BRPI0215731B1

BRPI0215731B1 - polímero sensível ao ph, seus usos e seu processo de preparação

Info

Publication number: BRPI0215731B1
Application number: BRPI0215731-4A
Authority: BR
Inventors: Meier Christian; Petereit Hans-Uirich; Leroux Jean-Christophe; Schultes Klaus; Yessine Marie-Andrée
Original assignee: Evonik Roehm Gmbh; Roehm Gmbh; Univ Montreal
Priority date: 2002-04-30
Filing date: 2002-10-22
Publication date: 2018-09-18
Also published as: ATE553780T1; US7879966B2; AU2002350592A1; EP1499358A1; IL163584A0; WO2003092732A1; JP2005531649A; KR20050025164A; US20060281887A1; BR0215731A; CA2480273A1; AU2002350592A8; EP1499358B1; ES2386422T3; JP5021160B2; CA2480273C; US7553918B2; IL163584A; DE10220470A1; BRPI0215731B8

Abstract

"polímero sensível ao ph". a presente invenção refere-se a um polímero sensível ao ph, o qual é um copolímero de (met)acrilato composto de 20 a 65% em peso de unidades de ácidos acrílico e/ou metacrílico e 80 a 35% em peso de unidades de ésteres c~ 1~-a c~ 18~-alquílicos de ácido (met)acrílico, caracterizado pelo fato de que ele tem um peso molecular na faixa de 1 000 a 50 000 g/mol, e ocasiona pelo menos 60 % de hemólise em ph 5,5, e menos do que 5% de hemólise em ph 7,4, em uma concentração de 150 <109>g/ml em um teste de citoxicidade com as células sangüíneas vermelhas humanas. a invenção adicionalmente relaciona-se ao uso do polímero sensível ao ph como veículo para biomoléculas farmaceuticamente efetivas ou ingredientes farmacêuticos ativos e como ingrediente de formas de dosagem correspondentes.

Description

(54) Título: POLÍMERO SENSÍVEL AO PH, SEUS USOS E SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO (51) Int.CI.: A61K 9/00; A61K 47/32 (30) Prioridade Unionista: 07/05/2002 DE 102 20 470.5, 30/04/2002 DE 102 19 505.6 (73) Titular(es): UNIVERSITÉ DE MONTREAL. EVONIK ROHM GMBH (72) Inventor(es): HANS-UIRICH PETEREIT; CHRISTIAN MEIER; KLAUS SCHULTES; MARIEANDRÉE YESSINE; JEAN-CHRISTOPHE LEROUX (85) Data do Início da Fase Nacional: 03/11/2004

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para POLÍMERO SENSÍVEL AO pH, SEUS USOS E SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO.

A presente invenção refere-se a um polímero sensível ao pH, o qual tem propriedades citotóxicas ou membranolíticas em valores de pH abaixo de pH 6,5 e que pode ser usado como veículo para biomoléculas naturais ou sintéticas ou ingredientes farmacêuticos ativos.

Técnica Anterior

Os polímeros que respondem a estímulos têm aumentado de importância nos anos recentes. Tais polímeros mostram propriedades modificadas após a exposição a uma influência química ou física, tal como, por exemplo, para mencionar somente algumas, a temperatura, o solvente ou o pH. Há interesse particular com relação a isto em polímeros sensíveis ao pH. Assim, por exemplo, os polímeros contendo grupos carboxila, que formam estruturas espirais hidrofílicas em alto pH, podem ser convertidos, quando a valores de pH baixos, nas estruturas de glóbulos hidrofóbicas (ver, por exemplo, (1)).

A pesquisa está focada em polímeros sensíveis ao pH em conexão com a administração de substâncias medicinais. Muitos processos fisiológicos e patológicos, tais como a endocitose, o crescimento de tumores e as inflamações, estão associados com uma mudança nas condições de pH. Os exemplos de polímeros sensíveis ao pH que estão sendo investigados em conexão com a administração de substâncias medicinais são, por exemplo, os ácidos a-alquilacrílicos, tais como o poli(ácido 2etilacrílico) e o poli(ácido propilacrílico) (ver 2), as poli(amido aminas) (ver 3, 4) e a poli(etilenimina), a poli(L-lisina isoftalamida) (ver (5)). As mudanças conformacionais induzidas por modificações no pH influenciam as interações do polímero com as membranas celulares em um modo tal que pode ocorrer uma desestabilização. É possível empregar, formar complexos ou conjugar polímeros sensíveis ao pH como um meio para o transporte com um grande número de biomoléculas naturais ou sintéticas. Eles podem ser formados por complexos com os lipídios ou conjugados com estes (ver 6, 7, 8, 14), com as proteínas e os peptídeos (ver 9, 10), com o DNA (4, 11), com as imunotoxi7/15 »········«

ΙΜ

nas (12), com os anticorpos (13) e/ou com os ingredientes ativos (3).

Lista da literatura citada acima

1. M. Watanabe, Y. Kosaka, K. Sanui, N. Ogata, K. Ogushi, and T. Yoden. On the mechanism of polyelectrolyte-induced structural reorganization in thin molecular films. Macromolecules, 20: 454-456 (1987).

2. N. Murthy, J.R. Robichaud, D.A. Tirrell, P.S. Stayton, and S. Hoffmann. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. J. Controlled Release, 61:137-143 (1999).

3. R. Duncan, P. Ferruti, D. Sgouras, A. Tuboku-Metzger, E. Ranucci, and F. Bignotti. A polymer-Triton X-100 conjugate capable of pHdependent red blood cell lysis: A model system illustrating the possibility of drug delivery within acidic intracellular compartments. J. Drug Targeting, 2: 341 -347 (1994).

4. S.C. Richardson, N.G. Pattrick. Y.K. Stella Man, P. Ferruti, and R. Duncan. Poly(amidoamine)s as potential nonviral vectors: ability to form interpolyelectrolyte complexes and to mediate transfection in vitro. Biomacromolecules, in press (2001).

5. M.E. Eccleston, M. Kuiper, F.M. Gilchrist, and N.K.H. Slater. pHresponsive pseudo-peptides for cell membrane disruption. J. Controlled Release, 69: 297-307 (2000).

6. T. Chen, L.S. Choi, S. Einstein, M.A. Klippenstein, P. Scherrer, and P.R. Cullis. Proton-induced permeability and fusion of large unilamellar vesicles by covalently conjugated poly(2-ethylacrylic acid). J. Liposome Res., 9: 387-405 (1999).

7. J.L. Thomas and D.A. Tirrell. Polyelectrolyte-sensitized phospholipid vesicles. Acc. Chem. Res., 35: 336-342 (1992).

8. X. Guo and F.C. Szoka Jr. Steric stabilization of fusogenic liposomes by a low-pH sensitive PEG-diortho ester-lipid conjugate. Bioconjugate Chem., 12: 291-300 (2001).

9. C.A. Lackey, N. Murthy, O.W. Press, D.A. Tirrell, A.S. Hoffmann, and P.S. Stayton. Hemolytic activity of pH-responsive polymer-streptavidin bioconjugates. Bioconjugate Chem., 10: 401-405 (1999).

• ············ ♦ · · · · • · · · · · ··· • ·· ·

10. V. Bulmus, Z. Ding, C.J. Long, P.S. Stayton, and A.S. Hoffman. Sitespecific polymer-streptavidin bioconjugate for pH-controlled binding and triggered release of biotin. Bioconjugate Chem., 11: 78-83 (2000).

11. P.S. Stayton, N. Murthy, C. Lackey, C. Cheung, R. To, O. Press, and A.S. Hoffman. Bioinspired polymers designed to enhance intracellular delivery of biotherapeutics. Proceed. Intern. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater., 27: 7330 (2000).

12. C.A. Lackey, N. Murthy, P.S. Stayton, O.W. Press, A.S. Hoffman, and D.A. Tirrell. Enhancement of endosomal release and toxic activity of ricin A chain by a pH-sensitive polymer. Proceed. Intern. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater., 26: 815-816 (1999).

13. C.A. Lackey, O.W. Press, A.S. Hoffman, and P.S. Stayton. pHsensitive polymer-protein complexes for control of intracellular trafficking of biomolecular therapeutics. Polym. Mater. Sei. Eng., 84 (2001).

