JPH06509226A - 組み替え蛋白質の製造法及び用いられる宿主細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ７、異種ＤＮＡ断片がＡＲ５型の染色体配列を含む、又はに、ドロソフィラルム （Ｋ、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）のｐＫＤ１プラスミドあるいはＳ、セレビ シアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｊａｅ）の２μプラスミドから誘導された複製起源 の自律複製発現プラスミドの一部を形成することを特徴とする請求の範囲６に記 載の宿生細胞。

８、構造遺伝子が製薬学的に価値のある、又は農−食物産業において価値のある 蛋白質をコードすることを特徴とする請求の範囲１−７のいずれか１つに記載の 宿主細胞。

９　蛋白質が酵素（特ｌニジスムターゼスーパーオキシド、カダラーゼ、アミラ ーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、キモシンなど）、血液誘導体（例えば血清アルジ ミン又はその分子変異型、アルファー又はベーターグロブリン、因子ＶＮＪ、因 子ＩＸ、Ｘオフビルプラント因子又はそのいくつかの断片、フィブロネタチン、 １−アルファーアンチトリプシン）、インスリン及びその変異型、リンホカイン ［例えばインターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ 、ＧＭ−Ｃ３Ｆ％Ｍ−ＣＳＦ、、、）　、ＴＮＦ、ＴＲＦ、ＭＩＰｓｌ）　、成 長因子（例えば成長ホルモン、エリトロポエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、、ＰＤＧＦ ＳＴＧＦなど）、アポリポタンパク質、ワクチン製造のための抗原性ポリペプチ ド（肝炎、サイトメガロウィルス、エプスタイン−パール、ヘルペスなど）、ウ ィルスレセプター、又は別の場合ポリペプチドの融合体、例えば特に安定化部分 に融合した活性部分を含む融合体から選ばれることを特徴とする請求の範囲８に 記載の宿主細胞。

１０、蛋白質がヒト血清アルブミン及びその分子変異体から選ばれることを特徴 とする請求の範囲９に記載の宿主細胞。

１１、請求の範囲１−１０のいずれか１つに記載の細胞を培養し、製造された蛋 白質を回収することを特徴とする組み替え蛋白質の製造法。

１２、蛋白質が培地中に分泌されることを特徴とする請求の範囲１１に記載の方 法。

１３　請求の範囲９にて定義されている蛋白質の製造のための、請求の範囲１１ 又は１２に記載の方法。

１４、蛋白質がヒト血清アルブミン又はその分子変異体から選ばれることを特徴 とする請求の範囲１３に記載の方法。

１５、酵母に、ラクチス（Ｋ、Ｉａｃｔｉｓ）￥６ｉ６　Ｎｏ、ＣＢ５２９４． ９１゜ 明　細　書 組み替え蛋白質の製造法及び用いられる宿主細胞本発明は遺伝子工学により改変 された新規酵母株、それらの製造及び組み替え蛋白質の製造のためのそれらの利 用に関する。さらに特定すると本発明はクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍ ｙｃｅｓ）　眞の新規酵母株に関する。

組み替え蛋白質の製造の目的で用いることができると思われる宿主生物として選 ばれるものは、例えば哺乳類細胞又は微生物など多数ある。

組み替えＤＮＡ法により改変された哺乳類細胞の利用は、生成物を天然起源の生 成物に非常に近づけるという利点を宵する。しかしこれらの細胞の培養は取り扱 いに（く、高価であり、限られた量でしか行うことができない。

バクテリアなどの微生物の利用は大規模の製造を可能にするが、ある場合には天 然起源の生成物と実質的に異なる生成物に導くという欠点を有する。かくして通 常ヒトの場合グリコジル化される蛋白質は一般にバクテリアによりグリコジル化 されない［Ｐ、Ｂｅｒｍａｎ　ａｎｄ　Ｌ。

、Ａ、Ｌａ５ｋｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｂｅｍ、Ｓｃｉ、、（１９８５） １０．１）、５１以下］。さらにＥ、コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）などのバクテリア 中で多量に発現されたヒトの蛋白質は多くの場合細胞内沈降（ｉｎｔｒａｃｅｌ ｌｕｌａｒ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を伴う不自然な構造をとっているＣ Ｒ，Ｇ、５ｃｈｏｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、（１９８５’、３．　ｐ、１５１以下：Ｊ　ＭＳｃｈ ｏｅｍａｋｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、ＥＭＢＯＪ、＜１９８５）。

４、ｐ、７７５以下］。最後に、Ｅ、ｃｏｌｉなどのバクテリア中で遺伝子を発 現することができるためには、成熟蛋白質のコード配列の前にメチオニンを形成 する開始コドンＡＴＧを置（ことが必須である。多（の場合この残基はＥ、ｃｏ ｌｉのメチオニルアミノペプチダーゼにより切り出されない［Ｐ、Ｈ，Ｓｅｅｂ ｕｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５゜３］。かくして得られる蛋白質は第１残基と して異常なアミノ酸を有し、それは生物学的活性に蛋白質の開始部分が含まれる 場合にその活性の立体的阻害を起こし得る。残基はその後の蛋白質の投与に不利 な免疫原性も有し得る。

