JPH06319570A - 凝集反応測定用粒子の製造方法 - Google Patents
凝集反応測定用粒子の製造方法Info
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Abstract
NAより発現し、得られた抗原を結合した凝集反応用粒
子の製造方法を提供する。 【構成】 ポリリジンをコードする領域と、抗原をコー
ドする領域とを含むリコンビナントDNAよりポリリジ
ンを有する抗原を発現し、該ポリリジンを有する抗原
と、凝集反応測定用粒子とを結合させることにより凝集
反応測定用粒子を製造する。 【効果】 本発明によれば抗原力価が高く、非特異反応
が少ない凝集反応測定用粒子を安全且つ容易に又大量に
製造することができる。
Description
る領域と、抗原をコードする領域とを含むリコンビナン
トDNAよりポリリジンを有する抗原を発現し、該ポリ
リジンを有する抗原と、凝集反応測定用粒子とを結合さ
せることにより得られる凝集反応測定用粒子の製造方法
に関する。本発明により得られる凝集反応測定用粒子
は、凝集反応を用いた体外診断試薬等に有用である。
測定試薬は、抗原と凝集反応用粒子とが結合されて製造
されている。
ルモン、蛋白質、又はウイルス等の抗原成分をそのまま
凝集反応用粒子に結合させるか、化学的又は物理的手段
を用いて抗原成分を破壊して得られた断片の他、化学合
成等により得られた合成抗原を凝集反応用粒子に結合さ
せて凝集免疫測定試薬として用いている。
調製した凝集免疫測定試薬は、抗体が微量又は希薄な検
体の測定を行なう場合、抗原に対して非特異な反応が認
められ、陰性である検体を陽性と判定する等の問題があ
った。
ポリマーとを結合させ、このポリマーを介して免疫測定
用固相体に抗原を結合させた試薬が酵素免疫測定方法
(ELISA法)に用いられた。(ARELLE BA
ILLOU,BLANDINEJANVIER,GUY
LEONARD,FRANSOIS DENIS,A
LAIN GOUDEAU and FRANCIS
BARIN J.CLINI.MICROBIOLOG
Y,July 1991,p1387−1391)この
結果、抗原力価が上り、非特異反応が抑制される様にな
った。
するに当っては、抗原の調製と精製、ポリマーの調製と
精製をそれぞれ行なった後、抗原とポリマーとを適当な
方法を用いて結合し、更に精製を行なわなければなら
ず、操作が複雑であり、収率も低いなどの問題があり、
大量の試薬を調製することは困難である。
に結合させるポリマーとしてポリアミノ酸の一つである
ポリリジンを用いると抗原力価が高くなる事に注目し、
抗原をコードするDNAとポリリジンをコードするDN
AとからリコンビナントDNAを作製し、これを発現さ
せることによりポリリジンを有する抗原を一体で取得
し、これを凝集反応測定用粒子に結合することにより、
抗原力価が高く、非特異反応が少ない凝集反応測定用粒
子を安全且つ容易に又大量に製造できることを見い出
し、本発明を完成させた。
る領域と、抗原をコードする領域とを含むリコンビナン
トDNAよりポリリジンを有する抗原を発現し、該ポリ
リジンを有する抗原と、凝集反応用粒子とを結合させる
ことにより得られる凝集反応測定用粒子の製造方法であ
る。
抗原の一部又は全部をコードするDNA切片を得ること
ができるものであれば良く、HIV1,HIV2,HT
LV−I,HBV,HCV,トリポネーマ(TP),ス
トレプトリジン−O,マイコプラズマ等を挙げる事がで
きる。
片は、抽出法、化学合成法など既知の方法を用いて入手
することができる他、市販されているDNA切片を用い
ることもできる。又DNA切片の取得量が少ない場合
は、PCR法を用い充分な量のDNA切片に増幅して用
いることもできる。
A切片を、抗原蛋白の発現のため、適当なベクターに組
み込み、抗原リコンビナントベクターとした。
ベクターに組み込むに当っては、前記DNA切片を制限
酵素を用いて消化し、同様に処理したベクターにライゲ
ーションする方法を用いれば良い。制限酵素は、前記D
NA切片を組み込むベクターの位置に応じて1種又は2
種を選ぶことができる。
法によればよく、制限酵素処理した前記DNA切片と同
様に制限酵素処理したベクターをDNAポリメラーゼ存
在下反応させれば良い。
切片は、天然物由来のDNAより取得することもできる
が、化学合成により簡単かつ大量に調製することができ
る。
切片を化学合成により調製する場合は、DNA自動合成
機等を用いて調製することができる。ポリリジンをコー
ドする領域を含むDNA切片を合成するにあたっては、
ポリリジンをコードする塩基配列の3′下流側に制限酵
素により消化された切断部位の塩基配列を有する一本鎖
DNAと、これに相補性を有する一本鎖DNAを別々に
合成すれば良い。
端の制限酵素切断部位の塩基配列は、使用するベクター
に応じて選択される制限酵素に合わせることは言うまで
もない。
アニーリングを行ない、ポリリジンをコードする領域の
両端に制限酵素で消化された切断部位の塩基配列を有す
る二本鎖DNA切片を得る。
えば良く、例えばお互いに相補的な一本鎖DNAを含む
溶液を65℃程度に加温した後、室温に放置し、徐冷す
れば良い。
むDNA切片を、抗原リコンビナントベクターに組み込
