WO2015133524A1 - 細胞内送達用高分子担体 - Google Patents

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WO2015133524A1
WO2015133524A1 PCT/JP2015/056364 JP2015056364W WO2015133524A1 WO 2015133524 A1 WO2015133524 A1 WO 2015133524A1 JP 2015056364 W JP2015056364 W JP 2015056364W WO 2015133524 A1 WO2015133524 A1 WO 2015133524A1
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lac
dmae
solution
meth
segment
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大塚　英典
大輔 松隈
佑紀 村松
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学校法人東京理科大学
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    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures

Definitions

  • the present invention relates to a polymer carrier for intracellular delivery.
  • Patent Document 1 discloses a polymer for intracellular delivery comprising a complex of a nucleic acid and a cationic polymer, which contains a predetermined cationic polymer and a nucleic acid.
  • a carrier is disclosed.
  • An object of the present invention is to provide a polymer carrier having excellent delivery ability into cells.
  • the present inventors have found that a copolymer having a segment obtained by random copolymerization of a cationic monomer and a monomer having a ligand capable of binding to the cell surface is easily taken up into the cell. It came to be completed. More specifically, the present invention provides the following.
  • a polymeric carrier for intracellular delivery comprising a copolymer having a segment (A) in which a cationic monomer and a monomer having a ligand capable of binding to the cell surface are randomly copolymerized.
  • FIG. 4 is a graph showing a UV-vis spectrum of a gold nanorod according to an example of the present invention. It is a graph which shows the delivery amount to the inside of the cell of gold
  • the cells are laser-treated after delivery of the gold nanorods into the cells. It is a graph which shows the amount of cells before and after performing irradiation. It is a figure which shows that the polymeric carrier for intracellular delivery which concerns on one Example of this invention has affinity with respect to a lectin.
  • Galactose by a graph showing the extent of competitive inhibition with respect to the suction against RCA 120 modified surfaces of intracellular delivery polymeric carrier according to an embodiment of the present invention.
  • (A) shows the measurement results for the silica solution not coated with the polymer coating (control)
  • (b) shows the measurement results for the silica solution coated with Py-b-Lac
  • (c) Shows the measurement results for the silica solution coated with Py-b- (Lac-co-DMAE 10%)
  • (d) shows the measurement for the silica solution coated with Py-b- (Lac-co-DMAE 20%). The results are shown, and (e) shows the measurement results for the silica solution coated with Py-b- (Lac-co-DMAE 50%).
  • the polymer carrier for intracellular delivery of the present invention comprises a copolymer having a segment (A) in which a cationic monomer and a monomer having a ligand capable of binding to the cell surface are at least randomly copolymerized.
  • the polymeric carrier for intracellular delivery of the present invention is excellent in the ability to deliver into cells. Since the segment (A) is a random copolymer of cationic monomers, the portion of the segment (A) where the cationic monomer is polymerized has a positive charge. Since the cell surface is negatively charged, the polymeric carrier for intracellular delivery of the present invention accumulates on the cell surface by this positive charge. Furthermore, since the segment (A) is obtained by random copolymerization of a monomer having a ligand capable of binding to the cell surface, the segment (A) has a monomer having the ligand in the vicinity of the portion where the cationic monomer is polymerized. It will have a polymerized part. As a result, the segment (A) accumulates on the cell surface due to its positive charge and can be bound to the cell surface via the ligand, so that it is easily taken into the cell.
  • the cationic monomer of the present invention is a polymerizable monomer and needs to have a polymerizable group in its structure, but the type thereof is not particularly limited.
  • a monomer or the like having a ligand capable of binding to the cell surface can be polymerized with a monomer or the like having a ligand capable of binding to the cell surface.
  • R 1 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, preferably a hydrogen atom or a methyl group.
  • R 2 is O, NH, or NR 3 , R 3 is an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and
  • X represents a group represented by the following general formula (II).
  • X 0 and X 1 are an alkylene group or a hydroxyalkylene group having 2 to 6 carbon atoms, and R 4 , R 5 , R 6 , R 7 and R 8 are independently of each other carbon number 1 Is an alkyl group of ⁇ 6, and Z ⁇ is a counter ion.
  • the counter ion is not particularly limited, and examples thereof include halide ions and acetate ions.
  • cationic monomer examples include dimethylaminoethyl (meth) acrylate (DMAEMA), diethylaminomethyl (meth) acrylate, diethylaminoethyl (meth) acrylate, dimethylaminomethyl (meth) acrylate, diethylaminopropyl (meth) acrylate, Dimethylaminobutyl (meth) acrylate, dimethylaminoneopentyl (meth) acrylate, dimethylaminoethyl (meth) acrylamide, diethylaminoethyl (meth) acrylamide, diethylaminopropyl (meth) acrylamide, dimethylaminopropyl (meth) acrylamide, dimethylaminoneo Examples include pentyl (meth) acrylamide. These may be used alone or in combination of two or more. Of these, dimethylaminoethyl (meth) acrylate is preferred.
  • the monomer having a ligand capable of binding to the cell surface of the present invention is a polymerizable monomer and needs to have a polymerizable group in its structure, but the type is not particularly limited, and examples thereof include a vinyl group, An allyl group, a styryl group, a (meth) acryloyl group, etc. may be sufficient. It is possible to polymerize with a cationic monomer or the like through this polymerizable group.
  • the monomer (B) is preferably represented by the following general formula (III).
  • R 9 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, preferably a hydrogen atom or a methyl group.
  • R 10 is O or NH.
  • X is a spacer, and Z 2 is a ligand.
  • the spacer is not particularly limited as long as the above-described ligand can be introduced, and examples thereof include an alkyleneoxy group having 1 to 200 repeating units, an alkylene group, and the like, and preferably 1 repeating unit. ⁇ 50 ethyleneoxy groups or alkylene groups.
  • the alkylene group may be linear or branched.
  • the number of carbon atoms of the alkylene group is not particularly limited, but is preferably 1-8.
  • An ethyleneoxy group having 1 to 50 repeating units or an alkylene group having 1 to 8 carbon atoms is preferable because the ability of the polymer carrier of the present invention to be delivered to cells is improved.
  • the above-described ligand is bound through this spacer.
  • Examples of the ligand having the ability to bind to the cell surface include a molecular recognition element that exhibits a specific interaction with a specific target substance on the cell surface, such as a sugar chain, a protein, and an antigen.
  • a specific target substance on the cell surface such as a sugar chain, a protein, and an antigen.
  • examples include sugar chains (lactose, galactose, etc.), antibodies, and the like.
  • the segment (A) of the present invention may contain a monomer other than the monomer having the cationic monomer and the ligand.
  • monomers include methoxymethyl (meth) acrylamide, ethoxymethyl (meth) acrylamide, propoxymethyl (meth) acrylamide, butoxymethoxymethyl (meth) acrylamide, N-hydroxymethyl (meth) acrylamide, and 2-hydroxyethyl.
  • the number of units of the cationic monomer in the segment (A) is not particularly limited, but is preferably 1 to 100, more preferably 2 to 80, still more preferably 5 to 60, and most preferably 15 to 40.
  • the proportion of the structural unit derived from the cationic monomer in the segment (A) is not particularly limited, but is preferably 5 mol% or more, more preferably 10 mol% or more, still more preferably 20 mol% or more, Most preferably, it is 50 mol% or more.
  • the number of units of the monomer having the ligand in the segment (A) is not particularly limited, but is preferably 1 to 100, more preferably 5 to 80, and still more preferably 15 to 50.
  • the proportion of the structural unit derived from the monomer having a ligand in the segment (A) is not particularly limited, but is preferably 10 mol% or more, more preferably 20 mol% or more, and further preferably 40 mol% or more. Yes, most preferably 50 mol% or more.
  • the random copolymerization method of the segment (A) is not particularly limited, and a conventionally known method can be used. Living radical polymerization methods such as addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization and atom transfer radical polymerization (ATRP) can be used. preferable. According to the living radical polymerization method, the molecular weight and molecular weight distribution of the amphiphilic polymer to be synthesized can be controlled.
  • RAFT addition-fragmentation chain transfer
  • ATRP atom transfer radical polymerization
  • the chain transfer agent used in RAFT is not particularly limited.
  • CDB cumyl dithiobenzoate
  • 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate
  • acetic acid dithiobenzoate butanoic acid dithiobenzoate
  • 4- And toluic acid dithiobenzoate 4- And toluic acid dithiobenzoate.
  • the polymerization initiator is not particularly limited.
  • a suitable amount of the polymerization initiator used is 0.001 to 1% by mass with respect to the monomer and 1 to 33% by mass with respect to the chain transfer agent.
  • the halogenated alkyl initiator used in ATRP is not particularly limited, and examples thereof include 2-bromoisobutyryl bromide, 2-chloroisobutyryl chloride, bromoacetyl bromide, bromoacetyl chloride, and benzyl bromide.
  • transition metal complexes such as monovalent copper and divalent ruthenium can be used.
  • the solvent used in the polymerization reaction is not particularly limited.
  • water, methanol, ethanol, propanol, t-butanol, benzene, toluene, N, N-dimethylformamide, tetrahydrofuran, chloroform, 1,4-dioxane, dimethyl examples thereof include sulfoxide and a mixed solution thereof.
  • the copolymer constituting the intracellular carrier for intracellular delivery of the present invention may have a segment other than the segment (A) depending on the substance to be delivered into the cell.
  • the copolymer of the present invention can further have a segment (B) having a group that can be adsorbed to inorganic fine particles.
  • the segment (B) having a group that can be adsorbed on the inorganic fine particles can be constituted by, for example, a monomer having a group that can be adsorbed on the inorganic fine particles.
  • the monomer that can be adsorbed to the inorganic fine particles of the present invention is a polymerizable monomer and needs to have a polymerizable group in the structure thereof, but the type thereof is not particularly limited, and examples thereof include a vinyl group, an allyl group, and styryl. It may be a group, a (meth) acryloyl group or the like. For example, it can be added to the segment (A) via this polymerizable group.
  • the monomer that can be adsorbed on the inorganic fine particles is not particularly limited.
  • a monomer having a group that can be adsorbed and dispersed on the inorganic fine particles is used.
  • the group include a thiol group and a pyridyl group.
  • it does not specifically limit as a monomer which has a pyridyl group What is a compound represented by the following general formula (IV) is preferable.
  • R 11 is a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, and is preferably a hydrogen atom or a methyl group.
  • R 12 is an alkylene group having 1 to 7 carbon atoms, preferably an alkylene group having 2 to 7 carbon atoms, and more preferably an alkylene group having 3 to 5 carbon atoms.
  • the inorganic fine particles are not particularly limited, and examples thereof include fine particles of silica, metal oxide (alumina, etc.), metal (gold, silver, iron, copper, etc.).
  • metal nanorod rod-like
  • the cell to be delivered can be killed by light heat.
  • mesoporous silica as the inorganic fine particles, the drug can be delivered into cells.
  • the number of units of the monomer having a group capable of being adsorbed on the inorganic fine particles in the segment (B) is not particularly limited, but is preferably 1 to 100, preferably 10 to 80, and more preferably 20 to 50.
  • the proportion of the structural unit derived from the monomer having a group capable of being adsorbed on the inorganic fine particles in the segment (B) is not particularly limited, but is preferably 50 mol% or more, more preferably 70 mol% or more, and still more preferably Is 80 mol% or more, and most preferably 90 mol% or more.
  • the segment (B) of the present invention may contain the above-mentioned other monomers other than the monomer having a group that can be adsorbed to the inorganic fine particles.
  • other monomers include (meth) acrylamide, methoxymethyl (meth) acrylamide, ethoxymethyl (meth) acrylamide, propoxymethyl (meth) acrylamide, butoxymethoxymethyl (meth) acrylamide, and N-hydroxymethyl (meth) acrylamide.
  • the method for producing the copolymer having the segment (A) and the segment (B) is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • a monomer having an adsorbable group it can be produced by a living radical polymerization method such as addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, atom transfer radical polymerization (ATRP) or the like.
  • RAFT addition fragmentation chain transfer
  • ATRP atom transfer radical polymerization
  • the copolymer constituting the polymeric carrier for intracellular delivery of the present invention can further have a segment (C) having a positive charge larger than the positive charge of the segment (A).
  • segment (C) of the copolymer of the present invention forms a polyplex (complex) with the nucleic acid, so that the nucleic acid can be delivered into the cell.
  • the segment (C) having a positive charge larger than the positive charge of the segment (A) is not particularly limited and can be appropriately set in consideration of the positive charge of the segment (A).
