DE602004007518T2 - Biologisch abbaubare poly(beta-aminoester) und anwendungen davon - Google Patents

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Description

  • Unterstützung der Regierung
  • Die hierin beschriebene Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse der National Science Foundation (Cooperative Agreement #ECC9843342 für das MIT Biotechnology Process Engineering Center), der National Institutes of Health (GM26698; NRSA Fellowship # 1 F32 GM20227-01) und des Department of the Army (Cooperative Agreement # DAMD 17-99-2-9-001 und des Center for Innovative Minimally Invasive Therapy) unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten kann bestimmte Rechte an dieser Erfindung haben.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Behandlung von menschlichen Krankheiten durch die Anwendung von Nucleotid-basierten Arzneien wie DNA und RNA hat das Potential, den medizinischen Sektor zu revolutionieren (Anderson Nature 392(Beil.): 25-30, 1996; Friedman Nature Med. 2: 144-147, 1996; Crystal Science 270: 404-410, 1995; Mulligan Science 260: 926-932, 1993.
  • Bis jetzt hat die Verwendung von modifizierten Viren als Gentransfervektoren im Allgemeinen die klinisch erfolgreichste Herangehensweise an Gentherapie dargestellt. Während virale Vektoren gegenwärtig die effizientesten Gentransfermittel sind, ergaben Bedenken um die allgemeine Sicherheit von viralen Vektoren, welche das Potential für ungebetene Immunantworten einschließen, parallele Anstrengungen, um nicht-virale Alternativen zu entwickeln (für führende Verweise siehe: Luo et al. Nat. Biotechnol. 18: 33-37, 2000; Behr Acc. Chem. Res. 26: 274-278, 1993).
  • Gegenwärtige Alternativen zu viralen Vektoren schließen polymere Abgabesysteme (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30: 97-113, 1998; Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6: 7-20, 1995), liposomale Formulierungen (Miller Angew. Chem. Int. Ed. 37: 1768-1785, 1998; Hope et al. Molecular Membrane Technology 15: 1-14, 1998; Deshmukh et al. New J. Chem. 21: 113-124, 1997; und „nackte" DNA Injektionsprotokolle (Sanford Trends Biotechnol. 6: 288-302, 1988) ein.
  • Während diese Strategien noch die klinische Wirksamkeit von viralen Vektoren erreichen müssen, haben die durch diese Verfahren angebotenen Nutzen bezüglich potentieller Sicherheit, Verar beitung und Wirtschaftlichkeit (Anderson Nature 392 (Beil.): 25-30, 1996) Interesse an der fortgesetzten Entwicklung von nicht-viralen Herangehensweisen an Gentherapie entfacht (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297-7301, 1995; Putnam et al. Macromolecules 32: 3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999; Gonzalez et al. Bioconjugate Chem. 10: 1068-1074, 1999; Kukowska-Latallo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4897-4902, 1996; Tang et al. Bioconjugate Chem./: 703-714, 1996; Haensler et al. Bioconjugate Chem. 7: 372-379, 1993).
  • Kationische Polymere sind wegen der Leichtigkeit, mit welcher sie negativ geladene Stränge von DNA schützen und kondensieren, weithin als Transfektionsvektoren verwendet worden. Amin enthaltende Polymere wie Poly(lysin) (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30: 97-113, 1998; Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6: 7-20, 1995), Poly(ethylenimin) (PEI) (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297-7301, 1995), und Poly(amidoamin)-Dendrimere (Kukowska-Latallo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4897-4902, 1996; Tang et al. Bioconjugate Chem. 7: 703-714, 1996; Haensler et al. Bioconjugate Chem. 4: 372-379, 1993) sind bei physiologischem pH positiv geladen, bilden Ionenpaare mit Nucleinsäuren und vermitteln Transfektion in einer Vielzahl an Zelllinien. Trotz ihrer üblichen Verwendung können kationische Polymere wie Poly(lysin) und PEI jedoch signifikant cytotoxisch sein (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30: 97-113, 1998; Deshmukh et al. New J. Chem. 21: 113-124, 1997; Choksakulnimitr et al. Controlled Release 34: 233-241, 1995; Brazeau et al. Pharm. Res. 15: 680-684, 1998). Als Folge erfordert die Wahl von kationischen Polymeren für eine Gentransfer-Anwendung im Allgemeinen einen Kompromiss zwischen Transfektionseffizienz und kurz- und langfristiger Cytotoxizität. Zusätzlich bleibt die langfristige Biokompatibilität dieser Polymere ein wichtiges Thema für die Verwendung in therapeutischen Anwendungen in vivo, da mehrere dieser Polymere nicht leicht biologisch abbaubar sind (Uhrich Trends Polym. Sci. 5: 388-393, 1997; Roberts et al. J. Biomed. Mater. Res. 30: 53-65, 1996).
  • Um sichere Alternativen zu bestehenden polymeren Vektoren und anderen funktionalisierten Biomaterialien zu entwickeln, sind abbaubare Polyester, welche kationische Seitenketten tragen, entwickelt worden (Putnam et al. Macromolecules 32: 3658-3662, 1999; Barrera et al. J. Am. Chem. Soc. 115: 11010-11011, 1993; Kwon et al. Macromolecules 22: 3250-3255, 1989; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639; 1999; Zhou et al. Macromolecules 23: 3399-3406, 1990). Beispiele für diese Polymere schließen Poly(L-lactid-co-L-lysin) (Barrera et al. J. Am. Chem. Soc. 115: 11010-11011, 1993), Poly(serinester) (Zhou et al. Macromolecules 23: 3399-3406, 1990), Poly(4-hydroxy-L-prolinester) (Putnam et al. Macromolecules 32: 3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999), und kürzlich Poly[α-(4-aminobutyl)-L-glycolsäure] ein. Von Poly(4-hydroxy-L-prolinester) und Poly[α-(4-aminobutyl)-L-glycolsäure] wurde kürzlich gezeigt, dass sie Plasmid DNA durch elektrostatische Interaktionen kondensieren und Gentransfer vermitteln (Putnam et al. Macromolecules 32: 3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999).
  • Wichtigerweise sind diese neuen Polymere signifikant weniger toxisch als Poly(lysin) und PEI und sie zerfallen in nicht-toxische Metaboliten. Es ist aus diesen Untersuchungen klar, dass der rationale Entwurf von Amin-enthaltenden Polyestern ein produktiver Weg zur Entwicklung von sicheren, wirksamen Transfektionsvektoren sein kann. Unglücklicherweise erfordern gegenwärtige Synthesen dieser Polymere jedoch entweder die unabhängige Herstellung von spezialisierten Monomeren (Barrera et al. J. Am. Chem. Soc. 115: 11010-11011, 1993) oder die Verwendung von stöchiometrischen Mengen an teuren Kopplungsreagenzien (Putnam et al. Macromolecules 32: 3658-3662, 1999). Zusätzlich müssen die Amin-Funktionalitäten in den Monomeren vor Polymerisation geschützt werden (Putnam et al. Macromolecules 32: 3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999; Gonzalez et al. Bioconjugate Chem. 10: 1068-1074, 1999; Barrera et al. J. Am. Chem. Soc. 115: 11010-11011, 1993; Kwon et al. Macromolecules 22: 3250-3255, 1989), was zusätzliche Entschützungsschritte nach Polymerisation notwendig macht, bevor die Polymere als Transfektionsmittel verwendet werden können.
  • US-2002/0131951 offenbart Poly(β-aminoester), hergestellt aus der Konjugat-Addition von Bis(sekundären Aminen) oder primären Aminen zu einem Bis(acrylatester) und ihre Verwendung in Arzneiabgabesystemen.
  • Es besteht ein fortgesetzter Bedarf an nicht-toxischen, biologisch abbaubaren, biokompatiblen Polymeren, die verwendet wer den können, um Nucleinsäuren zu transfizieren, und die effizient und wirtschaftlich leicht hergestellt werden. Solche Polymere hätten mehrere Anwendungen, einschließlich Abgabe von Nucleinsäuren in Gentherapie, als auch bei der Verpackung und/oder Abgabe von diagnostischen, therapeutischen und prophylaktischen Wirkstoffen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung sieht Polymere vor, welche beim Herstellen von Arzneimittelabgabevorrichtungen brauchbar sind, und pharmazeutische Zusammensetzungen davon. Die Erfindung sieht ebenfalls Verfahren zum Herstellen der Polymere vor und Verfahren zum Herstellen von Mikrokugeln und anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die Polymere der Erfindung enthalten.
  • Die Polymere der vorliegenden Erfindung sind Poly(β-aminoester) und Salze und Derivate davon. Bevorzugte Polymere sind biologisch abbaubar und biokompatibel. Typischerweise haben die Polymere ein oder mehrere tertiäre Amine im Grundgerüst des Polymers. Bevorzugte Polymere haben ein oder zwei tertiäre Amine pro sich wiederholender Grundgerüsteinheit. Die Polymere können auch Co-Polymere sein, in welchen einer der Bestandteile ein Poly(β-aminoester) ist. Die Polymere der Erfindung können leicht durch Kondensieren von Bis(sekundären Aminen) oder primären Aminen mit Bis(acrylatestern) hergestellt werden. Ein Polymer der vorliegenden Erfindung ist im Allgemeinen wie folgt definiert:
    Figure 00040001
    worin
    X ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C1-C6-nied.-Alkyl, C1-C6-nied.-Alkoxy, Halogen, OR und NR2; bevorzugter Methyl, OH oder NH2;
    R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, cyclisch, heterocyclisch, Aryl und Heteroaryl;
    jedes R' unabhängig ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C1-C6-nied.-Alkyl, C1-C6-nied.-Alkoxy, Hydroxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Cyano, Thiol, Heteroaryl, Aryl, Phenyl, heterocyclisch, carbocyclisch und Halogen; R' vorzugsweise Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Hydroxyl, Amino, Fluor, Chlor oder Brom darstellt, bevorzugter R' Fluor, Wasserstoff oder Methyl darstellt;
    n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10000 ist;
    x eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; x vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 2 und 6 ist;
    y eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; x vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 2 und 6 ist; und
    Derivate und Salze davon. Alternative Polymere, welche nicht Teil der Erfindung sind, werden durch eine der Formeln unten dargestellt:
    Figure 00050001
    wo A und B Linker sind, welche jede substituierte oder nichtsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte Kette von Kohlenstoffatomen oder Heteroatomen sein können. Das Molekulargewicht der Polymere kann von 1000 g/mol bis 20000 g/mol, vorzugsweise von 5000 g/mol bis 15000 g/mol reichen. B kann eine Alkylkette oder ein bis zwölf Kohlenstoffatome sein. B kann eine heteroaliphatische Kette sein, welche insgesamt ein bis zwölf Kohlenstoffatome und Heteroatome enthält. Die Gruppen R1 und R2 können jeder von einer großen Vielfalt an Substituenten sein. R1 und R2 können primäre Amine, sekundäre Amine, tertiäre Amine, Hydroxylgruppen und Alkoxygruppen enthalten. Die Polymere können Amin-terminiert sein und die Polymere können Acrylat-terminiert sein. Die Gruppen R1 und/oder R2 können cyclische Strukturen mit dem Linker A (siehe Abschnitt detaillierte Beschreibung unten) bilden. Poly mere, welche solche cyclischen Komponenten enthalten, haben das Kennzeichen, bei niedrigem pH löslicher zu sein. Besonders bevorzugte Polymere sind jene, die in wässerigen Lösungen bei physiologischem pH (pH 7,2-7,4) unlöslich sind und in wässerigen Lösungen unter dem physiologischen pH (pH < 7,2) löslich sind. Weitere bevorzugte Polymere sind jene, die in wässerigen Lösungen bei physiologischem pH (pH 7,2-7,4) und darunter löslich sind. Bevorzugte Polymere sind bei der Transfektion von Polynucleotiden in Zellen brauchbar.