14. K.M. Eum, K.H. Langley, and D.A. Tirrell. Quasi-elastic and electrophoretic light scattering studies of the reorganization of dioleoylphosphatidylcholine vesicle membranes by poly(2-ethyl-acrylic acid). Macromolecules, 22: 2755-2760. (1989).

O WO 97/09068 descreve conjugados moleculares interativos. Estes são, em particular, moléculas que respondem a um estímulo e que têm a capacidade de ligar-se a uma região-alvo celular, o estímulo, por sua vez, influenciando a capacidade de ligação. O estímulo pode ser dado pela temperatura, pH, íons ou forças iônicas particulares, campos elétricos ou solventes.

Uma molécula que responde a um estímulo pode ser, por exemplo, um polímero sensível ao pH que esteja combinado com uma molécula que se liga a um ligante, por exemplo um antígeno, um anticorpo ou um ingrediente farmacêutico ativo. O conjugado molecular é capaz de responder a condições ambientais alteradas, por exemplo à alteração do pH de valores acima de pH 7,0 na região dos fluidos corpóreos extracelulares, por exemplo na corrente sangüínea, para valores abaixo de pH 6,5, que está associado com a absorção nas células vivas, por exemplo por endocitose.

·»··········

Os polímeros mencionados de uma forma geral são baseados em monômeros do tipo vinila, os quais sofreram polimerização via radicais livres e têm pesos moleculares na faixa de 1 000 a 30 000. Os polímeros com grupos laterais reativos, por exemplo -OH, -COOH ou, preferivelmente, -NH₂, são sugeridos para as proteínas ou os peptídeos de ligação.

Os copolímeros de (met)acrilato compostos de unidades de ácido metacrílico e comonômeros, tais como os ésteres Ci- a Ci₂-alquílicos de ácido (met)acrílico, são conhecidos em princípio e são usados em particular como agentes de revestimento e aglutinantes para as formas de drogas.

Os exemplos conhecidos são os copolímeros compostos de 50% em peso de ácido metacrílico e 50% em peso de metacrilato de metila (EUDRAGIT® L), de 50% em peso de ácido metacrílico e 50% em peso de acrilato de etila (EUDRAGIT® L100-55), de 30% em peso de ácido metacrílico e 70% em peso de metacrilato de metila (EUDRAGIT® S). Os copolímeros comercialmente disponíveis têm pesos moleculares na região de cerca de 200 000 g/mol.

A US 2001/0007666 A1 descreve uma composição usada para aumentar o transporte ou a liberação de substâncias através das membranas celulares, entre as células, os compartimentos das células ou as membranas lipídicas. A composição consiste em um agente de transporte de membrana, o qual pode entre outras funções ser um polímero sensível ao pH, e meios físicos para aumentar a eficiência do agente de transporte de membrana, por exemplo o tratamento ultra-sônico. Os polímeros sensíveis ao pH particularmente adequados são os polímeros contendo grupos carboxila, por exemplo aqueles contendo mais do que 50% de resíduos de monômeros com grupos carboxila. Um exemplo específico mencionado é o poli(ácido 2-etilacrílico) com um peso molecular médio de 62 000. Os copolímeros a 50:50 de ácido acrílico com acrilatos de etila, propila e butila são também descritos. A preparação é estabelecida sendo feita por polimerização em massa na presença de um iniciador de AIBN. Os reguladores do peso molecular não são mencionados. Visto que os copolímeros são, além disso, purificados por precipitação com éter, os pesos moleculares devem

········ ···« • · · ··· · · • « · · · ·· · ·· · ser presumidos como sendo altos. Mesmo em baixas concentrações de alguns gg, os copolímeros quebram os eritrócitos extensivamente em pH 5,5 e, até uma menor proporção, em pH 7,4 pelo menos.

Problema e Solução

A introdução de biomoléculas ou ingredientes farmacêuticos ativos no citoplasma e dali possivelmente no núcleo da célula, via endossomas, requer agentes desestabilizadores da membrana (destruidores da membrana), os quais impedem que as substâncias trafeguem para os (entrem nos) lisossomos, onde elas podem ser quimicamente degradadas ou inativadas. Os polímeros de interesse, portanto, resultam na desestabilização (destruição) das membranas das células em valores de pH ligeiramente acídicos em torno de pH 6,5 ou abaixo, como predominam nos endossomas, porém são substancialmente destituídos de (não têm nenhum) efeito membranolítico nos valores de pH fisiológico em torno de pH 7,4, como ocorrem fora das células. Os copolímeros de ácido acrílico/acrilato de alquila da US 2001/0007666 A1 têm a desvantagem que eles podem resultar, mesmo em concentrações extremamente baixas, na citólise. Isto toma a sua dosagem crítica. Uma desvantagem adicional é que pode ocorrer alguma hemólise mesmo em pH 7,4, de modo que os copolímeros descritos são geralmente difíceis de controlar e, se eles forem usados em quantidades extremamente baixas, somente uma baixa carga com biomoléculas ou ingredientes farmacêuticos ativos é tomada possível. Uma desvantagem adicional é que seguindo a administração parenteral, eles poderíam acumular-se no corpo. Quando o peso molecular de um polímero for muito alto, por exemplo

62.000, a excreção por filtração glomerular é impedida.

Em conexão com o desenvolvimento de formas de drogas pretendidas para mostrar os seus efeitos especificamente em tipos particulares de células, portanto, há uma necessidade contínua por moléculas poliméricas de veículo adequadas. A intenção foi desenvolver polímeros sensíveis ao pH que mostrem propriedades citotóxicas ou membranolíticas somente em altas concentrações, ou de modo algum, na região de pH 7,0 ou ligeiramente maior, porém tenham efeitos citotóxicos, ou hemolíticos ou membra·«· ••······«··· !8 ··· ·· ··· nolíticos mesmo em baixa concentração in vivo abaixo de pH 6,5. Os polímeros são pretendidos serem adequados como veículos (complexos e conjugados) para biomoléculas naturais ou sintéticas ou ingredientes farmacêuticos ativos que sejam para serem liberados dentro das células, via absorção nos endossomas e desestabilização ou quebra subseqüente destes.

Além disso, na aplicação parenteral das substâncias, o problema de eliminação tem de ser considerado a fim de evitar um acúmulo no corpo humano ou animal e, conseqüentemente, os efeitos colaterais tóxicos.

Portanto, devem ser proporcionados polímeros sensíveis ao pH, os quais possam ser facilmente aplicados em concentrações na faixa de, por exemplo, 20 a 150 pg/ml, e os quais sejam bem carregáveis e que, portanto, sejam adequados como veículos (complexos e conjugados) para biomoléculas de origem natural ou sintética. Eles mostrarão boas propriedades hemolíticas nesta faixa de concentração e na faixa de pH 5,5 e abaixo de pH 6,5, ao mesmo tempo não haverá nenhum efeito membranolítico (hemolítico) em pH 7,4. Além disso, eles não serão eficazes contra os tipos de células de macrófagos sendo tóxicos ou sendo inibidores. Os polímeros serão eliminados bem por via renal e, portanto, serão adequados também para as aplicações parenterais.

O problema é resolvido por um polímero sensível ao pH, o qual é um copolímero (met)acrílico composto de a 65%, 25 a 65 % em peso de unidades de ácido metacrílico e a 35%, 75 a 35 % em peso de unidades de ésteres Cr a Ciealquílicos de ácido (met)acrílico, caracterizado pelo fato de que tem um peso molecular na faixa de 1 000 a 50 000 g/mol, e causa pelo menos 60% de hemólise em pH 5,5, e menos do que 5% de hemólise em pH 7,4, em uma concentração de 150 pg/ml em um teste de citoxicidade com as células sanguíneas vermelhas humanas.

Porque os poli(met)acrilatos - em contraste com os outros polímeros farmaceuticamente usados - não são biologicamente degradáveis, a eliminação deve ser efetuada por filtração glomerulosa, por via renal. EntreΗ tanto, este processo é restrito em relação ao peso molecular. Um limite superior para as moléculas que podem ser secretadas via o rim é adotado com 50.000 g/mol (Dalton). Surpreendentemente, os polímeros com baixos pesos moleculares de acordo com a presente invenção mostram atividades hemolíticas maiores do que aqueles com maiores pesos moleculares. Implementação da Invenção

Copolímeros de (met)acrilato

A invenção refere-se a um polímero sensível ao pH, em particular com propriedades membranolíticas, hemolíticas ou citotóxicas em valores de pH abaixo de pH 6,5, que é um copolímero de (met)acrilato composto de a 65% em peso de unidades de ácido metacrílico e a 35% em peso de unidades de ésteres Cr a Cia-alquílicos de ácido (met)acrílico, os ésteres C-ι- a Cia-alquílicos de ácido (met)acrílico, em particular os ^!ésteres C_r a Cia-alquíücos lineares ou ramificados de ácido (met)acrílico, são, por exemplo:

acrilato de metila, acrilato de etila, acrilato de vinila, acrilato de propila, acrilato de butila, acrilato de hexila, acrilato de octila, acrilato de decila, acrilato de dodecila, acrilato de miristila, acrilato de laurila, acrilato de cetila, acrilato de estearila, metacrilato de metila, metacrilato de etila, metacrilato de propila, metacrilato de butila, metacrilato de isobutila, metacrilato de hexila, (met)acrilato de 2-etilexila, metacrilato de fenila, metacrilato de octila, metacrilato de decila, metacrilato de dodecila, metacrilato de miristila, metacrilato de laurila, metacrilato de cetila, metacrilato de estearila.

Os componentes de éster podem ser ramificados ou cíclicos.

É dada preferência aos ésteres Cr a C₈-alquílicos de ácido acrílico ou metacrílico, em particular o metacrilato de metila, o metacrilato de etila, o metacrilato de butila, o metacrilato de 2-etilexila, o acrilato de metila, o acrilato de etila, o acrilato de butila e o acrilato de 2-etilexila.

Em geral, os conteúdos estabelecidos somam 100% em peso. Entretanto, é também possível estarem presentes, sem isto necessariamente resultar em uma deterioração ou alteração nas propriedades essenci<30

ais, pequenas quantidades na faixa de 0 a 10, por exemplo 0,1 a 5, ou não mais do que 2,5, % em peso de outros monômeros vinilicamente copolimerizáveis, os quais não são necessariamente os (met)acrilatos a estarem presentes, por exemplo, o acrilato de butila, o metacrilato de butila, o acrilato de metila, o metacrilato de hidroxietila, o acrilato de hidroxietila, a metacrilamida ou o estireno. Os monômeros reticuladores não estão presentes em geral. Variantes de copolímeros de (met)acrilato

São adequados e preferidos para os propósitos da invenção os copolímeros de (met)acrilato compostos de:

a 60, em particular 45 a 55, por exemplo 50, % em peso de unidades de ácido metacrílico e 60 a 40, em particular 55 a 45, por exemplo 50, % em peso de unidades de acrilato de etila (tipo EUDRAGlT® L100-55).

a 60, em particular 45 a 55, por exemplo 50, % em peso de unidades de ácido metacrílico e 60 a 30, em particular 45 a 35, por exemplo 50, % em peso de unidades de acrilato de etila, e 2 a 20% em peso, por exemplo 10% em peso, de metacrilato de butila.

a 60, em particular 45 a 55, por exemplo 50, % em peso de unidades de ácido metacrílico e 60 a 40, em particular 55 a 45, por exemplo 50, % em peso de unidades de acrilato de etila, e 0,1 a 2% em peso de um éster Cg- a C-i6-, preferivelmente C₈ - Ci2-alquílico de ácido acrílico ou metacrílico, preferivelmente o metacrilato de dodecila. O copolímero pode preferivelmente ser preparado na presença de 5 a 15% em peso de dodecil mercaptana ou 2 a 10% em peso de tioglicolato de 2-etilexila e varia assim em suas propriedades.

a 40, em particular 25 a 35, por exemplo 30, % em peso de unidades de ácido metacrílico, 25 a 45, em particular 30 a 40, por exemplo 35, % em peso de unidades de metacrilato de metila, 25 a 45, em particular 30 a 40, por exemplo 35, % em peso de unidades de acrilato de etila.

Em geral, os conteúdos estabelecidos somam 100% em peso. Entretanto, é também possível estarem presentes, sem isto necessariamente resultar em uma deterioração ou alteração nas propriedades essenciais, pequenas quantidades na faixa de 0 a 10, por exemplo 0,1 a 5, ou não

mais do que 2,5, % em peso de outros monômeros vinilicamente copolimerizáveis, os quais não são necessariamente os (met)acrilatos. Por exemplo, o acrilato de butila, o metacrilato de butila, o acrilato de metila, o metacrilato de hidroxietila, o acrilato de hidroxietila, a metacrilamida ou o estireno pode ser mencionado.

Peso molecular

O peso molecular pode ser determinado, por exemplo, através de viscometria ou cromatografia de exclusão em gel (GPC). Os valores viscométricos (número de viscosidade de limite) podem ser determinados em clorofórmio ou em DMF (dimetilformamida) a 23°C e devem preferivelmente estar na faixa de 1 a 25, preferivelmente 10 a 20, n_espec/c (cm³/g). Os números de viscosidade podem ser medidos, por exemplo, como especificado em ISO 1628-6. Os pesos moleculares de acordo com esta invenção devem ser determinados por viscosimetria de acordo com DIN 1628-6, modificados com

DMF como um solvente. Os números de viscosidade são correlacionados ao peso molecular (médio ponderai, P_m) usando padrões de poli metacrilato de metila (PMMA). O peso molecular (médio ponderai) do copolímero de (met)acrilato está na faixa de 1 000 a 50 000 g/mol, preferivelmente na faixa de 5 000 a 40 000 g/mol, em particular na faixa de 10 000 a 30 000 ou mais preferivelmente na faixa de 15 000 a 25 000.

A seguinte tabela pode ser usada como uma linha-guia para calcular os pesos moleculares a partir dos valores de viscosidade (VZ) de acordo com a fórmula geral VZ = 4,976 10'³ * P_m ^0,796:

Número de viscosidade (VZ)	Peso molecular (M_w)
1	780
3	3 110
5	5 910
10	14110
15	23 490
20	33 720
30	56 110
50	106 600

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Efeito hemolítico

Se a atividade hemolítica (hemólise) exceder 5%, é dito ser um efeito citotóxico. A atividade hemolítica deve ser menor do que 5% em pH 7,4 e ser alta e ser, por exemplo, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo me5 nos 50 ou pelo menos 60, % em um pH 5,5. É benéfico se este efeito for atingido com concentrações de copolímeros prontamente dosadas de 20 a 300, preferivelmente 50 a 250, em particular de 100 a 200, pg de copolímero/ml com base em uma concentração de eritrócitos de 1 x 10⁸ RBC/ml.

São mais preferidas as concentrações de copolímeros de 10 a

150, mais preferidas ainda de 15 a 110, em particular de 20 a 80 pg de copolímero/ml.

Em um teste de citoxicidade com as células sanguíneas vermelhas humanas, o copolímero (met)acrílico em uma concentração de 150 pg/ml causou pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 80%, de hemó.15 lise em pH 5,5, e menos do que 5%, preferivelmente menos do que 2,5, particular e preferivelmente menos do que 1, % de hemólise em pH 7,4.

O teste de citoxicidade com as células sanguíneas vermelhas humanas (eritrócitos) pode ser realizado por um método baseado naquele de Murthy et al.: N. Murthy, J.R. Robichaud, D.A. Tirrell, P.S. Stayton, e S. Ho20 ffman. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. J.Controlled Release, 61: 137-143 (1999).

Este vincula as células sangüíneas vermelhas (RBC) humanas obtidas de sangue novo sendo separadas por centrifugação, na presença de K3 EDTA. As células são, neste caso, sedimentadas a 200 g e 4°C por 5 min e subseqüentemente lavadas três vezes por centrifugação renovada e absorção em solução salina tamponada com fosfato (tampão de PBS, 34 mM, pH 7,4, 0 ,9% de NaCI peso/volume (75 mM)). A contagem de células na suspensão resultante pode ser determinada usando um hemocitômetro.

O teste de hemólise é realizado adicionando as células sangüí30 neas vermelhas (RBC) humanas no meio particular a uma suspensão de copolímero, em uma concentração de células de 1 x 10⁸ RBC/ml. A mistura é incubada a 37°C por 20 min.

Efeito citotóxico sobre as células do tipo macrófagos

Em contraste com as células sanguíneas vermelhas, onde a citólise presumivelmente ocorre principalmente através de uma interação dos copolímeros com a membrana celular externa, os tipos de células seme5 lhantes a macrófagos são capazes de absorção ativa dos copolímeros, de modo que deve ser presumido que outras interações podem causar a citólise neste caso. Os copolímeros de (met)acrilato preferidos são aqueles que mostram citólise ou toxicidade baixa ou zero no teste de MTT ou no teste de LDH (teste de lactato desidrogenase) com o tipo de célula semelhante a ma10 crófago de camundongo J774A.1 (ver o Exemplo 5). A linhagem celular J774A.1 está disponível, por exemplo, a partir da coleta pública de cepas ATCC (Coleta de Cultura de Tipo da América, Manassas, VA 20108) sob o Ν- TIB-67 (células de camundongos J774A.1; células semelhantes a macrófagos imortalizadas (não tumorais): ver também: Ralph P et al. Lysozyme

-15 synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. J. Exp. Med. 143: 1528-1533, 1976 PubMed: 76192838).

Teste de MTT (inibição das células de uma linhagem celular do tipo macrófago):

O teste colorimétrico detecta as células vivas que reduzem o corante amarelo MTT (MTT = brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazólio) até um produto de formazano azul escuro. O teste é adequado para detectar a citoxicidade, a proliferação das células e a ativação das células (ver, por exemplo, T. Mosmann. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays

J. Immunol. Meth. 65: 55-63 (1983)).

O grau de matança das células de macrófagos é indicado pela

LDH liberada (NC. Phillips, L. Gagné, N. Ivanoff, g. Riveau. (1996) Vaccine 14(9), 898-904. O teste de lactato desidrogenase para a medição da LDH liberada (ver P.G. Cabaud e F. Wroblewski em Am J Clin Pathol (1958) 30,

234-236) pode ser realizado com kits de teste comercialmente disponíveis, por exemplo o kit Sigma (procedimento N^e 500).

A toxicidade induzida pelos copolímeros em relação às células semelhantes a macrófagos deve ser tão baixa quanto possível em pH fisiológico (neutro).

Os copolímeros de (met)acrilato preferidos são, portanto, aqueles que, em uma concentração na região de 0,03125 mg/ml, causam no teste de MTT com o tipo de célula semelhante a macrófago J774A.1 (ATCC TIB-67) um valor percentual de sobrevivência celular de pelo menos 25 %, preferivelmente pelo menos 60%, com base em uma taxa de sobrevivência de 100% na experiência de controle.

Os copolímeros de (met)acrilato preferidos são, portanto, aque10 les que, em uma concentração na região de 0,03125 mg/ml, causam no teste de LDH com o tipo de célula semelhante a macrófago J774A.1 (ATCC TIB-67) um valor de liberação de LDH de não mais do que 40%, preferivelmente não mais do que 20%, com base em uma citólise (toxicidade) de 100% na experiência de controle.

.15 Preparação dos polímeros ou copolímeros de (met)acrilato sensíveis ao pH

Os polímeros sensíveis ao pH são preparados por polimerização via radicais livres dos monômeros, na presença de iniciadores da polimerização e reguladores do peso molecular, por polimerização em blocos, glóbulos ou emulsão, e descarga do polímero. Os outros métodos de prepara20 ção que são adequados em princípio são também a polimerização por transferência de grupos (GTP) ou a polimerização via radicais por transferência de átomos (ATRP) (ver, por exemplo, Matyjaszewski, K. et al., Chem. Rev. 2001, 101, 2921-2990). As estruturas dos polímeros resultantes são copolímeros aleatórios ou copolímeros em blocos.

É dada preferência à polimerização por emulsão na presença de a 15% em peso de reguladores do peso molecular, um teor de emulsificante na faixa de 0,1 a 2% em peso, uma quantidade de iniciador de polimerização na faixa de 0,02 a 0,4% em peso e em temperaturas de 65 a 90°C. É dada preferência a uma mistura de emulsificantes preferivelmente composta de lauril sulfato de sódio, por exemplo 0,1 a 0,5% em peso, e polioxietileno 20 monooleato de sorbitano, por exemplo 0,4 a 1,5% em peso. Os iniciadores particularmente adequados são o peroxodissulfato de sódio ou o peroxo»····· »

»· · c2S· dissulfato de amônio. É possível deste modo preparar, por exemplo, uma dispersão com um teor de sólidos de 20 a 40% em peso, e o copolímero pode ser isolado, preferivelmente através de secagem por pulverização ou por coagulação e expulsão da água em uma extrusora. O polímero é então dissolvido, preferivelmente em um solvente orgânico, purificado, preferivelmente por diálise múltipla contra água, e seco, preferivelmente seco por congelamento.

Os exemplos de iniciadores da polimerização que podem ser mencionados são: os compostos azo, tais como a 2,2'-azobis(isobutironitrila) ou a 2,2'-azobis(2,4-dimetil-valeronitrila), os sistemas redox, tais como, por exemplo, a combinação de aminas terciárias com peróxidos ou, preferivelmente, os peróxidos (com relação a isto, ver, por exemplo, H. RauchPuntigam, Th. Võlker, Acryl- und Methacrylverbindungen, Springer, Heidelberg, 1967 ou Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Vol. 1,

-15 páginas 386 e seg., J. Wiley, New York, 1978). Os exemplos de iniciadores da polimerização de peróxidos adequados são o peróxido de dilauroíla, o peroctoato de terc-butila, o perisononanoato de terc-butila, o peroxidicarbonato de dicicloexila, o peróxido de dibenzoíla ou o 2,2-bis(tercbutilperoxi)butano.

É também possível e preferido que a polimerização seja realizada com uma mistura de diversos iniciadores de polimerização diferindo em meia-vida, por exemplo, o peróxido de dilauroíla e o 2,2-bis(tercbutilperoxi)butano, a fim de manter o fluxo de radicais livres constante durante a polimerização e em diferentes temperaturas de polimerização. As quantidades de iniciadores da polimerização empregados são geralmente de 0,01 até um máximo de 1 % em peso, com base na mistura de monômeros.

Os pesos moleculares dos copolímeros (CP) são ajustados por polimerização da mistura de monômeros na presença de reguladores de peso molecular, tais como, em particular, das mercaptanas conhecidas para este propósito, tais como, por exemplo, a n-butil mercaptana, a n-dodecil mercaptana, o 2-mercaptoetanol ou o tioglicolato de 2-etilexila, geralmente empregando os reguladores de peso molecular em quantidades de 0,05 a

15% em peso, com base na mistura de monômeros, preferivelmente em quantidades de 0,1 a 10% em peso, e particular e preferivelmente em quantidades de 2 a 12% em peso da mistura de monômeros (comparar, por exemplo, com H. Rauch-Puntigam, Th. Võlker, Acryl- und Methacrylverbin5 dungen, Springer, Heidelberg, 1967; Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Vol. XIV/1, página 66, Georg Thieme, Stuttgart, 1961 ou KirkOthmer, Encyclopedia of Chemical Technology, Vol. 1, páginas 296 e seg., J. Wiley, New York, 1978). O regulador de peso molecular preferivelmente empregado é a n-dodecil mercaptana ou o tioglicolato de 2-etilexila. O tiogli10 colato de etilexila tem a vantagem que a hidrofobicidade do copolímero de (met)acrilato pode ser influenciada, visto que o regulador está incluído na molécula na extremidade. 5 a 15% em peso de dodecil mercaptana ou 2 a 10% em peso de tioglicolato de 2-etilexila são as quantidades preferidas empregadas.

-15 Conjugados/Complexos

O polímero sensível ao pH pode estar, conforme pretendido, na forma de um conjugado ou complexo com uma biomolécula natural ou sintética farmaceuticamente eficaz ou um ingrediente farmacêutico ativo. O conjugado ou o complexo pode ser preparado reversível ou irreversivelmente de modo covalente por ligação química ou através de valências secundárias via forças de Van der Waals, ligações iônicas, ligação hidrofóbica.

Usos

Os polímeros sensíveis ao pH podem ser usados como veículos, conjugados/complexos para biomoléculas naturais ou sintéticas ou ingredi25 entes farmacêuticos ativos que são para serem liberados dentro das células, via absorção nos endossomas, e desestabilização ou quebra subseqüentes destes.

Os polímeros sensíveis ao pH podem ser usados para a formação de complexos ou como conjugados com lipídios, proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos (DNA e RNA), em particular oligonucleotídeos, DNA antisentido ou RNA anti-sentido, DNA de plasmídio, nucleotídeos, hormônios, toxinas, imunotoxinas, anticorpos ou seus fragmentos ou ingredientes far• · <3* macêuticos ativos. A formação de complexos ou a formação de conjugados pode ocorrer reversível ou irreversivelmente de modo covalente por ligação química ou através de valências secundárias via forças de Van der Waals, ligações iônicas, ligação hidrofóbica. O complexo resultante pode ser usado como ingrediente ativo para a produção de uma forma de droga, em particular uma forma de droga dérmica, transdérmica, parenteral, nasal, pulmonar, vaginal ou oral.

Os polímeros sensíveis ao pH e os conjugados podem, onde apropriado, ser um constituinte de micropartículas, nanopartículas, liposso10 mos, emulsões e/ou vesículas lipídicas.

O dito uso como veículo, conjugado/complexo é possível e preferido para os ingredientes farmacêuticos ativos das classes de ingredientes ativos de analgésicos, antialérgicos, anti-reumáticos, antibióticos, antiinfectivos, agentes antiparkinson, antipsoriáticos, agentes antitumor, substâncias

-15 dermatológicas, remédios para gota, imunorreguladores, agentes gastrointestinais, agentes neurotrópicos, substâncias oftalmológicas, citoestáticos. Distúrbios possíveis:

câncer, infecções (incluindo o HIV), distúrbios cardiovasculares (por exemplo, a arteriosclerose), artrite, distúrbios neurodegenerativos (Pa20 rkinsonismo, esclerose múltipla, de Alzheimer), distúrbios de deficiência de enzima geneticamente relacionados, hepatite B e C, mucoviscidose, hipercolesteremia, síndrome de Down, distrofia muscular, doenças auto-imunes, herpes zoster e herpes, psoríase, retinite por CMV, doença de Crohn, colite ulcerativa, diabetes.

As substâncias medicinais empregadas para o propósito da invenção são pretendidas para serem usadas sobre o, ou no, corpo humano ou animal para

1. curar, aliviar, prevenir ou diagnosticar os distúrbios, as condições, o dano físico ou os sintomas patológicos.

2. revelar a condição, o status ou as funções dos estados corpóreos ou mentais.

3. repor as substâncias ativas ou os fluidos corpóreos produzi28 ’ ·* * »··♦···· , • · · ·· · · • · ♦ »· · · •·· ·« ··· dos pelo corpo humano ou animal.

4. evitar, eliminar ou tornar inócuos os patógenos, os parasitas ou as substâncias exógenas, ou

5. influenciar a condição, o status ou as funções dos estados corpóreos ou mentais.

As substâncias medicinais em uso são para serem encontradas em trabalhos de referência, tais como, por exemplo, a Rote Liste ou o Merck Index.

Deve ser feita menção particular dos ingredientes ativos anfote10 ricina B, citosina arabonosídeo Adriamicina. A forma lipossômica da adriamicina poderia também ser um bom modelo, visto que sua rápida liberação nos endossomas poderia ser usada para superar a resistência às múltiplas drogas. Os outros ingredientes ativos de interesse poderíam ser os oligonucleotídeos anti-sentido, o DNA de plasmídio e os peptídeos (leuprolida, calcitoni-15 na etc.).

A forma de droga pode ser usada, por exemplo, para a terapia de tumores, distúrbios cardiovasculares ou artrite reumática. A terapia de gene de distúrbios genéticos ou a terapia profilática de tais distúrbios, com o auxílio dos polímeros sensíveis ao pH de acordo com a invenção como in20 grediente de formas de drogas apropriadas, é também concebível no futuro. Comparados com os sistemas virais para transferir ácidos nucléicos para células vivas, os sistemas não-virais têm a vantagem geral de que eles podem ser preparados mais facilmente, nenhuma replicação do vetor está envolvida, e que o risco de reações imunoiógicas é menor.

Modificações das propriedades

a) Influência da conformação por ligação com outras moléculas

As propriedades, por exemplo a atividade tóxica ou membranolítica, dos copolímeros de (met)acrilato sobre as células sanguíneas vermelhas e/ou as células do tipo macrófago ou as suas propriedades físicas po30 dem ser modificadas por ligação covalente ou de valência secundária com outras moléculas, em particular os agentes que alteram a conformação, por exemplo os corantes, em particular os corantes hidrofóbicos, por exemplo ·· ··* ·· ·· • · * · · • * · · ·· · » · · • * · · ··· ·· ··· ··· ············ • · · ·· 4 · · • · * * · · · · ·· · ·· com a rodamina B. Os métodos de acoplamento adequados para os copolímeros de (met)acrilato contendo grupos carboxila são conhecidos para a pessoa versada.

É possível obter, por exemplo, um copolímero de (met)acrilato 5 composto de a 65% em peso de unidades de ácido metacrílico e a 35% em peso de unidades de ésteres Cr a Ci2-alquílicos de ácido (met)acrílico, o qual é modificado ou acoplado a um corante, preferivelmente 10 com um corante hidrofóbico, em particular com a rodamina B.

É dada preferência a um copolímero de (met)acrilato composto de a 60% em peso de unidades de ácido metacrílico e a 40% em peso de unidades de acrilato de etila, o qual é modificado com um corante, preferivelmente com um

-15 em particular corante hidrofóbico, em particular com a rodamina B.

É dada preferência a uma razão de acoplamento teoricamente determinada, na qual 5 a 100%, preferivelmente 5 a 20%, das moléculas de copolímero estão acopladas a uma molécula de corante.

O acoplamento tem a vantagem, por exemplo, de que as carac20 terísticas de solubilidade podem ser modificadas. É possível, por exemplo, atingir uma elevação excessiva na insolubilidade na região abaixo de pH 6,5, por exemplo na faixa de pH 6,0 a pH 5,0 (ver o Exemplo 6). b) Produção de complexos por reticulação intermolecular

Os grupos carboxila dos copolímeros de (met)acrilato são quimi25 camente reativos e são adequados para a modificação com o alvo de produzir complexos por reticulação intermolecular. Assim, por exemplo, os grupos SH podem ser introduzidos de forma relativamente fácil nos copolímeros de (met)acrilato por modificação química com NH2-CH2-CH2-SH.

É também fácil introduzir os grupos SH no DNA e no RNA, em 30 particular os oligonucleotídeos, 0 DNA anti-sentido ou o RNA anti-sentido, via os grupos OH 5'- e 3'-terminais dos ácidos nucléicos, por meio de COOH-CH2-CH2-SH.

Os copolímeros de (met)acrilato modificados com SH e os ácidos nucléicos modificados com SH podem ser reticulados por formação de pontes S-S para dar os complexos. O aumento no peso molecular e a solubilidade reduzida tomam os complexos disponíveis na forma de grânulos em particular para as células fagocitóticas, o que pode ser vantajoso no tratamento de certos estados patológicos, tais como, por exemplo, as doenças (auto)-imunes.

A redução da ponte de dissulfeto in vivo liberaria a forma ativa da molécula carregada. Os complexos poderiam também ser apreendidos por outros tipos de células após enxertar ligantes alvo apropriados.

Os polímeros de acordo com a invenção são empregados em combinação com ingredientes ativos e formam um sistema de distribuição de drogas que está particulado em geral. É possível para este propósito ligar o ingrediente ativo ao polímero via um espaçador biodegradável. Entretanto, é

-15 também dada preferência aos conjugados/complexos com substâncias de baixo peso molecular ou poliméricas catiônicas e agentes farmacologicamente ativos. Deve ser feita menção dos lipídios catiônicos, tais como a Lipofectina, a polilisina, a polietilenoimina, o poliamino(met)acrilato ou a espermina e as espermidinas e os seus derivados. Este complexo pode tam20 bém ser um lipossomo catiônico ou aniônico. O polímero e o agente ativo também podem ser encapsulados em, ou ligados a, um lipossomo catiônico, aniônico ou neutro.

Os agentes formadores de complexos que são conhecidos per se podem mostrar efeitos intensificadores da ação em uma variedade de modos (por exemplo, a polietilenoimina).

Os constituintes adicionais dos complexos podem ser os polímeros hidrofílicos (polietileno glicol, polivinilpirrolidona, polilactídeos, políglícolídeos, polissacarídeos e seus derivados). Estas substâncias protegem os ingredientes ativos de interações com os constituintes do sangue e prolon30 gam a circulação no sangue.

Os ligantes alvo, tais como os anticorpos contra os antígenos específicos de células, podem ser usados para a objetivação específica de célula.

Os sistemas de liberação particulados são produzidos por técnicas convencionais, por exemplo por formação direta de complexos em solução, secagem das soluções contendo lipídios e dispersão novamente em água, onde apropriado usando ultra-som ou homogeneização.

O ingrediente de uma forma de droga, que corresponde à técnica usual do uso pretendido, permite uma terapia segura e tolerada. A estabilidade pode ser prolongada através de secagem por congelamento ou pulverização das formas de drogas.

Exemplos

1. Copolímeros dos Exemplos 1 a 7

Copolímero A:

Copolímero de

50% em peso de ácido metacrílico e

50% em peso de metacrilato de metila.

Peso molecular médio ponderai = Pm cerca de 25 000. Copolímero B:

Copolímero de

50% em peso de ácido metacrílico e

50% em peso de acrilato de etila.

Peso molecular médio ponderai = P_m cerca de 25 000. Copolímero C:

Copolímero de

30% em peso de ácido metacrílico,

35% em peso de acrilato de etila e

35% em peso de acrilato de metila.

Peso molecular médio ponderai = P_m cerca de 25 000. Copolímero D:

Copolímero de

30% em peso de ácido metacrílico,

70% em peso de metacrilato de metila.

Peso molecular médio ponderai = P_m cerca de 25 000.

• ·

Copolímero E (não em conformidade com a invenção)

Copolímero de

10% em peso de ácido metacrílico,

45% em peso de metacrilato de metila e 45% em peso de acrilato de metila.

Peso molecular médio ponderai = Pm cerca de 25 000.

Copolímero L-100 (EUDRAGlT® L, não em conformidade com a invenção) Copolímero de

50% em peso de ácido metacrílico e 50% em peso de metacrilato de metila.

Peso molecular médio ponderai = P_m cerca de 100 000.

Copolímero L-100-55 (EUDRAGIT® L100-55, não em conformidade com a invenção)

Copolímero de

50% em peso de ácido metacrílico e 50% em peso de acrilato de etila.

Peso molecular médio ponderai = P_m cerca de 250 000.

Copolímero S-100 (EUDRAGlT® S100, não em conformidade com a invenção)

Copolímero de

30% em peso de ácido metacrílico e 70% em peso de metacrilato de metila.

Peso molecular médio ponderai = P_m cerca de 100 000.

Exemplo 1:

faixas de transição do pH (solúvel até insolúvel).

A intenção foi investigar, por medição da luz difusa a 37°C em valores de pH de 3,0 até 7,5 em tampão de fosfato, as faixas de pH nas quais os copolímeros estão presentes na forma insolúvel. A intensidade da difusão da luz aumenta à medida que o polímero precipita.

Os resultados são mostrados na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Copolí- mero	Ácido metacrílico [% em peso]	Metacri- lato de metila [% em peso]	Acrilato de etila [% em peso]	Acrilato de metila [% em peso]	Pm x 10³ [mol/g]	Faixa de pH na qual o copolímero precipita-se
A	50	50	-	-	25	3,8-4,5
B	50		50		25	4,7-5,1
C	30	-	35	35	25	5,0-5,6
D	30	70	-	-	25	4,8-5,3
E	10	45	-	45	25	4,5-7,0
L-100	50	50	-	-	100	3,7-4,3
L-100-55	50	-	50	-	250	4,6-5,0
S-100	30	70	-	-	100	4,7-5,2

Resultados:

' Os copolímeros de (met)acrilato, exceto o copolímero E, mostram faixas de transição relativamente estreitas de 0,4 a 0,7 unidades de pH.

O copolímero E parece, por causa de seu baixo teor de 10% em peso de monômeros com resíduos de grupos carboxila, ter uma faixa de transição de pH mais ampla de 2,5 unidades de pH.

O peso molecular parece não ter virtualmente nenhum efeito sobre as características de solubilidade dos copolímeros.

Exemplo 2:

Atividade hemolítica dependente da concentração em pH 7,4

O teste da citoxicidade com as células sangüíneas vermelhas humanas foi realizado por um método baseado naquele de Murthy et al. (N. Murthy, J.R. Robichaud, D.A. Tirrell, P.S. Stayton, e S. Hoffman. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. J.Controlled Release, 61:137-143 (1999)).

Este vincula as células sangüíneas vermelhas (RBC) humanas sendo separadas por centrifugação, na presença de K3 EDTA. As células são, neste caso, sedimentadas a 200 g e 4°C por 5 min e subseqüentemente lavadas três vezes por centrifugação renovada e absorção em solução salina

tamponada com fosfato (tampão de PBS, 34 mM, pH 7,4, 0,9% de NaCI peso/volume (75 mM)). A contagem de células na suspensão resultante pode ser determinada usando um hemocitômetro.

O teste de hemólise é realizado adicionando as células sangüí5 neas vermelhas (RBC) humanas no meio particular a uma suspensão de copolímero, em uma concentração de células de 1 x 10⁸ RBC/ml. A mistura é incubada a 37°C por 20 min. O grau de hemólise foi medido por determinação espectrométrica da hemoglobina liberada das células quebradas no sobrenadante da centrifugação a 541 nm.

Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo

Copolí- mero	Mw x 10³[mol/g]	Atividade hemolítica [%] em pH 7,4 com uma concentração de copolímero em [pg/ml])
150	250	500	2 500	10 000
A	25	< 5	< 5	< 5	< 5	< 5
B	25	<5	5	8	25	100
C	25	< 5	<5	5	100	100
D	25	< 5	<5	<5	100	100
E	25	<5	< 5	<5	12	20
L-100	100	<5	<5	<5	< 5	< 5
L-100-55	250	<5	< 5	<5	< 5	30
S-100	100	< 5	< 5	<5	< 5	< 5

Resultados:

Os copolímeros B e C mostram uma atividade hemolítica de 5% ou mais (início da toxicidade) em pH 7,4 a 500 pg/ml e acima. Os copolímeros B, C, D e E mostram atividades hemolíticas de mais do que 5 % a 2.500 pg/ml. A atividade hemolítica do copolímero B é, neste caso, menor do que aquela de C e D.

Os copolímeros A, L-100, L-100-55 e S-100 não têm nenhuma atividade hemolítica, mesmo nas altas concentrações até 10 000 pg/ml. O copolímero L-100-55, que é idêntico ao copolímero B, à parte de seu peso molecular, e o copolímero E mostram uma ligeira atividade hemolítica a 10 000 pg/ml.

Os copolímeros A e B têm um teor idêntico de ácido metacrílico de 50% em peso e diferem somente no comonômero - respectivamente o metacrilato de metila e o acrilato de etila. O copolímero B algo mais hidrofóbico é hemolítico mesmo a 250 pg/ml. Em contraste, o copolímero A não é hemolítico, mesmo a 10 000 pg/ml.

Exemplo 3:

Efeito hemolítico dos copolímeros B e C em diferentes concentrações, em pH 5,0 e pH 5,5.

Os resultados são mostrados na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3

Copolí- mero	Mw x 10³[mol/g]	Atividade hemolítica [%] em uma concentração de copolímero em [pg/ml])
		25	50	100	150	250
B	5,0	10	80	80	80	80
	5,5	50	90	95	90	90
L-100-55	5,0	<5	80	80	80	80
L-100-55	5,5	5	55	75	90	90
C	5,0	<5	<5	10	60	80
C	5,5	5	50	80	85	85

Resultado:

O copolímero B é mais hemofílico do que o copolímero C em pH 5,0 e em pH 5,5, especialmente nas baixas concentrações de 25 e 50 pg/ml. Ambos os copolímeros são muito ativos em pH 5,5 e 150 pg/ml.

O copolímero L-100-55 difere do copolímero B por seu peso molecular mais elevado. A atividade hemolítica do copolímero B é maior do que aquela do copolímero L-100-55 em pH 5,0 e pH 5,5 a 25 e 50 pg/ml, bem como em pH 5,5 e 100 pg/ml.

Exemplo 4:

Efeito hemolítico em uma concentração de copolímero de 150 pg/ml em valores de pH diversos.

Os resultados são mostrados na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4

Copolí- mero	Mw x 10³[mol/g]	Atividade hemolítica [%] com uma concentração de copolímero de 150 [pg/ml])
pH 5,5	pH 6,0	pH 6,5	pH 7,0	pH 7,5
A	25	< 5	< 5	<5	< 5	<5
B	25	80	55	<5	<5	<5
C	25	90	55	<5	< 5	<5
D	25	< 5	< 5	<5	< 5	< 5
E	25	<5	<5	< 5	< 5	< 5
L-100	100	<5	<5	<5	<5	<5
L-100-55	250	95	80	< 5	< 5	<5
S-100	100	<5	< 5	<5	< 5	<5

Resultado:

Os copolímeros B, C e L 100-55 mostram forte atividade hemolítica em uma concentração de 150 pg/ml na faixa de pH de 5,5 a 6,0. Todos os copolímeros contêm acrilato de etila como comonômero. O Pm de L 10055 é muito alto para as aplicações, entretanto.

Exemplo 5:

A intenção foi investigar o efeito dos copolímeros sobre os tipos de células de macrófagos. Em contraste com as células sangüíneas verme10 lhas, com as quais a citólise presumivelmente ocorre, principalmente através de uma interação dos copolímeros com a membrana celular externa, os tipos de células de macrófagos são capazes de absorção ativa dos copolímeros, de modo que deve-se presumir que as outras interações são capazes de causar a citólise ou outros efeitos tóxicos neste caso. Visto que a determina15 ção da citólise ou de outros efeitos tóxicos é relativamente inexata, são combinados dois sistemas de teste: o ensaio de MTT para acessar a proliferação das células e o ensaio de LDH para acessar a necrose das células (o teste de MTT para as células sobreviventes e o teste de LDH para as células mortas).

Teste de MTT

Teste de MTT (inibição da proliferação de células de uma linhagem celular

A · do tipo macrófago).

O teste colorimétrico detecta as células vivas que reduzem o corante amarelo MTT até um produto de formazan azul escuro. O teste é adequado para detectar a citoxicidade, a proliferação das células e a ativação das células (ver, por exemplo, T. Mosmann. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays, J. Immunol. Meth. 65: 55-63 (1983)).

As células de camundongos do tipo macrófago J 774 são suspensas em meio DMEM contendo 10% vol/vol de soro fetal de bezerro (prétratado a 56°C, 30 min) e 100 U/ml de penicilina G e 100 gg/ml de estreptomicina. As células são distribuídas em porções de 100 μΙ contendo 5 x 10³células em uma placa de microtítulo com 96 poços e incubadas sob uma atmosfera saturada com H₂O contendo 5% de CO₂ a 37°C por 24 h. 20 μΙ de solução de copolímero estéril em tampão de fosfato são adicionados, e são realizadas diluições em série de 0,5 até 0,003125 mg/ml (os controles recebem o tampão de fosfato sem o copolímero). A incubação é então continuada por 48 h.

gg de uma solução de MTT estéril (MTT = brometo de 3-(4,5dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) em tampão de fosfato (5 mg/ml) são colocados em cada poço e incubados a 37°C por umas 3 h adicionais. Então 100 gl de uma solução a 10% peso/volume de dodecil sulfato de sódio (SDS) em HCI a 0,01 M são adicionados a fim de solubilizar o MTT reduzido. A absorção a 570 nm é medida em um espectrômetro após 24 h e é avaliada em relação a uma taxa de sobrevivência de 100% na experiência de controle sem a adição de copolímero.

Teste de LDH

O teste colorimétrico detecta a atividade da lactato desidrogenase (LDH) liberada pelas células mortas. O teste é realizado em analogia ao teste de MTT com células J774 em placas de microtítulo. Após a incubação por 48 h, porções de 4 gl do sobrenadante são testadas quanto à atividade da LDH com um kit de teste de LDH comercialmente disponível. A avaliação ocorre em relação a uma citólise (toxicidade) de 100% na experiência de

3Ô ·«*·«······· ·

controle sem a adição de copolímero. O valor de 100% é, neste caso, determinado após incubação de uma alíquota de células na presença de Triton X-100 para a citólise completa.

Os resultados são mostrados nã Tabela 5 abaixo.

Tabela 5

Co- polí- mero	MAA	MMA	EA	MA	Teste de MTT % de sobrevivência das células	Teste de LDH % de LDH liberada
0,03125 [mg/ml]	0,5 [mg/ml]	0,03125 [mg/ml]	0,5 [mg/ml]
A	50	50	-	-	90	100	<5	<5
B	50		50		30	20	35	40
C	30	-	35	35	100	80	< 5	15
D	30	70	-	-	100	100	< 5	< 5
E	10	45	-	45	100	<5	< 5	40

MAA = [% em peso] ácido metacrílico MMA = [% em peso] metacrilato de metila EA = [% em peso] acrilato de etila MA = [% em peso] acrilato de metila

Resultado:

As medições obtidas no teste de MTT e no teste de LDH concordam qualitativamente. O copolímero B é o mais tóxico para J774, mesmo em baixa concentração. Nenhum efeito tóxico foi detectável para os copolímeros A e D. O copolímero E, que causa uma hemólise limitada das células sangüíneas vermelhas no Exemplo 4, prova ser tóxico para as células J774 em uma concentração de 0,5 mg/ml. O copolímero C prova ser ligeiramente tóxico para as células J774 em uma concentração de 0,5 mg/ml.

Exemplo 6

Mudança (transição) conformacional dependente do pH dos copolímeros A a E.

Fluorescência do pireno

O corante fluorescente pireno pode ser usado para seguir a transição dos polímeros sensíveis ao pH em diferentes valores de pH (ver, ·· «

por exemplo: K. Kalyanasundaram e J.K. Thomas. Environmental effects on vibronic band intensities in pyrene monomer fluorescence and their application in studies of micellar systems. J. Am. Chem. Soc. 99:2039-2044 (1977)).

As transições das estruturas em espiral hidrofílicas (espiral) para as estruturas de glóbulos hidrofóbicas estão associadas com uma diminuição na razão do primeiro (372 nm) e do terceiro (383 nm) picos do espectro de emissão (razão de I1/I3). Para a medição, o pireno é simplesmente adicionado à solução de copolímero.

Os resultados são mostrados na Tabela 6 abaixo.

Tabela 6

Copolímero	MAA	MMA	EA	MA	Emissão de pireno (I372 nm/Í383 nm)
					pH 5,5	pH 6,0	pH 6,5	pH 7,4
A	50	50	-	-	1,32	1,39	1,45	1,52
B	50		50		1,25	1,39	1,46	1,48
C ;	30	-	35	35	1,27	1,31	1,35	1,46
D	30	70	-	-	1,22	1,23	1,27	1,36
E '	10	45	-	45	1,27	1,26	1,26	1,26

Resultado:

Os copolímeros A e B (50% em peso de ácido metacrílico) mostram a transição mais pronunciada de pH 7,4 para pH 5,5, seguidos pelos copolímeros C e D (30% em peso de ácido metacrílico). O copolímero E (10% em peso de ácido metacrílico) não mostra virtualmente nenhum comportamento de transição. O comportamento de transição parece correlacionar-se com o teor de ácido metacrílico dos copolímeros, porém não com a atividade hemolítica dos copolímeros (ver os Exemplos 2 e 4).

Exemplo 7

Acoplamento do copolímero B ao corante Lissamine® (rodamina B)

O teste é realizado conforme descrito em K. Abdellaoui, M. Boustta, M. Vert, H. Morjani, M. Manfait. (1998) Eur J Pharm Sei, 6, 61-73, com as seguintes modificações. O ativador de grupo carboxila, Netoxicarbonil-2-etóxi-1,2-diidroquinolina (EEDQ), foi substituído pela 1,3diisopropilcarbodiimida (DIPC). A 4-(dimetilamino)piridina (DMAP) e a trietino ···········« • * · ··* · · lamina são adicionadas em quantidades catalíticas. A reação é realizada por 4 dias.

250 mg de copolímero B foram dissolvidos em 1 ml de tetrahidrofurano (THF) previamente destilado. Então 0,5 mg/ml (3 x 10'³ mmol) de 1,3-diisopropilcarbodiimida (DIPC) foi adicionado para ativar os grupos carboxila. Após 30 min, quantidades catalíticas de trietilamina e 4(dimetilamino)piridina e rodamina B Lissamine® etilenodiamina (1 mg/ml, 1,5 x 10’³ mmol), dissolvida em Ν,Ν-dimetilformamida anidra. A mistura de reação foi incubada na temperatura ambiente, no escuro, sob argônio, por 96 h.

A mistura de reação foi passada através de um filtro de 0,2 pm para remover a DIPC precipitada pelo produto. O THF presente foi retirado em vácuo. Ao produto bruto ainda contendo THF foi adicionada uma mistura de clorofórmio/metanol (85/15 vol/vol) e a solução foi eluída sobre uma coluna de sílica-gel para eliminar a rodamina livre. O processo de eluição, neste caso, foi monitorado por cromatografía em camada fina. As frações apropriadas foram combinadas e o solvente foi retirado em vácuo. O resíduo foi absorvido em THF e dialisado contra água/metanol (50/50) usando uma membrana de 3 500 dáltons por 3 dias, a fim de remover os resíduos de rodamina B não-covalentemente ligada. A diálise foi então continuada contra tampão de fosfato pH 9 por 2 dias e contra água destilada por uns 2 dias adicionais. O produto resultante foi secado por congelamento por 72 h.

O teor de rodamina B no copolímero foi determinado por espectrofluorometria em metanol, na temperatura ambiente (X_exc = 560 nm, λθη = 580 nm).

O rendimento de copolímero de cor carmim foi 83%. A ligação da rodamina B foi verificada ser 0,04 % em mol, o que significa que teoricamente uma em 9 moléculas de copolímeros está acoplada a uma molécula de rodamina.

Foi pretendido testar as características de solubilidade em diversos valores de pH, comparando com o copolímero B não-acoplado à roda4 mina B.

Os resultados são mostrados na Tabela 7 abaixo.

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Tabela 7

	Insolubilidade (precipitação) em [%] em pH
PH	4,2	4,5	5,3	5,6	6,0	7,0
Copolímero B	100	70	5	< 5	<5	<5
Copolímero B rodamina B	70	70	100	10	< 5	< 5

Resultado:

O acoplamento da rodamina ao copolímero B ocasiona uma mudança acentuada nas características de solubilidade. Há uma elevação excessiva a partir de aproximadamente pH 5,6 até 100% de insolubilidade em pH 5,3. Em contraste a isto, o copolímero B não-acoplado não mostra 100% de insolubilidade até o pH ser 4,2. A elevação nesta região ocorre distintamente menos exageradamente a partir do pH 5,3.

Exemplo 8

Processos de preparação: um exemplo é dado para cada um dos processos de preparação 1 e 2. As quantidades proporcionais podem ser variadãs conforme indicado na tabela na página 38.

O peso molecular médio ponderai (P_m) pode ser calculado aproximadamente a partir das medições para a viscosidade q_espec/c (cm³/g) em relação à viscosidade do polimetacrilato de polimetila (PMMA) a 25°C em DMF (dimetilformamida). A seguinte fórmula empiricamente encontrada é usada para este propósito:

M = f-O* (4.976-10³ )

Processo de preparação 1

430 g de água destilada, 3,78 g de lauril sulfato de sódio, 12,6 g de polioxietileno 20 monooleato de sorbitano e 1,26 g de peroxodissulfato de amônio, dissolvidos em 20 g de água destilada, foram introduzidos em um vaso de reação com uma capacidade de 2 I, equipado com condensador de refluxo, agitador e vaso de alimentação. A 81 °C, uma mistura de monômeros consistindo em:

270 g de acrilato de etila

• · · · ···

270 g de ácido metacrílico 27 g de tioglicolato de 2-etilexila foi dosada para uma solução durante o curso de 2,5 horas.

Após a alimentação estar completa, a mistura foi mantida a 81 °C por umas 2 horas adicionais, uma mistura de 0,176 g de emulsão antiespuma de silicone SE-2MC e 10 g de água destilada foi adicionada, e 95,42 g de água destilada foram retirados em vácuo em torno de 300 mbar, e esfriados até a temperatura ambiente. A dispersão tem um teor de sólidos de 30%. Processo de preparação 2

774 g de água destilada, 1,092 g de lauril sulfato de sódio e 1,4 g de peroxodissulfato de sódio, dissolvidos em 10 g de água destilada, foram introduzidos em um vaso de reação com uma capacidade de 2 I, equipado com condensador de refluxo, agitador e vaso de alimentação. A 75°C, uma emulsão consistindo em:

'15 390 g de acrilato de metila

150 g de metacriiato de metila 60 g de ácido metacrílico 1,008 g de lauril sulfato de sódio 7 g de polioxietileno 20 monooleato de sorbitano

30 g de tioglicolato de 2-etilexila

820,99 g de água destilada foi dosada para esta solução durante o curso de 4 horas.

Após a alimentação estar completa, a mistura foi mantida a 75°C por umas 2 horas adicionais, uma mistura de 0,21 g de emulsão antiespuma de silicone SE-2MC e 10 g de água destilada foi adicionada, e 120 g de água destilada foram retirados sob aproximadamente 300 mbar, e esfriados até a temperatura ambiente. A dispersão tem um teor de sólidos de 30%.

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Teor de sólidos (%)	30
Iniciador (partes)	0,1 J
Emulsiflcante (partes)	0,3 I 1 K
Temp. do polím. (°C)	CO
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Regula- dor (partes)	10H
Composição do polímero (% em peso)	o to 1 O Τ- Ο O LL 1 Q
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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polímero sensível ao pH, que é um copolímero de (met)acrilato composto de:

20 a 65% em peso de unidades de ácido metacrílico, e 5 80 a 35% em peso de unidades de ésteres C₁- a C₁₈-alquílicos de ácido (met)acrílico, sendo que apresenta um peso molecular na faixa de 1.000 a 50.000 g/mol, e sendo que causa pelo menos 60% de hemólise em pH 5,5, e

10 menos do que 5% de hemólise em pH 7,4, em uma concentração de 150 mg/mL em um teste de citoxicidade com as células sanguíneas vermelhas humanas, sendo o dito polímero caracterizado pelo fato de que está na forma de um conjugado ou um complexo com uma biomolécula natural ou

15 sintética farmaceuticamente efetiva ou um ingrediente farmacêutico ativo.
2. Polímero sensível ao pH, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que está acoplado a um agente que altera a conformação.
3. Polímero sensível ao pH, de acordo com a reivindicação 1 ou

20 2, caracterizado pelo fato de que é um constituinte de um complexo reticulado via ácidos nucléicos após a modificação química.
4. Processo para preparar um polímero sensível ao pH, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

25 polimerizar via radicais livres os monômeros na presença de iniciadores da polimerização e reguladores do peso molecular por polimerização em blocos, glóbulos ou emulsão, polimerização por transferência de grupos (GTP), polimerização via radicais por transferência de átomos (ATRP),

30 descarga do polímero, dissolução do polímero, purificar o polímero, e

Petição 870180022345, de 20/03/2018, pág. 5/10 secar o polímero.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a dodecilmercaptana e/ou o tioglicolato de 2-etilexila é empregado como regulador do peso molecular.
6. Uso de um polímero sensível ao pH, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é como veículo, conjugado ou complexo com biomoléculas naturais ou sintéticas ou ingredientes farmacêuticos ativos, onde apropriado como constituinte de micropartículas, nanopartículas, lipossomos, emulsões e/ou vesículas lipídicas.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é como veículo, conjugado ou complexo em combinação com lipídios, proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos (DNA e RNA), em particular, oligonucleotídeos, nucleosídeos, DNA anti-sentido ou RNA anti-sentido, nucleotídeos, toxinas, imunotoxinas, anticorpos ou fragmentos de anticorpos ou uma combinação dos mesmos.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é como veículo, conjugado ou complexo em combinação com ingredientes farmacêuticos ativos a partir das classes de ingredientes ativos de analgésicos, antialérgicos, anti-reumáticos, antibióticos, antiinfectivos, agentes antiparkinson, antipsoriáticos, agentes antitumor, substâncias dermatológicas, remédios para gota, imunorreguladores, agentes gastrointestinais, agentes neurotrópicos, substâncias oftalmológicas, citoestáticos.

Petição 870180022345, de 20/03/2018, pág. 6/10