JPH0847396A - 天然タンパク質甘味料の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 タウマチンＩＩまたはＩを、特定の規則に準
じて、それらの天然遺伝子ではなく人工、合成および実
質的に最適化した遺伝子の発現により得ることができ
る。好ましくは、この発現は、糸状菌、とりわけＧＲＡ
Ｓ真菌および特にＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅ
ｆｏｒｔｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒお
よびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのａｗａｍｏ
ｒｉ変異株種で行う。 【効果】 タウマチンの場合について本発明で初めて行
った糸状菌用の実質的に最適化された人工遺伝子の調製
により高タンパク質発現が可能となり、本発明の方法は
有価な甘味料の工業的生産に有用である。タウマチン
は、分泌シグナルを有するプラスミドを用いることによ
り細胞外産生で、および細胞内産生で得ることができ
る。後者の方法は、真菌菌糸体の分離を予め行うことな
く動物飼料に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野 本発明は、遺伝子工学または組換えＤＮＡ技術に基づく
ものであり、タウマチン型の天然タンパク質甘味料を得
る方法、糸状菌中での発現について最適化されかつこれ
らのタンパク質をコードしている新規なＤＮＡ配列、お
よびタウマチンの産生用糸状菌の形質転換におけるこれ
らの配列の使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】タウマチンは、甘味が強く、食物の嗜好
性を増加する能力（他の風味を高めたり向上すること）
を有するタンパク質であり、産業界では、タウマチン
は、現在のところ、植物Ｔｈａｕｍａｔｏｃｃｏｃｕｓ
ｄａｎｉｅｌｌｉｉ Ｂｅｎｔｈの実の仮種皮から抽
出されている。タウマチンは、これらの仮種皮から、イ
オン交換クロマトグラフィーを用いて分離できる少なく
とも５種の異なる形態（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ｂおよび
ｃ）として分離できる。これらの形態は、すべて２０７
アミノ酸で、分子量約２２，０００ダルトンの単一鎖ポ
リペプチドである。仮種皮に顕著に含有され、アミノ酸
の配列が極めて類似しているタウマチンＩおよびＩＩ
は、ショ糖よりもはるかに甘味が高い（ある推定によれ
ば甘味が１００，０００倍高い）。天然物である上に、
タウマチンＩおよびＩＩは無毒であり、動物および人間
用食品工業における一般の甘味料の代替物として良好で
ある。

【０００３】その利点にもかかわらず、抽出に附する果
実を得るのが極めて困難であることから、植物由来のタ
ウマチンの工業的用途は極めて限られている。タウマチ
ン作出植物Ｔ．ｄａｎｉｅｌｌｉｉは、熱帯気候および
昆虫による受粉が必要なだけでなく、他の木の間で栽培
しなければならず、しかもその花の７５％は実をつけな
い。

【０００４】Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＥＰ
５４．３３０、ＥＰ５４．３３１およびＷＯ８９／０６
２８３参照）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓお
よびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ等の
細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ（ＷＯ８７／０３００７参照）およびＫｌｕｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（ＥＰ９６．４３０および
ＥＰ９６．９１０）等の酵母、真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＨａｈｍおよびＢａｔｔ、Ａｑｒ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０、第５４巻、第２
５１３〜２０頁）並びにＳｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏ
ｓｕｍ等の遺伝子導入植物中で遺伝子工学によりタウマ
チンを産生する試みがなされたが、いままで、十分なも
のでなくしたがって、産業界が入手できるタウマチンは
極めて不足しており高価である（Ｍ．Ｗｉｔｔｙおよび
Ｗ．Ｊ．Ｈａｒｖｅｙ、”Ｓｅｎｓｏｒｙ ｅｖａｌｕ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｓｏｌａｎ
ｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒ−ｔ
ｈａｕｍａｔｉｎ ＩＩ”、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｒｐ ａｎｄ Ｈｏｒｔｉ
ｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ、１９９０、第１８
巻、第７７〜８０頁およびそこに引用されている論文参
照）。

【０００５】したがって、当該技術分野においては、工
業的に利用できる量のタウマチンを妥当な値段で得る課
題は解決されていない。

【０００６】

【発明の概要】本発明は、糸状菌での発現によるが、真
菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅについて記載
されているような天然ＤＮＡ（または誘導ｃＤＮＡ）を
使用することなくタウマチンＩＩおよびＩを製造する課
題を解決する。むしろ、人工、合成および実質的に最適
化された遺伝子を、特定の規則にしたがって糸状菌での
発現に使用する。

【０００７】糸状菌用の実質的に最適化された人工遺伝
子を得ることは、タウマチン用にここで初めてなされ、
タンパク質の高発現が可能となり、この方法は工業的に
有用なものとなる。

【０００８】

【発明の具体的説明】本発明の特定の実施態様では、使
用される糸状菌は、無毒と考えられるものに属し、特に
ＧＲＡＳ一覧（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｃｏｇｎｉｚ
ｅｄ ａｓＳａｆｅ）（認定安全性）に含まれているも
のである。好ましいＧＲＡＳ菌類には、Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ属があり、とりわけＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ種またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ属、とりわけｎｉｇｅｒ種およびｎｉｇｅｒ変異株ａ
ｗａｍｏｒｉが含まれる。

【０００９】本発明は、タウマチンＩおよびＩＩを分泌
または細胞外産生（このためには、適当な分泌シグナル
をプラスミドに導入しなければならない）して得るこ
と、並びにタウマチンＩおよびＩＩを、菌糸体を真菌か
ら予め分離することなく動物用食物に使用することを可
能とする細胞内産生でタウマチンＩおよびＩＩを得るこ
とを包含する。

【００１０】また、次の略語を、以下で使用する： Ａ＝アデニン Ａｍｐ＝アンピシリン ＡＴＰ＝アデノシントリホスフェート ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン Ｃ＝シトシン ＣＩＰ＝子ウシ腸ホスファターゼ ｄＡＴＰ＝２´−デオキシアデノシントリホスフェート ｄＣＴＰ＝２´−デオキシシチジントリホスフェート ｄＧＴＰ＝２´−デオキシグアノシントリホスフェート ＤＮＡ＝デオキシリボ核酸 ＤＴＴ＝１，４−ジチオスレイトール ｄＴＴＰ＝２´−デオキシチミジントリホスフェート ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸（二ナトリウム塩） Ｇ＝グアニン ＧＲＡＳ＝認定安全性 ＫＤａ＝キロダルトン ＭＣＳ＝多重クローニング部位 ｎｔ＝ヌクレオチド ｐｂ＝塩基対 ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応 ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール ＰＭＳＦ＝フェニルメチルスルホニルフルオライド ｒｐｍ＝回転数／分 ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム ＳＳＣ＝ナトリウムシュウ酸ナトリウム（０．１５Ｍ
ＮａＣｌ；０．０１５Ｍシュウ酸ナトリウム） Ｔ＝チミン ＴＥ＝緩衝液１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１
ｍＭ ＥＤＴＡ Ｕ＝単位 Ｘ−ｇａｌ＝５−ブロモ−４−クロロ−３−インド−β
−Ｄ−ガラクトース

【００１１】アミノ酸をそれぞれの標準的な略語で示
す。プラスミドについては、それぞれについて公表され
ている表記を使用する。

【００１２】本発明の主題の一部は、糸状菌中での発現
に関し５０％を超えて最適化された、タウマチンＩＩを
コードしている人工、合成遺伝子にある。この遺伝子
は、配列番号１のアミノ酸配列（後にｎ停止配列（但
し、整数ｎは１以上である）が続くタンパク質タウマチ
ンＩＩの２０７アミノ酸に相当する）をコードしている
ＤＮＡ配列からなり、このＤＮＡ配列は、タウマチンＩ
Ｉの２０７アミノ酸をコードしている天然遺伝子（文献
に記載されおよび配列番号：１にも含まれている遺伝
子）のＤＮＡ配列を、１以上の（配列番号１における
ｎ）ＴＡＡ停止コドンを付加することにより、可能な改
変の５０％を超える割合で、改変を行うこと、およびタ
ウマチンＩＩアミノ酸に相当するヌクレオチドコドンを
可能な変化の５０％を超える割合で変化させることによ
り得られたものであり、前記変化は、一定のアミノ酸に
おける原コドンを以下のアミノ酸コドン表における
（ ）内に示したコドンで置換することからなる：Ａｌ
ａ（ＧＣＣ）、Ａｒｇ（ＣＧＣ）、Ａｓｎ（ＡＡＣ）、
Ａｓｐ（ＧＡＣ）、Ｃｙｓ（ＴＧＣ）、Ｌｙｓ（ＡＡ
Ｇ）、Ｇｌｎ（ＣＡＧ）、Ｇｌｕ（ＧＡＧ）、Ｇｌｙ
（ＧＧＣ）、Ｉｌｅ（ＡＴＣ）、Ｌｅｕ（ＣＴＣ）、Ｍ
ｅｔ（ＡＴＧ）、Ｐｈｅ（ＴＴＣ）、Ｐｒｏ（ＣＣ
Ｃ）、Ｓｅｒ（ＴＣＣ）、Ｔｈｒ（ＡＣＣ）、Ｔｒｐ
（ＴＧＧ）、Ｔｙｒ（ＴＡＣ）、Ｖａｌ（ＧＴＣ）。

【００１３】上記遺伝子が７５％を超える最適化がなさ
れた場合が好ましい。また、最適化が最大（１００％）
であるとき、即ち、人工遺伝子のＤＮＡ配列を配列番
号：１配列から、全ての可能なコドン変化の１００％を
行うことにより得られるときがさらに好ましい（配列番
号２に相当する）。また、上記遺伝子おいて、ｎが１〜
３であるものも好ましい。

【００１４】本発明の主題の別の一部は、糸状菌中での
発現に関し５０％を超えて最適化された、タウマチンＩ
をコードしている人工、合成遺伝子にある。この遺伝子
は、タンパク質タウマチンＩの２０７アミノ酸に相当す
るアミノ酸配列（配列番号：１のアミノ酸配列とは、５
個のアミノ酸、即ち、４６−Ａｓｎ、６３−Ｓｅｒ、６
７−Ｌｙｓ、７６−Ａｒｇ、および１１３−Ａｓｎのみ
が異なる２０７アミノ酸の配列）をコードしているＤＮ
Ａ配列からなり、この最適化されたＤＮＡ配列は、５個
のコドン：ＡＡＣ（４６−Ａｓｎ）、ＴＣＣ（６３−Ｓ
ｅｒ）、ＡＡＧ（６７−Ｌｙｓ）、ＣＧＣ（７６−Ａｒ
ｇ）、およびＡＡＣ（１１３−Ａｓｎ）を未変化のまま
残すことにより、かつタウマチンＩＩ遺伝子のＤＮＡ配
列に関してコドンの残りを上記のように変更することに
より、そして１以上のＴＡＡ停止コドンを付加すること
により得られる。タウマチンＩをコードし、７５％を超
えて最適化された遺伝子が、特に好ましい。最適化が最
大（１００％）であるときがさらに好ましい。１〜３Ｔ
ＡＡ停止コドンを付加した人工遺伝子が好ましい。

【００１５】以下、５０％を超え最適化された遺伝子、
７５％を超え最適化された遺伝子、または最大１００％
まで最適化された遺伝子を区別なく、「実質的に最適化
された遺伝子」と称する。

【００１６】また、本発明の主題は、組換えプラスミド
にあり、これは（ｉ）タウマチンＩまたはＩＩを得る目
的で実質的に最適化された遺伝子と、（ｉｉ）適当なプ
ロモーター配列と糸状菌用終止配列とを含有する糸状菌
用発現カセットと、（ｉｉｉ）適当な選択マーカーと、
そして（ｉｖ）タンパク質を細胞外産生するための任意
の分泌シグナルＤＮＡ配列とから構成される。