  • Es wird ein Verfahren zum Herstellen der Polymere der Erfindung vorgesehen. Kommerziell erhältliche oder leicht erhältliche Monomere, Bis(sekundäre Amine), primäre Amine und Bis(acrylatester) können Bedingungen unterworfen werden, welche zur Konjugat-Addition des Amins an den Bis(acrylatester) führen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird jedes der Monomere in einem organischen Lösungsmittel (z.B. DMSO, DMF, THF, Diethylether, Methylenchlorid, Hexane usw.) gelöst und die sich ergebenden Lösungen werden vereinigt und für eine Zeit erhitzt, welche ausreichend ist, zu Polymerisation der Monomere zu führen. In anderen Ausführungsformen wird die Polymerisation in Abwesenheit von Lösungsmittel durchgeführt. Das sich ergebende Polymer kann dann unter Verwendung von nach Stand der Technik bekannten Techniken gereinigt und gegebenenfalls gekennzeichnet werden.
  • In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung werden die Polymere verwendet, um Komplexe im Nanometer-Maßstab mit Nucleinsäuren zu bilden. Die Polynucleotid/Polymer-Komplexe können durch Zugabe einer Lösung von Polynucleotid zu einer wirbelnden Lösung des Polymers bei einer gewünschten DNA/Polymer-Konzentration gebildet werden. Das Gewicht-zu-Gewicht Verhältnis von Polynucleotid zu Polymer kann von 1:0,1 bis 1:200, vorzugsweise von 1:10 bis 1:150, bevorzugter von 1:50 bis 1:150 reichen. Das Aminmonomer-zu-Polynucleotidphosphat Verhältnis kann annähernd 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1 und 200:1 sein. Die kationischen Polymere kondensieren das Polynucleotid in lösliche Partikel, welche typischerweise eine Größe von 50-500 nm haben. Diese Polynucleotid/Polymer-Komplexe können bei der Abgabe von Polynucleotiden an Zellen verwendet werden. In einer be sonders bevorzugten Ausführungsform werden diese Komplexe mit pharmazeutischen Arzneimittelträgern kombiniert, um pharmazeutische Zusammensetzungen zu bilden, welche für Abgabe an Tiere einschließlich Menschen geeignet sind. In bestimmten Ausführungsformen wird ein Polymer mit einem hohen Molekulargewicht zu Stickstoffatom Verhältnis (z.B. Polylysin, Polyethylenimin) verwendet, um Transfektionseffizienz zu erhöhen.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden die Polymere verwendet, um therapeutische, diagnostische und/oder prophylaktische Wirkstoffe einschließlich Polynucleotide einzukapseln, um Mikropartikel zu bilden. Typischerweise haben diese Mikropartikel eine Größenordnung größer als die Polynucleotid/Polymer-Komplexe. Die Mikropartikel reichen von 1 Mikrometer bis 500 Mikrometer. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ermöglichen diese Mikropartikel die Abgabe von labilen kleinen Molekülen, Proteinen, Peptiden und/oder Polynucleotiden an ein Individuum. Die Mikropartikel können unter Verwendung von beliebigen nach Stand der Technik bekannten Techniken zur Herstellung von Mikropartikeln hergestellt werden, zum Beispiel Doppelemulsion, Phaseninversion und Sprühtrocknen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform können die Mikropartikel für pH-getriggerte Abgabe des eingekapselten Inhalts als Folge von pH-responsiver Natur des Polymers (also bei niedrigerem pH löslicher zu sein) verwendet werden.
  • In noch einem weiteren Aspekt wird ein System zum Synthetisieren und Screening einer Sammlung von Polymeren vorgesehen. In bestimmten Ausführungsformen nutzt das System Techniken, welche nach Stand der Technik für automatisierte Flüssigkeitshandhabung und Robotertechnik bekannt sind. Das System von Synthetisieren und Screening kann mit Poly(beta-aminoester)n, als auch anderen Arten von Polymeren verwendet werden, einschließlich Polyamiden, Polyestern, Polyethern, Polycarbamaten, Polycarbonaten, Polyharnstoffen, Polyaminen usw. Die Sammlung von Polymeren kann eine Sammlung sein, bei der alle von einer Art sind (z.B. alle Poly(beta-aminoester), oder kann eine mannigfaltige Sammlung von Polymeren sein. Tausende von Polymeren können unter Verwendung des Systems der Erfindung parallel synthetisiert und gescreent werden. In bestimmten Ausführungsformen werden die Polymere nach Eigenschaften gescreent, welche im Bereich der Genabgabe, Trans fektion oder Gentherapie brauchbar sind. Einige dieser Eigenschaften schließen Löslichkeit bei verschiedenen pHs, Fähigkeit, Polynucleotide zu komplexieren, Fähigkeit, ein Polynucleotid in eine Zelle zu transfizieren usw. ein. Bestimmte Poly(beta-aminoester), von denen gefunden wurde, dass sie beim Transfizieren von Zellen brauchbar sind, schließen M17, KK89, C32, C36, JJ28, JJ32, JJ36, LL6 und D94 ein, wie in Beispielen 4 und 5 beschrieben.
  • Definitionen
  • Die Folgenden sind chemische Begriffe, welche in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet werden:
    Der Begriff Acyl, wie hierin verwendet, verweist auf eine Gruppe mit der allgemeinen Formel -C(=O)R, worin R Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, carbocyclisch, heterocyclisch oder aromatisch heterocyclisch darstellt. Ein Beispiel für eine Acylgruppe ist Acetyl.
  • Der Begriff Alkyl, wie hierin verwendet, verweist auf gesättigte, gerad- oder verzweigtkettige Kohlenwasserstoffreste, abgeleitet von einer Kohlenwasserstoffkomponente, welche zwischen einem und zwanzig Kohlenstoffatome enthält, durch Entfernung eines einzelnen Wasserstoffatoms. In einigen Ausführungsformen enthält die in der Erfindung eingesetzte Alkylgruppe 1-10 Kohlenstoffatome. In einer anderen Ausführungsform enthält die eingesetzte Alkylgruppe 1-8 Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthält die Alkylgruppe 1-6 Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthält die Alkylgruppe 1-4 Kohlenstoffe. Beispiele für Alkylreste schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl, sek.-Pentyl, iso-Pentyl, tert.-Butyl, n-Pentyl, Neopentyl, n-Hexyl, sek.-Hexyl, n-Heptyl, n-Octyl, n-Decyl, n-Undecyl, Dodecyl und Ähnliche, welche einen oder mehrere Substituenten tragen können.
  • Der Begriff Alkoxy, wie hierin verwendet, verweist auf eine gesättigte (also Alkyl-O-) oder ungesättigte (also Alkenyl-O- und Alkinyl-O-) Gruppe, gebunden an die molekulare Stammkomponente durch ein Sauerstoffatom. In bestimmten Ausführungsformen enthält die Alkylgruppe 1-20 aliphatische Kohlenstoffatome. In bestimmten anderen Ausführungsformen enthalten die in der Erfindung eingesetzten Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen 1-8 aliphatische Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthält die Alkylgruppe 1-6 aliphatische Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthält die Alkylgruppe 1-4 aliphatische Kohlenstoffatome. Beispiele schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy, tert.-Butoxy, i-Butoxy, sek.-Butoxy, Neopentoxy, n-Hexoxy und Ähnliche.
  • Der Begriff Alkenyl bezeichnet eine einwertige Gruppe, abgeleitet von einer Kohlenwasserstoffkomponente, mit mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung durch die Entfernung eines einzelnen Wasserstoffatoms. In bestimmten Ausführungsformen enthält die in der Erfindung eingesetzte Alkenylgruppe 1-20 Kohlenstoffatome. In einigen Ausführungsformen enthält die in der Erfindung eingesetzte Alkenylgruppe 1-10 Kohlenstoffatome. In einer anderen Ausführungsform enthält die eingesetzte Alkenylgruppe 1-8 Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthält die Alkenylgruppe 1-6 Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthält die Alkenylgruppe 1-4 Kohlenstoffe. Alkenylgruppen schließen zum Beispiel Ethenyl, Propenyl, Butenyl, 1-Methyl-2-buten-1-yl und Ähnliche ein.
  • Der Begriff Alkinyl, wie hierin verwendet, verweist auf eine einwertige Gruppe, abgeleitet von einem Kohlenwasserstoff mit mindestens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung durch die Entfernung eines einzelnen Wasserstoffatoms. In bestimmten Ausführungsformen enthält die in der Erfindung eingesetzte Alkinylgruppe 1-20 Kohlenstoffatome. In einigen Ausführungsformen enthält die in der Erfindung eingesetzte Alkinylgruppe 1-10 Kohlenstoffatome. In einer anderen Ausführungsform enthält die eingesetzte Alkinylgruppe 1-8 Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthält die Alkinylgruppe 1-6 Kohlenstoffatome. Repräsentative Alkinylgruppen schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Ethinyl, 2-Propinyl(propargyl), 1-Propinyl und Ähnliche.
