JP2022525057A - 融合ポリペプチド - Google Patents

Abstract

本明細書で提供されるのは、とりわけ、１つ以上の対象となるポリペプチドを発現させる及び精製するための改良されたプロテアーゼ認識配列を含む融合ＤＮＡ構築物、並びに組換え型宿主細胞中で１つ以上の対象となるポリペプチドを産生するための方法である。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０１９年３月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８１５，９１２号の優先権を主張する。

本明細書で提供されるのは、とりわけ、改良された切断可能な融合ポリペプチドを含む組成物、並びにこの組成物を利用して宿主細胞中で１つ以上の対象となるポリペプチドを産生するための方法である。

融合ポリペプチドの産生は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、及び糸状菌を含めた、たくさんの微生物において報告されている。これらの融合タンパク質のいくつかでは、対象となるポリペプチドと担体タンパク質の間に、プロテアーゼ認識部位が挿入されている（例えば、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ），９（４）：３７８－８１及びＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ），１３（５）：４９８－５０３）。しかし、多くの場合、１つ以上の対象となるポリペプチドの最適以下の収量につながる不完全な切断が認められている。したがって、改良された融合タンパク質産生のための組成物及び方法、並びに効率的且つ完全なプロテアーゼ媒介性融合タンパク質切断が必要とされる。本明細書に開示される対象物は、これらの必要性に応え、その上、追加の利益を提供する。

本明細書で提供されるのは、とりわけ、宿主細胞において１つ以上の対象となるポリペプチドを産生及び精製する場合に、改良された又は完全なプロテアーゼ媒介性（例えば、ＫＥＸ２媒介性）切断をもたらす、変更されたアミノ酸配列を有する天然に存在しない操作された融合ポリペプチド、並びにこの融合ポリペプチドを利用するための方法である。これらの開示された方法、操作された融合ポリペプチド、及び組換え型の宿主細胞は、開示された変更されたアミノ酸配列を含有しない及び／又は本明細書に開示される方法に従って使用されない融合ポリペプチドと比較した場合の、融合ポリペプチド分泌及び／又は１つ以上の対象となるポリペプチドの精製の増大を提供する。

したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供されるのは、アミノ酸配列Ｔ_１－Ｓ_２－Ｖ－Ａ_３－Ｖ_４－Ｅ_５－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｑ_６－Ｖ_７－（配列番号１）を含む融合ポリペプチドであって、１）Ｘ_１及びＸ_２が、塩基性アミノ酸であり；且つ２）このアミノ酸配列が、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、酸性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＴ_１；疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、塩基性アミノ酸、及び鎖配向に影響を与えるアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＳ_２；塩基性アミノ酸及びＭからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＡ_３；Ｌで置換されたＶ_４；芳香族アミノ酸で置換されたＥ_５；酸性アミノ酸、及び鎖配向に影響を与えるアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＱ_６；及び／又はＬ、Ｉ、及び芳香族アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＶ_７からなる群から選択される１つ以上の置換を有する、融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｔ_１は、Ａ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；Ｓ_２は、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｎ、及びＶからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；Ａ_３は、Ｈ、Ｋ、Ｍ、及びＲからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；Ｅ_５は、Ｆ及びＷからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；Ｑ_６は、Ｄ及びＧからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；及び／又はＶ_７は、Ｌ、Ｉ、及びＦからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。

本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＡＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号３）、ＦＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号２）、ＭＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号４）、ＱＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号５）、ＲＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号６）、及びＹＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号７）からなる群から選択される。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＴＦＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号８）、ＴＨＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号９）、ＴＫＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１０）、ＴＬＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１１）、ＴＭＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１２）、ＴＰＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１３）、ＴＱＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１４）、ＴＲＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１５）、及びＴＶＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１６）からなる群から選択される。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＴＳＶＨＶＥＫＲＱＶ（配列番号１７）、ＴＳＶＫＶＥＫＲＱＶ（配列番号１８）、及びＴＳＶＲＶＥＫＲＱＶ（配列番号１９）からなる群から選択される。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アミノ酸配列ＴＳＶＡＬＥＫＲＱＶ（配列番号２０）。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＴＳＶＡＶＦＫＲＱＶ（配列番号２１）及びＴＳＶＡＶＷＫＲＱＶ（配列番号２２）からなる群から選択される。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＴＳＶＡＶＥＫＲＤＶ（配列番号２３）及びＴＳＶＡＶＥＫＲＧＶ（配列番号２４）からなる群から選択される。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＴＳＶＡＶＥＫＲＱＦ（配列番号２５）及びＴＳＶＡＶＥＫＲＱＬ（配列番号２６）からなる群から選択される。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、Ｃ末端に追加の２つのアミノ酸、Ｔ_８－Ｌ_９（配列番号６４）をさらに含み、ここで、Ｔ_８は、酸性アミノ酸及び疎水性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；及び／又はＬ_９は、Ｉ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。いくつかの実施形態では、Ｔ_８は、Ｅ又はＦで置換されている。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＴＳＶＡＶＥＫＲＱＶＥＬ（配列番号２７）である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＴＳＶＡＶＥＫＲＱＶＴＩ（配列番号２８）及びＴＳＶＡＶＥＫＲＱＶＴＶ（配列番号２９）からなる群から選択される。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、２つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の置換の少なくとも１つは、Ｓ_２又はＶ_４位置である。いくつかの実施形態では、Ｓ_２での置換は、Ｈ又はＮである。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ＴＨＶＡＶＥＫＲＱＶＴＩ（配列番号３０）、ＴＨＶＡＶＥＫＲＤＶＴＬ（配列番号３１）、ＴＨＶＡＶＥＫＲＱＶＡＬ（配列番号３２）、ＥＨＶＡＶＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号３３）、ＴＮＶＡＶＥＫＲＤＶＴＬ（配列番号３４）、及びＴＮＶＡＶＥＫＲＱＶＡＬ（配列番号３５）からなる群から選択される配列である。いくつかの実施形態では、Ｖ_４での置換は、Ｌである。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＴＳＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号３６）、ＴＳＶＭＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号３７）、ＴＳＶＡＬＥＫＲＱＩＴＬ（配列番号３８）、及びＴＳＶＡＬＥＫＲＱＶＡＬ（配列番号３９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｓ_２及びＶ_４での置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＴＨＶＡＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号４０）である。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＴＳＶＡＶＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号４１）である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、３つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＴＨＶＭＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号４２）、ＴＫＶＭＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号４３）、ＴＨＶＡＶＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号４４）、ＴＨＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号４５）、ＴＫＶＡＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号４６）、ＴＮＶＡＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号４７）、ＥＨＶＡＶＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号４８）、ＥＨＶＡＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号４９）、ＥＳＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号５０）、ＲＳＶＲＶＥＫＲＤＶＴＬ（配列番号５１）、及びＴＳＶＡＬＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号５２）からなる群から選択される。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、４つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＴＨＶＡＬＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号５３）、ＴＫＶＲＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号５４）、ＴＮＶＡＬＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号５５）、ＥＨＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号５６）、ＥＰＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号５７）、ＮＨＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号５８）、ＲＳＶＲＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号５９）、ＲＫＶＲＶＥＫＲＤＶＴＬ（配列番号６０）、ＲＫＶＲＶＥＫＲＱＬＴＬ（配列番号６１）、及びＲＫＶＡＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号６２）からなる群から選択される。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、５つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、ＲＫＶＲＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号６３）である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、Ｘ_１及びＸ_２は、ＫＫ、ＲＲ、ＫＲ、及びＲＫからなる群から選択される、本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、１種以上のプロテアーゼによって完全に切断される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６１）である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、シグナル配列をコードするポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列をコードするポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に位置する。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、担体タンパク質をコードするポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質をコードするポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に位置する。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、担体タンパク質をコードするポリペプチドは、シグナル配列をコードするポリペプチドに隣接している。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、担体タンパク質は、ＣＢＨ１又はその断片を含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、対象となるポリペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドをコードするポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に位置する。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドは、酵素である。いくつかの実施形態では、酵素は、活性又は不活性な炭水化物分解酵素、プロテアーゼ、リパーゼ、及び細胞溶解酵素からなる群から選択される酵素である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドは、治療用タンパク質である。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、抗体又はその機能性断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、軽鎖又は重鎖モノクローナル抗体である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、シグナル配列はＣＢＨ１シグナル配列であり、担体タンパク質はＣＢＨ１含有担体タンパク質であり、対象となるポリペプチドは抗体軽鎖又はその機能性断片である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、シグナル配列はＣＢＨ１シグナル配列であり、担体タンパク質はＣＢＨ１含有担体タンパク質であり、対象となるポリペプチドは抗体重鎖又はその機能性断片である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、シグナル配列はＣＢＨ１シグナル配列であり、担体タンパク質はＣＢＨ１含有担体タンパク質であり、対象となるポリペプチドは抗体重鎖又はその断片及び抗体軽鎖又はその機能性断片である。いくつかの実施形態では、抗体又はその機能性断片は、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態では、抗体又はその機能性断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、二重特異性抗体、直鎖抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体からなる群から選択される。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体又はその機能性断片は、抗ＲＳウイルス（ＲＳＶ）抗体、抗エボラウイルス抗体、抗凝集βアミロイド（Ａβ）抗体、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗体、抗精子抗体（抗ヒト避妊抗原（ＨＣＡ）抗体など）、及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である。

他の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示される融合ポリペプチドのいずれかをコードする核酸である。

さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示される核酸のいずれかをコードするベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む。

さらに他の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示される融合ポリペプチドのいずれか、本明細書に開示される核酸のいずれか、及び／又は本明細書に開示されるベクターのいずれかを含む宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳類宿主細胞、細菌宿主細胞、及び真菌宿主細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、酵母細胞又は糸状菌細胞である。いくつかの実施形態では、酵母細胞は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、真菌細胞は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の種、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の種、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）の種、グリオクラジウム属（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）の種、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）の種、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の種、ボタンタケ属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）の種；マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）の種、及びエメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）の種からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、及びアワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）からなる群から選択される。

他の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示される融合ポリペプチドのいずれかを産生するための方法であって、本明細書に開示される宿主細胞のいずれかを、融合ポリペプチドの産生に適した条件下で培養することを含む方法である。いくつかの実施形態では、この方法は、融合ポリペプチドを単離することをさらに含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、この方法は、融合ポリペプチドをプロテアーゼで切断することをさらに含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６１）である。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの切断は、配列番号１のアミノ酸配列を欠く等価な融合ポリペプチドの切断と比較して増大される。いくつかの実施形態では、この方法は、切断された融合ポリペプチドの産生物の一方又は両方を単離することをさらに含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの分泌は、配列番号１のアミノ酸配列を欠く等価な融合ポリペプチドの分泌と比較して増大される。

さらなる態様では、本明細書で提供されるのは、融合ポリペプチドを切断するための方法であって、本明細書に開示される融合ポリペプチドのいずれかを、プロテアーゼと接触させることを含む方法である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６１）である。

他の態様では、本明細書で提供されるのは、ａ）本明細書に開示される融合ポリペプチドのいずれかを産生するための書面の説明書；並びにｂ）本明細書に開示される核酸のいずれか；２）本明細書に開示されるベクターのいずれか；及び／又は３）本明細書に開示される宿主細胞のいずれかのうちの１つ以上を含むキットである。いくつかの実施形態では、キットは、４）Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６１）を含む組成物；及び／又は５）Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼをコードする核酸のうちの１つ以上をさらに含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼを発現する宿主細胞をさらに含む。本明細書に開示される実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、キットは、６）追加のプロテアーゼを含む組成物；及び／又は７）追加のプロテアーゼをコードする核酸のうちの１つ以上をさらに含む。

本明細書に記載した態様と実施形態はそれぞれ、その実施形態又は態様の文脈により明示的に又は明確に除外されない限り、共に使用することが可能である。

本明細書全体を通して、様々な特許、特許出願、及び他の種類の刊行物（例えば、学術雑誌論文、電子データベースエントリなど）が引用されている。本明細書に引用されたすべての特許、特許出願、及び他の刊行物の開示の全体を、すべての目的のために、参照によって本明細書に組み込む。

ＫＥＸ２部位前駆及び後部配列を含む融合ポリペプチドを表す模式図である。

選択された操作されたＫＥＸ２認識配列の切断効率を示す代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを表す。変更されていない配列を、アスタリスク（＊）によって示した。

Ｓｙｎａｇｉｓ ＨＣ重鎖ＳＥＬライブラリー構築のために使用されるエントリークローンの模式図を表す。

発現ベクターｐＴＴＴｐｙｒ２－ＩＳｃｅＩ－Ｓｙｎａｇｉｓ ＨＣ＿Ｇｅｎｅａｒｔ＿ＳＥＬ重鎖の模式図を表す。

Ｓｙｎａｇｉｓ抗体重鎖のヌクレオチド配列を表す。 Ｓｙｎａｇｉｓ抗体重鎖のアミノ酸配列を表す。

ｐＡＳ２５発現ベクターの模式図を表す。

ＴＫＶＡＶＥＫＲ ｋｅｘ配列を有するトラスツズマブ重鎖ベクターの模式図を表す。 ＴＳＶＡＶＥＫＲ ｋｅｘ配列を有するトラスツズマブ重鎖ベクターの模式図を表す。

ＴＫＶＡＶＥＫＲ ｋｅｘ配列を有するトラスツズマブ軽鎖ベクターの模式図を表す。 ＴＳＶＡＶＥＫＲ ｋｅｘ配列を有するトラスツズマブ軽鎖ベクターの模式図を表す。

ＣＢＨ１からのトラスツズマブの切断を示すウエスタンブロットの結果を表す。

トラスツズマブＨＣのアミノ酸配列を表す。 ｐＪＣ１５９内のトラスツズマブＨＣのヌクレオチド配列を表す。 ｐＪＣ１５８内のトラスツズマブＨＣのヌクレオチド配列を表す。

トラスツズマブＬＣのアミノ酸配列を表す。 トラスツズマブＬＣのヌクレオチド配列を表す。

ＣＢＨ１のアミノ酸配列を表す。 ＣＢＨ１のヌクレオチド配列を表す。

本明細書に開示される発明は、プロテアーゼ認識部位前駆配列及び／又は後部配列中でプロテアーゼ認識部位が１つ以上の代替の置換されたアミノ酸を含むように操作された場合の融合ポリペプチドにおいて、タンパク質分泌及び／又はタンパク質切断が増強されるという本発明者らの知見に、ある程度基づいている。

