WO2023276937A1 - 細胞剥離剤および細胞分離方法 - Google Patents

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WO2023276937A1
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cell
ureido group
containing polymer
group
separated
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PCT/JP2022/025542
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龍太郎 今村
知之 大嶽
厚 丸山
直彦 嶋田
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日油株式会社
国立大学法人東京工業大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to a cell detachment agent and the like for use in a cell separation method using surface antigens of cells to be separated.
  • a technique of extracting normal cells from a diseased patient, culturing them outside the body, and then transplanting them back into the patient is often used.
  • This cell separation method is also widely used in the field of pathological diagnosis or clinical examination.
  • Known cell separation methods include a density gradient centrifugation method, a separation method using magnetic particles, a separation method using a substrate, and a method combining flow cytometry and a cell sorter.
  • the separation method using magnetic particles is a technique that allows a large number of cells to be treated and a high degree of cell purity after separation.
  • an antibody specific to the cells to be separated is desthiobiotinylated. After reacting this desthiobiotinylated antibody with surface antigens of the cells to be separated, they are captured using magnetic particles having streptavidin on their surfaces. After the magnetic particles are collected by magnetic force and the cells to be separated are separated from the cell group containing multiple cell types, a large amount of biotin is added as a cell detachment agent to compete with the desthiobiotin-streptavidin interaction, resulting in the separation of the cells. This is a technique for detaching separated cells and magnetic particles. However, since it is necessary to detach the cells from the separation carrier using a large amount of biotin, it is necessary to wash the separated cells several times, which poses a problem that the operation takes a long time.
  • Patent Document 1 discloses a method in which a separation carrier and cells are bound by an enzymatically degradable linker such as dextran, and the cells are detached from the separation carrier by cleaving the linker using an enzyme. is disclosed.
  • the enzyme used to decompose the linker may damage the cells after separation, so it is necessary to wash the separated cells multiple times, which is a problem that takes a long time. be.
  • Patent Document 2 discloses a cell separation method that uses strept-tagged MHC multimers as a method for specifically separating T cells. Strepttagged MHC multimers bound to surface antigens of T cells are bound to magnetic particles bearing streptactin prior to sorting of the separated cells. After that, the cells to be separated are detached with a small amount of biotin as a cell detachment agent. Although this cell separation method causes little damage to cells, the strept-tagged MHC multimers used can only be used for T cells, and cannot be applied to other types of cells, resulting in low versatility.
  • An object of the present invention is to provide a cell detachment agent that can be applied to a wide variety of cells and that does not require washing of the cells to be separated after separation in a cell separation method using surface antigens of the cells to be separated, and the cell detachment agent. It is to provide a cell separation method using
  • the present inventors have found that temperature response-induced expansion and contraction of polymer chains can be used as a driving force for detaching the cells to be separated from the separation carrier.
  • a cell detachment agent containing a non-affecting polymer can solve the above problems.
  • a cell detachment agent for detaching the cells to be separated from the separation carrier bound to the cells to be separated includes a binding ureido group-containing polymer having a side chain structure represented by the following formula (1) and having a separation carrier binding site capable of binding to the separation carrier on its side chain or end,
  • the upper critical solution temperature (UCST) of the binding ureido group-containing polymer is in the range of 4 to 40 ° C. The above cell detachment agent.
  • the separation carrier-binding site is a biotin residue, a streptavidin residue, an amino group, a carboxyl group, a mercapto group, a cyclodextrin residue, an adamantyl group, or a phenylboronic acid residue.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • a 1 represents O or NH
  • a represents an integer of 1 to 6.
  • R 2 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • a 2 represents O or NH
  • b represents an integer of 1 to 6
  • X represents the following formulas (4) to (9). selected.
  • m represents an integer of 0 to 20.
  • the ureido group-containing repeating sequence C which is a repeating ureido group-containing structure represented by the following formula (10)
  • a hydrophilic repeating sequence which is a repeating hydrophilic structure represented by the following formula (11)
  • the cell detachment agent according to [9] or [10] above which comprises the binding ureido group-containing polymer having a biotin residue on the side chain of the ureido group-containing polymer as the separation carrier-binding site.
  • the ureido group-containing repeating sequence E which is a repeating ureido group-containing structure represented by the following formula (12)
  • the hydrophilic repeating sequence which is a repeating hydrophilic structure represented by the following formula (13)
  • the cell detachment agent according to any one of [12] to [14] above, which comprises the binding ureido group-containing polymer having a biotin residue on the side chain of the ureido group-containing polymer as the separation carrier-binding site.
  • [17] A method for separating cells to be separated from a cell group containing the cells to be separated, characterized by comprising the following [Step A], [Step B], [Step C] and [Step D] Method.
  • [Step A] A step of adding a surface antigen recognizing substance of a cell to be separated having a separation carrier-binding site to a cell group containing the cell to be separated and reacting it with the surface antigen of the cell to be separated to obtain a cell-to-be-separated antigen-recognition substance complex
  • Step B] A step of obtaining a cell-to-be-separated carrier complex by allowing the to-be-separated cell-antigen recognition substance complex obtained in [Step A] to interact with the separation carrier via the separation carrier binding site
  • [Step C] A step of separating only the cells to be separated-separation carrier complexes obtained in [Step B] from the cell group containing the cells to be separated
  • [Step D]
  • the separation carrier binding site is a biotin residue, a streptavidin residue, an amino group, a carboxyl group, a mercapto group, a cyclodextrin residue, an adamantyl group, or a phenylboronic acid residue.
  • the separation carrier binding site is a biotin residue, a streptavidin residue, an amino group, a carboxyl group, a mercapto group, a cyclodextrin residue, an adamantyl group, or a phenylboronic acid residue.
  • the antigen-recognizing substance is an antibody, antibody fragment, peptide, aptamer, protein A or lectin.
  • the temperature change is heating from a temperature below the upper critical solution temperature (UCST) of the bonding ureido group-containing polymer to a temperature above the upper critical solution temperature (UCST) [17] to The cell separation method according to any one of [21].
  • UCST upper critical solution temperature
  • a cell detachment agent that can be applied to a wide variety of cells and that does not require washing of the cells to be separated after separation, and the cell detachment agent are provided.
  • a cell separation method using the method can be provided.
  • the ureido group-containing polymer is a polymer having a ureido group represented by the following formula (1) (hereinafter referred to as a ureido group) in a side chain.
  • the upper critical solution temperature (UCST) of the ureido group-containing polymer is basically the upper critical temperature of the binding ureido group-containing polymer having a separation carrier-binding site capable of binding to the separation carrier on its side chain or end, as described later. It is approximately the same as the solution temperature (UCST), preferably in the range of 4-40°C.
  • the main chain of the ureido group-containing polymer is not particularly limited, but includes ethylenically unsaturated polymers, polyallylamine, polypeptides, polyesters, polysaccharides, and the like. Among them, ethylenically unsaturated polymers, polyallylamines and polypeptides are preferred because of ease of synthesis.
  • ureido group-containing polymer When the main chain of the ureido group-containing polymer is an ethylenically unsaturated polymer, a structure having a ureido group-containing repeating sequence A, which is a repetition of the ureido group-containing structure represented by the following formula (2), is preferred.
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • a 1 represents O or NH
  • a represents an integer of 1 to 6.
  • a represents an integer of 1 to 6, preferably an integer of 1 to 4, and most preferably an integer of 2 to 3.
  • R 1 , A 1 and a in each ureido group-containing structure represented by formula (2) in the ureido group-containing repeating sequence A may be the same or different.
  • the ureido group-containing repeating sequence A includes, for example, a ureido group-containing repeating sequence A in which R 1 is a methyl group, A 1 is O, and a is 2; wherein a is 2, the ureido group-containing repeating sequence A, R 1 is a hydrogen atom, A 1 is O, and a is 2, the ureido group-containing repeating sequence A, R 1 is a hydrogen atom, Examples include a ureido group-containing repeating sequence A in which A 1 is NH and a is 2.
  • R 1 is a methyl group and A 1 is O a is 2, ureido group-containing repeating sequence A, R 1 is a hydrogen atom, A 1 is O, a is 2, ureido group-containing repeating sequence A or R 1 is a hydrogen atom, A A ureido group-containing repeating sequence A in which 1 is NH and a is 2 is preferred, and a ureido group-containing repeating sequence A in which R 1 is a methyl group, A 1 is O and a is 2 is more preferred.
  • the ureido group-containing polymer When the main chain of the ureido group-containing polymer is an ethylenically unsaturated polymer, the ureido group-containing polymer includes a monomer having a ureido group-containing structure such as the ureido group-containing structure represented by the above formula (2), and, for example, It may be a copolymer with other monomers described below, and the upper critical solution temperature (UCST) can be adjusted by copolymerization with other monomers.
  • UCST upper critical solution temperature
  • hydrophilic monomers such as hydrophilic monomers can be selected, such as glycerol (meth)acrylate, (meth)acryloyloxyethyl phosphate, N-methylcarboxybetaine ( meth)acrylate, N-methylsulfobetaine (meth)acrylate, aminoethyl (meth)acrylate, N,N'-dimethylacrylamide, S-methylsulfonium carboxylic acid (meth)acrylate, ethylene glycol (meth)acrylate, etc.
  • glycerol (meth)acrylate (meth)acryloyloxyethyl phosphate
  • N-methylcarboxybetaine ( meth)acrylate N-methylsulfobetaine (meth)acrylate
  • aminoethyl (meth)acrylate N,N'-dimethylacrylamide
  • S-methylsulfonium carboxylic acid (meth)acrylate ethylene glycol (meth)acrylate, etc.
  • acryloyloxyethyl phosphate N-methylcarboxybetaine (meth)acrylate, N-methylsulfobetaine (meth)acrylate, aminoethyl (meth)acrylate, S-methylsulfonium carboxylic acid (meth)acrylate or ethylene glycol (meth)acrylate be.
  • a structure having a hydrophilic repeating sequence B which is a repeating hydrophilic structure represented by the following formula (3), is preferred.
  • R 2 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • a 2 represents O or NH
  • b represents an integer of 1 to 6
  • X represents the following formulas (4) to (9). selected.
  • m represents an integer of 0 to 20.
  • b represents an integer of 1 to 6, preferably an integer of 1 to 4, and most preferably an integer of 2 to 3.
  • R 2 , A 2 and b in each hydrophilic structure represented by formula (3) in the hydrophilic repeating sequence B may be the same or different.
  • hydrophilic repeating sequence B for example, R 2 is a methyl group, A 2 is O, b is 2, and X is a ureido group-containing repeating sequence selected from the above formulas (4) to (9).
  • Sequence B R 2 is a methyl group, A 2 is NH, b is 2, X is a ureido group-containing repeating sequence B selected from the above formulas (4) to (9), and R 2 is hydrogen A 2 is O, b is 2, X is a ureido group-containing repeating sequence B selected from the above formulas (4) to (9), R 2 is a hydrogen atom, A 2 is NH, b is 2, and X is a ureido group-containing repeating sequence B represented by the above formulas (4) to (9), which has a ureido group-containing structure represented by the above formula (2).
  • R 2 is a methyl group
  • a 2 is O
  • b is 2
  • X is a ureido group selected from the above formulas (4) to (9).
  • ureido group-containing repeating sequence B or R 2 wherein the repeating sequence B containing R 2 is a hydrogen atom, A 2 is O, b is 2, and X is selected from the above formulas (4) to (9) is a hydrogen atom, A 2 is NH, b is 2, X is a ureido group-containing repeating sequence B represented by the above formulas (4) to (9), and most preferably R 2 is a methyl group.
  • a 2 is O
  • b is 2
  • X is a ureido group-containing repeating sequence B selected from the above formulas (4) to (9).
  • the ureido group-containing polymer whose main chain is an ethylenically unsaturated polymer is a copolymer with the other monomer
  • the molar ratio of the other monomer can be appropriately determined so that the required functions are exhibited.
  • the other monomers to be blended are preferably 70 mol% or less in all the monomers, and 60 mol. % or less, more preferably 50 mol% or less, even more preferably 40 mol% or less, particularly preferably 30 mol% or less, and 20 mol% or less. is particularly preferred.
  • the ureido group-containing repeating sequence such as the ureido group-containing repeating sequence A is preferably 30 mol% or more, more preferably 40 mol% or more, and further preferably 50 mol% or more of the entire sequence. It is preferably 60 mol % or more, particularly preferably 70 mol % or more, and particularly preferably 80 mol % or more.
  • the ureido group-containing polymer has a structure having the ureido group-containing repeating sequence A and the hydrophilic repeating sequence B
  • the molar ratio (number of moles) of the ureido group-containing repeating sequence A and the hydrophilic repeating sequence B is , 0.3 ⁇ A/(A+B).
  • the relationship of 0.4 ⁇ A / (A + B) is satisfied, and the relationship of 0.5 ⁇ A / (A + B) is more preferably satisfied, and 0.6 It is even more preferred that the relationship is within the range ⁇ A/(A+B) is satisfied, particularly preferably the relationship is within the range 0.7 ⁇ A/(A+B) is satisfied, and 0.8 ⁇ It is particularly preferred that the relationship lies within A/(A+B).
  • the ureido group-containing polymer whose main chain is an ethylenically unsaturated polymer is not particularly limited as long as it has a ureido group and has an upper critical solution temperature (UCST) in the range of 4 to 40°C.
  • the upper critical solution temperature (UCST) can be adjusted according to the type of other monomers, the combination of molecular weights, and the like.
  • the ureido group-containing repeating sequence C which is a repetition of the ureido group-containing structure represented by the following formula (10), and the hydrophilicity represented by the following formula (11)
  • a structure having a hydrophilic repeating sequence D which is a repeating structure, is preferred.
  • the ureido group-containing repeating sequence such as the ureido group-containing repeating sequence C should be 30 mol of the entire sequence. % or more, more preferably 40 mol % or more, even more preferably 50 mol % or more.
  • the molar ratio (number of moles) of the ureido group-containing repeating sequence C and the hydrophilic repeating sequence D is It is preferably in the range of 0.3 ⁇ C/(C+D). More preferably, the relationship 0.4 ⁇ C/(C+D) is satisfied, and it is particularly preferable that the relationship 0.5 ⁇ C/(C+D) is satisfied.
  • the ureido group-containing repeating sequence E which is a repetition of the ureido group-containing structure represented by the following formula (12), and the hydrophilicity represented by the following formula (13)
  • a structure having a hydrophilic repeating sequence F which is a repeating structure, is preferred.
  • c represents an integer of 0 to 6, preferably 0 to 4, and most preferably 0 or 4.
  • c is 0, it means that (CH 2 ) c does not exist in the above formula (12), and that CH and NH on both sides of (CH 2 ) c are directly single-bonded.
  • d represents an integer of 0-6, preferably 0-5, most preferably 0-4.
  • d is 0, it means that (CH 2 ) d does not exist in the above formula (12), and that CH and NH above and below (CH 2 ) d are directly single-bonded.
  • each ureido group-containing structure represented by formula (12) in the ureido group-containing repeating sequence E may be the same or different.
  • e represents an integer of 0 to 6, preferably 0 to 4, most preferably 0 or 4.
  • e is 0, it means that (CH 2 ) e does not exist in the above formula (13), and that CH and NH on both sides of (CH 2 ) e are directly single-bonded.
  • f represents an integer of 0 to 6, preferably 0 to 5, most preferably 0 to 4.
  • f is 0, it means that (CH 2 ) f does not exist in the above formula (13), and that CH and NH above and below (CH 2 ) f are directly single-bonded.
  • each hydrophilic structure represented by formula (13) in the hydrophilic repeating sequence F may be the same or different.
  • the hydrophilic repeating sequence F represented by the formula (13) includes, for example, a hydrophilic repeating sequence F ( ⁇ -polylysine) where e is 0 and f is 4, e is 0 and f is 3.
  • e is 0 and f is 4 hydrophilic repeating sequence F
  • e is 0 and f is 3 hydrophilic repeating sequence F or e is 4
  • the ureido group-containing repeating sequence such as the ureido group-containing repeating sequence E should be 30 mol of the entire sequence. % or more, more preferably 40 mol % or more, even more preferably 50 mol % or more.
  • the molar ratio (number of moles) of the ureido group-containing repeating sequence E and the hydrophilic repeating sequence F is It is preferably in the range of 0.3 ⁇ E/(E+F). More preferably, the relationship 0.4 ⁇ E/(E+F) is satisfied, and it is particularly preferable that the relationship 0.5 ⁇ E/(E+F) is satisfied.
  • the molecular weight of the ureido group-containing polymer can be appropriately determined by adjusting the polymerization conditions and the like so that the required performance can be exhibited. , preferably 10,000 to 2,000,000, more preferably 20,000 to 1,000,000, in order to increase the cell separation efficiency of the cell detachment agent of the present invention.
