JPH06505639A

JPH06505639A - 組換えＦＩＶ糖タンパク質１６０及びｐ２４ＧＡＧタンパク質

Info

Publication number: JPH06505639A
Application number: JP4509667A
Authority: JP
Inventors: ヤング，イーライ; デイビス，デボラ; ストーリー，ジェイムズ・アール; ベルツ，ジェラルド
Original assignee: ケンブリッジ・バイオテック・コーポレイション
Priority date: 1991-02-28
Filing date: 1992-02-27
Publication date: 1994-06-30
Also published as: EP0573616A1; WO1992015684A1; CA2104285A1; US6228608B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】４７、請求項４６に記載の形質転換細胞をＦＩＶｇａｇｏ、６断片を発現できる条件下で培養し、該断片を回収することを特徴とするＦＩＶｇａｇｏ、６断片の生産方法。

４８、該ＤＮＡ配列がバングストン株から誘導されたものである請求項４７に記載の方法。

４９、請求項４１に記載のＦＩＶｇａｇｏ、６断片に対する抗体。

５０、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗−イディオタイプ抗体、及び抗抗−イディオタイプ抗体の中から選ばれる請求項４９に記載の抗体。

５１、ネコにおけるＦＩＶに対する抗体の産生を誘導するのに有用である医薬組成物の調製方法であって、ＦＩＶｇａｇｏ、６断片のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの免疫学的に有効な量を製薬的に許容され得る担体と混合することを特徴とする方法。

５２、請求項４１に記載のＦＩＶｇａｇＱ、５断片を含有するＦＩＶ感染を予防するための医薬組成物。

５３、ＦＩＶに対してネコを免疫するための組成物を調製する際における請求項５２に記載の医薬組成物の使用。

５４、試料中のＦＩＶ抗体を検出するためのキットであって、第１の容器手段が固相免疫吸着剤に固定化されている請求項１．２．２９又は４１のいずれかに記載のペプチド断片を含有しており、第２の容器手段がＦＩＶ抗体に対する検出可能に標識されている抗−抗体を含有している、閉じた状態の１つ又はそれ以上の容器手段を収納するために区画化されている担体を包含するキット。

５５、試料中のＦＩＶウィルス又はそのタンパク質を検出するためのキットであって、第１の容器手段が固相免疫吸着剤に固定化されている請求項１１．１２．３６又は４９のいずれかに記載の抗体を含有しており、第２の容器手段が該第１抗体に対する検出可能に標識されている抗−抗体を含有している、閉じた状態の１つ又はそれ以上の容器手段を収納するために区画化されている担体を包含するキット。

５６、バングストン株の請求項５又は６に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含有するプラスミド。

明　細　書発明の名称組換えＦＩＶ糖タンパク質１６０及びｐ２４ＧＡＧタンパク質発明の分野本発明は一般に、血液学、免疫学及び組換え遺伝子の分野に属す。詳細には、本発明は組換えネコ免疫不全症ウィルス糖タンパク質１６０エンベロープタンパク質及びその断片、並びにｐ２４ｇａｇタンパク質及びその断片に関する。別の態様として、本発明はＦＩＶに対する抗体をネコにおいて誘発させるためにＦＩ■ 抗原及びその断片を使用することに関する。

従来技術の説明正式にはネコＴリンパ趨向性レンチウィルスと呼ばれるネコ免疫不全症ウィルス（Ｆ　Ｉ　Ｖ）　［Ｐｅｄｅｒｓｏｎら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３５ニア９０（１９８７）］は米国、英国（Ｉｌａｒｂｏｕｒら、Ｗｅｔ　Ｒｅｃ、　１２２：８４（１９８８））　、日本Ｑｓｈｉｄａら、　Ｊｐｎ　Ｊ　Ｙｅｔ　Ｓｃｉ、　５Ｑ：３９（１９８８））　、オ[ストラリア（Ｓａｂｉｎｅら、　Ａｕ５ｔ　Ｙｅｔ　Ｐａｒａｃｔｉｔ、　１８：１０５１０５（１９８、及びニューシーラント（Ｓｗｉｎｎｅｙら、　ＮＺ　Ｎｅｔ　Ｊ、　３７：４１（１９８９））にて同定された。このウィルスは水平伝播、主として咬傷によって蔓延するようである［Ｙａｍａｍｏｔｏら、＾ｔ　Ｊ、　Ｙｅｔ、　Ｒｅｓ、　、　８　：　１２４６（１９８８）　；　Ｆｒ１ｅｎｄら、Ａｕ５ｔＪｅｔ　Ｊ、、６７：２３７（１９９０）］　、　Ｆ　Ｉ　Ｖはレトロウィルス科に属するレンチウィルス亜科の一員として分類されている。これは、ヒト及びサル免疫不全症ウィルス、ウマ感染性貧血、ヒツジのマエディ、ビスナ、及びヤギ関節炎、脳炎ウィルス（ＣＡＥＶ）を包含する科である。

ＦＩＶのクローニング及び配列決定により、ビスナウィルス及びＣＡＥＶとの外被タンパク質の抗原類似性及びゲノム配向性によってそれはレンチウィルスと確認された［０１ｍ５ｔｅｄら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｉｌ、　Ｓ、　Ａ、　、　８６　：　２４４８（１X８９）　；　Ｔａ１ｂｏｔｔら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　８６：５７４３（１９８９）　；　Ｄｏｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ@ｏｆ　Ａｃｑｕｉｒｅｄ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ、　３：６５８（１９９０）］。

しかし、ネコ免疫不全症ウィルスの外側殻、即ちエンベロープに関する情報は現在までのところ殆ど入手されていない。ＦＩＶの免疫学的特性を理解し調節するにはエンベロープタンパク質の解明は非常に有益であるので、そのようなデータはなお要求されている。

発明の概要即ち、本発明者らはＦＩＶの免疫状態の診断及び処置に有用である、新規なエンベロープタンパク質及びそのタンパク質断片のクローニング及び発現に成功した。詳細には、本発明者らはＦＩＶ糖タンパク質１６０エンベロープタンパク質、及びＦＩＶｇｐ１６０エンベロープタンパク質の増幅産物であるＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質を報告するものである。また、ＦＩＶエンベロープの６９９６から８１２９領域から入手される増幅産物である新規なＦＩＶｌ、２エンベロープタンパク質を報告するものである。

