 製した酵母ＤＮＡ　’ａ：　ＩＩＩ　Ｖ’ＲｘンドヌクレアーゼＳａｕ　３　Ａ で部分分解し、生じたＤＮＡ断片（平均長さ５に’ｂ）をｐＦｌｌの脱燐酸化Ｂ ａｍＨ（部位においてＴ　４’　ＤＮＡ　ＩＪガーゼで接続した。

ＣａＣ！１２処理したエシェリヒア　コリー（Ｅ、、ｃｏｌｉ　）細胞のりガー ゼでつないだ物質による形質転換の後、約３０．０００のアンピシリン耐性クロ ーンのプールが得られた。此等のクローンはコロ−ニー雑種化法（Ｒ，Ｅ。

Ｔｈａｇｅｒ、　Ａｕａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｕ　９８．　６０　６３．　１９７ ９）により化学的に合成した３２ｐ−標識した５’　ＴＡＣＣＡＧＧＡＧＡＯＯ ＡＡＯＴＴ３’の配列を持つオリゴマーを使って選別した。

Ｊ、Ｐ、　ＨＯｌｌａｎｄ及びＭ、Ｊ、　ＨＯｌｌａｎｄ　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ。

２５５．２５９６−２６０５．１９８０）が発表したデータによれば、このオリ ゴマーはＧＡＰＤＨ遺伝子のアミノ酸６０６〜６１０（最後のアミノ酸のゆらめ き塩基はオリコ゛マーから省略した）を暗号つけるＤＮＡ配列と４１１　ａｉ的 である。Ｒ，Ｂ、　ＷａｌｌａＣｅ等により記載されたハイブリダイゼーション 条件（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ。

９．８７９−８９４．１９８１　）を用いて、６個の正の形質転換物がｌ”ｊ　 ＞Ｐ出来る。此等の一つはプラスミドｐＦｉ１−５３を収容した。後者のプラス ミドはＧＡＰＤＨ遺伝子をそのプロモータ７１１，１１節頒域及び転写停止／ポ リアデニル化領域を含み含有した。約９Ｋｂの長さのｐＦｌｌ−６３の挿入が制 限酵素分析（第１図）Ｌ部分ヌクレオチド配列分析（第２及び６図）により性格 づけられノこ。

