JPS61500946A

JPS61500946A - 狂犬病の抗原性蛋白を真核細胞内で発現するベクタ−及びそのワクチン製造への適用

Info

Publication number: JPS61500946A
Application number: JP59503639A
Authority: JP
Inventors: ラテ　リシヤール; キーニー　マリー‐ポール; ルモアン　イブ; ロワソン　ジエラール; エグル　ミツシエル; ルコツク　ジヤン‐ピエール
Original assignee: トランスジ−ン　ソシエテ　アノニム
Priority date: 1983-10-03
Filing date: 1984-10-02
Publication date: 1986-05-15
Also published as: FR2552776A1; FR2552776B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】狂犬病の抗原性蛋白を真核細胞内で発現するベクター及びそのワクチン製造への適用本発明は、特に狂犬病ワクチンの製造に関する。

狂犬病は、狂犬病ウィルスによって惹起される疾病であって、非常にひどい脳を陽炎の病態をとり、症状が現われる前に、処置を行なわなければ殆んど致命的である。

狂犬病は入獄伝染病である。すべての瀉血動物は、哺乳類も鳥類も感染する。主な感染経路は哺乳類にあり、家畜及び野生動物が噛むことにより感染する。

有効な予防手甲により、人の狂犬病の例は限られたものとなり、高度工業国においては、若干の偶発的なものに減少している。

しかしながら、南アメリカ、アフリカ及びアジアのある国々では、狂犬病は尚かなり重大な疾病である。

狂犬病と闘うための最大の武器は、ワクチン接種による予防である。

現在用いられているワクチンは、不活性化したウィルスである。

しかるに、工業的製造のためには、２等ウィルスは、新生マウスの脳、鳥類の胚、動物の腎臓細胞又は人の二倍体細胞等の媒体中での培養が必要であり、その後、例えばβ−プロビオラクトン等を作用させて完全に不活性化させねばならない。

不活性化ワクチンの使用には、常に不充分な不活性化の危険が伴われる問題がある。Ｒ後に、上記培養媒体の特殊性より、工業的製造段階での多種の困難性が惹起され、その結果、現在の抗狂犬病ワクチンは、非常に高価なものとなっている。

トランスジーン社は、既に例えばＥ、コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）細菌内で狂犬病の抗原性蛋白を発現するためのベクターによって、上記問題の解決に最初に寄与した（フランス国特許出願第８２１０８４０１号参照）。

本発明の目的は、偶発的な感染の危険のないワクチン化できる抗原性蛋白を製造することにあり、殊に該ワクチンが非常に低コストとなるような工業的条件下で、製造試薬として細菌を用いることなく、真核細胞を用いて、製造することにある。発言エレメントとしての真核細胞の強大な利点のひとつは、これが狂犬病に構造的に近似しており、且つ細菌よりもより完全な抗原の製造を可能とする点にある。

狂犬病ウィルスは、杆状ウィルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ　）である。

この杆状ウィルスは、弾丸状（ｂｕｌｌｅｔ　−５ｈａｐｅｄ）のリポ蛋白皮膜内に包含されるＲＮＡを含む螺旋状ヌクレオカプシドから構成される。

このウィルスは、ゲノムＧ（糖蛋白）、Ｎ（ヌクレオカプシド）、Ｍ＋及びＭ２　（マトリックス）及びしくラージ、トランスクリブターゼ〉によってコードされた５つの蛋白からなっている。その覆っている躾は、宿主由来であり、その表面に存在する有効な抗原は、分子量がほぼ６５０００ダルトンであって、血球凝集活性を有する膜転写蛋白である糖蛋白のみである。

精製された上記糖蛋白は、もとのウィルスよりも約６倍程度血球凝集活性が高い。

狂犬病ウィルスの糖蛋白は、その名が示す通り、グリコジル化されているが、該グリコジル化の役割は未知である。

狂犬病ウィルスの糖蛋白ｍ　ＲＮＡの相補的ＤＮＡ配列は、ニー、アニリオニスら（Ａ、　Ａｎｉｌｉｏｎｉｓ　ｅｔ　ａｌ）により、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ　、２９４，２７５−２７８（１９８１））に記載されている。

この遺伝子を、以下の実験に関連して使用し、また第１図に図式的に示した。

本発明は、狂犬病の抗原性蛋白を真核細胞内で発現するベクターに関し、該ベクターは少なくとも以下のものを含んでいる。

一狂犬病の抗原性蛋白をコードするＤＮＡ配列（１）−上記配列を真核細胞内で発現させるエレメント狂犬病の抗原性蛋白をコードするＤＮＡ配列（１）とは、真核細胞内で発現される時、狂犬病の抗原性蛋白の形成を導く配列を意味する。

該ＤＮＡ配列は、狂犬病の抗原性蛋白をコードする有効ＤＮＡ配列の全部又は一部であることができ、また発現された時、狂犬病の抗原性蛋白と同一もしくは非常に類似した免疫学的性質を有する蛋白を与えるＤＮＡ配列であることができる。

また、狂犬病の抗原性蛋白をコードする完全なりＮＡを、ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメントの形態で利用するのが有利である。かかるフラグメントにおいては、例えば発現された糖蛋白の品質に損傷を与えることなく、末端Ｇ／Ｃの全部又は一部を除去することができる。

ＤＮＡ（１）を発現させるエレメントは、宿主真核細胞に応じて変化する。最近工業的興味が持たれている２種の場合、即ら初物細胞、特に哺乳動物細胞と酵母とに、区別される。勿論２等以外の真核細胞も除外されるものではない。

動物剛胞内での江宿主１１１１胞がａ物１胞である場合、発現エレメントは一般にウィルス、例えばパポバビリジアエ（Ｐ　ａｐｏｖａｖｉｒｉｄｉａｅ　）科のつ・イルステある５Ｖ４０（ｓｉｒＡｉａｎ　ｖｉｒｕｓ　４０゜ｐｏｌｙｏｍａ　ｖｉｒｕｓ　）又はＢＰＶ　（ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ　）などから入手される。他のウィルス、例えばアデノウィルス（ａｄｅｎｏｖ　ｉ　ｒｕｓ　）も使用できる。Ｓ４０ウィルスの利点のひとつは、その宿主ｍ胞内での複製がかなり多く、収率が数千コピーに及ぶことである。

本発明ベクターの発現エレメントは、少なくともウィルスプロモーターからなる。該プロモーターは、ベクターウィルスのプロモーターのひとつであればよく、ＳＶ４０においては、後流遺伝子（ｌａｔｅ　ｇｅｎｅＳ　）のプロモーターが利用できるが、該プロモーターは異なるウィルス由来であってもよく、またＢＰＶにおいては単純ヘルペスウィルスのチミジン　キナーゼ遺伝子プロモーターが以下の如く使用可能である。

発現の改善のために、本発明ベクターはまた各種イントロン及びポリアデニル化サイトを、この順序でＤＮＡ配列（１）の末端に位置させたものでもよい。之等のエレメントもまた同様にベクターウィルス由来であるか又は外来のものでよい。従って、ベクターＢＶＰにおいて、ポリアデニル化サイトは、ＳＶ４０の光流（ａａｒｌｙ　）サイトでも、また後流（Ｉａｔｆｌりサイトでもよい。用いられるイントロンのうちではウサギβ−グロブリン遺伝子のイントロンエが挙げられるが、特にこれに限定されるものではない。

最後に、自己発現ベクター（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ）は、宿主細胞内で複製できるものでなければならず、従って該ベクターは複製起点（ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆｒｅＤｌｉｃａｔｉｏｎ　）　、例えばＳ、Ｖ２Ｏ又はＢＰＶＩ７）複製起点を含む必要がある。加えて、該ベクターはおそらくは上記細胞内でその維持及び複製のために必要な蛋白、例えば５Ｖ４ｏについてはＴ抗原、を発現可能であることが要求される。