  • it is derived from a cationic monomer. Those having a structural unit can be used.
  • the cationic monomer constituting the segment (C) of the present invention is a polymerizable monomer and needs to have a polymerizable group in its structure, but the type thereof is not particularly limited.
  • a vinyl group, allyl It may be a group, a styryl group, a (meth) acryloyl group or the like.
  • it can be added to the segment (A) via this polymerizable group.
  • the cationic monomer constituting the segment (C) is not particularly limited, and examples thereof include monomers having a cationic peptide such as polylysine, polyarginine, polyornithine, polyhistidine, and ethyleneimine. Further, the cationic monomer constituting the segment (C) may be of the same type as that of the cationic monomer constituting the segment (A), or may be of a different type. The positive charge of the segment (A) may be larger than that of the segment (A).
  • a method for producing a monomer having a cationic peptide a conventionally known method can be used.
  • a method for producing a monomer having polylysine can be a lysine derivative of ⁇ -amino acid N-carboxylic acid anhydride (NCA) ( ( ⁇ -carbobenzoxy L-lysine NCA) can be produced by reacting phosgene with a functional group other than an ⁇ -amino group and a carboxylic acid.
  • NCA ⁇ -amino acid N-carboxylic acid anhydride
  • a conventionally known method can be used as a method for producing a copolymer having a segment (A) and a segment (C).
  • the segment (A) is produced, the cationic component constituting the segment (C) is used.
  • a monomer it can be produced by a living radical polymerization method such as addition fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization or atom transfer radical polymerization (ATRP).
  • RAFT addition fragmentation chain transfer
  • ATRP atom transfer radical polymerization
  • the copolymer constituting the polymeric carrier for intracellular delivery of the present invention can be configured to have micelle forming ability.
  • the segment (A) is preferably made hydrophilic in order to improve delivery ability to cells.
  • the segment (A) is composed only of a cationic monomer and a monomer having a ligand capable of binding to the cell surface, when the segment (A) becomes hydrophobic, a hydrophilic monomer other than these is further added.
  • the segment (A) can be made hydrophilic.
  • hydrophilic monomer examples include (meth) acrylic acid, aminostyrene, hydroxystyrene, vinyl acetate, (meth) acrylamide, hydroxyalkyl (meth) acrylate such as 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, ( Alkyl) aminoalkyl (meth) acrylate, alkylene glycol mono (meth) acrylate, polyalkylene glycol mono (meth) acrylate, polyalkylene oxide-modified (meth) acrylate, (meth) acrylamides such as N, N-dimethylacrylamide, N -N-vinyl lactams such as vinyl-2-pyrrolidone; N-vinyl amides such as N-vinylformamide; polyethylene glycol monoalkyl ethers such as polyethylene glycol monomethyl ether; These may be used alone or in combination of two or more.
  • the segment (A) is hydrophilic
  • the segment (B) or the segment (C) may be hydrophobic so that the copolymer of the present invention has a micelle-forming ability.
  • a hydrophobic monomer may be further polymerized to the copolymer of the present invention.
  • the target substance can be delivered into the cell as a polymeric micelle carrier.
  • the mass average molecular weight (measured by GPC using polystyrene as a standard substance) of the copolymer of the present invention is preferably 2000 to 100,000, more preferably 2000 to 30000. By setting it as the said range, it is excellent in the delivery capability to the cell of a target substance.
  • the method for delivering the polymeric carrier for intracellular delivery of the present invention to cells can be performed by a conventionally known method.
  • a conventionally known method For example, when delivered into cells of a human body, it can be delivered by intravenous injection.
  • it In the case of delivery to an isolated cell, it can be delivered by mixing with a cell culture medium.
  • the reaction solution was concentrated, diluted with CHCl 3 , washed with aqueous NaHCO 3 solution and brine (brine), and then dehydrated with dryMgSO 4 (anhydrous magnesium sulfate). Thereafter, concentration and vacuum drying were performed, and column purification (developing solvent: hexane) was performed to obtain RAFT polymerization agent CDB (cumyldithiobenzoate) represented by the formula (3) (4.0 g, yield 45.). 5%). It was confirmed by structural analysis by 1 H-NMR that the obtained compound was CDB represented by the formula (3).
  • the reaction scheme is shown below.
  • Table 1 shows preparation ratios (molar ratios) of the compounds represented by the formulas (8) to (11).
  • the numerical values in the above-mentioned “AcLac-co-DMAE 12%”, “AcLac-co-DMAE 23%”, and AcLac-co-DMAE 52% are the total number of Lac units and DMAE units after synthesis. The ratio of the number of DMAE units to the number is shown.
  • Table 2 shows the detailed results of the theoretical number average molecular weight and the number of units of each monomer calculated for the compounds represented by formulas (8) to (11) from 1 H-NMR measurement.
  • the number of Lac units indicates the number of units of Glycomomer
  • the number of units of DMAE indicates the number of units of DMAEMA.
  • Table 3 shows the number of units of each monomer and the theoretical average molecular weight of the compound (13) and the compounds represented by formulas (17) to (19). “Number of Py units” in Table 3 indicates the number of units of pyridine monomer.
  • CTAB-Preparation of gold nanorods In addition to 0.1M of CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) solution 1mM of chloroauric acid aqueous solution by 2.5 ml, and further stirred for 5 minutes by adding 600 ⁇ l of NaBH 4 aqueous solution of 20 mM, were prepared gold seeds.
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • sample preparation Add 9 mL of aqua regia to the cell suspension and heat at 90 ° C. overnight. Thereafter, the solution was heated until it evaporated to about 1 mL, and 8 mL of Milli-Q water and 1 mL of 500 ng / mL yttrium solution were added. A sample was passed through a filter to remove insoluble matter.
  • PL means “Py-b-Lac”
  • PLD-12 means “Py-b- (Lac-co-DMAE 12%)
  • PLD-23 means “Py-b- (Lac-co-DMAE 23%)” is indicated
  • PLD-52 is “Py-b- (Lac-co-DMAE 52%)”.
  • Py-b- (Lac-co-DMAE) modified gold nanorods showed a large amount of cellular uptake of gold nanorods. This is because Py-b- (Lac-co-DMAE) -modified gold nanorods were first concentrated on the cell surface by the positive charge of DMAE, and further recognized by the lactose to the asialoglycoprotein receptor on the cell surface. This is presumably because of the accumulation effect.
  • HepG2 cells were seeded in 6 cm dishes at 1.8 ⁇ 10 6 (50% confluent) cells / well and cultured for 24 hours. Thereafter, the gold nanorods protected by Py-b-Lac and Py-b- (Lac-co-DMAE 12%) were respectively added so that the final concentration of gold was 10 ⁇ g / mL, and lactose was finally added. The solution was added to a concentration of 50 mM and incubated for 48 hours.
  • sample preparation Add 9 mL of aqua regia to the cell suspension and heat at 90 ° C. overnight. Thereafter, the solution was heated until it evaporated to about 1 mL, and 8 mL of Milli-Q water and 1 mL of 500 ng / mL yttrium solution were added. Each sample was passed through a filter to remove insolubles.
  • Laser irradiation 48 hours after the addition of the particles, the medium was removed and washed with PBS. PBS was removed, 100 ⁇ L of medium was added, and laser irradiation was performed.
  • the laser conditions were a wavelength of 800 nm, an irradiation time of 10 minutes / well, an intensity of 2.7 W / cm 2 , and a beam diameter of 0.6 cm.
  • MTT assay was performed 24 hours after laser irradiation. First, the medium was removed, 100 ⁇ L of a medium having an MTT reagent concentration of 0.5 mg / mL was added, and incubated at 37 ° C. for 4 hours. Thereafter, the medium was removed, 100 ⁇ L of IPA / HCl was added and left to stand overnight, and the absorbance was measured with a plate reader. The results of the MTT assay are shown in FIG.
  • Cell recovery After 4 hours, the medium was collected and washed twice with PBS. Thereafter, the cells are detached with a cell scraper, collected with PBS, and the supernatant is removed by centrifugation. Then, Lysis Buffer (20 mM Tris-HCl, 0.05% Triton-X 100, 2 mM EDTA) is added, and 1 mL of the cell suspension is added. Got.
  • sample preparation Add 9 mL of aqua regia to the cell suspension and heat at 90 ° C. overnight. Thereafter, the solution was heated until it evaporated to about 1 mL, and 8 mL of Milli-Q water and 1 mL of 500 ng / mL yttrium solution were added. A sample was passed through a filter to remove insoluble matter.
  • FIG. 7 The result of measuring the zeta potential of colloidal gold is shown in FIG.
  • (a) shows Py-b-Lac modified gold colloid
  • (b) shows Py-b- (Lac-co-DMAE 23%) modified gold colloid.
  • Py-b- (Lac-co-DMAE 23%) modified gold colloid showed a positive value at the pH (pH 7.4) of the cell culture medium.
  • sample preparation Add 9 mL of aqua regia to the cell suspension and heat at 90 ° C. overnight. Thereafter, the solution was heated until it evaporated to about 1 mL, and 8 mL of Milli-Q water and 1 mL of 500 ng / mL yttrium solution were added. A sample was passed through a filter to remove insoluble matter.
  • Laser irradiation 48 hours after the addition of the particles, the medium was removed and washed with PBS. PBS was removed, 100 ⁇ L of medium was added, and laser irradiation was performed.
  • the laser conditions were as follows: wavelength: 800 nm, irradiation time: 10 minutes / well, intensity: 2.7 W / cm 2 , and beam diameter: 0.6 cm.
  • MTT assay was performed 6 hours after laser irradiation. First, the medium was removed, 100 ⁇ L of a medium having an MTT reagent concentration of 0.5 mg / mL was added, and incubated at 37 ° C. for 4 hours. Thereafter, the medium was removed, 100 ⁇ L of IPA / HCl was added and left to stand overnight, and the absorbance was measured with a plate reader. The results of the MTT assay are shown in FIG.
  • the prepared 0.5mg / mLRCA 120 solution 100 ⁇ L diluted with 10mMpH4.0 acetate buffer 900 [mu] L was prepared 50 [mu] g / mL RCA 120 solution 1 mL. Furthermore, the prepared 50 [mu] g / mL RCA 120 solution 200 ⁇ L diluted with 10mMpH4.0 acetate buffer 800 [mu] L, was prepared 10 ⁇ g / mLRCA 120 solution 1 mL. 200 ⁇ L of the prepared 10 ⁇ g / mL RCA 120 solution was added to a 7 mm plastic vial and placed in Biacore 3000 (manufactured by GE Healthcare).
  • NHS solution and EDC solution 11.5 mg of N-hydroxysuccinimide (NHS) was dissolved in 1 mL of ultrapure water (Milli-Q) to prepare a 100 mM NHS solution. 19.2 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) was dissolved in 1 mL of ultrapure water (Milli-Q) to prepare a 100 mM EDC solution.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • CM5 chip inserted into Biacore 3000 and vacuum degassed 10 mM pH 7.8 phosphate buffer (mixed with 10 mM disodium hydrogen phosphate aqueous solution and 10 mM sodium dihydrogen phosphate aqueous solution to adjust to pH 7.8) 120 mL was installed as a running buffer. After inserting CM5 chip, prime washing (preliminary washing) was performed twice with a running buffer.
  • a lectin (RCA 120 ) modified surface was prepared by the amine coupling method under the following conditions.
  • the immobilization operation was carried out as follows for those that did not immobilize the lectin (those that used only the blocking agent).
  • NHS 100 mM
  • EDC 100 mM
  • aqueous solution Flow rate 5 ⁇ L / min, Immobilization time 7 min 1M ethanolamine pH 8.5 [blocking agent] Flow rate 5 ⁇ L / min, immobilization time 7 min
  • the numbers in the above “Lac-co-DMAE 5%”, “Lac-co-DMAE 10%”, “Lac-co-DMAE 20%”, and “Lac-co-DMAE 50%” are the number of Lac units.
  • the ratio of the number of DMAE units to the total number of units with the number of DMAE units is shown.
  • each of Lac-co-DMAE 5%, Lac-co-DMAE 10%, Lac-co-DMAE 20%, Lac-co-DMAE 50% is used with a pH 7.4 phosphate buffer solution, and 20 nM 30 nM, 40 nM, 60 nM, and 80 nM Lac-co-DMAE solutions were prepared.
  • Lac-glycopolymer Lac-co-DMAE 5%, Lac-co-DMAE 10%, Lac-co-DMAE 20%, Lac-co-DMAE 50% prepared as described above, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 60 nM, and 80 nM, respectively.