Ｅ、ＧＡＰＤＨフロモーター／レギュレーションＩｎ　域ノ分離とそのプレプロ ソーマチンを暗号つけるプラスミドへの導入（第４図） 制限酵素分析及びプラスミドｐＦｉｉ−３３の挿入のヌクレオチド配列データに 基づいて、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＲＮＡ開始／調節領域が８００ヌクレオチド長の Ｄｄｅ断片として分離された。このプロモーター断片を同定するため、プラスミ ドｐＦｉ　’、−３３”５　Ｓａｌ　ｌで分解し、得られた６つのＤ１ｉＡ断片 を化学的に合成したオリゴマーによるザず−ンハイプリダイゼーションテスト（ Ｊｐ、ｍ、　５ｏｕｆｈｅｒｎ　、Ｊ、　ＭＯｌ、　Ｂｉｏｌ、　９８．　５０ ６−５１７．１９７５）に供した。正に雑種形成する４、６Ｋｂ長の制限断片が ０．７％アガローズケ゛ルから電気溶出により予備的スケールで分離され、次い でこれをＤｄｅ　ｌで切断した。得られたＤｄｅ　Ｉ断片中、最大のもののみが ＧＡＰＤＨレギユロン領域（第１図）中に位置する切断部位であるＰｖｕ　ｌの 認識部位を持っていた。最大のＤｄｅＩ断片を分離し、これをフレナラ（Ｋ］、 ｅｎｏｔｖ　）Ｄ）：Ａポリメラーゼ及び４つのｄＮＴＰ’　ｓ　（Ａ、Ｉ（、 Ｄａｖｉｓ等、Ｇｅｎｅ　ｉ口、２０５−２１８．１９８０）とインキュベート し、平滑末端ＤＮＡ分子を生じた。反応混合物をフェノール／クロロフォルム（ ５０／　５０　ｖ／ｖ　）　Ｋよる抽出、水層のセアデソクス０５０カラムの通 過、ボイドボリーム中に存在する物質のエタノール沈澱後ＤＮＡ断片はＴ４リガ ーゼとインキュベーションすることにより３２ｐ−標識Ｅｃｏ　Ｒｌリンカ−５ ’　ＧＧＡＡＴＴＯｃ３’とつけた。クレナウボリメラーゼ反応及び引き続（Ｅ ＣＯＲＩ　！Ｊンカーとのりガーゼ接続のため、元のＤｄｅ　ｆ部位はレギユロ ン断片の末端で再構築された。リガーゼを失活させるため、反応混合物を６５℃ で１０分間加熱し、次いで塩化ナトｌ）ラムをカロえ（最終濃度５゜ｍｍｏｌ／ ｌ）全体の混合物ｆ　Ｅｃｏ　Ｒ（と共にインキュベートした。インキュベーシ ョンをフェノール／クロロフォルムによる抽出により停止し、ＤＮＡヲエタノー ルで２度沈澱させ、再懸濁させ、好適なベクター分子とりガーゼ処理で接続した 。Ｄｄθ■レギユロン断片はＥｃｏ　Ｒｆ部位につけであるので、中で酵母のレ ギユロンがプレプロソーマチンを暗号づげる遺伝子に＠接しているプラスミドを 創り出すため容易にｐＵＲ５２８１、ｇｐ−ｒ’Ａ３４３３１　）のＥｃｏ　Ｒ Ｔ部位に導入することが出来る。後者のプラスミドはｐＵＲ５２８のＥｃｏ　Ｒ Ｉによる切断、自己リケゞ−ジョンを防止するため直線化ブシスミ関分子のアル カリフォスファターゼ（ウシ腸）による処理及び此等ベクター分子各々又稍製Ｄ ｄｅ　（プロモーター断片のＴ　４　ＤＮＡリガーゼと共にインキュベーション により得られる。Ｃａ　Ｃｌ　２−処理エシェリヒアコリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ　 ）　ＨＥ　１０１細胞中の各種のリケゞ−ンヨン混合物の形質転換は数種のアン ピシリン耐性コロニーを生ずる。此等コロニーのあるもの力）らプラスミドＤＮ Ａ　’Ｉ（分離しく　Ｈ，Ｏ，Ｂｊ、ｒｕｌ）Ｏｉｍ及びＪ、　Ｄｏ１７　。

Ｎ　ｕ　ｃ　］、ｅ　ｊ、Ｃ／＼ｃｉｄｓＦ、ｅｓ、　７．　１　５　１　３　 １　５２３．　１９７９）そして挿入物の指向をテストするためＰＶｕ　ＩＩと インキュベートした。

命名法においては、正しい指向（即ちＧＡＰＤＨ、Ｌ／ギュロンから転写が構造 遺伝子の存在する下流方向におこ乙）へのＫｃｏ　Ｒｌ　（Ｄｄｅ　（）　ＧＡ ＰＤＨレギユロン断片を含むプラスミドはシラスミドの元のコードに対して付加 （ａｃｂｌ−ｅｎｄｕ、ｍ　）　−０１として示される（例え６１　Ｉ）ＵＲ５ ２８はｐＵＲ５２８−０１に変化する：第４図参照）。

Ｈ３ｃｏ　Ｒｆレギユロンを含むプラスミドの操作を容易にするため、２つのＥ ｃｏ　Ｒ１部位の１つを破カイした２μｇのプラスミドＤＮＡ　（例えばｐＵＲ ５２８−０１）をＥｃｏ　Ｒｌで部分分解し次℃・で５コーニツトの緑豆ヌクレ アーゼ（Ｐ、Ｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｃ、ｌ工ｕｃより入手）と０．０５モル ／ｌ酢酸ソーダ（ｐｔ（５，０）　０．０５モル／ｌ塩化ナトリウム及びｏ、ｏ 　ｏ　ｉモル／ｌ塩化亜鉛の存在下で総ｆｆ１２００μｌで室温で６０分間イン ギュベートして粘渚性末端を除去する。ヌクレアーゼを最終濃度０．１％になる 様にＳＤＳを加え又失活さぜ（Ｄ、　Ｋｏｗｃｌｓｈｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｕｒｉ ｓｔｒｙ　１５．　４４５７−４４６３．　１９７６）、ＤＮＡを２容のエタノ ールを加えて沈澱させた（この場合３モル／ｌ酢酸ノーダ０，１容の添加は省略 した）。

