KR20050025164A - ｐＨ-민감성 중합체 - Google Patents

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페터라이트한스-울리히
마이어크리스티안
슐테스클라우스
예셍마리-앙드레
르루쟝-크리스토프
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룀 게엠베하 운트 콤파니 카게
유니베르씨떼 드 몽레알
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Abstract

본 발명은 분자량 범위가 1,000 내지 50,000g/mol이고, 사람 적혈구를 사용한 세포독성 시험에서 농도 150㎍/ml에서의 용혈이 pH 5.5에서는 약 60% 이상으로 일어나며 pH 7.4에서는 5% 이하로 일어남을 특징으로 하는, 메타크릴산 단위 20 내지 65중량%와 (메트)아크릴산의 C1-C18알킬 에스테르 단위 80 내지 35중량%로 이루어진 (메트)아크릴레이트 공중합체인 pH 민감성 중합체에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 약제학적으로 유효한 생체분자 또는 약제학적 활성 성분 및 상응하는 약제 형태의 성분으로서의 pH 민감성 중합체의 용도에 관한 것이다.

Description

ｐＨ-민감성 중합체{pH-sensitive polymer}
본 발명은 pH 6.5 이하의 pH 값에서 세포독성 또는 막 특성을 가지며 천연 또는 합성 생체분자 또는 약제학적 활성 성분용 담체로서 사용될 수 있는 pH 민감성 중합체에 관한 것이다.
선행 기술
자극에 반응하는 중합체는 최근 중요성이 증가되어 왔다. 상응하는 중합체는, 예를 들면, 단지 약간의 온도, 용매 또는 pH와 같은 화학적 또는 물리적 영향에 노출한 후에 개질된 특성을 나타낸다. 이와 관련하여 pH 민감성 중합체가 특별한 관심의 대상이 되었다. 따라서, 예를 들면, 높은 pH에서 친수성 코일 구조를 형성하는 카복실 그룹 함유 중합체는 낮은 pH 값에서 소수성 소구체 구조로 전환될 수 있다[참조: 목록 1].
의약 물질의 투여와 관련하여 pH 민감성 중합체에 대한 연구가 집중되었다. 세포내이입, 종양 성장 및 염증과 같은 많은 생리학적 및 병리학적 과정들이 pH 조건의 변화와 연관된다. 의약 물질의 투여과 관련하여 연구하고자 하는 pH 민감성 중합체의 예로는, 예를 들면, α-알킬아크릴산[예: 폴리(2-에틸아크릴산) 및 폴리(프로필아크릴산)(참조: 목록 2), 폴리(아미도 아민)(참조: 목록 3, 4) 및 폴리(에틸렌이민), 폴리(L-리신 이소프탈아미드)(참조: 목록 5)]이다. pH 이동에 의해 유발되는 형태적인 변화는 불안정화가 발생할 수 있는 방향으로 중합체 및 세포막의 상호작용에 영향을 준다. 다수의 천연 또는 합성 생체분자를 운반하기 위한 수단으로서 pH 민감성 중합체를 사용, 착화 또는 공액시키는 것이 가능하다. 이러한 pH 민감성 중합체는 지질(참조: 목록 6, 7, 8, 14), 단백질 및 펩티드(참조: 목록 9, 10), DNA(참조: 목록 4, 11), 면역 독소(참조: 목록 12), 항체(참조: 목록 13) 및/또는 활성 성분(참조: 목록 3)과 착화 또는 공액될 수 있다.
위에서 인용한 문헌 목록
국제 공개특허공보 제WO 97/09068호에는, 상호작용 분자 포접체(conjugate)가 기재되어 있다. 이는 특히 결합능에 순차적으로 영향을 주는 자극에 반응하며 세포 표적 영역에 결합할 수 있는 능력을 갖는 분자들이다. 자극은 온도, pH, 특정 이온 또는 이온 강도, 전기장 또는 용매에 의해 받을 수 있다.
자극에 반응하는 분자는, 예를 들면, 리간드에 결합되는 분자, 즉 항원, 항체 또는 약제학적 활성 성분과 조합되는 pH 민감성 중합체일 수 있다. 분자 포접체는 변화된 환경 조건, 예를 들면, 세포외 체액의 영역에서, 즉 혈류에서 pH 7.0 이상의 값으로부터, 예를 들면, 세포이입에 의해 생체 세포 속으로의 섭취와 관련된, pH 6.5 이하의 값으로의 pH의 변경에 반응할 수 있다.
일반적으로 언급된 중합체는 자유 라디칼 중합 반응에 노출되고 분자량 범위가 1,000 내지 30,000인 비닐계 단량체를 기본으로 한다. 반응성 부그룹, 즉 -OH, -COOH 또는 바람직하게는 -NH2를 갖는 중합체는 커플링 단백질 또는 펩티드로 제안되어 있다.
(메트)아크릴산의 C1-C12-알킬 에스테르와 같은 메타크릴산 단위 및 공단량체로 구성된 (메트)아크릴레이트 공중합체는 대체로 공지되어 있으며, 특히 약제형 피복제 및 결합제로서 사용된다.
공지된 예로는 메타크릴산 50중량%와 메틸 메타크릴레이트[유드라깃(EUDRAGITR) L] 50중량%로 구성된 공중합체, 메타크릴산 50중량%와 에틸 아크릴레이트(유드라깃R L100-55) 50중량%로 구성된 공중합체, 및 메타크릴산 30중량%와 메틸 메타크릴레이트(유드라깃R S) 70중량%로 구성된 공중합체이다. 통상 시판되는 공중합체는 분자량 범위가 약 200,000g/mol이다.
미국 특허원 제2001/0007666 A1호에는, 세포막, 간세포, 세포 격실 또는 지질막을 통해 물질의 운반 또는 방출을 증가시키는 데 사용되는 조성물이 기재되어 있다. 당해 조성물은 특히 pH 민감성 중합체일 수 있는 막 운반제와 물리적인 수단으로 구성되어 막 운반제, 예를 들면, 초음파 처리제의 효율을 증가시킨다. 특히 적합한 pH 민감성 중합체는 카복실 그룹 함유 중합체, 예를 들면, 카복실 그룹을 갖는 단량체 잔기를 50% 이상 함유하는 중합체이다. 언급된 특정 예는 평균 분자량이 62,000인 폴리(2-에틸아크릴산)이다. 아크릴산과 에틸, 프로필 및 부틸 아크릴레이트로 이루어진 50:50 공중합체가 또한 기재되어 있다. 제조방법은 AIBN 개시제의 존재하에 벌크 중합시켜 제조되는 것으로 기재되어 있다. 분자량 조절제는 언급되지 않는다. 공중합체가 에테르 침전에 의해 추가로 정제되므로, 분자량은 높을 것으로 추측된다. 소량(㎍)의 저농도에서도, 공중합체는 pH 5.5에서 광범위하게 및 pH 7.4 이상에서 약간의 정도로 에리토사이트를 용해시킨다.
