JP3254815B2 - 凝集反応測定用粒子の製造方法 - Google Patents
凝集反応測定用粒子の製造方法Info
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- JP3254815B2 JP3254815B2 JP13409393A JP13409393A JP3254815B2 JP 3254815 B2 JP3254815 B2 JP 3254815B2 JP 13409393 A JP13409393 A JP 13409393A JP 13409393 A JP13409393 A JP 13409393A JP 3254815 B2 JP3254815 B2 JP 3254815B2
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本願発明は、抗原をコードする領
域を含むＤＮＡ切片にポリリジンをコードする領域を含
むＤＮＡ切片を結合させたリコンビナントＤＮＡによ
り、ポリリジン結合抗原を発現させ、得られたポリリジ
ン結合抗原のポリリジン部分をリンカーとして、該抗原
と凝集反応測定用粒子とを結合させることを特徴とする
凝集反応測定用粒子の製造方法に関する。本発明により
得られる凝集反応測定用粒子は、凝集反応を用いた体外
診断試薬等に有用である。
域を含むＤＮＡ切片にポリリジンをコードする領域を含
むＤＮＡ切片を結合させたリコンビナントＤＮＡによ
り、ポリリジン結合抗原を発現させ、得られたポリリジ
ン結合抗原のポリリジン部分をリンカーとして、該抗原
と凝集反応測定用粒子とを結合させることを特徴とする
凝集反応測定用粒子の製造方法に関する。本発明により
得られる凝集反応測定用粒子は、凝集反応を用いた体外
診断試薬等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】検体中の抗体を測定するための凝集反応
測定試薬は、抗原と凝集反応用粒子とが結合されて製造
されている。
測定試薬は、抗原と凝集反応用粒子とが結合されて製造
されている。
【０００３】ここで用いられる抗原としては、例えばホ
ルモン、蛋白質、又はウイルス等の抗原成分をそのまま
凝集反応用粒子に結合させるか、化学的又は物理的手段
を用いて抗原成分を破壊して得られた断片の他、化学合
成等により得られた合成抗原を凝集反応用粒子に結合さ
せて凝集免疫測定試薬として用いている。
ルモン、蛋白質、又はウイルス等の抗原成分をそのまま
凝集反応用粒子に結合させるか、化学的又は物理的手段
を用いて抗原成分を破壊して得られた断片の他、化学合
成等により得られた合成抗原を凝集反応用粒子に結合さ
せて凝集免疫測定試薬として用いている。
【０００４】しかしながら、これらの抗原成分を用いて
調製した凝集免疫測定試薬は、抗体が微量又は希薄な検
体の測定を行なう場合、感度が十分に取れず、陰性検体
と陽性検体とを判定し分けることが困難である等の問題
があった。
調製した凝集免疫測定試薬は、抗体が微量又は希薄な検
体の測定を行なう場合、感度が十分に取れず、陰性検体
と陽性検体とを判定し分けることが困難である等の問題
があった。
【０００５】ＥＬＩＳＡ法においては、抗原と適当なポ
リマーとを結合して合成し、このポリマーを介して免疫
測定用固相体に抗原を結合させた試薬が酵素免疫測定方
法（ＥＬＩＳＡ法）に用いられた。（ＡＲＭＥＬＬＥ
ＢＡＩＬＬＯＵ，ＢＬＡＮＤＩＮＥ ＪＡＮＶＩＥＲ，
ＧＵＹ ＬＥＯＮＡＲＤ，ＦＲＡＮＳＯＩＳ ＤＥＮＩ
Ｓ，ＡＬＡＩＮ ＧＯＵＤＥＡＵ ａｎｄ ＦＲＡＮＣ
ＩＳ ＢＡＲＩＮ．Ｊ．ＣＬＩＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯ
Ｌ．，Ｊｕｌｙ １９９１，ｐ１３８７−１３９１）こ
の結果、抗原力価が上り、非特異反応が抑制される様に
なった。
リマーとを結合して合成し、このポリマーを介して免疫
測定用固相体に抗原を結合させた試薬が酵素免疫測定方
法（ＥＬＩＳＡ法）に用いられた。（ＡＲＭＥＬＬＥ
ＢＡＩＬＬＯＵ，ＢＬＡＮＤＩＮＥ ＪＡＮＶＩＥＲ，
ＧＵＹ ＬＥＯＮＡＲＤ，ＦＲＡＮＳＯＩＳ ＤＥＮＩ
Ｓ，ＡＬＡＩＮ ＧＯＵＤＥＡＵ ａｎｄ ＦＲＡＮＣ
ＩＳ ＢＡＲＩＮ．Ｊ．ＣＬＩＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯ
Ｌ．，Ｊｕｌｙ １９９１，ｐ１３８７−１３９１）こ
の結果、抗原力価が上り、非特異反応が抑制される様に
なった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】合成法により抗原にポ
リマーを結合するに当っては、抗原の調製と精製、ポリ
マーの調製と精製をそれぞれ行なった後、抗原とポリマ
ーとを適当な方法を用いて結合し、更に精製を行なわな
ければならず、操作が複雑であり、収率も低いなどの問
題があり、大量の試薬を調製することは困難である。
リマーを結合するに当っては、抗原の調製と精製、ポリ
マーの調製と精製をそれぞれ行なった後、抗原とポリマ
ーとを適当な方法を用いて結合し、更に精製を行なわな
ければならず、操作が複雑であり、収率も低いなどの問
題があり、大量の試薬を調製することは困難である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、合成抗原
に結合させるポリマーとしてポリアミノ酸の一つである
ポリリジンを用いると抗原力価が高くなる事に注目し、
抗原をコードするＤＮＡとポリリジンをコードするＤＮ
ＡとからリコンビナントＤＮＡを作製し、これを発現さ
せることによりポリリジンを有する抗原を一体で取得
し、これを凝集反応測定用粒子に結合することにより、
抗原力価が高く、非特異反応が少ない凝集反応測定用粒
子を安全且つ容易に又大量に製造できることを見い出
し、本発明を完成させた。
に結合させるポリマーとしてポリアミノ酸の一つである
ポリリジンを用いると抗原力価が高くなる事に注目し、
抗原をコードするＤＮＡとポリリジンをコードするＤＮ
ＡとからリコンビナントＤＮＡを作製し、これを発現さ
せることによりポリリジンを有する抗原を一体で取得
し、これを凝集反応測定用粒子に結合することにより、
抗原力価が高く、非特異反応が少ない凝集反応測定用粒
子を安全且つ容易に又大量に製造できることを見い出
し、本発明を完成させた。
【０００８】すなわち本発明は、抗原をコードする領域
を含むＤＮＡ切片にポリリジンをコードする領域を含む
ＤＮＡ切片を結合させたリコンビナントＤＮＡにより、
ポリリジン結合抗原を発現させ、得られたポリリジン結
合抗原のポリリジン部分をリンカーとして、該抗原と凝
集反応測定用粒子とを結合させることを特徴とする凝集
反応測定用粒子の製造方法である。
を含むＤＮＡ切片にポリリジンをコードする領域を含む
ＤＮＡ切片を結合させたリコンビナントＤＮＡにより、
ポリリジン結合抗原を発現させ、得られたポリリジン結
合抗原のポリリジン部分をリンカーとして、該抗原と凝
集反応測定用粒子とを結合させることを特徴とする凝集
反応測定用粒子の製造方法である。
【０００９】本発明で利用することのできる抗原は、該
抗原の一部又は全部をコードするＤＮＡ切片を得ること
ができるものであれば良く、ＨＩＶ１，ＨＩＶ２，ＨＴ
ＬＶ−Ｉ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，トリポネーマ（ＴＰ），ス
トレプトリジン−Ｏ，マイコプラズマ等を挙げる事がで
きる。
抗原の一部又は全部をコードするＤＮＡ切片を得ること
ができるものであれば良く、ＨＩＶ１，ＨＩＶ２，ＨＴ
ＬＶ−Ｉ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，トリポネーマ（ＴＰ），ス
トレプトリジン−Ｏ，マイコプラズマ等を挙げる事がで
きる。
【００１０】上記抗原をコードする領域を含むＤＮＡ切
片は、抽出法、化学合成法など既知の方法を用いて入手
することができる他、市販されているＤＮＡ切片を用い
ることもできる。又ＤＮＡ切片の取得量が少ない場合
は、ＰＣＲ法を用い充分な量のＤＮＡ切片に増幅して用
いることもできる。
片は、抽出法、化学合成法など既知の方法を用いて入手
することができる他、市販されているＤＮＡ切片を用い
ることもできる。又ＤＮＡ切片の取得量が少ない場合
は、ＰＣＲ法を用い充分な量のＤＮＡ切片に増幅して用
いることもできる。
【００１１】得られた抗原をコードする領域を含むＤＮ
Ａ切片を、抗原蛋白の発現のため、適当なベクターに組
み込み、抗原発現ベクターとした。
Ａ切片を、抗原蛋白の発現のため、適当なベクターに組