直線化ＤＮＡ分子を次いでＴ　４　ＤＮＡ　リガーゼとインキュベートして再リ ガーゼ処理し、ＣａＣｔ２−処理エシェリヒア　コ！Ｊ　（Ｋ、　ｃｏｌｉ　） 細胞の形質転換に使用した。

アンピ″ンリン耐性コロニーから分離したプラスミドＤＮＡ　ｔ、６プレプロソ 〜マチン遺伝子に隣接する単−Ｅｃ。

Ｒ１部位の存在をみるためＥｃｏ　ＲｌとＭｌｕ　ｉで切断してテストした（第 ４図比較）。

ＧＡＰＤＨ断片を含むが下流位置構造遺伝子のＡＴＧ開始コードンに隣接する単 −Ｅｃｏ　ＲＩ認識部位のみを持つプラスミドを一０２型プラスミドと称する（ 例えば。

ｐＵＲ５２８−０１はｐＵＲ５２８−０２に変化する第４図参照）。

７１合成りＮＡ断片の導入によろプレプロソーマチンを暗号つけるシラスミド中 の元のＧＡＰＤＨプロモーター第２図に描かれたヌクレオチド配列に示される通 りＫＣＯＲＴ　、Ｄａｅ　■’）　ＧＡＰＤＨプロモーター断片は尤のＧＡＰＤ Ｈ，７Ｏｒ＋モ一ター／調節領域のヌクレオチド−８５０から−３９を含む。こ のプロモーター断片に含まれていないものは（）ＡＰＨＤを暗号づける遺伝子の ＡＴＧ開始コードンに先立つ３８のヌクレオチドである。後者の６８ヌクレオチ ド長の断片は数種の＃母の遺伝子に見出されるＰｕ、ＣＡＣＡＣＡ配列を含んで いる。該Ｐｕ０ＡＣＡＯＡ配列は翻訳開始部位の約２０　ｂｐ上流に位置してい るが（Ｍ、Ｊ、　Ｄｏｂｓｏｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｊ、ｄ　Ｒｅｓ、　１ ０　２６２５−２６５７．１９８２）、蛋白質開始にとって最適でアル。ＡＴ（ ］コードンの上流のヌクレオチド配列を提供−５２５２，１９８１）。更に第７ 図に示されている様に此等６８のヌクレオチド（、まＧＡＰＤＨ遺伝子の表現の 調節に開力しているであろうループ構造を生成させる。

」二連の議論に基づいて、６８ヌクレオチドのＤｃｌｅ　ｌプロモーター−断片 と下流位置構造遺伝子のＡＴＧコードンの間への導入はプロモーター活性のみな らず翻訳開始の改良のために必要であると考えられた。

第５図に概説される様に、欠けているＩ）ＮＡ断片は２つの部分的に重複するオ リゴマーの化学合成により得うレタ。２つのオリゴヌクレオチドの重複部に存在 するＳａｃ　１部位が２つの理由により導入された。（１）ポリへ−尾部づけ酵 母表現ベクターの構成を含むＡＴＧコードンのすぐ上流のヌクレオチド配列の操 作を可能にすＲ−／ｌ−Ｖ）−ｒｉｉｌ　４つのａＮＴＰの存在下でＴ　４　Ｔ ＵＮＡセＩＪメラ一ゼと共にインキュベーションすることにより容易力）つ再現 的に除去出来る酵素により生じた６′−突出末端のために切断部位を与えるため 。等モル蛍の２つの精製オリゴマーをそれ等の５′−末端で燐酸化し、ノ・イブ リッド形成しく　Ｊ、Ｊ、　Ｒｏｓｓｉ等、１９８２、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

ｃｈｅｍ２５７，９２２６−９２２９　）そしてフレナラＤＮＡポリメラーゼ及 び４つのｃｌ−ＮＴＰと共に、二本鎖ＤＮＡ合成のために記載さ」を又いる条件 下でインキュベーションすることにより二本鎖のＤＮＡ分子に変換した（　Ａ、 Ｂ、　Ｄａｖｉｓ等Ｇｅｎθ１０．２０５−２１８．１９８０）。