ある場合には、上記各エレメントの組み合せを有するベクターは、利用するにはあまりに大きすぎる。この場合にはベクターの維持及び複製に必要なエレメントのいくつかを、他のベクターにより供給するか、細胞自体によって生産させて、ベクター内の対応する蛋白を除去することができる。

完全なＳＶ４０ゲノムを有し且つＳＶ４０の複製に必要なＴ抗原を生産するＣＯ３細胞は、複製起点を有するがＳＶ４０の先決ファンクションは有さないＳＶ４０ベクターの複製を可能とする。

以下に示す例においては、実際の発現ベクター（ＤＮＡ配列（１）を有するベクター）の相補が、該発現ベクターに欠けるエレメントの発現を行なう「相補ベクター」と呼ばれる他のベクターにより行なわれる。

ある場合には、発現ベクターに、マーカー即ち宿主細胞内での正のもしくは負の選択のための遺伝子、例えば特異な化学物質に耐性を有する遺伝子を導入するのが望ましい。

ＢＰＶＩ築の場合、上記遺伝子は細胞にメトトレキセート耐性を与えるｄｈｆｒ　（ジヒドロホーレート　リダクターゼ）をコードする遺伝子である。

上記選択遺伝子は細胞内でのベクターの取り扱いを可能とし、またある場合にはそれ自体の維持を可能とする。

酵母内での発現宿主ｍ胞が酵母の場合、発現エレメントは、主にプロモーターと可能ならばターミネータ−とからなる。之等のエレメントは、必須ではないが、宿主酵母の遺伝子プロモーター及びターミネータ−であるのが好ましい。宿主細胞がサツカロミセス　セレビシアエ（３ａｃｃｈａｒｏＯｌｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の場合、ＵＲＡ３遺伝子又はＰＧＫ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ）遺伝子のプロモーター及びターミネータ−が使用できる。

上記の場合、自己発現ベクターは、酵母内で複製可能でなければならず、そのためには例えば２μプラスミドの複製起点のような酵母の複製起点を有するが、例えば染色体起源の複製起点等の他の複製起点を用いることもできる。

本発明ベクターは、また好ましくは、選択遺伝子、例えばしｅｕ−又はｕｒａ一種を補うＬＥＵ２遺伝子又はＵＲＡ３遺伝子を含有することができる。

本発明ベクターは、自立ベクター（ａｕｔｏｎｏｍｕｏｓ　ｖｅｃｔｏｒ＞の形態、即ちプラスミドの形態をとってもよく、また酵母及び哺乳動物細胞染色体のいずれの真核細胞染色体に統合されていてもよい。この場合、ＤＮＡ（１）をコードするフラグメント、例えばプロモーター／遺伝子／ターミネータ−フラグメントを染色体内の−又はそれ以上のコピーに統合させることができる〔ウエワーら（Ｗ　ｅａｗｅｒ　ｅｔ　ａｔ　）１９８１）　。

本発明ベクターは、一般に細菌内で維持可能な付加的なエレメントを含有することができる。特にイー、コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ、ｏｒｉｅｃｏ）に機能する複製起点及び選択遺伝子、例えばアンピシリン等の抗生物質に耐性を有する遺伝子（ＡＩＤ”）を含有することができる。

之等のエレメントは、宿主細胞として細菌を利用する時にベクターの構築に有利である。ＤＮＡ（１’）が真核細胞内で発現される時、之等のエレメントは消去される。

かくして得られるベクターは、公知の方法により、対応する真核細胞の形質転換又はトランスフェクションに使用される。

例えば酵母の場合、上記トランスフェクションの方法としては、イト−ら（Ｈ，Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｔ、　、　１９８３）の方法を用い得る。この例では用いられる種は、サツカロミセス　セレビシアエ（３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から特に分離されたもの（ＴＧ　Ｙ　１　５ｏｌ）であるが、同種の他の菌株又は他の種（シゾサツカロミセス　ボンベス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅｓ）　、３．ウバナム（Ｓ。

ｕｖａｎｕｉ）　）も適当な宿主である。

哺乳動物細胞の場合、トランスフェクションは、例えばウィグラーら（Ｗｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、１９７８）ノ方法に従い細胞ＤＮＡを用いて、プロトプラスト融合方法により、ミクロインジェクション方法により実施でき、またベクターがウィルス性である場合、他の各種の方法が知られている。

哺乳動物宿主細胞は、変化させ得るが、用いるベクターに適したものでなければならない。

形質転換又はトランスフェクトされた細胞は、それらの生育に適した適当な培地で培養される。

培養後、細胞は採取され、狂犬病の抗原性蛋白は蛋白及び抗原の精製分野で公知の方法により単離される。

かくして製造される抗原は、古典的な方法に従って製造されるそれと同様に、狂犬病の処置及び予防に有用であり、また該狂犬病のインビトロでの診断にも使用できる。

本発明は、また狂犬病の抗原性蛋白の特異な形態にも関している。実際上、全生物界を通じて、蛋白のＮ−グルコシル化（アスパラギン残基上の）は、下記のよく知られた３つの関連性のあるファクターの最小限度によっている。

−直面するアスパラギン残基における一次構造Ａ　ｓｐ−Ｘ　−３ｅｒ又はＡ　Ｓｐ−Ｘ　−Ｔ　ｈｅｒの存在、ここでＸはアスパラテート及びプロリン以外の各種アミノ酸を示す。

−上記アスパラギン残基のグルコシルトランスフェラーゼに対する近接性、該トランスフェラーゼは、この配列にβ−へリックスタイプ（β−ｈｅｌｉｘ　ｔＶＯｅ）の二次構造が非常に頻繁に存在することを要求する。

−上記蛋白の小胞体へのシフト性、即ち万能プレカーサー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　）　（ｇｌｃ　）　＋ｌ　（ｆｌａｉｌ　）　９（（ＩＩｃ　ＮＡｃ　）　２−Ｐ−Ｐ−トリチル（ｄｏｌｉｃｈｙｌ　）の生合成及び転写（該蛋白のアスパラギン残基受容体に対する）のだめの酵素は該小胞体に局在する。

最初の例においては、上記後者の条件は、蛋白がシグナルペプチドを備えたプレカーサーの形態で合成される時に達成される。上記シグナルペプチドは、一般に成熟蛋白のアミン末端領域に局在する。事実、該シグナルペプチドの細胞質性翻訳複合体（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｃｏａＢ＋ｌｅｘ　）における合成は、尚曖昧ではあるが分子機構を通して、後者が小胞体の外膜に移動することを可能にする。小胞体の膜を通しての鎖延長の転座と共にポリペプチド合成が継続される。上記転座と緊密に連結して、小胞体において万能プレカーサー（ｇｌｃ　）３（Ｉｌｌａｌ’ｌ　）９（Ｎｃ　ＮＡｃ　）２−Ｐ。

−Ｆ＞−トリチルの、潜在的受容体アスパラギン残基への転移が起る。即ち、上記残基は最小限で上記した条件に適合する。

細胞が狂犬病ウィルスに感染される時、狂犬病の糖蛋白は、プレカーサーの形態に合成される。該プレカーサーは、主に疎水性の１９アミノ酸残基のアミノ末端シグナル配列からなる。

成熟蛋白において、２つのアスパラギン残基（２０４及び３１９）は、−次配列に存在する３つのＡＳＩ）　Ｘ　Ｓｅｒ／　Ｔ　ｈｒの一致した配列の内の２つに対応し、有効にグルコシル化される。

酵母内での発瑣ベクターにおいては、上述したように、狂犬病糖蛋白に対応するＣ　ＤＮＡは、シグナル配列を与えるプレカーサーの合成に必要な情報を含んでいる。

それが真核細胞である故に、酵母は特異的な後翻訳修飾（ｐｏｓｔ　−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を得るための、即ち、例えば狂犬病糖蛋白のＮ−グルコシル化を行なうための選択された宿主である。Ｍ母内での合成において糖蛋白プレカーサーが小胞体に伝達され、ここに該プレカーサ（ｇｌＣ２）（ｌｌｌａｎ）９　（ｇＩＣＮＡＣ）２　Ｐ　Ｐ−トリチルの合成及び転移のための酵素が局在すると想定することは不合理ではない。この場合、Ｎ−アセチルグルコサミン残基及びマンノース残基（もし引続き成熟化が起らないならグルコース残基と考えられる）の排他的Ｎ−グリコジル化が期待される。