み、ポリリジン結合抗原リコンビナントベクターとし
た。
切片を抗原リコンビナントベクターに組み込むに当って
は、抗原リコンビナントベクターを制限酵素で消化し、
DNAポリメラーゼを用いて前記DNA切片とライゲー
ションを行なえば良い。抗原リコンビナントを消化する
制限酵素は前記DNA切片の一方の切断部位の塩基配列
により定められる制限酵素を使用する事は言うまでもな
い。
抗原リコンビナントベクターを、蛋白発現のため、大腸
菌等に導入し、大腸菌の形質転換を行なう。形質転換さ
れた大腸菌を培養を行なった後大腸菌を回収し、化学的
又は物理的に破砕し、溶液相から発現蛋白を得る。
良く、例えば、カラム精製した後ゲルロ過するなどの方
法で精製できる。
応測定用粒子に結合して凝集免疫測定に用いることがで
きる。使用できる粒子としては、ゼラチン粒子、磁性粒
子、ポリスチレン等有機材料を核としたラテックス、ア
ルミナ等無機材料を核としたラテックス、赤血球等の細
胞類を用いることができる。又それぞれの粒子が磁気応
答性を持っても良い。
なった後、ポリリジン結合抗原を含む溶液を加え、ポリ
リジンをリンカーとして抗原を粒子に結合させる。以上
のようにして得られたポリリジンをリンカーに用いた抗
原結合粒子は、凝集免疫測定に有用である。
ドの調製 HIV−2ウイルスの膜蛋白質(gp36)の遺伝子の
クローニングと発現のため、HIV−2 GH−1株エ
ンブの539番目−666番目のアミノ酸をコードする
遺伝子の5′端および3′端にそれぞれ相当する 5′−TC GTC GAC GTG CAG CAA CAG CAA−3′ 3′−TGG AGG ACC TAG TTC GAG CTC CT−5′ をそれぞれ381A DNAシンセサイザー(アプライ
ド・バイオシステム社)で合成した。HIV−2遺伝子
はHIV−2 GH−1株が持続感染しているMOLT
−4/GH−1細胞株から調製した。細胞培養液を遠心
して細胞を採取し、トリス塩緩衝液(10mMトリスp
H8.0,1mM EDTA)に浮遊させた。ドデシル
硫酸ナトリウム(SDS)とproteinase K
をそれぞれ、最終濃度0.5%、100μg/mlにな
るように添加し55℃で1時間反応させた。続いて、フ
ェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行
なった後、TE緩衝液に浮遊させ、HIV−2遺伝子を
含むDNAを得た。これらのオリゴヌクレオチドと単離
したHIV−2遺伝子を含むDNAを用い、ポリメラー
ゼチェーン反応(PCR)(Randall K.et
al.,Science,USA,239,487−
491,1988)により目的とする領域の遺伝子を増
幅し断片として得た。この断片を、PCRに用いたオリ
ゴヌクレオチドに含まれているSalIとXhoIの制
限部位で切断し、市販のpGEMEX−1をNheIと
SacIで消化した後、T4DNAポリメラーゼで処理
しセルフライゲーションを行ないgene10領域を除
き、さらに、EcoT22IとHind3の間に翻訳終
止コドンを挿入したpWA53をSalIとXhoIで
消化し、これに結合させ、pHIV 2−10SXを作
成した。
ン付加プラスミドの調製ポリリジンを付加したリコンビ
ナントの発現のために、次の2種のオリゴヌクレオチド
を用いた。 5′− T (AAG)10 TAA GGTAC−3′ 3′−ACGTA (TTC)10 ATT C −5′ これらのオリゴヌクレオチドを制限酵素EcoT22I
と制限酵素KpnIの認識部位間に組み込み、AAGを
コドンとして利用するとC末にリジンが10個付加され
る。これらのオリゴヌクレオチドは381A DNAシ
ンセサイザーで合成した。合成された2種のオリゴヌク
レオチドを混合し、65℃で5分間加温した後、30分
間室温に放置しゆっくり冷却し挿入断片を作成した。H
IV−2エンブの一部を産生するプラスミドpHIV
2−10SXを制限酵素EcoT−22IとKpnIで
消化し、調製したオリゴヌクレオチド断片を結合させ、
pHIV2−10 K10を作成した。
ラーゼがlacのプロモーターで制御されている大腸菌
JM109(DE3)にトランスフォームし、pHIV
2−10sx/JM109(DE3)を得た。pHIV
2−10sx/JM109(DE3)を50μg/ml
ampicilin M9CA培地(以下M9CA培
地と言う)で37℃、16時間振とう培養した後、等量
のM9CA培地を加え37℃、2時間培養した。IPT
Gを50mMになるように培養液に加え、さらに、37
℃、2時間培養し目的とする蛋白を発現誘導した。
収し、TNE緩衝液(50mM トリス pH8.0,
100mM Nacl,1mM EDTA)に浮遊させ
た。400mg/lとなるようにリゾチームを加え、3
7℃、30分加温した後、1時間4℃ SONIFIE
R CELLD ISRUPTOR 185(BRAN
SON社製)で、超音波処理を行ない大腸菌を破砕し
た。遠心分離により沈渣を回収し、8M尿素で溶解し
た。ハイドロキシアパタイトカラム(BioRad社
製)で精製した後、セファロースCL−6Bカラムでゲ
ル濾過を行い、単一ピークのものを得た。
たゼラチン粒子を5%濃度になるようにpH7.2のリ
ン酸緩衝生理食塩水(以下PBSと言う)に分散し、そ
