DD297448A5 - FUNGAL EXPRESSION SYSTEM - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekuel mit der Codierung fuer eine Polygalacturonase-Expressionskassette (PG-Expressionskassette), die das Strukturgen einer PG und/oder entsprechende Regulationssequenzen umfaszt, oder Hybridvektoren, welche eine von einem PG-Gen abgeleitete DNA umfassen, auszerdem transformierte Wirte, vor allem Fadenpilze, Methoden zur Herstellung dieser rekombinanten DNA-Molekuele und transformierten Wirte und zur Herstellung von Polypeptiden mit Hilfe dieser DNA und dieser Wirte, gereinigten Einzel-PG von natuerlichen oder transformierten Wirten, die Herstellung von Gemischen von PG, wahlweise mit anderen Enzymen, und die Verwendung der PG oder deren Gemische in der Industrie.{rekombinantes DNA-Molekuel; Codierung fuer eine Polygalacturonase-Expressionskassette; Strukturgen einer Polygalacturonase; Hybridvektoren; transformierte Wirte; Fadenpilze; Polypeptide; Verfahren; Herstellung; Verwendung; Industrie}The invention relates to a recombinant DNA molecule coding for a polygalacturonase expression cassette (PG expression cassette) which comprises the structural gene of a PG and / or corresponding regulatory sequences, or hybrid vectors comprising a PG gene-derived DNA as well as being transformed Hosts, especially filamentous fungi, methods for producing these recombinant DNA molecules and transformed hosts and for producing polypeptides by means of said DNA and these hosts, purified single PG of natural or transformed hosts, the production of mixtures of PG, optionally with others Enzymes, and the use of PG or their mixtures in industry {recombinant DNA molecule; Coding for a polygalacturonase expression cassette; Structural gene of a polygalacturonase; Hybrid vectors; transformed hosts; Filamentous fungi; polypeptides; Method; manufacture; Use; Industry}
Description
Hierzu 8 Seiten ZeichnungenFor this 8 pages drawings
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik und schafft neuartige DNA-Moleküle, welche DNA-Folgen mit der Codierung für Proteine mit Polygalacturonase-Aktivität und/oder die Promotor-, Signal- und/oder Transkriptionsterminatorfolgen, welche natürlich an diese gekoppelt sind, umfaßt. Die neuartigen DNA-Moleküle sind bei der Schaffung von Expressionskassetten für die Produktion von Polygalacturonasen oder die Expression von Fremdgenen in Fadenpilzen von Nutzen.The invention relates to the field of genetic engineering and provides novel DNA molecules comprising DNA sequences encoding polygalacturonase activity proteins and / or the promoter, signal and / or transcription termination sequences which are naturally coupled thereto. The novel DNA molecules are useful in the creation of expression cassettes for the production of polygalacturonases or the expression of foreign genes in filamentous fungi.
-6- 297 448 Charakteristik des bekannten Standes der Technik-6- 297 448 characteristic of the known prior art
die eine große Zahl von unterschiedlichen Expressionshybridvektoren, meistens Plasmide, entwickelt wurde. Die Nachteile dera large number of different expression hybrid vectors, mostly plasmids, have been developed. The disadvantages of
glycosylieren, aber ebenso wie E. coil sekretieren sie die Polypeptide, von kleinen abgesehen, nicht in das Nährmedium, sondernin den periplasmatischen Raum. Höhere eukaryotische Wirte, wie Krebszellen von Säugetieren, sind zum Glycosylieren und zurglycosylation, but just like E. coil, they secrete the polypeptides, apart from small ones, not into the nutrient medium but into the periplasmic space. Higher eukaryotic hosts, such as mammalian cancer cells, are useful for glycosylation and
zusammen mit dem gewünschten Peptid oncogene Nukleinsäuren isoliert werden.isolated together with the desired peptide oncogene nucleic acids.
untersucht. Ihre Anwendung in gentechnischen Verfahren war langsamer, vor allem auf Grund des Fehlens entsprechenderexamined. Their application in genetic engineering was slower, mainly due to the lack of appropriate
beschriebenen Vektoren replizieren nicht wie die Hefen autonom, sondern werden in das Pilzchromosom integriert. DiesesThe vectors described do not replicate autonomously, like the yeasts, but are integrated into the fungal chromosome. This
als einhundert Kopien berichtet.reported as a hundred copies.
sowohl negative als auch positive Selektionssysteme beschrieben (Bailance u.a., BBRC112,284,1983; Tilburn u.a., Gene 26,205,1983; Yelton u.a., PNAS 81,1470,1984; Yelton und Timberlake, J. Cell. Biochem. Suppl. 9C, 173,1985; Johnstone u.a.,both negative and positive selection systems have been described (Bailance et al., BBRC112,284,1983; Tilburn et al., Gene 26,205,1983; Yelton et al., PNAS 81,1470,1984; Yelton and Timberlake, J. Cell Biochem. Suppl. 9C, 173) , 1985; Johnstone et al.,
wichtigsten sind.most important are.
hydrolytischen Enzymen erreicht.achieved hydrolytic enzymes.
(Buxton u.a., Gene 37,207,1985; EP 184438; WO 86/06097), die beide von A. nidulans gewonnen wurden, eingesetzt.(Buxton et al., Gene 37, 207, 1985; EP 184438; WO 86/06097), both of which were obtained from A. nidulans.
a-i/i-glycosidisch gebundenen D-Galacturonsäurepolymeren bestehen. Einige der Uronsäuregruppen sind mit Methanolverestert, die durch Pectinesterase abgespalten werden können. Pectine kommen in der Natur als Bestandteile höherer Pflanzenvor, wo sie an Cellulosemoleküle gebunden sind, die vor allem in der Primärzellwand und der mittleren Lamelle gefundenwerden. Zu den reichsten Quellen für Pectin gehören Zitronen- und Orangenschale, die etwa 30% dieses Polysaccharidsenthalten. Pectinenzyme bauen das Kohlenhydratpolymersubstrat entweder durch Hydrolyse der a-1,4-glycosidischen Bindung(Endo- und Exo-Polygalacturonasen) oder durch Transeleminierung (Pectinlyasen), die zu einem gesättigten und zu einema-4,5-ungesättigten Poly- oder Oligogalacturonid führt, ab. Der systematische Name von Endo-Polygalacturonase ist (Poly-(1,4-a-D-Ga!acturonid))Glycanhydrolase (EC 3.2.1.15) und von Exo-Polygalacturonase (Poly-(1,4-a-D-Ga!acturonid))-galacturononhydrolase (EC 3.2.1.67). Ein anderes relevantes, pectinabbauendes Galacturonase-Enzym ista-i / i-glycosidically bound D-Galacturonsäurepolymeren exist. Some of the uronic acid groups are esterified with methanol, which can be cleaved off by pectinesterase. Pectins are found in nature as constituents of higher plants, where they are bound to cellulose molecules, which are found mainly in the primary cell wall and the middle lamella. The richest sources of pectin include lemon and orange peel containing about 30% of this polysaccharide. Pectin enzymes assemble the carbohydrate polymer substrate either by hydrolysis of the α-1,4-glycosidic linkage (endo- and exo-polygalacturonases) or by trans-lemination (pectin lyases) resulting in a saturated and a-4,5-unsaturated poly- or oligogalacturonide. from. The systematic name of endo-polygalacturonase is (poly (1,4-aD-galacturonide)) glycan hydrolase (EC 3.2.1.15) and of exo-polygalacturonase (poly (1,4-aD-galacturonide)) galacturonone hydrolase (EC 3.2.1.67). Another relevant pectin degrading galacturonase enzyme is
der ursprünglichen Verwendung von Pectinonzymen für die Behandlung von weichen Früchten zur Gewährleistung einer hohenthe original use of pectinone enzymes for the treatment of soft fruits to ensure a high
unteriichiedlichen Mengen, zusammen mit anderen Enzymen, wie Arabinanasen, Galactanasen, Xylanasen, ß-1,4-Glucanasen,various amounts, together with other enzymes, such as arabinanases, galactanases, xylanases, β-1,4-glucanases,
als mazerierende Enzyme für die Herstellung von fruchtigeren Nektaren eingesetzt, die eine glattere Konsistenz und einenhöheren Gehalt an löslichen Feststoffen, Pigmenten und Nährstoffen als Erzeugnisse haben, die nach einem mecnanischthermischen Verfahren hergestelt werden.used as macerating enzymes for the production of more fruity nectars, which have a smoother consistency and a higher content of soluble solids, pigments and nutrients than products made by a mecanane thermal process.
und/oder Pectinlyase Klären von Säften, Saft-/Ölextraktion, Zitronenschalenöl,and / or pectin lyase clarifying juices, juice / oil extraction, lemon peel oil,
Waschung von Zitruspulpe Pectinesterase/Polygalacturonase/ Pectinl^ase + (Hemi-)Cellulasen Verflüssigung, klare/trübe SäfteWashing of citrus pulp pectinesterase / polygalacturonase / pectinase + (hemi) cellulase liquefaction, clear / cloudy juices
beispielsweise für die Produktion von termentierbaron Polysacchariden aus Pflanzenzellen (Ref. 33) oder für die Modifikation vonfor example, for the production of termentable polysaccharides from plant cells (Ref. 33) or for the modification of
niger unter Verwendung von Pectin oder dessen Abbauprcdukten die oben genannten Enzyme aus, wenn andereniger using pectin or its decomposition products, the above-mentioned enzymes, if others
gereinigt beschrieben werden. Da jedoch keine strukturellen Daten gegeben werden, bleibt die Notwendigkeit vonbe described cleaned. However, given no structural data, the need remains
ihrer Aminosäuresequenzen möglich ist.their amino acid sequences is possible.
insbesondere PGI oder PGII, was die Synthese von DNA-Sonden mit der Codierung für relevante Teile des Proteins ermöglicht.especially PGI or PGII, allowing the synthesis of DNA probes encoding the relevant parts of the protein.
(als pgal bezeichnet) mit einer Genbank von einem Pilzstamm, z. B. A. nlger, zu identifizieren.(designated pgal) with a library of a fungal strain, e.g. B. A. nlger to identify.
vorliegenden rekombinanten PG-DNA ausgeprägt werden kann.present recombinant PG-DNA can be expressed.
a) dem Aspergillus niger-DNA-Einschub von pGW1800 oder pGW1900,a) the Aspergillus niger DNA insert of pGW1800 or pGW1900,
b) einer DNA-Sequenz, welche auf den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI, der durch einen DNA-Einschub von a) umfaßt wird, hybridisiert und welche ein Strukturgen für ein Polypeptid mit Polygalacturonase-Aktivität und wahlweise einen Promotor, einen codierenden Bereich für ein Signal-oder Leader-Peptid und/oder einen Transkriptionsterminator davon umfaßt,b) a DNA sequence which hybridizes to the coding region for the mature PGII or PGI encompassed by a DNA insert of a) and which comprises a structural gene for a polypeptide having polygalacturonase activity and optionally a promoter, a coding gene Range for a signal or leader peptide and / or a transcription terminator thereof,
c) einem Derivat einer DNA-Sequenz, wie sie in a) oder b) definiert wurde, oderc) a derivative of a DNA sequence as defined in a) or b), or
d) einer DNA-Sequenz, die für eine reife PG oder deren Signalpeptid oder Leader-Peptid codiert und die in dem Sinne des genetischen Codes mit Bezug auf eine DNA-Sequenz von a), b) oder c) degeneriert ist.d) a DNA sequence coding for a mature PG or its signal peptide or leader peptide and degenerate in the sense of the genetic code with respect to a DNA sequence of a), b) or c).
Insbesondere betrifft die Erfindung ein rekombinantes DNA-Molekül, welches eine DNA-Sequenz umfaßt, die ausgewählt wird ausIn particular, the invention relates to a recombinant DNA molecule comprising a DNA sequence selected from
a) dem AspergillusNlger-DNA-Einschub von pGW 1800,a) the AspergillusNlger DNA insert from pGW 1800,
b) einer DNA-Sequenz, welche auf den codierenden Bereich für die reife PGII, der durch den DNA-Einschub von a) umfaßt wird, hybridisiert und welche ein Strukturgen für ein Polypeptid mit Polygalacturonaseaktivität und wahlweise einen Promotor, einen codierenden Bereich für ein Signal- oder Leader-Peptid und/oder einen Transkriptionsterminator davon umfaßt,b) a DNA sequence which hybridizes to the coding region for the mature PGII encompassed by the DNA insert of a) and which comprises a structural gene for a polypeptide having polygalacturonase activity and optionally a promoter, a coding region for a signal or leader peptide and / or a transcription terminator thereof,
c) einem Derivat einer in a) oder b) definierten DNA-Sequenz oderc) a derivative of a DNA sequence defined in a) or b) or
d) einer DNA-Sequenz, die für eine reife PG oder deren Signalpeptid oder Leader-Peptid codiert und welche im Sinne des genetischen Codes mit Bezug auf eine DNA-Sequenz von a), b) oder c) dageneriert ist,oder ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine DNA-Sequenz umfaßt, die ausgewählt wird ausd) a DNA sequence coding for a mature PG or its signal peptide or leader peptide and which is diereneriert in terms of the genetic code with respect to a DNA sequence of a), b) or c), or a recombinant DNA Molecule comprising a DNA sequence selected from
a) dem Asperglllusniger-Einschub von pGW 1900,a) the Asperglllusniger slot of pGW 1900,
b) einer DNA-Sequenz, die auf den codierenden Bereich für die reife PGI, die durch den DNA-Einschub von a) umfaßt wird, hybridisiert und welche ein Strukturgen für ein Polypeptid mit Polygalacturciase-Aktivität und wahlweise einen Promotor, einen codieronden Bereich für ein Signal- oder Leader-Peptid und/oder einen Transkriptionsterminator davon umfaßt,b) a DNA sequence which hybridizes to the coding region for the mature PGI encompassed by the DNA insert of a) and which comprises a structural gene for a polypeptide having polygalacturicase activity and optionally a promoter, coding region for comprises a signal or leader peptide and / or a transcription terminator thereof
c) einem Derivat einer in a) oder b) definierten DNA-Sequenz oderc) a derivative of a DNA sequence defined in a) or b) or
d) einer DNA-Sequenz, die für eine reife PG oder deren Signalpeptid oder Leader-Peptid codiert und welche im Sinne des genetischen Codes mit Bezug auf eine DNA-Sequenz von a), b) oder c) degeneriert ist.d) a DNA sequence which codes for a mature PG or its signal peptide or leader peptide and which is degenerate in the sense of the genetic code with respect to a DNA sequence of a), b) or c).
der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM) hinterlegt wurden.the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM).
auch Fragmente oder Mutanten der natürlichen vorkommenden Polygalacturonasen ein, die ihre enzymatische Aktivitätbeibehalten haben. Die Begriffe Polygalacturonase oder PG1 die hier verwendet werden, schließen auch andere Galacturonasenein, welche als Substrat ein Oligo- oder Polysaccharid haben, das Galacturonat aufweist, z. B. Oligogalacturonase, die einalso fragments or mutants of the naturally occurring polygalacturonases which have retained their enzymatic activity. The terms polygalacturonase or PG 1 used herein also include other galacturonases having as substrate an oligo- or polysaccharide having galacturonate, e.g. B. oligogalacturonase, the one
deren Fragmente oder Mutanten, die ihre enzymatische Aktivität beibehalten haben. Ein „Leader-Peptid" ist als eine Sequenzeiner Präpro-PG zu verstehen, die während der Bildung einer reifen PG abgeschnitten wird. Ein „Signalpeptid" wird durch die„Signalpeptidase" im endoplasmatischen Retikulum in einem ersten Schritt abgeschnitten.their fragments or mutants that have retained their enzymatic activity. A "leader peptide" is to be understood as a sequence of a prepro-PG that is cleaved during the formation of a mature PG. A "signal peptide" is clipped by the "signal peptidase" in the endoplasmic reticulum in a first step.
pG W1800 oder pG W1900.pG W1800 or pG W1900.
bis zum EcoRI-Restriktionsort (Kartenposition 4100). Dieser Einschub umfaßt den Promotor und dento the EcoRI restriction site (map position 4100). This insert includes the promoter and the
bestimmt und wird in der Sequenzaufstellung unter der Sequenzidentifizierungszahl (SEQ ID NO) 2 dargestellt.and is shown in the Sequence Listing under the sequence identification number (SEQ ID NO) 2.
(SEQ ID NO) 2. Der codierende Bereich für das Leader-Peptid der Präpro-PGII erstreckt sich von der Position 1357 bis zur Position(SEQ ID NO) 2. The coding region for the prepro PGII leader peptide extends from position 1357 to position
1437. Das Signalpeptid wird durch die Nukleotide 1357 bis 1419 codiert. Der codierende Bereich für die reife PGII erstreckt sichvon der Position 1438 bis zur Position 2494. Daran schließt sich de' Transkriptionsterminatorbereich an, der bei Position 2499beginnt.1437. The signal peptide is encoded by nucleotides 1357 to 1419. The coding region for the mature PGII extends from position 1438 to position 2494. This is followed by the transcription terminator region beginning at position 2499.
zum BamHI-Ort in der angenäherten Kartenposition 8600, der in der Abb. 3 angegeben wird. Die DNA-Sequenz, die sich von etwader Kartenposition 6280 bis zu etwa 3880 erstreckt, wird in der Sequenzaufstellung unter SEQ ID NO. 1 gegeben.to the BamHI location in the approximate map position 8600 shown in FIG. The DNA sequence extending from approximately map position 6280 to about 3880 is shown in the Sequence Listing under SEQ ID NO. 1 given.
codierende Bereich für das 31 Aminosäuren lange Leader-Peptid der Präpro-PGI erstreckt sich von der Position 910 bis zurcoding region for the 31 amino acid leader peptide of prepro PGI extends from position 910 to
an der Position 1003 und erstreckt sich bis zu 2127. Der Transkriptionsterminatorbereich beginnt in der Position 2131.at position 1003 and extends up to 2127. The transcription terminator area begins at position 2131.
abgeleitet wurden, hybridisieren unter „homologen Bedingungen" mit dem codierenden Bereich des PGI- bzw. PGII-Gens odereinem Fragment von diesen, das von A. nlger N 400 abgeleitet wurde. DNA-Sequenzen, die wenigstens teilweise homolog zumhybridize under "homologous conditions" with the coding region of the PGI or PGII gene or a fragment of these derived from A. niger N 400. DNA sequences which are at least partially homologous to the
unter sogenannten „heterologen Bedingungen", die weniger streng als die „homologen Bedingungen" sind. Ein Glied derunder so-called "heterologous conditions," which are less stringent than the "homologous conditions." A member of the
oder PGII-Gen oder ein PGI-, PGII- oder unterschiedliches PG-Gen eines anderen PG-produzierenden Pilzstammes als A.nlgeror PGII gene or a PGI, PGII or different PG gene of another PG-producing fungal strain than A.nlger
oder anderen phytopathogenen Pilzen sowie von Hefe, beispielsweise von PG-produzierenden Kluyveromyces spec, wieor other phytopathogenic fungi as well as yeast, for example of PG-producing Kluyveromyces spec
sind. Glieder der PG-Genfamilie werden als „PG-Gene" bezeichnet.are. Members of the PG gene family are referred to as "PG genes".
welche Galacturonat aufweisen, spalten können, z. B. Oligogalacturonase, Rhamnogalacturonase oder insbesonderewhich have galacturonate, can cleave, for. As oligogalacturonase, rhamnogalacturonase or in particular
heterologe Hybridisierungsbedingungen genauer definiert.heterologous hybridization conditions defined in more detail.
größere Derivate einschließen, welche flankierende Sequenzen enthalten, Fragmente dieser DNA-Sequenzen und Mutanten, vorallem künstliche Mutanten.larger derivatives containing flanking sequences, fragments of these DNA sequences and mutants, especially artificial mutants.
und sie umfassen DNA-Sequenzen, welche an den codierenden Bereich für reife PGII oder PGI hybridisieren, die durch denand they include DNA sequences which hybridize to the coding region for mature PGII or PGI produced by the
der Nucleinsäuren, Behandlung der Fragmente mit einem geeigneten Restriktionsenzym, z. B. EcoRI, BamHI oder Hindill,of the nucleic acids, treatment of the fragments with a suitable restriction enzyme, e.g. EcoRI, BamHI or Hindill,
-PGII-Gen unter „heterologen" Bedingungen hybridisiert, ist ein Einschub eines Vektors oder dessen Fragment, welcher aus derPGG gene hybridized under "heterologous" conditions is an insert of a vector or its fragment derived from the
-E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 und -Y33, pGW1756 und pGW1910. Der Letztgenannte umfaßt das Strukturgen pgaC, welches-E6, -E38, -F5, -G17, -G27, -X31 and -Y33, pGW1756 and pGW1910. The latter comprises the structural gene pgaC, which
unterscheiden. Die Stämme NW756 und NW400 sind also nicht eng miteinander verwandt und könnten zu unterschiedlichendiffer. The strains NW756 and NW400 are therefore not closely related and could be too different
der Sequenzaufstellung gegeben wird. Der codierende Bereich für das Leader-Peptid das Präpro-PGII erstreckt sich vermutlichvon Position 890 bis zu Position 970, während das Signalpeptid durch die Nucleotide 890 bis 952 codier· wird. Der codierendethe sequence listing is given. The coding region for the leader peptide, prepro PGII, presumably extends from position 890 to position 970, while the signal peptide is encoded by nucleotides 890 to 952. The coding
ein Intron. An den codierenden Bereich schließt sich der Transkriptionsterminatorbereich an, der mit der Position 2031 beginnt.an intron. The coding region is followed by the transcription terminator region beginning at position 2031.
ganzen pgaC-Gen wird in der Sequenzaufstellung unter SEQ ID NO. 4 gegeben.Whole pgaC gene is shown in the Sequence Listing under SEQ ID NO. 4 given.
wird, erstreckt sich vermutlich von Nucleotid 663 bis zu 782 und schließt die DNA-Sequenz von 663 bis 710 ein, welche daspresumably extends from nucleotide 663 to 782 and includes the DNA sequence from 663 to 710, which includes the
gleiche Promotor-, Signal- und/oder Transkriptionsterminatorsequenz wie in pGW1800 oder wie in pGW 1900 oder eine anderesame promoter, signal and / or transcription terminator sequence as in pGW1800 or as in pGW 1900 or another
abgeleitet werden kann. Außerdem kann den hybridisierenden DNA-Sequenzen in Abhängigkeit vom Wirt, in welchem diegewünschte PG ausgeprägt werden soll, jede andere Promotor-, Signal- und/oder Transkriptionsterminatorsequenz hinzugefügtwerden.can be derived. In addition, depending on the host in which the desired PG is to be expressed, any other promoter, signal and / or transcription terminator sequence may be added to the hybridizing DNA sequences.
stehen in der Regel von ö'-nichtcodierenden Bereichen von prokaryotischen, eukaryotischen oder Viralgenen zur Verfügung,während Transkriptionsterminatoren von 3'-nichtcodierenden Bereichen zur Verfügung stehen. Signalsequenzen können vonden 5'-codierenden Bereichen von Präproteinen gewonnen werden, die in die sekretorische Bahn der Zelle eingebracht werden.are generally available from O'-non-coding regions of prokaryotic, eukaryotic or viral genes, while transcription terminators are available from 3'-non-coding regions. Signal sequences can be obtained from the 5 'coding regions of preproteins which are introduced into the secretory pathway of the cell.
ein PG-Gen im Genom flankieren. Diese flankierenden Sequenzen haben beispielsweise Regulationsfunktionen, z.B. eineflank a PG gene in the genome. These flanking sequences have, for example, regulatory functions, e.g. a
größeren Derivaten eingeschlossen sind, besonders solchen, die Promotor-, Signal-, Struktur- oderlarger derivatives are included, especially those which promoter, signal, or structural
codieren oder ein Polypeptid mit Polygalacturonase-Aktivität codieren oder einen Transkriptionsterminatorbereich enthalten.encode or encode a polypeptide having polygalacturonase activity or contain a transcriptional terminator region.
welche einen Promotor- und/oder einen codierenden Bereich für ein Leader- oder Signalpeptid und/oder für eine PG und/odereinen Transkriptionsterminator und ähnliches enthalten.which contain a promoter and / or a coding region for a leader or signal peptide and / or for a PG and / or a transcription terminator and the like.
zu etwa 2000, vorzugsweise bis zu etwa 500 bis 1400 Nucleotide stromaufwärts. Ein Promotorbereich bindet RNA-Polymerasewie auch Regulationsproteine.at about 2000, preferably up to about 500 to 1400 nucleotides upstream. A promoter region binds RNA polymerase as well as regulatory proteins.
umfaßt, erstreckt sich beispielsweise von Position 1 bis zu Position 1356 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 2. Bei einem A. nlger-NW756-Einschub von pGW1756 erstreckt sich ein Fragment, das den Promotorbereich von pgall umfaßt, beispielsweise von Position 1 bis zu Position 889 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 3. Im A. niger-Einschub von pGW 1910 erstreckt sich ein Fragment, das den Promotorbereich von pgaC umfaßt, von der Position 1 bis zur Position 662 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 4. Ein Fragment, welches die DNA-Sequenzcodierung für ein Leader-Peptid einer Präpro-PG enthält, erstreckt sich beispielsweise zwischen dem Ende des Promotors und dem Beginn der Sequenz, welche reifes Protein codiert. Ein codierender Bereich für ein Signalpeptid ist kürzer als der für das entsprechende Leader-Peptid. Er beginnt ebenfalls am Ende des Promotors und erstreckt sich bis zu einem codierenden Bereich für eine Signalpeptidasespaltstelle. Bei einer A. nlger N 400-Präpro-PGII umfaßt das Leader-Peptid 27 Aminosäuren. Ein DNA-Fragment, welches das Leader-Peptid codiert, erstreckt sich beispielsweise vom ATG-Couon in der Position 1357 bis zur Xhol-Spaltstelle in der Position 1429 der DNA-Sequenz mit der SEQ ID NO. 2. Bei der Präpro-PGI hat das Leader-Peptid 31 Aminosäuren. Ein DNA-Fragment mit der Codierung für dieses Leader-Peptid erstreckt sich beispielsweise zwischen den Positionen 910 und 1002 der DNA-Sequenz mit der SEQ ID NO. 1. Das Leader-Peptid der A.nlger-NW756-Präpro-PGII hat vermutlich 27 Aminosäuren, und folglich ist das DNA-Fragment, welches das Leader-Peptid codiert, das 81 bp lange DNA-Fragment, das sich zwischen den Positionen 889 und 971 in der DNA-Sequenz mit der SEQ ID NO. 3 erstreckt. Das DNA-Fragment, welches das vermutlich 40 Aminosäuren große Leader-Peptid des pgaC-Genproduktes von A. niger-N400 codiert, erstreckt sich von der Basenposition 663 bis zu 782 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 4. Die codierenden Bereiche für die entsprechenden Signalpeptide befinden sich beispielsweise auf den folgenden DNA-Fragmenten: Basenpositionen 911 bis 963 bei SEQ ID NO. 1,1358 bis 1419 bei SEQ ID NO. 2,890 bis 962 bei SEQ ID NO. 3 und 663 bis 710 bei SEQ ID NO. 4.includes, for example, from position 1 to position 1356 of the sequence of SEQ ID NO. 2. In an A. nlger NW756 insert of pGW1756, a fragment comprising the promoter region of pgall, for example, from position 1 to position 889 of the sequence having SEQ ID NO. 3. In the A. niger insert of pGW 1910, a fragment comprising the promoter region of pgaC extends from position 1 to position 662 of the sequence of SEQ ID NO. 4. A fragment containing the DNA sequence coding for a leader peptide of a prepro-PG, for example, extends between the end of the promoter and the beginning of the sequence encoding mature protein. A coding region for a signal peptide is shorter than that for the corresponding leader peptide. It also begins at the end of the promoter and extends to a coding region for a signal peptidase cleavage site. In an A. niger N 400 prepro PGII, the leader peptide comprises 27 amino acids. For example, a DNA fragment encoding the leader peptide extends from the ATG coon at position 1357 to the Xho I cleavage site at position 1429 of the DNA sequence of SEQ ID NO. 2. In prepro PGI, the leader peptide has 31 amino acids. For example, a DNA fragment coding for this leader peptide extends between positions 910 and 1002 of the DNA sequence of SEQ ID NO. 1. The leader peptide of A. nlger NW756 prepro PGII is thought to have 27 amino acids, and thus the DNA fragment encoding the leader peptide is the 81 bp DNA fragment located between positions 889 and 971 in the DNA sequence having SEQ ID NO. 3 extends. The DNA fragment encoding the presumably 40 amino acid leader peptide of the A. niger N400 pgaC gene product extends from base position 663 to 782 of the sequence of SEQ ID NO. 4. The coding regions for the corresponding signal peptides are, for example, on the following DNA fragments: Base positions 911 to 963 in SEQ ID NO. 1,1358 to 1419 in SEQ ID NO. 2,890 to 962 in SEQ ID NO. 3 and 663 to 710 in SEQ ID NO. 4th
Ein Fragment, welches den gesamten codierenden Bereich für die reife PGI umfaßt, erstreckt sich beispielsweise von Position 1003 bis zu Position 2127 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 1. Ein Fragment, welches den gesamten codierenden Bereich für die reife A. nlger-N 400-PGII umfaßt, eratreckt sich beispielsweise von Position 1430 bis zu 2497 der Sequenz mit der SEQID NO. 2. Reife A.nlgar-NW756-PGII wird beispielsweise durch das DNA-Fragment codiert, welches sich von Position 953 bis 2027 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 3 erstreckt, und das reife pgaC-Genprodukt wird beispielsweise durch das DNA-Fragment codiert, das sich zwischen den Basen No. 782 und 1996 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 4 erstreckt. Aber auch kürzere Fragmente können Polypeptide, welche PG-Aktivität beibehalten, codieren.For example, a fragment comprising the entire coding region for the mature PGI extends from position 1003 to position 2127 of the sequence of SEQ ID NO. 1. A fragment comprising the entire coding region for the mature A. niger N 400 PGII extends, for example, from position 1430 to 2497 of the sequence having the SEQ ID NO. 2. Mature A.nlgar-NW756-PGII is encoded, for example, by the DNA fragment which extends from position 953 to 2027 of the sequence of SEQ ID NO. 3, and the mature pgaC gene product is encoded, for example, by the DNA fragment extending between bases no. 782 and 1996 of the sequence with the SEQ ID NO. 4 extends. But even shorter fragments can encode polypeptides that retain PG activity.
Die Strukturgene von PGII oder PGI sowie von anderen PG können, wie viele Pilzgene, Introns enthalten. In den Rahmen der vorliegenden Erfindung sind jedoch auch intronfreie Strukturgene von PG einbezogen, z.B. solche, dia Introns nicht als genomische DNA-Sequenz enthalten oder auch solche, die von cDNA gewonnen werden können.The structural genes of PGII or PGI as well as other PGs, like many fungal genes, may contain introns. However, the scope of the present invention also includes intron-free structural genes of PG, e.g. those that do not contain introns as a genomic DNA sequence or even those that can be obtained from cDNA.
Ein Fragment, das einen Transkriptionsterminatorbereich umfaßt, erstreckt sich beispielsweise von einem Stoppcodon, z. B. TAA, TAG oder TGA, am Ende des codierenden Bereichs für eine PG, bis zu etwa 300 bis 2000, vorzugsweise bis zu etwa 500 bis 1000 Basenpaaren stromabwärts.For example, a fragment comprising a transcription terminator region extends from a stop codon, e.g. As TAA, TAG or TGA, at the end of the coding region for a PG, up to about 300 to 2000, preferably up to about 500 to 1000 base pairs downstream.
Ein solches Fragment erstreckt sich beispielsweise von Basenposition 2131 bis zu 2495 der Sequenz mit der SEQ ID NO. 1, von 2498 bis 3031 in der Sequenz mit der SEQ ID NO. 2, von 2031 bis 3047 in der Sequenz mit der SEQ ID NO. 3 und von 1999 bis 2304 in der Sequenz mit der SEQ ID NO. 4.Such a fragment extends, for example, from base position 2131 to 2495 of the sequence of SEQ ID NO. 1, from 2498 to 3031 in the sequence of SEQ ID NO. 2, from 2031 to 3047 in the sequence of SEQ ID NO. 3 and from 1999 to 2304 in the sequence with the SEQ ID NO. 4th
Die vorstehend genannten Fragmente können jedoch durch die natürlich 5'-flankierenden Sequenzen erweitert werden, oder sie können am 5'- oder 3'-Ende verkürzt werden und können trotzdem ihre Promotor- oder Transkriptionsterminatoraktivität beibehalten, oder die codierten Polypeptide können Signalpeptid- oder Galacturonase-Aktivität beibehalten. Auch diese Fragmente sind in den Rahmen der Erfindung einbezogen.However, the above-mentioned fragments may be extended by the naturally 5 'flanking sequences, or they may be truncated at the 5' or 3 'end and yet retain their promoter or transcriptional terminator activity, or the encoded polypeptides may be signal peptide or galacturonase Keep activity. These fragments are also included in the scope of the invention.
Die vorstehend genannten Fragmente können Linker enthalten oder durch Linker flankiert werden, welche für eine erfolgreiche Kopplung an andere DNA-Moleküle sorgen und/oder DNA-Fragmente mit Regulationsfunktionen oder der Codierung für ein Polypeptid, z. B. Promotor- und Strukturgen, in das korrekte Leseraster oder Abstand bringen können.The aforementioned fragments may contain linkers or be flanked by linkers which provide for successful coupling to other DNA molecules and / or DNA fragments having regulatory functions or coding for a polypeptide, e.g. As promoter and structural gene, in the correct reading frame or distance can bring.
Geeignete Linker für die oben genannten Fragmente haben eine DNA-Sequenz, welche in den Restriktionsort der DNA paßt, mit welcher das Fragment gekoppelt werden soll. Sie können einen im voraus bestimmten Rostriktionsort enthalten. Mutanten einer DNA-Sequenz der Erfindung sind z. B. natürlich vorkommende Mutanten. Die Erfindung umfaßt auch natürliche oder synthetische Mutanten des coierenden Bereichs für die Signal- oderteader-Peptide mit einem ähnlichen oder identischen Hydrophobizitätsprofil, z. B. solche, bei denen die Codone für die polaren Aminosäuren Histidin (H6+), Tyrosin (Y9') und Arginin (R5+) durch Codone für andere Aminosäuren mit ähnlichen Ladungen ausgetauscht sind, und die hydrophoben Aminosäuren Alanin (A), Leucin (L) und (T) Threonin durch Codone für andere hydrophobe Aminosäuren ersetzt sind. Beispielsweise kann der Codon für das positiv geladene Lysin durch einen Codon für Arginin ersetzt werden und umgekehrt, der Codon für das negativ geladene Tyrosin durch einen Codon für Glutamat oder Aspartat und/oder der Codon für das nichtpolare, hydrophob» Alanin durch einen der Codone für Threonin, Prolin, Valin, Isoleucin, Leucin, Methionin oder Phenylalanin und ähnliches. Ein rekombinantes DNA-Molekül der Erfindung umfaßt tuch DNA-Sequenzen, die im Sinne des genetischen Codes dahingehend degeneriert sind, daß eine unbegrenzte Zahl von Nucleotiden durch andere Nucleotide ersetzt wird, ohne die Aminosäurefolge zu ändern, welche sie codieren. Derartige degenerierte DNA-Folgen können auf Grund ihrer unterschiedlichen Restriktionsorte oder auf Grund einer bevorzugten Codonnutzung bei einem bestimmten Wirt von Nutzen sein.Suitable linkers for the above-mentioned fragments have a DNA sequence which fits into the restriction site of the DNA with which the fragment is to be coupled. They may contain a predetermined site of restriction. Mutants of a DNA sequence of the invention are e.g. B. naturally occurring mutants. The invention also encompasses natural or synthetic co-domain mutants for the signal or titer peptides having a similar or identical hydrophobicity profile, e.g. For example, those in which the codons for the polar amino acids histidine (H 6+ ), tyrosine (Y 9 ') and arginine (R 5+ ) are replaced by codons for other amino acids with similar charges, and the hydrophobic amino acids alanine (A ), Leucine (L) and (T) threonine are replaced by codons for other hydrophobic amino acids. For example, the codon for the positively charged lysine can be replaced by a codon for arginine and vice versa, the codon for the negatively charged tyrosine by a codon for glutamate or aspartate and / or the codon for the nonpolar, hydrophobic alanine by one of the codons for Threonine, proline, valine, isoleucine, leucine, methionine or phenylalanine and the like. A recombinant DNA molecule of the invention comprises cloth DNA sequences that are degenerate in the sense of the genetic code such that an infinite number of nucleotides are replaced by other nucleotides without altering the amino acid sequence which they encode. Such degenerate DNA sequences may be useful because of their different restriction sites or preferred codon usage in a particular host.
Ein recombinantes DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung umfaßt vorzugsweise den Aspergillus nlger-DNA-Einschub eines Hybridvektors, der aus der Gruppe von Hybridvektoren ausgewählt wird, die besteht aus pGW1800, pGW1900, pGW1756, pGW1910, XPG-A9, XPG-A10, XPG-A43, XPH-B4, XPG-B35, APG-B36, XPG-C1, XPG-C16, XPG-C20, XPG-C37, XPG-D8, XPG-D11, XPG-D12, XPG-E6, XPG-E38, XPG-F5, XPG-G17, XPG- G27, XPG-X31 und XPG-Y33 oder einem Fragment davon, das einen Promotorbereich von einem PG-Gen umfaßt, oder einen codierenden Bereich für ein Signalpeptid, Leader-Peptid, Präpro-PG, PG oder ein Fragment einer PG mit Polygalacturonase-Aktivität oder einen Transkriptionsterminatorbereich sinos PG-Gens. Die Einschübe selbst werden auch durch die vorliegende Erfindung erfaßt.A recombinant DNA molecule of the present invention preferably comprises the Aspergillus nlger DNA insert of a hybrid vector selected from the group of hybrid vectors consisting of pGW1800, pGW1900, pGW1756, pGW1910, XPG-A9, XPG-A10, XPG- A43, XPH-B4, XPG-B35, APG-B36, XPG-C1, XPG-C16, XPG-C20, XPG-C37, XPG-D8, XPG-D11, XPG-D12, XPG-E6, XPG-E38, XPG-F5, XPG-G17, XPG-G27, XPG-X31 and XPG-Y33 or a fragment thereof comprising a promoter region of a PG gene, or a coding region for a signal peptide, leader peptide, prepro-PG, PG or a fragment of a PG with polygalacturonase activity or a transcriptional terminator region sinos PG gene. The inserts themselves are also covered by the present invention.
Die Erfindung betrifft auch rekombinante DNA-Moleküle, welche Expressionskassetten sind, die einen Promotorbereich umfassen, ein DNA-Fragment, welches ein Leader- oder Signalpeptid codiert, ein Strukturgen und/oder einen Transkriptionsterminatorbereich der Erfindung, vorzugsweise solche, die von einem Vektor abgeleitet wurden, der aus der oben genannten Gruppe von Vektoren ausgewählt wurdeThe invention also relates to recombinant DNA molecules which are expression cassettes comprising a promoter region, a DNA fragment encoding a leader or signal peptide, a structural gene and / or a transcriptional terminator region of the invention, preferably those derived from a vector which was selected from the above group of vectors
Unter dem Begriff „Expressionskassette" versteht man eine DNA-Sequenz, die zum Ausprägen eines Polypeptids in der Lage ist By the term "expression cassette" is meant a DNA sequence capable of expressing a polypeptide
und einen Promotor, auf Wunsch eine Signalsequenz, außerdem ein Strukturgen, auf Wunsch einen Transkriptionsterminator und wahlweise einen Transkriptionsverstärker, ribosomale Bindungsstelle und/oder weitere Regulationssequenzen umfaßt. In einer Expressionskassette der Erfindung können die PG-genabgeleiteten funktioneilen Fragmente mit funktioneilen Fragmenten, die von anderen Genen abgeleitet wurden, kombiniert werden.and a promoter, optionally a signal sequence, also a structural gene, optionally a transcription terminator and optionally a transcriptional enhancer, ribosomal binding site and / or further regulatory sequences. In an expression cassette of the invention, the PG gene-derived functional fragments can be combined with functional fragments derived from other genes.
Es kann eine breite Vielfalt von Promotorsequenzen in Abhängigkeit von der Natur der Wirtszelle eingesetzt werden. Am nützlichsten sind Promotoren, die stark und gleichzeitig gut reguliert sind. Sequenzen für die Initiierung der Translation sind beispielsweise Shine-Dalgarno-Sequenzen. Sequenzen» die für die Initiierung und Termination der Transkription und für die Stabilisierung der mRNA notwendig sind, stehen im allgemeinen aus den nichtcodierenden 5'-Bereichen bzw. 3'-Bereichen von Viren- oder eukaryotischen cDNA, z. B. vom Expressionswirt, zur Verfügung.A wide variety of promoter sequences can be employed depending on the nature of the host cell. Most useful are promoters that are strong and well regulated at the same time. Sequences for the initiation of translation are, for example, Shine-Dalgarno sequences. Sequences which are necessary for the initiation and termination of transcription and for the stabilization of the mRNA are generally composed of the non-coding 5'-regions or 3'-regions of viral or eukaryotic cDNA, e.g. B. from the expression host available.
Beispiele für Promotoren sind APL, XPr, E. coil Iac, trp, tac, Hefe-TRP 1 -, ADHI-, ADHII-, PHO 3-, PHO 5- oder glycolytische Promotoren, wie der Promotor von Enolase-, GlyceraldehydO-phosphatdehydrogenase-, 3-Phosphogryceratkinase- (PGK-), Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofructokinase-, Glucose-e-phosphatisomerase-, S-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucoseisomerase- und Glucokinase-Genen, oder Promotoren, die von eukaryotischen Viren abgeleitet wurden, z. B. vom SV40, Rous-Sarcomvirus, Adenovirus 2, Rinderpapillomvirus, Papovavirus, Cytomgalovirus abgeleitete Promotoren oder von Säugetierzellen abgeleitete Promotoren, z. B. das Actin-, Collagen-, Myosin oder ß-Globin-Gen. Die eukaryotischen Promotoren können mit verstärkenden Sequenzen kombiniert werden, wie den stromaufwärts aktivierenden Sequenzen (UAS) von Hefe, oder Viren- oder Zellenverstärkungselementen, wie den Cytomgalovirus-IE-Verstärkungselementeri, SV40-Verstärkern-, Immunoglobulingenverstärkungselementen oder anderen. Verstärker sind transkriptionsstimulierende DNA-Sequenzen, die z. B. von Viren wie dem Simian-Virus, dem Polyom-Virus, dem Rinder-Papillom-Virus oder dem Moloney-Sarcom-Virus abgeleitet wurden oder genomischen Ursprungs sind. Eine Verstärkersequenz kann auch von der extrachromosomalen Ribosomal-DNA von Physarum polycephalum (PCT/EP 8500278) abgeleitet werden, oder sie kann die Stromaufwärtsaktivierungsstelle des Säurephosphatase-PHO 5-Gens (EP ApI. No.86111820.6) oder der PHO 5-, trp-, PHO5-GAPDH-Hybrid (EP Appl. No.86111820.6) oder ein ähnlicher Promotor sein. Signalsequenzen können beispielsweise eine Vorsequenz oder ein sekretorisches Leader-Element sein, welche die Sekretion des Polypeptid steuern, oder ähnliches. Eine Signalsequenz ist beispielsweise ein Signal oder ein Leader-Peptid der Präpro-PGI, Propro-PGII oder Präpro-PGC. Weitere Signalsoquenzen sind aus der Literatur bekannt, z. B. der von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14,4683 (1986), zusammengestellten.Examples of promoters are AP L , XPr, E. coli coli, trp, tac, yeast TRP 1, ADHI, ADHII, PHO 3, PHO 5 or glycolytic promoters, such as the promoter of enolase, glyceraldehyde-O phosphate dehydrogenase, 3-phosphogrycerate kinase (PGK), hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase, glucose-e-phosphate isomerase, S-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, triosephosphate isomerase, phosphoglucose isomerase and glucokinase genes, or promoters derived from eukaryotic viruses, e.g. SV40, Rous sarcoma virus, adenovirus 2, bovine papilloma virus, papovavirus, cytomgalovirus-derived promoters, or mammalian cell-derived promoters, e.g. As the actin, collagen, myosin or ß-globin gene. The eukaryotic promoters can be combined with enhancing sequences, such as yeast upstream activating sequences (UAS), or viral or cell enhancement elements, such as the cytomegalovirus IE enhancer elements, SV40 enhancer, immunoglobulin amplification elements, or others. Enhancers are transcription-stimulating DNA sequences, the z. Derived from viruses such as simian virus, polyoma virus, bovine papilloma virus or Moloney sarcoma virus, or of genomic origin. An enhancer sequence can also be derived from the extra chromosomal ribosomal DNA of Physarum polycephalum (PCT / EP 8500278), or it can be the upstream activating site of the acid phosphatase PHO 5 gene (EP ApI No. 86111820.6) or the PHO 5, trp , PHO5-GAPDH hybrid (EP Appl. No. 86111820.6) or a similar promoter. Signal sequences may be, for example, a pre-sequence or a secretory leader element that direct secretion of the polypeptide, or the like. A signal sequence is, for example, a signal or a leader peptide of prepro PGI, propro PGII or prepro PGC. Further signal sequences are known from the literature, for. For example, that of Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14,4683 (1986).
Strukturgene sind in diesem Zusammenhang neben denen mit der Codierung für PGI oder PGII auch die mit der Codierung für andere PG oder Derivate, insbesondere Fragmente, mit PG-Äktivität oder andere Aspergillus-Gene und Strukturgene, die ihren Ursprung in Viren, prokaryotischen Zellen oder eukaryotischen Zellen haben und die von genomischer DNA oder von cDNA abgeleitet werden können, welche über die mRNA-Route hergestellt wurden oder chemisch synthetisiert werden können, mit der Codierung für eine breite Vielfalt von brauchbaren Polypeptiden, einschließlich glycosylierter Polypeptide, insbesondere von höherem eukaryotischem, vor allem Säugetier-, wie tierischem oder vor allem menschlichem Ursprung, wie Enzymen, die beispielsweise für die Herstellung von Lebensmitteln und für die Ausführung von enzymatischen Reaktionen in der Chemie eingesetzt werden können, oder Polypeptide, die nützlich und wertvoll für die Behandlung von menschlichen und tierischen Krankheiten oder für deren Verhinderung sind, beispielsweise Hormone, Polypeptide mit immunmodulatorischen, Antiviren- und Antitumoreigenschafton, Antikörper, Virenantigene, Vakzine, Gerinnungsfaktoren, Lebensmittel und ähnliches. Beispiele für solche Strukturgene sind z. B. die mit der Codierung für Hormone, wie Secretin, Thymosin, Relaxin, Calcitonin, luteinisierendes Hormon, Parathyroidhormon, Adrenocorticotropin, melanocytstimulierendes Hormon, ß-Lipotropin, Urogastron oder Insulin, Wachstumsfaktoren, wie epidermischer Wachstumsfaktor, insulinartiger Wachstunisfaktor (IGF), z. B. IGF-I und IGF-I), Mastzellenwachstumsfaktor, Nervenzellenwachstumsfaktor, gliaabgeleiteter Nervenzellenwachstumsfaktor, oder transformierender Wachstumsfaktor (TGF), wie TGFß, Wachstumshormone, wie menschliche oder Rinderwachstumshormone, Interleukin, wie lnterleukin-1 oder -2, menschlicher Makrophagemigrationsur.terbindungsfaktor (MIF), Interferone, wie das menschliche α-Interferon, beispielsweise Interferon-aA, -aB, -aD oder aF, ß-lnterferon, y-lnterferon oder ein Hybridinterferon, beispielsweise ein ciA-aD- oder ein aB-aD-Hybridinterferon, vor allem das Hybridinterferon BDBB, Proteinaseinhibitoren, wie a,-Antitrypsin, SLOI und ähnliche, Heptatitisvirusantigene, wie das Oberflächen- oder Kernantigen von Hepatitis-B-Virus oder das Hepatitis-A-Virusantigen oder das Hepatitis-Nicht-A-Nicht-B-Antigen, Plasminogenaktivatoren, wie der Gewebeplasminogenaktivator oder Urokinase, Tumornekrosefaktor, Somatostatin, Renin, ß-Endophin, Immunoglobuline, wie die leichte und/oder schwere Kette von Immunglobulin D, E oder G, oder Mensch-Maus-Hybrid-Immunglobuline, Immunglobulinbindungsfaktoren, wie der Immunglobulin-E-Bindungsfaktor, Calcitonin, dem menschlichen Calcitonin verwandtes Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX oder VIIIc, Erythropoietin, Eglin, wie Eglin C, Hirudin, Desulfathirudin, wie Desulfathirudinvariante HV1, HV2 oder PA, menschliche Superoxiddismutase, Virenthymidinkinase, ß-Lactamase, Glucoseisomerase. Bevorzugte Gene sind die mit der Codierung für ein menschliches α-Interferon oder Hybridinterferon, besonders Hybridinterferon BDBB, den menschlichen Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), das Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen (HBVsAg), die insulinartigen Wachstumsfaktoren I und II, Eglin C und Desulfathirudin, z. B. Variante HV1. Bei den Hybridvektoren der vorliegenden Erfindung ist die vorliegende Promotor- und/oder Signalsequenz operabel an den polypeptidcodierenden Bereich gekoppelt, um so die effektive Expression des Polypeptids zu gewährleisten. Die Erfindung betrifft auch rekombinante DNA-Moleküle, welche rekombinante Vektoren, auch als Hybridvektoren bezeichnet sind, die eine DNA-Sequenz umfassen, die ausgewählt wird aus tStructural genes in this context, in addition to those coding for PGI or PGII, include those coding for other PGs or derivatives, in particular fragments, PG activity or other Aspergillus genes and structural genes originating in viruses, prokaryotic cells or eukaryotic genes Have cells and that can be derived from genomic DNA or cDNA which have been prepared via the mRNA route or can be synthesized chemically, with the coding for a wide variety of useful polypeptides, including glycosylated polypeptides, especially higher eukaryotic, especially Mammalian, animal or, more particularly, human origin, such as enzymes which can be used, for example, for the production of foods and for the performance of enzymatic reactions in chemistry, or polypeptides which are useful and valuable for the treatment of human and animal diseases or f r are the prevention, for example, hormones, polypeptides with immunomodulatory, anti-virus and Antitumoreigenschafton, antibodies, virus antigens, vaccines, clotting factors, foodstuffs and the like. Examples of such structural genes are, for. Hormone coding such as secretin, thymosin, relaxin, calcitonin, luteinizing hormone, parathyroid hormone, adrenocorticotropin, melanocyte stimulating hormone, β-lipotropin, urogastrone or insulin, growth factors such as epidermal growth factor, insulin-like growth factor (IGF), e.g. , IGF-I and IGF-I), mast cell growth factor, nerve cell growth factor, glial derived nerve cell growth factor, or transforming growth factor (TGF) such as TGFβ, growth hormones such as human or bovine growth hormone, interleukin such as interleukin-1 or -2, human macrophage migration inhibitory factor ( MIF), interferons, such as human α-interferon, for example interferon-aA, -aB, -aD or aF, β-interferon, y-interferon or a hybrid interferon, for example a ciA-aD or aB-aD hybrid interferon, especially the hybrid interferon BDBB, proteinase inhibitors such as a, antitrypsin, SLOI and the like, hepatitis virus antigens such as the hepatitis B virus surface or core antigen or the hepatitis A viral antigen or the hepatitis non-A non-B Antigens, plasminogen activators, such as tissue plasminogen activator or urokinase, tumor necrosis factor, somatostatin, renin, beta-endophin, immunoglobulins, such as the light and / or heavy Ke of immunoglobulin D, E or G, or human-mouse hybrid immunoglobulins, immunoglobulin binding factors such as immunoglobulin E-binding factor, calcitonin, human calcitonin-related peptide, blood coagulation factors such as factor IX or VIIIc, erythropoietin, eglin such as eglin C, hirudin, desulfathirudin, such as desulfathirudin variant HV1, HV2 or PA, human superoxide dismutase, virus thymidine kinase, β-lactamase, glucose isomerase. Preferred genes are those coding for a human alpha interferon or hybrid interferon, especially hybrid interferon BDBB, human tissue plasminogen activator (t-PA), hepatitis B virus surface antigen (HBVsAg), insulin-like growth factors I and II, eglin C and desulfathirudin, e.g. B. Variant HV1. In the hybrid vectors of the present invention, the present promoter and / or signal sequence is operably linked to the polypeptide coding region so as to ensure the effective expression of the polypeptide. The invention also relates to recombinant DNA molecules which are recombinant vectors, also referred to as hybrid vectors, comprising a DNA sequence selected from t
a) dem Aspergillus nlger-DNA-Einschub von pGW 1800 oder pGW 1900,a) the Aspergillus nlger DNA insert of pGW 1800 or pGW 1900,
b) einer DNA-Sequenz, welche an den codierenden Bereich für die reife PGII oder PGI hybridisiert, die durch einen DNA-Einschub von a) umfaßt wird,b) a DNA sequence which hybridizes to the coding region for the mature PGII or PGI encompassed by a DNA insert of a),
c) einem Derivat einer in a) oder b) definierten DNA-Sequenz oderc) a derivative of a DNA sequence defined in a) or b) or
d) einer DNA-Sequenz von a), b) oder c), weiche für eine reife PG oder deren Signalpeptid oder Leader-Peptid codiert und welche innerhalb der Bedeutung des genetischen Codes degeneriert ist.d) a DNA sequence of a), b) or c), which encodes a mature PG or its signal peptide or leader peptide and which is degenerate within the meaning of the genetic code.
Baculovirus, Phage λ, z.B. NM 939 oder EMBLM, oder Phage M13, z.B. M13mp8-Phage-DNA (Ref. 15), linearisiart durch BamHI-Digerieren, bakterielle Plasmide, ζ. B. pBR322, pUC 18, oder Hefe-Plasmide, z. B. Hefe-2 μ-Plasmid, oder auch chromosomaler DNA, die z.B. von Fadenpilzen, wie Asperglllus spec, abgeleitet wurde, z.B. A.niger, beispielsweise die durch EP 184438 beschriebenen, oder von einem defekten Virus, Phagen oder fiasmid bei Anwesenheit eines Helfervirus, -phagen oder -plasmids, was die Replikation dos defekten Virus, Phagen oder Plasmids ermöglicht, z. B. M13(+)KS-Vektor bei Anwesenheit von z.B. einem M14KO7-Helferphage·»Baculovirus, phage λ, e.g. NM 939 or EMBLM, or phage M13, e.g. M13mp8 phage DNA (Ref. 15), linearized by BamHI digests, bacterial plasmids, ζ. PBR322, pUC 18, or yeast plasmids, e.g. Yeast 2μ plasmid or chromosomal DNA, e.g. derived from filamentous fungi such as Asperglllus spec, e.g. A.niger, for example those described by EP 184438, or a defective virus, phage or fiasmid in the presence of a helper virus, phage or plasmid, which allows the replication of defective virus, phage or plasmid, z. B. M13 (+) KS vector in the presence of e.g. an M14KO7 helper phage · »
Die Hybridvektoren der Erfindung ermöglichen die Replikation und wahlweise die Expression einer gewünschten DNA in einem geeigneten Wirt, entweder als einem extrachromosomalon Element oder durch Integration in das Wirtschromosom. Verschiedene mögliche Vektorsysteme stehen für die Integration und Expression der klonierten DNA der Erfindung zur Verfugung. Im Prinzip sind alle Vektoren, welche ein gewünschtes Polypeptidgen, das in einer Expressionskassette der Erfindung in dem gewählten Wirt enthalten ist, replizieren und/oder ausprägen, geeignet. Der Vektor wird in Abhängigkeit von den für die Transformation vorgesehenen Wirtszellen ausgewählt. Im allgemeinen können diese Wirtszellen prokarvotische oder eukaryotische Mikroorganismen, wie Bakterien, Piize, Hefen oder Fadenpilze, oder Zellen von höherem eukaryotischem Ursprung, wie Wirbeltierzellen, ζ. B. Säugetierzellen, sein. Geeignete Wirtszellen werden unten detailliert behandelt. Im Prinzip umfassen die Hybridvektoren der Erfindung die DNA, wie sie vorstehend definiert wurde, einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz, dominante Marker-Sequenzen, wahlweise Expressionskontrollsequenzen, die wesentlich für die Transkription und Translation der gewünschten DNA und wahlweise für die Sekretion des gewünschten Produktes sind, und wahlweise zusätzliche Restriktionsorte.The hybrid vectors of the invention allow replication and optionally expression of a desired DNA in a suitable host, either as an extrachromosomal element or by integration into the host chromosome. Various possible vector systems are available for the integration and expression of the cloned DNA of the invention. In principle, all vectors which replicate and / or express a desired polypeptide gene contained in an expression cassette of the invention in the chosen host are suitable. The vector is selected depending on the host cells intended for transformation. In general, these host cells may be prokaryotic or eukaryotic microorganisms, such as bacteria, piires, yeasts or filamentous fungi, or cells of higher eukaryotic origin, such as vertebrate cells, ζ. B. mammalian cells. Suitable host cells are discussed in detail below. In principle, the hybrid vectors of the invention comprise the DNA as defined above, an origin of replication or an autonomously replicating sequence, dominant marker sequences, optionally expression control sequences essential for the transcription and translation of the desired DNA and optionally for the secretion of the desired product and optionally additional restriction sites.
Ein Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ein DNA-Element, das Fähigkeit der autonomen Replikation auf extrachromosomale Elemente überträgt) werden entweder durch eine solche Konstruktion des Vektors, daß dieser einen exogenen Ursprung, wie er beispielsweise vom Simian-Virus (SV40) oder einer anderen Virenquelle abgeleitet wird, enthält oder durch Chromosomenmechanismen der Wirtszelle geschaffen.An origin of replication or an autonomously replicating sequence (a DNA element that confers autonomous replication capability on extrachromosomal elements) is either by such a construction of the vector that it has an exogenous origin, such as the Simian virus (SV40) or a derived from other virus source, or created by chromosomal mechanisms of the host cell.
Ein Hybridvektor der erfindungsgemäßen Molekülo der vorliegenden Erfindung kann selektive Marker in Abhängigkeit von dem Wirt enthalten, der zu transformieren ist, ausgewählt und Moniert wird. Es kann jedes Marker-Gen verwendet werden, welches die Auswahl von Transformanten auf Grund der phänüiypischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker sind vor allem die, welche antibiotische Resistors: ausprägen, z. B. gegen Tetracyclin oder Ampicillin, oder bei auxotrophen Pilzmutanten Gene, welche Wirtsschäden komplementieren. Entsprechende Gene übertragen beispielsweise Resistenz gegenüber dem antibiotischen Cycloheximid oder sorgen für Prototrophie in einem auxotrophen Hefemutanten, beispielsweise das ure 3-, leu 2-, hls3- oder trp 1-Gen. Man kann als Marker auch Strukturgene einsetzen, die einem autonom replizierenden Segment zugeordnet sind, vorausgesetzt, daß der zu transformierende Wirt auxotroph für das Produkt ist, das durch den Marker ausgeprägt wird. Von besonderem Interesse sind Marker-Gene, die A. nlger-Wirtsschäden komplementieren, wie das argB-Gen mit der Codierung für Ornithincarbamoyitransferase, das z. B. von A. nlger oder A. nidulans (EP 184438) oder A.nidulans-DNA-Fragmenten abgeleitet wird, die homolog zum N.crassa pyr4-Gen sind (Ref.27).A hybrid vector of the molecules of the present invention may contain selective markers depending on the host to be transformed, selected and cloned. Any marker gene can be used which facilitates the selection of transformants due to the phenotypic expression of the marker. Suitable markers are especially those which antibiotic Resistors: express, z. Against tetracycline or ampicillin, or in auxotrophic fungal mutants, genes that complement host damage. Corresponding genes, for example, confer resistance to the antibiotic cycloheximide or provide prototrophy in an auxotrophic yeast mutant, for example the ure 3, leu 2, hls3 or trp 1 gene. It is also possible to use as structural markers structural genes associated with an autonomously replicating segment, provided that the host to be transformed is auxotrophic for the product expressed by the marker. Of particular interest are marker genes that complement A. nlger host damage, such as the argB gene encoding ornithine carbamoyl transferase, e.g. Derived from A. nlger or A. nidulans (EP 184438) or A. nidulans DNA fragments that are homologous to the N.crassa pyr4 gene (Ref. 27).
Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung sind Hybridvektoren, die eine Expressionskassette der Erfindung umfassen, z. B. die, welche das Strukturgen und/oder den Promotor und/oder die DNA-Sequenzcodierung für ein Leader- oder Signalpeptid und/oder den Transkriptionsterminator umfassen, abgeleitet von einem PG-Gen der Erfindung. Beispiele von Hybridvektoren, welche eine Expressionskassette der Erfindung umfassen, sind pGW 1800, pGW1900, pGW1910, pGII-lFNAMmpGllss-IFNAmiig.pGWiyee, XPG-AIO, XPG-A43,XPG-D8 und XPG-D11.Preferred embodiments of the present invention are hybrid vectors comprising an expression cassette of the invention, e.g. Those comprising the structural gene and / or the promoter and / or the DNA sequence coding for a leader or signal peptide and / or the transcription terminator derived from a PG gene of the invention. Examples of hybrid vectors comprising an expression cassette of the invention are pGW 1800, pGW1900, pGW1910, pGII-IFNAMmpGlsss-IFNAmigig.pGWyee, XPG-AIO, XPG-A43, XPG-D8 and XPG-D11.
Gegenstand der Erfindung ist nicht nur ein rekombinantes DAN-Molekül, das einen von einem PG-Gen abgeleiteten Einschub umfaßt, wie das vorstehend definiert wurde, sondern auch ein DNA-Molekül,, das ein PG-Gen oder ein funktionelles Fragment von diesem umfaßt, z.B. die, welche einen Promotor, den codierenden Bereich für ein Signalpeptid, Leader-Peptid oder ein Protein mit PG-Aktivität oder den Transkriptionsterminatorbereich selbst umfassen, welches aus einem PG-produzierenden Pilzstamm isoliert werden kann, z. B. aus AsperglUus »{wc, beispielsweise A. japonlcus, A. oryzae, A. nidulans, A. nlger, Trlchoderma spec, Botrytls spec, Sclerotinla spec, Fusarlum Spec oder anderen phytopathogenen Pilzen sowie von Hefe, beispielsweise von PG-produzierenden Kluyveromyces spec, wie K.fragills. Bevorzugt werden DNA-Moleküle, die aus A. nlgor isoliert wurden.The subject of the invention is not only a recombinant DAN molecule comprising a PG-derived insert as defined above, but also a DNA molecule comprising a PG gene or a functional fragment thereof; eg those comprising a promoter, the coding region for a signal peptide, leader peptide or a protein having PG activity, or the transcriptional terminator region itself, which can be isolated from a PG-producing fungal strain, e.g. B. AsperglUus »{wc, for example, A. japonlcus, A. oryzae, A. nidulans, A. niger, Trlchoderma spec, Botrytls spec, Sclerotinla spec, Fusarlum spec or other phytopathogenic fungi and yeast, such as PG-producing Kluyveromyces spec, like K.fragills. Preference is given to DNA molecules isolated from A. nlgor.
Die DNA-Moleküle der Erfindung und deren Derivate, einschließlich der Fragmente, können zum Auslesen von DNA-Genbänken oder mRNA für weitere ähnliche DNA oder mRNA verwendet werden.The DNA molecules of the invention and their derivatives, including the fragments, can be used to read DNA gene banks or mRNA for other similar DNA or mRNA.
definiert wurde, welches die Züchtung eines Wirts umfaßt, der mit einem solchen rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist,oder dessen Herstellung durch eine In-vitro-Synthese.which comprises cultivating a host transformed with such a recombinant DNA molecule, or producing it by an in vitro synthesis.
chemische Verbindungen entzogen sein können, welche die negative oder positive Selektion der Transformanten ermöglichen,chemical compounds that allow the negative or positive selection of the transformants,
d. h., der Wirte, welche das gewünschte DNA-Molekül zusammen mit einem Selektionsmarker enthalten, aus dend. h., The hosts containing the desired DNA molecule together with a selection marker, from the
ein Mutant, dem das pyrA-Gen fehlt, wie unten beschrieben wird, oder A. nlgar N 593. Die Transformation der Wirte erfolgt nachherkömmlichen Methoden.a mutant lacking the pyrA gene, as described below, or A. nlgar N 593. Host transformation is by conventional methods.
pilzausprägenden Polygalacturonase gewonnen werden oder kann beispielsweise durch Züchtung eines Wirts hergestelltwerden, der mit einem rekombinanten DNA-Molekül der Erfindung transformiert und, wenn erforderlich, aus diesem diegewünschte DNA-Sequenz isoliert werden kenn, oder durch chemische Synthese durch Nucleotidkondensation.or can be prepared, for example, by cultivating a host which can be transformed with a recombinant DNA molecule of the invention and, if necessary, isolated from this desired DNA sequence, or by chemical synthesis by nucleotide condensation.
Im einzelnen können diese DNA hergestellt werden durchIn particular, these DNA can be prepared by
a) Isolierung von genomischer DNA aus geeigneten Pilzzellen und Auswahl der gewünschten DNA, z. B. unter Verwendung einer DNA-Sonde oder unter Verwendung eines geeigneten Expressionssystems und Auslesen auf Expression des gewünschten Polypeptide, odera) Isolation of genomic DNA from suitable fungal cells and selection of the desired DNA, e.g. Using a DNA probe or using a suitable expression system and reading for expression of the desired polypeptide, or
b) Isolierung von mRNA aus geeigneten Pilzzellen, Auswahl der gewünschten mRNA, z.B. durch Hybridisieren mit einer DNA-Sonde oder durch Expression in einem geeigneten Expressionssystem und Auslesen nach Expression des gewünschten Polypeptids, Herstellung von einzelsträngiger cDNA, die komplementär zu dieser mRNA ist, dann daraus doppelstrangiger cDNA, oderb) Isolation of mRNA from appropriate fungal cells, selection of the desired mRNA, e.g. by hybridization with a DNA probe or by expression in a suitable expression system and reading after expression of the desired polypeptide, production of single-stranded cDNA which is complementary to this mRNA, then double-stranded cDNA therefrom, or
c) Isolieren von cDNA aus einer cDNA-Bank und Auswahl der gewünschten cDNA, z. B. unter Verwendung einer DNA-Sondo oder unter Verwendung eines geeigneten Expressionssystems und Auslesen nach der Expression des gewünschten Polypeptids, und/oderc) isolating cDNA from a cDNA library and selecting the desired cDNA, e.g. Using a DNA probe or using a suitable expression system and reading after expression of the desired polypeptide, and / or
d) Einbezieheh der c'oppelsträ ngigen DNA aus Schritt a), b) oder c) in einen angemessenen Vektor,d) incorporation of the double-stranded DNA from step a), b) or c) into an appropriate vector,
e) Transformation geeigneter Wirtszellen mit dem gewonnenen Hybridvektor,e) transformation of suitable host cells with the obtained hybrid vector,
f) Selektion von transformierten Wirtszellen, welche die gewünschte DNA enthalten, von untransformierten Wirtszellen und Vervielfältigung der transformierten Wirtszellan und, wenn erforderlich,f) selecting transformed host cells containing the desired DNA from untransformed host cells and replicating the transformed host cell and, if necessary,
g) Isolieren der gewünschten DNA und/oder Umwandlung der DNA in einen. Mutanten oder dessen Fragment.g) isolating the desired DNA and / or converting the DNA into one. Mutants or its fragment.
Genomische DNA kann isoliert und auf die gewünschte DNA geprüft werden (Schritt a). Genomische DNA wird aus geeigneten Pilzstammexpressionsproteinen mit PG-Aktivität isoliert. Daraus wird durch Digerieren mit geeigneten Restriktionsendonucleasen und Einbeziehung in geeignete Vektoren nach bekannten Verfahren eine genomische DNA-Bank hergestellt. Die genomische DNA-Bank wird mit einer DNA-Sonde geprüft, wie das spä.er beschrieben wird, oder in einem geeigneten Expressionssystem ausgeprägt und die g owonnenen Polypeptide auf herkömmliche Weise geprüft. Eine detaillierte Beschreibung der Isolierung eines DNA-Moleküls der Erfindung aus einer genomischen Bank wird unten gegeben. Polyadenylierte Messenger-RNA (Schritt b) wird aus den geeigneten Zellen nach bekannten Methoden isoliert. Die Isolierungsmethoden schließen beispielsweise die Homogenisierung bei Anwesenheit eines Detergenten und eines Ribonucleaseinhibitors, z.B. Heparin, Guanidiniumisothiocyanat oder Mercaptoethanol, die Extraktion der mRNA mit geeigneten Chloroform-Phenol-Gemischen, wahlweise bei Anwesenheit von Salz- und Pufferlösungen, Detergenten und/oder Kationchelatbildnern, und das Ausfällen der mRNA aus der restlichen wäßrigen, salzhaltigen Phase mit Ethanol, Isopropanol oder ähnlichen ein. Die isolierte mRNA kann weiter gereinigt werden durch Zentrifugieren in einem Cesiumchloridgradienten, gefolgt von der Ethanolausfällung, und/oder durch chromatographische Methoden, z. B. Affinitätschromatographie, beispielsweise Chromatographie auf OligofdT j-Cellulose oder auf Oligo(U)-Sepharose. Vorzugsweise wird diese gereinigte Gesamt-mRNA nach der Größe durch Gradientenzentrifugieren, z.B. in einem linearen Sucrosegradienten, oder durch Chromatographie auf geeigneten Größenfraktionierungssäulen, z. B. auf Agarosegelen, fraktioniert.Genomic DNA can be isolated and assayed for the desired DNA (step a). Genomic DNA is isolated from suitable fungal strain expression proteins with PG activity. From this, a genomic DNA library is prepared by digestion with suitable restriction endonucleases and incorporation into suitable vectors by known methods. The genomic DNA library is probed with a DNA probe, as described later, or expressed in a suitable expression system, and the resulting polypeptides tested in a conventional manner. A detailed description of the isolation of a DNA molecule of the invention from a genomic library is given below. Polyadenylated messenger RNA (step b) is isolated from the appropriate cells by known methods. The isolation methods include, for example, homogenization in the presence of a detergent and a ribonuclease inhibitor, e.g. Heparin, guanidinium isothiocyanate or mercaptoethanol, the extraction of the mRNA with suitable chloroform-phenol mixtures, optionally in the presence of salt and buffer solutions, detergents and / or cation chelating agents, and precipitating the mRNA from the remaining aqueous, salt-containing phase with ethanol, isopropanol or similar one. The isolated mRNA can be further purified by centrifugation in a gradient of cesium chloride, followed by ethanol precipitation, and / or by chromatographic methods, e.g. As affinity chromatography, for example chromatography on OligofdT j-cellulose or oligo (U) -Sepharose. Preferably, this purified total mRNA will be size-cen- trifuged by gradient, e.g. in a linear sucrose gradient, or by chromatography on suitable size fractionation columns, e.g. B. on agarose gels, fractionated.
Die gewünschte mRNA wird durch direktes Prüfen der mRNA mit einer DNA-Sonde oder durch Translation in geeignete Zellen oder zellfreie Systeme und Prüfen der gewonnenen Polypeptide selektiert.The desired mRNA is selected by directly assaying the mRNA with a DNA probe or by translation into appropriate cells or cell-free systems and assaying the recovered polypeptides.
Die Selektion der gewünschten mRNA wird vorzugsweise unter Anwendung einer DNA-Hybridisierungssondeerreicht, wodurch der zusätzliche Schritt der Translation vermieden wird. Geeignete DNA-Sonden sind DNA von bekannter Nucleotidsequenz, die aus wenigstens 17 Nucleotiden bestehen, beispielsweise synthetische DNA, cDNA, die von mRNA mit Codierung für die gewünschten Polypeptide abgeleitet wurden, oder genomische DNA-Fragmente, die z. B. angrenzende DNA-Sequenzen umfassen, die aus jiner natürlichen Quelle oder von einem gentechnisch manipulierten Mikroorganismus isoliert wurden. Synthetische DNA-Sonden werden nach bekannten Methoden symbolisiert, wie sie nachstehend ausführlicher dargestellt werden, vorzugsweise durch schrittweise Kondensation unter Anwendung der Festphasenphosphotriester-, -phosphittriester- oder Phosphoramiditmethode, z. B. die Kondensation von Dinucleotidkopplungseinheiten nach der Phosphotriestermethode. Diese Methoden sind der Synthese von Gemischen der gewünschten Oligonuclaotide durch Verwendung von Gemischen aus zwei, drei oder vier Nucleotiden dA, dC, dG und/oder dT in geschützter Form oder der entsprechenden Dinucleotidkopplungseinheiten in dem angemessenen Kondensationsschritt angepaßt, wie das von Y. Ike u.a. (Nucleic Acids Research 11,477,1983) beschrieben wird.Selection of the desired mRNA is preferably achieved using a DNA hybridization probe, thereby avoiding the extra step of translation. Suitable DNA probes are DNA of known nucleotide sequence consisting of at least 17 nucleotides, for example synthetic DNA, cDNA derived from mRNA encoding the desired polypeptides, or genomic DNA fragments, e.g. B. include adjacent DNA sequences isolated from a natural source or from a genetically engineered microorganism. Synthetic DNA probes are symbolized by known methods, as described in more detail below, preferably by stepwise condensation using the solid phase phosphotriester, phosphite triester or phosphoramidite method, e.g. For example, the condensation of dinucleotide coupling moieties by the phosphotriester method. These methods are adapted to the synthesis of mixtures of the desired oligonucleotides by using mixtures of two, three or four nucleotides dA, dC, dG and / or dT in protected form or the corresponding dinucleotide coupling units in the appropriate condensation step as described by Y. Ike et al (Nucleic Acids Research 11,477,1983).
Zur Hybridisierung werden die DNA-Sonden markiert, z. B. durch die allgemein bekannte Kinasereaktion radioaktiv markiert. Die Hybridisierung der größenfraktionierten mRNA mit DNA-Sonden, welche eine Markierung enthalten, erfolgt nach bekannten Verfahren, d. h. in Puffer- und Salzlösungen, welche Zusätze enthalten, z. B. Calciumchelatbildner, Viskositätsregulationsverbindungen, Proteine, nichthomologe DNA und ähnliche, bei Temperaturen, welche die selektive Hybridisierung begünstigen, z. B. zwischen O0C und 80°C, beispielsweise zwischen 250C und 500C oder um 65°C, vorzugsweise um etwa 20°C unter der doppelsträngigen Hybrid-DNA-Schmelztemperatur.For hybridization, the DNA probes are labeled, e.g. B. radiolabeled by the well-known kinase reaction. The hybridization of size-fractionated mRNA with DNA probes containing a label is carried out according to known methods, ie in buffer and saline solutions containing additives, e.g. Calcium chelating agents, viscosity regulating compounds, proteins, non-homologous DNA and the like, at temperatures which favor selective hybridization, e.g. B. between O 0 C and 80 ° C, for example between 25 0 C and 50 0 C or around 65 ° C, preferably at about 20 ° C below the double-stranded hybrid DNA melting temperature.
Fraktionierte mRNA kann in Zellen, z. B. Froschoozyten, oder in zellfreie Systeme, z. B. in Raticulocytlysate oder Weizenkeimextrakte, translatiert werden. Die gewonnenen Polypeptide werden auf enzymatische Aktivität oder auf Reaktion mit Antikörpern, gezogen im Vergleich zum nativen Poiypeptid, z. B. in einem Immunoassay, geprüft, beispielsweise Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay und Immunoassay mit fluoreszierenden Markern. Derartige Immunoassays und die Herstellung von polyklohalen und monoklonalen Antikörpern sind in Fachkreicen allgemein bekannt und werden entsprechend angewendet.Fractionated mRNA can be expressed in cells, e.g. As frog oocytes, or in cell-free systems, eg. B. in Raticulocytlysate or wheat germ extracts are translated. The recovered polypeptides are assayed for enzymatic activity or for reaction with antibodies raised relative to the native polypeptide, e.g. As in an immunoassay, tested, for example, radioimmunoassay, enzyme immunoassay and immunoassay with fluorescent markers. Such immunoassays and the production of polyclo-and monoclonal antibodies are well known in the art and are used accordingly.
Die Herstellung einer einzelsträngigen komplementären DNA (cDNA) aus der ausgewählten mRNA-Matrize ist in Fachkreisen allgemein bekannt, das gleiche gilt für die Herstellung einer doppelsträngigen DNA aus einer einzelsträngigen DNA. Die mRNA-Matrize wird mit einem Gemisch von Deoxynucleosidtriphosphaten, wahlweise radioaktiv markierten Deoxynucleosidtriphosphaten (um in der Lage zu sein, das Ergebnis der Reaktion zu prüfen), einer Starter-Sequenz, wie einem Oligo-dT-Rest, der mit dem Poly(A)-Schwanz der mRNA hybridisiert, und einem geeigneten Enzym, wie einer Umkehrtranskriptase, z. B. von dem Vogel-Myeloblastosevirus (AMV), inkubiert. Nach dem Abbau der Matrizen-mRNA, z. B. durch alkalische Hydrolyse, wird die cDNA mit einem Gemisch von Deoxynucleosidtriphosphaten und einem geeigneten Enzym inkubiert, um eine doppelsträngigo DNA zu ergeben. Geeignete Enzyme sind beispielsweise eine Umkehrtranskriptase, das Klenow- Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I oder T4-DNA-Polymerase. In der Regel wirkt eine Haarnadelschleifenstruktur,The production of a single-stranded complementary DNA (cDNA) from the selected mRNA template is well known in the art, as is the preparation of a double-stranded DNA from a single-stranded DNA. The mRNA template is treated with a mixture of deoxynucleoside triphosphates, optionally radioactively labeled deoxynucleoside triphosphates (to be able to test the result of the reaction), a starter sequence such as an oligo-dT residue linked to the poly (A ) Tail of the mRNA, and a suitable enzyme, such as a reverse transcriptase, e.g. From the avian myeloblastosis virus (AMV). After degradation of the template mRNA, e.g. By alkaline hydrolysis, the cDNA is incubated with a mixture of deoxynucleoside triphosphates and a suitable enzyme to give a double stranded DNA. Suitable enzymes include, for example, a reverse transcriptase, the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I or T4 DNA polymerase. As a rule, a hairpin loop structure,
die spontan von der einzelsträngigen cDNA gebildet wird, als Starter für die Synthese des zweiten Strangs. Diese Haarnadelstruktur wird durch Digerieren mit S1 -Nuclease entfernt. Als Alternative dazu wird zuerst das 3'-Ende der einzelsträngiyen DNA durch homopolymere Deoxynucleotidschwänze vor der Hydrolyse der mRNA-Matrize und anschließende Synthese des zweiten cDNA-Stranges erweitert.which is formed spontaneously from the single-stranded cDNA, as a starter for the synthesis of the second strand. This hairpin structure is removed by digestion with S1 nuclease. Alternatively, the 3'-end of the DNA einzelsträngiyen is extended by homopolymeric Deoxynucleotidschwänze before the hydrolysis of the mRNA template and subsequent synthesis of the second cDNA St r anges first.
Bei der Alternative wird doppelstränglge cDNA aus einer cDNA-Bank isoliert und auf die gewünschte cDNA geprüft (Schritt c). Die cDNA-Bank wird durch Isolieren von mRNA aus geeigneten Zellen und aus diesen Herstellen von einzelsträngiger und doppelsträngiger cDNA, wie das oben beschrieben wurde, aufgebaut. Diese cDNA wird mit geeigneten Restriktionsendonucleason aufgeschlossen und in einen λ-Phagen einbezogen, z.B. λ-Charon 4A oder Xgt 11, wobei die herkömmlichen Verfahren angewendet werden. Die auf Nitrocellulosemembranen replizierte cDNA-Bank wird unter Verwendung einer DNA-Sonde geprüft, wie das oben beschrieben wurds, oder in einem geeigneten Expressionssystem ausgeprägt, und die gewonnenen Polypeptide werden auf Reaktion rr'. einem für die gewünschten Verbindungen spezifischen Antikörper geprüft.In the alternative, double-stranded cDNA is isolated from a cDNA library and assayed for the desired cDNA (step c). The cDNA library is constructed by isolating mRNA from appropriate cells and preparing these single-stranded and double-stranded cDNAs as described above. This cDNA is digested with appropriate restriction endonuclease and incorporated into a λ phage, e.g. λ Charon 4A or Xgt 11 using the conventional methods. The cDNA library replicated on nitrocellulose membranes is assayed using a DNA probe as described above or expressed in an appropriate expression system, and the recovered polypeptides are assayed for rr '. an antibody specific for the desired compounds.
In Fachkreisen ist eine Vielzahl von Methoden für die Einbeziehung von doppelsträngiger cDNA oder genomischer DNA in einen angemessenen Vektor bekannt (Schritt d). Beispielsweise können komplementäre Homopolymertrakte der doppelsträngigen DNA und der Vektor-DNA durch Inkubation bei Anwesenheit der entsprechenden Deoxynucleosidtriphosphate und eines Enzyms, wie der Terminaldeoxynucleotidyltransferase, zugesetzt werden. Die Vektor- und Doppelstrang-DNA werden dann durch Basenpaarung zwischen den komplementär on homopolymeren Enden verbunden und schließlich durch spezifische Verbindungsenzyme, wie Ligasen, ligiert. Andere Möglichkeiten sind der Zusatz synthetischer Linker zu den Enden der Doppelstrang-DNA oder die Einbeziehung der Doppelstrang-DNA in den Vektor durch Ligalion stumpfer oder gestaffelter Enden. Passende Vektoren werden unten ausführlich behandelt.A variety of methods for the inclusion of double-stranded cDNA or genomic DNA in an appropriate vector are known in the art (step d). For example, complementary homopolymer tracts may be added to the double-stranded DNA and the vector DNA by incubation in the presence of the corresponding deoxynucleoside triphosphates and an enzyme such as terminal deoxynucleotidyltransferase. The vector and double-stranded DNA are then joined by base pairing between the complementary homopolymeric ends and finally ligated by specific joining enzymes, such as ligases. Other possibilities are the addition of synthetic linkers to the ends of the double-stranded DNA or the inclusion of the double-stranded DNA in the vector by ligating blunt or staggered ends. Appropriate vectors are discussed in detail below.
Die Transformation der passenden Wirtszellen mit dem gewonnenen Hybridvektor (Schritt e) und die Auswahl und Vervielfältigung der transformierten Wirtszellen (Schritt f) sind in Fachkreisen allgemein bekannt. Beispiele für diese Methoden werden unten gegeben. Hybridvektoren und Wirtsze'.len können für die Produktion von DNA oder auch für die Produktion der sonst gewünschten Polypeptide besonders geeignet sein.The transformation of the appropriate host cells with the recovered hybrid vector (step e) and the selection and amplification of the transformed host cells (step f) are well known in the art. Examples of these methods are given below. Hybrid vectors and host cells may be particularly suitable for the production of DNA or for the production of otherwise desired polypeptides.
Die Isolierung der gewünschten DNA, von deren Mutanten und Fragmenten nach der Erfindung erfolgt nach den in Fachkreisen bekannten Mothoden, z. B. durch Extraktion mit Phenol und/oder Chloroform. Wahlweise kann die DNA weiter manipuliert werden, z. B. durch Behandlung mit mutagenen Mitteln, um Mutanten herzustellen, odor durch Aufschließen mit Restrifctionsenzymen, um Fragmente tu erhalten, einen oder beide Termini zur Erleichterung der Einbeziehung in den Vektor zu modifizieren, Intervening-Sequenzen zu beseitigen und ähnliches.The isolation of the desired DNA, of the mutants and fragments according to the invention is carried out according to the known in the art mothodes, for. B. by extraction with phenol and / or chloroform. Optionally, the DNA can be further manipulated, eg. By treatment with mutagenic agents to make mutants, or by digesting with restriction enzyme enzymes to obtain fragments, to modify one or both termini to facilitate inclusion in the vector, to eliminate intervening sequences, and the like.
Die Nucleot'dsequonz einer DNA nach der Erfindung kann nach den bekannten Methoden bestimmt werden, z. B. nach der Maxam-Gilbert-Methode, die mit endmarkierter DNA arbeitet, oder nach der Dideoxykettenterminationsmethode von Sanger. PG-Gensequenzen nach der vorliegenden Erfindung können auch durch eine In-vitro-Synthese nach herkömmlichen Methoden hergestellt werden. Die In-vitro-Synthese kann vor allem für die Herstellung von kleine/enTragmenten einer PG-Expressionskassette verwendet werden, z. B. der DNA-Sequenzen eines PG-Gens mit d^r Codierung für einen Promotor oder ein Signalpeptid, beispielsweise das PGI-, PGII- oder pgaC-Gen, eines PG-Gens, das in einem DNA-Molekül, wie es vorstehend definiert wurde, enthalten ist, insbesondere in den λ-Klonen oder einem Mutanten davon.The nucleotide sequence of a DNA according to the invention can be determined by the known methods, e.g. For example, according to the Maxam-Gilbert method, which works with end-labeled DNA, or according to the Dideoxykettenterminationsmethode of Sanger. PG gene sequences of the present invention may also be prepared by in vitro synthesis by conventional methods. The in vitro synthesis can be used especially for the preparation of small fragments of a PG expression cassette, e.g. The DNA sequences of a PG gene coding for a promoter or a signal peptide, for example the PGI, PGII or pgaC gene, of a PG gene expressed in a DNA molecule as defined above was contained, in particular in the λ clones or a mutant thereof.
Geeignete Methoden für die Synthese von DNA wurden in zusammenfassender Form von S.A. Narang (Tetrahedron 39,3,1983) gegeben. Die bekannten Syntheseverfahren erlauben die Herstellung von Polynucleotiden mit einer Länge bis zu 120 Basen mit diner guten Ausbeute, hoher Reinheit und in verhältnismäßig kurzer Zeit. In geeigneter Weise geschützte Nucleotide werden miteinander nach der Phosphodiestermethode (K.L. Agarwal u.a., Angew. Chemie 84,489,1972), der effektiveren Phosphotriestermetho&e (C. B. Resse, Tetrahedron 34,3143,1972), der Phosphittriestermethode (R. L. Letsinger u. a., J. Am. Chem. Soc. 98,3655,1976) oder der Phosphoramiditmethode (S. L. Beaucage und M. H. Curruthers, Tetrahedron 22,1859,1981) verbunden. Die Vereinfachung der Synthese der Oligonucleotide und Polynucleotide wird durch die Festphasenmethode ermöglicht, bei welcher die Nucleotidketten an ein geeignetes Polymer gebunden werden. H. Rink u. a. (Nucl. Acids Research 12, 6369,1984) verwenden anstelle von einzelnen Nucleotiden Trinucleotide und verbinden sie durch die Phosphotriestermethode in der Festphasensynthese. Auf diese Weise kann ein Polynucleotid in kurzer Zeit und mit guter Ausbeute hergestellt werden. Die eigentliche Doppelstrang-DNA wird enzymatisch aus chemisch hergestellten, überlappenden Oligonucleotiden von beiden DNA-Strängen hergestellt, die in der korrekten Anordnung durch Basenpaarung zusammengehalten und dann chemisch durch die Enzym-DNA-Ligase verbunden werden.Suitable methods for the synthesis of DNA have been summarized by S.A. Narang (Tetrahedron 39, 3, 1983). The known synthesis methods allow the preparation of polynucleotides up to 120 bases in length, with good yield, high purity, and in a relatively short time. Suitably protected nucleotides are conjugated with each other according to the phosphodiester method (KL Agarwal et al., Angew. Chemie 84, 489, 1972), the more effective phosphotriester methoxy (CB Resse, Tetrahedron 34, 343, 1972), the phosphite triester method (RL Letsinger et al., J. Am. Chem Soc., 98, 36565, 1976) or the phosphoramidite method (SL Beaucage and MH Curruthers, Tetrahedron 22, 1859, 1981). The simplification of the synthesis of the oligonucleotides and polynucleotides is made possible by the solid phase method in which the nucleotide chains are attached to a suitable polymer. H. Rink u. a. (Nucl. Acids Research 12, 6369, 1984) use trinucleotides instead of single nucleotides and join them by the phosphotriester method in solid phase synthesis. In this way, a polynucleotide can be prepared in a short time and in good yield. The actual double-stranded DNA is prepared enzymatically from chemically produced, overlapping oligonucleotides from both strands of DNA, which are held together in the correct arrangement by base pairing and then chemically linked by the enzyme DNA ligase.
Eine andere Möglichkeit umfaßt die Inkubation von überlappenden einzelnen Oligonucleotiden von den beiden DNA-Strängen bei Anwesenheit der vier erforderlichen Deoxynucleosidtriphosphate mit einer DNA-Polymerase, z. B. DN A-Polymerase I, dem 'Klenow-Fragment von Polymerase I oder T%-DNA-Polymerase, oder mit einer AMV-Umkehrtranskriptase (Vogel-Myeloblastosevirus-Umkehrtranskriptase). Die beiden Oligonucleotide werden dadurch in der korrekten Anordnung durch Basenpaarung gehalten und mit den erforderlichen Nucleotiden durch das Enzym ergänzt, um eine komplette Doppelstrang-DNA zu ergeben (S.A.Narang u.a.. Anal. Biochem. 121,356,1982).Another approach involves incubation of overlapping single oligonucleotides from the two DNA strands in the presence of the four required deoxynucleoside triphosphates with a DNA polymerase, e.g. DN A polymerase I, the 'Klenow fragment of polymerase I or T% DNA polymerase, or with an AMV reverse transcriptase (avian myeloblastosis virus reverse transcriptase). The two oligonucleotides are thereby held in the correct alignment by base pairing and supplemented with the required nucleotides by the enzyme to give a complete duplex DNA (S.A. Narang et al., Anal. Biochem., 121, 56, 1952).
Nachstehend werden die Herstellung eines rekombinanten DNA-Moluküls der vorliegenden Erfindung aus einer genomischen Bank und homologe und heterologe Hybridisierungsbedingungen für die Identifizierung der Glieder der PG-Genfamilie ausführlicher beschrieben.Hereinafter, the production of a recombinant DNA molecule of the present invention from a genomic library and homologous and heterologous hybridization conditions for the identification of the members of the PG gene family will be described in more detail.
Eine genomische Bank kann hergestellt werden z. B. durch partielles Aufschließen der genomischen DNA eines A. nlger-Stammes, z.B. NW756 oder N401), mit z.B. Sau3AI oder Mbol und Klonieren der hoci molekulargewichtigen DNA-Fragmente in einen geeigneten Wirtsvektor, ü.B. dasE.coll-PlasmidpUB121 oder einen Lambda-Vi ktor, z. B. EMBLA4. Andere Pilzstämme, welche die gewünschten PG produzieren, z. B. Asperglllus spec, ζ. B. A. japonlcus, A.orvzae, A. nldulans, A. nlger, Trlchoderma spec, Botivtls spec, Sclerotin!» spec, Fusarlum spec, oder ar dere phytopathogene Pilze, sowie Hefe, beispielsweise PG-produzierende Kluyveromycea spec, wie K.fragilis, können als Quelie für die genomische Bank dienen, und andere geeignete Vektoren, z. B. die oben genannten, können als Rezipienten für die Fragmente genutzt werden. Um die Genombank erfolgreich nach D1 JA-Sequenzen mit der Codierung für PG prüfen zu können, ist eine hybridisierende DNA-Sonde notwendig. Das kann eine synthetische DNA-Sonde sein, wenn die Aminosäui esequenz oder ein Teil dieser für die gewünschte PG bekannt ist, oder ein anderes PG-Gen oder dessen Teil, die an das gewünschte PG-Gen hybridisieren. Da vor der Erfindung weder eine PG-Sequenz noch ein PG-Gen oder dessen Teil bekannt waren, wurdenzuerst die Probleme der Reinigung von PG, der Strukturbestimmung der N-Terminalsequenz einer PG und die Herstellung von brauchbaren DNA-Sonden gelöst.A genomic library can be made e.g. By partially digesting the genomic DNA of an A. nlger strain, eg, NW756 or N401) with, for example, Sau3AI or Mbol and cloning the high molecular weight DNA fragments into a suitable host vector, e.g. the E. coli plasmid pUB121 or a lambda filter, e.g. B. EMBLA4. Other fungal strains producing the desired PG, e.g. Aspergillus sp., Ζ. BA japonlcus, A.orvzae, A. nldulans, A. niger, Trlchoderma spec., Botivtls spec, sclerotin. »Spec, Fusarlum spec., Or other phytopathogenic fungi, as well as yeast, for example PG-producing Kluyveromycea spec., Such as K. fragilis. may serve as source for the genomic library, and other suitable vectors, e.g. As the above, can be used as recipients for the fragments. In order to be able to successfully test the genome bank for D 1 JA sequences encoding the PG, a hybridizing DNA probe is necessary. This may be a synthetic DNA probe if the amino acid sequence or part of it is known for the desired PG, or another PG gene or its part that hybridizes to the desired PG gene. Since prior to the invention, neither a PG sequence nor a PG gene or its part were known, the problems of purification of PG, structure determination of the N-terminal sequence of a PG and production of useful DNA probes were first solved.
Für die Reinigung der vorliegenden PG kann jede Quelle, In der sie enthalten sind, genutzt werden. Beispielsweise können Rohquellen, wie die Enzymgemische, die von Aspergillus nlger gewonnen werden, wie Rapidase·, ein kommerziell erhältliches Gemisch von pektinolyt'cchen Enzymen, als Quelle dienen.For the purification of the present PG any source in which they are contained can be used. For example, crude sources, such as the enzyme mixtures derived from Aspergillus niger, such as Rapidase®, a commercially available mixture of pectinolytic enzymes, can serve as a source.
Die Reinigung erfolgt nach herkömmlichen Reinigungsmethoden, wie Aussalzen, Entsalzen, erneutes Ausfällen in Form eines unterschiedlichen Salzes, Chromatographie, z. B. Affinitätschromatographie, wie auf einem vernetzten Alginat, lonenaustauschchromatographie, z. B. auf einer DEAE-Sephadex- oder Sepharose-Säule, Gelpermeationschromatographie, z. B. auf einer Sephacrylsäule, Elektrophorese, z. B. mit SDS-Polyacrylamldgel, isoelektrische Fokussierung und ähnliche oder beliebige Kombinationen der genannten.The cleaning is carried out by conventional cleaning methods, such as salting out, desalting, reprecipitation in the form of a different salt, chromatography, z. B. affinity chromatography, such as on a crosslinked alginate, ion exchange chromatography, e.g. On a DEAE Sephadex or Sepharose column, gel permeation chromatography, e.g. On a Sephacryl column, electrophoresis, e.g. With SDS-polyacrylamide gel, isoelectric focusing, and the like, or any combination thereof.
In der vorliegenden Erfindung wurden PGI, PGII, PGIIIA, PHIIIB und PGIV In reiner Form aus Rapidase· isoliert. Die genannten PG sind Endo-Polygalacturonasen (E.C. 3.2.1.15) mit folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: PGI hat einen Mr-Wert von 55 K, einen isoelektrischen Punkt (IEP) zwischen 3,2 und 3,5 und ein pH-Wert-Optimum für die enzymatische Aktivität von 4,9. Die Werte für PGII sind Mr von 38K, lEPzwischen 4,6 und 5,9, pH-Wert-Optimum von 4,8; PGIIIA hat die Werte von Mr gleich 57 K, IEP von 3,3 und pH-Wert-Optimum von 4,3; PGIIIB hat auch 57 K und einen IEP von 3,3, das pH-Wert-Optimum aber beträgt 4,5. Schließlich hat PGIV einen Mr-Wert von 59K, einen IEP von 3,7 und ein pH-Wert-Optimum von 4,8. Die gegebenen Mr-Werte werden durch SDS-Polyacrylamldgelelektrophorese bestimmt, die IEP-Werte durch isoelektrische Dünnschichtfokussierung. Die N-Terminalsequenzierung von PGI zeigte folgende Sequenz auf:In the present invention, PGI, PGII, PGIIIA, PHIIIB and PGIV were isolated in pure form from rapidase. The PGs mentioned are endo-polygalacturonases (EC 3.2.1.15) with the following physicochemical properties: PGI has a Mr value of 55 K, an isoelectric point (IEP) between 3.2 and 3.5, and a pH value. Optimum for the enzymatic activity of 4.9. The values for PGII are Mr of 38K, IEP between 4.6 and 5.9, pH optimum of 4.8; PGIIIA has the values of Mr equal to 57 K, IEP of 3.3, and pH optimum of 4.3; PGIIIB also has 57 K and an IEP of 3.3, but the pH optimum is 4.5. Finally, PGIV has a Mr value of 59K, an IEP of 3.7, and a pH optimum of 4.8. The given Mr values are determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, the IEP values by isoelectric thin film focusing. The N-terminal sequencing of PGI showed the following sequence:
ala'-ser-thr-X4-thre-phe-thr-ser-ala9 Die N-Terminalsequenzierung eines 21 kDa-BrCN-Fragmentes von PGI zeigte diese Sequenz auf:ala'-ser-thr-X 4 -thr e -phe-thr-ser-ala 9 N-terminal sequencing of a 21 kDa BrCN fragment of PGI revealed this sequence:
ala-ser-thr-X4-thr-phe-thr-ser-ala-ser-glu, d. h., die N-Terminalsequenz von PGI und die Sequenzierung eines 5,5kDa-BrCN-Fragmentes enthüllte die Sequenzala-ser-thr-X 4 -thr-phe-thr-ser-ala-ser-glu, ie, the N-terminal sequence of PGI and the sequencing of a 5.5kDa BrCN fragment revealed the sequence
ala-asp-gyl-ala-vaMle-asp-gly-asp-gly-serala-asp-gyl-ala-vaMle-asp-gly-asp-gly-ser
Die N-Terminalsequenzierung von PGII enthüllte die Sequenz N-terminal sequencing of PGII revealed the sequence
asp'-ser-X3-thr-phe6-thr-thr-ala-ala-ala10-ala-lys-ala12 und ein BrCN-Fragment von 17 kDa die Sequenzasp'-ser-X 3 -thr-phe 6 -thr-thr ala-ala-ala 10 -ala-lys-ala 12 and a BrCN fragment of 17kDa for the sequence
ala-phe-ser-val-gln-ala-asn-asp-ile-thr-phe.ala-phe-ser-val-gln-ala-asn-asp-ile-thr-phe.
X3 und X* in den Sequenzen wurden zu diesem Zeitpunkt nicht identifiziert.X 3 and X * in the sequences were not identified at this time.
Auf der Grundlage der Aminosäuresequenz des BrCN-Fragmenteszu 5,SkDa von PGl wurde das folgende Oligonucleotidgemisch synthetisiert:Based on the amino acid sequence of the BrCN fragment to 5, SkDa of PGl, the following oligonucleotide mixture was synthesized:
metalaaspglyalsvalmetalaaspglyalsval
HR 6298 5' (d) ATGGCIGAr1GGIGCIGTI ileaspglyaspgly ATR3GAR1GGIGAr1GG 3'HR 6298 5 '(d) ATGGCIGAr 1 GGIGCIGTI ileaspglyaspgly ATR 3 GAR 1 GGIGAR 1 GG 3'
Auf der Grundlage der Aminosäuresequenz des BrCN-Fragmentes zu 17 kDa von PGII wurden die beiden folgenden Oligonucleotidgemische synthetisiert:Based on the amino acid sequence of the 17 kDa BrCN fragment of PGII, the following two oligonucleotide mixtures were synthesized:
met ala phe ser val gin ala HR 6195 5' (d) ATG GCITTR1TCIGTICAR2 GCI KR 6196 5' (d! ATG GCITTR, AGIGTI CARj GCIwith ala phe ss val gin ala HR 6195 5 '(d) ATG GCITTR 1 TCIGTICAR 2 GCI KR 6196 5' (d! ATG GCITTR, AGIGTI CARj GCI
asn asp Heasnn asp he
HR 6195 AAR, GAR, AT 3' HR 6196 AAR, GAR, AT 3'HR 6195 AAR, GAR, AT 3 'HR 6196 AAR, GAR, AT 3'
In den Sequenzen der Oligonucleotide ist I Inosin, R1 ist T oder C, R2 ist A oder G und R3 ist T, C oder A.In the sequences of the oligonucleotides I is inosine, R 1 is T or C, R 2 is A or G and R 3 is T, C or A.
Die Gemische wurden radioaktiv markiert und zum Prüfen einer Genombank von Aspergillus nlger N400 auf PGI bzw. PGII verwendet.The mixtures were radioactively labeled and used to test a genome bank of Aspergillus niger N400 for PGI and PGII, respectively.
Die identifizierten Gene oder Genfragmente werden dann nach herkömmlichen Mitteln sequenziert. Die Sequenzen der PGf- und PGII-Gene von A. nlger N 400 werden durch die Sequenzen mit den SEQ ID NO. 1 bzw. 2 dargestellt, die in der Sequenzaufstellung gegeben werden.The identified genes or gene fragments are then sequenced by conventional means. The sequences of the PGf and PGII genes of A. niger N 400 are represented by the sequences of SEQ ID NO. 1 and 2, respectively, which are given in the Sequence Listing.
Zu Prüfungszwecken werden die DNA-Sonden nach den in Fachkreisen bekannten Methoden radioaktiv markiert, z. B. durch Verwendung von Y32P-ATP und T4-Kinase oder a32P-dATP und E.coll-DNA-PoIymerase I, in Abhängigkeit vom Typ der verwendeten Sonde. Wirtsorganismen, die Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung als einen Einschub tragen, werden durch Hybridisierung mit der markierten DNA-Sonde auf Filterrepliken der Genbank identifiziert.For testing purposes, the DNA probes are radioactively labeled according to methods known in the art, e.g. By using Y 32 P-ATP and T4 kinase or a 32 P-dATP and E. coli DNA polymerase I, depending on the type of probe used. Host organisms carrying nucleic acids of the present invention as an insert are identified by hybridization with the labeled DNA probe to filter replicas of the Genbank.
Klone, die eine Hybridisationsreaktion aufweisen gegenüber einer oder mehreren DNA-Sonden, werden isoliert und amplifiziert.Clones that hybridize to one or more DNA probes are isolated and amplified.
Die angewendeten Hybridisationsbedingungen sind die herkömmlichen, sie können mehr oder weniger streng sein.The hybridization conditions used are the conventional ones, they can be more or less severe.
Strenge Bedingungen sind die, unter denen nur DNA-Sequenzen mit einem höheren Grad an Homologie hybridisieren können („homologe" Hybridisationsbedingungen). Unter „heterologen" oder weniger strengen Bedingungen können auch verwandte DNA-Sequenzen mit einem niedrigeren Grad an Homologie hybridisieren. Die Strenge der Hybridisation wird beispielsweise beeinflußt durch Hybridisations- und Waschtemperatur, Formamid- oder Salzkonzentration, G + C-Gehalt der DNA, Länge derStrict conditions are those under which only DNA sequences can hybridize to a higher degree of homology ("homologous" hybridization conditions.) Under "heterologous" or less stringent conditions, related DNA sequences can also hybridize with a lower degree of homology. The severity of the hybridization is influenced, for example, by hybridization and washing temperature, formamide or salt concentration, G + C content of the DNA, length of the
Hybridisationszeit und Länge der DNA-Sonde. Illustrative, aber nicht einschränkende Beispiele für „homologe" und ,,heterologe" Hybridisationsbedingungen werden unten in den Beispielen gegeben.Hybridization time and length of the DNA probe. Illustrative but non-limiting examples of "homologous" and "heterologous" hybridization conditions are given below in the Examples.
Unter Verwendung von einer oder mehreren der DNA-Sonden, die von dem PGI- oder PGII-Gen abgeleitet wurden, insbesondere solchen, die wenigstens einen Teil von deren codierenden Bereichen umfassen, können hybridisierende Klone, die von einer Genombank, z. B. von A. nlger, vorzugsweise von A. nlger N400 oder A. niger NW756, abgeleitet wurden, identifiziert und in verschiedene Klassen auf der Grundlage ihres Grades an Homologie und auf der Grundlage der beobachteten hybridisierenden Restriktionsfragmente eingeteilt werden. Beispiele von bevorzugten Klonen, die von einer A.nlger-N400-Bank abgeleitet wurden, sind XPG-A9,-A10,-A43,-64,-635,-836,-01,-016,-C 20,-C 37,-D8,-D11,-D12,-E 6,-E 38,-F5,-G17,-X31 und-Y33.Using one or more of the DNA probes derived from the PGI or PGII gene, particularly those comprising at least a portion of their coding regions, hybridizing clones derived from a genomic library, e.g. Derived from A. niger, preferably A. niger N400 or A. niger NW756, and classified into different classes based on their degree of homology and on the observed hybridizing restriction fragments. Examples of preferred clones derived from an A. nlger N400 library are XPG-A9, -A10, -A43, -64, -635, -836, -01, -016, -C20, -C 37, -D8, -D11, -D12, -E6, -E38, -F5, -G17, -X31 and -Y33.
Ihre Herstellung wird unten i ι den Beispielen ausführlicher beschrieben. Ein Beispiel für einen bevorzugten Klon, der vonTheir preparation will be described below in more detail with reference to the examples. An example of a preferred clone used by
A. nlger-NW756 abgeleitet v/urde, ist das Plasmid pGW 1756.A. niger NW756 derived, the plasmid pGW 1756.
Diese Klone sowie die Plasmide pGW1800, pGW1803, pGW1900, pGW1902 und pGW1910 können zur Herstellung anderer rekombinanter DNA-Moleküle der Erfindung verwendet werden, insbesondere solche, welche Fragmente der darin eingeschlossenen PG-Gensequenzen enthalten. Diese anderen rekombinanten DNA-Moleküle werden auf herkömmliche Weise unter Einsatz herkömmlicher Restriktionsenzyme, Linker, von Ligations-, Amplifikations- und Isolierungsprozessen hergestellt.These clones as well as plasmids pGW1800, pGW1803, pGW1900, pGW1902 and pGW1910 can be used to prepare other recombinant DNA molecules of the invention, especially those containing fragments of the PG gene sequences included therein. These other recombinant DNA molecules are prepared in a conventional manner using conventional restriction enzymes, linkers, ligation, amplification and isolation processes.
Vorzugsweise werden Exprossionsvektoren hergestellt, die pro- oder eukaryotische Vektoren oder bifunktionelle Plasmide für die Vermehrung in pro- und eukaryotischen Zellen sein können. Beispiele für den Aufbau solcher bifunktionellen Plasmide sind in Fachkreisen allgemein bekannt. Die Expressionsvektoren können homologe oder heterologe Gene enthalten. Beispiele für solche Gene werden nachstehend gegeben.Preferably, expression vectors are prepared which may be pro- or eukaryotic vectors or bifunctional plasmids for propagation in pro- and eukaryotic cells. Examples of the construction of such bifunctional plasmids are well known in the art. The expression vectors may contain homologous or heterologous genes. Examples of such genes are given below.
Die Einschübe der rekombinanten DNA-Moleküle der Erfindung oder deren Fragmente können auf herkömmliche Weise gewonnen werden, z. B. nach dem Spalten der rekombinanten DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen und Isolierung der gewünschten DNA-Fragmente nach Agarosegelelektrophorese.The inserts of the recombinant DNA molecules of the invention or fragments thereof can be obtained in a conventional manner, e.g. After cleaving the recombinant DNA with appropriate restriction enzymes and isolating the desired DNA fragments after agarose gel electrophoresis.
Mutanten der DNA-Moleküle der Erfindung, besonders die PG-Gensequenzen, die neue Restriktionsorte enthalten, können ebenfalls hergestellt werden, beispielsweise in vitro durch ortsspezifische Mutagenese, nach herkömmlichen Methoden (siehe Übersichtsartikel von M. J." ^!!er und M. Smith, Methods, Enzymol. 100,468 [1983], D. Botstein und D. Shortle, Science 229,1193 [1985) oder K.Norri: -.ά., duel. Acids Res. 11,5103 [1983]).Mutants of the DNA molecules of the invention, particularly the PG gene sequences containing new restriction sites, can also be produced, for example, in vitro by site-directed mutagenesis, by conventional methods (see review by MJ "" and M. Smith, Methods Enzymol 100,468 [1983], D. Botstein and D. Shortle, Science 229,1193 [1985] or K. Norri: -άά, duel Acids Res. 11,5103 [1983]).
Die Erfindung betrifft auch den Einsatz der rekombinanten DNA-Moleküle der Erfindung für die Herstellung von Hybridvektoren für die Expression eines Strukturgens.The invention also relates to the use of the recombinant DNA molecules of the invention for the production of hybrid vectors for the expression of a structural gene.
Transformierte WirteTransformed hosts
Außerdem betrifft die Erfindung transformierte Wirtszellen für das Amplifizieren der rekombinanten DNA-Moleküle der Erfindung oder besonders für die Ausprägung einer Expressionskassette, die in einem rekombinanten DNA-Molekül der Erfindung eingeschlossen ist.In addition, the invention relates to transformed host cells for amplifying the recombinant DNA molecules of the invention or particularly to the expression of an expression cassette included in a recombinant DNA molecule of the invention.
Beispiele für geeignete Wirte, besonders für das Amplifizieren der rekombinanten DNA-Moleküle der Erfindung, sind Mikroorganismen, deren Restriktionsenzyme oder Modifikationsenzyme fehlen oder nur im geringen Maße zu eigen sind, beispielsweise Bakterien, besonders Stämme von Escherichla coil, beispielsweise E.culi W3110, E. coll HB101/LM1035, E.coll JA221, E. coil DH5a oder vorzugsweise E. coil DH5O.F', JM109, MH1 oder HB101, oder der E. coli-Stamm K12, Bacillus subtilis.Examples of suitable hosts, in particular for amplifying the recombinant DNA molecules of the invention, are microorganisms whose restriction enzymes or modification enzymes are absent or only poorly endowed, for example bacteria, especially strains of Escherichia coli, for example E.culi W3110, E coll HB101 / LM1035, E.coll JA221, E. coil DH5a or preferably E. coil DH5O.F ', JM109, MH1 or HB101, or E. coli strain K12, Bacillus subtilis.
Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus und andere, und Hefen, beispielsweise Saccharomyces cerevislae, wie S.cerevlslaeGRF18. Außerdem sind geeignete Wirtszellen Zellen von höheren Organismen, insbesondere feststehende kontinuierliche menschliche oder tierische Zellinien, z. B. Lungenfibroblasten des menschlichen Embryos L132, menschliche Bowes-Zellen des malignen Melanoms, HeLa-Zellen, durch den SV40-Virus transformierte Nierenzellen der afrikanischen Grünen Meerkatze COS-7 oder Eierstockzellen (CHO) des Chinesischen Hamsters.Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus and others, and yeasts, for example Saccharomyces cerevisiae, such as S.cerevlslaeGRF18. In addition, suitable host cells are cells of higher organisms, in particular fixed continuous human or animal cell lines, e.g. Human lung L132 lung fibroblasts, human melanoma Bowes cells, HeLa cells, COS-7 African green monkey kidney cells transformed by the SV40 virus, or Chinese hamster ovary (CHO) cells.
Beispiele für geeignete Wirte zum Ausprägen einer Expressionskassette der Erfindung sind die vorstehend genannten Zellen, und insbesondere sind es Fadenpilze, beispielsweise Penicllllum, Cephalosporium oder vorzugsweise Asperglllus spec, ζ. Β.Examples of suitable hosts for expressing an expression cassette of the invention are the cells mentioned above, and in particular they are filamentous fungi, for example Penicillum, Cephalosporium or, preferably, Asperglllus spec. Β.
A. carbonarlus, A. awamori oder vorzugsweise A. nlger, A. nldulans oder A. oryzae.A. carbonarlus, A. awamori or preferably A. nlger, A. nldulans or A. oryzae.
Bevorzugte transformierte Wirte sind E.coll MH1, transformiert mit pGW 1800 oder pGW1803, E. coil JM109, transformiert mit pGW1800 oder pGW1803, E.coll DH5 F', transformiert mit pGW 1900,1902,1657 oder 1910, pGII-IFN AM 119 oder pGllss-IFN AM 119, Asperglllus niger An8 oder N593 oder Asperglllus nldulans, transformiert mit pGII-IFN-AM 119 oder pGllss-iFN AM 199 und wahlweise mit dem Selektionsmarkerplasmid pCG 59D.Preferred transformed hosts are E.coll MH1 transformed with pGW 1800 or pGW1803, E. coil JM109 transformed with pGW1800 or pGW1803, E.coll DH5 F ', transformed with pGW 1900,1902,1657 or 1910, pGII-IFN AM 119 or pGllss-IFN AM 119, Asperglllus niger An8 or N593 or Asperglllus nldulans, transformed with pGII-IFN-AM 119 or pGllss-iFN AM 199 and optionally with the selection marker plasmid pCG 59D.
Die Erfindung betrifft auch eine Methode zur Herstellung solcher Transformanten, welche die Behandlung einer geeigneten Wirtszelle unter transformierenden Bedingungen mit einem rekombinanten DNA-Molekül der Erfindung, insbesondere einem Hybridvektor der Erfindung, wahlweise zusammen mit einem Selektionsmarkergen, und wahlweise die Auswahl der Transformanten umfaßt.The invention also relates to a method of producing such transformants, which comprises treating a suitable host cell under transforming conditions with a recombinant DNA molecule of the invention, in particular a hybrid vector of the invention optionally together with a selection marker gene, and optionally selecting the transformants.
Die Transformation von Mikroorganismen wird nach herkömmlichen Methoden ausgeführt, wie sie in der Literatur beschrieben werden, beispielsweise für S.cerevisiae (A.Hinnen u.a., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75,1929,1978), für B.subtilis (Anagnosiopoulos u. a., J. Bacteriol. 81,741,1961) und für E. coil (M. Mandel u. a„ J.Mol. Biol. 53,159,1970).The transformation of microorganisms is carried out according to conventional methods as described in the literature, for example for S. cerevisiae (A.Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978), for B.subtilis (Anagnosiopoulos et al., J. Bacteriol 81, 741, 1961) and E. coli (M. Almond et al., J. Mol. Biol., 53, 159, 1970).
Demzufolge schließt das Transformationsverfahren von E. coli-Zellen beispielsweisee die Ca2+-Vorbehandlung der Zellen ein, so daß die DNA-Aufnahme ermöglicht wird und die Inkubation mit dem Hybridvektor. Die anschließende Selektion der transformierten Zellen kann beispielsweise durch Transferieren der Zellen auf ein selektives Wachstumsmedium erreicht werden, welches die Trennung der transformierten Zellen von den Elternzellen in Abhängigkeit von der Natur der Markersequenz der Vektor-DNA ermöglicht. Vorzugsweise wird ein Wachstumsmedium verwendet, welches das Wachstum von Zellen, die den Vektor nicht enthalten, nicht zuläßt. Die Transformation von Hefe umfaßt beispielsweise die Schritte der enzymatischen Entfernung der Hefezellwand durch Glucosidasen, der Behandlung der gewonnenen Sphäroplaste mit dem Vektor bei Anwesenheit von Polyethylenglycol- und Ca2+-lonen und der Regenerierung der Zellwand durch Einbettung der Sphäroplaste in Agar. Vorzugsweise wird der Agar auf eine Weise hergestellt, der die Regenerierung und die Selektion der transformierten Zellen, wie sie oben beschrieben wurde, zur gleichen Zeit erlaubt.Accordingly, the transformation process of E. coli cells, for example, involves the Ca 2+ pretreatment of the cells to allow DNA uptake and incubation with the hybrid vector. The subsequent selection of the transformed cells can be achieved, for example, by transferring the cells to a selective growth medium which allows separation of the transformed cells from the parent cells depending on the nature of the vector DNA marker sequence. Preferably, a growth medium is used which does not allow the growth of cells which do not contain the vector. The transformation of yeast includes, for example, the steps of enzymatically removing the yeast cell wall by glucosidases, treating the obtained spheroplasts with the vector in the presence of polyethylene glycol and Ca 2+ ions, and regenerating the cell wall by embedding the spheroplasts in agar. Preferably, the agar is prepared in a manner that permits regeneration and selection of the transformed cells as described above at the same time.
Die Transformation von Zellen mit höherem eukaryotischen Ursprung, beispielsweise Säugetierzellinien, wird vorzugsweise durch Transfektion erreicht. Transfektion wird nach herkömmlichen Methoden ausgeführt, beispielsweise Calciumphosphatausfällung, Mikroinjektion, Protoplastfusion, Elektroporation, d. h. Einführung der DNA durch einen kurzen elektrischen Impuls, der vorübergehend die Durchlässigkeit der Zellmembran erhöht, oder bei Vorhandensein von Helferverbindungen, wie Diethylaminoethyldextran, Dimethylsulfoxid, Glycerol oder Polyethylenglycol, und ähnlichen. NachThe transformation of cells of higher eukaryotic origin, for example mammalian cell lines, is preferably achieved by transfection. Transfection is carried out by conventional methods, for example, calcium phosphate precipitation, microinjection, protoplast fusion, electroporation, d. H. Introduction of the DNA by a short electrical pulse, which temporarily increases the permeability of the cell membrane, or in the presence of helper compounds, such as diethylaminoethyldextran, dimethyl sulfoxide, glycerol or polyethylene glycol, and the like. To
dem Transfektionsverfahren werden die transfizierten Zellen identifiziert und ausgewählt, z. B. durch Züchtung in einem selektiven Medium, das in Abhängigkeit von der Art des Selektionsmarkers ausgewählt wird, beispielsweise Standardkulturmedien, wie modifiziertes Eagle-Medium von Dulbecco (DMEM), Minimalmedium, RPMI-1640-Medium und ähnliche, die z. B. das entsprechende Antibiotikum enthalten.the transfection procedure, the transfected cells are identified and selected, e.g. By culturing in a selective medium selected depending on the nature of the selection marker, for example, standard culture media such as Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), minimal medium, RPMI 1640 medium and the like, e.g. B. contain the corresponding antibiotic.
Die transformierten Wirtszellen werden nach den in Fachkreisen bekannten Methoden in einem flüssigen Medium gezüchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen enthält, z. B. Kohlehydrate, wie Glucose oder Lactose, Stickstoff, z. B. Aminosäuren, Peptide, Proteine oder deren Abbauprodukte, wie Peptone, Ammoniumsalze oder ähnliche, und anorganische Salze, z. B. Sulfate, Phosphate und/oder Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium. Das Medium enthält außerdem beispielsweise wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, beispielsweise Eisen, Zink, Mangan und ähnliche. Das Medium wird vorzugsweise so gewählt, daß es einen Selektionsdruck ausübt und das Wachstum von Zellen verhindert, die nicht transformiert wurden oder den Hybridvektor verloren haben. So wird dem Medium beispielsweise ein Antibiotikum zugesetzt, wenn der Hybridvektor ein antibiotisches Resistenzgen als Marker enthält. Wenn beispielsweise eine Wirtszelle verwendet wird, die in einer essentiellen Aminosäure auxotroph ist, während der Hybridvektor ein Gen mit der Codierung für ein Enzym enthält, welches den Wirtsdefekt ergänzt, wird zur Züchtung der transformierten Zellen ein Minimalmedium verwendet, dem diese Aminosäure fehlt.The transformed host cells are cultured by the methods known in the art in a liquid medium containing assimilable carbon sources, e.g. Carbohydrates, such as glucose or lactose, nitrogen, e.g. As amino acids, peptides, proteins or their degradation products, such as peptones, ammonium salts or the like, and inorganic salts, eg. As sulfates, phosphates and / or carbonates of sodium, potassium, magnesium and calcium. The medium also contains, for example, growth-promoting substances, such as trace elements, for example iron, zinc, manganese and the like. The medium is preferably chosen such that it exerts selective pressure and prevents the growth of cells that have not been transformed or have lost the hybrid vector. For example, an antibiotic is added to the medium when the hybrid vector contains an antibiotic resistance gene as a marker. For example, if a host cell is used which is auxotrophic in an essential amino acid while the hybrid vector contains a gene coding for an enzyme which complements the host defect, a minimal medium lacking this amino acid is used to culture the transformed cells.