  • Der Begriff Alkylamino, Dialkylamino und Trialkylamino, wie hierin verwendet, verweist auf ein, zwei, beziehungsweise drei Alkylgruppen, wie vorhergehend definiert, gebunden an die molekulare Stammkomponente durch ein Stickstoffatom. Der Begriff Alkylamino verweist auf eine Gruppe mit der Struktur -NHR', worin R' eine Alkylgruppe wie vorhergehend definiert darstellt; und der Begriff Dialkylamino verweist auf eine Gruppe mit der Struk tur -NR'R'', worin R' und R'' jeweils unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Alkylgruppen. Der Begriff Trialkylamino verweist auf eine Gruppe mit der Struktur -NR'R''R''', worin R', R'' und R''' jeweils unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Alkylgruppen. In bestimmten Ausführungsformen enthält die Alkylgruppe 1-20 aliphatische Kohlenstoffatome. In bestimmten anderen Ausführungsformen enthält die Alkylgruppe 1-10 aliphatische Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthält die Alkylgruppe 1-8 aliphatische Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthält die Alkylgruppe 1-6 aliphatische Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthält die Alkylgruppe 1-4 aliphatische Kohlenstoffatome. Zusätzlich können R', R'' und/oder R''' zusammen genommen gegebenenfalls -(CH2)k- darstellen, wo k eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist. Beispiele schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Methylamino, Dimethylamino, Ethylamino, Diethylamino, Diethylaminocarbonyl, Methylethylamino, Isopropylamino, Piperidino, Trimethylamino und Propylamino.
  • Die Begriffe Alkylthioether und Thioalkoxy verweisen auf eine gesättigte (also Alkyl-S-) oder ungesättigte (also Alkenyl-S- und Alkinyl-S-) Gruppe, gebunden an die molekulare Stammkomponente durch ein Schwefelatom. In bestimmten Ausführungsformen enthält die Alkylgruppe 1-20 aliphatische Kohlenstoffatome. In bestimmten anderen Ausführungsformen enthält die Alkylgruppe 1-10 aliphatische Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthalten die Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen 1-8 aliphatische Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthalten die Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen 1-6 aliphatische Kohlenstoffatome. In noch anderen Ausführungsformen enthalten die Alkyl-, Alkenyl- und Alkinylgruppen 1-4 aliphatische Kohlenstoffatome. Beispiele für Thioalkoxyl-Komponenten schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Methylthio, Ethylthio, Propylthio, Isopropylthio, n-Butylthio und Ähnliche.
  • Der Begriff Aryl, wie hierin verwendet, verweist auf eine ungesättigte cyclische Komponente, umfassend mindestens einen aromatischen Ring. In bestimmten Ausführungsformen verweisen Arylgruppen auf ein mono- oder bicyclisches carbocyclisches Ringsystem mit einem oder zwei aromatischen Ringen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Phenyl, Naphthyl, Tetrahydronaphthyl, Indanyl, Indenyl und Ähnliche. Arylgruppen können unsubstituiert oder substituiert sein, mit Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus verzweigtem und unverzweigtem Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Halogenalkyl, Alkoxy, Thioalkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Trialkylamino, Acylamino, Cyano, Hydroxy, Halogen, Mercapto, Nitro, Carboxyaldehyd, Carboxy, Alkoxycarbonyl und Carboxamid. Zusätzlich schließen substituierte Arylgruppen Tetrafluorphenyl und Pentafluorphenyl ein.
  • Der Begriff Carbonsäure, wie hierin verwendet, verweist auf eine Gruppe der Formel -CO2H.
  • Die Begriffe Halo und Halogen, wie hierin verwendet, verweisen auf ein Atom, ausgewählt aus Fluor, Chlor, Brom und Iod.
  • Der Begriff heterocyclisch, wie hierin verwendet, verweist auf ein aromatisches oder nicht-aromatisches, teilweise ungesättigtes oder vollständig gesättigtes, 3- bis 10-gliedriges Ringsystem, welches einzelne Ringe in der Größe von 3 bis 8 Atomen einschließt, und bi- und tricyclische Ringsysteme, welche aromatisches fünf- oder sechs-gliedriges Aryl oder aromatische heterocyclische Gruppen einschließen können, kondensiert zu einem nicht-aromatischen Ring. Diese heterocyclischen Ringe schließen jene ein, welche von ein bis drei Heteroatome haben, unabhängig ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, in welchem die Stickstoff- und Schwefel-Heteroatome gegebenenfalls oxidiert sein können und das Stickstoff-Heteroatom gegebenenfalls quarternisiert sein kann. In bestimmten Ausführungsformen verweist der Begriff heterocyclisch auf einen nicht-aromatischen 5-, 6- oder 7-gliedrigen Ring oder eine polycyclische Gruppe, worin mindestens ein Ringatom ein Heteroatom ist, ausgewählt aus O, S und N (worin die Stickstoff- und Schwefel-Heteroatome gegebenenfalls oxidiert sein können), einschließlich, aber nicht begrenzt auf eine bi- oder tricyclische Gruppe, umfassend kondensierte sechs-gliedrige Ringe mit zwischen einem und drei Heteroatomen, unabhängig ausgewählt aus dem Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, worin (i) jeder 5-gliedrige Ring 0 bis 2 Doppelbindungen hat, jeder 6-gliedrige Ring 0 bis 2 Doppelbindungen hat, und jeder 7-gliedrige Ring 0 bis 3 Doppelbindungen hat, (ii) die Stickstoff- und Schwefel-Heteroatome gegebenenfalls oxidiert sein können, (iii) das Stickstoff-Heteroatom gegebenenfalls quaternisiert sein kann, und (iv) jeder der obigen heterocyclischen Ringe zu einem Aryl- oder Heteroarylring kondensiert sein kann.
  • Der Begriff aromatisch heterocyclisch, wie hierin verwendet, verweist auf einen cyclischen aromatischen Rest mit von fünf bis zehn Ringatomen, von welchen ein Ringatom ausgewählt wird aus Schwefel, Sauerstoff und Stickstoff; null, ein oder zwei Ringatome zusätzliche Heteroatome sind, unabhängig ausgewählt aus Schwefel, Sauerstoff und Stickstoff; und die verbleibenden Ringatome Kohlenstoff sind, wobei der Rest an den Rest des Moleküls durch eines der Ringatome gebunden ist, wie zum Beispiel Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Pyrrolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Isooxazolyl, Thiadiazolyl, Oxadiazolyl, Thiophenyl, Furanyl, Chinolinyl, Isochinolinyl und Ähnliche. Aromatische heterocyclische Gruppen können unsubstituiert oder substituiert sein, mit Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus verzweigtem und unverzweigtem Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Halogenalkyl, Alkoxy, Thioalkoxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Trialkylamino, Acylamino, Cyano, Hydroxy, Halogen, Mercapto, Nitro, Carboxyaldehyd, Carboxy, Alkoxycarbonyl und Carboxamid.
  • Spezifische heterocyclische und aromatische heterocyclische Gruppen, die in die Verbindungen der Erfindung eingeschlossen werden können, schließen ein: 3-Methyl-4-(3-methylphenyl)piperazin, 3-Methylpiperidin, 4-(Bis-(4-fluorphenyl)methyl)piperazin, 4-(Diphenylmethyl)piperazin, 4-(Ethoxycarbonyl)piperazin, 4-(Ethoxycarbonylmethyl)piperazin, 4-(Phenylmethyl)piperazin, 4-(1-Phenylethyl)piperazin, 4-(1,1-Dimethylethoxycarbonyl)piperazin, 4-(2-(Bis-(2-propenyl)amino)ethyl)piperazin, 4-(2-(Diethylamino)ethyl)piperazin, 4-(2-Chlorphenyl)piperazin, 4-(2-Cyanophenyl)piperazin, 4-(2-Ethoxyphenyl)piperazin, 4-(2-Ethylphenyl)piperazin, 4-(2-Fluorphenyl)piperazin, 4-(2-Hydroxyethyl)piperazin, 4-(2-Methoxyethyl)piperazin, 4-(2-Methoxyphenyl)piperazin, 4-(2-Methylphenyl)piperazin, 4-(2-Methylthiophenyl)piperazin, 4-(2-Nitrophenyl)piperazin, 4-(2-Nitrophenyl)piperazin, 4-(2-Phenylethyl)piperazin, 4-(2-Pyridyl)piperazin, 4-(2-Pyrimidinyl)piperazin, 4-(2,3-Dimethylphenyl)piperazin, 4-(2,4-Difluorphenyl)piperazin, 4-(2,4-Dimethoxyphenyl)piperazin, 4-(2,4-Dimethylphenyl)piperazin, 4-(2,5-Dimethylphenyl)piperazin, 4-(2,6-Dimethylphenyl)piperazin, 4-(3-Chlorphenyl)piperazin, 4-(3-Methylphenyl)piperazin, 4-(3-Trifluormethylphenyl)piperazin, 4-(3,4-Dichlorphenyl)piperazin, 4-3,4-Dimethoxyphenyl)piperazin, 4-(3,4-Dime thylphenyl)piperazin, 4-(3,4-Methylendioxyphenyl)piperazin, 4-(3,4,5-Trimethoxyphenyl)piperazin, 4-(3,5-Dichlorphenyl)piperazin, 4-(3,5-Dimethoxyphenyl)piperazin, 4-(4-Phenylmethoxy)phenyl)piperazin, 4-(4-(3,1-Dimethylethyl)phenylmethyl)piperazin, 4-(4-Chlor-3-trifluormethylphenyl)piperazin, 4-(4-Chlorphenyl)-3-methylpiperazin, 4-(4-Chlorphenyl)piperazin, 4-(4-Chlorphenyl)piperazin, 4-(4-Chlorphenylmethyl)piperazin, 4-(4-Fluorphenyl)piperazin, 4-(4-Methoxyphenyl)piperazin, 4-(4-Methylphenyl)piperazin, 4-(4-Nitrophenyl)piperazin, 4-(4-Trifluormethylphenyl)piperazin, 4-Cyclohexylpiperazin, 4-Ethylpiperazin, 4-Hydroxy-4-(4-chlorphenyl)methylpiperidin, 4-Hydroxy-4-phenylpiperidin, 4-Hydroxypyrrolidin, 4-Methylpiperazin, 4-Phenylpiperazin, 4-Piperidinylpiperazin, 4-(2-Furanyl)carbonyl)piperazin, 4-((1,3-Dioxolan-5-yl)methyl)piperazin, 6-Fluor-1,2,3,4-tetrahydro-2-methylchinolin, 1,4-Diazacycloheptan, 2,3-Dihydroindolyl, 3,3-Dimethylpiperidin, 4,4-Ethylendioxypiperidin, 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin, 1,2,3,4-Tetrahydrochinolin, Azacyclooctan, Decahydrochinolin, Piperazin, Piperidin, Pyrrolidin, Thiomorpholin und Triazol.