反応生産物の１３％アクリルアミドケ゛ルによる電気泳動次いでオートラジオグ ラフィーによる分析は最初の一本鎖オリゴヌクレオチドの８０％以上が二本鎖物 質に変換されたこと欠示した。ＤＮＡは反応混合物をセファデックス０５０カラ ムに通過させ排出液中に存在する物質をエタノール沈澱することにより分離した 。

ＤＮＡは次いでポリヌクレオチドキナーゼと共にインキュベートして燐酸化し、 Ｄｃｌｅ　ｌで分解した。後者の反応中に切断したヌクレオチドを除去するため 、反応混合物をエタノールによる２回の沈澱に供した。

第６図に示す様に、生じた合成りＮＡ断片のクローニングをこの断片と、緑豆ヌ クレアーゼ分解によりＡＴＧ開始コードンに先行するＥｃｏ　Ｒ１部位を除去し であるベクター分子中のＢｇｌ　Ｈ−Ｄａｅｌ　（）ＡＰＤＨゾロモーター調節 断片との同時リケゞ−ジョンにより実施した。Ｂｇ１Ｉｆ　−Ｄｄ、ｅ　ｌプロ モーター／調節断片はプラスミドｐＵＲ５２８−０２をＤｄｅＩとＢＥＩ　Ｉｔ で分解することによりイ！Ｉた。生じた制限断片の２悌アガロ−スケ゛ル電気泳 動と引き続いてゲルからの断片の分離による分離により精製７９６ヌクレオチド 長プロモ一ター／調節断片を生じた。プラスミドｐＵＲ５２８〜０２中でＡＴＧ コードンに先行するヌクレオチド配列は５’−ＧＡＡＴＴＣｉ（Ｔ）ＡＴＣ−３ ’（Ｅｐ−、、ＰＡ　５４３３０とＥＰ−ＰＡ　５４３３１　）であり、これは Ｍ、Ｋｏｚａｋ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、’　９　、　５２３ ３−５２５２．１９８１　）により得られた好ましいヌクレオチド配列とは異な っている。我々の目標とするところばもとのＧＡＰＤＨプロモーター／Ａ節／蛋 白質開始領域を出来るだけ正確に再構−成することにあるので、ＪＣｃｏ　ＲＩ 部を合成りＮＡ断片を生じた平滑末端にリガーゼで接続するためにＢｃｏ　Ｒ１ 部位を除去した。ｇｃｏ　ＲＩ部の除去はＥｃｏ　ＲＩ−切断ｐＵＲ５２８−０ ２ＤＮＡ　（Ｅ参照）の緑豆ヌクレアーゼ分解により成しとげた。

引き続いて、プラスミドＤＮＡ　％″ＢｇＩ　ＩＩで分解し、ホスファターゼと 共にインキュベートした。０．７％アガロ−スケ゛ルによる電気泳動による２つ のＤＮＡ断片の分離の後、最大の断片を分離し、その中にＢｇｉ　１−Ｄｄｅ１ ノロモーター断片及びＤｄｅ　ｌ−処理一合成りＮＡ断片ｔｇ　ＩＪ　）ｆ−ジ ョンするベクターとして使用した。

Ｄｄ、ｅ　ｌプロモーター／調節断片が合成りＮＡ断片を含むＳａｃ　ｌ認識部 位と共に導入されたプラスミドは付加−０６により示さ、ｉする（例えばｐｌＪ Ｒ５２８−０２はｐＵＲ５２８−０３に変えられる）。