新規なエンベロープタンパク質及びその断片に加え、本発明者らは、これもＦＩＶの診断及び処置に有用である、ＦＩＶ由来のｐ２４ｇａｇタンパク質の同定に成功した。さらに、本発明者らは、ＦＩＶｇａｇタンパク質から入手される増幅産物であるＦＩＶｏ、６も同定した。

次ぎに、本発明の目的はＦＩＶによるネコの感染を診断するための方法を提供することである。このような本発明により、ネコ免疫不全症候群の研究及び治療に重要な利便が提供される。

本明細書に記載する研究によって、組換えＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質を形質転換細胞から発現させ得ることが証明された。組換えＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質の調製はＦＩＶの新たな検定及び処置を可能にする。従って、本発明の目的は、ネコにおけるＦＩＶ感染を提示させるワクチンの開発にｇｐ１６０エンベロープタンパク賀及びｇａｇタンパク質由来の組換えタンパク質を使用することにある。

本発明は１つの態様として、機能的に活性な組換えネコ免疫不全症ウィルス０゜４エンベロープタンパク質、又はその機能的もしくは化学的誘導体を提供するものである。

本発明はまた別の態様として、真核生物細胞から産生されるＦＩＶｇｐ１６０誘導化０，４工ンベロープ断片を提供する。また、本発明の１態様はプラスミドｐＬｃＢｃＯＦＩＶ０．４を包含スル。サラニ本発明ハ、ｇｐ１６０誘導化０゜４工ンベロープ断片を発現できる条件下に形質転換細胞を培養し、該ｇｐ１６０誘導化０．　４エンベロープタンパク質を回収することを特徴とする、ＦＩＶｇｐ１６０誘導化０．４エンベロープタンパク質の製造方法を提供する。

別の態様として本発明は、本発明のＦＩＶエンベロープタンパク質に対する抗体を提供する。

さらに、本発明は、試料を本発明抗体と接触させ、該抗体とＦＩＶとの間で複合体を試料で形成させ、次いで該抗体からＦＩＶを取り出して精製ＦＩＶを入手することを特徴とする、試料からＦＩＶを精製する方法を提供する。

さらに、本発明は、試料中のＦＩＶを検出するための方法であって、抗体を検出可能に標識し、試料中のＦＩＶと該検出可能に標識した抗体との間で複合体を形成させ、次いで複合化した、又は複合化していない検出可能に標識された抗体を検出することを特徴とする方法を提供する。

本発明はさらなる態様として、本発明の抗体を含有する医薬調製物を提供する。

別に、ＦＩＶに対する抗体の産生をネコ内にて誘導するのに有用である医薬組成物の調製方法であって、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０又はＦＩＶエンベロープタンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドの免疫学的に有効な量を製薬的に許容され得る担体と混合することを特徴とする方法をも提供する。

上記した本発明の態様及び別の際限のない態様は、当業者ならば、本発明の詳細な説明する以下の記載から明らかであろう。

第１図はＰＣＲプライマーの配列を示すものである。下線領域はＢａｍＨＩ制限部位を表している。

第２図は全ｇｐ１６０エンベロープタンパク質に相当する０、４増幅産物の位置を示すものである。

第３図はＦＩＶから精製された組換えタンパク質を示すものである。レーン１は分子量マーカーを含むレーンである。レーン２はＦＩＶエンベロープ遺伝子のｇｐ１２０領域由来の組換えタンパク質である。レーン３は組換えＦＩＶｐ２４ｇａｇタンパク質である。レーン４はＦＩＶｏ、４工ンベロープ診断タンパク質を含んでいる。

第４図は誘発されたＦＩＶｏ、４タンパク質によって感染されたネコ由来の血清の反応性を示すものである。レーン１−１０は、そのタンパク質がＦＩＶ感染ネコ由来の血清と特異的に反応したことを証明するものである。レーン１１−１５はネガティブ対照である。

好ましい態様の説明以下の説明では、分子生物学及び免疫学の領域の当業者に知られている種々の手法を引用している。既知の手法が記載されている引用する文献及び他のものは引用によってその全体が完全に記載されているものとして本明細書中に包含される。

組換えＤＮＡ技術の一般的な原理が記載されている標準的な参照研究には、１ａｔｓｏｎ、　Ｊ、　Ｄ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、　Ｉ及びＩｌ巻、　Ｔｈｅ　Ｂｅｎｊａｍ奄氏^Ｃｕｎ＋ｉｎｇｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｉｎｃ、　、出版社、　１ｌｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、ｃＡ　（１９８７）　；　Ｄａｒ獅■撃戟A　Ｊ、Ｅ。

ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ、Ｉｎｃ、、　出版社、@ＮｅｗＹｏｒｋ、　Ｎ、　Ｙ、　（１９８６）　；　Ｌｅｗｉｎ、　Ｂ、　Ｍ、　、　Ｇｅｎｅｓ　Ｉｌ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓA出版社、ＮｅｗＹａｒｋ、　Ｎ、　Ｙ、（１９８５）　；　Ｏｌｄ、　Ｒ，Ｗ、ら、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：@Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　２版、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅｓ刀A出版社、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ　（１９８１）　：及びＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、　１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌ≠ｂ盾窒≠煤B ｌｙ　１ｌａｎｕａｌ、　２版、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　出版社、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ奄獅■@Ｂａｒｂａｒ、　ＮＹ　（１９８９）。

定　義本発明に関して使用している「免疫学的に有効な量」なる用語は、ＦＩＶエピトープに結合する抗体の産生をネコ内にて誘発させるのに必要であるＦ　Ｉ　ＶＱ。

４エンベロープタンパク質又はＦＩＶｇｐ１６０もしくはＦＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質又はＦＩＶｏ、６ｇａｇ断片の量を規定する意味を有する。

「クローニング」とは、特定の遺伝子又は他のＤＮＡ配列をベクター分子に挿入するためにインビトロ組換え手法を使用することを意味する。所望の遺伝子のクローニングを成功させるには、ＤＮＡ断片を作成し、その断片をベクター分子に結合させ、得られた組み立てＤＮＡ分子をそれを複製できる宿主細胞に導入し、そして受容宿主細胞の中から標的遺伝子を有するクローンを選択するための各方法を使用する必要がある。