  • Der Begriff Carbamoyl, wie hierin verwendet, verweist auf eine Amidgruppe der Formel -CONH2.
  • Der Begriff Carbonyldioxyl, wie hierin verwendet, verweist auf eine Carbonatgruppe der Formel -O-CO-OR.
  • Der Begriff Kohlenwasserstoff, wie hierin verwendet, verweist auf eine chemische Gruppe, welche Wasserstoff und Kohlenstoff umfasst. Der Kohlenwasserstoff kann substituiert oder nicht-substituiert sein. Der Kohlenwasserstoff kann ungesättigt, gesättigt, verzweigt, unverzweigt, cyclisch, polycyclisch oder heterocyclisch sein. Veranschaulichende Kohlenwasserstoffe schließen zum Beispiel Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, Cyclopropyl, Allyl, Vinyl, n-Butyl, tert.-Butyl, Ethinyl, Cyclohexyl, Methoxy, Diethylamino und Ähnliches ein. Wie es einem Fachmann bekannt wäre, müssen alle Valenzen beim Vornehmen von Substitutionen befriedigt sein.
  • Der Begriff substituiert, ob der Begriff „gegebenenfalls" vorangeht oder nicht, und Substituent, wie hierin verwendet, verweist auf die Fähigkeit, wie durch einen Fachmann erkannt, eine funktionale Gruppe durch eine andere funktionale Gruppe auszuwechseln, vorausgesetzt, dass die Valenz aller Atome beibehalten wird. Wenn mehr als eine Position in einer gegebenen Struktur mit mehr als einem Substituenten, ausgewählt aus einer spezifischen Gruppe, substituiert sein kann, kann der Substituent an jeder Position entweder gleich oder unterschiedlich sein. Die Substituenten können ebenfalls weiter substituiert sein (z.B. kann ein Arylgruppen-Substituent davon ab einen weiteren Substituenten haben, wie eine weitere Arylgruppe, welche ferner an einer oder mehreren Positionen mit Fluor substituiert ist).
  • Der Begriff Thiohydroxyl oder Thiol, wie hierin verwendet, verweist auf eine Gruppe der Formel -SH.
  • Der Begriff Ureido, wie hierin verwendet, verweist auf eine Harnstoffgruppe der Formel -NH-CO-NH2.
  • Die Folgenden sind allgemeinere Begriffe, welche durchgängig in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden:
    „Tier": Der Begriff Tier, wie hierin verwendet, verweist auf Menschen, als auch auf nicht menschliche Tiere, einschließlich zum Beispiel Säuger, Vögel, Reptilien, Amphibien und Fisch. Vorzugsweise ist das nicht menschliche Tier ein Säuger (z.B. ein Nagetier, eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen, ein Affe, ein Hund, eine Katze, ein Primat oder ein Schwein). Ein Tier kann ein domestiziertes Tier sein. Ein Tier kann ein transgenes Tier sein.
  • „Verbunden mit": Wenn zwei Einheiten „miteinander verbunden" sind, wie hierin beschrieben, werden sie durch eine direkte oder indirekte kovalente oder nicht-kovalente Interaktion verbunden. Vorzugsweise ist die Verbindung kovalent. Wünschenswerte nicht-kovalente Interaktionen schließen Wasserstoffbindung, van-der-Waalsche Interaktionen, hydrophobe Interaktionen, magnetische Interaktionen, elektrostatische Interaktionen usw. ein.
  • „Biokompatibel": Der Begriff „biokompatibel", wie hierin verwendet, ist beabsichtigt, Verbindungen zu beschreiben, die für Zellen nicht toxisch sind. Verbindungen sind „biokompatibel", wenn ihre Zugabe zu Zellen in vitro weniger als oder gleich 20% Zelltod ergibt, und ihre Verabreichung in vivo keine Entzündung oder andere solche nachteiligen Wirkungen herbeiführt.
  • „Biologisch abbaubar": Wie hierin verwendet sind „biologisch abbaubare" Verbindungen jene, die wenn sie in Zellen eingeführt werden, durch den zellulären Mechanismus oder durch Hydrolyse in Bestandteile herunter gebrochen werden, die die Zellen ohne signifikante toxische Wirkung auf die Zellen (also weniger als etwa 20% der Zellen werden getötet, wenn die Bestandteile in vi tro zu den Zellen zugegeben werden) entweder wiederverwenden oder beseitigen können. Die Bestandteile führen vorzugsweise keine Entzündung oder andere nachteilige Wirkungen in vivo herbei. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen sind die chemischen Reaktionen, auf die das Herunterbrechen der biologisch abbaubaren Verbindungen angewiesen ist, nicht-katalysiert.
  • „Wirksame Menge": Im Allgemeinen verweist die „wirksame Menge" eines Wirkstoffs oder Arzneiabgabevorrichtung auf die Menge, welche notwendig ist, um die gewünschte biologische Antwort auszulösen. Wie durch gewöhnliche Fachleute anerkannt werden wird, kann die wirksame Menge eines Wirkstoffs oder einer Vorrichtung abhängig von solchen Faktoren variieren, wie dem gewünschten biologischen Endpunkt, dem abzugebenden Wirkstoff, der Zusammensetzung der einkapselnden Matrix, dem Zielgewebe usw. Zum Beispiel ist die wirksame Menge von Mikropartikeln, welche ein Antigen enthalten, was abgegeben werden soll, um ein Individuum zu immunisieren, die Menge, die eine Immunantwort ergibt, welche ausreichend ist, Infektion bei einem Organismus, der das verabreichte Antigen hat, zu verhindern.
  • „Peptid" oder „Protein": Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein „Peptid" oder „Protein" eine Kette von mindestens drei Aminosäuren, zusammengebunden durch Peptidbindungen. Die Begriffe „Protein" und „Peptid" können miteinander austauschbar verwendet werden. Peptid kann auf ein einzelnes Peptid oder eine Sammlung von Peptiden verweisen. Peptide der Erfindung enthalten vorzugsweise nur natürliche Aminosäuren, obwohl nicht-natürliche Aminosäuren (also Verbindungen, die in der Natur nicht vorkommen, aber die in eine Polypeptidkette eingeschlossen werden können) und/oder Aminosäure-Analoga, wie sie nach Stand der Technik bekannt sind, alternativ eingesetzt werden können. Auch können eine oder mehrere der Aminosäuren in einem Peptid der Erfindung modifiziert sein, zum Beispiel durch die Zugabe einer chemischen Einheit wie einer Kohlenhydratgruppe, einer Phosphatgruppe, einer Farnesylgruppe, einer Isofarnesylgruppe, einer Fettsäuregruppe, einem Linker für Konjugation, Funktionalisierung oder andere Modifikation usw. In einer bevorzugten Ausführungsform führen die Modifikationen des Peptids zu einem stabileren Peptid (z.B. größere Halbwertszeit in vivo). Diese Modifikationen können Cyclisierung des Peptids, den Einschluss von D-Aminosäuren usw. einschließen. Keine der Modifikationen sollte die gewünschte biologische Wirksamkeit des Peptids wesentlich stören.
  • „Polynucleotid" oder „Oligonucleotid": Polynucleotid oder Oligonucleotid verweist auf ein Polymer aus Nucleotiden. Typischerweise umfasst ein Polynucleotid mindestens drei Nucleotide. Das Polymer kann natürliche Nucleoside (also Adenosin, Thymidin, Guanosin, Cytidin, Uridin, Deoxyadenosin, Deoxythymidin, Deoxyguanosin und Deoxycytidin), Nucleosid-Analoga (z.B. 2-Aminoadenosin, 2-Thiothymidin, Inosin, Pyrrolo-pyrimidin, 3-Methyladenosin, C5-Propinylcytidin, C5-Propinyluridin, C5-Bromuridin, C5-Fluoruridin, C5-Ioduridin, C5-Methylcytidin, 7-Deazaadenosin, 7-Deazaguanosin, 8-Oxoadenosin, 8-Oxoguanosin, O(6)-Methylguanin und 2-Thiocytidin), chemisch modifizierte Basen, biologisch modifizierte Basen (z.B. methylierte Basen), interkalierte Basen, modifizierte Zucker (z.B. 2'-Fluorribose, Ribose, 2'-Deoxyribose, Arabinose und Hexose) oder modifizierte Phosphatgruppen (z.B. Phosphorthioate und 5'-N-Phosphoramidit-Bindungen) einschließen.
  • „Kleine Moleküle": Wie hierin verwendet verweist der Begriff „kleine Moleküle" auf organische Verbindungen, ob natürlich vorkommend oder künstlich erzeugt (z.B. durch chemische Synthese), die ein relativ geringes Molekulargewicht haben und die keine Proteine, Polypeptide oder Nucleinsäuren sind. Typischerweise haben kleine Moleküle ein Molekulargewicht von weniger als etwa 1500 g/mol. Auch haben kleine Moleküle typischerweise multiple Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen. Bekannte natürlich vorkommende kleine Moleküle schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Penicillin, Erythromycin, Taxol, Cyclosporin und Rapamycin. Bekannte synthetische kleine Moleküle schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Ampicillin, Methicillin, Sulfamethoxazol und Sulfonamide.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Vergleichsfigur 1 zeigt das Zeitprofil für die Degradation von Polymeren 1-3 bei 37°C bei pH 5,1 und pH 7,4. Degradation wird ausgedrückt als Prozent Degradation über die Zeit, basierend auf GPC-Daten.
  • Vergleichsfigur 2 zeigt cytotoxische Profile von Polymeren 1-3 und PEI. Lebensfähigkeit von NIH 3T3 Zellen wird als eine Funktion von Polymerkonzentration ausgedrückt. Die Molekulargewichte von Polymeren 1, 2 und 3 waren 5800, 11300 beziehungswei se 22500. Das Molekulargewicht des eingesetzten PEI war 25000.
