【発明の詳細な説明】
ＥＡ−ウィルス ゲノム配列を含んだ組換えＤＮＡベクター
本発明は、ＥＡ-ウィルスゲノム(馬動脈炎ウィルス:equine arteritis virus)
の少なくとも一部と相補的なＤＮＡ配列(ＤＮＡ sequence)(-ＤＮＡ)を含有する
組換えＤＮＡベクターに関するものである。このＤＮＡベクターは、ＤＮＡ配列
(-ＤＮＡ)の３'末端(3'end)に隣接して、非-ＥＡウィルス特異ＲＮＡポリメラー
ゼ(non-ＥＡ virus-specific ＲＮＡ polymerase)に対する非-ＥＡウィルス特異
プロモータ(non-ＥＡ-virus-specific promotor)を有するものであり、このベク
ターをリニア化(linearization)した後に非-ＥＡウィルス特異ＲＮＡポリメラー
ゼにてＤＮＡ(-ＤＮＡ)に転写(transcription)すると、ウイルス寄主細胞(virus
host cell)に感染性(infectious)のある+ＲＮＡになる。このＤＮＡ(-ＤＮＡ)
は、前記ゲノムの一部と相補的なＤＮＡ(+ＤＮＡ)配列を含有するＤＮＡあり、
この相補ＤＮＡ配列(+ＤＮＡ)は、第１配列(first sequence)と、第１配列の５'
末端に隣接した第２配列(second sequence)とを含有している。第１配列は、Ｓ
ＥＱ nr.1で表される配列であるか、あるいは遺伝子工学にて(genetically eng
ineered)得られるその誘導体(infectious derivative)であり、第２配列はＳＥ
Ｑ nr.2で表される配列か、あるいはその機能的な誘導体(functional derivativ
e)である。ＳＥＱ nr.1とＳＥＱ nr.2からなる相補ＤＮＡ(+ＤＮＡ)を含有する
ＤＮＡベクターは、Ｅ コリ Ｋ12ＰＣ2495株(ファバゲンコレクション(Phabag
en Collection)、ウトレヒト大学、私書箱80.056,3508号 ＴＢ ウトレヒト、
オランダ)をベクター寄主細胞として維持が可能である。分離(isolation)した後
、非-ＥＡウィルス特異プロモータであるＴ７プロモーター(ＳＥＱ nr.3))と非
-ＥＡウィルス特異ＲＮＡポリメラーゼであるＴ７ポリメラーゼとによってイン
ビトロで転写されると(in vitro transcription reaction)、寄主細胞であるハ
ムスター胎児腎細胞 ＢＨＫ-21(Ｃ13)株(ＡＴＣＣ ＣＣＬ10)に感染性を有す
る＋ＲＮＡを製造できて、ウイルス粒子(virusparticles)と、このベクターの遺
伝子工学的に製造された誘導体を生成できる。この誘導体は、成熟核において複
製(replication)することができるＲＮＡ転写生成物である。
馬動脈炎ウィルス(ＥＡウィルス)は、現在知られている限りにあっては馬と驢
馬にのみ
見られる天然のウイルスであるが、他の哺乳動物由来の培養細胞株で複製するこ
とができる。ＥＡウィルス染色体(genome)は、ＲＮＡ鎖（ＲＮＡ strand)である
。このＲＮＡは、１本の、ポジティブ(+)鎖(single，positive strand)である。
よって、このＲＮＡは、ウィルス寄主細胞に導入されると直ちに翻訳(translati
on)できる。すなわち、寄主細胞のリボゾームはこのＲＮＡに基づいて複数の蛋
白質を製造することができる。このＲＮＡ鎖がコードする第１番目の蛋白質は、
ＥΛウイルスレプリカーゼ(replicase)であり、ポジティブＲＮＡ鎖からネガテ
ィブコピー鎖(negatively stranded copy)を生成することができるＲＮＡポリメ
ラーゼである。ポジティブＲＮＡ鎖の場合と全く同様に、このネガティブコピー
鎖は、その３'末端に、レプリカーゼに対して非常に選択的な作用ポイント(poin
t of action)として機能するヌクレオチド配列を含有している。ＥＡウィルスの
ポジティブ染色体ＲＮＡは、キャプシド(capsids)と膜とによって囲まれている
。他のウィルスにあっては、ＲＮＡ鎖の末端がウィルス粒子の形成過程において
非常に重要であることが知られている。
ＥＡウィルスのヌクレオチド配列のおよその全貌は、公知である(デブーン、J
.A.他、，ジェイ.ビロル(J.Virol.)、1991年、65巻，2910-2920ページに"ＳＥＱ
nr.1"として記載)。この配列は、逆転写酵素(reverse transcriptase)にて得
られるｃＤＮＡを含有する多数のクローン(clone)を配列することにより決定さ