「ベクター」とは、ＤＮＡ断片が挿入又はクローンできるプラスミド又はバクテリオファージから誘導されるＤＮＡ分子を意味する。ベクターは１つ又はそれ以上の独特な制限部位を含有しており、特定の宿主又はビヒクル生物において自律的に複製することができ、その結果クローンされた配列は複製されることになる。従って、ｒＤＮＡ発現ベクター」とは、自律的要素であって付加的なりＮＡ配列が当該要素のゲノムに組み込まれた後に宿主の染色体とは独立して宿主内において複製できる自律的要素を意味する。このようなりＮＡ発現ベクターには細菌プラスミド及びファージがある。

「実質的に純粋」とは、本発明の抗原又はこのような抗原をコードする遺伝子であって、それぞれ他の抗原又は遺伝子、あるいは天然であれば通常認められ得る他の夾雑物を本質的に含まない、天然では見いだされない形態で存在しているような抗原又は遺伝子。「機能的な誘導体」とは、分子の「断片」、「変異体」、「同族体」又は「化学的誘導体」を意味する。本発明のＤＮＡ配列のいずれかのような分子の「断片」とは、分子のあらゆるヌクレオチド・サブセットを表すのに用いられる。このような分子の「変異体」とは、全分子又はその断片のいずれかに実質的に類似している天然に存在する分子を表す。分子の「同族体」とは、全分子又はその断片のいずれかに実質的に類似している天然に存在していない分子を表す。

分子が他の分子と「実質的に類似している」と言われるのは、両分子のアミノ酸配列が実質的に同じ場合である。実質的に類似しているアミノ酸分子は類似した生物活性を有する。従って、２つの分子において１つの分子が他の分子に見いだされない付加的なアミノ酸残渣を含有しており、又はそれらのアミノ酸残渣の配列が同一でなくても、それらの両分子が類似の活性を有する場合は、それらは本明細書にて使用する用語としての変異体と考える。本明細書にて使用しているように、ある分子が通常は他の分子の一部ではない付加的な化学的部分を含有する場合、その分子はその他の分子の「化学的誘導体」と呼ぶ。このような部分は分子の溶解性、吸収、生物学的半減期などを改善することができる。この部分はまた、分子の毒性を減少させ、その分子の望ましくない副作用を削除又は減衰させる場合などがある。このような効果を媒介できる部分は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　１６版、　１ｌａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、　、　Ｅａｓｔｏｎ、　Ｐｅ獅氏A　（１９８０）に記載されている。

同様に、本発明にかかるＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質、ＦＩＶｌ、２エンベロープタンパク質又はＦＩＶｏ、６断片の遺伝子の「機能的誘導体」とは、ヌクレオチド配列が「実質的に類似であること」ができ、かつＦＩＶｏ、４ペプチドに類似した活性を有する分子をコードするその遺伝子の「断片」、「変異体」又は「同族体」を包含する意味を有する。

このように本明細書では、ＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質、ＦＩＶＩ。

２エンベロープタンパク質及びＦＩＶｏ、６も同様に、ペプチドＦＩＶ０．４、ＦＩＶｌ、２及びＦＩＶｏ、６と「実質的に類似であること」ができ、かつ類似活性を有する機能的誘導体、断片、変異体、同族体、化学的誘導体を包含する意味を有する。

本発明のＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質、ＦＩＶｌ、２エンベロープタンパク質又はＦＩＶｏ、６断片をコードするＤＮＡ配列、又はその機能的な誘導体は、連結のための平滑末端又は粘着末端、適当な末端を提供する制限酵素消化、適当な粘着末端の充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、及び適当なりガーゼによる連結、などの常法に従ってベクターＤＮＡに組み換えることができる。このような操作の手法はＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、（前掲）に記載されており、当業者に周知である。

ＤＮＡなどの核酸分子は、転写及び翻訳調節情報を含有するヌクレオチド配列を含有し、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と「作動可能に結合」していれば、そのポリペプチドを「発現できる」と言われる。作動可能な結合とは、調節ＤＮＡ配列及び発現させようとするＤＮＡ配列が遺伝子を発現できるように連結されている結合である。遺伝子発現のために必要な調節領域の正確な種類は生物間で変動する場合があるが、一般には原核生物の場合、プロモーター（ＲＮＡ転写を開始させる）、及びＲＮＡに転写されるとタンパク質合成の開始を信号するＤＮＡ配列の両者を含有するプロモーター領域が含まれている。このような領域は普通、転写及び翻訳の開始に関与する５゛−非コード化配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などが含まれる。

要すれば、タンパク質をコードする遺伝子配列の３°非コード化領域を上述の方法によって入手すればよい。この領域はその転写終止調節配列、例えば終止及びポリアデニル化などのために保持させればよい。従つて、タンパク質をコードするＤＮＡ配列に天然にて隣接する３゛領域を保持させることによって、この転写終止シグナルを提供することができる。転写終止シグナルが発現宿主細胞において満足の行くほどに機能しない場合は、その宿主細胞にて機能する３′隣接と置換すればよい。

２つのＤＮＡ配列（例えば、プロモーター領域配列及びＦＩＶｏ、４エンベロ− プをコードする配列）の間における結合の種類が、（１）フレームンフト突然変異の導入にならず、（２）、ＦＩＶＱ、４工ンベロープタンパク質遺伝子配列を転写させるプロモーター領域配列の転写能を妨害せず、又は（３）プロモーター領域配列によって転写されるＦＩＶｏ、４工ンベロープ遺伝子配列のその被転写能を妨害しなければ、それら２つのＤＮＡ配列は作動可能に連結されていると呼ばれる。プロモーター領域は、プロモーターがＤＮＡ配列を転写できるならば、そのＤＮＡ配列と作動可能に連結されている。従って、タンパク質を発現させるためには、適当な宿主によって認識される転写及び翻訳シグナルが必要である。

本発明は、ＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質、ＦＩＶｌ、２エンベロープタンパク質、及びＦＩＶｏ、６ｇａｇ断片（又はその機能的な誘導体）の原核生物又は真核生物細胞における発現も包含している（原核生物における発現が好ましい）。

本発明の抗体は種々の方法によって調製することができる。例えば、Ｆ　Ｉ　Ｖｏ。

４エンベロープタンパク質又はその機能的誘導体を発現する細胞を動物に投与し、そのキメラと結合できるポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導すればよい。

好ましい方法では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体はハイブリドーマ手法によって製造することできる［Ｋｏｈｌｅｒら。

Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５（１９７５）　：　Ｋｏｈｌｅｒら、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　ｊ２：５１［１９７６）　：　jｏｈｌｅｒら、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｊ＞＝２９２（１９７６）　；　ＨａＩＩＩＩＩ＋ｅｒｌｉｎｇら、Ｉｎ：　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂ盾р奄■刀@ａｎｄ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ、Ｙ、、　５６３−６８１頁（１９８１）コ。一般に、このような操作には、ＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質抗原による動物の免疫が包含される。

このような動物の牌細胞を抽出し、適当なミエローマセルラインと融合させる。

本発明では、適当なミエローマセルラインを使用することができる。融合した後、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地中に選択的に維持させ、次いでＷａｎｄｓ。

検定し、ＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質抗原と結合できる抗体を分泌するクローンを同定する。

本発明の抗体はポリクローナル抗体、又は好ましくは領域特異的なポリクローナル抗体であってもよい。

本発明のＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質、ＦＩＶＩ、２エンベロープタンパク質及びＦＩＶｇａｇｏ、６タンパク質に対する抗体は、前サンドイッチ、逆サンドイッチ、及び同時サンドイッチ検定などの免疫測定又は「サンドイッチ」検定など、当業者に知られている標準的な免疫診断検定の使用に充分適している。

本発明の抗体はレセプター領域又はその等個物に対する許容され得る特異性、感度及び精度をもった免疫検定が可能であるか否かが理不尽な実験は必要とすることなく当業者に決定され得るんどえ、あらゆる数の組合わせ物でも使用することができる。

免疫学の一般的原理を説明する標準的参考文献には、Ｒｏｉｔｔ、Ｉ、、　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｉｓｍｕｎｏｌｇｙ、　５版、Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、出版社、オックスフォード（１９８ｇ）　：　Ｋｉｍｂａｌｌ、　Ｊ、　？、　、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｉｍｍｕｎｏｌｇｙ、２版、Ｍａｃｍｉｌｌａ氏@Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、　、出版社、ニューヨーク（１９８６）　；　Ｒｏｉｔｔ、　Ｌら、　Ｉｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｇｏｗｅｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｌｔｄ、　、出版社、ロンドン（１９８５）　；　Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ａ、　、　”１ｌｏｎｏｃｌｏｎ≠戟@Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、”　ｉｎ、Ｂｕｒｄｏｎ、Ｒ，ら編、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏモ■■高■ ｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１３巻、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、出版社、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　（１９８４）@；　Ｋｌｅｉｎ、Ｊ、、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：　Ｔｈｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　５ｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ　Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ、@Ｊｏｈｎ　ｆｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、出版社、ニューヨーク（１９８２）　；及びＫｅｎｎｅｔｔ、　Ｒ，ら編、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｔｂｏｄｉｅｓ、　Ｈｙｂｒｉｄｏ＠ａ：　Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｅｓ、　Ｐ１■獅普{ｅ　ＰｒｅｓＳ、出版社、ニューヨーク（１９８０）。

「検出」とは、ある物質の存在又は不存在を決定し、又は物質の量を定量することを包含するものである。従って、この用語は、定性及び定性測定のための本発明の物質、組成物及び方法の使用を意味している。

本明細書に記載しているものと同じ特異性を有するモノクローナル抗体を分泌する他のハイブリドーマは抗−イディオタイプスクリーニングの手法によって単離することができる。Ｐｏｔｏｃｍｊａｋら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２１５：１６３７（１９８２）。簡単に説明すると、抗−イディオタイプ抗体は、目的のクローンから産生される抗体に存在する独特の決定基を認識する抗体である。抗−イディオタイプ抗体は、モノクローナル抗体の供給源として使用しているものと同じ種の動物を目的のモノクローナル抗体で免疫することによって製造される。免疫された動物は、これらのイディオタイプ決定基に対する抗体（抗−イディオタイプ抗体）が産生されることによって、免疫した抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに応答する。

複製のためには、雑種細胞をインビトロ及びインビボの両方で培養すればよい。

高いインビボ産生はこのための本発明の好ましい培養方法である。簡単に説明すると、個々の雑種株から得た細胞をブリスタンでプライムしたＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注入し、高濃度の所望のモノクローナル抗体を含有する腹水を製造する。アイソタイプＩｇＭ又はＩｇＧのモノクローナル抗体を、当業者に周知のカラムクロマトグラフィーによって培養上清から精製すればよい。

本発明の抗体は、液相又は固相担体に結合して利用できる免疫検定に使用するのに特に適している。さらに、これらの免疫検定の抗体は種々の方法によって検出可能に標識することができる。

当業界では、種々の異なる標識物及び標識するための方法が知られている。本発明に使用できる標識物のタイプには、放射性同位元素、蛍光性化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、及び金属キレートなどがあるが、これらに限定されない。当業者ならば、抗体に結合するのに適した他の標識物を知っており、又は常套手段によってこれらを捜し出すことができよう。さらに、これらの標識物と抗体との結合は、当業者に周知の手法によって行うことができる。

本発明の抗体を検出可能に標識できる１つの方法は、その抗体を酵素に結合することである。この酵素は、後にその基質に暴露すると、例えば分光測定又は蛍光方法などによって検出できる化学的部分を提示するようにその基質と反応する。

検出可能に抗体を標識できる酵素としては、マレートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカス・ヌクレアーゼ、デルタ−■−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチン−アビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ｖＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼなどが挙げられる。

検出可能に標識された抗体の存在は、抗体を放射性同位元素で標識し、次いでガンマカウンター又はシンチレーションカウンターを用いるなどの手段によって測定することによっても検出することができる。本発明の目的にとって特に有用な同位元素は”Ｈ，”’Ｉ、”Ｐｓ　３ｓＳ、”Ｃ，”Ｃｒｓ　”ＣＩ、！？（ｏ、　Ｉｌｇ（：ｏ、”Ｆｅ及び７１Ｓｅである。

検出可能に標識された抗体の結合は、その抗体を蛍光性化合物で標識することによって検出することもできる。蛍光的に標識された抗体を適当な波長の光りに暴露すると、その存在は色素の蛍光によって検出することができる。最も普通に使用される蛍光性標識化合物の中にはフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、０−フタルデヒド及びフルオレスカミンがある。

本発明の抗体は蛍光放出金属、例えば！５２Ｅｕ、又はランタニド系列の他の金属を用いても検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレン− トリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を用いて抗体分子に結合することができる。