したがって、本明細書で提供されるのは、融合ＤＮＡ構築物、ベクター、融合ポリペプチド、融合ＤＮＡ構築物及び／又は融合ポリペプチドを発現する宿主細胞、並びに宿主細胞中で作られる融合ポリペプチドの分泌及び／又は切断を増強するための方法である。より具体的には、またいくつかの非限定的な態様では、融合ポリペプチドからの対象となるポリペプチドの切断を増強又は向上させるために、操作されたＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列が、融合ポリペプチド中に含められている。本明細書に開示される融合ポリペプチドは、本明細書に開示される操作されたプロテアーゼ認識部位前駆及び／又は後部配列を含まない融合ポリペプチドと比較して、より優れた、対象となるポリペプチドの分泌及び／又は精製を呈する。したがって、本開示は、切断されなかった産物の混入のリスクが制限された、比較的早いスケールアップ時間及び高レベルの精製タンパク質をもたらす、タンパク質産生、特に治療用タンパク質産生、例えば抗体産生のための、代替の改良された方法を提供する。

Ｉ．定義
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、その大きさにかかわらず、２０種の天然のアミノ酸のいずれかを含有するあらゆるポリマーを指すものとする。用語「タンパク質」は、比較的に大きいタンパク質に関して使用されることが多く、「ペプチド」は、小さいポリペプチドに関して使用されることが多いが、この分野におけるこれらの用語の使用は、しばしば重複する。したがって、用語「ポリペプチド」は、他に注記のない限り、一般に、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。本明細書では、アミノ酸残基についての従来の１文字又は３文字略号が使用される。

「融合ポリペプチド」又は「融合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、同じポリペプチド中に天然には存在しない２つ以上の異なるポリペプチド又はその活性な断片を含む、ポリペプチドを意味するものとする。いくつかの実施形態では、２つ以上の異なるポリペプチドは、動作可能なように共有結合されている、例えば、ペプチド結合によって化学的にインフレーム連結又は融合されている。

用語「プロテアーゼ認識部位」は、プロテアーゼによって切断される、ポリペプチドアミノ酸配列中の切断モチーフを指す。

用語「プロテアーゼ認識部位前駆配列」は、プロテアーゼ認識部位の直前の（すなわち、Ｎ末端のすぐ隣の）２～６個の連続したアミノ酸［（Ｘ）_ｎ（ここで、ｎは２～６である）］を指す。

用語「プロテアーゼ認識部位後部配列」は、プロテアーゼ認識部位の直後の（すなわち、Ｃ末端のすぐ隣の）２～６個の連続したアミノ酸［（Ｘ）_ｎ（ここで、ｎは２～６である）］を指す。

用語「ＫＥＸ２」は、ＩＵＢＭＢ酵素命名法に従ってＥＣ ３．４．２１．６１と定義された活性を有する、カルシウム依存性エンドペプチダーゼを指す。ＫＥＸ２は、タンパク質分泌中に、１対の塩基性アミノ酸のＣ末端のすぐ隣であるペプチド結合（ＫＥＸ２切断部位）を切断する。

用語「ＫＥＸ２領域」は、ポリペプチド、例えば融合ポリペプチド内に位置する、連続した４～１２個のアミノ酸残基領域（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２個のアミノ酸のいずれか）を指す。ＫＥＸ２領域は、ＫＥＸ２部位、ＫＥＸ２部位前駆配列、及びＫＥＸ２部位後部配列から構成される。

用語「ＫＥＸ２部位」は、ポリペプチド内の２つのアミノ酸のＫＥＸ２プロテアーゼ認識部位切断モチーフを指す。ＫＥＸ２部位は、あらゆる順序の、２つの連続した塩基性アミノ酸（例えば、リジン、ヒスチジン、及び／又はアルギニン）（例えば、ＫＫ、ＲＲ、ＫＲ、又はＲＫ）を含有する。

用語「ＫＥＸ２部位前駆配列」は、ＫＥＸ２部位の直前の（すなわち、Ｎ末端のすぐ隣の）２～８個の連続したアミノ酸［（Ｘ）_ｎ（ここで、ｎは２～８、例えば、２、３、４、５、６、７、又は８のいずれかである）］を指す。例えば、ＫＥＸ２領域が、ＴＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号８０）と定義されるならば、「ＫＲ」モチーフが、この領域のＫＥＸ２部位であり；ｎは６であり、「ＴＳＶＡＶＥ」モチーフ（配列番号８１）が、この領域のＫＥＸ２部位前駆配列に相当する。

用語「ＫＥＸ２部位後部配列」は、ＫＥＸ２部位の直後の（すなわち、Ｃ末端のすぐ隣の）１又は２個の、他の実施形態では１～４個の、連続したアミノ酸［（Ｘ）_ｎ（ここで、ｎは１～４、例えば、１、２、３、又は４のいずれかである）］を指す。例えば、ＫＥＸ２領域が、ＴＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号８０）と定義されるならば、「ＫＲ」モチーフが、この領域のＫＥＸ２部位であり；ｎは２であり、「ＱＶ」モチーフが、この領域のＫＥＸ２部位後部配列に相当する。

用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖及びその化学的改変物を包含する。用語「核酸」と「ポリヌクレオチド」は、本明細書では互換的に使用することができる。遺伝暗号は縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするために２つ以上のコドンが使用されている可能性があり、本発明の対象物は、ある特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包含する。

ポリペプチドに関する用語「野生型の」、「野生型」、「親の」、又は「参照基準の」は、１つ以上のアミノ酸位置での人為的な置換、挿入、又は欠失を含まない、天然に存在するポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する用語「野生型の」、「野生型」、「親の」、又は「参照基準の」は、人為的なヌクレオシド変化を含まない、天然に存在するポリヌクレオチドを指す。しかし、野生型の、親の、又は参照基準のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されず、野生型の、親の、又は参照基準のポリペプチドをコードするあらゆるポリヌクレオチドを包含する。

本明細書で使用する場合、用語「天然に存在しない」は、自然界には見られないあらゆるもの（例えば、研究室で産生された組換え型の核酸及びタンパク質配列）、例えば野生型の核酸及び／又はアミノ酸配列の改変物を指す。いくつかの実施形態では、天然に存在しないポリペプチドは、相当する野生型の又は天然に存在するアミノ酸配列には見られないアミノ酸置換（すなわち変異）を含有する。

本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「誘導体」又は「バリアント」は、１つ以上のアミノ酸の、Ｃ末端及びＮ末端の一方又は両方への付加、アミノ酸配列中の１つ又はいくつかの異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、ポリペプチドの一方若しくは両方の末端での又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入によって、前駆ポリペプチド（例えば、天然のポリペプチド）から得られるポリペプチドを意味する。

本明細書で使用する場合、「バリアントポリヌクレオチド」は、バリアントポリペプチドをコードする、又は親のポリヌクレオチドとの指定された度合いの相同性／同一性を有する、又はストリンジェントな条件下で親のポリヌクレオチド又はその相補体とハイブリッド形成する。適切には、バリアントポリヌクレオチドは、親のポリヌクレオチド又は親のポリヌクレオチドの相補体との少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、さらには少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。同一性（パーセント）を決定するための方法は、当技術分野で公知である。

用語「由来する」は、用語「に起因する」、「から得られる」、「から入手可能である」、「から単離される」、及び「から作製される」を包含し、一般に、ある指定された材料が、別の指定された材料に、その起源を見いだすか、又は別の指定された材料に関して説明することができる特徴を有することを示す。

「制御配列」は、本明細書では、ポリヌクレオチド又は対象となるポリペプチドの発現にとって必要又は好都合であるすべての構成要素を含むと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して天然又は外来であり得る。こうした制御配列には、限定はされないが、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが含まれる。最低限、制御配列は、プロモーターと、転写及び翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを提供することができる。

「作動可能に連結された」は、本明細書では、制御配列がポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの発現を誘導又は調節するように、制御配列がＤＮＡ配列中のコード配列などのポリヌクレオチド又は対象となるポリペプチドと機能的な関係で（すなわち、相対的な位置に）適切に置かれた配置と定義される。

用語「ＤＮＡ構築物」は、好適な宿主におけるタンパク質の発現を引き起こすことが可能な好適な制御配列に作動可能に連結されるＤＮＡ配列を意味する。こうした制御配列には、転写を引き起こすためのプロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー、及び転写及び翻訳の停止を制御する配列が含まれ得る。

用語「融合ＤＮＡ構築物」又は「融合核酸」は、共に作動可能に連結され、且つ融合ポリペプチドをコードする、５’～３’のいくつかのポリヌクレオチド配列（例えば、限定はされないが、シグナル配列をコードするＤＮＡ分子、担体タンパク質をコードするＤＮＡ分子、ＫＥＸ２部位をコードするＤＮＡ分子、及び対象となるポリペプチドをコードするＤＮＡ分子）を含む核酸を指す。

「ベクター」は、核酸を１つ以上の細胞型に導入するように設計されたポリヌクレオチド配列を指す。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセットなどが含まれる。

「発現ベクター」は、ＤＮＡ断片を細胞に組み込み発現させる能力を有するベクターを指す。多くの原核生物及び真核生物発現ベクターが、市販品として入手可能なである。

「プロモーター」又は「プロモーター配列」は、コード領域などの対象となるポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識される核酸配列である。一般に、プロモーター配列は、対象となるポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異、切断型、及びハイブリッドプロモーターを含めて、選択される宿主細胞において転写活性を示すあらゆる核酸配列であり得、宿主細胞に対して相同の又は異種の細胞外又は細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。

用語「シグナル配列」は、タンパク質を細胞からの分泌のための分泌系に誘導する、タンパク質のアミノ末端のアミノ酸の配列を指す。シグナル配列は、タンパク質の分泌の前に、タンパク質から切断される。ある種の場合には、シグナル配列は、「シグナルペプチド」又は「リーダーペプチド」と称することができる。シグナル配列の定義は、機能的なものである。成熟形態の細胞外タンパク質は、シグナル配列を欠いている（これは、分泌プロセス中に切除される）。

本明細書で使用される用語「担体タンパク質」は、宿主細胞からのポリペプチド（融合ポリペプチドなど）の分泌に対して機能する又は分泌を容易にするタンパク質を指す。例示的な担体タンパク質について、以下でより詳細に論じる。

対象細胞、核酸、ポリペプチド／酵素、又はベクターに関して使用される場合、用語「組換え型の」は、対象が、その天然の状態から改変されていることを示す。したがって、例えば、組換え型の細胞は、天然の（非組換え型の）形態の細胞内には見られない遺伝子を発現するか、又は天然の遺伝子を、自然界に見られるのとは異なるレベルで若しくは異なる条件下で発現する。組換え型の核酸は、１つ以上のヌクレオチドが天然の配列と異なり得る、及び／又は発現ベクター中で異種配列、例えば異種プロモーター、分泌を可能にするシグナル配列などに作動可能に連結されている。組換え型のポリペプチド／酵素は、１つ以上のアミノ酸が天然の配列と異なり得る、及び／又は異種配列と融合されている。抗体重鎖をコードする核酸を含むベクターは、例えば、組換え型のベクターである。

本明細書で使用する場合、「微生物」は、細菌、真菌、ウイルス、原生動物、及び他の微生物又は顕微鏡的微生物を指す。

「宿主株」又は「宿主細胞」は、ポリペプチド、特に本開示によって包含される組換え型の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター又はＤＮＡ構築物のための好適な宿主を意味する。具体的実施形態では、宿主株は、糸状菌細胞又は哺乳類細胞であり得る。用語「宿主細胞」には、細胞とプロトプラストとの両方が含まれる。

用語「糸状菌」は、すべての糸状形態の真菌亜門（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）を指す（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＯＲＹ ＭＹＣＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。これらの真菌は、キチン、グルカン、及び他の複合多糖から構成される細胞壁を有する栄養菌糸体を特徴とする。本明細書に開示される糸状菌は、酵母とは形態学的に、生理学的に、且つ遺伝学的異なる。糸状菌による栄養増殖は、菌糸伸長によるものであり、炭素異化は、絶対的好気性である。

用語「培養すること」は、微生物細胞の集団を、液体又は固体の培地中で、好適な条件下で増殖させることを指す。

ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関する用語「異種」は、宿主細胞中に天然には存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、商業的に重要な工業用タンパク質であり、いくつかの実施形態では、異種タンパク質は、治療用タンパク質である。この用語は、天然に存在する遺伝子、変異した遺伝子、及び／又は合成遺伝子によってコードされるタンパク質を包含することが意図される。

ポリヌクレオチド又はタンパク質に関する用語「相同の」は、宿主細胞中に天然に存在するポリヌクレオチド又はタンパク質を指す。

本明細書で使用される用語「回収される」、「単離される」、及び「分離される」は、それが関連する少なくとも１種の構成成分から取り出されたタンパク質（例えば、対象となるポリペプチド）、細胞、核酸、又はアミノ酸を指す。

本明細書で使用する場合、細胞に関して使用される用語「形質転換された」、「安定に形質転換された」、及び「トランスジェニック」は、細胞が、そのゲノムに組み込まれた非天然の（例えば異種）核酸配列又は天然の（例えば相同の）核酸配列の追加のコピーを有するか、又は複数世代を通してして維持されるエピソームプラスミドを有することを意味する。

本明細書で使用する場合、用語「発現」は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生されるプロセスを指す。このプロセスには、転写と翻訳の両方が含まれる。

用語「分泌されたタンパク質」は、タンパク質分泌中に細胞から放出されるポリペプチドの領域を指す。いくつかの実施形態では、分泌されたタンパク質は、組換え型の融合ポリペプチドから放出又は切断されたタンパク質である。

用語「分泌」は、宿主細胞中の膜を横断するタンパク質の、細胞外空間及び周囲の培地への選択的移動を指す。

ある種の範囲は、本明細書では、用語「約」が前に付く数値を伴って提供される。用語「約」は、本明細書では、それが前に付く厳密な数、並びにこの用語が前に付く数に近い又はほぼ同じである数についての文字による補助を提供するために使用される。ある数が、具体的に列挙された数に近い又はほぼ同じである数かどうかの決定においては、列挙されていないその近い又はほぼ同じ数も、それが存在する文脈において、具体的に列挙された数の実質的等価物を提供する数であり得る。例えば、数値に関して、用語「約」は、この用語が文脈の中で他に具体的に定義されない限り、その数値－１０％～＋１０％の範囲を指す。

