JPH06509234A - 組み換え体タンパク質の生産に関して高度に安定な組み換え酵母 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組み換え体タンパク質の生産に関して高度に安定な組み換え酵母本発明は、バイ オテクノロジーの分野、およびより具体的には、組み換え体微生物による工業的 発酵の分野に関する。

さらになお、より具体的には、それは、複合培地において高度に安定である宿主 ／ベクター系（ｃｏｕｐ　］　ｅ）　、その作製および工業的発酵におけるその 使用に関する。

分子生物学の分野において成し遂げられた進歩は、微生物に特殊な組み換え体タ ンパク質、好ましくは異種タンパク質を生産させるために、微生物を改変するこ とを可能ならしめた。特に、数多くの遺伝学的研究産方式のために有望な宿主生 物として浮上した。

しかしながら、これらの新しい生産方式の工業的応用は、特にこれらの組み換え 体微生物における遺伝子発現効率の問題、および工業的発酵条件下で安定である 組み換え体細胞を得ることの難しさによって、なお制約される。本質的な操作上 の制約の一つは、事実、使用される宿主内での発現ベクターの分配の安定性に関 連している。工業的レベルにおいては、ベクターは、少なくとも連続２５世代、 これは２００ｍ３の流加培養型工業発酵槽で終了まで行き着くために必要な世代 数をほぼ表しているが（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏ ｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　５ｔａｎｂｕｒｒｙ　ａｎｄ　ｆｈｉｔａｋｅｒ 、　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　１９８４）　、その世 代にわたつて高い安定性を有していなければならない。そのベクターの安定性は 、約百世代以上に達する必要がある連続発酵の場合には、一層高められねばなら ない。

バクテリアにおいて、実験室で使用される最も普通の解決は、使用されるプラス ミドに抗生物質耐性遺伝子を挿入することよりなり、この遺伝子は、該抗生物質 を含有する選択培地中で生き残り、そして増殖する能力をバクテリアに授ける。

しかしながら、バイオテクノロジーの分野における安全性と法的規制のために、 工業的レベルにおいて抗生物質耐性遺伝子の使用を避けることが、基本的に必要 である。酵母において、最も普通に使用される方法は、アミノ酸（Ｔｒｐ、Ｌｅ ｕ、Ｈｉｓ）またはプリン（アデニン）もしくはピリミジン（ウラシル）塩基の 生合成に関して欠陥のある経路をもつ細胞を培養することよりなり、該細胞は、 この欠陥を補う能力をもつ遺伝子を含有するベクターによって形質転換されてい る。しかしながら、このアプローチは、宿主菌株が栄養要求性であるアミノ酸も しくは塩基を含まない培地の使用を必要とする。そのような合成培地の使用は、 非常に不利益である。特に、これらの培地は高価であり、工業的使用には適さず 、さらに、それは細胞の増殖を遅らせ、菌体量を少なくする。

一つの解決策が、合成培地もしくは抗生物質耐性遺伝子の使用を避けるために提 案されており、それは、（ｊ）複合培地で生存するために必須である遺伝子を宿 主細胞内で変異させること、および（ｊ　ｉ）使用される発現ベクター中に、該 遺伝子の完全なコピーを導入すること、よりなる。このシステム、その原理は宿 主細胞にそのプラスミドを保持させることであるが、それは、宿主／ベクター系 の安定性を増大させることができた。このシステムは、特に、Ｅ、ｃｏｌｉに対 しては、テトラヒドロピコリン酸−Ｎ−サクシニルトランスフェラーゼをコード しているｄａｐＤ遺伝子（欧州特許第２５８１１８号）、その生産物がタンパク ９０）　４７）に関して記載されている。Ｆｅｒｒａｒｊ　らは、また、Ｂ、ズ ブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｊｌｉｓ）変異株内でプラスミドを安定化するために、 その変異株内では機能しないラセマーゼアラニン遺伝子の使用についてする遺伝 子の一つを不活性化すること、（ｉｉ）該細胞をその活性な遺伝子を保持するベ クターによって形質転換すること、（ｉｉｉ）突然変異誘発によってその他の代 謝経路を遮断すること、よりなる。

複合培地で安定な発現系を得るためのその他のアプローチは、宿主細胞のゲノム に組み込まれるベクターを使用することよりなる。しかしながら、このシステム は、組み換え体細胞当たり得られるベクターのコピー数を少なくしてしまい、さ らに、形質転換頻度はより低い。これらの条件下では、非相同遺伝子の発現レベ ルは、常に満足できるというものではない。ゲノム中に組み込まれている遺伝子 の増幅を可能にする方法は、さらに、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、リポ ソームタンパク質をコードしている遺伝子への組み込みを指向することによって 開発されており、該遺伝子は、ゲノム内に複数のコピーで存在している。しかし ながら、このシステムは、組み込まれた遺伝子が高レベルで発現される場合には 、それらが、相同または非相同の遺伝子にかかわらず、不安定であることが証明 されている。

フタ−の安定性の問題を解決するために、これらの微生物に適応する技ることに 関して特別に優れた能力を有していると考えられている。このことは、特に、酵 母に、ラクチス（Ｋ、Ｉａｃｔｉｓ）の場合において、キモシン（欧州特許第９ ６４３０号）、ＩＬ−］βもしくはヒト血清アルブミン（欧州特許第３６１９９ １号）の生産に関して認められた。しかしながら、十分安定な多コピー発現ベク ターは、この微生物において、工業的方法で使用されるようには存在しない。特 に、この微生物の使用を考える上で、複合培地で安定であり、大量培養、特に連 続培養が可能なベクターは存在しない。事実、Ｋ、Ｉａｃｔｉｓにおいて安定な ある種のベクターは、記述されているが（欧州特許第３６１９９１号）、これら のベクター中への非相同遺伝子発現カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）の導入は、本 質的に不安定化効果を生じ、さらにその生産を誘導するための条件下では、特に 著しい。

フター系を安定化させるための特に有効な手段が、今、見出だされた。

本発明の一つの主題は、複合培地において高度に安定である宿主／ベクター系よ りなるものであって、その宿主は、該培地においてその増殖に関して必須である 遺伝子が機能しないＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母であること、およびそ のベクターは該遺伝子の機能性コピーを保持していることを、特徴とする。

本発明の文脈中では、複合培地は、大量操作の経済的制約に適合する工業的発酵 のためのいかなる培地をも意味すると理解される。特に、それは、例えば、補填 （例えば、抗生物質を）されている限定合成培地に対して、工業用原料：トウモ ロコシ可溶性抽出物、酵母抽出物、糖蜜もしくは“蒸留粕”を含有する培地に関 する。しかしながら、本発明は、また、この態様は有利性は低いけれども、合成 培地において使用されてもよいことが理解される。

さらに、そのベクター中に存在する機能性遺伝子は、相同もしくは非相同遺伝子 でありでもよいことが理解される。

複合培地中での宿主細胞の増殖に必須である遺伝子として、その培地に存在する 炭素源（ガラクトース、ラクトース、グルコースおよびそれに類するもの）の代 謝に関与しているより特殊な遺伝子、および細胞分裂に、膜合成に、タンパク質 合成またはＤＮＡ複製もしくは転写に関与する遺伝子が言及されてもよい。

より好ましくは、本発明は、複合培地において高度に安定である宿主／ベクター 系よりなるものであって、その宿主は、解糖作用に関与している遺伝子が機能し ないＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母であること、およびそのベクターは該 遺伝子の機能性コピーを保持していることを、特徴とする。

工業的操作に適合している複合培地において非常に安定な宿主／ベクター系は、 Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓにおいて、その培地の炭素源を代謝するために解糖 系を働かせねばならない場合、その宿主細胞をプラスミド依存性にすることによ って取得されることが、実際に示された。

ｃｅｓ　１ａｃｔｉｓおよびクルイベロミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏ ｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）から選ばれる宿主／ベクター系に関する。