酵母又はマツシュルームなどの真核微生物系の利用は、組み替え蛋白質の製造に 関してバクテリア宿主の利用の興味深い代替えとなる。実際にこれらの生物は、 哺乳類細胞などのもっと複雑な真核生物の構造的及び細胞的体制のすべての特徴 を有する。特に酵母は多数の蛋白質の活性に重要な転写後及び翻訳後修飾を行う ことができる。さらに酵母は工業的規模で周知であり、高細胞密度で培養するこ とができ、病原性でなく、内毒素を製造せず、非常に長い間食物産業で使用され てきた。

酵母はすでに組み替え蛋白質の製造のための宿主生物として用いられている（” Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”Ｂａｒｒ　ｅｔ　ａｌ 、’（Ｅｄｓ）、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ。

Ｓｔｏｎｅｈａｍ、１９８９を参照）。

特許第６００５７号を参照）、この酵母を用いた系は異種遺伝子を非常に多量に 発現することを可能にする。しかしＳ、セレビシアエの分泌能力がこの酵母の開 発における制限因子となっている。

酵母ピチア　パストリル（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第４０ ２　８４７号）又はンゾサッカロミセス　ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）（欧州特許第３８５３９１号）を用いた他の製造系 が開発され、酵母シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）（欧州特 許第３９４　５３８号）についての研究も行われた。

近年、クルイベロミセス属の酵母が組み替え蛋白質の製造のための宿主生物とし て用いられてきた。この酵母により製造される蛋白質は特にキモシン（欧州特許 第９６　４３０号）、タウマチン（欧州特許第９６９１０号）、アルブミン、イ ンターロイキン−１β、ｔＰＡ及びＴＩＭＰ（欧州特許第３６１　９９１号）な らびに治療機能を有するアルブミン誘導体く欧州特許第４１３　６２２号）であ る。

しかし比較的強力な発現ベクターがこの酵母の利用のために開発されたが、用い られる細胞本来の性能を向上させる目的の研究は行われてこなかった。特にクル イベロミセス属の酵母には多数の種があり、それらの種の中に多数の異なる株が ある。ここで出願人はこれらの異なる株が組み替え蛋白質の製造に関して非常に 異質な方法で挙動し、それらのいくつかは完全に使用できないことを示した。

本発明は、組み替え蛋白質の製造に特に有利な性質を有する種であるクルイベロ ミセス　ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆａｃｔかくして本発明は遺 伝子工学により改変され、大量に培養することができ、生物学的活性組み替え蛋 白質を有効に製造でき、場合により培地中に分泌することができる酵母株の製造 につき記載する。

従って本発明の特徴の１つは組み替え蛋白質の製造のだめの新規酵母株に関する 。さらに正確には、本発明の１つの主題は組み替え蛋白質の製造のための宿主細 胞に関し、該宿主細胞が構造遺伝子及びその発現を可能にするシグナルを含む異 種ＤＮＡ断片を含む酵母に、ラクチスＣＢ５２９３．９１又はその誘導体あるい は突然変異体であることを特徴とする。

本発明の意味の場合誘導体又は突然変異体は、組み替え蛋白質の製造に用いるこ とができるに、ラクチス　ＣＢ５２９３．９１から得られるいずれの株でもある と理解される。特にそのような誘導体又は突然変異体は遺伝的修飾（ＤＮＡレベ ルでの改変）又は生化学的修飾により得ることができる。この目的のために、例 えば非特異的手段ニー物理的作因（Ｘ−線、紫外線など）又は−化学的作因（ア ルキル化又はジアルキル化試薬、挿入試薬など）あるいは特異的手段、例えばＤ ＮＡを標的とした突然変異的挿入系（トランスポゾン、レトロトランスポゾン、 組み込みプラスミドなど）などの種々の突然変異誘発手段を用いることができる 。

そのような誘導体の１つの例は、ＵＲＡ３遺伝子のレベルにおける欠失により株 ＣＢ５２９３．９１から得た株に、ラクチスＹ６１６である。

他の突然変異体はプロテアーゼ、特に小胞体により運ばれるプロテアーゼ、例え ばＡ及びＢプロテアーゼ、カルボキンペプチダーゼＹ又はコンバーターゼ（特に Ｋｅｘｌ）をコードする遺伝子のレベルにおける突然変異により得ることができ る。

異種ＤＮＡ断片は種々の方法により細胞中に導入することができる。

一般に形質転換又はエレクトロポレーションが適しているが、本発明は特定の方 法に制限されていないことが理解される。

異種ＤＮＡ断片は組み替え蛋白質の分泌を可能にするシグナルも含むのがさらに 好ましい。これらのシグナルは研究中の蛋白質の天然の分泌シグナルに対応する ことができるが、異なる起源であることもできる。