本明細書で使用する場合、文脈によって他に明確に指示されない限り、単数の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、複数の指示内容が含まれる。

特許請求の範囲を、何らかの任意要素を除外するために起草できることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項要素の記述、又は「消極的な」限定の使用に関連して、「唯一」、「～のみ」などのような排他的な用語法の使用のための先行詞としての役割を果たすものとする。

用語「本質的に～からなる」は、本明細書で使用する場合、この用語の後の構成成分が、組成物全体の重量に対して３０％未満であり、且つ構成成分の作用又は活性に寄与又は干渉しない総量の他の公知の構成成分の存在下である組成物を指すことにも留意されたい。

用語「～を含む」が、本明細書で使用する場合、限定はされないが、用語「～を含む」の後の構成成分を含むことを意味することにさらに留意されたい。用語「～を含む」の後の構成成分は、必要とされる又は必須であるが、構成成分を含む組成物は、他の必須ではない又は任意の構成成分をさらに含むことができる。

用語「～からなる」が、本明細書で使用する場合、用語「～からなる」の後の構成成分を含み、且つこれに限定されることを意味することにも留意されたい。したがって、用語「～からなる」の後の構成成分は、必要とされる又は必須であり、且つ他の構成成分は組成物中には存在しない。

本明細書全体を通して与えられるあらゆる最大数値制限には、あらゆるより低い数値制限が、あたかもこうしたより低い数値制限が本明細書に明示的に書かれているかのように含まれるものとする。本明細書全体を通して与えられるあらゆる最小数値制限には、あらゆるより高い数値制限が、あたかもこうしたより高い数値制限が本明細書に明示的に書かれているかのように含まれることとなる。本明細書全体を通して与えられるあらゆる数値範囲には、こうしたより広い数値範囲の範囲内にあるあらゆるより狭い数値範囲が、あたかもこうしたより狭い数値範囲が本明細書にすべて明示的に書かれているかのように含まれることとなる。

本明細書で他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。

用語の他の定義は、本明細書全体を通して明らかとなり得る。

ＩＩ．組成物
Ａ．融合ポリペプチド
本明細書で提供されるのは、改良された発現及び／又は切断特性を有する、天然に存在しない融合ポリペプチド、その断片、又はそのバリアントである。対象融合ポリペプチドは、限定はされないが、以下のうちの１つ以上：ａ）シグナル配列；ｂ）担体タンパク質；ｃ）以下を含むプロテアーゼ認識領域：ｉ）プロテアーゼ切断部位；ｉｉ）プロテアーゼ切断部位のＮ末端のすぐ隣のプロテアーゼ切断部位前駆配列；及び／又はｉｉｉ）プロテアーゼ切断部位のＣ末端のすぐ隣のプロテアーゼ切断部位後部配列；並びにｄ）１つ以上の対象となるポリペプチド（限定はされないが、抗体重鎖又は軽鎖など）を含むことができる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＫＥＸ２プロテアーゼ切断前駆及び／又は後部切断部位を含むＫＥＸ２プロテアーゼ切断部位である。

図１は、代表的な融合ポリペプチドを示す。対象ポリペプチドの様々な部分（すなわち、「シグナル配列」、担体タンパク質、「リンカー」（プロテアーゼ認識配列を含有する）、及び「所望されるタンパク質」（すなわち「対象となるポリペプチド」）を、単に明瞭性及び利便性のために、このように表示する。融合ポリペプチドは、分泌中に切除されるＮ末端領域と、分泌されるＣ末端領域を一般に含有するので、「プロタンパク質」又は「前駆体タンパク質」とも称することができることが認識されよう。

１．シグナル配列
対象融合ポリペプチドのシグナル配列は、宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）からのタンパク質分泌を容易にする、あらゆるシグナル配列であり得る。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、融合タンパク質が産生されることとなる宿主細胞から高度に分泌されることが公知であるタンパク質のためのシグナル配列を含むことができる。用いられるシグナル配列は、融合ポリペプチドが産生されることとなる宿主細胞に対して内在性又は非内在性であり得る。

好適なシグナル配列は、当技術分野で公知である（例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９０ ８：４３５－４４０；及びＰａｌｏｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００３ ６９：７０７３－７０８２を参照のこと）。好適なシグナル配列の非限定的な例としては、セロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ、α－アミラーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、グルコアミラーゼ、フィターゼ、マンナナーゼ、α及びβグルコシダーゼ、ウシキモシン、ヒトインターフェロン及びヒト組織プラスミノーゲン活性化因子、及び合成のコンセンサス真核生物シグナル配列のもの、例えばＧｗｙｎｎｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：７１３－７１９によって記載されたものが挙げられる。

いくつかの実施形態では、宿主細胞としてトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えばＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））が用いられるならば、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）マンナナーゼＩ（Ｍａｎ５Ａ、若しくはＭＡＮＩ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ若しくはＣＢＨＩＩ）、エンドグルカナーゼＩ（Ｃｅｌ７ｂ若しくはＥＧＩ）、エンドグルカナーゼＩＩ（Ｃｅｌ５ａ若しくはＥＧＩＩ）、エンドグルカナーゼＩＩＩ（Ｃｅｌ１２Ａ若しくはＥＧＩＩＩ）、キシラナーゼＩ若しくはＩＩ（ＸｙｎＩＩａ若しくはＸｙｎＩＩｂ）、又はＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ（Ｃｅｌ７ａ又はＣＢＨＩ）のシグナル配列又は担体を、融合ポリペプチド中で用いることができる。

他の実施形態では、宿主細胞としてコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えばクロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ））が用いられるならば、クロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ＧｌａＡ）又はアルファアミラーゼのシグナル配列又は担体を、融合ポリペプチド中で用いることができる。クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）とアワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミラーゼは、同一のアミノ酸配列を有する。２つの形態の酵素が、一般に、培養上清中で認識される。ＧＡＩは、全長形態（アミノ酸残基１～６１６）であり、ＧＡＩＩは、アミノ酸残基１～５１２を含む天然のタンパク分解性断片である。ＧＡＩは、伸長されたリンカー領域によって連結された２つの別のドメインとして折り畳まれることが公知である。これらの２つのドメインは、４７１残基の触媒ドメイン（アミノ酸１～４７１）及び１０８残基のデンプン結合ドメイン（アミノ酸５０９～６１６）であり、２つのドメインの間のリンカー領域は、３６残基（アミノ酸４７２～５０８）である。ＧＡＩＩは、デンプン結合ドメインを欠いている。Ｌｉｂｂｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：１１０９－１１１４を参照されたい。いくつかの実施形態では、担体タンパク質として使用され、シグナル配列を含むグルコアミラーゼは、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼの触媒ドメインとの９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％よりも大きい配列同一性を有することとなる。用語「触媒ドメイン」は、タンパク質の触媒活性を有する、タンパク質のアミノ酸配列の構造的部分又は領域を指す。

２．担体
特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、宿主細胞からのポリペプチドの分泌に対して機能する又は分泌を容易にする「担体タンパク質」を含むことができる。

担体タンパク質は、分泌されるポリペプチドの成熟配列のすべて又は一部を含むことができる。いくつかの実施形態では、全長の分泌された担体タンパク質ポリペプチドが使用される。しかし、分泌される担体タンパク質ポリペプチドの機能性部分を用いることもできる。本明細書で使用する場合、分泌される担体タンパク質ポリペプチドの「部分」又は文法的等価物は、切断されていても正常な立体配置に折り畳まれるその能力を保持する、切断された分泌された担体タンパク質ポリペプチドを意味する。

一般に、担体タンパク質が、切断されたタンパク質であるならば、これは、Ｃ末端が切断されている（すなわち、損なわれていないＮ末端を含有する）。或いは、担体タンパク質は、Ｎ末端が切断されている、又は、場合によっては、機能性部分を残すようにして両端が切断されている可能性がある。一般に、担体タンパク質を含む分泌されたタンパク質のこうした部分は、分泌されたタンパク質、いくつかの実施形態では、分泌されたタンパク質のＮ末端部分の、５０％超、７０％超、８０％超、及び９０％超を含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、触媒ドメインに加えて、リンカー領域を含むこととなる。いくつかの実施形態では、ＣＢＨＩタンパク質のリンカー領域の部分を、担体タンパク質に使用することができる。

いくつかの実施形態では、分泌配列として機能性のシグナル配列を含む第１のアミノ酸配列が、第１のＤＮＡ分子によってコードされる。担体タンパク質を含む第２のアミノ酸配列は、第２のＤＮＡ配列によってコードされる。しかし、上に記載した通り、シグナル配列と担体タンパク質は、同じ遺伝子から得ることができる。

３．ＫＥＸ２領域
真菌細胞におけるタンパク質分泌中に、ある種のタンパク質は、ＫＥＸ２、すなわちセリンペプチダーゼのＫＥＸ２又は「ケキシン」ファミリーのメンバー（ＥＣ ３．４．２１．６１）によって切断される。ＫＥＸ２は、そのタンパク質の分泌中に、タンパク質基質中の１対の塩基性アミノ酸のＣ末端のすぐ隣であるペプチド結合（すなわち、「ＫＥＸ２部位」）を切断する、高度に特異的なカルシウム依存性エンドペプチダーゼである。ＫＥＸ２タンパク質は、一般に、その活性部位のヒスチジン残基の近くにシステイン残基を含有し、ｐ－メルクリオ安息香酸塩によって阻害される。このグループの創設メンバー（ｆｏｕｎｄｉｎｇ ｍｅｍｂｅｒ）出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＫＥＸ２ペプチダーゼ（Ｆｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１４３４－１４３８）は、その分泌中に、α－ファクターフェロモン及びキラー毒素前駆体を切断する。

いくつかの実施形態では、プロテアーゼ認識部位は、ＫＥＸ２領域である。ＫＥＸ２領域は、ＫＥＸ２部位（Ｘ_１－Ｘ_２）、前記ＫＥＸ２部位のＮ末端のすぐ隣のＫＥＸ２部位前駆配列（Ｘ_ｎ＝２～６、例えば２、３、４、５、又は６のいずれか）、及び前記ＫＥＸ２部位のＣ末端のすぐ隣のＫＥＸ２部位前駆配列（Ｘ_ｎ＝２～４、例えば２、３、又は４のいずれか）を含む。いくつかの実施形態では、ＫＥＸ２領域は、対象となるポリペプチドの、融合ポリペプチドからの、インビボでのアミノ末端での切断（すなわち、分離）のための手段を提供する。本明細書に開示される融合ポリペプチドのＫＥＸ２領域は、担体タンパク質と対象となるポリペプチドとの間の、天然に存在する領域ではない。

ＫＥＸ２切断部位は、天然の糸状菌プロテアーゼ（例えば天然のコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ＫＥＸＢ様プロテアーゼ又は天然のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ＫＥＸ２プロテアーゼ）によって切断することもできるし、真核生物（酵母又は哺乳類など）細胞に存在する１つ以上の他のプロテアーゼによって切断することもできる。対象となるポリペプチドは、ＫＥＸ２切断部位のすぐ下流（すなわちＣ末端）で、融合ポリペプチドから切断される。

ＫＥＸ２部位は、アミノ酸配列「Ｘ_１－Ｘ_２」を含有し、ここでは、Ｘ_１及びＸ_２は、独立に、塩基性アミノ酸である。ＫＥＸ２部位は、ＫＫ、ＫＲ、ＲＫ又はＲＲのいずれかを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＫＥＸ２部位は、ＫＲである。

ＫＥＸ２部位前駆配列は、アミノ酸配列Ｘ_ｎ＝２～８を含むことができ、ここでは、Ｘは、いずれかのアミノ酸であり、ｎは、２～８、例えば２、３、４、５、６、７、又は８のいずれかである。本発明で定義したＫＥＸ２領域は、本明細書に開示される融合ポリペプチド中の担体タンパク質のＣ末端で、担体タンパク質中には天然には見られない。いくつかの実施形態では、ＫＥＸ２部位前駆配列は、担体タンパク質のＣ末端上の天然に存在する連続したＸ_ｎ＝２～８アミノ酸残基とは異なるアミノ酸配列である。しかし、連続したＸ_ｎ＝２～６アミノ酸残基は、担体タンパク質の他の部分において見ることができ、ＫＥＸ２部位（Ｘ_１－Ｘ_２）と連結することができるが、ＫＥＸ２領域は、対象となるポリペプチドのＮ末端には付着されないこととなる。

ＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列におけるアミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似の構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸と置き換えること、例えばロイシンのセリンとの置き換え、すなわち保存的置換の結果、又は、あるアミノ酸を、異なる構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸と置き換えること、例えばアスパラギンのアスパラギン酸との置き換え、すなわち非保存的置換の結果であり得る。天然に存在する残基は、一般的な側鎖の特性に基づいて、グループに分けることができる：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性・親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのあるメンバーを、別のクラスと交換することを伴う。こうした置換された残基はまた、保存的置換部位又は非保存部位に導入することができる。

いくつかの実施形態では、ＫＥＸ２部位前駆配列が、Ｔ_１－Ｓ_２－Ｖ－Ａ_３－Ｖ_４－Ｅ_５－Ｘ_１－Ｘ_２と定義される場合、Ｔ_１は、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、酸性アミノ酸、又は塩基性アミノ酸で置換されている；Ｓ_２は、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は鎖配向に影響を与えるアミノ酸で置換されている；Ａ_３は、塩基性アミノ酸又はＭで置換されている；Ｖ_４は、Ｌで置換されている；及び／又はＥ_５は、芳香族アミノ酸で置換されている。

他の実施形態では、ＫＥＸ２部位後部配列が、Ｘ_１－Ｘ_２－Ｑ_６－Ｖ_７と定義される場合、Ｑ_６は、酸性アミノ酸、又は鎖配向に影響を与えるアミノ酸で置換されている；及び／又はＶ_７は、Ｌ、Ｉ、又は芳香族アミノ酸で置換されている。