  • Vergleichsfigur 3 zeigt die Retardation von pCMV-Luc DNA durch Polymer 1 in Agarosegel-Elektrophorese. Jede Bahn entspricht einem unterschiedlichen DNA/Polymer-Gewichtsverhältnis. Die Verhältnisse sind wie folgt: 1) 1:0 (nur DNA); 2) 1:0,5; 3) 1:1; 4) 1:2; 5) 1:3; 6) 1:4; 7) 1:5; 8) 1:6; 9) 1:7 und 10) 1:8.
  • Vergleichsfigur 4 zeigt die durchschnittlichen wirksamen Durchmesser von DNA/Polymer-Komplexen, gebildet aus pCMV-Luc Plasmid und Polymer 3 (Mn = 31000) als Funktion von Polymerkonzentration.
  • Vergleichsfigur 5 zeigt durchschnittliche ζ-Potentiale von DNA/Polymer-Komplexen, gebildet aus pCMV-Luc Plasmid und Polymer 3 (Mn = 31000) als eine Funktion von Polymerkonzentration. Die Zahlen für jeden Komplex entsprechen den Komplexzahlen in 4.
  • Vergleichsfigur 6 ist eine SEM-Abbildung von Rhodamin/Dextran-geladenen Mikrokugeln, hergestellt aus Polymer 1.
  • Vergleichsfigur 7 zeigt die Abgabeprofile von Rhodamin/Dextran von Polymer 1 und PLGA Mikrokugeln bei verschiedenen pH-Werten. Die Pfeile zeigen die Punkte an, bei welchen HEPES-Puffer (pH 7,4) durch Acetatpuffer (pH 5,1) ausgetauscht wurde.
  • Vergleichsfigur 8 zeigt a) eine repräsentative Fluoreszenz-Mikroskopie-Abbildung von Rhodamin/Dextran-geladenen Polymer 1 Mikrokugeln, suspendiert in HEPES-Puffer (pH 7,4). 8b zeigt eine Probe von geladenen Polymer 1 Mikrokugeln bei pH 7,4 nach Zugabe von Acetatpuffer (pH 5,1). Die Richtung der Diffusion von Säure ist von oben rechts nach unten links der Abbildung (verstrichene Zeit ~ 5 Sekunden).
  • 9 zeigt einen Gel-Elektrophorese-Test, welcher verwendet wurde, um DNA-komplexierende Polymere zu identifizieren. Anmerkungen an den Bahnen entsprechen den 70 wasserlöslichen Mitgliedern der Screening-Bibliothek. Für jedes Polymer wurden Tests bei DNA/Polymer-Verhältnissen von 1:5 (linke Mulde) und 1:20 (rechte Mulde) durchgeführt. Die mit C* markierten Bahnen enthalten nur DNA (kein Polymer) und wurden als Kontrolle verwendet.
  • 10 zeigt Transfektionsdaten als eine Funktion von Struktur für einen Test, welcher pCMV-Luc (600 ng/Mulde, DNA/Polymer = 1:20) einsetzt. Lichteinheiten sind willkürlich und nicht zu Gesamtzellprotein normalisiert; die Versuche wurden dreifach durchgeführt (Fehlerbalken werden nicht gezeigt). Schwarze Quadrate stellen wasserunlösliche Polymere dar, weiße Quadrate stellen wasserlösliche Polymere dar, die DNA in 9 nicht komplexierten. Die rechte Säule (markiert „*") zeigt die Werte für die folgenden Kontrollversuche: kein Polymer (grün), PEI (rot) und Lipofectamin (hellblau).
  • Vergleichsfigur 11 zeigt eine Synthese von Poly(beta-aminoester)n. Poly(beta-aminoester) können durch die Konjugat-Addition von primären Aminen (Gleichung 1) oder Bis(sekundären Aminen) (Gleichung 2) zu Diacrylaten synthetisiert werden.
  • 12 zeigt eine Vielfalt von Amin (A) und Diacrylat (B) Monomeren, welche in der Synthese der Polymer-Bibliothek verwendet werden.
  • 13 ist ein Histogramm von Polymertransfektionseffizienzen. Im ersten Screen wurden alle 2350 Polymere auf ihre Fähigkeit getestet, pCMV-luc DNA bei N:P Verhältnissen von 40:1, 20:1 und 10:1 an COS-7 Zellen abzugeben. Transfektionseffizienz wird in ng Luciferase pro Mulde dargestellt. Als Bezug wird PEI-Transfektionseffizienz gezeigt. COS-7 Zellen nehmen leicht nackte DNA auf und erzeugen in unseren Bedingungen 0,15 ± 0,05 ng pro Mulde und das Lipid-Reagens Lipofectamin 2000 erzeugt 13,5 ± 1,9 ng pro Mulde.
  • 14 A) Optimierte Transfektionseffizienz der 50 oberen Polymere bezogen auf PEI und Lipofectamin 2000. Polymere wurden wie in Verfahren beschrieben getestet. Im ersten breiten Screen wurden N:P Verhältnisse von 40:1, 20:1 und 10:1 mit einem n von 1 getestet. Die oberen 93 wurden bei sechs unterschiedlichen N:P Verhältnissen = (optimaler N:P vom ersten Screen) × 1,75, 1,5, 1,25, 1,0, 0,75 und 0,5 dreifach wieder gescreent. Kontrollumsetzungen werden in rot markiert und Polymere, die DNA in einem Gel-Elektrophoresetest nicht banden, werden in schwarz gezeigt. B) DNA-bindende Polymere werden durch Agarosegel-Elektrophorese bestimmt. Die Daten wurden auf die folgende Weise tabellarisiert: 1) vollständig verlagerte DNA wird durch (+) dargestellt, 2) teilweise verlagerte DNA wird durch (+/–) dargestellt, 3) ungebundene DNA wird durch (–) dargestellt.
  • 15 zeigt die Transfektion von COS-7 Zellen unter Verwendung von Green Fluorescent Protein Plasmid. Zellen wurden bei einem N:P Verhältnis von (optimalem N:P vom breiten Screen) × 1,25 mit 600 ng DNA transfiziert. Bereiche der Mulde, welche hohe Transfektion zeigen, werden für die folgenden Polymere gezeigt: a) C36, b) D94.
  • 16 zeigt, wie das Polymer-Molekulargewicht und die Kettenendgruppe durch Variieren des Amin/Diacrylat-Verhältnisses im Umsetzungsgemisch beeinflusst wird. Molekulargewichte (Mw) (bezogen auf Polystyrol-Standards) wurden durch organische Phasen GPC bestimmt. Mit Amin/Diacrylat-Verhältnissen von > 1 synthetisierte Polymere haben Amin-Endgruppen und mit Amin/Diacrylat-Verhältnissen von < 1 synthetisierte Polymere haben Acrylat-Endgruppen.
  • 17 zeigt Luciferase-Transfektionsergebnisse für Poly-1 als Funktion von Polymer-Molekulargewicht, Polymer/DNA-Verhältnis (Gew./Gew.) und Polymer-Endgruppe. (A) Amin-terminierte Ketten; (B) Acrylat-terminierte Ketten (n = 4, Fehlerbalken werden nicht gezeigt).
  • 18 zeigt Luciferase-Transfektionsergebnisse für Poly-2 als eine Funktion von Polymer-Molekulargewicht, Polymer/DNA-Verhältnis (Gew./Gew.) und Polymer-Endgruppe. (A) Amin-terminierte Ketten; (B) Acrylat-terminierte Ketten. (n = 4, Fehlerbalken nicht gezeigt).
  • 19 zeigt die Cytotoxizität von Poly-1/DNA-Komplexen als eine Funktion von Polymer-Molekulargewicht, Polymer/DNA-Verhältnis (Gew./Gew.) und Polymer-Endgruppe. (A) Amin-terminierte Ketten; (B) Acrylat-terminierte Ketten. (n = 4, Fehlerbalken nicht gezeigt).
  • 20 zeigt die Cytotoxizität von Poly-2/DNA-Komplexen als eine Funktion von Polymer-Molekulargewicht, Polymer/DNA-Verhältnis (Gew./Gew.) und Polymer-Endgruppe. (A) Amin-terminierte Ketten; (B) Acrylat-terminierte Ketten. (n = 4, Fehlerbalken werden nicht gezeigt).
  • 21 zeigt den relativen zellulären Aufnahmegrad von Poly-1/DNA-Komplexen als eine Funktion von Polymer-Molekulargewicht, Polymer/DNA-Verhältnis (Gew./Gew.) und Polymer-Endgruppe. (A) Amin-terminierte Ketten; (B) Acrylat-terminierte Ketten. (n = 4, Fehlerbalken werden nicht gezeigt).
  • 22 zeigt den relativen zellulären Aufnahmegrad von Poly-2/DNA-Komplexen als eine Funktion von Polymer-Molekulargewicht, Polymer/DNA-Verhältnis (Gew./Gew.) und Polymer-Endgruppe. (A) Amin-terminierte Ketten (leere Quadrate stellen Bedingungen dar, wo Cytotoxizität der Komplexe eine verlässliche Messung von zellulärer Aufnahme verhinderte); (B) Acrylat-terminierte Ketten (n = 4, Fehlerbalken nicht gezeigt).
  • 23 zeigt die Verstärkung von Transfektionswirksamkeit von Poly-1 (Amin-terminierte Ketten, Mw = 13100) basierten Abgabevektoren durch die Verwendung von co-komplexierenden Wirkstoffen. (A) Polylysin (PLL); (B) Polyethylenimin (PEI). (n = 4, Fehlerbalken werden nicht gezeigt).
  • 24 zeigt die Verstärkung von Transfektionswirksamkeit von Poly-2 (Amin-terminierte Ketten, MW = 13400) basierten Abgabevektoren durch die Verwendung von co-komplexierenden Wirkstoffen. (A) Polylysin (PLL); (B) Polyethylenimin (PEI). (n = 4, Fehlerbalken werden nicht gezeigt).