特に酵母遺伝子から誘導された分泌シグナル、例えばキラー毒素の遺伝子からの もの（Ｓｔａｒｋ　ａｎｄ　Ｂｏｙｄ、ＥＭＢＯＪ、５（１９８６）１９９５） 又はアルファフェロモンの遺伝子からのもの（Ｋｕｒｊａｎ　ａｎｄ　Ｈｅｒｓ ｋｏｗｉｔｚ、Ｃｅ１ｌ　３旦（１９８２）９３３：Ｂｒａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｙｅａｓｔ　４（１９８８）Ｓ４３６）を用いることができる。

本発明のさらに特定の具体化において、異種ＤＮＡ断片は分泌マーカーも含む。

実際にこの種のマーカーは本発明の細胞を容易に同定できるようにする。関連す るマーカーは特に、抗生物質に対する耐性を与えるマーカー（例えばａｐｈ遺伝 子（Ｊｉｍｅｎｅｚ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ２８７　（１９８０ ）８６９））、又は細胞にとって毒性の他の化合物（特に銅イオン）に対する耐 性を与えるマーカー、あるいは宿生細胞の栄養要求性を補足するマーカー（例え ばＵＲＡ３遺伝子（Ｄｅ　Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌ、１５４　（１９８３）７３７））　であルコとカテキル。

一般に構造遺伝子の発現を可能にするシグナルは転写プロモーター及びターミネ ータ−から選ばれる。これらのシグナルは構造遺伝子及び所望の結果に依存して 選ばれると理解される。特にある場合には制御可能なプロモーターを用い、宿主 の発育相及び遺伝子の発現の発育相が共役しないようにできるのが好ましい。同 様に強さ及び適合性の理由で、ある場合には構造遺伝子の天然のプロモーターの 使用が、そして他の場合には興なる起源のプロモーターの使用が好ましい。

用いられるプロモーターは酵母の遺伝子から誘導されるのが好ましく、酵母の解 糖遺伝子からがより好ましい。特に価値のあるプロモーターはサツカロミセス又 はクルイベロミセス属の酵母の解糖遺伝子から誘導されたプロモーターである。

特にホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド３−リン酸塩 デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、エノラーゼ（ＥＮＯ）又はアルコールデヒドロゲ ナーゼ（ＡＤＨ）をコードする遺伝子のプロモーターを挙げることができる。ラ クターゼ遺伝子（ＬＡＣ４）、酸ホスファターゼ遺伝子（ＰＨ０５）又は翻訳延 長因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）（Ｔ ＥＦ）などの強く発現される遺伝子から誘導されるプロモーターも挙げることが できる。

さらにこれらのプロモーター領域は突然変異誘発により、例えば補足転写調節要 素（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｃｏｎｔｒｏ ｌ　ｅｌｅｍｅｎｔＬ例えば特にＵＡＳ　（上流活性化配列（Ｕｐｓｔｒｅａｍ 　Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　５ｅｑｕｅｎｃｅ））領域を加えることにより修飾す ることができる。例えばＳ、セレビンアエのＰＧＫ及びＧＡＬ１／ＧＡＬ１０遺 伝子のプロモーターの間のハイブリッドプロモーターは良い結果を与える。

本発明の好ましい具体化の場合、異種ＤＮＡ断片は自律複製又は組み込み性であ ることができる発現プラスミドの一部を形成する。

自律複製ベクターに関し、これらはに、ラクチスＣＢ５２９３．９１又はその誘 導体あるいは突然変異体の自律複製配列を用いることにより得ることができる。

特に関連する配列は、例えばＳ、セレビシアエ（Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　２８２　（１９７９）３９）又はに、ラクチス（Ｄａｓ　 ａｎｃｌ　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ。

Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ、６　（１９８２）１２３）を起源とする染色体配列（Ａ ＲＳ）であることができる。ベクターは又プラスミド、例えばＫ。

ドロンフィラルム（Ｋ、ｄｒｏｓｏ　ｈｉ　Ｉａｒｕｍ）（欧州特許第３６１９ ９１号）のプラスミドｐＫＤ１又はＳ、セレビシアエの２μプラスミド（考察の ためにＦｕｔｃｈｅｒ、Ｙｅａｓｔ　４　（１９８８）２７を参照）から誘導さ れた複製起源であることもできる。

組み込みベクターに関し、これは一般に宿生ｍＦ＆のゲノムのある領域と相同の 配列を用いて得られ、相同的組み替えによるプラスミドの組み込みを可能にする 。

本発明に従い構造遺伝子は、製薬学的に価値のある、又は農−食物産業において 価値のある蛋白質をコードするのが好ましい。例えば以下を挙げることができる ：酵素（特にスーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、アミラーゼ、リパー ゼ、アミダーゼ、キモシンなど）、血液誘導体（例えば血清アルブミン又はその 分子変異型、アルファー又はベーターグロブリン、因子ＶＩ　Ｉ　Ｉ、因子ＩＸ 、Ｘオフビルプラント因子又はそのい（つかの断片、フィブロネクチン、１−ア ルファーアンチトリプシンなど）、インスリン及びその変異型、リンホカイン［ 例えばインターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ、 ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｍ−Ｃ３Ｆ、、’　、）　、ＴＮＦ、ＴＲＦ、ＭＩ　Ｐｓなど］ 、成長因子（例えば成長ホルモン、エリトロポエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ。