Zellen von höherem eukaryotischem Ursprung, wie Säugetierzellen, werden unter Gewebekulturbedingungen unter Verwendung kommerziell erhältlicher Medien gezogen, beispielsweise dem oben genannten modifizierten Eagle-Medium von Dulbecco (DMEM), dem Minimalmediiim, dem RPMI-1640-Medium und ähnlichen, wahlweise vervollständigt mit wachstumsfördernden Substanzen und/oder Säugerseren. Techniken zur Zellkultivierung unter Gewebekulturbedingungen sind in Fachkreisen allgemein bekannt und schließen die homogene Suspensionskultur, z. B. in einem Airlift-Reaktor oder in einem Dauerrührreaktor, oder die immobilisierte oder eingeschlossene Zellkultur, z. B. in Hohlfasern, Mikrokapseln, auf Agarose-Mikroperlen, porösen Glasperlen, Keramikhülsen oder anderen Mikroträgern, ein.Cells of higher eukaryotic origin, such as mammalian cells, are grown under tissue culture conditions using commercially available media, for example, the above-mentioned modified Eagle's medium of Dulbecco (DMEM), Minimalmediiim, RPMI 1640 medium and the like, optionally completed with growth promoting substances and / or mammalian serums. Techniques for cell culture under tissue culture conditions are well known in the art and include the homogeneous suspension culture, e.g. In an airlift reactor or in a continuous stirred reactor, or the immobilized or entrapped cell culture, e.g. In hollow fibers, microcapsules, on agarose microbeads, porous glass beads, ceramic sleeves or other microcarriers.
Die Kultur erfolgt nach Prozessen, die in Fachkreisen bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentierungszeit, werden so gewählt, daß ein maximaler Titer des Polypeptids oder Derivats der Erfindung gewonnen wird. So wird ein E. coil- oder ein Hefestamm vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durch Submerskultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20°C bis 40eC, vorzugsweise bei etwa 3O0C, und einem pH-Wert von 4 bis 8, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 7, für die Dauer von etwa 4 bis 30 Stunden, vorzugsweise bis zum Erreichen einer maximalen Ausbeute des Polypeptids oder Derivats der Erfindung, gezogen.The culture follows processes known in the art. Culture conditions, such as temperature, pH of the medium and fermentation time, are chosen to provide maximum titre of the polypeptide or derivative of the invention. Thus, an E. coil or a yeast strain, preferably under aerobic conditions by submerged culture with shaking or stirring at a temperature of about 20 ° C to 40 e C, preferably at about 3O 0 C, and a pH of 4-8 preferably at a pH of about 7, for a period of about 4 to 30 hours, preferably until a maximum yield of the polypeptide or derivative of the invention is reached.
Um die Selektion der transformierten von nichttransformierten Zellen zu ermöglichen, tragen die DNA-Moleküle der Erfindung einen Selektionsmarker oder, als Alternative dazu, die Zellen werden mit einem zweiten Vektor, der einen solchen Marker enthält, cotransformiert. Wie in anderen Systemen ist ein solcher Selektionsmarker ein expressierbares Strukturgen, dessen ausgeprägtes Polypeptid (ein Enzym) Resistenz gegenüber Verbindungen vermittelt, welche toxisch für den Rezipientenorganismus sind, oder welches das Enzymsystem eines Mutanten ergänzt, dem ein solches essentielles Polypeptid fehlt. Solche Markergene, die für die Selektion von transformierten Fadenpilzzellen geeignet sind, sind beispielsweise die bekannten qa-2-, pyrG-, pyr4-, trpC-, amdS-, oder argB-Gene.To enable selection of the transformed from untransformed cells, the DNA molecules of the invention carry a selection marker or, alternatively, the cells are cotransformed with a second vector containing such a marker. As in other systems, such a selection marker is an expressible structural gene whose distinct polypeptide (an enzyme) confers resistance to compounds that are toxic to the recipient organism or that supplements the enzyme system of a mutant lacking such an essential polypeptide. Such marker genes which are suitable for the selection of transformed filamentous fungus cells are, for example, the known qa-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS, or argB genes.
wie in EP278355 beschrieben wird, wurde ein Marker-Gen mit der Bezeichnung pyrA aus der Genombank von A.nlger isoliert, das mit pyrG von A. nldulans und pyr4 von N. crassa verwandt ist und eine ähnliche Funktion wie diese hat, nämlich die Produktion des Enzyms Orotidin-ö'-Phosphatdecarboxylase. Dieses Enzym katalysiert die Decarboxylierung des Orotidin-5'-phosphats zu Uridylsäure (Uridin-5'-phosphat) und auch von Fluor-orotinsäure zu dem toxischen Fluoruridin. Durch Hybridisierung mit dem 1,1 kb-Hind Ill-Frugment von pDJB2 (Ref. 25), das einen Teil des pyr4-Gens enthält, wurde ein E. coli-Klon identifiziert, der das pyrA-Gen enthält. Es kann jedoch DNA von jedem anderen pyr-Gen mit der Codierung für Orodin-5'-Phosphatdecarboxylase verwendet werden. Aus einem positiven Klon mit der Bezeichnung E.coliB75183/pCG59D7 wurde das Plasmid pCG59D7, welches das pyrA-Gen umfaßt, isoliert und für die Coiransformation eines A.nlger-pyrA~-Mutanten verwendet. Diesem pyrA'-f/utanten fehlt das Orotidin-5'-phosphatdecarboxylasegen, und er ir,t daher nicht in der Lage, das entsprechende Enzym zu produzieren. Ein solcher Mutant wurde durch Behandlung von Konidiosporen von A. niger N 756 unter mutierender UV-Bestrahlung hergestellt, und es werden dio Kolonien ausgewählt, die bei Anwesenheit von Fluor-Orotinsäure und Uridin überleben. Kolonien, die bei Anwesenheit von Fluor-orotinsäure und Fehlen von Uridin überleben, werden ausgeschaltet. Die verbleibenden uridinbedürfenden Mutanten gehören entsprechend ihrer Fähigkeit, transformierbar zu sein, zu zwei Komplementationsgruppen pyrA und pyrB, die durch die Mutanten An8 bzw. An 10 dargestellt werden. Sie werden in Form ihrer Protoplasten unter transformierenden Bedingungen mit dem pyrA-haltigen Plasmid pCG 59D7 behandelt. Es wurde festgestellt, daß nur die An 8-Kolonien transformiert waren und das pyrA-Gen enthielten, wie durch die hybridisierende Fähigkeit ihrer aufgeschlossenen DNA mit DNA von pUN 121 unter Beweis gestellt wird.as described in EP278355, a marker gene named pyrA was isolated from the genome bank of A. niger, which is related to and has a similar function to pyrG of A. nldulans and pyr 4 of N. crassa, namely the production the enzyme orotidine-o'-phosphate decarboxylase. This enzyme catalyzes the decarboxylation of orotidine-5'-phosphate to uridylic acid (uridine-5'-phosphate) and also from fluoro-orotic acid to the toxic fluorouridine. By hybridization with the 1.1 kb Hind III fragment of pDJB2 (ref 25) containing part of the pyr4 gene, an E. coli clone containing the pyrA gene was identified. However, DNA from any other pyr gene coding for Orodin 5'-phosphate decarboxylase can be used. From a positive clone designated E. coli B75183 / pCG59D7, the plasmid pCG59D7, which comprises the pyrA gene, was isolated and used for the coir transformation of an A.nlger-pyrA mutant. This pyrA'-substrate is lacking the orotidine 5'-phosphate decarboxylase gene and therefore unable to produce the corresponding enzyme. Such a mutant was prepared by treating conidiospores of A. niger N 756 under mutant UV irradiation and selecting colonies that survive in the presence of fluoro-orotic acid and uridine. Colonies that survive in the presence of fluoro-orotic acid and absence of uridine are eliminated. The remaining uridine-requiring mutants, according to their ability to be transformable, belong to two complementation groups, pyrA and pyrB, represented by the mutants An8 and An10, respectively. They are treated in the form of their protoplasts under transforming conditions with the pyrA-containing plasmid pCG 59D7. It was found that only the An 8 colonies were transformed and contained the pyrA gene as evidenced by the hybridizing ability of their digested DNA with pUN 121 DNA.
Die Erfindung betrifft außerdem eine Methode zur Herstellung von Polypeptiden, welche dadurch gekennzeichnet ist, daß ein homologes oder heterologes Strukturgen, beispielsweise in dem oben definierten Sinne, eingefügt in eine Expressionskassette der Erfindung, nach herkömmlichen Methoden in einem in geeigneter Weise transformierten Wirt ausgeprägt wird. Wenn erforderlich, wird das Polypeptid auf herkömmliche Weise isoliert. In Abhängigkeit vom Aufbau der Expressionskassette, werden die Produkte entweder produziert oder, wenn eine Signalsequenz vorhanden ist, produziert und sekretiert. In der Regel ist die Expressionskassette in einem Hybridvektor enthalten, sie kann aber auch nach der Transformation in das Wirtsgenom integriert werden.The invention also relates to a method of producing polypeptides, characterized in that a homologous or heterologous structural gene, for example as defined above, inserted into an expression cassette of the invention is expressed by conventional methods in a suitably transformed host. If necessary, the polypeptide is isolated in a conventional manner. Depending on the construction of the expression cassette, the products are either produced or, if a signal sequence is present, produced and secreted. In general, the expression cassette is contained in a hybrid vector, but it can also be integrated into the host genome after the transformation.
Ein geeigneter Wirt ist beispielsweise ein Pilz, z. B. ein Fadenpilz, besonders ein Aspergillus-Stamm, wenn ein Promotor, der von einem PG-Gen der Erfindung abgeleitet wurde, oder ein anderer Promotor, der von Fadenpilzen abgeleitet wurde, für die Expression eines homologen oder heterologen Strukturgens genutzt wird. Wenn jedoch andere Promotoren verwendet werden, beispielsweise solche, die von Prokaryoten oder höheren Eukaryoten abgeleitet wurden, sind andere Wirte geeignet, beispielsweise Bakterien, wie E.coli bzw. höhere eukaryotische Zellen.For example, a suitable host is a fungus, e.g. A filamentous fungus, especially an Aspergillus strain, when a promoter derived from a PG gene of the invention or another promoter derived from filamentous fungi is used for the expression of a homologous or heterologous structural gene. However, when other promoters are used, for example, those derived from prokaryotes or higher eukaryotes, other hosts are suitable, for example, bacteria such as E. coli and higher eukaryotic cells, respectively.
Die Promotoren der PG-Gene von A.nlger sind in der A. nlger-Zelle induzierbar, d. h., die Expression des daran gebundenen Strukturgens, z. B. des Strukturgens mit der Codierung für ein PG- oder ein Fremdgen, wird durch den Zusatz von Pectin oder Pectinabbauprodukten zum Medium induziert. Bei Anwesenheit von genügend Glucose aber ist der Promotor nicht induzierbar, wenn ein A. niger-Stamm, z. B. An8 oder N 593, als Wirt verwendet wird. Das bedeutet, Gene unter der Kontrolle eines A. nlger-PG-Promotors sind in A. nlger „katabolit-reprimiert". Wird jedoch ein anderer Aspergillus-Stamm verwendet, vorzugsweiseThe promoters of A.nlger PG genes are inducible in the A. niger cell, i. h., the expression of the structural gene bound thereto, e.g. Of the structural gene coding for a PG or a foreign gene is induced by the addition of pectin or pectin degradation products to the medium. However, in the presence of sufficient glucose, the promoter is not inducible when an A. niger strain, e.g. B. An8 or N 593, is used as a host. That is, genes under the control of an A. niger PG promoter are " catabolite-repressed " in A. However, if another Aspergillus strain is used, preferably
A. oryzae oder besser noch A. nldulans, wird ein Gen unter der Kontrolle eines /.. nlger-PG-Promotors konstitutiv ausgeprägt, d. h. auch bei Fehlen von Pectin und/oder bei Anwesenheit von Glucose. Es kann daher vorteilhaft sein, Gene unter der Kontrolle eines A. nlger-PG-Promotors in einem anderen Aspergillus-Wirt als A. nlger, vorzugsweise A.oryzae oder besser noch A. nldulans, auszuprägen, weil beispielsweise dem Nährmedium Glucose anstelle von Pectin als Energie- und Kohlenstoffquelle während der Expression eines gewünschten Gens zugesetzt werden kann.A. oryzae, or better still A. nldulans, a gene is constitutively expressed under the control of a niger PG promoter, i. H. even in the absence of pectin and / or in the presence of glucose. It may therefore be advantageous to express genes under the control of an A. niger PG promoter in an Aspergillus host other than A. nlger, preferably A.oryzae or better still A. nldulans, because, for example, the nutrient medium is glucose instead of pectin can be added as an energy and carbon source during expression of a desired gene.
Wenn für den Aufbau einer Expressionskassette der Erfindung ein Promotor verwendet wird, der nicht von einem PG-Gen der vorliegenden Erfindung abgeleitet wurde, der z. B. ein Strukturgen umfaßt, das eine PG codiert, können andere Wirte als Expressionswirte verwendet werden. Solche geeigneten Wirte sind von dem verwendeten Promotor abhängig und sind z. B. Bakterien, wie E. coil, oder Hefe, wie S. cerevlslae oder Kluyveromyces lactis. Geeignete Wirte und Promotoren für die Herstellung von Polypeptiden nach der Erfindung sind auch die oben für die Transformation als geeignet angegebenen. Es ist nun möglich, eine oder mehrere gewünschte PG überauszuprägen, wofür verschiedene Methoden angewendet werden können. Eine gereinigte einzelne PG kann so hergestellt werden, daß pectinolytisches Enzymgemisch, welche eine PG enthält, herkömmlichen Reinigungsmethoden unterzogen wird. Eine andere Methode zur Produktion oiner einzelnen PG, vorzugsweise von PG I, PG Il oder des Produktes des pgaC-Gens, ist dadurch gekennzeichnet, daß ein geeigneter Wirt, der nicht in der Lage ist, eine PG auszuprägen, oder der PG in einer geringen Menge ausprägt oder der PG nicht unter den für das eingeführte PG-Gen angewendeten Induktionsbedingungen ausprägt, mit einem Hybridvektor transformiert wird, dor ein Strukturgen mit der Codierung für die PG, z. B. PG I, PG Il oder das pgaC-Genprodukt oder ein Fragment von PG mit PG-Aktivität umfaßt, und daß dieses Strukturgen ausgeprägt wird. Wenn ein Wirt, der nicht in der Lage ist, überhaupt eine PG auszuprägen, verwendet wird, kann die entsprechende einzelne PG in reiner Form gewonnen werden, d. h. nichtkontaminiert durch eine andere PG. Es ist auch möglich, im voraus bestimmte Gemische von PG, wahlweise zusammen mit anderen Enzymen, dadurch herzustellen, daß in einem transformierten Wirt nicht nur ein einzelnes, sondern mehr als ein gewünschtes PG-Gen, wahlweise zusammen mit Genen, die andere Enzyme codieren, ausgeprägt werden. Im voraus bestimmte Gemische kann man auch dadurch erhalten, daß ein oder mehrere gewünschte Gene für PG und/oder andere Enzyme, z. B. für Pectinesterasen, Pect.inlyasen, Cellulasen, gemischte Endoglucanasen, Hemicellulasen, Xylanasen, Arabinasen, Galactanasen, α- und ß-Glycodidasen und ähnliche, in einem Wirtsstamm ausgeprägt werden, wahlweise einem mit einem gewissen Hintergrund in der Enzymproduktion. Im voraus bestimmte Gemische von Enzymen kann man auch durch Unterbrechung von bestimmten PG-Genen im Wirt durch „Gen-Unterbrechung" erhalten, eine in Fachkreisen allgemein bekannte Technik, wobei die isolierten PG-Gene der Erfindung eingesetzt werden.When used to construct an expression cassette of the invention, a promoter not derived from a PG gene of the present invention, e.g. For example, if a structural gene encodes a PG, other hosts may be used as expression hosts. Such suitable hosts are dependent on the promoter used and are z. B. bacteria, such as E. coil, or yeast, such as S. cerevlslae or Kluyveromyces lactis. Suitable hosts and promoters for the production of polypeptides according to the invention are also those specified above for the transformation. It is now possible to override one or more desired PGs, for which various methods can be used. A purified single PG can be prepared so that pectinolytic enzyme mixture containing a PG is subjected to conventional purification methods. Another method for producing a single PG, preferably PG I, PG II or the product of the pgaC gene, is characterized in that a suitable host that is unable to express a PG, or the PG in a small Amounts or does not express the PG under the induced conditions for the introduced PG gene induction conditions, is transformed with a hybrid vector, which is a structural gene encoding the PG, z. PG I, PG II or the pgaC gene product or a fragment of PG having PG activity, and that this structural gene is expressed. If a host incapable of ever printing a PG is used, the corresponding single PG can be recovered in a pure form, i. H. not contaminated by another PG. It is also possible to prepare in advance certain mixtures of PG, optionally together with other enzymes, by virtue of the fact that in a transformed host not only a single, but more than one desired PG gene, optionally together with genes encoding other enzymes, be pronounced. Pre-determined mixtures may also be obtained by having one or more desired genes for PG and / or other enzymes, e.g. For pectin esterases, pect.inlyases, cellulases, mixed endoglucanases, hemicellulases, xylanases, arabinases, galactanases, α- and β-glycodidases and the like, in a host strain, optionally one with some background in enzyme production. Pre-determined mixtures of enzymes can also be obtained by disruption of certain PG genes in the host by "gene disruption", a technique well known in the art using the isolated PG genes of the invention.
Ein Wirt, der nicht in der Lage is', überhaupt eine PG auszuprägen, ist entweder ein Mikroorganismus ohne ein entsprechendes Gen, z. B. ein PC-Aspergillus-Stamm, ein anderer PG~-Nicht-Asperglllus-Pilz oder jede andere PG~-eukaryotische oder -prokaryotische Zelle, oder ein Aspergillus-Stamm, z. B. A. oryzae oder A. nidulans, dessen Expression von endogenen PG-Genen in einem entsprechend konditionierten Wachstumsmedium unterdrückt wird, die z.B. „katabolit-reprimiert" sind und/oder uninduziert, während der exogene PG-Promotor operativ mit dem gewünschten PG-Strukturgen gekoppelt ist, z. B. ein von A. niger abgeleiteter Promotor, und unter diesen Bedingungen aktiv ist, oder wenn das PG-Gen mit einem anderen Promotor verschmolzen ist.A host who is unable to express a PG at all is either a microorganism without a corresponding gene, e.g. A PC Aspergillus strain, another PG ~ non-Aspergillus fungus or any other PG ~ eukaryotic or prokaryotic cell, or an Aspergillus strain, e.g. B. A. oryzae or A. nidulans, the expression of which is suppressed by endogenous PG genes in a suitably conditioned growth medium, e.g. "Catabolite-repressed" and / or uninduced while the exogenous PG promoter is operably linked to the desired PG structural gene, e.g., an A. niger-derived promoter, and is active under these conditions, or when the PG Gene is fused with another promoter.
Andere Promotoren und Stämme, die für die Herstellung der PG geeignet sind, sind die gleichen, wie sie oben in der Beschreibung der Expressionskassetten gegeben wurden.Other promoters and strains suitable for the production of the PG are the same as those given above in the description of the expression cassettes.
Die einzelnen PG, die aus einem pectinolytischen Enzymgemisch, vorzugsweise aus einem von Aspergillus niger abgeleiteten pectinolytischen Enzymgemisch und insbesondere aus Rapdase*, gereinigt wurden, und PG, welche durch eine DNA-Sequenz nach der Erfindung codiert werden, und deren Derivate mit PG-Aktivität, insbesondere, wenn sie in einem geeigneten Wirt produziert werden, der mit einem Expressionshybridvektor mit der Codierung für eine solche PG oder deren Derivat mit PG-Aktivität transformiert wurde, und deren physiologisch akzeptable Salze sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Besonders bevorzugt werden PG I, PGII, PG III A, PG III B und PGIV von Aspergillus niger in gereinigter Form. Vorliegende Erfindung betrifft diese Polypeptide, wenn sie nach einer Methode der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf enzymatische Zusammensetzungen, welche eine oder mehrere dieser einzelnen PG und/oder deren Derivat mit PG-Aktivität und/oder deren biologisch akzeptable Salze, wahlweise in einer festgelegten Kombination mit einem oder mehreren geeigneten Enzymen mit einer anderen als PG-Aktivität, umfassen. Enzyme mit einer anderen als PG-Aktivität, die für die Herstellung dieser enzymatischen Zusammensetzungen geeignet sind, sind abbauende und modifizierende Pflanzenzellwandpolymere. Solche Enzyme sind z. B. Pectinesterasen, Pectinlyasen, gemischte Endoglucanasen, Hemicellulasen, Xylanasen, Arabinasen, Galactanasen, α- und ß-Glycodidasen und ähnliche. Vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf die Herstellung dieser enzymatischen Zusammensetzungen auf herkömmliche Weise.The individual PGs purified from a pectinolytic enzyme mixture, preferably from a pectinolytic enzyme mixture derived from Aspergillus niger and in particular from rapeseed *, and PG which are encoded by a DNA sequence according to the invention and their derivatives having PG activity in particular when produced in a suitable host transformed with an expression hybrid vector encoding such PG or its derivative having PG activity, and physiologically acceptable salts thereof are also provided by the present invention. Particularly preferred are PG I, PGII, PG III A, PG III B and PGIV of Aspergillus niger in purified form. The present invention relates to these polypeptides when prepared by a method of the present invention. The invention also relates to enzymatic compositions comprising one or more of these individual PGs and / or derivatives thereof having PG activity and / or their biologically acceptable salts, optionally in a predetermined combination with one or more suitable enzymes having other than PGs. Activity, include. Enzymes having other than PG activity suitable for the preparation of these enzymatic compositions are degradative and modifying plant cell wall polymers. Such enzymes are for. As pectin esterases, pectin lyases, mixed endoglucanases, hemicellulases, xylanases, arabinases, galactanases, α- and ß-glycodidases and the like. The present invention also relates to the preparation of these enzymatic compositions in a conventional manner.
Der Einsatz dieser einzelnen PG und/oder von deren Derivaten mit PG-Aktivität und/oder dieser enzymatischen Zusammensetzungen bei der Verarbeitung von Pflanzenmaterial ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Einzelne PG der Erfindung und/oder deren Derivate mit PG-Aktivität oder enzymatische Zusammensetzungen, welche diese PG oder Derivate umfassen, sind z. B. nützlich bei der Klärung von Gemüse- oder Fruchtsaft, bei der Steigerung des Saftertrages in der Gemüse- oder Fruchtsaftherstellung und des Preßertrages von ölhaltigen Samen oder Früchten, bei der Stabilisierung von Gemüse- oder Fruchtsaft, bei der Verringerung der Viskosität von Gemüse- oder Fruchtsaft, bei der Verflüssigung von Biomasse, bei der Mazerierung, bei der Steigerung der Extraktion von Naturprodukten, wie natürlichen Pigmenten, Aroma- und Geschmacksstoffen, bei der Aufwertung von Biomasse, Nahrungs- oder Futtermitteln, zur Verbesserung der Gewinnung von Cellulosefasern in der Papierzellstoffgewinnung und ähnlichenThe use of these individual PGs and / or derivatives thereof with PG activity and / or enzymatic compositions in the processing of plant material is also provided by the present invention. Individual PGs of the invention and / or their derivatives having PG activity or enzymatic compositions comprising these PGs or derivatives are e.g. B. useful in the clarification of vegetable or fruit juice, in increasing the juice yield in the vegetable or fruit juice production and the Preßertrages of oily seeds or fruits, in the stabilization of vegetable or fruit juice, in reducing the viscosity of vegetables or Fruit juice, in the liquefaction of biomass, in maceration, in increasing the extraction of natural products, such as natural pigments, flavorings and flavorings, in the upgrading of biomass, food or feed, to improve the recovery of cellulose fibers in pulp production and similar
Am meisten bevorzugt werden die Ausführungsbeispiele der Erfindung, die anschließend in den Beispielen beschrieben werden. Most preferred are the embodiments of the invention which are described below in the examples.
Abb. 1: Partielle Restriktionskarten der EcoRI-Fragmente der Phage XD und λ E, die aus einer Genombank von A. niger durch Hybridisierung mit den combinierten DNA-Sonden HR 6195 und HR 6196 mit der Codierung für einen Teil des PG Il-Gens gewonnen wurden. Die Zahlen bezeichnen die angenäherten Abstände in kbp von den rechten EcoRI-Orten.Fig. 1: Partial restriction maps of the EcoRI fragments of the phage XD and λ E obtained from a genomic library of A. niger by hybridization with the combined DNA probes HR 6195 and HR 6196 encoding part of the PG II gene were. The numbers indicate the approximate distances in kbp from the right EcoRI sites.
Ampicillinresistenzgen, und die Pfeile geben die von A. nlger abgeleitete DNA anAmpicillin resistance gene, and the arrows indicate A. nlger-derived DNA
Abb. 3: Partielle Restriktionskarte von pGW 1900. Zusammengesetzt aus dem pUC9-Vektor und einem 8,6kbp-BamHI-Fragmentdes Phagen PGI-A7. Fig. 3: Partial restriction map of pGW 1900. Composed of the pUC9 vector and an 8.6kbp BamHI fragment of phage PGI-A7.
Abb.4: Klonierungsstrategie für die Plasmide pG IUFN AM 119 und pG Ilss-IFN AM 119Fig.4: Cloning strategy for the plasmids pG IUFN AM 119 and pG Ilss-IFN AM 119
Abb. 5: Schrittweise Herstellung von DNA-Einschüben DNA5 und DNA6 für den Aufbau von pG H-IFN AM 119 bzw. pG Ilss-IFN Fig. 5: Stepwise preparation of DNA inserts DNA5 and DNA6 for the assembly of pG H-IFN AM 119 and pG Ilss IFN, respectively
AM 119 nach der Methode der Polymerasekettenreaktion (PCR-Methode)AM 119 according to the method of polymerase chain reaction (PCR method)
Abb.6: Partielle Restriktionskarte von pGW 1756. pGW 1756 ist das 5,5kbp-Xhol-Bglll-Fragment, welches das A.nlger-NW756- FIG. 6: Partial restriction map of pGW 1756. pGW 1756 is the 5.5 kbp Xho I Bgl II fragment which contains the A. nlger NW756 fragment.
Sail- bzw. BamHI-Orten des Vektors zerstörtSail or BamHI sites of the vector destroyed
Abb.7: Partielle Restriktionskarte von pGW 1910. pGW1910 ist das 7,8kbp-Bglll-Fragment des Lambdaphagen PG-C20, Fig. 7: Partial restriction map of pGW 1910. pGW1910 is the 7.8 kbp BglII fragment of lambda phage PG-C20.
eingeschoben in den BamHI-Ort des Vektors pUC9. Es wird die ungefähre Lage des A. nlger-N400-Gens angegeben,inserted into the BamHI site of the vector pUC9. The approximate location of the A. nlger N400 gene is indicated.
welches das PGC- (pgaC-) Gen codiert.which encodes the PGC (pgaC) gene.
bis Tris Bis(2-Hydroxyethyl)imino-tris(hydroxymethyl)-methanbis Tris bis (2-hydroxyethyl) imino-tris (hydroxymethyl) -methane
kbp Kilobasenpaarekbp kilobase pairs
explizit genannt werden, mit NaOH auf einen pH-Wert von 6,0 abgestimmtexplicitly mentioned, adjusted to a pH of 6.0 with NaOH
Vollmedium Minimalmedium mit 6 g NaNO3 und 10 g Glucose je Liter, plus 2 g Trypicasepenton (BBL), 1 g Casaminosäuren(Difco), 1 g Hefeextrakt (BBL),0,5g Ribonucleinsäurenatriumsalz von Hefe (ICN, Cleveland, USA), 2 mlComplete medium minimal medium with 6 g NaNO 3 and 10 g glucose per liter, plus 2 g trypicazepone (BBL), 1 g casamino acids (Difco), 1 g yeast extract (BBL), 0.5 g yeast ribonucleic acid sodium salt (ICN, Cleveland, USA), 2 ml
Vitaminlösung je Liter, mit NaOH auf einen pH-Wert von 6,0 abgestimmtVitamin solution per liter, adjusted to a pH of 6.0 with NaOH
Vitaminlösung je 100 ml 10 mg Thiamin, 100 mg Riboflavin, 10 mg Pantothensäure, 2 mg Biotin, 10 mg p-Aminobenzoesäure,100 mg Nicotinamid, 50 mg Pyridoxin-HCI Vitamin solution per 100 ml 10 mg thiamine, 100 mg riboflavin, 10 mg pantothenic acid, 2 mg biotin, 10 mg p-aminobenzoic acid, 100 mg nicotinamide, 50 mg pyridoxine-HCl
Probenpuffer 10 % (Vol./Vol.) Glycerol, 10OmM EDTA, pH-Wert 8,0, und 0,01 % Bromphenolblau RNase A RNase A, die in der von Maniatis u. a. beschriebenen Weise behandelt wurde (Ref. 6, S. 451)Sample buffer 10% (v / v) glycerol, 10 mM EDTA, pH 8.0, and 0.01% bromophenol blue RNase A RNase A, which was synthesized by the method described by Maniatis et al. a. (Ref 6, p. 451)
(F', traD 36, proAB, laclqZ M15](F ', traD 36, proAB, laclqZ M15]
Ε» werden folgende Vektoren verwendet:Ε »the following vectors are used:
pGW613pGW613
M13mp-PhageM13 mp phage
und werden zur Erleichterung der DNA-Sequenzierung designiert, da sie die Klonierung von DNA-Fragmanten an einemvielseitigen Polylinkerort und die Klonierung des gleichen Restriktionsfragmentes in beiden möglichen Orientierungen erlauben.and are designated for ease of DNA sequencing because they permit the cloning of DNA fragments at a versatile polylinker site and the cloning of the same restriction fragment in both possible orientations.
einzelsträngigen Sonden unter Verwendung des Oligodeoxyribonucleotid-Standardstarters und des Klenow-Fragments dersingle-stranded probes using the standard oligodeoxyribonucleotide starter and Klenow fragment
enthalten, werden in die lacZ-Sequenz eingeschoben. Der Polylinker behält das lacZ-Leseraster bei, und der Vektor gibt dieaüclische Komplementierung eines LacZa-Wirtsstammes, was blaue Plaques auf Platten ergibt, die IPTG und X-gal enthalten.are inserted into the lacZ sequence. The polylinker retains the lacZ reading frame and the vector gives complete complementation of a LacZa host strain, resulting in blue plaques on plates containing IPTG and X-gal.
lacZa-Peptids beeinträchtigen, werden als farblose Plaques aufgezeigt.lacZa peptide are shown as colorless plaques.
pGW635pGW635
beschrieben.described.
einen Mehrfachklonierungsbereich zwischen den Lambda-Armen und dem nichtessentiellen Stuffer-Bereich. Das gestattet es,a multiple cloning region between the lambda arms and the nonessential stuffer region. That allows
die Vektorarme reduziert wird, wenn die interessierende Fremd-DNA eingeschoben wird. Der Vektor nutzt auch denthe vector arms are reduced as the foreign DNA of interest is inserted. The vector also uses the
pEMBL18undpEMBL19pEMBL18undpEMBL19
(Ref. 10,22,23).(Ref 10,22,23).
u.a., Ref. 2) beschrieben wurde, wobei ein modifizierter Ferricyanidtest (Robyt u.a., Ref.3) angewendet wird.et al., Ref. 2) using a modified ferricyanide test (Robyt et al., Ref. 3).
pectinolytischen Enzymen, die von Aspergillus niger (Gist-brocades, Soclin, Frankreich) gewonnen wurden. Es werden 50g despectinolytic enzymes obtained from Aspergillus niger (Gist-brocades, Soclin, France). There will be 50g of the
250COg zentrifugiert, um die Feststoffe zu entfernen, und auf einer Sephadex-G-50-Säule (5cm x 90cm), die im gleichen Pufferäquilibriert worden war, entsalzt.Centrifuged to remove the solids and desalted on a Sephadex G-50 column (5cm x 90cm) equilibrated in the same buffer.
2,5cm x 30cm). Das entsalzte Enzym wird auf diese Säule gebracht und dann durch Anwendung eineslOOmM-Natriumacetatpuffers, pH-Wert 4,2 bzw. 5,6 (jeweils 400ml) gewaschen. Während PGI und PGII auf die Alginatmatrixadsorbieren, ist das bei den PG III A, III B und IV nicht der Fall.2.5cm x 30cm). The desalted enzyme is placed on this column and then washed by using a 100 mM sodium acetate buffer, pH 4.2 and 5.6 (400 ml each). While PGI and PGII adsorb to the alginate matrix, PG III A, III B and IV are not.
Die adsorbierten PGI- und PG Il-Proteine von der quervernetzten Alginatsäule werden durch einen linearen Natriumchloridgradienten (0-1 M) in einem lOOmM-Natriumacetatpuffer bei einem pH-Wert von 5,6 eluiert, was eine geringfügige Modifikation des bisher angewendete) < Verfahrensc! stellt (Rombouts u.a., Ref. 1). PGI coeluiert mit PG Il bei etwa 0,5M NaCI.The adsorbed PGI and PG II proteins from the cross-linked alginate column are eluted by a linear sodium chloride gradient (0-1 M) in a 100 mM sodium acetate buffer at pH 5.6, which is a minor modification of the hitherto employed method ! (Rombouts et al. Ref. 1). PGI co-elutes with PG II at about 0.5M NaCl.
Die Enzymfraktion, wolche PGI und PG Il enthält, wird anhand eines 20mM-Natriumacetatpuffers, pH-Wert 5,7, dialysiert und einer DEAE-Sephadex-A-50-Säule (2,5cm χ 3Oom) zugeführt, die in dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Die Enzyme werden unter Verwendung eines linearen NaCI-Gradienten (0-0,6M) eluiert. PGI eluiert bei etwa 0,3 M NaCI, PG Il bei etwa 0,2 M. Die Enzymfraktionen, welche PGI und PG Il enthalten, werden getrennt aufgofangen, anhand eines 20mM-Tris-HCI-Puffors, pH-Wert 5,8, dialysiert und auf einer DEAE-Sepharose-Schnellflußsäule Chromatographien, die in dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Bei Anwendung eines NaCI-Gradienten wird PG Il bei etwa 120 mM Natriumchlorid eluiert, PGI bei etwa 25OmM. Aktive Enzymfraktionen, welche PGI oder PG Il enthalten, werden nach der Dialyse anhand eines 2OmM-Natriumacetatpuffers, pH-Wert 5,7, auf ein Endvolumen von 25ml auf einer kleinen DEAE-Sepharose-Schnellflußsäule (1,6cm x 10cm) durch Eluieren mit 1M Natriumchlorid in diesem Puffer konzentriert. Die abschließende Reinigung jedes der beiden Enzyme PGI und PG Il wird durch Gelpermeationschromatographie auf Sephacryl S200 (1,6cm x 90cm) in 0,1 M Natriumacetat, pH-Wert 4,2, erreicht.The enzyme fraction containing PGI and PG II is dialysed from a 20 mM sodium acetate buffer, pH 5.7, and added to a DEAE Sephadex A-50 column (2.5 cm 3 Oom) in the same buffer had been equilibrated. The enzymes are eluted using a linear NaCl gradient (0-0.6M). PGI elutes at about 0.3 M NaCl, PG II at about 0.2 M. The enzyme fractions containing PGI and PG II are picked up separately using a 20 mM Tris-HCl buffer, pH 5.8. and on a DEAE-Sepharose fast flow column, chromatographies which had been equilibrated in the same buffer. Using a NaCl gradient, PG II is eluted at about 120 mM sodium chloride, PGI at about 25 mM. Active enzyme fractions containing PGI or PG II, after dialysis, are eluted with a 2MM sodium acetate buffer, pH 5.7, to a final volume of 25 ml on a small DEAE-Sepharose fast flow column (1.6 cm x 10 cm) Concentrated 1M sodium chloride in this buffer. The final purification of each of the two enzymes PGI and PG II is achieved by gel permeation chromatography on Sephacryl S200 (1.6 cm × 90 cm) in 0.1 M sodium acetate, pH 4.2.
PG Il weist eine einzelne Bande bei SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf und hat eine scheinbare Molekülmasse von 38kDa. Die spezifische Aktivität beträgt 2760 Einheiten/mg Protein, bestimmt in einem 0,075 M-Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2. Bei isoelektrischer Fokussierung zeigt das Enzym Mikroheterogenität. Neben einer ausgeprägten Hauptkomponente bei einem pH-Wert von etwa 5,2, wird eine große Zahl von kleineren Banden im pH-Wert-Bereich von 4,6 bis 5,9 beobachtet.PG II has a single band on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and has an apparent molecular mass of 38 kDa. The specific activity is 2760 units / mg protein, determined in a 0.075 M sodium acetate buffer, pH 4.2. In isoelectric focusing, the enzyme exhibits microheterogeneity. Besides a pronounced major component at a pH of about 5.2, a large number of smaller bands are observed in the pH range of 4.6 to 5.9.
PGI weist bei SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ebenfalls eine Bande auf. Dieses Enzym hat eine scheinbare Molekülmasse von 55kDa. Die spezifische Aktivität beträgt 555 Einheiten/mg Protein, bestimmt in einem 0,075 M-Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2. Beim isoelektrischen Fokussieren weist das Enzym auch Mikroheterogenität auf. Im pH-Wert-Bereich von 3,2 bis 3,5 werden mehrore Banden beobachtet.PGI also has a band on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. This enzyme has an apparent molecular mass of 55kDa. The specific activity is 555 units / mg of protein, determined in a 0.075 M sodium acetate buffer, pH 4.2. In isoelectric focusing, the enzyme also has microheterogeneity. In the pH range of 3.2 to 3.5, multiple bands are observed.
die in 0,02 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,7, äquilibriert worden war. Die Enzyme werden aus der DEAE-Sephadex-Säule miteinem linearen Natriumchloridgradienten (0-1 M) eluiert. PGIVeluiert bei 0,38M Natriumchlorid, PG III A und PJG III BcoeluierenbeiO,5M.which had been equilibrated in 0.02 M sodium acetate buffer, pH 5.7. The enzymes are eluted from the DEAE-Sephadex column with a linear sodium chloride gradient (0-1 M). PGIII eluted at 0.38M sodium chloride, PG III A and PJG III Bcoeluate in O, 5M.
5ml von jeder der beiden Enzymfraktionen werden auf einer Sephacryl-S-200-Säule (1,6cm x 90cm) in 0,1 M5ml of each of the two enzyme fractions are loaded onto a Sephacryl S-200 column (1.6cm x 90cm) in 0.1M
verdünnt und einer MONO Q-Säule (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) zugeführt, die in 0,02 M bis-Tris/HCI-Puffer,pH-Wert 5,8, äquilibriert worden war. Bei Anwendung eines linearen Natriumchloridgradienten von 20ml (0,1-0,4M) eluiertand MONO Q column (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) equilibrated in 0.02 M bis-Tris / HCl buffer, pH 5.8. Eluted using a linear sodium chloride gradient of 20ml (0.1-0.4M)
chromatographiert. Fraktionen mit PG-Aktivität werden zusammengefaßt, anhand eines 0,025M-Piperazin/HCI-Puffers,pH-Wert 6,0, dialysiert, und einer Säule MONO P (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) zugeführt, die in dem gleichenChromatograph. Fractions having PG activity are pooled, dialyzed from a 0.025M piperazine / HCl buffer, pH 6.0, and fed to a MONO P column (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) which is in the same
pH-Wert 3,0, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,75 ml/min eluiert.pH 3.0, eluted at a flow rate of 0.75 ml / min.
(LKB, Bromna, Schweden), die in 0,05M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,2, äquilibriert worden war,(LKB, Bromna, Sweden) equilibrated in 0.05M sodium phosphate buffer, pH 6.2,
einzige Bande bei SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und hat eine scheinbare Molekülmasse von 59kDa, bestimmt durchsingle band on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and has an apparent molecular mass of 59 kDa as determined by
0,075M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2. Bei isoelektrischer Fokussierung zeigt das Enzym eine einzige, scharfe Bande beieinem pH-Wert von 3,7.0.075M sodium acetate buffer, pH 4.2. In isoelectric focusing, the enzyme shows a single, sharp band at a pH of 3.7.
scheinbaren Molekülmasse von 32 bzw. 52kDa. Bei SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (15% Polyacrylamidgel) aber weisenbeide Enzyme eine einzige Bande mit einer identischen Molekülmasse von 57 kDa auf. PG III A und PG III B haben eine spezifischeapparent molecular mass of 32 or 52 kDa. However, in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (15% polyacrylamide gel), both enzymes have a single band with an identical molecular mass of 57 kDa. PG III A and PG III B have a specific
beschriebene Weise gereinigt. Die Eigenschaften dieser gereinigten Enzyme werden in der Tabelle Il zusammengefaßt.cleaned way described. The properties of these purified enzymes are summarized in Table II.
a Durch SDS-Gelelektrophorese bestimmter, extrapolierter Wert.a Extrapolated value determined by SDS gel electrophoresis.
b Isoelektrischer Punkt, durch isoelektrische DOnnschlchtfokuseierung bestimmt.b Isoelectric point, determined by isoelectric power focussing.
Alle gereinigten Enzyme haben auf einem 15%igen SDS-Polyacrylamidgel eine scheinbare Molekülmasse im Bereich von 55-59 kDa, ausgenommen nur PGII, die ein viel kleineres Protein zu sein scheint (38 kDa). Der besondere Charakter von PGII wird durch den relativ hohen isoelektrischen Punkt im Vergleich zu den niedrigen Werten des isoelektrischen Punktes, der für die anderen Polygalacturonasen bestimmt wurde, unterstrichen. Das pH-Wert-Optimum aller Polygalacturonast η liegt im gleichen Bereich (4,3-4,9).All purified enzymes have an apparent molecular weight in the range of 55-59 kDa on a 15% SDS-polyacrylamide gel, except for PGII, which appears to be a much smaller protein (38 kDa). The peculiar character of PGII is underlined by the relatively high isoelectric point compared to the low isoelectric point values determined for the other polygalacturonases. The pH optimum of all polygalacturonast η is in the same range (4.3-4.9).
Spezifische Antikörper gegen gereinigte PGI und PG Il werden in männlichen weißen Neuseelandkaninchen nach dem von Uitzetter (Ref. 33) beschriebenen Immunisationsschema gezogen.Specific antibodies to purified PGI and PG II are raised in male New Zealand white rabbits following the immunization schedule described by Uitzetter (ref. 33).
Wie unten ausgeführt wird, wird zwischen den beiden Antiseren und den fünf gereinigten Polygalacturonasen Kreuzreaktivität beobachtet. Auf ein 10%iges SDS-Polyacrylamidgel werden 0,4 bis '\fi\ig gereinigtes Protein gegeben und nach der Elektrophorese von dem Gel auf eine Nitrocellulosemembran unter Anwendung der von Bowen u.a. (Ref. 37) beschriebenen Methode übertragen. Die Inkubation des Nitrocellulose-Blots mit den spezifischen Antiseren, gefolgt vom Färben mit peroxidasemarkiertem Ziegen-Antikaninchen-lgG, wird nach Uitzetter ausgeführt (Ref. 36). Nach der Inkubation mit dem PG !-spezifischen Antiserum wird ein starkes Signal für PGI und die PG III A, III B und IV festgestellt. PG Il ergibt bei diesem Antikörper ein etwas schwächeres Signal. Die Inkubation des Blots mit PG ll-spezifischem Antiserum ergibt eine Hochintensitätsbande für PGII, für die anderen vier Polygalacturonasen aber nur schwache Banden.As noted below, cross-reactivity is observed between the two antisera and the five purified polygalacturonases. Loaded onto a 10% SDS-polyacrylamide gel to 0.4 to '\ fi \ given ig purified protein and transfer method described by electrophoresis from the gel to a nitrocellulose membrane using inter alia by Bowen (Ref. 37). Incubation of the nitrocellulose blot with the specific antisera followed by staining with peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG is performed according to Uitzetter (Ref 36). After incubation with PG! -Specific antiserum, a strong signal for PGI and PG III A, III B and IV is detected. PG II gives a slightly weaker signal to this antibody. Incubation of the blot with PG II specific antiserum gives one high intensity band for PGII, but only weak bands for the other four polygalacturonases.
Beispiel 1.3: Bestimmung der Aminosäuresequenz von Cyanogenfragmenten der Polygalacturonase Il Etwa 100pg der PG Il werden in 150μΙ 70%iger Ameisensäure aufgelöst, und ein festen Cyanogenbromid wird in einem einhundertfachen Molüberschuß Methionin zugesetzt (wovon 4 Reste je Enzymmolekül auftreten). Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur in einer verschlossenen Reaktionsphiole 24 Stunden lang ständig gerührt. Nach 24 Stunden wird WasserExample 1.3: Determination of the Amino Acid Sequence of Cyanogen Fragments of Polygalacturonase II About 100 μg of PG II are dissolved in 150 μM of 70% formic acid and a solid cyanogen bromide is added in a one hundred fold molar excess of methionine (of which 4 residues per enzyme molecule occur). The reaction mixture is stirred constantly at room temperature in a sealed reaction vial for 24 hours. After 24 hours is water
zugesetzt, und das Präparat wird durch Spülen mit N2 getrocknet. Dieser Schritt wird zur Entfernung der Ameisensäure wiederholt.added and the preparation is dried by rinsing with N 2 . This step is repeated to remove the formic acid.
Nach der Elektrophorese auf 15%igon SDS-Polacrylamidge!en können etwa 10 einzelne Banden durch Coomassie-Brilliantblau gefärbt werden. Sie stellen unvollständig und vollständig gespaltene Fragmente dar. Neben dem intakten Protein, ι. as eine Molekülmasse von 38kDa hat, werden die folgenden Banden beobachtet: 33,30,27,19,17,12,10,7,5,6 und 6kDa. Durch Probenahme in regelmäßigen Abständen während der 24stündigen Reaktionsperiode und durch deren Analyse durch SDS-Polyacrylamidgelslektrophorese wurden die Reihenfolge, in welcher die partiellen und abschließenden Reaktionsprodukte auftreten, sowie deren Position zueinander bestimmt. Das 17 kDa-Fragment ist ein Innenfragment, während das 5 kDa-Fragment sich entweder am C- oder N-Ende befindet. Die Fragmente der 24-Stunden-Behandlung werden dann auf Immobilon-P geblottet, eine Polyvinylidendifluoridmembran (Millipore), nach dem von Matsudaira u.a. (Ref.4) beschriebenen Verfahren. Drei Fragmente werden für die Gasphasensequenzierung verwendet, ein 17 kDa-Fragment und zwei kleinere Fragmente (5 und 6kDa). Aminosäuresequenzen werden mit einem Proteinsequenator der Applied Biosystems, Modell 470A, bestimmt, welcher direkt mit einem Analysator von Applied Biosystems, Modell 120A PTH, verbunden war. Membranfragmente, die 0,5-1 nMol eines bestimmten Peptids enthalten, werden gewaschen, auf den Gasphasensequenator gegeben und nach dem von Amons beschriebenen Programm der Sequenzanalyse unterzogen (Ref. 5)After electrophoresis on 15% SDS polacrylamide, about 10 single bands can be stained by Coomassie Brilliant Blue. They represent incomplete and completely cleaved fragments. In addition to the intact protein, ι. As has a molecular mass of 38 kDa, the following bands are observed: 33,30,27,19,17,12,10,7,5,6 and 6kDa. Sampling at regular intervals during the 24-hour reaction period and analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis determined the order in which the partial and final reaction products occur and their position relative to each other. The 17 kDa fragment is an internal fragment while the 5 kDa fragment is located either at the C- or N-terminus. The fragments of the 24 hour treatment are then blotted onto Immobilon-P, a polyvinylidene difluoride membrane (Millipore), prepared according to the procedure described by Matsudaira et al. (Ref. 4). Three fragments are used for gas-phase sequencing, one 17 kDa fragment and two smaller fragments (5 and 6 kDa). Amino acid sequences are determined with an Applied Biosystems Protein Sequenator, Model 470A, which was directly connected to an Applied Biosystems Model 120A PTH analyzer. Membrane fragments containing 0.5-1 nmoles of a particular peptide are washed, placed on the gas phase sequenator, and subjected to sequence analysis according to the program described by Amons (ref. 5).
Für das 5kDa-Fragment wird folgende Sequenz ermittelt: The following sequence is determined for the 5kDa fragment:
Position: 1 5Position: 1 5
Aminosäure: asp-ser-X-thr-phe-thr-thr-ala-Position: 10 12 13Amino acid: Asp-ser-X-thr-phe-thr-thr-ala-position: 10 12 13
In Position 3 (X) wird keine Aminosäure festgestellt. Da das angewendete Sequenzierungsprogramm Cysteinreste nur entdeckt, wenn das Protein vorher S-pyridylethyliert wird, ist es wahrscheinlich, daß die Position 3 ein Cystein sein kann (Amons, Ref. 5). In den Positionen 12 und 13 werden Spuren von ala gefunden, wie durch die Klammern angegeben wird. Während sich die Spur in Position 12 eindeutig aus einer unvollständigen Reaktion in dem vorangegangenen Schritt ergibt, stellt das niedrige Signal von ala in der Position 13 die Aminosäure ala in der Position 13 des Peptids dar.In position 3 (X) no amino acid is detected. Since the applied sequencing program only discovers cysteine residues when the protein is previously S-pyridylethylated, position 3 is likely to be a cysteine (Amons, ref. 5). In positions 12 and 13, traces of ala are found, as indicated by the parentheses. While the trace at position 12 clearly results from an incomplete reaction in the previous step, the low signal of ala at position 13 represents the amino acid ala at position 13 of the peptide.
Position: 1 5Position: 1 5
Aminosäure: ala-phe-ser-val-gln-ala-asn-Position: 10Amino acid: ala-phe-ser-val-gln-ala-asn-position: 10
Die Spuren von Isoleucin und Threonin, die in den beiden letzten Schritten beobachtet und durch Klammern angegeben werden, c. lultieren eindeutig aus UM.oilständigen Reaktionen in uen vorausgegangenen Schritten.The traces of isoleucine and threonine observed in the last two steps and indicated by parentheses, c. clearly indicate that the reactions have reacted in previous steps.
Beispiel 1.4: Bestimmung der Aminosäuresequenz des N-terminalen Teils von Polygalacturonase I Es werden 100 \ig von PGI, die nach Beispiel 1.1.1 gereinigt worden war, dreimal anhand von 11 Millipore-gefiltertem Wasser dialysiert und lyphilisiert. Die Aminosäuresequenz wird wie im Beispiel 1.3 bestimmt. Für das Enzym wurde folgende N-terminale Aminosäuresequenz bestimmt:EXAMPLE 1.4 Determination of the Amino Acid Sequence of the N-Terminal Part of Polygalacturonase I 100 μl of PGI, which had been purified according to Example 1.1.1, were dialysed three times on 11 millipore-filtered water and lyophilized. The amino acid sequence is determined as in Example 1.3. For the enzyme, the following N-terminal amino acid sequence was determined:
Position: 1 5Position: 1 5
Aminoisäure: ala-ser-thr-X-thr-phe-thr-Position: SAmino acid: ala-ser-thr-X-thr-phe-thr-position: S
Die Cysteinreste im Protein wurden nicht modifiziert und werden folglich nicht entdeckt. Es ist wahrscheinlich, daß Cystein in Position 4 (X) der Sequenz vorhanden ist. Die N-terminale Aminosäuresequenz von PGI weist Homologie mit der Aminosäuresequenz des 5 kDa-Cyanogenbromidfragments von PG Il auf, das aus Rapidase isoliert wurde (Beispiel 1.3), und mit der N-terminalen Aminosäuresequenz von PGII, die aus dem A. niger-Transformanten N 593/pGW 1800-27 (Beispiel 6.3) isoliert wurde. Diese Homologie wird im folgenden Schema unterstrichen, in welchem angenommen wird, daß Cystein in der Position 4 und 3 von PGI- bzw. PG Il-Sequenzen auftritt:The cysteine residues in the protein have not been modified and thus are not detected. It is likely that cysteine is present in position 4 (X) of the sequence. The N-terminal amino acid sequence of PGI has homology with the amino acid sequence of the 5 kDa cyanogen bromide fragment of PG II isolated from rapidase (Example 1.3) and with the N-terminal amino acid sequence of PGII derived from the A. niger transformant N 593 / pGW 1800-27 (Example 6.3) was isolated. This homology is underlined in the following scheme where it is assumed that cysteine occurs at positions 4 and 3 of PGI and PG II sequences, respectively:
von Polygalacturonase Il wird eingeführt, um die beiden Sequenzen auszurichten.of polygalacturonase II is introduced to align the two sequences.
vorhanden, dafür ist im letzteren Fall eine ähnliche Aminosäure, d. h., eine kleine Hydroxylaminosäure f ι hreonin), vorhanden.present, but in the latter case, a similar amino acid, d. h., A small hydroxyl amino acid f ι hreonine), present.
beispielsweise einer partiellen proteolytischen Spaltung, sein können. Es wird geschlußfolgert, daß PGI und PG Il durchverschiedene Gene derselben Familie codiert werden.for example, a partial proteolytic cleavage. It is concluded that PGI and PG II are encoded by different genes of the same family.
Beispiel 1.5: Bestimmung der Aminosäuresequenz von Cyanogenbromldfragmenten von Polygalacturonase I Etwa 100Mg PGI werden in 150μΙ 70%iger Ameisensäure aufgelöst, und es wird festes Cyanogenbromid zugesetzt, um Fragmente i'es Proteins herzustellen, wie das im Beispiel 1.3 beschrieben wurde. Je Enzymmolekül sind 4 Methioninreste vorhanden, κ' cn der Elektrophorese auf 15%igen SDS-Polyacrylamidgelen und dem Färben mit Coomassie-BrilliantblauExample 1.5: Determination of Amino Acid Sequence of Cyanogen Bromide Fragments of Polygalacturonase I Approximately 100 μg of PGI are dissolved in 150 μl of 70% formic acid and solid cyanogen bromide is added to produce fragments of the protein as described in Example 1.3. There are 4 methionine residues per enzyme molecule, κ 'cn electrophoresed on 15% SDS-polyacrylamide gels and stained with Coomassie brilliant blue
werden größere Banden mit einer Molekülmasse von 39,5 35,21,19,5 und 5,5kDa beobachtet.Larger bands are observed with a molecular mass of 39.5 35.21, 19.5 and 5.5 kDa.
Die Fragmente zu 21 und zu 5,5 kDa werden unter Anwendung derselben Ausrüstungen und Verfahren wie im Beispiel 1.3 sequenziert.The 21 and 5.5 kDa fragments are sequenced using the same equipment and procedures as in Example 1.3.
Die Sequenz für das 21 kDa-Fragment lautet:The sequence for the 21 kDa fragment is:
Position: 1Position 1
Aminosäure: ala-ser-thr-X-thr-phe-thr-. Position: 10Amino acid: ala-ser-thr-X-thr-phe-thr-. Position: 10
Aminosäure: ser-ala-sur-gluAmino acid: ser-ala-sur-glu
Es ist wahrscheinlich, daß Cystein in der Position 4 (X) der Sequenz auftritt, ähnlich, wie das in den Beispielen 1.3 und 1.4 ,, beschrieben wurde. Die Sequenz des 21 kDa-Fiagmentes ist identisch mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des intakten PG I-Proteins, die im Beispiel 1.4 beschrieben wurde.It is likely that cysteine occurs at position 4 (X) of the sequence, similar to that described in Examples 1.3 and 1.4. The sequence of the 21 kDa fibragion is identical to the N-terminal amino acid sequence of the intact PG I protein described in Example 1.4.
Das 5,5kDa-Fragment hat folgende Sequenz:The 5.5kDa fragment has the following sequence:
Position: 1 5Position: 1 5
Aminosäure: ala-asp-gly-ala-val-ile-asp-Position: 10Amino acid: ala-asp-gly-ala-val-ile-asp-position: 10
·< Aminosäure: gly-asp-gly-ser · <Amino acid: gly-asp-gly-ser
Es wird-geschlußfolgert, daß das 5,5kDa-Fragment nicht mit dem N-Ende des Proteins übereinstimmt. Grundlage dafür sind die Sequenzdaten.It is concluded that the 5.5 kDa fragment does not match the N-terminus of the protein. The basis for this is the sequence data.
Beispiel 1.6: Bestimmung der Aminosäuresequenz von einem tryptlschen Peptid PG Il wird durch Dialyse anhand von 0,5%iger Ameisensäure partiell denaturiert und anschließend gefriergetrocknet. Das Enzym (1 mg) wird in 1 ml einer 0,2 M N-Ethylmorpholinacetatpufferlösung, pH-Wert 8,0, suspendiert und dann bei 37"C mit Trypsin (Sigma) inkubiert, das in einem Molverhältnis von 1:50, bezogen auf PGII, zugesetzt wird. Nach 24 Stunden wird das Digerieren durch den Zusatz von Essigsäure (abschließende Konzentration 30%) gestoppt. Das Digerierte wird gefriergetrocknet. Proben des Digerierten werden in 0,1%iger Trifluoressigsäure aufgelöst.die 2,5mM Dithiothreitol enthält, und bei 370C wenigstens eine Stunde gehalten. Unter Anwendung eines Gerätes Spectra Physics SP 8000 HPLC, ausgestattet mit einer Nuclcosil C-18-Säule (4,6mm x 150mm) (Supelco) und einer Vydac-Vorsäule (Chrompack), werden trypische Peptide (Proben zu 100μΙ, die 100-200 μρ Protein enthalten) getrennt. Bei einer Säulentemperatur von 25°C, einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/min wird ein linearer Gradient angewei, Jet, der sich in 50min von 100% Lösungsmittel A (0,1 % TFA in Wasser) auf 50% Lösungsmittel A + 50% Lösungsmittel B (0,1 TFA in Acetnitril) ändert. Peptide werden durch UV-Absorption bei 214 nm festgestellt. Eines der Peptide, das spät während des Digerierens freigesetzt wird, scheint von den anderen Spitzen im Chromatogramm bei etwa 21 % Acetnitrli gut abgesetzt zu sein. Dieses Peptid wird durch Spülen mit trockener Luft bei 250C getrocknet und sequenziert. Die Aminosäuresequenz wird nach dem im Beispiel 1 4 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Sequen ί labtet:EXAMPLE 1.6 Determination of the Amino Acid Sequence of a Tryptical Peptide PG II is partially denatured by dialysis using 0.5% formic acid and then freeze-dried. The enzyme (1 mg) is suspended in 1 ml of a 0.2 M N-ethylmorpholine acetate buffer solution, pH 8.0, and then incubated at 37 ° C. with trypsin (Sigma), which is in a molar ratio of 1:50 After 24 hours, digestion is stopped by the addition of acetic acid (final concentration 30%), the digested is freeze-dried, and samples of the digested are dissolved in 0.1% trifluoroacetic acid containing 2.5 mM dithiothreitol. and maintained at 37 0 C for at least one hour. using a device Spectra Physics SP 8000 HPLC equipped with a Nuclcosil C-18 column (4.6 mm x 150 mm) (Supelco) and a Vydac guard column (Chrompack) are trypische Peptides (100μΙ samples containing 100-200 μρ protein) are separated at a column temperature of 25 ° C, a flow rate of 2 ml / min, indicating a linear gradient of the jet, which in 50 min of 100% solvent A (0 , 1% TFA in water) to 50% sol A + 50% solvent B (0.1 TFA in acetonitrile) changes. Peptides are detected by UV absorption at 214 nm. One of the peptides released late during digestion appears well off the other peaks in the chromatogram at about 21% acetonitrile. This peptide is dried by rinsing with dry air at 25 0 C and sequenced. The amino acid sequence is determined by the method described in Example 1 4. The Sequen ί refreshes:
Position: 1 5Position: 1 5
Aminosäure: thr-ile-ser-gly-ala-thr-gly-Position: 10 14Amino acid: Thr-ile-ser-gly-ala-thr-gly-position: 10 14
Aminosäure: ser-val-ser-glu-ile-thr-tyrAmino acid: ser-val-ser-glu-ile-thr-tyr
Beispiel 2.1: Isolierung von hochmolekulargewichtiger DNA aus A. nlger N 400 Konidiosporen von dem Asperglllus niger-Stamm N 400 werden mit einfer abschließenden Sporendichte von 10e Sporen/ml in 200ml Minimalmedium inokuliert und in I-I-Erlenmeyerkolben 24 Stunden lang bei 28°C mit 300 U/min unter Verwendung eines Drehrüttlers von New Brunswick geschüttelt. Das Mycel wird durch Filtern mit einem Büchner-Trichter mit Myracloth geerntet, mit kalter, steriler Salzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff gefroren und entweder bei -600C gelagert oder direkt verwendet. Die Methode, die zur Isolierung der DNA für die Herstellung der Genombank angewendet wird, basiert auf dem von Yelton u.a. (Ref. 18) beschriebenen Verfahren.Example 2.1: Isolation of high molecular weight DNA from A. niger N 400 conidiospores from the Asperglllus niger strain N 400 are inoculated with a final spore density of 10 e spores / ml in 200 ml minimal medium and in II conical flasks for 24 hours at 28 ° C Shaken at 300 rpm using a rotary shaker from New Brunswick. The mycelium is harvested by filtration with a Buchner funnel with Myracloth, washed with cold sterile saline, frozen in liquid nitrogen and either stored at -60 0 C or used directly. The method used to isolate DNA for genomic library production is based on the method described by Yelton et al. (Ref. 18).