【００１７】前記発現カセットのプロモーター配列がＡ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓの酵素グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの遺
伝子由来であり、発現カセットの終止配列がＡｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのトリプトファンＣ配
列であり、そして選択マーカーがスルファニルアミド耐
性マーカーである組換えプラスミドが特に好ましい。ま
た、発現カセットのプロモーター配列が、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの酵素グルコアミラーゼの遺伝
子由来である組換え類似体プラスミドも好ましい。

【００１８】本発明の特定の実施態様では、使用される
組換えプラスミドが融合タンパク質タウマチン−グルコ
アミラーゼを発現し、上記組換えプラスミドが、（ｉ）
適当な選択マーカーと、（ｉｉ）（ａ）タウマチンＩま
たはＩＩの発現に関し実質的に最適化された遺伝子と、
（ｂ）次にＫＥＸ２プロセッシング配列を含有している
スペーサー配列と、（ｃ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
ｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
（ｇｌａＡ）のａｗａｍｏｒｉ変異株のグルコアミラー
ゼの完全遺伝子とから構成されるＤＮＡ配列と、（ｉｉ
ｉ）ｇｌａＡ遺伝子の「プレ」および「プロ」シグナル
配列とを含んでなることを特徴としている。

【００１９】また、本発明の主題の一部は、タンパク質
タウマチンＩまたはＩＩを産生でき、上記したプラスミ
ドのいずれかにより形質転換した糸状菌の培養にも関す
る。特に、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒ
ｔｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、および
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのａｗａｍｏｒｉ
変異株の糸状菌が好ましい。

【００２０】本発明の主題の一部は、下記の工程を含ん
でなるタウマチンＩおよびＩＩの製造方法にもあり、す
なわち： ａ）タウマチンＩまたはＩＩの発現に関し実質的に最適
化された遺伝子を、上記したプラスミドに相当するもの
から選択される発現ベクターに、標準的な組換えＤＮＡ
法を用いて挿入する工程と、 ｂ）上記発現ベクターにより糸状菌株を形質転換する工
程と、 ｃ）適当な栄養条件下で前記の方法で形質転換した糸状
菌株を培養することにより、細胞内、細胞外、または両
方同時にタウマチンＩまたはＩＩを産生するか、または
融合タンパク質タウマチン−グルコアミラーゼの形態で
タウマチンＩまたはＩＩを産生する工程と、 ｄ）必要に応じて、タウマチンＩＩのみを分離精製する
か、またはタウマチンＩＩを培地から真菌性菌糸体とと
もに分離する工程とを含んでなる方法である。

【００２１】これらの方法の好ましい実施態様では、糸
状菌が、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ
ｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、またはＡｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのａｗａｍｏｒｉ変異
株から選択される。

【００２２】タウマチンＩＩを得るためには、ｐＴｈＩ
Ｉ組換えプラスミドが好ましく、このプラスミドは、実
施例および図６に示されている方法により得ることがで
きる。この方法は、概略以下の工程から調製できる。す
なわち、ａ）ｐＴＺ１８ＲＮ（３／４）プラスミドから
出発して、タウマチンＩＩをコードする実質的に最適化
された遺伝子のＤＮＡ配列の断片（３／４）を得、ｂ）
この断片をｐＡＮ５２−３プラスミド連結してｐＴｈ
（３／４）プラスミドを形成し、ｃ）ｐＴＺ１８ＲＮ
（１／２）プラスミドから出発して、タウマチンＩＩを
コードする実質的に最適化された遺伝子のＤＮＡ配列の
残りの断片（１／２）を得、ｄ）この断片をｐＴｈ（３
／４）プラスミドに連結してｐＴｈプラスミドを形成
し、そしてｅ）ＤＮＡ断片を挿入してスルファニルアミ
ド（Ｓｕ^ｒ）耐性を付与することにより、ｐＴｈＩＩプ
ラスミド（図６）を得る。このプラスミドを用いて、タ
ウマチンＩＩを大部分細胞内的に得る。Ｐｅｎｉｃｉｌ
ｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ中で基本的に細胞外
でタウマチンＩＩを産生するためには、ｐＴｈＩＩＩプ
ラスミドが好ましく、この調製については、実施例２に
記載され、図９に概要が示されている。タウマチンＩＩ
をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのａｗａｍ ｏｒ
ｉ変異株中で調製するには、実施例３に記載の方法を使
用する。

【００２３】グルコアミラーゼを用いて融合タンパクと
してタウマチンＩＩを産生するために、ｐＥＣＴｈＩＩ
プラスミドおよびｐＴｈＩＸプラスミドを使用でき、こ
の調製については実施例に記載され、図１２、１３およ
び１４に概要が示されている。

【００２４】タウマチンＩを産生するために、タウマチ
ンＩＩを産生するのに使用されるのと類似の方法に準じ
て得られる組換えプラスミドを使用する。即ち、例え
ば、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ
中での細胞内産生には、以下にようにして得られるｐＴ
ｈＩプラスミドが使用される。すなわち、ａ）ｐＴＺ１
８ＲＮ（１／２）プラスミドから出発して、タウマチン
ＩＩをコードする実質的に最適化された遺伝子配列の断
片（１／２）を得、ｂ）この断片をＮｃｏＩで線状化し
たｐＴＺ１８ＲＮ（３／４）プラスミドに連結してｐＴ
Ｚ１８ＲＮ（Ｔｈ）プラスミドを形成し、ｃ）単一鎖ｐ
ＴＺ１８ＲＮ（Ｔｈ）プラスミドを原料とし、部位驚異
的突然変異誘発法を用いて、以下の変化を、タウマチン
ＩＩの合成のシーケンスおよび人工遺伝子について実施
する。ここで、符号−＞は、置換されたもの（オリジナ
ル）と置換したもの（最終）をこの順序で示している： ＡＡＧ−＞ＡＡＣ（４６−Ｌｙｓ−＞４６−Ａｓｎ） ＣＧＣ−＞ＴＣＣ（６３−Ａｒｇ−＞６３−Ｓｅｒ） ＣＧＣ−＞ＡＡＧ（６７−Ａｒｇ−＞６７−Ｌｙｓ） ＣＡＧ−＞ＣＧＣ（７６−Ｇｌｎ−＞７６−Ａｒｇ） ＧＡＣ−＞ＡＡＣ（１１３−Ａｓｐ−＞１１３−Ａｓ
ｎ）

【００２５】このプラスミドはｐＴＺ１８ＲＮ（Ｔｈ
Ｉ）と呼ばれ、ｄ）ＰＴＺ１８ＲＮ（ＴｈＩ）プラスミ
ドを原料として、タウマチンＩをコードしている実質的
に最適化された遺伝子の完全配列のＤＮＡ断片を得、
ｅ）この断片をｐＡＮ５２−３プラスミドに連結してｐ
Ｔｈ´プラスミドを形成し、そしてｆ）スルファニルア
ミド、Ｓｕ^Ｒに対して耐性を有するＤＮＡ断片を挿入し
てｐＴｈＩプラスミドを得る。

【００２６】本発明の特定の実施態様では、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中でプラスミドを複製し増幅す
る。

【００２７】糸状菌がＧＲＡＳ型のときには、タウマチ
ンＩまたはＩＩを真菌性菌糸体とともに単離する方法が
特に興味深い。これらの場合、本発明の主題の一部は、
このようにして得られるタウマチンＩまたはＩＩと真菌
性菌糸体との混合物を使用して動物用食物の甘味または
嗜好性を増加することに関する。

【００２８】精製タウマチンＩまたはＩＩを得る必要が
あるときには、発現ベクターが、ＤＮＡに分泌シグナル
配列も含有していて糸状菌が細胞外でタウマチンＩまた
はＩＩを産生するようになっているプラスミドであるこ
とが特に重要である。

【００２９】ある場合には、タウマチンＩまたはＩＩの
産生は、グルコアミラーゼを用いて融合タンパク質を得
ることにより増加できる。

【００３０】本発明の特定の実施態様では、ｐＴｈＩプ
ラスミドおよびｐＴｈＩＩプラスミドを得るときには、
発現カセットのプロモーター配列は、糸状菌の以下の酵
素からのいずれの遺伝子に由来するものであってもよ
い：グルセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、β−グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ、グルコアミラーゼまたはα−アミラーゼ。さら
に、発現カセットの終止配列は、当該プロモーター配列
に相当する配列であることができる。最後に、選択マー
カーは、オレオマイシン、ヒグロマイシンＢ、フレオマ
イシンまたはアセタミドに耐性のある種類のものである
ことができる。

【００３１】実施例に示すように、本発明により、十分
な表現型特性を有し、かつ従来技術に対して重要な利点
である、高生産性的に工業用タウマチンＩまたはＩＩを
得ることが可能となる。

【００３２】さらに、真菌は無害であるので、タウマチ
ンを菌糸体とともに投与できる。このことは、精製工程
時間を節約でき、したがって、とりわけ動物用食物に使
用について重要なさらなる利点となる。

【００３３】非制限的に、以下の詳細な実施例により、
本発明を説明する。実施例１で得られたタウマチンＩＩ
を産生する真菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆ
ｏｒｔｉｉは、バレンシア大学のＦａｃｕｌｔａｄ ｄ
ｅ Ｃｉｅｎｃｉａｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｓのＤｅｐ
ａｒｔｍｅｎｔｏ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ
のＳｐａｎｉｓｈ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔ
ａｎｄａｒｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ
Ｅｓｐａｎｏｌａ ｄｅ ＣｕｌｔｉｖｏｓＴｉｐ
ｏ、ＣＥＣＴ）に寄託されている（寄託番号：ＣＥＣＴ
２９７２）。

【００３４】

【実施例】実施例１ ：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒ
ｔｉｉ中でのタウマチンＩＩの細胞内産生 （１．１）タウマチンＩＩをコードしている合成、人
工、完全最適化遺伝子の構築 （１．１．１）タウマチンＩＩのＤＮＡ配列の最適化 配列番号１に再現されているタウマチンＩＩおよびこれ
に対応する天然遺伝子に関する文献において公知のアミ
ノ酸およびヌクレオチドの配列（例えば、ＥＰ５４．３
３０参照）から出発して、同じタンパク質をコードする
ｎ＝３（停止コドン３ＴＡＡを有する）配列番号２の最
適化ＤＮＡの配列を設計した。配列番号２の最適化配列
は、配列番号１のコドンについて最大数の変化を行い、
原コドンを以下のアミノ酸コドン表の（ ）に示されて
いるコドンで置き換えることにより（後者はオリジナル
と異なる場合に行う）得た：Ａｌａ（ＧＣＣ）、Ａｒｇ
（ＣＧＣ）、Ａｓｎ（ＡＡＣ）、Ａｓｐ（ＧＡＣ）、Ｃ
ｙｓ（ＴＧＣ）、Ｌｙｓ（ＡＡＧ）、Ｇｌｎ（ＣＡ
Ｇ）、Ｇｌｕ（ＧＡＧ）、Ｇｌｙ（ＧＧＣ）、Ｉｌｅ
（ＡＴＣ）、Ｌｅｕ（ＣＴＣ）、Ｍｅｔ（ＡＴＧ）、Ｐ
ｈｅ（ＴＴＣ）、Ｐｒｏ（ＣＣＣ）、Ｓｅｒ（ＴＣ
Ｃ）、Ｔｈｒ（ＡＣＣ）、Ｔｒｐ（ＴＧＧ）、Ｔｙｒ
（ＴＡＣ）、Ｖａｌ（ＧＴＣ）。

【００３５】（１．１．２）部位特異的突然変異誘発を
用いたｐＴＺ１８ＲＮ組換えプラスミドの構築 タウマチンＩＩの合成遺伝子の組立てを始める前に、Ｎ
ｃｏＩに対して単一制限部位を、多機能ｐＴＺ１８Ｒプ
ラスミド（ＭＣＳ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．社
製）の多重クローニング部位に挿入した。このようにし
てｐＴＺ１８ＲＮプラスミド（ＮｃｏＩの「Ｎ」）を形
成した。この制限部位は図１に示される通りである。Ｎ
ｃｏＩに対する制限部位の挿入は、以下に示す部位特異
的突然変異誘発を用いて行った。