れた。ｃＤＮＡの様々なフラグメント(fragments)がオーバーラップしており、
これにより、ほぼ完全な配列として決定された。。
逆転写酵素は、相補ＤＮＡを合成過程で比較的多くのエラーを起こすので、結
果として得られる配列は、必ずしも最初に使用したＲＮＡに対応していない。逆
転写酵素作用は、ポジティブ ＥＡウィルスＲＮＡの５'末端に至る前に、終結
する傾向がある。よって、ｃＤＮＡ(-ＤＮＡ)は３'末端で不完全な状態となり、
このヌクレオチドの配列決定は非常に困難である。上述したように、ＲＮＡ鎖の
末端部は非常に重要である。
ＥＡＶレプリカーゼもまた、ポジティブ鎖及びネガティブＲＮＡ鎖を複製する
過程でエラーを発生させることがあり、そのために、非感染性のウィルスミュー
タント(non-infectious virus mutant)ができることがある。これらのものを、
周知手法にてベクター寄主細胞を形質変換(transform)するために使用されるｃ
ＤＮＡ製造時に使用すると、転写された+ＲＮＡ
が感染性ではないベクターが得られる。
原理的には、ｃＤＮＡフラグメントのすべてをウィルス+ＲＮＡ配列に対応さ
せて正確に配置するという遺伝子工学な過程を介してクローンを製造することは
可能であるが、非常に面倒である。事実、現在までのところ実現はしていない。
まず、ヌクレオチドの欠失に関する情報が不足しているからである。第２に、得
られたクローンを+ＲＮＡの製造に使用すると、得られた+ＲＮＡが感染性を失う
ことがある、という上述したような危険性を有しているからである。第３に、得
られたクローンが、選択したベクター寄主細胞の中で安定に存在するという保証
が全くないからである。例えば、ｃＤＮＡが発現して得られる蛋白質が、当該ベ
クター寄主細胞に対して有害であるかも知れない。例えば、ＥＡウィルスのゲノ
ムは３つのプロテアーゼをコードしており、これら蛋白質は、ベクター寄主細胞
の新陳代謝を阻害する可能性を持つている。
ｃＤＮＡフラグメントを段階的に組合せすることは、必ずしも解決策とはなら
ない。例えば、第１遺伝子が存在し第２遺伝子が存在していないと有害(毒性)と
なる旨記載する文献がある。有害である場合には、有害となる遺伝子が活性を消
失するようにクローンを選択し、得られるＲＮＡは感染性を消失する可能性が極
めて高くなる傾向がある。要約すれば、ｃＤＮＡを組合せすることは、膨大な作
業を必要とするにもかかわらず、成功する見込みは極めて少ない。
本発明の出願人は、Ｅ.コリ Ｋ12ＰＣ2495株(ファバゲンコレクション、ウト
レヒト大学、私書箱第80,056号、3508 ＴＢウトレヒト、オランダ)のＳＥＱ nr
.1に隣接して連続するＳＥＱ nr.2を有し、且つ非-ＥＡウィルス特異プロモー
タを有するヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡベクターは、ベクター寄生細胞
に安定して維持することができ、得られた+ＲＮＡはハムスター胎児腎臓由来Ｂ
ＨＫ-21(Ｃ13)株(ＡＴＣＣ ＣＣＬ10)に感染させることができることを見い出
した。
本出願人は、周知の方法によりＤＮＡの簡便な遺伝子工学な技術的な可能性を
提供するものであり、この方法にて組換えＲＮＡを製造することができる。
ＳＥＱ nr.2を使用する配列の代わりに、機能性の誘導体(functional deriva
tive)が使用することができるであろう。機能性の誘導体とは、欠失、付加、若
しくは他のヌクレオチドにて置換された配列を有するものであってウィルス粒子
の形成能を保持しているもの、と理解することができる。
第１番目の配列は、例えば、非-ＥＡウィルス特異遺伝子を導入して、ウィル
ス寄生細胞に新規な蛋白質を発現させるように適応することができるかもしれな
い。また、ウィルスの有害性を改善したり、寄生特異性(host specificity)を改
変することも可能である。
本発明によると、簡単な方法で組換えＤＮＡベクター及び組換えＲＮＡを製造
することができるようになるが、この分野の専門家であれば、新規遺伝子を導入
する際に、感染ウィルス粒子を複製する及び/又は形成する能力が、例えばＲＮ
Ａ複製に必須配列のような、ウイルスが必須とする遺伝子若しくはウィルスゲノ
ムの他の機能部を不能(knock out)にすることによって消失する可能性があると
いう事実を理解しているであろう。
図１は、ＥＡウイルスの公知遺伝子を示している。この図によると、当該遺伝
子がＯＲＦ1とＯＲＦ2との間に導入されていることが解る。しかしながら、本出