  • the amount of adsorption on the RCA 120 modified surface was measured under the following conditions. Flow rate: 20 ⁇ L / min Temperature: 25 ° C Running buffer: 10 mM PBS (150 mM NaCl, pH 7.4)
  • the binding / dissociation time was 180 seconds, and the diluent was the same as the running buffer.
  • Lac-glycopolymer 10 mM pH 2.0 glycine-HCl buffer 60 seconds
  • Lac-co-DMAE 5% 10 mM pH 2.0 glycine-HCl buffer 60 seconds
  • Lac-co-DMAE 10% 10 mM pH 2.0 glycine-HCl buffer 60 seconds
  • Lac-co-DMAE20 % 10 mM pH 2.0 glycine-HCl buffer 60 seconds ⁇ 2
  • reaction rate constant 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 + 1 langmuir binding, global fitting.
  • a 10 ⁇ g / mL RCA 120 solution (hereinafter referred to as “Low density RCA”) was used for the immobilization of the RCA 120 described above, but instead of Low density RCA, a 50 ⁇ g / mL RCA 120 solution (hereinafter referred to as “Middle”).
  • High density RCA 0.5 mg / mL RCA 120 solution
  • Lac-glycopolymer Lac-co-DMAE 5%
  • Lac-co-DMAE 10% Lac-co-DMAE 20%
  • Lac-co-DMAE 50% the amount of adsorption on the RCA 120- modified surface was measured, and the reaction rate constant, dissociation rate constant, and dissociation constant were calculated.
  • FIG. 10 shows K D / M calculated by a method (global fitting method) by measuring and calculating an adsorption rate constant, a dissociation rate constant, and a dissociation constant (the reciprocal is a binding constant).
  • the results shown in FIG. 10 indicate that the intracellular carrier for intracellular delivery of the present invention has an affinity for lectin by having a cationic moiety.
  • a galactose solution as an inhibitor was prepared. First, 36.0 mg of galactose was dissolved in 5 mL of 10 mM pH 7.4 phosphate buffer to prepare a 40 mM galactose solution. The 40 mM galactose solution was diluted with 10 mM pH 7.4 phosphate buffer to prepare 20 mM, 4 mM, 2 mM, 0.4 mM, 40 ⁇ M, 4 ⁇ M, and 400 nM galactose solutions.
  • Lac-glycopolymer Lac-co-DMAE 5%, Lac-co-DMAE 10%, Lac-co-DMAE 20%, Lac-co-DMAE 50% solution and the galactose solution (400 nM, 4 ⁇ M, 40 ⁇ M, 0. 4mM, 2mM, 4mM, 20mM, 40mM) and 1,10,100,1k, 5k, 10k, 50k, 100k, 500k, 1Meq with respect to Lac-co-DMAE, which is the analyte.
  • 1 mL of a sample used for the inhibition test was prepared. The prepared sample was put into a 7 mm plastic sample and placed in a biacore 3000.
  • RCA 120 was immobilized under the same conditions as in the dissociation constant calculation test described above, and Middle density RCA was used as the RCA 120 solution.
  • the running buffer was 10 mM PBS (150 mM NaCl, pH 7.4), and the diluted solution was the same as the running buffer.
  • the regeneration conditions were the same as in the dissociation constant calculation test described above.
  • FIG. 11 the graph which showed the relationship between the quantity with respect to each polymer support
  • Table 8 shows the amount and concentration (IC50) of galactose at which the adsorption of each polymer carrier was inhibited by 50% by galactose.
  • FIG. 12 is an SPR sensorgram of the inhibition experiment in NaCl-1M in FIG. 13 described later.
  • the graph of FIG. 13 shows the relationship between the amount of galactose with respect to Lac-co-DMAE 50% and the amount of adsorption with respect to the RCA 120- modified surface in each case of 150 mM NaCl and 1 M NaCl.
  • the graph of FIG. 14 shows the relationship between the time and the amount of adsorption of the Lac-glycopolymer on the RCA 120- modified surface in each case of 150 mM NaCl and 1 M NaCl.
  • the graph of FIG. 15 shows the relationship between the time and the amount of adsorption on the RCA 120- modified surface of Lac-co-DMAE 50% for each case of 150 mM NaCl and 1 M NaCl.
  • Lac-glycopolymer without a cation segment has little effect on the degree of adsorption to the RCA 120- modified surface, while having a high salt concentration, while Lac-co having a large cationic portion.
  • -It was confirmed that 50% DMAE adsorbed on the RCA 120- modified surface was extremely high, but the adsorbed amount on the RCA 120- modified surface was lowered by increasing the salt concentration. From this fact, the binding of this sugar chain polymer to the receptor is concentrated on the negatively charged surface due to electrostatic attraction by having a cation segment, and as a result, the specific binding is enhanced.
  • the specific binding is enhanced.
  • Py-b- (Lac-co-DMAE 50%) is Py-b- (Lac-co-DMAE 10%), Py-b— under the same conditions except that the number of units of each monomer is changed. (Lac-co-DMAE 20%) was synthesized.
  • the solution was centrifuged (4000 rpm, 10 min), and the supernatant was removed to remove unadsorbed polymer. At this time, centrifugation and supernatant removal were repeated until the fluorescence intensity of the supernatant disappeared.
  • the polymer-coated silica was precipitated by centrifugation (4000 rpm, 10 min), and after removing the supernatant, it was redispersed in 6 mL of PBS solution to prepare a polymer-coated silica solution having a silica concentration of 5 mg / mL.
  • the prepared polymer solution and silica solution were mixed 15 mL each and shaken for 1 day to prepare polymer-coated fluorescent-labeled silica particles.
  • the concentration at the time of shaking was 0.5 mg / mL for the polymer and 1 mg / mL for the silica.
  • the solution was centrifuged (4000 rpm, 10 min), and the supernatant was removed to remove unadsorbed polymer. At this time, centrifugation and supernatant removal were repeated until the fluorescence intensity of the supernatant disappeared.
  • the polymer-coated silica was precipitated by centrifugation (4000 rpm, 10 min), the supernatant was removed, and then redispersed in 3 mL of PBS solution to prepare a polymer-coated silica solution having a silica concentration of 10 mg / mL.
  • HepG2 cells were seeded on a 24 well plate at 2 ⁇ 10 5 (50% confluent) cells / well and cultured for 24 hours.
  • Lac glycopolymer solution 45.9 mg of Lac glycopolymer was dissolved in 100 ⁇ L of PBS to prepare a 1000 mM (Lac concentration) Lac glycopolymer solution (mother liquor). This Lac glycopolymer had Mw: 8718.83 and the number of linkages: 19.
  • Lac glycopolymer solution Using a 1000 mM Lac glycopolymer solution (mother solution), 10 ⁇ M and 100 ⁇ M Lac glycopolymer solutions were prepared.
  • sample solutions of Test Examples 1 to 5 were prepared as shown in Table 9 below.
  • the silica concentration of the sample solution was 500 ⁇ g / mL (containing 10% PBS).
  • the total amount of each sample solution was 600 ⁇ l.
  • FIG. 17 The results of FACS measurement for each sample are shown in FIG. 17, (a) shows the measurement results for the sample solution (control) of Test Example 5, (b) shows the measurement results for the sample solution of Test Example 1, and (c) shows the test example. The measurement result about the sample solution of Test Example 3 is shown, (d) shows the measurement result about the sample solution of Test Example 3, and (e) shows the measurement result about the sample solution of Test Example 4.

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Abstract

　細胞内への送達能に優れた高分子担体を提供する。　細胞内送達用高分子担体は、カチオン性モノマーと、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーとが、少なくともランダム共重合したセグメント（Ａ）を有する共重合体からなる。共重合体は、無機微粒子に吸着可能な基を有するセグメント（Ｂ）を更に有するか、セグメント（Ａ）の正電荷より大きい正電荷を有するセグメント（Ｃ）を更に有するか、又はミセル形成能を有するのが好ましい。

Description

細胞内送達用高分子担体
　本発明は、細胞内送達用高分子担体に関する。
　近年、高分子を担体として用いた、核酸、無機微粒子、薬剤等の細胞内への送達が注目されており、多数の高分子担体が開発されている。
　例えば、核酸を細胞内に送達するための高分子担体として、特許文献１には、所定のカチオン性ポリマーと核酸とを含む、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体からなる細胞内送達用高分子担体が開示されている。
特許第５２７７４４０号公報
　本発明は、細胞内への送達能に優れた高分子担体を提供することを目的とする。
　本発明者らは、カチオン性モノマーと、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーとが、ランダム共重合したセグメントを有する共重合体が、細胞内に取り込まれやすいことを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
　（１）カチオン性モノマーと、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーとが、少なくともランダム共重合したセグメント（Ａ）を有する共重合体からなる、細胞内送達用高分子担体。
　（２）前記共重合体は、無機微粒子に吸着可能な基を有するセグメント（Ｂ）を更に有する（１）記載の細胞内送達用高分子担体。
　（３）前記共重合体は、前記セグメント（Ａ）の正電荷より大きい正電荷を有するセグメント（Ｃ）を更に有する（１）記載の細胞内送達用高分子担体。
　（４）前記共重合体は、ミセル形成能を有する（１）記載の細胞内送達用高分子担体。