  • the molecular weight of the ureido group-containing polymer is 5,000,000 or less, the solubility of the cell detachment agent in water is further increased, which is preferable in that it is easier to use as a cell detachment agent.
  • Methods for producing the ureido group-containing polymer are already known, and for example, the method described in Japanese Patent No. 5800323 can be used. Specifically, a method of dissolving a primary amine-containing polymer in a solvent and reacting it with cyanate (MCNO) can be used.
  • MCNO cyanate
  • the above-mentioned primary amine-containing polymer is a polymer having a primary amino group in its side chain.
  • main chain of the primary amine-containing polymer is not particularly limited, it may be the same as those exemplified for the main chain of the ureido group-containing polymer.
  • the molecular weight of the primary amine-containing polymer can be appropriately determined by adjusting the polymerization conditions and the like so that the required performance can be exhibited. , preferably 10,000 to 2,000,000, more preferably 20,000 to 1,000,000, in order to increase the cell separation efficiency of the cell detachment agent of the present invention.
  • the molecular weight of the primary amine-containing polymer is 5,000,000 or less, the solubility of the cell detachment agent in water is further increased, which is preferable in that it can be used more easily as a cell detachment agent.
  • solvents for dissolving the primary amine-containing polymer include water, buffers such as imidazole buffers, organic solvents, and mixtures thereof.
  • the organic solvent is not particularly limited as long as it dissolves the primary amine-containing polymer.
  • examples include alcohols such as methanol, ethanol (EtOH), 1-propanol, 2-propanol, and 1-butanol; Dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), tetrahydrofuran (THF), 1,4-dioxane and the like can be mentioned.
  • the concentration of the primary amine-containing polymer in the primary amine-containing polymer solution used in the reaction is not limited, but is usually 1 to 80% by weight, preferably 2 to 50% by weight, more preferably 5 to 40% by weight. can.
  • concentration of the primary amine-containing polymer is 80% by weight or less, the reactivity with the cyanate is easily maintained without excessively increasing the viscosity of the solution, which is preferable.
  • cyanate (MCNO) to be reacted with the primary amine-containing polymer alkali metal salts of cyanic acid such as potassium cyanate and sodium cyanate can be suitably exemplified. Potassium cyanate is preferred.
  • the ratio of the cyanate to be used is not particularly limited, but is preferably 0.4 mol or more per 1 mol of the primary amino group in the primary amine-containing polymer. When the proportion of the cyanate used is 0.4 mol or more, the ureido groups can be introduced more sufficiently, and the upper critical solution temperature can be more easily achieved.
  • the reaction between the primary amine-containing polymer and cyanate (MCNO) is preferably carried out while stirring.
  • the reaction temperature is not particularly limited, it is desirable to maintain it at preferably 0 to 100°C, more preferably 30 to 60°C.
  • the reaction time is also not particularly limited, but usually 1 to 48 hours, preferably 1 to 25 hours, to obtain a solution of the ureido group-containing polymer. When the reaction time is 1 hour or more, the reaction tends to proceed sufficiently.
  • the resulting ureido group-containing polymer can be used as it is in the next step without being purified, or can be isolated and purified by treatments such as reprecipitation, gel filtration chromatography, and dialysis.
  • the ureido group-containing polymer can also be produced by radical polymerization of an ethylenically unsaturated ureido monomer such as the ureido monomer represented by the following formula (14).
  • the radical polymerization of the ethylenically unsaturated ureido monomer can also be copolymerized with other monomers.
  • the ethylenically unsaturated ureido monomer (and the other monomers) can be radically polymerized by bulk polymerization, but it is also possible to add a solvent for polymerization.
  • the solvent is not particularly limited as long as it dissolves the ethylenically unsaturated ureido monomer (and the other monomers), and common solvents can be used.
  • it is selected from polar aprotic solvents such as acetone, dioxane, N,N-dimethylformamide, dimethylsulfoxide and tetrahydrofuran, polar protic solvents such as methanol, ethanol and water, and mixtures thereof.
  • Radical polymerization of the ethylenically unsaturated ureido monomer (and other monomers) can be carried out by thermal polymerization or photopolymerization.
  • the thermal polymerization can be performed using, for example, a thermal polymerization initiator.
  • Thermal polymerization initiators include, for example, peroxide-based radical initiators (benzoyl peroxide, ammonium persulfate, etc.), or azo-based radical initiators (azobisisobutyronitrile (AIBN), 2,2′-azobis -dimethylvaleronitrile (ADVN), etc.), 2,2′-azobiscyanovaleric acid (ACVA), azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride (VA-044), water-soluble or oil
  • a soluble redox radical initiator (composed of dimethylaniline and benzoyl peroxide) can be used.
  • the amount of the radical initiator to be used is preferably 0.01 to 10 parts by mass per 100 parts by mass of the ethylenically unsaturated ureido monomer (and other monomers).
  • the polymerization temperature and polymerization time can be appropriately selected and determined depending on the type of radical initiator and the presence and type of other monomers. For example, when radical polymerization of the ethylenically unsaturated ureido monomer (and other monomers) is carried out using AIBN, a polymerization temperature of 40 to 90° C. and a polymerization time of 2 to 48 hours are suitable.
  • the photopolymerization can be carried out, for example, by ultraviolet (UV) radiation with a wavelength of 254 nm or electron beam (EB) radiation with an acceleration voltage of 150 to 300 kV.
  • UV ultraviolet
  • EB electron beam
  • the use of a photopolymerization initiator is optional, but it is preferable to use it in terms of reaction time.
  • photopolymerization initiators include 2-hydroxy-2-methyl-1-phenyl-1-propanone and 1-hydroxy-cyclohexylphenyl ketone. -Phenyl-1-propanone is preferred.
  • a chain transfer agent can also be used in the radical polymerization of the ethylenically unsaturated ureido monomer (and the other monomers).
  • chain transfer agents include 2-mercaptoethanol, 1-mercapto-2-propanol, 3-mercapto-1-propanol, p-mercaptophenol, mercaptoacetic acid, 2-mercaptopropionic acid, 3-mercaptopropionic acid, 2-mercapto nicotinic acid and the like.
  • Radical polymerization of the ethylenically unsaturated ureido monomer (and other monomers) can also be carried out by living radical polymerization, specifically atom transfer radical polymerization (ATRP), reversible addition-fragmentation chain transfer.
  • a polymerization method (RAFT polymerization method), a nitroxide-mediated polymerization method (NMP method), and the like can be used.
  • the reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization method is preferred because it does not use a metal and does not lower the enzymatic activity when used as a raw material for the cell detachment agent of the present invention.
  • a known method can be used as the RAFT polymerization method, and for example, the methods described in WO99/31144, WO98/01478 and US Pat. No. 6,153,705 are effective. Radical polymerization of the ethylenically unsaturated ureido monomer (and other monomers) using RAFT polymerization can be carried out by adding a RAFT agent to ordinary radical polymerization.
  • RAFT agent examples include 4-cyanopentanoic dithiobenzoate, 2-cyano-2-propylbenzodithioate, benzylbenzodithioate, 2-phenyl-2-propylbenzodithioate, methyl 2-phenyl-2-(phenyl- carbonothioylthio)acetate, 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid N-succinimidyl ester, 4-cyano-4-(dodecylsulfanyl-thiocarbonyl)sulfanylpentanoic acid, 4-cyano- 4-(dodecylsulfanyl-thiocarbonyl)sulfanylpentanol, 2-cyano-2-propyldodecyltrithiocarbonate, 2-(dodecylthiocarbonylthioylthio)-2-methylpropionic acid, 4-cyano-4-(do-4
  • the ethylenically unsaturated ureido monomer can form a random copolymer or a block copolymer with the other monomers, but a random copolymer is preferred in order to bring out the performance of the ureido group-containing polymer.
  • the binding ureido group-containing polymer is a polymer obtained by adding the separation carrier-binding site to the ureido group-containing polymer.
  • the separation carrier-binding site is a site that can bind to the separation carrier, and is not particularly limited as long as it is commonly used in this field. Examples include a hydrophobic substituent, a biotin residue, and a desthiobiotin residue.
  • avidin residue, streptavidin residue amino group, carboxyl group, mercapto group, glutathione residue, glutathione transferase residue, lectin residue, polysaccharide residue such as cyclodextrin residue, adamantyl group, phenylboronic acid residue groups, preferably biotin residues, streptavidin residues, amino groups, carboxyl groups, mercapto groups, cyclodextrin residues, adamantyl groups or phenylboronic acid residues.
  • the separation carrier-binding site may be contained at the end of the ureido group-containing polymer or within a repeating sequence (side chain, etc.).
  • Methods for incorporating the separation carrier-binding site into the ureido group-containing polymer include addition, click reaction, amidation, esterification, thioesterification, carbonate formation, Schiff base formation reaction, reductive amination, and radical-mediated cupping. Ring reaction, Diels-Alder reaction, disulfidation, Michael addition reaction, ene-thiol reaction, coupling reaction via aromatic boron compound, tertiary sulfonium formation reaction, quaternary ammonium formation reaction, etc. From a height perspective, click reactions, amidations or esterifications are preferred.
  • the content of the separation carrier-binding site is not particularly limited as long as the binding ureido group-containing polymer is bound to the separation carrier. It suffices to contain from one molecule to ten molecules of the separation carrier-binding site, preferably from 0.2 to 4 molecules, more preferably from 0.2 to 2 molecules. In the case of 10 molecules or less, cross-linking between separation carriers is more difficult to occur.
  • the separation carrier-binding site may be contained in 0.01 to 20 units, preferably 0.01 to 20 units per 100 repeating units. 01 to 10 units, more preferably 0.1 to 5 units. When the content is 20 units or less, cross-linking between separation carriers is less likely to occur.
  • the ureido group-containing polymer can be synthesized by a living radical polymerization method.
  • atom transfer radical polymerization method ATRP method
  • Reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization method RAFT polymerization method
  • NMP method nitroxide-mediated polymerization method
  • the reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization method is preferable for the purpose of the cell detachment agent of the present invention because it does not use metals and does not lower the enzymatic activity.
  • a known method can be used as the RAFT polymerization method, and for example, the methods described in WO99/31144, WO98/01478 and US Pat. No. 6,153,705 are effective.
  • radical polymerization of the ureido group-containing polymer is carried out using RAFT polymerization, it can be carried out by adding a RAFT agent to ordinary radical polymerization.
  • RAFT agent examples include 4-cyanopentanoic dithiobenzoate, 2-cyano-2-propylbenzodithioate, benzylbenzodithioate, 2-phenyl-2-propylbenzodithioate, methyl 2-phenyl-2-(phenyl- carbonothioylthio)acetate, 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid N-succinimidyl ester, 4-cyano-4-(dodecylsulfanyl-thiocarbonyl)sulfanylpentanoic acid, 4-cyano- 4-(dodecylsulfanyl-thiocarbonyl)sulfanylpentanol, 2-cyano-2-propyldodecyltrithiocarbonate, 2-(dodecylthiocarbonylthioylthio)-2-methylpropionic acid, 4-cyano-4-(do-4
  • the synthesis of the ureido group-containing polymer can also be performed by a living anion polymerization method.
  • a living anion polymerization method For example, it is a method of ring-opening polymerization using a polymerization initiator such as ⁇ -amino acid-N-carboxyanhydride (NCA) or N-diphenyl carbonate amino acid (DPC) in which the amino group of ornithine or lysine is protected.
  • a polymerization initiator such as ⁇ -amino acid-N-carboxyanhydride (NCA) or N-diphenyl carbonate amino acid (DPC)
  • the binding ureido group-containing polymer for example, the main chain of the ureido group-containing polymer represented by the following formula (15) is an ethylenically unsaturated polymer, and the biotin residue is used as the separation carrier binding site.
  • the binding ureido group-containing polymer for example, the main chain of the ureido group-containing polymer represented by the following formula (15) is an ethylenically unsaturated polymer, and the biotin residue is used as the separation carrier binding site.
  • the above-mentioned binding ureido group-containing polymer having at the end of the containing polymer examples thereof include the above-mentioned binding ureido group-containing polymer having at the end of the containing polymer.
  • the binding ureido group-containing polymer for example, the main chain of the ureido group-containing polymer represented by the following formula (16) is polyallylamine, and a biotin residue is added to the ureido group-containing polymer as a separation carrier binding site.
  • the binding ureido group-containing polymer for example, the main chain of the ureido group-containing polymer represented by the following formula (16) is polyallylamine, and a biotin residue is added to the ureido group-containing polymer as a separation carrier binding site.
  • examples thereof include the above-mentioned binding ureido group-containing polymers having side chains.
  • the binding ureido group-containing polymer for example, the main chain of the ureido group-containing polymer represented by the following formula (17) is polyallylamine, and an amino group is attached to the side of the ureido group-containing polymer as a separation carrier binding site.
  • the binding ureido group-containing polymer having a chain examples thereof include the above-mentioned binding ureido group-containing polymer having a chain.
  • the binding ureido group-containing polymer for example, the main chain of the ureido group-containing polymer represented by the following formula (18) is a polypeptide, and a biotin residue is added to the ureido group-containing polymer as a separation carrier binding site.
  • the binding ureido group-containing polymer for example, the main chain of the ureido group-containing polymer represented by the following formula (18) is a polypeptide, and a biotin residue is added to the ureido group-containing polymer as a separation carrier binding site.
  • examples thereof include the above-mentioned binding ureido group-containing polymers having side chains.
  • the upper critical solution temperature (UCST) is defined as the temperature at which the binding ureido group-containing polymer becomes insoluble in water or medium and forms an insoluble phase, and the binding ureido group-containing polymer dissolves and dissolves in water or medium. It is the boundary temperature with the temperature that forms a phase.
  • the upper critical solution temperature (UCST) is not particularly limited, but it must be a temperature suitable for cell culture, so it is in the range of 2 to 60°C, preferably 4 to 50°C, more preferably 4 to 40°C.
  • the upper critical solution temperature (UCST) of the ureido group-containing polymer is substantially the same as the upper critical solution temperature (UCST) of the bonding ureido group-containing polymer.
  • the upper critical solution temperature is obtained by dissolving the (bonding) ureido group-containing polymer in water or a medium at a concentration of at least 1 mM, measuring the transmittance of visible light at 500 nm in a quartz cell while cooling, It can be determined as the temperature at which the visible light transmittance of a clear solution when the compound is completely dissolved is 100% and the transmittance starts to decrease when the temperature is lowered.
  • the cell detachment agent in the present invention is a material for detaching cells to be separated from the separation carrier, and contains at least the binding ureido group-containing polymer. Furthermore, in addition to the binding ureido group-containing polymer, water or a medium can be usually contained, and additives such as chelating agents and proteins can be contained for more efficient cell separation.
  • Purified water, pure water, ion-exchanged water, etc. are preferable as the water, and various buffer solutions containing water may be used.
  • buffers commonly used in this field can be used as long as they do not impair physiological activities such as enzymatic activity and antigenicity of proteins. Examples thereof include phosphate buffer, Tris buffer, Good's buffer, glycine buffer, borate buffer and the like, and these may be mixed and used.
  • the above medium is not particularly limited as long as it is suitable for the cells to be separated, and general cell culture medium can be used.
  • Dulbecco's modified Eagle MEM medium DMEM
  • ⁇ -MEM medium Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium
  • F12 medium TC199 medium
  • GMEM medium etc.
  • bovine Supplements such as fetal serum (FBS), glutamine, bovine serum albumin, human serum albumin, and antibiotics may be added.
  • additives examples include other reagents and the like that are usually used in this field for the purpose of improving the cell separation efficiency. activators and the like.
  • chelating agent examples include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 1,2-bis(O-aminophenoxide)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid (BAPTA), bicine, trans-1, 2-diaminocyclohexane-N,N,N',N'-tetraacetic acid (CyDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), iminodiacetic acid, triethylenetetraminehexaacetic acid and the like.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • BAPTA 1,2-bis(O-aminophenoxide)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid
  • BAPTA 1,2-bis(O-aminophenoxide)ethane-N,N,N',N'-tetraacetic acid
  • BAPTA 1,2-bis(O-aminophenoxide)ethane-N,N
  • sugars include monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.
  • monosaccharides include allose, glucose (glucose), altrose, mannose, galactose, psicose, fructose (fructose), sorbose, ribose, xylose
  • arabinose disaccharides include xylulose, trehalose, isotrehalose, maltose (maltose), cellobiose, and isomaltose
  • oligosaccharides include fructo-oligosaccharide, galacto-oligosaccharide, milk oligosaccharide, deoxyribose, and fucose.
  • rhamnose glucuronic acid
  • galacturonic acid glucosamine
  • galactosamine xylitol sorbitol
  • ascorbic acid vitamin C
  • glucuronolactone gluconolactone, and the like.