願人は、ＯＲＦ2とオーバーラップしている未知の遺伝子、仮にＯＲＦ2aとする
、を見いだした(ＳＥＱ nr.1，ヌクレオチド9734から9937、参照)。換言すれば
、この部位(site)は、本発明に準じたベクター若しくは相補的(complementation
)であることを目的とする別のベクターにＯＲＦ2a配列が完全提供されていない
限り、挿入には適していない。これらは表現(expression)可能である。
非構造蛋白質1(non-structural protein:ＮＳＰ1、スニジュデル Ｅ.Ｊ.他、
ジェイ.ビロル、66巻、7040-7048ページ、1992年刊)をコードするヌクレオチド2
11から987(ＳＥＱ1 nr.1)の部位を除去すると、複製能を有するが感染性ウィル
ス粒子の形成能に欠ける組換えＲＮＡをコードする組換えＤＮＡベクターが製造
できる。ここに示したヌクレオチド配列に代えて、新規な遺伝子を挿入すること
ができる。望むならば、インタクトなＮＳＰ1遺伝子を新規遺伝子に隣接させて
導入することもできる。好適な実施例によれば、この新規
の遺伝子がＮＳＰ1としてヌクレオチド990の後に隣接して挿入されており、ヌク
レオチド985から990にコードされた２つのグリシン残基(residue)(ＳＥＱ nr.1
参照)間で、発現蛋白質を切断(cut)する。好適には、ヌクレオチド配列は、新
規遺伝子のヌクレオチド配列の後に提供され、この位置において、発現蛋白質は
、好適にはベアクターのウィルスｃＤＮＡに既にコードしているセリンプロテア
ーゼ(serin protease)にて切断される。好適なヌクレオチド配列は、例えば5209
から5268に位置するものである(ＳＥＱ nr.1参照)。
本発明によれば、第１遺伝子と第２遺伝子がオーバーラップしたオープンリー
ディングフレーム(overlapping open reading frame)は、ヌクレオチド配列の挿
入によって解かれる(unbraid)であろう。i)オーバーラップ部が複製される、ii)
第１遺伝子中に存在し第２遺伝子の開始コドンＡＴＧ(ＡＴＧ start codon)の少
なくとも１つのヌクレオチドが、他のヌクレオチドで置換され、結果とし、a)第
１遺伝子のＡＴＧトリプレット(triplet)が第２遺伝子の開始コドンとして作用
しなくなる。及び、b)前記他のヌクレオチドは第１遺伝子の遺伝子発現物が機能
を維持するように選択される。この目的に向かって好適には、コード遺伝子の宿
退(degeneracy)を活用することによって、ヌクレオチド配列の変化がアミノ酸配
列に変化をもたらさないように当該ヌクレオチドが選択される。第１遺伝子と第
２遺伝子を解く(unbraid)ことにより、新規遺伝子を含有する配列が挿入できる
ようになる。新規遺伝子と第２遺伝子とが遺伝子融合(gene fusion product)し
て融合体とならないようにするためは、公知のごとぐ、新規遺伝子と第２遺伝子
との間にストップコドン(stop codon)を挿入する、若しくは内部リボゾームエン
トリーサイト(Internal Ribosomal Entry Site;ＩＲＥＳ)に挿入することができ
る。必要であれば、このようなプロモータ配列あるいはＩＲＥＳを第１遺伝子と
新規遺伝子との間に挿入することもできる。
２つの遺伝子間のオーバーラップの解除は、これら遺伝子がほとんどオーバー
ラップしていない遺伝子間で実施されると、ベクターの全長の伸びを比較的小さ
くできるから、好適である。
加えて、本出願人は、ＯＲＦ1とＯＲＦ2aとがインタクトであり、そして、Ｏ
ＲＦ2内のヌクレオチド10,035からＯＲＦ7内のヌクレオチド12,545までが除去さ
れているベクターは、複
製能をもったＲＮＡ製造物を生成することを見いだした。除去された配列部は、
サブゲノム(sub-genomic)ｍＲＮＡから発現(expression)可能な新規遺伝子によ
って、部分的または完全に置換される。
遺伝子が機能的に不能化された(knocked out)全ての場合において、その遺伝
子の機能を継承させるため、この遺伝子のインタクトなコピーは本発明のベクタ
ー或いはウィルス寄主細胞内に提供される他のべクターに提供されているかもし
れない。
本発明は、遺伝子工学にて操作された組換えＤＮＡベクターに関するものであ
る。特に、非-ＥＡウィルス特異遺伝子の挿入によって改質されたものを含んで
いる。
本発明は、さらに請求項１において定義される組換えＤＮＡベクターを含有す