酵母においては、解糖系は、ＡＴＰおよびエタノール分子の生成に導かれる複雑 な酵素的および化学的段階の連続を包含する。この経路に含まれる主な酵素は、 周知であり、これらの酵素をコードしている遺伝子のあるものは、同定され、そ してクローン化されている：特に、ホスホ（１９７８）　７５０８）　；ホスホ グリセリン酸キナーゼ（Ｓｃｏｐｅｓ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｓｏｌ。

もしくはホスホグルコース・イソメラーゼ（Ｎｏｌｔｓａｎｎ、　Ｔｈｅ　Ｅｎ ｚｙｍｅｓ、　ｖｏＩ　Ｖｌ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、、 　２７１．１９７２）をコードしている遺伝子が、に、糖・輸送タンパク質（Ｇ ｏｆｆｒｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄ、　Ｒｅｓ、　１８　（ １９９０）　５２９４）およびホスホグルコース・イソメラーゼ（Ｗ６ｓｏｌｏ ｗｓｋｉ−Ｌｏｕｖｅ酵母における発現ベクターを安定化させるために、効率よ く使用するこはないことがわかった（ｆ６ｓｏ１ｏｗｓｋｉ−Ｌｏｕｖｅｌ、上 記；Ｇｏｆｆｒｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｙｅては、選択マーカーとして解糖系 遺伝子を用いて、安定な宿主／ベクター系を作製することを不可能にした。

このような条件下では、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母における発現ベク ターの安定化に、これらの遺伝子を使用することは、記載もまた示唆もされてい ないし、また不可能であった。

驚くべきことに、本出願人は、今や、い（つかの解糖系遺伝子が、複は生存のた めに必須であり、特に安定な宿主／ベクター系の作製を可能にすることを示した 。特に、選ばれた解糖系遺伝子が、単一の遺伝子であって、その産物がこの酵母 による培地炭素源の代謝に不可欠である場合には、安定な効率的な系が取得され る。実際に、いくつかの解糖段階は、数種の遺伝子によってコードされる活性を 有している。これは、特にＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、数種の遺伝子に よってコードされるエノラーゼ（ＥＮＯ）　、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ ）　、グリセルアルデヒド−３−リン酸・デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）もし くはアルコール・デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性に対する場合である。

この場合には、これらの酵素活性のひとつの不活性化には、それをコードできる 遺伝千金ての不活性化を必要とするであろう。

好ましくは、本発明の宿主／ベクター系においては、解糖系に関与する遺伝子は 単一の遺伝子であって、その産物は、その酵母による培地炭素源の代謝に不可欠 である。

なお一層好ましくは、それは、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ホスホ グリセリン酸ムターゼ（ＧＰＭ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）およびトリオ ースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）をコードしている遺伝子から選ばれる遺伝子 である。

その選ばれた遺伝子は、種々の方法で宿主酵母において非機能性にされる。特に 、非特異的な突然変異誘発技術を用いることができる。より特別には、その酵母 は、物理的因子（Ｘ線；紫外線およびそれに類するもの）もしくは化学的因子（ 挿入剤、モノもしくはニアルキル化剤およびそれに類するもの）によって処理さ れる。次いで、そのように処理された酵母は、目的の変異にしたがって種々の培 地において選択される。

また、特殊な変異誘発技術、特にＤＮＡへの変異性挿入もしくは相同組み換えに よる遺伝子置換のための技術を使用することもできる（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、　 Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ園ｏ１．１［拝（１９８３）　２０２）　、この作用に対 して、二つの変異続発経路が可能である・−欠失されるべき遺伝子を、抗生物質 耐性マーカー（ゲネチシン、フルオマイシンおよびそれに類するもの）という優 性の選択マーカーによって置換すること。この方策を野生株に直接応用すること は、可能であった；−欠失されるべき遺伝子を、使用される菌株の栄養要求性（ ｕｒａ３．ｔｒｐｌ、Ｉｅｕ２．およびそれに類するもの）を相補する遺伝子の 完全なコピーによって置換すること。この方策は、栄養要求性を示すいかなる菌 株にも、また予め栄養要求性にされた野生株に対しても応用することができる。

好ましくは、本発明の宿主／ベクター系においては、そのベクターに存在する必 須遺伝子の機能性コピーは、弱いプロモーターの制御下におかれる。この優れた 態様は、その系の安定性と宿主細胞光たりのベクターのコピー数増加を高め、続 いて、組み換え遺伝子の発現レベルを増大させる。この目的のために使用される 弱いプロモーターの例として、特に、キラー毒素遺伝子ノ二方向プロモーター（ Ｔａｎｇｕｙ−Ｒｏｕｇｅａｕ　ｅｔ　ａｌ、　。

な非相同遺伝子のプロモーターが挙げられる。本発明のその他の好ましい態様は 、ベクターに存在する必須遺伝子の機能性コピーは、プロモーター自体の変異の 結果か、または該プロモーターの転写活性化に係わる遺伝子の不活性化の結果と して、プロモーターを全く含まないか、または欠損プロモーターの制御下におか れているかの、いずれかである。本発明のその他の態様においては、ベクターに 存在する必須遺伝子は、例えば温度のようなある条件下で欠陥がある遺伝子であ ってもよい。特に、それは熱・感受性遺伝子でもよい。

好ましくは、本発明の宿主／ベクター系においては、付加的に、そのベクターは 、少なくとも一つの目的タンパク質をコードしている構造遺伝子、−およびその 発現を許すシグナル類を含むＤＮＡ塩基配列を包含する。

本発明のより好ましい態様においては、その構造遺伝子は、医薬品もしくは農産 ・食料品分野で重要であるタンパク質をコードしている。

例として、下記のものを挙げることができる：酵素類（例えば、特に、スーパー オキシド・ジスムターゼ、カタラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、キ モシンおよびそれに類するもの）、血液成分誘導体（例えば、血清アルブミンま たはその変異体もしくは前駆体、α−もしくはβ−グロブリン、Ｖｌｌｌ因子、 ＩＸ因子、フォンビルプラント因子もしくはそれの部分、フィブロネクチン、α −１−抗トリプシンおよびそれに類するもの）、インシュリンおよびその変異体 、リンホカイン［例えば、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激 因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｍ−Ｃ８Ｆおよびそれに類するもの）　、Ｔ ＮＦｌＴＲＦ、Ｍ■Ｐおよびそれに類するもの１、増殖因子（例えば、成長ホル モン、エリスロボイエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦおよびそれに類 するもの）、アポリポタンパク質、ワクチン（肝炎、サイトメガロウィルス、エ プスタイン・バール、ヘルペスおよびそれに類するもの）生産のための抗原ポリ ペプチド、ウィルス・レセプター、または特に、安定化部分と融合された活性部 分を含有する融合体のようなポリペプチド融合体（例えば、アルブミンもしくは アルブミン断片とウィルス・レセプター（ＣＤ４およびそれに類するもの）もし くはその部分との融合体）。

さらに、有利なことには、そのＤＮＡ塩基配列は、付加的に、組み換え体タンパ ク質の分泌を可能にするシグナルを包含する。これらのシグナルは、問題のタン パク質の分泌に関する本来のシグナルに対応しているが、それらは、また異なる 起源のものでもよい。特に、キラー毒素もしくはαフェロモン遺伝子からのよう に酵母遺伝子由来の分泌シグナルが、使用されてもよい。

好ましくは、その構造遺伝子は、ヒト血清アルブミン、その前駆体もしくはその 分子変異体をコードしている。アルブミンの分子変異体は、アルブミンの多形性 から生じる自然変異体、アルブミン型活性をもつ構造誘導体、アルブミンの端を 切り取った形、もしくは全てのアルブミン基本のハイブリッドタンパク質を意味 すると理解される。