さらなる実施形態では、ＫＥＸ２領域は、ＡＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号３）、ＦＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号２）、ＭＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号４）、ＱＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号５）、ＲＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号６）、ＹＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号７）、ＴＦＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号８）、ＴＨＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号９）、ＴＫＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１０）、ＴＬＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１１）、ＴＭＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１２）、ＴＰＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１３）、ＴＱＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１４）、ＴＲＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１５）、ＴＶＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１６）、ＴＳＶＨＶＥＫＲＱＶ（配列番号１７）、ＴＳＶＫＶＥＫＲＱＶ（配列番号１８）、ＴＳＶＲＶＥＫＲＱＶ（配列番号１９）、ＴＳＶＡＬＥＫＲＱＶ（配列番号２０）、ＴＳＶＡＶＦＫＲＱＶ（配列番号２１）、ＴＳＶＡＶＷＫＲＱＶ（配列番号２２）、ＴＳＶＡＶＥＫＲＤＶ（配列番号２３）、ＴＳＶＡＶＥＫＲＧＶ（配列番号２４）、ＴＳＶＡＶＥＫＲＱＦ（配列番号２５）、又はＴＳＶＡＶＥＫＲＱＬ（配列番号２６）から選択される。

ＫＥＸ２領域中に複数の置換（例えば、２、３、４、又は５つの置換のいずれか）を有するバリアントを作製する場合、ＫＥＸ２部位後部配列は、さらなる実施形態では、Ｘ_１－Ｘ_２－Ｑ_６－Ｖ_７－Ｔ_８－Ｌ_９（配列番号６４）と定義することができ、ここで、Ｑ_６は、酸性アミノ酸、又は鎖配向に影響を与えるアミノ酸で置換されている；Ｖ_７は、Ｌ、Ｉ、又は芳香族アミノ酸で置換されている；Ｔ_８は、酸性アミノ酸又は疎水性アミノ酸で置換されている；及び／又はＬ_９は、Ｉ及びＶで置換されている。いくつかの実施形態では、ＫＥＸ２領域は、ＴＳＶＡＶＥＫＲＱＶＥＬ（配列番号２７）、ＴＳＶＡＶＥＫＲＱＶＴＩ（配列番号２８）、又はＴＳＶＡＶＥＫＲＱＶＴＶ（配列番号２９）から選択される。

ＫＥＸ２領域中に複数の置換（例えば、２、３、４、又は５つの置換のいずれか）を有するバリアントを作製する場合のさらなる実施形態では、ＫＥＸ２部位前駆配列は、さらなる実施形態では、Ｇ_－２－Ｐ_－１－Ｔ_１－Ｓ_２－Ｖ－Ａ_３－Ｖ_４－Ｅ_５－Ｘ_１－Ｘ_２（配列番号６５）と定義することができ、ここで、Ｇ_－２は、チロシンで置換されている、及び／又はＰ_－１は、トレオニン又はロイシンで置換されている。

さらなる実施形態では、ＫＥＸ２領域は、ＴＨＶＡＶＥＫＲＱＶＴＩ（配列番号３０）、ＴＨＶＡＶＥＫＲＤＶＴＬ（配列番号３１）、ＴＨＶＡＶＥＫＲＱＶＡＬ（配列番号３２）、ＥＨＶＡＶＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号３３）、ＴＮＶＡＶＥＫＲＤＶＴＬ（配列番号３４）、ＴＮＶＡＶＥＫＲＱＶＡＬ（配列番号３５）、ＴＳＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号３６）、ＴＳＶＭＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号３７）、ＴＳＶＡＬＥＫＲＱＩＴＬ（配列番号３８）、ＴＳＶＡＬＥＫＲＱＶＡＬ（配列番号３９）、ＴＨＶＡＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号４０）、ＴＳＶＡＶＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号４１） ＴＨＶＭＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号４２）、ＴＫＶＭＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号４３）、ＴＨＶＡＶＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号４４）、ＴＨＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号４５）、ＴＫＶＡＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号４６）、ＴＮＶＡＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号４７）、ＥＨＶＡＶＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号４８）、ＥＨＶＡＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号４９）、ＥＳＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号５０）、ＲＳＶＲＶＥＫＲＤＶＴＬ（配列番号５１）、ＴＳＶＡＬＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号５２）、ＴＨＶＡＬＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号５３）、ＴＫＶＲＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号５４）、ＴＮＶＡＬＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号５５）、ＥＨＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号５６）、ＥＰＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号５７）、ＮＨＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号５８）、ＲＳＶＲＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号５９）、ＲＫＶＲＶＥＫＲＤＶＴＬ（配列番号６０）、ＲＫＶＲＶＥＫＲＱＬＴＬ（配列番号６１）、ＲＫＶＡＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号６２）、ＲＫＶＲＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号６３）、ＹＬＴＳＶＭＬＥＫＲＱＶ（配列番号８３）、ＹＬＴＨＶＭＬＥＫＲＱＶ（配列番号８４）、ＹＰＴＨＶＭＬＥＫＲＱＶ（配列番号８５）、ＹＰＴＨＶＡＬＥＫＲＱＶ（配列番号８６）、ＧＬＴＳＶＭＶＥＫＲＱＶ（配列番号８７）、又はＧＬＴＨＶＭＬＥＫＲＱＶ（配列番号８８）から選択される、変更されていないＫＥＸ２領域アミノ酸配列と比較して、２つ以上の置換（例えば、２、３、４、又は５つの置換のいずれか）を有する。

さらに他の実施形態では、ＫＥＸ２部位前駆配列は、ＫＳＲＳ（配列番号６６）；ＳＲＩＳ（配列番号６７）；ＧＧＧＳ（配列番号６８）；ＴＳＴＹ（配列番号６９）；ＡＳＩＳ（配列番号７０）；ＡＴＡＳ（配列番号７１）；ＴＡＳＱ（配列番号７２）；ＴＡＳＬ（配列番号７３）、ＳＶＩＳ（配列番号７４）；ＮＶＩＳ（配列番号７５）；ＧＧＧ；ＴＳＲＤ（配列番号７６）；ＳＰＭＤ（配列番号７７）；ＤＬＧＥ（配列番号７８）；又はＴＰＴＡ（配列番号７９）ではない。別の実施形態では、ＫＥＸ２部位前駆配列は、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，１９８，０４６号明細書に開示されているＫＥＸ２部位前駆配列のいずれかではない。

本明細書で提供される操作されたＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列は、本明細書で提供されるＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列を欠く等価な融合ポリペプチドからの対象となるポリペプチドの切断及び／又は分泌と比較した場合の、宿主細胞からの対象となるポリペプチドの切断及び／又は分泌の増強をもたらす。

本明細書で提供されるＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列は、最適化されたＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列であり得る。最適化されたＫＥＸ２前駆及び／又は後部配列は、他のバリアントＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列と比較した場合に、より大きい又はより効率的な、宿主細胞からの切断又は分泌（すなわち、非改変配列に対する、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％よりも大きい切断又は分泌）を提供する、本開示によって記載されるＫＥＸ２前駆及び／又は後部配列である。本明細書に開示される融合ポリペプチドのいずれかは、ＫＥＸ２前駆及び／又は後部配列として、最適化されたＫＥＸ２前駆及び／又は後部配列を含むことができる。最適化されたＫＥＸ２前駆及び／又は後部配列は、任意のシグナル配列、分泌タンパク質由来の任意の担体領域、任意のＫＥＸ２部位、又は任意の対象となるポリペプチドと共に用いることができる。最適化されたＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列を含有するＫＥＸ２領域は、天然に存在しないものであり得る。ある種の実施形態では、最適化されたＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列を含有するＫＥＸ２領域は、限定はされないが糸状菌宿主細胞などの宿主細胞から分泌される、いずれのタンパク質中にも見られない。

４．対象となるポリペプチド
融合ポリペプチド中の対象となるポリペプチドは、宿主細胞（真核生物宿主細胞、例えば、哺乳類又は糸状菌宿主細胞など）から分泌され得るタンパク質のあらゆる部分であり得、タンパク質としては、いわゆる工業用酵素、治療用タンパク質、ホルモン、構造タンパク質、血漿タンパク質、食品添加物、及び食品材料などが挙げられる。対象となるポリペプチドは、異種又は相同タンパク質であり得、ハイブリッドポリペプチド（これは、それぞれが発現宿主に対して相同又は異種であり得る部分又は完全ポリペプチドの組み合わせを含む）が含まれ得る。分泌された対象となるポリペプチドは、細菌（例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の種）、真菌（例えばコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、又はケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）の種）、ウイルス（例えばＡ型肝炎又はＢ又はアデノウイルス）、哺乳類の（例えばヒト、ラット、若しくはマウス）、又は植物起源に由来し得る。対象となるポリペプチドは、さらに、タンパク質の天然に存在する対立遺伝子変異、並びに操作された変異が含まれ得る。さらなる実施形態では、対象となるポリペプチドは、ヘテロ四量体、例えば抗体であり得る。さらなる実施形態では、ヘテロ四量体のポリペプチドは、１つ以上の融合ポリペプチド切断事象に起因し得る。

一実施形態では、対象となるポリペプチドは、例えば、酵素、例えばカルボヒドラーゼ、例えばデンプン加水分解α－アミラーゼ、アルカリ性α－アミラーゼ、β－アミラーゼ、セルラーゼ；デキストラナーゼ、α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ（ｐｅｎｔｏｓａｎａｓｅ）、キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ナリンガナーゼ（ｎａｒｉｎｇａｎａｓｅ）、ペクチナーゼ、又はプルラナーゼ；プロテアーゼ、例えば酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ブロメライン、フィシン、中性プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ、レンネット、レンニン、キモシン、サブチリシン、サーモリシン、アスパラギン酸プロテイナーゼ、又はトリプシン；粒状デンプン加水分解酵素、例えばグルコアミラーゼ又はアルファアミラーゼ；リパーゼ又はエステラーゼ、例えばトリグリセリダーゼ（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄａｓｅ）、ホスホリパーゼ、前胃（ｐｒｅｇａｓｔｒｉｃ）エステラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、イミノアシラーゼ（ｉｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ）、グルタミナーゼ、リゾチーム、又はペニシリンアシラーゼ；イソメラーゼ、例えばグルコースイソメラーゼ；フェノール酸化酵素、例えば、ラッカーゼ；酸化還元酵素、例えば、アミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒドロキシステロイド脱水素酵素、又はペルオキシダーゼ；リアーゼ、例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、フマレーゼ（ｆｕｍａｒｅｓｅ）又はヒスタダーゼ（ｈｉｓｔａｄａｓｅ）；トランスフェラーゼ、例えばシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ又はアシルトランスフェラーゼ；又はリガーゼであり得る。特定の実施形態では、タンパク質は、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、キチナーゼ、グルコアミラーゼ、アルファアミラーゼ、クチナーゼ、フィターゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、ラッカーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、ペクチン分解酵素、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、又はトランスグルタミナーゼであり得る。

他の実施形態では、対象となるポリペプチドは、治療用タンパク質（すなわち、治療的生物活性を有するタンパク質）であり得る。好適な治療用タンパク質の例としては、エリスロポエチン、サイトカイン、例えば、インターフェロン－α、インターフェロン－β、インターフェロン－γ、インターフェロン－ｏ、及び顆粒球－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及びヒトプロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩ、トロンビン、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、免疫グロブリン、例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＩｇＧ断片、ＩｇＧ融合体、ＩｇＭ又はＩｇＡ；インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、及び尿素トリプシン阻害剤、ＩＧＦ結合タンパク質、上皮増殖因子、成長ホルモン放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンジオスタチン、血管内皮増殖因子２、骨髄系前駆細胞阻害因子１、オステオプロテゲリン、α－１－アンチトリプシン、α－フェトプロテイン、ＤＮａｓｅ ＩＩ、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３、グルコセレブロシダーゼ、ＴＮＦ結合タンパク質１、卵胞刺激ホルモン、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４－Ｉｇ、膜貫通アクチベーター及びカルシウムモジュレーター及びシクロフィリンリガンド、可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合体、グルカゴン様タンパク質１、並びにＩＬ－２受容体アゴニストが挙げられる。

いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドは、任意のクラス、Ｇ、Ａ、Ｍ、Ｅ、又はＤの免疫グロブリン（すなわち、抗体）である。（免疫グロブリン構造の解説については、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，８１６，５６７号明細書、及びその中に引用されている参考文献を参照のこと）。他の実施形態では、抗体タンパク質は、その重鎖又は軽鎖及び機能性断片を含めたモノクローナル抗体である。さらなる実施形態では、ヒト化抗体は、対象となるポリペプチド（例えばトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）））である。いくつかの実施形態では、抗体又はその機能性断片は、抗ＲＳウイルス（ＲＳＶ）抗体、抗エボラウイルス抗体、抗凝集βアミロイド（Ａβ）抗体、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗体、抗精子抗体（抗ヒト避妊抗原（ＨＣＡ）抗体など）、及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である。モノクローナル抗体断片のいくつかの具体例は、定常領域の一部を除去するための切断型の重鎖、例えば、重鎖（Ｆｄ）がヒンジ領域とＣＨ２及びＣＨ３ドメインを欠くＦａｂ断片；重鎖がヒンジ領域を含むがＣＨ２及びＣＨ３ドメインを欠くＦａｂ’断片；並びにヒンジ領域によって連結されたＦａｂ部分を含むＦ（ａｂ’）_２断片である。（参照によって本明細書に組み込まれるＶｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１６：１６５－１８１及びＰｅｎｎｅｌｌ ａｎｄ Ｅｌｄｉｎ（１９９８）Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：５９９－６０３）。対象となるものはまた、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）及びシングルドメイン抗体（例えば、ラクダ抗体）、及びタンパク質が抗体の一部と安定に融合された融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）である。いくつかの実施形態では、抗体は、１つ以上の特性（例えば、安定性、製造可能性、及び／又は抗原への結合）を向上させるように操作される。

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、シグナル配列；担体タンパク質；ＫＥＸ２領域、及び対象となるポリペプチドを、作動可能な連結状態で含むこととなる。

Ｂ．ポリヌクレオチド
本明細書に開示される組成物及び方法の別の態様は、操作されたＫＥＸ２領域を含有する本明細書に開示される融合ポリペプチドのいずれかなどの融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は核酸配列である。