るベクター寄主細胞に関し、特には、Ｅ．コリ Ｋ12ＰＣ2495株であって組換え
ＤＮＡベクターＰＥＡＶ030を含有するベクター寄主細胞と、組換えＤＮＡベク
ターｐＥＡＶ030に関するものである。そして、このＥ．コリ Ｋ12ＰＣ2495株
であって組換えＤＮＡベクターＰＥＡＶ030を含有するベクター寄主細胞は、オ
ランダのバールン(Baarn)の寄託機関(Centra albureau voor Schimmelcultures)
に1996年７月11日に受託番号第760-96号として寄託されている。
さらに、本発明は、ＳＥＱ nr.2に従った若しくはその誘導体のＤＮＡ配列に
関するものもある。ＳＥＱ nr.1と、このＳＥＱ nr.1に対してＳＥＱ nr.2若し
くはその誘導体の５'末端が隣接して連結するＤＮＡ配列(+ＤＮＡ)を含有したＤ
ＮＡベクターが含まれと、ベクター寄主細胞内で維持することができる。そして
、非-ＥＡウィルス特異ＲＮＡポリメラーゼをコードする非-ＥＡウィルス-固有
プロモータと、非-ＥＡウィルス特異ＮＡポリメラーゼと相まって、ウィルス寄
主細胞に感染性を有するＲＮＡとなり、そしてウィルス粒子となる。
少なくともウィルス寄主細胞内での複製のために重要なこのオリゴヌクレオチ
ドを改質することにより、例えばウィルス粒子内の+ＲＮＡのエンキャプシデー
ション(encapsidation)を妨害(impede)することができるであろう。
本発明は、ＳＥＱ nr.2を含むＤＮＡ配列と、これに相補的な配列、およびこ
れらのフラグメント配列から構成される群から選択されるオリゴヌクレオチドを
、鎖延長反応(chain extension reaction)のプライマー(primer)として使用する
ことに関するもでもある。
このようなプライマーは、ポリメラーゼチェインリアクションア法(＝ＰＣＴ
法:Polymerase Chain Reaction technique)によるウィルス検出に利用可能であ
り、そして、特にはウィルスゲノムの完全ＤＮＡコピーを作成することにも利用
可能である。
ＲＮＡは、本発明の組換えＤＮＡベクターのＤＮＡ配列(-ＤＮＡ)を転写する
ことより入手できるであろう。、この転写はインビボの系で実施されるが、好適
な実施例にあっては、インビトロの系でも実施できる。この場合には、適当な非
-ＥＡウィルス特異プロモータを使用する。得られたＲＮＡは、ウィルス粒子と
薬剤の製造に有益である。
したがって、本発明は、ウィルス粒子を得るための２つの優れた方法に関する
ものである。第１実施例の方法は、ウィルス寄主細胞にＲＮＡを導入して細胞培
養し、ウィルス粒子を周知方法にて分離するものである。
第２の好適実施例は、組換えＤＮＡベクターをウィルス寄主細胞に導入しつい
で細胞培養し、ウィルス粒子を周知方法にて分離するものである。好適には、こ
の組換えＤＮＡベクターには、寄主細胞の非-ＥＡウイルス特異ポリメラーゼが
認識する非-ＥＡウイルス特異プロモータが組み込んである。これらの現象は、
ウイルス寄主細胞内で自然に発生するかもしれないしそうでないかもしれない。
本発明は、本発明となるＲＮＡ成いは上述した方法で得たウィルス粒子を感作
(transfect)したウイルス寄主細胞に関するものである。
最後に、本発明は、薬剤の製造のための２つの方法の提供に関するものである
。
組換えＲＮＡを含有する薬剤組成物を調整するための第１の方法は、本発明と
なる組換
えＤＮＡベクターをベクター寄主細胞内にて増幅(multiply)する。このＤＮＡベ
クターの転写によって、組換えＲＮＡを製造することができる。この組換えＲＮ
Ａをウイルス寄主細胞内に導入し、望むなら、分離できる組換えＲＮＡを含有す
るウィルスを製造することができる。このようにして得られた組換えＲＮＡを、
安全なキャリヤ(carrier)または賦形剤(excipient)とともに処理をして、薬物組
成物となす。
第２の製法は、本発明の組換えＤＮＡベクターをベクター寄主細胞内で増幅し
、周知方法にて分離する。得られた組換えＤＮＡを、薬学的に安全なキャリヤま
たは賦形剤にて処理して薬剤組成物となす。この場合、組換えＤＮＡベクターに
、ウィルス寄主細胞の非-ＥＡウイルス特異ポリメラーゼによって認識できる非-
ＥＡウイルス特異プロモータが備えてあると、好適である。これらの現象は、ウ
イルス寄主細胞内で自然に発生するかもしれないしそうでないかもしれない。
本発明を添付の図面を利用して説明する。この図は、本発明に従った組換えＤ