　本発明によれば、細胞内への送達能に優れた高分子担体を提供することができる。
本発明の一実施例に係る金ナノロッドのＵＶ－ｖｉｓスペクトルを示すグラフである。 本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体による、金ナノロッドの細胞内への送達量を示すグラフである。 本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体とラクトースとを用いることによる、金ナノロッドの細胞への取込み量を示すグラフである。 本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体を用いて金ナノロッドを細胞内に送達した後に、送達した細胞にレーザー照射を行った前後の細胞量を示すグラフである。 本発明の一実施例に係る金コロイドのＵＶ－ｖｉｓスペクトルを示すグラフである。 本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体による、金コロイドの細胞内への送達量を示すグラフである。 本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体により修飾された金コロイドにおける、ｐＨとゼータ電位との関係を示すグラフである。 本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体による、金コロイドの細胞内への送達量と、送達する細胞の培地のｐＨとの関係を示すグラフである。 本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体を用いて金ナノロッドを送達する細胞の培地のｐＨが５．５である場合における、細胞内への金ナノロッドの送達後に、細胞にレーザー照射を行った前後の細胞量を示すグラフである。 本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体が、レクチンに対する親和性を有することを示す図である。 ガラクトースによる、本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体のＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着性に対する競合阻害の程度を示すグラフである。 ガラクトースの量を変化させた場合の、時間と、本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体のＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量との関係を示すグラフである。 １５０ｍＭＮａＣｌ及び１ＭＮａＣｌの塩濃度とした場合における、ガラクトースのＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％に対する量と、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％のＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量との関係を示すグラフである。 １５０ｍＭＮａＣｌ及び１ＭＮａＣｌの塩濃度とした場合における、時間とＬａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒのＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量との関係を示すグラフである。 １５０ｍＭＮａＣｌ及び１ＭＮａＣｌの塩濃度とした場合における、時間とＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％のＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量との関係を示す 本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体のシリカに対する細胞取り込みを評価した、ＦＡＣＳ測定の結果を示す図である。（ａ）は、高分子被覆で被覆していないシリカ溶液（コントロール）についての測定結果を示し、（ｂ）は、Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃで被覆したシリカ溶液についての測定結果を示し、（ｃ）は、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１０％）で被覆したシリカ溶液についての測定結果を示し、（ｄ）はＰｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２０％）で被覆したシリカ溶液についての測定結果を示し、（ｅ）は、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％）で被覆したシリカ溶液についての測定結果を示す。 本発明の一実施例に係る細胞内送達用高分子担体の、Ｌａｃ　ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒによるシリカの細胞取り込みに対する阻害を評価した、ＦＡＣＳ測定の結果を示す図である。（ａ）は、試験例５のサンプル溶液（コントロール）についての測定結果を示し、（ｂ）は、試験例１のサンプル溶液についての測定結果を示し、（ｃ）は、試験例２のサンプル溶液についての測定結果を示し、（ｄ）は試験例３のサンプル溶液についての測定結果を示し、（ｅ）は、試験例４のサンプル溶液についての測定結果を示す。
　以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されるものでない。
　本発明の細胞内送達用高分子担体は、カチオン性モノマーと、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーとが、少なくともランダム共重合したセグメント（Ａ）を有する共重合体からなる。
　本発明の細胞内送達用高分子担体が、細胞内への送達能に優れる理由は以下のように推定される。セグメント（Ａ）がカチオン性モノマーのランダム共重合体であるため、セグメント（Ａ）のカチオン性モノマーが重合した部分は正の電荷を有する。細胞表面は、負の電荷を帯びているので、本発明の細胞内送達用高分子担体は、この正電荷によって細胞表面に集積する。更に、セグメント（Ａ）は、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーをランダム共重合したものであるため、セグメント（Ａ）はカチオン性モノマーが重合した部分の近傍に上記リガンドを有するモノマーが重合した部分を有することになる。これにより、セグメント（Ａ）は、その正電荷により細胞表面に集積し、リガンドを介して細胞表面に対して結合できるので、細胞内に取り込まれやすくなる。
　本発明のカチオン性モノマーは、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、その種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、（メタ）クリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマー等と重合することができる。
　カチオン性モノマー特に限定されないが、例えば、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記一般式（１）中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり、水素原子又はメチル基であることが好ましい。Ｒ２はＯ、ＮＨ、又はＮＲ３であり、Ｒ３は１～４の炭素数を有するアルキル基であり、Ｘは、下記一般式（ＩＩ）で表される基を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　上記一般式（ＩＩ）中、Ｘ０及びＸ１は炭素数２～６のアルキレン基又はヒドロキシアルキレン基であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８は互いに独立に炭素数１～６のアルキル基であり、Ｚ－は対イオンである。対イオンは、特に限定されないが、例えば、ハロゲン化物イオン、酢酸イオン等が挙げられる。
　カチオン性モノマーは、具体的には、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、ジエチルアミノメチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノブチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノネオペンチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド、ジエチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノネオペンチル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。これらは単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらのうち、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレートが好ましい。
　本発明の細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーは、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、その種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、（メタ）クリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、カチオン性モノマー等と重合することができる。
　本発明の共重合体では、モノマー（Ｂ）が下記一般式（ＩＩＩ）で表されるものであることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記一般式（ＩＩＩ）中、Ｒ９は、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり、水素原子又はメチル基であることが好ましい。Ｒ１０は、Ｏ又はＮＨである。また、Ｘは、スペーサーであり、Ｚ２は、リガンドである。
　上記リガンドを有するモノマーでは、スペーサーは、上述のリガンドを導入することができれば特に限定されないが、例えば、繰り返し単位数１～２００のアルキレンオキシ基、アルキレン基等が挙げられ、好ましくは繰り返し単位数１～５０のエチレンオキシ基又はアルキレン基である。アルキレン基は、直鎖状でも分枝状でもよい。アルキレン基の炭素数は特に限定されないが、好ましくは１～８である。繰り返し単位数１～５０のエチレンオキシ基や炭素数１～８のアルキレン基であれば、本発明の高分子担体の細胞への送達能が良好となるので好ましい。なお、本発明のセグメント（Ａ）では、このスペーサーを介して上述のリガンドが結合している。
　細胞表面に対する結合能を有するリガンドとしては、例えば、糖鎖、タンパク質、抗原等の細胞表面の特定の対象物質に対して特異的相互作用を示す分子認識素子が挙げられ、より具体的には、糖鎖（ラクトース、ガラクトース等）、抗体等が挙げられる。
　本発明のセグメント（Ａ）には、カチオン性モノマーと上記リガンドを有するモノマー以外のその他のモノマーが含まれてもよい。その他のモノマーとしては、例えば、メトキシメチル（メタ）アクリルアミド、エトキシメチル（メタ）アクリルアミド、プロポキシメチル（メタ）アクリルアミド、ブトキシメトキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、３－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、フマル酸、マレイン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、無水イタコン酸、シトラコン酸、無水シトラコン酸、クロトン酸、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、３－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２－フェノキシ－２－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２－（メタ）アクリロイルオキシ－２－ヒドロキシプロピルフタレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらのモノマーを、単独で有していても、２種以上を組み合わせて有していてもよい。
　セグメント（Ａ）における、カチオン性モノマーのユニット数は、特に限定されないが、１～１００が好ましく、２～８０がより好ましく、５～６０が更に好ましく、１５～４０が最も好ましい。
　セグメント（Ａ）における、カチオン性モノマーに由来する構成単位の占める割合は、特に限定されないが、好ましくは５ｍｏｌ％以上であり、より好ましくは１０ｍｏｌ％以上であり、更に好ましくは２０ｍｏｌ％以上であり、最も好ましくは５０ｍｏｌ％以上である。カチオン性モノマーに由来する構成単位の占める割合が高いほど、セグメント（Ａ）の正の電荷が高くなって細胞表面に集積しやすくなり、細胞内への送達能に優れる。
　セグメント（Ａ）における、上記リガンドを有するモノマーのユニット数は、特に限定されないが、１～１００が好ましく、５～８０がより好ましく、１５～５０が更に好ましい。
　セグメント（Ａ）における、上記リガンドを有するモノマーに由来する構成単位の占める割合は、特に限定されないが、好ましくは１０ｍｏｌ％以上であり、より好ましくは２０ｍｏｌ％以上であり、更に好ましくは４０ｍｏｌ％以上であり、最も好ましくは５０ｍｏｌ％以上である。上記リガンドを有するモノマーに由来する構成単位の占める割合が高いほど、リガンドの分子認識作用が向上し、細胞内への送達能に優れる。
　セグメント（Ａ）のランダム共重合方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができるが、付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）等のリビングラジカル重合法が好ましい。リビングラジカル重合法によれば、合成する両親媒性高分子の分子量や分子量分布を制御することができる。
　ＲＡＦＴに用いられる連鎖移動剤は、特に限定されず、例えば、ブチルベンジルトリチオカルボナート、クミルジチオベンゾエート（ＣＤＢ）、４－シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、酢酸ジチオベンゾエート、ブタン酸ジチオベンゾエート、４－トルイル酸ジチオベンゾエート等が挙げられる。
　重合開始剤は、特に限定されず、例えば、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’－アゾビス（２－メチルブチロニトリル）、ジイソプロピルペルオキシカーボネート、ｔ－ブチルペルオキシ－２－エチルヘキサノエート、ｔ－ブチルペルオキシピバレート、ｔ－ブチルペルオキシジイソブチレート、過酸化ベンゾイル、ラウロイルパーオキサイド、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム等を用いることができる。重合開始剤の好適な使用量は、モノマーに対して、０．００１～１質量％、連鎖移動剤に対して、１～３３質量％である。
　ＡＴＲＰに用いられるハロゲン化アルキル開始剤は、特に限定されず、例えば、２－ブロモイソブチリルブロミド、２－クロロイソブチリルクロリド、ブロモアセチルブロミド、ブロモアセチクロリド、ベンジルブロミド等が挙げられる。
　触媒としては、例えば、１価の銅、２価のルテニウム等の遷移金属錯体を用いることができる。
　なお、重合反応に用いる溶媒は、特に限定されず、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ－ブタノール、ベンゼン、トルエン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム、１，４－ジオキサン、ジメチルスルホキシド、これらの混合液等が挙げられる。
　本発明の細胞内送達用高分子担体を構成する共重合体は、細胞内に送達する対象となる物質に応じて、セグメント（Ａ）以外のセグメントを有してもよい。
　例えば、本発明の共重合体は、無機微粒子に吸着可能な基を有するセグメント（Ｂ）を更に有することができる。
　無機微粒子に吸着可能な基を有するセグメント（Ｂ）は、例えば、無機微粒子に吸着可能な基を有するモノマーによって構成することができる。
　本発明の無機微粒子に吸着可能なモノマーは、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、その種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、（メタ）クリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、例えば、セグメント（Ａ）に付加することができる。
　無機微粒子に吸着可能なモノマーは、特に限定されないが、例えば、金属を細胞内に送達させる場合は、無機微粒子に吸着して分散可能な基を有するモノマーが挙げられる。該基としては、チオール基や、ピリジル基が挙げられる。ピリジル基を有するモノマーとしては、特に限定されないが、以下の一般式（ＩＶ）で表される化合物であるものが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　Ｒ１１は、水素原子又は炭素数１～１０のアルキル基であり、水素原子又はメチル基であることが好ましい。Ｒ１２は、炭素数１～７のアルキレン基であり、炭素数２～７のアルキレン基であることが好ましく、炭素数３～５のアルキレン基であることが更に好ましい。
　無機微粒子は、特に限定されないが、例えば、シリカ、金属酸化物（アルミナ等）、金属（金、銀、鉄、銅等）等の微粒子が挙げられる。細胞に金属ナノ粒子を送達する場合、金属ナノ粒子として、金属ナノロッド（棒状）を用いると、送達する細胞を光温熱により細胞死させることができる。また、無機微粒子としてメソポーラスシリカを用いることで、薬剤を細胞内に送達させることもできる。