【００３６】オリゴヌクレオチドｐ１１５（５´−ＡＣ
ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＣＴＧ
ＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡ−３´）をＩｎｇｅｎａｓａ
Ｓ．Ａ．（スペイン、マドリード）から入手した。標準
法（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａ
ｌ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ出版、１９８９年）を用いて、ポリヌクレ
オチドキナーゼで^３２Ｐを［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰから転
移させることにより、このオリゴヌクレオチドの５´端
に標識した。ＤＮＡが単一鎖であるｐＴＺ１８Ｒを標準
法により得、５´端に^３２Ｐを標識したオリゴヌクレオ
チド１ピコモルと、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ
７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ ＭｇＣｌ
_２（最終容積５μＬ）を含有する緩衝液中でハイブリダ
イゼーションした。得られた混合物を、６５℃で５分間
インキュベーションし、ゆっくりと（一晩かけて）室温
まで冷却した。次に、以下の酵素と試薬を、この混合物
５μＬに添加した：Ｂ１０Ｘ溶液（２００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２；５
０ｍＭ ＤＴＴ）１．５μＬ；１０ｍＭ ＡＴＰ１μ
Ｌ；４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、
ｄＣＴＰ）を各々２．５ｍＭ含有する混合物４μＬ；水
６．５μＬ；Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（３単位／μＬ）
１μＬ；およびＤＮＡリガ−ゼ（６単位／μＬ）１μ
Ｌ。反応混合物を室温で３時間インキュベーションし、
このインキュベーション時間の終りに、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ１μＬ（３単位）を添加し、およびＤＮＡリガ
−ゼ１μＬ（６単位）を添加した。反応を、３７℃で６
０分間さらに継続した。

【００３７】各反応混合物の１．０μＬアリコートを使
用して、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０３株を形質転換した。Ｌ
Ｂ／アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）皿に成長した種
々のクローンを、新しい培地を入れた皿で再平板培養
し、分析した（ＬＢ＝ルリア肉汁、以下の組成を有する
培地：１％バクト−トリプトン、０．０５％酵母エキ
ス、１７０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）。所望の変異
を有するクローンを得るために、クローンを、下記のよ
うにして、プローブとして［γ−^３２ｐ］ＡＴＰで標識
したｐ１１５オリゴヌクレオチドを用いて分析した。

【００３８】候補のコロニーを、ニトロセルロースフィ
ルタ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）で平板
培養した。フィルターをＬＢ／ａｍｐ皿に配置し、３７
℃で一晩インキュベーションした。次の日、３つの溶液
中でフィルターを順次洗浄することにより、溶菌した： −０．５Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１Ｍ Ｎ
ａＣｌ中で５分間 −１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で５分間 −０．５Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１Ｍ Ｎ
ａＣｌ中で５分間

【００３９】フィルターを、次に８０℃で９０分間乾燥
させた。フィルターが乾燥次第、３ｘＳＳＣ、０．１％
ＳＤＳ中で３回洗浄し、６ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒ
ｄｔ溶液、０．０５％ソジウムピロホスフェート、ボイ
ルしたサケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌおよび０．５％
ＳＤＳを含有する溶液中で、３７℃で１時間予備ハイブ
リダイゼーションした。ハイブリダイゼーションは、同
溶液に標識ｐ１１５プローブ３３ｎｇを添加した溶液５
０ｍｌ中で一晩行った。ハイブリダイゼーション温度
は、５０℃であった。次の日に、フィルターを以下のよ
うにして洗浄した： −第一洗浄：２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温で１５
分間 −第二洗浄：同条件、但し５５℃ −第三洗浄：同条件、但し６５℃ −第四洗浄：０．４ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃
で１５分間

【００４０】第四洗浄後、フィルターを、−２０℃で２
時間Ｘ線フィルムに暴露した。プローブ１１５に対して
標識ハイブリダイゼーションを示すＤＮＡを有する種々
のコロニーを確認し、各々から抽出した。クローンの最
終的な確認は、ＤＮＡがＮｃｏＩで切断できるかできな
いかを試験することによるか、その配列を解析すること
により行った。ＢａｍＨＩとＰｓｔＩとの間のＮｃｏＩ
制限部位（図１）を含むプラスミドは、ｐＴＺ１８ＲＮ
と呼ばれ、タウマチンＩＩの完全最適化人工、合成遺伝
子の構築に使用される親ベクターとした。

【００４１】（１．１．３）タウマチンＩＩをコードし
ている合成遺伝子を構築するための方法 タウマチンＩＩの合成遺伝子を組み立てるために選択さ
れた方法は、図２に示される通りであった。図３に示さ
れる配列の８種の長オリゴヌクレオチドを、Ｉｓｏｇｅ
ｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（オランダ）から
入手した。対で示されている一本鎖オリゴヌクレオチド
は、配列が相補的であるので、対合することができる。
これらは、１ａ、１ｂ；２ａ、２ｂ；３ａ、３ｂ；およ
び４ａ、４ｂとして示されている。対合後、一本鎖領域
を、修飾Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼも使用できる）で充填した。得られた二本鎖
断片を、適当な制限酵素で消化して、相補末端または平
滑端を得た後、所望のベクターに連結した。図４は、次
に発現ベクターに結合した一断片において合成遺伝子の
組立てに使用した方法を示す。

【００４２】（１．１．３．１）配列番号２（ｎ＝３）
の合成遺伝子の第一３３２塩基対の組立て 初期の段階で、オリゴヌクレオチド１ａ、１ｂ、２ａお
よび２ｂを連結して、ｐＴＺ１８ＲＮプラスミドに挿入
できる３３２塩基対を有するＤＮＡ断片を得た。オリゴ
ヌクレオチド１ａ １μｇと１ｂ １μｇを、４０ｍＭ
Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ
_２、５ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＮａＣｌおよびウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）５０μｇ／ｍＬを含有する緩衝
液に添加して混合した。得られた混合物（１７μＬ）を
７０℃で５分間加熱した後、約１０分間でゆっくりと６
５℃（オリゴヌクレオチド対をハイブリダイゼーション
するに適当な温度）に冷却した。その後、４種のデオキ
シヌクレオチドの混合物２μＬ（各ｄＮＴＰ２．５ｍ
Ｍ）を添加し、修飾Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ酵素（米
国Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．製、商標Ｓｅｑ
ｕｅｎａｓａ）１μＬを添加して、最終容積２０μＬと
した。反応を３７℃で３０分間行った後、７０℃でさら
に１０分間（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅが不活性化するため）
行った。反応生成物を、Ｂａｍ ＨＩおよびＢｇｌ Ｉ
Ｉに、より、３７℃で３時間消化した。ＤＮＡについ
て、以下の抽出を行った：フェノールで一回、フェノー
ル：クロロホルムで一回およびクロロホルムで一回。そ
の後、エタノール沈殿させた。得られたものを、最後
に、ＴＥ緩衝液に添加し−２０℃で凍結して、後で使用
するまでこの状態としておいた。

【００４３】最終生成物をＢｇｌ ＩＩおよびＮｃｏ
Ｉで消化した以外は同様にして、オリゴヌクレオチド２
ａおよび２ｂとを処理した。プラスミドｐＴＺ１８ＲＮ
を、Ｂａｍ ＨＩおよびＮｃｏ Ｉで順次消化し、そし
てウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で脱リン酸化した。
２８７１塩基対の線状化断片を、０．８％アガロースゲ
ルから回収した後、精製した。その後、反応１および２
の生成物を線状化ｐＴＺ１８ＲＮで連結し、混合物を使
用してＥ．ｃｏｌｉＮＭ５２２株を形質転換した。挿入
物を有するクローンを確認するために、白／青インジケ
ーター試験を基本的に以下のようにして行った。

【００４４】ｐＴＺ１８Ｒプラスミドとその誘導体ｐＴ
Ｚ１８ＲＮは、バクテリア遺伝子ＬａｃＺ´を含有して
いる。したがって、このプラスミドを含有するバクテリ
アクローンは、ＬＢ／アンピシリンを入れ、さらに色素
産生基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インド−β−Ｄ
−ガラクト−ス（Ｘ−ｇａｌ）を含有しているディシュ
上では、青色である。外来ＤＮＡの断片をｐＴＺ１８Ｒ
Ｎプラスミドの複数のクローニング部位（ＭＣＳ）に挿
入すると、ＬａｃＺ´遺伝子が不活性化され、得られた
コロニーは青色ではなく、白色である。したがって、白
色コロニーが、タウマチンＩＩの合成遺伝子の異なる断
片を含有する候補であるとして、白色コロニーを最初に
分離した。適当なサイズの挿入物を有する種々のコロニ
ーは、タウマチンＩＩの合成遺伝子の３２５塩基対の完
全断片を含有していた。得られたプラスミドは、ｐＴＺ
１８ＲＮ（１／２）と命名した。

【００４５】（１．１．３．２）配列番号２（ｎ＝３）
の合成遺伝子の第二３０５塩基対の組立て この場合に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＣＲ
を用いた代替法を採用した。閉鎖段階の前に、標準法を
用いて、リン酸基をヌクレオチド３ｂおよび４ａの５´
端に標識した。即ち、５´リン酸基を平滑端に連結し
た。このオリゴヌクレオチドを、３ｂ＊および４ａ＊と
呼ぶこととした。３ａ１μｇと３ｂ＊１μｇを、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣ
ｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および０．１ｍｇ／ｍｌゼ
ラチンを含有する反応混合物（１８μＬ）に添加して、
インキュベーションした。試料を、７０℃で５分間イン
キュベーションし、さらに６５℃で５分間インキュベー
ションした。この時点で、各ｄＮＴＰ（Ｇ、Ａ、Ｔ、
Ｃ）を最終濃度２ｍＭおよびＡｍｐｌｉ Ｔａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕ
ｓ社製）２．５単位を添加した。ＰＣＲは下記の通りで
あった：９４℃で１分間；５５℃で１分間；および７２
℃で１分間を３０サイクルした後、最後に７２℃で５分
間。試料を、次に、フェノール：クロロホルムで抽出
し、ＴＥ緩衝液１０μＬに再懸濁し、Ｎｃｏ Ｉととも
に３７℃で３時間インキュベーションした。エタノール
で抽出および沈殿後、ＤＮＡをＴＥ緩衝液に溶解し、−
２０℃で凍結して、後で使用するまでこの状態にしてお
いた。

【００４６】最終生成物をＰｓｔ Ｉで消化する以外
は、上記と同様にしてオリゴヌクレオチド４ａ＊および
４ｂを処理した。Ｎｃｏ ＩおよびＰｓｔ Ｉで切断
し、ウシ腸ホスファターゼで処理し、最後にアガロース
ゲルで精製したｐＴＺ１８ＲＮを使用した以外は、上記
と同様の方法で３つの断片の連結を行った。連結反応系
に、平滑端との連結を刺激する１５％ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）を含有させた。連結生成物を使用し
て、Ｅ．ｃｏｌｉＮＭ５２２株を形質転換した。Ｘ−ｇ
ａｌおよびＩＰＴＧを添加したＬＢ／ａｍｐ培地の入っ
たディシュ上で、組換え体の白／青選択を再び行った。
組換え体を分析後、タウマチンＩＩ遺伝子の第二部分の
３０５ｐｂ断片を含有する一つのクローンを分離した。
このプラスミドを、ｐＴＺ１８ＲＮ（３／４）と命名し
た。

【００４７】（１．１．３．３）配列の解析 合成遺伝子の確認は、Ｓａｎｇｅｒ法（Ｓａｎｇｅｒ，
Ｆ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、
１９７７年、第７４巻、第５４６３〜６７頁）を用いて
配列を解析することにより行った。この際、Ｕｎｉｔｅ
ｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒ
ｐ．製シーケンセーションキット（バージョン２．０）
を使用した。合成遺伝子の配列は、（１）２つの遺伝子
鎖をシーケンセーションし、（２）ｄＩＴＰと平行シー
ケンセーション反応を行って、高ＧＣ領域のために形成
した可能性がある第二構造体を不安定化することにより
不明瞭なく決定された。代表的なオートラジオグラフを
図５に示す。