その他の態様においては、その構造遺伝子（群）は、遺伝的もしくは生化学的レ ベルにおいて、代謝産物の生合成に係わるポリペプチドをコードしている。特に 、それらは、アミノ酸、抗生物質もしくはビタミンの生合成に関与している遺伝 子でもよい。

一般に、構造遺伝子の発現ｉ可能とするシグナル類は、転写プロモーターおよび ターミネータ−から選ばれる。これらのシグナルは、構造遺伝子およびその望ま しい結果の機能を考慮して選ばれると理解される。

特に、ある場合には、遺伝子発現相から宿主増殖相を脱共役できるように、調節 されるプロモーターを使用することが好ましい。同様に、長さと相補性に関する 理由により、ある場合には、構造遺伝子に対する本来のプロモーター、および他 の場合には、異なる起源のプロモーターを使用することが好ましいこともある。

好ましくは、使用されるプロモーターは、酵母遺伝子から、さらになお好ましく は、酵母解糖系遺伝子から得られる。ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓもしくはＫｌ ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属酵母の解糖系遺伝子から得られたプロモーターは、特 別に重要である。特に、ホスホグリセリンさらに、これらのプロモーター領域は 、例えば、特別なＵＡＳ領域（“上流活性化塩基配列”）に、転写の制御に関す る付加要素を加えるために、変異誘発によって改変されてもよい。例としては、 Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＧＫおよびＧＡＬ１／ＧＡＬ１０遺伝子のプロモ ーター間のハイブリッドプロモーターが、よい結果を与える。

本発明の宿主／ベクター系は、組み換え体タンパク質生産の方法において使用す ることができる。それらの系は、特に、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母に おいて達成される効果的な生産システムを可能とする。

これに関連して、本発明のその他の主題は、上記の宿主／ベクター系は、該タン パク質を発現させるシグナルの制御下のそれをコードしている構造遺伝子を含む ものであって、その系が培養され、そして生産されたタンパク質が回収される組 み換え体タンパク質の生産方法に関する。

そのような方法は、既に述べたような医薬品もしくは農産・食料品分野で重要で あるタンパク質の生産を可能にする。それは、特に、ヒト血清アルブミン、その 前駆体および分子変異体の生産に好適であるが、それに限定されるものではない 。

本発明の宿主／ベクター系は、また生物変換反応の触媒として直接使用されても よい。

より好ましくは、その必須遺伝子は、前記機能の一つに関与する遺伝子である。

この遺伝子は、当業者にとって周知のいかなる方法（非相同プローブを用いるハ イブリダイゼーションクローニング、変異相補クローニングおよびそれに類する もの）によっても得ることができる。

さらに有利な点は、本発明のベクターは、いかなる細菌由来の塩基配列も含まな いことである。試験管内でそのようなベクターによってに↓ｕｙｖｅｒｏｍｙｃ ｅｓ酵母を形質転換できることが、実際に示された。

この系は、より小さく、したがって取り扱いがより容易であり、比較的大きい組 み換えＤＮＡ塩基配列を受け入れることができるベクターの使用を可能とする利 点を有する。

そのようなベクターの例としては、特に、ベクターｐＹＧ１０２３、ｐＹＧ１０ ３３およびｐＹＧ１０３３Δ５ｆｉｌが挙げられ、それらは、実施例において記 載されている。

先行技術の系と比較して、本発明の優位性は、特に次の点にあるニーＫｌｕｙｖ ｅｒｏｍｙｃｅｓ属酵母におけるプラスミドの非常に効果的な安定化；−非常に 安価であり、容易に、大量に入手できる培地における組み換え体細胞の培養の実 現；または−付加される選択マーカーの使用を不必要とする非常に単純な方法で の組み換え体細胞検出の実現。実際に、組み換え体細胞を同定および／または選 択するためには、−個以上のマーカーを一般に必要とする。特に、ゲネチシン（ ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）のような抗生物質（見且九遺伝子）、または、銅イオン（ ＣＵＰ遺伝子）のような細胞毒性をもつ他の化合物に耐性を付与する遺伝子が、 ター系は、他の全ての選択マーカーの使用を避けることを、可能ならしめる。

本発明は、次の実施例によって、より完全に説明されるが、それは、例示として 、また非限定的に考えられるべきである。

図に対する説明 図１ニブラスミドｐＹＧ６００の制限酵素切断地図。ｂｌａ＝ｌミニアンピシリ ン付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。

図２ニブラスミドｐＹＧ７０を構築する方策。ａｐｈ＝ゲネチシン（Ｇ４１８） 耐性を付与する３゛−アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子；ｐｒ ｏｍ＝＝プロモーター、ＩＲ＝逆方向反復塩基配列；０ＲＩ＝複製開始点；Ｌａ ｃＺ’＝β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子。

図３＝プラスミドｐＹＧ７０−２を構築する方策。説明は、図２参照。

＊印の部位は、回復なしに対応部位に適合する末端を有し、連結反応後は、該酵 素によって認識される切断部位。

図４ニアダブター１〜３の構築およびｐｇＫ変異体の遺伝子型を試験するための ＰＣＲ反応に使用される合成オリゴヌクレオチドＡ−Ｈの塩基配列（実施例３． 　２．　（ｉｔ））。

図５ニブラスミドｐＹＧ７０−３を構築する方策。説明は、図２参照。

ｔｅｒｍ＝ターミネータ−０ 図６：プラスミドｐＹＧ１００３を構築する方策。説明は、図２参照。

図７：ブラスミドｐＹＧ１０２３を構築する方策。説明は、図２参照。

図８＝プラスミドｐＹＧ１０３３を構築する方策。　Ｓ＝ＳｍａＩ、Ｈ＝Ｈｉｎ ｄｌｌ　Ｉ、Ｐ＝Ｐｖｕ１１．Ａｆ＝Ａｆ　ＩＩ　１．Ａｖ＝ＡｖｒＩＩ。

図９＝ベクターｐＹＧ１０３３およびｐＹＧ１０３３Δ５ｆｉｌの図示。説明は 、図２参照。

図１０：に、ＩａｃｔｉｓＣＢＳ２３５９のＵＲＡ３遺伝子をクローニングおよ び改変する方策。

図１１ニブラスミドｐＹＧ１０１２を構築する方策。

図１２ニブラスミドｐＹＧ１０１３を構築する方策および改変旦９五・Ｋ、１遺 伝子を保有するＥｃｏＲＩ−８ｐｅｌ断片の図示。

図１３＝この図は、プラスミドｐＹＧ１０２３で形質転換された酵母ＦＢＯ５Ｄ によるヒト・アルブミンの生産を表す。工業用の複合培地において２００世代に わたり培養し、同期間においてこの酵母のプラスミドｐＹＧ１０２３は安定。そ の安定性およびアルブミン生産は、対応する実施例にて記載される。

一般的クローニング技術 塩化セシウム−臭化エチジウム勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心、制限酵素 による分解、ゲル電気泳動、アガロースゲルからのＤＮＡ断片のエレクトロエリ ューション（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｉｔｉｏｎ）、Ｅ。

ｃｏｌｉにおける形質転換およびそれに類するような慣例の分子生物学的方法は 、成書に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　、“恥１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１ｌａｎｕａｌ″、　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｆｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ、Ｙ、A　 １ ９８６；＾ｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　（ｅｄｓ、　）、　’Ｃｕｒｒｅｎ ｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉB １ｏｇｙ”、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１ ９８７　）。