　セグメント（Ｂ）における、無機微粒子に吸着可能な基を有するモノマーのユニット数は、特に限定されないが、１～１００が好ましく、１０～８０が好ましく、２０～５０が更に好ましい。
　セグメント（Ｂ）における、無機微粒子に吸着可能な基を有するモノマーに由来する構成単位の占める割合は、特に限定されないが、好ましくは５０ｍｏｌ％以上であり、より好ましくは７０ｍｏｌ％以上であり、更に好ましくは８０ｍｏｌ％以上であり、最も好ましくは９０ｍｏｌ％以上である。セグメント（Ｂ）における、無機微粒子に吸着可能な基を有するモノマーに由来する構成単位の占める割合が高いほど、細胞内に送達可能な無機微粒子が多くなり、より効率的に細胞内への送達が可能となる。
　本発明のセグメント（Ｂ）には、無機微粒子に吸着可能な基を有するモノマー以外の上述のその他のモノマーが含まれてもよい。その他のモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド、メトキシメチル（メタ）アクリルアミド、エトキシメチル（メタ）アクリルアミド、プロポキシメチル（メタ）アクリルアミド、ブトキシメトキシメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ヒドロキシメチル（メタ）アクリルアミド、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、３－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、フマル酸、マレイン酸、無水マレイン酸、イタコン酸、無水イタコン酸、シトラコン酸、無水シトラコン酸、クロトン酸、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、３－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２－フェノキシ－２－ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２－（メタ）アクリロイルオキシ－２－ヒドロキシプロピルフタレート、グリセリンモノ（メタ）アクリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノ（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらのモノマーを、単独で有していても、２種以上を組み合わせて有していてもよい。
　セグメント（Ａ）とセグメント（Ｂ）とを有する共重合体の製造方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、セグメント（Ａ）を製造した後に、無機微粒子に吸着可能な基を有するモノマーを用いて、付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）等のリビングラジカル重合法により製造することができる。
　本発明の細胞内送達用高分子担体を構成する共重合体は、セグメント（Ａ）の正電荷より大きい正電荷を有するセグメント（Ｃ）を更に有することができる。これにより、細胞内に核酸を送達したい場合、本発明の共重合体のセグメント（Ｃ）が、核酸とポリプレックス（複合体）を形成するので、核酸を細胞内に送達することができる。
　セグメント（Ａ）の正電荷より大きい正電荷を有するセグメント（Ｃ）は、特に限定されず、セグメント（Ａ）の正電荷を勘案して適宜設定することができ、例えば、カチオン性モノマーに由来する構成単位を有するものを用いることができる。
　本発明のセグメント（Ｃ）を構成するカチオン性モノマーは、重合可能なモノマーであり、その構造中に重合性基を有する必要があるが、その種類は特に限定されず、例えば、ビニル基、アリル基、スチリル基、（メタ）クリロイル基等であってもよい。この重合性基を介して、例えば、セグメント（Ａ）に付加することができる。
　セグメント（Ｃ）を構成するカチオン性モノマーは、特に限定されないが、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリヒスチジン等のカチオン性のペプチドを有するモノマーや、エチレンイミン等が挙げられる。また、セグメント（Ｃ）を構成するカチオン性モノマーは、セグメント（Ａ）を構成するカチオン性モノマーと同種類のものであってもよく、異なる種類のものであってもよく、セグメント（Ｃ）が、セグメント（Ａ）の正電荷より大きい正電荷を有するように構成されればよい。
　カチオン性のペプチドを有するモノマーの製造方法は、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、ポリリジンを有するモノマーの製造方法は、α－アミノ酸Ｎ－カルボン酸無水物（ＮＣＡ）のリジン誘導体（ε－カルボベンゾキシＬ－リジンＮＣＡ）について、α－アミノ基とカルボン酸以外の官能基を保護した後、ホスゲンを反応させることにより製造することができる。
　セグメント（Ａ）とセグメント（Ｃ）とを有する共重合体の製造方法は従来公知の方法を用いることができるが、例えば、セグメント（Ａ）を製造した後に、セグメント（Ｃ）を構成するカチオン性モノマーを用いて、付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）等のリビングラジカル重合法により製造することができる。
　本発明の細胞内送達用高分子担体を構成する共重合体を、ミセル形成能を有するように構成することができる。ミセル形成能を有するように構成する場合、細胞への送達能を向上させるために、上記セグメント（Ａ）を親水性とすることが好ましい。セグメント（Ａ）が、カチオン性モノマーと、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーのみによって構成される場合において、セグメント（Ａ）が疎水性となるときは、これら以外の親水性モノマーを更に共重合させることによって、セグメント（Ａ）を親水性にすることができる。該親水性モノマーとしては、具体的には、（メタ）アクリル酸、アミノスチレン、ヒドロキシスチレン、酢酸ビニル、（メタ）アクリルアミド、２－ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート等のヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、（アルキル）アミノアルキル（メタ）アクリレート、アルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリアルキレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ポリアルキレンオキシド変性（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド類、Ｎ－ビニル－２－ピロリドン等のＮ－ビニルラクタム類、Ｎ－ビニルホルムアミド等のＮ－ビニルアミド類、ポリエチレングリコールモノメチルエーテル等のポリエチレングリコールモノアルキルエーテル等が挙げられる。これらは単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　上記セグメント（Ａ）が親水性である場合、本発明の共重合体がミセル形成能を有するようにするためには、セグメント（Ｂ）やセグメント（Ｃ）が疎水性であってもよい。また、セグメント（Ｂ）やセグメント（Ｃ）が親水性であった場合、本発明の共重合体に更に疎水性モノマーを重合してもよい。これにより、高分子ミセル担体として、対象となる物質を細胞内に送達することができる。
　本発明の共重合体の質量平均分子量（ポリスチレンを標準物質としたＧＰＣによる測定）は、２０００～１０００００であることが好ましく、２０００～３００００であることがより好ましい。上記範囲とすることで、対象物質の細胞への送達能に優れる。
　本発明の細胞内送達用高分子担体の、細胞への送達する方法は、従来の公知の方法によりすることができ、例えば、人体の細胞内に送達する場合、静脈注射により送達することができ、単離された細胞に送達する場合、細胞培地に混合することで、送達することができる。
　＜細胞内送達用高分子担体の合成＞
　［ピリジンモノマーの合成］
　常温、Ａｒ雰囲気下で、ＤＣＣ（１，３－ジシクロヘキシルカルボジイミド）８．２７ｇ（４０ｍｍｏｌ）をＣＨＣｌ２（ジクロロメタン）２００ｍＬで溶解した。その後、メタクリル酸を３．４ｍＬ（４０ｍｍｏｌ）加え、１０分撹拌した。更に、４－ピリジンプロパノールを５ｇ（３６．４ｍｍｏｌ）加えた。最後に、ＤＭＡＰ（４－ジメチルアミノピリジン）４４５．３ｍｇ（３．６４ｍｍｏｌ）を加え、１日撹拌した。撹拌後、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）で反応が進んでいることを確認し、ろ過、濃縮した。酢酸エチルに溶解させ、ＮａＨＣＯ３、Ｂｒｉｎｅ（食塩水）で洗浄後、有機層を回収した。回収した有機層をＭｇＳＯ４で脱水し、濃縮を行なった。濃縮によって得られたクルードをカラム（展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝４／１）によって精製分離し、濃縮、真空乾燥を行った（３．９ｇ，収率５２．１％）。得られた化合物が式（１）で表されるピリジンモノマーであることを１Ｈ－ＮＭＲによる構造解析により確認した。反応スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　［ＲＡＦＴ重合剤ＣＤＢ（クミルジチオベンゾエート）の合成］
　マグネシウム１．１３ｇ（４６．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ）（テトラヒドロフラン（超脱水））６０ｍＬに溶解し、Ａｒ雰囲気下、６０℃で還流しながらブロモベンゼン５．０ｍＬ（４６．５ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、マグネシウムが溶解するまで撹拌した。氷浴下で二硫化炭素４．０ｍＬ（５１．１ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、２時間撹拌後、更に室温で３０分撹拌した。反応終了後、氷水７００ｍＬを反応溶液に加え、ｐＨが酸性になるまで１ＮＨＣｌを加えた。反応溶液をジエチルエーテルで３回抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水し、溶液を濃縮した後に真空乾燥を行い、式（２）で表される化合物を得た。式（２）で表される化合物５．２ｇ（３３．７ｍｍｏｌ）をＣＣｌ４１００ｍＬに溶解し、ＴｓＯＨ（トルエンスルホン酸）・Ｈ２Ｏ１３０ｍｇ（０．６２ｍｍｏｌ）を加え、Ａｒ雰囲気下、９０℃で還流しながらα－メチルスチレン６．４ｍＬ（５０．６ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、一晩撹拌した。反応溶液を濃縮し、ＣＨＣｌ３で希釈し、ＮａＨＣＯ３水溶液とｂｒｉｎｅ（食塩水）とで洗浄した後に、ｄｒｙＭｇＳＯ４（無水硫酸マグネシウム）で脱水した。その後、濃縮・真空乾燥を行い、カラム精製（展開溶媒：ヘキサン）を行い、式（３）で表されるＲＡＦＴ重合剤ＣＤＢ（クミルジチオベンゾエート）を得た（４．０ｇ，収率４５．５％）。得られた化合物が式（３）で表されるＣＤＢであることを１Ｈ－ＮＭＲによる構造解析により確認した。反応スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　［Ｐｙ－ｃｏ－ＰＥＧの合成］
　式（１）で表される化合物（ピリジンモノマー）６００ｍｇ（２．９ｍｍｏｌ）、式（４）で表される化合物（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＭＡ）１．８ｇ（０．８７ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（アゾイソブチロニトリル）０．７２ｍｇ（４．０μｍｏｌ）、式（３）で表される化合物（ＣＤＢ）５．２ｍｇ（２０μｍｏｌ）をＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）が２０．６ｍｌになるようにこれに溶かした。その後、凍結脱気を３回し、再びＡｒ置換して、７０℃オイルバスで３日間撹拌した。撹拌後、再沈殿（再沈殿溶媒：ジエチルエーテル／ＩＰＡ＝１８／２）、ろ過、濃縮の操作を二回行った。その後、ベンゼンによる凍結乾燥を行い、式（５）で表される化合物（Ｐｙ－ｃｏ－ＰＥＧ）を得た（１．０３７ｇ，収率４２．７％）。仕込み比（モル比）は、式（１）で表される化合物：式（４）で表される化合物：ＡＩＢＮ：式（３）で表される化合物＝１３３：４０：０．２：１とした。得られた化合物が式（５）で表される化合物であることを１Ｈ－ＮＭＲによる構造解析により確認した。反応スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　［Ｇｌｙｃｏｍｏｎｏｍｅｒの合成］
　ピリジン溶液１４１．７０ｍＬ（１．６１３ｍｏｌ）にＤ－ラクトースを２５．０５ｇ（０．０７３ｍｏｌ）、無水酢酸を１６４．６２ｍｌ（１．６１３ｍｏｌ）、ＤＭＡＰ０．０９２ｇ（０．７３００ｍｍｏｌ）を加え、９６時間撹拌した。白濁していた溶液が透明に変化したところで、ＴＬＣにより反応の終了を確認し、濃縮、真空引きをした。その後、少量のＣＨＣｌ３で溶解し、ジエチルエーテルを用いて再結晶二回行って精製し、式（６）で表される化合物を得た（３０．８１ｇ，収率６２．２０％）。得られた化合物が式（６）で表される化合物（オクタアセチルラクトース）であることを１Ｈ－ＮＭＲによる構造解析により確認した。
　Ａｒ雰囲気下において、式（６）で表される化合物（オクタアセチルラクトース）１５ｇ（２２．１ｍｍｏｌ）と、ＨＥＭＡ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）３．２ｇ（２６．５２ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２溶液１００ｍＬに溶解させ、氷冷で３０分、室温で１８時間撹拌した。ＴＬＣで反応の終了を確認し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。Ｈ２ＯとＮａＨＣＯ３、Ｂｒｉｎｅ（食塩水）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水、濃縮した。その後、少量のクロロホルムに溶解し、水に対して滴下して精製を行った。デカンテーションとＭｇＳＯ４により水を除き、ベンゼンによる凍結乾燥を行い、式（７）で表される化合物を得た（１３．８ｇ，収率８３．２％）。得られた化合物が式（７）で表される化合物（Ｇｌｙｃｏｍｏｎｏｍｅｒ）であることを１Ｈ－ＮＭＲによる構造解析により確認した。１反応スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　［ＡｃＬａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒの合成］
　式（７）で表される化合物を２ｇ（２．６７ｍｍｏｌ）、式（３）で表される化合物（ＣＤＢ）２１．７ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ４．３８ｍｇ（０．０２７ｍｏｌ）をＤＭＦ１２ｍＬに溶解させ、凍結脱気を３回行い、Ａｒ置換し、７０℃オイルバスで４８時間撹拌した。ジエチルエーテルを用いて再沈殿を二回行うことにより精製を行い、更にベンゼンによる凍結乾燥により式（８）で表さられる化合物（ＡｃＬａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）を得た（９５２ｍｇ，収率４７．６％）。得られた化合物が式（８）で表される化合物（ＡｃＬａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）であることを１Ｈ－ＮＭＲによる構造解析により確認した。反応スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　［ＡｃＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥの合成］
　式（７）で表される化合物を２ｇ（２．６７ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＥＭＡ（ジメチルアミノエチルメタクリレート）４２ｍｇ（０．２６７ｍｍｏｌ）、式（３）で表される化合物（ＣＤＢ）２１．６ｍｇ（０．０７９２ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ４．４２ｍｇ（０．０２７ｍｏｌ）をＤＭＦ１３．３５ｍＬに溶解させ、凍結脱気を３回行い、Ａｒ置換し、７０℃オイルバスで４８時間撹拌した。ジエチルエーテルを用いて再沈殿を二回行うことにより精製を行い、更にベンゼンによる凍結乾燥により式（９）で表される化合物を得た（１．１２７ｇ，収率５５．２％）。得られた化合物が式（９）で表される化合物（ＡｃＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１２％）であることを１Ｈ－ＮＭＲによる構造解析により確認した。また、式（９）で表される化合物と、仕込み比（モル比）を変えて、式（１０）で表される化合物（ＡｃＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２３％）、（１１）で表される化合物（ＡｃＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５２％）を合成した。反応スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　式（８）－（１１）で表される化合物のそれぞれの仕込み比（モル比）を表１に示す。上記「ＡｃＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１２％」、「ＡｃＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２３％」、ＡｃＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５２％」中のそれぞれの数値は、合成後の、Ｌａｃのユニット数とＤＭＡＥのユニット数との合計ユニット数に対する、ＤＭＡＥのユニット数の割合を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　なお、１Ｈ－ＮＭＲ測定より、式（８）－（１１）で表される化合物について算出した理論数平均分子量、各モノマーのユニット数の詳細な結果を以下の表２に示す。なお、表２中の「Ｌａｃのユニット数」とは、Ｇｌｙｃｏｍｏｎｏｍｅｒのユニット数を指し、ＤＭＡＥのユニット数とは、ＤＭＡＥＭＡのユニット数を指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　［Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃの合成］