ＮＡベクターのうちＥＡウイルスに固有な部分と、その構築を示した略図である
。
この図は、アビアンミエロブラストシスウィルス逆転写酵素(Avian Myeloblas
tosis Virus reverse transcriptase)で得た12個のｃＤＮＡクローンを使用して
、ＥＡウィルスのGenomicＲＮＡのｃＤＮＡコピーのほぼ完全な配列を構築した
ことを示している。図面の上方に図示されたクローンと遺伝子(オープンリーデ
ィングフレーム(open reading frames))は、デンブーン、J.A.他によって詳細に
説明されている(ジェイ ビロル誌、1991年、65巻，2910-2920ページ)。制限マ
ップ(restriction map)が、クローンがオーバーラップしているｃＤＮＡ部分を
切り出すために用いた制限酵素(restriction enzyme)を示している。図面の右側
に示されているクローン108は、ＳＥＱ nr.1から得られる140個のヌクレオチド
でそのうちの25個からなるポリ-Ａ-テール(poly-Ａ-tail)を含み、周知の様式で
伸びている。
５'末端において、未知数のヌクレオチドが逆転写酵素の早期終結(premature
termination)によって脱落抜け落ちていた。ＲＮＡ配列の直接決定法(direct Ｒ
ＮＡ sequence determination)より、16のヌクレオチドが決定できた。デューマ
ス Ｊ.Ｂ.他により記述された
方法(核酸研究、1991年版、19巻、5227-5232ページ)によると、ヌクレオチド17
が得られた。この配列を、５'末端部の配列の一部と共に合成し、公知の方法に
てクローンに付加された。
このように得られたＥＡウイルスのｃＤＮＡ(ＳＥＱ nr.2+1)と、Ｔ７プロモ
ータ配列(ＳＥＱ nr.3)を、(５'）ＳＥＱ nr.3−ＳＥＱ nr.2-ＳＥＱ nr.1(
３'）となるようにＰＣＲ法(polymerase chain reaction)によって貼りつけた。
この反応中に、５'末端に、NdeIとNotIの特異制限部位(unique restriction sit
e)を含むヌクレオチド配列15，491-15,511(参照:ＳＥＱ nr.4)を貼りつけた。
３'末端には、XhoIの特異制限部位をコードしているヌクレオチド配列12,845-12
,851を付加した。
この構造体(construct)を、ベクターｐＵＣ18(ＥＭＢＬデータベースアクセッ
ション(database accession)L08752)の、EcoRI特異制限部位とHindIIIの特異制
限部位間に導入した。切断してこれらの制限部位をブラント状態(blunt)にし、
当該構造物を貼りつけ(ligation)することにより、環状ベクターｐＥＡＶ030(Ｓ
ＥＱ nr.4)を得た。
ＳＥＱ nr.1の配列番号7491のＴがＣに置換されたシングルポイントの変異(s
ingle point mutation)が起きていると、ＲＮＡは非感染性になる。この事実は
、安定した組換えＤＮＡベクターが得られたとしても、感染性のＲＮＡとして得
ることができない危険性が非常に高いこと示している。
本発明を、以下の２つの実施例を利用して説明する、これらの実施例に制限さ
れるものではない。分子生物学用試薬(molecular biology products)と細胞培養
用試薬類(cell culture products)は、いずれもライフテクノロジー社(Life Tec
hnology)(ブレダ、オランダ)の標準的なものを使用した。
例１
ｐＥＡウイルス030(ｐＥＡＶ30)+ＲＮＡの細胞株感作
a)ｐＥＡＶ030プラズミドＤＮＡのリニア化(linearization)
３'末端にポリＡテールを持つＲＮＡ鎖を製造するため、前記プラズミドをXho
I制限酵素部位を用いて直鎖状にした(Iiniarized)。ｐＥＡＶ030プラズミドＤＮ
Ａを、本発明に従って大腸菌 ＰＣ2495株を公知の方法で分離し(アルカリ加水
分解法:シャムブルック、Ｊ.、フリッチ、Ｅ.Ｆ.、マニアチス、Ｔ.、1989年、
分子クローン技術、実験マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー
、ニューヨーク、アメリカ:以下、"マニアチス他"という)、ＤＮＡ濃度を分光学
的にて算定した。
ｐＥＡＶ030プラズミドＤＮＡ２μｇを、10ユニットの制限酵素XhoI(このベク
ターを１度だけ切断する)で消化(digestion)することにより直鎖化(開環)した。