また、抗体は化学発光化合物とカップリングすることによっても検出可能に標識することができる。そうすれば、化学反応の経過時に発生する発光の存在を検出することにより化学発光勧賞によって標識された抗体の存在は測定される。特に有用な化学発光標識化合物としては、ルミノール、イソルミノール、サーモチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、オキサレートエステル、及びジオキセタン（ｄｉｏｘｅｔａｎｅ）などが挙げられる。

同様に、本発明の抗体を標識するには生物発光化合物を使用できる。生物発光物質は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増大させる生物系に見いだされるタイプの化学発光物質である。生物発光性抗体の存在は、発光の存在を検出することにより測定される。標識の目的にて重要な生物発光化合物にはルシフェリン、ルシフェラーゼ及びアエクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）などがある。

本発明の実質的に精製された抗原及び抗体はキットの調製に理論上適している。

このようなキットは、使用する検定の分別要素を含有する容器手段であるバイアル、チューブなどの１つ又はそれ以上の容器手段を閉じられた部屋に受けるために区切られている担体手段を包含できる。

キット形態に導入できるタイプの検定は多く、例えば競合及び非競合検定などがある。本発明の抗体を利用できる典型的な検定としてはラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）　、酵素免疫検定（Ｅ　Ｉ　Ａ）　、酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、及び免疫測定又はサンドイッチ免疫検定などが例示される。

「免疫測定検定」又は「サンドイッチ免疫検定」なる用語は、同時サンドイッチ、前サンドイッチ及び逆サンドイッチ免疫検定を包含する意味を有する。これらの用語は当業者に充分知られている。当業者ならばまた、本発明の抗体が現在知られている又は将来開発され得る他の検定形態及び変法にも有用であることが理解されよう。これらも本発明の範囲内に包含されるものとする。

検定を行うための好ましい態様では、特定の「ブロッカ−」をインキュベート媒質中に存在させること（通常は標識された可溶性抗体と共に加える）が重要である。この「ブロッカ−」は、実験試料中に存在するマウス免疫グロブリンに対するネコ抗体、プロテアーゼ又は非特異的タンパク質が固相支持体の抗体又は放射標識化指示抗体と交叉連結又はそれらを破壊し、偽陽性又は偽陰性の結果を与えないように加える。従って、「ブロッカ−」の選択は、本明細書に記載の検定の特異性を実質的に増加させる。

検定に使用されるものと同じクラス又はサブクラス（アイソタイプ）の多くの非相当（即ち、非特異的）な抗体（例えば、ＩｇＧ、、ＩｇＧ、、、ＩｇＭなど）がこの「ブロッカ−」として使用できる。「ブロッカ−」の濃度（通常は１−１００μｇ／μｌ）は、適切な感度を維持させ、ネコ血清中において相互に交叉反応す゛るタンパク質による望ましくない妨害を抑制するために重要である。さらに、「ブロッカ−」を含有する緩衝系は最適化する必要がある。好ましい緩衝液は生理学的ｐＨ範囲にて、弱有機酸、例えばイミダゾール、ＨＥＰＰＳＳＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＲｌ５などを基礎としているものである。若干望ましくない緩衝液は、リン酸、ホウ酸又は炭酸などの無機緩衝液である。最後に、「ブロッカ−」を含有する緩衝液には、既知のプロテアーゼインヒビターを加えるべきである（通常は０．０１−１０μｇｋｌ）。

本発明に使用され、利用できる多くの固相免疫吸着剤がある。周知の免疫吸着剤にはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキストラン、ナイロン及び他の物質のチューブ、ビーズ形態のもの、及びこれらの物質から形成され又はそれらによって被覆されているマイクロタイタイ−平板などがある。固定化抗体は、アミド又はエステル結合を介する共有結合などの手法、又は吸着によって固相免疫吸着剤に共有結合又は物理的に結合させることができる。当業者ならば多くの他の適当な固相免疫吸着剤及び抗体をそれらに固定化する方法を知っており、あるいは常套手段のみを使ってそのようなものを突き止めることができる。

インビボ、インビトロ又は同系診断では、放射性同位元素などの標識物を本発明の抗体に直接又は介在性官能基を用いて結合させればよい。金属カチオンとして存在する放射性同位元素を抗体に結合させるのに使用されることの多い介在性の基はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）である。この態様において結合される金属カチオンとは通常、９・”Ｔ　ｃ　ｓ　’　！３１　Ｓ”　’　Ｉ　ｎｓ　１３’　Ｉ　Ｉ？Ｒｕｓ　”ＣｕｅｔＱａ、及び６ａＧａなどである。本発明の抗体は診断目的では、非放射活性同位元素によっても標識することができる。この態様にて特に有用な元素は、’Ｓ’Ｇｄｓ　”Ｍｎ、””Ｄｙ、”Ｃｒｓ及びｓ＠Ｆｅである。

本発明の抗原は本発明の抗体を用いることによって実質的に純粋な形態で単離することができる。従って、本発明の１つ態様は実質的に純粋なＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質、ＦＩＶｌ、２エンベロープタンパク質及びＦＩＶｏ、６ｇａｇタンパク質抗原であって、本発明の抗体によって認識され、該抗体と結合することを特徴とする抗原の提供である。別の態様は、ＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質、ＦＩＶｌ、２エンベロープタンパク賀及びＦＩＶｏ、６ｇａｇタンパク質抗原を単離し又は精製する方法であって、それぞれＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質、ＦＩＶｌ、２エンベロープタンパク質及びＦＩＶｏ、６ｇａｇタンパク質を目的とする１つ又はそれ以上の抗体と該抗原との複合体を形成させることを特徴とする方法の提供である。

本発明の実質的に純粋な抗原は反対に、血清又は尿などの試料中のＦ　Ｉ　Ｖｏ。

４エンベロープタンパク質、ＦＩＶｌ、２エンベロープタンパク質又はＦＩＶｏ。

６ｇａｇタンパク質のいずれかに対する抗体の検出又はその測定に使用することができる。従って、本発明の１つの態様は試料中のＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質抗原に対する抗体の存在又は量を検出するための方法であって、ＦＩＶＯ８４エンベロープタンパク質に対する該抗体を含有する該試料を検出可能に標識したＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質と接触させ、該標識物を検出することを特徴とする方法の提供である。その免疫反応画分及びその断片の免疫反応同族体も使用できると考えられる。「免疫反応画分」なる用語は、レセプターキメラに対する抗体と等価な免疫応答を示すＦＩＶｏ、４エンベロープタンパク質抗原の部分を意味する。「免疫反応同族体」なる用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸がレセプター断片とは異なっているが、本発明の抗体と等価な免疫応答を示すタンパク質を意味する。