  • 25 ist ein Vergleich von GFP-Gentransfer in COS-7 Zellen unter Verwendung von Poly-1/PLL (Poly-1:PLL:DNA = 60:0,1:1 (Gew./Gew./Gew.)), Poly-2/PLL (Poly-2:PLL:DNA = 15:0,4:1 (Gew./Gew./Gew.)), Lipofectamin 2000 (μL Reagens: μg DNA = 1:1), PEI (PEI:DNA 1:1 (Gew./Gew.), N/P ~ 8) und nackter DNA. Zellen wurden auf 6-Mulden-Platten gesät und zu neuer Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden mit Komplexen (5 μg DNA/Mulde) für 1 Stunde inkubiert, nach welcher Zeit die Komplexe entfernt wurden und frisches Wachstumsmedium zugegeben wurde. Zwei Tage später wurde GFP-Expression durch Flusscytometrie getestet. (n = 3, Fehlerbalken zeigen eine Standardabweichung an).
  • 26 zeigt GFP-Expression in COS-7 Zellen, transfiziert unter Verwendung von Poly-1/PLL.
  • 27 zeigt GFP-Gentransfer in vier unterschiedlichen Zelllinien unter Verwendung von Poly-1/PLL (Poly-1:PLL:DNA = 60:0,1:1 (Gew./Gew./Gew.). Die Zellen wurden auf 6-Mulden-Platten gesät und nahe Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann mit Komplexen (5 μg DNA/Mulde) für 1 Stunde inkubiert, nach welcher Zeit die Komplexe entfernt und frisches Wachstumsmedium zugegeben wurde. Zwei Tage später wurde GFP-Expression durch Flusscytometrie getestet. (n = 5, Fehlerbalken zeigen eine Standardabweichung an).
  • Vergleichsfigur 28 zeigt die Molekulargewichte (Mw und Mn) von Polymer G5 als Funktion des Molverhältnisses von Amin:Diacrylat-Monomeren in der Synthese.
  • Vergleichsfigur 29 zeigt die Molekulargewichte (Mw und Mn) von Polymer B14 als eine Funktion des Molverhältnisses von Amin:Diacrylat-Monomeren in der Polymersynthese.
  • Vergleichsfigur 30 ist ein Vergleich der Funktion von Molekulargewicht mit Amin:Diacrylat-Molverhältnis für Polymere B14 und G5.
  • Detaillierte Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsfor men der Erindung
  • Die vorliegende Erfindung sieht verbesserte polymere Einkapselung- und Abgabesysteme, basierend auf der Verwendung von β-Aminoester-Polymeren vor. Die Systeme können in der Kunst der pharmazeutischen/Arzneimittelabgabe verwendet werden, um Polynucleotide, Proteine, kleine Moleküle, Peptide, Antigene, Arzneien usw. an einen Patienten, Gewebe, Organ, Zelle usw. abzugeben. Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls die Herstellung und das Screening von großen Sammlungen von Polymeren für „Treffer" vor, die in den pharmazeutischen und Arzneiabgabekünsten brauchbar sind.
  • Die β-Aminoester-Polymere der vorliegenden Erfindung sehen mehrere unterschiedliche Verwendungen in der Kunst der Arzneiabgabe vor. Die Polymere mit ihren tertiäres Amin enthaltenden Grundgerüsten können verwendet werden, um Polynucleotide zu komplexieren, und dadurch die Abgabe von Polynucleotid zu verstärken und ihre Degradation zu verhindern. Die Polymere können auch bei der Bildung von Nanopartikel oder Mikropartikel enthaltenden eingekapselten Wirkstoffen verwendet werden. Wegen der Eigenschaften der Polymere, biokompatibel und biologisch abbaubar zu sein, sind diese gebildeten Partikel ebenfalls biologisch abbaubar und biokompatibel und können verwendet werden, um kontrollierte, Depot-Abgabe des eingekapselten Wirkstoffs vorzusehen. Diese Partikel können auch gegenüber pH-Veränderungen responsiv sein, in Anbetracht der Tatsache, dass diese Polymere typischerweise in wässerigen Lösungen bei physiologischem pH nicht wesentlich löslich sind, sondern bei niedrigerem pH löslicher sind. Polymere
  • Die Polymere der vorliegenden Erfindung sind Poly(β-aminoester), welche tertiäre Amine in ihren Grundgerüsten enthalten, und Salze davon. Die Molekulargewichte der Polymere der Erfindung können von 5000 g/mol bis über 100000 g/mol, bevorzugter von 4000 g/mol bis 50000 g/mol reichen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Polymere der Erfindung relativ nicht-cytotoxisch. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Polymere der Erfindung biokompatibel und biologisch abbaubar. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform haben die Polymere der vorliegenden Erfindung PKas im Bereich von 5,5 bis 7,5, bevorzugter zwischen 6,0 und 7,0. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform kann das Polymer entworfen werden, um einen gewünschten pKa zwischen 3,0 und 9,0, bevorzugter zwischen 5,0 und 8,0 zu haben. Die Polymere der Erfindung sind aus mehreren Gründen besonders attraktiv für Arzneimittelabgabe: 1) Sie enthalten Aminogruppen zum Interagieren mit DNA und anderen negativ geladenen Wirkstoffen, zum Puffern des pH, zum Verursachen von Endosomolyse usw.; 2) sie enthalten abbaubare Polyesterbindungen; 3) sie können aus kommerziell erhältlichen Ausgangsmaterialien synthetisiert werden; und 4) sie sind pH responsiv und zukünftige Generationen könnten mit einem gewünschten pKa konstruiert werden. Beim Screening für Transfektionseffizienz waren die am besten leistenden Polymere hydrophob oder die Diacrylat-Monomere waren hydrophob und viele hatten Mono- oder Di-hydroxyl-Seiten und/oder lineare, Bis sekundäre Amine) als Teil ihrer Struktur.
  • Die Polymere der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen wie folgt definiert:
    Figure 00220001
    worin
    jedes R' unabhängig ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C1-C6-nied.-Alkyl, C1-C6-nied.-Alkoxy, Hydroxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Cyano, Thiol, Heteroaryl, Aryl, Phenyl, heterocyclisch, carbocyclisch und Halogen;
    n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10000 ist;
    x eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; und
    wenn X für Methyl oder NR2 steht; und
    R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, cyclisch, heterocyclisch, Aryl und Heteroaryl; oder wenn x für OR steht; und R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, cyclisch, heterocyclisch, Aryl und Heteroaryl;
    y eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist;
    oder wenn x für OR steht; und R für Wasserstoff steht, y 5 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 2 oder 6 und 10 ist, und Derivate und Salze davon.
    y ist eine ganze Zahl zwischen 1 und 10; vorzugsweise x eine ganze Zahl zwischen 2 und 6 ist;
  • In bestimmten Ausführungsformen werden die Polymere der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen wie folgt definiert:
    Figure 00230001
    worin
    x ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C1-C6-nied.-Alkyl, C1-C6-nied.-Alkoxy, Halogen, OR und NR2; bevorzugter Methyl, OH oder NH2;
    R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, cyclisch, heterocyclisch, Aryl und Heteroaryl;
    jedes R' unabhängig ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C1-C6-nied.-Alkyl, C1-C6-nied.-Alkoxy, Hydroxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Cyano, Thiol, Heteroaryl, Aryl, Phenyl, heterocyclisch, carbocyclisch und Halogen; R' vorzugsweise Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Hydroxyl, Amino, Fluor, Chlor oder Brom darstellt; bevorzugter R' Fluor, Wasserstoff oder Methyl darstellt;
    n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10000 ist;
    x eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; x vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 2 und 6 ist;
    y eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; y vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 2 und 6 ist;
    z eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist, z vorzugsweise eine ganze Zahl zwischen 2 und 6 ist; und
    Derivate und Salze davon.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die Bis(acrylatester)-Einheit in dem Polymer der Erfindung ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Bis(acrylatester)-Einheiten
    Figure 00240001
  • Besonders bevorzugte Bis(acrylatester) in dieser Gruppe schließen B, C, E, F, II, JJ, KK und LL ein.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Amin des Polymers der Erfindung ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Aminen (1'-20'):
    Figure 00240002
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Polymer das Amin 5'.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Amin in dem Polymer der Erfindung ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Aminen (1-94):
    Figure 00250001
  • In bestimmten Ausführungsformen schließen die Polymere Amine 6, 8, 20, 24, 25, 28, 32, 36, 75 oder 80 ein.
  • Besondere Beispiele der Polymere der vorliegenden Erfindung schließen ein:
    Figure 00250002
  • Weitere besonders brauchbare Poly(beta-aminoester) schließen F32, F28, JJ36, JJ32, LL8, E36, E32, 080, C32, JJ28, C28, C36, E28 ein.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind einer oder beide der Linker A und B Polyethylenpolymere. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform sind einer oder beide der Linker A und B Polyethylenglycolpolymere. Weitere biokompatible, biologisch abbaubare Polymere können als einer oder beide der Linker A und B verwendet werden.
  • Die folgenden Polymere sind nicht Teil der vorliegenden Erfindung und können allgemein durch die Formel (I):
    Figure 00260001
    definiert werden.
  • Die Linker A und B sind jeweils eine Kette aus Atomen, welche kovalent die Aminogruppen, beziehungsweise Estergruppen verbinden. Diese Linker können Kohlenstoffatome oder Heteroatome enthalten (z.B. Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel usw.). Typischerweise sind diese Linker 1 bis 30 Atome lang, bevorzugter 1-15 Atome lang. Die Linker können mit verschiedenen Substituenten substituiert sein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Wasserstoffatome, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Aminoalkylamino, Dialkylamino, Trialkylamino, Hydroxyl, Alkoxy, Halogen, Aryl, heterocyclisch, aromatisch heterocyclisch, Cyano, Amid, Carbamoyl, Carbonsäure, Ester, Thioether, Alkylthioether, Thiol und Ureidogruppen. Wie durch einen Fachmann erkannt würde, kann jede dieser Gruppen ihrerseits substituiert sein. Die Gruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 und R8 können jede chemische Gruppe sein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Wasserstoffatome, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Trialkylamino, Hydroxyl, Alkoxy, Halogen, Aryl, heterocyclisch, aromatisch heterocyclisch, Cyano, Amid, Carbamoyl, Carbonsäure, Ester, Alkylthioether, Thiol und Ureidogruppen. In den Polymeren der Erfindung ist n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 10000, bevorzugter von 10 bis 500.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Bis(sekundäre Amin) eine cyclische Struktur und das Polymer wird allgemein durch die Formel II:
    Figure 00260002
    dargestellt.