上記理由により、本発明は、酵母のグリコジル化、殊にＳ、セレビシアエ種により行なわれるグリコジル化に関連した狂犬病の抗原性蛋白を包含している。

上記グリコジル化は、好ましくは２つのアスパラギン残基２０４及び３１９につき行なわれる。

この目的のために、酵母に移送するために用いられるベクターは、上述したものであり、これはそのＤＮＡ配列（１）内に、シグナル配列の１９アミノ酸残基をコードするアミノ−末端シグナル配列の全部又は一部を含有している。

最優に、本発明は、有効成分として、特に上記した狂犬病のグリコジル化された抗原性蛋白を含有するワクチン又は治療組成物に関している。

以下に示す例は、本発明の他の特徴及び利点を示すものであるが、本発明は之等に限定されるものではない。

添附の図面につき説明する。

第１図は、狂犬病糖蛋白をコードする遺伝子の構造を示す。

第２図は、ＳＶ４０ウィルスのＩ造を示す。

第３図は、ｐ（１１４７の合成を模式的に示す。

第４図は、ｐＴＧ１５０の合成を模式的に示す。

第５図は、ｐｓＶＴＧ１５１の合成を模式的に示す。

第６図は、相補ベクターｐＴＧ１５２の合成を模式的に示す。

第７図は、ｐＴＧ１５５の合成を模式的に示す。

第８図は、１ｌＴＧ１５５における糖蛋白のＯＤＮＡの５’　Ｇ／Ｃ末端の除去法を示す。

第９図は、５ＶＴＧ１７１の合成を模式的に示す。

第１０図は、Ｍｌ　３ＴＧ１４０の合成を模式的に示す。

第１１図は、ＢＰＶの簡素化された構造を示す。

第１２図は、プラスミドｐＭＯＰの簡素化された構造を示す。

第１３図は、ｄｅｆｒ遺伝子の発現ブロックでのｐＭＯＰの詳細な構造を示す。

第１４図は、ｏ　ＴＧｌ　５８−８ＡＬの合成を示す。

第１５図は、ｐＴＧ１７２の合成を示す。

第１６図は、ｐＴＧ８５６の合成を示す。

第１７図は、ＰＧＫプロモーターの末端の修飾を示す。

第１８図は、Ｗ９母プロモーター及び狂犬病遺伝子の間の結合のエレメント及び最終構造を示す。

第１９図は、酵母抽出物におｔプる狂犬病ウィルス糖蛋白ポリペプチドの特異的免疫沈降を示す。

第２０図は、３Ｔ３細胞抽出物から得られた免疫螢光図を示す。

各個においては、特に断わらない限り、以下の各物質及び方法を利用した。

種及びプラスミド用いた細菌種は、Ｅ、コリ一種１１０６＜ＳｕｏＥｈｓｄｓ　ｍｅｔ　５ｕｐＦ）である。ＴＧＹｌＳＤｌは、近接ＧＦＲ１８（ＭａｔｃｔＨｉｓ３−１　１− １５Ｌｅｕ２−３−１　２＞（ＦＩＮＫ　ｅｔ　ａｌ）と種ＴＧＹＩＯ−１（Ｍａｔα１Ｊｒａ３−２５１−３７３−３２８＞との交配によって得た単離物である。種ＴＧＹ１０−１は種ＦＬ１００　（ＡＴＣＣ２２８３）の相同性（１ｓｏｏｅｎｉｃ）　ｍ導体テｓル。

酵素及び化学物質用いた全ての酵素は、ベテスダ社（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　ｌ、二ｌ−ｚ’ングランド社Ｎ　ｅｗ　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　３１ｏｔａｂ　）製又はベーリンガー社　′（８ｏｒｈｉｅｎｇｅｒ　Ｍ　ａｎｈｅｉｎ）　％である。

用いたオリゴヌクレアーゼは、ニューイングランド社、ハナ　バイオロジック社（Ｈａｎａ　Ｂ　１ｏｌｏｑｉｃｓ）及びワシントン　バイオケミカル社（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｃａｌ）から入手したか又はコーリーら（Ｋｏｈｌｉ　ｅｔ　ａｔ）の方法に従い合成した。

放射活性な物質は、ラジオケミカル　センター　アメルシャム（ＲａｄｉｏｃｈｅＩＩｌｉｃａｌ　Ｑ　ｅｎｔｒｅ　Ａ　ｍｅｒｓｈａｍ　）から得た。

形質転換プラスミドによるＥ、コリー１１ｏ６の形質転換は、ダジャー及びエルリツｉ：　（Ｄａｇｅｒｔ　ａｎｄ　ｌ：ｈｒｌｉｃｈ、　１９７９　）の方法によった。

制限酵素の使用制限酵素は、製造者により特定された条件で用いた。他ノ酵素処！ｉ、ｔ、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、　１９８２　）に記載の方法により行なった。

各酵素処理の後、ＤＮＡをフェノールで抽出し、オクタツール／クロロホルム（１：８）で２回抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。小さいフラグメント（＜１００ｂｐ）の場合、エタノールによる沈澱の代りにジエチルエーテルで３回抽出した。

消化生成物の分析は、公知のアガロースゲル電気泳動法によった。

非ホスホリル化リンカ−の挿入は、次の方法によった。

リンカ−をＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス・ＨＣＱ、ＯＨ７，５，１１１１Ｍ　Ｎａ２ＥＤＴＡ）中に１１１１ｇ／７の濃度でとり、６５℃から４℃に冷却してプレハイブリダイズする。

３０ｎ　Ｍ　Ｎａ　ＣＱ　、３０ｎ　ｆｖ１トリス−ＨＣＱＩ）ｌ−１７，５，１ｎＭ　スペルミジン、０．２５＋＋Ｍ　ＡＴＰ、２ｍＭＤＴＴ、０．２１　Ｍ　Ｎａ　２　ＥＤＴＡ及び０．１１１（１／−生血溝アルブミンの濃度の緩衝液中で連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行なう。一般に、連結（１０〜１５μＱ）は、ＤＮＡ末端の８０倍モル以上のリンカ−を用いて、ターゲットＤＮＡｌ１１度０．１μＭで行なわれる。リガーゼは１００〜２００単位／−の濃度で利用され、連結は４℃で１６時間を要して実施される。過剰のリンカ−は、スペルミン（ツーブス及びマフラー（Ｈｏｏｐｅｓ　ａｎｄ　Ｍｃ　Ｃ１ｕｒｅ、１９８１　）　）を用いた沈澱によって移動する。ＤＮＡを次いで１０ＩＩＩＭトリスーＨＣＱｏ　Ｈ７，５，１１℃１Ｍ　Ｎａ２ＥＤＴＡ中に取り出し、次にハイブリダイゼーション緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｔ２Ｄ　Ｈ７，５，５ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ、１゜ＯＩＭ　Ｎａ　ＣＱ　）で希釈する。リンカ−のプレハイブリダイゼーションと同様にして再度ハイブリダイゼーションを行ない、整除数を直接Ｅ、コリーに形質転換させる。上記方法の基礎はラスら（ｌａｔｈｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　１９８３）に記載されでいる。

実施例１ＳＶ４０ウィルスを用いた発現１−狂犬病の抗原性蛋白をコードする遺伝子（以下狂犬病遺伝子という）のモンキー細胞内でのＳ４０による発現は、２つのベクターの相補に基づいている。そのひとつは、狂犬病遺伝子及びＳＶ４０ゲノムの蛋白を担っており、他はＳＶ４０ゲノムの相補蛋白を担っている。この目的のために、５２００ｂｐ（挿入のないＳＶ４０の大きざ）のオーダーの、互いに相補し合い包囲された（ｅｎｃａｇｓｉｄａｔｅｄ）　２つの小さなベクターを得る。