문제 및 해결책
생체분자 또는 약제학적 활성 성분을 세포질로 도입시키고 세포질에서 가능하게는 엔도솜을 통해 세포핵으로 도입시키는 것은 화학적으로 분해되거나 불활성화될 수 있는 리소좀으로 물질의 운반(도입)을 억제하는 막 불안정화제(막 파괴제)를 필요로 한다. 이에 따라 관심을 끄는 중합체는 엔도솜에서 우세한 pH 약 6.5 이하의 약산성 pH 값에서 세포막의 불안정화(파괴)에 이르렀으나, 세포 외부에서 발생하는 바와 같은, pH 약 7.4의 생리학적 pH 값에서 막 효능이 실질적으로 없다(존재하지 않는다). 미국 특허원 제2001/0007666 A1호의 아크릴산/알킬 아크릴레이트 공중합체는 극히 낮은 농도에서도 세포용해가 될 수 있다는 결점이 있다. 이는 이 약제의 중요성을 야기시킨다. 또 다른 결점은 pH 7.4에서도 다소의 용혈이 일어날 수 있으므로, 기재된 공중합체는 전반적으로 조절하기 어려우며, 공중합체가 극미량으로 사용되는 경우, 생체분자 또는 약제학적 활성 성분으로 단지 약간만 충전시키는 것이 가능해진다는 점이다. 또 다른 결점은 비경구 투여 후에 공중합체가 체내에 축적될 수 있다는 점이다. 중합체의 분자량이 너무 높으면, 예를 들면, 62,000인 경우, 사구체 여과에 의한 배설이 억제된다.
구체적으로 특별한 세포 유형에서 효과를 나타내는 것으로 생각되는 약제 형태의 개발과 관련하여, 적합한 중합체성 담체 분자에 대한 요구가 계속 있어 왔다. 이러한 생각은 고농도에서만 세포독성 또는 막 특성을 나타내거나, pH 7.0 또는 이보다 약간 높은 영역에서는 세포독성 또는 막 특성을 전혀 나타내지 않지만, pH 6.5 이하의 생체내 저농도에서도 세포독성, 용혈성 또는 막 효과를 갖는 pH 민감성 중합체를 개발하려는 것이다. 이 중합체는 엔도솜으로 흡수시켜 세포 내부로 방출시키고 후속적으로 이의 불안정화 또는 용해를 유발할 수 있는 천연 또는 합성 생체분자 또는 약제학적 활성 성분에 담체(착체 및 포접체)로서 적합할 것으로 생각된다.
또한, 물질의 비경구 투여시에, 배출 문제는 인체내 또는 동물 체내의 축적 및 이에 따른 독성 부작용을 막기 위한 것으로 간주되어야 한다.
따라서, 예를 들면, 20 내지 150㎍/ml의 농도 범위에서 용이하게 적용될 수 있으며 잘 충전될 수 있으며, 이에 따라 천연 또는 합성 기원의 생체분자용 담체(착체 및 포접체)로서 적합한 pH 민감성 중합체가 공급되어야 한다. 이러한 pH 민감성 중합체는 이러한 농도 범위 및 pH 5.5와 pH 6.5 이하의 범위에서 우수한 용혈 특성을 나타내어야 하는 반면, pH 7.4에서는 막 영향(용혈 영향)이 없어야 한다. 게다가, 이는 독성이 있거나 억제됨으로 인해 대식세포 유형에 대하여 영향을 받지 않아야 한다. 중합체는 신장을 통해 잘 배출되어야 하며, 따라서 비경구 투여에도 적합해야 한다.
이러한 문제는 분자량 범위가 1,000 내지 50,000g/mol이고, 사람 적혈구를 사용한 세포독성 시험에서 농도 150㎍/ml에서의 용혈이 pH 5.5에서는 약 60% 이상으로 일어나며 pH 7.4에서는 5% 이하로 일어남을 특징으로 하는, 메타크릴산 단위 20 내지 65중량%, 바람직하게는 25 내지 65중량%와 (메트)아크릴산의 C1-C18알킬 에스테르 단위 80 내지 35중량%, 바람직하게는 75 내지 35중량%로 이루어진 (메트)아크릴산 공중합체인 pH 민감성 중합체에 의해 해결된다.
폴리(메트)아크릴레이트 - 기타 약제학적으로 사용되는 중합체와는 달리 - 는 생물학적으로 분해될 수 없기 때문에, 신장을 통한 사구체 여과에 의해 배출이 수행되어야 한다. 그러나, 이러한 공정은 분자량과 관련하여 제한된다. 신장을 통해 분비될 수 있는 분자의 상한은 50,000g/mole(달톤)로 채택되었다. 놀랍게도, 본 발명에 따르는 저분자량 중합체는 고분자량 중합체보다 용혈 활성이 높음을 나타낸다.
발명의 수단
(메트)아크릴레이트 공중합체
본 발명은 pH 민감성 중합체, 특히 (메트)아크릴레이트 공중합체가 메타크릴산 단위 20 내지 65중량%와 (메트)아크릴산의 C1-C18-알킬 에스테르 단위 80 내지 35중량%로 구성되며, (메트)아크릴산의 C1-C18-알킬 에스테르, 특히 (메트)아크릴산의 직쇄 또는 측쇄 C1-C18-알킬 에스테르가, 예를 들면, 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 비닐 아크릴레이트, 프로필 아크릴레이트, 부틸 아크릴레이트, 헥실 아크릴레이트, 옥틸 아크릴레이트, 데실 아크릴레이트, 도데실 아크릴레이트, 미리스틸 아크릴레이트, 라우릴 아크릴레이트, 세틸 아크릴레이트, 스테아릴 아크릴레이트, 메틸 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 프로필 메타크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 이소부틸 메타크릴레이트, 헥실 메타크릴레이트, 2-에틸헥실-(메트)아크릴레이트, 페닐 메타크릴레이트, 옥틸 메타크릴레이트, 데실 메타크릴레이트, 도데실 메타크릴레이트, 미리스틸 메타크릴레이트, 라우릴 메타크릴레이트, 세틸 메타크릴레이트, 스테아릴 메타크릴레이트인, pH 6.5 이하의 pH 값에서 막 특성, 용혈 특성 또는 세포독성 특성을 갖는 pH 민감성 중합체에 관한 것이다.
에스테르 성분은 직쇄 또는 사이클릭일 수 있다.
아크릴산 또는 메타크릴산의 C1-C18-알킬 에스테르, 특히 메틸 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 부틸 아크릴레이트 및 2-에틸헥실 아크릴레이트가 바람직하다.
대체로, 언급한 함량은 100중량%까지 첨가한다. 그러나, 본질적인 특성에의 손상 또는 변경이 필수적으로 유도되지는 않으며, (메트)아크릴레이트, 예를 들면, 부틸 아크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 메틸 아크릴레이트, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 하이드록시에틸 아크릴레이트, 메타크릴아미드 또는 스티렌이 필수적으로 존재하지는 않는 기타 공중합 가능한 비닐 단량체 0 내지 10중량%, 예를 들면, 0.1 내지 5중량% 또는 2.5중량% 이하로 소량의 경우에 가능하다. 가교결합 단량체는 대체로 존재하지 않는다.
(메트)아크릴레이트 공중합체 변형
메타크릴산 단위 40 내지 60중량%, 특히 45 내지 55중량%, 예를 들면, 50중량%와 에틸 아크릴레이트 단위(유드라깃R L100-55 유형) 60 내지 40중량%, 특히 55 내지 45중량%, 예를 들면, 50중량%;
메타크릴산 단위 40 내지 60중량%, 특히 45 내지 55중량%, 예를 들면, 50중량%, 에틸 아크릴레이트 단위 60 내지 30중량%, 특히 45 내지 35중량%, 예를 들면, 50중량% 및 부틸 메타크릴레이트 2 내지 20중량%, 예를 들면, 10중량%;
메타크릴산 단위 40 내지 60중량%, 특히 45 내지 55중량%, 예를 들면, 50중량%, 에틸 아크릴레이트 단위 60 내지 40중량%, 특히 55 내지 45중량%, 예를 들면, 50중량%, 및 아크릴산 또는 메타크릴산의 C8-C16, 바람직하게는 C8-C12 -알킬 에스테르, 바람직하게는 도데실 메타크릴레이트 0.1 내지 2중량%; 또는
메타크릴산 단위 20 내지 40중량%, 특히 25 내지 35중량%, 예를 들면, 30중량%, 메틸 메타크릴레이트 단위 25 내지 45중량%, 특히 30 내지 40중량%, 예를 들면, 35중량%, 및 에틸 아크릴레이트 단위 25 내지 45중량%, 특히 30 내지 40중량%, 예를 들면, 35중량%로 이루어진 (메트)아크릴레이트 공중합체(이는 도데실 머캅탄 5 내지 15중량% 또는 2-에틸헥실 티오글리콜레이트 2 내지 10중량%의 존재하에 바람직하게 제조할 수 있으며, 따라서 이의 특성이 다양하다)가 본 발명의 목적에 적합하고 바람직하다.