Ｇ　２μｒ］ＤＮＡ複製起源と酵母１ｅｕ　−２遺伝子のプレプロノルマチンを 暗号つけるプラスミドへの導入ＧＡＰＤＨレギユロンのサツカロミセス　セレビ シェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）中の機能性をテストするため、プラス ミドｐＵＲ５２８−０２とｐＵＦｔ　５２８０３　［酵母２μｍ　ＤＮＡから得 られた複製起源と選択可能なマーカーを取り付けた。両方の機能をプラスミドｐ ＭＰ　（３ｉから切り一城９２つのプレプロソーマチンを暗号づけるプラスミド に導入した。エシェリヒア　コリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクター ｐＭ８１（第８図、０、Ｐ、　ＨｏｌｌｅｎｂｅｒｇＸ微生吻学と免疫学におけ る最近の話題９６，１１９−１４４．１９８２）はプラスミＦｐＣＲｌ　（Ｃ， Ｃ０Ｖｅｙ等、ＭＧＧｌ　４５．　ｌ　５５−１５８゜１９７６）と：ｈｅｕ　 −２遺伝子と酵母２　μｍ　ＤＮＡ複製起源の両者を持っている。ＩＩＩＪＤＢ 　２１９　（Ｊ、Ｄ、　Ｂｅｇｇｓ　。

Ｎａｔｕｒ、Ｃ２７５、１０４−１０９，１９７８）の二重Ｅｃｏ　Ｒｌ断片よ り成っている。最後に述べた２つの機能’ｉ　ｐＭＰ　８１　ｈ）らＨｉｎｄ　 ＩＩＩとＳａｌ　■による分解により切除した。生じた４、４　ｘｂ長の制限断 片をプレプロソーマチン遺伝子を含むｐ［ＪＲ５２８−０２又ハｐＵＲ５２８− ０６誘導体及びサツカロミセス　セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　 ）のＧＡＰＤＨプロモーター／調節領域とプラスミドを作るために合せた。これ は該プラスミドのＨｉｎｄ　ｉｌｌ及びＳａｌ　ｒ　（第６，９図比較）による 切断とこ７１．に続く生じた断片のホスファターゼによる処理により成しとげら れた。１％アガロースゲルの電気泳動による断片の分離後、最大の断片を分離し 、ｉ−ＩＭＰ８１から得られた精製Ｈｉｎｄ　１１−　Ｓａｌ　ｌ断片と混合し 、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼでつなぎそしてＣａＣｌ２−処Ｗ　Ｅ、　ｃｏｌｉ細 胞に形質転換した。アンビ′シリンー耐性形質転換のある物からプラスミドＤＮ Ａを分離し制限酵素分析に供した。正しい挿入物（ｐＵＲＹ　５２８−０２又は ｐＵＲＹｂ　２８−０３　）　’、を含むプラスミド１１ＣｓＯ１−臭化エチジ ウム密度勾配遠沈により精製し、Ｊ、Ｄ、　Ｂｅｇｇｓ（Ｎａｔｕｒｅ２７５， １０４−１０９．１９７８）の方（Ａ、　Ｔコミ　ｎ　ｕ　ｅ　ｕ等、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｊ−、ＵＳＡ　７５１９２９−１９３３．１ ９７８）。

Ｈ，］（、ＡＲ８−２及びｔｒｐ　−ｉ遺伝子のプレプロソーマチンを暗号つけ るプラスミドへの導入 エシェリヒア　コリー（Ｅ、　Ｃ０１ｉ　）酵母シャトルベクターｐＥＫ　２− ７はｉ、２ＫｂのＫＡＲ８−２断片を含むプラスミドＹＲＩ）　７　（Ｄ　、Ｔ 　Ｓｔｌ　ｎ　Ｃｈ、ｂ　Ｏｍｂ　等、Ｎａｔｕｒｅ　２８２゜３９−４３．１ ９７９）より成っている。酵母ｔｒｐ　−１遺伝子の存在のために、プラスミド ｐＥＫ２７はに、　］ａｃｔｉｓ　Ｓ　］）　１１　ｌａｃ　−４、ｔｒｐ−１ 中に保持することが出来る（　−ｏＥＫ　２−７の調製はオランダ％許出ｗ４８ ２０２０９１の優先権を主張するヨーロッパ特許出７１／ｐｃ’ｒ　に記載され ている）。