　式（８）で表される化合物を１．３ｇ（０．０７９ｍｍｏｌ）、式（１）で表される化合物（ピリジンモノマー）を６４８．６ｍｇ（３．１６ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ４．２６ｍｇ（０．０２６ｍｏｌ）をＤＭＦ１４．３ｍＬに溶解させ、凍結脱気を３回行い、Ａｒ置換し、７０℃オイルバスで４８時間撹拌した。仕込み比は［ＡｃＬａｃ　ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ］：［ピリジンモノマー］：［ＡＩＢＮ］：＝１：４０：０．３３である。ジエチルエーテルを用いて再沈殿を二回行うことにより精製し、更にベンゼンによる凍結乾燥により式（１２）で表される化合物を得た（１．８４ｇ，収率９４．２％）。得られた化合物が式（１２）で表される化合物であることを１Ｈ－ＮＭＲによる構造解析により確認した。
　ナスフラスコに式（１２）で表される化合物を１．８ｇ（０．０７２ｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）５０ｍＬ、Ｎ２Ｈ４・Ｈ２Ｏ５ｍＬ（０．１ｍｏｌ）を加えて一晩撹拌した。その後、濃縮し、透析（分画分子量３５００）による精製を行なった。精製後、凍結乾燥により回収し、式（１３）で表される化合物を得た（１．１ｇ，収率８５．６％）。得られた化合物が式（１３）で表される化合物（Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃ）であることを１Ｈ－ＮＭＲによる構造解析により確認した。反応スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　［Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ）の合成］
　式（９）で表される化合物を１ｇ（０．０５６ｍｍｏｌ）、式（１）で表される化合物（ピリジンモノマー）を４６３ｍｇ（２．２６ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ３．００ｍｇ（０．０１８４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０．５ｍＬに溶解させ、凍結脱気を３回行い、Ａｒ置換し、７０℃オイルバスで４８時間撹拌した。仕込み比は［ＡｃＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ］：［ピリジンモノマー］：［ＡＩＢＮ］：＝１：４０：０．３３とした。ジエチルエーテルを用いて再沈殿を二回行うことにより精製し、更にベンゼンによる凍結乾燥により式（１４）で表される化合物を得た（１．３６８ｇ，収率９３．５％）。得られた化合物が式（１４）で表される化合物であることを１Ｈ－ＮＭＲによる構造解析により確認した。
　ナスフラスコに式（１４）で表される化合物を１．３６８ｇ（０．０７７ｍｏｌ）、ＤＭＳＯ２０ｍＬ、Ｎ２Ｈ４・Ｈ２Ｏ３．８ｍＬ（７７ｍｍｏｌ）を加えて一晩撹拌した。その後、濃縮し、透析（分画分子量３５００）による精製を行なった。精製後、凍結乾燥により回収し、式（１７）で表される化合物を得た（８７１ｇ，収率８９．７％）。得られた化合物が式（１７）で表される化合物（Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１２％））であることを１Ｈ－ＮＭＲによる構造解析により確認した。また、式（１７）で表される化合物の合成とは、各モノマーのユニット数を変更して、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２３％）（式（１８）で表される化合物）とＰｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５２％）（式（１９）で表される化合物）を合成した。反応スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　化合物（１３）及び式（１７）－（１９）で表される化合物についての各モノマーのユニット数と、理論数的平均分子量を表３に示す。表３中の「Ｐｙのユニット数」とは、ピリジンモノマーのユニット数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　＜ポリマー保護金ナノロッドの調製＞
　［ＣＴＡＢ－金ナノロッドの調製］
　０．１ＭのＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）溶液に１ｍＭの塩化金酸水溶液を２．５ｍｌずつ加えて、更に２０ｍＭのＮａＢＨ４水溶液を６００μｌ加えて５分撹拌し、金シードを調製した。
　［金ナノロッドの調製］
　０．１ＭのＣＴＡＢ溶液５０ｍｌに、１ｍＭ硝酸銀を５ｍｌ加えて３時間撹拌した。３時間後、０．５ｍＭの塩化金酸水溶液を５０ｍｌ加え、３０分撹拌した。その後、０．１Ｍのアスコルビン酸を２５０μｌ加え、更に上記金シードを２５０μｌ加え、１日撹拌してナノロッドを成長させた。
　［ポリマー保護金ナノロッドの調製］
　調製したＣＴＡＢ－金ナノロッドを遠心分離（２１０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）した。その後、上澄みを取り除き、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を加えて、もう一度遠心分離（１８０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）した。その後、上澄みを取り除いた。これにより、余分なＣＴＡＢを取り除いた。その後、０．５ｍｇ／ｍｌのポリマー水溶液（キトサン、Ｐｙ－ｃｏ－ＰＥＧ、Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃ及びＰｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１２－５２％）のそれぞれの水溶液）を加えて２日間振とうした。振とう後、３日間の透析（ＭＷＣＯ：３５００）によりＣＴＡＢを除き、遠心分離（２００００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で更に過剰のポリマーを除去した。調製後の金ナノロッドのＵＶ－ｖｉｓスペクトルを図１に示す。
　＜ポリマー修飾金ナノロッドの細胞取り込みの評価＞
　［細胞準備］
　ＨｅｐＧ２細胞を６ｃｍディッシュに１．８×１０６（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。その後、キトサン、Ｐｙ－ｃｏ－ＰＥＧ、Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃ、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１２－５２％）のそれぞれに保護された金ナノロッドを、それぞれ金の最終濃度が、１０μｇ／ｍＬとなるように加え４８時間インキュベートした。
　［細胞回収］
　４時間後、培地を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ＰＢＳで回収、遠心分離により上澄みを除去した後、Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ　１００，２ｍＭＥＤＴＡ）を加え、細胞懸濁液１ｍＬを得た。
　［サンプル調製］
　細胞懸濁液に王水を９ｍＬ加え、一晩９０℃で加熱。その後、溶液が約１ｍＬに蒸発するまで加熱し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水８ｍＬと５００ｎｇ／ｍＬのイットリウム溶液を１ｍＬ加えた。不溶物を除くためフィルターに通し、サンプルとした。
　［細胞内への送達量の定量（ＩＣＰ－ＡＥＳ測定）］
　金標準液とイットリウム標準液、王水を用いて検量線サンプルを調製した。王水は、濃硫酸（１３Ｍ）、濃塩酸（１２Ｍ）を１：３で混合して調製した。作成した検量線を用いて、測定サンプルのＡｕ濃度を測定した。測定結果から、各サンプル１０ｍＬにおける、全細胞に取り込まれた金の重量を算出した。その結果を表４、図２に示す。なお、図２中、ＰＬとは、「Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃ」を意味し、ＰＬＤ－１２とは、「Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１２％）」を示し、ＰＬＤ－２３とは、「Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２３％）」を示し、ＰＬＤ－５２とは、「Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５２％）」を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　表４及び図２に示すとおり、金ナノロッドの細胞取り込みは、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ）修飾金ナノロッドが、大きな細胞取り込み量を示した。これは、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ）修飾金ナノロッドが、まずＤＭＡＥの正電荷により、細胞表面に濃縮され、更にラクトースにより細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターに認識された結果、高い細胞集積効果を示したためであると推定される。
　［ポリマー修飾金ナノロッドの細胞取り込み阻害評価］
　ＨｅｐＧ２細胞を６ｃｍディッシュに１．８×１０６（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。その後、Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃ、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１２％）のそれぞれに保護された金ナノロッドを、それぞれ、金の最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、また、ラクトースを最終濃度が５０ｍＭになるように加えて４８時間インキュベートした。
　［細胞回収］
　４時間後、培地を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ＰＢＳで回収、遠心分離により上澄みを除去した後、Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００，２ｍＭＥＤＴＡ）を加え、細胞懸濁液１ｍＬを得た。
　［サンプル調製］
　細胞懸濁液に王水を９ｍＬ加え、一晩９０℃で加熱。その後、溶液が約１ｍＬに蒸発するまで加熱し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水８ｍＬと５００ｎｇ／ｍＬのイットリウム溶液を１ｍＬ加えた。不溶物を除くためフィルターに通し、各サンプルとした。
　［細胞内への送達量の定量（ＩＣＰ－ＡＥＳ測定）］
　金標準液とイットリウム標準液、王水を用いて検量線サンプルを調製した。王水は、濃硫酸（１３Ｍ）、濃塩酸（１２Ｍ）を１：３で混合して調製した。作成した検量線を用いて、測定サンプルのＡｕ濃度を測定し、その結果に基づいて、各サンプル１０ｍＬにおける、全細胞に取り込まれた金の重量を算出した。その結果を表５、図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　図２と図３との比較により、ラクトースを添加することで、細胞取り込みが減少したことが確認された。これは、細胞表面のレセプターがフリーのラクトースにキャップされたことに起因すると考えられる。このことから、この粒子の細胞取り込みがＬａｃ－細胞間の特異的なものであるということが確認され、更に、この取り込みは、ＤＭＡＥの正電荷による細胞表面への濃縮効果と、ラクトースによる糖鎖認識効果が共同的に作用することによって、達成されることが示唆された。
　＜細胞への光温熱治療効果＞
　［細胞準備］
　ＨｅｐＧ２細胞を９６ｗｅｌｌプレートに３．２×１０４（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。この時の培地量は１００μＬとした。２４時間後、キトサン、Ｐｙ－ｃｏ－ＰＥＧ、Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃ、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１２－５２％）のそれぞれに保護された金ナノロッド粒子をそれぞれ含有する培地を１００μＬ（濃度は１０μｇ／ｍＬ）添加し、４８時間インキュベートした。
　［レーザー照射］
　粒子添加から４８時間後、培地を除去しＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを除去し、培地を１００μＬ添加して、レーザーを照射した。レーザー条件は、波長８００ｎｍ、照射時間１０分／ｗｅｌｌ、強度２．７Ｗ／ｃｍ２、ビーム直径０．６ｃｍとした。
　［ＭＴＴアッセイ］
　レーザー照射後、２４時間後にＭＴＴアッセイを行った。まず、培地を除去し、ＭＴＴ試薬濃度が０．５ｍｇ／ｍＬの培地を１００μＬ添加し、４時間３７℃でインキュベートした。その後培地を除去し、ＩＰＡ／ＨＣｌを１００μＬ加え一晩静置し、プレートリーダーにより吸光度を測定した。ＭＴＴアッセイの結果を図４に示す。
　図４に示すとおり、ＰＬＤ－５２においては、レーザー照射により、細胞活性が低下しており、細胞死が確認できた。これは、ＰＬＤ－５２修飾ナノロッドは他の粒子に比べ、より多くの粒子が細胞内に取り込まれたため、より発熱し、大きな細胞死が誘導できたためであると考えられる。この結果は、ＩＣＰ－ＡＥＳの結果とも相関しており、粒子の細胞取り込みは、光温熱治療における重要なファクターであると示唆された。
　＜ポリマー保護金コロイドの調製＞
　［クエン酸還元金コロイドの合成］
　テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸四水和物をＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶かし、２４．２８ｍＭ塩化金酸水溶液を調製した。また、クエン酸をＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶かし、１００ｍＭクエン酸水溶液を調製した。２４．２８ｍＭ塩化金酸水溶液０．２４８ｍＬをＭｉｌｌｉ－Ｑ水２９．１５２ｍＬに添加し、１０分間激しく撹拌しながら１１０℃で還流した。１０分後、１００ｍＭクエン酸水溶液０．６ｍＬをゆっくり滴下し、３０分撹拌した。撹拌後、氷冷することで、０．２ｍＭ金コロイド溶液を得た。
　調製したクエン酸還元金コロイドに０．５ｍｇ／ｍｌとなるようポリマー水溶液（キトサン、Ｐｙ－ｃｏ－ＰＥＧ、Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃ及びＰｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２３％）のそれぞれの水溶液）を加えて１日間振とうした。振とう後、２日間透析（ＭＷＣＯ：３５００）によりクエン酸を除き、遠心分離（２００００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）で更に過剰のポリマーを除去した。調製後の金コロイドのＵＶ－ｖｉｓスペクトルを図５に示す。
　＜ポリマー修飾金コロイドの細胞取り込み評価＞
　［細胞準備］
　ＨｅｐＧ２細胞を６ｃｍディッシュに１．８×１０６（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。その後、キトサン、Ｐｙ－ｃｏ－ＰＥＧ、Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃ及びＰｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２３％）に保護されたそれぞれの金コロイドを、それぞれ金の最終濃度が、１０μｇ／ｍＬとなるように加え４８時間インキュベートした。
　［細胞回収］
　４時間後、培地を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ＰＢＳで回収し、遠心分離により上澄みを除去した後、Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ　１００，２ｍＭＥＤＴＡ）を加え、細胞懸濁液１ｍＬを得た。
　［サンプル調製］
　細胞懸濁液に王水を９ｍＬ加え、一晩９０℃で加熱。その後、溶液が約１ｍＬに蒸発するまで加熱し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水８ｍＬと５００ｎｇ／ｍＬのイットリウム溶液を１ｍＬ加えた。不溶物を除くためフィルターに通し、サンプルとした。
　［細胞内への送達量の定量（ＩＣＰ－ＡＥＳ測定）］