【００４８】（１．２）糸状菌用発現ベクターへの遺伝
子の挿入（図６） 本実施例では、ｐＡＮ５２−３プラスミド（Ｐｕｎｔ、
Ｐ．Ｊ．等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、１９９０年、第１７巻、第１９〜３４頁に
記載されている；以下「原料プラスミド」と呼ぶ）を、
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉを形
質転換するのに使用する糸状菌（ｐＴｈＩＩ）における
発現ベクターの構築のための原料プラスミドとして使用
した。この原料プラスミドへの合成遺伝子の連結は、以
下の３工程で行った。

【００４９】（１．２．１）３／４断片の連結 ｐＴＺ１８ＲＮ（３／４）３０μｇを、ＮｃｏＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩで順次切断して、二断片を形成した。合
成遺伝子の第二部分を含有する３１０ｐｂの小断片を、
２％アガロ−スゲルで精製した。同時に、原料プラスミ
ド５μｇを、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで順次制限
した。次に、アルカリ性ホスファターゼで処理し、５．
８Ｋｂの断片を、０．８％アガロースで分離した。次
に、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、フォスフ
ァタイズし、精製した原料プラスミドを、ｐＴＺ１８Ｒ
Ｎ（３／４）から得た３１０ｐｂ断片と連結した。混合
物を使用して、図６に概略示したようにＥ．ｃｏｌｉＤ
Ｈ５αＦ´を形質転換した。所望の構成を有するクロー
ンは、組換えプラスミドｐＴｈ（３／４）をＮｃｏＩお
よびＨｉｎｄＩＩＩで切断することにより確認した。

【００５０】（１．２．２）断片１／２の連結 第二工程において、ｐＴＺ１８ＲＮ（１／２）プラスミ
ドをＮｃｏＩで切断し、遺伝子の第一部分含有ＮｃｏＩ
−ＮｃｏＩを有する断片を、４％アガロ−スゲルで精製
した。ｐＴｈ（３／４）プラスミドを、ＮｃｏＩで線状
化し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。次に、ｐ
ＴＺ１８ＲＮ（１／２）から得たＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断
片で連結した。得られたプラスミドを、ｐＴｈと命名し
た。クローンを解析するために、ｐＴｈプラスミドを切
断して、ＢａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを得た。適当な
配向を有するクローンでは、６２５ｂｐ断片が得られた
が、不適当な配向を有するクローンでは、３００ｐｂ断
片が得られた。

【００５１】（１．２．３）真菌性マーカーとの連結 次に、ｐＴｈプラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、５´端
にポリメラーゼＩから得たクレノー断片を充填した。こ
の処理したプラスミドを、次に０．８％アガロースで精
製した。ｐＥｃｏｌｉＲ３８８プラスミド（Ｎ Ｄａｔ
ｔａ、Ｓａｉｎｔ Ｍａｒｙ´ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、
ロンドン）を原料として、スルファミルアミド耐性の配
列を得て、原核生物プロモーターとターミネーターを除
去した構築物を得た後、構造遺伝子をプロモーターを、
糸状菌（ＴｒｐＣ）のプロモーターおよびターミネータ
ーの制御下に配置した。このようにして得られた耐性配
列を、ＳｍａＩおよびＸｂａＩで切断し、５´端にクレ
ノーおよびｄＮＴＰを充填し、１．７５Ｋｂ断片を、４
％アクリルアミドで分離した。次に、このようにして得
られた断片をｐＴｈで連結し、形質転換をＥ．ｃｏｌｉ
ＤＨ１において実施した。得られたプラスミドを、ｐＴ
ｈＩＩと命名した。このプラスミドは、（ｉ）真菌性プ
ロモーターの制御下にタウマチンＩＩをコードしている
合成遺伝子を、（ｉｉ）スルファニルアミド耐性マーカ
ーを含有してなる。このプラスミドの最終的な確認は、
上記１．３．３．で説明したようなシーケンセーション
により行った。

【００５２】（１．３）上記した真菌性発現ベクターに
よるＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ
の形質転換 （１．３．１）プロトプラストの調製 形質転換実験に使用したＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏ
ｑｕｅｆｏｒｔｉｉのプロトプラストは、ＭＵＣＬ２９
１４８株を原料として、下記の方法に準じて調製した。
その分生子を、ＭＳＤＰＭ液体培地（菌糸体製造用に半
調整してある培地であり、この組成は以下に記載する）
５０ｍＬに接種した。培養を、２７０ｒｐｍで機械攪拌
しながら、２８℃で４４時間インキュベーションした。
濾過により菌糸体を回収し、無菌水で洗浄し、菌糸体１
ｇ当たりＬｙｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ社製）
４０ｍｇを含む１．２Ｍ ＫＣｌ溶液に再懸濁した。中
速度で攪拌しながら、２８℃で４時間インキュベーショ
ンした後、プロトプラストを得た。菌体を、ガラスウー
ル濾過により除去した。プロトプラスト懸濁液を、１．
２Ｍ ＫＣｌ溶液（１０ｍＬ／ｇ）を用いて、２回洗浄
し遠心分離（２０００ｒｐｍ，１０分間）した。最後
に、プロトプラストを、１．２Ｍ ＭＣｌ（１ｍＬ／
ｇ）に再懸濁した。このプロトプラスト懸濁液（１０^７
−１０^８プロトプラスト／ｍＬ）を使用して、形質転換
実験を行った。

【００５３】（１．３．２）形質転換 プロトプラストを遠心分離（２０００ｒｐｍ，１０分
間）した後、溶液Ｉ：１．２Ｍ ＫＣｌ；５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８）、５０ｍＭ ＣａＣｌ_２およ
び溶液ＩＩ２０％（下記参照）に再懸濁（５ｘ１０^８プ
ロトプラスト／ｍＬ）した。これらを、２８℃で１０分
間インキュベーションした。０．１ｍＬアリコートを、
タウマチンＩＩ遺伝子を含有する発現プラスミドから得
たＤＮＡ（１０μｇ）と混合した。その後直ちに、溶液
ＩＩ２ｍＬ［１．２Ｍ ＫＣｌ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ．
ＨＣｌ（ｐＨ８）、５０ｍＭ ＣａＣｌ_２および３０％
ＰＥＧ６０００］を添加した。この混合物を、室温で５
分間インキュベーショした。遠心分離（２０００ｒｐ
ｍ、１０分間）によりプロトプラストを回収後、１．２
Ｍ ＫＣｌ１ｍＬに再懸濁した。最後に、このようにし
て処理したプロトプラストのアリコットを、細胞壁の再
生に適当な培地を入れたペトリ皿で再平板培養した後、
スルファニルアミド（７５０μｇ／ｍＬ）を用いて選択
した。この形質転換法を用いて、スルファニルアミド耐
性の種々の菌株を分離した。これらの菌株を解析して、
タウマチンＩＩの合成遺伝子がそのゲノムに導入された
かどうか確認した。

【００５４】（１．４）形質転換体の解析 （１．４．１）ＰＣＲ解析 タウマチンＩＩの合成遺伝子であってスルファニルアミ
ド耐性の遺伝子のＤＮＡ配列を検出するために、適当な
オリゴヌクレオチドを用いた標準ＰＣＲ法により、上記
のようにして得られた形質転換体を解析した。即ち、以
下の１．４．１．２で配列を示したＴ１およびＴ２オリ
ゴヌクレオチドを使用した。Ｔ１はタウマチンＩＩの合
成遺伝子の上鎖のヌクレオチド６０５および６２４に相
補であるのに対して、Ｔ２は下鎖のヌクレオチド２１〜
４６に相補である。したがって、これらの２種のオリゴ
ヌクレオチドを用いて、タウマチンＩＩの合成遺伝子の
オリゴヌクレオチド２１〜６２４に相当する６０４塩基
対の断片を増幅することが可能であった。図７は、未形
質転換真菌（対照）では合成遺伝子に相当するサイズの
バンドがない（レーン２）のに対して、形質転換遺伝子
（Ｍ０９０１およびＴ０９０１）の２つでは、ｐＴｈＩ
Ｉプラスミドに挿入した合成遺伝子に相当するバンドと
同数の塩基を有するバンドが現れることを示しており
（レ−ン３〜５）、結果が良好であったことを示してい
る。

【００５５】（１．４．１．１）核酸の抽出 ブフナー漏斗を用いて真空濾過し、５日間のＭＳＤＰＭ
培養（０．６％ＮａＮｏ_３；０．０５２％ＭｇＳＯ_４・
７Ｈ_２Ｏ；０．０５２ＫＣｌ；１％グルコース；０．５
％酵母エキス；０．５％カザミノ酸；ＦｅＳＯ_４・７Ｈ
_２Ｏ極微量；ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ極微量）から得た菌
糸体５ｇを、原料として使用した。菌糸体を、磁製乳鉢
を用いて液体窒素中で粉砕した。この菌糸体を、抽出緩
衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ６．９；０．３Ｍサ
ッカロース；２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；０．５
％ＳＤＳ）に、菌糸体１グラム当たり緩衝液１０ｍＬの
割合で再懸濁した。懸濁液を、６５℃で１５分間インキ
ュベーションし、室温で５分間、７０００ｒｐｍ（Ｂｅ
ｃｋｍａｎ ＪＡ２０ローター）で遠心分離して菌体を
除去し、上清を集めて、フェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコール（４９：４９：２）で二回処理して
タンパク質を除去した。水相を、０．３Ｍ酢酸ナトリウ
ムおよびエタノール２．５容積を用いて、−２０℃、２
０分間で沈殿させた。沈殿物を、７０００ｒｐｍで２０
分間遠心分離した。沈殿を、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）
１ｍＬに再懸濁した。

【００５６】（１．４．１．２）ＰＣＲ反応混合物 総体積１００μＬで、ＤＮＡ２０ｎｇとＰＥＣ１０Ｘ緩
衝液１０μＬとを混合した（５００ｍＭ ＫＣｌ；１５
ｍＭ ＭｇＣｌ_２；１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．３；０．０１％豚ゼラチン；ＤＮＴＰ各濃度２０
０μＭの混合物；；Ａｍｐｌｉｔａｑ２．５単位および
プライマー１μＭ）。使用した合成オリゴヌクレオチド
は、Ｔ１（２６ヌクレオチド）およびＴ２（２０ヌクレ
オチド）並びにタウマチンＩＩの合成遺伝子の開始およ
び終止用の特定のプライマーであった。 Ｔ１：５´−ＣＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＡＣＡＣＣＧＴＣ
ＴＧＧＧＣＣＧ−３´ Ｔ２：５´−ＴＴＡＧＧＣＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＡＡＧ
Ｇ−３´ 鉱油２０μＬを得られた混合物に添加して、試料を蒸発
しないようにした。

【００５７】（１．４．１．３）ＰＣＲ 試料を９４℃で５分間のサイクルに付して二本のＤＮＡ
鎖を分離した。次に、３０連鎖反応を行った。まず、Ｄ
ＮＡを９４℃で１分間変性した。温度を３０秒で５５℃
まで低下させて、特定のプライマーを変性ＤＮＡ鎖に連
結させ、次に、温度を再び１分間で７２℃まで上昇させ
て、新たな鎖（形成する）を伸長させた。全てのサイク
ルを完了したとき、最終伸長を、７２℃で５分間行っ
た。各ＰＣＲの生成物を、０．８％アガロ−スゲルで解
析した（図７）。この方法を用いて、Ｍ０９０１および
Ｔ０９０１と称する二本の鎖を確認した。これらのゲノ
ムには、タウマチンＩＩの合成遺伝子が含有されてい
た。