  • In dieser Ausführungsform sind R1 und R2 direkt zusammengebunden, wie in Formel II gezeigt. Beispiele von Polymeren der Erfindung in dieser Ausführungsform schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Formeln III und IV:
    Figure 00270001
  • Wie oben in dem vorhergehenden Absatz beschrieben kann jede chemische Gruppe, die die Valenz von jedem Atom befriedigt, für jedes Wasserstoffatom substituiert werden.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Gruppen R1 und/oder R2 kovalent an Linker A gebunden, um eine oder zwei cyclische Strukturen zu bilden. Die Polymere der vorliegenden Ausführungsform werden allgemein durch die Formel V dargestellt, in welcher sowohl R1, als auch R2 an Linker A gebunden sind, um zwei cyclische Strukturen zu bilden:
    Figure 00270002
  • Die cyclischen Strukturen können 3-, 4-, 5-, 6-, 7- oder 8-gliedrige Ringe oder größer sein. Die Ringe können Heteroatome enthalten und ungesättigt sein. Beispiele für Polymere der Formel V schließen Formeln VI, VII und VIII ein:
    Figure 00280001
  • Wie oben beschrieben kann jede chemische Gruppe, die die Valenz von jedem Atom in dem Molekül befriedigt, für jedes Wasserstoffatom substituiert werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform können die Polymere allgemein durch die Formel (IX)
    Figure 00280002
    definiert werden.
  • Der Linker B ist eine Kette von Atomen, welche kovalent die Estergruppen verbinden. Der Linker kann Kohlenstoffatome oder Heteroatome enthalten (z.B. Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel usw.). Typischerweise ist der Linker 1 bis 30 Atome lang, vorzugsweise 1-15 Atome und bevorzugter 2-10 Atome lang. In bestimmten Ausführungsformen ist Linker B eine substituierte oder unsubstituierte, lineare oder verzweigte Alkylkette, vorzugsweise mit 3-10 Kohlenstoffatomen, bevorzugter mit 3, 4, 5, 6 oder 7 Kohlenstoffatomen. In einer weiteren Ausführungsform ist der Linker B eine substituierte oder unsubstituierte, lineare oder verzweigte heteroaliphatische Kette, vorzugsweise mit 3-10 Atomen, bevorzugter mit 3, 4, 5, 6 oder 7 Atomen. In bestimmten Ausführungsformen umfasst Linker B sich wiederholende Einheiten von Sauerstoff- und Kohlenstoffatomen. Der Linker kann mit ver schiedenen Substituenten substituiert sein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Wasserstoffatome, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Trialkylamino, Hydroxyl, Alkoxy, Halogen, Aryl, heterocyclisch, aromatisch heterocyclisch, Cyano, Amid, Carbamoyl, Carbonsäure, Ester, Thioether, Alkylthioether, Thiol, Acyl, Acetyl und Ureidogruppen. Wie durch einen Fachmann erkannt würde, kann jede dieser Gruppen ihrerseits substituiert sein. Jedes von R1, R3, R4, R5, R6, R7 und R8 kann unabhängig jede chemische Gruppe sein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Wasserstoffatom, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Trialkylamino, Hydroxyl, Alkoxy, Halogen, Aryl, heterocyclisch, aromatisch heterocyclisch, Cyano, Amid, Carbamoyl, Carbonsäure, Ester, Alkylthioether, Thiol, Acyl, Acetyl und Ureidogruppen. In bestimmten Ausführungsformen schließt R1 Hydroxylgruppen ein. In weiteren Ausführungsformen schließt R1 Amino-, Alkylamino- oder Dialkylaminogruppen ein. In dem Polymer der Erfindung ist n eine ganze Zahl im Bereich von 5 bis 10000, bevorzugter von 10 bis 500.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die Bis(acrylatester)-Einheit in dem Polymer der Erfindung ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Bis(acrylatester)-Einheiten (A'-G'):
    Figure 00300001
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Polymer den Bis(acrylatester) G'.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird die Bis(acrylatester)-Einheit in dem Polymer ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Bis(acrylatester)-Einheiten (A-PP):
    Figure 00300002
  • Besonders bevorzugte Bis(acrylatester) in dieser Gruppe schließen B, C, D, E, F, M, O, U, AA, II, JJ, KK und LqL ein.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Amin in dem Polymer ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Aminen (1'-20'):
    Figure 00310001
  • In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Polymer das Amin 5'. In anderen Ausführungsformen umfasst das Polymer Amin 14'.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Amin in dem Polymer ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Aminen (1-94):
    Figure 00320001
  • In bestimmten Ausführungsformen schließen die Polymere Amine 6, 8, 17, 20, 24, 25, 28, 32, 36, 60, 61, 70, 75, 80, 86, 87, 89, 93 oder 94 ein.
  • Besondere Beispiele der Polymere schließen:
    Figure 00330001
    Figure 00340001
    ein.
  • Weitere besonders brauchbare Poly(beta-aminoester) schließen:
    Figure 00350001
    ein.
  • Weitere besonders brauchbare Poly(beta-aminoester) schließen C86, D60, D61, U94, F32, F28, JJ36, JJ32, LL6, LL8, U28, E28, U36, E36, U32, E32, C94, F94, JJ94, U28, JJ86, C86, U86, E86, C80, E80, JJ80, U80, D24, E24, JJ24, B17, II28, II36, II32, C20, JJ20, E20, C25, U25, D25, D70, D28, D32, D36, D93, U87, D87, C75, U75, O20, O28, C94, AA20, AA28, D86, F86, AA36, AA24, AA94, O24, AA60, A61, C32, JJ28, C28, JJ20, D94; U32, D24, C36, E28, D36, U94, E24, E32, D28, U36, E80, E36, JJ80, E94, D93, B17, M17, AA61, U93 und C25 ein.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind einer oder beide der Linker A und B Polyethylenpolymere. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform sind einer oder beide der Linker A und B Polyethylenglycolpolymere. Weitere biokompatible, biologisch abbaubare Polymere können als einer oder beide der Linker A und B verwendet werden.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen sind die Polymere der vorliegenden Erfindung Amin-terminiert. In anderen Ausführungsformen sind die Polymere der vorliegenden Erfindung Acrylat-terminiert. Größtenteils wird die Terminationseinheit des Polymers durch das Verhältnis von Amin gegenüber Acrylat in der Polymer-Syntheseumsetzung bestimmt. Ein Überschuss an Amin-Monomer ergibt ein Amin-terminiertes Polymer. Und ein Überschuss an Acrylat-Monomer ergibt ein Acrylat-terminiertes Polymer.
  • In bestimmten Ausführungsformen reicht das durchschnittliche Molekulargewicht der Polymere der vorliegenden Erfindung von 1000 g/mol bis 50000 g/mol, vorzugsweise von 2000 g/mol bis 40000 g/mol, bevorzugter von 5000 g/mol bis 20000 g/mol und sogar noch bevorzugter von 10000 g/mol bis 17000 g/mol. Da die Polymere der vorliegenden Erfindung durch eine Stufenpolymerisation hergestellt werden, wird typischerweise eine breite statistische Verteilung von Kettenlängen erhalten. In bestimmten Ausführungsformen wird die Verteilung von Molekulargewichten in einer Polymerprobe durch Reinigungs- und Isolationsschritte eingeengt, welche nach Stand der Technik bekannt sind. Das Molekulargewicht des Polymers kann auch durch die Synthese des Polymers variiert werden, zum Beispiel wenn sich die Menge an Amin-Monomeren erhöht, verringert sich das Molekulargewicht des sich ergebenden Polymers. In weiteren Ausführungsformen kann das Polymergemisch eine Mischung aus Polymeren mit unterschiedlichen Molekulargewichten sein.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Polymer der vorliegenden Erfindung ein Co-Polymer, worin eine der sich wiederholenden Einheiten ein Poly(β-aminoester) der vorliegenden Erfindung ist. Weitere in dem Co-Polymer zu verwendende Wiederholungseinheiten schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Polyethylen, Poly(glycolid-co-lactid) (PLGA), Polyglycolsäure, Polymethacrylat usw.
  • Synthese von Polymeren
  • Die Polymere der Erfindung können durch jedes nach Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Vorzugsweise werden die Polymere aus kommerziell erhältlichen Ausgangsmaterialien hergestellt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Polymere aus leicht und/oder preiswert hergestellten Ausgangsmaterialien hergestellt.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Polymer der Erfindung durch die Konjugat-Addition von Bis(sekundären Aminen) an Bis(acrylatester) hergestellt. Dieses Umsetzungsschema wird unten gezeigt:
    Figure 00370001
  • Bis(sekundäres Amin)-Monomere, die in dem vorliegenden Verfahren brauchbar sind, schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf N,N'-Dimethylethylendiamin, Piperazin, 2-Methylpiperazin, 1,2-Bis(N-ethylamino)ethylen und 4,4'-Trimethylendipiperidin. Diacrylat-Monomere, die brauchbar sind, schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf 1,4-Butandioldiacrylat, 1,4-Butandioldimethacrylat, 1,2-Ethandioldiacrylat, 1,6-Hexandioldiacrylat, 1,5-Pentandioldiacrylat, 2,5-Hexandioldiacrylat und 1,3-Propandioldiacrylat. Jedes der Monomere wird in einem organischen Lösungsmittel gelöst (z.B. THF, CH2Cl2, MeOH, EtOH, CHCl3, Hexane, Toluol, Benzol, CCl4, Glycolether, Diethylether, DMSO, DMF usw.), vorzugsweise DMSO. Die sich ergebenden Lösungen werden vereinigt und das Umsetzungsgemisch wird erhitzt, um das gewünschte Polymer zu ergeben. In anderen Ausführungsformen wird die Umsetzung ohne die Verwendung eines Lösungsmittels (also pur) durchgeführt, wodurch die Notwendigkeit des Entfernens des Lösungsmittels nach der Synthese vermieden wird. Das Umsetzungsgemisch wird dann auf eine Temperatur im Bereich von 30°C bis 200°C, vorzugsweise 40°C bis 150°C, bevorzugter 50°C bis 100°C erhitzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Umsetzungsgemisch auf annähernd 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C oder 90°C erhitzt. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Umsetzungsgemisch auf annähernd 75°C erhitzt. In einer weiteren Ausführungsform wird das Umsetzungsgemisch auf annähernd 100°C erhitzt. Die Polymerisationsumsetzung kann auch katalysiert werden. Die Umsetzungszeit kann von Stunden bis Tage reichen, je nach Polymerisationsumsetzung und den Umsetzungsbedingungen. Wie durch einen Fachmann erkannt würde, neigt Erhitzen der Umsetzung dazu, die Umsetzungsgeschwindigkeit zu beschleunigen, was eine kürzere Umsetzungszeit erfordert. In bestimmten Ausführungsfor men wird die Polymersynthese in DMSO bei annähernd 60°C für annähernd 2 Tage durchgeführt. In anderen Ausführungsformen wird die Polymersynthese ohne Lösungsmittel bei 95°C für 8-16 Stunden durchgeführt. Wie durch einen Fachmann erkannt würde, kann das Molekulargewicht des synthetisierten Polymers durch die Umsetzungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ausgangsmaterialien, Konzentration, Katalysator, Lösungsmittel, Umsetzungszeit usw.), welche in der Synthese verwendet werden, bestimmt werden.