クルイベロミセス　ラクテイス（Ｋ、　’］、ａｃｔｉｓ）中のＧＡＰＤＨ＠号 つげ遺伝子のプロモーター／調節領域の機能性を示すため、プラスミドｐＵＲ５ ２８０３（第９図）にＫＡＲ８−２断片とｔｒｐ　−ｉ遺伝子の両者を取りつけ た。最後に述べた２つの機能をＢｇｌＨによる分解とこれに続り０．７％アガロ ースゲルから生じた最小断片の分離により切り出した。この精製断片を次いでＴ 　４　ＤＮＡリガーゼとインキュベーションすることによりｐＵＲ５２８−０３ の脱リン酸化したＢｇＩ　ＩＩ切断部に挿入した。０ａＣｔ２−処理したエシェ リヒア　コリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞中のリゲーション混合物の形質転換によ りプラスミドｐＵＲＫ　５２８−０３　（第１０図）を生じた。後者のプラスミ ドをオランダ特許出願痛８２０２０９１号に記載されている方法でクルイベロミ セス　ラクテイス（Ｋ、　１ａｃｔｉｓ　）　Ｓ　Ｄ　１１細胞に導入すること により生じた形質転換物はソーマチン一様蛋白質（第１１図）を合成することを 示した。

上述のものと同様の技法により、プラスミドｐ　ＵＲＹ５２８−０３（Ｇ参照） にも又ＫＡＲ８−２断片と酵母ｔｒｐ　−１遺伝子を取りつげ、Ｋ、　１ａｃｔ ｉｓ　ｓ　Ｄ　１１　（第１０図）に導入した。

■、ザソカロミセス　セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）のグリセ ルアルデヒド−３−リン酸デヒドロケゞす−ゼオベロンのプロモーター／調節領 域の調節のもとてのブルプロノーマチンを暗号づける遺獣子のクル同じ検出法を 用い、ｐ［ＪＲＫ５２８　３３Ｙ持つクルイベロミセス　システィン（Ｋ、　１ ａｃｔｉｓ　）細胞も又ノーマチン様蛋白質（第１１図）を合成することが示さ れた。ｐＵＲＫ、　５２８−６６を含む細胞中のノーマチン様（ｌｒ白質の生産 はしかしながらｐＵＲＫ　５２８−０３を含む約１胞中におけるよりも６倍も高 かった。同様な観察が酵（Ｊ：　ｕｒａ遺１八子の表現においてこの遺伝子を２ １、ｔ＋ｎ　ＤＮＡのｆｉｇ号つけ領域［ニーグル（Ａｂｌｅ）Ｊ中に挿入した ときにＣ，Ｇｅｒｂａｎｄ等（Ｇｅｎｅ　５　、　２３３−２５３゜１９７９） によりなされているので、ｐＵＲＫ　５２８−６６によるノーマチン様蛋白質の 増強された表現は「エーブル（Ａ１）１．８　）　Ｊオペロンの転写／ボリアデ ニレーンヨンにおける効率的な転写停止の事実によるものであるらしい。この観 察はＧＡＰＤＨプロモータ／調節部′（より・転写さＪｌ、た構造遺伝子の効率 的転写の下流の効率的転写停止／ボ゛リアデニレーション領域の存在が遺伝子表 現の最適化における重要な要素であることを示している。ＧＡＰＤＨ停止ポリア ゾニレ−ジョン部（第３図）によるニーゾル（Ａｂｌｅ　）−停止暗号の代用は 表現におけろ少なくとも同様な改良をもたら才、二とが期待されろ。

図面の説明 第１図　酵母グリセルアルデヒド−６−リン酸デヒドロゲナーゼオペロンを含む プラスミドｐＦ１１−３３の領域の制限エンドヌクレアーゼ切１％マツプ。

ｍ２図　ｐＦｌ　１−３３にクローンさＪｔたグリセルアルデヒド−６−リン酸 デヒド１コケゞナーゼオペロンのプロモーター／調節領域のヌクレオチド配列。

ＴＡＴＡ及びＴＡＴＡＡＡ配列は実線のアンダーラインで示す。推定転写停止信 号は点線アンダーラインをした。カッコの間のヌクレオチド配列は逆獣反複ｌ： 示す。６８アミノ酸陛ペプチドを暗号づけるヌクレオチドの配列はボックスの中 に含まれている。

第６図　ｐＦ１１３３にクローンされたグリセルアルデヒド−６−リン酸デヒド ロゲナーゼオペロンの転写停止／ポリアゾニレ−ジョン領域のヌクレオチド配列 。ＡＡＴＡＡ配列は実線アンダーラインで示す。推定転写停止信号は点線アンダ ーラインビした。