【００５８】（１．４．２）免疫ブロット検出（ウエス
タンブロット） タウマチンＩＩ遺伝子を組み込んだ形質転換体を正しく
検出したら、予め標準ウサギ免疫法により得てタンパク
質を確認したポリクローナル抗体を用いて、ウエスタン
ブロットを発現について行った（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ
Ｗ．Ｎ．、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、１９８１、第１１２巻、第１９５〜２０３
頁）。各ウサギから得た血清を、標準法を用いて硫酸ア
ンモニウムで沈殿させて免疫グロブリンを沈殿させるこ
とにより、ＩｇＧ抗体が富化したタンパク質分画を得
た。図８は、得られた結果であり、未形質転換真菌（対
照）にはタウマチンＩＩに相当するサイズのバンドが現
れないのに対して、形質転換真菌の２つでは、商用タウ
マチンＩＩと同じ分子量のバンドが現れることを示して
いる。

【００５９】（１．４．２．１）試料の調製 ブフナー漏斗を用いて真空濾過し、ＭＳＤＰＭ培地で２
８℃で５日間培養して得た菌糸体２ｇを、原料として使
用した。漏斗に保持されている菌糸体（固体分画）と培
地における菌糸体（液体分画）の両方を分析した。

【００６０】固体分画 菌糸体１グラム当たり音波処理溶液（６２５ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ６．５、１ｍＭ ＰＭＳＦ、５％β
−メルカプトエタノール）１０ｍＬを、漏斗に保持され
た菌糸体に添加した。菌糸体を、１秒パルス（即ち、１
秒音波処理、１秒音波処理なし等）で１分間音波処理し
た。このプロセスを、さらに３〜５分間隔で３回反復し
た。７５００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＡ２０ロータ
ー）で、４℃、２０分間遠心分離した。

【００６１】液体分画 β−メルカプトエタノール（最終濃度５％）およびＰＭ
ＳＦ（最終濃度１ｍＭ）を、細胞外培地３ｍＬを添加し
た。両分画３ｍＬを原料として使用し、分子量が１０，
０００ダルトンを超えるタンパク質を保持するカラム遠
心分離（Ｂｉｏ−Ｒａｄ限外濾過器）で濃縮した。この
プロセスで、３ｍＬがカラムを通過して、２００μＬに
減少した。２ｘ試料緩衝液（２５％グリセロール；２．
５％ＳＤＳ；０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ７．
０；１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０；０．００２％ブロ
モフェノールブルー）２０μＬを、濃縮液２０μＬに添
加した。これらを５分間沸騰させ、直ちにタンパク質変
性ゲル（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド）に配置した。使
用したタンパク質ゲルは、１４％ポリアクリルアミドお
よび１８％尿素であった。１５０ボルトで電気泳動し、
試料の前部がゲルの末端から３または５ｍｍとなったと
き停止した。

【００６２】（１．４．２．２）ニトロセルロースへの
移行 電気泳動を完了し、堆積部分を除去した後、ゲルをニト
ロセルロース紙（ＮＣ）に移行させた。このようにする
ために、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ ＳＤ
Ｓｅｍｉｄｒｙ Ｕｎｉｔを使用した。移行には、１
５ボルトで３０分間かかった。バンドをＮＣ紙に移行次
第、このＮＣ紙をブロック溶液（３％ＢＳＡ；０．０１
％アジ化ナトリウム；０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０のＴ
ＢＳ溶液；ＴＢＳ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ；５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ８．０）に残し、一晩攪拌し
た。この操作後、ＮＣ紙を以下のように処理した。この
ＮＣ紙をブロック溶液から取り出し、ＴＢＳで洗浄し、
血清とともにインキュベーションした：免疫ＩｇＧ分画
（０．３７ｍｇ／ｍＬ）をブロック溶液（アジ化ナトリ
ウム含有）で希釈（１：５００）。陰性対照として、正
常予備免疫ＩｇＧ分画を、ブロック溶液（アジ化ナトリ
ウム含有）に希釈（１：５００）して使用した（０．３
５ｍｇ／ｍＬ）。この溶液を攪拌し、室温で４時間イン
キュベーションした。

【００６３】ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ１Ｘ＋Ｔｗｅ
ｅｎ−２０、０．０５％）で、１０分間洗浄を３回行っ
た。第二抗体（抗ウサギＩｇＧ−ホスファターゼアルカ
リ性接合体を、ブロック溶液（アジ化ナトリウムなし）
に希釈（１：５００））とともに室温で４時間攪拌・イ
ンキュベーションした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで、１０分
間洗浄を３回行った。アルカリ性ホスファターゼ反応を
行った。すなわち、ａ）ＮＣをアルカリ性ホスファター
ゼ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ９．５
１００；１００ｍＭ ＮａＣｌ； ５０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２）で平衡化し、ｂ）ＮＣをデベロップメント反応混
合物（アルカリ性ホスファターゼ緩衝液１５ｍＬ、ニト
ロブルーテトラゾジウム、ＮＢＴ６６μＬ）（７０％ジ
メチルホルムアミドに７５ｍｇ／ｍＬ）、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドールホスフェート（ＢＣＩＰ）
９９μＬ（１００％ジメチルホルムアミドに２５ｍｇ／
ｍＬ）に、バンドが暗色になるまで入れ、そしてｃ）反
応を、アルカリ性ホスフェート停止溶液（２０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ．ＨＣＬ、ｐＨ８．０および２０ｍＭ ＥＤＴ
ａ、ｐＨ８．０）で停止した。

【００６４】（１．４．２．３）タンパク質ゲル染色 ゲルを染色溶液（２５エタノール；１０％酢酸；０．１
％コマシーブルー）で１時間染色し、ゆっくりと攪拌し
た。これらを、脱染色液（２５％メタノール；７．５％
酢酸）で、青色がゲルベースからなくなるまで脱色し
た。

【００６５】実施例２：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏ
ｑｕｅｆｏｒｔｉｉ タウマチンの細胞外産生 タウマチンの細胞外産生のために、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉを、以下に説明しかつ図
９に概略示してある方法により組立てたｐＴｈＩＩＩプ
ラスミドで形質転換した。上記したｐＴｈＩＩプラスミ
ド（上記１．２．３）を、標準法を用いて精製し、最終
濃度１μｇ／μｌのＴＥ溶液に再懸濁した。このプラス
ミド３０μｇを制限酵素ＭｓｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
で切断し、タウマチンＩＩの完全遺伝子を含有する６４
６塩基対の断片を０．８％アガロースゲルで分離した。
断片の末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩから得たクレノー
断片で平滑端とした。

【００６６】約７．５Ｋｂを含有し、ｐＡＮ５２−６Ｎ
ｏｔ１（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ等、“Ｈｅｔｅ
ｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｉｎｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ“；Ｂｅｎｎ
ｅｔｔおよびＬａｓｖｒｅ、“Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍ
ａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ“；Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９１、第１８章、第３９
６〜４２８頁参照）由来のｐＡＮ５２−６Ｂプラスミド
をＢｓｓＨＩＩで消化し、その末端をＤＮＡポリメラー
ゼＩのクレノー断片により平滑端とした。これらの２つ
の断片を、ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、得られた構
造体を使用してＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αＦ´株を形質転換
した。得られたプラスミド、ｐＴｈＩＩ−ビス、を分離
し、その構造体を、サンガージデオキシ法を用いたシー
ケンセーションにより確認した。

【００６７】以下の工程により、ｐＴｈＩＩ−ビスプラ
スミド（８．１Ｋｂ）をＸｂａＩで切断し、タウマチン
遺伝子、プロモーター配列およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼシグナル配列を含有す
る長さ約５．５Ｋｂの断片を分離した。Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓのｔｒｐＣターミネーター
配列もこの断片に含まれていた。上記した５．５Ｋｂ断
片を、予めＸｂａＩで調節したスルファニルアミド耐性
配列（このプラスミドについての唯一の切断部位）を含
有するプラスミドと連結した。連結混合物を使用して、
Ｅ．ｃｏｌｉのＤＨ５αＦ´株を形質転換した。得られ
たプラスミドを、図９に示すように、ｐＴｈＩＩＩと命
名した。

【００６８】ｐＴｈＩＩＩプラスミドは、（ｉ）Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼプロ
モーターの制御下にタウマチンＩＩをコードする合成遺
伝子、（ｉｉ）シグナル配列（「ｐｒｅ」）およびＡｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ遺
伝子「ｐｒｏ」配列、（ｉｉｉ）スルファニルアミド耐
性マーカー、および（ｉｖ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｄｕｌａｎｓのｔｒｐＣターミネーターを含有して
いた。この構築物の最終的な確認は、シーケンセーショ
ンにより行った。Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅ
ｆｏｒｔｉｉの菌株を、実施例１（１．３．１および
１．３．２）に記載されているのと同様の方法によりｐ
ＴｈＩＩＩプラスミドで形質転換した。スルファニルア
ミド耐性コロニーを試験して、ゲノムが合成遺伝子を含
有するかどうかおよびそれらが実質的に変更されタウマ
チンＩＩをコードしているものであるかどうかを確認し
た。用いた方法（ＰＣＲ）は、実施例１（１．４．１）
に記載の方法と類似のものであった。

【００６９】図１０に、ＰＣＲ実験の結果を示す。タウ
マチン遺伝子の検出に使用された二種のオリゴヌクレオ
チドは、上記したのもと同じ（Ｔ１およびＴ２）であっ
た。これらの二種のオリゴヌクレオチドを用いて、タウ
マチンＩＩの合成遺伝子のオリゴヌクレオチド２１〜６
２４に相当する６０４塩基対断片を増幅できる。図１０
から、未形質転換真菌から得たＤＮＡを使用すると合成
遺伝子に相当するバンドが何も増幅されない（「対
照」、レーン２）のに対して、ｐＴｈＩＩＩで形質転換
した真菌由来のＤＮＡを使用すると予期されたサイズの
バンドが増幅される（レーン３）ことが分かる。この真
菌を、形質転換体ａ２と命名した。対照として、ｐＴｈ
ＩＩＩプラスミドによる鋳型として使用された反応生成
物も、ゲルを通過させた（レーン４）。

【００７０】図から、形質転換体ａ２がそのゲノムにタ
ウマチンＩＩの合成遺伝子を正しく含んでいることが明
かである。したがって、この形質転換体をより詳細に解
析して、タウマチンＩＩの正しい発現および分泌につい
て確認した。組換えタウマチンの免疫ブロット解析（ウ
エスタンブロット）のために、（１．４．２）に記載の
方法を以下のように変更して使用した。実験を、菌糸体
産生（ＭＳＤＰＭ）用に半調整した培地で２８℃で８日
間成長させたＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏ
ｒｔｉｉのａ２株１リットルを原料として行った。ブフ
ナー漏斗で真空濾過した後、培養１リットル当たり菌糸
体４５ｇを産生している、培地（液体分画）と漏斗に保
持された菌糸体（固体分画４．５ｇ）の両方を、解析し
た。固体分画を、音波処理を含む上記（１．４．２．
１）に概要を示した方法を用いて処理することにより、
音波処理液中に菌糸体抽出物１３．５ｍＬを得た。菌糸
体抽出物１３．５ｍＬおよび培地１０ｍＬを１０％トリ
クロール酢酸で沈殿させ、沈殿物質を音波処理液最終容
積２００μＬに再懸濁した。これらの試料を、次にタン
パク質電気泳動および実施例１、１．４．２に詳細に記
載されているような免疫ブロット法により解析した。

【００７１】１４％電気泳動ゲルからの実験結果を、図
１１に示す。この図におけるレーン７は、公知の分子量
のタンパク質（マーカー）を含んでいる。各タンパク質
に相当する分子量は、図の右側に示されている。レーン
２は、真菌Ｔ０９０１を成長させた培地の試料を含んで
いる。実施例１に記載のように、この真菌は、細胞内タ
ウマチンのプロデユーサーである。レーン３および５
は、形質転換体ａ２に相当する培地（Ｅ：細胞外）およ
び菌糸体（Ｉ：細胞内）の試料を含んでいる。レーン４
および６は、未形質転換Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏ
ｑｕｅｆｏｒｔｉｉに相当する同じ試料（ＥおよびＩ）
を含んでいる。図１１に明確に示されているように、形
質転換株ａ２は、タウマチンの良好なプロデユーサーお
よび分泌型であることが判明した。しかしながら、レー
ン３と５との比較から明らかなように、産生タウマチン
の一部が分泌されず、分泌の有効性は完全ではなかっ
た。官能検査を培養ブロスについて行ったところ、タウ
マチン特有の甘味が検出された。