Für den Aufbau der Bank werden 10g Mycel in flüssigem Stickstoff in Portionen zu 1 g in einem Braun-Mikrodismembrator gemahlen. Das gemahlene Mycel wird auf einen sterilen I-I-Erlenmeyerkolben übertragen, der 200ml Extraktionspuffer (5OmM EDTA, pH-Wert 8,5,0,2% SDS) und 200 μΙ Diethylpyrocarbonat enthält. Das Gemisch wird langsam auf Zimmertemperatur erwärmt und dann für die Dauer von 20min unter gelegentlichem Schütteln bei 680C erhitzt. Die Suspension wird auf Zimmertemperatur abgekühlt und 15min bei 12000 χ g zentrifugiert. Dem Überstand wird ein Volumen von Vie einer 8M Kaliumacetatlösung, pH-Wert 4,2, zugesetzt, und man läßt das Gemisch eine Stunde lang auf Eis. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (20 min; 16000 χ g; 40C) entfernt. Die Nucleinsäuren werden aus dem Überstand durch Inkubation mit einem 0,6-Volumen von Isopropanol auf Eis für die Dauer von 15min ausgefällt. Die ausgefällte Nucleinsäure wird durch Zentrifugieren (10min; 6000 x g; 40C) aufgefangen, mit70%igem Ethanol gewaschen und kurz getrocknet. Das Pellet wird in 10ml TE, das 20μς/ιηΙ Rnase A (Boehringer, Mannheim) enthält, suspendiert und für die Dauer von 15min bei 370C inkubiert. Die DNA wird mit nucleasefreier Pronase (Konzentration abschließend 1 mg/ml) behandelt (Hochlight, Coinbrock), für die Dauer von einer Stunde bei 370C. Die Pronase-Vorratslösung in TE-Puffer enthält 20 mg/ml E-nzym, das bei 370C für eine Stunde vorinkubiert ist, um Nucleasen zu digerieren.For the construction of the bank, 10 g mycelium in liquid nitrogen are ground in 1 g portions in a brown microdismembrator. The ground mycelium is transferred to a sterile II-Erlenmeyer flask containing 200 ml extraction buffer (50 mM EDTA, pH 8.5, 2% SDS) and 200 μM diethylpyrocarbonate. The mixture is slowly warmed to room temperature and then heated at 68 ° C. for 20 minutes with occasional shaking. The suspension is cooled to room temperature and centrifuged for 15 min at 12000 g. To the supernatant is added a volume of Vie of an 8M potassium acetate solution, pH 4.2, and the mixture is left on ice for one hour. The precipitate is removed by centrifugation (20 min, 16,000 g, 4 ° C.). The nucleic acids are precipitated from the supernatant by incubation with a 0.6 volume of isopropanol on ice for 15 min. The precipitated nucleic acid is collected by centrifugation (10 min; 6,000 xg; 4 0 C) collected, washed with 70% ethanol and dried briefly. The pellet is suspended in 10 ml TE containing 20μς / ιηΙ RNase A (Boehringer, Mannheim) and incubated for a period of 15 min at 37 0 C. The DNA is with nucleasefreier Pronase (concentration final 1 mg / ml) (High Light, Coinbrock), for a period of one hour at 37 0 C. The pronase stock solution in TE buffer contains 20 mg / ml E-NZYM, the is pre-incubated at 37 0 C for one hour to digest nucleases.
In 9ml der so gewonnenen DNA-Lösung werden 8,5g CsCI aufgelöst, es werden 0,2 ml 10 mg/ml Ethidiumbromid zugesetzt, und diese Lösung wird entweder für die Dauer von 60 Stunden bei 33000 U/min in einem Beckman-SW41 -Rotor oder für die Dauer8.5 ml of CsCl are dissolved in 9 ml of the DNA solution thus obtained, 0.2 ml of 10 mg / ml ethidium bromide are added, and this solution is applied either for a period of 60 hours at 33,000 rpm in a Beckman SW41. Rotor or for the duration
von 40 Stunden bei 45000U/min in einem Beckman-50-Ti-Rotor zentrifugiert. Die DNA-Bande wird aufgefangen, und das Ethidiumbromid wird durch Mehrfachextraktion mit Isopropanol, das mit einer gesättigten Lösung von NaCI in Wasser äquilibriert worden war, entfernt. Es werden 5 Volumen TE zugesetzt, und die DNA-Lösung wird nacheinander mit TE-gesättigtem Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1 und Chloroform/Isoamylalkohol 24:1 behandelt. Die DNA wird durch den Zusatz von 0,1 Volumen 3 M Natriumacetatlösung, pH-Wert 5,2,2,5 Volumen Ethanol und eine Inkubation bei -20°C über Nacht ausgefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren (1 Stunde, 30000 χ g, 4°C) aufgefangen, mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 400 μΙ TE aufgelöst.centrifuged for 40 hours at 45,000 rpm in a Beckman 50 Ti rotor. The DNA band is collected and the ethidium bromide is removed by multiple extraction with isopropanol equilibrated with a saturated solution of NaCl in water. 5 volumes of TE are added and the DNA solution is treated sequentially with TE-saturated phenol, phenol / chloroform / isoamyl alcohol 25: 24: 1 and chloroform / isoamyl alcohol 24: 1. The DNA is precipitated by the addition of 0.1 volume 3 M sodium acetate solution, pH 5.2.2.5 volume ethanol and incubation at -20 ° C overnight. The precipitate is collected by centrifugation (1 hour, 30,000 g, 4 ° C), washed with 70% ethanol, dried and dissolved in 400 μΙ TE.
Beispiel 2,2: Partielles Digerieren von A. nlger-N400-DNA mit Mbol und Isolierung der Fragmente Um die Mbol-Konzentration zu bestimmen, welche die größte Menge an DNA-Fragmenten zwischen 13,6 und 23kbp ergibt, werden Portionen zu 1 \ig von A. nigor-N 400-DNA in dem angemessenen Puffer, der vom Lieferer empfohlen wird, mit abnehmenden Mengen von Mbol (0,5 bis 0,001 Einheiten) für die Dauer von einer Stunde bei 37°C in einem Volumen von 10μΙ digeriert. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 1 μΙ 0,25 M EDTAgestoppt, und die Proben werden auf ein 0,6%iges Agarosegel in TBE-Puffer, das 1 Mg/ml Ethidiumbromid enthält, übertragen. Angemessene Größenmarker sind ein Gemisch aus Lambda-DNA und Lambda-DNA, digeriert mit BgI III, was Banden von 49,22,8,13,6,9,8,2,3kbp und ein nichtsichtbares Fragment von 0,45kbp ergibt. Die erforderliche Mbol-Konzentration, um einen hohen Ertrag der gewünschten Fragmente von 13,6-23 kbp zu erreichen, beträgt etwa 0,02 Einheiten^g DNA. Demzufolge werden 200Mg der DNA in einem Gesamtvolumen von 2 ml digeriert und in 20 gleiche Aliquote unmittelbar nach dem Zusatz des Enzyms geteilt. Nach einer Stunde bei 370C wird das Digerierte jeweils auf Eis gegeben. Nachdem eine Ι-μΙ-Probe durch den Durchlauf auf einem Gel auf richtiges Digerieren geprüft worden war, wird EDTA bis zu einer Endkonzentration von 25mM zugesetzt, das Enzym wird durch eine Behandlung bei 650C für die Dauer von 10 min wärmeinaktiviert, die Proben werden zusammengefaßt, und die DNA wird ausgefällt, gewaschen, getrocknet und in 400μΙ TE aufgelöst.Example 2.2 Partial Digestion of A. nlger N400 DNA with Mbol and Isolation of the Fragments To determine the Mbol concentration which gives the largest amount of DNA fragments between 13.6 and 23kbp, portions become 1 \ ig with decreasing amounts of MboI (0.5 to 0.001 unit) digested by A. Nigor N-400 DNA in the appropriate buffer recommended by the supplier, for a period of one hour at 37 ° C in a volume of 10μΙ , The reaction is stopped by the addition of 1 μM 0.25 M EDTA and the samples are transferred to a 0.6% agarose gel in TBE buffer containing 1 μg / ml ethidium bromide. Appropriate size markers are a mixture of lambda DNA and lambda DNA digested with Bgl I, giving bands of 49,22,8,13,6,9,8,2,3kbp and a non-visible fragment of 0,45kbp. The required Mbol concentration to achieve a high yield of the desired fragments of 13.6-23 kbp is about 0.02 units of DNA. Thus, 200 μg of the DNA is digested in a total volume of 2 ml and divided into 20 equal aliquots immediately after addition of the enzyme. After one hour at 37 0 C, the digested is each placed on ice. After a Ι-μΙ sample had been tested by the passage on a gel for proper digestion, EDTA is added to a final concentration of 25 mM was added, the enzyme is heat-inactivated by treatment at 65 0 C for a period of 10 min, the samples are pooled and the DNA is precipitated, washed, dried and dissolved in 400μΙ TE.
Die fragmentierte DNA wird auf einem 0,4%igen präparation Agarosegel (Mittelvertiefung 120 mm χ 1,5 mm) getrennt. Lambda-DNA, die mit BgIII digeriert wurde, wird als Marker verwendet, um die Größe der partiell digerierten DNA-Fragmente nach Elektrophorese bei 4°C und 40V (3 V/cm) zu bestimmen. Der Gelbereich, welcher Fragmente in der korrekten Größe enthält, wird aus dem Gel herausgeschnitten, und die DNA wird aus dem Gel in einem sterilen Dialyserohr in 2ml TBE bei 100V über die Dauer von 2 bis 3 Stunden elektroeluiert. Der Strom wird für die Dauer von 30s umgekehrt, und der Puffer, der die DNA enthält, wird aufgefangen. Anschließend werden die Fragmente durch Ethanolausfällung konzentriert und in 100μΙ TE aufgelöst.The fragmented DNA is separated on a 0.4% preparation agarose gel (center well 120 mm χ 1.5 mm). Lambda DNA digested with BglII is used as a marker to determine the size of the partially digested DNA fragments after electrophoresis at 4 ° C and 40V (3 V / cm). The gel region containing fragments of the correct size is excised from the gel and the DNA is electroeluted from the gel in a sterile dialysis tube in 2ml TBE at 100V for 2 to 3 hours. The current is reversed for a period of 30s and the buffer containing the DNA is collected. Subsequently, the fragments are concentrated by ethanol precipitation and dissolved in 100μΙ TE.
In EMBL4In EMBL4
von 100μΙ für die Dauer von 2 Stunden bei 370C vollständig digeriert. Das Enzym wird durch 10min bei 650C inaktiviert. Dieof 100μΙ for 2 hours at 37 0 C completely digested. The enzyme is inactivated by 10 min at 65 0 C. The
bei 370C anschließen. Nach dem Zusatz von EDTA auf 25mM und der Inaktivierung des Enzyms dOminütiges Erhitzen boi 65°C)wird die Lösung mit gleichen Volumen von Phenol (TE-gesättigt), Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1 und Chloroform/at 37 ° C. After addition of EDTA to 25 mM and inactivation of the enzyme dOminute heating boi 65 ° C), the solution is mixed with equal volumes of phenol (TE-saturated), phenol / chloroform / isoamylalcohol 25: 24: 1 and chloroform /
15 Minuten Zentrifugieren bei 12000 x g bei 4°C wird der Niederschlag gründlich mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknetund in 40μΙ TE aufgelöst.Centrifuge at 12000 x g for 15 minutes at 4 ° C, wash the precipitate thoroughly with 70% ethanol, dry and dissolve in 40μΙ TE.
Es ist wesentlich, daß die cos-Orte nach dem Beispiel 2,3 hergestellten Vektors vor der Ligationsreaktion hybridisiert werden. Der Vektor in 10OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5, und 1OmM MgCI2 wird 10min bei 650C erhitzt und dann eine Stunde lang bei 420C hybridisiert. Aus Versuchsligationen wird ermittelt, daß ein Verhältnis von Vektor zu Fragment von annähernd 1:1 (Gewichtsgrundlage) die meisten Rekombinanten ergibt. Die Ligation erfolgte in 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmM MgCI2, 1OmM DTTund 1mM ATP unterVerwendung von 9,5pg Vektor und 10μg DNA-Fragmente in einem Gesamtvolumen von 100μΙ. DNA-Ligase (BRL) wird bei einer Konzentration von 0,5 Einheiten^g DNAzugesetzt, und das Ligationsgemisch wird über Nacht bei 140C inkubiert. Um auf Ligation zu prüfen, wird eine Probe der ligierten DNA auf ein Agarosegel gegeben. Außerdem wird zur Kontrolle eine Vektormenge von 0,5Mg ohne den Zusatz der Fragmente in einem ö-pl-Volumen ligiert. Das große Volumenligationsgemisch wird durch Ethanolausfällung konzentriert und in 20 μΙ TE vor der In-vitro-Verpackung aufgelöst. Die In-vitro-Verpackung erfolgt mit Promega-Packagene-Extrakten nach den Instruktionen des Herstellers unter Verwendung von ΙΟ-μΙ-Portionen zur Verpackung von 1 μg DNA. Als Kontrolle wird gesondert 1 μΙ des hochmolekulargewichtigen Kontrollphagen Lambda el 857 Sam 7, der mit den Extrakten geliefert wird, gesondert verpackt. Nach dem Verpacken werden 500 μΙ des Phagenlösungspuffers (PSB) und 5 μΙ Chloroform zugesetzt. Die rekombinanten Phagenvorräte können bei 40C gelagert werden. Die gewonnene Bank wird aus zwei getrennten Ligationsexperimenten konstruiert.It is essential that the cos sites are hybridized to the vector prepared according to Example 2.3 prior to the ligation reaction. The vector in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, and 10 mM MgCl 2 is heated for 10 min at 65 0 C and then hybridized at 42 0 C for one hour. From experimental ligations, it is determined that a ratio of vector to fragment of approximately 1: 1 (weight basis) yields most recombinants. Ligation was carried out in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5.1 mM MgCl 2 , 10 mM DTT and 1 mM ATP using 9.5 μg vector and 10 μg DNA fragments in a total volume of 100 μM. DNA ligase (BRL) was incubated at a concentration of 0.5 units ^ g DNAzugesetzt, and the ligation mixture overnight at 14 0 C. To test for ligation, a sample of the ligated DNA is placed on an agarose gel. In addition, as a control, a vector amount of 0.5 μg is ligated without the addition of the fragments in an δ-pl volume. The large volume ligation mixture is concentrated by ethanol precipitation and dissolved in 20 μΙ TE prior to in vitro packaging. In vitro packaging is carried out with Promega Packagene extracts according to the manufacturer's instructions using ΙΟ-μΙ portions to package 1 μg of DNA. As a control, separately 1 μΙ of the high molecular weight control phage Lambda el 857 Sam 7, which is supplied with the extracts, packed separately. After packaging, 500 μΙ of the phage solution buffer (PSB) and 5 μΙ of chloroform are added. The recombinant phage stocks can be stored at 4 0 C. The recovered library is constructed from two separate ligation experiments.
Zellen von E. coll NM 539 werden auf einem LB-Medium gezogen, das 0,2% Maltose, 1OmM MgSO4 und 1 mM CaCI2 enthält, bis zu einer optischen Dichte (600 nm) von 1,0. Zu 0,1 ml einer geeigneten Phagenverdünnung in PSB werden Aliquote dieser Kultur zu 0,2ml gegeben. Nach der Adsorption der Phagen für die Dauer von 20 Minuten bei 370C werden 3ml 0,6%iges LB-Top-Agar mit einer Temperatur von 45°C zugegeben, das Gemisch wird auf LB-Agar-Platten plattiert, und diese werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Anzahl der plaquebildenden Einheiten (pfu)je ml Phasensuspension beträgt 12 χ 105 und 4,2 x 106pfu/ml bei den beiden nach Beispiel 1.4 hergestellten Phagenvorräten. Nachdem der Hintergrund subtrahiert wurde, welcher aus den Kontrolligationen ohne Fragmente berechnet wurde (17% bzw. 40%), beträgt die absolute Zahl der Rekombinanten 6 χ 106. Die in den Rekombinanten enthaltene DNA ist mehr als 200 Genomen von Aspergillus niger gleichwertig.Cells of E. coll NM 539 are grown on an LB medium containing 0.2% maltose, 10 mM MgSO 4 and 1 mM CaCl 2 to an optical density (600 nm) of 1.0. To 0.1 ml of appropriate phage dilution in PSB, aliquots of this culture are added to 0.2 ml. After adsorption of the phages for 20 minutes at 37 0 C 3 mL 0.6% sodium LB top agar are added at a temperature of 45 ° C, the mixture is plated on LB agar plates, and these incubated overnight at 37 ° C. The number of plaque-forming units (pfu) per ml of phase suspension is 12 χ 10 5 and 4.2 x 10 6 pfu / ml in the two prepared according to Example 1.4 phage stocks. After subtracting the background calculated from controls without fragments (17% and 40%, respectively), the absolute number of recombinants is 6 χ 10 6 . The DNA contained in the recombinants is equivalent to more than 200 genomes of Aspergillus niger.
Um eine Bankzu verstärken, werden βΟμΙ-Aliquote der beiden Phagenvorräte zur Infektion von E. coll-NM 539-Zellen verwendet, die in LB-Top-Agarose auf LB-Agarplatten plattiert und dann über Nacht bei 37°C inkubiert werden. Die Phagen werden aus der Agarose durch sanftes Schütteln der Platten mit 5ml PSB je Platte für die Dauer von einer Stunde bei Zimmertemperatur eluiert. Der PSB wird aufgefangen, zentrifugiert (10min bei 6000 χ g), um die Bakterien zu entfernen, und es wird Chloroform (0,5% Endkonzentration) zugesetzt. Beide Phagenvorräte, die etwa im gleichen Umfang verstärkt werden, werden dann gemischt (40ml Vorrat), titriert (8 χ 109pfu/ml) und bei 40C aufbewahrt.To amplify a library, βΟμΙ aliquots of the two phage stocks are used to infect E. coli NM 539 cells which are plated in LB agarose on LB agar plates and then incubated overnight at 37 ° C. The phages are eluted from the agarose by gently shaking the plates with 5ml PSB per plate for one hour at room temperature. The PSB is collected, centrifuged (10 min at 6000 g) to remove the bacteria and chloroform (0.5% final concentration) added. Both phage stocks, which are amplified approximately to the same extent, are then mixed (40 ml stock), titrated (8 χ 10 9 pfu / ml) and stored at 4 0C.
Beispiel 3.1: Synthese von Ollgonuclaotidgemlschen mit der Codierung für das 17kDa-Cvanogenbrom!dfragment von Polygalacturonase IlExample 3.1: Synthesis of ollgonuclotide mixtures with the coding for the 17 kDa cyanogen bromide d fragment of polygalacturonase II
Die Oligonucleotide zum Prüfen der Genombank von Aspergillus nlger, die nach Beispiel 2 hergertellt wurden, werden unter Anwendung der Phosphoramiditmethode (M. H. Caruthers, Ref. 8) mit einem Oligonucleotidsynthesizer von Applied Biosystems (Modell 280B) synthetisiert. Das *7 kDA-Cyanogenbromidfragment, das im Beispiel 1.2 beschrieben wurde, ist ein innen befindliches Peptid. Daher kann die im Beispiel 1.4 bestimmte Aminosäuresequenz an N-Ende mit einem Methioninrest erweitert werden. Die synthetisierten Oligonucleotide sind komplexe Gemische, da die Degeneration des genetischen Codes berücksichtigt wird. Aus technischen Gründen ist es notwendig, die Anzahl der Nucleotide im Gemisch zu verringern. Um die Oligonucleotide mit der falschen Kombination TG und AC an der Position 10 und 11 auszuschließen und um die Größe des Gemischs zu begrenzen, werden zwei getrennte Gemische von Oligonucleotiden, die der Sequenz im Codierungsstrang entsprechen, unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes synthetisiert. Die Anzahl der erforderlichen Oligonucleotide wird außerdem durch Einführung von Inosin als Taumetbasis an vier verschiedenen Positionen der synthetisierton 29-mere verringert, und so besteht jedes Gemisch aus 16 verschiedenen Oligonucieotiden (Ohtsuka u.a., Ref. 16). Die beiden Gemische, die als HR6195 und HR 6196 bezeichnet werden, stellen DNA dar, welche die folgende Aminosäuresequenz codiert und folgende Zusammensetzung hat:The oligonucleotides for testing Aspergillus niger genomic library prepared according to Example 2 are synthesized using the phosphoramidite method (M.H. Caruthers, ref. 8) with an Applied Biosystems oligonucleotide synthesizer (model 280B). The * 7 kDa cyanogen bromide fragment described in Example 1.2 is an internal peptide. Therefore, the amino acid sequence determined in Example 1.4 can be extended at the N-end with a methionine residue. The synthesized oligonucleotides are complex mixtures because of the degeneracy of the genetic code. For technical reasons, it is necessary to reduce the number of nucleotides in the mixture. To exclude the oligonucleotides with the wrong combination TG and AC at positions 10 and 11 and to limit the size of the mixture, two separate mixtures of oligonucleotides corresponding to the sequence in the coding strand are synthesized, taking into account the degeneracy of the genetic code. The number of oligonucleotides required is also reduced by introducing inosine as the taumet base at four different positions on the synthesized 29-mer, and so each mixture consists of 16 different oligonucleotides (Ohtsuka et al., Ref. 16). The two mixtures, designated HR6195 and HR 6196, represent DNA which encodes the following amino acid sequence and has the following composition:
Aminosäuresequenz: met ala phe ser val gin alaAmino acid sequence: met ala phe ser val gin ala
HR6195: 5'(d) ATG GCI TTR, TCI GTI CAR2 GCIHR6195: 5 '(d) ATG GCI TTR, TCI GTI CAR 2 GCI
HR6190: 5'(d)ATG GCI TTR1 AGI GTI CAR2 GCIHR6190: 5 '(d) ATG GCI TTR 1 AGI GTI CAR 2 GCI
worin I Inosin ist, R1T oder C ist und R2 A oder G ist.wherein I is inosine, R 1 is T or C and R 2 is A or G.
Das ö^kDa-Cyanogenbromidfragment, das in Beispiel 1,5 beschrieben wurde, ist ein innen befindliches Peptid, das durch CNBr-Spaltung hergestellt wird. Seine Aminosäuresequenz kann daher am N-Ende mit einem Methioninrest erweitert werden.The δ kDa cyanogen bromide fragment described in Example 1.5 is an internal peptide produced by CNBr cleavage. Its amino acid sequence can therefore be extended at the N-end with a methionine residue.
Die Anzahl der erforderlichen Oligonucleotide wird durch Einführung von Inosin als Taumelbasis an fünf verschiedenen Stellen der 32-mere, die synthetisiert werden, verringert.The number of oligonucleotides required is reduced by introducing inosine as the tumbling base at five different sites on the 32-mer that are synthesized.
Dadurch wird das Gemisch auf 24 Oligonucleotide begrenzt. Das als HR6298 bezeichnete Gemisch stellt DNA dar, welche die folgende Aminosäuresequenz codiert und folgende Zusammensetzung hat:This limits the mixture to 24 oligonucleotides. The mixture designated HR6298 represents DNA which encodes the following amino acid sequence and has the following composition:
worin I Inosin ist, R, T oder C ist und R2 T, C oder A ist.wherein I is inosine, R, T or C and R 2 is T, C or A.
Beispiel 3.3: "P-Markierung von OligonucleotidenExample 3.3: "P-labeling of oligonucleotides
Die lyoph.lisierten Oligonukleotidgemische HR6195, MR6196 und HR6298 werden in Konzentrationen von 29μΜ in Wasser aufgelöst. Proben dieser Lösungen werden zur Herstellung des Reaktionsgemischs zehnfach verdünnt. Das Reaktionsgemisch ist zusammengesetzt aus entweder 20 pMol Oligonucleotidgemisch HR6195, zusammen mit 20 pmol HR6196, oder nur aus 4G pmol HR6298,L4 pmol [V-32P]-ATP(NEN,6000Ci/mmol) und30 EinheitenT4-Polynucleotidkinase(BRL) in 50μΙ Kinasepuffer, der aus 5OmM Trie HCI (pH-Wert 7,6), 1OmM MgCI2,5mM DTT, 0,1 mM EDTA und 0,1 mM Permidin besteht (Maniatis u. a., Ref. 6, S. 122). Die Inkubalion wird bei 37 0C für die Dauer von 30min ausgeführt. Die Reaktion wird durch den Zusatz von 4 μΙ 0,5 M EDTA (pH-Wert 8,0) beendet. Die Reaktionsgemische werden ohne Reinigung zum Prüfen der Genombank (Beispiel 3.4) oder Sondieren von Southern-Blots (Beispiel 3.6) verwundet.The lyophilized oligonucleotide mixtures HR6195, MR6196 and HR6298 are dissolved in concentrations of 29μΜ in water. Samples of these solutions are diluted tenfold to produce the reaction mixture. The reaction mixture is composed of either 20 pmoles of oligonucleotide mixture HR6195 together with 20 pmoles HR6196 or of only 4G pmol HR6298, L4 pmol [V- 32 P] ATP (NEN, 6000Ci / mmol) and 30 units T4 polynucleotide kinase (BRL) in 50μΙ Kinase buffer consisting of 50 mM Trie HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl 2 , 5 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 0.1 mM permidine (Maniatis et al., Ref. 6, p. 122). The Inkubalion is performed at 37 0 C for a period of 30min. The reaction is terminated by the addition of 4 μM 0.5 M EDTA (pH 8.0). The reaction mixtures are wound without purification to test the genomic library (Example 3.4) or probing Southern blots (Example 3.6).
Ein Teil der oben (Beispiel 2) beschriebenen Genombank von dem Aspergillus nlger-Stamm N 400 wird in SM verdünnt, und Portionen zu 0,1 ml, die jeweils etwa 2000pfu enthalten, werden plattiert. Wirtszellen werden durch Inokulierungen von 50ml LB-Medium, ergänzt mit 0,2% Maltose, mit 0,5 ml einer Übernachtkultur von E. coll-NM 539 in LB-Medium, vierstündiges Schütteln mit 250 U/min auf einem Gallenkamp-Orbitalrüttler bei 37 0C, gefolgt vom Zusatz von 0,5 ml 1M MgSO4 und von 0,5 ml 0,5MCaCI2, präpariert. Aliquote zu 0,2 ml dieser Zellen werden jeweils mit einer0,1-ml-Portion der Phagensuspension gemischt, und diese Gemische werden bei Zimmertemperatur eine halbe Stunde lang inkubiert. Dann werden 3ml von 0,7%iger AgaroseA portion of the genomic library of Aspergillus niger strain N 400 described above (Example 2) is diluted in SM and 0.1 ml portions, each containing about 2000 pfu, are plated. Host cells are seeded by inoculating 50 ml LB medium supplemented with 0.2% maltose with 0.5 ml of an overnight culture of E. coll-NM 539 in LB medium, shaking at 250 rpm for 4 hours on a Gallenkamp orbital shaker 37 0 C, followed by the addition of 0.5 ml 1M MgSO 4 and 0.5 ml 0.5MCaCI 2 , prepared. 0.2 ml aliquots of these cells are each mixed with a 0.1 ml portion of the phage suspension, and these mixtures are incubated at room temperature for half an hour. Then 3ml of 0.7% agarose
in LM-Medium bei 470C zugesetzt, kurz gewirbelt und sofort auf LM-Agar-Platten plattiert. Die Platten werden über Nacht bei 370C inkubiert und 2 Stunden lang bei 4°C abgeschreckt.in LM medium at 47 ° C., swirled briefly and immediately plated on LM agar plates. The plates are incubated overnight at 37 0 C for 2 hours and quenched at 4 ° C.
Von jeder Platte werden zwei Repliken nach der Plaquehybridisationsmethode von Benton und Davis (Ref.7) hergestellt. Der erste Filter (Schleicher und Schuell BA85) wird oben auf die Platte für 1 min, die zweite Replik für 2mh > gegeben, und die Position der Repliken wird unter Verwendung von Ausziehtusche markiert. Nach Abnahme der Filter werden Me in eine Scha!'; gegeben, in der sich 100ml einer denaturierenden Lösung (1M NaCI, 0,5M NaOH) befinden, Dauer 0,5min, dann iui 1 min in 100ml neutralisierende Lösung (0,5M Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1,5M NaCI). Die Filter werden in eine Schale gegeben, die 3 χ SSC enthält, und werden mit einer behandschuhten Hand vorsichtig gerieben, um Bakterientrümmer zu entfernen, und sie werden mit 3 x SSC gespült. Die Filter werden geblottet, 10 min bei Zimmertemperatur getrocknet und auf einem Whatman-3 MM-Papier in einem Ofen bei 8O0C 2 Stunden lang gebacken.From each plate, two replicates are made according to the plaque hybridization method of Benton and Davis (ref.7). The first filter (Schleicher and Schuell BA85) is placed on top of the plate for 1 min, the second replica for 2mh>, and the position of the replicas is marked using pink ink. After removing the filters, Me will be put into a dam! '; containing 100 ml of a denaturing solution (1 M NaCl, 0.5 M NaOH), duration 0.5 min, then 1 min in 100 ml neutralizing solution (0.5M Tris-HCl, pH 7.5.1, 5M NaCl). The filters are placed in a dish containing 3 χ SSC and gently rubbed with a gloved hand to remove bacterial debris and are rinsed with 3 x SSC. The filters are blotted, dried for 10 min at room temperature and baked on Whatman 3 MM paper for 2 hours in an oven at 8O 0 C.
Die gebackenen Filter werden in 3 χ SSC benetzt, in dieser Lösung eine Stunde lang bei Zimmertemperatur gewaschen und dann auf eine Schale übertragen, in der sich 250ml vorgewärmtes (650C) Prähybridisationsgemisch befinden, das aus 2 x SSC besteht, wenn das Oligonucleotidgemisch HR6195 und HR6196 verwendet wird, und aus 1 χ SSC, wenn das Oligonucleotidgamisch HR6298 verwendet wird, außerdem aus 10 x Denhardts (0,2% BSA, Boehringer-Fraktion V; 0,2% Ficoll 400, Pharmacia; 0,2% Polyvinylpyrrolidon-10, Sigma), 0,1 % SDS und 0,1 mg/ml gescherter und frisch denaturierter Heringsperma-DNA. Die Vorhybridisation erfolgt 5 Stunden lang in einem Rüttelwasserbad bei 650C. Anschließend werden die Filter einmal eine halbe Stunde lang in 250ml vorgewärmten (65°C) Hybridisationsgemisch gewaschen, das mit dem Prä- oder Vorhybridisationsgemisch bis auf den Wegfall der Heringsperma-DNA identisch ist. Dann werden die Filter in eine andere Schale gegeben, die 150 ml des vorgewärmten (650C) Hybridisationsgemische enthält, dem die vorher markierten kombinierten Oligonucleotidgemische HR6195 und HR6196 (Beispiel 3.1) oder das markierte Gemisch HR6298 frisch zugesetzt worden waren. In dem Fall, in welchem HR6195 und HR6196 eingesetzt werden, wird die Schale in das Rüttelwasserbad bei 650C gebracht, der Thermostat wird auf 470C eingestellt, und man läßt die Hybridisation 14 Stunden fortschreiten. Die Filter werden einmal für die Dauer einer halben Stunde in 250ml vorgewärmtem (470C) Hybridisationsgemisch bei 470C gewaschen, gefolgt vom Waschen bei Zimmertemperatur mit zwei Wechseln in 250ml 2 x SSC, jeweils für die Dauer von 45 min. Eine strenge Waschung wird durch Übertragung der Filter auf eine Schale durchgeführt, in der sich 250ml vorgewärmtes (630C) 6 χ SSC, 0,05% Natriumpyrophosphat befinden, und anschließendes Inkubieren in einem Rüttelwasserbad bei 630C für die Dauer von 30 min. Dann werden die Filter bei Zimmertemperatur mit zwei Wechseln in 2 χ SSC für jeweils 30min gewaschen. Die Filter worden an der Luft getrocknet, auf einer Auflage von Whatman-3MM-Papier fixiert, mit einer Plastehülle bedeckt und drei Tage lang bei -600C unter Verwendung eines intensivierenden Schirms einem Kodak-Film XAR5 ausgesetzt.The baked filters are wetted in 3 χ SSC, washed in this solution for one hour at room temperature and then transferred to a tray in which 250 ml of prewarmed (65 0 C) Prähybridisationsgemisch are composed of 2 x SSC, if the oligonucleotide mixture HR6195 and HR6196, and from 1 χ SSC when the oligonucleotide gum HR6298 is used, also from 10 x Denhardts (0.2% BSA, Boehringer V fraction, 0.2% Ficoll 400, Pharmacia, 0.2% polyvinylpyrrolidone). 10, Sigma), 0.1% SDS and 0.1 mg / ml of sheared and freshly denatured herring sperm DNA. The prehybridization is carried out in a Rüttelwasserbad at 65 0 C for 5 hours. Then the filters are washed once for half an hour in 250ml preheated (65 ° C) hybridization mixture, identical to the pre- or pre-hybridization until the elimination of herring sperm DNA is. Then the filters are placed in a different dish containing 150 ml of prewarmed (65 0 C) Hybridisationsgemische to which the previously labeled combined oligonucleotide mixtures HR6195 and HR6196 (Example 3.1) or the labeled mixture HR6298 had been freshly added. In the case in which HR6195 and HR6196 are used, the shell is placed in the Rüttelwasserbad at 65 0 C, the thermostat is set to 47 0 C, and the hybridization is allowed to proceed for 14 hours. The filters are washed once for a period of half an hour in 250 ml prewarmed (47 0 C) Hybridisationsgemisch at 47 0 C, followed by washing at room temperature with two changes in 250ml 2 x SSC, each for a period of 45 min. A rigorous wash is performed by transferring the filters to a dish in which 250ml prewarmed (63. 0 C) 6 χ SSC, 0.05% sodium pyrophosphate are, and then incubating in a shaking water bath at 63 0 C for a period of 30 min , Then the filters are washed at room temperature with two changes in 2 χ SSC for 30 min each. The filters were air dried, fixed on a support of Whatman 3MM paper, covered with a plastic envelope and exposed three days at -60 0 C using an intensifying screen on Kodak XAR5 film.
Auf diese Weise werden von den sechs geprüften Platten 6 positive Signale gewonnen. Positive Plaques werden mit einer sterilen Pasteur-Pipette ausgestanzt, wozu die Platten sorgfältig auf dem Autoradiogramm unter Verwendung der Tuschmarkierungen positioniert werden. Die Stücke des Agars, welche die positiven Plaques enthalten, werden zu 1 ml SM gegeben, und es werden 2,5μΙ Chloroform zugesetzt. Man läßt die Phage bei Zimmertemperatur für die Dauer von einer Stunde bei gelegentlichem Wirbeln diffundieren, und dann wurde über Nacht bei 40C inkubiurt. Das Agar und die Bakterienzelltrümmer werden durch fünfminütiges Zentrifugieren entfernt, es werden 2,5μΙ Chloroform zugesetzt, und die Phagenvorräte werden bei 4°C gelagert.In this way 6 positive signals are obtained from the six tested plates. Positive plaques are punched out with a sterile Pasteur pipette by carefully positioning the plates on the autoradiograph using the ink marks. The pieces of agar containing the positive plaques are added to 1 ml of SM and 2.5 μL of chloroform are added. Allowing the phage at room temperature for a period diffuse from one hour with occasional swirling, and then inkubiurt overnight at 4 0 C. The agar and bacterial cell debris are removed by centrifugation for five minutes, 2.5μl of chloroform are added, and the phage stocks are stored at 4 ° C.
Die positiven Klone werden als XC bis KG und M bezeichnet. Da die Phagen mit hoher Dichte plattiert sind, werden die positiven Plaque zweimal durch Plattieren auf geringe Dichte und Wiederholung des gesamten Verfahrens der Replikverdopplung, Hybridisierung und Herausnahme der positiven Plaques gereinigt.The positive clones are referred to as XC to KG and M. Since the phages are plated at high density, the positive plaques are purified twice by plating to low density and repeating the entire procedure of replica doubling, hybridizing and taking out the positive plaques.
In dem Fall, in welchem das Oligonucleotidgemisch HR 6298 verwendet wird, wird die Schale in das Rüttelwasserbad bei 650C gegeben, der Thermostat wird auf 520C eingestellt, und man läßt die Hybridisation 14 Stunden lang ablaufen. Dann werden die Filter einmal in 250ml vorgewärmten (520C) Hybridisationsgemisch für die Dauer einer halben Stunde bei 520C gewaschen, gefolgt vom Waschen bei Zimmertemperatur mit zwei Wechseln von 250ml 2 χ SSC, jeweils über 45 Minuten. Anschließend wird die strenge Waschung durch Übertragung der Filter auf eine Schale durchgeführt, die 250 ml vorgewärmtes (640C) 4 x SSC, 0,05% Natriumpyrophosphat enthält, und anschließendes Inkubieren für eine halbe Stunde in einem Rüttelwasserbad bei 640C. Dann werden die Filter bei Zimmertemperatur mit zwei Wechseln von 2 χ SSC für jeweils 30 min gewaschen. Die Filter werden an der Luft getrocknet, auf einer Auflage von Whatman-3MM-Papier fixiert, mit einer Plasthülle abgedeckt und drei Tage lang unter Verwendung eines intensivierenden Schirms bei -6O0C einem Kodak-Film XAR 5 ausgesetzt.In the case in which the oligonucleotide mixture 6298 HR is used, the tray in the shaking water is added at 65 0 C, the thermostat is adjusted to 52 0 C, and allowing the hybridization to proceed for 14 hours. The filters are then washed once in 250 ml prewarmed (52 0 C) Hybridisationsgemisch for a period of half hour at 52 0 C, followed by washing at room temperature with two changes of 250 ml 2 χ SSC, each over 45 minutes. Subsequently the stringent wash is performed by transferring the filter to a shell (64 0 C) containing 250 ml prewarmed 4 x SSC, 0.05% sodium pyrophosphate, and then incubating for half an hour in a shaking water bath at 64 0 C. Then The filters are washed at room temperature with two changes of 2 χ SSC for 30 min each. The filters are air dried, fixed on a support of Whatman 3MM paper, covered with a plastic envelope and exposed for three days C using an intensifying screen at -6O 0 to Kodak XAR film. 5
Auf diese Weise erhält man von den sechs geprüften Platten neun positive Signale. Positive Plaque werden mit einer sterilen Pasteur-Pipette unter sorgfältiger Positionierung der Platten auf dem Autoradiogramm unter Nutzung der Tuschmarkierungen ausgestanzt. Die Stücke des Agars, die positive Plaques enthalten, werden zu 1 ml SM gegeben, und es werden 2,5 μΙ Chloroform zugesetzt. Man läßt die Phage bei Zimmertemperatur unter gelegentlichem Wirbeln eine Stunde lang aus dem Agar diffundieren, und anschließend wird über Nacht bei 40C inkubiert. Das Agar und die Bakterienzelltrümmer werden durch fünfminütiges Zentrifugieren entfernt, es werden 2,5μΙ Chloroform zugesetzt, und die Phagenvorräte werden bei 4°C gelagert. Die positiven Klone werden PG Ι-λ 1-9 bezeichnet. Die positiven Plaques werden weiter durch Plattieren in geringer Dichte gereinigt, unter Verwendung des 1,2kbp-BamHI/EcoRI-Frag.T\entes von pGW 1803 (siehe Beispiel 3,8) als heterologe Sonde für die Hybridisation, die bei 6O0C ausgeführt wird, während das Waschen ebenfalls bei 6O0C in 2 χ SSC ausgeführt wird.In this way one receives nine positive signals from the six tested plates. Positive plaques are punched out with a sterile pasteur pipette with careful positioning of the plates on the autoradiogram using the ink marks. The pieces of agar containing positive plaques are added to 1 ml of SM and 2.5 μL of chloroform are added. Allowing the phage at room temperature with occasional swirling of the diffuse agar for one hour, and then was incubated overnight at 4 0 C. The agar and bacterial cell debris are removed by centrifugation for five minutes, 2.5μl of chloroform are added, and the phage stocks are stored at 4 ° C. The positive clones are designated PG Ι-λ 1-9. The positive plaques are further purified by plating at low density, gent using the 1,2kbp BamHI / EcoRI Frag.T \ PGW 1803 (see Example 3.8) as a heterologous probe for hybridization which at 6O 0 C is carried out while the washing is also carried out at 6O 0 C in 2 χ SSC.
Um DNA aus den rekombinanten Klonen zu isolieren, werden die Phage zuerst verstärkt. Zu diesem Zweck worden E. coll-LE 392-Wirtszellen bis iu einer optischen Dichte (600 nm) von 1,0 in LB-Medium, das mit 1OmM MgSO4 und 0,2% Maltose ergänzt war, gezogen. Dann werden gesondert 50 μΙ der Vorräte der gereinigten Phage plattiert, wie das im Beispiel 2,5 beschrieben wurde. Nach der über Nacht ausgeführten Inkubation be! 370C wurden die Phage aus den nichtkonfluenten Platten dadurch eluiert, daß 5 ml SM über die Platten gestrichen und diese unter sanften Schütteln zwei Stunden lang inkubiert wurden. Die aluierten Phage werden geerntet, und es wird 0,1 ml Chloroform zugesetzt. Man läßt das Gemisch kurz wirbeln, und Zelltrümmer werden durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wird gewonnen, es wird Chloroform auf 0,3% zugesetzt, und das resultierende Plattenlysat wird bei 40C gelagert.To isolate DNA from the recombinant clones, the phage are first amplified. For this purpose, E. coli LE 392 host cells were grown to an optical density (600 nm) of 1.0 in LB medium supplemented with 10 mM MgSO 4 and 0.2% maltose. Then, separately, 50 μl of the stocks of purified phage are plated, as described in Example 2.5. After overnight incubation be! 37 ° C., the phage were eluted from the non-confluent plates by stroking 5 ml of SM over the plates and incubating with gentle shaking for two hours. The alu phage are harvested and 0.1 ml of chloroform is added. The mixture is allowed to vortex briefly and cell debris is removed by centrifugation. The supernatant is recovered, it is added chloroform to 0.3%, and the resulting Plattenlysat is stored at 4 0 C.
Um für die Isolierung der Phagen-DNA annähernd konfluente Platten zu erhalten, werden Portionen zu 10 μΙ der Plattenlysate mit E. coll-LE392-Wirtszellen plattiert. Nach der Inkubation über Nacht bei 370C wird die Agaroseoberschicht von drei annähernd konfluenten Platten abgeschabt. Diese Schichten werden kombiniert, es werden 20ml SM und 0,4ml Chloroform zugegeben, und das resultierende Gemisch wird 30min bei 370C geschüttelt. Zelltrümmer und Agarose werden durch ZentrifugierenIn order to obtain approximately confluent plates for the isolation of the phage DNA, portions of 10 μl of the plate lysates are plated with E. coli LE392 host cells. After incubation overnight at 37 0 C the Agaroseoberschicht is scraped off from three nearly confluent plates. These layers are combined, it will 20ml SM and 0.4 ml of chloroform was added, and the resulting mixture is shaken at 37 0 C for 30 min. Cell debris and agarose are removed by centrifugation
entfernt, der Überstand wird gewonnen und sein Volumen mit SM auf 18ml abgestimmt. Es wird ein gleiches Volumen von 2M NaCI, 20% PEG 6000 (BDH, Poole, GB) in SM zugesetzt, und die Lösungen werden gemischt und auf Eis qesetzt. Nach 75min werden die Phagen pelletiert, dazu wird bei 12000 x g bei 4°C 20min zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert, und die restliche Flüssigkeit wird mit einem Kleenex-Gewebe entfernt. Das Pellet wird wieder in 3ml SM suspendiert und anschließend mit 3ml Chloroform extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit RNase A (67 pg/ml) und DNase I (33μς/ηΊΐ) 20min lang bei 370C behandelt. Dann wird dieses Gemisch durch den Zusatz von 2 ml Phenol, Wirbeln, den Zusatz von 1 ml Chloroform, erneutes Wirbeln und Trennen der beiden Phasen durch Zentrifugieren extrahiert. Die wäßrige Phase wird zweimal zusätzlich, mit 3ml Phenol/Chloroform (1:2) bzw. 3ml Chloroform, extrahiert. Dann wird die DNA aus der wäßrigen Phase durch den sequentiellen Zusatz von 0,3ml 3M Natriumacetatpuffer (pH-Wert 5,2) und 6ml Ethanol ausgefällt. Dieses Gemisch läßt man bei 40C 16 Stunden stehen, dann wird die DNA durch Zentrifugieren (10min, 12000 χ g, 40C) gewonnen. Das Pellet wird in 0,4 ml TE-Puffer aufgelöst, es wird RNase A biszu 200μ9/ΓηΙ zugesetzt und bei 370C eint Stunde lang inkubiert. Die DNA wird ausgefällt, dazu werden 38μΙ 3 M Natriumacetatpuffer (pH-Wert 5,2) und 0,8ml Ethanol bei 4°C zugesetzt, Sauer eine Stunde. Die DNA wird durch Zentrifugieren gewonnen und anschließend in 100μΙ ΊΈ-Puffei aufgelöst.removed, the supernatant is recovered and its volume matched with SM to 18ml. An equal volume of 2M NaCl, 20% PEG 6000 (BDH, Poole, UK) in SM is added and the solutions are mixed and placed on ice. After 75 minutes, the phages are pelleted by centrifuging at 12,000 × g at 4 ° C. for 20 minutes. The supernatant is decanted and the remaining liquid is removed with Kleenex tissue. The pellet is resuspended in 3 ml SM and then extracted with 3 ml chloroform. The aqueous phase is treated 20min at 37 0 C with RNase A (67 pg / ml) and DNase I (33μς / ηΊΐ). Then, this mixture is extracted by the addition of 2 ml of phenol, vortexing, the addition of 1 ml of chloroform, re-vortexing and separation of the two phases by centrifugation. The aqueous phase is extracted twice additionally with 3 ml of phenol / chloroform (1: 2) or 3 ml of chloroform. Then the DNA is precipitated from the aqueous phase by the sequential addition of 0.3 ml of 3M sodium acetate buffer (pH 5.2) and 6 ml of ethanol. This mixture is allowed to stand at 4 0 C for 16 hours, then the DNA by centrifugation (10 min, 12000 g, 4 0 C) was recovered. The pellet is dissolved in 0.4 ml of TE buffer, RNase A is added to it biszu 200μ9 / ΓηΙ and at 37 0 C in one hour incubated. The DNA is precipitated, to 38 .mu.M 3 M sodium acetate buffer (pH 5.2) and 0.8 ml of ethanol are added at 4 ° C, acid one hour. The DNA is recovered by centrifugation and then dissolved in 100μΙ ΊΈ-Puffei.
Aus den positiven Phagen, welche die PG Il-Gensequenzen enthalten, werden AD und λΕ für die weitere Analyse ausgewählt. Zuerst wird durch Restriktionsanalyse ermittelt, daß beide Phagen Einschöbe enthalten, welches aui demselben Bereich des A. nlger-Genoms abgeleitet sind, und dann v/ird eine partielle Restriktionskarte von XE konstruiert.From the positive phage containing the PG II gene sequences, AD and λΕ are selected for further analysis. First, it is determined by restriction analysis that both phages contain inserts derived from the same region of the A. niger genome, and then a partial restriction map of XE is constructed.
Es werden 2 μρ der Phagen-DNA mit 20 Einheiten EcoRI oder BamHI f^er der Kombination dieser Enzyme in einem Volumen von 100μΙ 3 Stunden lang bei 370C in dem vom Hersteller (BRL) empfohlenen Puffer und bei Anwesenheit von 0,8mg/mI RNase A digeriert. Dann werden 10μΙ eines 3 M Nntriumacetatpuffers (pH-Wert 5,2) zugesetzt, und das Gemisch wird mit 80 μΙ Chloroform extrahiert. Die DNA wird aus der wäßrigen Phase durch den Zusatz von 250 μΙ Ethanol ausgefällt, und das Gemisch wird 1 Stunde auf Eis gegeben. Die DNA wird durch Zentrifugieren aufgefangen, in 25μΙ von 1 x Probenpuffer aufgelöst und bei 650C 10min erhitzt. Die Proben werden auf einem 0,7%igen Agarosegel unter Verwendung von 1 μg Lambda-DNA (BRL), die mit Hindill als Giößenmarkern digeriert wurde, behandelt. Das Gel wird auf einer UV-Durchleuchtungsvorrichtung unter Verwendung eines Polaroidfilms 667 fotografiert. Die DNA wird auf eine Nitrocellulose-Membran von Schleicher und Schuell BA85 nach der Methode von Southern (1975) übertragen, wie das von Maniatis u. a., S. 382-386 (Ref. 6) beschrieben wurde. Dann wird die Membran gebacken und mit den kombinierten, markierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisiert, wie das im Beispiel 3.3 beschrieben wurde.There are 2 μρ of the phage DNA with 20 units of EcoRI or BamHI f ^ he combination of these enzymes in a volume of 100μΙ for 3 hours at 37 0 C in the manufacturer recommended by (BRL) buffer and in the presence of 0.8mg / with RNase A digested. Then, 10μl of a 3M nitrate acetate buffer (pH 5.2) is added and the mixture is extracted with 80μl of chloroform. The DNA is precipitated from the aqueous phase by the addition of 250 μM ethanol, and the mixture is placed on ice for 1 hour. The DNA is collected by centrifugation, dissolved in 25μΙ of 1 x sample buffer and heated at 65 0 C for 10min. The samples are treated on a 0.7% agarose gel using 1 μg lambda DNA (BRL) digested with HindIII as size markers. The gel is photographed on a UV transilluminator using a Polaroid film 667. The DNA is transferred to a nitrocellulose membrane from Schleicher and Schuell BA85 according to the method of Southern (1975), as described by Maniatis et al., Pp. 382-386 (reference 6). The membrane is then baked and hybridized with the combined, labeled oligonucleotide mixtures HR6195 and HR6196, as described in Example 3.3.
Fragmentlängen werden aus der Fotografie und den Autoradiogrammen durch Vergleich mit den bekannten Markerbanden berechnet. Die Größe von Fragmenten, die kleiner als 5kbp sind und nach dem Digerieren der DNA, die aus den Phagen AD und AE isoliert wurde, mit EcoRI, BamHI bzw. der Kombination dieser Enzyme ermittelt wurde, wird in der Tabelle III gegeben. Bei der Auflösungskraft des eingesetzten Elektrophoresesystems ist es nicht sinnvoll, Fragmente von größerer Länge zu vergleichen. Wie aus dem Vorhandensein einiger Bande mit reduzierter Intensität in den EcoRI-Aufschließungen, die in derTabelle III gezeigt werden, hervorgeht, hat EcoRI die DNA nicht vollständig digeriert. Die Fragmente, welche in der EcoRI/BamHI-Doppelaufschließung, nicht aber in einer der Einzelaufschließungen vorhanden sind, haben mit denen der BamHI-Fragmente im gleichen Größenbereich vergleichbare Intensitäten. Sie müssen daher vollständig digerierte Produkte darstellen. Die Fragmente, die mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisieren, sind im Falle von AE ein Fragment, das größer als 10kbp ist, in der BamHI-Aufschließung, ein 7,4kbp-EcoRI-Fragment und ein Fragment, das größer als 10 kbp ist, in der EcoRI-Aufschließung und ein 2,8kbp-Fragment sowie ein Fragment, das größer als 10 kbp ist, in der BamHI/EcoRI-Doppelaufschließung.Fragment lengths are calculated from the photograph and the autoradiograms by comparison with the known marker bands. The size of fragments smaller than 5 kbp and determined after digestion of the DNA isolated from the phages AD and AE with EcoRI, BamHI or the combination of these enzymes is given in Table III. In the resolution of the electrophoresis system used, it is not useful to compare fragments of greater length. As evidenced by the presence of some reduced intensity bands in the EcoRI digests shown in Table III, EcoRI has not completely digested the DNA. The fragments which are present in the EcoRI / BamHI double digestion, but not in one of the individual digestions, have comparable intensities to those of the BamHI fragments in the same size range. You must therefore represent completely digested products. The fragments which hybridize to the combined oligonucleotide mixtures HR6195 and HR6196 are, in the case of AE, a fragment larger than 10kbp in BamHI digestion, a 7.4kbp EcoRI fragment and a fragment larger than 10kbp is in the EcoRI digest and a 2.8kbp fragment as well as a fragment larger than 10kbp in the BamHI / EcoRI double digest.
Im Falle von AD sind die Fragmente, welche mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisieren, die folgenden: ein Fragment, das größer als 10kbp ist, in der BamHI-Aufschließung, ein 5,8kbp-Fragment und ein Fragment, das größer als 10kbp ist, in der EcoRI-Aufschließung und ein 1,2kbp-Fragment sowie ein Fragment, das größer als 10kbp ist, in der BamHI/EcoRI-Doppelaufschließung. Wenn mehr Fragmente beobachtet werden, z. B. in den Aufschließungen mit EcoRI, wird das größere Fragment als ein Produkt betrachtet, das sich aus einer partiellen Spaltung ergibt. Die Hybridisation von Fragmenten gleicher Größe, die von AD und AE gewonnen wurden, mit den Oligonucleotidgemischen wird nicht beobachtet. Aus den Unterschieden in den oben aufgeführten Phagen AD und AE wird geschlußfolgert, daß die Phage AD und AE nicht identisch sind. Tabelle III führt jedoch zwei EcoRI-Fragmente, drei BamHI-Fragmente und wenigstens vier BamHI-EcoRI-Fragmente auf, die in AD und AE die gleiche Größe haben. Diese Phagen müssen ihren Ursprung in den Einschüben dieser Phagen haben, da der Vektor keine EcoRI- oder BamHI-Orte enthält, ausgenommen die BamHI-Orte, die zum Einfügen der Fragmente von Aspergillus-DNA in den Vektor verwendet wurden, und die EcoRI-Orte, welche diese BamHI-Orte flankieren und damit auch den Einschub flankieren (Frischauf u. a., Ref. 9). Es wird daher geschlußfolgert, daß die Einschübe der Phagen AD und AE aus demselben Bereich des A. nlger-Genoms abgeleitet wurden. In Verbindung mit der Tatsache, daß das relevante hybridisierende BamHI-EcoRI-Fragment von AD kleiner als das entsprechende Fragment von AE ist, z. B. 1,2 kbp im Vergleich zu 2,8kbp, und unter der Annahme, daß die beobachteten Unterschiode im Restriktionsmuster nicht das Ergebnis eines Klonierungsartefakts sind, ergibt sich, daß der EcoRI-Ort des hybridisierenden 1,2 kbp-BamHI-EcoRI-Fragmentes von AD nicht von A. Niger-DNA abgeleitet wird und einer der EcoRI-Orte ist, welche den Einschub dieses Phagen flankieren. Außerdem ergibt sich daraus, daß sich der Einschub von AD in einer Richtung höchstens 1,2 kbp über die Folge hinaus erstreckt, welche mit dem Oligonucleotidgemisch hybridisiert. Außerdem wird gefolgert, daß die Sequenz von AE, die mit dem Oligonucleotidgemisch hybridisiert, sich innerhalb von 1,2 kbp vom BamHI-Ort an die Grenze des hybridisierenden 2,8kbp-BamHI-EcoRI-Fragmentes befindet (Abb. 1).In the case of AD, the fragments which hybridize to the combined oligonucleotide mixtures HR6195 and HR6196 are as follows: a fragment larger than 10kbp in the BamHI digest, a 5.8kbp fragment, and a fragment larger than 10kbp is in the EcoRI digest and a 1.2kbp fragment as well as a fragment larger than 10kbp in the BamHI / EcoRI double digest. If more fragments are observed, e.g. In EcoRI digestions, the larger fragment is considered a product resulting from partial cleavage. Hybridization of equal sized fragments derived from AD and AE with the oligonucleotide mixtures is not observed. From the differences in the phages AD and AE listed above, it is concluded that the phage AD and AE are not identical. However, Table III lists two EcoRI fragments, three BamHI fragments and at least four BamHI-EcoRI fragments that are the same size in AD and AE. These phages must have their origin in the inserts of these phages, since the vector contains no EcoRI or BamHI sites, except for the BamHI sites used to insert the fragments of Aspergillus DNA into the vector, and the EcoRI sites flanking these BamHI sites and thus also flanking the inset (Frischauf et al. Ref. 9). It is therefore concluded that the inserts of the phages AD and AE were derived from the same region of the A. nlger genome. In conjunction with the fact that the relevant hybridizing BamHI-EcoRI fragment of AD is smaller than the corresponding fragment of AE, e.g. 1.2 kbp compared to 2.8 kbp, and assuming that the observed sub-chords in the restriction pattern are not the result of a cloning artifact, it follows that the EcoRI site of the hybridizing 1.2 kbp BamHI-EcoRI Fragment of AD is not derived from A. niger DNA and is one of the EcoRI sites flanking the inset of this phage. In addition, it follows that the insertion of AD in one direction extends at most 1.2 kbp beyond the sequence which hybridizes with the oligonucleotide mixture. In addition, it is concluded that the sequence of AE that hybridizes to the oligonucleotide mixture is within 1.2 kbp from the BamHI site to the boundary of the hybridizing 2.8 kbp BamHI-EcoRI fragment (Figure 1).