の溶液10mlをタンニン酸を含むpH7.2のPBS
10mlと混合した。この混合液を37℃で10分間加
温後、遠心分離により粒子を回収し、さらに生理食塩水
により洗浄した。この粒子を5%の濃度になるようにP
BS(pH6.4)に分散し、タンニン酸処理ゼラチン
粒子分散液を得た。この中からタンニン酸処理ゼラチン
粒子分散液10mlをとり、実施例 で製造したポリリ
ジン付加HIV−2 エンブ溶液10mlを加え混合し
て37℃で60分間加温した。その後、粒子を生理食塩
水で充分洗浄し、分散液に浮遊させて凍結乾燥し、抗H
IV−2抗体検出用粒子(粒子B)を得た。上記と同様
な方法で、ポリリジンが付加されていないHIV−2
エンブペプチドと粒子とを結合して抗HIV−2抗体検
出用粒子(粒子A)を得た。
粒子A,Bに蒸留水を加えて復元し、HIV−2抗体陽
性血清についてマイクロタイタープレート法で力価を測
定した。その結果を表1に示した。表1に示したよう
に、ポリリジンを付加した抗原を用いた粒子では、付加
しない粒子に較べ、4−8倍高い力価を示した。 表 1 検 体 感 染 粒子A 粒子B NO. 最終希釈倍数 1 感 染 64000 256000 2 感 染 32000 128000 3 感 染 2000 16000 4 感 染 2000 8000 5 感 染 16000 84000 6 非感染 <32 <32 7 非感染 <32 <32
応が少ない凝集反応測定用粒子が提供された。本発明の
凝集反応測定用粒子はポリリジンを有する抗原をリコン
ビナントDNAより発現することを特徴とし、これを凝
集反応測定用粒子に結合しているため、感染性を有する
抗原を扱うことがなく、安全で容易且つ大量に凝集反応
測定用粒子を製造することができる。
Claims (2)
- 【請求項1】 ポリリジンをコードする領域と、抗原を
コードする領域とを含むリコンビナントDNAよりポリ
リジンを有する抗原を発現し、該ポリリジンを有する抗
原と、凝集反応測定用粒子とを結合させることにより得
られる凝集反応測定用粒子の製造方法。 - 【請求項2】 ポリリジンが5つ以上のリジンからなる
請求項1記載の方法。
Priority Applications (1)
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---|---|---|---|
JP13409393A JP3254815B2 (ja) | 1993-05-13 | 1993-05-13 | 凝集反応測定用粒子の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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---|---|---|---|
JP13409393A JP3254815B2 (ja) | 1993-05-13 | 1993-05-13 | 凝集反応測定用粒子の製造方法 |
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Publication Number | Publication Date |
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JPH06319570A true JPH06319570A (ja) | 1994-11-22 |
JP3254815B2 JP3254815B2 (ja) | 2002-02-12 |
Family
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JP13409393A Expired - Fee Related JP3254815B2 (ja) | 1993-05-13 | 1993-05-13 | 凝集反応測定用粒子の製造方法 |
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JP (1) | JP3254815B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018037742A1 (ja) * | 2016-08-23 | 2018-03-01 | 日立化成株式会社 | 吸着材 |
-
1993
- 1993-05-13 JP JP13409393A patent/JP3254815B2/ja not_active Expired - Fee Related
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CN109153006A (zh) * | 2016-08-23 | 2019-01-04 | 日立化成株式会社 | 吸附材料 |
TWI660774B (zh) * | 2016-08-23 | 2019-06-01 | 日商日立化成股份有限公司 | 吸附材料 |
US10898878B2 (en) | 2016-08-23 | 2021-01-26 | Showa Denko Materials Co., Ltd. | Adsorbent material |
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