  • polysaccharides examples include chitosan, dextran, cyclodextrin, hyaluronic acid, carboxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxyethylstarch, starch, and pullulan.
  • proteins examples include fetal bovine serum (FBS), antifreeze peptide, bovine serum albumin, collagen, gelatin, casein, and the like.
  • FBS fetal bovine serum
  • antifreeze peptide fetal bovine serum
  • bovine serum albumin bovine serum albumin
  • collagen gelatin, casein, and the like.
  • salts include amino acids and amino acid salts such as glycine, alanine, serine, threonine, glutamic acid, aspartic acid, glutamine, asparagine, lysine and histidine, peptides such as glycylglycine, phosphates, borates, Examples include inorganic salts such as sulfates and tris salts, organic acids such as flavins, acetic acid, citric acid, malic acid, maleic acid and gluconic acid, and salts of organic acids.
  • vitamins examples include vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B7, vitamin B9, vitamin B12, vitamin C, and vitamin-like substances.
  • surfactants examples include Triton, polyoxyethylene alkyl ether, Tween 20, Pluronic, and the like.
  • the content of the binding ureido group-containing polymer contained in the cell detachment agent of the present invention is not particularly limited as long as it can be used for cell separation. % or more by mass is more preferable.
  • the additive contained in the cell detachment agent of the present invention is not particularly limited as long as it can be used for cell separation. % or more by mass is more preferable.
  • the material of the separation carrier is not particularly limited, but plastics, polysaccharides, metals, magnetic metals, ceramics and the like are used, and a plurality of these materials may be used.
  • plastics include acrylic polymers such as polymethyl methacrylate, various silicone rubbers such as polydimethylsiloxane, polystyrene, polyethylene terephthalate, and polycarbonate.
  • the shape of the separation carrier may be, for example, container-like, plate-like, particulate, fiber-like, or porous with holes or grooves.
  • container-like, plate-like, particulate, fibrous, or magnetic particles are preferable because of ease of handling during cell separation, and magnetic particles are particularly preferable.
  • the separation carrier is magnetic particles
  • the average particle diameter is preferably 0.9 nm or more and less than 5000 nm. , 2.9 nm or more and less than 4000 nm.
  • Materials for the magnetic particles include, for example, magnetite, nickel oxide, ferrite, cobalt iron oxide, barium ferrite, carbon steel, tungsten steel, KS steel, rare earth cobalt magnets, and hematite.
  • the surface of the separation carrier may have various functional groups such as hydroxyl group, tosyl group, carboxyl group, amino group, epoxy group, mercapto group, sulfide group, polyhydric alcohol residue and the like.
  • residues of various compounds such as residues of proteins such as streptavidin, gelatin, collagen, and fibronectin; residues of polysaccharides such as dextran, pullulan, chitosan, and cyclodextrin; residues of chelating agents such as ethylenediamine; It may have a surfactant residue such as
  • the combination of the surface of the separation carrier and the binding site of the separation carrier is not particularly limited as long as it can bind.
  • a combination of streptavidin and biotin residues, a combination of streptavidin and desthiobiotin residues, a combination of tosyl and amino groups, a combination of epoxy and amino groups, or carboxyl A combination of a group and an amino group is preferred, and a combination of a streptavidin residue and a biotin residue, a combination of a streptavidin residue and a desthiobiotin residue, or a combination of a tosyl group and an amino group is most preferred.
  • the separation of the cells to be separated from the cell group containing the cells to be separated includes the following [Step A], [Step B], [Step C] and [Step D]. method.
  • Step A A step of adding a surface antigen recognizing substance of a cell to be separated having a separation carrier-binding site to a cell group containing the cell to be separated, and reacting it with the surface antigen of the cell to be separated to obtain a cell-to-be-separated antigen-recognition substance complex.
  • Examples of the above cells include established cells for culture, fertilized eggs and egg cells of animals including humans.
  • stem cells such as sperm cells, ES cells, iPS cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, umbilical cord blood cells, hepatocytes, nerve cells, cardiomyocytes, vascular endothelial cells, vascular smooth muscle cells, blood cells, etc.
  • Animal cells including human or plant cells can also be mentioned.
  • the above-mentioned cells to be separated refer to a group of cells obtained as a result of cell separation using the cell detachment agent of the present invention. There may be.
  • the cell group containing the cells to be separated is preferably a group of cells containing 0.1% or more of the cells to be separated, and the type of cells contained is not limited.
  • the surface antigen may be present in any of blood, body fluids, tissue sections, cell aggregates, suspension cells, adherent cells, etc., and these cells may be live or dead cells. .
  • the surface antigen-recognizing substance examples include any antibody, antibody derivative, fragmented antibody, or fragmented antibody derivative against an antigen expressed intracellularly or extracellularly, a TCR molecule targeting a peptide/MHC complex, and cell adhesion.
  • Receptor molecules, receptors for co-stimulatory molecules, artificially engineered binding molecules, protein A, lectins, peptides targeting cell surface molecules, aptamers and the like can be mentioned.
  • a commercially available reagent can be used as the antigen-recognizing substance for the cells to be separated having the separation carrier-binding site, but it is also possible to prepare it separately according to the antigen-recognizing substance to be used.
  • Methods for incorporating the separation carrier binding site into the surface antigen recognition substance include addition, click reaction, amidation, esterification, thioesterification, carbonate formation, Schiff base formation reaction, reductive amination, and radical-mediated coupling.
  • the reaction between the surface antigen-recognizing substance of the cells to be separated and the surface antigens of the cells to be separated having the separation carrier-binding site is not particularly limited as long as it does not adversely affect the cells to be separated, but the reaction temperature is from 2°C. A range of 25°C is typical, preferably 2°C to 20°C, more preferably 2°C to 10°C.
  • the reaction time is also not particularly limited, but is generally in the range of 10 minutes to 2 hours, preferably in the range of 10 minutes to 1 hour, more preferably in the range of 10 minutes to 30 minutes.
  • the reaction between the surface antigen-recognizing substance of the cells to be separated and the surface antigens of the cells to be separated having the separation carrier-binding site can be carried out, for example, in a buffer for cell separation, unless the cells to be separated are adversely affected.
  • buffers and media commonly used in this field can be used. Examples thereof include phosphate buffer, Tris buffer, Good's buffer, glycine buffer, borate buffer and the like, and these may be mixed and used. Phosphate buffer is preferred.
  • Dulbecco's Modified Eagle MEM medium (DMEM), ⁇ -MEM medium, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium, F12 medium, TC199 medium, GMEM medium, etc.
  • bovine Supplements such as fetal serum (FBS), glutamine, and antibiotics may be added, but a serum-free medium is preferred so as not to impair the reactivity of the antigen recognition substance.
  • FBS fetal serum
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • the concentration of the chelating agent in the cell separation buffer is in the range of 0.1 mM to 20 mM, preferably 0.5 mM to 10 mM, more preferably 1 mM to 5 mM.
  • concentration of the chelating agent is 0.1 mM or more, the effect of inhibiting cell aggregation is more likely to be exhibited, while when it is 20 mM or less, cytotoxicity and the like are less likely to be exhibited.
  • polysaccharides, proteins, surfactants, etc. may be added in order to promote the reaction between the surface antigen-recognizing substance of the cells to be separated having the separation carrier-binding site and the surface antigen of the cells to be separated.
  • the polysaccharide include the same polysaccharides as those exemplified as the additive in the cell detachment agent
  • examples of the protein include those exemplified as the protein as the additive in the cell detachment agent.
  • the surfactant include the same surfactants as those exemplified as additives in the cell detachment agent, but dextran, bovine serum albumin or Tween 20 are preferable, Bovine serum albumin is more preferred.
  • Polysaccharides, proteins, surfactants, and the like in the cell separation buffer are not particularly limited as long as they can be used for cell separation, but are preferably 0.01% by mass or more, more preferably 0.05% by mass or more. When polysaccharides, proteins, surfactants, etc. in the cell separation buffer are within the above ranges, the above additives are more likely to exhibit sufficient effects.
  • the separated cell-antigen recognition substance complex can be obtained.
  • a specific example of [Step A] is the step of reacting the surface antigen of the cells to be separated with a biotinylated antibody.
  • Step B the cell-to-be-separated cell-antigen recognition substance complex obtained in [Step A] is allowed to interact with the separation carrier via the separation carrier binding site to obtain the cell-to-be-separated carrier complex.
  • the reaction between the cell-to-be-separated-antigen recognition substance complex and the separation carrier is not particularly limited as long as it does not adversely affect the cells to be separated.
  • the reaction temperature is generally in the range of 2°C to 25°C, preferably in the range of 2°C to 20°C, more preferably in the range of 2°C to 10°C.
  • the reaction time is also not particularly limited, but is generally in the range of 10 minutes to 2 hours, preferably in the range of 10 minutes to 1 hour, more preferably in the range of 10 minutes to 30 minutes.
  • a cell-to-be-separated-separation carrier complex can be obtained by performing the above [Step B].
  • a specific example of [step B] is a step of binding cells to be separated to a separation carrier via a biotinylated antibody.
  • Step C This is a step of separating only the cells to be separated-separation carrier complexes obtained in [Step B] from the cell group containing the cells to be separated.
  • the method for separating only the cell-to-be-separated-separation carrier complexes from the cell group containing the cells to be separated differs depending on the separation carrier. be.
  • the separation carrier is particles such as latex particles, sedimentation by time change or by centrifugation is possible.
  • the separation carrier is a flat plate, it can be simply removed from the cell separation buffer.
  • washing is not particularly limited as long as it does not adversely affect the cells to be separated.
  • the above buffer for cell separation can be used.
  • [Step C] By performing the above [Step C], the cells to be separated-separation carrier complexes can be separated.
  • a specific example of [Step C] is a step of removing the cell-to-be-separated carrier complex from the cell group containing the cells to be separated by magnetism, centrifugation, or the like.
  • Step D In this step, the cell detachment agent is added to the cell-separation carrier complex obtained in [Step C], and the cells are separated by changing the temperature.
  • the cell detachment agent can be added directly to the cell-to-be-separated-separation carrier complex, or it may be added after being mixed with the cell separation buffer.
  • the temperature at the time of addition is not particularly limited as long as it is lower than the upper critical solution temperature (UCST) of the binding ureido group-containing polymer, which is a component of the cell detachment agent used, but is more preferably a temperature that does not adversely affect cells. is preferably in the range of 4 to 10°C.
  • the reaction time is also not particularly limited, but is generally in the range of 10 minutes to 2 hours, preferably in the range of 10 minutes to 1 hour, more preferably in the range of 10 minutes to 30 minutes.
  • the temperature change in the above [Step D] means heating from a temperature below the upper critical solution temperature (UCST) of the binding ureido group-containing polymer, which is a constituent of the cell detachment agent, to a temperature above the upper critical solution temperature (UCST). It is to be.
  • the temperature after heating is preferably in the range of 25 to 40° C. as it does not adversely affect the cells.
  • the cells to be separated can be separated from the cell-to-be-separated carrier complex.
  • the cell-to-be-separated carrier complex and the cell detachment agent are reacted, and the temperature is changed to break the interaction between the separation carrier and the cell to be separated, thereby separating the cell. This is the process of taking out.
  • Aminoethyl methacrylate hydrochloride (20.0 g, 120 mmol) was added to an eggplant flask and dissolved in 90 mL of ion-exchanged water. Potassium cyanate (10.7 g, 132 mmol) was added and stirred at room temperature. After stirring for 2 hours, the reaction solution was lyophilized and resuspended in 200 mL of acetone. After that, the insoluble matter was filtered, and the solvent was distilled off under reduced pressure from the obtained mixed solution. Then, it was purified by silica gel chromatography with ethyl acetate/methanol 9/1 (v/v) to obtain ureido monomer (1).
  • ureido monomer (1) (380 mg), 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine (2) (MPC, 32.8 mg), 2-(dodecylthiocarbonothioylthio)-2-methylpropionic acid-3-azido- 1-Propanol ester (0.90 mg) and azobisisobutyronitrile (0.164 mg) were added and dissolved in dimethylsulfoxide (2.4 mL) and ethanol (0.6 mL). After bubbling with nitrogen gas, the reaction solution was heated to 65° C. and reacted for 20 hours. A ureido group-containing polymer A was obtained by reprecipitating the polymerization solution with acetone.
  • the number average molecular weight of the resulting ureido group-containing polymer A was determined by gel permeation chromatography using a multi-angle light scattering detector (MALS) manufactured by WYATT as a detector.
  • MALS multi-angle light scattering detector
  • LC-720AD manufactured by Shimadzu Corporation was used as a pump
  • RID10A manufactured by Shimadzu Corporation as a detector (differential refractometer)
  • SPD-20A as a detector (UV).
  • As the column two columns of Tosoh Corporation's TSKGel G3000PWXL and TSKGel G5000PWXL (column size: 4.6 mm x 25 cm) were used.
  • Distilled water/acetonitrile (5/5 v/v) in which 100 mM sodium nitrate was dissolved was used as the developing solvent.
  • the measurement conditions were a flow rate of 0.6 ml/min, a column temperature of 40°C, a sample concentration of 2 mg/mL, and an injection volume of 100 ⁇ L.
  • the number average molecular weight of the ureido group-containing polymer A was 308,000.
  • the phase transition temperature of the resulting ureido group-containing polymer A was measured with an ultraviolet-visible spectrophotometer.
  • Ureido group-containing polymer A was dissolved in a cell separation buffer (phosphate-buffered saline (PBS) + 0.1% bovine serum albumin (BSA) + 2 mM EDTA) to a concentration of 2.5 mg/mL.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • the transmittance (%) of the solution was measured with an ultraviolet-visible spectrophotometer.
  • the transmittance (%) of the solution was calculated from the following formula.
  • the phase transition temperature of the ureido group-containing polymer A was 20°C.
  • the number average molecular weight of the resulting ureido group-containing polymer B was determined in the same manner as in Synthesis Example 2-1. As a result of gel permeation chromatography measurement, the number average molecular weight of the ureido group-containing polymer B was 36,000.
  • phase transition temperature of the resulting ureido group-containing polymer B was determined in the same manner as in Synthesis Example 2-1.
  • the phase transition temperature was 30°C as a result of measurement with a UV-visible spectrophotometer.
  • the number average molecular weight of the resulting ureido group-containing polymer C was determined in the same manner as in Synthesis Example 2-1. As a result of gel permeation chromatography measurement, the number average molecular weight of the ureido group-containing polymer C was 260,000.
  • phase transition temperature of the resulting ureido group-containing polymer C was determined in the same manner as in Synthesis Example 2-1.
  • the phase transition temperature was 20°C as a result of measurement with a UV-visible spectrophotometer.
  • Example 1-1> Human-derived leukemia cell line HL-60 (5 ⁇ 10 6 cells/mL, 200 ⁇ L) suspended in serum-free RPMI1640 medium was dispensed into an Eppendorf tube to prepare a cell suspension. The number of cells in the prepared cell suspension was counted (count A). Biotinylated anti-CD45 antibody (4 ⁇ L) was added to the cell suspension and shaken at 4° C. for 10 minutes. After that, 300 ⁇ L of cell separation buffer (phosphate-buffered saline (PBS)+0.1% bovine serum albumin (BSA)+2 mM EDTA) was added and centrifuged at 350 g for 10 minutes.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • measurement sample X was counted using a ThermoFisher cell counter (Countess 2) after trypan blue treatment.
  • the viability of the measurement sample X was determined by a ThermoFisher cell counter (Countess 2) after culturing at 37° C. for 6 hours without washing after separation, followed by treatment with trypan blue.
  • the recovery rate of HL-60 cells after cell separation was calculated by the following formula (5).
  • the survival rate was calculated by the following formula (6). Table 1 shows the evaluation results.
  • Examples 1-2 to 1-4 A cell separation test using a single cell type was conducted in the same manner as in Example 1-1 except that the separation carrier and cell detachment agent shown in Table 1 were used. Table 1 shows the evaluation results.
  • Example 2-1> Cell separation test using multiple cell types
  • HeLa cells and HL-60 cells pre-stained with Hoechest 33342 were mixed in an Eppendorf tube at a cell count of 33:67 to prepare a multi-cell mixture (total cell count 5 ⁇ 10 6 cells/mL, 200 ⁇ L) ( Measurement sample A).