プロモーター；シグナル配列をコードする第１のＤＮＡ分子；担体タンパク質をコードする第２のＤＮＡ分子；ＫＥＸ２領域をコードする第３のＤＮＡ分子（前記ＫＥＸ２領域は、ＫＥＸ２部位、及びＫＥＸ２部位の５’のすぐ隣のＫＥＸ２部位前駆配列、及びＫＥＸ２部位の３’のすぐ隣のＫＥＸ２部位後部配列を含む）；並びに対象となるポリペプチドをコードする第４のＤＮＡ分子を、作動可能な連結状態で含む、上で開示した融合ポリペプチドをコードする融合ＤＮＡ構築物が、本明細書で提供される。融合ＤＮＡ構築物の構成要素は、あらゆる順序で存在することができる。遺伝暗号は、公知であるので、これらの核酸の設計及び産生は、本明細書に開示される融合ポリペプチドの説明を前提とすると、十分に当技術分野の範囲内である。ある種の実施形態では、核酸は、特定の宿主細胞中での融合ポリペプチドの発現のためにコドン最適化することができる。例えば哺乳類細胞及び糸状菌の多くの種について、コドン使用表が利用可能であるので、対象融合ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸の設計及び産生は、十分に当技術分野の範囲内であろう。

Ｃ．プロモーター
宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）における核酸の転写を誘導するのに適したプロモーターの例は、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アルファ－アミラーゼ、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）酸安定性アルファ－アミラーゼ（Ｋｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ １７：２０３－２１２；Ｇｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９：１０７－１１７）、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はアワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：２３０６－２３１５；Ｂｏｅｌ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１５８１－１５８５）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）アルカリ性プロテアーゼ、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ（Ｈｙｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１４３０－１４３９）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＰＡ ＥＰＯ ０１３７２８０）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ベータ－キシロシダーゼに対する遺伝子から得られるプロモーター、並びにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アルファ－アミラーゼとコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼに対する遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）；並びにその変異、切断型、及びハイブリッドプロモーターである。Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０－１４７４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：３７－４５；Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｇｅｎｅ ３３：１３７－１４９；Ｍａｃｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｃｅｌｌ ４６：１４３－１４７；Ｈｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：１４３０－１４３９も参照されたい。より高等な真核生物プロモーター、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Ｂａｒｃｌａｙ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：２１１７－２１３０）も有用であり得る。プロモーターは、恒常的又は誘導性プロモーターであり得る。例示的なプロモーターとしては、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ又はＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、ＩＩ又はＩＩＩ、及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩが挙げられる。

Ｄ．ベクター
本明細書に開示される融合ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、又はレトロウイルスベクター中に存在することができる。ある種の実施形態では、ベクターは、糸状菌細胞において対象融合ポリペプチドを発現させるための発現ベクターであり得る。

組換え型のタンパク質の発現のためのベクターは、当技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。

融合ＤＮＡ構築物は、例えばその開示が参照によって本明細書に組み込まれる欧州特許出願公開第０２１５５９４号明細書に概ね記載されているのと同様に、周知の技術を使用して構築することができる。

対象となるポリペプチド（例えば免疫グロブリン）をコードする天然又は合成のポリヌクレオチド断片を、宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）への導入及び宿主細胞中での複製を可能にする異種の核酸構築物又はベクターに組み込むことができる。

ＤＮＡ構築物、より具体的には融合ＤＮＡ構築物が作製されたら、これを、当技術分野で公知であるような、あらゆる数のベクターに組み込むことができる。ＤＮＡ構築物は、いくつかの実施形態では、プロモーター配列を含むこととなるが、他の実施形態では、ベクターが、形質転換されることとなる宿主において機能性の他の調節配列、例えば、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー、及び／又はアクチベーターを含むこととなる。いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチド及びＫＥＸ２領域をコードするポリヌクレオチドは、プロモーター、シグナル配列、及び担体タンパク質を含むベクターの適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に、標準の手順によって挿入されることとなる。こうした手順及び関連のサブクローニング手順は、当業者の知識の範囲内であるとみなされる。

転写を終結させるための、発現宿主によって認識されるターミネーター配列は、発現されることとなる融合タンパク質をコードする融合ＤＮＡ構築物の３’末端に作動可能に連結させることができる。当業者は、糸状菌などの宿主細胞と共に使用することができる様々なターミネーター配列をよく知っている。非限定的な例としては、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０－１４７４）由来のターミネーター、又はクロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２３０６－２３５３）由来のターミネーター、又はトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ遺伝子由来のターミネーターが挙げられる。

ポリアデニル化配列は、転写されたものが発現宿主によって認識された場合に、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するＤＮＡ配列である。例としては、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１；１４７０－１４７４）；クロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２３０６－２３１５）；コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）又はクロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）アルファアミラーゼ遺伝子、及びリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）カルボキシルプロテアーゼ遺伝子由来のポリアデニル化配列が挙げられる。

さらなる実施形態では、融合ＤＮＡ構築物、又は融合ＤＮＡ構築物を含むベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能マーカー遺伝子を含有することとなる。選択マーカー遺伝子は、当技術分野で周知であり、使用される宿主細胞と共に変化することとなる。選択可能マーカーの例としては、限定はされないが、抗菌薬耐性を与えるもの（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、及びフレオマイシン）が挙げられる。栄養選択マーカーなどの代謝的優位性を与える遺伝子も使用することができる。これらのマーカーのある種のものとして、ａｍｄＳが挙げられる。また、栄養要求性の欠陥を補完する遺伝子をコードする配列も、選択マーカーとして使用することができる（例えばｐｙｒ４欠損Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、又はトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のｐｙｒ４補完、及びａｒｇＢ欠損株のａｒｇＢ補完）。Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：４７５－４７９；Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ ６１：１５５－１６４、及びＫｉｎｇｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｆｕｎｇｉ，Ｂｌａｃｋｉｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（そのそれぞれの開示が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

Ｅ．宿主細胞
発現カセット又はベクターは、融合ポリペプチドをコードする対応するポリヌクレオチドをその後発現する好適な発現宿主細胞に導入することができる。

好適な宿主細胞としては、あらゆる微生物の細胞（例えば、細菌、原生生物、藻類、真菌（例えば、酵母若しくは糸状菌）、又は他の微生物の細胞）が挙げられ、また、好適な宿主細胞は、細菌、酵母、又は糸状菌の細胞であり得る。真菌の発現宿主は、例えば、エタノール源（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎ）としての役割を果たすこともできる酵母であり得る。適したものはまた、マウス（例えば、ＮＳ０）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、又はベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株などの、哺乳類の発現宿主である。昆虫細胞又はウイルス発現系（例えば、Ｍ１３、Ｔ７ファージ、又はラムダなどのバクテリオファージ、又はバキュロウイルスなどのウイルス）などの他の真核生物宿主も、ポリペプチドを産生するために適している。

好適な細菌の属の宿主細胞には、限定はされないが、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の細胞が含まれる。好適な細菌の種の細胞には、限定はされないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｅｉ）、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、及びストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の細胞が含まれる。

好適な酵母の属の宿主細胞には、限定はされないが、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、及びファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）の細胞が含まれる。好適な酵母の種の細胞には、限定はされないが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｐ．カナデンシス（Ｐ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、クリベロミセス・マルキシアナス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、及びファフィア・ロドジマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）の細胞が含まれる。

好適な糸状菌の宿主細胞には、すべての糸状形態の真菌亜門（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）が含まれる。好適な糸状菌属の細胞には、限定はされないが、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オーレオバシディウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｐｏｒｉｕｍ）、ヒトヨタケ属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、カワラタケ属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、コリナスクス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、ケトミウム属（Ｃｈａｅｒｔｏｍｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシディウム属（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ヒラタケ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スキタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｄｉｕｍ）、スエヒロタケ属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、スポロトリクム属（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、タラロミセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、ティエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、ホウロクタケ属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞が含まれる。

好適な糸状菌種の細胞には、限定はされないが、アワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンセ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコセキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ブエルカンデラ・アズスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ－ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、ネナガヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ニューロスポラ・インターメディア（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ・ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カネセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・ソリタム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｏｌｉｔｕｍ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、白色腐朽菌（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジエート（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔｅ）、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、タラロミセス・フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ－ｆｌａｖｕｓ）、ティエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、フルイカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、及びトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の細胞が含まれる。

対象となるある特定の宿主における分泌されるタンパク質に関連するプロモーター及び／又はシグナル配列は、その宿主又は他の宿主における融合ポリペプチドの異種産生及び分泌に使用するための候補である。非限定的な例として、糸状菌系では、セロビオヒドロラーゼＩ（ｃｂｈ１）、グルコアミラーゼＡ（ｇｌａＡ）、ＴＡＫＡ－アミラーゼ（ａｍｙＡ）、キシラナーゼ（ｅｘｌＡ）、ｇｐｄ－プロモーターｃｂｈ１、ｃｂｈｌｌ、エンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇ１－ｅｇ５、Ｃｅｌ６１Ｂ、Ｃｅｌ７４Ａ、ｇｐｄプロモーター、Ｐｇｋ１、ｐｋｉ１、ＥＦ－１アルファ、ｔｅｆ１、ｃＤＮＡ１、及びｈｅｘ１に対する遺伝子を駆動するプロモーターが適しており、たくさんの様々な微生物（例えば、クロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、コウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アワモリコウジカビ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ））から得ることができる。

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞外（又はペリプラズム）空間への組換え型ポリペプチドの分泌をもたらす好適な相同又は異種シグナル配列をコードするポリヌクレオチドと組換えによって結合され、それによって、細胞上清（又はペリプラズム空間若しくはライセート）における酵素活性の直接的な検出が可能になる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、他のグラム陰性細菌、及び当技術分野で公知の他の微生物に適したシグナル配列には、ＨｌｙＡ、ＤｓｂＡ、Ｐｂｐ、ＰｈｏＡ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＴ、又はＭ１３ファージＧｉｌｌ遺伝子の発現を駆動するものが含まれる。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、グラム陽性微生物、及び当技術分野で公知の他の微生物については、好適なシグナル配列には、さらに、ＡｐｒＥ、ＮｐｒＢ、Ｍｐｒ、ＡｍｙＡ、ＡｍｙＥ、Ｂｌａｃ、ＳａｃＢの発現を駆動するものが含まれ、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は他の酵母については、キラー毒素、Ｂａｒ１、Ｓｕｃ２、接合因子アルファ、Ｉｎｕ１Ａ、又はＧｇｐｌｐシグナル配列が含まれる。シグナル配列は、いくつかのシグナルペプチダーゼによって切断する、したがって、発現されたタンパク質のその他の部分から除去することができる。

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、単独で、又はＮ又はＣ末端に位置する追加のペプチド、タグ、又はタンパク質（例えば、６ＸＨｉｓ、ＨＡ、又はＦＬＡＧタグ）との融合体として発現される。好適な融合体は、アフィニティ精製又は検出を容易にするタグ、ペプチド、又はタンパク質（例えば、６ＸＨｉｓ、ＨＡ、キチン結合タンパク質、チオレドキシン、又はＦＬＡＧタグ）、並びに標的ベータ－グルコシダーゼの発現、分泌、又はプロセシングを容易にするものを含む。ＫＥＸ２に加えて、さらなる好適なプロセシング部位には、エンテロキナーゼ、ＳＴＥ１３、又はインビボ又はインビトロでの切断のための当技術分野で公知の他のプロテアーゼ切断部位が含まれる。

融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、限定はされないが、電気穿孔法、脂質媒介性の形質転換又は遺伝子導入（「リポフェクション」）、化学的に媒介される遺伝子導入（例えば、ＣａＣｌ及び／又はＣａＰ）、酢酸リチウム媒介性の（例えば、宿主－細胞プロトプラストの）形質転換、微粒子銃「遺伝子銃」形質転換、ＰＥＧ媒介性の（例えば、宿主－細胞プロトプラストの）形質転換、プロトプラスト融合（例えば、細菌又は真核生物のプロトプラストを使用する）、リポソーム媒介性形質転換、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アデノウイルス若しくは他のウイルス、又はファージ形質転換又は形質導入を含めた、いくつかの形質転換方法によって、発現宿主細胞に導入することができる。

ＩＩＩ．方法
Ａ．融合ポリペプチド産生
本明細書でさらに提供されるのは、宿主細胞（限定はされないが、哺乳類又は糸状菌宿主細胞など）中で、本明細書に開示される融合ポリペプチドの１つ以上のを産生するための方法である。いくつかの実施形態では、これらの方法は、本明細書に開示される融合ＤＮＡ構築物又はベクターを含む宿主細胞を得ることと、この宿主細胞を、対象となるポリペプチドの発現及び分泌を可能にする好適な条件下で培養することとを含む。宿主細胞の培養物（すなわち、宿主細胞と増殖培地とを含有する組成物）は、本明細書に記載した融合ポリペプチドの分泌されたタンパク質を含有することができるので、いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドは、培養培地から回収される。他の実施形態では、対象となるポリペプチドは、精製される。タンパク質は、当技術分野で公知のあらゆる好都合な方法によって、増殖培地から回収及び／又は精製することができる。

いくつかの実施形態では、対象宿主細胞（真菌宿主細胞など）は、回分又は連続的発酵条件下で培養することができる。古典的な回分発酵は、密閉系であり、ここでは、培地の組成は、発酵の開始時に設定され、発酵中に人為的な変更を受けない。したがって、発酵の開始時に、培地に所望される微生物が植菌される。この方法では、発酵は、その系にいずれの構成成分も添加されずに行われる。典型的には、回分発酵は、炭素源の添加について「回分」とみなし、ｐＨ及び酸素濃度などの制御因子についての試みが、しばしば行われる。回分系の代謝産物及びバイオマス組成は、発酵が停止される時まで常に変化する。回分培養内では、細胞は、静的な遅滞期を経て、高増殖の対数期へ、最後に定常期（ここでは、増殖速度は低下又は停止される）へと進行する。処理を行わなければ、定常期の細胞は、最終的には死ぬ。一般に、対数期の細胞は、最終産物の産生の大部分を担う。

標準の回分系に対する変化形態は、「流加発酵」系であり、これも使用することができる。この典型的な回分系の変化形態では、発酵が進行した分の基質が添加される。流加系は、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合に有用であり、ここでは、限られた量の基質を培地中に有することが望ましい。流加系における実際の基質濃度の測定は難しいので、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ_２などの廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。回分及び流加発酵は、一般的であり且つ当技術分野で公知である。

連続的発酵は、開放系であり、ここでは、定義された発酵培地が、バイオリアクターに連続的に添加され、等量の培養上清が、処理のために同時に除去される。連続的発酵は、一般に、培養物を一定の高い密度に維持し、ここでは、細胞は、主として対数期増殖状態である。