ＰＤＧＦ、ＴＧＦなど）、アポリポタンパク質、ワクチン製造のための抗原性ポ リペプチド（肝炎、サイトメガロウィルス、エプスタイン−バール、ヘルペスな ど）、ウィルスレセプター、又は別の場合ポリペプチドの融合体、例えば特に安 定化部分に融合した活性部分を含む融合体（ｆｌｆえばアルブミン又はアルブミ ン断片とレセプター又はウィルスレセプターの一部の間の融合体（ＣＤ４など） ）。

構造遺伝子はヒトの血清アルブミン、その前駆体又はその分子変異体の１つをコ ードするのが好ましい。アルブミンの分子変異体は、アルブミンの多量から生ず る天然の変異体、アルブミン型の活性を有する構造的誘導体、アルブミンに基づ く不完全な形態又はいずれかのハイブリッド蛋白質であると理解される。

本発明の他の主題は組み替え蛋白質の製造の方法ｌこ関し、その方法に従って上 記で定義した組み替え細胞を培養し、製造された蛋白質を回収する。

実施例に示す通りこの方法は、驚くべきことに多量の組み替え蛋白質の製造の達 成を可能にする。

本発明の方法は組み替え蛋白質の培地中への分泌も可能にするのが有利である。

本発明の方法は製薬学的価値のある、又は農−食物産業において価値のある組み 替え蛋白質の大量の製造を可能にする。それは特にヒトの血清アルブミン又はそ の分子変異型の製造に適しているが、これに限られるわけではない。

本発明のさらに別の利点は以下の実施例を読むと明らかになるが、それは例示で あり、制限ではないと理解するべきである。

−ター：ＵＡＳ＝“上流活性化配列“。

里ｌ：ベクターｐＹＧ４０１の構築の戦略及び提示。Ｐ＝プロモーター、Ｔ＝転 写ターミネータ−；　ｂ　１　ａ＝アンピシリンに対する耐性を与える遺伝子； ａｐｈ＝ゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｊｎ）に対する耐性を与える遺伝子（０４ １８）。

々の株におけるアルブミンの発現及び分泌。実施例に記載の条件下で得た培地上 澄み液（２５μｍ）の、クーマシーブルーで染色した後の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析 （８，５％のアクリルアミド）。ａ及びｂ列は０．５及ヒ１．０８ｇの標準アル ブミンに対応する。

履互：ヘクターｐＹＧ１０７により形質転換されたに、ラクチスの種々の株にお けるアルブミンの発現及び分泌。実施例に記載の条件下で得た培地上澄み液（２ ５μｍ）の、クーマシーブルーで染色した後の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析（８，５％ のアクリルアミド）。形質転換された細胞は２％のグルコース（Ｇ　］　ｕ）又 は２％のラクトース（Ｌａｃ）の存在下のＭ９ＥＬ１０培地（実施例参照）中で 培養した。ａ及びｂ列は０．５及び１．０μｇの標準アルブミンに対応する。

区立−Ｋ、ラクチス　ＣＢ５２３５９のＵＲＡ３遺伝子のクローニング戦略及び 修飾。

一般的クローニング法 分子生物学の従来の方法、例えば塩化センラム／エチジウムプロミド勾配を用い たプラスミドＤＮＡ遠心、制限酵素による消化、ゲル電気泳動、アガロースゲル からのＤＮＡ断片の電気溶出、Ｅ、ｃｏｌｉ甲の形質転換などは文献に記載され ている（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。

”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ １″、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ ｄ’Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、、１９８６；Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ 　ａｌ、、（ｅｄｓ、）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅ ｗ　Ｙｏｒｋ　１９８７）。

オリゴデオキシヌクレオチドによる試験管内における部位特異的突然変異誘発（ ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を、Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ　 （Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３（１９８５）８７４９−８７６４ ）により開発された方法を用い、Ａｍｅｒｓｈａｍの供給によるキットを用いて 行う。Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、７４　（１９７７）５４．６３−５４６７）により記載のジデオキシ法 を用いてヌクレオチド配列決定を行う。特定のＤＮＡ断片の酵素増幅を、“ＤＮ Ａ熱サイクラ−（ＤＮＡ　ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ）”　（Ｐｅｒｋｉｎ 　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を用い、製造者の勧告に従い、Ｍｕｌｌｉｓａｎｄ 　Ｆａｌｏｏｎａ　（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、１旦旦（１９８７）３３５−３ ５０）及び５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、（Ｓｃｉｅｎｃｅ旦旦旦（１９８５）１’ ３５０−１３５４）により記載の条件下のＰＣＲ（“ポリメラーゼ−触媒連鎖反 応“）により行う。