本発明の医薬組成物は、本発明の化合物の有益な効果を享受できる動物に投与すればよい。このような動物の中で主要なものはネコであるが、本発明がこれらに限定されるものでない。

以下に実施例を挙げるが、これにより当業者ならば、本発明を実施するための手法及び方法を完全に理解することができょう。しかし、これらはいがなる意味においても本発明又は添付する請求の範囲の限定を意図するものでない。

ＦＩＶ感染ネコの末梢血白血球からゲノムＤＮＡを抽出した。ＦＩＶの開示された配列データ［Ｔａ１ｂｏｔｔら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８６　：５７４３（１９８X）コを使用し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのオリゴヌクレオチドブライマーを作製した。このプライマーによりＦＩＶエンベロープの８１７８から８５７６までの領域を増幅し、さらにクローニングを簡単にするため各５゛末端にＧＣ豊富なりランプと共にＢａ＋ｉＨＩ制限部位を含有させた。第１図はこれらのプライマーの配列を詳細に示すものである。

プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡ合成装置［Ｍｉｌｌｉｇｅｎ］を使用するホスホロアミダイト方法によって合成した。増幅する前には、ゲノムＤＮＡを５分間煮沸することにより熱変性させ、次いでそれを１μｇ／反応の終濃度でＰＣＲ反応混合物に加えた。ＰＣＲ反応混合物には以下の終濃度でそれぞれが含有されていた：　５０ｍＭ　ＫＣＩ、１０１Ｍ　）リス−Ｈｃ１ｐＨｓ、３　（室温）、０．０１％ゼラチン、１．５ｍＭ　Ｍｇ（Ｊｆｆｉ、それぞれ３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ、及びそれぞれ０．７７μＭのプライマー。このＰＣＲ反応は以下の温度プロフィルによってＴｅｃｈｎｅ　Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ　Ｄｒｉｂｌｏｃｋ　ＰｌｌｌＣ− １にて行った＝　９５℃で１分、３７℃で１分、及び７２℃で３分を３５サイクル、最後は７２℃を５分間に延長。

全ＦＩＶｇｌ）１６０エンベロープタンパク質に相当する領　４ｋｂ増幅産物の位置は第２図に示している。この０．　４ｋｂ増幅産物をＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、各プライマーのリンカ−領域のみを切断させた（第１図を参照）。ＢａｍＨＩの切断ＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩ制限化発現ベクターｐＬｃＢｃｏにクローンし、りｏ−ンｐＬｃＢｃＯＦＩＶ０．４を作製した。

プラスミドｐＬｃＢｃｏは、バクテリオファージλｐＬプロモーターが使用できるようにされた大腸菌発現ベクターである。ｐＬｃＢｃｏは、Ｂｅ１ｔｚらの米国特許第４，７５３．８７３号に完全に記載されているｐＪＬ６に類似しているにれを引用によって本明細書に包含させる］。

ＦＩＶ組換えタンパク質の精製大腸菌細胞を３２℃にて○Ｉ）ｓｓｏが１０．０になるまで発酵させた。温度を４２℃に２時間変動させてＦＩＶｏ、４診断タンパク質の発現を誘導した。次いで、４０００ＸＧ、２０分の遠心によって細胞を採取し、アプロチニン（２５μ ｇ／冨ｉ）、２ｍＭ　ＰＭＳＦ、２５μｇ／曹ｌＤＮアーゼＩ及び１％トリトン −Ｘ１００を含有する５０禦Ｍ　トリス−ＨＣｆｐＨ７，５中、０．５諺ｇ／舅ｌリゾチームによる３０分、一定撹拌下の酵素消化によって細胞溶解した。消化の終点にて、混合物を１２．０００ｘＧで３０分間遠心し、得られたベレットを上記と同じ条件下で再度リゾチームにより消化した。次いで、５０鳳Ｍ炭酸ナトリウムｐＨ１０，０中、０．５％デオキシコール酸ナトリウムで１回洗浄した。

次ぎに、このペレット中の抗原を同じ炭酸緩衝液中、０．５％双性抗原（ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎ、ツバイターゲン）３−１４で可溶化した。ツバイターケン上清中の抗原を、その溶液のｐＨを６゜０に調節することにより沈殿させ、６Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭホウ酸塩、ｐＨ９，０，０，２％β−メルカプトエタノール中にて再溶解し、β−メルカプトエタノールの１．２倍過剰のモル濃度のヨード酢酸でアルキル化し、８Ｍ尿素、５０ｍＭホウ酸塩ｐＨ９，０に対して最後に透析した。

次いで、アルキル化し透析した抗原に５０倍過剰のモル濃度のシトラコン酸無水物（タンパク質アミノ基以上）を加え、その抗原をシトラコン酸化した。シトラコニル反応の後、抗原溶液を５０ＱＩＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ９，０に対して透析を完璧に行い、その同じ緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−ＴＳＫカラムにかけた。次いで、このＤＥＡＥ−ＴＳＫカラムを０〜ＩＭＮａＣ１の直線グラジェントで展開し、精製された組換え抗原を入手した。

第３図はこの精製組換えタンパク質を示すものである。レーン１は分子量マーカーを含む。レーン２はＦＩＶＩ、２エンベロープ遺伝子である。ジー／３ｉｔＦＩＶ０１６９２４ブタンバク賀である。

ネコのＦＩＶ感染を検出するのにＦＩＶＱ，４タンパク質を使用することＦＩＶ感染の診断のためにＦＩＶＱ，４エンベロープタンパク質を使用する際に、精製タンパク質をアクリノげミドゲルによって電気泳動し、そのタンパク質をウェスターンプロットによってニトロセルロース膜に移した。ＦＩＶｏ．４タンパク質を含有する個々の帯を１０匹のＦＩＶ感染ネコ由来の血清及び５つのネガティブ対照と反応させた。得られた結果を第４図に示す。