第２図に模式的に示されている猿のウィルスのゲノムは、グリッツイン（ＧｒｉＮｉｎ、　１９８１　）からのものであり、これは５２４３ｂｐからなる環状二重鎖ＤＮＡ分子である。

このゲノムは、我々の知る所では、複製起点０Ｒ１２つの抗原、Ｔ抗原及びも抗原をコードする光流領域、及びＶＰｌ、ＶＦ６及びＶＦ３を含む後流領域を含有している。

ｐＴＧ１４９の構築−第４図プラスミドｐ　ＢＲ３２７（ソベａンら（Ｓ　ｏｂｅｒｏｎ　ｅｔａｔ）、１９８０）を、ｌ−１ｉｎｄｌｌＩで消化させた。結合力のある末端を、クレノー（１（ｌｅｎｏｗ　）　ＤＮＡポリメラーゼ処理により相補させ、プラスミドを、５’　−ｄ　ＣＡＧＡＴＣＴＧ−３′オクタマ−ＢｇｌＩＩリンカーで結合させた。リンカ−末端の再ハイブリダイゼーション及びそのＥ、コリーへの形質転換の後、Ｂ（ＩＩＩＩを用いた復旧によって正しいプラスミドであることが実証された。

ＤＴＧ１４７の構築このベクターの構築を、第３図に模式的に示した。

出発プラスミドＩ）Ｋ１４は、ｐＢＲ３２２のＥＣ０Ｒ１−３ａｎ＋１−１１サイトに挿入された、ＳＶ４０起源のＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨ１フラグメントを含有している。

該ＳＶ４０フラグメントは、Ｋｐｎ１リンカ−オリゴヌクレオチドによってＨｐａｉ　−ｓａｍｔ−＋　ｉフラグメントに連結されたＥｃＯＲｌ−Ｈｐａ１ルミ１フラグメントっている。

ＳＶ４０の、直接に及び後に転写するためのポリアデニル化（Ａ）サイトは、Ｋｐｎ１サイト及びＢａｍＨ１サイトの側面にある。このプラスミドをＥｃｏＲ１ −８ａ１１フラグメントの形態でクローン化するためには、ＢａｍＨｌと３ａｌｌとのサイト（このフラグメントは既にベクターウィルスに存在している）を、除去する必要がある。更に該フラグメントの直接の繰返しは、インビボでの相同する組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　）によって削除される。

上記理由により、ｐ　Ｋ１４をＢａｍＨｌ及びＳ１ヌクレアーゼにより処理し、５ａ１１での消化及びＤＮＡポリメラーゼでの処理を行なって、５ａ１１での切断によって起る５′の延長を満たす。ＤＮＡリガーゼによる２つの末端の融合は、ＤＴＧ１４２の５ａ１１サイトの再構成を可能とする。

ＥｃｏＲ１サイト又はＫｐｎ１サイトのいずれかへの糖蛋白ＣＤＮＡの挿入が望ましいので、ｐ　ＢＲ３２８のＥＯＯＲ１サイトを使用する。このサイトは、クロラムフェニコール耐性遺伝子に局在するプラスミド遺伝子の内部サイトである。細菌内での糖蛋白の発現に関連した致死の問題に遭遇するので、ＥｃｏＲ１− ５ａ１１フラグメントを、対応するｐＢＲ３２２サイトに転移させてｐＴＧ１４３を得る。次いでＢ（ＩＩＩＩリンカ−を２つのＥＣ０Ｒ１及びＫｏｎ１サイト間に挿入し、アダプター法を利用して糖蛋白遭伝子を挿入する。

５’　ＧＡＴＣＴＧＣＡ３’　アダプターを中間体として用いることにより（ラスら（Ｌａｔｈｅ　ｅｔ　ａｔ）　、１９８３）、狂犬病糖蛋白を、アニリアニス（Ａｎｉｌｉａｎｉｓ、　１９８１　）により示されたプラスミドＩ）ＲＧ由来のＰｓｔＩ　−ＰｓｔＩフラグメントの形態で、ＢｇｌｌＩサイトに挿入することができる。

１）ＴＧ１５０の構築−第４図プラスミド１）ＴＧ１４７及びＤＴＧ１４９を、ＢｇｌＩ［で完全に消化させ、等モル量で混合し、結合させ、連結混合物をＥ、コリーの形質転換に使用する。

プラスミドｐＴＧ１５０は、Ｉ）ＴＧ１４９のＢｇｌＩＩサイトに挿入された狂犬病糖蛋白の完全なＣＤＮＡを有するプラスミドとして同定ｏ　ＴＧｌ　５０にＣ１ａ１を、またＳＶ４０にＨｐａｌＩをそれぞれ作用させ、次に制限酵素断片をリガーゼの存在下に放置することにより、プラスミドｐＴＧ１５０を、ｃ１ａ工消化フラグメントの形態で、ＳＶ４０ウィルスのＨｐａＩＩ制限酵素サイト（以下５Ｖ４０１と呼ぶ）に導入させた。

かくして１０．１ｋｂプラスミドｐＴＧ１５１を得た。

このプラスミドは、これを哺乳動物に導入するにはあまりに大きすぎた。この理由から、これをＢａ１ｌＨ１で線状にしたフラグメントの形態で用いた。このＢａ１ｌＨ１フラグメントは、実際に狂犬病糖蛋白遺伝子に加えて、プラスミドｐＴＧ１５２に相補的なＳＶ４０ゲノムの蛋白を含有していた。その構成については債述する。

ＤＴＧ１５２の構成−第６図プラスミドｐＴＧ１５２を、ｐ　ＢＲ３２７Ｄがら得た。

即ち、Ｅ、コリー（ｏｒｉ　−ｅｃｏ　）に機能的な複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含有するフラグメントを単離するために、ｏ　ＢＲ３２７ＤをＢａ１ｌｌＨ１及びｃｌａＩｒｉ化させた。このフラグメントを、ＳＶ４０をＢｃｌｌ及びＴａｇｌで消化させることにより得られたフラグメントと連結した。

かくしてプラスミド５ＶＴＧ１５１のＳＶ４０の完全な部分を含有する５、３ｋｂプラスミドｐＴＧ１５２を得た。

実施例２ベクター５ＶＴＧ１６０の合成−第７図プラスミドｐＴＧ１５５の合成プラスミドｐＴＧ１５０から始め、ＢｇｌＩＩを用いた部分消化及び引続＜ＭｓＢを用いた完全消化を行なった。合成二重鎖アダプターの存在下での連結により、８ｇ１ＩＩ及びｆｖｌｓｔＩ［サイトの融合及びｃ　ＤＮＡエレメントの５′ 末端のＧ／Ｃポリマーの削除を行なって、プラスミドを再構成した。上記アダプターは、第８図に式Ｂで示されている。上記プラスミドｐＴＧ１５５は、再構成された翻訳開始サイトを含んでいる。このサイ１−においてヌクレオチド　アデニンは、３位に局在し、真核細胞内での翻訳の開始のための一般に認められた配列に適合する。

上記プラスミドはｏＴＧ１５０と同様に処理され、かくしてベクター５ＶＴＧＩ　６０が得られる。

実施例３ベクター５ＶＴＧ１７１の合成−第９図このベクターは、狂犬病遺伝子に続いてイントロンを含有する点において上記とは異なっている。

該イントロンは、１）ＳＸＢＥＴＡ÷　（ウサギβグロブリン）由来のイントロンエである。該イントロンは、ｐｖｕ［−ＢａｌｉＨ１フラグメントの形態で除去され、Ｍ１３ファージ、この場合Ｍ１３ＴＧ１２０に、ｌ−１ｉｎｄＩＩ及び［３ａｍＨ１サイト間で導入される。かくしてイントロン■を含有するファージＭ１３ＴＧ１４０（第１０図）が収得され、これはｐＴＧ１４９の対応するサイト間に挿入されるためのＢｏｌｆｆ　−ＢａｍＨ１フラグメントの形態で回収される（上記参照）。