대체로, 언급한 함량은 100중량%까지 첨가한다. 그러나, 본질적인 특성에의 손상 또는 변경이 필수적으로 유도되지는 않으며, (메트)아크릴레이트가 필수적으로 존재하지는 않는 기타 공중합 가능한 비닐 단량체 0 내지 10중량%, 예를 들면, 0.1 내지 5중량% 또는 2.5중량% 이하로 소량의 경우에 가능하다. 예를 들면, 부틸 아크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 메틸 아크릴레이트, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 하이드록시에틸 아크릴레이트, 메타크릴아미드 또는 스티렌을 들 수 있다.
분자량
분자량은, 예를 들면, 점도계 또는 겔 배제 크로마토그라피(GPC)에 의해 측정할 수 있다. (점도수를 제한하는) 점도계 값은 23℃에서 클로로포름 또는 DMF(디메틸포름아미드) 속에서 측정할 수 있으며, 1 내지 25ηspec/c(cm3/g) 바람직하게는 10 내지 20ηspec/c(cm3/g)의 범위내에 존재하는 것이 바람직하다. 점도수는, 예를 들면, ISO 1628-6에서 명시한 바와 같이 측정할 수 있다. 본 발명에 따르는 분자량은 용매로서 DMF로 조절된, DIN 1628-6에 따르는 점도계로 측정해야 한다. 점도수는 폴리 메틸메타크릴레이트(PMMA)- 표준을 사용하여 분자량(중량 평균, Mw)과 관련된다. (메트)아크릴레이트 공중합체의 분자량(중량 평균)은 1,000 내지 50,000g/mol, 특히 5,000 내지 40,000g/mol, 특히 10,000 내지 30,000g/mol, 가장 바람직하게는 15,000 내지 25,000g/mol의 범위이다.
다음 표는 화학식 VZ = 4,976 10-3 ×MW 0.796에 따르는 점도 값(VZ)으로부터 분자량을 계산하기 위한 지침으로서 사용할 수 있다.
점도수(VZ) 분자량(MW)
1 780
3 3,110
5 5,910
10 14,110
15 23,490
20 33,720
30 56,110
50 106,600
용혈 효과
용혈 활성(용혈)이 5%를 초과하는 경우, 세포독성 효과가 있는 것으로 언급된다. 용혈 활성은 pH 7.4에서 5% 미만이고, pH 5.5에서 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상 또는 60% 이상으로 높아야 한다. 이러한 효과가, 적혈구 농도 1 ×108RBC/ml를 기준으로 하여, 용이하게 투여된 공중합체 농도 20 내지 300㎍/ml, 바람직하게는 50 내지 250㎍/ml, 특히 100 내지 200㎍/ml에 이르는 경우 유리하다.
공중합체 농도 10 내지 150㎍/ml, 바람직하게는 15 내지 110㎍/ml, 특히 20 내지 80㎍/ml가 가장 바람직하다.
사람 적혈구를 사용한 세포독성 시험에서, 농도 150㎍/ml의 (메트)아크릴산 공중합체는 pH 5.5에서 용혈이 약 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상에 이르며, pH 7.4에서는 용혈이 5% 미만, 바람직하게는 2.5 미만, 특히 바람직하게는 1% 미만에 이른다.
사람 적혈구를 사용한 세포독성 시험은 문헌[참조: Murthy et al.: N. Murthy, J.R. Robichaud, D.A. Tirrell, P.S. Stayton, and S. Hoffman. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. J. Controlled Release, 61: 137-143 (1999)]에 기초한 방법으로 수행할 수 있다.
이는 K3 EDTA의 존재하에 원심분리시켜 분리되는 새로운 혈액으로부터 획득한 사람 적혈구(RBC)를 필요로 한다. 이 적혈구는 이 경우에 200g 및 4℃에서 5분 동안 침강시키고, 후속적으로 원심분리를 재개하고 인산염 완충 식염수[PBS 완충액, 34mM, pH 7.4, 0.9% NaCl중량/용적(75mM)] 속에서 용해시켜 3회 세척한다. 생성된 현탁액 속에서 계수한 적혈구는 혈구계를 사용하여 측정할 수 있다.
용혈 시험은 사람 적혈구(RBC)를 세포 농도 1 ×108RBC/ml에서 특정 매질 속에서 공중합체 현탁액에 가함으로써 수행한다. 이 혼합물은 37℃에서 20분 동안 배양한다.
대식세포형 세포에 대한 세포독성 효과
세포용해가 주로 공중합체와 외부 세포막과의 상호작용을 통해 발생하는 것으로 가정되는 적혈구와는 달리, 대식세포형 세포 유형은 공중합체를 활성적으로 흡수할 수 있으므로, 이러한 경우에 기타 상호작용은 세포용해를 유발할 수 있는 것으로 가정되어야 한다. 바람직한 (메트)아크릴레이트 공중합체는 마우스 대식세포형 세포 유형 J774A.1(실시예 5 참조)을 사용한 MTT 시험 또는 LDH 시험(락테이트 탈수소효소 시험)에서 세포용해성 또는 독성이 낮거나 전혀 없는 공중합체이다. 세포주 J774A.1은, 예를 들면, 제TIB-67호(J774A.1 마우스 세포; 불멸의 대식세포형 세포(종양은 없음)[참조: Ralph P et al. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. J. Exp. Med. 143: 1528-1533, 1976 PubMed: 76192838]하에 세포주 ATCC[미국 버지니아주 20108 마나사스에 소재하는 아메리카 타입 컬쳐 콜렉션(America Type Culture Collection)]의 공적인 수집으로부터 시판된다.
MTT 시험(대식세포형 세포주의 세포 억제):
측색계 시험은 황색 MTT 염료[MTT = 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드]를 암청색 포마잔 생성물로 감소시키는 생존 세포를 검출한다. 이 시험은 세포독성, 세포 증식 및 세포 활성화를 검출하기에 적합하다[참조: T. Mosmann. Rapid calorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Meth. 65:55-63 (1983)].
대식세포의 사멸 정도는 방출된 LDH에 의해 나타난다[참조: NC. Phillips, L. Gagne, N. Ivanoff, g. Riveau. (1996) Vaccine 14(9), 898-904]. 방출된 LDH를 측정하기 위한 락테이트 탈수소효소 시험[참조: P.G. Cabaud and F. Wroblewski in Am J Clin Pathol (1958) 30, 234-236]은 통상 이용되는 시험 키트, 예를 들면, 시그마 키트(공정 번호 500)를 사용하여 수행할 수 있다.
대식세포형 세포에 대해 공중합체에 의해 유발된 독성은 생리학적(중성) pH에서 가능한 한 낮아야 한다.
바람직한 (메트)아크릴레이트 공중합체는 따라서 0.03125mg/ml의 농도 영역에서 대식세포형 세포 유형 J774A.1(ATCC TIB-67)을 사용한 MTT 시험에서 세포 생존의 퍼벤티지 값(perventage-value)을, 대조 실험에서의 100% 생존율을 기준으로 하여, 25% 이상, 바람직하게는 60% 이상으로 구하였다.