オリゴデオキシヌクレオチドによる試験管内の部位特異的変異誘発は、Ｔａｙｌ ｏｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１３　（１９８５）　８７４９ −８７６４　）によって開発された方法により、＾ｓｅｒｓｈａｍ販売のキット を用いて実施される。ヌクレオチドの塩基配列は、Ｓａｎｇｅｒらによって記載 されたジデオキシ技術により行われる（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ、　７４　（１９７７）　５４６３−５４６７）、特定のＤＮＡ 断片の酵素的増幅は、ＰＣＲ反応（“ポリメラーゼ触媒連鎖反応”）によって、 １ｌｕｌｌｉｓ　ａｎｄ　Ｆａｌｏｏｎａ（蓋ｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、、　１５ ５　（１９８７）　３３５−３５０　）、および５ａｉｋｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ 　２３Ｇ　（１９８５）　１３５０−１３５４）により記された条件下で、ＤＮ Ａサーマルサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｓｅｒ　Ｃｅｔｕｓ製）を用いて製 造者の指示にしたがって実施される。

衷施男 選択マーカとしてに、ＩａｃｔｉｓのＰＧＫ遺伝子の使用この実施例は、宿主／ ベクター系の作製を記載しており、その場合増加されるべき多コピープラスミド を安定化させる遺伝子は、Ｋ、Ｉａｃ↓１互の３−ホスホグリセリン酸キナーゼ （ＰＧＫ）をコードしている遺伝子である。

このようにして得られた系は、先に記したような工業用の複合培地において安定 である。

＾ｃｆｄ、　Ｒｅｓ、　１０　（１９８２）　２６２５−２６３７）のＮ末端部 分に対応する非相同プローブを用いて、部分ゲノムライブラリーをスクリーニン グすることによって、旦９べ遺伝子が、Ｋ、Ｉａｃ目５ＣＢＳ２３５９から単離 された。

より特定すれば、その使用されたプローブは、１．３−ｋｂのＰｖｕ　１−Ｅｃ ｏＲＩ断片に対応する。

サザンプロット解析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｅｔ　ａｌｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｗ、　９８　（１９７５）５０３）において、使用されたプローブは、特 に、４−ｋｂのＨｉｎｄｌＩｆ−Ｈｊｎｄｌｌｌ断片の中に存在するＤＮＡ塩基 配列とハイブリダイズする。この塩基配列は、上記プローブを用いるコロニー・ ハイブリダイゼーションによって単離された。そのために、プラスミドｐＵｃ１ ８の１−１ｉｎｄｌ１１部位に導入されるサイズ、３〜５ｋｂのＩ（ｉ　ｎ　ｄ 　ＩＩＩ断片よりなるＣＢ５２３５９菌株の限定ゲノムＤＮＡライブラリーが、 作製され、スクリーニングされた。

プラスミドｐＹＧ６００　（図１）を保持するクローンが、このようにり質発現 ベクターの構築。

２．１　プラスミドｐＹＧ７０（図２）の構築。

プラスミドｐＹＧ７０は、続くクローニング段階を容易にするために、ＵＲＡ３ 遺伝子およびｐＫＤｌプラスミドの塩基配列を有するＥｃｏＲ■断片の除去、な らびにａｐｈ遺伝子に存在する非反復Ｈｉｎｄｌ１１部位の除去によって、プラ スミドｐＫａｎ７０７　（欧州特許第３６１９９１号参照）から誘導される。ａ ｐｈ遺伝子は、アミノグリコシド３゜−ホスホトランスフェラーゼ（１）をコー ドしており（Ｏｋａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４７　（１９８１）　２１７）　、酵母においてゲネ チシン（０４１８）耐性に対するマーカーとして使用される。１遺伝子を有する プラスミドｐＫａｎ７０７のＰｓｔｌ断片は、バクテリオ７７一ジＭ１３ｍｐ７ 中にサブクローニングされた。この遺伝子に存在するＨｉｎｄｌ１１部位は、次 いで、プラスミドｐＹＧ６５　（図２参照）を作製するために、Ｔａ１ｌｏｒら による方法（一般的なりローニング技術）にしたがって部位特異的変異誘発によ って壊された。この変異誘発を行うために、次のオリゴデオキシヌクレオチドが 使用された：５’−ＧＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＴ　ＡＡＧ　ＣＴＣＴＴＧ　ＣＣＡ　 ＴＴＣＴＣＡ　ＣＣＧ−３’このオリゴデオキシヌクレオチドは、ロイシン１８ ５をコードしているトリブレットＣＴＴをＣＴＣによって！換された。この変化 は、それにより得られるタンパク賃の配列を改変しない。

プラスミドｐＹＧ７０を得るために、ｐＫａｎ７０７からの細菌レプリコンを含 む部分が、ＥｃｏＲＩ酵素による分解によって単離され、プラスミドｐＹＧ６９ を作るためにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて再び環状が、次に、ｐＹＧ６５から得 られた等量の変異断片により置換された。

このようにして得られたプラスミドｐＹＧ７０は、それ故、次のもの２．２．プ ラスミドｐＹＧ７０　（図３）の制限酵素切断部位の修飾続くクローニング段階 を進めるために、若干の制限酵素切断部位が、除去され（ｉ）、二個のアダプタ ーが、そのプラスミドｐＹＧ７０に付加された（ｉｔおよびｉ　ｉ　ｊ）。

（ｉ）Ｓｐｈ１部位の除去。

プラスミドｐＹＧ７０が、５ｐｈＩにより切断され、次いで、その付着末端が、 ファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼの存在で分解によって除去された。リガーゼの 存在で連結反応後、そのｐＹＧ７０△ｓｐｈ　Ｉが得られた（図３参照）。

（ｉｉ）アダプター１の挿入。

アダプター１が、図４に示された合成オリゴデオキシヌクレオチドＡおよびＢの ハイブリダイゼーションによって得られた。そのために、各オリゴデオキシヌク レオチド２μｇが、ハイブリダイゼーションバッファー２０１１１　（３０ｍＭ トリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７，５；３０ｍＭＮａＣＩ　：　７．５ｍＭＭ ｇＣＩ２；　０．２５ｍＭＡＴＰ　；　２ｍＭＤＤＴ；　０．２ｍＭＥＤＴＡ） 中でインキュベートされ、次いで、１０分間に８０℃まで加温され、徐々に室温 まで下げられた。　このようにして得られたアダプターは、次の酵素：５ａｃ１ ．Ｓａｔ　Ｉ、Ｍａｕｌ、Ｂｓ５ＨＩＩおよび５ｆｉｌに対する切断部位を含有 し、プラスミドｐＹＧ７０△５ｐｈＩに存在する５ａｌＩ部位を、そのアダプタ ーを導入する間に除去させる。このアダプターは、予め酵素５ａｌｌおよびＳａ ｃ■により分解されたプラスミドｐＹＧ７０△５ｐｈｌ中に連結反応によって導 入された。

その得られたプラスミドは、ｐＹＧ７０−１と呼ばれる。

（ｉ　ｆ　ｉ）アダプター２の挿入。

アダプター２が、図４に示されたオリゴデオキシヌクレオチドＣおよびＤを用い て、アダプター１について述べられた方法に従って作製され；Ｎａｒｌおよび５ ａｃｌに対する切断部位を含有し、プラスミドｐＹＧ７０−１に存在するＥｃｏ ＲＩ部位をそれを導入する間に除去させる。

そのアダプターは、予め酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｃ　Ｉにより分解されたプラ スミドｐＹＧ７０−１中に、連結反応によって導入され、プラスミドｐＹＧ７０ −２が作られる。

２．３．ヒト血清アルブミン発現カセットの導入。

使用されたヒト血清アルブミン発現カセットは、次のものを包含するｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ−ＰＧＫ遺伝子に関するターミネータ−０このカセットは、５ａｌＩ −５ａｃｌ断片の形でプラスミドｐＹＧ４０４から単離され（欧州特許第３６１ ９９１号）、続いて、予め対応する酵素により分解されたプラスミドｐＹＧ７０ −２中に、連結反応によって導入された。