(全容量:20マイクロリットル;バッファー条件:10ｍＭトリス-HCl(Tris-HCl)緩衝
液(ｐＨ7.9)、10ｍＭMgCl2、１ｍＭジチオスレイトール(dithiothreitol)(ＤＴ
Ｔ)、100マイクログラム/ｍｌ牛血清アルブミン(ＢＳＡ);インキュベーション:3
7℃、２時間)。
反応液１μｌを用いて、消化が完全であることをチェックした(ＤＮＡのアガ
ロースゲル電気泳動法(agarose gel electrophoresls)、マニアチス他参照)。残
り19μｌにアクアビデストト(aqua bidest)80μｌを加え、そして20ｍｇ/ｍｌプ
ロテイナーゼＫ溶液、１μｌを加えた(インキュベーション:37℃、１時間)。
リニア化されたプラズミドＤＮＡは、フェノール／クロロホルム/イソアミルア
ルコール混合液100μｌにて２回抽出し、公知のメタノール沈殿法にて濃縮した(
マニアチス他参照)。遠心分離(15分、15,000xg)で得たＤＮＡペレットを70％エ
タノール500μｌで洗浄した後、得られるプラズミドＤＮＡを全量15μｌの水け
ん濁液とした。
b) インビトロ系での転写(in vitro transcription)
インビトロ系において、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用い、直鎖化したＤＮＡか
らＲＮＡを転写するために、以下の成分をまとめて加えられた。
-XhoI-リニア化ｐＥＡＶ030ＤＮＡ(前記参照)、15μｌ
-１ｍｇ/ｍｌＢＳＡ(ライフテクノロジー社)、５μｌ
-50ｍＭＤＴＴ、５μｌ
-リボヌクレオチド混合物(ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ、それぞれ10
ｍＭ)、５μｌ
-10ｍＭキャッピング アナローグ(capping analogon)(ｍ７Ｇ(５')ppp(５')
Ｇ)(ライフテ
クノロジー社)、５μｌ
-５倍濃縮Ｔ７転写緩衝液(transcription buffer):(200ｍＭトリス-HCl緩衝液
(ｐＨ8.0)、40ｍＭMgCl2、10ｍＭスペルミジン(spermidine)、125ｍＭNaCl)
(ライフテクノロジー社)、10μ
-8units/μｌＲＮＡse インヒビター(ＲＮＡ-ガード；ファーマシア(Pharmac
ia)、ベルゲン・オプ・ズーム(Bergen op Zoom)、オランダ)、２.５μｌ
-8units/μｌ Ｔ７-ＲＮＡ-ポリメラーゼ(ライフテクノロジー社)、２．５μ
ｌ
転写反応液量(transcription volume);50μｌ
反応条件:37℃、１時間。
転写反応液１μｌを用い、公知の方法で転写反応が完結していることを確認し
た(ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動法、マニアチス他参照)。本反応で得られた
ＲＮＡ量は、10μｇと推定された。
c)細胞培養
ＢＨＫ-21培養細胞株(ハムスター、ＡＴＣＣ ＣＣＬ10)、HeLa株(ヒト、ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ-２.１)及びＬ株(マウス、ＡＴＣＣ ＣＣＬ10)を、10の胎児牛血
清(foetal calf serum)、常量の抗生物質バンコマイシン(vancomycin)と常量の
ゲンタマイシン(gentamycin)を加えたＤＭＥＭ培地を用いて37℃で培養した。こ
の細胞培養法自体は公知である。
転写反応は、細胞密度が60-80％となるように注意した。
d)エレクトロポレーション(electroporation)とウィルスハーベスト(virus harv
est)
イクイバイオイージージェクトプラスタイプ(EquiBio Easy-Ject Plus)のエレ
クトロポレーション装置(ユーロジェンテック社、セライング、ベルギー)及び付
属セル(cuvette)(直径０.４ｃｍ)を使用して、成熟細胞の核にＲＮＡを導入した
。
細胞をＰＢＳ(137ｍＭNaCl，27ｍＭKCl、8ｍＭNa2HPO4、１.５ｍＭKH2PO4、ｐ
Ｈ７.２)で洗浄し、トリプシン溶液を添加(ライフテクノロジー、１ｍｌ/75ｃｍ
2培養ディッシュ表面積)、37℃、３〜５時間インキュベートして、培養皿(cultu
re dish)から細胞を分離させた。この方法自体は公知である。
細胞懸濁液１ｍｌ当たり、上記ＤＭＥＭ培地９ｍｌを加え、細胞を完全に懸濁
(resuspen
ded)させた。遠心分離処理(10分、3000xg)して細胞をペレット状とし、オリジナ