【００７２】実施例３：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｇｅｒのａｗａｍｏｒｉ変異株におけるタウマチンの細
胞外産生 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのａｗａｍｏｒｉ
変異株のＮＲＲＬ３１２株を、文献（Ｙｅｌｔｏｎ等、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、１９８
４、第８１巻、第１４７０〜４頁）に記載の方法を多少
変更して、ポリエチレングリコールの存在下で形質転換
した。２リットルフラスコに入れたＣＭ媒体（麦芽エキ
ス、５ｇ／Ｌ；酵母エキス、５ｇ／Ｌ；グルコース、５
ｇ／Ｌ）４００ｍＬに、ディシュからＡｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｎｉｇｅｒのａｗａｍｏｒｉ変異株の胞子を接
種した。真菌を、１６時間成長させた。菌糸体を、無菌
ガーゼ濾過により採取し、洗浄緩衝液１００ｍＬ（０．
６Ｍ ＭｇＳＯ_４、１０ｍＭ Ｎａ_３ＰＯ_４、ｐＨ５．
８）で洗浄した。菌糸体を、無菌ペーパータオルで圧搾
し、２．５ｇを得た。

【００７３】プロトプラストの形成のために、菌糸体
を、冷プロトプラスト緩衝液（１．２Ｍ ＭｇＳＯ_４、
１０ｍＭ Ｎａ_３ＰＯ_４、ｐＨ５．８）１５ｍＬ／ｇに
再懸濁した。この時点で、菌糸体１ｇ当たりリシン酵素
（Ｓｉｇｍａ）４０ｍｇを添加し、混合物を、氷中に５
分間配置した。このインキュベーション後、ＢＳＡ溶液
１ｍＬ（プロトプラスト緩衝液に１２ｍｇ／ｍＬ）を添
加し、溶液を、３０℃で３〜４時間インキュベーション
した。プロトプラストの形成は、顕微鏡で監視した。混
合物を、ナイロンまたはガラス膜で濾過し、プロトプラ
スト緩衝液で洗浄した。プロトプラストを、浮動ロータ
ー（ベックマンＧＰＲセントリフユージ）を用いて、２
０００ｒｐｍ、４℃、１５分間遠心分離した。プロトプ
ラストを、ＳＴ溶液（１Ｍソルビット、１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）１５ｍＬに再懸濁し、再び
遠心分離し、ＳＴ溶液１ｍＬに再懸濁した。溶液を再び
遠心分離し、ＳＴＣ（ＳＴ＋０．０１Ｍ ＣａＣｌ_２）
１ｍＬで２回洗浄した。顕微鏡により、プロトプラスト
をカウントし、再び遠心分離し、十分な容積のＳＴＣに
再懸濁して、濃度１０^８プロトプラスト／ｍＬとした。
各４００ｍＬ培養で、一般的に１０^８プロトプラストが
得られた。その時点で、プロトプラストを、５ｍＬ試験
官にショ糖浸透安定剤（１Ｍ）含有０．７％軟寒天の再
分化培地で直接平板培養し、１．５％寒天を有する基本
培地で平板培養した。

【００７４】形質転換実験のために、１０^８−プロトプ
ラスト／ｍＬプロトプラスト溶液２００μＬを原料とし
て使用した。形質転換体ＤＮＡ（この場合ｐＴｈＩＩ
Ｉ）１０μｇおよびＰＴＣ（６０％ＰＥＧ６０００；１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１０ｍＭ Ｃ
ａＣｌ_２）５０μＬをプロトプラストに添加し、溶液を
氷中で２０分間インキュベーションした。次に、ＰＴＣ
１ｍＬを添加し、溶液を十分に混合し、室温で５分間保
持した。プロトプラストを遠心分離し、ＳＴＣ媒体２０
０μＬに再懸濁した。混合物を、スルファニルアミド１
ｍｇ／ｍＬを有する再分化培地で平板培養した。ディシ
ュをさかさにして、３０℃でインキュベーションした。
インキュベーション開始３〜４日後に、再分化を観察し
た。

【００７５】（３．１）再分化媒体の製造 １．追跡溶液：４００ｍｇ／Ｌ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ
_２Ｏ；８００ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；８００
ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ_４・２Ｈ_２Ｏ；８００ｍｇ／ＬＮａ
_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ；４０ｍｇ／Ｌ Ｎａ_２ＢｒＯ_７
・１０Ｈ_２Ｏ；８ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ。 ２．塩溶液（５０Ｘ）：２６ｇ／Ｌ ＫＣｌ；２６ｇ／
Ｌ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ；７６ｇ／Ｌ ＫＨ_２Ｐ
Ｏ_４；追跡溶液５０ｍＬ／Ｌ。 ３．酒石酸アンモニウム：１リットル当たり３０グラム ４．ＭＭＡ（最小アスペルギルス培地）：グルコース１
０若しくは１５ｇまたは寒天７ｇを、蒸留水９７０ｍＬ
を添加（それぞれ最終濃度１．５％または０．７％）し
た。得られた混合物をオートクレーブ処理し、次に無菌
酒石酸アンモニウム溶液１０ｍＬおよび無菌塩溶液２０
ｍＬを添加した。最後に、ショ糖をＭＭＡ培地に濃度１
Ｍとなるまで添加して、再分化培地を調製した。

【００７６】実施例４：グルコアミラーゼ−タウマチン
融合タンパク質の産生、分泌および処理 図１２に概略
示すように、ｐＧＥＸ−ＫＧプラスミド（５．０Ｋｂ）
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ製）を、Ｎｃｏ
ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで順次制限して、約４９００ｐ
ｂの断片を形成した。ｐＧＥＸ−ＫＧポリリンカーのＳ
ａｌＩ制限部位をもはや含んでいないこの断片を、０．
８％アガロースゲルで精製した。前記断片を、タウマチ
ンの合成遺伝子の第二部分を含むｐＴＺ１８ＲＮ（３／
４）プラスミドから得たＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片
と連結することにより、約５．３ＫｂのｐＥＣＴｈＩプ
ラスミドを形成した。この新たなプラスミドをＮｃｏＩ
で制限し、線状化断片を、タウマチンの合成遺伝子の第
一部分を含むｐＴＺ１８ＲＮ（１／２）プラスミドから
得たＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ断片と連結することにより、ｐ
ＥＣＴｈＩＩプラスミド（約５．６Ｋｂ）を形成した。
ｐＥＣＴｈＩＩプラスミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉのｔａｃプロモーターにより制御されたタウ
マチンの合成遺伝子を含んでいた。この構築により、Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中での組換えタウマチ
ンの細胞内産生を制御することが可能となった。

【００７７】ｐＴｈＩＸの構築の開始点は、ｐＥＣＴｈ
Ｉプラスミド（約５．３Ｋｂ）であった。このプラスミ
ドに存在する唯一のＭｓｃＩ制限部位を除去するため
に、ｐＥＣＴｈＩを、ＭｓｃＩおよびＥｃｏＲＶ（平滑
端を生じる酵素）で順次制限して、４．１Ｋｂ断片と
１．２Ｋｂ断片の２つを得た。４．１Ｋｂ断片を０．８
％アガロ−スゲルで精製し、ＤＮＡリガーゼを用いて再
連結した。その結果、ｐＴｈＩＶプラスミドが得られ
た。このプラスミドをＮｃｏＩで線状化し、線状断片
を、タウマチンの合成遺伝子の前半の半分を含むｐＴＺ
１８ＲＮ（１／２）プラスミドから得たＮｃｏＩ−Ｎｃ
ｏＩ断片と連結することにより、ｐＴｈＶプラスミドを
得た。

【００７８】市販の一本鎖オリゴヌクレオチドであるＧ
ＬＡ１およびＧＬＡ２（Ｉｎｇｅｎａｓａ Ｓ．Ａ）を
入手した。これらのオリゴヌクレオチドは、以下の配列
（図１４のように不融化した）を有する： ＧＬＡ１：５´−ＡＡＴＴＣＴＧＣＧＧＡＡＣＧＴＣＧ
ＡＣＣＧＣＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣ
ＧＧＣＧＡＡＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＧＧ−３´ ＧＬＡ２：５´−ＣＣＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＴＴＣＧＣ
ＣＧＣＣＡＧＧＴＧＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＧＣＧＧ
ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＣＧＣＡＧ−３´

【００７９】これらの２種のオリゴヌクレオチドを、以
下の方法でアニーリングした：各オリゴヌクレオチド１
０μｇを、連結緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
ｐＨ７．５；２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２；５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ）に添加して（最終容積２５μＬ）混合した。得られ
た混合物を６５℃で５分間加熱し、温度を、ゆっくり
（１時間３０分）と３０℃まで低下させた。このように
して閉鎖した二本鎖ＤＮＡを、８％ポリアクリルアミド
ゲルで精製した。ＧＬＡ（１／２）と命名したこの二本
鎖合成ヌクレオチドは、１つの平滑端と、１つのＥｃｏ
ＲＩ端を有していた。ｐＴｈＶプラスミドをＭｓｃＩお
よびＥｃｏＲＩで消化し、ＧＬＡ（１／２）合成断片と
連結することにより、ｐＴｈＶＩを得た。図１４に、Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ
遺伝子の最後の配列、スペーサー配列およびタウマチン
ＩＩの合成遺伝子間の結合を示す。

【００８０】次の工程では、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
のａｗａｍｏｒｉ変異株のグルコアミラーゼ（ｇｌａ
Ａ）の完全遺伝子を、タウマチンＩＩの完全遺伝子と合
わせて挿入することにより、グルコアミラーゼ−タウマ
チン融合タンパク質が形成できるようにした。Ｂｅｌｇ
ｉａｎ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｓおよびＬＭＢＰプラスミド（Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉ
ｕｍ、ｎｕｍｂｅｒ１７２８）から得たｐＦＧＡ２プラ
スミドは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグル
コアミラーゼの完全遺伝子（ｇｌａＡ）を有していた。
このプラスミドを、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化
し、タンパク質の最後の１０アミノ酸を除いてグルコア
ミラーゼの完全遺伝子を含有する約２．３Ｋｂ断片を分
離した。この断片を、予めＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで
消化したｐＴｈＶＩプラスミドと連結することにより、
ｐＴｈＶＩＩプラスミドを得た（スプライスは図１４に
説明されている）。

【００８１】Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのａ
ｗａｍｏｒｉ変異株のグルコアミラーゼ遺伝子を得るた
めに、以下のプロセスを実施した：この真菌のＮＲＲＬ
３１２株の完全ＤＮＡを、上記１．４．１．１に示した
プロトコールに準じて調製した。グルコアミラーゼ遺伝
子の５´および３´端の２つの相補オリゴヌクレオチド
を使用して、完全遺伝子を増幅した。このように増幅し
た断片を、０．８％アガロースゲル精製し、ＥｃｏＲＩ
およびＳａｌＩで消化した。この２．３Ｋｂ断片Ｅｃｏ
ＲＩ−ＳａｌＩを、予めＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで制
限したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｍｅ Ｉｎｃ．より入手）でサブクローニングするこ
とにより、ｐＧＬＡ−Ａｗプラスミドを形成した。

【００８２】グルコアミラーゼ−スペーサー−タウマチ
ンカセットをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのｇ
ｌａプロモーターの制御下に配置するために、ｐＴｈＶ
ＩＩプラスミドを制限酵素ＢｓｓＨＩＩ（部分消化）お
よびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、約３．０Ｋｂ断片を分離
した。この断片を、予めＢｓｓＨＩＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化したｐＡＮ５２−６Ｂで連結することによ
り、ｐＴｈＶＩＩＩプラスミドを得た。最後に、スルフ
ァニルアミド耐性遺伝子（Ｓｕ^Ｒ）を実施例２と同様に
して挿入することにより、ｐＴｈＩＸを形成した。