その得られたプラスミドは、ｐＹＧ７０−３と呼ばれる（図５）。

２．４．に、Ｉａｃｔｉｓ−ＰＧＫ遺伝子の挿入。

から単離され、プラスミドｐＹＧ１００３を作出するために、ｐＹ６１００２中 にサブクローニングされ、次いで、Ｍｌｕｌ−ＢｓｓＨ１１断片の形で後者から 単離された。

ｐＹＧ１００２中へのサブクローニングにより、Ｋ、１ａｃｔｉｓ一旦９ム遺伝 子を、プロモーターのない、Ｍｌｕｌ−ＢｓｓＨＩＩ断片の形で得られる。

プラスミドｐＹＧ１００３は、次の方法において得られた（図６）ニブラスミド ｐ　Ｉ　Ｃ２０Ｈ（Ｍａｒｓｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　３２　（１９８４ ）　４８１）が、アダプター３を導入するために、ＢｇｌｌｌおよびＥｃｏＲＩ によって分解された。このアダプターは、ＥｃｏＲＩ、Ｂｓ５ＨＩＩ、Ｃ１ａ　 Ｉ　５Ｎｈｅｌ、ＭｌｕｌおよびＢｇ１１１部位を有し、上記（２，２゜　（ｉ ｉ））のように、オリゴデオキシヌクレオチドＥおよびＦ（図４）のハイブリダ イゼーションによって得られた。得られたプラスミドは、ｐＹＧ１００２と呼ば れる。Ｋ、Ｉａｃｔｉｓ−片９人遺伝子は、プラスミドｐＹＧ６００から得られ たＣ１ａｌ−ＮｈｅＩ断片の形で、この新しいプラスミド中に導入された。その 得られたプラスミドは、ｐＹＧ１００３（図６）と呼ばれる。

次いで、Ｋ、１ａｃｔｉｓ−ＰＧＫ遺伝子を有するプラスミドｐＹ６１００３か ら得られたＭｌｕｌ−ＢｓｓＨＩＩ断片が、プラスミドｐｙＧ７０−４　（図７ ）を作出するために、プラスミドｐＹＧ７０−３上の対応する部位に導入された 。　それ故、このプラスミドにおいて、凡ユの制御下におかれる。

２．５．酵母レプリコンの挿入。

プラスミドｐＹＧ７０−４　（図７）およびｐＫＤｌ（欧州特許第３６１９９１ 号）が、５ｐｈＩにより分解され、リガーゼの存在で共に連結された。この連結 反応後、プラスミドｐＫＤ１のコンホメーション（Ａ形もしくはＢ形）およびｐ ＫＤｌに関してプラスミドｐＹＧ７０−４に対応する部分の方向によって、４個 のベクターを得ることができる。

これらの構成物の一つが選択され、ｐＹＧ１０２３　（図７）と呼ばれた。この ベクターは、次のものを包含するニープラスミドｐＫＤｌの完全塩基配列、それ は、酵母および好ましくはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ互属の酵母において、ｐＹ Ｇ１０２３を、安定であり、複製できる多コピープラスミドにさせる、−ヒト血 清アルブミン発現カセット、それは、Ｋ、１ａｃｔｉｓ　ＬＡＣ４遺伝子の誘導 プロモーターおよびＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＰＧＫ遺伝子のターミネータ− の制御下でプレプロ形をコードしている構造遺伝子を含有する、−Ｅ、ｃｏｌｉ に関するレプリコンおよび選択マーカー（アンピシリン耐性を付与するｂａａ遺 伝子）、−に、１ａｃｔｉｓＦＢＯ５Ｄ株（実施例３参照）ｊ、ｍ関す６２個の 選択マーカー：キラー毒素二方向プロモーターに１の制御下にある変異ａｐｈ遺 伝子およびａｐｈ遺伝子に関して同じプロモーターの制御下　′にあるが、分か れて転写されるに、１ａｃｔｉｓ　ＰＧＫ遺伝子。

２．６．ベクターｐＹＧ１０３３△５ｆｉｌの構築。

プラスミドｐＹＧ１０２３から誘導された構成物は、酵母への導入に際し、細菌 レプリコン、ならびにアンピシリンおよびゲネチシン耐性のマーカーを含まない 発現ベクターを得る目的をもって作製され、それには、ＰＧＫ遺伝子の上流に位 置するに１プロモーターが除かれている。

この構成物は、次の方法において作製された：（ｉ）ＰＧＫターミネータ−の改 変。

この段階は、任意に行われる。しかしながら、それは、宿主／ベクター系の生産 能を低下させるであろう発現ベクターそれ自体における組み換えの危険性を、全 て排除するために実施された。事実、プラスミド。

択マーカーとして使用されたに、１ａｃｔｉｓ−ＰＧＫ遺伝子の対応領域と相同 性を示す。それ故、このターミネータ−は、次の方法において改変された： 最初の例においては、ｐＹＧ１０２３から単離された３、６−ｋｂのＰｖｕｌｌ 断片は、プラスミドｐＹＧ１０２７を作製するために、ベクターｐＵｃ１８の対 応する部位にサブクローニングされた。次いで、ＰＧＫターミネータ−領域を保 持するこのプラスミドの４２７−ｂｐのＳｍａ　ｌ−Ｈ４ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片 は、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ−ＰＧＫ遺伝子の非コード３′領域に対応してい る３２５−ｂｐ断片（すなわち、構造遺伝子の要素を含まない）によって置換さ れた。この３２５−ｂｐ断片は、プラスミドｐＹＧ１０２３に存在するＰ　Ｇ　 Ｋターミネータ−におけるＰＣＲ増幅反応（一般的なりローニング技術参照）に よって、次のオリゴデオキシヌクレオチド： ５　’　−ＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＧＧＡＣＣＧＴＡＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧＡＡＴ ＴＧＡＡＡＴＣ−３’５　’　−ＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＣＴＣＡＴＣＣＧＭ ＴＴＭＴＴＣＣＣＡＧＣ−３’を用いて得られ、続いて、酵素Ｓｍａ　Ｉおよび Ｈｉｎｄｌｌｌによって分解された。得られたベクターは、ｐＹ０１０２８　（ 図８）と名付けられた。酵素ＡｖｒｌｌおよびＡｆｌｌｌによるそのベクターの 分解は、１．１−ｋｂ断片を分離させ、それは、ｐＹＧ１０２３中の対応する断 片を置換するために使用された。得られたプラスミドは、ｐＹＧ１０３３と名付 けられた（図９）。

（ｉｉ）Ｓｆｉｌ断片の欠失。

プラスミドｐＹＧ１０３３が、次に、細菌レプリコンと耐性マーカーを含む３． ５−ｋｂ断片を切り取るために、酵素５ｆｉｌの存在で分解され、続いて、プラ スミドｐＹＧ１０３３Δ５ｆｉｌ（図９）を作出するために、リガーゼの存在で 連結させられた。

３、　Ｋ、１ａｃｔｉｓ　ｐｇｋ変異株の単離。

この実施例は、抗生物質耐性に関する遺伝子を使用せずに、Ｋ、１ａｃｔｉｓ野 生株からのＤＱｋ変異株作製について記載される。二段階が続けて実施された： （ｉ）ｕｒａ３栄養要求株の作製（実施例３．　１．）、および（ｉ　ｉ）改変 されたＰＧＫ遺伝子を有するＤＮＡを用いる旦９人遺伝子の置換（置換遺伝子、 Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、前記）であり、その改変は、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ− ＵＲＡ３遺伝子を有するＤＮＡ断片によるその遺伝子内部の置換。且又Ｘ変異株 は、ｕｒａａ株のゲノム中の匹に遺伝子のほとんど完全な開放読み枠（ＯＲＦ） の直接除去によって、作製された（実施例３．２．参照）。

この変異誘発技術は、細胞ゲノムの他の領域に影響する非特異的な突然変異誘発 剤の使用を避けることができる。それはまた、旦９ぺ遺伝子上で実施された改変 を修正する危険性をもついかなる遺伝的復帰動作をも避けることができる。