  • a biotinylated anti-CD45 antibody (4 ⁇ L) was added thereto and shaken at 4° C. for 10 minutes. After that, 300 ⁇ L of cell separation buffer (phosphate-buffered saline (PBS)+0.1% bovine serum albumin (BSA)+2 mM EDTA) was added and centrifuged at 350 g for 10 minutes.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • measurement sample B CD45-positive cells were stained using a fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled secondary antibody. It was later placed in a BD Truecount Tube and analyzed by an LSRFortessa X-20 flow cytometer. The survival rate of measurement sample B was determined by a ThermoFisher cell counter (Countess 2) after culturing at 37° C. for 6 hours without washing after isolation, followed by treatment with trypan blue.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Example 2-2 to 2-4 A cell separation test using multiple cell types was conducted in the same manner as in Example 2-1 except that the separation carrier and cell detachment agent shown in Table 2 were used. Table 2 shows the evaluation results.
  • ⁇ Comparative Example 1 Human-derived leukemia cell line HL-60 (5 ⁇ 10 6 cells/mL, 200 ⁇ L) suspended in serum-free RPMI1640 medium was dispensed into an Eppendorf tube to prepare a cell suspension. The number of cells in the prepared cell suspension was counted (count A). Desthiobiotinylated anti-CD45 antibody (4 ⁇ L) was added to the cell suspension and shaken at 4° C. for 10 minutes. After that, 300 ⁇ L of cell separation buffer (phosphate-buffered saline (PBS)+0.1% bovine serum albumin (BSA)+2 mM EDTA) was added and centrifuged at 350 g for 10 minutes.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • ThermoFisher cell counter (Countess 2).
  • the viability of the measurement sample X was determined by a ThermoFisher cell counter (Countess 2) after culturing at 37° C. for 6 hours without washing after separation, followed by treatment with trypan blue.
  • the recovery rate of HL-60 cells after cell separation was calculated by the above formula (5).
  • the survival rate was calculated by the above formula (6). Table 1 shows the evaluation results.
  • ⁇ Comparative Example 2 HeLa cells and HL-60 cells pre-stained with Hoechest 33342 were mixed in an Eppendorf tube at a cell count of 33:67 to prepare a multi-cell mixture (total cell count 5 ⁇ 10 6 cells/mL, 200 ⁇ L) ( Measurement sample A). A desthiobiotinylated anti-CD45 antibody (4 ⁇ L) was added thereto and shaken at 4° C. for 10 minutes. After that, 300 ⁇ L of cell separation buffer (phosphate-buffered saline (PBS)+0.1% bovine serum albumin (BSA)+2 mM EDTA) was added and centrifuged at 350 g for 10 minutes.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • Measurement samples A and B were stained for CD45-positive cells using a fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled secondary antibody. It was later placed in a BD Truecount Tube and analyzed by an LSRFortessa X-20 flow cytometer. The survival rate of the measurement sample B was determined by a ThermoFisher cell counter (Countess 2) after culturing at 37° C. for 6 hours without washing, followed by treatment with trypan blue.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • a driving force for detaching the cells to be separated from the separation carrier the expansion and contraction of the polymer chain due to temperature response can be used, and a polymer that does not affect the cells after separation, such as the surface antigen of the cells to be separated, was used. It is found that a cell detachment agent containing a binding ureido group-containing polymer having a separation carrier-binding site capable of binding to a separation carrier is useful in a cell separation method. Furthermore, it is also clear that highly versatile biotinylated antibodies can be used in the cell separation method using the cell detachment agent.
  • a cell detachment agent that can be applied to a wide variety of cells and that does not require washing of the cells to be separated after separation, and the cell detachment agent are used.
  • a method for isolating cells is provided.

Abstract

本発明は、被分離細胞と結合した分離担体から被分離細胞を剥離するための細胞剥離剤であって、上記細胞剥離剤は、下記式（１）で表される側鎖構造を有し上記分離担体と結合可能な分離担体結合部位をその側鎖または末端に有する結合性ウレイド基含有ポリマーを含み、上記結合性ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）は、４～４０℃の範囲である、上記細胞剥離剤などを提供する。 －ＮＨ－（Ｃ＝Ｏ）－　ＮＨ２　・・・（１）

Description

細胞剥離剤および細胞分離方法
　本発明は、被分離細胞の表面抗原を用いた細胞分離方法において使用するための細胞剥離剤等に関する。
　再生医療分野では疾患のある患者から正常な細胞を取り出し、体外で培養後、再度患者に移植するといった手法が多く用いられる。しかしながら患者の体内、血液、体液から特定の細胞のみを取り出すのは困難である。そこで特定の細胞を分離する技術が必要となる。
　この細胞分離方法は、病理診断または臨床検査の分野においても普及している。細胞分離方法としては密度勾配遠心法、磁性粒子を用いた分離法、基材を用いた分離方法やフローサイトメトリーとセルソーターを組み合わせた方法が知られている。なかでも磁性粒子を用いた分離法は、処理可能な細胞数が多く、分離後の細胞の純度が高い手法である。
　一般的な磁性粒子を用いた細胞分離方法では、デスチオビオチン－ストレプトアビジンの相互作用を利用する方法が一般的である。まず被分離細胞に特異的な抗体をデスチオビオチン化する。このデスチオビオチン化抗体と被分離細胞の表面抗原を反応させた後に、ストレプトアビジンを表面に有する磁性粒子を用いて捕捉する。磁性粒子を磁力により集め、複数の細胞種を含む細胞群から被分離細胞を分離した後に、細胞剥離剤として大量のビオチンを加え、デスチオビオチン－ストレプトアビジン間相互作用と競合させることで、被分離細胞と磁性粒子を脱離する手法である。しかしながら大量のビオチンを用いて分離担体から細胞を脱離させる必要があるため、分離後の細胞を複数回洗浄する必要があり、作業に長時間を要するという課題がある。
　ビオチンを使用しない細胞分離方法として特許文献１には分離担体－細胞間をデキストランなどの酵素分解性のリンカーにより結合させ、酵素を用いてリンカーを切断することで分離担体から細胞を脱離させる方法が開示されている。しかしながらこの細胞分離方法においても分離後の細胞にリンカーの分解で使用した酵素がダメージを与える恐れがあるため、分離後の細胞を複数回洗浄する必要があり、作業に長時間を要するという課題がある。
　大量のビオチンや酵素を使用しない細胞分離方法として特許文献２にはＴ細胞を特異的に分離する方法としてストレプトタグ化ＭＨＣ多量体を用いる細胞分離方法が開示されている。Ｔ細胞の表面抗原と結合したストレプトタグ化ＭＨＣ多量体をストレプトタクチンを有する磁性粒子と結合させた後に被分離細胞のソーティングを行う。その後細胞剥離剤として少量のビオチンにより被分離細胞を脱離させる方法である。この細胞分離方法は細胞へのダメージは少ないものの、使用するストレプトタグ化ＭＨＣ多量体はＴ細胞にのみ対応可能であり、他種の細胞には適用できず、汎用性が低いという課題がある。
特開２０１６－１３６９３７号公報 特開２０１７－５１４４８１号公報
　以上のように、被分離細胞の表面抗原を用いた細胞分離方法において、幅広い種類の細胞に適用でき、さらには分離後の被分離細胞の洗浄が不要となる細胞剥離剤は知られていない。
　本発明の課題は、被分離細胞の表面抗原を用いた細胞分離方法において、幅広い種類の細胞に適用でき、さらには分離後の被分離細胞の洗浄が不要となる細胞剥離剤および当該細胞剥離剤を用いた細胞分離方法を提供することである。
　本発明者らは、上述の目的を達成するべく鋭意研究を重ねた結果、分離担体から被分離細胞を脱離させる駆動力として、温度応答によるポリマー鎖の伸縮が利用でき、分離後の細胞に影響を与えないポリマーを含有する細胞剥離剤が上述の課題を解決できることを見出した。
　すなわち、本発明は、少なくとも下記の［１］～［２２］を提供する。
［１］
　被分離細胞と結合した分離担体から被分離細胞を剥離するための細胞剥離剤であって、
　上記細胞剥離剤は、下記式（１）で表される側鎖構造を有し上記分離担体と結合可能な分離担体結合部位をその側鎖または末端に有する結合性ウレイド基含有ポリマーを含み、
　上記結合性ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）は、４～４０℃の範囲である、
上記細胞剥離剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
［２］
　上記分離担体結合部位がビオチン残基、ストレプトアビジン残基、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、シクロデキストリン残基、アダマンチル基またはフェニルボロン酸残基である上記［１］に記載の細胞剥離剤。
［３］
　上記ウレイド基含有ポリマーの主鎖がエチレン性不飽和ポリマー、ポリアリルアミンまたはポリペプチドである上記［１］または［２］に記載の細胞剥離剤。
［４］
　上記ウレイド基含有ポリマーが下記式（２）で表されるウレイド基含有構造の繰り返しであるウレイド基含有繰り返し配列Ａを有する上記［１］～［３］のいずれかに記載の細胞剥離剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（上記式（２）中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を表し、Ａ１はＯまたはＮＨを表し、ａは１～６の整数を表す。）
［５］
　上記ウレイド基含有ポリマーが下記式（３）で表される親水性構造の繰り返しである親水性繰り返し配列Ｂをさらに有する上記［４］に記載の細胞剥離剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（上記式（３）中、Ｒ２は水素原子またはメチル基を表し、Ａ２はＯまたはＮＨを表し、ｂは１～６の整数を表し、Ｘは下記式（４）～（９）から選択される。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（上記式（９）中、ｍは０～２０の整数を表す。）
［６］
　上記ウレイド基含有繰り返し配列Ａ中、Ａ１がＯであり、ａが２であり、上記親水性繰り返し配列Ｂ中、Ａ２がＯであり、ｂが２であり、Ｘが上記式（４）で表される上記［５］に記載の細胞剥離剤。
［７］
　上記ウレイド基含有ポリマーの上記ウレイド基含有繰り返し配列Ａと上記親水性繰り返し配列Ｂのモル比が０．５≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）の関係にある上記［５］または［６］に記載の細胞剥離剤。
［８］
　上記結合性ウレイド基含有ポリマーが上記分離担体結合部位としてのビオチン残基を上記ウレイド基含有ポリマーの末端に有する上記［４］～［７］のいずれかに記載の細胞剥離剤。
［９］
　上記ウレイド基含有ポリマーが下記式（１０）で表されるウレイド基含有構造の繰り返しであるウレイド基含有繰り返し配列Ｃと下記式（１１）で表される親水性構造の繰り返しである親水性繰り返し配列Ｄを有する上記［１］～［３］のいずれかに記載の細胞剥離剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
［１０］
　上記ウレイド基含有ポリマーの上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｃと上記親水性繰り返し配列Ｄのモル比が０．５≦Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）の関係にある上記［９］に記載の細胞剥離剤。
［１１］
　上記分離担体結合部位としてビオチン残基を上記ウレイド基含有ポリマーの側鎖に有する上記結合性ウレイド基含有ポリマーを含む上記［９］または［１０］に記載の細胞剥離剤。
［１２］
　上記ウレイド基含有ポリマーが下記式（１２）で表されるウレイド基含有構造の繰り返しであるウレイド基含有繰り返し配列Ｅと下記式（１３）で表される親水性構造の繰り返しである親水性繰り返し配列Ｆを有する上記［１］～［３］のいずれかに記載の細胞剥離剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（上記式（１２）中、ｃは０～６の整数を表し、ｄは０～６の整数を表し、上記式（１３）中、ｅは０～６の整数を表し、ｆは０～６の整数を表す。）
［１３］
　上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｅ中、ｃが０であり、ｄが３であり、上記親水性繰り返し配列Ｆ中、ｅが０であり、ｆが３である上記［１２］に記載の細胞剥離剤。
［１４］
　上記ウレイド基含有ポリマーの上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｅと上記親水性繰り返し配列Ｆのモル比が０．５≦Ｅ／（Ｅ＋Ｆ）の関係にある上記［１２］または［１３］に記載の細胞剥離剤。
［１５］
　上記分離担体結合部位としてビオチン残基を上記ウレイド基含有ポリマーの側鎖に有する上記結合性ウレイド基含有ポリマーを含む上記［１２］～［１４］のいずれかに記載の細胞剥離剤。
［１６］
　上記ウレイド基含有ポリマーの数平均分子量が２０，０００～１，０００，０００である上記［１２］～［１５］のいずれかに記載の細胞剥離剤。
［１７］
　被分離細胞を含む細胞群から被分離細胞を分離するための方法であって、下記〔工程Ａ〕、〔工程Ｂ〕、〔工程Ｃ〕および〔工程Ｄ〕を含むことを特徴とする細胞分離方法。
　〔工程Ａ〕
　被分離細胞を含む細胞群に分離担体結合部位を有する被分離細胞の表面抗原認識物質を加え、被分離細胞の表面抗原と反応させることで被分離細胞－抗原認識物質複合体を得る工程
　〔工程Ｂ〕
　〔工程Ａ〕で得られた被分離細胞－抗原認識物質複合体を分離担体と分離担体結合部位を介して相互作用させることで被分離細胞－分離担体複合体を得る工程
　〔工程Ｃ〕
　〔工程Ｂ〕で得られた被分離細胞－分離担体複合体のみを被分離細胞を含む細胞群から分離する工程
　〔工程Ｄ〕
　〔工程Ｃ〕で得られた被分離細胞－分離担体複合体に、上記［１］～［１６］のいずれかに記載の細胞剥離剤を加え、温度変化により被分離細胞を分離する工程
［１８］
　上記〔工程Ａ〕中、分離担体結合部位がビオチン残基、ストレプトアビジン残基、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、シクロデキストリン残基、アダマンチル基またはフェニルボロン酸残基である上記［１７］に記載の細胞分離方法。
［１９］
　上記〔工程Ａ〕中、抗原認識物質が抗体、抗体フラグメント、ペプチド、アプタマー、プロテインＡまたはレクチンである上記［１７］または［１８］に記載の細胞分離方法。
［２０］
　上記〔工程Ｂ〕中、分離担体が磁性粒子である上記［１７］～［１９］のいずれかに記載の細胞分離方法。
［２１］
　上記〔工程Ｃ〕中、磁力により被分離細胞－分離担体複合体のみを被分離細胞を含む細胞群から分離する、上記［２０］に記載の細胞分離方法。
［２２］
　上記〔工程Ｄ〕中、温度変化が結合性ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）以下の温度から上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）以上の温度まで加温することである上記［１７］～［２１］のいずれかに記載の細胞分離方法。