み込み、抗原発現ベクターとした。
【００１２】抗原をコードする領域を含むＤＮＡ切片を
ベクターに組み込むに当っては、前記ＤＮＡ切片を制限
酵素を用いて消化し、同様に処理したベクターにライゲ
ーションする方法を用いれば良い。制限酵素は、前記Ｄ
ＮＡ切片を組み込むベクターの位置に応じて１種又は２
種を選ぶことができる。
ベクターに組み込むに当っては、前記ＤＮＡ切片を制限
酵素を用いて消化し、同様に処理したベクターにライゲ
ーションする方法を用いれば良い。制限酵素は、前記Ｄ
ＮＡ切片を組み込むベクターの位置に応じて１種又は２
種を選ぶことができる。
【００１３】ライゲーションは一般に行なわれている方
法によればよく、制限酵素処理した前記ＤＮＡ切片と同
様に制限酵素処理したベクターをＤＮＡポリメラーゼ存
在下反応させれば良い。
法によればよく、制限酵素処理した前記ＤＮＡ切片と同
様に制限酵素処理したベクターをＤＮＡポリメラーゼ存
在下反応させれば良い。
【００１４】ポリリジンをコードする領域を含むＤＮＡ
切片は、天然物由来のＤＮＡより取得することもできる
が、化学合成により簡単かつ大量に調製することができ
る。
切片は、天然物由来のＤＮＡより取得することもできる
が、化学合成により簡単かつ大量に調製することができ
る。
【００１５】ポリリジンをコードする領域を含むＤＮＡ
切片を化学合成により調製する場合は、ＤＮＡ自動合成
機等を用いて調製することができる。ポリリジンをコー
ドする領域を含むＤＮＡ切片を合成するにあたっては、
ポリリジンをコードする塩基配列の３′下流側に制限酵
素により消化された切断部位の塩基配列を有する一本鎖
ＤＮＡと、これに相補性を有する一本鎖ＤＮＡを別々に
合成すれば良い。
切片を化学合成により調製する場合は、ＤＮＡ自動合成
機等を用いて調製することができる。ポリリジンをコー
ドする領域を含むＤＮＡ切片を合成するにあたっては、
ポリリジンをコードする塩基配列の３′下流側に制限酵
素により消化された切断部位の塩基配列を有する一本鎖
ＤＮＡと、これに相補性を有する一本鎖ＤＮＡを別々に
合成すれば良い。
【００１６】合成する一本鎖ＤＮＡとしては、例えば ５′− Ｔ（ＡＡＧ）10ＴＡＡＧＧＴＡＣ−３′ ３′−ＡＣＧＴＡ（ＴＴＣ）10ＡＴＴＣ −５′ などを挙げることができる。いずれの一本鎖ＤＮＡも両
端の制限酵素切断部位の塩基配列は、使用するベクター
に応じて選択される制限酵素に合わせることは言うまで
もない。
端の制限酵素切断部位の塩基配列は、使用するベクター
に応じて選択される制限酵素に合わせることは言うまで
もない。
【００１７】合成された各々の一本鎖ＤＮＡについて、
アニーリングを行ない、ポリリジンをコードする領域の
両端に制限酵素で消化された切断部位の塩基配列を有す
る二本鎖ＤＮＡ切片を得る。
アニーリングを行ない、ポリリジンをコードする領域の
両端に制限酵素で消化された切断部位の塩基配列を有す
る二本鎖ＤＮＡ切片を得る。
【００１８】アニーリングは一般的な方法を用いて行な
えば良く、例えばお互いに相補的な一本鎖ＤＮＡを含む
溶液を６５℃程度に加温した後、室温に放置し、徐冷す
れば良い。
えば良く、例えばお互いに相補的な一本鎖ＤＮＡを含む
溶液を６５℃程度に加温した後、室温に放置し、徐冷す
れば良い。
【００１９】得られたポリリジンをコードする領域を含
むＤＮＡ切片を、抗原発現ベクターに組み込み、ポリリ
ジン結合抗原発現ベクターとした。ポリリジンを組み込
む部位は、抗原とポリリジンとが連続して発現する部位
であればよい。
むＤＮＡ切片を、抗原発現ベクターに組み込み、ポリリ
ジン結合抗原発現ベクターとした。ポリリジンを組み込
む部位は、抗原とポリリジンとが連続して発現する部位
であればよい。
【００２０】ポリリジンをコードする領域を含むＤＮＡ
切片を抗原発現ベクターに組み込むに当たっては、抗原
発現ベクターを制限酵素で消化し、ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて前記ＤＮＡ切片とライゲーションを行なえば良
い。抗原発現ベクターを消化する制限酵素は前記ＤＮＡ
切片の一方の切断部位の塩基配列により定められる制限
酵素を使用する事は言うまでもない。
切片を抗原発現ベクターに組み込むに当たっては、抗原