かくしてプラスミドｐＴＧ１７０が収得される。

ｐ　ＴＧｌ　７０及びｐＴＧ１５１（上記参照）をＢｇｌＩＩ及び３ａｌ■で消化させ、消化されたフラグメントを結合させることにより、プラスミドｐＴＧ１７１が得られる。これを上記したようにＢａｍＨＩで線状にして、ベクター５ＶＴＧ１７１を得る。

同様の条件下にｐＴＧ１６０を用いて、イントロンを含有するプラスミドを得ることができる。

哺乳動物細胞におけるｐＴＧ１５２に相補する異なるプラスミド５ＶＴＧ１７Ｌ　５ＶＴＧ１５１及び５ＶＴＧ１６０は、狂犬病の抗原性蛋白の収得を可能にする。

実施例４ＰＶＢからのベクターの製造］）プラスミドｏ　ＭＯＰ−第１１ル１２サイトに分け、２つの公知のフラグメント６９％及び３１％のそれぞれを得た（チェノら（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ）　。

１９８２、第１１図）。

この例で用いたＢＰＶ由来のベクターはｐＭＯＰと呼ばれる。これはＢＰＶのＢａｆｆ１Ｈ１サイトに、ＳＶ４０の光流プロモーターの制御下にジヒドロフォーレート　リダクターゼをコードするｄＭｒマーカーを導入することにより得られた（第１３図参照）。

このｐＭＯＰベクターは、更にアンピシリン耐性遺伝子を担うｐＢＲ３２２のフラグメントを有している。該フラグメントは、ラスキー及びボッチャン（　Ｌ　ｕｓｋｙ　ａｎｄＥ３ｏｃｈａｎ　、　１９８１　）に記載のプラスミドｐ　ＭＬ２起源のものである。第１３図は、ＩＩＭＯＰのＢａ１ｌ）−１１サイト間の詳細な構造を示したものである。しかし之等のエレメントは、ｄｈｆｒ遺伝子の発現を意図するものであり、本発明に必須のエレメントを構成するものではない。

２）プラスミドｐ　ＴＧｌ　５８ＳＡＬ−第１４図狂犬病の抗原性蛋白をコードする遺伝子は、プラスミド０丁Ｇ１４７に由来し、その構成は上述した通りである。

この遺伝子を、ｐＴＧ１４７の部分消化によりＢｇｌｌＩ−３ａｌＩフラグメントの形態で回収し、Ｂａ１ＩＩ／５ａｌＩで処理したプラスミドｏＴＧ３０１の対応するサイトに導入する。このプラスミドｐＴＧ３０１は、チミジン　キナーゼ（ｔｋ）遺伝子及びそのプロモーター＜ｐＣｋ　）を含有し、これはｐ　ＢＲ３２２の３ａ…Ｈ１サイトに、単純ヘルペスウィルスのＢａｍＨ　１　−ＢａｌＨ　１フラグメントを挿入し、ｔｋ遺伝子の除去の制限処理を行なうことにより得られた。

連結した生成物ｐＴＧ１５６は、その重要な部分として、チミジン　キナーゼ　プロモーターの制御下にある狂犬病遺伝子を含んでおり、該遺伝子はＳＶ４０ポリアデニル化サイト（Ａ）に続いている。

グロブリン　イントロンの導入を、ファージＭ１３ＴＧ１４０（上記参照）から始め、これをＢｇｌＩＩ−８ａｎＨ１フラグメントの形態で、対応するＢｇｌｆｆ　−　Ｂａ１ｌＩフラグメントを除去した後のｔ）ＴＧ１５６のＢａ１ｌＩサイトに挿入した。

上記除去によれば、狂犬病遺伝子が除去されるので、これを再度、ｐＴＧ１５６の単一ＢｇｌＩＩサイトに、ｐＴＧ１４７のＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントの形態で導入する。

かくしてプラスミドＤＴＧ１５８を得る。

該プラスミドの主要部分を、３ａｌニー５ａｌＩフラグメント（ｐＭＯＰにおける非常に希な単一サイト）の形態で回収せねばならないので、Ｍ１３ＴＧ１２０由来の小さいフラグメントであって３ａｌエサイトを有するフラグメントを、プロモーターの上流に、ＢａｍＨｌサイトで導入する。Ｍ１３ＴＧ１２０を、Ｂａ１Ｉ［及び３ｌｍＨＩで消化し、またｐＴＧ１５８をＢａｍＨＩで消化し、連結を行なってｐＴＧ１５８ＳＡＬを得る。

３）ベクターの合成−第１５図ｐＴＧ１５８及びｐＭＯＰを５ａｌＩで消化させ、連結して、プラスミド１）ＴＧ１７２を得る。これはｐＭＯＰに注目されるエレメントの結合と共に、ｐｔｋプロモーターの制御下にあり、且つβグロブリン　イントロンで終結する狂犬病遺伝子及びポリアデニル化サイトを有している。

哺乳動物細胞のトランスフェクションによれば、このベクターは、以下に示すように狂犬病の抗原性蛋白を生産する。

実施例５３Ｔ３Ｎ　］　ＨＡ細胞の形質転換（マウス　フィブロラスト（ｆｉｂｒｏｌａｓｔｅｓ　））形質転換のために、起源ｐＭＯＰプラスミド及びプラスミドｐ　ＴＧＩ　７２を使用する。

細胞を直径１０ｃｍのベトリデイツシュで、８ｘ１０５ｍ胞／’ｊ）Ｌｔヘツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　）培地＋１０％ＮＢＣ３　（Ａｉｒ生牛血清）十抗生物質の濃度で培養する。

２４時間の培養後、ウィグラーら（　Ｗ　１ｇ１ｅｒ　ｅｔ　ａｔ。

１９７８）の方法に従い、ベクターを用いてトランスフェクションを行なう。

トランスフェクションの２４時間後、培地を取り替える。

メトトレキセートを含む選択培地上で、サブ培養を行なう。

２〜３週間後、コロニー形成細胞が固定され、イムノフルオレッセンスを利用して抗原の生成が確認される。

３７３ｉ１１１胞ラインを、下記精製ＤＮＡでトランスフェクトさせる。

ａ）プラスミドｐ　ＴＧｌ　７　２−０　（ｐ　ＭＯＰ　：ベクター３　Ｐ　Ｖ　ｄｈｆｒ”　、他（Ｄｔ１人ナシ）ｂ　）７ラスミドｐＴＧ１　７２−狂犬病（ＢＰＶＴＧｌ　７２　：ベクターＢ　Ｐ　Ｖ　ｄＭｒ”　、狂犬病糖蛋白発現のための各種エレメントを挿入）プラスミドを含有し、それ故メトトレキセート耐性（ｄｈｆｒ”　）である１１Ｉ胞由来のコロニーを、アセトンを用いて固定する。狂犬病糖蛋白の発現は、該糖蛋白に対するモノクローナル抗体（ｎｏ．　５０９−６）及びこの第一の抗体に対する第二の螢光抗体を用いた継続処理により観察できる。

倍率：約１０００倍実施例６狂　糖　遺伝　を含有するプラスミドｐＴ８５６の構築−第１６図酵母及びＥ、コリー（シエバリールら（（：、　ｈｅｖａｌｌ　１ｅｒｅｔ　ａｔ）　、１９８０）の両者で複製可能なプラスミド（ｐＦＬｌ＞のＢａｏ＋ＨＩサイトでランダムに切断＜５ａｕ３Ａで部分消化）したフラグメントの統合によって得た染色体ＤＮＡのバンクから、酵母ＰＧＫ遺伝子を単離した。

ＰＧＫ遺伝子を含むフラグメントの検出は、細菌コロニーのハイブリダイゼーション、上記バンクの特異的プローブ（５’　−ＴＧＴＴＴＡＧＴＴＴＡＧＴＡＧＡＡＣＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＴＴ−３’　）（ｖニアテイスら（ＭａｎｉａｔｉＳｅｔ　ａｔ）、　１９８２）による形質転換により行なった。