３，１．に、Ｉａｃｔｉｓ　ｕｒａ３変異株の作製。

（ｉ）Ｋ、］ａｃｔｊｓＣＢＳ２３５９のＵＲＡ３遺伝子のクローニングおよび 改変（図１０）。

オロチ’）シー５−リン酸デカルボキシラーゼ（Ｓｈｕｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 、　ＮｕｃｌＡｃｉｄ、　Ｒｅｓ、　１５　（１９８７）　８５７３）をコード しているに、Ｉａｃｔｉｓ　Ｕ“Ｍｅｔｈｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐ ｒｅｓｓ。

Ｎ、Ｙ、、　１９９０）を出発として、次のオリゴデオキシヌクレオチド・にょ って、１．２−ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｐｓｔｌ断片の形でクローン化された。　次 いで、得られた断片は、プラスミドｐＹＧ１００７　（図１０）を得るために、 プラスミドｐｌｃ２０ＨのＢａｍＨＩとＰｓｉ部位の中にサブクローニングされ た。次に、ＵＲＡ３遺伝子は、２８６ｂｐをもつＯＲＦ内の５ｔｙｌ断片の欠失 によって改変された。これは、酵素５Ｌｙｒによる分解、続いてリガーゼの存在 での連結によって、。

ＹＧ１００７について実施された。この新規プラスミドは、ｐＹＧｌｏｌｏと呼 ばれる（図１０）。

（１１）欠失ＵＲＡ３遺伝子によるに、ＩａｃｔｉｓＣＢＳ２９３９１の形質転 換。

ＣＢ５２９３．９１株が、Ｄｕｒｒｅｎｓらの方法（Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、 　１８　（１９９０）７）により、欠失ＵＲＡ３遺伝子を有するプラスミドｐＹ Ｇ１０１０からエレクトロエリューションによって単離されたＰｓ　ｔ　Ｉ−Ｂ ａｍＨＩ断片の１０μｇを用いて形質転換された。急激に温度を４２℃に上げ（ ヒートショック）、水で２回連続洗浄後、ＹＰＤ培地（酵母エキス１０ｇ／ｌ； ペプトン２０ｇ／ｌニゲルコース２０ｇ／Ｉ）６００μｍが添加され、−その細 胞は一夜培養された。次いで、その細胞は、ウラシル（１００μｇ／ｍり、ウリ ジン（１００μｇ／ｍｌ）および５−フルオロオロチン酸（５ＦＯ）１５ｍＭの 存在において、ＳＤ最少合成培地（アミノ酸不含バクトー酵母窒素源（Ｄｉｒｃ ｏ）　６．　７　ｇ　；グルコース２０ｇ；バクト寒天２０ｇ：蒸留水１００１ ００Ｏ上にブレーティングされた。

クローンが４〜５日後に現れた。それらは、単離されたコロニーを得るためにＹ ＰＤ培地において継代培養された。

第１火線代培養から、３種のクローンが、始めにＳＤ＋５ＦＯ培地で出現したコ ロニーから得られ、さらにそれらは、ＹＰＤ培地（第２火線代培養）において再 び単離された。

第２火線代培養から得られたクローンは、その後、ＳＤおよびＳＤ＋ウラシル培 地におけるドロップテスト（ｄｒｏｐ　ｔｅｓｔ）を用いてＵｒａ３−表現型に ついて検査された（Ｊｕｎｄ　ａｎｄ　Ｌａｃｒｏｕｔｅ、Ｊ、　ｏｆ　Ｂａｃ ｔ。

て試験されたニー４．　１．におけるクローニングに関して記載されたオリゴデ オキシヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応、それは、欠失もしくは完全ＵＲＡ３遺 伝子を保持しているクローンが、増幅のサイズにおいて異なる（それぞれ、０． ９および１．２ｋｂ）ことによって同定されることを可能とする；一完全なＳ、 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＲＡ３遺伝子を保持しているプラスミドｐＫａｎ７０ ７　（欧州特許第３６１９９１号）による相補、それは、Ｋ、］ａｃｔｉｓにお いてｕｒａ３変異を相補する能力として知られている（Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏ ｕｒｔ、前記）、−同定されたクローンのゲノムＤＮＡにおけるサザンプロット 、それは、ＦｅｉｎｂｅｒｇとＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎの技術（＾ｎａ１．　Ｂｊ ｏｃｈｅｍ、　１３２　（１９８３）　６）に従ってｓ２ｐによりラベルされた 実施例４．１．において単離されたに、ＩａｃｔｉｓＵＲＡ３遺伝子をプローブ として使用する。この段階は、欠失もしくは完全なＵＲＡ３遺伝子を保持してい るクローンが、ハイブリダイゼーションにより表された断片のサイズにおける差 異によって同定されることを可能とする。選択されたｕｒａ３変異株は、Ｋ、Ｉ ａｃｔｉｓＹ６１６と呼ばれる。　３．２．に、１ａｃｔｉｓＹ６１６のｐｇｋ 変異株の作製。

Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＲＡ３遺伝子を有しているＤＮＡ断片による遺伝 子内部の置換によって、改変された旦９ぺ遺伝子を有するＤＮＡ断片が、作製さ れた。次いで、この断片は、二重相同組み換えによってＰＧＫ遺伝子の完全なゲ ノムコピーを置換するために使用された（Ｒ。

ｔｈｓｔｅｉｎ、前記）。

（ｉ）改変ＰＧＫ遺伝子（図１１および１２）を有するＤＮＡ断片の構築。

相同組み換えの頻度を増大させるために、まず第一に、旦９旦遺伝子が回復され 、より大きい隣接領域で境界を定められた。特に、旦９ぺ遺伝子の上流に位置す る領域が、クローン化され、次いで、プラスミドｐＹＧ６００　（図１）を保持 している断片中に連結された。

−ＰＧＫ遺伝子の上流領域のクローニング。

実施例１に記載のライブラリーのスクリーニングは、また、約２．２ｋｂのＸｂ ａｌゲノム断片を、サザンプロット分析によって明らかにした。この断片は、サ イズ２〜３ｋｂのＸｂａＩ切断ＤＮＡ断片よりなるに、１ａｃｔｉｓｃＢｓ２３ ５９の限定ゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離され、そ れが、プラスミドｐＵｃ１８のＸｂａ１部位に導入された。５００クローンを有 するライブラリーが、このようにして構築され、続いて、実施例１で使用された 非相同プローブによってスクリーニングされた。一つのクローンが、コロニーハ イブリダイゼーションとその分離されたプラスミドＤＮＡによって同定された。

このプラスミド、ｐＹＧ６１０（図１１）は、２．５−ｋｂのゲノムＤ２ｋｂを 含有することを示している。　−プラスミドｐＹＧ１０１２の構築（図１１）。

プラスミドｐＹＧ６００のＡｆ　ｌ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片および プラスミドｐＹＧ６１０のＥｃｏＲＩ−Ａｆ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片が、エレクトロエ リューションによって単離され、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＨｔｎｄｌ■１によ って予め分解されたプラスミドｐＵＣ９中に、連結反応によって一緒に導入され た。その得られたプラスミドは、ｐＹＧ１０１２と呼５ａｉｌ−８ａｃｌ断片が 、プラスミドｐＹＧ１０１３　（図１２）を作出するために、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅのＵＲＡ３遺伝子を保持しているプラスミドｐＹＧ１０１１から得られ た５ａｌｌ−３ａｃｌ断片を用い、分解後の連結によって置換された。

プラスミドｐＹＧ１０１１は、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＲＡ３遺伝子を含 むプラスミドＹＥｐ２４　（ＡＴＣＣＮｏ、３７０５１）から単離されたＢｉｎ ｄｌｌｌ断片を、バクテリオファージＭ１３ｔｇ１３０　（Ｋｉｅｎｙ　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　２６　（１９８３）　１０１）の対応する部位への挿入す ることによって構築された。