Angenäherte Größe der Fragmente (in kbp), die kleiner als 5kbp sind und nach dem Digerieren von DNA, die aus den Phagen AD und XE isoliert wurde, mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI bzw. der Kombination dieser Enzyme gewonnen werden. (P) bezeichnet Fragmente, die wahrscheinlich aus einer partiellen Spaltung resultieren.Approximate size of fragments (in kbp) smaller than 5kbp recovered after digestion of DNA isolated from phage AD and XE with the restriction enzymes EcoRI, BamHI, or the combination of these enzymes. (P) denotes fragments likely to result from partial cleavage.
XD λΕ AD XEXD λΕ AD XE
3,8 . 3,83.8. 3.8
3,5(Pi 3,2(P) 2,4 2,4 2,43.5 (Pi 3.2 (P) 2.4 2.4 2.4
2,2 2,22,2 2,2
1,6 1,61.6 1.6
0,980.98
0,62 0,62 0,62 0,620.62 0.62 0.62 0.62
Um eine partielle Restriktionskarte von XE zu konstruieren, wird Phagen-DNA mit EcoRI, Xbal, Hindill und allen möglichen Kombinationen dieser Enzyme aufgeschlossen. Das geschieht in zwei Schritten. Zuerst werden 6μg der DNA 105min lang bei 370C entweder bei Anwesenheit oder bei Fehlen von 200 Einheiten EcoRI in einem Volumen voin 200μΙ inkubiert, welches den vom Hersteller (BRL) empfohlenen Puffer und RNase A (2 mg je ml) enthält. Dann werden die Reaktionsgemische mit 100 μΙ Phenol/Chloroform (1:1) und anschließend mit 100μΙ Chloroform extrahiert. DNA wird aus der wäßrigen Phase durch den Zusatz von 0,1 Volumen eines 3M Natriumacetatpuffers und von 2 Volumen Ethanol ausgefällt. Nach dem das Ganze 10min auf Eis gestanden hat, werden die Ausfällungen durch Zentrifugieren aufgefangen. Die Pellets werden in Luft getrocknet und in ΙΟΟμΙ TE-Puffer aufgelöst. Dann werden die Lösungen für nachfolgende Inkubationen, entweder bei Fehlen des Restriktionsenzyms (nur EcoRI-digeriertes Material) oder bei Anwesenheit von Hindill, Xbal oder der Kombination dieser Enzyme, verwendet. Inkubationen werden für 2 Stunden bei 37 0C in einem Volumen von 20 μΙ ausgeführt, das 10 μΙ der jeweiligen DNA-Lösung, RNase A (2 mg/ml), 10 Einheiten des jeweiligen Restriktionsenzyms und den vom Hersteller (BRL) empfohlenen Puffer enthält. Die Inkubation wird durch den Zusatz von 5μΙ des fünffach konzentrierten Probenpuffers gestoppt, und anschließend werden die Proben wie oben beschrieben analysiert.To construct a partial restriction map of XE, phage DNA is digested with EcoRI, XbaI, HindIII and all possible combinations of these enzymes. This happens in two steps. First, 6μg of DNA are incubated for 105min at 37 0 C either in the presence or absence of 200 units of EcoRI in a volume voin 200μΙ containing the manufacturer (BRL) recommended buffer and RNase A (2 mg per ml). Then the reaction mixtures are extracted with 100 .mu.l phenol / chloroform (1: 1) and then with 100 .mu.l chloroform. DNA is precipitated from the aqueous phase by the addition of 0.1 volume of 3M sodium acetate buffer and 2 volumes of ethanol. After the whole thing has been on ice for 10min, the precipitates are collected by centrifuging. The pellets are dried in air and dissolved in ΙΟΟμΙ TE buffer. Then the solutions are used for subsequent incubations, either in the absence of the restriction enzyme (EcoRI digested material only) or in the presence of HindIII, XbaI or the combination of these enzymes. Incubations are carried out for 2 hours at 37 0 C in a volume of 20 μΙ containing 10 μΙ of the respective DNA solution, RNase A (2 mg / ml), 10 units of the respective restriction enzyme and recommended by the manufacturer (BRL) buffer , The incubation is stopped by the addition of 5 μΙ of the five-fold concentrated sample buffer, and then the samples are analyzed as described above.
Auf dem Autoradiogramm wird in den Aufschließungen mit Hindill, Xbal und den Kombinationen dieser zwei Enzyme nur eine einzige hybridisierende Bande, die größer als 10 kbp ist, festgestellt. Eine Bande von etwa dergleichen Größe ist in allen anderen Aufschließungen, wenn auch mit geringerer Intensität, vorhanden, was darauf hinweist, daß die Enzyme die DNA nicht vollständig beschränkt haben. Die zweite und am stärksten hybridisierende Bande in der EcoRI-Aufschließung repräsentiert ein 7,4kbp-Fragment. Diese Bande, die wiederum auf unvollständiges Dispergieren hinweist, ist in den Aufschließungen mit EcoRI und einem zweiten Enzym, wenn auch in geringerer Intensität, vorhanden. Außerdem ergeben die EcoRI/Hindlll-Doppelaufschließung und die EcoRI/Hindlll/Xbal-Dreifachaufschließung ein hybridisierendes Fragment von 3,6 kbp. Ein 4,1 kbp-Fragment, das hybridisierend isi, wird in der Doppelaufschließung mit den Enzymen EcoRI und Xbal festgestellt. Dieses Fragment ist auch in der Dreifachüufschließung mit den Enzymen EcoRI, Hindlll und Xbal vorhanden, aber in sehr geringer Intensität. Im letzteren Fall wird das 4,1 kbp-Fragment als ein partielles Spaltungsprodukt betrachtet.On the autoradiogram, only one single hybridizing band greater than 10 kbp is detected in the digestions with HindIII, XbaI and the combinations of these two enzymes. A band of about the same size is present in all other digests, albeit at a lower intensity, indicating that the enzymes have not completely restricted the DNA. The second and most strongly hybridizing band in the EcoRI digestion represents a 7.4kbp fragment. This band, again indicating incomplete dispersion, is present in the digests with EcoRI and a second enzyme, albeit at a lower intensity. In addition, the EcoRI / HindIII double digest and the EcoRI / HindIII / XbaI triple digest give a hybridizing fragment of 3.6 kbp. A 4.1 kbp fragment hybridizing to isi is detected in the double digestion with the enzymes EcoRI and XbaI. This fragment is also present in the triple bond with the enzymes EcoRI, HindIII and Xbal, but in very low intensity. In the latter case, the 4.1 kbp fragment is considered to be a partial cleavage product.
Es wird geschlußfolgert, daß das 7,4 kbp-EcoRI-Fragment, welches mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisiert, mit jedem einzelnen der Enzyme Xbal, Hindlll oder BamHI gespalten werden kann und daß die Lage des Spaltungsortes dieser Enzyme die in der Abb. 1 gezeigte sein muß. Diese Abbildung gibt nur eine partielle Restriktionskarte, z. B. könnte das 7,4 kbp-EcoRI-Fragment noch mehr als einen Spaltungsort für eines der Enzyme Hindlll, Xbal und BamHI jeweils enthalten, wobei in diesem Fall nur der Ort gezeigt wird, welcher der speziellen Sequenz am nächsten liegt, die mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisiert.It is concluded that the 7.4 kbp EcoRI fragment which hybridizes with the combined oligonucleotide mixtures HR6195 and HR6196 can be cleaved with each of the enzymes XbaI, HindIII or BamHI and that the location of the cleavage site of these enzymes is as shown in Fig 1 must be shown. This figure gives only a partial restriction map, e.g. For example, the 7.4 kbp EcoRI fragment could still contain more than one cleavage site for one of the enzymes HindIII, Xbal and BamHI, in which case only the location closest to the particular sequence closest to the one would be shown hybridized hybrid oligonucleotide mixtures HR6195 and HR6196.
Mit dem Phagen XD wird keine Xbal- oder Hindlll-AufschlieSung vorgenommen, es wird jedoch angenommen, daß die Xbal· und Hindlll-Restriktionsorte wie im Phagen XE angeordnet sind.No XbaI or HindIII digest is made with the phage XD, but it is believed that the XbaI and HindIII restriction sites are located as in phage XE.
Aus den neun positiven Klonen, welche PGI-Gensequenzen tragen, werden die vier Phagen PGI-X4, -X5, -X6 und -X7 für die weitere Analyse ausgewählt. Zuerst wird ermittelt, daß die Phagen Einschübe enthalten, die aus demselben Bereich des A. nlger-Genoms abgeleitet wurden, und anschließend wird eine partielle Restriktionskarte von X5 hergestellt, wie das oben für die PGII-Gensequenz beschrieben wurde, welche die Phagen D und E enthält. Die DNA wird mit Restriktionsenzymen (Enzyme siehe Tabelle IV) nach den Empfehlungen der Enzymhersteller digeriert. Die Fragmente werden auf einem Agarosegel getrennt und auf Nitrocellulose geblottet, wie das oben beschrieben wurde. Dann wird die Membran gebacken und mit einem vorher einer Nick-Translation unterzogenen 1,2kb-BamHI/EcoRI-Fragment der Strukturgencodierung für PGII hybridisiert. Dieses Fragment wird vom Plasmid pGW 1803 abgeleitet, das im Beispiel 3.8 beschrieben wird. Das Fragment wird aus Scheiben eines Agarosegels isoliert, und 50 ng des Fragments werden einer Nick-Translation unterzogen, wie das von Maniatis u. a. (S. 109-112; Ref. 6) beschrieben wurde. Bevor die der Nick-Translation unterzogene DNA dem Hybridisationsgemisch zugesetzt wird, wird sie 10 min lang in einem siedenden Wasserbad denaturiert. Die Nitrocellulosefilter werden mit den radioaktiven Sondeh hybridisiert, wie das im Beispiel 3.8 beschrieben wird, wobei aber die Vorhybridisations- und die Hybridisationstemperatur jeweils 6O0C betragen. Dann werden die Membranen bei 600C unter Verwendung einer Reihe von vorgewärmtem Puffern gewaschen. Zuerst werden die Membranen in 6 χ SSC gespült und zweimal eine halbe Stunde lang in Hybridisationspuffer gewaschen. Dann werden die Filter nacheinander in 4 x SSG und 2 χ SSC für 30min je Puffer gewaschen. Diese Puffer enthalten beide 0,1% SDS und 0,1% Na4P2O? χ 10HjO. Nach der letzten Waschung werden die Membranen kurz in 0,1 χ SSC gespült und dann trocknen lassen, anschließend werden sie einem Röntgenfilm ausgesetzt.From the nine positive clones carrying PGI gene sequences, the four phages PGI-X4, -X5, -X6 and -X7 are selected for further analysis. First, it is determined that the phage contain inserts derived from the same region of the A. nlger genome, and then a partial restriction map of X5 is prepared, as described above for the PGII gene sequence containing phages D and E contains. The DNA is digested with restriction enzymes (enzymes see Table IV) according to the recommendations of the enzyme manufacturer. The fragments are separated on an agarose gel and blotted to nitrocellulose as described above. Then the membrane is baked and hybridized with a previously nick-translated 1.2kb BamHI / EcoRI fragment of the structural gene coding for PGII. This fragment is derived from plasmid pGW 1803, which is described in Example 3.8. The fragment is isolated from slices of agarose gel, and 50 ng of the fragment is nick-translated as described by Maniatis et al. (Pp. 109-112, ref. Before the nick-translated DNA is added to the hybridization mixture, it is denatured for 10 minutes in a boiling water bath. The nitrocellulose filters are hybridized with the radioactive probe, as described in Example 3.8, but the prehybridization and the hybridization temperature are each 6O 0 C. The membranes are then washed at 60 ° C. using a series of preheated buffers. First, the membranes are rinsed in 6 χ SSC and washed twice in hybridization buffer for half an hour. Then the filters are washed successively in 4 x SSG and 2 x SSC for 30 min per buffer. These buffers contain both 0.1% SDS and 0.1% Na 4 P 2 O? χ 10HjO. After the last wash, the membranes are rinsed briefly in 0.1 χ SSC and then allowed to dry, then exposed to X-ray film.
Die verwendete Sonde stellt einen kleinen Teil des PG Il-Promotorbereichs (200bp) und einen großen Teil der Codierungssequenz dar. Unter den beschriebenen Hybridisationsbedingungen ergibt diese Sonde starke Signale bei allen oben isolierten Phagen (siehe Beispiel 3.4), welche PGI-Sequenzen enthalten.The probe used represents a small portion of the PG II promoter region (200 bp) and much of the coding sequence. Under the described hybridization conditions, this probe gives strong signals to all phage isolated above (see Example 3.4) containing PGI sequences.
Fragmentlängen werden aus der Fotografie und den Autoradiogrammen durch Vergleich mit den bekannten Markerbanden ermittelt. In der Tabelle IV werden die hybridisierenden Fragmente und ihre angenäherte Größe aufgeführt.Fragment lengths are determined from the photograph and the autoradiograms by comparison with the known marker bands. Table IV lists the hybridizing fragments and their approximate size.
Die angenäherte Größe der hybridisierenden Fragmente (kbp), die nach dem Digerieren der DNA, die aus PGI λ4-7 isoliert wurde, mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI, Xhol und den Kombinationen dieser Enzyme sowie mit dem BamHI/Bglll gewonnen wurdenThe approximate size of hybridizing fragments (kbp) recovered after digestion of the DNA isolated from PGI λ4-7 with the restriction enzymes EcoRI, BamHI, Xhol and the combinations of these enzymes and with the BamHI / BglII
Aus der Tabelle IV geht hervor, daß alle Phagen ein EcoRI-Fragment von 6,4 kbp und ein Xhol/EcoRI-Fragment von 2,0kbp enthalten, während eine EcoRI/BamHI-Doppelaufschließung auch zu einem 6,4kbp führt. Die Pagen λ4, λ5 und λ7 haben auch identische Fragmente, wenn sie mit BamHI (8,6kbp) und BamHI/Bglll (7,5 kbp) digeriert werden. Der Vektor enthält keine BamHI-Orte mit Ausnahme der BamHI-Orte, dii zu Einfügen der Fragmente von Aspergillus-DNA verwendet werden (Frischauf u. a„ Ref.9). Die Einschübe dieser drei Phagen werden daher als vom gleichen Bereich des A. nlger-Genoms abgeleitet betrachtet. Um eine partielle Restriktionskarte zu schaffen, wird A5-Phagen-DNA auch mit Kpnl, Smal, Sstl und Sail und mit BamHI in Verbindung mit diesen Enzymen digeriert. Außerdem wird eine Bglll/Xhol-Aufschließung analysiert. Alle diese Inkubationen werden für die Dauer von 3 Stunden bei 370C, ausgenommen Saml (300C), in einem Volumen von 20μΙ ausgeführt, das 1 pg Phagen-DNA enthält. Die Fragmente, die bei 6O0C mit der PGII-Sonde hybridisieren, werden in der Tabelle V aufgeführt.Table IV shows that all phages contain an EcoRI fragment of 6.4 kbp and a Xhol / EcoRI fragment of 2.0 kbp, while an EcoRI / BamHI double digestion also leads to a 6.4 kbp. The pages λ4, λ5 and λ7 also have identical fragments when digested with BamHI (8.6kbp) and BamHI / Bglll (7.5kbp). The vector contains no BamHI sites except for the BamHI sites, which are used to insert fragments of Aspergillus DNA (Frischauf et al Ref. 9). The insets of these three phages are therefore considered to be derived from the same region of the A. nlger genome. To create a partial restriction map, A5 phage DNA is also digested with KpnI, SmaI, SstI and Sail and BamHI in conjunction with these enzymes. In addition, a Bglll / Xhol digest is analyzed. All of these incubations are carried out for 3 hours at 37 0 C, except Saml (30 0 C), in a volume of 20μΙ containing 1 pg of phage DNA. The fragments that hybridize at 6O 0 C with the PGII probe are listed in Table V.
Die angenäherte Größe der hybridisiernden Fragmente (kbp), die nach dem Aufschließen von DNA, die aus PG Ι-λ5 isoliert wurde, mit den Restriktionsenzymen BgIII, Kpnl, Smal, Sstl, Sail und mit Kombinationen von BamHI mit diesen Enzymen oder mit Xhol gewonnen wurden. Aufgeführt wird auch eine Doppelaufschließung von Bglll/Xhol.The approximate size of hybridizing fragments (kbp) recovered after digestion of DNA isolated from PG Ι-λ5 with the restriction enzymes Bglll, Kpnl, SmaI, Sstl, Sail and with combinations of BamHI with these enzymes or with XhoI were. A double digestion by Bglll / Xhol is also performed.
Eine Restriktionskarte von PGI-A5 kann aus den hybridisierenden Fragmenten aufgebaut werden, woraus geschlußfolgert werden kann, daß sich das Gen mit der Codierung für Polygalacturonase I am 8,6 kbp-BamHI-Fragment befindet.A restriction map of PGI-A5 can be constructed from the hybridizing fragments, from which it can be concluded that the gene encoding polygalacturonase I is located at the 8.6 kbp BamHI fragment.
Die relevanten EcoRI-Xba!-Fragmente der Phagen AD und AE werden in pEMBL-Vektoren eingefügt (Dente und Cortese, Ref. 10), was die Plasmide pGW1803 bzw. pGW1800 ergibt.The relevant EcoRI-Xba! Fragments of phages AD and AE are inserted into pEMBL vectors (Dente and Cortese, Ref. 10), resulting in plasmids pGW1803 and pGW1800, respectively.
Aus der Abb. 1 und dem Beispiel 3.5 wird abgeleitet, daß der Phage AD ein 2,5 kbp-EcoRI-Xbal-Fragment haben muß, das mit einem Teil des 4,1 kbp-EcoRI-Xbal-Fragmentes des Phagen AE identisch ist. Es werden 6 \ig der AD-DNA mit 60 Einheiten Xbal für die Dauer von 2 Stunden bei 37°C in einem Volumen von 200μΙ in dem von BRL empfohlenen Puffer plus RNase A (1,5mg/ml) digeriert. Dann wird die NaCI-Konzentration auf 14OmM abgestimmt, konzentrierter Reaktionspuffer wird zugesetzt, um die Volumensteigerung zu kompensieren, es werden 60 Einheiten EcoRI zugegeben, und die Inkubation wird 2,5-Stunden in einem Volumen von 230 μΙ weitergeführt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit 100μΙ Chloroform extrahiert, und die DNA wird aus der wäßrigen Phase durch den Zusatz von 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetatpuffer (pH-Wert 5,2) und 2 Volumen Ethanol ausgefällt. Nach der Inkubation bei 40C für die Dauer von 16 Stunden wird die DNA durch Zentrifugieren gewonnen, das Pellet wird an der Luft getrocknet und dann in dem gleichen Puffer aufgelöst. Die Restriktionsfragmente werden auf einer 0,6%igen, niedrigschmelzenden Agarose (BRL)-GeI in 0,5 χ TBE-Puffer, der Ethidiumbromid enthielt, getrennt. Die DNA-Fragmente werden unter UV-Licht sichtbar gemacht, und es wird eine Gel-Scheibe, die das 2,5 kbp-EcoRI-Xbal-Fragment enthält, isoliert. Phagen-AE-DNA wird mit den Restriktionsenzymen Xbal und EcoRI im wesentlichen so inkubiert, wie das oben beschrieben wurde. Nach der Extraktion mit Chloroform wird die DNA ausgefällt, durch Zentrifugieren pelletiert, in dem gleichen Puffer aufgelöst und einer Elektrophorese auf einem 0,6%igen Agarosegel in 1 x TBE-Puffer unterzogen. Es wird eine Gel-Scheibe, die das 4,1 kbp-Xbal-Eco-RI-Fragment enthält, gewonnen und bei -2O0C gelagert. Auf den Boden eines 0,5-ml-Mikrozentrifugeteströhrchens, das 60μΙ des hohen TE-Puffers (10OmM Tris-HCI, pH-Wert 8,0,1OmM EDTA) enthält, wird ein Stopfen aus silanisierter Glaswolle gegeben. Die Gel-Scheibe wird aufgetaut, in das Teströhrchen gegeben und das Röhrchen in flüssigem Stickstoff gefroren. In den Boden des kleinen Röhrchens wird ein kleines Loch gestoßen, und es wird in einFrom Fig. 1 and Example 3.5 it is deduced that the phage AD must have a 2.5 kbp EcoRI-XbaI fragment which is identical to a part of the 4.1 kbp EcoRI-XbaI fragment of phage AE , There are digested 6 \ ig of AD DNA with 60 units of Xbal for 2 hours at 37 ° C in a volume of 200μΙ in the recommended BRL buffer plus RNase A (1.5 mg / ml). Then, the NaCl concentration is adjusted to 14 oMM, concentrated reaction buffer is added to compensate for the increase in volume, 60 units of EcoRI are added, and the incubation is continued for 2.5 hours in a volume of 230 μΙ. Subsequently, the reaction mixture is extracted with 100 μΙ chloroform, and the DNA is precipitated from the aqueous phase by the addition of 0.1 volume of 3 M sodium acetate buffer (pH 5.2) and 2 volumes of ethanol. After incubation at 4 ° C. for 16 hours, the DNA is recovered by centrifugation, the pellet is air-dried and then dissolved in the same buffer. Restriction fragments are separated on a 0.6% low melting agarose (BRL) gene in 0.5 χ TBE buffer containing ethidium bromide. The DNA fragments are visualized under UV light and a gel disc containing the 2.5 kbp EcoRI-XbaI fragment is isolated. Phage AE DNA is incubated with the restriction enzymes XbaI and EcoRI essentially as described above. After extraction with chloroform, the DNA is precipitated, pelleted by centrifugation, dissolved in the same buffer, and electrophoresed on a 0.6% agarose gel in 1X TBE buffer. A gel disc containing the 4.1 kbp Xba I-Eco RI fragment is recovered and stored at -2O 0 C. To the bottom of a 0.5 ml microcentrifuge tube containing 60 μΙ of the high TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA) is added a plug of silanized glass wool. The gel disc is thawed, placed in the test tube and the tube frozen in liquid nitrogen. In the bottom of the small tube a small hole is pushed, and it gets into a
1 ,S-ml-Mikrozentrifugenteströhrchen gegeben, und der Puffer und die DNA aus der Gel-Scheibe werden durch Zentrifugieren aufgefangen. Die Reste der Gel-Scheibe werden in 50 μΙ des hohen TE-Puf fers erneut suspendiert, diese Suspension wird wieder in flüssigem Stickstoff gefroren, und der Puffer wird durch Zentrifugieren aufgefangen. Die Eluate werden dann kombiniert und mit 100μΙ Chloroform extrahiert. Die DNA wird aus der wäßrigen Phase ausgefällt, durch Zentrifugieren aufgefangen und in 40 μΙ TE-Puffer aufgelöst. Die DNA-Konzentration wird durch Agarosegelelektrophorese bestimmt, gefolgt von der Sichtbarmachung der Bande unter UV-Licht, wobei 1 μρ der mit Hindlll digerierten Lambda-DNA (BRL) als Referenz verwendet werden. Die Vektoren pEMBL18 und pEMBL19 werden durch sequentielle Aufschließung mit Xbal und EcoRI unter den vom Hersteller (BRL) empfohlenen Bedingungen hergestellt. Die Extraktion der DNA mi onol, Phenol/Chloroform (1:1) und Chloroform und die Ausfällung der DNA mit Ethanol werden so ausgeführt, wie das von Maniatis u.a. (Ref. 6) beschrieben wurde, wobei aber der Isoamylälkohol aus der Chloroformlösung weggelassen wurde und die für die Ausfällung der DNA angewendete Temperatur 40C beträgt.Add 1 .mu.L microcentrifuge tube, and the buffer and DNA from the gel disc are collected by centrifugation. The remainder of the gel disc is resuspended in 50 μL of the high TE buffer, this suspension is frozen again in liquid nitrogen, and the buffer is collected by centrifugation. The eluates are then combined and extracted with 100μΙ chloroform. The DNA is precipitated from the aqueous phase, collected by centrifugation and dissolved in 40 μM TE buffer. The DNA concentration is determined by agarose gel electrophoresis, followed by visualization of the band under UV light, using 1 μρ of the HindIII-digested lambda DNA (BRL) as a reference. The vectors pEMBL18 and pEMBL19 are prepared by sequential digestion with XbaI and EcoRI under conditions recommended by the manufacturer (BRL). The extraction of the DNA mi onol, phenol / chloroform (1: 1) and chloroform and the precipitation of the DNA with ethanol are carried out as described by Maniatis et al. (Ref 6) except omitting the isoamyl alcohol from the chloroform solution and the temperature used for the precipitation of the DNA is 4 ° C.
DNA-Fragmente werden an den jeweiligen Vektor in einem Reaktionsvolumen von 25μΙ ligiert, welches den von BRL empfohlenen Puffer plus ATP (1 mM), 1,5 Einheiten T4-DNA-Ligase (BRL), 10Ong der Vektor-DNA enthält, die auf oben beschriebene Weise hergestellt wurde, und das relevante Restriktionsfragment. Xbal und EcoRI, digeriert mit pEMBL18, werden für die Konstruktion von pGW 1800 plus einer äquimolaren Menge des gereinigten 4,1 kbp-Xbal-Fragmentes von AE verwendet. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden lang bei 160C inkubiert, dann wird die Reaktion durch den Zusatz von 125 μΙ destilliertem Wasser und Gefrieren gestoppt. Xbal· und EcoRI-digeriertes pEMBL19 wird für die Konstruktion von pGW 1803 verwendet. In diesem Fall wird die Agarose-Scheibe, welche das 2,5kbp-Xbal-EcoRI-Fragment von D enthält, bei 60°C geschmolzen, und ein Volumen von 4 μΙ, das ca. 15 ng der DNA enthält, wird zu 11 μΙ destilliertem Wasser gegeben, worauf die anderen Komponenten des Reaktionsgemische zugesetzt werden. Man läßt die Ligationsreaktion 14 Stunden bei 20cC ablaufen, dann wird eine zusätzliche Einheit T4-DNA-Ligase zugesetzt. Die Reaktion wird weitere 7 Stunden fortgesetzt, und anschließend wird die Reaktion der oben beschriebenen Weise entsprechend beendet.DNA fragments are ligated to the respective vector in a reaction volume of 25μΙ containing the BRL-recommended buffer plus ATP (1mM), 1.5 units T4 DNA ligase (BRL), 10ng of the vector DNA raised on as described above, and the relevant restriction fragment. XbaI and EcoRI digested with pEMBL18 are used for the construction of pGW 1800 plus an equimolar amount of the purified 4.1 kbp XbaI fragment from AE. The reaction mixture is incubated for 16 hours at 16 0 C, then the reaction is stopped by the addition of 125 μΙ distilled water and freezing. XbaI and EcoRI-digested pEMBL19 is used for the construction of pGW 1803. In this case, the agarose disc containing the 2.5 kbp XbaI-EcoRI fragment of D is melted at 60 ° C and a volume of 4 μM containing about 15 ng of the DNA becomes 11 μM distilled water is added, whereupon the other components of the reaction mixture are added. The ligation reaction is allowed to proceed for 14 hours at 20 ° C, then an additional unit of T4 DNA ligase is added. The reaction is continued for another 7 hours, and then the reaction is terminated as described above.
Es werden 15μΙ des resultierenden Reaktionsgemische eingesetzt, um E. coil zu transformieren, wie das im M 13-Klonierungs-/ Dideoxysequenzierungshandbuch von BRL (S.30-33; Ref. 11) beschrieben wird, wobei aber E. coil DH 5aF' und E. coll JM109 bis zu einem OD6M-Wert von 0,7 bzw. 0,9 g>. ogen werden, bevor die Kolben auf Eis gesetzt werden. Der erstgenannte Stamm wird unter Verwendung des Ligationsreaktionsgemischs mit dem Fragment von AD transformiert, der letztgenannte Stamm wird unter Einsatz des Ligationsreaktionsgemischs mit dem Fragment AE transformiert. Nach dem Wärmeschock werden die Zellen zwei Minuten auf Eis inkubiert, dann wird 1 ml LB-Medium zugesetzt, und die Zellen werden bei 37 0C eine Stunde lang inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit pelletiert, 1 ml des Überstandes wird entfernt, und die Zellen werden sanft erneut suspendiert. Dann werden die 73llen auf LB-Agarplatten plattiert, welche ΙΟΟμρ/ml Ampilicillin enthalten und aufweiche eine IPTG/X-Gallösung (= 200μΙ H20,30 μΙ Dimethylformamid, das 2% X-GaI enthält, und 20μΙ einer Lösung von 24 mg/ml IPTG in Wasser) gestrichen wurde. Die Platten werden über Nacht bei 370C inkubiert. Mehrere einzelne weiße Kolonien werden verwendet, um Übernachtkulturen in LB-Medium, das durch 0,1 % Glucose und 75μρ/(Τ)Ι Ampicillin ergänzt war, herzustellen. Diese Kulturen werden zur Plasmidisolierung verwendet, wobei die Mini-Präparationsmethode von Holmes und Quigley (Ref. 12) angewendet werden. Die Plasmide werden mit mehreren Restriktionsenzymen nach den Empfehlungen des Herstellers (BRL) und bei Anwesenheit von RNAse A (0,5 mg/ml) digeriert, und die Produkte werden auf Agarosegel analysiert. Plasmide, die zur Bildung von Xbal-EcoRI-, BamHI-EcoRI- und Hindill-Fragmenten der erwarteten Größe führen, werden ausgewählt, und die E. coll-Zellen, die sie in sich tragen, werden bei -20°C auf Glycerol gehalten.15μΙ of the resulting reaction mixture is used to transform E. coli, as described in the BRL M13 Cloning / Dideoxy Sequencing Handbook (p.30-33; ref 11), but E. coil DH 5aF 'and E. coll JM109 to an OD 6 M value of 0.7 or 0.9 g>. before the pistons are put on ice. The former strain is transformed with the fragment of AD using the ligation reaction mixture, the latter strain is transformed with the fragment AE using the ligation reaction mixture. After thermal shock, the cells are incubated on ice for two minutes, then 1 ml of LB medium is added and the cells are incubated at 37 ° C. for one hour. The cells are pelleted by low speed centrifugation, 1 ml of the supernatant is removed, and the cells are gently resuspended. The plates are then plated on LB agar plates containing ΙΟΟμρ / ml ampicillillin and blotted with an IPTG / X gall solution (= 200μΙ H 2 0.30 μΙ dimethylformamide containing 2% X-GaI and 20μΙ of a 24 mg solution / ml IPTG in water). The plates are incubated overnight at 37 ° C. Several single white colonies are used to prepare overnight cultures in LB medium supplemented with 0.1% glucose and 75μρ / (μ) Ι ampicillin. These cultures are used for plasmid isolation using the mini-preparation method of Holmes and Quigley (ref 12). The plasmids are digested with several restriction enzymes according to the manufacturer's recommendations (BRL) and in the presence of RNAse A (0.5 mg / ml), and the products are analyzed on agarose gel. Plasmids leading to the formation of XbaI-EcoRI, BamHI-EcoRI and HindIII fragments of the expected size are selected and the E. coli cells they carry are kept at -20 ° C on glycerol ,
Es werden zwei neue Plasmide konstruiert. pGW1800 ist das 4,1 kbp-Xbal-EcoRI-Fragment des Phagen AE, eingefügt in den Vektor pEMBL18. pGW1803 ist das 2,5 kbp-Xbal-EcoRI-Fragment des Phagen AD, eingefügt in den Vektor pEMBL19.Two new plasmids are constructed. pGW1800 is the 4.1 kbp XbaI-EcoRI fragment of phage AE inserted into the vector pEMBL18. pGW1803 is the 2.5 kbp XbaI-EcoRI fragment of phage AD inserted into the vector pEMBL19.
Das Verhältnis zwischen pGW 1800 und pGW 1803 wird durch erweiterte Restriktionsanalyse bestätigt. Die spezielle Sequenz, die mit den kombinierten Oligonucleotiden HR6195 und HR6196 hybridisiert, wird als ein spezieller Bereich von pGW1803 bezeichnet. Das Fehlen von Klonierungsartefakten, wie Deletionen oder Ligationen von A. nlger-abgeleiteten DNA-Fragmenten, wird durch Vergleich der Restriktionsfragmente bestimmt, die von Plasmid pGW1800 bzw. von A. nlger-N 400-DNA gewonnen wurden.The relationship between pGW 1800 and pGW 1803 is confirmed by extended restriction analysis. The particular sequence which hybridizes to the combined oligonucleotides HR6195 and HR6196 is referred to as a specific region of pGW1803. The lack of cloning artifacts, such as deletions or ligations of A. niger-derived DNA fragments, is determined by comparison of the restriction fragments derived from plasmid pGW1800 and A. niger-N 400 DNA, respectively.
pGW1800 und pGW 1803 werden im E. coll-Stamm JM109 bzw. DH5aF' vermehrt, und Plasmid-DNA wird aus 250ml Übernachkulturen in LB-Modium, das mit 0,1 % Glucose und 100μg/ml Ampicillin ergänzt wurde, gewonnen, wie das von Maniatis u.a. (S.90-91; Ref.6) beschrieben wurde, und schließlich wieder in TE-Puffer suspendiert. Da pGW 1800 auch zur Transformation von A. niger eingesetzt wird, wird es durch Bandenkennzeichnung in einem Cäsiumchloridgradienten gereinigt. Zu 2,5ml DNA-Lösung in TE werden 3,3g CsCI und 1 ml Ethidiumbromid (10mg je ml in Wasser) zugesetzt. Das Zentrifugieren erfolgt in einem Beckmane-Rotor VTi 65.2 bei 200C für die Dauer von 16 Stunden mit45000U/min. Von den beiden unter UV-Licht sichtbaren, fluoreszierenden Banden wird die untere, welche kovalent geschlossene, ringförmige Plasmid-DNA enthält, durch seitliches Punktieren des Röhrchens gewonnen. Die DNA-Lösung (etwa 1 ml) wird fünfmal mit wassergesättigtem Butanol gewaschen, um das Ethidiumbromid zu entfernen. Dann wird das Volumen mit Wasser auf 15ml gebracht, und die DNA wird durch den Zusatz von 30 ml Ethanol ausgefällt. Die DNA wird durch Zentrifugieren aufgefangen, und dann wird das Pellet einmal mit 75%igem Ethanol gewaschen und anschließend in TE-Puffer aufgelöst und bei -2O0C aufbewahrt. pGW1803 wird nicht aus einem CsCI-Gradienten isoliert, sondern einem schnelleren Verfahren unterzogen. RNase A wird 4ml DNA-Lösung bis zu einer Konzentration von 10Opg/ml zugesetzt, und dieses Gemisch wird bei 370C eine Stunde lang inkubiert und anschließend mit einem gleichen Volumen von Phenol, Phenol/Chloroform (1:1) und Chloroform extrahiert. Dann wird die DNA aus der wäßrigen Phase durch den Zusatz von 0,4ml 3M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,2 und 8ml Ethanol ausgefällt. Die DNA wird durch Zentrifugieren aufgefangen, das resultierende Pellet wird mit 75%igem Ethanol gewaschen und an der Luft getrocknet und anschließend in TE-Puffer aufgelöst.pGW1800 and pGW 1803 are propagated in E. coli strain JM109 and DH5aF ', respectively, and plasmid DNA is recovered from 250 ml overnight cultures in LB-modium supplemented with 0.1% glucose and 100 μg / ml ampicillin by Maniatis et al. (p.90-91; ref.6), and finally resuspended in TE buffer. Since pGW 1800 is also used to transform A. niger, it is purified by banding in a cesium chloride gradient. To 2.5 ml of DNA solution in TE are added 3.3 g of CsCl and 1 ml of ethidium bromide (10 mg per ml in water). The centrifugation is carried out in a Beckman e- rotor VTi 65.2 at 20 0 C for 16 hours at 45000U / min. Of the two visible under UV light, fluorescent bands, the lower, which contains covalently closed circular plasmid DNA, obtained by lateral puncturing of the tube. The DNA solution (about 1 ml) is washed five times with water-saturated butanol to remove the ethidium bromide. Then the volume is brought to 15 ml with water and the DNA is precipitated by the addition of 30 ml of ethanol. The DNA is collected by centrifugation, and then the pellet is washed once with 75% ethanol and then dissolved in TE buffer and stored at -2O 0 C. pGW1803 is not isolated from a CsCl gradient, but undergoes a faster procedure. RNase A is 4 ml DNA solution to a concentration of 10Opg / ml was added, and this mixture is incubated C for one hour at 37 0 and then with an equal volume of phenol, phenol / chloroform (1: 1) and chloroform. Then the DNA is precipitated from the aqueous phase by the addition of 0.4 ml of 3M sodium acetate buffer, pH 5.2 and 8 ml of ethanol. The DNA is collected by centrifugation, the resulting pellet is washed with 75% ethanol and air dried and then dissolved in TE buffer.
A. nlger-DNA wird nach einem Verfahren hergestellt, das gegenüber dem für die Isolierung von Pflanzen-RNA angewendeten (Slater, Ref. 21) leicht modifiziert ist. Mycel wird mit Salzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff gefroren, und 2,5g werden unter Anwendung eines Mikrodismembrationsgerätes (Braun) aufgespalten. Das Mycelpulver wird mit frisch zubereitetem Extraktionspuffiir extrahiert. Der Extraktionspuffer wird folgendermaßen hergestellt: 5m Triiosopropylnaphthalensulfonsäure (TNS, 20mg/ml) werden mit 5ml p-Aminosalicylsäure (PAS, 120mg/ml) und 2,5ml 5 x RNB-Puffer gemischt (5 x RNB enthältA. niger DNA is prepared by a method slightly modified from that used for isolation of plant RNA (Slater, Ref. 21). Mycelium is washed with saline, frozen in liquid nitrogen, and 2.5 g are split using a Mikrodismembrationsgerätes (brown). The mycelium powder is extracted with freshly prepared extraction puffiir. The extraction buffer is prepared as follows: 5m Triiosopropylnaphthalenesulfonic acid (TNS, 20mg / ml) are mixed with 5ml p-aminosalicylic acid (PAS, 120mg / ml) and 2.5ml 5x RNB buffer (5x RNB contains
121,1g Tris, 73,04g NaCI und 95,1 g EGTA in 11, pH-Wert 8,5). Nach dem Zusatz von 7,5ml Phenol wird der Extraktionspuffer 10min lang bei 550C äquilibriert. Der warme Puffer wird dann dem Mycelpulver zugesetzt, und die Suspension wird 2 min lang gemischt. Dann werden 5ml Chloroform zugesetzt, und es wird 2 min lang gemischt. Die Phasen werden durch Zentrifugieren (10 Minuten, 10000 x g) getrennt, und die wäßrige Phase wird ein weiteres Mal mit 10ml Phenol/Chloroform (1:1) und dann zweimal mit Chloroform extrahiert.121.1 g Tris, 73.04 g NaCl and 95.1 g EGTA in 11, pH 8.5). After the addition of 7.5 ml phenol, the extraction buffer is equilibrated 10 minutes at 55 0 C. The warm buffer is then added to the mycelial powder and the suspension is mixed for 2 minutes. Then 5 ml of chloroform are added and mixed for 2 minutes. The phases are separated by centrifugation (10 minutes, 10,000 xg), and the aqueous phase is extracted once more with 10 ml of phenol / chloroform (1: 1) and then twice with chloroform.
Die wäßrige Phase enthält sowohl RNA als auch DNA. Die DNA wird mit 2 Volumen Ethanol bei Zimmertemperatur ausgefällt und durch Zentrifugieren (10min, 10000 χ g) aufgefangen, zweimal durch wiederholtes Auflösen in destilliertem, sterilen Wasser und erneutes Ausfällen mit Ethanol gewaschen. RNA wird durch den Zusatz von RNase A (20Mg/ml) zur abschließenden Lösung entfernt.The aqueous phase contains both RNA and DNA. The DNA is precipitated with 2 volumes of ethanol at room temperature and collected by centrifugation (10 min, 10000 g), washed twice by repeated dissolution in distilled, sterile water and reprecipitation with ethanol. RNA is removed by the addition of RNase A (20 μg / ml) to the final solution.
Um physikalische Karten von pGW1800 und pGW1803zu konstruieren, werden verschiedene Reaktionsgemische hergestellt, welche etwa 1 Mg der Plasmid-DNA, RNase A in einer Konzentration von 1 mg/ml (nur bei pGW 1803), den von BRL empfohlenen relevanten Puffer und 10 Einheiten eines Restriktionsenzyms enthalten, wobei verschiedene Enzyme für die einzelnen Reaktionsgemische gewählt werden. In mehreren Fällen wird eine Kombination von zwei verschiedenen Enzymen gewählt, oder Plasmid-DNA wird durch ein bestimmtes Enzym oder eine Kombination von Enzymen beschränkt, gefolgt von der Ausfällung der DNA bei Anwesenheit von Natriumacetat und Ethanol und anschließende Wiederaufnahme der DNA durch Zentrifugieren, wobei dieses Material dann als Substrat für ein zweites oder drittes Restriktionsenzym verwendet wird. Die Reaktionsgemische werden bei 370C eine Stunde lang inkubiert, dann wird die Reaktion durch den Zusatz von fünffach konzentriertem Probenpuffer gestoppt, und dann werden die Reaktionsprodukte auf einem 1%igen Agarosegel in TBE-Puffer analysiert. Aus der berechneten Größe der speziellen Fragmente wird die Position der einzelnen Restriktionsenzymorte im Verhältnis zu einem Bezugspunkt, der willkürlich am eindeutigen Xbal-Ort gewählt wird, abgeleitet. Die Restriktionskarte von pGW1800wird in der Abb.2 gegeben. Die Restriktionskarte von der A. nlger-abgeleiteten DNA von pGW 1803 (nicht gezeigt) ist mit der Karte von pGW 1800 vom Xbal-Ort in der Position 1 bis zum Hincll-Ort in der Position 2000 identisch. pGW 1803 enthält jedoch keinen Bglll-Ort, der in Position 2400 in pGW1800 vorhanden ist. Das 0,4 kbp-Hincll-Bglll-Fragment von pGW1800 wies die gleiche elektrophoretische Mobilität wie das Hincll-EcoRI-Fragment von pGW1803 auf, das sich am Ende der von A. nlger abgeleiteten Einschub-DNA befindet. Es wird geschlußfolgert, daß die von A. nlger abgeleitete DNA von pGW1803 mit der von A. nlger abgeleiteten DNA von pGW 1800 zwischen dem Xbal-Ort in Position 1 und einer Stelle, die sehr dicht beim Bglll-Ort in der Position 2400 liegt, diesen aber nicht einschließt, identisch ist. Folglich stellt die abgeleitete Größe des EcoRI-Xbal-Fragmentes des Phagen XD von 2,5kbp (Beispiel 3.6) eine geringe Überschätzung dar.To construct physical maps of pGW1800 and pGW1803, various reaction mixtures are prepared containing about 1 μg of plasmid DNA, RNase A at 1 mg / ml (pGW 1803 only), BRL recommended relevant buffer, and 10 units of plasmid DNA Contain restriction enzymes, wherein different enzymes are selected for the individual reaction mixtures. In several cases, a combination of two different enzymes is chosen, or plasmid DNA is restricted by a particular enzyme or combination of enzymes, followed by precipitation of the DNA in the presence of sodium acetate and ethanol and subsequent resumption of the DNA by centrifugation Material is then used as a substrate for a second or third restriction enzyme. The reaction mixtures are incubated at 37 ° C. for one hour, then the reaction is stopped by the addition of five times concentrated sample buffer, and then the reaction products are analyzed on a 1% agarose gel in TBE buffer. From the calculated size of the specific fragments, the position of each restriction enzyme locus is derived relative to a reference point arbitrarily chosen at the unique XbaI site. The restriction map of pGW1800 is given in Fig.2. The restriction map from the A. niger-derived DNA of pGW 1803 (not shown) is identical to the map of pGW 1800 from the XbaI site in position 1 to the HincII site in position 2000. However, pGW 1803 does not contain a Bglll location that exists in position 2400 in pGW1800. The 0.4 kbp Hincll-BglII fragment of pGW1800 had the same electrophoretic mobility as the Hincll-EcoRI fragment of pGW1803 located at the end of the A. nlger-derived insert DNA. It is concluded that the A. nlger-derived DNA of pGW1803 interacts with A. nlger-derived pGW 1800 DNA between the Xbal site at position 1 and a site very close to the BglII site at 2400. but this does not include, is identical. Consequently, the deduced size of the EcoRI-XbaI fragment of the phage XD of 2.5 kbp (Example 3.6) represents a small overestimation.
Um die spezielle Sequenz zu lokalisieren, welche mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisiert, wird pGW1803-DNA beschränkt, und die resultierenden Fragmente werden in der oben beschriebenen Weise getrennt. Dann wird die DNA auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und mit den kombinierten und markierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisieren lassen, wie das oben beschrieben wurde. Die Fragmente, die mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisieren, sind ein 0,64 kbp-Hincll-Fragment in der Hincll-Aufschließung und ein 0,62 kbp-Ncol-EcoRI-Fragment in der Ncol/EcoRI-Doppelaufschließung. Es wird geschlußfolgeri, daß die spezielle Sequenz, welche mit den kombinierten Oligonucleotidgemischen HR6195 und HR6196 hybridisiert, sich zwischen dem Ncol-Ort in der Position 1750 und dem Hincll-Ort in der Position 2000 der Restriktionskarte von pGW 1803 befindet, wobei diese Koordinaten mit der gleichen Sequenz auf der Restriktionskarte von pGW1800 übereinstimmen. Das Fehlen von Klonierungsartefakten wird durch den Vergleich der Restriktionsfragmente von pGW 1800 mit den Restriktionsfragmenten ermittelt, die von A. nlger N400-DNA gewonnen wurden. Aufschließungen von pGW 1800 werden in der oben beschriebenen Weise hergestellt. Aufschließungen der chromosomalen DNA des Stammes N 400 werden bei 370C in einem Reaktionsvolumen von 200μΙ vorgenommen, das aus 2μΙ DNA, 0,5mg/ml RNase A, einem von BRL gelieferten Reaktionspuffer (REact-Puffer 2 für Xhol, Xbal, EcoRV und BgIII, REact-Puffer 4 für Kpnl und REact-Puffer 3 für EcoRI und Sail) und 90 Einheiten des jeweiligen Enzyms besteht. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden inkubiert und dann mit 100μΙ Chloroform extrahiert. Anschließend wird die ÜNA aus der wäßrigen Phase durch den Zusatz von 20μ| eines 3 M Natriumacetatpuffers, pH-Wert 5,2, und von 0,5ml Ethanol, gefolgt vom Stehenlassen auf Eis für die Dauer von 45 min, ausgefällt. Danach wird die DNA durch Zentrifugieren wiederaufgenommen und an Luft getrocknet. Die DNA wird im Probenp-jffer aufgelöst, und diese Proben und die Aufschließungen von pGW1800 und Lambda-DNA-Größenmarker werden auf ein 0,7%iges Agarosegel in TBE-Puffer gegeben. Nach der Elektrophorese wird das resultierende Muster dokumentiert, und die DNA in den Bahnen mit den Aufschließungen der chromosomalen A. niger-DNA wird auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, beides in der oben beschriebenen Art und Weise. Die Membran wird gebacken und in zwei Teile geschnitten, die mit unterschiedlichen Sonden hybridisiert werden.To locate the particular sequence which hybridizes to the combined oligonucleotide mixtures HR6195 and HR6196, pGW1803 DNA is restricted and the resulting fragments are separated in the manner described above. The DNA is then transferred to a nitrocellulose membrane and allowed to hybridize with the combined and labeled oligonucleotide mixtures HR6195 and HR6196, as described above. The fragments that hybridize with the combined oligonucleotide mixtures HR6195 and HR6196 are a 0.64 kbp Hincll fragment in Hincll digestion and a 0.62 kbp Ncol-EcoRI fragment in the Ncol / EcoRI double digest. It is concluded that the particular sequence which hybridizes to the combined oligonucleotide mixtures HR6195 and HR6196 is located between the NcoI site at position 1750 and the HincII site at position 2000 of the pGW 1803 restriction map, these coordinates coinciding with the same sequence on the restriction map of pGW1800 match. The lack of cloning artifacts is determined by comparing the restriction fragments of pGW 1800 with the restriction fragments derived from A. niger N400 DNA. Digestions of pGW 1800 are made in the manner described above. Digestions of the chromosomal DNA of strain N 400 are carried out at 37 0 C in a reaction volume of 200μΙ, which consists of 2μΙ DNA, 0.5 mg / ml RNase A, a BRL supplied reaction buffer (REACT buffer 2 for Xhol, Xbal, EcoRV and BgIII, REact buffer 4 for Kpnl and REact buffer 3 for EcoRI and Sail) and 90 units of the respective enzyme. The reaction mixture is incubated for 2 hours and then extracted with 100μΙ chloroform. Then the ÜNA from the aqueous phase by the addition of 20μ | of a 3M sodium acetate buffer, pH 5.2, and 0.5 ml of ethanol, followed by standing on ice for 45 minutes. Thereafter, the DNA is resumed by centrifugation and dried in air. The DNA is resolved in the sample buffer and these samples and the digests of pGW1800 and lambda DNA size marker are placed on a 0.7% agarose gel in TBE buffer. After electrophoresis, the resulting pattern is documented and the DNA in the lanes containing the digests of the A. niger chromosomal DNA is transferred to a nitrocellulose membrane, both in the manner described above. The membrane is baked and cut into two parts which are hybridized with different probes.
Die für die Hybridisation verwendeten Sonden sind die einer Nick-Translation unterzogenen EcoRV-Bglll-Fragmente zu 1,45kbp und 2,05kbp von pGW 1800. Die Fragmente werden vorher aus den Scheiben eines Agarosegels isoliert, wie das oben beschrieben wurde, und 100 ng der Fragmente werden in getrennten Reaktionen einer Nick-Translation unterzogen, wie das von Maniatis u.a. (S. 109-112; Ref.6) beschrieben wurde. Vor dem Zusatz zum Hybridisationsgemisch wird die der Nick-Translation unterzogene DNA 10min in einem siedenden Wasserbad denaturiert.The probes used for hybridization are the nick-translated EcoRV-BglII fragments of 1.45 kbp and 2.05 kbp of pGW 1800. The fragments are previously isolated from the slices of an agarose gel as described above and 100 ng the fragments are nick-translated in separate reactions, such as that of Maniatis et al (Pp. 109-112; ref.6). Before addition to the hybridization mixture, the nick-translated DNA is denatured for 10 min in a boiling water bath.
Dh gebackenen Nitrocellulosefilter werden in 3 x SSC benetzt und dann auf gesonderte Schalen übertragen, in denen sich 100ml vorgewärmter (680C) Hybridisationspuffer befindet, der aus 6 χ SSC, 1OmM EDTA, 0,1 mg je ml frisch zugesetzter, gescherter und denaturierter Heringssperma-DNA, 0,1 % Na4P2O7 x 10H20,0,5%SDS und 5x Denhardts (0,1 % BSA, Boehringer, Fraktion V, 0,1 % Ficoll 400, Pharmacia, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon-10, Sigma) besteht. Die Vorhybridisation erfolgt zwei Stunden lang bei 680C in einem Schüttelwasserbad, und dann wird der Hybridisationspuffer durch frischen Puffer (75ml) ersetzt, dem anschließend eine der Nick-Translation unterzogene Sonde zugesetzt wird. Man läßt die Hybridisation bei 680C wenigstens 16 Stunden weitergehen. Dann werden die Membranen bei 68°C unter Verwendung einer Reihe von vorgewärmten Puffern gewaschen, die alle 0,1 % SDS und 0,1 % Na4P2O7 χ 10H2O, aber eine abnehmende Menge SSC enthalten. Zuerst werden die Membranen in4 x SSC gespült und dann zweimal fürdie Dauer von 10min in4 x SSC gewaschen. That is baked nitrocellulose filters are wetted in 3xSSC and then transferred to separate dishes, in which 100 ml of prewarmed (68 0 C) hybridization buffer is composed of 6 χ SSC, 1OmM EDTA, 0.1 mg per ml freshly added, sheared and denatured Herring sperm DNA, 0.1% Na 4 P 2 O 7 x 10H 2 .0.5% SDS and 5x Denhardts (0.1% BSA, Boehringer, fraction V, 0.1% Ficoll 400, Pharmacia, 0, 1% polyvinylpyrrolidone-10, Sigma). The Vorhybridisation carried out for two hours at 68 0 C in a shaking water bath and then the hybridization buffer with fresh buffer (75 ml) is replaced, then is added to the one of the nick translation subjected probe. The hybridization is allowed to continue at 68 ° C. for at least 16 hours. The membranes are then washed at 68 ° C using a series of preheated buffers containing all 0.1% SDS and 0.1% Na 4 P 2 O 7 χ 10H 2 O but a decreasing amount of SSC. First, the membranes are rinsed in 4 x SSC and then washed twice in the length of 10 min in 4 x SSC.
Dann werden die Filter nacheinander für jeweils 30min in4 χ SSC, 2 χ SSC, 0,5 χ SSC, 0,2 χ SSC und 0,1 χ SSC gewaschen. Nach der letzten Waschung werden die Membranen kurz in 0,1 x SSC gespült und dann trocknen lassen, danach werden sie einem Röntgenfilm exponiert.The filters are then washed successively for 30 min in 4 χ SSC, 2 χ SSC, 0.5 χ SSC, 0.2 χ SSC and 0.1 χ SSC. After the last wash, the membranes are rinsed briefly in 0.1 x SSC and then allowed to dry, after which they are exposed to X-ray film.
Die Membran, die mit dem 1,45 kbp-EcoRV-Bglll-Fragment sondiert wird, enthält die folgenden hybridisierenden Fragmente: ein 2,4 kbp-Fragment in der Xhol-Aufschließung, ein 2,8 kbp- und ein 1,2 kbp-Fragment in der Kpnl-Aufschließung und ein 1,3The membrane probed with the 1.45 kbp EcoRV-BglII fragment contains the following hybridizing fragments: a 2.4 kbp fragment in the Xhol digest, a 2.8 kbp and a 1.2 kbp Fragment in the Kpnl resolution and a 1.3
kbp-Fragment in der Bglll/EcoRV-Doppelaufschließung. Die Membran, die mit dem 2,05 kbp-EcoRV-Bglll-Fragmeni sondiert wird, enthält die folgenden Fragmente: ein großes Fragment von etwa 11 kbp in der EcoRI/Sall-Doppelaufschließung, 2,3 kbp- und 2,1 kbp-Fragmente in der Xhol-Aufschließung, 2,3kbp- und 1,4kbp-Fragmente in der Xho/Xbal-Doppelaufschließung, 1,2kbp-Fragmente in der Kpnl-Aufschließung und ein 2,0kbp-Fragment in der EcoRV/Bglll-Doppelaufschließung. Für vier der hybridisierenden Fragmente können aus der Restriktionskarte von pGW1800 nur das Vorhandensein und eine Minimalgröße abgeleitet werden, d. h. Fragmente, die Homologie mit einer eingesetzten Sonde aufweisen, deren eines Ende aberaußerhalb der Sequenz liegt, die in pGW1800 vorhanden ist. Diese Fragmente sind im Falle der 2,05kbp-EcoRV-Bglil-Sonde die Fragmente in der EcoRI/Sall-Aufschließung, das 2,1 kbp-Fragment in der Xhol-Aufschließung und das 3,2 kbp-Fragment in der Kpnl-Aufschließung und im Falle der 1,45 kbp-EcoRI-Bglll-Sonde das 2,8 kbp-Fragment in der Kpnl-Aufschließung. Diese Fragmente sind alle kleiner als die Minimalgröße, die aus der Restriktionskarte von pGW1800 gefolgert wird. Die unterschiedlichen hybridisierenden Fragmente von genomischer A. nlger-DNA können mit Fragmenten in Korrelation gebracht werden, die In den Aufschließungen von pGW1800 vorhanden sind, und alle haben eine berechnete Größe, die der Größe sehr nahekommt, die aus der Restriktionskarte von pGW1800 hergeleitet wurde. Es wird geschlußfolgert, daß die von A. niger abgeleitete DNA von pGW 1800 eine glaubhafte Darstellung eines Teils des A. nlger-N 400-Genoms ist.kbp fragment in the Bglll / EcoRV double digest. The membrane probed with the 2.05 kbp EcoRV BglII fragment contains the following fragments: a large fragment of approximately 11 kbp in the EcoRI / Sall double digestion, 2.3 kbp and 2.1 kbp Fragments in the Xhol digest, 2.3kbp and 1.4kbp fragments in the Xho / XbaI double digest, 1.2kbp fragments in the KpnI digest, and a 2.0kbp fragment in the EcoRV / BglII double digest. For four of the hybridizing fragments, only the presence and a minimum size can be deduced from the restriction map of pGW1800, i. H. Fragments having homology with an inserted probe one end of which is outside the sequence present in pGW1800. These fragments are in the case of the 2.05 kbp EcoRV Bglil probe the fragments in the EcoRI / Sall digestion, the 2.1 kbp fragment in the Xhol digest and the 3.2 kbp fragment in the KpnI digestion and in the case of the 1.45 kbp EcoRI-BglII probe, the 2.8 kbp fragment in the KpnI digestion. These fragments are all smaller than the minimum size deduced from the pGW1800 restriction map. The different hybridizing fragments of genomic A. nlger DNA can be correlated to fragments present in the digests of pGW1800 and all have a calculated size very close to the size derived from the pGW1800 restriction map. It is concluded that the A. niger-derived pGW 1800 DNA is a plausible representation of a portion of the A. niger N 400 genome.
Das 8,6 kbp-BamHI-Restriktionsfragm6nt des Phagen PGI-X7, das mit PGII-Codierungssequenzen hybr.disiert (siehe Tabelle IV, Beispiel 3.6), wird in den pUC9-Vektor eingefügt (Vieira, J. und Messing, J., 1982, Gene 19,259-268), was die Plasmide pGW 1900 (siehe Abb.3) und pGW1901 ergibt, die den Einschub in entgegengesetzten Richtungen haben. Zu ^l5μg PGI-A7 OMA in 5μΙ TE-Puffer werden 1 μΙ Spermidin einer 10 mM Vorratslösung, 20 Einheiten BamHI, der von BRL empfohlene Reaktion^puffer und steriles, destilliertes Wasser zu einem Endvolumen von 30μΙ gegeben. Den digerierten Proben wird ein Viertel Beladungspuffer zugesetzt (Beladungspuffer = 0,25% Bromphenolblau; 0,25% Xylolcyanol und 15% Ficoll 400 in H2O). Die Reaktionsfragmente werden auf einem 0,6%igem Agarosegel in 1 χ TAE-Puffer, der Ethidiumbromid enthält, getrennt (50 x TAE-Puffer = 252g Tris, 57,1 ml Essigsäure und 100ml 0,5M EDTA, pH-Wert 8,0, je Liter).The 8.6 kbp BamHI restriction fragment of phage PGI-X7, which hybridizes with PGII coding sequences (see Table IV, Example 3.6), is inserted into the pUC9 vector (Vieira, J. and Messing, J. 1982, Gene 19, 259-268), resulting in plasmids pGW 1900 (see Fig. 3) and pGW1901, which have insertion in opposite directions. ^ L to 5 .mu.g PGI-A7 OMA 5μΙ in TE buffer 1 μΙ spermidine are added to a final volume of 30μΙ a 10 mM stock solution, 20 units of BamHI, the recommended by BRL ^ reaction buffer and sterile distilled water. A quarter of loading buffer is added to the digested samples (loading buffer = 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol and 15% Ficoll 400 in H 2 O). The reaction fragments are separated on a 0.6% agarose gel in 1 × TAE buffer containing ethidium bromide (50 × TAE buffer = 252 g Tris, 57.1 ml acetic acid and 100 ml 0.5M EDTA, pH 8, 0, per liter).