実施例 実施例１　組み替え蛋白質のための発現カセット及び／又はベクターの構築 １゜１．ヒトアルブミンのための発現ベクターの構築１゜１．１．ＰＧＫ／ＧＡ Ｌハイブリッドプロモーターの制御下のアルブミン発現ベクターの構築 ヒト血清アルブミンの発現ベクターをプラスミドｐＹＧ１９（欧州特許第３６１ 　９９１号）から製造した。後者は以下の要素を含むニー安定でクルイベロミセ ス属の酵母中で複製することができる多数のコピーを有するプラスミドをｐＹＧ １９から作るプラスミドｐＫＤ１配列（欧州特許第３６１　９９１号）、 −８，セレビシアエのＰＧＫ遺伝子のプロモーターの制御下でプレプロ形態をコ ードする構造遺伝子を含むヒト血清アルブミンのための発現カセット、 −バクテリアレブリコン及びバクテリア選択マーカー（アンピシリンヒト血清ア ルブミンのための発現カセットのレベルにおける修飾によりプラスミドｐＹＧ１ ９からベクターｐＹＧ４０１を構築した。ｐＹＧ−ターの制御下にある。このハ イブリッドプロモーターはＰＧＫプロモーター（Ｓｔａｎｗａｙ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｎｕｃｌ：　Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、１５　（１９８７）６８５５）のＵＡＳ　（ “上流活性化配列“）をＧＡＬ１／ＧＡＬＩＯプロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ 　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅ７）のＵＡＳ領域で置換することにより得た。

このハイブリッドプロモーターは、以下の方法で構築した（図１を参−照）ニ プラスミドｐＹＧ２９の構築は欧州特許出願筒３６１　９９１号に詳細に記載さ れている。このプラスミドは、プラスミド］）ＹＣｌ３から５ａｌｌ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片の形態で単離され、バクテリオファージＭ１３ｍｐ１８中にクローニ ングされたＳ、セレビシアエのＰＧＫ遺伝子のプロモーターを含む。それをその 後特定の部位の突然変異誘発により修飾し、以下の制限部位を導入したニ ーＡＴＧに関して−２５の位置に１個の補足ＨｉｎｄｌＩＩ部位。この部位の導 入は、種々のクローニング段階の後にＡＴＧに近接したヌクレオチド配列をＰＧ Ｋプロモーターの天然の配列と同一に復帰させることを可能にする。実際にＡＴ Ｇコドンの環境は真核遺伝子の翻訳の開始の効率に実質的影響を有することが知 られている（Ｋｏ　ｚ　ａ　ｋ、　Ｍ、　。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、４７　（１９８３）１−４５；Ｈａｍｉ　］ｔｏ ｎ、Ｒ，，Ｎｕｃ１．Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ　１５　（１９８７）３５８１−３５９ ３）。

−ＵＡＳの両側に２個のＮｏｔ１部位。

ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターのＵＡＳはＭｉ　ｙａ　ｊ　ｉｍａｅｔ　ａ ｌ、（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ　１２　（１９８４）６３９７−５４１４； Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｐｏｕｗｅｌｓｅｔ　ａｌ、　、　Ｅｌｓｅ ｖｉｅｒ　（１９８５）　Ｖｌ　−Ｂ−ｉｉ−２）により記載のプラスミドｐＧ １から単離した。このプラスミドは、第３７３０５号としてＡＴＣＣに寄託した 。

プラスミドｐＧ１はＳ６　セレビシアエのＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターを 含む０．８−ｋｂ断片を含み、それはプラスミドｐＵＣ８のＨｉｎｄ１１１部位 に挿入されており、そこからＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片の形態で切り出すことが できる（図１）。

この断片をｐＧｌから切り出し、精製し、その後切断部位がそれぞれＵＡＳ領域 の両側にある酵素ＲｓａＩ及びＡｌｕｌで消化した。その後電気溶出により１４ ３−ｂｐ断片を単離し、５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３′リンカ−を加えることに よりＮｏｔＩ断片の形態とした。その後この断片を、前にＮｏｔＩで消化したプ ラスミドｐＹＧ２９中にクローニングした。

得られたプラスミドをｐＹＧ３２と命名する（図１）。

このハイブリッドプロモーターを含む発現ベクターを得るために、ハイブリッド プロモーターを含むＳａ　１１−Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片をｐｙｃ３２から単 離し、以下の２つの相補的績を含む合成Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＢｓｔＥＩＩアダプタ ーと連結した：５’−ＡＧＣＴＴＴ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＡＡＴ　ＡＴＡ　ＡＡＡ 　ＡＣＡ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＧＧ−３′及び５’　−ＧＴ　ＴＡＣＣＣＡ　Ｃ ＴＴ　ＣＡＴ　ＴＧＴ　ＴＴＴＴＡＴ　ＡＴＴ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＡＡ−３’　 （転写を開始するコドンは太字で示す）。このアダプターは、Ｓ、セレビシアエ のＰＧＫ構造遺伝子の直上流に位置し、プレプロＨ３Ａをコードする遺伝子の第 １コドンを含む２２−ｂｐを天然の遺伝子に存在するＢｓｔＥＩＩ部位まで再構 築する（図１）。