　本発明によると、被分離細胞の表面抗原を用いた細胞分離方法において、幅広い種類の細胞に適用でき、さらには分離後の被分離細胞の洗浄が不要となる細胞剥離剤および当該細胞剥離剤を用いた細胞分離方法を提供することができる。
　以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
＜ウレイド基含有ポリマー＞
　上記ウレイド基含有ポリマーとは、下記式（１）で表されるウレイド基（以下、ウレイド基という）を側鎖に有しているポリマーのことである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　上記ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）は、基本的には後述するようにその側鎖または末端に分離担体と結合可能な分離担体結合部位を有する結合性ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）とほぼ同じであり、４～４０℃の範囲であるのが好ましい。
　上記ウレイド基含有ポリマーの主鎖としては特に限定されないが、エチレン性不飽和ポリマー、ポリアリルアミン、ポリペプチド、ポリエステル、多糖などが挙げられる。中でも合成の容易さからエチレン性不飽和ポリマー、ポリアリルアミンまたはポリペプチドが好ましい。
　上記ウレイド基含有ポリマーの主鎖がエチレン性不飽和ポリマーである場合、下記式（２）で表されるウレイド基含有構造の繰り返しであるウレイド基含有繰り返し配列Ａを有する構造が好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（上記式（２）中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を表し、Ａ１はＯまたはＮＨを表し、ａは１～６の整数を表す。）
　なお、本明細書でいう「構造の繰り返し」は、当該構造の連続した繰り返しである場合の他、断続的な繰り返しも指す。
　上記式（２）においてａは１～６の整数を表すが、１～４の整数が好ましく、２～３の整数が最も好ましい。
　また、上記ウレイド基含有繰り返し配列Ａ中のそれぞれの式（２）で表されるウレイド基含有構造におけるＲ１、Ａ１およびａは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
　上記ウレイド基含有繰り返し配列Ａとしては、例えばＲ１がメチル基であり、Ａ１がＯであり、ａが２であるウレイド基含有繰り返し配列Ａ、Ｒ１がメチル基であり、Ａ１がＮＨであり、ａが２であるウレイド基含有繰り返し配列Ａ、Ｒ１が水素原子であり、Ａ１がＯであり、ａが２であるウレイド基含有繰り返し配列Ａ、Ｒ１が水素原子であり、Ａ１がＮＨであり、ａが２であるウレイド基含有繰り返し配列Ａなどが挙げられるが、後述する他のモノマーとの共重合性の観点からＲ１がメチル基であり、Ａ１がＯであり、ａが２であるウレイド基含有繰り返し配列Ａ、Ｒ１が水素原子であり、Ａ１がＯであり、ａが２であるウレイド基含有繰り返し配列ＡまたはＲ１が水素原子であり、Ａ１がＮＨであり、ａが２であるウレイド基含有繰り返し配列Ａが好ましく、Ｒ１がメチル基であり、Ａ１がＯであり、ａが２であるウレイド基含有繰り返し配列Ａがより好ましい。
　上記ウレイド基含有ポリマーの主鎖がエチレン性不飽和ポリマーである場合、上記ウレイド基含有ポリマーは、上記式（２）で表されるウレイド基含有構造などのウレイド基含有構造を有するモノマーと、例えば下記の他のモノマーとの共重合体であってもよく、上記上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）の調節は他のモノマーとの共重合で行うことができる。上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を低下させるためには、他のモノマーとして例えば親水性のモノマーを選択可能であり、例えばグリセロール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスフェート、Ｎ－メチルカルボキシベタイン（メタ）アクリレート、Ｎ－メチルスルホベタイン（メタ）アクリレート、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアクリルアミド、Ｓ－メチルスルホニウムカルボン酸（メタ）アクリレート、エチレングリコール（メタ）アクリレートなどが挙げられるが、少なくとも上記主鎖がエチレン性不飽和ポリマーであるウレイド基含有ポリマーを細胞剥離剤の原料として用いる場合、水への溶解性の観点、非特異吸着を抑制する観点などから好ましくは（メタ）アクリロイルオキシエチルホスフェート、Ｎ－メチルカルボキシベタイン（メタ）アクリレート、Ｎ－メチルスルホベタイン（メタ）アクリレート、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｓ－メチルスルホニウムカルボン酸（メタ）アクリレートまたはエチレングリコール（メタ）アクリレートである。より具体的には上記ウレイド基含有繰り返し配列Ａに加え、下記式（３）で表される親水性構造の繰り返しである親水性繰り返し配列Ｂを有する構造が好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（上記式（３）中、Ｒ２は水素原子またはメチル基を表し、Ａ２はＯまたはＮＨを表し、ｂは１～６の整数を表し、Ｘは下記式（４）～（９）から選択される。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（上記式（９）中、ｍは０～２０の整数を表す。）
　上記式（３）においてｂは１～６の整数を表すが、１～４の整数が好ましく、２～３の整数が最も好ましい。
　また、上記親水性繰り返し配列Ｂ中のそれぞれの式（３）で表される親水性構造におけるＲ２、Ａ２およびｂは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
　上記親水性繰り返し配列Ｂとしては、例えばＲ２がメチル基であり、Ａ２がＯであり、ｂが２であり、Ｘが上記式（４）～（９）から選択されるウレイド基含有繰り返し配列Ｂ、Ｒ２がメチル基であり、Ａ２がＮＨであり、ｂが２であり、Ｘが上記式（４）～（９）から選択されるウレイド基含有繰り返し配列Ｂ、Ｒ２が水素原子であり、Ａ２がＯであり、ｂが２であり、Ｘが上記式（４）～（９）から選択されるウレイド基含有繰り返し配列Ｂ、Ｒ２が水素原子であり、Ａ２がＮＨであり、ｂが２であり、Ｘが上記式（４）～（９）であるウレイド基含有繰り返し配列Ｂなどが挙げられるが、上記式（２）で表されるウレイド基含有構造を有するモノマーなどとの共重合性の観点から好ましくはＲ２がメチル基であり、Ａ２がＯであり、ｂが２であり、Ｘが上記式（４）～（９）から選択されるウレイド基含有繰り返し配列Ｂ、Ｒ２が水素原子であり、Ａ２がＯであり、ｂが２であり、Ｘが上記式（４）～（９）から選択されるウレイド基含有繰り返し配列ＢまたはＲ２が水素原子であり、Ａ２がＮＨであり、ｂが２であり、Ｘが上記式（４）～（９）であるウレイド基含有繰り返し配列Ｂであり、最も好ましくはＲ２がメチル基であり、Ａ２がＯであり、ｂが２であり、Ｘが上記式（４）～（９）から選択されるウレイド基含有繰り返し配列Ｂである。
　主鎖がエチレン性不飽和ポリマーである上記ウレイド基含有ポリマーが上記他のモノマーとの共重合体である場合、上記他のモノマーのモル比は要求される機能が発揮されるように適宜決定できるが、上記結合性ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度を４～４０℃の範囲にするためには配合される上記他のモノマーが全モノマー中、７０モル％以下であることが好ましく、６０モル％以下であることがより好ましく、５０モル％以下であることがさらに好ましく、４０モル％以下であることがさらにより好ましく、３０モル％以下であることが特に好ましく、２０モル％以下であることが特により好ましい。すなわち、上記ウレイド基含有繰り返し配列Ａなどのウレイド基含有繰り返し配列が全配列の３０モル％以上であることが好ましく、４０モル％以上であることがより好ましく、５０モル％以上であることがさらに好ましく、６０モル％以上であることがさらにより好ましく、７０モル％以上であることが特に好ましく、８０モル％以上であることが特により好ましい。また上記ウレイド基含有ポリマーが上記ウレイド基含有繰り返し配列Ａと上記親水性繰り返し配列Ｂを有する構造である場合、上記ウレイド基含有繰り返し配列Ａと上記親水性繰り返し配列Ｂのモル比（モル数）が、０．３≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）の範囲にあることが好ましい。より好ましくは０．４≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）の範囲内にあるという関係が満たされ、０．５≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）の範囲内にあるという関係が満たされることがより好ましく、０．６≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）の範囲内にあるという関係が満たされることがさらにより好ましく、０．７≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）の範囲内にあるという関係が満たされることが特に好ましく、０．８≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）の範囲内にあるという関係が満たされることが特により好ましい。
　主鎖がエチレン性不飽和ポリマーである上記ウレイド基含有ポリマーは、ウレイド基を有し、上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）が４～４０℃の範囲であれば特に限定されないが、主鎖の種類、他のモノマーの種類、分子量の組み合わせなどに応じて、上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）を調整することができる。
　上記ウレイド基含有ポリマーの主鎖がポリアリルアミンである場合、下記式（１０）で表されるウレイド基含有構造の繰り返しであるウレイド基含有繰り返し配列Ｃと下記式（１１）で表される親水性構造の繰り返しである親水性繰り返し配列Ｄを有する構造が好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　主鎖がポリアリルアミンである上記ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度を４～４０℃の範囲にするためには、上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｃなどのウレイド基含有繰り返し配列が全配列の３０モル％以上であることが好ましく、４０モル％以上であることがより好ましく、５０モル％以上であることがさらに好ましい。
　上記ウレイド基含有ポリマーが上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｃと上記親水性繰り返し配列Ｄを有する構造である場合、上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｃと上記親水性繰り返し配列Ｄのモル比（モル数）が、０．３≦Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）の範囲にあることが好ましい。より好ましくは０．４≦Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）の範囲内にあるという関係が満たされ、０．５≦Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）の範囲内にあるという関係が満たされることが特に好ましい。
　上記ウレイド基含有ポリマーの主鎖がポリペプチドである場合、下記式（１２）で表されるウレイド基含有構造の繰り返しであるウレイド基含有繰り返し配列Ｅと下記式（１３）で表される親水性構造の繰り返しである親水性繰り返し配列Ｆを有する構造が好ましく挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（上記式（１２）中、ｃは０～６の整数を表し、ｄは０～６の整数を表し、上記式（１３）中、ｅは０～６の整数を表し、ｆは０～６の整数を表す。）
　上記式（１２）において、ｃは０～６の整数を表すが、０～４が好ましく、０または４が最も好ましい。ｃが０である場合、上記式（１２）中、（ＣＨ２）ｃが存在しないことを表し、（ＣＨ２）ｃの両側のＣＨとＮＨが直接単結合していることを表している。
　上記式（１２）において、ｄは０～６の整数を表すが、０～５が好ましく、０～４が最も好ましい。ｄが０である場合、上記式（１２）中、（ＣＨ２）ｄが存在しないことを表し、（ＣＨ２）ｄの上下のＣＨとＮＨが直接単結合していることを表している。
　また、上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｅ中のそれぞれの式（１２）で表されるウレイド基含有構造におけるｃおよびｄは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
　上記式（１２）で表されるウレイド基含有繰り返し配列Ｅとしては、例えばｃが０であり、ｄが４であるウレイド基含有繰り返し配列Ｅ（α－ポリリジン）、ｃが０であり、ｄが３であるウレイド基含有繰り返し配列Ｅ（ポリオルニチン）、ｃが４であり、ｄが０であるウレイド基含有繰り返し配列Ｅ（ε－ポリリジン）、ｃが３であり、ｄが０であるウレイド基含有繰り返し配列Ｅなどが挙げられるが、入手の容易さから、ｃが０であり、ｄが４であるウレイド基含有繰り返し配列Ｅ、ｃが０であり、ｄが３であるウレイド基含有繰り返し配列Ｅまたはｃが４であり、ｄが０であるウレイド基含有繰り返し配列Ｅが好ましい。
　上記式（１３）で表される親水性繰り返し配列Ｆにおいて、ｅは０～６の整数を表すが、０～４が好ましく、０または４が最も好ましい。ｅが０である場合、上記式（１３）中、（ＣＨ２）ｅが存在しないことを表し、（ＣＨ２）ｅの両側のＣＨとＮＨが直接単結合していることを表している。
　上記式（１３）で表される親水性繰り返し配列Ｆにおいて、ｆは０～６の整数を表すが、０～５が好ましく、０～４が最も好ましい。ｆが０である場合、上記式（１３）中、（ＣＨ２）ｆが存在しないことを表し、（ＣＨ２）ｆの上下のＣＨとＮＨが直接単結合していることを表している。
　また、上記親水性繰り返し配列Ｆ中のそれぞれの式（１３）で表される親水性構造におけるｅおよびｆは、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
　上記式（１３）で表される親水性繰り返し配列Ｆとしては、例えばｅが０であり、ｆが４である親水性繰り返し配列Ｆ（α－ポリリジン）、ｅが０であり、ｆが３である親水性繰り返し配列Ｆ（ポリオルニチン）、ｅが４であり、fが０である親水性繰り返し配列Ｆ（ε－ポリリジン）、ｅが３であり、ｆが０である親水性繰り返し配列Ｆなどが挙げられるが、入手の容易さから、ｅが０であり、ｆが４である親水性繰り返し配列Ｆ、ｅが０であり、ｆが３である親水性繰り返し配列Ｆまたはｅが４であり、ｆが０である親水性繰り返し配列Ｆが好ましい。
　主鎖がポリペプチドである上記ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度を４～４０℃の範囲にするためには、上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｅなどのウレイド基含有繰り返し配列が全配列の３０モル％以上であることが好ましく、４０モル％以上であることがより好ましく、５０モル％以上であることがさらに好ましい。
　上記ウレイド基含有ポリマーが上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｅと上記親水性繰り返し配列Ｆを有する構造である場合、上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｅと上記親水性繰り返し配列Ｆのモル比（モル数）が、０．３≦Ｅ／（Ｅ＋Ｆ）の範囲にあることが好ましい。より好ましくは０．４≦Ｅ／（Ｅ＋Ｆ）の範囲内にあるという関係が満たされ、０．５≦Ｅ／（Ｅ＋Ｆ）の範囲内にあるという関係が満たされることが特に好ましい。
　上記ウレイド基含有ポリマーの分子量としては、要求される性能が発揮しうるように重合条件等を調整して適宜決定できるが、通常、数平均分子量で１，０００～５，０００，０００程度であり、本発明の細胞剥離剤の細胞分離の効率を上げるためには１０，０００～２，０００，０００が好ましく、２０，０００～１，０００，０００がより好ましい。上記ウレイド基含有ポリマーの分子量が５，０００，０００以下の場合、細胞剥離剤の水への溶解性がより増し、細胞剥離剤としてより利用しやすくなる点で好ましい。
＜ウレイド基含有ポリマーの製造方法１＞
　上記ウレイド基含有ポリマーの製造方法はすでに公知であり、例えば特許第５８００３２３号公報に記載の方法を使用できる。具体的には一級アミン含有ポリマーを溶媒に溶解させ、シアン酸塩（ＭＣＮＯ）と反応させる方法が使用できる。
　上記一級アミン含有ポリマーとは一級アミノ基を側鎖に有しているポリマーのことである。
　上記一級アミン含有ポリマーの主鎖としては特に限定されないが、前記ウレイド基含有ポリマーの主鎖の例示で挙げたものと同じものが挙げられる。
　上記一級アミン含有ポリマーの分子量としては、要求される性能が発揮しうるように重合条件等を調整して適宜決定できるが、通常、数平均分子量で１，０００～５，０００，０００程度であり、本発明の細胞剥離剤の細胞分離の効率を上げるためには１０，０００～２，０００，０００が好ましく、２０，０００～１，０００，０００がより好ましい。上記一級アミン含有ポリマーの分子量が５，０００，０００以下の場合、細胞剥離剤の水への溶解性がより増し、細胞剥離剤としてより利用しやすくなる点で好ましい。
　上記一級アミン含有ポリマーを溶解するための溶媒としては、例えば水、イミダゾール緩衝液などの緩衝液、有機溶媒またはこれらの混合液を挙げることができる。有機溶媒としては、一級アミン含有ポリマーが溶解すれば特に限定されないが、例えばメタノール、エタノール（ＥｔＯＨ）、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール等のアルコール類；アセトニトリル、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４－ジオキサン等を挙げることができる。反応に使用する一級アミン含有ポリマー溶液における一級アミン含有ポリマーの濃度としては、制限されないが、通常１～８０重量％、好ましくは２～５０重量％、より好ましくは５～４０重量％を挙げることができる。上記一級アミン含有ポリマーの濃度が８０重量％以下の場合、溶液粘度が上がりすぎることなく上記シアン酸塩との反応性を維持しやすく好ましい。
　上記一級アミン含有ポリマーと反応させるシアン酸塩（ＭＣＮＯ）としては、シアン酸カリウムやシアン酸ナトリウム等のシアン酸のアルカリ金属塩を好適に例示することができる。好ましくはシアン酸カリウムである。シアン酸塩の使用割合としては、特に限定されないが、上記一級アミン含有ポリマー中の一級アミノ基１モルに対して、０．４モル以上が好ましい。シアン酸塩の使用割合が０．４モル以上の場合、より十分にウレイド基を導入することができ、上限臨界溶液温度がより達成されやすい。
　上記一級アミン含有ポリマーとシアン酸塩（ＭＣＮＯ）との反応は、撹拌しながら行うことが好ましい。反応温度は、特に制限されないが、好ましくは０～１００℃、より好ましくは３０～６０℃に維持することが望ましい。反応温度が０℃以上の場合、反応がより十分に進行しやすく、１００℃以下の場合は、原料の分解、さらには望まない副反応を生じる恐れがより少ない。反応時間も特に制限されないが、通常１～４８時間、好ましくは１～２５時間で、上記ウレイド基含有ポリマーの溶液を得ることができる。反応時間が１時間以上の場合、反応がより十分に進行しやすく、４８時間以下の場合は、原料の分解、さらには望まない副反応を生じる恐れがより少ない。
　得られた上記ウレイド基含有ポリマーはそのまま未精製で次工程に用いられるほか、好ましくは再沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィーや透析などの処理により単離、精製を行うこともできる。
＜上記ウレイド基含有ポリマーの製造方法２＞