発現ベクターを制限酵素で消化し、ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて前記ＤＮＡ切片とライゲーションを行なえば良
い。抗原発現ベクターを消化する制限酵素は前記ＤＮＡ
切片の一方の切断部位の塩基配列により定められる制限
酵素を使用する事は言うまでもない。
【００２１】以上の操作により得られたポリリジン結合
抗原発現ベクターを、蛋白発現のため、大腸菌等に導入
し、大腸菌の形質転換を行なう。形質転換された大腸菌
の培養し、発現誘導を行なった後大腸菌を回収し、化学
的又は物理的に破砕し、溶液相から発現物を得る。
抗原発現ベクターを、蛋白発現のため、大腸菌等に導入
し、大腸菌の形質転換を行なう。形質転換された大腸菌
の培養し、発現誘導を行なった後大腸菌を回収し、化学
的又は物理的に破砕し、溶液相から発現物を得る。
【００２２】発現蛋白の精製は、公知の方法で行なえば
良く、例えば、カラム精製した後ゲルロ過するなどの方
法で精製できる。
良く、例えば、カラム精製した後ゲルロ過するなどの方
法で精製できる。
【００２３】精製が終ったポリリジン結合抗原は凝集反
応測定用粒子に結合して凝集免疫測定に用いることがで
きる。使用できる粒子としては、ゼラチン粒子、磁性粒
子、ポリスチレン等有機材料を核としたラテックス、ア
ルミナ等無機材料を核としたラテックス、赤血球等の細
胞類を用いることができる。又それぞれの粒子が磁気応
答性を持っても良い。
応測定用粒子に結合して凝集免疫測定に用いることがで
きる。使用できる粒子としては、ゼラチン粒子、磁性粒
子、ポリスチレン等有機材料を核としたラテックス、ア
ルミナ等無機材料を核としたラテックス、赤血球等の細
胞類を用いることができる。又それぞれの粒子が磁気応
答性を持っても良い。
【００２４】凝集反応測定用粒子にタンニン酸処理を行
なった後、ポリリジン結合抗原を含む溶液を加え、ポリ
リジンをリンカーとして抗原を粒子に結合させる。以上
のようにして得られたポリリジンをリンカーに用いた抗
原結合粒子は、凝集免疫測定に有用である。
なった後、ポリリジン結合抗原を含む溶液を加え、ポリ
リジンをリンカーとして抗原を粒子に結合させる。以上
のようにして得られたポリリジンをリンカーに用いた抗
原結合粒子は、凝集免疫測定に有用である。
【００２５】
【００２６】〔実施例１〕 ＨＩＶ−２ エンブ（ｅｎｖ）タンパク質産生ベクター
の調製 ＨＩＶ−２ウイルスの膜蛋白質（ｇｐ３６）の遺伝子の
クローニングと発現のため、ＨＩＶ−２ ＧＨ−１株エ
ンブの５３９番目−６６６番目のアミノ酸をコードする
遺伝子の５′端および３′端にそれぞれ相当する ５′−ＴＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＡＡ−３′ ３′−ＴＧＧ ＡＧＧ ＡＣＣ ＴＡＧ ＴＴＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＴ−５′ をそれぞれ３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザー（アプライ
ド・バイオシステム社）で合成した。ＨＩＶ−２遺伝子
はＨＩＶ−２ ＧＨ−１株が持続感染しているＭＯＬＴ
−４／ＧＨ−１細胞株から調製した。細胞培養液を遠心
して細胞を採取し、トリス塩酸緩衝液（１０ｍＭトリス
ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）（以下ＴＥ緩衝液と言
う）に浮遊させた。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
とｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋをそれぞれ、最終濃度０．
５％、１００μｇ／ｍｌになるように添加し５５℃で１
時間反応させた。続いて、フェノール抽出、クロロホル
ム抽出、エタノール沈澱を行なった後、ＴＥ緩衝液に浮
遊させ、ＨＩＶ−２遺伝子を含むＤＮＡを得た。これら
のオリゴヌクレオチドと単離したＨＩＶ−２遺伝子を含
むＤＮＡを用い、ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）