それ故、プラスミドｐＹＧ１０１３は、ＥｃｏＲＩ−３ｐｅｌ断片の境界をなし ている（図１２）。

（ｉ　ｉ）改変旦９ム遺伝子によるに、１ａｃｔｊｓＹ６１６の形質転換。

７６１６株（ｕ　ｒ　ａ　３）が、Ｄｕｒｒｅｎｓらの方法（前記）により、プ ラスミドｐＹＧ１０１３から単離されたＥｃｏＲＩ−８ｐｅｌ断片１０μｇを用 いて形質転換された。

形質転換後、機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する細胞は、グルコースが、グリセロー ル（３％）およびエタノール（２％）によって置換されたＳＤ最少合成培地にお いて選択された。この培地は、２呈Ｘ変異株の増殖を許す。

このようにして得られた形質転換コロニーは、次いで、ｐｇｋ変異株が増殖でき ない複合ＹＰＤ培地において継代培養された。得られた菌株の５０％が、この試 験でＰｇｋ−表現型を示した。

旦９べ遺伝子における変異は、図４に記載されたオリゴデオキシヌクレオチドＧ およびＨを用いるＰＣＲ増幅反応によって、同定されたコロニーについて試験さ れた。これらの２種のオリゴデオキシヌクレオチドは次のものの増幅反応を可能 とするニー完全なに、１ａｃｔｉｓＰＧＫ遺伝子における約０．９ｋｂの領域、 および−上記（ｉ）のように改変されたに、１ａｃｔｉｓのＰＧＫ遺伝子におけ る約１．３ｋｂの領域。

増幅は、Ｐｇｋ−表現型を示す全細胞において実施された。３０サイクルの増幅 の後、その上澄液（１０μｍ）が、そのバンドのサイズを決定するために、アガ ロースゲル（０，８％）上に着けられた。その対照は、プラスミドｐＹＧ６００ 　（完全遺伝子）およびｐＹＧ１ｏ１３（改変遺伝子）について同じオリゴデオ キシヌクレオチドを用いる増幅によって調製された。

得られた結果は、１．３ｋｂのバンドが、Ｐｇｋ−菌株において増幅４、　プラ スミドｐＹＧ１０２３およびｐＹＧ１０３３△５ｆｉｌによるに、Ｉａｃｔｉｓ ＦＢＯ５Ｄ株の形質転換。

ベクターｐＹＧ１０２３が、エチレングリコール／ジメチルスルホキａｃｔｉｓ ＦＢＯ５Ｄ株中に導入された。形質転換酵母は、複合ＹＰＤ培地においてプラス ミドｐＹＧ１０２３によって付与されたＰｇｋ−表現型について選択された。

ベクターｐＹＧ１０３３△５ｆｉＩは、Ｍｅｉｌｈｏｃらの技術（Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎ。

１ｏｇｉｅ　％　（１９９０）　２２３）に従うエレクトロポレーション（ｅｌ ｅｃｔｒ。

ｐｏｒａｔｉｏｎ）によつて、Ｋ、］ａｃｔｉｓＦＢＯ５Ｄ株に導入された。形 質転換後、その細胞は、ＹＰＤ培地上に撒かれ、３０℃で３日間培養された。こ の種の培地で増殖できる細胞（それ故、旦９ム遺伝子の機能性コピーを有してい る）は、次いで、ゲネチシン耐性に関して試験された。それらの６０％が、Ｇ４ １８の２００μｇ／ｍｌ存在下のＹＰＤ培地では、増殖できない。これらの結果 は、導入されたベクターが、Ｇ４１８マーカーを失い、ＦＢＯ５Ｄ株の見ｌＫ変 異を相補できることを示している。

５、　プラスミドｐＹＧ１０２３の安定性およびアルブミン生産の研究。

５．１．安定性研究 形質転換細胞が、エルシンマイヤーフラスコ中のＭ９Ｃ３２０工業用複合培地［ 酢酸アンモニウム２ｇ／ｌおよびラクトース２０ｇの存在で、トウモロコシ可溶 性抽出物（Ｓｏｌｕｌｙｓ、Ｌ、　Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）　２０　ｇ／　１を補填 されたＭ９培地（ｌｌａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、前記）］で、２８℃にお いて撹拌しつつ前培養された。この前培養が、次いで、Ｍ９Ｃ３２０培地５０ｍ １を含有スる２個の３００ｍ１エルレンマイヤーフラスコに、１Ｏ−３（エルレ ンマイヤーフラスコ１）および１０−’（エルレンマイヤーフラスコ２）の希釈 液で接種された。続いて、その細胞は、上記のように３日間、撹拌（２００回転 ／ｍ１ｎ）培養された。この段階で、エルレンマイヤーフラスコ１の細胞は、１ ０回の細胞分裂（１０世代時間）を経過し、エルレンマイヤーフラスコ２の細胞 は、２０回の細胞分裂（２０世代時間）を経過した。　エルレンマイヤーフラス コ２の培養は、その次に、２個の他のエルレンマイヤーフラスコに、１０−”（ エルレンマイヤーフラスコ３）および１０−’（エルレンマイヤーフラスコ４） の希釈液で接種された。続いて、その細胞は、上記のように３日間、培養された 。この段階で、エルレンマイヤーフラスコ３の細胞は、３０回の細胞分裂（３０ 世代時間）を経過し、エルレンマイヤーフラスコ４の細胞は、４０回の細胞分裂 （４０世代時間）を経過した。

この操作が、５０回から２００回までの細胞分裂を経過した培養を含有するエル レンマイヤーフラスコ５〜２０を得るために、再び８回繰り返された。

各培養の末期において、１０３細胞／ｍｌを含有する懸濁液を調製するために、 サンプルが、エルレンマイヤーフラスコから回収された。これらの懸濁液の２０ ０μｌが、２種のシャーレにまかれたニーＹＰＧＥシャーレ（酵母エキス１０ｇ ／Ｌペプトン２０ｇ／ｌ、グリセロール３０ｇ／ｌ、エタノール２０ｇ／ｌ）。

この培地は、全ての細胞の増殖を許す。−０４１８（２００μｇ／ｍｌ）存在下 のＹＰＤシャーレ。Ｇ４１８耐性遺伝子および旦９本遺伝子を保持するプラスミ ドｐＹＧ１０２３を有する細胞のみが、このシャーレにおいて増殖可能である。

　このようにして、プラスミドｐＹＧ１０２３の安定性が、各培養に対して試験 された。その結果は、図１３に示されていて、その安定性は、ＹＰＧＥシャーレ に存在するコロニー数に対するＹＰＤ１０４１８シャーレに存在するコロニー数 の比で表される。

その結果は、先行技術に比べて、本発明の優位性を明らかに示している。事実、 ｐＫＤ１由来の安定なプラスミドは、既に記載されているけれども、それに発現 カセットを導入し、組み換え体タンパク質を生産させることは、常に安定性を低 下させる結果となった。このことは、特に、アルブミンおよびインターロイキン −１βに関して観察された（欧州特許第３６１９９１号）。本発明は、この安定 性の消失を排除し、それゆえに、発現を誘導する条件下（ラクトース）でも、そ のベクターが、培養２００世代後も形質転換細胞の１００％に維持されているの である。

５２　アルブミン生産の研究 各培養の末期において、５，１．に記載された方法により得られた細胞を含まな い上清液１０μｍが、各エルレンマイヤーフラスコから採取され、等量の２倍濃 度レムリ・バフ７−（Ｌａｅｍ＋ｗｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７　（１９７（ １）６８０）と混合される。９６℃で１０分間加熱後、そのサンプル中のタンパ ク質が、８．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離された。次いで、アル ブミンの生産は、クーマシープル−（Ｃｏｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅｂｌｕｅ）に よるゲルの染色によって表され、島津製Ｃ５９３０デンントメーター（この技術 の誤差限界：＋／−２０％）を用いる濃度測定によって評価された。図１３は、 種々のアルブミン生産を、誘導の条件下（ラクトース含有培地）での培養世代数 の関数として示している。その値は、２００世代にわたり測定された平均生産量 に対する生産量％として与えられる。