　上記ウレイド基含有ポリマーは、例えば下記式（１４）で表されるウレイドモノマーなどのエチレン性不飽和ウレイドモノマーをラジカル重合することによっても製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　上記エチレン性不飽和ウレイドモノマーのラジカル重合は、他のモノマーとの共重合も可能である。
　上記エチレン性不飽和ウレイドモノマー（および上記他のモノマー）のラジカル重合は、バルク重合も可能であるが、溶媒を加えて重合に供することもできる。また、溶媒としては上記エチレン性不飽和ウレイドモノマー（および上記他のモノマー）が溶解するものであれば特に限定されず、一般的な溶媒が使用可能である。例えばアセトン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフランなどの極性非プロトン性溶媒、メタノール、エタノール、水などの極性プロトン性溶媒、これらの混合液から選択される。
　上記エチレン性不飽和ウレイドモノマー（および上記他のモノマー）のラジカル重合は、熱重合または光重合により行うことができる。上記熱重合は、例えば熱重合開始剤を用いて行うことができる。熱重合開始剤としては、例えば、過酸化物系ラジカル開始剤（過酸化ベンゾイル、過硫酸アンモニウム等）、または、アゾ系ラジカル開始剤（アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス－ジメチルバレロニトリル（ＡＤＶＮ）等）、２，２’－アゾビスシアノ吉草酸（ＡＣＶＡ）、アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩（ＶＡ－０４４）、水溶性あるいは油溶性のレドックス系ラジカル開始剤（ジメチルアニリンと過酸化ベンゾイルからなる）などが使用できる。ラジカル開始剤の使用量は、上記エチレン性不飽和ウレイドモノマー（および上記他のモノマー）の合計１００質量部に対して通常０．０１から１０質量部が好ましい。重合温度および重合時間はラジカル開始剤の種類や他のモノマーの有無や種類などによって適宜選択して決定することができる。例えば、上記エチレン性不飽和ウレイドモノマー（および上記他のモノマー）のラジカル重合をＡＩＢＮを用いて行う場合等において、重合温度は４０～９０℃、重合時間は２～４８時間程度が適当である。
　上記光重合は、例えば、波長２５４ｎｍの紫外線（ＵＶ）または加速電圧１５０～３００ｋＶの電子線（ＥＢ）照射等により実施することができる。この際、光重合開始剤の使用は任意であるが、反応時間の点からは使用することが好ましい。光重合開始剤としては２－ヒドロキシ－２－メチル－１－フェニル－１－プロパノン、１－ヒドロキシ－シクロヘキシルフェニルケトンなどが挙げられるが、溶解性等の点から２－ヒドロキシ－２－メチル－１－フェニル－１－プロパノンが好ましく挙げられる。
　上記エチレン性不飽和ウレイドモノマー（および上記他のモノマー）のラジカル重合においては、連鎖移動剤を用いることもできる。上記連鎖移動剤としては２－メルカプトエタノール、１－メルカプト－２－プロパノール、３－メルカプト－１－プロパノール、ｐ－メルカプトフェノール、メルカプト酢酸、２－メルカプトプロピオン酸、３－メルカプトプロピオン酸、２－メルカプトニコチン酸などが挙げられる。
　上記エチレン性不飽和ウレイドモノマー（および上記他のモノマー）のラジカル重合はリビングラジカル重合法により行うことも可能であり、具体的には原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ法）、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）およびニトロキシドを介した重合法（ＮＭＰ法）などが利用可能である。特に本発明の細胞剥離剤の原料の用途では金属を使用せず、酵素活性を低下させないといった理由で可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）が好ましい。
　上記ＲＡＦＴ重合法としては公知の方法が利用可能であり、例えばＷＯ９９／３１１４４、ＷＯ９８／０１４７８および米国特許第６，１５３，７０５号などに記載されている方法が有効である。ＲＡＦＴ重合を用いて、上記エチレン性不飽和ウレイドモノマー（および上記他のモノマー）のラジカル重合を行う場合、通常のラジカル重合にＲＡＦＴ剤を添加することで行うことができる。上記ＲＡＦＴ剤としては４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、２－シアノ－２－プロピルベンゾジチオエート、ベンジルベンゾジチオエート、２－フェニル－２－プロピルベンゾジチオエート、メチル２－フェニル－２－（フェニル－カルボノチオイルチオ）アセテート、４－シアノ－４－（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタノール、２－シアノ－２－プロピルドデシルトリチオカーボネート、２－（ドデシルチオカルボニルチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタン酸ポリエチレングリコールメチルエーテルエステル、２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸－３－アジド－１－プロパノールエステル、ベンジル１Ｈ－ピロール－１－カルボジチオエート、２－シアノプロパン－２－イル－Ｎ－メチル－Ｎ－ピリジン４－イルカルボジチオエート、プロピオン酸エチル－２－エチルザンテートなどから選択されるが、上記ウレイドモノマー（および上記他のモノマー）の重合制御の観点から、４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、４－シアノ－４－（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタノールまたは２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸－３－アジド－１－プロパノールエステルが好ましい。さらに上記エチレン性不飽和ウレイドモノマーは上記他のモノマーとはランダムコポリマーまたはブロックコポリマーを形成しうるが、上記ウレイド基含有ポリマーの性能を引き出すためにはランダムコポリマーであることが好ましい。
＜結合性ウレイド基含有ポリマー＞
　上記結合性ウレイド基含有ポリマーとは上記ウレイド基含有ポリマーに上記分離担体結合部位が付加したポリマーである。
　上記分離担体結合部位とは上記分離担体と結合可能な部位であり、通常この分野で使用されるものであれば特に限定されないが、例えば、疎水性置換基、ビオチン残基、デスチオビオチン残基、アビジン残基、ストレプトアビジン残基、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、グルタチオン残基、グルタチオントランスフェラーゼ残基、レクチン残基、シクロデキストリン残基などの多糖類残基、アダマンチル基、フェニルボロン酸残基など、好ましくはビオチン残基、ストレプトアビジン残基、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、シクロデキストリン残基、アダマンチル基またはフェニルボロン酸残基などが挙げられる。
　上記分離担体結合部位は上記ウレイド基含有ポリマーの末端もしくは繰り返し配列内（側鎖など）に含有していてもよい。上記分離担体結合部位を上記ウレイド基含有ポリマーに含有させる方法としては、添加、クリック反応、アミド化、エステル化、チオエステル化、カーボネート化、シッフ塩基形成反応、還元的アミノ化、ラジカルを介したカップリング反応、ディールスアルダー反応、ジスルフィド化、マイケル付加反応、エン－チオール反応、芳香族ホウ素化合物を介したカップリング反応、三級スルホニウム形成反応、四級アンモニウム形成反応などが挙げられるが、汎用性の高さから、クリック反応、アミド化またはエステル化が好ましい。
　上記分離担体結合部位の含有量としては上記結合性ウレイド基含有ポリマーが上記分離担体に結合すれば特に制限されないが、上記ウレイド基含有ポリマーの末端に含有される場合は１分子中、０．２分子から１０分子の上記分離担体結合部位が含有されていればよく、好ましくは０．２分子から４分子、さらに好ましくは０．２分子から２分子である。１０分子以下の場合は分離担体間の架橋がより起こりにくい。また、上記分離担体結合部位が上記ウレイド基含有ポリマーの繰り返し配列内に含有される場合は１００繰り返し単位当たり、上記分離担体結合部位が０．０１から２０単位含有されればよく、好ましくは０．０１から１０単位、より好ましくは０．１から５単位である。２０単位以下含有される場合は分離担体間の架橋がより起こりにくい。
＜末端に分離担体結合部位を含有する結合性ウレイド基含有ポリマーの製造方法＞
　上記ウレイド基含有ポリマーの末端に分離担体結合部位を導入する場合、ウレイド基含有ポリマーの合成はリビングラジカル重合法により行うことも可能であり、具体的には原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ法）、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）およびニトロキシドを介した重合法（ＮＭＰ法）などが利用可能である。特に本発明の細胞剥離剤の用途では金属を使用せず、酵素活性を低下させないといった理由で可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）が好ましい。
　上記ＲＡＦＴ重合法としては公知の方法が利用可能であり、例えばＷＯ９９／３１１４４、ＷＯ９８／０１４７８および米国特許第６，１５３，７０５号などに記載されている方法が有効である。ＲＡＦＴ重合を用いて、上記ウレイド基含有ポリマーのラジカル重合を行う場合、通常のラジカル重合にＲＡＦＴ剤を添加することで行うことができる。上記ＲＡＦＴ剤としては４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、２－シアノ－２－プロピルベンゾジチオエート、ベンジルベンゾジチオエート、２－フェニル－２－プロピルベンゾジチオエート、メチル２－フェニル－２－（フェニル－カルボノチオイルチオ）アセテート、４－シアノ－４－（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタノール、２－シアノ－２－プロピルドデシルトリチオカーボネート、２－（ドデシルチオカルボニルチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタン酸ポリエチレングリコールメチルエーテルエステル、２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸－３－アジド－１－プロパノールエステル（Ｎ３－ＤＴＰＡ）、ベンジル１Ｈ－ピロール－１－カルボジチオエート、２－シアノプロパン－２－イル－Ｎ－メチル－Ｎ－ピリジン４－イルカルボジチオエート、プロピオン酸エチル－２－エチルザンテートなどから選択されるが、上記ウレイド基含有ポリマーの末端に分離担体結合部位を導入する容易さから、４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、４－シアノ－４－（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸Ｎ－スクシンイミジルエステル、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４－シアノ－４－（ドデシルスルファニル－チオカルボニル）スルファニルペンタノールまたは２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸－３－アジド－１－プロパノールエステルが好ましい。
　上記ウレイド基含有ポリマーの末端に分離担体結合部位を導入する場合、ウレイド基含有ポリマーの合成はリビングアニオン重合法により行うことも可能である。例えばオルニチンやリジンのアミノ基を保護したα－アミノ酸－Ｎ－カルボキシ無水物（ＮＣＡ）やＮ－ジフェニルカーボナートアミノ酸（ＤＰＣ）などの重合開始剤を用いて開環重合する方法である。
　上記結合性ウレイド基含有ポリマーとしては例えば下記式（１５）で表されるような上記ウレイド基含有ポリマーの主鎖がエチレン性不飽和ポリマーであり、分離担体結合部位としてビオチン残基を上記ウレイド基含有ポリマーの末端に有している上記結合性ウレイド基含有ポリマーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　上記結合性ウレイド基含有ポリマーとしては例えば下記式（１６）で表されるような上記ウレイド基含有ポリマーの主鎖がポリアリルアミンであり、分離担体結合部位としてビオチン残基を上記ウレイド基含有ポリマーの側鎖に有している上記結合性ウレイド基含有ポリマーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　上記結合性ウレイド基含有ポリマーとしては例えば下記式（１７）で表されるような上記ウレイド基含有ポリマーの主鎖がポリアリルアミンであり、分離担体結合部位としてアミノ基を上記ウレイド基含有ポリマーの側鎖に有している上記結合性ウレイド基含有ポリマーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　上記結合性ウレイド基含有ポリマーとしては例えば下記式（１８）で表されるような上記ウレイド基含有ポリマーの主鎖がポリペプチドであり、分離担体結合部位としてビオチン残基を上記ウレイド基含有ポリマーの側鎖に有している上記結合性ウレイド基含有ポリマーが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
＜結合性ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）＞
　上記上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）とは、上記結合性ウレイド基含有ポリマーが水や培地中で不溶化し不溶相を形成する温度と、上記結合性ウレイド基含有ポリマーが水や培地中で溶解し溶解相を形成する温度との境界温度のことである。上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）は特に限定されないが、細胞培養に適した温度である必要があるため、２～６０℃、好ましくは４～５０℃、より好ましくは４～４０℃の範囲である。
　なお、前述のように、上記ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）は、上記結合性ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）とほぼ同じである。
　上記上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）は、上記（結合性）ウレイド基含有ポリマーを少なくとも１ｍＭの濃度で水や培地に溶解し、降温させながら石英セル中で５００ｎｍの可視光の透過率を測定し、当該化合物が完全に溶解しているときの清澄溶液の可視光の透過率を１００％とした場合に、これを降温したときに該透過率が減少し始める温度として求めることができる。
＜細胞剥離剤＞
　本発明における細胞剥離剤とは分離担体から被分離細胞を脱離させるための材料であり、少なくとも上記結合性ウレイド基含有ポリマーを含有する。さらに通常、結合性ウレイド基含有ポリマーの他に水や培地を含有したり、より効率的な細胞分離のためにキレート剤やタンパク質などの添加剤を含有することができる。
　上記水としては、精製水、純水、イオン交換水等が好ましく、また水を含有する各種緩衝液であってもよい。各種緩衝液としては、タンパク質の酵素活性、抗原性等の生理活性を失わせるようなものでなければ、通常この分野で用いられる緩衝液を用いることができる。例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられ、これらを混合して使用してもよい。
　上記培地とは分離する細胞に適したものであれば特に限定されず、一般的な細胞培養用培地が利用可能である。例えば、ダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）、α－ＭＥＭ培地、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地、Ｆ１２培地、ＴＣ１９９培地、ＧＭＥＭ培地などが挙げられ、これらを混合したり、必要に応じてウシ胎児血清（ＦＢＳ）やグルタミン、ウシ血清アルブミンやヒト血清アルブミン、さらには抗生物質などといったサプリメントを添加してもよい。
　上記添加剤としては、細胞の分離効率の向上を目的として、通常、この分野で用いられるその他の試薬類等であって、例えば、キレート剤、糖類、多糖類、タンパク質、塩類、ビタミン類、界面活性剤等が挙げられる。
　上記キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２－ビス（Ｏ－アミノフェノキシド）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、ビシン、トランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、イミノ二酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸などが挙げられる。
　上記糖類としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖などを指し、例えば、単糖類としてはアロース、グルコース（ブドウ糖）、アルトロース、マンノース、ガラクトース、プシコース、フルクトース（果糖）、ソルボース、リボース、キシロース、アラビノースなどが挙げられ、二糖類としてはキシルロース、トレハロース、イソトレハロース、マルトース（麦芽糖）、セロビオース、イソマルトースなどが挙げられ、オリゴ糖としてはフルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、デオキシリボース、フコース、ラムノース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、グルコサミン、ガラクトサミンキシリトール、ソルビトール、アスコルビン酸(ビタミンＣ)、グルクロノラクトン、グルコノラクトンなどが挙げられる。
　上記多糖類としては、例えば、キトサン、デキストラン、シクロデキストリン、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルスターチ、スターチ、プルランなどが挙げられる。
　上記タンパク質としては、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、不凍ペプチド、ウシ血清アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、カゼイン等が挙げられる。
　上記塩類としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、ヒスチジン等のアミノ酸およびアミノ酸塩、グリシルグリシン等のペプチド類、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、トリス塩等の無機塩類、フラビン類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、グルコン酸などの有機酸および有機酸の塩等が挙げられる。
　上記ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミン様物質などが挙げられる。
　上記界面活性剤としては例えば、トライトン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｔｗｅｅｎ２０、プルロニック等が挙げられる。
　本発明の細胞剥離剤に含まれる上記結合性ウレイド基含有ポリマーの含有量としては細胞分離に使用できれば特に限定されないが、細胞剥離剤中０．０１質量％以上であることが好ましく、０．０５質量％以上がより好ましい。
　本発明の細胞剥離剤に含有される上記添加剤は、細胞分離に使用できれば特に限定されないが、上記結合性ウレイド基含有ポリマーに対して０．０１質量％以上であることが好ましく、０．０５質量％以上がより好ましい。
＜分離担体＞
　上記分離担体の材質としては特に限定はないがプラスチックや多糖類、金属、磁性を有する金属、セラミックス等が用いられ、これらの材料が複数使用されていてもよい。プラスチックとしては、例えば、ポリメタクリル酸メチル等のアクリル系ポリマー、ポリジメチルシロキサン等の各種シリコーンゴム、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート等が挙げられる。