（Ｒａｎｄａｌｌ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，ＵＳＡ，２３９，４８７−４９１，１９８８）によ
り目的とする領域の遺伝子を増幅し断片として得た。こ
の断片を、ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドに含まれ
ているＳａｌＩとＸｈｏＩの制限部位で切断し、市販の
ｐＧＥＭＥＸ−１をＮｈｅＩとＳａｃＩで消化した後、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理しセルフライゲーション
を行ないｇｅｎｅ１０領域を除き、さらに、ＥｃｏＴ２
２ＩとＨｉｎｄ３の間に翻訳終止コドンと制限酵素Ｋｐ
ｎＩの認識部位を挿入したｐＷＡ５３をＳａｌＩとＸｈ
ｏＩで消化し、これに結合させ、ｐＨＩＶ ２−１０Ｓ
Ｘを作成した。
の調製 ＨＩＶ−２ウイルスの膜蛋白質（ｇｐ３６）の遺伝子の
クローニングと発現のため、ＨＩＶ−２ ＧＨ−１株エ
ンブの５３９番目−６６６番目のアミノ酸をコードする
遺伝子の５′端および３′端にそれぞれ相当する ５′−ＴＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＡＡ−３′ ３′−ＴＧＧ ＡＧＧ ＡＣＣ ＴＡＧ ＴＴＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＴ−５′ をそれぞれ３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザー（アプライ
ド・バイオシステム社）で合成した。ＨＩＶ−２遺伝子
はＨＩＶ−２ ＧＨ−１株が持続感染しているＭＯＬＴ
−４／ＧＨ−１細胞株から調製した。細胞培養液を遠心
して細胞を採取し、トリス塩酸緩衝液（１０ｍＭトリス
ｐＨ８．０，１ｍＭ ＥＤＴＡ）（以下ＴＥ緩衝液と言
う）に浮遊させた。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
とｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋをそれぞれ、最終濃度０．
５％、１００μｇ／ｍｌになるように添加し５５℃で１
時間反応させた。続いて、フェノール抽出、クロロホル
ム抽出、エタノール沈澱を行なった後、ＴＥ緩衝液に浮
遊させ、ＨＩＶ−２遺伝子を含むＤＮＡを得た。これら
のオリゴヌクレオチドと単離したＨＩＶ−２遺伝子を含
むＤＮＡを用い、ポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）
（Ｒａｎｄａｌｌ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，ＵＳＡ，２３９，４８７−４９１，１９８８）によ
り目的とする領域の遺伝子を増幅し断片として得た。こ
の断片を、ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドに含まれ
ているＳａｌＩとＸｈｏＩの制限部位で切断し、市販の
ｐＧＥＭＥＸ−１をＮｈｅＩとＳａｃＩで消化した後、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理しセルフライゲーション
を行ないｇｅｎｅ１０領域を除き、さらに、ＥｃｏＴ２
２ＩとＨｉｎｄ３の間に翻訳終止コドンと制限酵素Ｋｐ
ｎＩの認識部位を挿入したｐＷＡ５３をＳａｌＩとＸｈ
ｏＩで消化し、これに結合させ、ｐＨＩＶ ２−１０Ｓ
Ｘを作成した。
【００２７】〔実施例２〕 ＨＩＶ−２ エンブ（ｅｎｖ）タンパク質産生ポリリジ
ン付加ベクターの調製ポリリジンを付加したリコンビナ
ント抗原の発現のために、次の２種のオリゴヌクレオチ
ドを用いた。 ５′− Ｔ （ＡＡＧ）10 ＴＡＡ ＧＧＴＡＣ−３′ ３′−ＡＣＧＴＡ （ＴＴＣ）10 ＡＴＴ Ｃ −５′ これらのオリゴヌクレオチドを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ
と制限酵素ＫｐｎＩの認識部位間に組み込み、ＡＡＧを
コドンとして利用するとＣ末にリジンが１０個付加され
る。これらのオリゴヌクレオチドは３８１Ａ ＤＮＡシ
ンセサイザーで合成した。合成された２種のオリゴヌク
レオチドを混合し、６５℃で５分間加温した後、３０分