連続的発酵は、細胞増殖及び／又は最終産物濃度に影響を与える１つの因子又はあらゆる数の因子の調節を可能にする。例えば、一実施形態では、炭素源又は窒素源などの栄養を制限することが、一定の割合で維持され、すべての他のパラメータを中程度にさせる。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保つ一方で、増殖に影響を与えるいくつかの因子を、連続的に変えることができる。連続系は、定常状態増殖条件を維持しようと努める。したがって、培地が取り除かれることによる細胞喪失を、発酵中の細胞増殖速度と釣り合わせなければならない。連続的発酵プロセスのための栄養及び増殖因子を調節する方法、並びに産物形成の速度を最大にするための技術は、公知である。

Ｂ．発現及び分泌
融合ポリペプチドをコードする融合ＤＮＡ構築物を含む宿主細胞（例えば、糸状菌宿主細胞）における対象となるポリペプチドの産生は、融合ポリペプチドの対象となるポリペプチドの分泌をもたらす。例えば真菌における分泌プロセス中、分泌されることとなるタンパク質に糖鎖が付着して、グリコシル化タンパク質が産生され得る。したがって、いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチド（例えば抗体）の産生には、グリコシル化又は非グリコシル化タンパク質が含まれ得る。

いくつかの実施形態では、対象融合ポリペプチドの分泌されたタンパク質は、一般に、等価な宿主細胞（すなわち、同じ条件下で増殖される、同じ細胞型）によって産生される、本明細書に開示される操作されたＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列を欠く等価な融合ポリペプチドの分泌された対象となるポリペプチドの量よりも多い量で、宿主細胞の培養培地中に存在する。本明細書に開示される方法に従う融合ポリペプチドから対象となるポリペプチドを産生する対象細胞の培養物は、本開示によって包含される操作されたＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列を有しない他の等価なタンパク質を発現する等価な細胞培養物と比較して、増殖培地中に、約５％超、約１０％超、約２０％超、約４０％超、約６０％超、約８０％超、約１００％超、約１５０％超、約２００％超、約３００％超、約５００％超、又は約１０００％超の対象となるポリペプチドを含有することができる。

いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチド（例えば全長抗体）についての発現及び分泌のレベルは、０．５ｇ／Ｌを超えることとなる。慣例的に、１．０ｇ／Ｌを超える対象となるポリペプチドは、培養培地から回収することができる。約１．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０、１、１１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ｇ／Ｌを超える再現可能レベルを達成することができる。いくつかの実施形態では、対象となるポリペプチドの発現及び分泌のレベルは、約３０ｇ／Ｌを超える、さらには約４０ｇ／Ｌを超えることとなる。

他の実施形態では、分泌された切断された対象となるポリペプチドと、切断されなかった分泌された対象となるポリペプチドとの比率は、約５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１５０：１、２００：１、２５０：１、３００：１、３５０：１、４００：１、４５０：１、５００：１、１０００：１、５０００：１、７５００：１、１００００：１、又は１０００００：１（これらの比率の間に入るすべての値を含む）よりも大きい。

いくつかの実施形態では、組換え型の融合ポリペプチドからの対象となるポリペプチドの切断は、本明細書に開示されるＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列を欠く等価な組換え型の融合ポリペプチドからの同じ対象となるポリペプチドの切断を超えることとなる。いくつかの実施形態では、ＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％の効率（ここで、１００％の効率は、融合ポリペプチドから完全に切断された対象となるポリペプチドをもたらす）で切断される融合タンパク質をもたらすことができる。

ある種の実施形態では、タンパク質切断の効率は、生じた切断の量を決定することによって、例えば、切断されなかったタンパク質の量に対する切断されたタンパク質の量を決定することによって算出することができる。一実施形態では、タンパク質切断の量は、細胞培養物の体積あたりの、増殖培地中の切断されていない融合タンパク質の量に対する、増殖培地中の切断されたタンパク質の量の割合を決定することによって算出することができる。

ＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列又は最適化されたＫＥＸ２部位前駆及び／又は後部配列を含有する融合ポリペプチドは、ある種の実施形態では、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の効率（ここで、１００％の効率は、完全に切断された対象となるポリペプチドである）で切断される融合ポリペプチドをもたらすことができる。

他の実施形態では、対象融合ポリペプチドの分泌の効率は、そのタンパク質を分泌する細胞の増殖培地中の融合ポリペプチドの分泌された部分の量を決定することによって算出することができる。この決定は、定量的、定性的、相対的、又は絶対的であり得る。一実施形態では、対象融合体を分泌する細胞の増殖培地中の分泌タンパク質の量は、最適化されたＫＥＸ２前駆及び／又は後部配列を含有しない等価な融合ポリペプチドを産生する細胞によって分泌された、分泌タンパク質の量よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約９０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍多い可能性がある。

いくつかの実施形態では、分泌及び／又は切断の増大は、ＧＧＧＢ１Ｂ２（ここで、Ｂ１Ｂ２は、ＫＫ、ＫＲ、ＲＫ、又はＲＲ、好ましくはＫＲである）と定義される標準のＫＥＸ２領域に対して測定することができる。一実施形態では、対象融合体を分泌する細胞の増殖培地中の分泌された対象となるタンパク質又はポリペプチドの量は、本質的に同じ条件下で等価な宿主における等価な融合ポリペプチドによって分泌された、分泌された対象となるタンパク質又はポリペプチドの量よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも２×、少なくとも３×、少なくとも５×、及び少なくとも１０×多い可能性がある。

ＩＶ．キット
本明細書でさらに提供されるのは、本明細書に開示される融合ポリペプチドのいずれかを産生するための書面の説明書；本明細書に開示される核酸のいずれかのうちの１つ以上；本明細書に開示されるベクターのいずれか；本明細書に開示される宿主細胞のいずれかのうちの１つ以上を含有するキットである。キットは、Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼを含む組成物；及び／又はＫｅｘ２セリンペプチダーゼをコードする核酸のうちの１つ以上をさらに含むことができる。さらに、キットはまた、Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼを発現する宿主細胞、追加のプロテアーゼを含む１つ以上の組成物；及び／又は１つ以上の追加のプロテアーゼをコードする核酸を含むことができる。

本発明は、実例の目的で提供され且つ限定する目的ではない、以下の実施例を参照することによって、さらに理解することができる。

実施例１：アッセイ
以下の実施例では、読解を容易にするために、下に示す通り、様々なアッセイを使用した。下で提供されるプロトコルからのいずれの逸脱も、該当するセクションに示す。これらの実験では、反応の完了後に形成された産生物の吸光度を測定するために、分光光度計を使用した。

タンパク質分泌アッセイ：この方法は、融合ポリペプチド（例えば、担体タンパク質に付着されたもの）の形態のままである分泌されたタンパク質の量に対する、増殖培地中の、融合ポリペプチドから放出又は切断された、分泌されたタンパク質（対象となるポリペプチド）の量を測定する。融合ポリペプチド及び対象となるポリペプチドは、プロテインＡ樹脂を使用して、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）からの未精製のブロスから精製した。プロテインＡ樹脂を含む９６ウェルプレートを、最初にＰＢＳ中で平衡化し、培養ブロスのｐＨを、１Ｍリン酸ナトリウムを使用してｐＨ７に調整し、次いで、このブロスを濾過し、濾液を樹脂と共に９６ウェルプレート中で振盪しながら５分間インキュベートした。ＰＢＳを使用して、プロテインＡ樹脂に結合しなかったあらゆるタンパク質を洗い流し、結合したタンパク質を、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．７）を使用して樹脂から溶離し、それに続いて、１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）での中和を行った。各バリアントの精製されたタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに流した（図２）。融合ポリペプチド及び対象となるポリペプチドの分子量に基づいて、これらのタンパク質のバンド強度を、ｉｍａｇｅ ｑｕａｎｔソフトウェアを使用して定量化することができる。融合ポリペプチドと対象となるポリペプチドとの比率を算出することができる。

ＣＢＨ１加水分解：異なるバリアントの融合ポリペプチドと対象となるポリペプチドとの比率を比較するために、融合ポリペプチド中の担体タンパク質ＣＢＨ１を、その基質４－ニトロフェニルβ－Ｄ－ラクトピラノシド（ｐＮＰ，Ｓｉｇｍａ）に対するＣＢＨ１加水分解を測定することによって定量化した。１０μｌの精製されたタンパク質を、３８４ウェルプレート中で、４０μｌの２．５ｍＭ ｐＮＰＬ（５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中）（ｐＨ５）と共にインキュベートした。プレートを密封し、１４００ｒｐｍの振盪で５０℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、２０μｌの５００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）を、３８４ウェルＧｒｅｉｎｅｒプレート中の各ウェルに添加して、反応を停止させた。ポリペプチド中の相対ＣＢＨ１濃度を定量化するために、ＯＤ４０５を測定した。全ポリペプチド及び対象となるポリペプチド濃度を、Ｏｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でプロテインＡプローブを使用して測定した。ＣＢＨ１活性を、全ポリペプチド及び対象となるポリペプチド濃度に対して規準化した。性能指数（ＰＩ）は、各バリアントについて、バリアントの規準化されたＣＢＨ１活性に対して、変更されていない対照の規準化されたＣＢＨ１活性を除算することによって算出した。８以上のＰＩを有するバリアントは、融合ポリペプチドからのＣＢＨ１の＞９０％超の切断を示す。いずれのＣＢＨ１活性も有しないバリアントは、融合ポリペプチドからのＣＢＨ１の完全な切断を示す。

実施例２：部位評価ライブラリーの産生及び評価
Ａ．抗ＲＳＶ ＨＣ重鎖のためのプラスミド及び部位評価構築
ＲＳウイルス（パリビズマブ又はＳｙｎａｇｉｓ）に対するモノクローナル抗体の重鎖のための配列は、コドン最適化され、ＧｅｎｅＡｒｔ ＧｍＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。真菌細胞内での発現中のＫｅｘ２フーリン様プロテアーゼによる分解の可能性を防止するために、重鎖内の第２５１位のリジンを、トレオニン（Ｋ２５１Ｔ）に変異させた。最初に、抗ＲＳＶ ＨＣの合成配列を、そのリンカー領域（１－４７９ ａａ）と共に、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）天然セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＢＨ１）の触媒コアの後ろにそれぞれクローニングした。担体パートナーから成熟抗体鎖を放出させるために、リンカーとＨＣとの間にＫｅｘ２切断部位を導入した。

次いで、ｃｂｈＩ－ＨＣ＿Ｓｙｎａｇｉｓの融合構築物を、ｐＤｏｎｏｒ２２１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）へのＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ組換えクローニングを可能にするためにａｔｔＢ１及びａｔｔＢ２部位で伸長させた遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。図３に示す通り、プラスミドｐＥｎｔｒｙ－ＳｙｎａｇｉｓＨＣＫ２５１Ｔ＿Ｇｅｎｅａｒｔ＿ＳＥＬを、４６６－７２５ ａａ位置（ＣｂｈＩ Ｍｅｔからカウントしている）での部位評価（ＳＥＬ）ライブラリーの構築のための鋳型として、供給業者ＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって使用した。ａａ位置ごとの変異バリアントの平均数は、およそ１７であった。変異した配列を、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲ組換え技術を介して、ｐＴＴＴｐｙｒ２－ＩＳｃｅＩデスティネーションベクターにさらにクローニングし、最終の発現プラスミドｐＴＴＴｐｙｒ２－ＩＳｃｅＩ－ＳｙｎａｇｉｓＨＣ＿Ｇｅｎｅａｒｔ＿ＳＥＬ（図３）をもたらした。

この発現ベクターは、対象となる遺伝子の強力な誘導性発現を可能にするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩプロモーター及びターミネーター領域と、ウリジンを添加しない最少培地での形質転換体の増殖を与えるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２選択マーカーを含有する。このプラスミドは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のテロメア領域により、真菌細胞内で自律的に維持される。プラスミドを、市販品として入手可能な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）内で増殖させ、精製し、配列確認し、９６ウェルＭＴＰにそれぞれ配列させ、下に記載する通りの真菌の形質転換のために使用した。

ｐＥｎｔｒｙ－Ｓｙｎａｇｉｓ＿ＬＣ＿Ｇｅｎｅａｒｔプラスミドを、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＢＰ組換えクローニングを介して構築し、上に記載したのと同様の方式で、ｐＴｒｅｘ６ｇデスティネーションベクターを用いてさらに組換え、発現ベクターｐＴｒｅｘ６ｇ－Ｓｙｎａｇｉｓ＿ＬＣをもたらした。このベクターは、ｃｂｈＩプロモーターによって駆動され、真菌細胞にクロリムロンエチルへの抵抗性を与えるａｌＳマーカーに連結される、軽鎖を発現するＰＣＲ断片を産生するための鋳型としての役割を果たした（図４）。

Ｂ．真菌宿主株構築及び形質転換
発現カセットは、ＣＢＨ１プロモーター、ＣＢＨ１コア、ＣＢＨ１リンカーによって連結される抗体ＨＣ及びＬＣ、及びＣＢＨ１のプロセシングのためのｋｅｘ２、ＣＢＨ１ターミネーター、並びに真菌細胞にクロリムロンエチルへの抵抗性を与えるａｌＳマーカーからなる。ＳＥＬバリアントのためにｐｙｒ２マーカーが利用可能になるように、宿主株を作成するためにａｌＳマーカーを使用した。この発現カセットを、多重コピーで、宿主Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ゲノムにランダムに組み込んだ。この完全発現カセットを、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、精製し、５００～１０００ｎｇ／μＬに濃縮した。

形質転換のために使用された宿主Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、主なセルラーゼ及びキシラナーゼについて欠失させた。この株を、標準のＰＥＧ－プロトプラスト形質転換方法を使用して形質転換させた。２５０μｌの総体積中におよそ１０μｇのＤＮＡと５×１０^６個のプロトプラストを含有する形質転換混合物を、２ｍＬの２５％ ＰＥＧ溶液で処理し、２体積の１．２Ｍソルビトール／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／１０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液で希釈し、１Ｍソルビトール、１ｇ／Ｌウリジン、７５ｍｇ／Ｌクロリムロンエチル（最少培地中）を含有する２６ｍＬの２％低融点アガロースと混合し、あらかじめ注がれた１．５％アガロース、１Ｍソルビトール（最少培地中）を含有する４枚の１０ｃｍペトリ皿に分配した。十分な増殖後、各皿の形質転換体を観察し、それぞれのコロニーを、１．５％寒天、１ｇ／Ｌウリジン、７５ｍｇ／Ｌクロリムロンエチルを含有する新たな１０ｃｍペトリ皿に、安定性を評価する余地を与えるために皿あたり４つ選び取った。安定なコロニーの表現型は、平滑縁を伴う同心円状の増殖である。安定な形質転換体が観察され、十分に胞子形成されたら、胞子を回収し、液体培養物の植菌のために使用した。