　また、分離担体の形状は、例えば、容器状、板状、粒子状および繊維状の形状のほか、穴や溝が設けられた多孔質状のものであってもよい。なかでも細胞分離時の取り扱いの容易さから、容器状、板状、粒子状、繊維状または磁性を有した粒子状（磁性粒子）が好ましく、磁性粒子が特に好ましい。
　上記分離担体が磁性粒子である場合は、特に制限はないが、平均粒径が、０．９ｎｍ以上、５０００ｎｍ未満であることが好ましく、目的物の認識性を高めるためには、平均粒径が、２．９ｎｍ以上、４０００ｎｍ未満であることが特に好ましい。磁性粒子の素材は、例えば、マグネタイト、酸化ニッケル、フェライト、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、ＫＳ鋼、希土類コバルト磁石およびヘマタイト等が挙げられる。
　また、上記分離担体の表面は、各種官能基、例えば水酸基、トシル基、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、メルカプト基、スルフィド基、多価アルコール残基などを有していてもよく、また表面に各種化合物の残基、例えばストレプトアビジン、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチンなどのタンパク質の残基、デキストラン、プルラン、キトサン、シクロデキストリンなどの多糖類の残基、エチレンジアミンのようなキレート剤の残基、ポリソルベートのような界面活性剤の残基を有していてもよい。
　上記分離担体の表面と上記分離担体結合部位との組み合わせは結合可能であれば特に限定されないが、ストレプトアビジン残基とビオチン残基の組み合わせ、ストレプトアビジン残基とデスチオビオチン残基の組み合わせ、トシル基とアミノ基の組み合わせ、エポキシ基とアミノ基の組み合わせ、カルボキシル基とアミノ基の組み合わせ、シクロデキストリン残基とアダマンチル基の組み合わせ、多価アルコール残基とフェニルボロン酸残基の組み合わせなどが挙げられるが、入手の容易さから、ストレプトアビジン残基とビオチン残基の組み合わせ、ストレプトアビジン残基とデスチオビオチン残基の組み合わせ、トシル基とアミノ基の組み合わせ、エポキシ基とアミノ基の組み合わせ、またはカルボキシル基とアミノ基の組み合わせが好ましく、ストレプトアビジン残基とビオチン残基の組み合わせ、ストレプトアビジン残基とデスチオビオチン残基の組み合わせ、またはトシル基とアミノ基の組み合わせが最も好ましい。
＜細胞分離方法＞
　本発明の細胞剥離剤を用いることで被分離細胞を含む細胞群からの被分離細胞の分離は下記の〔工程Ａ〕、〔工程Ｂ〕、〔工程Ｃ〕および〔工程Ｄ〕を含む細胞分離方法により行うことができる。
〔工程Ａ〕
　被分離細胞を含む細胞群に分離担体結合部位を有する被分離細胞の表面抗原認識物質を加え、被分離細胞の表面抗原と反応させることで被分離細胞－抗原認識物質複合体を得る工程である。
　上記細胞としては、培養用樹立細胞、ヒトを含む動物の受精卵および卵細胞などを挙げることができる。また、精細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、臍帯血細胞などの幹細胞、肝細胞、神経細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、血球細胞などのヒトを含む動物細胞もしくは植物細胞などを挙げることもできる。
　上記被分離細胞とは本発明の細胞剥離剤を用いて細胞分離を行った結果、得られる細胞群のことであり、単一の種類であっても、複数の種類の細胞からなる細胞群であってもよい。
　上記被分離細胞を含む細胞群とは被分離細胞を好ましくは０．１％以上含有する細胞群のことで、含まれる細胞の種類は制限されない。
　上記表面抗原とは、血液、体液、組織切片、細胞集合体、懸濁細胞、付着細胞などのいずれに存在してもよく、それらの細胞は生細胞であっても死細胞であってもよい。
　上記表面抗原認識物質としては細胞内または細胞外で発現している抗原に対する任意の抗体、抗体誘導体、フラグメント化抗体、またはフラグメント化抗体誘導体、ペプチド／ＭＨＣ複合体を標的とするＴＣＲ分子、細胞接着受容体分子、共刺激分子のための受容体、人工的にエンジニアリングされた結合分子、プロテインＡ、レクチン、細胞表面分子を標的とするペプチド、アプタマーなどを挙げることができる。
　上記分離担体結合部位を有する被分離細胞の抗原認識物質としては市販されている試薬を用いることもできるが、使用する抗原認識物質に応じて別途作成することも可能である。上記表面抗原認識物質に上記分離担体結合部位を含有させる方法としては添加、クリック反応、アミド化、エステル化、チオエステル化、カーボネート化、シッフ塩基形成反応、還元的アミノ化、ラジカルを介したカップリング反応、ディールスアルダー反応、ジスルフィド化、マイケル付加反応、エン－チオール反応、芳香族ホウ素化合物を介したカップリング反応、三級スルホニウム形成反応、四級アンモニウム形成反応などが挙げられるが、汎用性の高さから、クリック反応、アミド化またはエステル化が好ましい。
　上記分離担体結合部位を有する被分離細胞の表面抗原認識物質と上記被分離細胞の表面抗原との反応は被分離細胞に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、反応温度は２℃から２５℃の範囲が一般的であるが、好ましくは２℃から２０℃の範囲であり、より好ましくは２℃から１０℃の範囲である。また、反応時間についても特に制限されないが、１０分から２時間の範囲が一般的であるが、好ましくは１０分から１時間の範囲であり、より好ましくは１０分から３０分の範囲である。
　上記分離担体結合部位を有する被分離細胞の表面抗原認識物質と上記被分離細胞の表面抗原との反応は、例えば細胞分離用バッファー中で行うことができ、被分離細胞に悪影響を与えなければ特に限定されないが、通常この分野で用いられる緩衝液や培地を用いることができる。例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられ、これらを混合して使用してもよい。好ましくはリン酸緩衝液である。またダルベッコ改変イーグルＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ）、α－ＭＥＭ培地、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地、Ｆ１２培地、ＴＣ１９９培地、ＧＭＥＭ培地、などが挙げられ、これらを混合したり、必要に応じてウシ胎児血清（ＦＢＳ）やグルタミン、抗生物質といったサプリメントを添加してもよいが、抗原認識物質の反応性を損なわないためには無血清の培地が好ましい。また、細胞の凝集を防ぐために各種キレート剤を使用することも可能である。キレート剤としては、上記細胞剥離剤における添加剤としてのキレート剤の例示で挙げたものと同じものが挙げられるが、好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。細胞分離用バッファー中のキレート剤の濃度としては０.１ｍＭから２０ｍＭの範囲であるが、０．５ｍＭから１０ｍＭの範囲が好ましく、１ｍＭから５ｍＭの範囲がより好ましい。キレート剤の濃度が０.１ｍＭ以上の場合、細胞の凝集抑制効果がより発現しやすく、一方で２０ｍＭ以下の場合は細胞毒性などをより示しにくい。
　さらに、上記分離担体結合部位を有する被分離細胞の表面抗原認識物質と上記被分離細胞の表面抗原との反応を促進させるために多糖類やタンパク質、界面活性剤等を添加してもよい。上記多糖類としては、上記細胞剥離剤における添加剤としての多糖類の例示で挙げたものと同じものが挙げられ、上記タンパク質としては、上記細胞剥離剤における添加剤としてのタンパク質の例示で挙げたものと同じものが挙げられ、上記界面活性剤としては上記細胞剥離剤における添加剤としての界面活性剤の例示で挙げたものと同じものが挙げられるが、デキストラン、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０が好ましく、より好ましくはウシ血清アルブミンである。細胞分離用バッファー中の多糖類やタンパク質、界面活性剤等は、細胞分離に使用できれば特に限定されないが、０．０１質量％以上であることが好ましく、０．０５質量％以上がより好ましい。細胞分離用バッファー中の多糖類やタンパク質、界面活性剤等が上記範囲内にある場合は 上記添加剤が十分な効果をより発揮しやすい。
　以上〔工程Ａ〕を行うことで被分離細胞－抗原認識物質複合体を得ることができる。〔工程Ａ〕における具体例としては、被分離細胞の表面抗原とビオチン化抗体を反応させる工程である。
〔工程Ｂ〕
　〔工程Ａ〕で得られた被分離細胞－抗原認識物質複合体を分離担体と分離担体結合部位を介して相互作用させることで被分離細胞－分離担体複合体を得る工程である。
　上記被分離細胞－抗原認識物質複合体と分離担体との反応は被分離細胞に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、例えば上記細胞分離用バッファーを用いて行うことができる。また反応温度は２℃から２５℃の範囲が一般的であるが、好ましくは２℃から２０℃の範囲であり、より好ましくは２℃から１０℃の範囲である。２５℃以下での反応とすることにより、細胞が表面の抗原及び抗体を取り込み、結果として分離担体への結合細胞数が少なくなることをより避けやすい。また、反応時間についても特に制限されないが、１０分から２時間の範囲が一般的であるが、好ましくは１０分から１時間の範囲であり、より好ましくは１０分から３０分の範囲である。
　以上〔工程Ｂ〕を行うことで被分離細胞－分離担体複合体を得ることができる。〔工程Ｂ〕における具体例としては、被分離細胞をビオチン化抗体を介して分離担体と結合させる工程である。
〔工程Ｃ〕
　〔工程Ｂ〕で得られた被分離細胞－分離担体複合体のみを被分離細胞を含む細胞群から分離する工程である。
　上記被分離細胞－分離担体複合体のみを被分離細胞を含む細胞群から分離する方法としては分離担体により異なるが、例えば分離担体が磁性粒子である場合、磁力により集磁する方法が一般的である。また、分離担体がラテックス粒子のような粒子である場合、時間変化による沈殿や遠心分離による沈降が可能である。さらに分離担体が平板である場合、上記細胞分離用バッファーから取り出すだけでよい。
　上記分離後、洗浄することが好ましく、洗浄では、被分離細胞に悪影響を与えないものであれば、特に限定されないが、例えば上記細胞分離用バッファーを使用することもできる。
　以上〔工程Ｃ〕を行うことで被分離細胞－分離担体複合体を分離することができる。〔工程Ｃ〕における具体例としては、被分離細胞－分離担体複合体を磁性や遠心分離などにより被分離細胞を含む細胞群から取り出す工程である。
〔工程Ｄ〕
　〔工程Ｃ〕で得られた被分離細胞－分離担体複合体に、上記細胞剥離剤を加え、温度変化により被分離細胞を分離する工程である。
　上記被分離細胞－分離担体複合体に上記細胞剥離剤を直接添加することもできるが、上記細胞分離用バッファーと混ぜて添加してもよい。また添加時の温度としては使用する細胞剥離剤の構成成分である結合性ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）以下であれば特に限定されないが、細胞に悪影響を与えない温度としてより好ましくは４～１０℃の範囲が好ましい。また、反応時間についても特に制限されないが、１０分から２時間の範囲が一般的であるが、好ましくは１０分から１時間の範囲であり、より好ましくは１０分から３０分の範囲である。
　上記〔工程Ｄ〕中の温度変化とは細胞剥離剤の構成成分である結合性ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）以下の温度から上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）以上の温度まで加温することである。加温後の温度としては細胞に悪影響を与えない温度としてより好ましくは２５～４０℃の範囲が好ましい。
　以上〔工程Ｄ〕を行うことで被分離細胞－分離担体複合体から被分離細胞を分離することができる。〔工程Ｄ〕における具体例としては、被分離細胞－分離担体複合体と細胞剥離剤を反応させ、温度変化させることで、分離担体と被分離細胞間の相互作用を切断し、被分離細胞を取り出す工程である。
　以下、実施例等に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例等に限定されるものではない。
（合成例１：ウレイドモノマー（１）の合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　ナスフラスコにアミノエチルメタクリレート塩酸塩（２０．０ｇ，　１２０ｍｍｏｌ）を加え、イオン交換水９０ｍＬに溶解させた。シアン酸カリウム（１０．７ｇ，　１３２ｍｍｏｌ）を加え室温で撹拌した。２時間撹拌後、反応溶液を凍結乾燥し、アセトン２００ｍＬに再懸濁した。その後、不溶分のろ過を行い、得られた混合溶液から溶媒を減圧留去した。その後酢酸エチル／メタノール９／１（ｖ／ｖ）でシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、ウレイドモノマー（１）を得た。
収量：１２ｇ
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６、４００ＭＨｚ）
　６．２ｐｐｍ（ＣＯＮＨ ２ ），５．７ｐｐｍ（ＣＨ ２ ＝Ｃ），５．５ｐｐｍ（ＣＨ ２ ＝Ｃ，ＮＨＣＯ），４．０ｐｐｍ（ＯＣＨ ２ ），３．２ｐｐｍ（ＣＨ ２ ＮＨ），２．０ｐｐｍ（ＣＨ ３ ）
（合成例２－１：ウレイド基含有ポリマーＡの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
（式中、ｃｏは化学式中の２つのモノマー単位の共重合体構造であることを示す。）
　試験管にウレイドモノマー（１）（３８０ｍｇ）、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（２）（ＭＰＣ、３２．８ｍｇ）、２－（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）－２－メチルプロピオン酸－３－アジド－１－プロパノールエステル（０．９０ｍｇ）、アゾビスイソブチロニトリル（０．１６４ｍｇ）を加えジメチルスルホキシド（２．４ｍＬ）、エタノール（０．６ｍＬ）に溶解させた。窒素ガスでバブリングした後、反応液を６５℃まで昇温し２０時間反応させた。重合溶液をアセトンで再沈殿することでウレイド基含有ポリマーＡを得た。
収量：３５０ｍｇ
組成比（モル比）　ｘ：ｙ＝９５：５（１ＨＮＭＲから算出）
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ＋Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）
　４．１ｐｐｍ（Ｕｒｅｉｄｏ：ＣＯＯ－ＣＨ ２ ），３．８－４，６ｐｐｍ（ＭＰＣ：ＣＯＯ－ＣＨ ２ ，ＣＨ２－ＣＨ ２ ，ＰＯ－ＣＨ ２ ），３．６ｐｐｍ（ＭＰＣ：ＣＨ ２ －Ｎ），３．４ｐｐｍ（Ｕｒｅｉｄｏ：ＣＨ２－ＣＨ ２ ），３．２ｐｐｍ（Ｎ（ＣＨ ３ ）３），１．０－２．４ｐｐｍ（ポリマー主鎖）
　得られたウレイド基含有ポリマーＡの数平均分子量は、検出器にＷＹＡＴＴ社製　多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定により求めた。ポンプに島津製作所（株）社製ＬＣ－７２０ＡＤを、検出器（示差屈折率計）に島津製作所（株）社製ＲＩＤ１０Ａを、検出器（ＵＶ）にＳＰＤ－２０Ａを用いた。カラムには、東ソー（株）社製ＴＳＫＧｅｌ　Ｇ３０００ＰＷＸＬとＴＳＫＧｅｌ　Ｇ５０００ＰＷＸＬ（カラムサイズ　４．６ｍｍ×２５ｃｍ）とを二本連結したものを用いた。展開溶媒は、１００ｍＭの硝酸ナトリウムを溶解させた蒸留水／アセトニトリル（５／５　ｖ／ｖ）を用いた。測定条件は、流速　０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度　４０℃、サンプル濃度　２ｍｇ／ｍＬ、注入量　１００μＬであった。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ウレイド基含有ポリマーＡの数平均分子量は３０８，０００であった。
　得られたウレイド基含有ポリマーＡの相転移温度は紫外可視分光光度計により測定した。ウレイド基含有ポリマーＡを、細胞分離用バッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋２ｍＭ　ＥＤＴＡ）に２.５ｍｇ／ｍＬ濃度になるように溶解した。溶液を石英セルに入れ、溶液温度を７０℃～５℃の範囲で変化させ、その間の溶液の透過率（％）を紫外可視分光光度計によって測定した。なお、溶液の透過率（％）は下式から算出した。その結果ウレイド基含有ポリマーＡの相転移温度は２０℃であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000026
（合成例２－２：結合性ウレイド基含有ポリマーＡ’の合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（式中、ｃｏは化学式中の２つのモノマー単位の共重合体構造であることを示す。）
　試験管にウレイド基含有ポリマーＡ（３００ｍｇ）、ビオチン-２－アルキン（２）（３４．１ｍｇ）、臭化銅（Ｉ）（１３．２ｍｇ）を加え、ジメチルスルホキシド（４ｍＬ）、イオン交換水（１ｍＬ）に溶解させた。ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＴＡ）（１６．０ｍｇ）のジメチルスルホキシド溶液（１ｍＬ）を加え、反応を開始させた。室温で一晩反応後、透析により精製することで結合性ウレイド基含有ポリマーＡ’を得た。
収量：３００ｍｇ
（調製例２－３：細胞剥離剤Ａ’’の調整）
　結合性ウレイド基含有ポリマーＡ’を０．８ｍｇ／ｍＬの濃度となるように細胞分離用バッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋２ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解させ、細胞剥離剤Ａ’’を調製した。
（合成例３－１：ウレイド基含有ポリマーＢの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
（式中、ｃｏは化学式中の２つのモノマー単位の共重合体構造であることを示す。）
　四ッ口フラスコにＭｅｒｃｋ社より購入した数平均分子量が３０，０００程度であるポリアリルアミン（５００ｍｇ）を加え、イオン交換水１０ｍＬに溶解し、５０℃に加熱し、これにシアン酸カリウム（６１１ｍｇ，７．５４ｍｍｏｌ）（ポリアリルアミン中アミノ基１モルに対して０.８６モル）を加え、２４時間反応させた。反応終了後、同温度で透析により精製し、ウレイド基含有ポリマーＢを得た。
収量：５７９ｍｇ
組成比（モル比）ｘ：ｙ＝８５：１５（１ＨＮＭＲにより算出）
　得られたウレイド基含有ポリマーＢの数平均分子量は、合成例２－１と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ウレイド基含有ポリマーＢの数平均分子量は３６，０００であった。
　得られたウレイド基含有ポリマーＢの相転移温度は合成例２－１と同様にして求めた。紫外可視分光光度計による測定の結果相転移温度は３０℃であった。
（合成例３－２：結合性ウレイド基含有ポリマーＢ’の合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
（式中、ｃｏは化学式中の２つまたは３つのモノマー単位の共重合体構造であることを示す。）
　試験管にウレイド基含有ポリマーＢ（３００ｍｇ）、ビオチン－２－ＮＨＳ（３）（５０ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）（ウレイド基含有ポリマーＢ中アミノ基１モルに対して０．１モル）を加え、ジメチルスルホキシド（１ｍＬ）に溶解させた。室温で一晩反応後、透析により精製することで結合性ウレイド基含有ポリマーＢ’を得た。
収量：３２６ｍｇ
（調製例３－３：細胞剥離剤Ｂ’’の調整）
　結合性ウレイド基含有ポリマーＢ’を０．８ｍｇ／ｍＬの濃度となるように細胞分離用バッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋２ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解させ、細胞剥離剤Ｂ’’を調製した。
（合成例４－１：ウレイド基含有ポリマーＣの合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