実施例１においてＰＣＲに使用したものと同じゲノムＤＮＡをこの実施例でも使用する．ＦＩＶの開示されている配列データ［Ｔａ１ｂｏｔｔら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ，　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．、　Ｕ．　Ｓ．　Ａ．　８６：５７４３（１９８９）コラ使用し、Ｐ　Ｃ　Ｒ（７）りａｌりノ，ｔ　ＩＪゴヌクレオチドプライマーを作製した。これらのプライマーはＦＩＶｇａｇの１０５０から１６４４位までの領域を増幅し、ＢａｍＨＩ制限部位及びＧＣ豊富なりランプを含有している。

これらのプライマーの配列は以下のようであるニプライマー３：５′アンプライマー、１０５０がら１０００位５’　−ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＴＡＴＧＴＡＧＣ−３’プライマー４：３′アンプライマー、１６２５から１６４４位までの逆側の相補対５’　−ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＣＴＡＧＧＧＴＡＣｍＣＴＧＧＣ−３’実施例１と同じ方法により、これらのオリゴヌクレオチドブライマーを合成し、ＰＣＲ増幅を行った。得られた０．　６ｋｂ断片を、各プライマーのリンカ−領域中しか切断しないＢａｍＨＩで消化した。ＢａｍＨＩ制限化ＰＣＲ産物を精製し、ＢａａＨＩ制限化発現ベク９−ｐＬｃＢｃｌ中１：り０−ンし、りｏ−：／Ｉ）ＬＣＢＣＩＦＩＶｏ．６を作製した。

プラスミドｐＬｃＢｃ１は、ＢａｍＨＩクローニング部位の直前に単一塩基が付加されているためｐＬＢｃＢｏと異なっている。この場合、ｐＬｃＢｃｏに対してｐＬｃＢｃｌを使用し、適切な解読枠の並びにするようにした。ｐＬｃＢｃｌもＢｅ１ｔｓら，米国特許第４．７５３．８７３号に記載されている。

得られたプラスミドを大腸菌宿主ＭＺ−１に移入し、実施例１のように発現させた。

実施例３ＦＴＶエンベロープ発現クローン（ＦＩＶｌ．２）の構築実施例１及び２においてＰＣＲに使用したものと同じゲノムＤＮＡをこの実施例でも使用する。ＦＩＶの開示されている配列データ［Ｔａ１ｂｏｔｔら，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　、　Ｕ．　Ｓ．　Ａ．　８６　：５７４３（１９８９）コを使用し、ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドブライマーを作製した。これらのプライマーはＦＩＶエンベロープの６９９６から８１２９位までの領域を増幅するが、ＧＣ豊富なりランプのためのＢａｍＨＩ制限部位は含有していない。これらのプライマーの配列は以下のようであるニプライマー５：５゛アングライマー、６９９６がら７ｏ２５位５°ー＾ＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＧ＾＾ＴＡＴＧＧ−３’プライマー６：３°アンプライマー、８１ｏ１がら８１２９位までの逆側の相補対５’　−ＴＧｎＧＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＣＡＴＡＡＣＡＴＧＡＡＴＡＧＣ−３’ 実施例１及び２と同じ方法により、これらのオリゴヌクレオチドブライマーを合成し、ＰＣＲ増幅を行った。得られた１．　２ｋｂ断片をＢａｍＨＩリンカ−［ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　＄１００３コに連結した。得られたＢａｍＨＩ連結ＰＣＲ産物をＢａｌ１ｌＨ■で消化し、精製し、Ｂａ＋ａＨＩ制限化発現ベクターｐＬＣＢＣ２中に知−ンし、りｏ−ンｐＬｃＢｃ２ＦＩＶ１．２を作ｔｉｌした。

プラスミドｐＬＣＢＣ２は、ＢａｍＨＩクローニング部位の直前に２つの塩基が付加されているためＤＬＣＢＣＯと異なっている。この場合、ｐＬｃＢｃＯに対してｐＬＣＢＣ２を使用し、適切な解読枠の並びにするようにした。ｐＬＣＢＣ２４Ｂｅｌｔｓら，米国特許第４．７５３，８７３号に記載されている。

得られたプラスミドを大腸菌宿主ＭＺ−１に移入し、実施例１及び２のように発現させた。

上記のように本発明の特定の態様を説明してきたが、本発明の思想及び範囲がら逸脱することなく種々の改変が可能であることは当業者ならば理解できょう。

従って、本発明は添付の請求の範囲に限定されるものではない。

Ｆｌｒ、ＩｍＦ　１ハイドロフィリシティーレーン第３図：精製ＦＩＶ組換えタンパク質。レーン１は分子量マーカーである。レーア２１ｔＦＩＶ１．２エンベロープタンパク質である。レーン３はｐ２４ｇａｇタンパク質であり、レーン４は精製組換えＦＩＶｏ、４診断タンパク質である。

ＦＩＧＵＲε　４フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｓ　９２８４−４ＣＣＯ７Ｋ　１３１００　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０− ２Ｊ３３１５６９　Ｈ９０１５−２Ｊ（７２）発明者　ストーリー、ジェイムズ・アールアメリカ合衆国０１５２５マサチユーセツツ、リンウッド、レイク・ストリート１潜Ｉ（７２）発明者　ベルッ、ジェラルドアメリカ合衆国０２１７３マサチューセッツ、レキシントン、ダウニジグ・ロード４２番