　金標準液とイットリウム標準液、王水を用いて検量線サンプルと測定サンプルを調製した。王水は、濃硫酸（１３Ｍ）、濃塩酸（１２Ｍ）を１：３で混合して調製した。作成した検量線を用いて、測定サンプルのＡｕ濃度を測定し、その結果に基づいて、各サンプル１０ｍＬにおける、全細胞に取り込まれた金の重量を算出した。各サンプルの金濃度を表６、図６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　表６、図６より、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ）修飾金コロイドは、金ナノロッドと同様に、高い細胞取り込み量を示すことが確認された。これは、上述のＰｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ）修飾金ナノロッドと同様に、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ）修飾金コロイドは、まずＤＭＡＥの正電荷により細胞表面に濃縮され、更にＬａｃにより細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターに認識された結果、高い細胞集積効果を示したためであると推定される。
　金コロイドのゼータ電位を測定した結果を図７に示す。図７中（ａ）は、Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃ修飾金コロイドを示し、（ｂ）は、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２３％）修飾金コロイドを示す。図７に示すとおり、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２３％）修飾金コロイドにおいては、細胞培養培地のｐＨ（ｐＨ７．４）で正の値を示していることが確認された。このことからも、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ）修飾金コロイドは、まずＤＭＡＥの正電荷により細胞表面に濃縮され、更にラクトースにより細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターに認識された結果、高い細胞集積効果を示すことが示された。
　＜酸性条件での金コロイドの細胞取り込み＞
　［細胞準備］
　ＨｅｐＧ２細胞を６ｃｍディッシュに１．８×１０６（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。その後、Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃ、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２３％）にそれぞれ保護された金コロイドを、それぞれ金の最終濃度が、１０μｇ／ｍＬとなるように加え４８時間インキュベートした。また、このとき、ｐＨが５．５、６．５又は７．４の３種類の培地について準備した。
　［細胞回収］
　４８時間後、それぞれの培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、セルスクレーパーで細胞を剥離し、ＰＢＳで回収し、遠心分離により上澄みを除去した後、Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ　１００，２ｍＭＥＤＴＡ）を加え、細胞懸濁液１ｍＬを得た。
　［サンプル調製］
　細胞懸濁液に王水を９ｍＬ加え、一晩９０℃で加熱。その後、溶液が約１ｍＬに蒸発するまで加熱し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水８ｍＬと５００ｎｇ／ｍＬのイットリウム溶液を１ｍＬ加えた。不溶物を除くためフィルターに通し、サンプルとした。
　［ＩＣＰ－ＡＥＳ測定］
　金標準液とイットリウム標準液、王水を用いて検量線サンプルを調製した。王水は、濃硫酸（１３Ｍ）、濃塩酸（１２Ｍ）を１：３で混合して調製した。作成した検量線を用いて、測定サンプルのＡｕ濃度を測定した。測定結果に基づいて、各サンプル１０ｍＬにおける、全細胞に取り込まれた金の重量を算出した。全細胞に取り込まれた金の重量を、表７、図８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２３％）においては、ｐＨが低くなるほど、金の取り込み量が大きくなった。これは、ｐＨが低くなることにより、よりアミンがカチオニックになったためであると推定される。
　＜細胞への光温熱治療効果（ｐＨ５．５）＞
　［細胞準備］
　ＨｅｐＧ２細胞を９６ｗｅｌｌプレートに３．２×１０４（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。この時の培地量は１００μＬとした。２４時間後、キトサン、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５２％）にそれぞれ保護された金ナノロッド粒子含有培地を１００μＬ（濃度は１０μｇ／ｍＬ）添加し、４８時間インキュベートした。このとき培地のｐＨをｐＨ５．５とした。
　［レーザー照射］
　粒子添加から４８時間後、培地を除去しＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを除去し培地を１００μＬ添加して、レーザーを照射した。レーザー条件は、波長：８００ｎｍ、照射時間：１０分／ｗｅｌｌ、強度：２．７Ｗ／ｃｍ２、ビーム直径：０．６ｃｍとした。
　［ＭＴＴアッセイ］
　レーザー照射後、６時間後にＭＴＴアッセイを行った。まず、培地を除去し、ＭＴＴ試薬濃度が０．５ｍｇ／ｍＬの培地を１００μＬ添加し、４時間３７℃でインキュベートした。その後培地を除去し、ＩＰＡ／ＨＣｌを１００μＬ加え一晩静置し、プレートリーダーにより吸光度を測定した。ＭＴＴアッセイの結果を図９に示す。
　キトサン、ＰＬＤ－５２共に、レーザー照射により細胞死が誘導されたことが確認された。また、キトサンにおいては、レーザー未照射にもかかわらず、ＰＬＤ－５２より細胞活性が低下していることが確認できた。上記の図２から、キトサンは、ＰＬＤ一５２より、細胞への金ナノロッドの取り込み量が少ないことが確認される。それにもかかわらず、キトサンの方が、細胞死が多かったことから、キトサンの方が、ＰＬＤ－５２より、細胞毒性が強いことが示唆された。
　＜ＳＰＲ測定によるカチオン性モノマー及び糖鎖の共重合体とレクチンとの解離定数算出＞
　［ＲＣＡ１２０溶液の準備］
　市販の５．０ｍｇ／ｍＬ　Ｒｉｃｉｎｕｓ　Ｃｏｍｍｕｎｉｓ　Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　Ｉ（ＲＣＡ１２０）２０μＬを１０ｍＭｐＨ４．０酢酸緩衝液（１０ｍＭ酢酸水溶液と１０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液を混合し、ｐＨ４．０に調製したもの）１８０μＬで希釈し、０．５ｍｇ／ｍＬＲＣＡ１２０溶液２００μＬを調製した。調製した０．５ｍｇ／ｍＬＲＣＡ１２０溶液１００μＬを１０ｍＭｐＨ４．０酢酸緩衝液９００μＬで希釈し、５０μｇ／ｍＬ　ＲＣＡ１２０溶液１ｍＬを調製した。さらに、調製した５０μｇ／ｍＬ　ＲＣＡ１２０溶液２００μＬを１０ｍＭｐＨ４．０酢酸緩衝液８００μＬで希釈し、１０μｇ／ｍＬＲＣＡ１２０溶液１ｍＬを調製した。調製した１０μｇ／ｍＬＲＣＡ１２０溶液２００μＬを７ｍｍプラスチックバイヤルに添加し、ｂｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア社製）に設置した。
　［ＮＨＳ溶液及びＥＤＣ溶液の準備］
　Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）１１．５ｍｇを超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）１ｍＬに溶解させ１００ｍＭＮＨＳ溶液を調製した。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）１９．２ｍｇを超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）１ｍＬに溶解させ１００ｍＭ　ＥＤＣ溶液を調製した。
　市販のＣＭ５　ｃｈｉｐをｂｉａｃｏｒｅ３０００に挿入し、真空脱気した１０ｍＭｐＨ７．８リン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸水素二ナトリウム水溶液と１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム水溶液を混合し、ｐＨ７．８に調製したもの）１２０ｍＬをランニングバッファーとして設置した。ＣＭ５　ｃｈｉｐを挿入した後、ランニングバッファーでプライム洗浄（予備洗浄）を２回行った。
　洗浄後、１００ｍＭＮＨＳ溶液と１００ｍＭＥＤＣ溶液を１１５μＬずつ７ｍｍプラスチックバイヤルに別々に添加し、ｂｉａｃｏｒｅ３０００に設置した。市販の１０ｍＭエタノールアミンｐＨ８．５７５μＬを７ｍｍプラスチックバイヤルに添加し、ｂｉａｃｏｒｅ３０００に設置した。
　［レクチン修飾表面の作製］
　上記のとおり、各溶液を準備した後、アミンカップリング法によりレクチン（ＲＣＡ１２０）修飾表面の作製を、以下の条件で行った。
　　ＮＨＳ（１００ｍＭ）／ＥＤＣ（１００ｍＭ）水溶液：流速５μＬ／ｍｉｎ、固定化時間７ｍｉｎ
　　１０μｇ／ｍＬＲＣＡ１２０（１０ｍＭｐＨ４．０アセテートバッファー）：流速１０μＬ／ｍｉｎ、固定化時間１ｍｉｎ（フローセル（Ｆｃ）２）、３ｍｉｎ（Ｆｃ３）、７ｍｉｎ（Ｆｃ４）
　　１ＭエタノールアミンｐＨ８．５［ブロッキング剤］：流速５μＬ／ｍｉｎ、固定化時間７ｍｉｎ
　また、参考例としてレクチンを固定化しないもの（ブロッキング剤のみ使用したもの）についても以下のように固定化操作を行った。
　　ＮＨＳ（１００ｍＭ）／ＥＤＣ（１００ｍＭ）水溶液　　流速５μＬ／ｍｉｎ、固定化時間７ｍｉｎ
　　１Ｍエタノールアミン　ｐＨ８．５［ブロッキング剤］　　     流速５μＬ／ｍｉｎ、固定化時間７ｍｉｎ
　上記のＲＣＡ１２０固定化の際、ランニングバッファーは１０ｍＭ　ｐＨ７．８リン酸塩緩衝液を使用した。
　［Ｌａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ溶液の準備］
　式（２０）で表される化合物（Ｌａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）（Ｍｎ＝９０７１）と１０ｍＭｐＨ７．４リン酸緩衝液を用いて、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭ、８０ｎＭのＬａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ溶液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　［Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ溶液の準備］
　Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５％（Ｍｎ＝８９８９）（式（２１）で表される化合物）、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１０％（Ｍｎ＝９２７２）（式（２２）で表される化合物）、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２０％（Ｍｎ＝１２０１６）（式（２３）で表される化合物）、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％（Ｍｎ＝１３７２０）（式（２４）で表される化合物）を準備した。なお、上記「Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５％」、「Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１０％」、「Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２０％」、「Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％」中のそれぞれの数値は、Ｌａｃのユニット数とＤＭＡＥのユニット数との合計ユニット数に対する、ＤＭＡＥのユニット数の割合を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　これらの化合物を用いて、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１０％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２０％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％のそれぞれについて、ｐＨ７．４リン酸緩衝液を用いて、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭ、８０ｎＭのＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ溶液を調製した。
　［ＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着の測定］
　上記のとおりに準備したＬａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１０％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２０％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％について、それぞれの２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭ、８０ｎＭの溶液を用いて、ＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量を、以下に示す条件で測定した。
　流速：２０μＬ／ｍｉｎ
　温度：２５℃
　ランニングバッファー：１０ｍＭＰＢＳ（１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）
　結合・解離時間は１８０秒とし、いずれも希釈液はランニングバッファーと同じとした。
　なお、再生条件は、以下のとおりとした。
　Ｌａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ：１０ｍＭｐＨ２．０グリシン－ＨＣｌバッファー　６０秒
　Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５％：１０ｍＭｐＨ２．０グリシン－ＨＣｌバッファー　６０秒
　Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１０％：１０ｍＭｐＨ２．０グリシン－ＨＣｌバッファー　６０秒
　Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２０％：１０ｍＭｐＨ２．０グリシン－ＨＣｌバッファー　６０秒×２
　Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％：１０ｍＭｐＨ２．０グリシン－ＨＣｌバッファー秒×３
　得たセンサーグラムから、反応速度定数・解離速度定数・解離定数の算出をＢＩＡ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。解析条件は、ｋｉｎｅｔｉｃｓ解析を用い、算出モデルは１：１　ｌａｎｇｍｕｉｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ，　ｇｌｏｂａｌ　ｆｉｔｔｉｎｇとした。
　また、上述のＲＣＡ１２０の固定化には、１０μｇ／ｍＬＲＣＡ１２０溶液（以下、「Ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ＲＣＡ」という。）を用いたが、Ｌｏｗ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ＲＣＡに替えて、５０μｇ／ｍＬＲＣＡ１２０溶液（以下、「Ｍｉｄｄｌｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ＲＣＡ」という。）と、０．５ｍｇ／ｍＬＲＣＡ１２０溶液（以下、「Ｈｉｇｈ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ＲＣＡ」という。）を用いた以外は、上記と同様の条件で、Ｌａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１０％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２０％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％について、ＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量の測定、反応速度定数・解離速度定数・解離定数の算出を行った。そのうち、Ｌａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２０％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％のそれぞれの２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭ、８０ｎＭの溶液を用いて、ＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着と脱着を時間に対して測定し、吸着速度定数、解離速度定数、解離定数（この逆数は結合定数）を算出する方法（グローバルフィッティング法）により算出されたＫＤ／Ｍを、図１０に示す。
　図１０に示す結果から、本発明の細胞内送達用高分子担体は、カチオン性の部分を有することにより、レクチンとの親和性が増すことが示された。
　＜ＳＰＲ測定によるカチオン性モノマー及び糖鎖の共重合体とレクチンとの結合阻害試験＞
　［ガラクトース溶液の調製］
　阻害剤であるガラクトース溶液の調製を行った。まず、ガラクトース３６．０ｍｇを１０ｍＭｐＨ７．４リン酸緩衝液５ｍＬに溶解させ、４０ｍＭガラクトース溶液を調製した。４０ｍＭガラクトース溶液を、１０ｍＭｐＨ７．４リン酸緩衝液で希釈して、２０ｍＭ、４ｍＭ、２ｍＭ、０．４ｍＭ、４０μＭ、４μＭ、４００ｎＭのそれぞれのガラクトース溶液を調製した。