第４図　プレプロソーマチン暗号づけプラスミド中へのＥｃｏ　Ｒｌ　（ＩＭｅ 　ｌ　）　ＧＡＰＤＨプロモーター、′調節断片の挿入及び生じたプラスミドが らの：５ｃｏ　Ｒｌ切断部位の除去の図式的表示。

第５図　プレプロソーマチン暗号っけヌクレオチド配列の上流のもとのＧＡＰＤ Ｈプロモーター／調節領域を再構成するために使用する合成りＮＡ断片の調製に 関与する各段階の表示。

第６図　プレプロソーマチン暗号っげプラスミド中への合成りＮＡ断片の導入の 図式的表示。

第７図　可能な幹とループ構ｉａを含むＧＡＰＤＨプロモーター／調節領域の構 造の図式的表示。推定転写停止信号は斜線で示す。断片上の６８アミノ酸長ペプ チドを暗号つけろ配列の位置はＡＴＧ及びＴＡＡコードンで示される。

第８図　プラスミドｐＭＰ　８１の図式的表示。

９９図　Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ及びＳａｌ　ｌによる分解によりｐｙｐ８１Ｌ・ら得 られた２ミクロンの複製のＤＮＡ起源とｌｅｎ　２遺伝子ノプレプロノ−マチン 暗号づげプラスミドへの導入の図式的表示。

第１０図　ＪｊｇＩ　ＩＩによる分解によりＩ）ＥＫ　２−７から得られたＫＡ 、ＪｉＳ　−２及びｔｒｐ　ｉ遺伝子のプレプロソーマチン暗号つけプラスミド への導入の図式的表示。

第１１図　シラスミドｐＥＫ　２−７　（レーンａ）、シラスミドｐｌＪＲＫ、 　５２８−０３　（レーンｂ）及びプラスミドｐＵ］：’（Ｋ　ｂ　２８−６６ （レーンＣ）を含むクルイベロミセス　システィン（Ｋ、　１ａｃｔｉｓ　）　 Ｓ　Ｄ　１１細胞により合成された（３５Ｓ）で標式したノーマチン様蛋白質の ７０ログシト。酵母形質転換物を３５８−システィンを含む最小培地中で生育さ せた。菌体を遠沈により集め、これをｉ　ｍｌの２．０ｍ０１／Ｖのソルビトー ル、０．０２５　ｍｏｉ／１ＮａＰＯ４（ｐＨ７，５）、ｉ　ｍ　ｍｏｌ／　ｌ 　ＥＤＴＡ、ｉ　ｎ：　ｍｏ：Ｌ　／　７１１ｖ１ｇｃｔ２．２５％β−メルカ プトエタノール１ｕｖ）　／　ｍｅ　＊ｊ’イモリアーゼ６０，０００中に再懸 濁し、３０分１’、７４ろＣ１℃にインキュベートした。スフェロプラストを次 いで遠沈し、２７０μｍＨ２Ｏ，４ｔＱ　Ｉ　Ｄ　Ｏｍｍｏｌ／ｌＰＭＳＦ　１ 　８　μｍ　２５　Ｄ　Ｉｎ　ｍｏｌ／’１ＥＤＴＡ　、４０　μｍ９％ＮａＣ １及び８０μコ５　Ｘ　ＰＢＳＴＤＳ　（５Ｑ　ｍ　ｍｏｌ　／ＩＪＮａＰＯ， （ｐＨ７，２）、５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１Ｑ　Ｑ、２．５％デシキシマレート 、２．５％ＳＤＳ　）をカロえて溶７％さ拷だ。。