Ｓｙｎａｇｉｓ ＨＣバリアントを用いるすべてのハイスループット形質転換は、Ｂｉｏｍｅｋロボット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）を使用する２４ウェルＭＴＰフォーマットで、ロボット制御によって実施した。バリアントを有するプラスミドは、あらかじめ決定された配置に従って配列された９６ウェルフォーマットで、供給業者から受け取った。５０ｍｌの総体積中におよそ１ｍｇのＤＮＡと５×１０^６個のプロトプラストを含有する形質転換混合物を、２００μＬの２５％ ＰＥＧ溶液で処理し、１体積の１．２Ｍソルビトール／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／１０ｍＭ ＣａＣｌ_２溶液で希釈し、ロボット制御によって２４ウェルＭＴＰに再配列し、１Ｍソルビトール（最少培地中）を含有する１ｍｌの３％低融点アガロースに注いだ。十分な増殖後、各ウェルからの形質転換体を一緒にプールし、最少培地を有する新たな２４ウェル寒天皿に乗せた。十分に胞子形成されたら、胞子を回収し、液体培養物の植菌のために使用した。

Ｃ．徐放性の２４ウェルＭＴＰにおける真菌発酵
十分に高い抗体力価をもたらすために、１０^５～１０^６個のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）胞子を、連続的産生を確実にするために発酵中に培地中でゆっくりと放出されるラクトースとあらかじめ混合されたＳｙｌｇａｒｄ １７０エラストマー（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡより）から構成されるカスタムメイドの（ｃｕｓｔｏｍｅｒ ｍａｄｅ）２４ウェルＭＴＰに植菌した。培養株を、１６ｇ／Ｌグルコース、９ｇ／Ｌカザミノ酸、１０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、３３ｇ／Ｌ ＰＩＰＰＳ緩衝液［ｐＨ ５．５］、０．２５％ Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素（１００％：１７５ｇ／Ｌクエン酸（無水）、２００ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／Ｌ ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／Ｌ ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／Ｌ Ｈ３ＢＯ３）を含有する１．２５ｍｌの培地中で増殖させた。

プレートを、２００ｒｐｍ及び２８Ｃで、８０％湿度で、５０ｍｍの振盪幅を用いて、Ｉｎｆｏｒｓシェーカー中でインキュベートした。５～６日の増殖の後、培養物を、９６ウェルディープウェルＭＴＰにフォーマットし直し、９６ウェルマイクロタイターフィルタープレート（０．２μｍ親水性ＰＶＤＦ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ ＭＡ）を使用して濾過した。プレートを、Ａｘｙｇｅｎハーフディープウェルプレート（Ｐ－ＤＷ－１１－Ｃ）で凍結した。

Ｄ．精製
プレートを、冷凍庫から冷蔵室に移動して、試料を４℃で一晩、徐々に解凍した。精製前に、増殖したＷＴ試料をプレートから取り除き、これらの試料をプールした。ウェルあたり１ｍＬのプールされたＷＴ、プールされた低結合対照、プールされた高結合対照、及びプールされたベクターのみ（同じ株においてＣＢＨ１を発現するベクター）試料を、指定されたウェルに添加した。これらのライブラリープレート物は、２連で増殖させ、これらの対照は、両方のプレートに添加した。これらのプレートを、２分間、やさしくゆすって、ウェル内の流体を均質化させ、続いて、１分間遠心分離を行って、あらゆる沈殿をペレット化させた。

次いで、遠心分離されたプレートを、ロボットに移動して、ＯｃｔｅｔプロテインＡ定量化のために、２０μＬの未精製材料を取り出した。この２０μＬを、３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ ７８１２０９）中の８０μＬの１Ｘ ＰＢＳに添加した。４つのライブラリープレート物を、１つの３８４ウェルプレートに入れ、４つのプレート物の２連の増殖のために、別の３８４ウェルプレートが存在していた（プレートＸａ及びＸｂ）。

試料をＯｃｔｅｔ定量化のために取り出した後、次いで、プレート物を精製した。ロボットは、４つのライブラリープレートを一度に処理した。ロボットは、プロテインＡ樹脂への抗体結合を向上させるために、５０μＬの１Ｍ ＫＰｉ（ｐＨ７）を添加して、上清のｐＨを上昇させた。次いで、ロボットは、未精製材料（最大８８０μＬ／ウェル）を、４つのプレートから、２２０μＬのプロテインＡ樹脂（ＰＢＳ中）であらかじめ満たした２ｍＬフィルタープレート（Ｐａｌｌ ８２７５）に移した。次いで、これらのフィルタープレートを、５分間、シェーカーでゆすった。次いで、プレート物を、１０００ｇでの２分間の遠心分離によって濾過し、フロースルーを、試料がそこから移された空の回収プレートに収集した。この材料は、定量化後まで保管した。フィルタープレートを、ロボットの台に戻し、２連の増殖プレート物を、同じフィルタープレートに添加した。これらのプレート物を、前回と同様にインキュベート及び遠心分離した。次いで、樹脂を、８８０μＬのＰＢＳ緩衝液で洗浄した。これらのプレートを、１分間ゆすり、次いで、１０００ｇで２分間遠心分離した。フロースルーを捨て、プレートを、第２のＰＢＳ洗浄のために、ロボットに戻した。第２の洗浄後、プレートを、溶離プログラムを実行するロボットに移動した。

溶離プログラムは、４つのプレートを一度に処理した。このプログラムは、試料が溶離されることとなる清浄なハーフディープウェルプレートに、１１μＬの中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ９）を添加した。次いで、このプログラムは、フィルタープレートに、４４０μＬの溶離緩衝液（１００ｍＭグリシン ｐＨ２．７）を添加した。次いで、プレートを、設定７で１分間ゆすり、次いで、遠心分離（１０００ｇ、２分間）によって、新たに準備した回収プレートへと濾過した。遠心分離後、中和緩衝液の適切な混合を確実にするために、試料プレートを１分間ゆすった。

Ｅ．結果
バリアントを、実施例１に記載した通りに、切断効率について試験した。変更されていない及びバリアントのＫＥＸ２切断部位の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、図２に示す。各バリアントについて、変更されていない切断ドメインに対する切断に関する性能指数（ＰＩ）を算出した。変更されていないアミノ酸配列に対する完全又はほぼ完全な（＞９０％）切断を示す８以上のＰＩを有するバリアントを、表１に示す。

実施例３：コンビナトリアルバリアントの産生及び試験
表１に示されたものから、リンカー部位中に複数の置換を含有するさらなるバリアントを作製し、融合タンパク質のより高い又は完全な切断を実現するために、置換の組み合わせ性能を試験した。

Ｓｙｎａｇｉｓ抗体の重鎖と軽鎖を、同時発現のために、１つのベクター上で組み合わせた。

合成ＤＮＡを、単鎖抗体宿主株への単鎖バリアント形質転換のために、発現ベクターにクローニングした。これらのベクターは、表１に示されたＳＥＬデータに基づいて設計された、バリアントの組み合わせを有していた。バリアントの特定のサブセットを選択して互いに組み合わせ、主なセルラーゼ及びキシラナーゼについて欠失させた宿主Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株中で発現させた。

この発現ベクターｐＡＳ２５（図６）は、対象となる遺伝子の強力な誘導性発現を可能にするＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩプロモーター及びターミネーター領域と、ウリジンの非存在下での最少培地での形質転換体の増殖を与えるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２選択マーカーを含有する。このプラスミドは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のテロメア領域により、真菌細胞内で自律的に維持される。この発現ベクターはまた、ＣＢＨ１コアエクソン１及び２及び部分的に３（ここで、これは、切除され、ｃｃｄＢ及びクロラムフェニコール耐性マーカーの配列は、これの間にある）、及び部分的なＣＢＨ１ターミネーターを含有していた。対象となるカセットをこのベクターに入れるために、制限酵素を使用してｃｃｄＢ及びクロラムフェニコールを切除し、シームレスアセンブリ（ｇｅｎｅａｒｔ）のためにゲル精製した。

ＨＣ断片は、５’末端での相同性を有するプラスミドからのｃｂｈ１コア欠損、ＨＣそれ自体、ＣＢＨ１ターミネーター、及びＬＣカセットと連結するための４８ｍｅｒアダプターアームで埋められていた。ＬＣカセットは、５’末端上の相同性のための４８ｍｅｒアダプター、ＣＢＨ１プロモーター、ＣＢＨ１コア、ＬＣ、ｃｂｈ１ターミネーター、及び３’末端でのベクターに対する相同性を利用していた。これらのカセットは、ＰＣＲによって産生し、ＤｐｎＩ処理し、その後、精製した。３つすべての断片を組み合わせ、シームレスアセンブリ（Ｇｅｎｅａｒｔ）を行い、市販品として入手可能な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）に形質転換した。バリアントの組み合わせあたり４つ～６つのコロニーを選び、プラスミド精製し、診断的に制限酵素ＮｏｔＩで切断し、ＺＡＧフラグメント分析器（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で分析して、どのクローンが正しく構築されたかを評価した。次いで、正しく構築されたベクターを、サンガーシーケンシングに送って、正確な配列を確実にした。プラスミドを、市販品として入手可能な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳ）内で増殖させ、精製し、９６ウェルＭＴＰにそれぞれ配列させ、先に上に記載した通りの真菌の形質転換のために使用した。

表２に示す通り、コンビナトリアルも、融合ポリペプチドの完全なＫＥＸ２媒介性切断の増大をもたらした。

さらに、ＫＥＸ２前駆切断部位と後部切断部位の両方における追加の部位でのある種の置換は、表１に示した置換と組み合わせて使用される場合に、改良された又は完全な切断をもたらした。具体的には、アラニンで置換されたＴ_８位置及びイソロイシンで置換されたＬ_９位置、並びにチロシンで置換されたＧ_－２位置及びトレオニンで置換されたＰ_－１位置は、表１に示した置換の１つ以上と組み合わせて使用される場合に、完全な切断をもたらした（表３）。追加の高度に組み合わせ性能の高い置換は、Ｓ_２（Ｈｉｓ）及びＶ_４（Ｌｅｕ）であると判明した（表３）。

実施例４：追加の抗体におけるバリアントの産生及び試験
先の実施例で特定された改良されたリンカーバリアントを、モノクローナル抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））の産生における切断効率について試験した。

ベクター構築：発現ベクターは、対象となる遺伝子の強力な誘導性発現を提供するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈＩプロモーター及びターミネーター領域、ＣＢＨ１コア、ＣＢＨ１リンカーによって連結される軽鎖又は重鎖、及びＣＢＨ１のプロセシングのためのｋｅｘ２を含有していた。軽鎖ベクターは、唯一の窒素源としてアセトアミドを含む最少培地での増殖を与えるアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ選択マーカーを含有する。重鎖ベクターは、ウリジンの非存在下での最少培地での増殖を与えるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２選択マーカーを含有する。ベクター構築は、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）によって完了され、届けられた。全体として、４つのベクター：抗体トラスツズマブの軽鎖を含有する２つと重鎖を含有する２つを構築した。それぞれの鎖について、リンカー部分は、Ｓ４８０Ｋ変異を含有するかしないかのいずれかであり、その結果、融合パートナーＣＢＨ１から抗体鎖をプロセシングする効力を評価することができた。

真菌株及び形質転換：リンカー変異Ｓ４８０Ｋの効力を評価するために、重鎖と軽鎖の両方に対するＳ４８０Ｋ変異を伴う又は伴わないすべての組み合わせの形質転換を試験した。軽鎖と重鎖は、異なる選択可能マーカーを有する別のベクター上にあるので、重鎖ベクターと軽鎖ベクターを、宿主Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株に同時形質転換させることができる。これらのプラスミドは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のテロメア領域により、真菌細胞内で自律的に維持される。複製プラスミド結果の使用は、形質転換の頻度増大をもたらし、組込み真菌形質転換で観察される遺伝子座依存性発現という問題を回避させた。

形質転換のために使用された宿主Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、主なセルラーゼ及びキシラナーゼについて欠失させた。この株を、標準のＰＥＧ－プロトプラスト形質転換方法を使用して形質転換させた。２５０μＬの総体積中におよそ１μｇの各ベクターＤＮＡと５×１０^６個のプロトプラストを含有する形質転換混合物を、２ｍＬの２５％ ＰＥＧ溶液で処理し、２体積の１．２Ｍソルビトール／１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５／１０ｍＭ ＣａＣｌ_２溶液で希釈し、１Ｍソルビトール、２０ｍＭアセトアミド（最少培地中）を含有する８ｍＬの２％低融点アガロースと混合し、あらかじめ注がれた１．５％アガロース、１Ｍソルビトール、２０ｍＭアセトアミド（最少培地中）を含有する１０ｃｍペトリ皿に分配した。十分な増殖後、形質転換体を一緒にプールし、唯一の窒素源として１０ｍＭアセトアミドを含有する最少培地を有する新たなペトリ寒天皿に乗せた。胞子形成されたら、胞子を回収し、液体培養物の植菌のために使用した。

十分に高い抗体力価をもたらすために、１０^５～１０^６個のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）胞子を、連続的産生を確実にするために発酵中に培地中でゆっくりと放出されるラクトースとあらかじめ混合されたＳｙｌｇａｒｄ １７０エラストマー（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡより）から構成されるカスタムメイドの（ｃｕｓｔｏｍｅｒ ｍａｄｅ）２４ウェルＭＴＰに植菌した。培養株を、１６ｇ／Ｌグルコース、９ｇ／Ｌカザミノ酸、１０ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、３３ｇ／Ｌ ＰＩＰＰＳ緩衝液［ｐＨ ５．５］、０．２５％ Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素を含有する１ｍｌの培地中で増殖させた。