ルの細胞懸濁液１ｍｌ当たり10ｍｌのＰＢＳを加えて懸濁した。遠心分離処理に
て細胞を再びペレット状とし、107細胞/ｍｌＰＢＳに調整した。この時点から先
は氷保存した。
前記細胞懸濁液０.６ｍｌと転写反応剤(transcription reaction)49μｌとの
混合物を、エレクロロポレーションのセル内に入れた。前記のエレクトロポレー
ション装置を使用して85ＯＶ、2310オームで25マイクロファラットの２つの連続
的なパルスを与えた。ついで、細胞懸濁液をＤＭＥＭ培地と混合し、培養ディシ
ュ内にて39.5℃でインキュベートし、様々な公知のウィルス分析に使用した。
前記各培養細胞系をエレクトロポレーション処理した後、20-30時間転写処理
した細胞培地を栄養培地として保存することにより、それぞれ感染性ウィルスを
得ることができた。
最後に、本発明となるベクターの転写物は、自然界でウィルス寄主細胞として
作用しない細胞株にて複製することができ、天然ウィルス寄主細胞株に対して感
染性を持つウィルスとして製造されることが解った。
例２
組換え表現ベクターの構築(construction of a recombinant expression vect
or)
緑蛍光蛋白質(Green Fluorescent Protein:ＧＦＰ)の遺伝子を、適切な配向性
(orientation)を持たせ(すなわち、ＧＦＰ遺伝子の+ストランドがＤＮＡべクタ
ーのＥＡＶ部分の+ＤＮＡに存在するように)、ｐＥＡＶ030の一部であるＳＥＱ
nr.4のヌクレオチド12303-12398上のHindIII制限部位に挿入した。制限部位は
、ＯＲＦ７の直前に存在する(図１参照)。
この挿入により、ＯＲＦ６(ＥＡＶの膜蛋白質(membrane protein)のリーディ
ングフレーム(reading frame))は妨害をうけ、ＯＲＦ７(ＥＡＶのヌクレオキャ
プシド(nucleocapsid)蛋白質をコード化)の翻訳を阻止される。遺伝子的に変異
したベクター(ｐＥＡＶＧＦＰ７)は、転写能と複製能を具有している(ＧＦＰ表
現を含む)、２つの重要な構造蛋白質が製造できないために、ウィルス製造能と
ウイルス増殖能を持っていない。
a)中間構造物(intermediate construct)ｐＭ115128の構築(construction)
ｐＥＡＶ030内にはいくつかのHindIII制限部位が存在するため、ＳＥＱ nr.4
の12303-12308部にあるHindIII制限部位に、ＧＦＰ遺伝子を直接挿入することは
不可能であった。よって、前記HindIII制限部位に特異的な中間構造物(プラズミ
ド)として製造された。この構造物(ｐＭ115128)は、EcoRI(ＳＥＱ nr.4の11488
-11493部)と、XhoI(ＳＥＱ nr.4のヌクレオチド12,845-12,851部)を使用してｐ
ＥＡＶ030を切断することにより、製造した。これらはともに特異制限部位ある
。得られたＤＮＡフラグメントは、ウィルスゲノムの３'末端に対応しており、
且つＳＥＱ nr.4の12303-12308部にある前記HindIII制限部位を含有している。
EcoRI-XhoIのＤＮＡフラグメントは、ｐＥＡＶ030プラズミドＤＮＡ１μを,制限
酵素EcoRIとXhoIのそれぞれ10ユニットで消化することにより得られた(全容積:2
0μｌ;バッファー条件:10ｍＭトリス-HCl緩衝液(ｐＨ7.9)、10ｍＭMgCl2、１ｍ
Ｍジチオスレイトール(ＤＴＴ)、100μｇ/ｍｌ牛血清アルブミン(ＢＳＡ)、;イ
ンキュベーション:37℃、２時間)。
消化反応液を公知の方法で分析し(ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動、マニア
チス他参照)、そして、ＤＮＡフラグメントの必要量を公知のアガロースゲルよ
り純粋し、アクアビデスト10μｌとした。
ｐＭ115128の基本ベクター(basic vector)は、プラズミドpブルースクリプト
ＳＫ-pBluescript ＳＫ)(ｐＳＫ、ストラタゲン(Stratagene)、ラホーラ、アメ
リカ)であり、この１μｇをEcoRIとXhoIで(前述のように)切断し、アガロースゲ
ルから純化し、全量10μｌのアクアビデストにした。
前記ｐＥＡＶ030から得られたEcoRI-XhoI ＤＮＡフラグメント、及びEcoRI-X
hoIで切断したベクターｐＳＫを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(ligase)を使用してｐＭ1