바람직한 (메트)아크릴레이트 공중합체는 따라서 0.03125mg/ml의 농도 영역에서 대식세포형 세포 유형 J774A.1(ATCC TIB-67)을 사용한 LDH 시험에서 LDH 방출값을, 대조 실험에서의 100% 세포용해(독성)를 기준으로 하여, 40% 이하, 바람직하게는 20% 이하로 구하였다.
pH 민감성 중합체 또는 (메트)아크릴레이트 공중합체의 제조
pH 민감성 중합체는 블럭 중합, 비드 중합 또는 유화 중합 및 중합체의 방출에 의해 중합 개시제 및 분자량 조절제의 존재하에 단량체를 자유 라디칼 중합시켜 제조한다. 대체로 적합한 기타 제조방법은 그룹 이동 중합(GTP) 또는 원자 이동 라디칼 중합(ATRP)이다[참조: Matyjaszewski, K. et al., Chem. Rev. 2001, 101, 2921-2990]. 생성된 중합체 구조는 랜덤 공중합체 또는 블럭 공중합체이다.
분자량 조절제 2 내지 15중량%, 유화제 함량 0.1 내지 2중량%, 중합 개시제의 양 0.02 내지 0.4중량%의 존재하에 온도 65 내지 90℃에서 유화 중합시키는 것이 바람직하다. 유화제 혼합물은 바람직하게는 나트륨 라우릴 설페이트 0.1 내지 0.5중량% 및 폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노올레에이트 0.4 내지 1.5중량%로 구성되는 것이 바람직하다. 특히 적합한 개시제는 나트륨 퍼옥소디설페이트 또는 암모늄 퍼옥소디설페이트이다. 이러한 방식으로, 예를 들면, 고체 함량이 20 내지 40중량%인 분산액을 제조하는 것이 가능하며, 공중합체는 바람직하게는 분무 건조 또는 응고시키고 압출기 속에서 물을 배출시킴으로써 분리할 수 있다. 이어서, 중합체는 바람직하게는 유기 용매 속에서 용해시키고, 바람직하게는 물에 대한 다중 투석에 의해 정제하고, 건조, 바람직하게는 동결 건조시킬 수 있다.
언급할 수 있는 중합 개시제의 예로는 아조 화합물, 예를 들면, 2,2'-아조비스(이소부티로니트릴) 또는 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴), 산화환원 시스템, 예를 들면, 3급 아민과 퍼옥사이드와의 혼합, 또는 바람직하게는 퍼옥사이드이다[참조: H. Rauch-Puntigam, Th. Volker, "Acryl- und Methacrylverbindungen", Springer, Heidelberg, 1967 or Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 20 Vol. l, pages 386 et seq., J. Wiley, New York, 1978]. 적합한 퍼옥사이드 중합 개시제의 예는 디라우로일 퍼옥사이드, 3급 부틸 퍼옥토에이트, 3급 부틸 퍼이소노나노에이트, 디사이클로헥실 퍼옥시디카보네이트, 디벤조일 퍼옥사이드 또는 2,2-비스(3급 부틸퍼옥시)부탄이다.
이는 또한 반감기가 상이한 각종 중합 개시제, 예를 들면, 디라우로일 퍼옥사이드와 2,2-비스(3급 부틸퍼옥시)부탄의 혼합물을 사용하여 중합을 수행함으로써 중합 중에 일정한 유리 라디칼의 유량 및 상이한 중합 온도를 유지시키는 것이 가능하며 바람직하다. 사용되는 중합 개시제의 양은 일반적으로, 단량체 혼합물을 기준으로 하여, 0.01 내지 최대 1중량%이다.
공중합체(CP)의 분자량은 일반적으로, 단량체 혼합물을 기준으로 하여, 단량체 혼합물을 0.05 내지 15중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10중량%, 특히 바람직하게는 2 내지 12중량%의 양으로 사용하는 분자량 조절제, 예를 들면, 특히 이러한 목적을 위해 공지된 머캅탄(예: n-부틸 머캅탄, n-도데실 머캅탄, 2-머캅토에탄올 또는 2-에틸헥실티오글리콜레이트)의 존재하에 단량체 혼합물을 중합시켜 조절한다[참조: Rauch-Puntigam, Th. Volker, "Acryl- und Methacrylverbindungen", Springer, Heidelberg, 1967; Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Vol. XIV/1, page 66, Georg Thieme, Stuttgart, 1961 or Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Vol. 1, pages 296 et seq., J. Wiley, New York, 1978]. 바람직하게 사용되는 분자량 조절제는 n-도데실 머캅탄 또는 2-에틸헥실 티오글리콜레이트이다. 에틸헥실 티오글리콜레이트는 조절제가 말단의 분자 속에 포함되기 때문에 (메트)아크릴레이트 공중합체의 소수성이 영향받을 수 있다는 이점이 있다. 사용되는 바람직한 양은 도데실 머캅탄 5 내지 15중량% 또는 2-에틸헥실 티오글리콜레이트 2 내지 10중량%이다.
포접체/착체
pH 민감성 중합체는 약제학적으로 유효한 천연 또는 합성 생체분자 또는 약제학적 활성 성분과의 포접체 또는 착체의 형성시에 제공될 수 있다. 포접체 또는 착체는 판데르 바알스 힘, 이온 결합, 소수성 결합을 통해 화학 결합 또는 2급 원자가를 통해 가역적으로 또는 비가역적으로 공유결합하여 제조할 수 있다.
용도
pH 민감성 중합체는 엔도솜으로의 흡수 및 후속적인 불안정화 또는 이의 용해를 통해 세포 안으로 방출되는 천연 또는 합성 생체분자 또는 약제학적 활성 성분용 담체, 포접체/착체로서 사용될 수 있다.
pH 민감성 중합체는 착화에 사용될 수 있거나, 지질, 단백질, 펩티드, 핵산(DNA 및 RNA), 특히 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, 플라스미드 DNA, 뉴클레오타이드, 호르몬, 옥소, 면역독소, 항체 또는 이의 분획물 또는 약제학적 활성 성분과의 포접체로서 사용될 수 있다. 착화 또는 포접체 형성은 화학 결합에 의해 또는 판 데르 바알스 힘, 이온 결합, 소수성 결합을 통한 2급 원자가를 통해 가역적으로 또는 비가역적으로 공유결합시킬 수 있다. 생성된 착체는 약제 형태, 특히 피부, 경피, 비경구, 비강, 폐, 질 또는 경구 투여형 제조용 활성 성분으로서 사용할 수 있다.
pH 민감성 중합체 및 포접체는, 경우에 따라, 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 유액 및/또는 지질 소포 성분일 수 있다.
담체, 포접체/착체로서의 이의 용도는 진통제, 항알레르기제, 항류마티스제, 항생제, 감염 방지제, 항파킨슨제, 항건선제, 항종양제, 피부병제, 통풍 치료제, 면역 조절제, 위장관제, 향신경 제제, 안과 제제, 세포성장 억제제의 활성 성분 그룹으로부터의 약제학적 활성 성분용으로 가능하고 바람직하다.
가능한 질병:
암, 감염 질환(HIV 포함), 심혈관 질환(예: 아테롬성 동맥경화증), 관절염, 신경 퇴행성 질환(파킨슨병, 다발성 경화증, 알쯔하이머병), 유전학적으로 연관된 효소 결핍성 질환, B형 및 C형 간염, 낭포성 섬유증(mucoviscidosis), 저콜레스테롤혈증, 다운 증후군, 근위축증, 자가면역 질환, 대상포진 및 포진, 건선, CMV 망막염, 크론병, 궤양성 대장염, 당뇨병.