間室温に放置しゆっくり冷却し挿入断片を作成した。Ｈ
ＩＶ−２エンブの一部を産生するプラスミドｐＨＩＶ
２−１０ＳＸを制限酵素ＥｃｏＴ−２２ＩとＫｐｎＩで
消化し、調製したオリゴヌクレオチド断片を結合させ、
ｐＨＩＶ２−１０ Ｋ１０を作成した。
ン付加ベクターの調製ポリリジンを付加したリコンビナ
ント抗原の発現のために、次の２種のオリゴヌクレオチ
ドを用いた。 ５′− Ｔ （ＡＡＧ）10 ＴＡＡ ＧＧＴＡＣ−３′ ３′−ＡＣＧＴＡ （ＴＴＣ）10 ＡＴＴ Ｃ −５′ これらのオリゴヌクレオチドを制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ
と制限酵素ＫｐｎＩの認識部位間に組み込み、ＡＡＧを
コドンとして利用するとＣ末にリジンが１０個付加され
る。これらのオリゴヌクレオチドは３８１Ａ ＤＮＡシ
ンセサイザーで合成した。合成された２種のオリゴヌク
レオチドを混合し、６５℃で５分間加温した後、３０分
間室温に放置しゆっくり冷却し挿入断片を作成した。Ｈ
ＩＶ−２エンブの一部を産生するプラスミドｐＨＩＶ
２−１０ＳＸを制限酵素ＥｃｏＴ−２２ＩとＫｐｎＩで
消化し、調製したオリゴヌクレオチド断片を結合させ、
ｐＨＩＶ２−１０ Ｋ１０を作成した。
【００２８】〔実施例３〕 目的蛋白の発現 ｐＨＩＶ ２−１０ＳＸは発現のためＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼがｌａｃのプロモーターで制御されている大腸菌
ＪＭ１０９（ＤＥ３）にトランスフォームし、ｐＨＩＶ
２−１０ＳＸ／ＪＭ１０９（ＤＥ３）を得た。ｐＨＩＶ
２−１０ＳＸ／ＪＭ１０９（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌ
ａｍｐｉｃｉｌｉｎ Ｍ９ＣＡ培地（以下Ｍ９ＣＡ培
地と言う）で３７℃、１６時間振とう培養した後、等量
のＭ９ＣＡ培地を加え３７℃、２時間培養した。ＩＰＴ
Ｇを５０ｍＭになるように培養液に加え、さらに、３７
℃、２時間培養し目的とする蛋白を発現誘導した。
ラーゼがｌａｃのプロモーターで制御されている大腸菌
ＪＭ１０９（ＤＥ３）にトランスフォームし、ｐＨＩＶ
２−１０ＳＸ／ＪＭ１０９（ＤＥ３）を得た。ｐＨＩＶ
２−１０ＳＸ／ＪＭ１０９（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌ
ａｍｐｉｃｉｌｉｎ Ｍ９ＣＡ培地（以下Ｍ９ＣＡ培
地と言う）で３７℃、１６時間振とう培養した後、等量
のＭ９ＣＡ培地を加え３７℃、２時間培養した。ＩＰＴ
Ｇを５０ｍＭになるように培養液に加え、さらに、３７
℃、２時間培養し目的とする蛋白を発現誘導した。
【００２９】〔実施例４〕 発現蛋白の精製 発現誘導を行なった培養液は遠心分離により大腸菌を回
収し、ＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ トリス ｐＨ８．０，
１００ｍＭ Ｎａｃｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に浮遊させ
た。４００ｍｇ／ｌとなるようにリゾチームを加え、３
７℃、３０分加温した後、１時間４℃ ＳＯＮＩＦＩＥ
Ｒ ＣＥＬＬＤ ＩＳＲＵＰＴＯＲ １８５（ＢＲＡＮ
ＳＯＮ社製）で、超音波処理を行ない大腸菌を破砕し
た。遠心分離により沈渣を回収し、８Ｍ尿素で溶解し
た。ハイドロキシアパタイトカラム（ＢｉｏＲａｄ社
製）で精製した後、セファロースＣＬ−６Ｂカラムでゲ
ル濾過を行い、単一ピークのものを得た。
収し、ＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭ トリス ｐＨ８．０，
１００ｍＭ Ｎａｃｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に浮遊させ
た。４００ｍｇ／ｌとなるようにリゾチームを加え、３
７℃、３０分加温した後、１時間４℃ ＳＯＮＩＦＩＥ
Ｒ ＣＥＬＬＤ ＩＳＲＵＰＴＯＲ １８５（ＢＲＡＮ
ＳＯＮ社製）で、超音波処理を行ない大腸菌を破砕し
た。遠心分離により沈渣を回収し、８Ｍ尿素で溶解し
た。ハイドロキシアパタイトカラム（ＢｉｏＲａｄ社
製）で精製した後、セファロースＣＬ−６Ｂカラムでゲ