これらの結果は、記載された宿主／ベクター系の高度の安定性、ならびにそれに よる、一定の高いレベルにおいて、誘導条件下で、少なくとも工業用複合培地に おける２００培養世代にわたっての組み換えタンパク質の生産能を確実に証明す る。

ンブルは、ブダペスト条約の規定に従い、それぞれナン／＜−ＣＢ５２９５．９ １およびＣＢ５２９５．９１のちとに、オランダＢａａｒｎのＣｅｎｔｒａａｌ ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　ＳｃｈｉｍｍｅＬｋｕｌｔｕｒｅｎ　（ＣＢ　Ｓ　） 　Ｊこ、１９９１年６月１１日ニ癖託された。Ｋ、１ａｃｔｉｓｌｉ株ＣＢ５２ ９３．９１＋よ、ブダペスト条約の規定により１９９１年６月１１日再寄託され た菌株ＣＢ８１０６５に対応する。

ＦＩＧＬＩＲｒ　１ オリゴデオキシヌクレオチド Ｄ　５；　ＣＧＧＣＧＣＣＧＣＡＴＧＣＧＡＣＧＴＣＧＧＣＣＣＣＡＴｒＧＧＣ ＣＴ　３’Ｆ　５’　ＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＣＧＴＧＧＧＣＴＡＧＣＧＧＡＴＣ ＧＡＴＧＧＧＣＧＣＧＣＧＧα１゜ｒｌ（、ｕＦＩＥ　５ に、１Ｐ（Ｊ プラスミドおよびアルブミン生産の安定性ｒｌＧＩＪＲ［１３ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：６４５） Ｉ

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．複合培地において高度に安定である宿主／ベクター系であって、その宿主は 、該培地においてその増殖に関して必須である遺伝子が機能しないＫｌｕｙｖｅ ｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母であること、およびそのベクターは該遺伝子の機能性コ ピーを保持していることを、特徴とする。
2. ２．請求の範囲１に記載の宿主／ベクター系であって、その必須遺伝子が、その 培地に存在する炭素源（ガラクトース、ラクトース、グルコースおよびそれに類 するもの）の代謝に関与している遺伝子、および細胞分裂に、膜合成に、タンパ ク質合成またはＤＮＡ複製もしくは転写に関与する遺伝子から選ばれることを、 特徴とする。
3. ３．請求の範囲２に記載の宿主／ベクター系であって、その必須遺伝子が、解糖 作用に関与している遺伝子であることを、特徴とする。
4. ４．請求の範囲３に記載の宿主／ベクター系であって、解糖作用に関与する遺伝 子は、その産物がその酵母による培地炭素源の代謝に不可欠である単一の遺伝子 であることを、特徴とする。
5. ５．請求の範囲４に記載の宿主／ベクター系であって、解糖作用に関与する遺伝 子は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ ＧＰＭ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）およびトリオースリン酸イソメラーゼ （ＴＰＩ）をコードしている遺伝子から選ばれることを、特徴とする。
6. ６．請求の範囲１に記載の宿主／ベクター系であって、そのベクターに存在する 必須遺伝子の機能性コピーは、弱いプロモーターの制御下におかれているか、あ るいはプロモーターを全く含まないか、または欠損プロモーターの制御下におか れているかの、いずれかであることを特徴とする。
7. ７．請求の範囲１に記載の宿主／ベクター系であって、そのベクターに存在する 必須遺伝子は、例えば温度（熱・感受性遺伝子）のようなある条件下で欠陥があ ることを特徴とする。
8. ８．請求の範囲１〜７のいずれか一つに記載の宿主／ベクター系であって、その 宿主は、酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓおよびＫｌｕｙｖｅｒ ｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓから選ばれることを特徴とする。
9. ９．請求の範囲１に記載の宿主／ベクター系であって、そのベクターは、付加的 に、少なくとも一つの目的タンパク質をコードしている構造遺伝子、およびその 発現を許すシグナル類を含むＤＮＡ塩基配列を包含する、ことを特徴とする。
10. １０．請求の範囲９に記載の宿主／ベクター系であって、その構造遺伝子は、医 薬品もしくは農産・食料品分野で重要であるタンパク質をコードしている、こと を特徴とする。
11. １１．請求の範囲１０に記載の宿主／ベクター系であって、その構造遺伝子は、 酵素類（例えば、特に、スーパーオキシド・ジスムターゼ、カタラーゼ、アミラ ーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、キモシン）、血液成分誘導体（例えば、血清アル ブミンまたはその変異体、α−もしくはβ−グロブリン、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因 子、フォンビルブラント因子もしくはそれの部分、フィブロネクチン、α−１− 抗トリプシン）、インシュリンおよびその変異体、リンホカイン［例えば、イン ターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳ Ｆ，Ｍ−ＣＳＦ）、ＴＮＦ、ＴＲＦ、ＭＩＰ］、増殖因子（例えば、成長ホルモ ン、エリスロポイエチン、ＦＧＦ，ＥＧＦ，ＰＤＧＦ，ＴＧＦ）、アポリボタン パク質、ワクチン（肝炎、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バール、ヘル ペスおよびそれに類するもの）生産のための抗原ポリペプチド、ウイルス・レセ プター、または特に、安定化部分と融合された活性部分を含有する融合体のよう なポリペプチド融合体から選ばれるタンパク質をコードしている、ことを特徴と する。
12. １２．請求の範囲９に記載の宿主／ベクター系であって、そのＤＮＡ塩基配列は 、付加的に、組み換え体タンパク質の分泌を可能にするシグナル類を包含する、 ことを特徴とする。
13. １３．請求の範囲９に記載の宿主／ベクター系であって、その構造遺伝子の発現 を可能とするシグナル類は、転写プロモーターおよびターミネーターから選ばれ る、ことを特徴とする。
14. １４．請求の範囲１３に記載の宿主／ベクター系であって、使用されるプロモー ターは、任意に改変される酵母遺伝子、さらになお好ましくは、酵母解糖系遺伝 子または高発現性遺伝子のプロモーターである、ことを特徴とする。
15. １５．組み換え体タンパク質の生産方法であって、請求の範囲９〜１４に定義さ れたような宿主／ベクター系が、培養され、そして生産されたタンパク質が回収 される、ことを特徴とする。
16. １６．医薬品もしくは農産・食料品分野で重要であるタンパク質を生産するため の請求の範囲１５に記載の方法。
17. １７．請求の範囲１１に定義されたようなタンパク質を生産するための請求の範 囲１６に記載の方法。
18. １８．ヒト血清アルブミン、その前駆体および分子変異体を生産するための請求 の範囲１７に記載の方法。
19. １９．請求の範囲９〜１４に定義されたような宿主／ベクター系の、生物変換反 応における触媒としての使用。
20. ２０．複合培地におけるＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の増殖に必須である遺 伝子の機能性コピーを有するＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属酵母のための発現ベ クター。
21. ２１．請求の範囲２０に記載のベクターであって、その必須遺伝子が、請求の範 囲２〜５の一つにより定義されることを特徴とする。
22. ２２．請求の範囲２０に記載のベクターであって、それが細菌の塩基配列を含ま ないことを特徴とする。
23. ２３．図７および９に記載のベクターｐＹＧ１０２３、ｐＹＧ１０３３およびｐ ＹＧ１０３３ΔＳｆｉＩ。
24. ２４．Ｐｇｋ−表現型を表すＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属の酵母。
25. ２５．Ｋ．ｌａｃｔｉｓ酵母ＦＢ０５Ｄ・Ｎｏ．ＣＢＳ２９５．９１。