본 발명의 목적을 위해 사용되는 의약 물질은 사람 또는 동물 소체의 위 또는 속에 사용되어 다음을 수행하는 것으로 생각된다:
1. 질병, 질환, 신체 손상 또는 병리학적 증상의 치료, 경감, 억제 또는 진단하는 것.
2. 육체 또는 정신 상태의 질환, 상태 또는 기능을 밝히는 것.
3. 사람 또는 동물 소체에 의해 생산된 활성 물질 또는 체액을 치환하는 것.
4. 해로운 병원균, 기생충 또는 외인성 물질을 피하거나, 제거하거나 정제하는 것.
5. 육체 또는 정신 상태의 질환, 상태 또는 기능에 영향을 주는 것.
사용되는 의약 물질은, 예를 들면, 로트 리스트(Rote Liste) 또는 머크 인덱스(Merck Index)와 같은 참고 문헌에서 발견될 수 있다.
특정한 언급은 활성 성분 암모페리신 B, 시토신 아라본시드 아드리아마이신으로 제조해야 한다. 아드리아마이신의 리포좀 형태는 또한 우수한 모델이 될 수 있는데, 이는 엔도솜에서의 이의 신속한 방출이 다중 약 저항을 극복하는 데 사용될 수 있기 때문이다. 기타 유용한 활성 성분은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 플라스미드 DNA 및 펩티드(류프롤리드, 칼시토닌 등)일 수 있다.
약제 형태는, 예를 들면, 종양, 심혈관 질환 또는 류마티스 관절염의 치료에 사용할 수 있다. 본 발명에 따르는 pH 민감성 중합체를 적절한 양제 형태의 성분으로서 사용한 유전 질환의 유전자 치료 또는 이러한 질환의 예방 치료는 마찬가지로 앞으로 생각할 수 있다. 핵산을 생존 세포에 운반하기 위한 바이러스 시스템에 비하여, 비바이러스 시스템은 보다 용이하게 제조할 수 있으며 벡터의 복제가 수반되지 않으며 면역학적 반응의 위험성이 낮다는 전반적인 이점이 있다.
특성의 변경
(a) 기타 분자들을 결합함에 의한 구조의 영향
적혈구 및/또는 대식세포형 세포 또는 이의 물리적인 특성에 대한 (메트)아크릴레이트 공중합체의 특성, 예를 들면, 독성 또는 막 활성은 기타 분자들, 특히 구조-변형제, 예를 들면, 염료, 특히 소수성 염료, 예를 들면, 로다민 B와의 공유결합 또는 2급 원자가 커플링에 의해 조절될 수 있다. 카복실 그룹 함유 (메트)아크릴레이트 공중합체에 적합한 커플링 방법은 숙련가에게 공지되어 있다.
예를 들면, 메타크릴산 단위 25 내지 65중량%와
(메트)아크릴산의 C1-C12-알킬 에스테르 단위 75 내지 35중량%로 이루어지며
염료, 특히 소수성 염료, 특히 로다민 B로 조절되거나 충전된 (메트)아크릴레이트 공중합체를 수득하는 것이 가능하다.
메타크릴산 단위 40 내지 60중량%와
에틸 아크릴레이트 단위 60 내지 40중량%로 이루어지며
염료, 바람직하게는 특히 소수성 염료, 보다 특히 로다민 B로 조절된 (메트)아크릴레이트 공중합체가 바람직하다.
공중합체 분자 5 내지 100%, 바람직하게는 5 내지 20%를 염료 분자와 커플링시키는 이론적으로 측정한 커플링 비율이 바람직하다.
커플링은, 예를 들면, 용해도 특성이 개질될 수 있다는 이점이 있다. 예를 들면, pH 6.5 이하의 영역, 예를 들면, pH 6.0 내지 pH 5.0의 영역에서 불용성이 급상승하는 것이 바람직하다(실시예 6 참조).
(b) 분자내 가교결합에 의한 착체의 제조
(메트)아크릴레이트 공중합체의 카복실 그룹은 화학적 반응성이 있으며 분자내 가교결합에 의해 착체를 제조함으로써 개질시키는 데 안정하다. 따라서, 예를 들면, SH 그룹은 NH2-CH2-CH2-SH가 갖는 화학적 개질에 의해 (메트)아크릴레이트 공중합체로 비교적 용이하게 도입될 수 있다.
COOH-CH2-Ch2-SH에 의해 핵산의 5'- 및 3'- 말단 OH 그룹을 통해 SH 그룹을 DNA 및 RNA, 특히 올리고뉴클레오티드, 안티센스 DNA 또는 안티센스 RNA로 도입하는 것은 마찬가지로 용이하다.
SH-개질된 (메트)아크릴레이트 공중합체 및 SH-개질된 핵산은 S-S 브릿지를 형성함으로써 가교결합되어 착체를 형성할 수 있다. 분자량의 증가 및 감소된 용해도에 의해 착체를 과립 형태, 특히 대식세포로 얻을 수 있으며, 이는, 예를 들면, (자가)면역 질환과 같은 특정한 병리학적 상태의 치료시 유용할 수 있다.
생체내 이설파이드 브릿지의 감소로 활성 형태의 운반된 분자를 방출시킬 수 있다. 착체는 또한 적절한 표적 리간드를 그라프팅한 후에 기타 세포 유형에 의해 내재화할 수 있다.
본 발명에 따르는 중합체는 활성 성분과 혼합하여 사용하며 대체로 미립인 약제 운반 시스템을 형성한다. 이러한 목적을 위해 활성 성분을 생분해성 스페이서를 통해 중합체에 결합시키는 것이 가능하다. 그러나, 양이온성 저분자량의 포접체/착체 또는 중합체성 물질 및 약리학적 활성제가 바람직하다. 리포펙틴, 폴리리신, 폴리에틸렌이민, 폴리아미노(메트)아크릴레이트 또는 스퍼민 및 스퍼미딘, 및 이들의 유도체와 같은 양이온성 지질이 언급되어야 한다. 이러한 착체는 또한 양이온성 또는 음이온성 리포좀일 수 있다. 중합체 및 활성제는 또한 양이온성, 음이온성 또는 중성 리포좀 속으로 캡슐화되거나 이들과 결합될 수 있다.
그 자체로 공지된 착화제(예: 폴리에틸렌이민)는 각종 방식으로 작용 증진 효과를 나타낼 수 있다.
추가의 착화제 성분은 친수성 중합체(폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리사카라이드 및 이들의 유도체)일 수 있다. 이러한 물질은 혈액 성분과 상호작용함으로써 활성 성분을 보호하며 혈액 속에서의 순환을 지연시킨다.
표적 리간드, 예를 들면, 세포 특이성 항원에 대한 항체는 세포 특이성 표적화에 사용할 수 있다.
미립 방출 시스템은 종래의 기술에 의해, 예를 들면, 용액 속에서의 직접 착화, 지질 함유 용액의 건조 및 수중 재분산에 의해, 경우에 따라, 초음파 또는 균질화를 사용하여 생산될 수 있다.
약제 형태의 성분은 의도하는 용도의 통상의 기술에 상응하며 허용되는 치료법에 의해 안전하다. 이 안전성은 동결건조 또는 분무건조에 의해 약제 형태를 증량시킬 수 있다.
실시예
1. 실시예 1 내지 7의 공중합체
공중합체 A:
메타크릴산 50중량%와
메틸 메타크릴레이트 50중량%와의 공중합체.
중량평균 분자량(MW) 약 25,000.
공중합체 B:
메타크릴산 50중량%와
에틸 아크릴레이트 50중량%와의 공중합체.