ＰＧＫ遺伝子の５′領域を、ｐ　ＢＲ３２２内においてＨｉｎｄ　ｍ−３ａｌＩフラグメント（２，３ｋｂ）の形態で、再度クローン化した。

上記フラグメントは、ＰＧＫ遺伝子の転写開始（プロモーター）の制御下に含まれる全配列と、コードされた配列の開始部分を有している〈フイツツマンら（Ｈｉｔｚｍａｎ　ｅｔａｌ）、１９８２）。

ＰＧＫをコードする配列の開始ＡＴＧを壊すＢ　１ｇＩＩサイトは、インビトロでの変異誘発により創製した（スミス及びギルラム（Ｓａ＋１ｔｈａｎｄ　Ｑｉｌｌａｌ）　、　１９７９　）　（第１７図）。

更に、上記コード配列の末端（３′　）及びＰＧＫ転写の終結シグナルを含むＥＣＯＲｌ−Ｈｌｎｄ　ｌ［フラグメント（０゜５ｋｂ）を、クレノー　ポリメラーゼで処理し、上記節に記載したプラスミドの単−ｐＶ１１［サイトと連結した。

これにより、再構成されたＥＣ０ＲＩサイトは、壊されたＨ　ｉｎｌ［［サイトの上流に位置する。この新しく合成されたフラグメントは、ＰＧＫ遺伝子をコードする部分に局在するＢｏｌＩＩサイトを含んでいる。２つのＢｇｌＩＩサイト間フラグメント、即ち新たに創製したＰＧＫプロモーターの下流及び終結因子の上流、の削除によって単一のＢＩＩＩＩＩＩサイトを残し、これによって発現を望まれる遺伝子のクローン化が可能である。

ＰＧＫ遺伝子のプロモータ一部分、Ｓｇｌ］Ｉサイト、ＰＧＫ遺伝子の終結部分、ｐＢＲ３２２の複製起点及びアンピシリン耐性を及ぼすＡ　ｍｔ＋Ｒ遺伝子の配列部分を含むＨｉｎｄ　ｍ　−ＰｓｔＩフラグメントを、プラスミドｉｌ　ＪＤＢ２０７のＨｉｎｄ　ｍ　−Ｐｓｔに型温化により得られる最大のフラグメントと連結して、Ａ　ＩｐＲ遺伝子の再構築を行なツた（ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）　、　１９８１　）　（第１６図参照）。

得られたプラスミド（ｐＴＧ８４１）は、酵母のＬＥｔ、１２遺伝子、Ｅ、コリーＡ　ｍｐｌ？遺伝子、酵母２μプラスミドのＲＥＰ３遺伝子、酵母２μプラスミドの複製起点、ｏ　ＢＲ３２２の複製起点、及び酵母ＰＧＫ遺伝子のプロモーター及び終結因子を有している。

酵母ＵＲＡ３遺伝子（ヨーロッパ特許第７８／３２１０号）を含む１　、１　ｋｂＨｉｎｄ　ｍフラグメントを、Ｐｓ【エサイｐ　ＴＧ９０２のｔ−１ｉｎｄＩ［［サイトにてクローン化して、プラスミドｐＴＧ８０２を得た。該プラスミドのＤＮＡを、ＵＲＡ３遺伝子の非−コード５′領域に局在する単一のｐｓｔＩサイトにて切断して線状とし、タレノー　ポリメラーゼ処理してＰＳｔＩ消化により遊離させたプラントエンドを作成し、次いでファージＴ４リガーゼの作用により再環状化させた。かくして修飾（ＰＳｔＩサイトな消去する）された１　、　１　ｋｂＨｉｎｄ　ＩＩ［７ラグメントを、プ、ラスミドＤＴＧ８４１の単一のＨｉｎｄＩ［ｌサイトと結合させた。これによりＬＩＲＡ３遺伝子の転写命令は、ＰＧＫのそれとは異なるものとなる（プラスミドｐ　ＴＧ８４９）。かくしてプラスミドＥＩＴＧ８４９は、修飾されたＵＲＡ３遺伝子の存在に加えて、ｐＴＧ８４１と、同一の特性を有する。

狂犬病糖蛋白ＣＤＮＡを、全コード配列とポリｄ　Ｇｄ　Ｃ末端を有するＢａ１ＩＩフラグメントの形態で単離した。該コード配列の開始（５′　）点にＭｓｔＩＩサイトを位置させ、開始因子ＡＴＧのＡに続く７つと８つのヌクレオチドの間で酵素切断を行なった。該遺伝子の５′領域にあるＢｇｌｆｆ−ＭＳｔｌＩフラグメントの代替のために合成配列を作成し、これにより上記ポリｄ　Ｇｄ　Ｃ５’末端を、酵母のメセンジャ−ＲＮＡの翻訳されない配列に近似する配列に置き換える（第１７図を参照）。

かくして修飾されたＢ！ＩＩＩＩＩサイトを、ｐＴＧ８４．９の単一の８ｐｌＩＩサイトと結合させて、狂犬病糖蛋白の翻訳命令をＰＧＫのそれと同一とする。

実施例７酵母内での狂犬病ウィルス糖蛋白ポリペプチドのプラスミドｐＴＧ８５６を、Ｓ、セレビシアエ（Ｓ。

ｃｅｒｅｖ　ｉ　ｓ　ｉ　ａｅ　）種ＴＧＹ１ｓｐ１に、リチウム塩法（イト− ら（Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ）、　１９８３）に従い導入する。

同一種を、ｐ　ＴＧ８４９で形質転換させる。該ｐＴＧ８４９は、糖蛋白遺伝子を含まない以外は、上記ｐＴＧ８５６と同じプラスミドである。これらの各種をウラシルを含まない培地２５−で培養して、プラスミドを安定化させる。

３５．５放射活性システインを加えて、酵母蛋白をラベルする。

細胞を以下の緩衝液を用いて粉砕する。

２５０μＱ：２５１Ｍトリス・ＨＣｆ！　ＤＨ７，５１０ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ　ＤＨ８２５０μＱ：１Ｍ　ＫＣＱ０．　ＩＭ　ｔ−ＩＪス−ＨＣＱ　１１　Ｈ８，８２％トソトンＸ１００５μＱ：ＰＭＳＦ　フェニルメチルスルフリルフルオライド５μＱ：大豆トリプシン阻害剤１０ｍｇ７ＩＩ１１００ｅＭ　ヨードアセトアミド１０ｍＭ　Ｎ−工、チルマレイミド１ｏＩＩＩＭ　１，１０−フェナンスロリン５μＱ：　ＤＮＡ５ｅＩ　（０，５ｍｇ／ｍＱ）放射活性蛋白を含む上記各粉砕物の上清を、−夜４℃でウサギ血１５μＱを用いてインキュベートする。二つの血清が糖蛋白に対して向けられ（バッチ２７２６及び２５２７）、一つの血清が全ウィルスに対して向けられる（バッチ２７２５）、蛋白Ａ−セファローズ（ファルマシアＣＬ〜４Ｂ）５０μＱを加える。インキュベーション後、ペレットを第１の緩衝液（０，５Ｍ　ＫＣＱ：１０ｍＭ　トリス−ＨＣＱ　ｐＨ８，８：０．５％　トリトンＸ１ｏｏ）で４回、次いで第２の緩衝液（１０ｉＭ　トリス・ＨＣＱＬｌ−１８，８）で３回それぞれ洗浄する。ベレットを変性緩衝液（６２ｍＭ　トリス−ＨＣＱ　Ｉ）Ｈ６，８：２％ＳＤＳ　；　５％　β−メルカプトエタノール＋０．０１％ブロモフェノールブルー）中で１００℃で１０分間インキュベートする。抽出物を次いでラエメリ（Ｌｅａｌｌｌ！ｌｌｉ。