【００８３】ｐＴｈＩＸプラスミドは、（ｉ）スルファ
ニルアミド耐性マーカーと；（ｉｉ）（ａ）タウマチン
ＩＩの合成遺伝子と、（ｂ）次にＫＥＸ２プロセッシン
グ配列を含有しているスペーサー配列と、（ｃ）Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの完全グルコアミラーゼ
遺伝子とにより形成された融合タンパク質をコードして
いるＤＮＡ配列と；（ｉｉｉ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）の
シグナル配列（「プレ」）と「プロ」配列とを含んでい
た。ｐＴｈＩＸプラスミドを使用して、実施例３に示し
たプロトコールに準じてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
ｇｅｒのａｗａｍｏｒｉ変異株を形質転換した。正しく
タウマチンを分泌し処理した形質転換体が得られ、そし
てこのタンパク質が甘味があることが分かった。

【００８４】ｐＴｈＶＩＩプラスミドの代わりにｐＧＬ
Ａ−Ａｗプラスミドを用いた以外は同様にして、Ａ．ｎ
ｉｇｅｒのｇｌａの代わりにＡ．ａｗａｍｏｒｉのｇｌ
ａを含有するｐＴｈＩＸの類似のプラスミドを得た。同
様に、このプラスミドも使用してＡ．ａｗａｍｏｒｉ株
を形質転換したところ、同様の結果が得られた。

【００８５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：６２４ 配列の型：核酸 鎖の数： トポロジー： 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCC ACC TTC GAG ATC GTC AAC CGC TGC TCC TAC ACC GTG TGG GCG GCC 48 Ala Thr Phe Glu Ile Val Asn Arg Cys Ser Tyr Thr Val Trp Ala Ala 1 5 10 15 GCC TCC AAA GGC GAC GCC GCC CTG GAC GCC GGC GGC CGC CAG CTC AAC 96 Ala Ser Lys Gly Asp Ala Ala Leu Asp Ala Gly Gly Arg Gln Leu Asn 20 25 30 TCG GGA GAG TCC TGG ACC ATC AAC GTA GAA CCC GGC ACC AAG GGC GGC 144 Ser Gly Glu Ser Trp Thr Ile Asn Val Glu Pro Gly Thr Lys Gly Gly 35 40 45 AAA ATC TGG GCC CGC ACC GAC TGC TAT TTC GAC GAC AGC GGC CGC GGC 192 Lys Ile Trp Ala Arg Thr Asp Cys Tyr phe Asp Asp Ser Gly Arg Gly 50 55 60 ATC TGC CGG ACC GGC GAC TGC GGC GGC CTC CTC CAG TGC AAG CGC TTC 240 Ile Cys Arg Thr Gly Asp Cys Gly Gly Leu Leu Gln Cys Lys Arg Phe 65 70 75 80 GGC CGG CCG CCC ACC ACG CTG GCG GAC TTC TCG CTC AAC CAG TAC GGC 288 Gly Arg Pro Pro Thr Thr Leu Ala Glu Phe Ser Leu Asn Gln Tyr Gly 85 90 95 AAG GAC TAC ATC GAC ATC TCC AAC ATC AAA GGC TTC AAC GTG CCG ATG 336 Lys Asp Tyr Ile Asp Ile Ser Asn Ile Lys Gly Phe Asn Val Pro Met 100 105 110 GAC TTC TGC CCG ACC ACG CGC GGC TGC CGC GGG GTG CGG TGC GCC GCC 384 Asp Phe Ser Pro Thr Thr Arg Gly Cys Arg Gly Val Arg Cys Ala Ala 115 120 125 GAC ATC GTG GGC CAG TGC CCG GCG AAG CTG AAG GCG CCG GGG GGT GGT 432 Asp Ile Val Gly Gln Cys Pro Ala Lys Leu Lys Ala Pro Gly Gly Gly 130 135 140 TGC AAC GAT GCG TGC ACC GTG TTC CAG ACG AGC GAG TAC TGC TGC ACC 480 Cys Asn Asp Ala Cys Thr Val Phe Gln Thr Ser Glu Tyr Cys Cys Thr 145 150 155 160 ACG GGG AAG TGC GGG CCG ACG GAG TAC TCG CGC TTC TTC AAG AGG CTT 528 Thr Gly Lys Cys Gly Pro Thr Glu Tyr Ser Arg Phe Phe Lys Arg Leu 165 170 175 TGC CCC GAC GCG TTC AGT TAT GTC CTG GAC AAG CCA ACC ACC GTC ACC 576 Cys Pro Asp Ala Phe Ser Tyr Val Leu Asp Lys Pro Thr Thr Val Thr 180 185 190 TGC CCC GGC AGC TCC AAC TAC AGC GTC ACT TTC TGC CCT ACT GCC(TAA)n 624 Cys Pro Gly Ser Ser Asn Tyr Arg Val Thr Phe Cys Pro Thr Ala 195 200 205

【００８６】配列番号：２ 配列の長さ：６２４ 配列の型：核酸 鎖の数： トポロジー： 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GCC ACC TTC GAG ATC GTC AAC CGC TGC TCC TAC ACC GTG TGG GCC GCC 48 Ala Thr Phe Glu Ile Val Asn Arg Cys Ser Tyr Thr Val Trp Ala Ala 1 5 10 15 GCC TCC AAG GGC GAC GCC GCC CTC GAC GCC GGC GGC CGC CAG CTC AAC 96 Ala Ser Lys Gly Asp Ala Ala Leu Asp Ala Gly Gly Arg Gln Leu Asn 20 25 30 TCC GGC GAG TCC TGG ACC ATC AAC GTA GAG CCC GGC ACC AAG GGC GGC 144 Ser Gly Glu Ser Trp Thr Ile Asn Val Glu Pro Gly Thr Lys Gly Gly 35 40 45 AAG ATC TGG GCC CGC ACC GAC TGC TAC TTC GAC GAC TCC GGC CGC GGC 192 Lys Ile Trp Ala Arg Thr Asp Cys Tyr phe Asp Asp Ser Gly Arg Gly 50 55 60 ATC TGC CGC ACC GGC GAC TGC GGC GGC CTC CTC CAG TGC AAG CGC TTC 240 Ile Cys Arg Thr Gly Asp Cys Gly Gly Leu Leu Gln Cys Lys Arg Phe 65 70 75 80 GGC CGC CCC CCC ACC ACC CTC GCC GAC TTC TCC CTC AAC CAG TAC GGC 288 Gly Arg Pro Pro Thr Thr Leu Ala Glu Phe Ser Leu Asn Gln Tyr Gly 85 90 95 AAG GAC TAC ATC GAC ATC TCC AAC ATC AAG GGC TTC AAC GTC CCC ATG 336 Lys Asp Tyr Ile Asp Ile Ser Asn Ile Lys Gly Phe Asn Val Pro Met 100 105 110 GAC TTC TCC CCC ACC ACC CGC GGC TGC CGC GGC GTC CGC TGC GCC GCC 384 Asp Phe Ser Pro Thr Thr Arg Gly Cys Arg Gly Val Arg Cys Ala Ala 115 120 125 GAC ATC GTC GGC CAG TGC CCC GCC AAG CTC AAG GCC CCC GGC GGC GGC 432 Asp Ile Val Gly Gln Cys Pro Ala Lys Leu Lys Ala Pro Gly Gly Gly 130 135 140 TGC AAC GAC GCC TGC ACC GTC TTC CAG ACC TCC GAG TAC TGC TGC ACC 480 Cys Asn Asp Ala Cys Thr Val Phe Gln Thr Ser Glu Tyr Cys Cys Thr 145 150 155 160 ACC GGC AAG TGC GGC CCC ACC GAG TAC TCC CGC TTC TTC AAG CGC CTC 528 Thr Gly Lys Cys Gly Pro Thr Glu Tyr Ser Arg Phe Phe Lys Arg Leu 165 170 175 TGC CCC GAC GCC TTC TCC TAC GTC CTC GAC AAG CCC ACC ACC GTC ACC 576 Cys Pro Asp Ala Phe Ser Tyr Val Leu Asp Lys Pro Thr Thr Val Thr 180 185 190 TGC CCC GGC TCC TCC AAC TAC CGC GTC ACC TTC TGC CCC ACC GCC(TAA)n 624 Cys Pro Gly Ser Ser Asn Tyr Arg Val Thr Phe Cys Pro Thr Ala 195 200 205

【図面の簡単な説明】

【図１】（Ａ）市販のプラスミドｐＴＺ１８ＲＮのＭＣ
Ｓから得た配列２７２〜３０４の部分を示す断片であ
り、（Ｂ）ＮｃｏＩについての唯一の制限部位を示す、
図１Ａの断片から得られるプラスミドｐＴＺ１８ＲＮの
断片である。

【図２】二対のオリゴヌクレオチドを有する合成遺伝子
を組立てるのに使用される方法を示す。各対のオリゴヌ
クレオチドは、相補部を有している。Ａ、Ｂ、およびＣ
は、オリゴヌクレオチドを対合しｐＴＺ１８ＲＮベクタ
ー上に伸長したオリゴヌクレオチド対のクローニングに
必要な制限酵素を表す。

【図３】遺伝子の組立てに使用されるオリゴヌクレオチ
ドの配列を示す。

【図４】人工および合成遺伝子（黒で表されている配
列）の構築における異なる段階を示す図である。

【図５】サンガージデオキシ法を用いた遺伝子配列の代
表的なオートラジオグラフである。（Ａ）は最初の６０
ヌクレオチド、（Ｂ）はヌクレオチド７０〜１７０、そ
して（Ｃ）はヌクレオチド３３０〜３７０である。

【図６】ｐＴｈＩＩプラスミドを得るために行なわれた
操作を示す図である。

【図７】二種の形質転換真菌Ｍ０９０１およびＴ０９０
１のＰＣＲ解析の結果を、ｐＴｈｉＩＩプラスミドおよ
び未形質転換対照真菌と比較して示したものである。ｘ
軸上には、二基準マーカーによる塩基数が示されてい
る。

【図８】図７の形質転換真菌の免疫ブロット解析の結果
を、市販のタウマチンＩＩ（Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．より
入手）および未形質転換対照真菌と比較してし示した図
である（Ｅ＝細胞外タンパク質；Ｉ＝細胞内タンパク
質）。ｙ軸に示されている数値は、公知分子量のタンパ
ク質マーカーに相当する。矢印は、市販のタウマチン
（４）および組換えタウマチンが移動する場所（２、
３、５、および６）を示す。

【図９】ｐＴｈＩＩＩプラスミドを得るために行なわれ
た操作を示す図である。スルファニルアミド耐性（Ｓｕ
^Ｒ）の遺伝子に相当する配列は濃い網目部として示さ
れ、タウマチンの配列は薄い網目部として示されてい
る。垂直線を有する部分は、グルコアミラーゼ遺伝子か
ら得た２４アミノ酸の「シグナル」配列だけでなく、異
なる真菌プロモーターおよび終止配列をも示す（図中、
ＳＳＧｌａＡ_２４と表示してある）。

【図１０】Ａ２形質転換真菌（タウマチン分泌型）のＰ
ＣＲ分析の結果を示す。ｘ軸上には、基準マーカーによ
る塩基数が示されている。レーン１および５はマーカー
に相当し、レーン２は未形質転換真菌（対照）から得た
ＤＮＡを含み、レーン３は真菌ａ２から得たＤＮＡを含
む。レーン４は、陽性対照（ｐＴｈＩＩＩプラスミド由
来ＤＮＡ）である。