중량평균 분자량(MW) 약 25,000.
공중합체 C:
메타크릴산 30중량%,
에틸 아크릴레이트 35중량% 및
메틸 아크릴레이트 35중량%와의 공중합체.
중량평균 분자량(MW) 약 25,000.
공중합체 D:
메타크릴산 30중량%와
메틸 메타크릴레이트 70중량%와의 공중합체.
중량평균 분자량(MW) 약 25,000.
공중합체 E (본 발명에 따르지 않음)
메타크릴산 10중량%,
메틸 메타크릴레이트 45중량% 및
메틸 아크릴레이트 45중량%와의 공중합체.
중량평균 분자량(MW) 약 25,000.
공중합체 L-100 [유드라깃(EUDRAGIT)R L, 본 발명에 따르지 않음]
메타크릴산 50중량%와
메틸 메타크릴레이트 50중량%와의 공중합체.
중량평균 분자량(MW) 약 100,000.
공중합체 L-100-55 (유드라깃R L100-55, 본 발명에 따르지 않음)
메타크릴산 50중량%와
에틸 아크릴레이트 50중량%와의 공중합체.
중량평균 분자량(MW) 약 250,000.
공중합체 S-100 (유드라깃R S100, 본 발명에 따르지 않음)
메타크릴산 30중량%와
메틸 메타크릴레이트 70중량%와의 공중합체.
중량평균 분자량(MW) 약 100,000.
실시예 1:
pH 전이 범위(용해성에서 불용성)
본 발명은 인산염 완충액 속에서 pH 값 3.0 내지 7.5에서 35℃에서 산란광을 측정함으로써 공중합체가 불용성 형태로 존재하는가를 연구하는 것이다. 산란광의 강도는 중합체가 침전함에 따라 증가한다.
결과는 다음 표 1에 기재한다.
결과
(메트)아크릴레이트 공중합체는 공중합체 E를 제외하고는 pH 단위 0.4 내지 0.7의 전이 범위가 상대적으로 좁다.
공중합체 E는 카복실 그룹 잔기를 갖는 단량체의 함량이 10%중량로 낮기 때문에 pH 단위 2.5의 pH 전이 범위가 넓다.
분자량은 공중합체의 용해도 특성에 대해 실질적으로 영향이 없음을 나타낸다.
실시예 2:
pH 7.4에서의 농도 의존성 용혈 활성
사람 적혈구를 사용한 세포독성 시험은 문헌[참조: Murthy et al., N. Murthy, J. R.Robichaud, D.A. Tirrell, P.S. Stayton, The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. J. Controlled Release, 61: 137-143 (1999)]에 근거한 방법으로 수행하였다.
이는 사람 적혈구(RBC)를 K3 EDTA의 존재하에 원심분리시켜 분리시킨다. 사람 적혈구는 200g 및 4℃에서 5분 동안 침강시키고, 후속적으로 원심분리를 재개하고 인산염 완충 식염수[PBS 완충액, 34mM, pH 7.4, 0.9% NaCl중량/용적(75mM)] 속에서 용해시켜 3회 세척한다. 생성된 현탁액 속에서 계수한 적혈구는 혈구계를 사용하여 측정할 수 있다.
용혈 시험은 사람 적혈구(RBC)를 세포 농도 1 ×108RBC/ml에서 특정 매질 속에서 공중합체 현탁액에 가함으로써 수행한다. 이 혼합물은 37℃에서 20분 동안 배양한다. 용혈 정도는 541nm의 원심분리 상청액 속에서 용해된 세포로부터 방출시킨 헤모글로빈을 분광 측정함으로써 측정한다.
결과는 다음 표 2에 기재한다.
결과:
공중합체 B 및 C는 500㎍/ml에서 위쪽으로 pH 7.4에서 용혈 활성이 5% 이상(독성 역치)이다. 공중합체 B, C, D 및 E의 용혈 활성은 2,500㎍/ml에서 5% 이상이다. 공중합체 B의 용혈 활성은 이 경우에 공중합체 C 및 D의 용혈 활성보다 낮다.
공중합체 A, L-100, L-100-55 및 S-100은 10,000㎍/ml 이하의 고농도에서도 용혈 활성이 없다. 공중합체 L-100-55는 분자량 문제만 뺀다면 공중합체 B와 동일하며, 공중합체 E는 10,000㎍/ml에서 용혈 활성이 미미하다.
공중합체 A 및 B는 메타크릴산 함량이 50중량%로 동일하며 공단량체 - 각각 메틸 메타크릴레이트 및 에틸 아크릴레이트 속에서만 상이하다. 다소의 추가의 소수성 공중합체 B는 250㎍/ml에서도 용혈성이 있다. 반면, 공중합체 A는 10,000㎍/ml에서도 용혈성이 없다.
실시예 3:
pH 5.0 및 pH 5.5에서 상이한 농도에서 공중합체 B 및 C의 용혈 효과
결과는 다음 표 3에 기재한다.
결과:
공중합체 B는 pH 5.0 및 pH 5.5에서, 특히 25 내지 50㎍/ml의 저농도에서 공중합체 C보다 용혈성이 크다. 이러한 두 가지 공중합체는 pH 5.5 및 150㎍/ml에서 활성이 보다 크다.
공중합체 L-100-55는 이의 고분자량으로 인해 공중합체 B와는 상이하다. 공중합체 B의 용혈 활성은 pH 5.5 및 100㎍/ml에서 뿐만 아니라 pH 5.0 및 pH 5.5에서 25㎍/ml 및 50㎍/ml에서 공중합체 L-100-55의 용혈 활성보다 크다.
실시예 4:
150㎍/ml 및 각종 pH 값의 공중합체 농도에서의 용혈 효과
결과는 다음 표 4에 기재한다.
결과:
공중합체 B, C 및 L 100-55는 pH 범위 5.5 내지 6.0에서 농도 150㎍/ml에서 용혈 활성이 크다. 모든 공중합체는 공단량체로서 에틸 아크릴레이트를 함유한다. 그러나, L 100-55의 MW는 도포용으로는 너무 높다.
실시예 5:
본 발명은 대식 세포 유형에 대한 공중합체의 효과를 연구하려는 것이다. 세포 용해가 주로 공중합체와 외부 세포막과의 상호작용을 통해 발생할 수 있는 적혈구와는 달리, 대식 세포 유형은 공중합체를 활성적으로 흡수할 수 있으므로, 기타 상호작용은 이 경우에 세포용해 또는 기타 독성 효과를 유발할 수 있는 것으로 추측된다. 세포용해 또는 기타 독성 효과의 측정이 비교적 부정확하므로, 다음의 두 가지 시험 시스템을 결합한다: 세포 증식에 접근하는 MTT 검정 및 세포 괴사에 접근하는 LDH 검정(생존 세포용 MTT 시험 및 사멸 세포용 LDH).
MTT 시험
MTT 시험(대식세포 유형 세포주의 세포증식 억제).
비식계 시험은 생존 세포를 검출하며 이는 황색 MTT 염료를 암청색 포마잔 생성물로 감소시킨다. 이 시험은 세포독성, 세포 증식 및 세포 활성화를 검출하는 데 적합하다[참조: T. Mosmann. Rapid calorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Meth. 65: 55-63 (1983)].