（式中、ｃｏは化学式中の２つのモノマー単位の共重合体構造であることを示す。）
　試験管に数平均分子量が１５０，０００～３００，０００程度であるポリ－Ｌ－オルニチン５００ｍｇを入れ、１Ｍイミダゾール緩衝液（ｐＨ７）１ｍｌに溶解した、５０℃に加熱し、これにシアン酸カリウム（２６３ｍｇ，３．２５ｍｍｏｌ）（オルニチン残基１モルに対して０．８６モル）を加え２４時間反応させた。反応終了後、同温度で透析により精製し、ウレイド基含有ポリマーＣを得た。
収量：５４０ｍｇ
組成比（モル比）ｘ：ｙ＝８４：１６（１ＨＮＭＲにより算出）
　得られたウレイド基含有ポリマーＣの数平均分子量は、合成例２－１と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ウレイド基含有ポリマーＣの数平均分子量は２６０，０００であった。
　得られたウレイド基含有ポリマーＣの相転移温度は合成例２－１と同様にして求めた。紫外可視分光光度計による測定の結果相転移温度は２０℃であった。
（合成例４－２：結合性ウレイド基含有ポリマーＣ’の合成）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（式中、ｃｏは化学式中の２つまたは３つのモノマー単位の共重合体構造であることを示す。）
　試験管にウレイド基含有ポリマーＣ（３００ｍｇ）、ビオチン－２－ＮＨＳ（３）（３０ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ）（ウレイド基含有ポリマーＣ中アミノ基１モルに対して０．１モル）をジメチルスルホキシド（１ｍＬ）に溶解させた。室温で一晩反応後、透析により精製することで結合性ウレイド基含有ポリマーＣ’を得た。
収量：２９８ｍｇ
（調製例４－３：細胞剥離剤Ｃ’’の調整）
　結合性ウレイド基含有ポリマーＣ’を０．８ｍｇ／ｍＬの濃度となるように細胞分離用バッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋２ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解させ、細胞剥離剤Ｃ’’を調製した。
（調製例５：細胞剥離剤Ｄ’’の調整）
　ウレイド基含有ポリマーＢを０．８ｍｇ／ｍＬの濃度となるように細胞分離用バッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋２ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解させ、細胞剥離剤Ｄ’’を調製した。
＜実施例１－１＞
（単一細胞種を用いた細胞分離試験）
　エッペンチューブに無血清のＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したヒト由来白血病細胞株ＨＬ－６０（５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，２００μＬ）を分注し、細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液の細胞数をカウントした（カウントＡ）。細胞懸濁液にビオチン化抗ＣＤ４５抗体（４μＬ）を入れ、４℃で１０分間振とうした。その後細胞分離用バッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋２ｍＭ　ＥＤＴＡ）を３００μＬ入れ、３５０ｇで１０分間遠心した。遠心後上清を除去し、細胞分離用バッファー（２００μＬ）で再懸濁させた。分離担体としてＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）　Ｍ－２８０Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（６×１０８ｂｅａｄｓ／ｍＬ，１６μＬ）を加え撹拌した後に４℃で１５分振とうした。４℃でビーズを集磁し、上清を取り除き、細胞分離用バッファーにより洗浄後、細胞剥離剤Ａ’’を添加後、４℃で１５分間反応させた。その後３７℃で１５分加温し、再度集磁を行い上清を回収し（測定サンプルＸ）、その細胞数をカウントした（カウントＢ）。細胞数のカウントはトリパンブルー処理後、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　２）を用いて行った。測定サンプルＸの生存率については分離後に洗浄を行わず３７℃、６時間培養後にトリパンブルー処理を行い、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　２）により求めた。
　細胞分離後のＨＬ－６０細胞の回収率は下記式（５）により算出した。生存率は下記式（６）により算出した。評価結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000032
＜実施例１－２～１－４＞
　表１に示す分離担体および細胞剥離剤を使用したこと以外は実施例１－１と同様にして単一細胞種を用いた細胞分離試験を行った。評価結果を表１に示す。
＜実施例２－１＞
（複数細胞種を用いた細胞分離試験）
　エッペンチューブにＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２であらかじめ染色したＨｅＬａ細胞とＨＬ－６０細胞を細胞数で３３：６７となるように混合した複数細胞混合液（総細胞数５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，２００μＬ）を調製した（測定サンプルＡ）。そこにビオチン化抗ＣＤ４５抗体（４μＬ）を入れ、４℃で１０分間振とうした。その後細胞分離用バッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋２ｍＭ　ＥＤＴＡ）を３００μＬ入れ、３５０ｇで１０分間遠心した。遠心後上清を除去し、細胞分離用バッファー（２００μＬ）で再懸濁させた。分離担体としてＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）　Ｍ－２８０Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（６×１０８ｂｅａｄｓ／ｍＬ，１６μＬ）を加え撹拌した後に４℃で１５分振とうした。４℃でビーズを集磁し、上清を４℃で取り除き、細胞分離用バッファーにより洗浄した。その後細胞剥離剤Ａ’’を添加し、４℃で１５分間反応させた。その後３７℃で１５分加温し、再度集磁を行い、上清を回収した（測定サンプルＢ）。測定サンプルＡおよびＢはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－標識二次抗体を用いてＣＤ４５陽性細胞の染色を行った。後にＢＤ社製Ｔｒｕｅｃｏｕｎｔ　Ｔｕｂｅに入れ、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　Ｘ－２０　フローサイトメーターにより分析した。測定サンプルＢの生存率については分離後に洗浄を行わず３７℃、６時間培養後にトリパンブルー処理を行い、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　２）により求めた。
　細胞分離後のＨＬ－６０細胞の回収率は下記式（７）により算出した。次に純度は下記式（８）により算出した。生存率は下記式（９）により算出した。評価結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000033
＜実施例２－２～２－４＞
　表２に示す分離担体および細胞剥離剤を使用したこと以外は実施例２－１と同様にして複数細胞種を用いた細胞分離試験を行った。評価結果を表２に示す。
＜比較例１＞
　エッペンチューブに無血清のＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したヒト由来白血病細胞株ＨＬ－６０（５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，２００μＬ）を分注し、細胞懸濁液を調製した。調製した細胞懸濁液の細胞数をカウントした（カウントＡ）。細胞懸濁液にデスチオビオチン化抗ＣＤ４５抗体（４μＬ）を入れ、４℃で１０分間振とうした。その後細胞分離用バッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋２ｍＭ　ＥＤＴＡ）を３００μＬ入れ、３５０ｇで１０分間遠心した。遠心後上清を除去し、細胞分離用バッファー（２００μＬ）で再懸濁させた。分離担体としてＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）　Ｍ－２８０Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（６×１０８ｂｅａｄｓ／ｍＬ，１６μＬ）を加え撹拌した後に４℃で１５分振とうした。４℃でビーズを集磁し、上清を取り除き、細胞分離用バッファーにより洗浄後、ビオチン含有細胞分離バッファーを添加後、４℃で１５分間反応させた。再度集磁を行い上清を回収し（測定サンプルＸ）、その細胞数をカウントした（カウントＢ）。細胞数のカウントはトリパンブルー処理後、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　２）を用いて測定した。測定サンプルＸの生存率については分離後に洗浄を行わず３７℃、６時間培養後にトリパンブルー処理を行い、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　２）により求めた。
　細胞分離後のＨＬ－６０細胞の回収率は上記式（５）により算出した。生存率は上記式（６）により算出した。評価結果を表１に示す。
＜比較例２＞
　エッペンチューブにＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２であらかじめ染色したＨｅＬａ細胞とＨＬ－６０細胞を細胞数で３３：６７となるように混合した複数細胞混合液（総細胞数５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，２００μＬ）を調製した（測定サンプルＡ）。そこにデスチオビオチン化抗ＣＤ４５抗体（４μＬ）を入れ、４℃で１０分間振とうした。その後細胞分離用バッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）＋２ｍＭ　ＥＤＴＡ）を３００μＬ入れ、３５０ｇで１０分間遠心した。遠心後上清を除去し、細胞分離用バッファー（２００μＬ）で再懸濁させた。分離担体としてＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）　Ｍ－２８０Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（６×１０８ｂｅａｄｓ／ｍＬ，１６μＬ）を加え撹拌した後に４℃で１５分振とうした。４℃でビーズを集磁し、上清を４℃で取り除き、細胞分離用バッファーにより洗浄した。その後ビオチン含有細胞分離バッファーを添加し、４℃で１５分間反応させた。再度集磁を行い、上清を回収した（測定サンプルＢ）。測定サンプルＡおよびＢはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－標識二次抗体を用いてＣＤ４５陽性細胞の染色を行った。後にＢＤ社製Ｔｒｕｅｃｏｕｎｔ　Ｔｕｂｅに入れ、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　Ｘ－２０　フローサイトメーターにより分析した。測定サンプルＢの生存率については分離後に洗浄を行わず、３７℃、６時間培養後にトリパンブルー処理を行い、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ　２）により求めた。
　細胞分離後のＨＬ－６０細胞の回収率は上記式（７）により算出した。次に純度は上記式（８）により算出した。生存率は上記式（９）により算出した。評価結果を表２に示す。
　表１、２に示す通り、実施例のポリマーを用いた場合、デスチオビオチン化抗体を別途調整し、ビオチン含有細胞分離バッファーを用いた細胞分離を行った場合に比べ回収率が向上している。また、本発明の細胞剥離剤を用いて分離した細胞の生存率が非常に高いことも見て取れる。
　以上のことから分離担体から被分離細胞を脱離させる駆動力として、温度応答によるポリマー鎖の伸縮が利用でき、分離後の細胞に影響を与えないポリマー、例えば被分離細胞の表面抗原を用いた細胞分離方法において分離担体と結合可能な分離担体結合部位を有する結合性ウレイド基含有ポリマーを含む細胞剥離剤が有用であることが分かる。さらに当該細胞剥離剤を用いた細胞分離方法において、汎用性の高いビオチン化抗体を使用可能であることについても明らかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　本発明により、被分離細胞の表面抗原を用いた細胞分離方法において、幅広い種類の細胞に適用でき、さらには分離後の被分離細胞の洗浄が不要となる細胞剥離剤および当該細胞剥離剤を用いた細胞分離方法が提供される。
　本出願は、日本で出願された特願２０２１－１０９２７８（出願日：２０２１年６月３０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (22)

  1. 　被分離細胞と結合した分離担体から被分離細胞を剥離するための細胞剥離剤であって、
    　上記細胞剥離剤は、下記式（１）で表される側鎖構造を有し上記分離担体と結合可能な分離担体結合部位をその側鎖または末端に有する結合性ウレイド基含有ポリマーを含み、
    　上記結合性ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）は、４～４０℃の範囲である、
    上記細胞剥離剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 　上記分離担体結合部位がビオチン残基、ストレプトアビジン残基、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、シクロデキストリン残基、アダマンチル基またはフェニルボロン酸残基である請求項１に記載の細胞剥離剤。
  3. 　上記ウレイド基含有ポリマーの主鎖がエチレン性不飽和ポリマー、ポリアリルアミンまたはポリペプチドである請求項１または２に記載の細胞剥離剤。
  4. 　上記ウレイド基含有ポリマーが下記式（２）で表されるウレイド基含有構造の繰り返しであるウレイド基含有繰り返し配列Ａを有する請求項１または２に記載の細胞剥離剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （上記式（２）中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を表し、Ａ１はＯまたはＮＨを表し、ａは１～６の整数を表す。）
  5. 　上記ウレイド基含有ポリマーが下記式（３）で表される親水性構造の繰り返しである親水性繰り返し配列Ｂをさらに有する請求項４に記載の細胞剥離剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （上記式（３）中、Ｒ２は水素原子またはメチル基を表し、Ａ２はＯまたはＮＨを表し、ｂは１～６の整数を表し、Ｘは下記式（４）～（９）から選択される。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （上記式（９）中、ｍは０～２０の整数を表す。）
  6. 　上記ウレイド基含有繰り返し配列Ａ中、Ａ１がＯであり、ａが２であり、上記親水性繰り返し配列Ｂ中、Ａ２がＯであり、ｂが２であり、Ｘが上記式（４）で表される請求項５に記載の細胞剥離剤。
  7. 　上記ウレイド基含有ポリマーの上記ウレイド基含有繰り返し配列Ａと上記親水性繰り返し配列Ｂのモル比が０．５≦Ａ／（Ａ＋Ｂ）の関係にある請求項５に記載の細胞剥離剤。
  8. 　上記結合性ウレイド基含有ポリマーが上記分離担体結合部位としてのビオチン残基を上記ウレイド基含有ポリマーの末端に有する請求項４に記載の細胞剥離剤。
  9. 　上記ウレイド基含有ポリマーが下記式（１０）で表されるウレイド基含有構造の繰り返しであるウレイド基含有繰り返し配列Ｃと下記式（１１）で表される親水性構造の繰り返しである親水性繰り返し配列Ｄを有する請求項１または２に記載の細胞剥離剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  10. 　上記ウレイド基含有ポリマーの上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｃと上記親水性繰り返し配列Ｄのモル比が０．５≦Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）の関係にある請求項９に記載の細胞剥離剤。
  11. 　上記分離担体結合部位としてビオチン残基を上記ウレイド基含有ポリマーの側鎖に有する上記結合性ウレイド基含有ポリマーを含む請求項９に記載の細胞剥離剤。
  12. 　上記ウレイド基含有ポリマーが下記式（１２）で表されるウレイド基含有構造の繰り返しであるウレイド基含有繰り返し配列Ｅと下記式（１３）で表される親水性構造の繰り返しである親水性繰り返し配列Ｆを有する請求項１または２に記載の細胞剥離剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （上記式（１２）中、ｃは０～６の整数を表し、ｄは０～６の整数を表し、上記式（１３）中、ｅは０～６の整数を表し、ｆは０～６の整数を表す。）
  13. 　上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｅ中、ｃが０であり、ｄが３であり、上記親水性繰り返し配列Ｆ中、ｅが０であり、ｆが３である請求項１２に記載の細胞剥離剤。
  14. 　上記ウレイド基含有ポリマーの上記ウレイド基含有繰り返し配列Ｅと上記親水性繰り返し配列Ｆのモル比が０．５≦Ｅ／（Ｅ＋Ｆ）の関係にある請求項１２に記載の細胞剥離剤。
  15. 　上記分離担体結合部位としてビオチン残基を上記ウレイド基含有ポリマーの側鎖に有する上記結合性ウレイド基含有ポリマーを含む請求項１２に記載の細胞剥離剤。
  16. 　上記ウレイド基含有ポリマーの数平均分子量が２０，０００～１，０００，０００である請求項１または２に記載の細胞剥離剤。
  17. 　被分離細胞を含む細胞群から被分離細胞を分離するための方法であって、下記〔工程Ａ〕、〔工程Ｂ〕、〔工程Ｃ〕および〔工程Ｄ〕を含むことを特徴とする細胞分離方法。
    　〔工程Ａ〕
    　被分離細胞を含む細胞群に分離担体結合部位を有する被分離細胞の表面抗原認識物質を加え、被分離細胞の表面抗原と反応させることで被分離細胞－抗原認識物質複合体を得る工程
    　〔工程Ｂ〕
    　〔工程Ａ〕で得られた被分離細胞－抗原認識物質複合体を分離担体と分離担体結合部位を介して相互作用させることで被分離細胞－分離担体複合体を得る工程
    　〔工程Ｃ〕
    　〔工程Ｂ〕で得られた被分離細胞－分離担体複合体のみを被分離細胞を含む細胞群から分離する工程
    　〔工程Ｄ〕
    　〔工程Ｃ〕で得られた被分離細胞－分離担体複合体に、請求項１または２に記載の細胞剥離剤を加え、温度変化により被分離細胞を分離する工程
  18. 　上記〔工程Ａ〕中、分離担体結合部位がビオチン残基、ストレプトアビジン残基、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、シクロデキストリン残基、アダマンチル基またはフェニルボロン酸残基である請求項１７に記載の細胞分離方法。
  19. 　上記〔工程Ａ〕中、抗原認識物質が抗体、抗体フラグメント、ペプチド、アプタマー、プロテインＡまたはレクチンである請求項１７に記載の細胞分離方法。
  20. 　上記〔工程Ｂ〕中、分離担体が磁性粒子である請求項１７に記載の細胞分離方法。
  21. 　上記〔工程Ｃ〕中、磁力により被分離細胞－分離担体複合体のみを被分離細胞を含む細胞群から分離する請求項２０に記載の細胞分離方法。
  22. 　上記〔工程Ｄ〕中、温度変化が結合性ウレイド基含有ポリマーの上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）以下の温度から上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）以上の温度まで加温することである請求項１７に記載の細胞分離方法。
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