【図１１】形質転換真菌Ｔ０９０１およびａ２の免疫ブ
ロット分析の結果を示す図である。レーン１はＳｉｇｍ
ａ社から入手した市販のタウマチンを含む。レーン７
は、公知の分子量のタンパク質マーカーに相当する（各
タンパク質の分子量を各レーンの隣に示す）。レーン２
は、Ｔ０９０１１真菌の成長を行った培地（細胞内タウ
マチンのプロデユーサー）を含む。レーン３および４
は、ａ２真菌の成長を行った培地（細胞外プロデリュー
サー）および未形質転換真菌（対照）を含む。レーン５
および６は、それぞれこれらの二種の真菌から得た菌糸
体を含む。

【図１２】ｐＥＣＴｈＩＩプラスミドを得るために行な
われた操作を示す図である。濃い網目部分は、タウマチ
ンＩＩの合成遺伝子を表す。

【図１３】ｐＴｈＩＸプラスミドを得るために行なわれ
た操作を示す図である。濃い網目部分は、Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒのａｗａｍｏｒｉ変異株のグルコアミラーゼ
（ｇｌａＡ）配列である。波線部分は、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉのグルタチオン−Ｓ−転移酵素配列
を表す。タウマチンＩＩをコードしている合成遺伝子は
薄い灰色網目部として示され、垂直線で示されているス
ペーサー配列は、タウマチンとグルコアミラーゼの遺伝
子間にある。

【図１４】図１３と同様にｐＴｈＩＸプラスミドを得る
ために行なわれた操作を示す図である。

【図１５】グルコアミラーゼとタウマチンとの間の融合
部の配列を詳細に示した図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/415 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/15 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:665） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:665） (72)発明者 クリスティーナ、パティーニョ‐マルティ ン スペイン国マドリード、トレス、カント ス、セクトル、リテラトス、32 (72)発明者 エリサ、イオシフ、カロ‐コエノバ スペイン国マドリード、アベニーダ、マル ケス、デ、サフラ、28 (72)発明者 カタリーナ、デル、モラル‐フアレス スペイン国マドリード、アベニーダ、サン タ、エウゲニア、56 (72)発明者 イグナチオ、ファウス‐サンタスサーナ スペイン国バルセロナ、アルキテクト、モ ラガス、18‐ア (72)発明者 ホセ‐ルイス、デル、リオ‐ペリカチョ スペイン国テラサ、ラムブラ、デガラ、 273 (72)発明者 ホアン、ブラデ‐ピケ スペイン国バルセロナ、アルベルト、リャ ナス、11

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下流にｎ停止配列（但し、整数ｎは１以上
   である）が続くタンパク質タウマチンＩＩ（配列番号１
   に含まれる）の２０７アミノ酸に相当するアミノ酸配列
   をコードしているＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列
   は、タウマチンＩＩの２０７アミノ酸をコードしている
   天然遺伝子（配列番号１に示されている天然遺伝子）
   を、可能な変更の５０％を超える割合で変更して得られ
   たものであり、前記変更が、ｎＴＡＡ停止コドン（但
   し、整数ｎは１以上である）を付加し、かつタウマチン
   ＩＩのアミノ酸に相当するヌクレオチドコドンを可能な
   変化の５０％を超える割合で変化させることからなり、
   前記変化が、可能なすべてのアミノ酸における原コドン
   を以下のアミノ酸コドン表における（ ）内に示したコ
   ドンで置換することからなる、ＤＮＡ配列：Ａｌａ（Ｇ
   ＣＣ）、Ａｒｇ（ＣＧＣ）、Ａｓｎ（ＡＡＣ）、Ａｓｐ
   （ＧＡＣ）、Ｃｙｓ（ＴＧＣ）、Ｌｙｓ（ＡＡＧ）、Ｇ
   ｌｎ（ＣＡＧ）、Ｇｌｕ（ＧＡＧ）、Ｇｌｙ（ＧＧ
   Ｃ）、Ｉｌｅ（ＡＴＣ）、Ｌｅｕ（ＣＴＣ）、Ｍｅｔ
   （ＡＴＧ）、Ｐｈｅ（ＴＴＣ）、Ｐｒｏ（ＣＣＣ）、Ｓ
   ｅｒ（ＴＣＣ）、Ｔｈｒ（ＡＣＣ）、Ｔｒｐ（ＴＧ
   Ｇ）、Ｔｙｒ（ＴＡＣ）、Ｖａｌ（ＧＴＣ）。
2. 【請求項２】前記変更が、１〜３ＴＡＡ停止コドン（ｎ
   ＝１、２または３）を付加し、可能なコドン変化の７５
   ％を超える割合でコドンを変化させることからなる、請
   求項１に記載のＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】可能なコドン変化のすべて（１００％）が
   行なわれ、ＤＮＡ配列が配列番号２に示したものとされ
   た、請求項２に記載のＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】（ｉ）請求項１〜３のいずれか１項に記載
   のＤＮＡ配列と、（ｉｉ）糸状菌発現カセットであって
   この種の菌に関する一つのプロモーター配列と一つの終
   止配列とを含有する糸状菌発現カセットと、（ｉｉｉ）
   適当な選択マーカーと、そして、必要に応じて、（ｉ
   ｖ）タンパク質の細胞外産生用分泌シグナルＤＮＡ配列
   とを含んでなる、組換えプラスミド。
5. 【請求項５】前記発現カセットのプロモーター配列がＡ
   ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの酵素グリセルアル
   デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの遺伝子由
   来または同じ菌のグルコアミラーゼ遺伝子由来であり、
   発現カセットの終止配列がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
   ｉｄｕｌａｎｓのトリプトファンＣの終止配列であり、
   そして選択マーカーがスルファニルアミド耐性マーカー
   である、請求項４に記載の組換えプラスミド。
6. 【請求項６】（ｉ）適当な選択マーカーと、（ｉｉ）
   （ａ）請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列
   と、（ｂ）次にＫＥＸ２プロセッシング配列を含有して
   いるスペーサー配列と、（ｃ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
   ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅ
   ｒ（ｇｌａＡ）のａｗａｍｏｒｉ変異株の完全グルコア
   ミラーゼ遺伝子とから構成されるＤＮＡ配列と、（ｉｉ
   ｉ）ｇｌａＡ遺伝子の「プレ」シグナル配列と「プロ」
   配列とを含んでなる融合タンパク質タウマチン−グルコ
   アミラーゼを発現する、組換えプラスミド。
7. 【請求項７】請求項４〜６に記載のプラスミドのいずれ
   かにより形質転換された、タンパク質タウマチンＩＩを
   産生することのできる、糸状菌。
8. 【請求項８】前記糸状菌が、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
   ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎ
   ｉｇｅｒ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
   のａｗａｍｏｒｉ変異株から選択される、請求項７に記
   載の培養。
9. 【請求項９】タウマチンＩＩの製造方法であって、 ａ）請求項１、２、または３に記載のＤＮＡ配列を、請
   求項４、５、または６に記載の発現ベクターのいずれか
   に、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて挿入する工程と、 ｂ）上記発現ベクターにより糸状菌株を形質転換する工
   程と、 ｃ）適当な栄養条件下で前記の方法で形質転換した糸状
   菌株を培養することにより、細胞内、細胞外若しくは両
   方同時にタウマチンＩＩを産生するか、または融合タン
   パク質タウマチン−グルコアミラーゼの形態でタウマチ
   ンＩＩを産生する工程と、そして ｄ）必要に応じて、タウマチンＩＩのみを分離精製する
   か、またはタウマチンＩＩを培地から真菌性菌糸体とと
   もに分離する工程とを含んでなるタウマチンＩＩの製造
   方法。
10. 【請求項１０】糸状菌が、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒ
    ｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
    ｇｅｒ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの
    ａｗａｍｏｒｉ変異株から選択される請求項９に記載の
    方法。
11. 【請求項１１】タンパク質タウマチンＩの２０７アミノ
    酸（配列番号１のものとは５アミノ酸のみ、即ち、４６
    −Ａｓｎ、６３−Ｓｅｒ、６７−Ｌｙｓ、７６−Ａｒ
    ｇ、および１１３−Ａｓｎのみが異なる２０７アミノ
    酸）に相当するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列で
    あって、５固定コドン：ＡＡＣ（４６−Ａｓｎ）、ＴＣ
    Ｃ（６３−Ｓｅｒ）、ＡＡＧ（６７−Ｌｙｓ）、ＣＧＣ
    （７６−Ａｒｇ）、およびＡＡＣ（１１３−Ａｓｎ）を
    有し、コドンの残りは請求項１に記載のＤＮＡ配列と同
    じであることを特徴とするＤＮＡ配列。
12. 【請求項１２】１〜３ＴＡＡ停止コドン（ｎ＝１、２、
    または３）を有し、コドンの残りは５固定コドンが異な
    る以外は請求項２に記載のＤＮＡ配列と同様である、請
    求項１１に記載のＤＮＡ配列。
13. 【請求項１３】５固定コドンが異なる以外は請求項３に
    記載のＤＮＡ配列と同様のコドンを有する、請求項１２
    に記載のＤＮＡ配列。
14. 【請求項１４】（ｉ）請求項１１、１２、または１３の
    いずれか１項に記載のＤＮＡ配列と、（ｉｉ）糸状菌発
    現カセットであってこの種の菌に適当である一つのプロ
    モーター配列と一つの終止配列とを含有する糸状菌発現
    カセットと、（ｉｉｉ）適当な選択マーカーと、そし
    て、必要に応じて、（ｉｖ）タンパク質の細胞外産生用
    分泌シグナルＤＮＡ配列とを含んでなる、組換えプラス
    ミド。
15. 【請求項１５】前記発現カセットのプロモーター配列が
    Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの酵素グリセルア
    ルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼの遺伝子
    由来または同じ菌のグルコアミラーゼ遺伝子由来であ
    り、発現カセットの終止配列がＡ ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
    ｎｉｄｕｌａｎｓのトリプトファンＣであり、そして
    選択マーカーがスルファニルアミド耐性選択マーカーで
    ある、請求項１４に記載の組換えプラスミド。
16. 【請求項１６】（ｉ）適当な選択マーカーと、（ｉｉ）
    （ａ）請求項１１、１２、または１３に記載のＤＮＡ配
    列と、（ｂ）次にＫＥＸ２プロセッシング配列を含有し
    ているスペーサー配列と、（ｃ）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
    ｓ ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅ ｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇ
    ｅｒ（ｇｌａＡ）のａｗａｍｏｒｉ変異株のグルコアミ
    ラーゼの完全遺伝子とから構成されるＤＮＡ配列と、
    （ｉｉｉ）ｇｌａＡ遺伝子の「プレ」シグナル配列と
    「プロ」配列とを含んでなる融合タンパク質タウマチン
    −グルコアミラーゼを発現する、組換えプラスミド。
17. 【請求項１７】請求項１４〜１６に記載のプラスミドの
    いずれかにより形質転換された、タンパク質タウマチン
    ＩＩを産生することのできる、糸状菌。
18. 【請求項１８】前記糸状菌が、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
    ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
    ｎｉｇｅｒおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ
    のａｗａｍｏｒｉ変異株から選択される、請求項１７に
    記載の培養。
19. 【請求項１９】タウマチンＩの製造方法であって、 ａ）請求項１１、１２、または１３のいずれか１項に記
    載のＤＮＡ配列を、請求項１４、１５または１６に記載
    の発現ベクターから選択される１つの発現ベクターに、
    標準的な組換えＤＮＡ法を用いて挿入する工程と、 ｂ）上記発現ベクターにより糸状菌株を形質転換する工
    程と、 ｃ）適当な栄養条件下で前記の方法で形質転換した糸状
    菌株を培養することにより、細胞内、細胞外若しくは両
    方同時にタウマチンＩを産生するか、またはタウマチン
    −グルコアミラーゼ融合タンパク質の形態でタウマチン
    Ｉを産生する工程と、そして ｄ）必要に応じて、タウマチンＩのみを分離精製する
    か、またはタウマチンＩを培地から真菌性菌糸体ととも
    に分離する工程とを含んでなるタウマチンＩの製造方
    法。
20. 【請求項２０】糸状菌が、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒ
    ｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉ
    ｇｅｒ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの
    ａｗａｍｏｒｉ変異株から選択される、請求項１９に記
    載の方法。