J 774 마우스 대식세포 유형 세포는 소 태아 혈청(56℃에서 예비처리, 30분) 10용적/용적% 및 페니실린 G 100U/ml 및 스트렙토마이신 100㎍/ml를 함유하는 DAEM 배지 속에서 현탁시킨다. 대식세포 유형 세포는 96웰 미세역가 플레이트 속에 세포를 5 ×103개 함유하는 100㎕ 분획물 속에 분배시키고 37℃에서 24시간 동안 5% CO2를 함유하는 H2O 포화 대기하에 배양한다. 멸균 공중합체 용액 20㎕를 인산염 완충액 속에 가하고, 일련의 희석액 0.5 내지 0.003125mg/ml를 수행한다(대조군은 공중합체의 부재하에 인산염 완충액을 수취한다). 48시간 동안 계속 배양한다.
인산염 완충액(5mg/ml) 중의 멸균 MTT 용액[MTT = 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드] 10㎍을 각각의 웰에 위치시키고, 37℃에서 추가로 3시간 동안 배양한다. 이어서, 10중량/용적% 나트륨 도데실 설페이트 용액 100㎕를 0.01M HCl 속에 가하여 감소된 MTT를 용해시킨다. 570nm에서의 흡수율은 24시간 후에 분광계로 측정하고, 공중합체를 첨가하지 않고 대조 시험에서 100% 생존율에 관하여 평가한다.
LDH 시험
측색계 시험은 사멸 세포에 의해 방출시킨 락테이트 탈수소효소(LDH) 활성을 검출한다. 이 시험은 미세역가 플레이트 속에서 J774 세포를 사용한 MTT 시험과 유사하게 수행한다. 48시간 배양한 후, 상청액 4㎕ 분획물을 시판되는 LDH 시험 키트를 사용하여 LDH 활성을 시험한다. 공중합체를 첨가하지 않고 대조 실험에서의 100% 세포용해(독성)에 관하여 평가를 수행한다. 100% 평가는 이 경우에 완전한 세포용해를 위해 트리톤 X-100의 존재하에 세포 표본을 배양한 후에 측정한다.
결과는 다음 표 5에 기재한다.
MAA = [중량%] 메타크릴산
MMA = [중량%] 메틸 메타크릴레이트
EA = [중량%] 에틸 아크릴레이트
MA = [중량%] 메틸 아크릴레이트
결과:
MTT 시험 및 LDH 시험에서 수득한 측정치는 정성적으로 허용된다. 공중합체 B는 저농도에서도 J774에 대한 독성이 가장 크다. 공중합체 A 및 D에 대해서는 독성 효과가 검출되지 않으며, 이는 실시예 4에서 적혈구의 용혈 현상을 제한하게 하여 농도 0.5mg/ml에서 J774 세포에 대한 독성이 있음을 입증한다. 공증합체 C는 농도 0.5mg/ml에서 J774 세포에 대한 독성이 미미함을 입증한다.
실시예 6
공중합체 A 내지 E의 pH 의존성 형태 변화(전이)
피렌 형광성
형광 염료 피렌을 사용하여 상이한 pH 값에서 pH 민감성 중합체의 전이를 수행한다[참조: K. Kalyanasundaram and J.K. Thomas. Environmental effects on vibronic band intensities in pyrene monomer fluorescence and their application in studies of micellar systems. A. Am. Chem. soc. 99: 2039-2044 (1977)].
소수성 코일형 구조(코일)로부터 소수성 소구체 구조로의 전이는 방출 스펙트럼(I1/I3 비율)을 제1 피크(372nm)의 비율 및 제3 피크(383nm)의 비율의 감소와 연관시킨다. 측정을 위해, 피렌을 공중합체 용액에 단순히 첨가한다.
결과는 다음 표 6에 기재한다.
결과:
공중합체 A 및 B(메타크릴산 50중량%)는 pH 7.4 내지 pH 5.5의 전이가 가장 뚜렷하며, 공중합체 C 및 D(메타크릴산 30중량%)의 전이도 뚜렷하다. 공중합체 E(메타크릴산 10중량%)는 전이 특성을 실질적으로 나타내지 않는다. 전이 특성은 공중합체의 메타크릴산 함량과 상관관계를 나타내지만, 공중합체의 용혈 활성과는 상관관계가 없다(참조: 실시예 2 및 4).
실시예 7
공중합체 B와 염료 리자민(Lissamine)R(로다민 B)과의 커플링
이 시험은 다음과 같은 변경하에 문헌[참조: K. Abdellaoui, M. Boustta, M. Vert, H. Morgani, M. Manfait. (1998) Eur J Pharm Sci 6, 61-73]에 기재한 바와 같이 수행한다. 카복실 그룹-활성화제 N-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2-디하이드로퀴놀린(EEDQ)은 1,3-디이소프로필카보디이미드(DIPC)에 의해 대체된다. 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP) 및 틜에틸아민은 촉매량으로 첨가한다. 이 반응은 4일 동안 수행한다.
공중합체 B 250mg을 미리 증류시킨 테트라하이드로푸란(THF) 1ml 속에 용해시킨다. 이어서, 1,3-디이소프로필카보디이미드(DIPC) 0.5mg/ml(3 ×10-3mmol)를 가하여 카복실 그룹을 활성시킨다. 30분 후, 촉매량의 트리에틸아민, 4-(디메틸아미노)피리딘 및 리자민R 로다민 B의 촉매량 에틸렌디아민을 무수 N,N-디메틸포름아미드 속에 용해시킨다. 반응 혼합물을 아르곤하에 암실에서 실온에서 96시간 동안 배양한다.
반응 혼합물을 0.2㎛들이 필터로 통과시켜 부산물로 침전된 DIPC를 제거한다. 존재하는 THF를 진공하에 박리시킨다. 여전히 THF를 함유하는 조악한 생성물에 클로로포름/메탄올(85/15용적/용적)의 혼합물을 가하고, 용액을 실리카 겔 칼럼에 용출시켜 유리 로다민을 제거한다. 이 경우의 용출 과정을 박막 크로마토그라피로 모니터링한다. 적절한 분획물을 합하고, 용매를 진공하에 박리시킨다. 잔사를 THF 속에 용해시키고, 3,500달톤의 막을 사용하여 3일 동안 물/메탄올(50/50)에 대해 투석시켜 비공유결합적으로 결합된 로다민 B의 잔사를 제거한다. pH 9의 인산염 완충액에 대해 2일 동안 계속 투석하고, 추가로 2일 동안 증류수에 대해 투석한다. 생성된 생성물은 72시간 동안 동결건조시킨다.
공중합체에서 로다민 B의 함량은 실온에서 메탄올 속에서 분광형광측정법으로 측정한다(λexc = 560nm, λem = 580nm).
크림슨 착색된 공중합체의 수율은 83%이다. 로다민 B의 결합력은 0.04mol%인 것으로 밝혀졌으며, 이는 이론적으로 9개의 공중합체 분자 중의 1개가 로다민 분자에 결합됨을 의미한다.
로다민 B와 결합되지 않은 공중합체 B와 비교하여 각종 PH 값에서 용해도 특성을 시험하고자 한다.
결과는 다음 표 7에 기재한다.
결과:
공중합체 B에 결합되는 로다민은 용해도 특성에 뚜렷한 변화를 가져온다. 급경사는 약 pH 5.6에서 일어나며, 100% 불용성은 pH 5.3에서 일어난다. 이와는 반대로, 결합되지 않은 공중합체 B는 pH가 4.2로 될 때까지 100% 불용성을 나타내지 않는다. 이러한 구역의 증가는 약 pH. 5.3에서 분명하게 경사가 줄어든다.
실시예 8
제조공정: 하나의 실시예는 제조공정 1 및 2 각각에 제공된다. 이러한 비율의 양은 표 38에 기재한 바와 같이 다양할 수 있다.