１９７０）の方法に従い、ポリアクリルアミドゲル上で分析する。該ゲルを感光フィルムに曝した後、用像して、蛋白に対応する異なるバンドを観察する（第１９図参照）。

特に、ｐ　ＴＧ８５６　（ａ　）及び（ｂ）を担う種の抽出物においては、矢印で示された、分子量約６５０００の強度にラベルされたバンドが認められ、これはｐＴＧ８４９＜Ｃ＞及び（ｄ）を担う種の抽出物には認められない。該分子ｌが、狂犬病ウィルス蛋白のものであると考えられる。

以下の種を、パスツール　インステイチュート（Ｐａ５ｔｅｕｒ　ｌ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）のコレクチオン　ナシオナルド　カルチャー　ド　マイクロオーガニズムス（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｔｅ　ｄｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｄｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ　、　ＣＮ　ＣＭ　）に、１９８３年９月３０日に寄託した。

Ｅ、コリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　１１０６／ｐ　ＴＧ　１５２ｎｏ、１２４７Ｅ、コリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　１１０６／ｐ　ＴＧ　１７１ｎｏ、Ｉ２４８Ｅ、コリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　１１０６／ｐ　ＴＧ　１７２ｎｏ、Ｉ２４９　。

Ｓ、セレビシアエ（３、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｔ　Ｇ　Ｙ　１　ｓｐ　１　／ｐＴＧ８５６　ｎｏ、Ｉ　２５０プラスミドｐＫ１４．ｐＭＯＰ及びｐＳＸＢＥＴＡは、ブリースナツバ（Ｒ、８ｒｅａｔｈｎａｃｈ　）より供与をうけた。

実施例８狂犬病ウィルス糖蛋白が酵母内で発現され、その免疫沈降により検出されることを試験するため、これを確実にグリコジル化し、該糖蛋白にエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨを、インビトロで作用させた。更に酵母で発現された糖蛋白に、インビボでツニカマイシンを作用させる試験を行なった。

エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨは、以下の３つの条件が満たされれば、アスパラギン残基に結合したＮ−アセチルシチビオーゼ（Ｎ　−ａｃｅｔｙｌｃ旧ｔｉｂｉＱｓｅ）基のＮ−アセチルグルコサミン残基相互の結合を創製する。

−グルコシル化された基は、自然に中性でなれければならない。即ち、該蟇はＮ −７セチルシチビオーゼに加えて、排他的にマンノース残基力；らなっている（糖蛋白に見られる如く）。

−Ｎ−アセチルシチビオーゼ基と結合するマンノース残基は最低５つなければならない。

−グルコシル化された基は、酵素エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨと近づきゃすくなければならない。もし問題の蛋白が不一致である場合、これは事実ではないが、エンドＨの酵素作用は部分的に変性された条件下（０，５％ＳＤＳ、５０ｍ　Ｍβ−メルカプトエタノール）に、行なわれなければならない。

実験手順予めその蛋白を（３５Ｓ）−メチオニンでラベルした（１１５Ｃｉ　／ｍｍｏｌの割合で２５４μＣｉで１０分ラベルした）ｔＩＡ胞（分離されたＴＨＹ２ｓｐｌ　３ｂ　、　ＨｉＳ−の代りに１ｅｕ−である以外、狂犬病糖蛋白を発現する力＼合力Ｘ、即ちｐＴＧ８５６で形質転換されたか又はｏＴＧ８４９で形質転換されたかに拘わらすＴＧＹｌと同じ）を、対数増殖期に収穫（ＹＮＢＧ培地×２０μｇ／ＩＩＩＣＪ）シ、１２．５ｍＭ　ｔ−リス・ＨＣｆ２　ｐＨ７，５，５信Ｍ　ＥＤＴＡｐＨ８，０，５Ｍ　ＫＣＱ、５０Ｉｌ１Ｍ　トリス・Ｈ（１ｐＨ８，８，１％トリトンｘ１００．２ｍＭ　ＰＭＳ’Ｆ及び２．５μ（ｌ　ＤＮＡ５ｅＩ添加の緩衝液に再懸濁させる。

ガラスピーズを用いて細胞を粉砕し、温和な遠心分離４ｘＩＱ６ｃｐｍを行なった後、整除数に相当する上清を、狂犬病糖蛋白に対するウサギポリ抗体（血清）ｎｏ、２１５の５μＱを用いて免疫沈降させた（４℃、１６時間）。

蛋白Ａセファロース８ｍｇを添加し、ｖ温で１時間インキュベートした後、遠心分離して得られた蛋白Ａセファロースノヘレットヲ、ＢＳＡ　０．１＋ａ／ｍＱ、０．２７Ｍ　クエン酸Ｎａ　ｐＨ５，５，５０ｍＭ　β−メルカプトエタノールを含む０．５％　ＳＯ８緩衝液２００μＱに再懸濁させた。懸濁液を１００℃ で１０分間加熱した後、各１００１１Ｑの２つのフラクションを形成させた。その一つにエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ１μＱ（５０ナノグラム）を加え、各フラクションを次いで３７℃で１６時間インキュベートした。

上記２つのフラクションにつき、水溶液形態で０．５％ＳＤＳに対して各種の分析を行なった。試料の最Ｉｌ！濃度を、次いでＳＤＳにつき２％及びβ−メルカプトエタノールにつき５％とした。各フラクションを１０分間煮沸し、次いで１０％強度のポリアクリルアミドゲル上に置いた。

分析の結果、酵母で得られた狂犬病糖蛋白のサブユニットの分子岱は、エンド− β−Ｎ−７セチルグルコサミニダーゼＨにより約５０００ダルトン（エンドＨなしでは６３０００及びエンドＨ作用後５８０００）減少することが判った。これは、Ｅ、′コリーで発現された成熟糖蛋白の分子債に相当する。

用いた試験条件下では、エンドＨの不純物による蛋白分解活性は認められない。

ストレプトマイセス　リソスーベリフイカス（３ｔｒｅｐｔｏｉｙｃｅｓ　１ｙｓｏｓｕｐｅｒｉｆｉｃｕｓ　）から製造される関連構造混合物であるツニカマイシンは、ブレカーナー（ｇｌｃ　）２　（ｍａｎ　）９　（ｇＩＱ　ＮＡＣ）２　Ｐ−Ｐ−トリチルの合成における第一段階を阻害する。

そのインビボにあける作用は、良く知られており、糖蛋白プレカーサーが、証明されるべきアスパラギン残基上の糖を完全に除去することを可能とする。

実験手順ＹＮＢＧ＋ロイシン２０ｕ（１／ｄ上で対数増殖期にある酵母種（狂犬病糖蛋白を発現するか又はしないＴＧＹ２ｓｐ１３ｂ）を、ツニカマイシン（１５μａ／＋ｎＱ’）を用いて３０分間ブレインキュベートする。この予備試験で用いた種は、この濃度、この培地では全く生育しないことが示された。

上記ブレインキュベーションの後、（３５８）−メチオニン（１１１５Ｃｉ　／ｍｍｏｌの割合で２５４μＣ１）を、培地に加え、細胞をラベル１０分後に収穫した。これを１２．５１Ｍ　トリス−ＨＣＧ！　ｏ　Ｈ７，５，５ｒＡＭＥＤＴＡ　ｐＨ８，０，５Ｍ　ＫＣＱ、５０ｎ＋Ｍ　ｔ−リス−ＨＣＱ　Ｉ）Ｈ８，８，１％　トリトン×１００．２１０ＭＰＭＳＦ及び２．５ＭｇＤＮＡｓｅＩの！！函液に再懸濁させた。

ガラスピーズを用いて細胞を粉砕し、温和な遠心分離、２ｘ　１０６ＣＣ１１、を行なった後、整除数に相当する上溝を、天然の狂犬病糖蛋白に対するウサギポリ抗血清ｎｏ、２１５の５μＱを用いて免疫沈降させた（４℃、１６時間）。