Claims

【特許請求の範囲】１．ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）に感染された細胞から入手される組換えネコ免疫不全症ウイルスｇｐ１６０エンベロープタンパク質。２．ＦＩＶに感染された細胞から入手される組換えＦＩＶ０．４エンベロープタンパク質。３．大腸菌から産生される請求項１又は２に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質。４．大腸菌株ＭＺ−１から産生される請求項１又は２に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質。５．ＦＩＶ０．４エンベロープタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド。６．ＦＩＶｇｐ１６０含有タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド。７．バンダストン（Ｂａｎｇｓｔｏｍ）株のＦＩＶエンベロープタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド。８．請求項５、６又は７に記載のプラスミドによって形質転換された真核生物細胞。９．請求項８に記載の形質転換細胞をＦＩＶ０．４エンベロープタンパク質を発現できる条件下で培養し、該タンパク質を回収することを特徴とするＦＩＶ０．４エンベロープタンパク質の生産方法。１０．該ＤＮＡ配列がＦＩＶバンダストン株から誘導されたものである請求項９に記載の方法。１１．請求項１に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質に対する抗体。１２．請求項２に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質に対する抗体。１３．請求項３に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質に対する抗体。１４．請求項４に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質に対する抗体。１５．モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗−イディオタイプ抗体、及び抗抗−イディオタイプ抗体の中から選はれる請求項１１又は１２に記載の抗体。１６．モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗−イディオタイプ抗体、及び抗抗−イディオタイプ抗体の中から選はれる請求項１３に記載の抗体。１７．モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗−イディオタイプ抗体、及び抗抗−イディオタイプ抗体の中から選ばれる請求項１４に記載の抗体。１８．ＦＩＶを精製するための方法であって、ＦＩＶを含有する試料を請求項１１、１２、１３、１４、３６又は４９に記載の抗体と接触させ、該試料中のＦＩＶと該抗体との間で複合体を形成させ、次いで該抗体からＦＩＶを回収し、精製ＦＩＶを入手することを特徴とする方法。１９．試料中のＦＩＶを検出するための方法であって、該試料を請求項１１、１２、１３、１４、３６又は４９に記載の、検出可能に標識された抗体と接触させ、該試料中のＦＩＶと該検出可能に標識された抗体との間で複合体を形成させ、次いで複合化した、又は複合化していない検出可能に標識された抗体を検出することを特徴とする方法。２０．１つ又はそれ以上の容器であって、そのうちの１つの容器が検出可能に標識されている請求項１１、１２、１３、１４、３６又は４９に記載の抗体を含有している容器、からなる容器手段を包含する試料中のＦＩＶを検出するためのキット。２１．請求項１１、１２、１３、１４、３６又は４９に記載の抗体を含有する医薬組成物。２２．ネコにおけるＦＩＶに対する抗体の産生を誘導するのに有用である医薬組成物の調製方法であって、ＦＩＶｇｐ１６０又はＦＩＶ０．４エンベロープタンパク質のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの免疫学的に有効な量を製薬的に許容され得る担体と混合することを特徴とする方法。２３．請求項１又は２に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質を含有するＦＩＶ感染を予防するための医薬組成物。２４．請求項３に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質を含有するＦＩＶ感染を予防するための医薬組成物。２５．請求項４に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質を含有するＦＩＶ感染を予防するための医薬組成物。２６．ＦＩＶに対してネコを免疫するための組成物を調製する際における請求項２３に記載の医薬組成物の使用。２７．ＦＩＶに対してネコを免疫するための組成物を調製する際における請求項２４に記載の医薬組成物の使用。２８．ＦＩＶに対してネコを免疫するための組成物を調製する際における請求項２５に記載の医薬組成物の使用。２９．バンダストン株から入手される組換えネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）１．２エンベロープタンパク質。３０．大腸菌から産生される請求項２９に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質。３１．大腸菌株ＭＺ−１から産生される請求項２９に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質。３２．ＦＩＶ１．２エンベロープタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド。３３．請求項３２に記載のプラスミドによって形質転換された真核生物細胞。３４．請求項３３に記載の形質転換細胞をＦＩＶ１．２エンベロープタンパク質を発現できる条件下で培養し、該タンパク質を回収することを特徴とするＦＩＶ１．２エンベロープタンパク質の生産方法。３５．該ＤＮＡ配列がバンダストン株から誘導されたものである請求項３４に記載の方法。３６．請求項２９に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質に対する抗体。３７．モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗−イディオタイプ抗体、及び抗抗−イディオタイプ抗体の中から選ばれる請求項３６に記載の抗体。３８．ネコにおけるＦＩＶに対する抗体の産生を誘導するのに有用である医薬組成物の調製方法であって、ＦＩＶ１．２エンベロープタンパク質のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの免疫学的に有効な量を製薬的に許容され得る担体と混合することを特徴とする方法。３９．請求項２９に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質を含有するＦＩＶ感染を予防するための医薬組成物。４０．ＦＩＶに対してネコを免疫するための組成物を調製する際における請求項３９に記載の医薬組成物の使用。４１．バンダストン株から入手される組換えネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇ０．６断片。４２．大腸菌から産生される請求項４１に記載のＦＩＶｇａｇ０．６断片。４３．大腸菌株ＭＺ−１から産生される請求項４１に記載のＦＩＶｇａｇ０．６断片。４４．ＦＩＶｇａｇ０．６断片をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド。４５．バンダストン株のＦＩＶｇａｇ０．６断片をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド。４６．請求項４４又は４５に記載のプラスミドによって形質転換された真核生物細胞。４７．請求項４６に記載の形質転換細胞をＦＩＶｇａｇ０．６断片を発現できる条件下で培養し、該断片を回収することを特徴とするＦＩＶｇａｇ０．６断片の生産方法。４８．該ＤＮＡ配列がバンダストン株から誘導されたものである請求項４７に記載の方法。４９．請求項４１に記載のＦＩＶｇａｇ０．６断片に対する抗体。５０．モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗−イディオタイプ抗体、及び抗抗−イディオタイプ抗体の中から選ばれる請求項４９に記載の抗体。５１．ネコにおけるＦＩＶに対する抗体の産生を誘導するのに有用である医薬組成物の調製方法であって、ＦＩＶｇａｇ０．６断片のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの免疫学的に有効な量を製薬的に許容され得る担体と混合することを特徴とする方法。５２．請求項４１に記載のＦＩＶｇａｇ０．６断片を含有するＦＩＶ感染を予防するための医薬組成物。５３．ＦＩＶに対してネコを免疫するための組成物を調製する際における請求項５２に記載の医薬組成物の使用。５４．試料中のＦｌＶ抗体を検出するためのキットであって、第１の容器手段が固相免疫吸着剤に固定化されている請求項１、２、２９又は４１のいずれかに記載のペプチド断片を含存しており、第２の容器手段がＦＩＶ抗体に対する検出可能に標識されている抗−抗体を含有している、閉じた状態の１つ又はそれ以上の容器手段を収納するために区画化されている担体を包含するキット。５５．試料中のＦＩＶウイルス又はそのタンパク質を検出するためのキットであって、第１の容器手段が固相免疫吸着剤に固定化されている請求項１１、１２、３６又は４９のいずれかに記載の抗体を含有しており、第２の容器手段が該第１抗体に対する検出可能に標識されている抗−抗体を含有している、閉じた状態の１つ又はそれ以上の容器手段を収納するために区画化されている担体を包含するキット。５６．バンダストン株の請求項５又は６に記載のＦＩＶエンベロープタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含有するプラスミド。