ノーマチン様蛋白質の免疫沈澱゛及び沈２殿した蛋白質の分析はり、　Ｅｄｅｎ ｓ等（Ｇｅｎｅ１８，１−１２．１９８２）の記載により行った。

％’＋２１２（内′ｆ遣こ変更なし） ３’　ＣＡＡ、ＡＧＴ、ＴＴＡ、ＡＴＴ、ＴＣＴ、ＣＧＡ、ＧＴＡ、ＧＴＧ、Ｔ ＧＴ、ＴＴＧ、ＴＴＴ、ＧＴＴ、丁ＴＧ、ＴＴＴ　５’ｓｌ　’ｒＴＡ、ｃｒｒ 、ＴｃＡ、ＡＡＴ、ＴＡＡ、Ａｃｃ、八ＴＣ，ＡＣＡ、ＣＡ、Ａ、ＡＣＡ、ＡＡ Ｃ，ＡＡＡ、ＡＣＡ、ＡＡ　３’３’　ＣＡＡ、ＡＧＴ、ＴＴＡ、ＡＴＴ、ＴＣ Ｇ、ＴＡＧ、Ｔ（１；ＴｊＣＴＴ、ＴＧＴ、ＴＴＧ、ＴＴＴ、ＴＧＴ、ＴＴ　５ ’特許庁長官殿 １．事件の表示 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 特Ｆ＝、、’−；−乙１−Ｓヒ’、：　７ｉ　ｌ’ｉ　Ｔ　ｉ　’：Ｔ％Ｔ’　 ニー”−フニｆ　：　Ｊ　ル’１１面ノ４：’；Ｑ’Ｉ’ｍ：＋ｙ＋／１５．・ シ・、Ｑ）；Ｚｒ’Ｄ’ａｓ□Ｆ１面−Ｔ、Ｔ７：、：、７！、−どｒ４’：＝ ！てｉ、：７：：更Ｊｃｌハ釜任状、及びその訳文各１通 ８゜補正の内容　別紙のとおり 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　下記より成る組換えＤＮＡシラスミドを含むクルイペロマイセス（Ｋｌｕｙ ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　）属の酵母、（１）　プレプロンーマチン、その種々の対 立型、修飾］、ａｃｔｉｓ　（いわゆるＫＡＲ８）に起源する自律的複製配ヒド ロデナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子から誘導された酵母レギユロン、そして任意に 目５、 （ｉｖ）　ｔｒｐ　−１又はｌａｃ　−４遺伝子の様な選択マーカーそして任意 には、 Ｍ　酵母から誘導された転写停止暗号 （ｖｌ）酵母から誘導された動態体、及び（ｖｌ）　酵母から誘導された複製領 域。 項記載の酵母。 ６、構造遺伝子がヨーロッパ特許出願（Ａ２）　００５４３乙０号及び００５４ ３３１号に開示された構造遺伝子Ｊりなる群から選択されることを特徴とする請 求の範囲４、ＫＡＲ３−配列が野生株に、　１ａｃｔｉｓ　ｃＥ３ｓ　２３６０ に起源することを特徴とする請求の範囲第１項記載の酵母。 ５、転写停止暗号がサツカロミセス　セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ　）の２ミクロンＤＮＡのＨｉｎｄ　Ｎ　−Ｅｃ。 ＲＩ断片に起源する停止配列と停止配列より成る群より選択されることを特徴と する請求の範囲第１項記載の酵母。 ６　組換えＤＮＡプラスミドが請求の範囲第１項記載の構造遺伝子をＫＡＲ８− 配列及び構造遺伝子の上流に酵母ＧＡＰＤＨレギユロン及び選択マーカーそして 任意には、酵母から誘導された動態体及び任意には、酵母から誘導された複製領 域及び任意には、構造遺伝子の下流に酵母から誘導された転写停止暗号と組み合 せることにより調製され、この様に調製されたプラスミドをクルイベロマイセス 属の酵母中に導入することを特徴とする請求の範囲の第１項から第５項のいずれ か１項に記載の酵母の調製法。 Ｚ　請ポの範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載のクルイベロマイセス属 の酵母を培養し、その後酵母の生産したンーマチン又はンーマチン様蛋白質を採 取することを特徴とする、ヨーロッパ特許出願（Ａ２）、ｒ　０５４３５０号及 び００５４６３１号に開示されているゾレプロンーマチン又はその各種の対立又 は修飾型又はそ８、　好ましくはヨーロッパ特許出願（Ａ２）　００５４３３０ 号及び００５４３３１号に開示され、請求の範囲第７項記載の方法に従って調製 されたプレプロソーマチン、その各種の対立又は修飾又はそれ等の成熟型。