蛋白Ａセファロース８ｎ＋ｇを添加し、至温で１時間インキュベートした後、遠心分離して得られた蛋白Ａセファロースのベレットを、０．５Ｍ　ＫＧ＋１．１０ＩＩＭ　ｔ−リス・１−ＩＣＧ！　ＤＨ８，８，０，５％　トリトンｘｉｏｏで３回洗浄し、次いで１０＋ｎＭ　トリス・ＨＣＱ　Ｄ　Ｈ８，８で３回洗浄した。最俄にベレットを、変性混合物（１０％ＳＤＳ、２５％　β−メルカプトエタノール、５０％　グリセロール、０．３２５Ｍ　トリス・ＨＣＱ　ｐＨ６，８＞３０μＱに再懸濁させ、１０分間煮沸し、次いで１０％強度のポリアクリルアミドゲル上に置いた。

分析の結果、インビボにおいてツニカマイシン（インビトロにおけるエンド−β −Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨの作用と正確に同様である）は、Ｗ！ｆ母内で製造された狂犬病！？Ｊ白のサブユニットの分子０を約５０００ダルトン減少させることが判った。

２つの全く異なる方法、即ちインビトロにおけるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコザミニダーぜＨ及びインごボにおけるツニカマイシン、を用いた上記結果の同一性より、ＦｆｆＲで産生される狂犬病ウィルス糖蛋白は、真正にグリコジル化されていることが判る。

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（ＭＩＹＡＮＯＨＡＣＡ、Ａ、、ＴＯＨ−Ｅ、Ｃ。

ＮＡＺＡＫ　１．Ｆ、ＮＡＭＡＤＡ、Ｎ、ＯＫＴＯＭＯａｎｄ　Ｋ　、　Ｍ　Ａ　Ｔ　Ｓ　ＩＪ　Ｂ　Ａ　Ｒ△（１９８３）　、Ｐｒｏｃ　。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ　、３ｃｉ、ＵＳＡ８０，１．５）☆ブロック、ナットル、アカデ、ソシ、（ＯＲＲ。

ＷＥＡＮＥＲＴ、Ｌ、、５ＺＯ３ＴＡＫ　Ｊ、Ｗ、。

ＲＯＴＨ８Ｔ’ＥＩＮ　Ｒ，Ｊ、（１９８１）、Ｐｒｏｃ。

☆ジーン（ＳＯＢＥＲＯＮ　ｅｉ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　９．２８７−＊ネーチャー（ＶＡＬＥＮＳＵＥＬＡ　Ｐ、、Ａ。

ＭＥＤ　ＩＮＡ、Ｗ、ＲＵＴＴＥＲ，Ｇ、ＡＭＭＥＲＥＲａｎｄ　Ｂ、Ｄ、ＨＡＬＬ、Ｎａｔｕｒｅ　２９８，３４７−＊ｔル（ＷＩＧＬＥＲｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ　、　ｖｏｌ、１４゜（Ｃｏ（、）ＳＥＲＬＥＬＪ　５ＥＲ５’　−ＡＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＣ３’ｇｌＨ５’−ＡＧＡＴＣＴ　ＡＡＴＡＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴ−３’国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１真核細胞内で狂犬病の抗原性蛋白を発現するベクターであつて、少なくとも狂犬病の抗原性蛋白をコードするＤＮＡ配列（１）及び上記配列を真核細胞内で発現させるためのエレメントを含有するベクター。２真核細胞の複製起点の少なくともひとつを含有する自己発現型ベクターある請求の範囲第１項に記載のベクタ３ＤＮＡ配列（１）がＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ間にある請求の範囲第１項又は第２項に記載のベクター。４ウイルスの複製起点の少なくともひとつを含有する自己発現型ベクターである請求の範囲第２項又は第３項に記載のベクター。５複製起点がＳＶ４０又はＢＰＶウイルスのものである請求の範囲第４項に記載のベクター。６発現エレメントがウイルスのＤＮＡに由来するものである請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の発現ベクター。７発現エレメントがＳＶ４０ウイルスのプロモーターの全部又は少なくとも一部を含む請求の範囲第６項に記載の発現ベクター。８発現エレメントが単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターの全部又は少なくとも一部を含む請求の範囲第６項に記載のベクター。９真核細胞内で発現されるマーカー遺伝子を更に含んでいる請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のベクター１０ＤＮＡ配列（１）がイントロンに続いている請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載のベクター。１１ＤＮＡ配列（１）がボリアデニル化サイトに続いている請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載のベクター１２それぞれＳＶ４０複製起点を含有し、且つ一方がＳＶ４０プロモーターの制御下にあるＤＮＡ配列（１）及びＳＶ４０ゲノムの一部分を、また他方が上記ゲノムの相補部分をそれぞれ含有する２つの相補的ベクターからなる発現ベクターである請求の範囲第６項に記載の発現ベクター。１３相補ベクターの一方がＳＶ４０の複製起点に加えて少なくともＳＶ４０の後流遺伝子領域の全部を含有し、また実際の発現ベクターがＳＶ４０の複製起点及びＤＮＡ配列（１）に加えて、少なくともＳＶ４０の先流遺伝子領域の全部及びＤＮＡ（１）遺伝子を発現させるエレメントを含有する特許請求の範囲第１２項に記載の発現ベクター。１４用いられる各ベクターがベクターＳＶＴＧ１５１及び相補ベクターｐＴＧ１５２であるか又はベクターＳＶＴＧ１６０及び相補ベクターｐＴＧ１５２である請求の範囲第１２項に記載の発現ベクター。１５用いられる各ベクターがベクターＳＶＴＧ１７１及びベクターｐＴＧ１５２である請求の範囲第１２項に記載の発現ベクター。１６ＢＰＶゲノムの全部又は一部と共に、ウイルスプロモーターの全部又は一部、ＤＮＡ配列（１）、イントロン及びボリアデニル化サイトをこの順序で含む配列、を含有する特許請求の範囲第４項に記載の発現ベクター。１７プロモーターが単純ヘルペスのチミジンキナーゼ遺伝子プロモーターであり、イントロンがβ−グロブリンイントロンであり、且つボリアデニル化サイトがＳＶ４０先流ボリアデニル化サイトである請求の範囲第１６項に記載のベクター。１８ベクターｐＴＧ１７２である請求の範囲第１項に記載のベクター。１９酵母の複製起点を含むブラスミドである請求の範囲第２項又は第３項に記載のベクター。２０２μブラスミドの複製起点である請求の範囲第１９項に記載のベクター。２１発現エレメントが酵母由来のものである請求の範囲第１〜３項並びに第１９及び２０項のいずれかに記載のべクター。２２発現エレメントが少なくともＵＲＡ３プロモーター又はホスホログリセレートキナーゼプロモーターからなる請求の範囲第２１項に記載のベクター。２３発現エレメントがＵＲＡ３遺伝子又はホスホログリセレートキナーゼの終結因子を含む請求の範囲第２１項又は第２２項に記載のベクター。２４マーカー遺伝子を含む請求の範囲第１９〜２３項のいずれかに記載のベクター。２５ブラスミドｐＴＧ８５６である請求の範囲第１９〜２４項のいずれかに記載のベクター。２６細菌における複製起点及び細菌内で発現される抗生物質耐性遺伝子を含む請求の範囲第１〜２５項のいずれかに記載のベクター。２７請求の範囲第２６項に記載のトランスフエクトされた細胞を培養し、蛋白を単離することを特徴とする狂犬病の抗原性蛋白の製造方法。２８請求の範囲第２７項に記載の方法を行なって得られる狂犬病の抗原性蛋白。２９醇母によりグリコシル化された蛋白である請求の範囲第２８項に記載の狂犬病の抗原性蛋白。３０グリコシル化が先の特許の請求の範囲のひとつに従うプラスミドにより形質転換されたサツカロミセスセレヒシアエ種によって行なわれた請求の範囲第２９項に記載の蛋白。３１アスバラギン残基２０４及び３１９でグリコシル化された請求の範囲第２９項又は第３０項に記載の蛋白。３２少なくとも請求の範囲第２８〜３１項のいずれかに記載の蛋白を有効成分として含有するワクチン又は治療組成物。