15128に貼りつけた(ligate)。その反応条件をつぎに示す。
-EcoRI-XhoIで切断、精製した純ｐＳＫベクター,１μ
-ｐＥＡＶ030から精製した純EcoRI-XhoIＤＮＡフラグメント，６μｌ
-５倍濃縮リゲートバッファー(250ｍＭトリス-HCl(ｐＨ７.８)、50ｍＭMgCl2
、50ｍＭＤＴＴ、５ｍＭＡＴＰ、125μｇ/ｍｌＢＳＡ)、２μｌ
-Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(1unit/μｌ、ライフテクノロジー社),1μｌ
20℃で１時間インキュベートした後、反応混合を公知の方法でＥ.コリ ＰＣ249
5株にトランスフォームした。トランスフォームされたバクテリアを、抗生物質
であるアンピシリン(am
picillin)、及びその耐性遺伝子(resistance gene)を含有したベクターとともに
、培養した。ついで、公知の方法でバクテリアよりプラズミドを分離し、ｐＥＡ
Ｖ030から得たEcoRI-XhoIＤＮＡフラグメントに対して制限酵素でチェックした
。
b)中間構成物(intermediate construct)ｐＭ115128内へのＧＦＰ遺伝子の挿入
ｐＭ115128の特異的HindIII制限部位(ＳＥＱ nr.4の12303-12308部)に、ＧＦ
Ｐ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを挿入するため、制限酵素Asp718とEcoR
にてプラズミドｐＧＦＰ,１μｇ(クロンテク社、パロアルト、アメリカ)を消化
し、ＧＦＰ遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントを分離した。この方法は公知で
ある(上述した方法に類似するものである)。
ゲルよりＤＮＡフラグメントを精製する前に、頑固な末端部を、Ｅ.コリ Ｄ
ＮＡポリメラーゼIの大きな(または“クレノウ(Klenow)"）フラグメントにて処
理してなまくらにした。この方法自体は公知である。アガローズゲルより精製し
た後、アクアビデスト10ｍｌに再び混合した。
ｐＧＦＰから得たAsp718-EcoRI ＤＮＡフラグメントと、HindIIIを含有する
ベクターｐＭ115128を公知の方法に従いそしてＴ４ＤＮＡリガーゼを使用した貼
りつけ、ｐＭ115128/ＧＦＰとした。この反応混合物を、Ｅ.コリ ＰＣ2495株に
トランスフォームし、ついで、アンピシリン存在下で培養し、前記ベクターはア
ンピシリン耐性遺伝子を含む。プラズミドをバクテリアより分離し、制限酵素を
使用してＧＦＰ遺伝子の存在とその適切な配向性を確認した。
c)ＧＦＰ遺伝子のｐＥＡＶ030への逆クローニング
ｐＭ115128/ＧＦＰの遺伝子を、元のｐＥＡＶ030に戻すため、EcoRIとXhoIの
上述した特異制限を使用した。これら酵素を使用して、ｐＭ115128/ＧＦＰから
、ＧＦＰ遺伝子プラス側部(nanking)ＥＡＶ配列のＤＮＡフラグメントを得、こ
のグラグメントを前記ｐＥＡＶ030の特異制限部位と、前記EcoRIの特異制限部位
との間に逆に貼りつけた(back-ligated)。
例１の方法において(d)の条件を使用して、ＤＮＡベクターのＲＮＡ逆転写物
を、ＢＨＫ-21細胞内に導入した。すると、ＲＮＡ逆転写物が複製されて、ＧＦ
Ｐが表現した。ＯＲＦ
6とＯＲＦ7とを無効化処理すると、ウィルス粒子を形成することができなかった
。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 ブレーデンベーク ペトラス ジョアンネ
ス
オランダ国 エヌエル―2403 エイチゼッ
ト アルフェン アー／デー リヨン コ
ニングスマンテル 14
(72)発明者 デン ボン ジョアン アリー
アメリカ合衆国 53705 ウィスコン州
マディソン ブロディ ドライブ 5327
アパルトメント 104
(72)発明者 ヴァン ディンテン レオニー クリステ
ィーナ
オランダ国 エヌエル―2343 ティーダブ
リュー エグシュトゲスト リダースポー
ルラーン 69
(72)発明者 ヴァセナール アルフレッド レオナルド
マリア
オランダ国 エヌエル―2396 シーケー
クーデケルク アー／デー リヨン リダ
ーホフラーン 67
(72)発明者 シニョデール エリック ジョン
オランダ国 エヌエル―2411 ケイエス
ボデグラーベン ベセムシンゲル ９