Die DNA-Fragmente werden unter UV-Licht sichtbar gemacht, und es wird eine Gelscheibe isoliert, welche das 8,6 kbp-BamHI-Fragment enthält. DNA-Fragmente werden nach herkömmlichen Methoden elektrophoretisch isoliert. Das Eluieren erfolgt bei 100V für die Dauer von einer Stunde. Die DNA wird aufgefangen und mit 2 Volumen Ethanol ausgefällt. Nach dem Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifugo für die Dauer von 30 Minuten wird die Ausfällung aufgefangen, in einem Gerät Speedvac getrocknet und in 10μΙ TE-Puffer aufgelöst. Vektor pUC9 (1 μς) wird unter Verwendung von 10 Einheiten BamHI bei 370C für die Dauervon 1,5 Stunden unter Verwendung des empfohlenen BRL-Puffers in einem Reaktionsgesamtvolumen von 20 μΙ linearisiert. Anschließend wird 1 μΙ CIP-Lösung (etwa 2 Einheiten) zugesetzt, und das Gemisch wird 30min lang bei 37"C inkubiert. Der linearisierte Vektor wird auch durch Elektrophorese präpariert. Er wird in 20μΙ TE aufgelöst, das entspricht einer DNA-Konzentration von etwa BOng/μΙ.The DNA fragments are visualized under UV light and a gel slice containing the 8.6 kbp BamHI fragment is isolated. DNA fragments are electrophoretically isolated by conventional methods. Elution is at 100V for one hour. The DNA is collected and precipitated with 2 volumes of ethanol. After centrifugation in an Eppendorf centrifugation for 30 minutes, the precipitate is collected, dried in a Speedvac instrument and dissolved in 10μΙ TE buffer. Vector pUC9 (1 μς) is linearized using 10 units of BamHI at 37 0 C for 1.5 hours under Dauervon using the recommended BRL buffer in a total reaction volume of 20 μΙ. Subsequently, 1 μΙ CIP solution (about 2 units) is added and the mixture is incubated for 30 min at 37 ° C. The linearized vector is also prepared by electrophoresis and is dissolved in 20 μΙ TE, which corresponds to a DNA concentration of approximately Bong / μΙ.
In der Ligationsreaktion werden 1 μΙ des linearisierten und ClP-behandelten pUC9-Vektors (50ng) und 4μΙ des BamHI-Fragments (etwa 100ng) mit 1,2 Einheiten T4-DNA-Ligase in einem angomessenen Ligasepuffer ligiert. Das abschließende Reaktionsvolumen beträgt 10ml. Man läßt die Reaktion 14 Stunden bei 140C ablaufen, dann wird das Gemisch mit TE auf 50 μΙ verdünnt.In the ligation reaction, 1 μΙ of the linearized and ClP-treated pUC9 vector (50ng) and 4 μΙ of the BamHI fragment (approximately 100 ng) are ligated with 1.2 units of T4 DNA ligase in an angiogenic ligase buffer. The final reaction volume is 10ml. The reaction is allowed to run for 14 hours at 14 0 C, then the mixture is diluted with TE to 50 μΙ.
Zum Transformieren von E. coil in der im M 13-Klonierungs-/Dideoxysec inzierungshandbuch von BRL (S. 30 bis 33; Ref. 11} beschriebenen Art und Weise we 'den 50 μΙ der resultierenden Ligationsreaktionsgemische eingesetzt, wobei aber E. coli-DH 5aF' auf einen OD66o-Wert von 0,5 bis 0,7 bezogen wird, bevor die Kolben auf Eis gesetzt werden. Nach dem Wärmeschock werden die Zellen zwei Minuten lang auf Eis inkubiert, dann wird 1 ml LB-Medium zugesetzt, und die Zellen werden bei 37°C eine Stunde lang inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit pelletiert, 1 ml des Überstandes wird entfernt, und die Zellen werden sanft erneut suspendiert. Dann werden die Zellen auf LB-Agarplatten plattiert, welche 1(^g/ml Ampicillin enthalten und aufweiche eine IPTG/X-Gallösung (= 200 μΙ H20,30 μΙ Dimethylformamid, das 2% X-GaI enthält, und 20μΙ einer Lösung von 24 mg/ml von IPTG in Wasser) gestrichen worden war. Die Platten wurden über Nacht bei 370C inkubiert. Mehrere einzelne weiße Kolonien werden zur Herstellung von Übernachtkulturen in LB-Medium verwendet, das mit 0,1 % Glucose und 75μς/ηιΙ Ampicillin ergänzt war. Diese Kulturen werden zur Isolierung von Plasmid unter Anwendung der Mini-Präparationsmethode von Holmes und Quigley (Ref. 12) verwendet. Die Plasmide werden mit verschiedenen Restriktionsenzymen digeriert, unter Beachtung der Empfehlungen des Herstellers (BRL) und bei Anwesenheit von RNase A (0,5 mg/ml), und die Produkte werden auf einem Agarosegel analysiert. Plasmide, welche BamHI-Fragmente der erwarteten Größe ergeben, werden ausgewählt, und die E. coll-Zellen, welche diese tragen, werden bei -20°C auf Glycerol gehalten. Die neuen Plasmide pGW 1900 (das in der Abb. 3 gezeigt wird) und pGW 1901, welche den Einschub in entgegengesetzter Richtung tragen, werden für weitere Experimente verwendet.For transforming E. coil in the manner described in the M 13 Cloning / Dideoxy Sequencing Handbook of BRL (pages 30 to 33; ref 11), we used the 50 μM of the resulting ligation reaction mixtures, but E. coli was used. DH 5aF 'is taken to an OD 66 o value of 0.5 to 0.7 before the flasks are placed on ice After heat shock, the cells are incubated on ice for two minutes then 1 ml of LB medium is added and the cells are incubated for one hour at 37 ° C. The cells are pelleted by low speed centrifugation, 1 ml of the supernatant is removed, and the cells are gently resuspended, then the cells are plated on LB agar plates, which 1 (^ g / ml ampicillin and an IPTG / X-gall solution (= 200 μΙ H 2 0.30 μΙ dimethylformamide containing 2% X-GaI and 20 μΙ of a solution of 24 mg / ml IPTG in water) The plates were dried overnight at 37 ° C Several single white colonies are used to prepare overnight cultures in LB medium supplemented with 0.1% glucose and 75 μ / I ampicillin. These cultures are used to isolate plasmid using the mini-preparation method of Holmes and Quigley (ref 12). The plasmids are digested with various restriction enzymes, following the manufacturer's recommendations (BRL) and in the presence of RNase A (0.5 mg / ml), and the products are analyzed on an agarose gel. Plasmids which give BamHI fragments of the expected size are selected and the E. coli cells carrying them are maintained at glycerol at -20 ° C. The new plasmids pGW 1900 (shown in Figure 3) and pGW 1901, which carry the insert in the opposite direction, are used for further experiments.
pGW1900 wird im E. coli-Stamm DH 5aF' vermehrt, und die Plasmid-DNA wird aus 250ml Übernachtkulturen in LB-Medium gewonnen, das mit 0,1 % Glucose und 100 pg/ml Ampicillin ergänzt wurde, wie das von Maniatis u. a. (S. 90-91; Ref. 6) beschrieben wurde, und schließlich wieder in TE-Puffer suspendiert. Da pGW1900 auch zur Transformation von A. nlger verwendet wird, wird es durch Bandenbestimmung in einem Cäsiumchloridgradienten gereinigt. Zu 2,5ml DNA-Lösng in TE werden 3,3g CsCI und 1 ml Ethidiumbromid (10mg/ml Wasser) gegeben. Das Zentrifugieren erfolgt in einem Beckmanr.®-Rotor VTi 65,2 bei 200C für die Dauervon 16 Stunden mit 45000U/min. Von den beiden unter UV-Licht sichtbaren, fluoreszenten Banden wird die untere, welche kovalent geschlossene, ringförmige Plasmid-DNA enthält, durch seitliches Punktieren des Röhrchens gewonnen. Die DNA-Lösung (etwa 1ml) wird fünfmal mit wassergesättigtem Butanol extrahiert, um das Ethidiumbromid zu entfernen. Dann wird das Volumen mit Wasser auf 15ml gebracht, und die DNA wird durch den Zusatz von 30ml Ethanol ausgefällt. Die DNA wird durch Zentrifugieren aufgefangen, und das Pellet wird einmal mit 75%igem Ethanol gewaschen und anschließend in TE-Puffor aufgelöst und bei -20°C aufbewahrt.pGW1900 is propagated in E. coli strain DH 5aF 'and the plasmid DNA is recovered from 250 ml overnight cultures in LB medium supplemented with 0.1% glucose and 100 pg / ml ampicillin, such as that of Maniatis et al. Pp. 90-91; Ref. 6), and finally resuspended in TE buffer. Since pGW1900 is also used to transform A. nlger, it is purified by banding in a cesium chloride gradient. To 2.5 ml of DNA solution in TE are added 3.3 g of CsCl and 1 ml of ethidium bromide (10 mg / ml of water). The centrifugation is performed in a Beckmanr.® rotor VTi 65.2 at 20 0 C for 16 hours Dauervon 45000U / min. Of the two visible under UV light, fluorescent bands, the lower, which contains covalently closed circular plasmid DNA, obtained by lateral puncturing of the tube. The DNA solution (about 1 ml) is extracted five times with water-saturated butanol to remove the ethidium bromide. Then the volume is brought to 15 ml with water and the DNA is precipitated by the addition of 30 ml of ethanol. The DNA is collected by centrifugation and the pellet is washed once with 75% ethanol and then dissolved in TE-Puffor and stored at -20 ° C.
Außerdem wird aus einer pGW1900-Kpnl-Aufschließung ein 2,7 kbp-Kpnl-DNA-Fragment elektrophoretisch aus einer Agaraosegel-Scheibe isoliert und in pEMBL18eingefügt(Dente und Cortese, Ref. 10), was die Plasmide pGW1902 (siehe Abb. 4) bzw. PGW1903 ergibt.In addition, from a pGW1900-KpnI digestion, a 2.7 kbp KpnI DNA fragment was electrophoretically isolated from an agarose gel slice and inserted into pEMBL18 (Dente and Cortese, ref. 10), yielding plasmids pGW1902 (see Fig. 4). or PGW1903 results.
Um eine physikalische Karte von pGW 1900 und pGW 1902 zu konstruieren, werdon verschiedene Reaktionsgemische präpariert, die etwa 1 \ig Plasmid-DNA, den relevanten, von BRL empfohlenen Puffer und 10 Einheiten eines Restriktionsenzyms oder einerAbout 1902 to construct a physical map of PGW 1900, PGW, werdon different reaction mixtures prepared, the plasmid DNA about 1 ig \, the relevant buffer as recommended by BRL and 10 units of a restriction enzyme, or
Kombination von zwei verschiedenen Restriktionsenzymen enthalten. Die Reaktionsprodukte werden auf 1%iges Agarosegel in TAE-Puffer analysiert. Aus der berechneten Größe von speziellen Fragmenten wird die Position der einzelnen Restriktionsenzymorte in den Abbildungen 3 bzw. 4 bestimmt.Combination of two different restriction enzymes included. The reaction products are analyzed on 1% agarose gel in TAE buffer. From the calculated size of specific fragments, the position of each restriction enzyme locus in Figures 3 and 4, respectively, is determined.
Die genomische DNA von A. nlger NW756 wird durch Southern-Blot-Analyse unter Verwendung des pgall-Gens von A. niger N400 (d. h., des 1,2 kbp-BamHI-Bglll-Fragmentes von pGW 1800) als Sonde analysiert. Gegenüber der Beschreibung in Beispiel 7.1 wurden zwei Modifikationen vorgenommen. In diesem Fall werden Restriktionsenzyme gewählt, weiche innerhalb der strukturellen Komponente des A. niger-N400-pgall-Gens schneiden, und die Hybridisationsbedingungen sind strenger, d.h., es gelten die im Beispiel 7.2 beschriebenen „homologen" Bedingungen. In der BamHI-Aufschlitüung wird nur ein einzelnes hybridisierendes Fragment von 3,3 kbp festgestellt. Unter diesen Hybridisationsbedingungen wird eine einzelne Sequenz festgestellt, und diese wird daher als das pgail-Gen von A. nlger NW756 definiert. Es wird ein einzelnes hybridisierendes Hincll-Fragment von 3.3 kbp beobachtet, was auf das Fehlen eines Hincll-Ortes im Strukturgen hinweist. Das hybridisierende Xhol-Bglll-Fragment ist 5,5kbp. Diese Ergebnisse stimmen nicht mit den im Beispiel 3.7 gegebenen Date η und der DNA-Sequenz von pgall von A. niger N400, die in der Sequenzaufstellung unter der SEQ ID NO. 2 gegeben wird, überein. Es wird daher geschlußfolgert, daß das pgall-Gen von A. nlger NW756 nicht mit dem pgall-Gen von A. niger N400 identisch ist.The genomic DNA of A. niger NW756 is analyzed by Southern blot analysis using the pgall gene of A. niger N400 (i.e., the 1.2 kbp BamHI-BglII fragment of pGW 1800) as a probe. Compared to the description in Example 7.1, two modifications have been made. In this case, restriction enzymes are chosen which cleave within the structural component of the A. niger N400 pgall gene, and the hybridization conditions are more stringent, ie, the "homologous" conditions described in Example 7.2 apply. In the BamHI digestion Under these conditions of hybridization, a single sequence is detected, and this is therefore defined as the pgail gene of A. niger NW756 A single Hincll hybridizing fragment of 3.3 kbp is observed. The hybridizing Xhol-BglII fragment is 5.5kbp, and these results are not consistent with the date η given in Example 3.7 and the DNA sequence of pgall from A. niger N400, the in the sequence listing under SEQ ID No. 2. It is therefore concluded that the pgall gene of A. niger NW756 does not interfere with the pgall gene n is identical to A. niger N400.
Mit geringfügigen Modifikationen wird eine Genombank von A. nlger NW756 nach der Beschreibung für den Stamm N 400 im Beispiel 2 geschaffen. Sau3Al wird anstelle des Isoschizomers Mbol zur Restriktion der Asperglllus-DNA verwendet. Die Bank des Stammes NW756 wird im Lambda-Vektor EMBL3 konstruiert, der ein enger Verwandter von EMBL4 ist (Ref. 9). EMBL3-DNA, die bereits mit BamHI und EcoRI digeriert und mit Phosphatase behandelt war, wurde von Promega bezogen. Ein Teil der resultierenden Bank wird plattiert, und es werden Plaque-Hyoridisierungen hergestellt, wie das im Beispiel 3.3 beschrieben wurde. Dann werden die Filter mit dem 1,2 kbp-BamHI-EcoRI-Fragment von pGW 1803 unter Anwendung der im Beispiel 7.2 beschriebenen homologen Bedingungen hybridisiert. Positive Phagen werden in einem wiederholten Sichtungsschritt gereinigt, und anschließend wird die DNA dieser Phagen gereinigt, wie das im Peispiel 3.4 beschrieben wurde. Die DNA wird einer Restriktionsanalyse unter Verwendung der Enzyme BgIII und Xhol unterzogen. Dann wird das 5,5 kbp-Xhol-Bglll-Fragment eines der positiven Phagen, welche dieses Fragment enthalten, in der Art und Weise isoliert, die im Beispiel 3.6 beschrieben wurde. Dieses f /agment wird dann in BamHI- und Sall-digeriertes pEMBL18 ligiert, und das resultierende Ligationsgemisch wird zur Transformation von E. coli JM109 verwendet (Beispiel 3.6). Dann werden die Transformationen durch Koloniehybridisierung unter „heterologen" Bedingungen analysiert, wie das im Beispiel 7.3 beschrieben wird. Die Plasmid-DNA eines positiven Klons wird gereinigt und anschließend zur Konstruktion einer physikalischen Karte verwendet (Beispiel 3.7). Die Restriktionskarte von pGW1756 wird in der Abb.6 gezeigt. pG\ V1756 ist das 5,5 kbp-Xhol-Bglll-Fragment, welches das A. niger-NW756-pgall-Gen, eingefügt in den Vektor pEMBL 18, enthalt.With minor modifications, a genomic library of A. nlger NW756 is created as described for strain N 400 in Example 2. Sau3Al is used instead of the isoschizomer Mbol for the restriction of Asperglllus DNA. The library of strain NW756 is constructed in the lambda vector EMBL3, which is a close relative of EMBL4 (Ref 9). EMBL3 DNA already digested with BamHI and EcoRI and treated with phosphatase was purchased from Promega. Part of the resulting library is plated and plaque hybrids are prepared as described in Example 3.3. The filters are then hybridized with the 1.2 kbp BamHI-EcoRI fragment of pGW 1803 using the homologous conditions described in Example 7.2. Positive phage are purified in a repeated screening step and then the DNA of these phages is purified as described in Example 3.4. The DNA is subjected to restriction analysis using the enzymes Bglll and Xhol. Then, the 5.5 kbp Xhol-Bgl II fragment of one of the positive phage containing this fragment is isolated in the manner described in Example 3.6. This f / agment is then ligated into BamHI and SalI digested pEMBL18, and the resulting ligation mixture is used to transform E. coli JM109 (Example 3.6). The transformations are then analyzed by colony hybridization under "heterologous" conditions, as described in Example 7.3 The plasmid DNA of a positive clone is purified and subsequently used to construct a physical map (Example 3.7) The restriction map of pGW1756 is described in U.S. Pat Figure 6. pG \ V1756 is the 5.5 kbp Xho I Bgl II fragment containing the A. niger NW756 pgall gene inserted into the pEMBL 18 vector.
sofort plattiert werden, wie das im M 13-Klonierungs-/Dideoxysequenzierungshandbuch Ji>.34; Ref. 11) von BRL beschriebenwurde. Die Isolierung der einzelsträngigen DNA-Matrizen aus den rekombinanten Phagen erfolgt nach der Beschreibung vonplated immediately, as described in the M 13 cloning / dideoxy sequencing manual Ji> .34; Ref. 11) of BRL. The isolation of the single-stranded DNA templates from the recombinant phages is carried out as described by
anschließend als eine Glycerolkultur bei -20°C aufbewahrt.then stored as a glycerol culture at -20 ° C.
ermitteln zu können. Getrennte Übernacht-Kulturen in YT-Medium werden aus E. coil JM109 und aus dem relevanten Klonhergestellt, im letzteren Fall wird ein Teil der Glycerolkultur als Inokulum verwendet.to be able to determine. Separate overnight cultures in YT medium are prepared from E. coli JM109 and from the relevant clone, in the latter case, part of the glycerol culture is used as the inoculum.
lang bei 370C in einem Orbitalschüttelapparat inkubiert. Dann werden 20ml der Übernachtkultur des relevanten Klons zugesetzt,und die Inkubation in dem Orbitalschüttelapparat wird 5 Stunden weitergeführt. Die replikative Form der DNA wird dann ausdiesen Zellen isoliert, wie das oben für pGW1803 beschrieben wurde. Diese DNA wird dann mit Hindill, Pstl, BamHI bzw. Ncoldigeriert. Die BamHI- und Ncol-digerisrte DNA wird dann mit Sail digeriert, anschließend mit Phenol/Chloroform (1:1) undlong incubated at 37 0 C in an orbital shaking apparatus. Then 20 ml of the overnight culture of the relevant clone are added and incubation in the orbital shaker is continued for 5 hours. The replicative form of DNA is then isolated from these cells as described above for pGW1803. This DNA is then digested with HindIII, PstI, BamHI or Nc. The BamHI and Ncol digested DNA is then digested with Sail followed by phenol / chloroform (1: 1) and
von 5 Einheiten T4-DNA-Polymerase (BRL) in dem von Maniatis u. a. (S. 117; Ref.6) beschriebenen Puffer und bei Anwesenheitvon jeweils 0,1 mM dCTP, d/ ΓΡ, dGTP und dTTP gefüllt. Die Reaktionsgemische mit einem Volumen von 25μΙ werden 5 Minutenlang bei 370C inkubiert, dann werden 5 μΙ 0,5 M EDTA, pH-Wert 8,0, zugesetzt, und die Gemische werden anschließend mit Phenolextrahiert. Die kleinen, in den so gewonnenen vier DNA-Präparaten vorhandenen DNA-Fragmente werden durch Elektrophoresein einem 0,7%igen, niedrigschmelzenden Agarosegel (BRL) entfernt, und Gelscheiben, die große Fragmente enthalten, v/erdenisoliert. Diese DNA-Fragmente werden anschließend unter Verwendung von T4-DNA-Ligase zirkularisiert. Die resultierendenof 5 units of T4 DNA polymerase (BRL) in the buffer described by Maniatis et al. (p. 117; ref.6) and in the presence of 0.1 mM dCTP, d / ΓΡ, dGTP and dTTP, respectively. The reaction mixtures with a volume of 25μΙ are incubated for 5 minutes at 37 0 C, then 5 μΙ 0.5 M EDTA, pH 8.0, was added and the mixtures are subsequently phenol extracted with. The small DNA fragments present in the four DNA preparations thus obtained are removed by electrophoresis in a 0.7% low melting agarose gel (BRL) and gel slices containing large fragments are isolated. These DNA fragments are then circularized using T4 DNA ligase. The resulting
verwendet.used.
u. t., Ref. 29), und die Plasmid-DNA wird anschließend auf die im Beispiel 3.8 beschriebene Weise isoliert, wobei aber allenu. t., Ref. 29), and the plasmid DNA is then isolated in the manner described in Example 3.8, but with all
dann zum Gewinnen von Subklonen verwendet, welche eine Sequenzanalyse von dem Bcll-Ort aus erlauben.then used to recover subclones allowing sequence analysis from the Bcll site.
empfohlenen Bedingungen sequenziert. In einigen Fällen werden die so ermittelten Sequenzierungsdaten für diesequenced recommended conditions. In some cases, the sequencing data thus obtained will be for the
Programmierung der Synthese spezieller Oligonucleotide nach der Methode von Caruthers (Ref. 8) verwundet. Diese Oligonucleotide sind HR 6425, das 5'Id)CAAGAACGTCACCATCGAACa' ist, HR 6439, das 5'Id)GAATTGCTCACGGTGGAGTGa' ist und HR6/40, dasProgramming the synthesis of specific oligonucleotides by the method of Caruthers (Ref. 8). These oligonucleotides are HR 6425, which is 5'Id) CAAGAACGTCACCATCGAACa ', HR 6439, which is 5'Id) GAATTGCTCACGGTGGAGTGa', and HR6 / 40, the
5'Id)ACTTGGGClTCTTCTTTCCG3' ist. Diese Oligonucleotide werden anschließend als spezieile Sequenzierungsp, imer für die relevanten Matrizen verwendet. Der Primer HR6439 ergibt zwei sich überlagernde Sequenzierungsleitern, wenn er mit M IS-Matrizen verwendet wird, und daher wird dieser Primer für die Doppelstrangsequenzierung von alkali-denaturiertem pGW 1800 nach den Anweisungen von Pharmacia verwendet.5'Id) is ACTTGGGClTCTTCTTTCCG3 '. These oligonucleotides are then used as the specific sequencing sites for the relevant templates. Primer HR6439 gives two overlapping sequencing ladders when used with M IS templates and therefore this primer is used for double-stranded sequencing of alkali-denatured pGW 1800 according to the instructions of Pharmacia.
Die Sequenz des Gens, welches PGII (pgall) codiert, die sich auf pGW1800 befindet, wird aus beiden Strängen der DNA gewonnen. Die Sequenzierung in der stromabwärts führenden Richtung (vom Xbal-Ort in der Position 1 in der Richtung des Pvull-Ortes an etwa Position 3028) erfolgt von den Orten von Xbald), EcoRV (etwa 334), Hindll) (etwa 557), Pstl (etwa 827), Bell (etwa 1056Γ, BamHI (etwa 1158), Hincll (etwa 1344 und etwa 1974), Kpnl (etwa 1565 und etwa 2706), Ncol (etwa 1749) bzw. BgIII (etwa 2379 aus, während der Primer HR 6425 zum Sequonzieren des Bereichs des Bglll-Ortes verwendet wird. Die Sequenzierung in der entgegengesetzten Richtung erfolgt von den Orten von Pvull (etwa 3028 und etwa 1442), Kpnl (etwa 2706 und etwa 1565), BgIII (etwa 2379), Hincll (etwa 1974), BamHI (etwa 1158), Bell (etwa 1056), Pstl (etwa 827), Hindill (etwa 557) bzw. EcoRV (etwa 334) aus, während die Primer HR6439 und HR644C zum Sequenzieren über die Orte von Hincll (etwa 1974) bzw. Kpnl (etwa 1565) verwendet werden.The sequence of the gene encoding PGII (pgall) located on pGW1800 is recovered from both strands of the DNA. Sequencing in the downstream direction (from the XbaI site at position 1 in the direction of the Pvull site at about position 3028) is from the sites of Xbald), Eco RV (about 334), Hind III) (about 557), PstI (about 827), Bell (about 1056Γ, BamHI (about 1158), Hincll (about 1344 and about 1974), Kpnl (about 1565 and about 2706), Ncol (about 1749) and BgIII (about 2379, respectively), while the primer Sequencing in the opposite direction occurs from the locations of Pvull (about 3028 and about 1442), Kpnl (about 2706 and about 1565), BgIII (about 2379), Hincll (see US Pat. 1974), BamHI (about 1158), Bell (about 1056), PstI (about 827), Hindill (about 557), and EcoRV (about 334), respectively, while primers HR6439 and HR644C were used for sequencing across Hincll sites (Fig. about 1974) or Kpnl (about 1565) are used.
Die Sequenz von pgall wird in der Sequenzaufstellung unter SEQ ID NO. 2 gegeben. Die Sequenz zu 3031 bp beginnt mit dem ersten Nucleotid des Xbal-Ortes an der Posi'.ion 1 in pGW1800 und endet am letzten Nucleotid des Pvull-Ortes, der in der angenäherten Kartenposition 3050 in der Restriktionskarte von pGW 1800 angegeben wird. Das pgall-Gen umfaßt 1356 Nucleotide des Promotorbereiches, 1138 Nucleotide des strukturellen Teils (einschließlich eines mutmaßlichen Introns von 52 Nucleotiden) und 537 Nucleotide des Transkriptionsterminatorbereichs.The sequence of pgall is shown in the sequence listing under SEQ ID NO. 2 given. The 3031 bp sequence begins with the first nucleotide of the XbaI site at position 1 in pGW1800 and terminates at the last nucleotide of the Pvull site, indicated in approximate map position 3050 in the pGW 1800 restriction map. The pgall gene comprises 1356 nucleotides of the promoter region, 1138 nucleotides of the structural portion (including a putative intron of 52 nucleotides) and 537 nucleotides of the transcriptional terminator region.
Die Sequenz unmittelbar unterhalb der Signalsequenz und des Xhol-Spc Hortes codiert eine Aminosäuresequenz, die vollständig mit der Sequenz übereinstimmt, die für das 5 kDa-Fragment von Polygalacturonase Il unter der Voraussetzung ermittelt wird, daß Cystein in der Position 3 vorhanden ist (Beispiel 1.3).The sequence just below the signal sequence and the XhoI-Spc Hortes encodes an amino acid sequence that is completely consistent with the sequence determined for the 5 kDa fragment of polygalacturonase II, provided that cysteine is present at position 3 (Example 1.3 ).
Die DNA-Sequenz codiert ein Leader-Peptid von 27 Aminosäuren, wobei Arginin die letzte Aminosäure vor der Sequenz des reifen Proteins ist. Dieses Leader-Peptid muß durch proteolytische Spaltung entfernt werden. Da Signalpeptidasespaltungsorte nicht unmittelbar hinter Argininresten und nicht unmittelbar hinter geladenen Aminosäuren generell gefunden werden (von Heijne; Ref. 39), wird das Leader-Peptid in wenigstens zwei proteolytischen Schritten entfernt, d. h„ das Leader-Peptid stellt eine Präpro-Sequenz dar. In diesem Fall schneidet Signalpeptidase die Präsequenz oder das Signalpeptid, während die verbleibende Prosequenz durch eine andere Protease gespalten wird.The DNA sequence encodes a leader peptide of 27 amino acids, with arginine the last amino acid before the sequence of the mature protein. This leader peptide must be removed by proteolytic cleavage. Since signal peptidase cleavage sites are not found immediately immediately behind arginine residues and not immediately behind charged amino acids (von Heijne, Ref. 39), the leader peptide is removed in at least two proteolytic steps; h "the leader peptide represents a prepro sequence. In this case, signal peptidase cleaves the pre-sequence or the signal peptide while the remaining prosequence is cleaved by another protease.
Das struktureile Polygalacturonase Il-Gen enthält ein Intron, das höchstwahrscheinlich die Nucleotidsequenz von Position 1987 bis 2038 umfaßt. Diese Sequenz enthält Terminationscodone in allen drei möglichen Leserastern. Das Vorhandensein dieses Introns verändert das Leseraster in einer Art und Weise, die mit den Proteinsequenzierungsdaten konsistent ist, die ermittelt wurden (siehe Beispiel 1). Das Leseraster vor dem Intron wird durch die Aminosäuresequenzen der Cyanogenbromidfragmente (Beispiel 1.3) bestätigt, während das Leseraster nach dem Intron durch die Aminosäuresequenz des tryptischen Peptide TP4 (Beispiel 1.5) bestätigt wird, wobei diese Sequenz auch aus der Nucleotidsequenz von Position ?183 bis 2225 abgeleitet werden kann. Der 5'-Spit;iiiungsort des Introns, GTAAGC, ähnelt der Pilz-5'-Spleißungsconsensus-Sequenz GTPuNGT, während der 3'-Spleißi!iigsort TAG vollständig mit dem Pilzconsensus-3'-Spleißungsort PyAG übereinstimmt (Ref. 41).The structurally active polygalacturonase II gene contains an intron most likely comprising the nucleotide sequence from position 1987 to 2038. This sequence contains termination codons in all three possible reading frames. The presence of this intron alters the reading frame in a manner consistent with the protein sequencing data that was determined (see Example 1). The reading frame in front of the intron is confirmed by the amino acid sequences of the cyanogen bromide fragments (Example 1.3), while the reading frame after the intron is confirmed by the amino acid sequence of the tryptic peptide TP4 (Example 1.5), this sequence also from the nucleotide sequence from position? 183 to 2225 can be derived. The 5 'site of the intron, GTAAGC, is similar to the fungal 5' splicing consensus sequence GTPuNGT, while the 3 'splice site TAG is fully aligned with the fungal consensus 3' splice site PyAG (Ref. 41).
Beispiel 4.2: Das Polygalacturonase I-Gen (pgal) von A. niger N400Example 4.2: The polygalacturonase I gene (pgal) of A. niger N400
Geeignete Restriktionsfragmente werden aus pGW1900 und pGW1902 nach Agarosegel-Elektrophorese isoliert, wie das im Beispiel 3.9 beschrieben wurde. Diese werden in die Vektoren M 13mp 18RF und M 13mp19RF nach dem M13 Klonierungs-/ Dideoxysequenzierungshandbuch von BRL (Ref. 11) ligiert. Kompetente Zellen werden hergestellt, wie das im Pharmacia-Handbuch für das M 13-Klonierungs-/Sequenzierungssystem beschrieben wurde. Die Transformation von E. coil JM101 wird so ausgeführt, wie das von Messing u.a., Ref. 30, beschrieben wurde. Die Isolierung von einzelsträngigen DNA-Matrizen aus rekombinanten Phagen erfolgt nach herkömmlichen Methoden (z.B. Ref. 11, S. 29-34). Die resultierenden Klone werden unter Verwendung des T7-Sequenzierungs™-Satzes von Pharmacia (Uppsala, Schweden) unter Anwendung der vom Hersteller empfohlenen Bedingungen sequenziert.Suitable restriction fragments are isolated from pGW1900 and pGW1902 after agarose gel electrophoresis, as described in Example 3.9. These are ligated into the M 13mp 18RF and M 13mp19RF vectors according to the BRL M13 Cloning / Dideoxy Sequencing Handbook (ref 11). Competent cells are prepared as described in the Pharmacia manual for the M13 cloning / sequencing system. The transformation of E. coil JM101 is carried out as described by Messing et al., Ref. 30. Isolation of single-stranded DNA templates from recombinant phages is accomplished by conventional methods (e.g., Ref. 11, pp. 29-34). The resulting clones are sequenced using the T7 Sequencing ™ kit from Pharmacia (Uppsala, Sweden) using the manufacturer's recommended conditions.
pGW 1900 wird vom EcoRI-Ort in der angenäherten Kartenposition 5750 bis zum Call-Ort in der angenäherten Kartenposition 3900, der sich dicht am Hindlll-Ort in der angenäherten Kartenposition 3790 befindet, sequenziert. Unter Anwendung der Methode von Caruthers (Ref. 8) werden mehrere Oligonucleotide (304-307) synthetisiert. Diese Oligonucleotide haben folgende Sequenzen:pGW 1900 is sequenced from the EcoRI site in approximate map position 5750 to the call location in approximate map position 3900, which is close to the HindIII site in approximate map position 3790. Using the method of Caruthers (reference 8), several oligonucleotides (304-307) are synthesized. These oligonucleotides have the following sequences:
Nummer304 5'(d) TTCAGCCCAA G CGTCAATCC 3'Number304 5 '(d) TTCAGCCCAA G CGTCAATCC 3'
Nummer 305 5'(d) ACCTGAACGACTTCACCATC3'Number 305 5 '(d) ACCTGAACGACTTCACCATC3'
Nummer306 5'(d) T C T G T A G G A C G T C T 6 G T T G 31 Number306 5 '(d) TCTGTAGGACGTCT 6 GTTG 3 1
Nummer307 5'(d) TGGCAGTAAAACCACCTAAC3'Number307 5 '(d) TGGCAGTAAAACCACCTAAC3'
Sie werden als spezielle Sequenzierungs-Primer für die relevanten Matrizen verwendet.They are used as special sequencing primers for the relevant templates.
Das Oligonucleotid Nr. 307 wird für die Doppelstrangsequenzierung von alkali-denaturiertem pGW 1900 nach den Anweisungen für den T7-Sequenzierungs™-Satz verwendet. Die vollständige Sequenz für das pgal-Gen wird in der Sequenzaufstellung der der SEQ ID NO. 1 gegeben. Die Sequenz basiert auf den mit beiden Strängen ermittelten Sequenzierungsdaten.Oligonucleotide # 307 is used for double-stranded sequencing of alkali-denatured pGW 1900 following the instructions for the T7 Sequencing ™ kit. The complete sequence for the pgal gene is set forth in the Sequence Listing of SEQ ID NO. 1 given. The sequence is based on the sequencing data obtained with both strands.
Die pgl-Sequenz zu 2495bp beginnt mit dem ersten Nucleotid des EcoRI-Ortes an der angenäherten Kartenposition 6280 in pGW1900 und endet 12 Nucleotide jenseits des letzten Nucleotids desClal-Ortes dicht am Hindlll-Ort, der bei 3880 angegeben ist.The 2495bp pgl sequence begins with the first nucleotide of the EcoRI site at approximate map position 6280 in pGW1900 and ends 12 nucleotides beyond the last nucleotide of the Clal site, close to the HindIII site indicated at 3880.
Die pgal-Sequenz umfaßt 909 Nucleotide des Promotorbereichs, 1218 Nucleotide des strukturellen Teils, einschließlich zwei mutmaßlicher Introns zu 52bp (Intron A) und 62 bp (Intron B), und 366 Nucleotide des Transkriptionsterminatorbereiches.The pgal sequence comprises 909 nucleotides of promoter region, 1218 nucleotides of structural portion, including two putative introns to 52bp (intron A) and 62 bp (intron B), and 366 nucleotides of the transcriptional terminator region.
Die Aminosäuresequenzen, die für die reife Polygalacturonase I (siehe Beispiel 1,4) und für das Cyanogenbromidfragment zu 21 kDa (siehe Beispiel 1.i jrmittelt wurden, stimmen vollkommen mit der Aminosäuresequenz überein, die aus der Nucleotidsequenz abgeleitet werden kann und die in Position 1003 beginnt. Die DNA-Sequenz codiert also ein Leadsr-Peptid vonThe amino acid sequences jrmittelt for mature polygalacturonase I (see Example 1.4) and for the Cyanogenbromidfragment to 21 kDa (see Example 1, i, agree perfectly with the amino acid sequence identical, which can be derived from the nucleotide sequence and the position in 1003 begins, so the DNA sequence encodes a Leadsr peptide from
31 Aminosäuren, wobei Lysin die letzte Aminosäure vor Beginn des reifen Proteins ist. Aus ähnlichen Gründen, wie sie für PGII gegeben wurden, wobei das Leader-Peptid mit einem Argininrest endet, sollt dieses PGI-Leader-Peptid eine Präprosequenz dar, die ebenfalls in wenigstens zwei proteolytischen Schritten entfernt wird31 amino acids, where lysine is the last amino acid before the beginning of the mature protein. For reasons similar to those given for PGII, where the leader peptide ends with an arginine residue, this PGI leader peptide should be a prepro sequence which is also deleted in at least two proteolytic steps
Die Sequenz, welche mit dem Oligonucleotidgemisch hybridisiert, wird als Sonde verwendet und beginnt in Position 1277 der Nucleotidsequenz. Es bosteht vollständige Übereinstimmung zwischen der N-terminalen Aminosäuresequenz, die für das Cyanogenbromidpeptidfragment zu 5,5kDa im Beispiel 1 bestimmt wurde, und der mutmaßlichen Aminosäuresequenz auf der Grundlage der Nucleotidsequenz.The sequence that hybridizes to the oligonucleotide mixture is used as a probe and begins at position 1277 of the nucleotide sequence. There is complete agreement between the N-terminal amino acid sequence determined for the 5.5 kDa cyanogen bromide peptide fragment in Example 1 and the putative amino acid sequence based on the nucleotide sequence.
Das Polygalacturonase I-Strukturgen enthält zwei Introns. Intron A umfaßt die Nucleotidsequenz von Position 1138 bis 1189. Die 5'-Spleißungsstelle GTATGT stimmt mit der Pilz-ö'-Spleißungsstellen-Consensus-Sequenz GT Pu NGT überein (Ref. 41), während die Lariatsequenz GC TAAC und die 3'-Spleißungsstelle TAG auch mit den bekannten Consensus-Sequenzen Pu CT Pu AC und Py AG übereinstimmen. Das Vorhandensein dieses Introns ändert das Leseraster auf eine Art und Weise, die mit den Proteinsequenzdaten konsistent ist, die mit dem bereits lozierten 5,5kDA-Cyanogenbromidfragment (siehe Beispiel 1) ermittelt wurden. Das zweite Intron (B) umfaßt die Nucleotidsequenz 1610 bis 1671. Sowohl die Lariatsequenz als auch der 3'-Spleißungsort stimmen mit den bekannten Consensus-Sequenzen überein. Der 5'-Spleißungsort GCACGA stimmt nicht mit der Consensus-Sequenz GT Pu GNT überein, aber GC am 5'-Spleißungsort sowie ein A in Position +6 im Verhältnis zum 5'-Spleißungsort wurden in einigen anderen Genen gefunden (Ref. 41 und 43).The polygalacturonase I structural gene contains two introns. Intron A comprises the nucleotide sequence from position 1138 to 1189. The 5 'splice site GTATGT is in agreement with the fungal δ'-splice site consensus sequence GT Pu NGT (Ref. 41), while the lariat sequence is GC TAAC and the 3' TAG cleavage site also match the known consensus sequences Pu CT Pu AC and Py AG. The presence of this intron alters the reading frame in a manner consistent with the protein sequence data obtained with the already-linked 5.5 kDa cyanogen bromide fragment (see Example 1). The second intron (B) comprises nucleotide sequence 1610 to 1671. Both the lariat sequence and the 3 'splice site are consistent with known consensus sequences. The 5 'splice site GCACGA does not match the GT Pu GNT consensus sequence, but GC at the 5' splice site and an A at +6 relative to the 5 'splice site were found in several other genes (Ref 43).
a) Es ändert das Leseraster, während in den beiden anderen Leserastern ein vorzeitiger Stopp auftritt.a) It changes the reading frame, while an early stop occurs in the two other reading frames.
b) Das Intron in pgall tritt in der gleichen Position auf, und die Aminosäuresequenz, welche diesem Intron vorausgeht, Asn-Ser-Gly-Giu, ist in beiden Proteinen identisch. Ein Bereich mit starker Homologie wird auch zwischen den Aminosäuresequenzen festgestellt, die von den Nucleotidsequenzen abgeleitet werden, die sich dem mutmaßlichen Intron unmittelbar anschließen:b) The intron in pgall occurs in the same position, and the amino acid sequence preceding this intron, Asn-Ser-Gly-Giu, is identical in both proteins. A region of strong homology is also detected between the amino acid sequences derived from the nucleotide sequences immediately following the putative intron:
PG Il Asn-Ile-Trp-Phe-Thr Gly-Gly-Thr-Cys PG I Ser-Ile-Ser-Phe-Thr Gly-Gly-Thr-CysPG Il Asn-Ile-Trp-Phe-Thr Gly-Gly-Thr-Cys PG I Ser-Ile-Ser-Phe-Thr Gly-Gly-Thr-Cys
PG Il Ile-Gly-Gly-His-Gly-Leu-Ser-Ile-Gly PG I Ser-Gly-Gly-His-Gly-Leu-Ser-Ile-Gly.PG II Ile-Gly-Gly-His-Gly-Leu-Ser-Ile-Gly PG I Ser-Gly-Gly-His-Gly-Leu-Ser-Ile-Gly.
miteinander verwandt, wie das im Beispiel 1.2 beschrieben wurde.related to each other, as described in Example 1.2.
unterscheiden, zeigt, daß ein hohes Maß an Homologie vorhanden ist. Diese Daten zoigen eindeutig, daß die Gencodierungenfür die PG eng miteinander verwandt sind und Glieder einer Polygalacturonasegenfamilie sind.show that there is a high degree of homology. These data clearly indicate that the gene coding for the PGs are closely related and are members of a polygalacturonase gene family.
Beispiel 5.1: Vermehrung und Reinigung der zur Transformation von A. niger verwendeten Plasmide Plasmid ρGW635, dos eine verkürzte Version von pGW613 ist (Goosen u.a., Ref. 13) und das auch das pyrA-Gen enthält, und Plasmid pGW 1800, welches das Polygalacturonase Il-Gen enthält, werden in E. coil MH1 bzw. JM109 vermehrt. Plasmid pGW1900 wird in E. coil DH5aF' vermehrt. Plasmid-DNA wird von 250ml Übernachtkulturen gewonnen, wie das von Maniatis u.a. (S.90-91; Ref. 6) und im Beispiel 3.7 beschrieben wurde.Example 5.1: Propagation and purification of the plasmids used for transformation of A. niger Plasmid ρGW635, which is a truncated version of pGW613 (Goosen et al, Ref. 13) and which also contains the pyrA gene, and plasmid pGW 1800, which is the polygalacturonase Il gene is propagated in E. coil MH1 and JM109, respectively. Plasmid pGW1900 is propagated in E. coil DH5aF '. Plasmid DNA is recovered from 250ml overnight cultures, such as Maniatis et al. (P.90-91, reference 6) and described in example 3.7.
Beispiel 5.2: Herstellung von Protoplasten und Transformation des urldlnauxotrophen mutanten A. niger-Stammes N 593 Der A. nlger-Stamm N 593 (cspA, pyrA), der ein Abkömmling des Elternstammes N400 ist, wurde durch positive Selektion anhand des toxischen 5-fluororotinsäureartigen Analogs in Hefe gewonnen (Boeke u.a., Ref. 14) bei Vorhandensein von Uridin, wie das von Goosen u.a. (Ref. 13) beschrieben wurde.Example 5.2: Preparation of protoplasts and transformation of the primitive auxotrophic mutant A. niger strain N 593 The A. nlger strain N 593 (cspA, pyrA), which is a derivative of the parental strain N400, was identified by positive selection on the toxic 5-fluoro-amino acid-like Analogously obtained in yeast (Boeke et al., Ref. 14) in the presence of uridine, as that of Goosen, et al (Ref. 13).
Flüssiges Minimalmedium, das mit 0,5% Hefeextrakt, 0,2% Casaminosäuren, 1OmM Uridin (Janssen Chemie) und 5OmM Glucose ergänzt ist, wird mit 106 Konidiosporen von A. niger N 593 je ml geimpft und 20 Stunden lang bei 3O0C in einem New Brunswick-Orbitalschüttelapparat inkubiert. Das Mycel wird durch Filtrieren durch Miracloth gewonnen, mit isoosmotischem Minimalmedium (STC) mit der folget den Zusammensetzung gewaschen: 1,33M Sorbitol, 1OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,5OmM CaCI2. Eine Menge von 1 g des Mycels wird in 20ml STC erneut suspendiert. Innerhalb ven 2 Stunden werden aus dem Mycel Protoplaste durch den Zusatz von 150mg filtersterilisiertem Novozym 234 (Novo Industries, Dänemark) und Inkubieren des Gemischs bei 30°C in einer Schüttelmaschine, die mit 95 U/min arbeitet, freigesetzt. Die Protoplaste werden von dem restlichen Mycel durch Filtrieren unter Verwendung eines Trichters mit einem Stöpsel aus Glaswolle getrennt. Dann wird kaltes STC bis zu einem Volumen von 40ml zugesetzt, und das Gemisch wird für die Dauer von 10min auf Eis gegeben. Die Protoplaste werden durch Zentrifugieren (10min, 2500U/min) gewonnen, und das Pellet wird wieder in 5ml STC suspendiert. Die Protoplaste werden ein weiteres Mal pelletiert und schließlich in 1 ml kaltem STC wieder suspendiert.Liquid minimal medium supplemented with 0.5% yeast extract, 0.2% casamino acids, 1OmM uridine (Janssen Chemie) and 5OmM glucose supplemented with 10 6 conidiospores of A. niger N 593 per ml inoculated and 20 hours at 3O 0 C incubated in a New Brunswick orbital shaker. The mycelium is recovered by filtration through Miracloth, washed with isoosmotic minimal medium (STC) followed by the composition: 1.33 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM CaCl 2 . An amount of 1 g of the mycelium is resuspended in 20 ml of STC. Within two hours protoplasts are released from the mycelium by the addition of 150 mg of filter-sterilized Novozym 234 (Novo Industries, Denmark) and incubating the mixture at 30 ° C in a shaker operating at 95 rpm. The protoplasts are separated from the residual mycelium by filtration using a funnel with a glass wool plug. Then cold STC is added to a volume of 40 ml and the mixture is placed on ice for 10 min. The protoplasts are recovered by centrifugation (10 min, 2500 rpm) and the pellet is resuspended in 5 ml STC. The protoplasts are pelleted once more and finally resuspended in 1 ml of cold STC.
Zur Transformation werden 5 χ 108 Protoplaste in 200μΙ aufgenommen, die dann zusammen mit 1 Mg pGW 635 und 20 pg pGW1800 oder pGW1900 inkubiert werden. Nach dem Zusatz von Plasfnid-DNA zu den Protoplasten werden 50 μΙ PCT(IOmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,50 mM CaCI2,25% PEG 6000) zugesetzt, und dieses Inkubationsgemisch wird 20min auf Eis gehalten. Dann werden weitere 2ml PCT zugesetzt, und das Gemisch wird weitere 5min bei Zimmertemperatur inkubiert. Schließlich werden 4ml STC zugesetzt und gemischt. Aliquote dieser abschließenden Transformationslösung zu 1 ml werden mit 4 ml verflüssigtem, isoosmotischem MM-Top-Agar, oas durch 0,95M Sucrose stabilisiert war, gemischt. Das Protoplastgemisch wird sofort auf Agar-Platten, welche das gleiche isoosmotische Minimalmedium enthalten, plattiert, und diese werden bei 3O0C inkubiert. ZuFor transformation, 5 χ 10 8 protoplasts are taken up in 200μΙ, which are then incubated together with 1 μg pGW 635 and 20 μg pGW1800 or pGW1900. Following the addition of plasfnid DNA to the protoplasts, 50 μM PCT (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM CaCl 2 , 25% PEG 6000) is added and this incubation mixture is kept on ice for 20 min. Then another 2 ml of PCT are added and the mixture is incubated at room temperature for a further 5 min. Finally, 4 ml of STC are added and mixed. Aliquots of this final 1 ml transformation solution are mixed with 4 ml of liquified isoosmotic MM top agar stabilized by 0.95M sucrose. The protoplast mixture is immediately plated on agar plates containing the same iso-osmotic minimal medium and these are incubated at 3O 0 C. To
den angemessenen Kontrollexperimenten gehören ähnlich behandelte Protoplaste ohne Plasmid-DNA und solche auf nichtstabilisiertem Minimalmedium mit 2,5mM Uridin.the appropriate control experiments include similarly treated protoplasts without plasmid DNA and those on non-stabilized minimal medium with 2.5 mM uridine.
Nach drei Tagen Wachstum bei 3O0C erscheinen gut wachsende Transformanten, die Sporen bilden (150 Transformanten/pg pGW635). Außerdem erscheint eine große Zahl von vermutlich abortiven Transformanten. Etwa 300 Transformanten erhält man mit pGW1800 und etwa 100 mit pGW1900. Von jedem der Transformanten mit pGW1800 und pGW1900 werden willkürlich zwanzig Kolonien herausgenommen, es werden Sporen von einzelnen Transformanten genommen und getrennt auf 5OmM-Glucose-Minimalmedium plattiert, um einzelne Kolonien zu erhalten, die ein weiteres Mal gereinigt und anschließend zur Vermehrung der Sporen für die weitere Transformantenanalyse verwendet werden.After three days of growth at 3O 0 C well growing transformants appear that form spores (150 transformants / pg pGW635). In addition, a large number of presumably abortive transformants appear. About 300 transformants are obtained with pGW1800 and about 100 with pGW1900. From each of the transformants with pGW1800 and pGW1900, twenty colonies are arbitrarily taken out, spores are taken from individual transformants and plated separately on 5OmM glucose minimal medium to obtain single colonies, which are purified once more and then multiplied for spore growth further transformant analysis can be used.
Beispiel 5.3: Selektion von polygalacturonase-überproduzlerenden Cotransformanten des A. niger-Stammes N593 durch Haloblldung auf pectlnhaltlgen, festen MedienExample 5.3: Selection of polygalacturonase overproducer cotransformants of the A. niger strain N593 by halogenation on non-porous, solid media
Etwa 200 Kolonien, die mit pGW 1800 transformiert worden waren, und etwa 100 Kolonien, die mit pG 1900 transformiert worden waren und die auf die im Beispiel 5.2 beschriebene Weise gewonnen wurden, sind auf eine Zunahme der Polygalacturonaseaktivität nach einem Koloniesichtungsverfahren ohne vorheriges Reinigen geprüft worden. Das zum Sichten verwendeto Medium setzt sich zusammen aus 2% Glucose, 0,5% Apfelpectin (34,8% Veresterungsgrad, Obipektin, Bischoffszell) Minimalmediumsalzen und Sporenelementen; 6g/l NaNO3; 0,2% Hefeextrakt; 0,2% Pepton, 0,004% Triton X-100 und 1,2% Agar. Die Petrischale wird in der Mitte geimpft und 2 Tage lang bei 30°C inkubiert. Die Kolonien werden über Nacht kalt aufbewahrt. Dann wird die Oberfläche der Platte durch Hinzufügen einer Überschicht von 5ml einer 0,05%igen Rutheniumrotlösung gefärbt, und es wird 5 min unter Schütteln inkubiert. Der ungebundene Farbstoff wird dann durch Waschen mit destilliertem Wasser für weitere 5min entfernt. Die Produktion von Polygalacturonase unter diesen Bedingungen wird durch die Größe des gebildeten Hofs angezeigt. Etw<i 50% der auf diese Weise analysierten Transformanten hat eine Polygalacturonaseaktivität, die höher als die des Wildtyps ist.About 200 colonies that had been transformed with pGW 1800 and about 100 colonies that had been transformed with pG 1900 and that were recovered in the manner described in Example 5.2 were tested for an increase in polygalacturonase activity following a colonization procedure without prior purification , The medium used for screening is composed of 2% glucose, 0.5% apple pectin (34.8% degree of esterification, obipectin, Bischoffszell) minimal medium salts and spore elements; 6 g / l NaNO 3 ; 0.2% yeast extract; 0.2% peptone, 0.004% Triton X-100 and 1.2% agar. The Petri dish is seeded in the middle and incubated for 2 days at 30 ° C. The colonies are kept cold overnight. Then, the surface of the plate is stained by adding an overcoat of 5 ml of a 0.05% ruthenium red solution, and it is incubated with shaking for 5 minutes. The unbound dye is then removed by washing with distilled water for an additional 5 minutes. The production of polygalacturonase under these conditions is indicated by the size of the court formed. Approximately 50% of the transformants analyzed in this way have a polygalacturonase activity higher than that of the wild-type.
Zwanzig Kolonien der pGW1800-Transformanten und sieben der pGW1900-Transformanten werden auf der Grundlage der Größe des Hofes, der auf pectinhaltigen, festen Medien gebildet wird, herausgenommen, und nach einer zweiten Sichtung mit diesen positiven Kolonien nach 45 Stunden Wachstum werden jeweils sechs der Transformanten abschließend herausgenommen und auf die im Beispiel 5.2 beschriebene Art und Weise gereinigt.Twenty colonies of the pGW1800 transformants and seven of the pGW1900 transformants are taken out on the basis of the size of the courtyard formed on pectin-containing solid media, and after a second sighting with these positive colonies after 45 hours of growth, six of the transformants, respectively finally removed and cleaned in the manner described in Example 5.2.
Beispiel 5.4: Genomanalyse von A. niger-Stammen, die mit Polygalacturonase Il transformiert wurden Transformanten, die nach den Beispielen 5.2 oder 5.3 gewonnen wurden, sowie der Elternwildstamm N402 werden auf einem flüssigen Minima/medium gezogen, das mit 0,5% Hefeextrakt, 0,2% Casaminosäuren, 5OmM Glucose und NaNO3 (6g/l) ergänzt war. Nach 18 Stunc'jn Wachstum bei 30°C wird die DNA extrahiert und auf das Vorhandensein von ^transformierendem Plasmid analysiert. A. nlger-DNA wird wie oben beschrieben isoliert.Example 5.4 Genome Analysis of A. niger Strains Transformed with Polygalacturonase II Transformants obtained according to Examples 5.2 or 5.3 and the parent wild strain N402 are grown on a liquid minima / medium supplemented with 0.5% yeast extract, 0.2% Casamino acids, 5OmM glucose and NaNO 3 (6g / l). After 18 hours of growth at 30 ° C, the DNA is extracted and analyzed for the presence of transforming plasmid. A. niger DNA is isolated as described above.
Aufschließungen der chromosomalen DNA (2pg) werden bei 370C in einem Reaktionsvolumen von 200μΙ ausgeführt, das aus 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 8,0,1OmM MgCI2,10OmM NaCI und 4mM Spermidin besteht, das auf einen pH-Wert von 7,5 abgestimmt wurde, wozu Tris-Base verwendet wurde, bevur es dem Reaktion.sgemisch zugesetzt wurde. Es werden 20 Einheiten sowohl von EcoRI als auch von Sail zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei 370C inkubiert, dann werden weitere 20 Einheiten der beiden Enzyme zugesetzt, und die Inkubation wird über weitere 2 Stunden fortgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch (200μΙ) mit 100μΙ Chloroform extrahiert. Die DNA wird danach aus der wäßrigen Phase durch den Zusatz von 1Ao eines 3M Natriumacetatpuffers, pH-Wert 5,2, und von 2,5 Volumen Ethanol ausgefällt. Nach einer einstündigen Inkubation bei 40C und nach der Zentrifugierung wird das DNA-Pellet luftgetrocknet und in 20 μΙ Probenpuffer ausgelöst. DNA von den Transformanten und von A. niger N402, digeriert mit EcoRI/Sall, wird durch Hybridisation der Southern-Blots in der vorstehend beschriebenen Art und Weise mit dem 1,2 kbp-BamHi/Bglll-Fragment von pGW 1800 als PGII-Sonde analysiert. Es wird eine Cotransformationshäufigksit von mehr a!s 75% ermittelt. Durch Southern-Blotting wurde eine Zahl von 9 Transformanten analysiert. Die Sonde hybridisiert mit einem großen genomischen Fragment in N402. In den genomischen Blots der Transformanten, welche pGW1800-Sequenzen enthalten, wird ein EcoRI-Sal-Einschub zu 4,1 kbp festgestellt. Die Intensität dieser Bande variiert in Abhängigkeit von der Kopienummer. In den analysierten Fällen wird das genomische Fragment, welches das Gen des Wildtyps darstellt, immer gefunden, was auf eine heterologe Integration hinweist. Die Analyse der Produktion von Polygalacturonase Il in einem A. niger-Transformanten, nachstehend als N593/pGW 1800-27 bezeichnet, wird als detailliertes Beispiel (Beispiel 6) gegeben. Aus einer DNA-Verdünnungsserie wird die Kopienummer als wenigstens in der Größenordnung von 20 geschätzt. Neben dem wildtyphybrir'isierenden Fragment und dem 4,1 kbp-Fragmont werden einige andere, kleinere hybridisierende Fragmente in diesem Stamm gefunden, welche Gronzfragmente von Integrationsereignissen Typ Il oder Umstellungen darstellen.Digests of the chromosomal DNA (2pg) are carried out at 37 0 C in a reaction volume of 200μΙ, which consists of 5OmM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM MgCl 2 , 10OmM NaCl and 4mM spermidine, which to a pH of 7.5, to which Tris base was used, before adding it to the reaction mixture. 20 units of both EcoRI and Sail are added and the reaction mixture is incubated for 2 hours at 37 ° C., then an additional 20 units of the two enzymes are added and incubation is continued for a further 2 hours. Then the reaction mixture (200μΙ) is extracted with 100μΙ chloroform. The DNA is then precipitated from the aqueous phase by the addition of 1 Ao of a 3M sodium acetate buffer, pH 5.2, and 2.5 volumes of ethanol. After a one-hour incubation at 4 0 C and after centrifugation, the DNA pellet is air-dried and released in 20 μΙ sample buffer. DNA from the transformants and A. niger N402 digested with EcoRI / SalI is prepared by hybridization of the Southern blots in the manner described above with the 1.2 kbp BamHi / BglII fragment of pGW 1800 as a PGII probe analyzed. A cotransformation abundance of more than 75% is determined. Southern blotting was used to analyze a number of 9 transformants. The probe hybridizes to a large genomic fragment in N402. In the genomic blots of the transformants containing pGW1800 sequences, a 4.1 kbp EcoRI-Sal insert is detected. The intensity of this band varies depending on the copy number. In the cases analyzed, the genomic fragment representing the wild-type gene is always found, indicating heterologous integration. Analysis of the production of polygalacturonase II in an A. niger transformant, hereinafter referred to as N593 / pGW 1800-27, is given as a detailed example (Example 6). From a series of DNA dilutions, the copy number is estimated to be at least on the order of 20. In addition to the wildtyphybric fragment and the 4.1 kbp Fragmont, several other smaller hybridizing fragments are found in this strain, which are Gronz fragments of type II integration events or rearrangements.