かくして得、ハイブリッドプロモーター及びアルブミン構造遺伝子の５゛末端を 含む５ａｌＩ−ＢｓｔＥＩ　Ｉ断片を、プラスミドｐＹＧ１９から単離され、ア ルブミン遺伝子の残り及びＳ、セレビシアエのＰＧＫ遺伝子のターミネータ−を 含むＢｓ　ｔＥＩ　ｌ−３ａｃ　Ｉ断片と連結することによりヒトアルブミンの ための発現カセットを再構築した（図２）。

かくして得たカセットを用いてプラスミドｐＹＧ１９に含まれる５ａ１１−＝Ｓ ａｃ１発現カセットを置換した。

得られたベクターをｐＹＧ４０１と命名する（図２）。

１、　１．　２．　Ｋ、ラクチスのＬＡＣ４プロモーターの制御下のアルブミン 発現ベクターの構築 本発明の製造系における誘導プロモーターＬＡＣ４の効率を調べるために、発現 ベクターｐＹＧ１０７を構築した。このベクターはｐＹＧ４０１ベクターと同一 でありそれは： （ｉ）ｐＫＤ１部分とバクテリアレプリコンの間の連結位置のＥｃ。

ＲＩ部位が破壊されている。この破壊は、ｐＹＧ４０１プラスミドをＥｃｏＲＩ で切断し、Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントを用いて 付着末端を充填し、再連結することにより得られる。

（ｉ　１）Ｇ４１８に対する耐性を与えるａｐｈ遺伝子中に存在するＨｉｎｄＩ ＩＩ部位が破壊されている：この修飾は、バクテリオファージＭ１３ｍｐ７中へ のａｐｈ遺伝子のサブクローニングの後、Ｔａｙｌ。

ｒ　ｅｔ　ａｌ、（Ｎｕｃｌｅｉｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、１３（１９８５）８７ ４９）により記載の方法を用い、以下のオリゴデオキシヌクレオチド：５’−Ｇ ＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＴ　ＡＡＧ　ＣＴＣＴＴＧ　ＣＣＡ　ＴＴＣＴＣＡ　ＣＣＧ −３’を用いた特定部位の突然変位誘発により得た。このオリゴデオキシヌクレ オチドはロイシン１８５をコードするＣＴＴコドンをＣＴＣに変換する。この変 更は得られる蛋白質配列を改変しない。

修飾（１）及び（ｉ　ｉ）は、単にその後のクローニング段階を容易にするため の小さな変更を生ずるが、それはベクターによる発現効率を妨げない。

（ｉ　ｉ　ｉ）アルブミン発現カセット（Ｓａ　Ｉ　ｌ−８ａｃ　Ｉ断片）はプ ラスミドｐＹＧ４０４　（欧州特許第３６１　９９１号）を起源とする５ａｌＩ −Ｓａｃｌカセットに置換され、それの場合ヒトアルブミン（プレプロ形態）を コードする遺伝子はに、ラクチスのＬＡＣ４プロモーターの制御下にある。

ベクターｐＹＧ１０７の構造を図３に示す。

酵母中へのＤＮＡ断片の導入を可能にする種々の方法を用いることができる。

用いられる種々のクルイベロミセス株は、全細胞を酢酸リチウム及びポリエチレ ングリコールの存在下でＩｔｏ　ｅｔ　ａｌ、（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５ ３　（１９８３）ｉ６３−１６８）に記載の方法を用いて処理することにより形 質転換するのが有利である。

代わりとなる方法も欧州特許第３６１　９９１号に詳細に記載されている。

実施例３：クルイベロミセス属の種々の酵母における組み替え蛋白質の発現及び 分泌 この実施例は、本発明の遺伝的に改変された新規酵母の利用が組み替え蛋白質の 特に多量の製造及び分泌を可能にすることを示す。

３．１．ヒト血清アルブミン ３、　１．　１．実施例２に記載の方法を用い、以下のクルイベロミセス組み替 えアルブミン製造は、２％のゲネチシンの存在下のＹＰＤ培地（酵母抽出物１０ ｇ／ｌ；ペプトン２Ｃ）ｇ／］ニゲルコース２０ｇ／Ｉ）中で一定の撹拌をしな がら２８℃で１２０時間の培養時間の後、欧州特許出願第３６１　９９１号に記 載の方法により決定した。続けて２回遠心しく４００Ｏｒｐｍで５分、及びその １１２．０００ｒｐｍで１０分）、すべての細胞汚染物を除去した後、培養上澄 み液を得た。その後０．５ｍｌの試料を等体積の以下の緩衝液：０．１２５Ｍの トリス−ＨＣｌ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール、 ４．６％のナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）及び０，４％のブロモフ ェノールブルー（Ｌａｅｍｌ　ｉ　２ｘ緩衝液、Ｌａｅｍｌ　ｔ、Ｎａｔｕｒｅ 　２２ユ（１９７０）６８０））の存在下で９５℃に１５分間加熱し、得られた 溶液の５０ａｌを８．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に置いた。移動さ せた後、クーマシーブルーを用いてゲルを視覚化した。