ル濾過を行い、単一ピークのものを得た。
【００３０】〔実施例５〕 担体への結合 特公昭６３−２９２２３号に記載の方法により製造され
たゼラチン粒子を５％濃度になるようにｐＨ７．２のリ
ン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳと言う）に分散し、そ
の溶液１０ｍｌをタンニン酸を含むｐＨ７．２のＰＢＳ
１０ｍｌと混合した。この混合液を３７℃で１０分間加
温後、遠心分離により粒子を回収し、さらに生理食塩水
により洗浄した。この粒子を５％の濃度になるようにＰ
ＢＳ（ｐＨ６．４）に分散し、タンニン酸処理ゼラチン
粒子分散液を得た。この中からタンニン酸処理ゼラチン
粒子分散液１０ｍｌをとり、実施例４で精製したポリリ
ジン付加ＨＩＶ−２ エンブ溶液１０ｍｌを加え混合し
て３７℃で６０分間加温した。その後、粒子を生理食塩
水で充分洗浄し、分散液に浮遊させて凍結乾燥し、抗Ｈ
ＩＶ−２抗体検出用粒子（粒子Ｂ）を得た。上記と同様
な方法で、ポリリジンが付加されていないＨＩＶ−２
エンブペプチドと粒子とを結合して抗ＨＩＶ−２抗体検
出用粒子（粒子Ａ）を得た。
たゼラチン粒子を５％濃度になるようにｐＨ７．２のリ
ン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳと言う）に分散し、そ
の溶液１０ｍｌをタンニン酸を含むｐＨ７．２のＰＢＳ
１０ｍｌと混合した。この混合液を３７℃で１０分間加
温後、遠心分離により粒子を回収し、さらに生理食塩水
により洗浄した。この粒子を５％の濃度になるようにＰ
ＢＳ（ｐＨ６．４）に分散し、タンニン酸処理ゼラチン
粒子分散液を得た。この中からタンニン酸処理ゼラチン
粒子分散液１０ｍｌをとり、実施例４で精製したポリリ
ジン付加ＨＩＶ−２ エンブ溶液１０ｍｌを加え混合し
て３７℃で６０分間加温した。その後、粒子を生理食塩
水で充分洗浄し、分散液に浮遊させて凍結乾燥し、抗Ｈ
ＩＶ−２抗体検出用粒子（粒子Ｂ）を得た。上記と同様
な方法で、ポリリジンが付加されていないＨＩＶ−２
エンブペプチドと粒子とを結合して抗ＨＩＶ−２抗体検
出用粒子（粒子Ａ）を得た。
【００３１】〔実施例６〕検体の測定 実施例５で製造した凍結乾燥粒子Ａ，Ｂに蒸留水を加え
て復元し、ＨＩＶ−２抗体陽性血清についてマイクロタ
イター法で力価を測定した。その結果を表１に示した。
表１に示したように、ポリリジンを付加した抗原を用い
た粒子では、付加しない粒子に較べ、４−８倍高い力価
を示した。一方、非感染検体においては、力価に影響は
なかった。
て復元し、ＨＩＶ−２抗体陽性血清についてマイクロタ
イター法で力価を測定した。その結果を表１に示した。
表１に示したように、ポリリジンを付加した抗原を用い
た粒子では、付加しない粒子に較べ、４−８倍高い力価
を示した。一方、非感染検体においては、力価に影響は
なかった。
【００３２】
【発明の効果】本発明により抗原力価が高い凝集反応測
定用粒子が提供された。本発明の凝集反応測定用粒子は
ポリリジンを有する抗原をリコンビナントＤＮＡより発
現することを特徴とし、これを凝集反応測定用粒子に結
合しているため、感染性を有する抗原を扱うことがな
く、安全で容易且つ大量に凝集反応測定用粒子を製造す
ることができる。
定用粒子が提供された。本発明の凝集反応測定用粒子は
ポリリジンを有する抗原をリコンビナントＤＮＡより発
現することを特徴とし、これを凝集反応測定用粒子に結
合しているため、感染性を有する抗原を扱うことがな
く、安全で容易且つ大量に凝集反応測定用粒子を製造す
ることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５８１ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (56)参考文献 特開 昭64−25060（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−35364（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／8321（ＷＯ，Ａ１) Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．54，Ｎｏ．５ （1988）ｐ．