중량평균 분자량(Mw)은 DMF(디메틸포름아미드) 속에서 25℃에서 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA)의 점도에 관하여 점도 ηspec/c(cm3/g)의 측정치로부터 대략적으로 계산할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 다음의 실험적으로 발견된 수학식 1을 사용한다:
제조공정 1
증류수 20g 속에 용해시킨 증류수 1,430g, 나트륨 라우릴 설페이트 3.78g, 폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노올레에이트 12.6g 및 암모늄 퍼옥소디설페이트 1.26g을 환류 콘덴서, 교반기 및 공급 용기가 구비되어 있는 2l 용량의 반응 용기 속으로 도입시킨다. 81℃에서 에틸 아크릴레이트 270g, 메타크릴산 270g 및 2-에틸헥실 티오글리콜레이트 27g으로 이루어진 단량체 혼합물을 2.5시간에 걸쳐서 용액 속으로 계량도입한다.
공급을 완료한 후, 혼합물을 81℃에서 추가로 2시간 동안 유지시키고, SE-2MC 실리콘 소포제 유액 0.176g과 증류수 10g과의 혼합물을 가하고, 증류수 95.42g을 약 300mbar하에 진공하에 박리시켜 제거하고, 실온으로 냉각시킨다. 분산액의 고체 함량은 30%이다.
제조 공정 2
증류수 10g 속에 용해시킨 증류수 774g, 나트륨 라우릴 설페이트 1.092g 및 나트륨 퍼옥소디설페이트 1.4g을 환류 콘덴서, 교반기 및 공급 용기가 구비되어 있는 2l 용량의 반응 용기 속으로 도입시킨다. 75℃에서 메틸 아크릴레이트 390g, 메틸 메타크릴레이트 150g, 메타크릴산 60g, 나트륨 라우릴 설페이트 1.008g, 폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노올레에이트 7g, 2-에틸헥실 티오글리콜레이트 30g 및 증류수 820.99g으로 이루어진 유액을 4시간에 걸쳐서 용액 속으로 계량도입한다.
공급을 완료한 후, 혼합물을 75℃에서 추가로 2시간 동안 유지시키고, SE-2MC 실리콘 소포제 유액 0.21g과 증류수 10g과의 혼합물을 가하고, 증류수 120g을 약 300mbar하에 박리시켜 제거하고, 실온으로 냉각시킨다. 분산액의 고체 함량은 30%이다.

Claims (17)

  1. 분자량 범위가 1,000 내지 50,000g/mol이고, 사람 적혈구를 사용한 세포독성 시험에서 농도 150㎍/ml에서의 용혈이 pH 5.5에서는 약 60% 이상으로 일어나며 pH 7.4에서는 5% 이하로 일어남을 특징으로 하는, 메타크릴산 단위 20 내지 65중량%와 (메트)아크릴산의 C1-C18알킬 에스테르 단위 80 내지 35중량%로 이루어진 (메트)아크릴레이트 공중합체인 pH 민감성 중합체.
  2. 제1항에 있어서, 메타크릴산 단위 40 내지 60중량%와 에틸 아크릴레이트 단위 60 내지 40중량%로 이루어진 (메트)아크릴레이트 공중합체임을 특징으로 하는, pH 민감성 중합체.
  3. 제1항에 있어서, 메타크릴산 단위 20 내지 40중량%, 메틸 아크릴레이트 단위 25 내지 45중량% 및 에틸 아크릴레이트 단위 25 내지 45중량%로 이루어진 (메트)아크릴레이트 공중합체임을 특징으로 하는, pH 민감성 중합체.
  4. 제1항에 있어서, 메타크릴산 단위 40 내지 60중량%, 에틸 아크릴레이트 단위 60 내지 30중량% 및 부틸 메타크릴레이트 2 내지 20중량%로 이루어진 (메트)아크릴레이트 공중합체임을 특징으로 하는, pH 민감성 중합체.
  5. 제1항에 있어서, 메타크릴산 단위 40 내지 60중량%, 에틸 아크릴레이트 단위 60 내지 40중량% 및 아크릴산 또는 메타크릴산의 C8-C16-알킬 에스테르 단위 0.1 내지 2중량%로 이루어진 (메트)아크릴레이트 공중합체임을 특징으로 하는, pH 민감성 중합체.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 농도 0.03125mg/ml에서, 대조 실험에서의 100% 생존율을 기준으로 하여, 마우스 대식세포형 세포 유형 J774A.1(ATCC TIB-67)을 사용한 MTT 시험에서 세포 생존율 값(%)이 25% 이상임을 특징으로 하는, pH 민감성 중합체.
  7. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 농도 0.03125mg/ml에서, 대조 실험에서의 100% 세포용해성(독성)을 기준으로 하여, 마우스 대식세포형 세포 유형 J774A.1(ATCC TIB-67)을 사용한 LDH 시험에서 LDH 방출값이 40% 이하임을 특징으로 하는, pH 민감성 중합체.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 유효한 천연 또는 합성 생체분자 또는 약제학적 활성 성분과의 포접체(conjugate) 또는 착체 형태임을 특징으로 하는, pH 민감성 중합체.
  9. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 형태 변형제에 커플링됨을 특징으로 하는, pH 민감성 중합체.
  10. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 화학적 개질 후에 핵산을 통해 가교결합된 착체 성분임을 특징으로 하는, pH 민감성 중합체.
  11. 중합 개시제 및 분자량 조절제의 존재하에 블럭 중합, 비드 중합 또는 유화 중합, 그룹 전이 중합(GTP), 원자 전이 라디칼 중합(ATRP) 및 중합체의 방출에 의해 단량체를 자유 라디칼 중합시킴으로써 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따르는 pH 민감성 중합체를 제조하는 방법에 있어서,
    중합체를 용해시키고, 정제한 다음, 건조시킴을 특징으로 하는, pH 민감성 중합체의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서, 도데실 머캅탄 및/또는 2-에틸헥실 티오글리콜레이트가 분자량 조절제로서 사용됨을 특징으로 하는 방법.
  13. 천연 또는 합성 생체분자 또는 약제학적 활성 성분과의 담체, 포접체 또는 착체로서, 경우에 따라, 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 유액 및/또는 지질 소포체 성분으로서의 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따르는 pH 민감성 중합체의 용도.
  14. 제13항에 있어서, 지질, 단백질, 펩티드, 핵산(DNA 및 RNA), 특히 올리고뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드, 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, 뉴클레오타이드, 독소, 면역독소, 항체 또는 이의 분획물, 또는 이들의 혼합물과 혼합시킨 담체, 포접체 또는 착체로서의 용도.
  15. 제13항에 있어서, 진통제, 항알레르기제, 항류마티스제, 항생제, 감염 방지제, 항파킨슨제, 항건선제, 항종양제, 피부병제, 통풍 치료제, 면역 조절제, 위장관제, 향신경 제제, 안과 제제 및 세포성장 억제제의 활성 성분 그룹으로부터의 약제학적 활성 성분과 혼합시킨 담체, 포접체 또는 착체로서의 용도.
  16. 피부, 경피, 비경구, 비강, 폐, 질 또는 경구 투여형의 성분으로서의 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따르는 pH 민감성 중합체의 용도.
  17. 제16항에 있어서, 암, 감염 질환(HIV 포함), 심혈관 질환(예: 아테롬성 동맥경화증), 관절염, 신경 퇴행성 질환(파킨슨병, 다발성 경화증, 알쯔하이머병), 유전학적으로 연관된 효소 결핍성 질환, B형 및 C형 간염, 낭포성 섬유증(mucoviscidosis), 저콜레스테롤혈증, 다운 증후군, 근위축증, 자가면역 질환, 대상포진 및 포진, 건선, CMV 망막염, 크론병, 궤양성 대장염 및 당뇨병 치료용 약제 형태에서의 용도.
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