Beispiel 5.5: Produktion von Polygalacturonase Il durch transformierte A. nlger-Stamme und durch A. nlger N402 Zwanzig dar pGW1800-Transformanten, die im Beispiel 5.2 beschrieben wurden, und sechs der im Beispiel 5.3 beschriebenen pGW1800-Transformanten werden auf einem Medium gezogen, das aus einem Minimalsalzmedium besteht, dem Harnstoff (4,2 g/l), 1 % (Gew./Vol.) Apfelpectin (Veresterungsgrad 61,2%) und 1 % (Gew./Vol.) Weizenkleie zugesetzt werden. Die Kulturen werden 43 Stunden lang bei 30°C bei 250U/min in einem Gallenkamp-Orbitalschüttelapparat gezogen, und es werden Kulturfiltrate gewonnen. Das Mycel wird durch Filtrieren über Miracloth unter Verwendung eines Büchner-Trichters entfernt. Der Gehalt dieser Proben an PGII wird durch Western-Blotting bestimmt, das unter Anwendung der alkalischen Phosphatasenachweismethode nach den Anweisungen des Biorad-Instruktionsmanuals ausgeführt wird. Auf der Grundlage der Signale auf den Western-Blots produzierten 70% der 20 Transformanten, die willkürlich aus den im Beispiel 5.2 gewonnenen herausgegriffen wurden, wesentlich mehr Polygalacturonase Il als A. nlger N 402. Die Transformanten, die auf der Grundlage der Hofgröße unter Anwendung der Plattensichtungsmethode ermittelt wurden (siehe Beispiel 5.3), produzieren alle signifikant mehr Enzym als A. nlger N402.Example 5.5: Production of Polygalacturonase II by Transformed A. nlger Strains and by A. nlger N402 Twenty dar pGW1800 transformants described in Example 5.2 and six of the pGW1800 transformants described in Example 5.3 are grown on a medium containing from a minimum salt medium to which urea (4.2 g / l), 1% (w / v) apple pectin (degree of esterification 61.2%) and 1% (w / v) wheat bran are added. The cultures are grown for 43 hours at 30 ° C at 250 rpm in a Gallenkamp orbital shaker, and culture filtrates are recovered. The mycelium is removed by filtration through Miracloth using a Buchner funnel. The content of these samples on PGII is determined by Western blotting performed using the alkaline phosphatase detection method according to the instructions of the Biorad Instruction Manual. Based on the signals on the Western blots, 70% of the 20 transformants randomly picked from those obtained in Example 5.2 produced significantly more polygalacturonase II than A. nlger N 402. Transformants based on farm size of the plate-screening method were determined (see Example 5.3), all produce significantly more enzyme than A. nlger N402.
Der A. nlger-Stamm N 402 und drei der Transformanten, die als N 593/pGW 1800-27, N 593/pGW 1800-30 und N 593/pGW 1800-37 bezeichnet werden, werden zur Messung der Polygalacturonaseaktivität ausgewählt. Die drei letztgenannten Stämme stammen aus dem Satz von pGW1800-Transformanten, die im Beispiel 5.2 gewonnen wurden.A. nlger strain N 402 and three of the transformants designated N 593 / pGW 1800-27, N 593 / pGW 1800-30, and N 593 / pGW 1800-37 are selected for measurement of polygalacturonase activity. The latter three strains are from the set of pGW1800 transformants obtained in Example 5.2.
N 593/pGW 1800-30 und N 593/pGW 1800-37 enthalten beide mehrere Kopien von pGW 1800, aber weniger Kopien als N 593/ pGW 1800:27. Diese Stämme werden auf einem 1 %igen Pectinmedium (Veresterungsgrad 61,2 %) gezogen, dem 1 % (Gew./Vol.) getrocknete und gemahlene Zuckerrübenpulpe zugesetzt ist, wobei nach den oben beschriebenen Bedingungen gearbeitet wird.N 593 / pGW 1800-30 and N 593 / pGW 1800-37 both contain multiple copies of pGW 1800, but fewer copies than N 593 / pGW 1800 : 27. These strains are grown on a 1% pectin medium (degree of esterification 61.2%). ) to which 1% (w / v) dried and ground sugar beet pulp has been added, operating under the conditions described above.
Um reduzierende Zucker und Inhibitoren der PG-Aktivität zu entfernen, wird PGII nach der Fermentierung unter Verwendung von kreuzvernetztem Alginat partiell gereinigt. Ein Milliliter des Kulturfiltrats wird mit 1 ml von 2OmM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2, verdünnt und dann einer kleinen Säule mit einem Packungsvolumen von 2 ml kreuzvernetztem Alginat (5,2 ml/g), in diesem Puffer äquilibriert, zugesetzt. Anschließend wird die Säule mit 4ml Natriumac6tatpuffer gewaschen, und dann wird die PGII-Aktivität pulsierend aus der Säule bestimmt, wobei 4 ml voi 2OmM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2, verwendet werden, dem 1M NaCI zugesetzt wurden. Die PG-Aktivität in dem Eluat wird dann in der beschriebenen Weise bestimmt (Ref. 2), und aus dem ermittelten Wert wird die PG-Aktivität im Kulturfiltrat errechnet.To remove reducing sugars and inhibitors of PG activity, PGII is partially purified after fermentation using cross-linked alginate. One milliliter of the culture filtrate is diluted with 1 ml of 20 mM sodium acetate buffer, pH 4.2, and then added to a small column with a packing volume of 2 ml cross-linked alginate (5.2 ml / g) equilibrated in this buffer. Subsequently, the column is washed with 4 ml of sodium acetate buffer and then the PGII activity is determined pulsating out of the column using 4 ml of 20 mM sodium acetate buffer, pH 4.2, to which 1M NaCl has been added. The PG activity in the eluate is then determined in the manner described (Ref. 2), and from the value determined, the PG activity in the culture filtrate is calculated.
Die folgenden PG-Aktivitäten wurden für Kulturfiltrate berechnet, die zwanzig Stunden nach der Inokulation gewonnen wurden: 2,2,5,6,5,8 und 10,8 Einheiten/ml für die Stämme N402, N 593/pGW 1800-30, N 593/pGW 1800-37 bzw. N 593/pGW 1800-27. Für die nach vierzig Stunden gewonnenen Kulturfiltrate lauten diese Werte, in der gleichen Reihenfolge, 2,8,13,7,16,4 und 30,9 Einheiten/ml.The following PG activities were calculated for culture filtrates obtained twenty hours after inoculation: 2,2,5,6,5,8 and 10,8 units / ml for strains N402, N 593 / pGW 1800-30, N 593 / pGW 1800-37 or N 593 / pGW 1800-27. For the culture filtrates recovered after forty hours, these values are, in the same order, 2,8,13,7,16,4 and 30,9 units / ml.
Es hat also den Anschein, daß pGW1800 erfolgreich zur Transformation von A. nlger verwendet werden kann, um eine weit höhere PG-Aktivität zu erzeugen.Thus, it appears that pGW1800 can be successfully used to transform A. nlger to produce much higher PG activity.
Beispiel 5.6: Produktion von Polygalacturonase I durch transformierte A. nlger-Stämme und durch A. nlger N402 und N 593 Siebzehn der pGW1900-Transformanten, die im Beispiel 5.2 beschrieben wurden, und sechs der pGW-Transformanten, die im Beispiel 5.3 beschrieben wurden, sowie A. nlger N 402 und ein pyr+-Transformant von N 593 werden auf einem Medium gezogen, das aus einem Minimalsalzrrediurr n<?teht, dem Harnstoff (4,2g/l), 1 % (Gew./Vol.) Apfelpectin (Veresterungsgrad 61,2%), 1 % Zuckerrübenpulpe zugesetzt werden, u. j Kulturen werden 64 Stunden lang bei 30°C unter Verwendung eines Gallenkamp-Orbitalschüttelapparates, der mit 250 U/min arbeitete, gezogen und zwischendurch werden nach 20 Stunden und nach 39 Stunden Proben des Kulturfiltrats genommen. Der Gehalt dieser Proben an PGI wird wie der PGII-Gehalt im Beispiel 5.5 durch Western-Blotting untersucht.Example 5.6: Production of polygalacturonase I by transformed A. nlger strains and by A. nlger N402 and N 593 Seventeen of the pGW1900 transformants described in Example 5.2 and six of the pGW transformants described in Example 5.3. and A. nlger N 402 and a pyr transformant of N + 593 are drawn on a medium, the n from a Minimalsalzrrediurr <? TEHT, the urea (4.2 g / l), 1% (wt./vol.) apple pectin (Degree of esterification 61.2%), 1% beet pulp are added, u. Cultures are grown for 64 hours at 30 ° C using a Gallenkamp orbital shaker operating at 250 rpm and samples of the culture filtrate are taken in between 20 hours and 39 hours. The content of PGI in these samples, like the PGII content in Example 5.5, was examined by Western blotting.
Auf der Grundlage der Signale auf den Western-Blots kann festgestellt werden, daß von den 23 geprüften Transformanten 65% signifikant mehr PGI als A. nlger N402 produzieren. Die auf dor Grundlage der Hofgröße ausgewählten Transformanten erzeugen alle mehr PGI als A. nlger N 402, und vier von sechs Transformanten sind starke Produzenten. Aus Aktivitätsmessungen geht hervor, daß in diesem Medium die Aktivität nach 20 Stunden höher als nach 39 Stunden ist. Nimmt man 12 verschiedene PGI-transformierte A. niger-Stämme, variiert die Aktivität zwischen 2,8 und 7 Einheiten/ml, während der nichttransformierte Kontrollstamm N402 und ein A. nlger-N 593/pGW635-Transformant 0,5 bzw. 0,8 Einheiten/ml produzieren. Diese Aktivität ist zumindest teilweise das Ergebnis der Wj jdtyppegel für PGI und PGII, während die Steigerung bei den Transformanten das Ergebnis einer stärkeren PGI-Expression ist.Based on the signals on Western blots, it can be seen that of the 23 transformants tested, 65% produce significantly more PGI than A. niger N402. The transformants selected on the basis of yardage all produce more PGI than A. nlger N 402, and four out of six transformants are strong producers. Activity measurements indicate that in this medium the activity is higher after 20 hours than after 39 hours. Taking 12 different PGI-transformed A. niger strains, the activity varies between 2.8 and 7 units / ml, while the non-transformed control strain N402 and an A. nlger-N 593 / pGW635 transformant 0.5 and 0, respectively, 8 units / ml produce. This activity is at least in part the result of the Wj jdtyp levels for PGI and PGII, while the increase in transformants is the result of increased PGI expression.
Der A. nlger-Transformant N 593/pGW 1800-27, der im Beispiel 5.4 beschrieben wurde, wird auf Komplettmedium in Petrischalen 3 bis 4 Tage lang bei 300C gezogen, um Konidien zu produzieren. Die Konidien werden in 5ml sterile Salzlösung geerntet, die je Platte 0,005% Tween 80 enthält. Die Sporensuspension wird auf einem Griffin-Schüttelapparat 20min lang gerührt, und nach dem Zählen der Sporen werden 10* Sporen/ml in siliconisierte Erlenmeyerkolben zu 11 Fassungsvermögen, welche 300ml steriles Wachstumsmedium enthielten, gegeben. Dieses Medium ist ein Minimalmedium, das 70 mM Ammoniumchlor. J ais Stickstoffquelle und 1 % (Gew./Vol.) Apfelpectin (Veresterungsgrad 61, %) und 1 % (Gew./Vol.) Zuckerrübenpulpe als Kohlenstoffquellen onthält. Das Mycel wird 43 Stunden bei 3O0C unter Verwendung eines Gallenkamp-Orbitalschüttelapparates, der mit 200U/min arbeitete, gezogen. Nach dem Wachstum wird das Mycel durch Filtrieren durch Miracloth unter Verwendung eines Büchner-Trichters entfernt. Das Kulturfiltrat wird unter Verwendung von 1NNaOH auf einenpH-Wert von 4,2 abgestimmt. In allen weiteren Schritten wird 0,02% Natriumazid zugesetzt, um ein mikrobielles Wachstum zu verhindern.The A. nlger transformant N 593 / pGW 1800-27 described in Example 5.4 is grown on complete medium in petri dishes for 3 to 4 days at 30 ° C. to produce conidia. The conidia are harvested in 5 ml of sterile saline containing 0.005% Tween 80 per plate. The spore suspension is stirred on a Griffin shaker for 20 minutes, and after counting the spores, 10 * spores / ml are placed in 11-liter siliconized Erlenmeyer flasks containing 300 ml of sterile growth medium. This medium is a minimal medium containing 70 mM ammonium chloride. As a nitrogen source and 1% (w / v) apple pectin (degree of esterification 61,%) and 1% (w / v) of sugar beet pulp as carbon sources. The mycelium is 0 C using a Gallenkamp Orbitalschüttelapparates, who worked with 200U / min drawn 43 hours at 3O. After growth, the mycelium is removed by filtration through Miracloth using a Buchner funnel. The culture filtrate is adjusted to a pH of 4.2 using 1N NaOH. In all further steps, 0.02% sodium azide is added to prevent microbial growth.
Beispiel 6.2: Reinigung von Polygalacturonase II, die aus dem A. nlger-Transformanten N593/pGW 1800-27 gewonnen wurde Das Kulturfiltrat (ca. 2,5I) wird einer kreuzvernetzten Alginatsäule (2,5cm X 25cm) zugeführt, die mit 2OmM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2, äquilibriert worden war. Nach der Beschickung wird die Säule nacheinander mit einem Bettvolumen des Äquilibrationspuffers, einem Bettvolumen von 2OmM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 5,6, einem linearen Salzgradienten zu 1200ml (0-0,5M NaCI) im vorangegangenen Puffer und abschließend mit 275ml einer 1M NaCI-Lösung in dem gleichen Puffer eluiert. Es werden Fraktionen zu je 6ml aufgefangen und auf ihre enzymatische Aktivität geprüft, wie das im B' ,spiel 1.1 beschrieben wurde. Der mittlere Teil der aktiven Fraktionen wird zusammengefaßt und dreimal anhand eine? 2OmM bis-Tris-HCI-Puffers, pH-Wert 6,0, dialysiert. Die endgültige Enzymlösung (475ml) wird dann einer DEAE-Sepharose-Schnellflußsäule (Pharmacia) zugeführt, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Nach dem Waschen wird ein NaCI-Gradient in dem gleichen Puffer angewendet, und die Polygalacturonaseaktivität wird bei etwa 10OmM Natriumchlorid eluiert. Die aktiven Fraktionen werden durch SDS-Poiyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Diese Fraktionen, die einen hohen Gehalt an PGII haben, werden zusammengefaßt (54 ml), anhand von 2OmM bis-Tris-HCI-Puffer, pH-Wert 6,0, dialysiert und weiter auf einer Säule Mono Q (Pharmacia) gereinigt, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Nach der Beschickung wird das Enzym durch Anwendung eines Salzgradienten (0-1M NaCI) eluiert.Example 6.2: Purification of polygalacturonase II, which was obtained from the A. nlger transformant N593 / pGW 1800-27 The culture filtrate (about 2.5I) is a cross-linked alginate column (2.5 cm X 25 cm) supplied with 2OmM sodium acetate buffer , pH 4.2, had been equilibrated. After loading, the column is washed sequentially with a bed volume of the equilibration buffer, a bed volume of 20 mM sodium acetate buffer, pH 5.6, a linear salt gradient to 1200 ml (0-0.5M NaCl) in the previous buffer and finally with 275 ml of a 1M NaCl. Solution eluted in the same buffer. Fractions of 6 ml each are collected and tested for their enzymatic activity, as described in B ', game 1.1. The middle part of the active fractions is summarized and three times using a? 20 mM bis-Tris-HCl buffer, pH 6.0, dialyzed. The final enzyme solution (475 ml) is then fed to a DEAE-Sepharose fast flow column (Pharmacia) which had been equilibrated with the same buffer. After washing, a NaCl gradient is applied in the same buffer and polygalacturonase activity is eluted at about 10 mM sodium chloride. The active fractions are analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. These fractions, which have a high content of PGII, are pooled (54 ml), dialyzed using 20 mM bis-Tris-HCl buffer, pH 6.0, and further purified on a Mono Q (Pharmacia) column had been equilibrated with the same buffer. After loading, the enzyme is eluted using a salt gradient (0-1M NaCl).
Das Enzym wird willkürlich in zwei verschiedenen Pools A und B aufgefangen, die dem 0,2- bis O,26M-Teil des Natriumchloridgradienten und dem 0,26- bis O,34M-Teii des Gradienten entsprechen. Beide Fraktionen enthalten eine einzelne Proteinbande in derselben Position wie PGII, wenn sie einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen werden.The enzyme is randomly collected in two different pools A and B corresponding to the 0.2 to 0.26M part of the sodium chloride gradient and the 0.26 to 0. 34M part of the gradient. Both fractions contain a single protein band in the same position as PGII when subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
Es werden 200pg der PGII aus den kombinierten Pools A und B, die nach Beispiel 6.2 gereinigt wurden, dreimal anhand von 11 Millipore-filtriertem destillierten- Wasser dialysiert und lyophilisiert. Die Aminosäuresequenz wird so bestimmt, wie das im Beispiel 1.3 beschrieben wurde, unter Verwendung eines Gasphasenproteinsequeriziergerätes von Applied Biosystems, Modell 470A. Für das Enzym wird die folgende N-terminale Aminosäuresequenz bestimmt:200pg of PGII from combined pools A and B, which were purified according to Example 6.2, were dialysed three times from 11 millipore-filtered distilled water and lyophilized. The amino acid sequence is determined as described in Example 1.3 using an Applied Biosystems Model 470A gas phase protein sequencer. For the enzyme, the following N-terminal amino acid sequence is determined:
Position: 1 5 10Position: 1 5 10
Aminosäure: aps-ser-X-thr-thr-phe-thr-ala-ala-ala-Position: 15 20Amino acid: aps-ser-X-thr-thr-phe-thr ala-ala-ala position: 15 20
Aminosäure: ala-lys-ala-gly-lys-ala-lys-X-ser-thr-ileAmino acid: ala-lys-ala-gly-lys-ala-lys-X-ser-thrile
Die Cysteinreste im Protein wurden nicht modifiziert und werden daher nicht festgestellt. Es ist wahrscheinlich, daß sie in der Position 3 (X) und in der Position 18 (X) der Sequenzen auftreten (siehe Beispiel 1.3). Die drei letzten Aminosäurereste werden nur auf niedrigem Pegel festgestellt. Die für dieses reine Enzym ermittelte Sequenz entspricht genau der Aminosäuresequenz des N-Tecminus von PGII, die aus der Nucleotidsequenz des PGII-Gens abgeleitet wurde (siehe Beispiel 4 und Abb.4, Formel II). Die entsprechende Nucleotidsequenz zeigt auch Cysteinreste in den erwarteten Positionen, d.h. bei den Resten 3 und 18. Diese Sequenz entspricht auch der Sequenz, die für das Cyanogenbromidfragment zu 5kDa bestimmt wurde (siehe Beispiel 1.3), und sie entspricht folglich dem N-Terminus von Protein.The cysteine residues in the protein have not been modified and therefore are not detected. They are likely to occur at position 3 (X) and at position 18 (X) of the sequences (see Example 1.3). The last three amino acid residues are detected only at low level. The sequence determined for this pure enzyme corresponds exactly to the amino acid sequence of the N-Tecminus of PGII derived from the nucleotide sequence of the PGII gene (see Example 4 and Fig. 4, Formula II). The corresponding nucleotide sequence also shows cysteine residues in the expected positions, i. at residues 3 and 18. This sequence also corresponds to the sequence determined for the cyanogen bromide fragment at 5kDa (see Example 1.3) and thus corresponds to the N-terminus of protein.
Beispiel 6.4: Eigenschaften von Polygalacturonase II, die aus dem Transformanten N593/pGW 1800-27 gereinigt wurdo Dar Enzym, das nach Beispiel 6.2 gereinigt wurde, wurde mit dem Enzym verglichen, das aus Rapidase gereinigt wurde, wie das im b ispiel 1.1 beschrieben wurde. Beide Enzyme haben eine identische scheinbare Molekulmasse von 38kDa auf SDS-Polyatrylamidgelen, und sie reagieren identisch mit polyklonalen Antikörpern, die anhand von PGII gezogen wurden. Ein monoklonaler Antikörper, der nur mit einem kontinuierlichen Epitop von PGII, nicht aber mit PGI, IHA, HIB oder IV reagiert, reagiert auch mit dem nach Beispiel 5.2 gereinigten Enzym. Bei der isoelektrischen Fokussierung weist die nach den Beispielen 6.1 und 6.2 produzierte und gereinigte PGII eine scharfe Bande bei einem pl-Wert auf, der mit dem von PGII identisch ist (pl = 5,2). Auf Grund der Mikroheterogenität von PGII wurde eine Reihe anderer Banden mit niedrigeren pl-Werten beobachtet, wenn mit einem pH-Wert-Gradienten von pH-Wert 3 bis 7 oder von pH-Wert 3-10 gearbeitet wurde. Ähnliche Muster erhält man bei der Verwendung von PGII, die nach Beispiel 6.1 hergestellt worden war.Example 6.4 Properties of Polygalacturonase II Purified from Transformant N593 / pGW 1800-27 The enzyme purified according to Example 6.2 was compared with the enzyme purified from Rapidase as described in Example 1.1 , Both enzymes have an apparent molecular mass of 38kDa on SDS-polyatrylamide gels, and they react identically with polyclonal antibodies raised by PGII. A monoclonal antibody which reacts only with a continuous epitope of PGII, but not with PGI, IHA, HIB or IV, also reacts with the enzyme purified according to Example 5.2. In isoelectric focusing, the PGII produced and purified according to Examples 6.1 and 6.2 has a sharp band at a pI value identical to PGII (pI = 5.2). Due to the microheterogeneity of PGII, a number of other bands with lower pI values were observed when operating with a pH gradient of pH 3 to 7 or of pH 3-10. Similar patterns are obtained using PGII prepared according to Example 6.1.
DNA wird aus A. nlger NW756 unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens isoliert. Die DNA wird mit den Enzymen BamHI, EcoRI und der Kombination dieser Enzyme beschränkt, wie das im Beispiel 5.4 beschrieben wurde. Die DNA-Fragmente werden dann auf einem 0,6%igen Agarose-Gel getrennt, und sie werden anschließend auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, wie das im Beispiel 3.7 beschrieben wurde. Die gebackene Membran wird 2 Stunden lang bei 60°C in einem vorgewärmten Hybridisationspuffer vorhybridisiert, der aus 1 % BSA (Boehringer), 1 mM EDTA, 0,5 M Natriumphosphat, pH-Wert 7,2 (zugesetzt aus einem Vorrat von 1M, der aus 89,0g Na2HPO4 2H2O und 4ml von 85%iger H3PO4 je Liter zusammengesetzt ist) und 7% SDS besteht, wie das von Church und Gilbert (Ref. 38) beschrieben wird, und dem gescherte und denaturierte Heringssperma-DNA bis zu einer Konzentration von 0,1 mg/ml zugesetzt wurde. Das einer Nick-Translation unterzogene 1,2kbp-BamHI-Bglll-Fragmentvon pGW1800, das wie im Beispiel 3.7 hergestellt wurde, wird dann zugesetzt, und man läßt die Hybridisation untersanftem Schütteln 44 Stunden lang bei 600C weitergehen. Dann wird die Membran zweimal mit vorgewärmten (60°C) Hybridisationspuffer (ohne Heringssperma-DNA) für 10min gewaschen. Anschließend wird die Membran zweimal 20min bei 6O0C in einem vorgewärmten Puffer gewaschen, der aus 5x SSC, 0,1 % SDS und 0,1 % Na4P2O7 10H2O besteht. Dann wird die Membran getrocknet und 3 Tage lang bei -600C einem Kodak-Film XAR5 ausgesetzt. Unter diesen Bedingungen wird keine unspezifische Hybridisation beobachtet, was sich aus dem Fehlen eines signifikanten Ausstrichpräparats an hybridisierenden DNA-Fragmenten und außerdem aus dem Fehlen der Hybridisation der Sonde mit Lambda-Größenmarkern ergibt. In jeder Bahn werden mehrere hybridisierende Banden beobachtet, wobei in jeder Bahn eine Bande intensiver als die anderen Banden ist. Diese intensiven Banden stimmen mit dem 3,3kbp-Fragment in der BamHI-Aufschließung, einem größeren Fragment als 20kbp in der EcoRI-Aufschließung und einem 3,3kbp-Fragment in der BamHI/ EcoRI-Doppelaufschließung überein. Die Banden mit der geringeren Intensität stimmten mit den Fragmenten von 17,9,5,6,4 und 2,0 kbp in der BamHI-Aufschließung, den Fragmenten von 15,12,65 und 4,8 kbp in der EcoRI-Aufschließung und den Fragmenten von 7,6,6,4,4,0,3,7 und 2,0kbp in der BamHI/EcoRI-Doppelaufschließung überein.DNA is isolated from A. niger NW756 using the method described above. The DNA is restricted with the enzymes BamHI, EcoRI and the combination of these enzymes, as described in Example 5.4. The DNA fragments are then separated on a 0.6% agarose gel and then transferred to a nitrocellulose membrane as described in Example 3.7. The baked membrane is prehybridized for 2 hours at 60 ° C in a preheated hybridization buffer consisting of 1% BSA (Boehringer), 1 mM EDTA, 0.5 M sodium phosphate, pH 7.2 (added from a stock of 1M, composed of 89.0g Na 2 HPO 4 2H 2 O and 4ml of 85% H 3 PO 4 per liter) and 7% SDS as described by Church and Gilbert (ref 38) and sheared and denatured herring sperm DNA was added to a concentration of 0.1 mg / ml. The nick translated subjected 1,2kbp-BamHI-BglII fragment of pGW1800, which was prepared as in Example 3.7 is then added and allowed to hybridization untersanftem shaking for 44 hours at 60 0 C to continue. Then the membrane is washed twice with prewarmed (60 ° C) hybridization buffer (without herring sperm DNA) for 10 min. The membrane is then washed twice 20 min at 6O 0 C in a preheated buffer consisting of 5X SSC, 0.1% SDS and 0.1% Na 4 P 2 O 7 10H 2 O. The membrane is then dried and exposed for 3 days at -60 0 C to Kodak XAR5 film. Nonspecific hybridization is not observed under these conditions, which results from the lack of a significant smear specimen on hybridizing DNA fragments, and also from the lack of hybridization of the probe with lambda size markers. In each lane, several hybridizing bands are observed, with one band more intense in each lane than the other bands. These intense bands are consistent with the 3.3kbp fragment in the BamHI digest, a larger fragment than 20kbp in the EcoRI digest and a 3.3kbp fragment in the BamHI / EcoRI double digest. The lower intensity bands matched the 17,9,5,6,4 and 2,0 kbp fragments in the BamHI digest, the fragments of 15,12,65 and 4,8 kbp in EcoRI digestion and the fragments of 7,6,6,4,4,0,3,7 and 2,0kbp in the BamHI / EcoRI double digestion.
Aus der Tatsache, daß spezielle Hybridisationssignale beobachtet werden, ergibt sich, daß das PGII-Gen von A. nlger N400 verwendet werden kann, um spezielle Sequenzen in der DNA nachzuweisen, die von A. niger NW756 gewonnen wurde. Es wird angenommen, daß die Fragmente, welche starke Hybridisationssignale ergeben, das PGII-Gen tragen. Im Prinzip kann sich ein schwach hybridisierendes Fragment herausbilden, wenn ein Restriktionsenzym die DNA innerhalb und in der Nähe des Endes des Bereichs schneidet, der mit der verwendeten Sonde homolog ist. Das kann jedoch nicht vollständig die Anzahl der hybridisierenden großen Fragmente erklären, die im vorliegenden Beispiel beobachtet werden. Daraus ergibt sich, daß spezielle DNA-Sequenzen nachgewiesen wurden, die Homologie mit dem PGII-Gen aufweisen, aber nicht mit diesem identisch sind. Es wird angenommen, daß diese DNA-Sequenzen unterschiedliche PG-Gene sind, was mit der Tatsache übereinstimmt, daß Polygalacturonasen Homologie beim Proteinpegel aufweisen (siehe Beispiel 1.4).From the fact that specific hybridization signals are observed, it follows that the PGII gene of A. niger N400 can be used to detect specific sequences in the DNA recovered from A. niger NW756. It is believed that the fragments which give strong hybridization signals carry the PGII gene. In principle, a weakly hybridizing fragment may form when a restriction enzyme cuts the DNA within and near the end of the region homologous with the probe used. However, this can not fully explain the number of hybridizing large fragments observed in the present example. As a result, specific DNA sequences have been detected that are homologous with, but not identical to, the PGII gene. It is believed that these DNA sequences are distinct PG genes, consistent with the fact that polygalacturonases have protein level homology (see Example 1.4).
Unter Verwendung von E. coli LE?92 werden etwa 1 χ 10* Phagen von der A. nigar-N400-Bank auf 5 Platten plattiert, und von jeder Platte werden drei Nitrocellulose-Replikate gemacht, wie das im Beispiel 3.4 beschrieben wurde, wobei der dritte Filter oben auf einer Platte 5min inkubiert wird. Der erste und der zweite Filter jeder Platte werden unter Bedingungen behandelt, die als „hetarolog" bezeichnet werden.Using E. coli LE 92, approximately 1 × 10 phage from the A. nigar N400 library are plated on 5 plates, and from each plate are made three nitrocellulose replicates as described in Example 3.4 the third filter is incubated on top of a plate for 5min. The first and second filters of each plate are treated under conditions called "hetarolog".
Der dritte Filter wird strengen Bedingungen unterzogen, die als „homolog" bezeichnet werden. Vorhybridisierung, Hybridisierung und Waschen der Filter werden bei 6O0C unter heterologen Bedingungen und bei 680C unter homologen Bedingungen ausgeführt. Nach dem Backen werden die Filter in 3x SSC benetzt und dann zwei Stunden lang in vorgewärmtem Hybridisationspuffer vorhybridisiert, der aus 10x Denhardt's (siehe Beispiel 3.4), 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,2OmM EDTA, pH-Wert 8,0,1M NaCI, 0,5% SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat besteht, dem 0,1 mg/ml gescherte und denaturierte Heringssperma-DNA frisch zugesetzt werden. Die Filter werden dann einzeln in einen Kolben übertragen, der 50 mlThe third filter is subjected to severe conditions, are referred to as "homologous". Prehybridization, hybridization and washing of the filters are performed at 6O 0 C under heterologous conditions and at 68 0 C under homologous conditions After baking, the filters in 3X SSC be. and then prehybridized for two hours in preheated hybridization buffer consisting of 10x Denhardt's (see Example 3.4), 50 mM Tris-HCl, pH 7.5.2 mM EDTA, pH 8.0, 1M NaCl, 0.5% SDS and 0.1% sodium pyrophosphate, to which 0.1 mg / ml sheared and denatured herring sperm DNA are added fresh, and the filters are then individually transferred to a flask containing 50 ml
Hybridisationspuffer, einschließlich Heringssperma-DNA, enthält, welchem vorher das der Nick-Translation unterzogene BamHI-Bglll-Fragment zu 1,2 kbp von pGW 1800 zugesetzt worden war. Man läßt die Hybridisation weitere 40 Stunden ablaufen, und anschließend werden die Filter unter homologen oder heterologen Bedingungen gewaschen. Folgendes sind die homologen Waschbedingungen: Die Filter werden zweimal eine halbe Stunde in 2x SSC, 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat und anschließend zweimal eine halbe Stunde in 0,2x SSC, 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat gewaschen. Folgendes sind die heterologen Bedingungen: Die Filter werden zweimal eine halbe Stunde in Hybridisationspuffer, dann eine halbe Stunde in 4x SSC, 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat und abschließend in 2x SSC, 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat gewaschen. Die Filter werden an Luft getrocknet und 3 Tage lang bei -60°C unter Verwendung intensivierender Schirme einem Kodak-Film XAR 5 exponiert. Die Phagen, welche positive Signale geben, werden wie im Beispiel 3.4 gewonnen.Hybridization buffer, including herring sperm DNA, to which was previously added the nick-translated BamHI-BglII fragment to 1.2 kbp of pGW 1800. The hybridization is allowed to proceed for an additional 40 hours and then the filters are washed under homologous or heterologous conditions. The following are the homologous wash conditions: The filters are washed twice in 2x SSC, 0.1% SDS, and 0.1% sodium pyrophosphate for two and a half hours, and then in 0.2x SSC, 0.1% SDS, and 0.1% twice for half an hour. Sodium pyrophosphate washed. The following are the heterologous conditions: The filters are incubated twice for half an hour in hybridization buffer, then for half an hour in 4x SSC, 0.1% SDS and 0.1% sodium pyrophosphate and finally in 2x SSC, 0.1% SDS and 0.1 % Sodium pyrophosphate washed. The filters are air dried and exposed to Kodak film XAR 5 for 3 days at -60 ° C using intensifying screens. The phages which give positive signals are obtained as in example 3.4.
Auf den Filtern, die den homologen Bedingungen ausgesetzt waren, wurden 7 positive Signale armittelt, die auch an den entsprechenden Positionen auf Filtern vorhanden sind, die heterologen Bedingungen ausgesetzt waren. Diese Signale werden als das Ergebnis von rekombinanten Lambda-Phagen, welche das PGII-Gen tragen, betrachtet. Von diesen Signalen abgesehen, wurden auf den Filtern, die heterologen Bedingungen ausgesetzt waren, 30 positive Signale gewonnen, und diese Signale sind in der entsprechenden Position auf beiden Filtern vorhanden. Die Signalstärke ist bei diesen 30 Signalen unterschiedlich. Die Mehrzahl dieser Signale wird als das Ergebnis von Phagen betrachtet, welche ein von PGIi-Gen verschiedenes PG-Gen enthalten.On the filters exposed to the homologous conditions, 7 positive signals were detected, which are also present at the corresponding positions on filters exposed to heterologous conditions. These signals are considered to be the result of recombinant lambda phage carrying the PGII gene. Apart from these signals, 30 positive signals were obtained on the filters exposed to heterologous conditions, and these signals are present in the corresponding position on both filters. The signal strength is different for these 30 signals. The majority of these signals are considered to be the result of phage containing a PG gene other than PGIi gene.
Die A. nlger-N 400-Genombank wird ein zweites Mal gesichtet. In der oben beschriebenen Weise werden Plaque-Lifts ausgeführt. Von der Temperatur abgesehen, wird die Hybridisation in der oben beschriebene Art und Weise ausgeführt. Hybridisation und Waschen erfolgen bei einem dor beiden von einer Platte gewonnenen Filter bei 620C, während der andere Filter bei 68"C hybridisiert und gewaschen wird. Nach dem Hybridisieren werden die Filter unter starken SSC-Bedingungen (HSSC-Bedingungen) bei 620C bzw. bei 68°C gewaschen. Folgendes sind die HSSC-Bedingungen: Die Filter werden zweimal 5 Minuten lang in 4x SSC gewaschen, dann werden die Filter zweimal eine halbe Stunde lang in 4x SSC und anschließend zweimal eine halbe Stunde lang in 2x SSC gewaschen, wobei die verwendeten SSC-Lösungen auch 0,1 % SDS und 0,1 % Natriumpyrophosphat enthalten.The A. nlger N 400 genomic library is spotted a second time. Plaque lifts are performed in the manner described above. Apart from the temperature, the hybridization is carried out in the manner described above. Hybridization and washing carried out at a dor both obtained from a disk filters at 62 0 C, while the other filters at 68 "C hybridized and washed. After hybridization, the filters under strong SSC conditions (HSSC) conditions are at 62 0 C or washed at 68 ° C. The following are the HSSC conditions: The filters are washed twice in 5X SSC for 5 minutes, then the filters are washed twice in 2x SSC for half an hour and then in 2x SSC for two and a half hours The SSC solutions used also contain 0.1% SDS and 0.1% sodium pyrophosphate.
Auf den bei 68 0C inkubierten Filtern („homologe" Hybridisationsbedingungen) wurden fünf starke, positive Signale ermittelt, die auch in der entsprechenden Position auf den bei 620C inkubierten Filtern vorhanden sind. Die Restriktionsanalyse eines dieser Phagen nach Beispiel 3.5 zeigt, daß dieser Phage einen Einschub enthält, auf dem sich das Gen mit der Codierung für PGII (pgall) befindet. Es wird daher davon ausgegangen, daß diese fünf Phagen alle pgall enthalten. Außerdem sind auf den bei 620C inkubierten Filtern („heterologe" Hybridisationsbedingungen) 17 positive Signale vorhanden, die auf den entsprechenden, bei 680C inkubierten Filtern nicht oder nu. schwach hybridisieren. Die Signalstärke bei diesen 17 Signalen ist unterschiedlich. Sechzehn Phagen vor der ersten Sichtung und 10 Phagen von der zweiten Sichtung, die nicht pgall enthalten, werden für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Diese Phagen werden unter den Bedingungen gereinigt, die für den ursprünglichen Nachweis angewendet wurden. Die charakterisierten Phagen sind die in der Tabelle VII aufgeführten Phagen und acht zusätzliche Phagen (Nummern 2,3,7,31,33,40,41,42). Die mit 1 bis 30 nummerierten Phagen wurden bei der ersten Sichtung der Bank ermittelt, während die Phagen mit der höheren Zahl bei der zweiten Sichtung ermittelt wurden.On the filters incubated at 68 ° C. ("homologous" hybridization conditions), five strong, positive signals were detected, which are also present in the corresponding position on the filters incubated at 62 ° C. The restriction analysis of one of these phages according to example 3.5 shows that this phage contains an insert on which the gene is located with the encoding PGII (pga II). It is therefore assumed that these five phage all contain pga II. in addition, in the incubated at 62 0 C filters ( "heterologous" hybridization ) 17 positive signals that do not or nu on the corresponding, at 68 0 C incubated filters. to hybridize weakly. The signal strength of these 17 signals is different. Sixteen phages before the first sighting and 10 phages from the second sighting, which do not contain pgall, are selected for further characterization. These phages are purified under the conditions used for the original detection. The characterized phages are the phages listed in Table VII and eight additional phages (Nos. 2,3,7,31,33,40,41,42). The phages numbered 1 to 30 were determined on the first sighting of the library, while the phages of higher number on the second sighting were detected.
Um zwischen den Phagen zu unterscheiden, welche das Polygalocturonsse I-Gen enthalten, und denen, welche andere, mit Polygalacturonase Il verwandte Sequenzen enthalton, werden Plaque-Lifts der ausgewählten Phagen mit dem vorher einer Nick-Translation unterzogenen 1,8kbp-Hindlll-Fragment von pGW1900 (Beispiel 3.9) hybridisiert. Die Hybridisation erfolgt bei 620C, während auch das Waschen bei 620C unter Verwendung einer Reihe von SSC-Puffern erfolgt, die alle 0,1 % SDS und 0,1% Natriumpyrophosphat enthalten (4 χ SSC, 2 χ SSC, Ix SSC, 0,5x SSC, 0,2 χ SSC und 0,1 χ SSC; Inkubationszeit je Puffer eine halbe Stunde). Unter Anwendung dieser Bedingungen ergeben die Phagen 2,3,7,40,41 und 42 starke Hybridisationssignale, die mit dem Signal vergleichbar sind, das bei dem Phagen PGI-X7 ermittelt wurde, welcher das pgal-Gen trägt (Beispiel 3.6). Die Restriktionsanalyse der DNA, die von einem dieser Phagen ermittelt wurde, zeigt auch, daß dieser Phage einen Einschub enthält, auf dem sich das pgal-Gen befindet. Es wird daher davon ausgegangen, daß diese sechs Phagen alle das pga-Gen enthalten. Die anderen analysierten Phagen (1,8,31,33,35,36,37,38,43) ergeben, wenn überhaupt, nur ein schwaches Hybridisationssignal, und diese Phagen enthalten daher das pgal-Gen nicht.To discriminate between the phage containing the polygalacturonase I gene and those containing other polygalacturonase II related sequences, plaque lifts of the selected phage become the previously nick-translated 1.8 kbp HindIII fragment of pGW1900 (Example 3.9). Hybridization occurs at 62 ° C. while also washing at 62 ° C. using a series of SSC buffers containing all 0.1% SDS and 0.1% sodium pyrophosphate (4 χ SSC, 2 χ SSC, Ix SSC, 0.5x SSC, 0.2 χ SSC and 0.1 χ SSC, incubation time per buffer for half an hour). Using these conditions, phages 2,3,7,40,41 and 42 give strong hybridization signals comparable to the signal detected on phage PGI-X7 carrying the pgal gene (Example 3.6). Restriction analysis of the DNA detected from one of these phages also indicates that this phage contains an insert on which the pgal gene is located. It is therefore assumed that these six phages all contain the pga gene. The other phages analyzed (1,8,31,33,35,36,37,38,43) give, if any, only a weak hybridization signal, and thus these phages do not contain the pgal gene.
Um herauszufinden, welche Phagen identische Fragmente enthalten, wird aus den in der Tabelle VII angegebenen Phagen DNA auf die Art und Weise isoliert, die im Beispiel 3.5 beschrieben wurde, und wie im Beispiel 3.6 beschrieben digeriert, und die resultierenden Fragmente werden anschließend durch Southern-Blot-Analyse charakterisiert. Für die Analyse von Hlnf I- und Hlncll-Aufschließungen wird der Agarosegehalt der Gele auf 1 % (Gew./Vol.) erhöht. Southern-Blots weiden bei 60°C mit dom vorher einer Nink-Translation unterzogonen 1,2kbp-BamHI/EroRI-Fragment von pGW1803 hybridisiert, das Waschen erfolgt gleichfalls bei 600C, wobei die oben beschriebenen HSSC-Bedingungen angewendet werden. Die Restriktionsenz> me, die als nützlich für eine anfängliche Klassifikation bei diesen Phagen ermittelt werden, sind eine Kombination von BamHI und BgIII und von Hlnfl und Hincll, wobei die letzteren Enzyme getrennt eingesetzt werden. Hlncll und Hlnfll erzeugen in der Regal kleine Restriktionsfragmente, was im vorliegenden Fall die Möglichkeit, daß die resultierenden hybridisierenden Fragmente neben der pgall-verwandten Sequenz DNA, die vom EMBL4-Vektor abgeleitet wurde, enthalten, auf ein Minimum reduziert wird.To find out which phages contain identical fragments, DNA is isolated from the phage indicated in Table VII in the manner described in Example 3.5 and digested as described in Example 3.6, and the resulting fragments are Blot analysis characterized. For the analysis of Hlnf I and Hlncll digestions, the agarose content of the gels is increased to 1% (w / v). Southern blots feed at 60 ° C with a previously dom Nink translation unterzogonen 1,2kbp BamHI / EroRI fragment of pGW1803 hybridize, the washing is also at 60 0 C, the above-described HSSC conditions are applied. The restriction enzymes which are found to be useful for an initial classification of these phages are a combination of BamHI and BglII and of Hlnfl and Hincll, the latter enzymes being used separately. Hlncll and Hlnfll generate small restriction fragments on the shelf, which in the present case minimizes the possibility that the resulting hybridizing fragments contain, in addition to the pgall-related sequence, DNA derived from the EMBL4 vector.
Klassifizierung von PGII-verwandten λ-Phagen auf der Grundlage der Größe der hybridisierenden λ-DNA-Fragmente (kbp), die nach dem Aufschließen von DNA, die aus diesen Phagen isoliert wurde, mit Hincll, Hlnfl und Bglll/BamHI und manchmal mit Sail unter Verwendung des 1,2 kbp BamHI/EcoRI-Fragmentes von pGW 1803 als Sonde ermittelt wurdenClassification of PGII-related λ phages based on the size of hybridizing λ DNA fragments (kbp) recovered after digestion of DNA isolated from these phages with Hincll, Hlnfl and Bglll / BamHI and sometimes with Sail using the 1.2 kbp BamHI / EcoRI fragment of pGW 1803 as a probe
tionsenzymtion enzyme
λ-Phagen, die zu den entsprechenden Klassen gehören: 9, 10, 4, 1, 16, 8, 6, 5 17,λ phages belonging to the corresponding classes: 9, 10, 4, 1, 16, 8, 6, 5 17,
43 35, 36 20, 11, 36 2743 35, 36 20, 11, 36 27
37 1237 12
a Phagen mit der Nummer 16 und 20 weisen auch ein 1,64kbp-KPnl-Fragment und ein 1,38kbp-Hlncll/Xpnl-Fragment auf. b Phagen der Klasse G hybridisieren unter nicht-strengen Bedingungen nur schwach mit PGII. n. d. = keine Aufschließung ausgeführt.phages numbered 16 and 20 also have a 1.64kbp KPnl fragment and a 1.38kbp HlncII / Xpnl fragment. b Class G phages do not hybridize with PGII under non-severe conditions. n. d. = no decomposition carried out.
Aus den in der Tabelle VII aufgezeigten Daten geht hervor, daß bei den meisten Klassen von Phagen mehrere repräsentative Phagen unabhängig voneinander isoliert wurden. Ausgehend von der Tatsache, daß nur eine Auswahl aller hybridisierenden Signale in die anfängliche Sichtung einbezogen wurde, gibt die Anzahl der λ-Phagen, die für die einzelnen Klassen ermittelt wurde (Klasse A: 3; B: 3; C: 4; D: 3; E: 2), an, daß bei einer ähnlichen Frequenz unterschiedliche Gene gefunden werden. Beim Fall von PGI ist diese Zahl größer (6 von 26 analysierten Phagen), während PGII-haltige Phagen an derselben Frequenz (12 von analysierten Phagen) gefunden werden. Die Klasse G hybridisiert schwächer mit beiden Sonden, die entweder vom PGI-Gen oder vom PGIII-Gen abgeleitet wurden. Neben einem hybridisierenden Fragment von 3,0 und 4,9kb in den Phagen mit der Nummer 17 bzw. 27 werden in der Bgll/BamHI-Doppelaufschließung mehrere nichthybridisierende Fragmente gefunden, die in beiden Phagen identisch sind und die von den Einschüben abgeleitet werden, nämlich ein 5,6 kbp-, ein 5,1 kbp-, ein 1,45kbpundein O,57kbp-Fragment. Auch die Hindi- und Hlnfi-Aufschließungen der beiden Phagen sind annähernd die gleichen. Die in diesem Beispiel isolierten Phagen werden folgender, naßen umbenannt:From the data presented in Table VII, it can be seen that in most classes of phage, several representative phage were independently isolated. Based on the fact that only a selection of all hybridizing signals was included in the initial sighting, the number of λ phage determined for each class (class A: 3; B: 3; C: 4; D: 3, E: 2) that different genes are found at a similar frequency. In the case of PGI, this number is larger (6 out of 26 phages analyzed), while PGII-containing phages are found at the same frequency (12 of analyzed phage). The class G hybridizes weaker with both probes derived from either the PGI gene or the PGIII gene. In addition to a hybridizing fragment of 3.0 and 4.9kb in the phage number 17 and 27, respectively, several non-hybridizing fragments are found in the Bgll / BamHI double digestion which are identical in both phages and are derived from the inserts, viz a 5.6 kbp, a 5.1 kbp, a 1.45 kbp, and an O, 57kbp fragment. The Hindi and Hlnfi digestions of the two phages are also approximately the same. The phages isolated in this example are renamed as follows:
Phage APG-C20 (Beispiel 7.2; Phage 20, Klasse C) wird mit BgIII digeriert, und die resultierenden Fragmente werden auf Agarosegel getrennt. Die Gelscheiben, welche das hybridisierende 7,9kbp-Bglll enthalten, werden gewonnen, und das Fragment wird dann in der beschriebenen Art und Weise isoliert (Beispiel 3.6). Das Bglll-Fragment wird in den BamHI-digerierten und ClP-behandelten (Phosphatase aus Kälberdarm) pUC9 ligiert. Das Ligationsreaktionsgemisch wird zur Transformation von E. coll JM109 (Beispiel 3.6) verwendet. Mehrere der resultierenden weißen Kolonien werden auf YT-Agar gestrichen, das mit Ampicillin ergänzt worden war. Nachdem die Kolonien über Nacht gewachsen sind, werden sie auf einen Nitrocellulosefilter adsorbiert. Die Kolonien auf dem Filter werden dann aufgelöst, und die freigesetzte DNA wird durch Backen fixiert, wie das vonPhage APG-C20 (Example 7.2, phage 20, class C) is digested with BglII and the resulting fragments are separated on agarose gel. The gel slices containing the hybridizing 7.9kbp BglII are recovered and the fragment is then isolated in the manner described (Example 3.6). The BglII fragment is ligated into the BamHI-digested and ClP-treated (calf intestinal phosphatase) pUC9. The ligation reaction mixture is used to transform E. coli JM109 (Example 3.6). Several of the resulting white colonies are streaked onto YT agar supplemented with ampicillin. After the colonies have grown overnight, they are adsorbed onto a nitrocellulose filter. The colonies on the filter are then dissolved and the released DNA is fixed by baking, like that of
Maniatis u.a. (Ref. 6; S. 314) beschrieben wurde. Die gebackenen Filter werden in 2 χ SSC benetzt, und sie werden vorsichtig mit einer behandschuhten Hand gerieben, um die Bakterienzelltrümmer zu entfernen. Dann werden die Filter mit dem 1,2 kbp-Fragment von pGW 1803 unter Anwendung der heterologen Bedingungen hybridisiert, die im Beispiel 7.2 beschrieben wurden (6O0C, Waschungen mit 2x SSC). Ein positiver Klon wird ausgewählt, und die Plasrnid-DNA wird wie oben gereinigt. Die Plasmid-DN A wird dann für die Restriktionsanalyse verwendet, um eine physikalische Karte herzustellen.Maniatis et al. (Ref 6, p. The baked filters are wetted in 2½ SSC and gently rubbed with a gloved hand to remove the bacterial cell debris. The filters are then hybridized with the 1.2 kbp fragment of PGW 1803 using the heterologous conditions described in Example 7.2 (6O 0 C, washes with 2x SSC). A positive clone is selected and the plasmid DNA is purified as above. The plasmid DN A is then used for restriction analysis to prepare a physical map.
Auf diese Weise wurde ein neues Plasmid konstruiert. pGW1910 (Abb. 7) ist das 7,8kbp-Bgll-Fragment des Phagen APG-C20, eingefügt in den BamHI-Ort des Vektors pUC9. Dieser Subklon umfaßt hybridisierende Fragmente des Phagen APG-C20, z. B. das Smal-Fragment zu 1,1 kbp und das Kpnl-Fragment zu 1,6kbp. Aus der Lage dieser Fragmente auf der physikalischen Karte von pGW 1910 wird abgeleitet, daß dieses Plasmid das vollständige PGC-Gen (pgaC) enthält.In this way a new plasmid was constructed. pGW1910 (Figure 7) is the 7.8kbp BglI fragment of phage APG-C20 inserted into the BamHI site of vector pUC9. This subclone comprises hybridizing fragments of phage APG-C20, e.g. For example, the SmaI fragment is 1.1 kbp and the KpnI fragment is 1.6 kbp. From the location of these fragments on the physical map of pGW 1910, it is deduced that this plasmid contains the complete PGC gene (pgaC).
Plasmid pGW1800 mit EcoRI digeriert und wie unten mit T4-Polymerase behandelt. Die Religation dieser DNA und die Transformation von E.coll DH SaF' erlauben die Isolierung eines Plasmids pGW 1800-E, welches das gleiche wie pGW 1800 ist, ausgenommen die Tatsache, daß die EcoRI-Spaltungsstelle deletiert wird.Plasmid pGW1800 digested with EcoRI and treated as below with T4 polymerase. The religation of this DNA and the transformation of E. coli DH SaF 'allow the isolation of a plasmid pGW 1800-E, which is the same as pGW 1800, except for the fact that the EcoRI cleavage site is deleted.
Plasmid pGW1800-E wird mit BgIII digeriert und mit alkalischer bakterieller Phosphatase (BRL) bei Anwesenheit von 5OmM Tris-HCI, pH-Wert 8,0, und 5OmM NaCI für die Dauer von einer Stunde bei 65°C behandelt. Die alkalische Phosphatase wird durch Aufschließung mit Proteinase K (Boehringer, Mannheim) und Phenolextraktion inaktiviert. Anschließend wird die DNA mit Ethanol ausgefällt, getrocknet und wieder in Wasser aufgelöst. Dann werden die klebrigen Enden wie unten mit T4-DNA-Polymerase gefOllt.Plasmid pGW1800-E is digested with BglII and treated with alkaline bacterial phosphatase (BRL) in the presence of 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, and 50 mM NaCl for one hour at 65 ° C. The alkaline phosphatase is inactivated by digestion with proteinase K (Boehringer, Mannheim) and phenol extraction. Subsequently, the DNA is precipitated with ethanol, dried and redissolved in water. Then the sticky ends are filled as below with T4 DNA polymerase.
Plasmid pJDB207-IFN AM 119 (EP205404) wird mit Hindlll und CIaI digeriert. Die klebrigen Enden dieser linearen Fragmente werden mit T4-DNA-Polymerase (Boehringer, Mannhein) bei Anwesenheit von jeweils 0,1 mM dCTP, dGTP, dATP und dTTP plus 67mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,6,7mM MgCI2,16,7mM (NH4J2SO4 und 5mM DTT 30min lang bei 370C gefüllt. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 650C für die Dauer von 5 min gestoppt. Die Fragmente werden in einem 0,8%igen Agarosegel mit niedriger Gelierungstemperatur (BioRad) getrennt, und das 1,0kbp-Fragment, welches den IFN AM 119-Codierungsbereich umfaßt, wird herausgeschnitten, die DNA auf einer Elutip-D-Säule (Schleicher & Schull) gereinigt und mit Ethanol ausgefällt (Schmitt und Lohen, Ref. 34).Plasmid pJDB207-IFN AM 119 (EP205404) is digested with HindIII and CIal. The sticky ends of these linear fragments are digested with T4 DNA polymerase (Boehringer, Mannhein) in the presence of 0.1 mM dCTP, dGTP, dATP and dTTP plus 67 mM Tris-HCl, pH 7.5, 6.7 mM MgCl 2, 16.7 mm (NH 4 J 2 SO 4, and 5 mM DTT 30min long filled at 37 0 C. the reaction is stopped by heating to 65 0 C for a period of 5 min. the fragments are separated in a 0.8% Agarose gel with low gelation temperature (BioRad) is separated, and the 1.0kbp fragment comprising the IFN AM 119 coding region is excised, the DNA purified on an Elutip D column (Schleicher & Schull) and ethanol precipitated (Schmitt and Lohen, Ref. 34).
Es werden 100 ng des IFN AM 119-Fragmentes und der präparierte pGW1800-E-Vektor zusammen in 5μΙ 2OmM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,1OmMMgCIj, 1OmMDTT, 1mM ATP und einer Einheit T4-DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) für die Dauer von 2 Stunden bei Zimmertemperatur ligiert. Dieses Gemisch wird in kompetente E. coll-DH5aF'-Zellen übertragen. Ampicillinresistente Transformanten werden durch Restriktionsaufschließung der Plas-nid-DNA gesichtet, um diejenigen zu identifizieren, welche den Plasmid-pGII-IFN AM 119-Vor!äufer tragen.100 ng of the IFN AM 119 fragment and the prepared pGW1800 E vector are combined together in 5 μM 20 mM Tris-HCl, pH 7.5.1 μmMgCIj, 10 mM DTT, 1 mM ATP and one unit of T4 DNA ligase (Boehringer, Mannheim) for a period of 2 hours at room temperature. This mixture is transferred to competent E. coli DH5aF 'cells. Ampicillin-resistant transformants are screened by restriction digestion of the plasmid DNA to identify those carrying the plasmid pGII-IFN AM 119 precursor.
(Abbildungen 4 und 5)(Figures 4 and 5)
Es wird die von R. M. Horton u. a. (Ref.35) beschriebene PCR-Methode angewendet, die in der Abb. 5 dargestellt ist.It is the of R. M. Horton u. a. (Ref.35) described PCR method shown in Fig. 5.
pGW1800 wird durch Xbal-Aufschließung linearisiert und mit Ethanol ausgefällt. Nach der erneuten Suspension in Wasser werden 100 ng dieser DNA einer Vermehrung durch Polymerasekettenreaktion (PCR-Reaktion) unter Einsatz der Oligonucleotide A und B (Abb. 5) in einer automatischen Wärmezyklusvorrichtung für 25 Zyklen (die jeweils aus 1 min bei 940C, 2 min bei 4O0C und 3 min bei 720C bestehen) unterzöget), gefolgt von 10 Minuten bei 720C. Für jede Reaktion werden 10OpM jedes Nucleotiden und 0,5μΙ derTaq-Polymerase (Perkin Eimer Cetus) in einem Volumen von 100 μΙ unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Reaktionspuffers eingesetzt. Das ergibt DNA1 (Abb. 5).pGW1800 is linearized by XbaI digestion and precipitated with ethanol. After re-suspension in water, 100 ng of DNA of a multiplication by polymerase chain reaction (PCR reaction) using the oligonucleotides A and B (Fig. 5) (in an automated thermal cycler for 25 cycles each consisting of 1 min at 94 0 C, are 2 min at 4O 0 C and 3 min at 72 0 C) unterzöget), followed by 10 minutes at 72 0 C. For each reaction 10OpM each nucleotides and 0,5μΙ Taq polymerase (Perkin Elmer Cetus) in a volume of 100 μΙ using the reaction buffer recommended by the manufacturer. This results in DNA1 (Figure 5).
Ähnlich behandeltes pGW1800 mit den Oligonucleotiden A und C ergibt DNA2.Similarly treated pGW1800 with oligonucleotides A and C yields DNA2.
Ebenso ergibt pJDB207-IFN AM 119, linearisiert mit BamHI und der PCR mit den Oligonucleotiden D und F oder den Oligonucleotiden E und F unterzogen, DNA3 bzw. PNA4.Similarly, pJDB207-IFN yields AM 119 linearized with BamHI and PCR with oligonucleotides D and F or oligonucleotides E and F, DNA3 and PNA4, respectively.
Diese Reaktionsgemische werden mit Ethanol ausgefällt, wieder in Wasser aufgelöst, und ein Aliquot wird auf einem Gel geprüft, um die Konzentration der DNA-Fragmente in den Gemischen zu bestimmen.These reaction mixtures are ethanol precipitated, redissolved in water, and an aliquot is gel-tested to determine the concentration of DNA fragments in the mixtures.
Unter den gleichen Bedingungen wie oben werden die DNA1 und die DNA4 der PCR mit den Oligonucleotiden A und F unterzogen, was die DNA5 ergibt, und die DNA2 und die DNA3 mit den gleichen Oligonucleotiden, was die DNA6 ergibt (Abb. 5).Under the same conditions as above, DNA1 and DNA4 are subjected to PCR with oligonucleotides A and F to give DNA5, and DNA2 and DNA3 with the same oligonucleotides to give DNA6 (Figure 5).
Die DNA5 beginnt mit einem BamHI-Ort und endet mit einem EcoRI-Ort, und sie schließt eine perfekte, im Raster befindliche Fusion des ursprünglichen Methioninstartcodons, gekoppelt an ein PGII-Promotorfragment mit dem codierenden Bereich für das reife Hybridinterferon BDBS, ein.The DNA5 starts with a BamHI site and ends with an EcoRI site and includes a perfect in-frame fusion of the original methionine type codon coupled to a PGII promoter fragment with the coding domain for the mature hybrid interferon BDBS.
Das BamHI-EcoRI-Fragn-.ent von DNA5 wird in den BamHI-EcoRI-geschnittenen Plasmid-pGII-IFN AM 119-Vorläufer, der im Beispiel 8.1 konstruiert worden ist, ligiert, um das Plasmid pGI-IFN AM 119 zu schaffen.The BamHI-EcoRI-Fragn-.ent of DNA5 is ligated into the BamHI-EcoRI cut plasmid pGII-IFN AM 119 precursor constructed in Example 8.1 to create the plasmid pGI-IFN AM 119.
Ebenso wurde das BamHI-EcoRI-Fragment von DNA6, das eine perfekte, im Raster befindliche Fusion der PGII-Signalsequenz, gekoppelt an ein PGII-Promotorfragment mit dem codierenden Bereich für das reife Hybridinterferon BDBB, enthält, in den pGII-IFN AM 119-Vorläufer eingefügt, >-m das Plasmid pGllss-IFN AM 119zu schaffen.Similarly, the BamHI-EcoRI fragment of DNA6, which contains a perfect in-frame fusion of the PGII signal sequence, coupled to a PGII promoter fragment with the coding region for the mature hybrid interferon BDBB, into the pGII-IFN AM 119- Precursor inserted,> -m to create the plasmid pGllss-IFN AM 119.