図４は以前に記載された最良の系の場合（欧州特許第３６１　９９１号）と比較 して、本発明の系において製造されるアルブミンの量が約２００％増加すること を示す。

３、　１．　２．実施例２の方法を用い、以下のクルイベロミセス　ラフ組み替 えアルブミン製造は、２０ｇ／Ｉのグルコース又は２０　ｇ／　１のラクトース の存在下のＭ９ＥＬ１０培地中で一定に撹拌しながら２８０Ｃにて１２０時間培 養した後、欧州特許出願第３６１　９９１号及び実施例３．　１．　１．に記載 の方法を用いて決定した。Ｍ９ＥＬ１０培地は１０ｇ／ｌの酵母抽出物で補足し たＭ９培地（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ、、上記）を含む。

図５は製造されるアルブミンの量が常に本発明の系において高いことを示す。そ れは又、グルコース培地よりラクトース（ＬＡＣ４プロモーター誘導物質）を含 む培地中の製造が２−３倍多いことも示す。さらに最後に驚くべきことに、それ は株ＣＢ５２９３．９１がＬＡＣ４プロモーターの制御下で組み替え蛋白質の製 造に関して半構成性であることを示している。

３．２　インターロイキン−１β 実施例２に記載の方法を用い、以下のクルイベロミセス　ラクチス株をｐｓＰＨ ｏ−ＩＬ３５ベクター（欧州特許第３６１　９９１号を参照）により形質転換し た。

構築 に、ラクチス　ＣＢ５２９３．９１からｕｒａ３誘導体を製造した。

そのような誘導体は最初の株の性質を保持し、さらに選択マーカーとして用いる ことができるウラシルに関する栄養要求性を有する。復帰が起細胞の他のゲノム 領域を改変することができる非特異的突然変異誘発剤の利用を避けることも可能 にする。

４、　１．　Ｋ　ラクチス　ＣＢ５２３５９のＵＲＡ３遺伝子のクローニング及 び修飾（図６） ＣＢ５２３５９からのゲノムＤＮＡ抽出物から（Ｒｏ’ｓｅ　ｅｔａｌｌ、Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、、１９９０）以下の オリゴデオキシヌクレオチド： ５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＧＴＣＧＴＴＣＡＴＧＧＴ ＧＡＣＡＣ−３’及び５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＡＡＴＧ ＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣ−３’を用いたＰＣＲ法（一般 的クローニング法を参照）を用いて１．２ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｔ断片 の形態でクローニングした。

得られた断片をその後ｐＩ　Ｃ−２０Ｈプラスミド（Ｍａｒｓｈ　ｅｔａｌ、、 Ｇｅｎｅ　３２　（１９８４）４８１）のＢａｍＨＩ及びＰｓｔ１部位にサブク ローニングし、プラスミドｐＹＧ１００７を得た（図６）。このフラグメントを その後、５ｔｙｒ部位の間に位置する２８６ｂｐを含むＵＲＡ３遺伝子の内部断 片の欠失、及びリガーゼの存在下における再連結により修飾した。この新規プラ スミドをｐＹＧｌｏｌｏと命名する（図６）。

４．２　欠失ＵＲＡ３遺伝子によるＫ　ラクチス　ＣＢ５２９３．９１の形質転 換 電気溶出によりプラスミドｐＹＧ１０１０から単離され、欠失ＵＲＡ３．９１株 を形質転換した。温度を突然４２℃に上げ（“熱ショック”）、水で連続２回洗 浄した後、６００μＪのＹＰＤ培地を加え、細胞を終夜インキュベートした。そ の後細胞を、ウラシル（１００μｇ／ｍｌ）、ウリジン（１００μｇ／ｍｌ）及 び１５ｍＭの５−フルオロオロテート（５ＦＯ）の存在下の合成最小ＳＤ培地（ アミノ酸を含まない“バクトー酵母窒素ベース（ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｎｉ ｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ）”　（Ｄｉｆｃｏ）６．７ｇ；グルコース２０ｇ　： バクトー寒天２０ｇ１蒸留水１．０００ｍ１）上で平板培養した。

クローンは４−５日の最後に現れた。それらをＹＰＤ培地上で継代培養し、単離 コロニーを得た。

第１の継代培養から、ＳＤ＋５ＦＯ培地上に最初に現れたコロニーから得られた ３クローンをＹＰＤ培地上に再単離した（第２継代培養）。

その後第２継代培養から得られたクローンを、ＳＤ及びＳＤ＋ウラシル培地上へ の落下試験（ｄｒｏｐ　ｔｅｓｔ）を用い（Ｊｕｎｄａｎｄ　Ｌａｃｒｏｕｔｅ 、Ｊ、ｏｆ　Ｂａｃｔ、１０２（１９７０）６０７−６１５；Ｂａｃｈ　ａｎｄ 　Ｌａｃｒｏｕｔｅ、Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、’Ｇｅｎｅｔ、１１５　（１９７２）１２６−１３０）、Ｕｒａ３−表 現型に関して調べた。かくして得られたクローンのｕｒａ３遺伝４１、のクロー ニングの場合に記載したオリゴデオキシヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応、 −Ｋ　ラクチスにおけるｕｒａ３栄養要求体を補う能力で知られている（Ｄｅ　 Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ、上記）Ｓ　セレビシアエの無損傷ＵＲＡ３遺伝子を含 むｐＫａｎ７０７ブラスミド（欧州特許第３６１９９１号）を用いた補足、及び −実施例４．１．で単離され、Ｆｅｉｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｖｏｇｅをプローブ として用いた、同定されたクローンのゲノムＤＮＡ上のサザンプロット法により 調べた。

選択されたｕｒａ３突然変異体はに、ラクチス　ＹＣｌ３と命名する。

株に、ラクチス　ＹＣｌ３の試料を、１１９１年６月１１日、ブタペスト条約の 条件下でＣｅｎｔｒａａ、Ｉｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｋｕｌ ｔｕｒｅｎ　（ＣＢＳ）　ｉｎ　Ｂａａｒｎ　１ｎｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎ ｄｓに番号ＣＢ５２９４．９１として寄託した。株に、ラクチス　ＣＢ５２９３ ．９１は、ブタベスト条約の条件下で１９９１年６月１１日に再出願された株Ｃ Ｂ５１０６５に対応する。

５ｊｊｌ　内−Ｉｌｌ　Ｂｓ＋ε１１ Ｆｉｇｕｒｅ　１ ｌａ Ｆｉｇｕｒｅ　２ Ｆｉｇｕｒｅ　３ φ 〉 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：６４５） Ｉ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．宿主細胞が構造遺伝子及びその発現を可能にするシグナルを含む異種ＤＮＡ 断片を含む酵母Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＣＢＳ２．９３．９１又はそ の誘導体あるいは突然変異体であることを特徴とする、組み替え蛋白質の製造の ための宿主細胞。
2. ２．異種ＤＮＡ断片が組み替え蛋白質を分泌させるシグナルも含むことを特徴と する請求の範囲１に記載の宿主細胞。
3. ３．異種ＤＮＡ断片が選択マーカーも含むことを特徴とする請求の範囲１に記載 の宿主細胞。
4. ４．構造遺伝子を発現させるシグナルが転写プロモーター及びターミネーターか ら選はれることを特徴とする請求の範囲１に記載の宿主細胞。
5. ５．転写プロモーターが酵母遺伝子、好ましくは酸母解糖遺伝子又は強く発現さ れた酵母遺伝子のプロモーターから選ばれることを特徴とする請求の範囲４に記 載の宿主細胞。
6. ６．異種ＤＮＡ断片が自律複製又は組み込み発現プラスミドの一部を形成するこ とを特徴とする、請求の範囲１−５のいずれか１つに記載の宿主細胞。
7. ７．異種ＤＮＡ断片がＡＲＳ型の染色体配列を含む、又はＫ、ドロソフィラルム （Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）のｐＫＤ１プラスミドあるいはＳ．セレビ シアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μプラスミドから誘導された複製起源 の自律複製発現プラスミドの一部を形成することを特徴とする請求の範囲６に記 載の宿主細胞。
8. ８．構造遺伝子が製薬学的に価値のある、又は農−食物産業において価値のある 蛋白質をコードすることを特徴とする、請求の範囲１〜７のいずれか１つに記載 の宿主細胞。
9. ９．蛋白質が酵素（特にジスムターゼスーパーオキシド、カタラーゼ、アミラー ゼ、リパーゼ、アミダーゼ、キそシンなど）、血液誘導体（例えば血清アルブミ ン又はその分子変異型、アルファー又はベーターグロブリン、因子ＶＩＩＩ、因 子ＩＸ、フォンビルブラント因子又はそのいくつかの断片、フィブロネクチン、 １−アルファーアンチトリプシン）、インスリン及びその変異型、リンホカイン 〔例えばインターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ 、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ．．．）、ＴＮＦ、ＴＲＦ、ＭＩＰｓ］、成長因子 （例えば成長ホルモン、エリトロポエチン、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ など）、アポリボタンパク質、ワクチン製造のための抗原性ポリペプチド（肝炎 、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バール、ヘルペスなど）、ウィルスレ セプター、又は別の場合ポリペプチドの融合体、例えば特に安定化部分に融合し た活性部分を含む融合体から選ばれることを特徴とする請求の範囲８に記載の宿 主細胞。
10. １０．蛋白質がヒト血清アルブミン及びその分子変異体から選ばれることを特徴 とする請求の範囲９に記載の宿主細胞。
11. １１．請求の範囲１−１０のいずれか１つに記載の細胞を培養し、製造された蛋 白質を回収することを特徴とする絡み替え蛋白質の製造法。
12. １２．蛋白質が培地中に分泌されることを特徴とする請求の範囲１１に記載の方 法。
13. １３．請求の範囲９にて定義されている蛋白質の製造のための、請求の範囲１１ 又は１２に記載の方法。
14. １４．蛋白質がヒト血清アルブミン又はその分子変異体から選ばれることを特徴 とする請求の範囲１３に記載の方法。
15. １５．酵母Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）Ｙ６１６Ｎｏ．ＣＢＳ２９４．９ １。