633−639 Ｎｕｃｒｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．10，Ｎｏ．15（1982) ｐ．4493−4500 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．51，Ｎ ｏ．２（1984）ｐ．458−469 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/62 C07K 17/00 - 17/14 C07K 19/00 G01N 33/53 - 33/556 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／Ｇｅｎｅｓ ｅｑ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】 抗原をコードする領域を含むＤＮＡ切片
にポリリジンをコードする領域を含むＤＮＡ切片を結合
させたリコンビナントＤＮＡにより、ポリリジン結合抗
原を発現させ、得られたポリリジン結合抗原のポリリジ
ン部分をリンカーとして、該抗原と凝集反応測定用粒子
とを結合させることを特徴とする凝集反応測定用粒子の
製造方法。 - 【請求項２】 抗原が、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＴＬＶ
−Ｉ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、トレポネーマ（ＴＰ）、ストレ
プトリジン−Ｏ又はマイコプラズマである請求項１記載
の製造方法。 - 【請求項３】 ポリリジンが５つ以上のリジンからなる
請求項１又は２記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13409393A JP3254815B2 (ja) | 1993-05-13 | 1993-05-13 | 凝集反応測定用粒子の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13409393A JP3254815B2 (ja) | 1993-05-13 | 1993-05-13 | 凝集反応測定用粒子の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06319570A JPH06319570A (ja) | 1994-11-22 |
| JP3254815B2 true JP3254815B2 (ja) | 2002-02-12 |
Family
ID=15120275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13409393A Expired - Fee Related JP3254815B2 (ja) | 1993-05-13 | 1993-05-13 | 凝集反応測定用粒子の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3254815B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6778380B2 (ja) * | 2016-08-23 | 2020-11-04 | 昭和電工マテリアルズ株式会社 | 吸着材 |
-
1993
- 1993-05-13 JP JP13409393A patent/JP3254815B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．５（１９８８）ｐ．６３３−６３９ |
| Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．２（１９８４）ｐ．４５８−４６９ |
| Ｎｕｃｒｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．１５（１９８２）ｐ．４４９３−４５００ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06319570A (ja) | 1994-11-22 |
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