　８０ｎＭの、Ｌａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１０％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２０％、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％溶液と、上記のガラクトース溶液（４００ｎＭ、４μＭ、４０μＭ、０．４ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ）を、ガラクトースの添加量が、アナライトであるＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥに対し、１、１０、１００、１ｋ、５ｋ、１０ｋ、５０ｋ、１００ｋ、５００ｋ、１Ｍｅｑとなるように混合し、阻害試験に用いるサンプル１ｍＬを調製した。調製したサンプルを７ｍｍプラスチックサンプルに入れ、ｂｉａｃｏｒｅ３０００に設置した。各サンプルを結合・解離時間３分でインジェクトを行い、ＲＣＡ１２０を固定化した表面（０．０１５ｍｏｌｅｃｕｌｅ／ｎｍ２）に対する吸着量を測定した。ＲＣＡ１２０の固定化は、上述の解離定数算出試験と同様の条件で行い、ＲＣＡ１２０溶液は、Ｍｉｄｄｌｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ＲＣＡを用いた。ランニングバッファーは、１０ｍＭＰＢＳ（１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を用い、希釈溶液はランニングバッファーと同じものを用いた。再生条件は上述の解離定数算出試験と同様とした。
　図１１に、ガラクトースのそれぞれの高分子担体に対する量と、ＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量との関係を示したグラフを示す。また、それぞれの高分子担体の吸着がガラクトースによって５０％阻害されたガラクトースの量及び濃度（ＩＣ５０）を、表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　図１１、表８に示す結果から、ガラクトースによる競合阻害は、高分子に占める、カチオン性であるＤＭＡＥの割合が多くなるほど、生じにくいことが示された。
　また、１０ｍＭＰＢＳ（１ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）において、８０ｎＭのＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％を用いた場合における、ガラクトースのＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％に対する量を変化させた場合の、時間とＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量との関係を、結果を、図１２に示す。なお、図１２は、後述の図１３のＮａＣｌ－１Ｍにおける阻害実験のＳＰＲセンサーグラムである。
　図１２に示す結果から、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％の細胞用高分子担体は、ガラクトースの量が増えると、ガラクトースによる競合阻害が阻害濃度依存的に確認された。したがって、この糖鎖ポリマーの受容体への結合は静電気的な引力によって負電荷表面に濃度濃縮されることによって特異的結合が増強されていることが分かった。
　８０ｎＭのＬａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ溶液、Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％溶液について、１０ｍＭＰＢＳ（１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）に替えて、１０ｍＭＰＢＳ（１ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．４）を用いた以外は、上記と同様の条件で、ガラクトースによる競合阻害の程度を測定した。
　図１３のグラフに、１５０ｍＭＮａＣｌと、１ＭＮａＣｌのそれぞれの場合についての、ガラクトースのＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％に対する量とＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量との関係を示す。
　図１３から、ＮａＣｌの塩濃度に依存して、ガラクトースによる依存は強くなることが確認された。
　また、塩効果による静電相互作用の吸着への寄与率を調べるために、１５０ｍＭＮａＣｌと、１ＭＮａＣｌのそれぞれの塩濃度の場合について、Ｌａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒとＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％のＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量を調べた。吸着量を測定方法は、ガラクトースを用いない以外は、上記の阻害試験と同様の手順で行った。その結果を、図１３、図１４に示す。
　図１４のグラフには、１５０ｍＭＮａＣｌと、１ＭＮａＣｌのそれぞれの場合についての、時間とＬａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒのＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量との関係を示す
　図１５のグラフには、１５０ｍＭＮａＣｌと、１ＭＮａＣｌのそれぞれの場合についての、時間とＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％のＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量との関係を示す。
　図１４、１５の結果から、塩濃度を高くしても、カチオンセグメントのないＬａｃ－ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒは、ＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着の程度に影響が少ない一方で、カチオン性の部分を多く有するＬａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％は、ＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量は著しく高いが、塩濃度を高くすることで、ＲＣＡ１２０修飾表面に対する吸着量が低くなることが確認された。このことから、この糖鎖ポリマーの受容体への結合は、カチオンセグメントを有することで、静電気的な引力によって負電荷表面に濃度濃縮され、その結果としてとの特異的結合が増強されていることが裏付けられた。
　＜シリカ粒子の細胞取り込み能の評価＞
　［Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ）の合成］
　上述した式（１７）～（１９）で表される化合物の合成とは、各モノマーのユニット数を変更した以外は、同様の条件で、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％）を合成した。Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％）は、上述した式（１７）～（１９）のｎ＝２４、ｍ＝２３、ｌ＝３５である化合物に相当するものである。
　また、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％）とは、各モノマーのユニット数を変更した以外は、同様の条件で、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１０％）、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２０％）を合成した。
　［高分子被覆シリカ溶液の調製］
　Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％）８ｍｇとＰｙ－ｂ－ＰＥＧ－ＦＩＴＣ（式（２５）で表される化合物）８ｍｇとを混合し、１６ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解させ、高分子溶液（高分子濃度：１ｍｇ／ｍＬ）を調製した。シリカ粒子（ＫＥ－Ｐ１０、株式会社日本触媒製）４０ｍｇを２０ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に分散させ、２ｍｇ／ｍＬのシリカ溶液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
  
 
　調製した高分子溶液とシリカ溶液を１５ｍＬずつ混合し、１日振とうさせることで、高分子で被覆した、蛍光標識シリカ粒子を調製した。振とう時の濃度は、高分子は０．５ｍｇ／ｍＬとし、シリカは１ｍｇ／ｍＬとした。
　振とう後、溶液を遠心分離し（４０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）、上澄みを取り除くことで、未吸着高分子を除去した。この際、上澄みの蛍光強度がなくなるまで、遠心分離、上澄み除去を繰り返した。
　精製後、遠心分離（４０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）により高分子被覆シリカを沈殿させて、上澄みを除去後に６ｍＬのＰＢＳ溶液に再分散させ、シリカ濃度５ｍｇ／ｍＬの高分子被覆シリカ溶液を調製した。
　［細胞準備］
　ＨｅｐＧ２細胞を２４ｗｅｌｌプレートに２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（５０％　コンフルエント）で播種し、２４時間培養した。調製した高分子被膜シリカ溶液を２０分間、ＵＶ滅菌した。その後、高分子被膜シリカ溶液２ｍＬをＤＭＥＭ１８ｍＬで希釈し、シリカ濃度５００μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ１０％含有）の溶液を調製した。この溶液を細胞に５００μＬずつ添加し、２４時間インキュベートした。
　［ＦＡＣＳ測定］
　２４時間後、培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した（０．５ｍＬ×３）。その後、トリプシンを１ｍＬ添加し、５分間インキュベートした。剥離した細胞を回収し、遠心分離により上澄みを除去した。上澄みを除去後、ＰＢＳを２ｍＬ加え、細胞懸濁液を調製した。その後、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ）測定より評価を行った。
　上記のＰｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％）を、Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃ（式１３で表される化合物）、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１０％）、又はＰｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２０％）に替えた以外は、同様の条件で、高分子被覆シリカ溶液の調製、細胞準備、及びＦＡＣＳ測定を行った。また、コントロールとして、高分子被覆で被覆していないシリカ溶液を調製して、細胞準備、及びＦＡＣＳ測定を行った。それぞれについてのＦＡＣＳ測定の結果を、図１６に示す。図１６中、（ａ）は、高分子被覆で被覆していないシリカ溶液（コントロール）についての測定結果を示し、（ｂ）は、Ｐｙ－ｂ－Ｌａｃで被覆したシリカ溶液についての測定結果を示し、（ｃ）は、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ１０％）で被覆したシリカ溶液についての測定結果を示し、（ｄ）はＰｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ２０％）で被覆したシリカ溶液についての測定結果を示し、（ｅ）は、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％）で被覆したシリカ溶液についての測定結果を示す。
　図１６に示された結果から、高分子に占めるカチオン性の部分の割合が多くなるほど、細胞内に取り込まれるシリカの量が増えることが確認された。
　＜シリカ粒子の細胞取り込み能に対する阻害の評価＞
　［高分子被覆シリカ溶液の調製］
　Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％）８ｍｇとＰｙ－ｂ－ＰＥＧ－ＦＩＴＣ８ｍｇを混合し、１６ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に溶解させ、高分子溶液（高分子濃度：１ｍｇ／ｍＬ）を調製した。シリカ粒子（ＫＥ－Ｐ１０、株式会社日本触媒製）４０ｍｇを２０ｍＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ水に分散させ、２ｍｇ／ｍＬのシリカ溶液を調製した。
　調製した高分子溶液とシリカ溶液を１５ｍＬずつ混合し、１日振とうさせることで、高分子被覆された蛍光標識シリカ粒子を調製した。振とう時の濃度は、高分子は０．５ｍｇ／ｍＬとし、シリカは１ｍｇ／ｍＬとした。
　振とう後、溶液を遠心分離し（４０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）、上澄みを取り除くことで、未吸着高分子を除去した。この際、上澄みの蛍光強度がなくなるまで、遠心分離、上澄み除去を繰り返した。
　精製後、遠心分離（４０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）により高分子被覆シリカを沈殿させ、上澄みを除去後にＰＢＳ溶液に３ｍＬに再分散させ、シリカ濃度：１０ｍｇ／ｍＬの高分子被覆シリカ溶液を調製した。
　［細胞準備］
　ＨｅｐＧ２細胞を２４ｗｅｌｌプレートに２×１０５（５０％コンフルエント）ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間培養した。
　［Ｌａｃ　ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ溶液の調製］
　Ｌａｃ　ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ４５．９ｍｇをＰＢＳ１００μＬに溶かし、１０００ｍＭ（Ｌａｃ濃度）のＬａｃ　ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ溶液（母液）を調製した。このＬａｃ　ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒは、Ｍｗ：８７１８．８３、連鎖数：１９であった。
　１０００ｍＭのＬａｃ　ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ溶液（母液）を用いて、１０μＭ、及び１００μＭＬａｃ　ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ溶液を調製した。
　調製した高分子被膜シリカ粒子溶液、Ｌａｃ　ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒ溶液、ＤＭＥＭを用いて、以下の表９に示すように試験例１～５のサンプル溶液を調製した。サンプル溶液のシリカ濃度は、５００μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ１０％含有）とした。なお、各サンプル溶液の全量は６００μｌとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　調製したそれぞれのサンプル溶液を細胞に５００μＬずつ添加し、５時間インキュベートした。
　［ＦＡＣＳ測定］
　５時間後、それぞれのサンプル溶液から培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した（０．５ｍＬ×３）。トリプシンを１ｍＬ添加し、５分間インキュベートした。剥離した細胞を回収し、遠心分離により上澄みを除去した。上澄みを除去後、ＰＢＳを２ｍＬ加え、細胞懸濁液を調製した。その後、ＦＡＣＳ測定より評価を行った。
　それぞれのサンプルについてのＦＡＣＳ測定の結果を、図１７に示す。図１７中、（ａ）は、試験例５のサンプル溶液（コントロール）についての測定結果を示し、（ｂ）は、試験例１のサンプル溶液についての測定結果を示し、（ｃ）は、試験例２のサンプル溶液についての測定結果を示し、（ｄ）は試験例３のサンプル溶液についての測定結果を示し、（ｅ）は、試験例４のサンプル溶液についての測定結果を示す。
　図１７に示す結果から、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％）と同時に加えられた、Ｌａｃ　ｇｌｙｃｏｐｏｌｙｍｅｒの濃度が高いほど、Ｐｙ－ｂ－（Ｌａｃ－ｃｏ－ＤＭＡＥ５０％）によるシリカの細胞内への取り込みが阻害されることが確認された。この理由は、本発明の細胞内送達用高分子担体の、細胞表面における濃度が高くなる前に、細胞表面に対する結合能を有するリガンド濃度が増すことで、リガンドと細胞内送達用高分子担体とが部分的に競合したからであると考えられる。

Claims (4)

  1. 　カチオン性モノマーと、細胞表面に対する結合能を有するリガンドを有するモノマーとが、少なくともランダム共重合したセグメント（Ａ）を有する共重合体からなる、細胞内送達用高分子担体。
  2. 　前記共重合体は、無機微粒子に吸着可能な基を有するセグメント（Ｂ）を更に有する請求項１記載の細胞内送達用高分子担体。
  3. 　前記共重合体は、前記セグメント（Ａ）の正電荷より大きい正電荷を有するセグメント（Ｃ）を更に有する請求項１記載の細胞内送達用高分子担体。
  4. 　前記共重合体は、ミセル形成能を有する請求項１記載の細胞内送達用高分子担体。
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