Der uridinauxotrophe Mutant An8 (= DMS 3917, offenbart in EP278355) wird mit Plasmid pCG 59D7 und pGllss-FN oder pGII-IFN AM119cotransformiert, um Uridinprototrophezu ergeben.The uridine auxotrophic mutant An8 (= DMS 3917, disclosed in EP278355) is co-transformed with plasmid pCG 59D7 and pGllss-FN or pGII-IFN AM119 to give uridine prototrophic.
Konidialsporen von A. nfger An 8 werden 4 Tage lang bei 280C in einem Komplettmedium gezogen, bis sie vollständig sporuliert haben. Es werden 2 χ 108 Konidiosporen verwendet, um 200 ml Minimalmedium zu impfen, ergänzt durch 1 g/l Arginin und Uridin.Konidialsporen of nfger A. An 8 are drawn for 4 days at 28 0 C in a complete medium until they have fully sporulated. Two 10 8 conidiospores are used to inoculate 200 ml of minimal medium supplemented with 1 g / l arginine and uridine.
Nach 20 Stunden Wachstum bei 280C und 180" U/min wird das Mycel durch Filtrieren durch Miracloth geerntet, zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI2 gewaschen und erneut in 20ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI2,0,5mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) suspendiert. Das Gemisch wird in einem Rüttelwasserbad (300C, 50U/min) inkubiert, bis genügend Protoplaste freigesetzt worden sind (nach 90 bis 120min mikroskopisch nachgewiesen). Die Protoplastsuspension wird durch einen Stopfen aus Glaswolle in einem Trichter filtriert, um Mycoltrümmer zu entfernen. Die Protoplaste werden durch sanftes ZentrifugierenAfter 20 hours of growth at 28 0 C and 180 "U / min, the mycelium is harvested by filtration through Miracloth, washed twice with 10 ml 0.8M KCl, 5OmM CaCl2 washed and resuspended in 20 ml 0.8 M KCl, 5OmM CaCl2, 0, 5mg / ml Novozym 234 (Novo Industries) was suspended. The mixture (30 0 / C 50U min) incubated in a shaking water, have been until sufficient protoplasts released (after 90 to 120 min microscopically detected). The protoplast suspension is filtered through a plug of Glass wool is filtered in a funnel to remove mycotic debris and the protoplasts are gently centrifuged
(10min, 2000U/min) bei Zimmertemperatur pelletiert und zweimal mit 10ml 0,8M KCI, 5OmM CaCI2 gewaschen. Abschließendwerden die Protoplaste in 200 bis 500μΙ 0,8M KCI, 5OmM CaCI2 erneut suspendiert, um eine Konzentration von 1 χ 108ZmI zuergeben.(10min, 2000U / min) pelleted at room temperature and washed twice with 10ml 0.8M KCl, 50mM CaCl 2 . Finally, the protoplasts are resuspended in 200 to 500 μM 0.8M KCl, 50 mM CaCl 2 to give a concentration of 1 × 10 8 ZmI.
pGII-IFN AM 119- oder pGII-IFN AM 119-DNA, 50 μΙ PCT (10 mM Tris-HCI, pH-Wert 7,5,5OmM CaCl·,, 25% PEG 6000) inkubiert. DaspGII-IFN AM 119 or pGII-IFN AM 119 DNA, 50 μM PCT (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM CaCl 2, 25% PEG 6000). The
5 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Es werden 4 ml 0,8 M KCI, 5OmM CaCI2 zugesetzt, und Aliquote zu 1 ml von derfertigen Transformationslösung werden mit verflüssigtem Minimalagarmedium (Minimalmedium + 1 g/l Arginin + 10g/lIncubated for 5 minutes at room temperature. 4 ml of 0.8 M KCl, 50 mM CaCl 2 are added and aliquots of 1 ml of the prepared transformation solution are mixed with liquefied minimal agar medium (minimal medium + 1 g / l arginine + 10 g / l
einem Hintergrundwachstum von vielen hundert kleinen, vermutlich abortiven Transformanten.a background growth of many hundreds of small, probably abortive transformants.
Es werden Transformanten des Cotransformationsexperimentes (Beispiel 8.3) herausgenommen und auf Interferonexpression analysiert. Die Interferonaktivität wird nach dem Verfahren von Armstrong (J. A.Armsf^ng, Appl. Microbiol. 21,732 (1971)) unter Verwendung von menschlichen CCL-23-Zellen und des Vesicular stomatitis-Virus (VSV) als Eignungsvirus bestimmt. Konidialsporen von Transformanten werden einzeln in 50ml eines Vorkulturmediums (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, Frankreich!,3g/l,NH4CI22g/l,KH2PO40,5g/l,NaCI0,5g/l,Mg2SO4 7H2O0,5g/l,Ca2SO4 · 2H2O0,5g/l,pH-Wert7,0,1%Arginin) vorkultiviert. Die Vorkultur wird 72 Stunden lang bei 250 U/min und 28°C inkubiert. 10% der Vorkultur werden zum Impfen von M1 ' 1^ Hauptkulturmediums (Sojabohnenmehl 20g/l, Pectin Slow-Satz 5g/l, 1 % Arginin) verwendet. Die Kultur wird 72 bis 96 Stunüuii ι, i 250U/min und 280C gezogen.Transformants of the cotransformation experiment (Example 8.3) are taken out and analyzed for interferon expression. Interferon activity is determined by the method of Armstrong (JA Armsang, Appl. Microbiol, 21, 732 (1971)) using human CCL-23 cells and vesicular stomatitis virus (VSV) as the aptitude virus. Konidialsporen of transformants are individually in 50ml of a preculture medium (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, France !, 3g / l, NH 4 Cl 2 2g / l, KH 2 PO 4 0.5g / l, NaCl 0.5g / Mg 2 SO 4 .7H 2 O0.5 g / l, Ca 2 SO 4 .2H 2 O0.5 g / l, pH 7.0.1% arginine) is pre-cultured for 72 hours at 250 rpm and incubated for 28 ° C. 10% of the preculture are used to inoculate M 1 '1 ^ main culture medium (soybean flour 20 g / l, pectin Slow set 5 g / l, 1% arginine) were used. the culture is ι 72 to 96 Stunüuii, i 250rpm and 28 0 C pulled.
Zu verschiedenen Zeitpunkten (alle 20 Stunden) werden Proben genommen, die Zellen werden durch Zentrifugieren pelletiert und durch Gefriertrocknen und Trockenmahlen aufgebrochen. Es werden sowohl der Überstand als auch die Zellextrakte auf Interferonaktivität getestet, wie das oben beschrieben wurde. Die Masse der Interferonaktivität wird, sekretiert in das Medium, in Transformanten gefunden, die pGllss-IFN AM 119 tragen, während sich Transformanten, die pGII-IFN AM 119 tragen, vorwiegend im Zellextrakt befinden.Samples are taken at various times (every 20 hours), the cells are pelleted by centrifugation and disrupted by freeze drying and dry milling. Both supernatant and cell extracts are assayed for interferon activity as described above. The mass of interferon activity, secreted into the medium, is found in transformants carrying pGllss-IFN AM 119, whereas transformants carrying pGII-IFN AM 119 are predominantly in the cell extract.
werdenbecome
pGW635 wird in E. coli MH1, pGW1800 in JM109 und PGW1900 in DH5aF'vermehrt.pGW635 is propagated in E. coli MH1, pGW1800 in JM109 and PGW1900 in DH5aF '.
Beispiel 9.2: Herstellung von Protoplasten und Transformation von urldlnauxotrophen A. nlduians-Mutanten Der A. nldulans-mutanteStammG191 (pyrG,pabaA1,fwA1,uaY9) wurde von Ballance und Turner, 1985 (Ref. 27), beschrieben. Mycel wird bei 37°C und weiter in der Weise gezogen, wie das für A. nlger beschrieben wurde (siehe Beispiel 5.2), wobei aber je Liter Medium 2 mg p-Aminobenzoat zugesetzt werden. Nach dem für A. nlger beschriebenen Verfahren werden Protoplaste hergestellt. Für die Transformation werden 5x10° Protoplaste in 200 μΙ STC aufgenommen, welche dann zusammen mit 1 Mg pGW635 und 20pg pGW1800 oder 25pg pGW1900 inkubiert werden. Die Platten werden drei Tage lang bei 37°C inkubiert. Bei dem Cotransformationsexperiment erhält man etwa 50 Transformanten/Vg pGW635, und in jedem Experiment werden 20 Transformanten auf 50 mM Glucose-Minimalmedium weiter gereinigt. Diese Stämme werden anschließend zur Vermehrung von Sporen für die weitere Analyse verwendet.Example 9.2: Preparation of protoplasts and transformation of primitive auxotrophic A. nlduians mutants The A. nldulans mutant strain G191 (pyrG, pabaA1, fwA1, and others Y9) was described by Ballance and Turner, 1985 (ref 27). Mycelium is grown at 37 ° C and further in the manner described for A. nlger (see Example 5.2) but with 2 mg of p-aminobenzoate added per liter of medium. Protoplasts are produced according to the procedure described for A. nlger. For the transformation, 5 × 10 ° protoplasts are taken up in 200 μl STC, which are then incubated together with 1 μg pGW635 and 20 μg pGW1800 or 25 μg pGW1900. The plates are incubated at 37 ° C for three days. In the cotransformation experiment, about 50 transformants / μg of pGW635 are obtained, and in each experiment, 20 transformants are further purified on 50 mM minimal glucose medium. These strains are then used to propagate spores for further analysis.
A.nidulansA. nidulans
5mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 6,5, der 0,02% (Gew./Vol.) Natriumazid enthält, über Nacht bei 4°C dialysiert. Die5 mM sodium phosphate buffer, pH 6.5, containing 0.02% (w / v) sodium azide, dialyzed overnight at 4 ° C. The
oder monoklonalen Antikörpern durchgeführt. Die als Kontrolle verwendeten Proben von A.nidulans enthalten kein PGII-kreuzreaktives Material, wie mit monokionalen Antikörpern geprüft wurde.or monoclonal antibodies. A.nidulans samples used as control do not contain PGII cross-reactive material as tested with monoclonal antibodies.
kleinere Bande mit geringerer Molekülmasse, die höchstwahrscheinlich Abbauprodukte darstellen, beobachtet. Dersmaller band of lower molecular weight, most likely representing degradation products. The
verglichen, wie das die Tabelle VIII zeigt.compared, as shown in Table VIII.
Polygalacturonaseaktivität von Kulturfiltraten des A.nldulane-Transformanten G191/pGW1800-13und von A.nldulansG191. Die Stämme werden durch Impfen von 10e Sporen/ml bei 300C in Minimalmedium unter Einsatz der definierten N- und C-Quellen und vor. hoher Phosphatase (15g KH2PO4/!) plus 0,1 % Hefeextrakt gezogen.Polygalacturonase activity of culture filtrates of A. nldulane transformant G191 / pGW1800-13 and A. nldulans G191. The strains are prepared by seeding 10 e spores / ml at 30 0 C in minimal medium using the defined N and C sources and before. high phosphatase (15g KH 2 PO 4 /!) plus 0.1% yeast extract.
n.d. = nicht nachweisbarn.d. = undetectable
Da der Transformant G191 /pGW 1800-13 hohe Pegel an PGII bei Fehlen von pektischen Substanzen synthetisiert, wird auch die PGII-Produktion der anderen A. nldulans G 191/pGW1800-Transformanten weiter analysiert. Zu diesem Zweck werden 19 Transformanten sowie G 191/pGW635-1 in einem Medium gezogen, das aus Minimalmediumsalzen besteht, wobei 0,4% NH4CI als Stickstoffquelle und 5% Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet und Phosphat in hoher Konzentration (15g/l KH2PO4) zugesetzt werden. Kulturfiltrate werden nach 46 und nach 69 Stunden genommen, und sie werden anschließend durch Western-Blotting und Sondierung mit dem monoklonalen Antikörper ohne vorherige Konzentration 1Jna Dialyse der Kulturfiltrate analysiert. Wenigstens 17 der 19 A.nldulans-G191/pGW1800-Transformantensynthetisie en PGII auf dem Glucosemedium, während mit A. nldulans G 191/pGW635-1 kein Signal ermittelt wird. Die Tatsache, daß klare Signale ermittelt werden, impliziert einen hohen Expressionspegel im Vergleich zu A.nlger N402, wenn dieser Stamm unter polygalacturonase-induzierenden Bedingungen gezogen wird, wie das im Beispiel 5.5 beschrieben wird, da nur schwache PGII-Signale auf Western-Blots von Kulturfiltraten des nichttransformierten Stammes ermittelt werden, wenn mit nichtkonzentrierten Filtraten und dem monoklonalen Antikörper gearbeitet wird. Analysiert wird auch die PGII-Produktion von A.niger G191/pG W1800-13 und von sechs anderen G 191/pGW1800-Transformanten, bei denen das oben beschriebene Medium, aber 1 % Zuckerrübenpulpe und 1 % Pektin als Kohlenstoffquelle anstelle von 5% Glucose verwendet werden. Im Gegensatz zu A. nldulans G191 /pGW 1800-13 produzieren diese sechs Transfo-manten weit mehr PGII auf dem Medium mit Pektin und Zuckerrübenpulpe, während mit A. nidulans G191/pGW635-1 erneut kein Signal festgestellt wird.Since the transformant G191 / pGW1800-13 synthesizes high levels of PGII in the absence of pectic substances, the PGII production of the other A. nldulans G191 / pGW1800 transformants is further analyzed. For this purpose, 19 transformants and G 191 / pGW635-1 are grown in a medium consisting of minimal medium salts, using 0.4% NH 4 Cl as nitrogen source and 5% glucose as carbon source and high concentration of phosphate (15g / l KH 2 PO 4 ) are added. Culture filtrates are taken at 46 and 69 hours, and are then analyzed by Western blotting and probing with the monoclonal antibody without prior concentration of 1 μl dialysis of the culture filtrates. At least 17 of the 19 A.nldulans G191 / pGW1800 transformant syntheses PGII on the glucose medium, while no signal is detected with A. nldulans G191 / pGW635-1. The fact that clear signals are detected implies a high level of expression compared to A.nlger N402 when this strain is grown under polygalacturonase-inducing conditions, as described in Example 5.5, as only weak PGII signals on Western blots of culture filtrates of the untransformed strain when working with non-concentrated filtrates and the monoclonal antibody. Also analyzed is PGII production of A.niger G191 / pG W1800-13 and six other G191 / pGW1800 transformants using the medium described above, but 1% sugar beet pulp and 1% pectin as the carbon source instead of 5% glucose be used. In contrast to A. nldulans G191 / pGW 1800-13, these six transformants produce far more PGII on the medium with pectin and beet pulp, while again no signal is detected with A. nidulans G191 / pGW635-1.
Die Cotransformanten, die nach Beispiel 9.2 unter Verwendung von pGW 1900 als dem cotransformierenden Plasmid gewonnen wurden, werden auf zwei verschiede ien Medien gezogen. Das erste Medium besteht aus einem Minimalsalzmedium mit hohem Phosphatgehalt, dem NH4CI (4,0g/l), 1 % (Gew./Vol.) Apfelpektin (Veresterungsgrad 61,2%) und 1 % (Gew./Vol.) Zuckerrübenpulpe zugesetzt wurde, während einige Transformanten auch in diesem Medium mit Harnstoff (4,2 g/l) anstelle von NH4CI aus Stickstoffquelle gezogen werden. Der Unterschied besteht bei dem erstgenannten Minimalmedium mit niedrigem Phosphatgehalt (Orig.-S. 28) darin, daß 15g KH2PO4 je Liter anstelle von i,og verwendet werden. Das zweite Medium besteht auch aus einem Minimalsalzmedium mit hohem Phosphatgehalt, dem 0,1 % Hefeextrakt, NH4CI (10g/l) und 3% Glucose als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle zugesetzt werden. Bei beiden Medien werden 2 mg/1 p-Aminobenzoat zugesetzt. Die Kulturen werden 42 Stunden lang bei 30°C unter Verwendung eines Gallenkamp-Orbital-Schüttelapparates mit 250U/min gezogen, und Proben des Kulturfiltrats werden nach 20 Stunden und nach 42 Stunden genommen. Bei Western-Blots von A. nidulans G191, der unter ähnlichen Bedingungen wie die Transformanten gezogen wurde, wird kein oder nur wenig Protein nachgewiesen, das mit polyklonalen Antikörpern kreuzreagiert, die anhand von gereinigter Polygalacturonase I gezogen wurden. Im Kulturfiltrat von 75% der Transformanten wird PGI in signifikanten Werten nachgewiesen.The cotransformants obtained according to Example 9.2 using pGW 1900 as the cotransforming plasmid are grown on two different media. The first medium consists of a minimal phosphate medium with high phosphate content, the NH 4 Cl (4.0 g / L), 1% (w / v) apple pectin (degree of esterification 61.2%) and 1% (w / v) Sugar beet pulp was added, while some transformants are also drawn in this medium with urea (4.2 g / l) instead of NH 4 Cl from nitrogen source. The difference with the former low-phosphate minimal medium (orig. P. 28) is that 15 g KH 2 PO 4 per liter is used instead of i, og. The second medium also consists of a high phosphate minimum salt medium to which 0.1% yeast extract, NH 4 Cl (10 g / l) and 3% glucose as nitrogen and carbon source are added. For both media, 2 mg / l p-aminobenzoate is added. The cultures are grown for 42 hours at 30 ° C using a Gallenkamp orbital shaker at 250 rpm, and samples of the culture filtrate are taken at 20 hours and at 42 hours. Western blots of A. nidulans G191 grown under conditions similar to the transformants show little or no protein cross-reacting with polyclonal antibodies raised from purified polygalacturonase I. In the culture filtrate of 75% of the transformants PGI is detected in significant values.
Verwendet man NH4CI anstelle von Harnstoff und einen hohen Phosphatgehalt auch in Komplexmedien, verringert sich der proteolytische Abbau der Polygalacturonase I, die prc duziert wird, erheblich. Auf der Grundlage der Ergebnisse des Western-Blottings und von Aktivitätsmessungen wird angenommen, daß der Transformant G191 /pGW 1900-6 mehr als 1 g Enzym je Liter produzierte, wie aus der Tabelle Vl hervorgeht, da die spezifische Aktivität von PGI550 Einheiten je mg beträgt («ester und Visser, 1990).If NH 4 Cl is used in place of urea and a high phosphate content, even in complex media, the proteolytic degradation of polygalacturonase I, which is preconditioned, is considerably reduced. Based on the results of western blotting and activity measurements, it is believed that the transformant G191 / pGW 1900-6 produced more than 1 gram of enzyme per liter, as shown in Table VI, as the specific activity of PGI550 units per mg ("Ester and Visser, 1990).
Polygalacturonaseaktivitäten von Kulturfiltraten von dem A.nldulans-Transformanten G191 /pGW 1900-6 und dem Kontrollstamm G191/PGW635-1. Die Stämme werden durch Impfen von 10* Sporen/ml bei 3O0C in Minimalmedium unter Verwendung von den angegebenen N- und C-Quellen und einem hohen Phosphatgehalt (15g KHjPO4/!) gezogenPolygalacturonase activities of culture filtrates from A. nldulans transformant G191 / pGW 1900-6 and control strain G191 / PGW635-1. The logs are taken by inoculating 10 * spores / ml at 3O 0 C in minimal medium using the indicated N- and C-sources and a high phosphate content (15g KHjPO 4 /!)
n. d. = nicht nachweisbarn. d. = undetectable
Das pgal- und das pgall-Gen mit der Codierung für Polygalacturonase I bzw. Il werden in A.niger auf glucosehaltigen Medien nicht ausgeprägt, auch nicht in Mehrfachkopietransformanten mit einer hohen Gendosis. Die Expression dieser A. nlger-Gene in A.nldulans-Transformanten, wie in den Stämmen G191 /pGW 1900-6 und G191 /pGW 1900-10 bzw. wie in den Stämmen G191/ pGW1800-13 und G191/pGW 1800-20, weist jedoch darauf hin, daß in A.nldulans die Katabolit-Repression dieser Gene umgangen wird. Das impliziert unterschiedliche Spezifizitäten im Katabolit-Repressionssystem bei diesen unterschiedlichen Aspergillus-Spezies. Das kann dafür genutzt werden, ein bestimmte A. nlger-Polygalacturonaso-Gen in einem unterschiedlichen Wirt, wie A. nldulans, unter Bedingungen auszuprägen, welche die Expression der Polygalactonasen des Wirts selbst vermeiden. Die so gewonnenen Polygalacturonaseenzyme sind praktisch rein.The pgal and the pgall gene coding for polygalacturonase I or IL are not expressed in A. niger on glucose-containing media, not even in multicopy transformants with a high gene dose. The expression of these A. nlger genes in A.nldulans transformants, such as in strains G191 / pGW 1900-6 and G191 / pGW 1900-10 or in strains G191 / pGW1800-13 and G191 / pGW 1800-20 however, points out that in A.nldulans the catabolite repression of these genes is circumvented. This implies different specificities in the catabolite repression system in these different Aspergillus species. This can be used to express a particular A. nlger polygalacturonase gene in a different host, such as A. nldulans, under conditions which avoid the expression of the host's polygalactonases themselves. The polygalacturonase enzymes thus obtained are practically pure.
EinA.nIdulans-TransformantG191/pGW1800-13wirdin 100-ml-Kulturenauf einem 1%igen Zuckerübenpulpe- und 1%igem Pektinmedium gezogen, das die im Beispiel 5.3 beschriebene Zusammensetzung hat, wobei aber anstelle von 1,5g/l 15g/l KH2PO4 eingesetzt werden. Ebenso wird dieser Transformant auch auf Minimalmedium sowohl mit niedrigem als auch mit hohem Phosphatpegel gezogen, wobei 5% oder 1 % Glucose als Kohlenstoffquelle eingesetzt werden. Diese Medien ergeben keinerlei nachweisbare Polygalacturonase Il in A. niger N402, während der Stamm A. nldulans G191 selbst unfähig ist, PG Il herzustellen, wie das im Beispiel 9.3 beschrieben wurde.An A. nIdulans transformant G191 / pGW1800-13 is grown in 100 ml cultures on a 1% beet pulp and 1% pectin medium having the composition described in Example 5.3, but with 15g / l KH 2 instead of 1.5g / l PO 4 are used. Likewise, this transformant is also grown on minimal medium at both low and high phosphate levels using 5% or 1% glucose as the carbon source. These media do not yield any detectable polygalacturonase II in A. niger N402, while strain A. nldulans G191 itself is unable to produce PG II as described in Example 9.3.
In den Proben von Kulturfiltration des A.nidulans-Transformanten G191/pGW1800-13, die nach 72 Stunden und unter Verwendung von 5% Glucose und einem hohen Phosphatgehalt genommen wurden, wird eine PG-Aktivität von etwa 860 Einheiten/ml ermittelt, während bei niedrigem Phosphatgehalt dieser Betrag gleich 550 Einheiten/ml ist. Die geringeren Werte, die beobachtet werden, wenn man mit 1 % Glucose und einem hohen Phosphatgehalt arbeitet, sind vor allem auf eine Zunahme des Proteinstoffumsatzes zurückzuführen, wenn die Kohlenstoffquelle nach 48 Stunden erschöpft ist. Bei 1 % Glucose und niedrigem Phosphatgehalt bleibt das Produktionsniveau während der gesamten Kulturperiode niedrig. Die Proteinmenge, die je Liter Kulturf iltrat bei Verwendung von 5% Glucose und einem hohen Phosphatgehalt ermittelt wird, geht gegen 1 g/l. Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese zeigt, daß das Kulturfiltrat des Transformanten eine Proteinbande mit einer Molekülmasse enthält, welche der von A. niger PGII entspricht.In the culture filtration samples of the A.nidulans transformant G191 / pGW1800-13 taken after 72 hours and using 5% glucose and a high phosphate content, a PG activity of about 860 units / ml is determined while at low phosphate content this amount is equal to 550 units / ml. The lower levels observed when working with 1% glucose and a high phosphate content are mainly due to an increase in protein turnover when the carbon source is depleted after 48 hours. At 1% glucose and low phosphate content, the production level remains low throughout the culture period. The amount of protein determined per liter of culture filtrate using 5% glucose and a high phosphate content is about 1 g / l. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis shows that the culture filtrate of the transformant contains a protein band having a molecular mass corresponding to that of A. niger PGII.
Beispiel 10.2: Isolierung und Reinigung von PGII aus dem Kulturfiltrat des A.nldulans-Transformanten G191/pGW1800-13 Das Kulturfiltrat (etwa 21), das einen pH-Wert von etwa 4,9 hat, wird fünffach mit destilliertem Wasser verdünnt und dann unter Verwendung von2NNaOHaufeinen pH-Wert von 6,0 gebracht. Um das Enzym zu konzentrieren, wird die Lösung einer Sephadex-Säule DEAE-A50 zu 600ml zugeführt, die in 2OmM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 6,0 voräquilibriert worden war, der in einem Büchner-Trichtsr gehalten wird, um hohe Durchflußgeschwindigkeiten zu ermöglichen. Die gesamte Enzymaktivität wird auf das lonenaustauschmaterial adsorbiert und durch Eluierung mit 1M NaCI in dem gleichen Puffer in 300ml aufgefangen (Gewinnung: 65%). Die Enzymlösung wird dann anhand von 1OmM Bis-Tris-Pufv</r, pH-Wert 6,0, dialysiert und einer Sepharose-Schnellflußsäule DEAE (60ml Bettvolumen) zugeführt, die in dem gleichen Puffer äquilibriert worden war. Die Enzymaktivität wird durch Anwendung eines NaCI-Gradienten von 0-0,5M in einem Puffer bei etwa 0.15M NaCI eluiert (Gesamtgewinn: 57%).Example 10.2: Isolation and purification of PGII from the culture filtrate of A. nldulans transformant G191 / pGW1800-13 The culture filtrate (about 21), which has a pH of about 4.9, is diluted five times with distilled water and then submerged Use of 2N NaOH brought to a pH of 6.0. To concentrate the enzyme, the solution is fed to a Sephadex DEAE-A50 column of 600 ml pre-equilibrated in 20 mM potassium phosphate buffer, pH 6.0, maintained in a Büchner funnel to allow high flow rates. All enzyme activity is adsorbed onto the ion exchange material and collected by elution with 1M NaCl in the same buffer in 300 ml (recovery: 65%). The enzyme solution is then dialysed from 10 mM Bis-Tris-Pufv </ r, pH 6.0 and fed to a Sepharose fast-flow column DEAE (60 ml bed volume) equilibrated in the same buffer. The enzyme activity is eluted by applying a NaCl gradient of 0-0.5M in a buffer at about 0.15M NaCl (total gain 57%).
Beispiel 10.3: Eigenschaften von PQII, die aus dem Kulturf lltrat des A. nldulans-Transformanten A. nldulans Q 191/pGW1800-13 gereinigt wurdeExample 10.3: Properties of PQII purified from the culture filtrate of the A. nldulans transformant A. nldulans Q191 / pGW1800-13
PGII, die nach Beispiel 10.2 gereinigt wurde, ist mit dem Enzym verglichen worden, das aus Rapidase gereinigt wurde, wie das im Beispiel 1.1 beschrieben wurde (Fall PGiI). Beide Enzyme haben auf SDS-Polyacrylamidgelen eine identische scheinbare Molekülmasse von 38kDa, und sie reagieren identisch mit polyklonalen Antikörpern und mit dem monoklonalen Antikörper (siehe Beispiel 6.4). Nach der isoelektrischen Fokussierung hat PGII, die durch den A. nldulans-Transformanten produziert und nach Beispiel 10.2 gereinigt wurde, eine weit geringere Mikroheterogenität als das Enzym, das durch A. nlger produziert wurde, da neben der Hauptbande (pl-Wert 5,2) nur eine kleinere Bande festgestellt wird.PGII purified according to Example 10.2 has been compared with the enzyme purified from Rapidase as described in Example 1.1 (Case PGiI). Both enzymes have an apparent molecular weight of 38 kDa on SDS-polyacrylamide gels, and they react identically with polyclonal antibodies and with the monoclonal antibody (see Example 6.4). After isoelectric focusing, PGII produced by the A. nldulans transformant and purified according to Example 10.2 has a much lower microheterogeneity than the enzyme produced by A. nlger, in addition to the major band (pI value 5.2 ) only a smaller band is detected.
Die kinetischen Eigenschaften beider Enzyme wurden durch Messung der Polygalacturonaseaktivität bei 250C in 0,075 M Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,2, bei Variieren der Polygalacturonatkonzentration zwischen 0,2 und 1 mg/ml unter Anwendung eines modifizierten Ferricyanidtests verglichen. F'ir die A.nlger-PGII von Rapidase beträgt Vm,x 2760 Einheiten/mg Protein bei einem Wert Kn, von 0,8 mg/ml Polygalacturonat (USB). Bei der PGII, die von dem Transformanten abgeleitet wurde, ist der Vmix-Wert geringfügig höher, er beträgt 3480 Einheiten/mg Protein, während der Kn,-Wert identisch ist. Schließlich wurde PGII, die aus dem A. nldulans-Transformanten gereinigt wurde, mit Cyanogenbromid nach Beispiel 1.3 behandelt (Fall PGII). Das ergibt ein identisches Muster der Fragmente wie bei PGII, die aus Rapidase gereinigt wurde.The kinetic properties of both enzymes were compared by measuring polygalacturonase activity at 25 ° C. in 0.075 M sodium acetate buffer, pH 4.2, varying the polygalacturonate concentration between 0.2 and 1 mg / ml using a modified ferricyanide assay. For the A. nlger PGII of Rapidase is V m , x 2760 units / mg protein at a K n value of 0.8 mg / ml polygalacturonate (USB). For the PGII derived from the transformant, the Vmix value is slightly higher, being 3480 units / mg protein, while the K n , value is identical. Finally, PGII purified from the A. nldulans transformant was treated with cyanogen bromide according to Example 1.3 (case PGII). This results in an identical pattern of fragments as PGII purified from Rapidase.
Die Expression des pgall-Gen» von A. nlger NW756 In transformierten A. nlger N 593-StSmmen pGW1756 (Beispiel 3.10) wird zur Transformation von A. nlger N 593 unter Verwendung von pGW635 als dem selektiven Vektor verwendet (siehe Beispiel 5.2). Acht willkürlich herausgegriffene Transformanten werden gereinigt und für die weitere Analyse verwendet. Sie werden auf einem flüssigen Minimalsalzmedium gezogen, dem Ammoniumchlorid (4,0g/l), 1 % Pektin (Veresterungsgrad 61,2%) und 1% getrocknete und gemahlene Zuckerrübenpulpe zugesetzt werden, wobei nach den im Beispiel 5.5 beschriebenen Bedingungen gearbeitet wird. Die PGII-Überproduktion in die Kulturfiltrate der Transformanten wird durch Western-Blotting gezeigt, wobei mit PGII-spezifischen Antikörpern gearbeitet wird. Zwei der PGII-überproduzierenden Transformanten (N593/pGW1756-6und N593/pGW 1756-7) werden ausgewählt, und diese Stämme und der Kontrollstamm N 402 (siehe Beispiel 5.5) werden wieder unter den oben beschriebenen Bedingungen gezogen. Kulturfiltrate erhält man nach 44 Stunden nach Impfung, und die Polygalacturonaseaktivität in den Rohfiltraten wird in der beschriebenen Art und Weise bestimmt (Ref.2), während das Enzymreaktionsgemisch bei einem pH-Wert von4,8 unter Verwendung von 5OmM Natriumacetat gepuffert wird.Expression of the pgall gene from A. niger NW756 in transformed A. nlger N 593 strain pGW1756 (Example 3.10) is used to transform A. nlger N 593 using pGW635 as the selective vector (see Example 5.2). Eight arbitrarily picked transformants are cleaned and used for further analysis. They are grown on a liquid minimum salt medium to which ammonium chloride (4.0 g / l), 1% pectin (degree of esterification 61.2%) and 1% dried and ground sugar beet pulp are added, operating according to the conditions described in Example 5.5. The PGII overproduction into the culture filtrates of the transformants is demonstrated by Western blotting using PGII-specific antibodies. Two of the PGII overproducing transformants (N593 / pGW1756-6 and N593 / pGW 1756-7) are selected and these strains and the control strain N 402 (see Example 5.5) are again grown under the conditions described above. Culture filtrates are obtained after 44 hours after inoculation and the polygalacturonase activity in the crude filtrates is determined in the manner described (Ref. 2) while the enzyme reaction mixture is buffered at pH 4.8 using 5 mM sodium acetate.
Die Ergebnisse zeigen auch, daß das pgall-Gen auf pGW1756 funktional ist und daß dieses Plasmid zur Transformation vonThe results also show that the pgall gene is functional on pGW1756 and that this plasmid is useful for transforming
A. nlger zur Überausprägung oder Überexpression von Polygalacturonaseaktivität verwendet werden kann.A. can be used for over-expression or overexpression of polygalacturonase activity.
Produktion von Polygalacturonase C durch transformierte A. nidulans-StSmme Plasmid pgW1919, welches das pgaC-Gen von A.niger N400 trägt (Beispiel 7.3), wird als das ^transformierende Plasmid in einem Experiment verwendet, das für die Transformation von A. nldulans G191 zur Uridinprototrophie aufgebaut ist, wie das im Beispiel 9.2 beschrieben wurde. Zehn der resultierenden Transformanten werden gereinigt, und sie werden anschließend dazu verwendet, Sporen zur weiteren Analyse zu vermehren. Diese Stämme und G191 /pGW635-1 werden in einem flüssigen Minimalsalzmedium gezogen, das mit 2 mg/ml p-Aminobenzoat, 4,0g/l NH4CI als Stickstoffquelle, 1 % Zuckerrübenpulpe und 1 % Pektin als Kohlenstoffquellen ergänzt wurde, wobei Phosphat in einer hohen Konzentration (15g/l KH2PO4) zugesetzt wurde. Die Impfung erfolgt mit 10° Sporen/ml und die Inkubation )ei 3O0C in einem Gallenkamp-Orbitalschüttelapparat, der mit 250U/ min arbeitet. Kulturfiltrate werden 65 Stunden nach dem Impfen gewonnen, und die Filtrate werden anschließend ohne vorherige Reinigung oder Konzentration analysiert. Western-Blots werden mit einem Gemisch der anhand von PGI und PGII gezogenen Antikörper inkubiert (Beispiel 1.2). Es werden Aktivitätsmessungen (Ref. 2) in einem 5OmM Natriumacetatpuffer, pH-Wert 4,8 der 0,25% Polygalacturonsäure (USB) enthält, vorgenommen.Production of Polygalacturonase C by Transformed A. nidulans Strains Plasmid pgW1919 carrying the A. niger N400 pgaC gene (Example 7.3) is used as the transforming plasmid in an experiment used for the transformation of A. nldulans G191 to Uridinprototrophie is constructed, as described in Example 9.2. Ten of the resulting transformants are purified and then used to propagate spores for further analysis. These strains and G191 / pGW635-1 are grown in a liquid minimal salt medium supplemented with 2 mg / ml p-aminobenzoate, 4.0 g / l NH 4 Cl as nitrogen source, 1% sugar beet pulp and 1% pectin as carbon sources, using phosphate in a high concentration (15 g / l KH 2 PO 4 ) was added. The vaccination is carried out with 10 ° spores / ml and incubation) ei 3O 0 C in a Gallenkamp orbital shaker, operating at 250 U / min. Culture filtrates are collected 65 hours after seeding and the filtrates are then analyzed without prior purification or concentration. Western blots are incubated with a mixture of PGI and PGII raised antibodies (Example 1.2). Activity measurements (Ref. 2) are made in a 50 mM sodium acetate buffer, pH 4.8 containing 0.25% polygalacturonic acid (USB).
Ausgehend von den Wrrtern-Blottings, produzieren die meisten der gewonnenen Transformanten große Mengen an Polygalacturonase C (PGC). Dieses Ergebnis wird durch Messung der PG-Aktivität im Überstand der Transformanten und von einem Kontrollstamm (A.nldulans G191, transformiert mit pGW635) bestätigt.Based on the word blotting, most of the transformants obtained produce large amounts of polygalacturonase C (PGC). This result is confirmed by measuring the PG activity in the supernatant of the transformants and a control strain (A.nldulans G191, transformed with pGW635).
Die Expressfon der pgaA- und pgaD-Gene von A. nlger In transformierten A. nidulans-StS mmen Neben den pgal-, pgall- und pgaC-Genen werden andere Glieder der Polygalacturonase-Gen-Familie von A.niger (Beispiel 7.2) zur Transfermation von A. nldulans verwendet. Im vorliegenden Beispiel werden Klone des Phagen λ anstelle von dessen Subklonen in einem Plasmidvektor verwendet.The Expressfon of A. nlger pgaA and pgaD Genes In Transformed A. nidulans Strains In addition to the pgal, pgall, and pgaC genes, other members of the A. niger polygalacturonase gene family (Example 7.2) are used Transfermation used by A. nldulans. In the present example, phage λ clones are used instead of its subclones in a plasmid vector.
Phagen-A-DNA wird aus Plattenlysaten hergestellt, wie das im Beispiel 3.5 beschrieben wurde, und wird dann ein weiteres Mal mit Phenol und Chloroform extrahiert. Für ein Cotransformationsexperiment werden etwa 20pg λ-DNA verwendet, und die DNA wird in etwa gleichen Mengen von 2 Phagen derselben Klasse gewonnen (z.B. APG-A10 in Kombination mit APG-A43 oder APG-D8 in Kombination mit APG-D11). Die Cotransformation von A. nldulans G191 wird wie im Beispiel 9.2 ausgeführt, während die Kontrollen in diesem Fall die Cotransformation mit pGW1900 und APGI-7 getrennt einschließen. Bei Verwendung von A-Phagen-DNA, die in der oben beschriebenen Art und Weise hergestellt worden ist, sind die Transformationshäufigkeiten niedriger als die von Plasmid-DNA, die durch Bandenbildung in Cäsiumchloridgradienten gereinigt wurde.Phage A DNA is prepared from plate lysates as described in Example 3.5 and is then extracted once more with phenol and chloroform. For a cotransformation experiment, approximately 20 μg of λ DNA is used and the DNA is recovered in approximately equal amounts of 2 phages of the same class (e.g., APG-A10 in combination with APG-A43 or APG-D8 in combination with APG-D11). The cotransformation of A. nldulans G191 is carried out as in Example 9.2, while the controls in this case include cotransformation with pGW1900 and APGI-7 separately. When using A-phage DNA prepared in the manner described above, the transformation frequencies are lower than that of plasmid DNA purified by banding in cesium chloride gradients.
Die relevanten Transformanten werden gereinigt und so analysiert, wie das für die pGW1910-Transformanten im Beispiel 12 beschrieben wurde. In diesem Fall werden die Transformanten auch auf einem Medium gezogen, das 3% Glucose als Kohlenstoffquelle enthält (hoher Phosphatgehalt, 0,1 % Hefeextrakt, 1 % Ammoniumchlorid).The relevant transformants are purified and analyzed as described for the pGW1910 transformants in Example 12. In this case, the transformants are also grown on a medium containing 3% glucose as carbon source (high phosphate content, 0.1% yeast extract, 1% ammonium chloride).
Unter Verwendung der Phagen der Klasse PG-A bzw. PG-D, die oben genannt wurden, wurden Transformanten A. nldulans-G 191/LambdaA-1 und -G 191/LambdaD-1 gewonnen. Die Polygalacturonaseaktivitäten in den Kulturfiltraten des Zuckerrubenpulpe'/Pektinmediums waren 65 Stunden nach dem Impfen erheblich größer als beim Kontrollstimm G191/ pGW635-1. Die in den Phagen der Klasse A und D vorhandenen pgall-verwandten Sequenzen codieren also Proteine mit Polygalacturonaseaktivität. Ausgehend von den Western-Blots, wird geschlußfolgert, daß diese Genprodukte, die Polygalacturonasen A bzw. D, mit einer ähnlichen elektrophonischen Mobilität wie PGI wandern.Using the phages of class PG-A and PG-D, respectively, mentioned above, transformants A. nldulans-G 191 / lambda A-1 and -G 191 / lambda D-1 were obtained. The polygalacturonase activities in the culture filtrates of the Zuckerrubenpulpe / pectin medium were significantly greater at 65 hours after seeding than at control G191 / pGW635-1. The pgall-related sequences present in the class A and D phages thus encode proteins with polygalacturonase activity. From Western blots, it is concluded that these gene products, polygalacturonases A and D, respectively, migrate with a similar electrophonic mobility to PGI.
A. nldulans-G 191/LambdaA-1 produziert Polygalacturonase A auch auf dem Medium mit Glucose als Kohlenstoffquelle.A. nldulans G 191 / lambda A-1 also produces polygalacturonase A on the medium with glucose as the carbon source.
Für ein Cotransformationsexperiment werden etwa 20pg Plasmid-DNA pGII-IFN AM 119 oder pGllss-IFN AM 119 eingese\zt. Die Cotransformation von A. nldulans G191 erfolgt In der im Beispiel 9.2 beschriebenen Art und Weise.For a cotransformation experiment, about 20 μg of plasmid DNA pGII-IFN AM 119 or pGllss-IFN AM 119 are inserted. The cotransformation of A. nldulans G191 is carried out in the manner described in Example 9.2.
Die relevanten Transformanten werden so gereinigt und analysiert, wie das für die Transformation im Beispiel 8.4 beschrieben wurde. In diesem Fall werden die Transformanten auch auf einem Medium gezogen, das 3% Glucose als Kohlenstoffquelle enthält (hoher Phosphatgehalt, 0,1 % Hefeextrakt, 1 % Ammoniumchlorid).The relevant transformants are purified and analyzed as described for the transformation in Example 8.4. In this case, the transformants are also grown on a medium containing 3% glucose as carbon source (high phosphate content, 0.1% yeast extract, 1% ammonium chloride).
Zu mehreren Zeitpunkten (alle 20 Stunden) werden Proben genommen, die Zellen werden durch Zentrifugieren pelletiert undAt several times (every 20 hours) samples are taken, the cells are pelleted by centrifugation and
durch Gefriertrocknen und Trockenmahlen aufgebrochen. Der Überstand und die Zellextrakte werden auf Interferonaktivität geprüft {siehe oben). Die Masse der Interferonaktivität wird sekrstiert in das Medium in Transformanten gefunden, die pGII: s-IFN AM 119 tragen, während sie sich bei Transformanten, die pGII-IFNAM 119 tragen, vorwiegend im Zellextrakt nachweisen läßt, was darauf hinweist, daß A. nldulans IFN aus pGII-IFN AM 119 oder pGllss-IFN AM 119 produziert, wenn Glucose als einzige Kohlenstoffquelle verwendet wird.disrupted by freeze drying and dry milling. The supernatant and cell extracts are assayed for interferon activity (see above). The mass of interferon activity is found secreting into the medium in transformants carrying pGII: s-IFN AM 119, whereas in transformants carrying pGII-IFNAM 119 it is predominantly detected in the cell extract, indicating that A. nldulans IFN from pGII-IFN AM 119 or pGllss-IFN AM 119 produces when glucose is used as the sole carbon source.
Die Zelltrennung von Gurkengewebe wird zur Prüfung der mazerierenden Aktivität von A.ni.qer-Polygalacturonasen verwendet. Im örtlichen Gemüseladen wird eine Gurkenfrucht gekauft, und die Oberfläche wird anschließend durch Abwischen mit einem Tuch, das mit Ethanol getränkt war, oder durch einstündiges Abspülen in Javellescher Lauge 'Handelsqualität, auf 0,5% Natriumhypochlorit verdünnt) dekontaminiert. Die Gurke wird dann in Scheiben geschnitten, und das weiche Innere der Gurkenscheibe wird entfernt. Zwei der resultierenden Scheiben (etwa 12g) werden in einen fc'rlenmeyerkolben zu 100ml, der 25ml eines Mazerationspuffers enthält, welchem vorher Polygalacturonase zugesetzt oder nicht zugesetzt wurde, gegeben. Die anschließende Inkubation geht über 24 Stunden unter sanftem, ungerichtetem Schütteln in einem Wasserbad, das über einen Thermostaten bei 300C gehalten wurde. Anschließend werden die Kolben visuell überprüft. Eine vollständige Mazeration erfüllt folgende Kriterien: (i) die Schale der Gurkenfrucht ist im wesentlichen frei von anhaftendem Gewebe, was durch makroskopische Untersuchung gezeigt wird; (ii) der Mazerationspuffer ist stark trüb geworden; (Hi) es besteht eine positive Korrelation zwischen der Zelltrennung und der hohen Trübung des mazerierenden Puffers, wie durch einen hohen Anteil loser Zellen angezeigt wird, die intakt zu sein scheinen, was durch mikroskopische Sichtbarmachung beurteilt wird.Cell separation of cucumber tissue is used to test the macerating activity of A.ni.qer polygalacturonases. A cucumber fruit is purchased at the local grocery store and the surface is then decontaminated by wiping with a cloth soaked in ethanol or by rinsing in Javel lye of commercial grade for one hour, diluted to 0.5% sodium hypochlorite). The cucumber is then sliced and the soft interior of the cucumber slice is removed. Two of the resulting slices (about 12 g) are added to a 100 ml conical flask containing 25 ml of a maceration buffer to which polygalacturonase has been previously added or not added. The subsequent incubation is for 24 hours with gentle, undirected shaking in a water bath, which was held at 30 0 C via a thermostat. Then the flasks are checked visually. Complete maceration meets the following criteria: (i) the cucumber fruit shell is substantially free of adherent tissue, as revealed by macroscopic examination; (ii) the maceration buffer has become very cloudy; (Hi) There is a positive correlation between cell separation and high turbidity of the macerating buffer, as indicated by a high proportion of loose cells that appear to be intact, as judged by microscopic visualization.
Polygalacturonase Il und Polygalacturonase I, die auf die im Beispiel 1 beschriebene Art und Weise hergestellt worden waren, werden in verschiedenen Puffern geprüft. Mazerationspuffer A (MBA) ist 5OmM Natriumacetat, pH-Wert 4,8. Mazerationspuffer B (MBB) ist ein Phosphateitratpuffer (Ishii [1976], Phytopathology 66, £.281-289). MBB wird durch Mischen von 0,1 M Citronensäure und 0,1 M Na2HPGyLösung hergestellt, bis der gewünschte pH-Wort von 4,5 erreicht ist, und dann wird ein gleiches Volumen destilliertes Wasser zugesetzt, und anschließend wird Rinderserumalbumin biszu einer Endkonzentration von 10 mg/25 ml unter Verwendung einer konzentrierten Lösung von 10mg/ml zugegeben.Polygalacturonase II and polygalacturonase I, prepared in the manner described in Example 1, are tested in various buffers. Maceration Buffer A (MBA) is 5 mM sodium acetate, pH 4.8. Maceration Buffer B (MBB) is a phosphate nitrate buffer (Ishii [1976], Phytopathology 66, £ .281-289). MBB is prepared by mixing 0.1 M citric acid and 0.1 M Na 2 HPGy solution until the desired pH of 4.5 is reached, then adding an equal volume of distilled water and then bovine serum albumin to a final concentration of 10 mg / 25 ml using a concentrated solution of 10 mg / ml.
Gurkengewebe wird innerhalb von 24 Stunden vollständig mazeriert, wenn 1 pg Polygalacturonase M in MBA eingesetzt wird. In diesem Puffer wird das Gurkengewebe bei Fehlen von Polygalacturonase oder bei Vorhandensein von 1 [ig Polygalacturonase I nicht mazeriert. Die Mazeration von Gurkengewebe in MBB wird bei Fehlen von Polygalacturonase oder bei Vorhandensein von 10pg Polygalacturonase I bzw. Polygalacturonase Il geprüft. Auch in diesem Fall wird bei Fehlen des Enzyms oder bei Vorhandensein von Polygalacturonase I keine Mazeration beobachtet, während Polygalacturonase Il das Gurkengewebe vollständig mazeriert. PGII, die nach Beispiel 10 hergestellt wurde, hat auch mazerierende Eigenschaften.Cucumber tissue is completely macerated within 24 hours when 1 μg polygalacturonase M is used in MBA. In this buffer, the cucumber tissue is not macerated in the absence of polygalacturonase or in the presence of 1 % polygalacturonase I. The maceration of cucumber tissue in MBB is tested in the absence of polygalacturonase or in the presence of 10 μg polygalacturonase I or polygalacturonase II. Also in this case, no maceration is observed in the absence of the enzyme or in the presence of polygalacturonase I, while polygalacturonase II completely macerates the cucumber tissue. PGII prepared according to Example 10 also has macerating properties.
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Bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Mascheroder Weg 16,D- 330Q Braunschweig, wurden folgende Mikroorganismen und Phagen deponiert:At the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSM), Mascheroder Weg 16, D-330Q Braunschweig, the following microorganisms and phages were deposited:
Sequenzaufstellungsequence Listing
SEQ ID NO. 1SEQ ID NO. 1
Sequenztyp: Nucleotid mit entsprechendem PolypeptidSequence type: nucleotide with corresponding polypeptide
Sequenzlänge: 2495 BasenpaareSequence length: 2495 base pairs
Strangart: DoppelstrangStrand type: double strand
Topologie: linearTopology: linear
Merkmale: Genpg von 1 bis 909: von 901 bis 963: von 901 bis 1 002: von 1003 bis 2 127: von 1138 bis 1189: von 1610 bis 1671: von 2138 bis 2 130: von 2131 bis 2 495:Characteristics: Genpg from 1 to 909: from 901 to 963: from 901 to 1 002: from 1003 to 2 127: from 1138 to 1189: from 1610 to 1671: from 2138 to 2 130: from 2131 to 2 495:
gaattcggaagaattcggaa
tcctaaaatttcctaaaatt
gaacccctgagaacccctga
tgattcgcggtgattcgcgg
cactcgatagcactcgatag
tcagtgcggctcagtgcggc
tgagtcccagtgagtcccag
ccaaggaccgccaaggaccg
attgccgagaattgccgaga
aagcatgttgaagcatgttg
atggggcagaatggggcaga
agtggagatgagtggagatg
gaccttcagcgaccttcagc
''.'..: uerCodierung für A.nlger N400-Präpro-Polygalacturonase I''. '..: Coding for A.nlger N400 prepro-polygalacturonase I
codierender Bereich für PGI-Signalpeptidcoding region for PGI signal peptide
codierender Bereich für PGI-Präprosequenzcoding region for PGI preprosequence
codierender Bereich für reife PGIcoding area for mature PGI
3'-nichtcodierender Bereich, Teil des Transkriptionsterminatorbereiches3 'non-coding region, part of the transcriptional terminator region
TAC CAG Tyr GIn 5TAC CAG Tyr GIn 5
GTC VaIGTC VaI
TTC PheTTC Phe
TCT SerTCT Ser
GCT AlsGCT Als
CTT LeuCTT Leu
GCC AIaGCC AIa
AAGAAG
LysLys
CTT LeuCTT Leu
GCC AIaGCC AIa
AAG LysAAG Lys
GGC GIyGGC GIy
CCCCCC
ProPer
2020
GCC AIaGCC AIa
ATCCATGCCT CCGTTAGCGT TGCTTACCAA CCTGGCTÜAA GGTGGATCGGATCCATGCCT CCGTTAGCGT TGCTTACCAA CCTGGCTÜAA GGTGGATCGG
gaggtatctcgaggtatctc
tggaccagtctggaccagtc
tcgttgagattcgttgagat
tccttghcttccttghct
ttttggccgattttggccga
acaatcaccacaatcacc
CTG LeuCTG Leu
GCT AIaGCT AIa
TCT SerTCT Ser
GCC AIa 10GCC AIa 10
CCT ProCCT Pro
GCT AIaGCT AIa
TCT SerTCT Ser
acaacgacgtacaacgacgt
aaccagggtcaaccagggtc
tcaatcatattcaatcatat
gggtctttgcgggtctttgc
tctagtctcgtctagtctcg
tgctggtgggtgctggtggg
TCTTGGGTCA CTGAGATACG TGCTGTGATG GCGCCCATCG AGGGTCCCCT ACTGCTTTGT TTTCACGTAT GCTCTATCCA TTCTTTCTGT AACCTGTTCT ATG CAC Met His 1TCTTGGGTCA CTGAGATACG TGCTGTGATG GCGCCCATCG AGGGTCCCCT ACTGCTTTGT TTTCACGTAT GCTCTATCCA TTCTTTCTGT AACCTGTTCT ATG CAC Met His 1
GTC VaIGTC VaI
CGC' ArgCGC 'Arg
ACC TGC ACCACC TGC ACC
Thr Cys ThrThr Cys thr
3535
GGC GIyGGC GIy
GTC VaI 25GTC VaI 25
TTC PheTCT SerTTC PheTCT Ser
TCC SerTCC Ser
TCC SerTCC Ser
ACC ThrACC Thr
CTCCTC
Lou 15Lou 15
GAG GIuGAG GIu
TCT SerTCT Ser
40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 48040 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 480
520 560 600 640 680 720 760 800 840 880 918520 560 600 640 680 720 760 800 840 880 918
954954
990990
10261026
GAT AspGAT Asp
TCT SerTCT Ser
GTT VaIGTT VaI
GAG ACC GIu Thr 65GAG ACC GIu Thr 65
GAG GIuGAG GIu
GTC VaIGTC VaI
CTC LeuCTC Leu
GCC AIaGCC AIa
CTGCTG
LeuLeu
5555
GAC AspGAC Asp
AGC GAG Ser GIu 45AGC GAG Ser GIu 45
AGC SerAGC Ser
CTG LeuCTG Leu
AGC SerAGC Ser
TCC SerTCC Ser
AGC ATC Ser HeAGC ATC Ser He
AC MeAC Me
GAT GCT Asp AIa 70GAT GCT Asp AIa 70
TCC SerTCC Ser
GAG GTC GIu VaI 60GAG GTC GIu VaI 60
GCT AIaGCT AIa
AGC SerAGC Ser
CCC ProCCC Pro
GAT AspTGCGAT AspTGC
CysCys
5050
GCT AIaGCT AIa
TCC SerTCC Ser
GGC GIyGGC GIy
GGC TCCGGC TCC
GIy SerGIy Ser
7575
10221022
10981098
11341134
ACC ThrACC Thr
ATC HeATC Hey
ACC ThrACC Thr
TTC PheTTC Phe
GAGGAG
GIuGlu
8080
GGC GIyGGC GIy
ACC ThrACC Thr
ACT ThrTCC SerACT ThrTCC Ser
TTCTTC
PhePhe
8585
11771177
12161216
SEQIDNO.2SEQIDNO.2
von 1 bis 1 356: Promotorbereichvon 1 357 bis 1 419: codierender Bereich für PGII-Signalpeptidvon 1 357 bis 1 437: codierender Bereich für PGII-Präprosequenzvon 1 438 bis 2 494: codierender Bereich für reife PGIIvon 1 987 bis 2 038: Intronvon 2 495 bis 2 497: Stoppcodonfrom 1 to 1 356: promoter region from 1 357 to 1 419: coding region for PGII signal peptide from 1 357 to 1 437: coding region for PGII preprosequence from 1 438 to 2 494: coding region for mature PGII from 1 987 to 2 038: intron from 2 495 to 2 497: stop codon
von 2 498 bis 3 031:3'-nichtcodierender Bereich. Teil des Transkriptionsterminatorbereichesfrom 2 498 to 3 031: 3 'non-coding region. Part of the transcription terminator area
AACACGCTGG GGTCAGAGCA AACCTTGAAA GAGGGTAATG GGAATAGTGT CAGACATAAA TGCCCCGAGG CGCGCTCGAT TGAGGTTGTT GAAAAAACGTAACACGCTGG GGTCAGAGCA AACCTTGAAA GAGGGTAATG GGAATAGTGT CAGACATAAA TGCCCCGAGG CGCGCTCGAT TGAGGTTGTT GAAAAAACGT
40 80 120 160 200 240 280 320 360 40040 80 120 160 200 240 280 320 360 400
SEQIDNO.3SEQIDNO.3
von 890 bis 952: codierender Bereich für PGII-Signalpep'.idfrom 890 to 952: coding region for PGII signal peptide
von 890 bis 970: mutmaßlicher codierender Bereich für PGII-Präprosequenzvon 971 bis 2 027: mutmaßlicher codierender Bereich für reife PGIIfrom 890 to 970: putative coding region for PGII preprosequence from 971 to 2 027: putative coding region for mature PGII
von 1 520 bis 1 571: Intronvon 2 028 bis 2 030: Stoppcodonfrom 1 520 to 1 571: intron from 2 028 to 2 030: stop codon
von 2 031 bis 3 047:3'-nkhtcodierender Bereich, Teil des Transkriptionsterminatorbereichesfrom 2,031 to 3,047: 3'-nk coding region, part of the transcriptional terminator region
ACACTGCAGA ACCCGTTTCC ATTATAGTAC TATGAATCTGACACTGCAGA ACCCGTTTCC ATTATAGTAC TATGAATCTG
acgctcaaga gaacctgttcacgctcaaga gaacctgttc
ccaccacggcccaccacggc
cttaagttcacttaagttca
cttaatgtgacttaatgtga
aggctgtcggaggctgtcgg
gctgaaattggctgaaattg
tgaggtgagttgaggtgagt
agaccgattaagaccgatta
TCACCGnGGTCACCGnGG
AGTGACTAG^AGTGACTAG ^
CACTCT(TTTCACTCT (TTT
ATCCCAAGGC ATGGCTGTTT TGTCTTGAGT TCCACCTTGAATCCCAAGGC ATGGCTGTTT TGTCTTGAGT TCCACCTTGA
GTCC111111GTCC111111
40 80 120 160 200 240 280 320 36040 80 120 160 200 240 280 320 360
400 440 480 520 560 600400 440 480 520 560 600
640 680 720 760 8CO 840 880640 680 720 760 8CO 840 880
916 952916 952
988 1024 1060 1096 1132 1168 1204 1240 1276 1312 1348 1384 1420 1456 1492 1529988 1024 1060 1096 1132 1168 1204 1240 1276 1312 1348 1384 1420 1456 1492 1529
SEQIDNO.4SEQIDNO.4
Sequenztyp: Nucleotid mit entsprechendem Polypeptid Sequenzlänge: 2304 Strangart: Doppelstrang Topologie: linear Molekültyp: genomisch Organismus-Originalquelle: Aspergillus niger N400 Unmittelbare experimentelle Quelle: pGW1910 (DSM 5943)Sequence type: nucleotide with corresponding polypeptide Sequence length: 2304 Strand type: double strand Topology: linear Molecule type: genomic Original source: Aspergillus niger N400 Direct experimental source: pGW1910 (DSM 5943)
Merkmale: Gen pgaC mit der Codierung für A. niger N400-Präpro-Polygalacturonase C Von 1 bis 662: Promotorbereich von 663 bis 710: codierender Bereich für PGC-Signalpeptid von 663 bis 782: mutmaßlicher codierender Bereich für Präprosequenz von 783 bis 1 995: mutmaßlicher codierender Bereich für reife PGC von 927 bis 1 001: Intron von 1 428 bis 1 438: Intron von 1 614 bis 1 666: intron von 1 996 bis 1 998: Stoppcodon von 1 999 bis 2 304: S'-Nichtcodierender Bereich, Teil des TranskriptionsterminatorbereichesFeatures: Gene pgaC encoding A. niger N400 prepro-polygalacturonase C From 1 to 662: 663 to 710 promoter region: coding region for PGC signal peptide from 663 to 782: presumptive coding region from 783 to 1 995: putative coding region for mature PGC from 927 to 1 001: intron from 1 428 to 1 438: intron from 1 614 to 1 666: intron from 1 996 to 1 998: stop codon from 1 999 to 2 304: S 'non-coding region, Part of the transcription terminator area
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---|---|---|---|
ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |