DE102020002360A1

DE102020002360A1 - Nanopartikel enthaltend Komplexe aus Nukleinsäuren und kationischen Copolymeren, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung zum Gentransfer in Zellen

Info

Publication number: DE102020002360A1
Application number: DE102020002360.6A
Authority: DE
Inventors: Anja Träger; Jana Ines Solomun
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU
Priority date: 2020-04-18
Filing date: 2020-04-18
Publication date: 2021-10-21
Also published as: US20230218536A1; CN115715186A; WO2021209169A2; CA3179980A1; WO2021209169A3; EP4135657A2

Abstract

Beschrieben werden Nanopartikel enhaltend Komplexe gebildet aus Nukleinsäuren und kationischen Copolymeren enthaltend die wiederkehrenden Struktureinheiten der Formeln (la) und (Ib)

worin
R¹ und R⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl oder -COOR⁹ bedeuten,
R² und R⁷ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl sind,
R³ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -O-R¹⁰-, -COO-R¹⁰-,

-CONH-R¹⁰- oder -R¹⁰-,
R⁴ Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl
oder Alkylaryl bedeutet,
R⁵ Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Alkylaryl oder -(Alkylen-NH-)_m-Alkyl bedeutet, oder
R⁴ und R⁵ zusammen mit dem gemeinsamen Stickstoffatom einen heterozyklischen Ring bilden,
R⁸ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -O-R¹¹, -COO-R¹¹, -CONH-R¹¹ oder -R¹¹,
R⁹ und R¹¹ unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen einwertigen organischen Rest bedeuten, R¹⁰ einen zweiwertigen organischen Rest bedeutet, und m eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, mit der Massgabe, dass
die Nanopartikel einen mittels dynamischer Lichstreuung ermittelten Durchmesser (z-Average) von kleiner gleich 900 nm aufweisen.
Mit Hilfe dieser Nanopartikel lassen sich Nukleinsäuren mit großer Effizienz in Zellen übertragen.

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Herstellung und Verarbeitung von Nanopartikeln enthaltend Nukleinsäure-Komplexe mit ausgewählten Copolymeren. Diese Komplexe lassen sich vorteilhaft bei der Übertragung von Nukleinsäuren in Zellen einsetzen.
Kationische Polymere stehen seit einiger Zeit als Vehikel für den Gentransfer im Fokus. Kationische Gruppen wie primäre, sekundäre und tertiäre Amine in der Seitenkette, wie beispielsweise im 2-(Dimethylamino)ethylmethacrylat (DMAEMA) oder im Rückgrat, wie sie in linearem Polyethylenimin (IPEI) vorkommen, können das genetische Material durch elektrostatische Wechselwirkungen binden und kondensieren. Dadurch ist das genetische Material vor Abbau durch beispielweise Nukleasen geschützt und kann gleichzeitig in Zellen transportiert werden. Durch Einführung weiterer hydrophober Einheiten in kationische, wasserlösliche Polymere kann zusätzlich die in vitro-Effizienz des Gentransfers unter anderem durch eine verbesserte Interaktion mit Zellmembranen erhöht werden.
Aminogruppen sowie hydrophobe Struktureinheiten enthaltende Copolymere sind bekannt. Ein Beispiel dafür ist das Polymer Eudragit^® E. Dieses Copolymer wird zur Herstellung von Beschichtungen für oral verabreichbare Arzneimittel eingesetzt. Die Umhüllung bewirkt beispielsweise eine Maskierung des Geschmacks des Arzneimittels. Dabei handelt es sich um ein Copolymer abgeleitet von 2-(Dimethylamino)ethylmethacrylat (DMAEMA), Methylmethacrylat (MMA) und Butylmethacrylat (BMA), welches auch als Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer bezeichnet werden kann.
Es ist weiterhin bekannt, Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer zur Steigerung der Transfektionseffizienz von IPEI-DNA-Komplexen einzusetzen (N. Kanthamneini, B. Yung, R.J. Lee, Anticancer Research 36: 81-86 (2016)). In diesem Dokument wurde berichtet, dass die Kombinationen von DNA komplexiert mit IPEI (= lineares Polyethylenimin) und Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer als Zusatz verglichen mit IPEI allein bei niedrigen N/P-Verhältnissen eine synergistische Wirkung auf die Genexpression von DNA bewirken. Hergestellt wurden Nanopartikel, die aus einer Kombination von IPEI und (pEGFP)-DNA (= Plasmid, das ein verstärkt grün fluoreszierendes Protein kodiert) bestanden. Außerdem wurden Nanopartikel hergestellt, bei denen Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer ergänzt wurde. Der Anteil an Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer an der Gesamtmasse des Nanopartikels war mit weniger als 16 Gew. % relativ gering. In diesem Dokument wird darüber berichtet, dass es nicht möglich war, Nanopartikel nur bestehend aus Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer und (pEGFP)-DNA herzustellen. In diesem Dokument wurde auch dargestellt, dass die alleinige Verwendung von Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer als kationisches Polymer, also ohne IPEI, keine Genexpression verursacht. Desweiteren wurde in diesem Dokument auf frühere Dokumente verwiesen, in denen Studien über den Einsatz von Nanopartikeln aus DNA und DMAEMA-Homopolymer in Transfektionsexperimenten beschrieben waren. Die Effizienz dieser Systeme ist jedoch der Effizenz von IPEI unterlegen.
R. Jain, P. Dandekar, B. Loretz, M. Koch und C.M. Lehr beschreiben in Med. Chem. Commun. 2015, 6, 691-701 Nanopartikel aus Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer und siRNA. Diese Partikel wurden zur Stillegung eines therapeutisch relevanten Gens (gene-silencing) in Makrophagen eingesetzt. Das mit siRNA beladene kationische Copolymer wurde dazu eingesetzt, den Transfer der siRNA in das Zytoplasma von Makrophagen zu fördern. Die Herstellung der Nanopartikel erfolgte durch das Eintragen einer Lösung des kationischen Copolymers in den organischen Lösungsmitteln Aceton oder Ethylacetat in eine wässrige Polyvinylalkohollösung mit Hilfe eines Hochgeschwindigkeits-Homogenisators. Für eine ausreichende Stabilität der Nanopartikel sind Stabilisatoren nötig. Anstelle des Schutzkollodis Polyvinylalkohol wurden auch Tenside als Stabilisatoren verwendet, z.B. Vitamin E-TPGS oder Poloxamer 407. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde eine stabilisierte Nanopartikel-Suspension erhalten, der anschließend pDNA (pUC 18DNA) und danach siRNA hinzugefügt wurden. Die Nukleinsäuren können dadurch an die Oberfläche der Nanopartikel gebunden werden (elektrostatische Wechselwirkung) und es bildet sich eine Kern-Schale-Struktur der Nanopartikel aus. Außerdem enthalten diese polymerbasierten Partikel zur Stabilisation Schutzkolloide bzw. Tenside. Der Einsatz solcher Stabilisatoren ist jedoch kritisch zu sehen, da die Partikeleigenschaften dadurch beeinflusst werden, beispielsweise die Oberflächenladung (bzw. das Zeta-Potential) der Partikel. So wirken beispielsweise Polyvinylalkohol wie auch andere Tenside bei hohen Konzentrationen zellschädigend und führen demzufolge dazu, dass hergestellte Partikel nachträglich aufgereigt werden müssen. Eine Genexpression ist in dieser Arbeit nicht beschrieben bzw. gezeigt, obwohl auch pDNA verwendet wurde.
A. Basarkar und J. Singh beschreiben in Pharmaceutical Research, vol. 26, No. 1, Jan. 2009, 72-81 Nanopartikel aus einer Kombination von Poly(lactid-co-glycolid) und Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer. Diese Partikel wurden mit einem Plasmid beladen, das ein Interleukin-10 Gen der Maus kodiert. Die Herstellung der Nanopartikel erfolgte durch das Eintragen einer Lösung der Polymere in dem organischen Lösungsmittel Dichlormethan in eine mit Phosphat gepufferte wässrige Lösung. Der Anteil der kationischen Copolymere betrug bis zu 50 Gew. % der gesamten Menge an Polymeren. Durch Beschallen mit Ultraschall wurde eine w/o-Emulsion erhalten. Diese wurde mit dem kationischen Tensid Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) versetzt und nochmals beschallt, wodurch eine w/o/w-Emulsion entstand. Das organische Lösungsmittel wurde verdampft, die Nanopartikel wurden durch Zentrifugieren abgetrennt und überschüssiges Tensid wurde entfernt. Danach wurden die Nanopartikel gefriergetrocknet. Die Beladung mit dem Plasmid erfolgte durch Suspendieren der fertigen Nanopartikel in eine Plasmidlösung. Die Nukleinsäuren werden dabei durch elektrostatische Wechselwirkungen an die Oberfläche der Nanopartikel gebunden und es bildet sich eine Kern-Schale-Struktur der Nanopartikel aus. Außerdem enthalten diese polymerbasierten Partikel zur Stabilisierung kationische Tenside, die eine positive Ladung auf der Oberfläche der Partikel induzieren und dadurch zu einer Bindung des genetischen Materials beitragen können.
G. Doerdelmann, D. Kozlova und M. Epple beschreiben in J. Mater. Chem. B 2014, 2, 7123-7131 ein pH-sensitives Poly(methylmethacrylat)-Copolymer für die Verwendung als effektives Agens für den Wirkstoff- und Gentransfer durch eine Zellmembran. Beschrieben wird ein System aus Ca-phosphat/ Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer Nanopartikeln mit Durchmessern von weniger als 200 nm in Form einer Wasser-in-ÖI-in-Wasser-Emulsion. Die Herstellung dieser Partikel erfolgt durch die Herstellung von mit siRNA beladenen Ca-Phosphat Nanopartikeln, indem wässrige Lösungen von Ca-Lactat und von Ammoniumhydrogenphosphat miteinander vermischt wurden und unter starkem Rühren zu einer wässrigen Lösung von anti-EGFP-siRNA gegeben wurden. Es bildete sich eine Dispersion von Nanopartikeln aus einem Kern aus Ca-Phosphat, der von der anti-EGFP-siRNA umhüllt ist. Diese Nanopartikel wurden anschließend in das Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer verkapselt, indem die Suspension zu einer Lösung des Copolymeren in Dichlormethan gegeben wurde. Nach Zusatz einer wässrigen Lösung von Albumin aus Kälberserum (BSA) wurde diese mit Ultraschall behandelt und es bildete sich eine primäre W/O-Emulsion. Diese wurde in Wasser gegossen, das mit Polyvinylalkohol als Dispergiermittel versetzt war, und wiederum mit Ultraschall behandelt. Nach 3-stündigem starkem Rühren war das Dichlormethan verdampft und es hatten sich Nanopartikel mit Kern-Schale Struktur aus Ca-Phosphat/anti-EGFP-siRNA gebildet, die von einer Umhüllung aus Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer umgeben waren.
Vorbekannte Partikel enthalten Kombinationen von Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer mit Nukleinsäuren weisen also eine Kern-Schale-Struktur auf, wobei die Nukleinsäuren sich auf der Oberfläche eines Polymerkerns oder eines Kerns aus anorganischem Material befinden oder die Nukleinsäuren sind von Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer umhüllt also nicht gebunden oder Dimethylaminoethylmethacrylat-Copolymer wird mit einem Überschuss an IPEI kombiniert. Häufig enthalten diese vorbekannten Nanopartikel auch Tenside oder Schutzkolloide als Stabilisatoren, die einen Einfluss auf Ladung und Interaktion mit dem genetischen Material und Zellen haben können.
Es wurde jetzt überraschend gefunden, dass sich Nanopartikel herstellen lassen, die Komplexe aus Nukleinsäuren und ausgewählten kationischen Copolymeren enthalten, wobei die Nukleinsäure besser durch das kationische Copolymere komplexiert und kondensiert wird als bei Komplexen, die mit bekannten Verfahren hergestellt worden sind. Dieses äußert sich unter anderem in einem geringeren Teilchendurchmesser der erfindungsgemäß erzeugten Nanopartikel verglichen mit herkömmlich erzeugten Nanopartikeln, insbesondere bei hohem Anteil an genetischem Material.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand in der Bereitstellung von Nanopartikeln, die eine kompakte und einfach aufgebaute Struktur sowie einen hohen Gehalt an Nukleinsäure-Copolymer-Komplexen aufweisen und die sich hervorragend für den Gentransfer von Nukleinsäuren eignen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand in der Bereitstellung von Nukleinsäure-Copolymer-Nanopartikeln, die frei von irgendwelchen Stabilisatoren sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand in der Bereitstellung eines Herstellungsverfahrens für Nanopartikel, welches keine organischen Lösungsmittel benötigt, einfach, schnell und reproduzierbar durchzuführen ist und zu Nukleinsäure-Copolymerkomplexen mit hoher Gentransfereffizienz führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft Nanopartikel enhaltend Komplexe gebildet aus Nukleinsäuren und kationischen Copolymeren enthaltend die wiederkehrenden Struktureinheiten der Formeln (la) und (Ib)
worin
R¹ und R⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl oder-COOR⁹ bedeuten,
R² und R⁷ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl sind,
R³ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -O-R¹⁰-, -COO-R¹⁰-, -CONH-R¹⁰- oder -R¹⁰-,
R⁴ Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkylaryl bedeutet,
R⁵ Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Alkylaryl oder -(Alkylen-NH-)_m-Alkyl bedeutet, oder
R⁴ und R⁵ zusammen mit dem gemeinsamen Stickstoffatom einen heterozyklischen Ring bilden,
R⁸ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -O-R¹¹, -COO-R¹¹, -CONH-R¹¹ oder -R¹¹,
R⁹ und R¹¹ unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen einwertigen organischen Rest bedeuten,
R¹⁰ einen zweiwertigen organischen Rest bedeutet, und
m eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, mit der Massgabe, dass
die Nanopartikel einen mittels dynamischer Lichstreuung ermittelten Durchmesser (z-Average) von kleiner gleich 900 nm aufweisen.
In den erfindungsgemäßen Nanopartikeln können als Nukleinsäuren DNA und/oder RNA und deren Modifikationen eingesetzt werden.
Es können beliebige DNA-Typen eingesetzt werden. Beispiele dafür sind A-DNA, B-DNA, Z-DNA, mtDNA, antisense DNA, bakterielle DNA und virale DNA.
Es können auch beliebige RNA-Typen eingesetzt werden. Beispiele dafür sind hnRNA, mRNA, tRNA, rRNA, mtRNA, snRNA, snoRNA, scRNA, siRNA, miRNA, antisense RNA, bakerielle RNA und virale RNA.
In den erfindungsgemäßen Komplexen können auch Kombinationen von DNA und RNA eingesetzt werden.
Als kationische Copolymere werden in den erfindungsgemäßen Komplexen Copolymere eingesetzt, die mindestens eine wiederkehrende Struktureinheit der Formel (la) enthalten, welche sich ableitet von einem ethylenisch ungesättigten und eine Aminogruppe enthaltenden Monomer und die mindestens eine weitere wiederkehrende Struktureinheit der Formel (Ib), vorzugsweise mindestens zwei unterschiedliche Struktureinheiten der Formel (Ib) enthalten, die sich ableiten von ethylenisch ungesättigten und einen Kohlenwasserstoffrest enthaltenden Monomeren.
Die in den erfindungsgemäßen Komplexen eingesetzten kationischen Copolymere können ein oder mehrere unterschiedliche, wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (la) enthalten. Vorzugsweise enthalten diese Copolymere nur einen Typ von wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel (la).
Die in den erfindungsgemäßen Komplexen eingesetzten kationischen Copolymere können ein oder mehrere unterschiedliche, wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (Ib) enthalten. Vorzugsweise enthalten diese Copolymere neben den wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel (la) nur einen oder zwei unterschiedliche Typen von wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel (Ib).
Neben den wiederkehrenden Struktureinheiten der Formeln (Ia und (Ib) können die in den erfindungsgemäßen Komplexen eingesetzten kationischen Copolymere noch weitere wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (Ic) enthalten

worin
R¹², R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl, bevorzugt Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl, besonders bevorzugt Wasserstoff oder Methyl sind, und
BG eine zweiwertige organische Brückengruppe mit Ether-, Ester-, Amid-, Sulfid-, Phosphat- oder Disulfidgruppen bedeutet.
Die Anwesenheit von Struktureinheiten der Formel (Ic) im erfindungsgemäß eingesetzten Copolymeren verleiht diesem eine verbesserte Bioabbaubarkeit.
Beispiele für Polymere, von denen sich wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (Ic) ableiten, sind Polyester, Polyamide, Polyether, Phosphate, Sulfide oder Disulfide, die jeweils zwei Endgruppen mit ethylenisch ungesättigten Gruppen, wie Vinyl- oder Allylgruppen aufweisen.
Die Reste R¹, R², R⁴- R⁷ und R¹² - R¹⁴ können Alkyl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Alkylgruppen mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen, die geradkettig oder verzweigt sein können. Bevorzugt sind Methyl und Ethyl, insbesondere Methyl.
Die Reste R⁴ und R⁵ können Cycloalkyl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Cycloalkylgruppen mit fünf bis sechs Ringkohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt ist Cyclohexyl.
Die Reste R⁴ und R⁵ können Aryl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um aromatische Kohlenwasserstoffreste mit fünf bis zehn Ringkohlenstoffatomen. Bevorzugt ist Phenyl.
Die Reste R⁴ und R⁵ können Alkylaryl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Arylgruppen, die mit ein oder zwei Alkylgruppen substituiert sind. Bevorzugt ist Tolyl.
Die Reste R⁴ und R⁵ können Aralkyl bedeuten. Dabei handelt es sich in der Regel um Arylgruppen, die über eine Alkylengruppe mit dem Rest des Moleküls verbunden sind. Bevorzugt ist Benzyl.
R⁵ kann auch ein Rest der Formel -(Alkylen-NH-)_m-Alkyl sein. Die Alkylenreste weisen dabei in der Regel zwei bis vier Kohlenstoffatome auf und können verzweigt oder vorzugsweise geradkettig sein. Die Alkylgruppe weist in der Regel ein bis vier Kohlenstoffatome auf, und ist vorzugsweise Ethyl oder Methyl, insbesondere Methyl. Die Anzahl der Wiederholeinheiten, gekennzeichnet durch den Index m beträgt 1 bis 5, vorzugsweise 1 bis 3.
R⁴ und R⁵ können auch zusammen mit dem gemeinsamen Stickstoffatom einen heterozyklischen Ring bilden. Dabei handelt es sich in der Regel im Ringe mit insgesamt fünf bis sechs Ringatomen, wovon ein oder zwei Ringatome Heteroatome sind, und der Rest der Ringatome Kohlenstoffatome darstellt. Eines der Ringheteroatome ist ein Stickstoffatom. Bei einem gegebenenfalls zusätzlich anwesenden Ringheteroatom handelt es sich um Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel.
R⁹ und R¹¹ können unabhängig voneinander einwertige organische Reste sein. Dabei handelt es sich um organische Reste mit einer kovalenten Bindung, welche die Verbindung zum Rest des Moleküls herstellt. Bei den einwertigen organischen Resten handelt es sich in der Regel um Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkylaryl oder Aralkyl.
R¹⁰ ist ein zweiwertiger organischer Rest. Dabei handelt es sich um organische Reste mit zwei kovalenten Bindungen, welche die Verbindung zum Rest des Moleküls herstellen. Bei den zweiwertigen organischen Resten handelt es sich in der Regel um Alkylen, Cycloalkylen, Arylen, Alkylarylen oder Aralkylen.
Bevorzugt werden Copolymere eingesetzt, in denen R¹ und R⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl, insbesondere Wasserstoff oder Methyl und ganz besonders bevorzugt Wasserstoff bedeuten.
Bevorzugt werden Copolymere eingesetzt, in denen R² und R⁷ unabhängig voneinander Wasserstoff oder C₁-C₉-Alkyl, insbesondere Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl, besonders bevorzugt Wasserstoff oder Methyl und insbesondere bevorzugt Methyl bedeuten.
Bevorzugt werden Copolymere eingesetzt, in denen R³ einen zweiwertigen Rest der Formeln -O-R¹⁰-, -COO-R¹⁰-, -CONH-R¹⁰- oder -R¹⁰- darstellt, und R¹⁰ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C₂-C₁₂-Alkylen, C₅-C₇-Cycloalkylen und C₆-C₁₀-Arylen, insbesondere C₂-C₆-Alkylen, und ganz besonders bevorzugt Ethylen ist.
Bevorzugt werden Copolymere eingesetzt, in denen R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl, und insbesondere Wasserstoff und Methyl und ganz besonders bevorzugt Methyl bedeuten.
Bevorzugt werden Copolymere eingesetzt, in denen R⁸ einen einwertigen Rest der Formeln -O-R¹¹, -COO-R¹¹, -CONH-R¹¹ oder -R¹¹ darstellt, und R¹¹ Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkylaryl bedeutet, insbesondere C₁-C₆-Alkyl, Vinyl, Allyl, Phenyl, Benzyl oder C₁-C₆-Alkylphenyl und ganz besonders bevorzugt C₁-C₆-Alkyl.
Besonders bevorzugt werden Copolymere eingesetzt, in denen R⁸ -COO-R¹¹ oder -CONH-R¹¹ darstellt, und R¹¹ C₁-C₆-Alkyl, Phenyl, Benzyl oder C₁-C₆-Alkylphenyl, ganz besonders bevorzugt C₁-C₆-Alkyl und äußerst bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl und/oder Butyl bedeutet.
Bevorzugt werden Copolymere eingesetzt, in denen R⁹ und R¹¹ unabhängig voneinander Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkylaryl bedeuten, insbesondere C₁-C₆-Alkyl, Phenyl, Benzyl oder C₁-C₆-Alkylphenyl und ganz besonders bevorzugt C₁-C₆-Alkyl.
Bevorzugt werden Copolymere eingesetzt, in denen R¹⁰- C₂-C₁₂-Alkylen, C₅-C₇-Cycloalkylen und C₆-C₁₀-Arylen ist, insbesondere C₂-C₆-Alkylen, und ganz besonders bevorzugt Ethylen bedeutet.
Besonders bevorzugt werden Copolymere enthaltend eine wiederkehrende Struktureinheit der Formel (la) und zwei unterschiedliche wiederkehrende Strukturenheiten der Formel (Ib) eingesetzt, in denen R¹ und R⁶ Wasserstoff bedeuten, R² und R⁷ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, insbesondere Methyl, R³ -COO-R¹⁰- ist, R¹⁰ Ethylen bedeutet, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander C₁-C₆-Alkyl sind, insbesondere Methyl, und R⁸ -COO-R¹¹ ist, wobei in einer wiederkehrenden Struktureinheit der Formel (Ib) R¹¹ C₁-C₃-Alkyl, insbesondere Methyl ist, und in einer anderen wiederkehrenden Struktureinheit der Formel (Ib) R¹¹ C₄-C₆-Alkyl, insbesondere n-Butyl ist.
Es wird angenommen, dass die kompakten erfindungsgemäßen Nanopartikel Nukleinsäure-Copolymer-Komplexe enthalten, welche über das gesamte Volumen des Nano-partikels verteilt sind. Im Gegensatz zu vorbekannten Nanopartikeln mit ausgeprägter Kern-Schale-Struktur und mit einer Konzentration der Nukleinsäure-Polymer-Komplexe in der äußeren Hülle sind bei den erfindungsgemäßen Nanopartikeln Nukleinsäure-Copolymer-Komplexe sowohl im Innern als auch in den äußeren Bereichen der Nanopartikel zu finden. Solche Nanopartikel werden nachstehend auch „Polyplexe“ genannt.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel sind weiterhin durch einen hohen Gehalt an Nukleinsäure charakterisiert. Der Gewichtsanteil an kationischem Copolymer enthaltend die wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel (la) und (Ib) in den erfindungsgemäßen Nanopartikeln beträgt typischerweise 15 bis 99 %, und vorzugsweise 20 bis 90 % und insbesondere 30 bis 80 %, bezogen auf die Gesamtmasse der Nanopartikel.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel lassen sich durch deren Teilchendurchmesser charakterisieren. Typische Teilchendurchmesser (beispielsweise z-Average) bewegen sich im Bereich von kleiner gleich 900 nm, vorzugsweise von kleiner gleich 500 nm, besonders bevorzugt zwischen 30 und 500 nm, ganz besonders bevorzugt zwischen 40 und 250 nm und insbesondere zwischen 50 und 200 nm. Die Teilchendurchmesser werden für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung durch dynamische Lichtstreuung (DLS) unter Verwendung eines Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, Vereinigtes Königreich) bestimmt. Mittels Kumulantenanalyse der Korrelationsfunktion (ISO13321, ISO22412) wurde der intensitätsgewichtete mittlere Durchmesser (beispielsweise z-average) bestimmt. Zur Größenbestimmung wurde ein Brechungsindex von 1,33 für ultrareines Wasser und von 1,59 für das Copolymer angenommen.
Teilchendurchmesser können alternativ auch durch andere Methoden bestimmt werden, beispielsweise durch Nanosize-Tracking-Analysis (NTA), oder durch Elektronenmikroskopie, z.B. mittels Transmissions-Elektronenmikroskop oder mittels Raster-Elektronenmikroskop.
Teilchendurchmesser (z-Average) von bevorzugten erfindungsgemäßen Nanopartikeln bewegen sich im Bereich zwischen 50 und 200 nm, ermittelt durch dynamische Lichtstreuung (DLS).
Die erfindungsgemäß eingesetzten kationischen Copolymere und die erfindungsgemäßen Nanopartikel lassen sich weiterhin durch deren Polydispersitätsindex (beziehungsweise PDI) charakterisieren. Der Polydispersitätsindex Ð oder PDI_MW von Molekulargewichten ist ein Maß für die Breite der Molmassenverteilung eines Polymers. Der Polydispersitätsindex D oder PDI_MW berechnet sich aus dem Verhältnis von Gewichtsmittel zu Zahlenmittel der Molmassenverteilung. Je größer D, desto breiter ist die Molmassenverteilung. Bei sehr engen Molekulargewichtsverteilungen strebt der Wert von PDI_MW gegen 1 bei breiteren Molekulargewichtsverteilungen ist der Wert von PDI_MW deutlich größer als 1.
Der Polydispersitätsindex der Teilchengrößenverteilung PDI_TG hingegen gibt die Breite der Verteilung der Teilchengrößen von Partikeln an. Dabei können Werte zwischen 0 (monodispers) und 1 (polydispers) angenommen werden. Der PDI_TG Wert wird für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung durch dynamische Lichtstreuung (DLS) unter Verwendung eines Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, Vereinigtes Königreich) bestimmt. Mittels Kumulantenanalyse der Korrelationsfunktion wurde PDI_TG bestimmt.
Der PDI_TG-Wert der Teilchengrößenverteilung der erfindungsgemäßen Nanopartikel bewegt sich typischerweise im Bereich zwischen 0,05 und 0,4, vorzugsweise zwischen 0,1 und 0,4 und besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 0,3.
Der Polydispersitätsindex D der Molmassenverteilung der erfindungsgemäß eingesetzten kationischen Copolymere bewegt sich typischerweise im Bereich zwischen 1,0 und 5,0, vorzugsweise zwischen 1,01 und 2,6.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel lassen sich auch durch deren Transfektionseffizienz für DNA charakterisieren. Dazu werden Nanopartikel enthaltend ein ausgewähltes Protein kodierende DNA, beispielsweise eGFP-kodierende DNA, mit Zellen für eine vorbestimmte Zeit, beispielsweise 1 Stunde lang, in Kontakt gebracht und inkubiert. Anschließend werden die Zellen 23 Stunden lang in Wachstumsmedium ohne Nanopartikel inkubiert und danach wird ermittelt, wieviele der Zellen das ausgewählte Protein exprimieren. Der in Prozent angegebene Anteil an exprimierenden Zellen wird als Transfektionseffizienz für DNA bezeichnet.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nanopartikel weisen nach 1 Stunde Inkubationszeit eine Transfektionseffizienz für DNA von 15 bis 50% (viable fluoreszierende Zellen), insbesondere von 20 bis 45% auf.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel lassen sich weiterhin durch deren N/P-Verhältnis charakterisieren. Darunter versteht man das molare Verhältnis von Stickstoffatomen im Copolymer zu den Phosphatgruppen in der Nukleinsäure.
Das N/P-Verhältnis in den erfindungsgemäßen Nanopartikeln kann in weiten Bereichen schwanken. Typischerweise beträgt das N/P-Verhältnis in den erfindungsgemäßen Nanopartikeln, zwischen 1 und 200, vorzugsweise zwischen 2,5 und 100, besonders bevorzugt zwischen 5 und 50, und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 30.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nanopartikel weisen mittels DLS bestimmte Durchmesser (z-Average) zwischen 40 und 250 nm, insbesondere zwischen 50 und 200 nm auf sowie einen Polydispersitätsindex der Teilchendurchmesser zwischen 0,1 und 0,3.
Ganz besonders bevorzugte erfindungsgemäße Nanopartikel weisen mittels DLS bestimmte Durchmesser (z-Average) zwischen 40 und 250 nm, insbesondere zwischen 50 und 200 nm auf, und einen Polydispersitätsindex der Teilchendurchmesser zwischen 0,1 und 0,3 und ein N/P-Verhältnis zwischen 10 und 30.
Der molare Anteil der wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel (la) in den erfindungsgemäß eingesetzten kationischen Copolymeren beträgt üblicherweise zwischen 10 und 75%, vorzugsweise zwischen 15 und 65% und ganz besonders bevorzugt zwischen 20 und 55%, bezogen auf das gesamte kationische Copolymer.
Der molare Anteil der wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel (Ib) in den erfindungsgemäß eingesetzten kationischen Copolymeren beträgt üblicherweise zwischen 90 und 25%, vorzugsweise zwischen 85 und 45% und ganz besonders bevorzugt zwischen 80 und 45%, bezogen auf das gesamte kationische Copolymer.
Der molare Anteil der wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel (Ic) in den erfindungsgemäß eingesetzten kationischen Copolymeren beträgt üblicherweise zwischen 0 und 25%, vorzugsweise zwischen 1 und 10% und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 10%, bezogen auf das gesamte kationische Copolymer.
Bevorzugt sind erfindungsgemäße Nanopartikel, die keine Hilfs- oder Zusatzstoffe, insbesondere keine Schutzkolloide und/oder Tenside enthalten.
Für den Fall, dass die erfindungsgemäßen Nanopartikel neben den oben beschriebenen Nukleinsäure-Copolymer-Komplexen zusätzliche Polymere oder zusätzliche Komplexe von Nukleinsäuren mit zusätzlichen Polymeren, z.B. Komplexe von Nukleinsäuren mit IPEI enthalten, so liegen diese weiteren Komponenten nur in geringen Mengen vor, beispielsweise beträgt deren Gewichtsanteil 15% oder darunter, insbesondere weniger als 5%.
Besonders bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Nanopartikel neben den oben beschriebenen Nukleinsäure-Copolymer-Komplexen keine weiteren Komplexe von Nukleinsäuren mit anderen Polymeren.
Die Begriffe „Teilchen“ oder „Partikel“ werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung synonym verwendet.
Unter „Nanopartikeln“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Teilchen zu verstehen, deren Durchmesser (z-Average) kleiner gleich 900 nm ist und die aus kationischen Copolymeren sowie Komplexen daraus mit Nukleinsäuren oder nur aus solchen Komplexen aufgebaut sein können. Sie zeichnen sich allgemein durch ein sehr hohes Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis aus und bieten damit eine sehr hohe chemische Reaktivität. Nanopartikel können nur aus den genannten kationischen Copolymeren und Komplexen oder auch nur aus den Komplexen bestehen oder enthalten neben den Copolymeren und Komplexen noch andere Bestandteile, wie z.B. Wirkstoffe oder Hilfs- oder Zusatzstoffe.
Unter „Copolymeren“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung die oben genannten organischen Verbindungen zu verstehen, die durch Wiederholung von mindestens zwei unterschiedlichen bestimmten Einheiten (Monomereinheiten oder Wiederholungseinheiten) gekennzeichnet sind. Copolymere werden durch die chemische Reaktion von Monomeren unter Ausbildung von kovalenten Bindungen hergestellt (Polymerisation) und bilden durch Verknüpfen der polymerisierten Einheiten das sogenannte Polymerrückgrad. Dieses kann Seitenketten aufweisen, an denen sich funktionelle Gruppen befinden können. Die Copolymere weisen zum Teil hydrophobe Eigenschaften auf, und können konzentrationsabhängig in wässriger Umgebung nanoskalige Strukturen (z.B. Nanopartikel, Mizellen, Vesikel) ausbilden. Die Copolymere bestehen aus mindestens zwei, vorzugsweise aus drei unterschiedlichen Monomereinheiten, welche statistisch, als Gradient oder alternierend angeordnet sein können.
Unter „Tensiden“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung nicht-polymere Stoffe oder Stoffgemische zu verstehen, die wasserlösliche und wasserunlösliche Eigenschaften aufweisen und die der Stabilisierung von Partikeln während der Herstellung und der Lagerung in wässrigen Medien dienen. Sie werden üblicherweise dem Dispergiermedium, z.B. der wässrigen Phase, bei der Herstellung der Partikel zugegeben, können aber auch nach deren Herstellung zur Stabilisierung der erhaltenen Dispersion zugegeben werden. So könnten z.B. kationische Tenside auf der Oberfläche der Nanopartikel angelagert werden, um deren Oberflächenladung zu verschieben und so eine Bindung von Nukleinsäuren auf der Oberfläche zu ermöglichen, beispielsweise durch Beschichtung mit CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid).
Unter „Schutzkolloiden“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung wasserlösliche oder wasserdispergierbare Polymere oder Polymergemische zu verstehen, die der Stabilisierung von Partikeln während der Herstellung und der Lagerung in wässrigen Medien dienen. Sie werden üblicherweise dem Dispergiermedium, z.B. der wässrigen Phase, bei der Herstellung der Partikel zugegeben, können aber auch nach deren Herstellung zur Stabilisierung der erhaltenen Dispersion zugegeben werden.
Unter „wasserlöslichen Verbindungen“ oder „wasserlöslichen Polymeren“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Verbindungen bzw. Polymere zu verstehen, die sich zu mindestens 1 g/L Wasser bei 25 °C und bei neutralen pH-Werten lösen.
Unter „Hilfs- und Zusatzstoffen“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Substanzen zu verstehen, die einer Formulierung zugesetzt werden, um dieser bestimmte zusätzliche Eigenschaften zu verleihen und/oder um deren Verarbeitung zu erleichtern. Beispiele für Hilfs- und Zusatzsstoffe sind Tracer, Kontrastmittel, Trägerstoffe, Füllstoffe, Pigmente, Farbstoffe, Parfums, Gleitmittel, UV-Stabilisatoren, Antioxidantien oder Tenside. Insbesondere ist unter „Hilfs-und Zusatzstoffen“ jede pharmakologisch verträgliche und therapeutisch sinnvolle Substanz zu verstehen, die kein pharmazeutischer Wirkstoff ist, jedoch zusammen mit einer Nukleinsäure in einem Nukleisäure-Copolymer-Komplex formuliert werden kann, um qualitative Eigenschaften des Nanopartikels zu beeinflussen, insbesondere zu verbessern. Bevorzugt entfalten die Hilfs- und/oder Zusatzstoffe keine oder im Hinblick auf die beabsichtigte Behandlung keine nennenswerte oder zumindest keine unerwünschte Wirkung.
Unter „Gentransfer“ ist im Rahmen der vorliegenden Beschreibung das Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen und deren funktionale Freisetzung in den Zellen zu verstehen.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können als Pulver in fester Form vorliegen oder sie können eine Dispersion bilden und in wässrigen Lösungsmitteln dispergiert vorliegen, wobei die Teilchen im Dispergiermedium in fester Form vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform bilden die erfindungsgemäßen Nanopartikel eine disperse Phase in Wasser oder in einer wässrigen Pufferlösung .
Die Löslichkeit der erfindungsgemäß eingesetzen Copolymere kann durch CoPolymerisation mit geeigneten Monomeren und durch Funktionalisierung beeinflusst werden. Dem Fachmann sind solche Techniken bekannt.
Der Anteil der erfindungsgemäßen Nanopartikel in einer Dispersion kann einen weiten Bereich umfassen. Typischerweise beträgt der Gewichtsanteil der Nanopartikel in der Dispersion zwischen 0,01 und 20%, vorzugsweise zwischen 0.05 und 5 %.
Die erfindungsgemäß eingesetzten organischen Copolymere können einen weiten Molmassenbereich umfassen. Typische Momassen (M_n) bewegen sich im Bereich von 2.000 bis 500.000 g/mol, insbesondere von 5.000 bis 50.000 g/mol. Diese Molmassen können durch ¹H-NMR-Spektroskopie des gelösten Copolymers bestimmt werden. Insbesondere lassen sich zur Bestimmung der Molmassen eine analytische Ultrazentrifuge oder chromatographische Methoden, wie die Größenausschlusschromatographie, einsetzen.
Bevorzugt eingesetzte organische Copolymere weisen eine mittlere Molmasse (Zahlenmittel) im Bereich von 5.000 bis 40.000 g/mol auf, ermittelt durch ¹H-NMR-Spektroskopie oder durch Verwendung einer analytischen Ultrazentrifuge.
Die Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzen kationischen Copolymere kann mit den üblichen Polymerisationsverfahren erfolgen. Beispiele dafür sind die Polymerisation in Substanz, die Polymerisation in Lösung oder die Emulsions- bzw. Suspensionspolymerisation. Dem Fachmann sind diese Vorgehensweisen bekannt.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können durch Nanofällung hergestellt werden. Dazu werden die erfindungsgemäß verwendeten kationischen Copolymere, welche durch die Anwesenheit polarer Gruppen abhängig vom pH Wert hydrophil sind, in Wasser oder in einer wässrigen Pufferlösung gelöst. Dabei wird ein pH-Wert der wässrigen Lösung von 3 bis 6,5 eingestellt, z.B. durch Verwendung eines Acetatpuffers oder eines anderen geeigneten Puffers wie beispielsweise Citratpuffer, Lactatpuffer, Phosphatpuffer und Phosphat-Citrat-Puffer Außerdem werden die Nukleinsäuren in Wasser gelöst, wobei der pH der wässrigen Nukleinsäurelösung vorzugsweise auf einen Wert zwischen 6,5 und 8,5 eingestellt wird, besonders bevorzugt auf einen Wert zwischen 6,8 und 7,5. Dazu eignet sich besonders eine Pufferlösung enthaltend HEPES, TRIS, oder nur Salze. Beide Lösungen werden miteinander kombiniert, wobei die Mengen an Nukleinsäuren und an kationischem Copolymer so gewählt werden, dass sich ein gewünschtes N/P-Verhältnis einstellt. Nach dem Vermischen beider Lösungen wird die Mischung bewegt, beispielsweise für eine kurze Zeit, wie zwischen 2 und 20 Sekunden. Das kann durch Rühren und/oder durch Vortexen erfolgen. Vorzugsweise werden die entstandenen Nanopartikel vor der weiteren Verwendung einige Zeit stehen gelassen, beispielsweise zwischen 5 und 20 Minuten, um eine Bindung zwischen Polymer und Nukleinsäuren zu ermöglichen (nachstehend „Inkubation“ genannt). Die erfindungsgemäßen Nanopartikel werden im Dispergiermedium in feinverteilter Form ausgefällt.
Zusätzlich zu dem kationischen Copolymer und der Nukleinsäure können bei deren Nanofällung im Dispergiermedium ein oder mehrere Hilfs- und Zusatzstoffe zugegen sein. Alternativ können diese Hilfs- und Zusatzstoffe nach dem Dispergieren des Nukleinsäure-Copolymer-Komplexes in der wässrigen Phase hinzugefügt werden.
Als Dispergiermedium wird Wasser eingesetzt. Diesem können Puffersubstanzen, Salze, Zucker oder Säuren und Basen zugesetzt sein, um den gewünschten pH-Wert oder die Osmolarität einzustellen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Nanopartikel, welches folgende Maßnahmen enthält:

i) Herstellen einer wässrigen Lösung eines kationischen Copolymers enthaltend die oben beschriebenen wiederkehrenden Struktureinheiten der Formeln (la) und (Ib) mit einem pH-Wert zwischen 3 und 6,5,
ii) Herstellen einer wässrigen Lösung einer Nukleinsäure,
iii) Vermischen beider in Schritt i) und ii) hergestellten Lösungen in einem ausgewählten Mengenverhältnis von Nukleinsäure und Copolymer, so dass ein gewünschtes molares N/P-Verhältnis von Stickstoffatomen im Copolymer zu den Phosphatgruppen in der Nukleinsäure erhalten wird, vorzugsweise ein N/P-Verhältnis zwischen 1 und 200,
iv) Bewegen der Mischung aus Schritt iii), und
v) gegebenenfalls nachfolgende Inkubation der erhaltenen Mischung.

Die wässrige Lösung des kationischen Copolymers für Schritt i) des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält vorzugsweise einen Puffer, insbesondere einen Acetatpuffer, Citratpuffer, Lactatpuffer, Phosphatpuffer, Phosphat-Citrat-Puffer oder Mischungen daraus.
Die wässrige Lösung der Nukleinsäure für Schritt ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens besitzt vorzugsweise einen pH-Wert von 6,5 bis 8,5, insbesondere von 6,8 und 7,5.
Die wässrige Lösung der Nukleinsäure für Schritt ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält vorzugsweise einen Puffer, insbesondere einen HBG-, HEPES- oder TRIS-Puffer.
Das Bewegen in Schritt iv) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt vorzugsweise durch Rühren oder Vortexen. Die Behandlungsdauer in diesem Schritt beträgt üblicherweise zwischen 1 und 60 Sekunden, insbesondere zwischen 2 und 20 Sekunden.
Die Inkubation in Schritt v) des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt üblicherweise durch einfaches Stehenlassen der erhaltenen Mischung, beispielsweise für eine Zeitspanne von 5 bis 60 Minuten, vorzugsweise von 5 bis 20 Minuten. Die Mischung kann auch in einem Wärmeschrank inkubiert werden, beispielsweise bei Temperaturen zwischen 30 und 80°C
Die Abtrennung der Nanopartikel aus der wässrigen Phase kann auf unterschiedliche Weisen erfolgen. Beispiele dafür sind Zentrifugation, Ultrafiltration oder Dialyse. Die Dispersion der Nanopartikel kann aber auch vorzugsweise direkt nach der Herstellung ohne weitere Aufarbeitung eingesetzt werden.
Durch Reinigung mittels Filtration können Teilchen, wie zum Beispiel Aggregate, aber auch überschüssige Hilfsstoffe oder Verunreinigungen aus der Dispersion abgetrennt werden. Dabei kann sich die Partikelkonzentration ändern.
Durch Reinigung mittels Dialyse können gelöste Moleküle aus der Dispersion abgetrennt werden. Das Verfahren ist hinsichtich der dispergierten Partikel weitgehend unabhängig von der Partikelgröße.
Durch Reinigung mittels Zentrifugation können ebenfalls gelöste Moleküle aus der Dispersion abgetrennt werden. Allerdings verringert sich auch bei diesem Verfahren die Konzentration der dispergierten Teilchen. Außerdem lassen sich nur Dispersionen mit Nanoteilchen größeren Durchmessers, z.B. von mehr als 150 nm, behandeln und die Teilchen können dabei in Mitleidenschaft gezogen werden. Ferner kann das Redispergieren der auf diese Weise gewonnenen Teilchen Schwierigkeiten bereiten.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel eignen sich hervorragend zum Gentransfer von Zellen also zum Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen. Dazu werden die Nukleinsäuren enthaltenden Nanopartikel, einzelnen Zellen, Geweben oder einer Zellkultur hinzugefügt und von den Zellen durch Endozytose aufgenommen. Überaschenderweise hat sich gezeigt, dass sich hohe Gehalte an Nukleinsäuren mittels der erfindungsgemäßen Nanopartikel in Zellen übertragen lassen. Dabei lassen sich Nanopartikel einsetzen, welche einen vergleichsweise geringen Gehalt an kationischem Copolymer enthalten.
Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zum Gentransfer in Zellen, welches folgende Schritte enthält:

A) Inkontaktbringen von Zellen mit einer wässrigen Suspension enthaltend die oben beschriebenen Nanopartikel, und
B) anschließendes Inkubieren.

Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Gentransfer in Zellen, welches folgende Schritte enthält:

C) Bereitstellen einer Zellkultur in einem Bioreaktor oder Inkubator,
D) Zugabe einer wässrigen Suspension enthalten die oben beschriebenen Nanopartikel,
E) Verteilen der wässrigen Suspension in der Zellkultur, und
F) anschließendes Inkubieren.

Das erfindungsgemäße Gentransferverfahren kann unter Verwendung von unterschiedlichen Zellen durchgeführt werden, beispielsweise durch Verwendung von Einzelzellen, Geweben oder von Zellkulturen.
So lassen sich die erfindungsgemäßen Nanopartikel mit prokaryontischen Zellen, mit Geweben aus eukaryontischen Zellen oder mit Zellkulturen kombinieren. Dabei kann es sich um pflanzliche oder vorzugsweise um tierische Zellen, einschließlich menschlicher Zellen handeln.
Die Applikation der erfindungsgemäßen Nanopartikel kann in vivo erfolgen, beispielsweise unter die Haut oder in den Muskel, oder die Applikation kann auch ex vivo erfolgen, beispielsweise mit Immunzellen, wie in der CAR-T Therapie. Es kann sich auch um eine RNA Vaccination oder um eine Impfung handeln.
Unter „Zellen“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung kleinste lebende Einheiten von Organismen zu verstehen. Dabei kann es sich um Zellen von Ein- oder Mehrzellern handeln, welche von Prokaryonten oder von Eukaryoten stammen können. Bei den Zellen kann es sich um Mikroorganismen oder um einzelne Zellen handeln. Zellen können prokariontischen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein oder auch von Pilzen stammen. Vorzugsweise werden eukaryotische Zellen eingesetzt, insbesondere solche, die ursprünglich aus Gewebe isoliert wurden und dauerhaft kultiviert werden können, die also immortalisiert sind.
Unter „Geweben“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Ansammlungen differenzierter Zellen einschließlich ihrer extrazellulären Matrix zu verstehen.
Unter „Zellkulturen“ werden im Rahmen der vorliegenden Beschreibung Kombinationen von Zellen und Zellkulturmedium bezeichnet, wobei die Zellen in dem Zellkulturmedium außerhalb des Organismus kultiviert werden. Dabei kommen Zelllinien zum Einsatz, also Zellen einer Gewebeart, die sich im Verlauf der Kultivierung teilen können. Es können sowohl immortalisierte (unsterbliche) Zelllinien als auch primäre Zellen (Primärkultur) kultiviert werden. Unter Primärkultur ist üblicherweise eine nicht immortalisierte Zellkultur zu verstehen, die direkt aus einem Gewebe gewonnen wurde.
Unter „Zellkulturmedium“ oder „Nährmedium“ sind im Rahmen der vorliegenden Beschreibung wässrige Systeme zu verstehen, die als Plattform für die Kultivierung von Zellen dienen. Diese Systeme enthalten alle benötigten Substanzen, die für das Wachstum und die Viabilität der Zellen erforderlich sind.
Das Zellkulturmedium kann neben den Zellen und den erforderlichen Nährstoffen Serum enthalten. Vorzugsweise enthält das Zellkulturmedium Seren oder Proteine und Wachstumsfaktoren.
Unter „Serum“ ist im Rahmen dieser Beschreibung ein Blutserum oder ein Immunserum zu verstehen. Dabei versteht man unter Blutserum jenen flüssigen Anteil des Blutes, den man als Überstand erhält, wenn eine Blutprobe zentrifugiert wird. Dieser Überstand enthält bis auf die durch die Gerinnung verbrauchten Gerinnungsfaktoren alle natürlicherweise in der Blutflüssigkeit gelösten Stoffe. Das Blutserum entspricht also dem Blutplasma abzüglich der Gerinnungsfaktoren. Unter Immunserum versteht man eine Aufreinigung spezifischer Antikörper, die aus dem Blutserum immunisierter Säugetiere gewonnen werden.
Seren bedeuten im Rahmen dieser Beschreibung in der Regel Seren von Wirbeltieren, und insbesondere Seren von Kalb, Kuh, Rind, Pferd oder Mensch.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Zellkulturen können nach Standardmethoden erzeugt und kultiviert werden.
So lassen sich z.B. Primärkulturen aus unterschiedlichen Geweben anlegen, beispielsweise aus Geweben einzelner Organe, wie Haut, Herz, Niere oder Leber, oder aus Tumorgewebe. Die Gewebezellen können durch an sich bekannte Methoden vereinzelt werden, z.B. durch Behandlung wird mit einer Protease, wodurch die Proteine abgebaut werden, die den Zellverband aufrechterhalten. Es kann auch angebracht sein, durch Zugabe von Wachstumsfaktoren gezielt manche Zelltypen zur Teilung anzuregen oder im Fall von schlecht wachsenden Zelltypen Fütterzellen, basalmembranartige Matrices oder recombinate Bestandteile der extrazellulären Matrix zu verwenden. Die erfindungsgemäß eingesetzten Zellen können auch durch Einschleusung eines Plasmids als Vektor genetisch verändert werden.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Zellen können eine eingeschränkte Lebensdauer besitzen oder es handelt sich um unsterbliche Zelllinien mit der Fähigkeit, sich unendlich zu teilen. Diese können durch durch zufällige Mutation erzeugt worden sein, z.B. in Tumorzellen, oder durch gezielte Veränderung, beispielsweise durch die künstliche Expression des Telomerase-Gens.
Bei den erfindungsgemäß eingesetzten Zellen kann es sich um adhärent (auf Oberflächen) wachsende Zellen handeln, wie beispielsweise Fibroblasten, Endothelzellen oder Knorpelzellen, oder es kann sich um Supensionszellen handeln, die frei im Nährmedium schwimmend wachsen, wie zum Beispiel Lymphozyten.
Kulturbedingungen und Zellkulturmedien werden in Abhängigkeit von den einzelnen kultivierten Zellen ausgewählt. Die verschiedenen Zelltypen bevorzugen dabei unterschiedliche Nährmedien, die spezifisch zusammengestellt werden. So werden beispielsweise unterschiedliche pH-Werte eingestellt und die einzelnen Nährmedien können unterschiedliche Aminosäuren und/oder andere Nährstoffe in unterschiedlichen Konzentrationen enthalten.
Die erfindungsgemäß transfizierten Zellen können für verschiedene Bereiche eingesetzt werden, beispielsweise der Biotechnologie, Forschung oder Medizin. Dabei kann es sich um die Produktion von (rekombinanten) Proteinen, Viren- und/oder Viruspartikelproduktion, Untersuchung von Stoffwechsel, Teilung und weiteren zellulären Prozessen handeln. Weiterhin können die erfindungsgemäß transfizierten Zellen als Testsysteme verwendet werden, beispielsweise bei der Untersuchung der Wirkung von Substanzen auf Zelleigenschaften, wie die Signaltransduktion oder die Toxizität. Weitere zur Herstellung der erfindungsgemäß transfizierten Zellen bevorzugt eingesetzte Zellen sind Stammzellen. Dabei handelt es sich bekanntermaßen um Körperzellen, die sich in verschiedene Zelltypen oder Gewebe ausdifferenzieren können.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der oben beschriebenen Nanopartikel zum Gentransfer in Zellen, also zum Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne diese zu begrenzen.
Nachstehend wird die Synthese von Polymeren durch RAFT-Polymerisation beschrieben, die mit dem kommerziell erhältlichen Produkt EUDRAGIT^® E100 vergleichbar sind. Die Eignung der Polymere zur Nukleinsäure-Bindung wurde untersucht und es wird eine neuartige Art der Nukleinsäureverkapselung und -Formulierung beschrieben.
Abkürzungen
In den Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet:

CPAETC: 4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentansäure
nBMA: n-Butylmethacrylat
MMA: Methylmethacrylat
DMAEMA: 2-(N,N-Dimethylamino)ethylmethacrylat
ACVA: 4,4'-Azobis-(4-cyanovaleriansäure)
DMAc-SEC: Größenausschlusschromatographie mit Dimethylacetamid + 0.21% LiCI als Eluent
CTA: Chain Transfer Agent (Kettenüberträger)
pDNA: mEGFP-N1 Plasmid (kodierend für EGFP); pKMyc Plasmid (Kontrollplasmid) HEPES: 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HBG: mit HEPES gepufferte 5%-ige Glukoselösung
DMEM: Dulbecco's modifiziertes Eagle Medium
HBSS: Salzlösung nach Hanks
FBS: Fötales Kälberserum
EGFP: verstärkt grün fluoreszierendes Protein
IPEI: lineares Polyethylenimin
PDMAEMA: homopolymeres 2-(N, N-Dimethylamino)ethyl-methacrylat
PBMD: nBMA-st-MMA-st-DMAEMA-Copolymer (st = statistisch verteilt)
PDI: Polydispersitätsindex, ermittelt durch DLS unter Verwendung eines Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, Vereinigtes Königreich) unter Anwendung der Kumulantenanalyse der Korrelationsfunktion (ISO13321, ISO22412)
RFI: relative Fluoreszenzintensität
CTRL: Kontrolle in Form von nur mit HBG Puffer und nicht mit Copolymer behandelten Zellen
E100: EUDRAGIT^®E100 (in Pulverform)

Materialien und Verfahren
In den nachfolgenden Experimenten wurden folgende Materialien eingesetzt:

E100: EUDRAGIT^®E100 in Pulverform
pDNA (eGFP, pkmyc): mEGFP-N1 Plasmid (kodierend für EGFP), pKMyc plasmid
(Kontrollplasmid, nicht für ein fluoreszierendes Protein kodierend)
Zellen: Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK), insbesondere die HEK293T Zellinie
Agarose: Agarose-HR plus

Molekulargewichtsberechnung der bei der RAFT Polymerisation erzeugten Polymere
Die Monomer-Umwandlung (p) wurde aus ¹H-NMR-Daten berechnet, indem die Integrale der Vinyl-Banden (5,5-6,3 ppm) mit einer externen Referenz (1,3,5-Trioxan, 5,14 ppm) vor (t=0) und nach (t=endgültig) der Polymerisation miteinander verglichen wurden. Die theoretische zahlenmittlere Molmasse (M_n, _th) wurde dann mit folgender Gleichung berechnet: $M_{n,th} = (({[M]}_{0} * p * M_{M}) / {[CTA]}_{0}) + M_{CTA}$
worin [M]₀ und [CTA]₀ die Anfangskonzentrationen von Monomer bzw. von CTA bedeuten, M_M bzw. M_CTA das Molekulargewicht des Monomers bzw. von CTA ist und p die Umwandung von Monomer zu CTA bedeutet.
Herstellung und Charakterisierung von Polymeren und von nanopartikulären Polymerteilchen bzw. von nanopartikulären DNA-Polymer-Komplexen
Beispiel 1A: Synthese von (nBMA-st-MMA-st-DMAEMA)-Copolymer (PBMD) durch RAFT Polymerisation (st = statistisch verteilt)
CPAETC (130,7 mg, 4,96 × 10^-4 mol), nBMA (3,5265 g, 2,48 × 10^-2 mol), MMA (2,5218 g, 2,52 × 10^-2 mol), DMAEMA (7,8165 g, 4,97 × 10^-2 mol), 1,4-Dioxan (6,2113 g), eine 1,0 Gew.-%ige ACVA-Lösung in 1,4-Dioxan (1,436 g, 14,36 mg ACVA, 5,12 × 10^-5 mol) und 1,3,5-Trioxan (externer NMR-Standard, 23,7 mg) wurden in ein 20 ml Mikrowellenfläschchen eingeführt, das mit einem magnetischen Rührstab ausgestattet war. Die Lösung wurde von Sauerstoff befreit, indem 10 Minuten lang mit Argon durchperlt wurde. Das Fläschchen wurde versiegelt, in ein Ölbad von 70 °C gelegt und es wurde 21 h lang gerührt, wobei zu vorbestimmten Zeiten Proben für die ¹H-NMR- und die DMAc-SEC-Analyse entnommen wurden. Das Polymer wurde dreimal von THF in kaltes Hexan gefällt und unter reduziertem Druck getrocknet, um einen gelben Feststoff zu ergeben. DMAc-SEC: M_n,SEC = 25,1 kg mol^-1, Ð = 1,13.
Beispiel 1B: Synthese von DMAEMA-Homopolymer durch RAFT Polymerisation
CPAETC (50,0 mg, 1,9 × 10-4 Mol), DMAEMA (4,54 g, 2,88 × 10-2 Mol), 1,4-Dioxan (2,5 g), 1 Gew.-% ACVA in 1,4-Dioxan (426 mg, 1,5 × 10-5 Mol) und 1,3,5-Trioxan (externer NMR-Standard, 21 mg) wurden in ein 20-mL-Mikrowellenfläschchen mit Magnetrührstab eingeführt. Das Fläschchen wurde verschlossen, und die Lösung wurde durch Durchblasen mit Argon für ca. 10 Minuten desoxygeniert. Das Fläschchen wurde in ein auf 70 °C eingestelltes Ölbad gestellt und 7 h lang gerührt, wobei zu festgelegten Zeiten Proben für die ¹H-NMR- und CHCI3-SEC-Analyse entnommen wurden. Das Polymer wurde dreimal von THF in kaltes Hexan ausgefällt und unter reduziertem Druck getrocknet, um einen gelben Feststoff zu erhalten. CHCl₃-SEC: M_n,SEC= 14,2 kg mol-1, Ð = 1,19.
zeigt die Struktur des Copolymeren Eudragit^® E100.
zeigt die Struktur des durch RAFT-Polymerisation gemäß Beispiel 1A dargestellten Copolymeren.
zeigt die die Molekulargewichtsverteilung des Copolymeren Eudragit^® E100 und des durch RAFT-Polymerisation gemäß Beispiel 1A dargestellten Copolymeren, ermittelt durch Größenausschlusschromatographie (SEC).
Beispiel V1: Bildung von Nanopartikeln und Komplexierung mit pDNA (nicht erfindungsgemäß)
Für die Bildung von Nanopartikeln wurden die in Beispiel 1 erzeugten Copolymere in 2,5 mL Aceton (2 mg mL^-1) gelöst. Die Polymerlösung wurde manuell in 5 mL ultrareines Wasser getropft, die resultierende Nanopartikelsuspension wurde zur Entfernung des organischen Lösungsmittels über Nacht bei 800 Umdrehungen/Minute gerührt, und bei 4 °C bis zum Gebrauch gelagert. Um das jeweilige N/P-Verhältnis zu erreichen, wurde pDNA in unterschiedlichen Konzentrationen entweder während des Bildungsprozesses zur Acetonphase und anschließenden Nanopartikelbildung hinzugefügt oder pDNA wurde in unterschiedlichen Konzentrationen der endgültigen Partikelsuspension zugesetzt.
Beispiel 2: Bildung von nanopartikulären Copolymer-Nucleinsäure-Komplexen (erfindungsgemäß)
Vorratslösungen der nach Beispiel 1 hergestellten Copolymere wurden durch Auflösen in 0,2 M Acetatpuffer (pH 5,8) hergestellt. pDNA, siRNA oder mRNA wurden in ultrareinem Wasser gelöst. Zur Herstellung von Nukleinsäure-Polymer-Komplexen wurden unterschiedlich verdünnte Lösungen des Copolymeren sowie der Nucleinsäure in HBG-Puffer (20 mM HEPES, 5% Glukose (w/v), pH 7,4) oder in 20 mM HEPES-Puffer hergestellt, um die jeweiligen N/P-Verhältnisse zu erreichen (molares Verhältnis von Stickstoffatomen im Copolymer zu den Phosphatgruppen in der Nukleinsäure). Nach dem Vermischen der Copolymerlösung und der Nukleinsäure-Lösung wurden die Mischungen sofort 10 Sekunden lang verwirbelt. Vor der Anwendung wurden die entstandenen Copolymer-Nukleinsäure-Komplexe mindestens 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
zeigt schematisch die Bildung von Nukleinsäure-Copolymer-Komplexen in Nanopartikeln aus dem Copolymeren nach Beispiel 1A (DMAEMA : BMA : MMA = 2 : 1 : 1).
Die Verwendung des kationischen und hydrophoben Copolymers resultiert in Bindung, Stabilisierung und Schutz des genetischen Materials, in der Ausbildung von stabilen Nanopartikeln, in einer Stabilität gegenüber kokurrierenden Polyanionen und bewirkt eine endosomale Freisetzung nach Aufnahme durch die Zelle.
Beispiel 3: Allgemeine Vorschrift zur Charakterisierung von Nanopartikeln und von nanopartikulären Copolymer-pDNA-Komplexen
Beispiel 3A: Durchmesser (z-Average) und Zeta-Potenzial von Nanopartikeln und pDNA-Copolymerkomplexen wurden durch dynamische oder elektrophoretische Licht-streuung (DLS, Zetasizer Nano-ZS, Malvern Instruments, Worcestershire, Vereinigtes Königreich) bestimmt. Zur Größenbestimmung wurde ein Brechungsindex von 1,33 für ultrareines Wasser und von 1,59 für das Copolymer angenommen. Das Zeta-Potenzial der Nanopartikel hergestellt durch Fällung in Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln wurde an den gleichen Proben bestimmt.
Beispiel 3B: Gel-Verzögerungsuntersuchung
Die pDNA-Bindungsfähigkeit bei unterschiedlichen N/P-Verhältnissen wurde durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt. Die Proben wurden wie für die pDNA-Polymer-Komplexe in den Beispielen V1 und 2 beschrieben hergestellt, liefen bei 80 V für 1,5 h auf einem 1%igen Agarose-Gel, das mit Ethidiumbromid (EtBr, 0.1 µg mL^-1) gefärbt war, und wurden unter Verwendung eines Gel-Imagers (Red^™ Imaging System, Alpha Innotech, Kasendorf, Deutschland) abgebildet.
Beispiel 3C: Ethidiumbromid-Bindungstest (EBA) und Heparin-Freisetzungstest (HRA)
pDNA-Komplexierung und Stabilität der nanopartikulären Copolymer-pDNA-Komplexe wurden untersucht, indem ein Ethidiumbromid-Bindungstest und ein Heparin-Freisetzungstest verwendet wurden.
Dazu wurden pDNA mit einer Konzentration von 15 µg mL^-1 mit Ethidiumbromid 10 Minuten lang inkubiert. Die Polymer-Vorratslösungen wurden in einer schwarzen 96-Mikrotiterplatte (Nunc, Thermo Fisher) verdünnt, um N/P-Verhältnisse von 1 bis 50 einzustellen. Anschließend wurde pDNA zugegeben und die nanopartikulären Copolymer-pDNA-Komplexe wurden 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Ethidiumbromid-Fluoreszenzintensität wurde bei λ_Ex = 525 nm / λ_EM = 605 nm gemessen. pDNA ohne Copolymer wurde als 100% freie DNA definiert. Die Freisetzung von komplexierter DNA wurde durch schrittweise Zugabe von Heparin und Messung der resultierenden Veränderungen der Intensität der Ethidiumbromidfluoreszenz untersucht. Der Einfluss des pH-Werts auf die pDNA-Bindung und die pDNA-Freisetzung wurde untersucht, indem der Versuch bei unterschiedlichen pH-Werten in den jeweiligen Puffern (Acetatpuffer pH 5 und 5,8 sowie HBG-Puffer pH 6,5; 7 und 7,4) ausgeführt wurde.
Beispiel 3D: Transfektion von HEK293T Zellen mit EGFP pDNA
Die HEK293T-Zelllinie wurde in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM, 1 g L^-1 Glukose, 10% (v/v) FBS, 100 g mL^-1 Penicillin/Streptomycin) bei 37 °C in einer befeuchteten 5%-igen CO₂-Atmosphäre kultiviert. Für Transfektionsexperimente wurden 0,2*10⁶ Zellen pro mL in eine 24-Mikrotiterplatte in 500 µL DMEM, das mit 10 mM HEPES ergänzt war, ausgebracht und für 24 h erholen gelassen. 1 Stunde vor der Behandlung wurde das Behandlungsmedium durch 450 µL frisches DMEM (10 mM HEPES) ersetzt. Nanopartikuläre Copolymer-pDNA-Komplexe wurden wie in Beispiel 2 beschrieben frisch zubereitet, indem egfp pDNA kodierend für EGFP oder pkmyc pDNA, die nicht für ein fluoreszierendes Protein kodiert, als Negativkontrolle verwendet wurden. Die Zellen wurden mit 50 µL einer Dispersion nanopartikulärer Copolymer-pDNA-Komplexe des angegebenem N/P-Verhältnisses und der pDNA-Konzentration behandelt oder mit HBG-Puffer als Kontrolle (ctrl) und wurden 1 oder 4 h lang inkubiert. Anschließend wurde der Überstand entfernt, durch frisches DMEM (10 mM HEPES) ersetzt und die Zellen wurden bis zu 24 h weiter inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen durch Trypsin-EDTA abgetrennt, in HBSS (2% FBS (v/v), 20 mM HEPES) resuspendiert und mit einem Durchflusszytometer (Cytoflex S, Beckmann coulter, CA, U.S.A.) wurde die Fluoreszenz gemessen. Die EGFP-Expression lebensfähiger Zellen wurde mittels Anregung bei 488 nm und Messung der Emission bei 610 nm (Bandpassfilter 610/20) analysiert. Fluoreszierende Zellen wurden durch Gating zur Negativkontrolle identifiziert.
Beispiel 3E: Knock-down von GFP in HEK-GFP Zellen mittels anti-EGFP-siRNA
Die HEK-GFP-Zelllinie wurde in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM, 1 g L^-1 Glukose, 10% (v/v) FBS, 100 g mL^-1 Penicillin/Streptomycin) bei 37 °C in einer befeuchteten 5%-igen CO₂-Atmosphäre kultiviert. Für Transfektionsexperimente wurden 0,1*10⁶ Zellen pro mL in eine 24-Mikrotiterplatte in 500 µL DMEM, das mit 10 mM HEPES ergänzt war, ausgebracht und für 24 h erholen gelassen. 1 Stunde vor der Behandlung wurde das Behandlungsmedium durch 450 µL frisches DMEM (10 mM HEPES) ersetzt. Copolymer-siRNA Komplexe wurden wie in Beispiel 2 beschrieben frisch zubereitet. Die Zellen wurden mit 50 µL der frisch vorberiteten Komplexe behandelt. Als Negativkontrolle wurden Komplexe mit siRNA, die nicht gegen GFP gerichtet ist, und HBG Puffer verwendet. 72 h nach der Behandlung mit Copolymer-siRNA Komplexen wurde der Überstand abgenmmen und die Zellen mit Trypsin-EDTA abgetrennt. Nach Resuspension in HBSS (2% FBS (v/v), 20 mM HEPES) wurden die Zellen mittels Durchflusszytometrie bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm bei 525 nm analysiert (Bandpassfilter 525/40)
Beispiel 3F: Transfektion von HEK293T-Zellen mit GFP-mRNA
Die HEK293T-Zelllinie wurde in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM, 1 g L^-1 Glukose, 10% (v/v) FBS, 100 g mL^-1 Penicillin/Streptomycin) bei 37 °C in einer befeuchteten 5%-igen CO₂-Atmosphäre kultiviert. Für Transfektionsexperimente wurden 0,2*10⁶ Zellen pro mL in eine 24-Mikrotiterplatte in 500 µL DMEM, das mit 10 mM HEPES ergänzt war, ausgebracht und für 24 h erholen gelassen. 1 Stunde vor der Behandlung wurde das Behandlungsmedium durch 450 µL frisches DMEM (10 mM HEPES) ersetzt. Copolymer-mRNA Komplexe wurden wie in Beispiel 2 beschrieben frisch zubereitet. 50 µL der Copolymer-mRNA Komplexe wurden zu den Zellen gegeben und für 4 h inkubiert. Nachfolgend wurde der Überstand abgenommen und die Zellen wurden für weitere 2 beziehungsweise 20 h inkubiert Nach der Inkubation wurde der Überstand abgenommen, die Zellen mittels Trypsin-EDTA abgelöst und in HBSS (2% FBS (v/v), 20 mM HEPES) resuspendiert. Nachfolgend wurde die Fluoreszenz der Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. Hierfür wurde eine Anregungswellenlänge von 488 nm verwendet und die Emission bei 525 nm gemessen (Bandpassfilter 525/40).
Beispiel 3G: PrestoBlue^®-Test zur Bestimmung der Viabiltät
Für Zytotoxizitätstests wurden HEK293T-Zellen in 24-Mikrotiterplatten mit einer Dichte von 0,2 10⁶ Zellen pro mL (HEK293T) in 500 µL DMEM (10 mM HEPES) ausgebracht und 24 h lang inkubiert, um eine Erholung zu ermöglichen 50 µL nanopartikuläre Copolymer-pDNA-Komplexe wurden wie in Beispiel 2 beschrieben hinzugefügt, um einen Konzentrationsbereich von 0,25-1,5 g mL^-1 pDNA zu testen. Die Zellen wurden 1 oder 4 h lang mit dem nanopartikulären Copolymer-pDNA-Komplex inkubiert. Anschließend wurde der Überstand entfernt und durch 500 µL frisches DMEM (10 M HEPES) ersetzt. 24 Stunden nach der Behandlung wurde der Überstand entfernt und dieser wurde durch eine 10%-ige (v/v) mit DMEM Medium verdünnte Lösung von PrestoBlue^® (Invitrogen, CA, U.S.A.) ersetzt. Die Zellen wurden 45 min lang inkubiert und der Überstand wurde auf eine 96-Mikrotiterplatte (100 µL pro Näpfchen) übertragen, um die Fluoreszenzintensität zu bestimmen (λ_EX 560 nm, λ_EM 590 nm). Zellen, die mit dem HBG-Puffer behandelt waren, wurden als Kontrolle verwendet, und die Lebensfähigkeit wurde relativ zur Pufferkontrolle berechnet, nachdem die Blindprobe subtrahiert worden war (PrestoBlue^® ohne Zellen).
Untersuchungen an nanopartikulären Polymerteilchen bzw. an nanopartikulären DNA-Polymer-Komplexen
Die Bindung des genetischen Materials ist ein entscheidender Schritt im Gen-Übertragungsprozess, da das genetische Material extra- und intrazelluläre Barrieren überwinden muss, um ihre Zielzellen zu erreichen. Verkapselung und Komplexierung durch kationische Polymere ermöglichen beispielsweise den Schutz vor Nukleasen im Blutkreislauf und die Überwindung von Zellmembranen (vergl. dazu H. Yin, R. L. Kanasty, A. A. Eltoukhy, A. J. Vegas, J. R. Dorkin, D. G. Anderson, Nat Rev Genet 2014, 15, 541-555).
Beispiel 4: Versuche zur pDNA-Bindungsfähigkeit von Polymeren und zur Freisetzung der pDNA aus den gebildeten Komplexen
In werden Ergebnisse von Versuchen zur DNA-Bindungsfähigkeit von Polymeren und zur Freisetzung der pDNA aus den gebildeten Komplexen beschrieben.
zeigt Ergebnisse eines Ethidiumbromid-Bindungstests (EBA) an DNA-Polymer-Komplexen im HBG-Puffer bei pH 7,4. Es wurden DNA-IPEI-Komplexe, DNA-PDMAEMA-Komplexe und DNA-PBMD-Komplexe untersucht.
Die Bindung des genetischen Materials ist entscheidend für seine Anwendung in der Genübertragung. Daher wurde die pDNA-Bindungsfähigkeit des Polymers durch Agarose-Gel-Elektrophorese bei unterschiedlichen N/P-Verhältnissen untersucht. zeigt Ergebnisse von Agarose-Gel-Elektrophoresetests mit DNA-PBMD-Komplexen bei unterschiedlichen N/P-Verhältnissen.
zeigen Ergebnisse von Heparin-Freisetzungstests (HRA) für pH-abhängige DNA-Bindung und DNA-Freisetzung im pH-Bereich von 5 bis 7,4. Es wurden DNA-IPEI-Komplexe, DNA-PDMAEMA-Komplexe und DNA-PBMD-Komplexe untersucht.
Der in dargestellt Test bestätigte die vollständige Bindung von pDNA bei N/P-Verhältnissen oberhalb von 1. Die DNA-Polymer-Wechselwirkung kann durch die reversible Interkalation von Ethidiumbromid in die DNA weiter charakterisiert werden. Eine starke Fluoreszenz kann beobachtet werden, wenn dieser in die pDNA interkaliert wird. Dies wird jedoch durch die Wechselwirkung zwischen Polymer und genetischem Material (EBA) reduziert. Der Test wurde bei pH 7,4 und N/P-Verhältnissen von 1 bis 50 durchgeführt, um den Einfluss einer zunehmenden Polymermenge auf die Komplexbildung zu untersuchen. Neben dem PBMD-Polymer wurden IPEI und ein PDMAEMA-Homopolymer untersucht ( . Letzteres setzt sich aus der gleichen Anzahl kationischer Gruppen wie das PBMD-Polymer zusammen, um den Einfluss der hydrophoben Seitenketten im PBMD-Polymer zu bewerten. Es wurde beobachtet, dass die relative Fluoreszenzintensität (RFI) mit steigenden N/P-Verhältnissen abnahm, und dass ein Plateau bei einem N/P-Verhältnis von 10 erreicht wurde ( . IPEI wies die niedrigsten Plateauwerte auf, gefolgt von PDMAEMA (13% im Vergleich zu 42%) während PBMD das RFI nur auf 72% verringerte. Da der Elektrophorese-Test über N/P 1 eine vollständige DNA-Bindung zeigte, könnten diese Unterschiede auf Unterschiede in der DNA-Kondensation und damit auf unterschiedlich gepackte Komplexe zurückzuführen sein, die zu einem unterschiedlichen Ausmaß an EtBr-Verdrängung führen kann. Daher kann angenommen werden, dass das PBMD-Polymer im Vergleich zu IPEI und PDMAEMA einen weniger dichten DNA-Copolymerkomplex bildet.
Zur Untersuchung der Stabilität der Komplexe im relevanten physiologischen pH-Bereich wurde die Dissoziation der Komplexe bei pH-Werten von 5 (endosomal) bis 7,4 (Blut) untersucht. Vorgeformte DNA-Copolymerkomplexe mit einem N/P-Verhältnis von 20 wurden mit zunehmenden Mengen an Heparin als konkurrierendem Polyanion inkubiert, und die Fluoreszenzintensität wurde gemessen. Die Dissoziation und damit die Freisetzung von pDNA aus dem Komplex bewirkte eine Re-Interkalation von EtBr. Bei allen Polymeren wurde ein Einfluss des umgebenden pH-Werts auf die Komplexbildung vor der Zugabe von Heparin beobachtet. Für IPEI (obere ) wurde eine gute Verschiebung von EtBr und anschließende Freisetzung von pDNA bei relativ niedrigen Heparinkonzentrationen (20 U mL^-1) beobachtet. pDNA-Komplexe, die bei niedrigeren pH-Werten gebildet wurden, erforderten etwas weniger Heparinzusatz zur Freisetzung der pDNA, aber bei hohen Heparinkonzentrationen (100 U/ml) wurde pDNA bei allen pH-Werten vollständig freigesetzt. Im Allgemeinen erforderte die pDNA-Freisetzung aus PDMAEMA-Komplexen höhere Mengen an Heparin (mittlere ) und wurde im Vergleich zu IPEI stärker durch den umgebenden pH-Wert beeinflusst. Bei niedrigen pH-Werten (5 und 5,8) führten 100 U/ml Heparin zur totalen Freisetzung von pDNA, während bei einem pH-Wert von 6,5 und mehr nur 66-79% freigesetzt wurden. Das PBMD-Copolymer (untere zeigte ein noch ausgeprägteres pHabhängiges Verhalten. Die RFI-Werte vor der Heparin-Zugabe liegen zwischen 27 und 60% und liegen bei pH-Werten von 5 bis 5,8 niedriger. Die Freisetzung der gesamten pDNA wurde nur bei pH 5 beobachtet und veringerte sich schrittweise mit steigendem pH-Wert. Bei neutralem pH-Wert deutet eine leichte Abnahme des RFI nach Heparin-Zugabe auf eine noch stärkere Komplexierung der pDNA in Gegenwart konkurrierender Polyanionen hin. Im Allgemeinen wurde IPEI kaum vom pH-Wert beeinflusst, während PDMAEMA und PBMD-Copolymer einen schwachen beziehungsweise den stärksten Einfluss des pH-Wertes auf die anfänglichen RFI-Werte bzw. die anschließende pDNA-Freisetzung zeigten.
Diese Ergebnisse deuten auf einen Einfluss des pK_a-Werts und der Hydrophobie des Copolymeren auf die pDNA-Bindung, die Anordnung im Komplex und die anschließende pDNA-Freisetzung hin. Für IPEI wird ein pK_a-Wert von 8,5 in der Literatur berichtet, während PDMAEMA einen pK_a von etwa 7,5 hat. Für PBMD konnte nur ein scheinbarer pK_a-Wert von 6,8 bestimmt werden, da das Polymer während der Titration in diesem pH-Bereich ausfiel.
Bei der Berechnung des Anteils an Ladungen aus diesen pK_a-Werten wurde für IPEI ein Ladungsgrad von 100 bis 90% über den gesamten getesteten pH-Bereich berechnet, während PDMAEMA einen Rückgang von 100% bei pH 5 auf 56% bei pH 7,4 zeigte. Bei der Berechnung des Ladungsgrades für PBMD mit dem scheinbaren pK_a-Wert ist der Effekt noch stärker ausgeprägt (98% bei pH 5 und 20% bei pH 7,4). Da der Ladungsgrad und damit die Anzahl der kationischen Gruppen im Polymer abnimmt, ändert sich das Verhältnis von hydrophilen zu hydrophoben Gruppen, was zu zusätzlichen hydrophoben Wechselwirkungen und zu unterschiedlichen Anordnungen im Komplex und damit zu verändertem Freisetzungsverhalten der DNA führt. Dieser Effekt ist am deutlichsten im PBMD-Copolymer aufgebildet, wo die zusätzlichen hydrophoben Seitenketten der nBMA- und der MMA-Einheiten die Komplexstabilität insbesondere bei neutralen pH-Werten durch starke hydrophobe Wechselwirkungen fördern (vergl. dazu E.J. Adolph, C.E. Nelson, T.A. Werfel, R. Guo, J.M. Davidson, S.A. Guelcher, C.L. Duvall, J. Mater Chem B 2014, 2, 8154-8164). Somit zeigt das PBMD-Copolymer ein hohes Potenzial als Genübertragungsvektor, da eine hohe Stabilität und die Verhinderung der Dissoziation bei neutralem pH-Wert im Blutstrom für die systemische Anwendung von Komplexen von Vorteil ist.
Beispiel 5: Versuche zur Komplexierung von pDNA
In und werden Ergebnisse von Versuchen zur Komplexierung von pDNA in verschiedenen Polymeren und die Bildung von Nanopartikeln beschrieben.
zeigt schematisch die Bildung von Nanopartikeln durch Nanofällung mit Lösungsmittel-Verdampfungstechnik.
Auf der linken Seite von ist eine elektronenmikroskopische Abbildung (Rasterelektronenmikroskopie, SEM) von Nanopartikeln aus Eudragit^® E100 gefällt aus Aceton-Wassermischungen gezeigt.
Auf der rechten Seite von ist eine elektronenmikroskopische Abbildung (Rasterelektronenmikroskopie, SEM) von Nanopartikeln aus PBMD-Copolymer gefällt aus Aceton-Wassermischungen gezeigt.
zeigt schematisch die Bildung von nanopartikulären DNA-Komplexen von PBMD mit pDNA in Abhängigkeit von der angewandten Formulierungsmethode. Auf der linken Seite von ist die Nanofällung mit Lösungsmittel-Verdampfungstechniken kombiniert mit verschiedenen Techniken der pDNA-Zugabe dargestellt (Zugabe im Verfahren und nach dem Verfahren). Auf der rechten Seite von ist die wasserbasierte lösungsmittelfreie pH-abhängige Formulierung zur Komplexierung von pDNA dargestellt. Die erhaltenen Nanopartikel wurden durch dynamische Lichtstreuung charakterisiert.
Die obere zeigt den Durchmesser (z-Avarage) von Nanopartikeln aus PBMD-Copolymer und pDNA bei verschiedenen N/P-Verhältnissen, die mittels Fällung aus Aceton oder wässriger Lösung hergestellt wurden. Die mittlere zeigt die PDI-Werte der Durchmesser von Nanopartikeln aus PBMD-Copolymer und pDNA bei verschiedenen N/P-Verhältnissen, die mittels Fällung aus Aceton oder aus wässriger Lösung hergestellt wurden. Die untere zeigt die Oberflächenladung (Zetapotential) von Nanopartikeln aus PBMD-Copolymer und pDNA, die mittels der Lösungsmittel-Verdampfungtechnik aus Aceton hergestellt wurden.
Die linken beiden zeigen elektronenmikroskopische Aufnahmen (Rasterelektronenmikroskopie, SEM) von Nanopartikeln aus PBMD-Copolymer, die bei zwei unterschiedlichen N/P-Verhältnissen durch Nanofällung aus Aceton in Anwesenheit von pDNA erzeugt worden sind. Die rechte zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme (kryogene Transmissionselektronenmikroskopie, cryo-TEM) von Nanopartikeln aus PBMD-Copolymer, die durch Nanofällung aus wässriger Lösung erzeugt worden sind.
Da das PBMD-Copolymer ein hohes Potenzial für die pDNA-Bindung und eine hohe Komplexstabilität beim pH-Wert im Blut zeigte, wurde das Copolymer für die Entwicklung einer stabilen Formulierung zur Verkapselung der pDNA verwendet. Es wurden drei verschiedene Formulierungsansätze untersucht. Die häufig angewandte Nanofällung mit Zugabe von DNA

a) zur endgültigen Nanopartikelsuspension oder
b) während des Formulierungsprozesses wurde verglichen mit
c) der Komplexierung der DNA durch das im sauren Puffer gelöste Polymer als pH-abhängige wasserbasierte Nanofällung

Bei der Nanofällung handelt es sich um eine weit verbreitete Methode zur Formulierung von polymeren Nanopartikeln welche es auf einfache Art und Weise ermöglicht, die Größe der Nanopartikel einzustellen und eine Vielzahl von Komponenten zu komplexieren. Die Nanofällung des PBMD-Copolymers ohne die Zugabe von pDNA führt zu Partikeldurchmessern von rund 125 nm (N/P-Verhältnis 0) mit einer positiven Oberflächenladung (+ 55 mV) (vergl. ) Es wurde erwartet, dass die positive Oberflächenladung der Nanopartikel die Bindung und Komplexierung von pDNA an die Partikeloberfläche erleichtern sollte. Die Zugabe von pDNA zu den vorformulierten positiv geladenen Nanopartikeln (NP + pDNA) führte im Allgemeinen zu einer erhöhten Größe und Polydispersität der Nanopartikel ( und . Nur bei dem niedrigsten und dem höchsten untersuchten N/P-Verhältnis (N/P 5 und N/P 100) wurden Nanopartikel mit Größen unter 200 nm und mit akzeptablen PDI-Werten gefunden (PDI<0,250) Die Oberflächenladung der Partikel verringerte sich mit zunehmender DNA-Menge und verschob sich bei N/P 10 zu negativen Werten ( ) Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass vorformulierte Nanopartikel (NP + pDNA) eine begrenzte Bindungsfähigkeit für pDNA haben und die pDNA während der Komplexierung nicht vollständig kondensieren. Die Vorinkubation der DNA mit dem in Aceton gelösten Polymer und der anschließenden Nanofällung in Wasser (NP(pDNA)) führt zu einem ähnlichen vom N/P-Verhältnis abhängigen Trend von Nanopartikelgröße und Homogenität. Das Zetapotential verbleibt im Vergleich zur NP + pDNA Formulierung interessanterweise im positiven Bereich. Im Allgemeinen zeigten Partikel, die durch Zugabe der pDNA im Verfahren erhalten wurden, einen etwas kleineren z-Mittelwert als solche, die durch nachträgliche Zugabe der pDNA erhalten wurden. Dies könnte auf eine verbesserte Wechselwirkung der pDNA mit den gelösten Polymerketten während des Nanofällungsprozesses zurückzuführen sein. Insgesamt verbesserte dieser Formulierungsansatz die Verkapselung der DNA nicht wesentlich, und die Menge an komplexierter pDNA, die zu stabilen Nanopartikeln im Größenbereich unter 200 nm mit geringer Polydispersität führte, war auf relativ hohe N/P-Verhältnisse beschränkt (N/P 100).
Zur Nanopartikelbildung und pDNA-Komplexierung wurden außer den oben beschriebenen Polymeren PDMAEMA, IPEI und PBMD-Copolymer außerdem das Copolymer Eudragit^® E100 eingesetzt.
Formulierungsmethoden ausgehend von Polymeren und basierend auf organischen Lösungsmitteln zur Nanofällung und verwandte Formulierungsmethoden sind grundsätzlich bekannt (vergl. dazu R. Jain, P. Dandekar, B. Loretz, M. Koch, C.-M. Lehr, MedChemComm 2015, 6, 691-701; N. Kanthamneni, B. Yung, R.J. Lee, Anticancer research 2016, 36, 81-85; M. Gargouri, A. Sapin, S. Bouali, P. Becuwe, J. Merlin, P. Maincent, Technology in cancer research & treatment 2009, 8, 433-443).
Erfindungsgemäß wird eine neue von organischem Lösungsmittel freie, wasserbasierte Formulierungsmethode bereitgestellt, die von der gemeinsamen Komplexbildung von DNA mit wasserlöslichen Polymeren inspiriert wurde. Das hier eingesetzte Eudragit^® E100 Copolymer und das durch RAFT hergestellte PBMD-Copolymer sind unter sauren Bedingungen aufgrund der Protonierung der DMAEMA-Gruppen löslich.
Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Methode wurde Natriumacetatpuffer (pH 5,8) verwendet, um die Copolymere vor dem Mischen mit pDNA aufzulösen. Dieser Formulierungsansatz führte zu Nanopartikeln im Bereich von 100 nm mit bei höheren N/P-Verhältnissen abnehmendem Durchmesser und mit PDI-Werten um 0,25 für alle getesteten N/P-Verhältnisse (vergleiche und . Insgesamt konnten mit dieser Formulierungsmethode wesentlich niedrigere N/P-Verhältnisse erreicht werden, was auf eine bessere Komplexierung und Kondensation der pDNA durch das PBMD-Copolymer hindeutet. Dies könnte auf einen höheren Ladungsanteil des Polymers zurückzuführen sein, wenn es im Acetatpuffer gelöst ist, und damit auf eine bessere Komplexierung und Kondensation der pDNA. Für die Genübertragung werden niedrige N/P-Verhältnisse bevorzugt. Bei niedrigeren N/P-Verhältnissen können geringere Copolymermengen verwendet werden, was zu einer effizienteren Genübertragung und einem geringeren toxischen Potenzial aufgrund reduzierter Copolymerkonzentrationen führt. Da die Komplexformulierung diese Kriterien erfüllt, wurde diese Formulierung auf In-vitro-Transfektion getestet im Vergleich zur NP + pDNA-Formulierung. Die NP(pDNA)-Formulierung wurde nicht weiter untersucht, da die niedrigen N/P-Verhältnisse, die in den In-vitro-Experimenten (10 und 20) getestet wurden, aufgrund von Ausfall und starker Aggregation während des Formulierungsprozesses nicht hergestellt werden konnten.
Beispiel 6: Versuche zur pDNA-Transfektionseffizienz in HEK293T Zellen
In , und werden Ergebnisse von Versuchen zur Transfektionseffizienz von pDNA-Copolymerkomplexen in Zellen beschrieben.
zeigt Vergleiche von Formulierungsmethoden und deren Transfektionseffizienz gemessen durch Durchflusszytometrie.
In werden durch Fluoreszenzmikroskopie ermittelte Ergebnisse beschrieben.
beschreibt die Ergebnisse der Optimierung des N/P-Verhältnisses und der pDNA-Konzentration in Komplexen mit PMBD-Copolymer durchgeführt wurde.
beschreibt Ergebnisse von Transfektionsexperimenten mit Komplexen aus pDNA mit IPEI.
beschreibt Ergebnisse von Transfektionsexperimenten mit Komplexen aus pDNA mit PMBD-Copolymer sowie mit verschiedenen kommerziell erhältlichen Polymeren wie beispielsweise Eudragit®E100.
Die Transfektionseffizienz der pH-abhängigen Formulierung, hergestellt durch pDNA-Zugabe nach der Erzeugung der Nanopartikel wurde durch Übertragung von EGFP-kodierender pDNA in HEK293T-Zellen und Messung der EGFP-Expression nach 24 h untersucht. Es wurden zwei unterschiedliche N/P-Verhältnisse im nichttoxischen Bereich ( des Copolymers getestet. Es kamen Komplexe zum Einsatz, welche durch Fällung der Nanopartikel aus Aceton gefolgt von pDNA-Zugabe (rechter Teil von und ) erzeugt worden waren und welche durch Fällung der Nanopartikel aus saurer wässriger Lösung in Anwesenheit von pDNA (linker Teil von erzeugt worden waren. Außerdem wurden zwei unterschiedliche Medien mit unterschiedlichem Gehalt an FCS eingesetzt. Ein Medium enthielt 10% FCS und ein anderes Medium war Serum-reduziert (Opti-MEM, 2% FCS). Die linken beiden Spalten in den einzelnen Teilen der beschreiben die Ergebnisse in dem Serum enthaltenden Medium; die rechten beiden Spalten in den einzelnen Teilen der beschreiben die Ergebnisse in serumfreien Medium.
In sind fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der transfizierten Zellen nach 1+23 Inkubationszeit (ohne Muster) oder nach 4 + 20 h Inkubationszeit (Muster) gezeigt. Es kamen Komplexe zum Einsatz, welche durch Fällung der Nanopartikel aus Aceton gefolgt von pDNA-Zugabe (untere Zeile von erzeugt worden waren und welche durch Fällung der Nanopartikel aus saurer wässriger Lösung in Anwesenheit von pDNA (mittlere Zeile von erzeugt worden waren. Dabei wurden jeweils N/P-Verhältnisse von 20 verwendet. Außerdem wurden in der oberen Zeile von Ergebnisse dargestellt, die Zellen zeigen, die HBG Puffer anstelle von Nanopartikeln oder Komplexen erhalten haben und die als interne Kontrolle innerhalb des Expermentes dienen (ctrl).
Im Allgemeinen zeigten beide Formulierungen, also solche hergestellt durch Fällung aus Aceton und durch Fällung aus saurer wässsriger Lösung, Transfektion in HEK293T-Zellen mit einer höheren Effizienz unter serumreduzierten Bedingungen und bei höheren N/P-Verhältnissen. Die pH-abhängige Formulierung zeigte höhere und beständigere Transfektionseffizienzen im Vergleich zur Formulierung hergestellt durch Fällung aus Aceton. Dies könnte auf Aggregate zurückzuführen sein, die durch die Formulierung der pDNA-Zugabe nach dem Verfahren gebildet worden sind mit Teilchendurchmessern von > 500 nm und mit einer höheren Polydispersität in den DLS-Messungen ( und . Daher unterscheidet sich die Sedimentation der verschiedenen Arten in der Formulierung in Abhängigkeit von deren Größe, was zu Variationen in der zellulären Aufnahme und in der Transfektionseffizienz führt.
Die pH-abhängige Formulierung führt zu Nanopartikeln mit geringerer Variation der Größen ohne Bildung von Aggregaten. Dies könnte zu einer kontrollierteren Aufnahme in die Zellen und zu einer beständigeren Transfektionsraten führen.
Da die pH-abhängige Formulierung Partikel mit bevorzugtem N/P-Verhältnis, Größe und Homogenität liefert, wurde diese Formulierung weiter untersucht und hinsichtlich der Transfektionseffizienz optimiert. Die Bedingungen während der Transfektion mit PBMD-Copolymer-Komplexen wurden für eine hohe Transfektionseffizienz bei gleichzeitig hoher Zelllebensfähigkeit optimiert. Darüber hinaus sollten die minimale Menge an Copolymer und pDNA identifiziert werden. Unterschiedliche pDNA-Konzentrationen wurden untersucht, wobei das N/P-Verhältnis konstant bei 20 gehalten wurde, da sich dies als optimal erwiesen hatte (vergl. linke Hälfte von ). Anschließend wurde die ideale pDNA-Konzentration (0,5 mg mL^-1) durch Variation des N/P-Verhältnisses weiter optimiert (vergl. rechte Hälfte von ).
Die Ergebnisse aus wurden mit Komplexen aus p-DNA und IPEI als Goldstandard verglichen (vergleiche ). Insgesamt zeigten mit PBMD-Copolymer gebildete Komplexe hohe Transfektionseffizienzen bei niedrigeren pDNA-Konzentrationen und kürzeren Inkubationszeiten im Vergleich mit Komplexen, die mit pDNA und IPEI gebildet wurden.
Inkubationszeiten von 4 h führten bei Komplexen aus pDNA und PBMD-Copolymer im Vergleich zu Komplexen aus p-DNA und IPEI zu höheren Transfektionseffizienzen über den untersuchten Konzentrations- und N/P-Verhältnisbereich, aber führten bei höherer Polymerkonzentration (= größerem N/P-Verhältnis) auch zu einer verminderten Zelllebensfähigkeit (vergl. und ). Bei der Erhöhung der pDNA-Konzentration (8.59% bei 0,25 µg mL^-1 bis 64,3% bei 1,5 µg mL^-1, 4h Inkubationszeit) wurde eine Erhöhung der Transfektions-effizienz beobachtet (vergl. linker Teil von ). Eine Erhöhung des N/P-Verhältnisses bei konstanter pDNA-Konzentration resultierte in höheren Wirkungsgraden (vergl. rechter Teil von ), führte aber zu einer erhöhten Zellablösung und zu Zelltod. Daher wurden 0,5 µg mL^-1 bei einem N/P-Verhältnis von 20 als ideale Voraussetzungen für eine effektive pDNA-Transfektion mit dem PBMD-Copolymer-Komplex gewählt.
Im Vergleich mit dem Goldstandard IPEI konnte die pDNA-Konzentration auf 0,5 µg mL^-1 verringert werden, was nach 1 h Inkubation immer noch zu 22,5% fluoreszierender Zellen führte, und was mit IPEI in dieser kurzen Inkubationszeit und in diesem untersuchten pDNA-Konzentrationsbereich (0,5 bis 5 µg mL^-1) nicht möglich war (vergl. linken Teil von mit ). Um höhere Transfektionseffizienzen zu erreichen, muss entweder die pDNA-Konzentration erhöht werden oder Inkubationszeiten von bis zu 24 h sind erforderlich (vergl. ). PDMAEMA zeigte selbst bei sehr hohen pDNA-Konzentrationen von 5 µg mL^-1 und Inkubationszeiten von 24 h fast keine Transfektion. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese des Einflusses hydrophober Seitenketten auf die In-vitro-Leistungsfähigkeit von kationischen Polymeren als Genübertragungsvektoren.
In ist die Transfektionseffizienz von pDNA-Komplexen mit PMBD-Copolymer, mit PDMAEMA-Homopolymer und mit den kommerziellen Polymeren Eudragit^® E100, Viromer red und IPEI gezeigt.
Die Formulierungen für PBMD und EUDRAGIT^® E100 wurden durch Fällung aus saurer wässriger Lösung in Anwesenheit von pDNA hergestellt. Die Expression von eGFP in HEK293T-Zellen nach Transfektion wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. HEK293T-Zellen wurden bei einem N/P-Verhältnis von 20 und einer pDNA-Konzentration von 0,5 µg mL^-1 transfiziert.
Die pDNA-PBDM-Komplex-Formulierungstechnik wurde weiter auf das kommerzielle Polymer Eudragit^® E100 angewendet und unter den optimierten Transfektionsbedingungen untersucht. Darüber hinaus wurde die Transfektionseffizienz mit dem kommerziellen Transfektionsmittel Viromer Red verglichen. Insgesamt war die pH-abhängige Formulierung auf das kommerzielle Polymer EUDRAGIT^® E100 anwendbar, das nach 1 h Inkubation mit dem pDNA-PBMD-Copolymer-Komplex vergleichbare Transfektionseffizienzen aufwies, aber nach 4 h Inkubation einen etwas geringeren Wirkungsgrad zeigte. Dies könnte auf den etwas höheren DMAEMA-Gehalt im PBMD-Copolymer zurückzuführen sein. Ein höherer kationischer Gehalt würde zu einer höheren DNA-Bindung und einer erhöhten Membranaktivität führen.
Beide Copolymere sind in ihrer Leistungsfähigkeit den kommerziellen Transfektionsmitteln Viromer Red und IPEI deutlich überlegen.
In werden Ergebnisse von Versuchen zur Transfektionseffizienz von siRNA-Komplexen in Zellen beschrieben.
Zur Bestimmung der Knock-down Effizienz wurde anti-GFP-siRNA in HEK-GFP Zellen, die eine stabile Expression von GFP zeigen, durch Copolymer-siRNA Komplexen, die mittels Fällung aus wässriger saurer Lösung hergestellt wurden, in die Zellen eingebracht. Die Knock-down Effizienz nach 72 h Inkubation wurde mit dem Goldstandard Lipofectamin verglichen. Als Kontrolle dienten Zellen, die nur mit HBG Puffer behandelt wurde. Sowohl durch Einbringen von Lipofactamin als auch Copolymer-siRNA Komplexen zeigte sich eine Reduktion der Anzahl an fluoreszierenden Zellen (GFP positive Zellen) im Vergleich zur Kontrolle (100%).
Copolymer-siRNA Komplexe zeigten eine Reduktion der GFP positiven Zellen auf 42,9% bei einem N/P-Verhältnis von 10 und eine weitere Reduktion auf 25,2% bei einem N/P-Verhältnis von 5. Lipofectamin führte zu einer Reduktion auf 8,6%. Damit zeigt das PBMD-Copolymer auch für das Einbringen von siRNA in Zellen ein hohes Potential, das durch weitere Optimierung der Transfektionsbedingungen wie Inkubationszeit, N/P Verhältnis und siRNA Menge, noch verbessert werden kann.
In werden Ergebnisse von Versuchen zur Transfektioneffizienz von mRNA-Komplexen in Zellen beschrieben.
Die Ausfällung von Komplexen aus genetischem Material und Copolymer wurde auch für die Herstellung von Copolymer-mRNA Komplexen angewendet. Die Transfektionseffizienz dieser Komplexe wurde durch Einbringen von GFP-mRNA in HEK293T Zellen bestimmt. Hierbei wurden verschiedene N/P-Verhältnisse (5, 10, 20) und mRNA Konzentrationen (0,25 bis 0,75 µg mL^-1) getestet. Die Zellen wurden 4 h mit den Komplexen inkubiert wurden. 6 beziehungsweise 24 h nach Beginn der Behandlung wurde die GFP-Expression mittels Fluoreszenzmessung in der Durchflusszytometrie bestimmt. Die Transfektionseffizienz der Copolymer-mRNA Komplexe wurde mit dem kommerziell erhältlichen Viromer Red verglichen, das für die Transfektion von mRNA entwickelt wurde und in der Literatur hohe Effizienzen zeigt. Als Negativkontrolle dienten Zellen, die nur mit HBG Puffer bzw. mRNA ohne Copolymer inkubiert wurden. Sowohl Viromer Red, als auch Copolymer-mRNA Komplexe führten zu einer von der mRNA Konzentration abhängigen GFP Expression in HEK293T Zellen. Eine höhere mRNA Konzentration führte zu höheren Expressionsraten, während eine Erhöhung des N/P-Verhältnisses in den Copolymer-mRNA Komplexen ebenfalls zu einer Erhöhung führte. Viromer Red zeigte die höchste Transfektioneffizienz bei einer mRNA Konzentration von 0.75 µg mL^-1 und einer Inkubationszeit von 24 h (55,8%). Die höchste Transfektionseffizienz wurde nach 24h Inkubation mit Copolymer-mRNA Komplexen mit einen N/P-Verhältnis von 20 und einer mRNA-Konzentration von 0.75 µg mL^-1 erreicht (73.1%). Neben dem Einbringen von pDNa und siRNA in Zellen zeigt das PBMD-Copolymer somit auch ein hohes Potential für das Einbringen von mRNA in Zellen.
In - werden Ergebnisse zur Synthese und Charakterisierung unterschiedlicher PBMD-Copolymerer mit variierenden Molekulargewichten beschrieben.
Gezeigt werden die Syntheseroute für die Herstellung der PBMD-Copolymere (beschrieben in Beispiel 1A, sowie die Molekulargewichtsverteilung und Polydispersität der durch RAFT-Polymerisation in Analogie zu Beispiel 1A dargestellten Copolymere, ermittelt durch Gößenausschlusschromatographie (SEC) ( und ).
In ist die Transfektionseffizienz von pDNA-Komplexen mit PMBD-Copolymeren unterschiedlichen Molekulargewichts in HEK293T Zellen gezeigt.
Die Transfektionseffizienz der PBMD-Polymerbibliothek wurde in HEK293T-Zellen unter den optimierten Bedingungen von PBMD182-Copolymer untersucht. egfppDNA wurde durch die in Acetatpuffer gelösten Copolymere komplexiert und entweder 1 oder 4 h mit den Zellen inkubiert. Insgesamt zeigten alle Copolymer-pDNA Komplexe innerhalb der PBMD-Bibliothek eine Transfektionseffizienz HEK293T Zellen. Die Ergebnisse zeigen einen klaren Einfluss der Molmasse und des molaren Gehalts an DMAEMA auf die Transfektionseffizienz. Copolymer-pDNA Komplexe mit einem Molekulargewicht von >15 kDa und einem molaren DMAEMA Gehalt von 50% zeigen Transfektioneffizienzen von 18% und höher abhängig von der Inkubationszeit. Die höchsten Transfektionseffizienzen wurden mit dem PBMD182-Copolymer (dem Copolymer hergestellt nach Beispiel 1A) nach 4h Inkubation mit den Copolymer-pDNA Komplexen erreicht (34,6%). Das PBMD185(40%)-Copolymer mit einem molaren Gehalt an DMAEMA von 40% und mit einer Molmasse > 15 kDa zeigte vergleichsweise etwas geringere Transfektionseffizienzen (13% nach 1h Inkubation, 21,7% nach 4h Inkubation) im Vergleich zu Polymeren mit 50% molarem DMAEMA Gehalt. Die Bildung von Copolymer-pDNA Komplexen lässt sich somit auch auf Polymere unterschiedlicher Molmasse übertragen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Nanopartikel enhaltend Komplexe gebildet aus Nukleinsäuren und kationischen Copolymeren enthaltend die wiederkehrenden Struktureinheiten der Formeln (la) und (Ib)
worin R¹ und R⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl oder -COOR⁹ bedeuten, R² und R⁷ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl sind, R³ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -O-R¹⁰-, -COO-R¹⁰-, -CONH-R¹⁰- oder -R¹⁰-, R⁴ Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkylaryl bedeutet, R⁵ Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Alkylaryl oder -(Alkylen-NH-)_m-Alkyl bedeutet, oder R⁴ und R⁵ zusammen mit dem gemeinsamen Stickstoffatom einen heterozyklischen Ring bilden, R⁸ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus -O-R¹¹, -COO-R¹¹, -CONH-R¹¹ oder -R¹¹ darstellt, R⁹ und R¹¹ unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen einwertigen organischen Rest bedeuten, R¹⁰ einen zweiwertigen organischen Rest bedeutet, und m eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, mit der Massgabe, dass die Nanopartikel einen mittels dynamischer Lichstreuung ermittelten Durchmesser (z-Average) von kleiner gleich 900 nm aufweisen.
Nanopartikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren DNA und/oder RNA bedeuten, insbesondere ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus A-DNA, B-DNA, Z-DNA, mtDNA, bakterieller DNA, antisenseDNA, viraler DNA, hnRNA, mRNA, tRNA, rRNA, mtRNA, snRNA, snoRNA, scRNA, siRNAa, miRNA, antisense RNA, bakerieller RNA und viraler RNA.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ und R⁶ unabhängig voneinander Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl, insbesondere Wasserstoff oder Methyl und ganz besonders bevorzugt Methyl bedeuten.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass R² und R⁷ unabhängig voneinander Wasserstoff oder C₁-C₉-Alkyl, insbesondere Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl und ganz besonders bevorzugt Wasserstoff oder Methyl bedeuten.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass R³ -O-R¹⁰-, -COO-R¹⁰-, -CONH-R¹⁰- oder -R¹⁰- darstellt, und R¹⁰ ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C₂-C₁₂-Alkylen, C₅-C₇-Cycloalkylen und C₆-C₁₀-Arylen, insbesondere C₂-C₆-Alkylen, und ganz besonders bevorzugt Ethylen ist.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl, und insbesondere Wasserstoff und Methyl und ganz besonders bevorzugt Methyl bedeuten.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass R⁸ -COO-R¹¹ oder -CONH-R¹¹ darstellt, und R¹¹ C₁-C₆-Alkyl, Phenyl, Benzyl oder C₁-C₆-Alkylphenyl, ganz besonders bevorzugt C₁-C₆-Alkyl und äußerst bevorzugt Methyl, Ethyl, Propyl und/oder Butyl bedeutet.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Copolymere eine wiederkehrende Struktureinheit der Formel (la) und zwei unterschiedliche wiederkehrende Strukturenheiten der Formel (Ib) enthalten, in denen R¹ und R⁶ Wasserstoff bedeuten, R² und R⁷ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, insbesondere Methyl, R³ -COO-R¹⁰-, R¹⁰ Ethylen bedeutet, R⁴ und R⁵ unabhängig voneinander C₁-C₆-Alkyl sind, insbesondere Methyl, und R⁸ -COO-R¹¹ ist, wobei in einer wiederkehrenden Struktureinheit der Formel (Ib) R¹¹ C₁-C₃-Alkyl, insbesondere Methyl ist, und in einer anderen wiederkehrenden Struktureinheit der Formel (Ib) R¹¹ C₄-C₆-Alkyl, insbesondere n-Butyl ist.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Copolymeren neben den wiederkehrenden Struktureinheiten der Formeln (Ia und (Ib) noch weitere wiederkehrende Struktureinheiten der Formel (Ic) enthalten
worin R¹², R¹³ und R¹⁴ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl, bevorzugt Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl, besonders bevorzugt Wasserstoff oder Methyl sind, und BG eine zweiwertige organische Brückengruppe mit Ether-, Ester-, Amid-, Sulfid-, Phosphat- oder Disulfidgruppen bedeutet.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der molare Anteil der wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel (la) zwischen 10 und 75%, vorzugsweise zwischen 15 und 65% und ganz besonders bevorzugt zwischen 20 und 55%, bezogen auf das gesamte kationische Copolymer, beträgt und dass der molare Anteil der wiederkehrenden Struktureinheiten der Formel (Ib) zwischen 90 und 25%, vorzugsweise zwischen 85 und 45% und ganz besonders bevorzugt zwischen 80 und 45%, bezogen auf das gesamte kationische Copolymer, beträgt.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass deren durch Lichtstreuung bestimmte Teilchendurchmesser (z-Average) sich im Bereich zwischen 40 und 250 nm bewegen.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass deren Polydispersitätsindex der Teilchengrößenverteilung, gemessen mit dem Malvern Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, Vereinigtes Königreich) unter Anwendung der Kumulantenanalyse der Korrelationsfunktion (ISO13321, ISO22412) sich im Bereich zwischen 0,05 und 0,4, vorzugsweise zwischen 0,1 und 0,4 und besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 0,3 bewegt.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Polydispersitätsindex der Molmassenverteilung der eingesetzten kationischen Copolymere sich im Bereich zwischen 1,0 und 3,0, vorzugsweise zwischen 1,01 und 2,6 bewegt.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass diese nach 1 Stunde Inkubationszeit von Zellen mit den Nanopartikeln und 23 h folgender Inkubation der Zellen in Wachstumsmedium ohne Nanopartikel eine Transfektionseffizienz für pDNA von 15 bis 50% (viable fluoreszierende Zellen), insbesondere von 20 bis 45% aufweisen.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das molare Verhältnis von Stickstoffatomen im Copolymer zu den Phosphatgruppen in der Nukleinsäure zwischen 1 und 200, vorzugsweise zwischen 2,5 und 100 und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 50 beträgt.
Nanopartikel nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass diese mittels DLS bestimmte Durchmesser zwischen 40 und 250 nm aufweisen sowie einen Polydispersitätsindex der Teilchendurchmesser zwischen 0,1 und 0,3.
Nanopartikel nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass deren molares Verhältnis von Stickstoffatomen im Copolymer zu den Phosphatgruppen in der Nukleinsäure zwischen 10 und 30 beträgt.
Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass diese in Wasser dispergiert vorliegen, und dass deren Gewichtsanteil in der Dispersion zwischen 0,01 und 20%, vorzugsweise zwischen 0.05 und 5% beträgt.
Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln enthaltend die folgende Maßnahmen : i) Herstellen einer wässrigen Lösung eines kationischen Copolymeren enthaltend die wiederkehrenden Struktureinheiten der Formeln (la) und (Ib) nach Anspruch 1 mit einem pH-Wert zwischen 3 und 6,5, ii) Herstellen einer wässrigen Lösung einer Nukleinsäure, iii) Vermischen beider in Schritt i) und ii) hergestellter Lösungen in einem ausgewählten Mengenverhältnis von Nukleinsäure und Copolymer, so dass sich ein gewünschtes molares N/P-Verhältnis von Stickstoffatomen im Copolymer zu den Phosphatgruppen in der Nukleinsäure ergibt, vorzugsweise ein N/P-Verhältnis zwischen 1 und 200, und iv) Bewegen der erhaltenen Mischung.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass dieses als Schritt v) eine Inkubation der erhaltenen Mischung umfasst.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung des kationischen Copolymers für Schritt i) einen Puffer enthält, insbesondere einen Acetatpuffer, Citratpuffer, Lactatpuffer, Phosphatpuffer, Phosphat-Citrat-Puffer oder Micshungen der Puffer.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung der Nukleinsäure für Schritt ii) einen pH-Wert von 6,5 bis 8,5, insbesondere von 6,8 und 7,5, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung der Nukleinsäure für Schritt ii) einen Puffer enthält, insbesondere einen HBG-, HEPES- oder TRIS-Puffer.
Verfahren zum Gentransfer in Zellen, welches folgende Schritte enthält: A) Inkontaktbringen von Zellen mit einer wässrigen Suspension enthaltend die Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18, und B) anschließendes Inkubieren.
Verfahren nach Anspruch 24, welches folgende Schritte enthält: C) Bereitstellen einer Zellkultur in einem Bioreaktor oder Inkubator, D) Zugabe einer wässrigen Suspension enthaltend die Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüch 1 bis 18, E) Verteilen der wässrigen Suspension in der Zellkultur, und F) anschließendes Inkubieren.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 24 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzten Zellen ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Einzelzellen, Geweben oder Zellkulturen.
Verwendung der Nanopartikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18 zum Gentransfer in Zellen.