プレートを、２００ｒｐｍ及び２８Ｃで、８０％湿度で、５０ｍｍの振盪幅を用いて、Ｉｎｆｏｒｓシェーカー中でインキュベートした。５～６日の増殖の後、培養物を、９６ウェルディープウェルＭＴＰにフォーマットし直し、９６ウェルマイクロタイターフィルタープレート（０．２μｍ親水性ＰＶＤＦ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ ＭＡ）を使用して濾過した。清澄化された試料を、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのあらかじめ混合された重鎖及び軽鎖特異的な抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートを使用するウエスタンブロットによって、抗体の発現について分析した。

結果：Ｓ４８０Ｋ変異を伴って又は伴わずに発現されたトラスツズマブ軽鎖及び重鎖を、ウエスタンブロットによって、十分なＣＢＨ１プロセシングについて評価した。図９に示し、Ｓ４８０Ｋ変異が、重鎖又は軽鎖のいずれかに存在する場合、これは、ＣＢＨ１からほぼ十分にプロセシングされる。逆に、変異が存在しないならば、重鎖又は軽鎖から十分にはプロセシングされないＣＢＨ１の注目すべきシグナルが存在する。したがって、この変異は、トラスツズマブ抗体鎖からのＣＢＨ１の改良された完全なプロセシングに必須である。

Claims (73)

1. アミノ酸配列Ｔ_１－Ｓ_２－Ｖ－Ａ_３－Ｖ_４－Ｅ_５－Ｘ_１－Ｘ_２－Ｑ_６－Ｖ_７－（配列番号１）を含む融合ポリペプチドであって、１）Ｘ_１及びＸ_２が、塩基性アミノ酸であり；及び、２）前記アミノ酸配列が、
   ａ．疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、酸性アミノ酸、及び塩基性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＴ_１；
   ｂ．疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、塩基性アミノ酸、及び鎖配向に影響を与えるアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＳ_２；
   ｃ．塩基性アミノ酸及びＭからなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＡ_３；
   ｄ．Ｌで置換されたＶ_４；
   ｅ．芳香族アミノ酸で置換されたＥ_５；
   ｆ．酸性アミノ酸、及び鎖配向に影響を与えるアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＱ_６；及び／又は
   ｇ．Ｌ、Ｉ、及び芳香族アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されたＶ_７
   からなる群から選択される１つ以上の置換を有する、融合ポリペプチド。
2. ａ．Ｔ_１が、Ａ、Ｆ、Ｍ、Ｑ、Ｒ、Ｎ、Ｅ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；
   ｂ．Ｓ_２が、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｎ、及びＶからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；
   ｃ．Ａ_３が、Ｈ、Ｋ、Ｍ、及びＲからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；
   ｄ．Ｅ_５が、Ｆ及びＷからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；及び／又は
   ｅ．Ｑ_６が、Ｄ及びＧからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている
   ｆ．Ｖ_７が、Ｌ、Ｉ、及びＦからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている
   請求項１に記載の融合ポリペプチド。
3. ＡＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号３）、ＦＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号２）、ＭＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号４）、ＱＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号５）、ＲＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号６）、及びＹＳＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の融合ポリペプチド。
4. ＴＦＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号８）、ＴＨＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号９）、ＴＫＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１０）、ＴＬＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１１）、ＴＭＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１２）、ＴＰＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１３）、ＴＱＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１４）、ＴＲＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１５）、及びＴＶＶＡＶＥＫＲＱＶ（配列番号１６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の融合ポリペプチド。
5. ＴＳＶＨＶＥＫＲＱＶ（配列番号１７）、ＴＳＶＫＶＥＫＲＱＶ（配列番号１８）、及びＴＳＶＲＶＥＫＲＱＶ（配列番号１９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の融合ポリペプチド。
6. アミノ酸配列ＴＳＶＡＬＥＫＲＱＶ（配列番号２０）を含む、請求項１又は請求項２に記載の融合ポリペプチド。
7. ＴＳＶＡＶＦＫＲＱＶ（配列番号２１）及びＴＳＶＡＶＷＫＲＱＶ（配列番号２２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の融合ポリペプチド。
8. ＴＳＶＡＶＥＫＲＤＶ（配列番号２３）及びＴＳＶＡＶＥＫＲＧＶ（配列番号２４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の融合ポリペプチド。
9. ＴＳＶＡＶＥＫＲＱＦ（配列番号２５）及びＴＳＶＡＶＥＫＲＱＬ（配列番号２６）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の融合ポリペプチド。
10. 前記アミノ酸配列が、Ｃ末端に追加の２つのアミノ酸、Ｔ_８－Ｌ_９（配列番号６４）をさらに含み、ここで、
    ａ．Ｔ_８は、酸性アミノ酸及び疎水性アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている；及び／又は
    ｂ．Ｌ_９は、Ｉ及びＶからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている
    請求項１又は請求項２に記載の融合ポリペプチド。
11. Ｔ_８が、Ｅ又はＦで置換されている、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
12. アミノ酸配列ＴＳＶＡＶＥＫＲＱＶＥＬ（配列番号２７）を含む、請求項１０又は請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
13. ＴＳＶＡＶＥＫＲＱＶＴＩ（配列番号２８）及びＴＳＶＡＶＥＫＲＱＶＴＶ（配列番号２９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の融合ポリペプチド。
14. ２つ以上の置換を含む、請求項１～２又は１０～１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
15. ２つ以上の置換の少なくとも１つが、Ｓ_２又はＶ_４位置である、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
16. 前記Ｓ_２での置換が、Ｈ又はＮである、請求項１５に記載の融合ポリペプチド。
17. ＴＨＶＡＶＥＫＲＱＶＴＩ（配列番号３０）、ＴＨＶＡＶＥＫＲＤＶＴＬ（配列番号３１）、ＴＨＶＡＶＥＫＲＱＶＡＬ（配列番号３２）、ＥＨＶＡＶＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号３３）、ＴＮＶＡＶＥＫＲＤＶＴＬ（配列番号３４）、及びＴＮＶＡＶＥＫＲＱＶＡＬ（配列番号３５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
18. 前記Ｖ_４での置換が、Ｌである、請求項１５に記載の融合ポリペプチド。
19. ＴＳＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号３６）、ＴＳＶＭＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号３７）、ＴＳＶＡＬＥＫＲＱＩＴＬ（配列番号３８）、及びＴＳＶＡＬＥＫＲＱＶＡＬ（配列番号３９）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の融合ポリペプチド。
20. Ｓ_２及びＶ_４での置換を含む、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
21. アミノ酸配列ＴＨＶＡＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号４０）を含む、請求項２０に記載の融合ポリペプチド。
22. アミノ酸配列ＴＳＶＡＶＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号４１）を含む、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。
23. ３つ以上の置換を含む、請求項１～２又は１０～１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
24. ＴＨＶＭＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号４２）、ＴＫＶＭＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号４３）、ＴＨＶＡＶＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号４４）、ＴＨＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号４５）、ＴＫＶＡＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号４６）、ＴＮＶＡＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号４７）、ＥＨＶＡＶＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号４８）、ＥＨＶＡＬＥＫＲＱＶＴＬ（配列番号４９）、ＥＳＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号５０）、ＲＳＶＲＶＥＫＲＤＶＴＬ（配列番号５１）、及びＴＳＶＡＬＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号５２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
25. ４つ以上の置換を含む、請求項１～２又は１０～１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
26. ＴＨＶＡＬＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号５３）、ＴＫＶＲＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号５４）、ＴＮＶＡＬＥＫＲＤＶＡＬ（配列番号５５）、ＥＨＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号５６）、ＥＰＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号５７）、ＮＨＶＡＬＷＫＲＱＶＴＬ（配列番号５８）、ＲＳＶＲＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号５９）、ＲＫＶＲＶＥＫＲＤＶＴＬ（配列番号６０）、ＲＫＶＲＶＥＫＲＱＬＴＬ（配列番号６１）、及びＲＫＶＡＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号６２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の融合ポリペプチド。
27. ５つ以上の置換を含む、請求項１～２又は１０～１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
28. アミノ酸配列ＲＫＶＲＶＥＫＲＤＬＴＬ（配列番号６３）を含む、請求項２７に記載の融合ポリペプチド。
29. Ｘ_１及びＸ_２が、ＫＫ、ＲＲ、ＫＲ、及びＲＫからなる群から選択される、請求項１～２又は１０～１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
30. 前記アミノ酸配列が、１種以上のプロテアーゼによって完全に切断される、請求項１～２９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
31. 前記プロテアーゼが、Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６１）である、請求項３０に記載の融合ポリペプチド。
32. シグナル配列をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
33. 前記シグナル配列をコードするポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に位置する、請求項３２に記載の融合ポリペプチド。
34. 担体タンパク質をコードするポリペプチドをさらに含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
35. 前記担体タンパク質をコードするポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に位置する、請求項３４に記載の融合ポリペプチド。
36. 前記担体タンパク質をコードするポリペプチドが、シグナル配列をコードするポリペプチドに隣接している、請求項３４又は請求項３５に記載の融合ポリペプチド。
37. 前記担体タンパク質が、ＣＢＨ１又はその断片を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
38. 対象となるポリペプチドをさらに含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
39. 前記対象となるポリペプチドをコードするポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に位置する、請求項３８に記載の融合ポリペプチド。
40. 前記対象となるポリペプチドが、酵素である、請求項３８又は請求項３９に記載の融合ポリペプチド。
41. 前記酵素が、活性又は不活性な炭水化物分解酵素、プロテアーゼ、リパーゼ、及び細胞溶解酵素からなる群から選択される酵素である、請求項４０に記載の融合ポリペプチド。
42. 前記対象となるポリペプチドが、治療用タンパク質である、請求項３８又は請求項３９に記載の融合ポリペプチド。
43. 前記治療用タンパク質が、抗体又はその機能性断片である、請求項４２に記載の融合ポリペプチド。
44. 前記抗体が、軽鎖又は重鎖モノクローナル抗体である、請求項４３に記載の融合ポリペプチド。
45. 前記シグナル配列がＣＢＨ１シグナル配列であり、前記担体タンパク質がＣＢＨ１含有担体タンパク質であり、前記対象となるポリペプチドが抗体軽鎖又はその機能性断片である、請求項４２又は請求項４３に記載の融合ポリペプチド。
46. 前記シグナル配列がＣＢＨ１シグナル配列であり、前記担体タンパク質がＣＢＨ１含有担体タンパク質であり、前記対象となるポリペプチドが抗体重鎖又はその機能性断片である、請求項４２又は請求項４３に記載の融合ポリペプチド。
47. 前記シグナル配列がＣＢＨ１シグナル配列であり、前記担体タンパク質がＣＢＨ１含有担体タンパク質であり、前記対象となるポリペプチドが抗体重鎖又はその断片及び抗体軽鎖又はその機能性断片である、請求項４２又は請求項４３に記載の融合ポリペプチド。
48. 前記抗体又はその機能性断片が、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、請求項４３に記載の融合ポリペプチド。
49. 前記抗体又はその機能性断片が、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、二重特異性抗体、直鎖抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体からなる群から選択される、請求項４３に記載の融合ポリペプチド。
50. 前記抗体又はその機能性断片が、抗ＲＳウイルス（ＲＳＶ）抗体、抗エボラウイルス抗体、抗凝集βアミロイド（Ａβ）抗体、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗体、抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗体、抗精子抗体（抗ヒト避妊抗原（ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ）（ＨＣＡ）抗体など）、及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である、請求項４３～４９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
51. 請求項１～５０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。
52. 請求項５１に記載の核酸をコードするベクター。
53. プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む、請求項５２に記載のベクター。
54. 請求項１～４８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、請求項４９に記載の核酸、又は請求項５２又は請求項５３に記載のベクターを含む宿主細胞。
55. 前記宿主細胞が、哺乳類宿主細胞、細菌宿主細胞、及び真菌宿主細胞からなる群から選択される、請求項５４に記載の宿主細胞。
56. 前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項５５に記載の宿主細胞。
57. 前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項５５に記載の宿主細胞。
58. 前記真菌細胞が、酵母細胞又は糸状菌細胞である、請求項５５に記載の宿主細胞。
59. 前記酵母細胞が、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種である、請求項５８に記載の宿主細胞。
60. 前記真菌細胞が、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の種、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の種、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）の種、グリオクラジウム属（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ）の種、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の種、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）の種、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の種、ボタンタケ属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）の種、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）の種、及びエメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）の種からなる群から選択される、請求項５５又は請求項５８に記載の宿主細胞。
61. 前記真菌細胞が、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ハルチアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、クロカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ）、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ショウユコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、及びアワモリコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）からなる群から選択される、請求項６０に記載の宿主細胞。
62. 請求項１～５０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを産生するための方法であって、請求項５４～６１のいずれか一項に記載の宿主細胞を、前記融合ポリペプチドの産生に適した条件下で培養することを含む方法。
63. 前記融合ポリペプチドを単離することをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
64. 前記融合ポリペプチドをプロテアーゼで切断することをさらに含む、請求項６２又は請求項６３に記載の方法。
65. 前記プロテアーゼが、Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６１）である、請求項６４に記載の方法。
66. 前記融合ポリペプチドの切断が、配列番号１のアミノ酸配列を欠く等価な融合ポリペプチドの切断と比較して増大される、請求項６４又は請求項６５に記載の方法。
67. 前記融合ポリペプチドの分泌が、配列番号１のアミノ酸配列を欠く等価な融合ポリペプチドの分泌と比較して増大される、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の方法。
68. 融合ポリペプチドを切断するための方法であって、請求項１～５０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを、プロテアーゼと接触させることを含む方法。
69. 前記プロテアーゼが、Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６１）である、請求項６８に記載の方法。
70. ａ）請求項１～５０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを産生するための書面の説明書；並びにｂ）以下のもの１）請求項５１に記載の核酸；２）請求項５２又は請求項５３に記載のベクター；及び／又は３）請求項５４～６１のいずれか一項に記載の宿主細胞、のうちの１つ以上を含むキット。
71. 以下のもの４）Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１．６１）を含む組成物；及び／又は５）Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼをコードする核酸、のうちの１つ以上をさらに含む、請求項７０に記載のキット。
72. Ｋｅｘ２セリンペプチダーゼを発現する宿主細胞をさらに含む、請求項７０又は請求項７１に記載のキット。
73. 以下のもの６）追加のプロテアーゼを含む組成物；及び／又は７）追加のプロテアーゼをコードする核酸、のうちの１つ以上をさらに含む、請求項７０～７２のいずれか一項に記載のキット。

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