  • In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Polymere durch Konjugat-Addition eines primären Amins an einen Bis(acrylatester) hergestellt. Die Verwendung von primären Aminen statt Bis(sekundären Aminen) erlaubt eine viel größere Vielfalt an kommerziell erhältlichen Ausgangsmaterialien. Das Umsetzungsschema bei Verwendung von primären Aminen statt sekundären Aminen wird unten gezeigt:
    Figure 00380001
  • Primäre Amine, welche in diesem Verfahren brauchbar sind, schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Methylamin, Ethylamin, Isopropylamin, Anilin, substituierte Aniline und Ethanolamin. Die Bis(acrylatester), welche in diesem Verfahren brauchbar sind, schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf 1,4-Butandioldiacrylat, 1,4-Butandioldimethacrylat, 1,2-Ethandioldiacrylat, 1,6-Hexandioldiacrylat, 1,5-Pentandioldiacrylat, 2,5-Hexandioldiacrylat und 1,3-Propandioldiacrylat. Jedes der Monomere wird in einem organischen Lösungsmittel gelöst (z.B. THF, DMSO, DMF, CH2Cl2, MeOH, EtOH, CHCl3, Hexane, CCl4, Glycolether, Diethylether usw.). Organische Lösungsmittel werden wegen der Anfälligkeit von Polyestern für Hydrolyse bevorzugt. Vorzugsweise ist das verwendete organische Lösungsmittel relativ nicht-toxisch in lebenden Systemen. In bestimmten Ausführungsformen wird DMSO als das organische Lösungsmittel verwendet, weil es relativ nichttoxisch ist und häufig als Lösungsmittel in Zellkultur und beim Lagern von gefrorenen Vorräten von Zellen verwendet wird. Weitere bevorzugte Lösungsmittel schließen jene ein, welche mit Wasser mischbar sind, wie DMSO, Ethanol und Methanol. Die sich er gebenden Lösungen aus Monomeren, welche vorzugsweise eine Konzentration zwischen 0,01 M und 5 M, zwischen annähernd 0,1 M und 2 M, bevorzugter zwischen 0,5 M und 2 M und besonders bevorzugt zwischen 1,3 M und 1,8 M haben, werden vereinigt und das Umsetzungsgemisch wird erhitzt, um das gewünschte Polymer zu ergeben. In bestimmten Ausführungsformen wird die Umsetzung ohne Lösungsmittel betrieben. Betreiben der Polymerisation ohne Lösungsmittel kann die Menge an Cyclisierungsprodukten verringern, welche sich aus intramolekularen Konjugat-Additionsreaktionen ergeben. Die Polymerisation kann bei einer Temperatur im Bereich von 20°C bis 200°C, vorzugsweise von 40°C bis 100°C, bevorzugter von 50°C bis 75°C, noch bevorzugter von 50°C bis 60°C betrieben werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Umsetzungsgemisch bei 20°C gehalten. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Umsetzungsgemisch auf annähernd 50°C erhitzt. In einigen Ausführungsformen wird das Umsetzungsgemisch auf annähernd 56°C erhitzt. In noch einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Umsetzungsgemisch auf annähernd 75°C erhitzt. Das Umsetzungsgemisch kann auch auf annähernd 0°C gekühlt werden. Die Polymerisationsumsetzung kann auch katalysiert werden, wie mit einem organometallischen Katalysator, Säure oder Base. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können eine oder mehrere Arten von Amin-Monomeren und/oder Diacrylat-Monomeren in der Polymerisationsumsetzung verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Kombination aus Ethanolamin und Ethylamin verwendet werden, um ein Polymer herzustellen, welches hydrophiler ist, als eines, welches unter Verwendung von Ethylamin allein hergestellt wurde, und auch hydrophober ist, als eines, welches unter Verwendung von Ethanolamin allein hergestellt wurde.
  • Beim Herstellen der Polymere der vorliegenden Erfindung können die Monomere in dem Umsetzungsgemisch in unterschiedlichem Verhältnis kombiniert werden, um Molekulargewicht, Ausbeute, End-Termination usw. des sich ergebenden Polymers zu bewirken. Das Verhältnis von Amin-Monomeren zu Diacrylat-Monomeren kann von 1,6 bis 0,4, vorzugsweise von 1,4 bis 0,6, bevorzugter von 1,2 bis 0,8, sogar noch bevorzugter von 1,1 bis 0,9 reichen. In bestimmten Ausführungsformen ist das Verhältnis von Amin-Monomeren zu Diacrylat-Monomeren annähernd 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,050, 1,025, 1,0, 0,975, 0,950, 0,900, 0,800 und 0,600. Zum Beispiel ergibt Kombinieren der Monomere bei einem Verhältnis von 1:1 typischerweise Polymere mit höherem Molekulargewicht und höheren Gesamtausbeuten. Auch ergibt Vorsehen eines Überschusses an Amin-Monomeren (also Amin-zu-Acrylat-Verhältnis > 1) Amin-terminierte Ketten, während Vorsehen eines Überschusses an Acrylat-Monomeren (also Amin-zu-Acrylat-Verhältnis < 1) Acrylat-terminierte Ketten ergibt. Das Verhältnis von Amin-Monomeren zu Acrylat-Monomeren in der Polymersynthese kann beeinflussen, wie die Polymerketten terminiert sind, das Molekulargewicht der hergestellten Polymere, die Verteilung von Molekulargewichten und das Ausmaß von Quervernetzung.
  • Das synthetisierte Polymer kann durch jede Technik gereinigt werden, die nach Stand der Technik bekannt ist, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Ausfällung, Kristallisation, Extraktion, Chromatographie usw. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Polymer durch wiederholte Ausfällungen in organischen Lösungsmitteln (z.B. Diethylether, Hexan usw.) gereinigt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Polymer als ein Hydrochlorid, Phosphat, Acetat oder anderes Salz isoliert. Vorzugsweise ist das Salz in bestimmten Ausführungsformen pharmazeutisch annehmbar. Das sich ergebende Polymer kann ebenfalls wie es ist ohne weitere Reinigung und Isolation verwendet werden, wodurch es vorteilhaft gemacht wird, ein Lösungsmittel zu verwenden, welches mit den beim Testen der Polymere zu verwendenden Tests kompatibel ist. zum Beispiel können die Polymere in einem nicht-toxischen Lösungsmittel wie DMSO hergestellt werden und die sich ergebende Lösung aus Polymer kann dann in einem Zellkulturtest verwendet werden, welcher Transfizieren einer Nucleinsäure in eine Zelle einbezieht. Wie durch einen Fachmann verstanden würde, können das Molekulargewicht des synthetisierten Polymers und das Ausmaß der Quervernetzung durch die Umsetzungsbedingungen (z.B. Temperatur, Ausgangsmaterialien, Konzentration, Äquivalente von Amin, Äquivalente von Acrylat, Reihenfolge der Zugabe, Lösungsmittel usw.), welche in der Synthese verwendet werden, bestimmt werden (Odian Principles of Polymerization, 3. Aufl., New York: John Wiley & Sons, 1991; Stevens Polymer Chemistry: An Introduction, 2. Aufl., New York: Oxford University Press, 1990).
  • Das Ausmaß der Quervernetzung des hergestellten Polymers kann auf zwischen 1-20%, vorzugsweise zwischen 1-10%, bevorzugter zwischen 1-5% und insbesondere bevorzugter weniger als 2% minimiert werden. Wie durch Fachleute verstanden würde, sind Amine oder Bis(acrylatester) mit nucleophilen Gruppen anfälliger für Quervernetzung und eventuell müssen Maßnahmen ergriffen werden, um Quervernetzung zu verringern, wie Senken der Temperatur oder Veränderung der Konzentration der Ausgangsmaterialien in dem Umsetzungsgemisch. Acrylate und andere Komponenten mit Unsättigung oder Halogene sind ebenfalls anfällig für Rest-Polymerisation, welche zu Quervernetzung führen kann. Das Ausmaß der Rest-Polymerisation und Quervernetzung kann durch Verringern der Temperatur des Umsetzungsgemisches oder durch andere nach Stand der Technik bekannte Mittel verringert werden.
  • In einer Ausführungsform wird eine Bibliothek von unterschiedlichen Polymeren parallel hergestellt. Die Synthese einer Bibliothek von Polymeren kann unter Verwendung von jeder der nach Stand der Technik bekannten oder hierin hinsichtlich der Synthese von Polymeren der Erfindung beschriebenen Lehren durchgeführt werden. In einer Ausführungsform wird ein unterschiedliches Amin und/oder Bis(acrylatester) bei einem bestimmten Amin-zu-Acrylat-Verhältnis zu jeder Viale in einem Satz Vialen zugegebenen, welche verwendet werden, um die Bibliothek herzustellen, oder zu jeder Mulde in einer Multiwell-Platte (z.B. 96-Mulden-Platte). In einer Ausführungsform werden die Monomere auf zwischen 0,1 M und 5 M, bevorzugter 0,5 M bis 2 M und insbesondere bevorzugt bei annähernd 1,6 M in einem organischen Lösungsmittel wie DMSO verdünnt. Die Monomere können in unterschiedlichem Verhältnis kombiniert werden, um Molekulargewicht, Ausbeute und End-Termination usw. zu bewirken. Zum Beispiel ergibt Kombinieren der Monomere bei einem Verhältnis von 1:1 typischerweise Polymere mit höherem Molekulargewicht und höhere Gesamtausbeuten. Vorsehen eines Überschusses von Amin-Monomer ergibt Amin-terminierte Ketten, während Vorsehen eines Überschusses von Acrylat-Monomer Acrylat-terminierte Ketten ergibt. In einigen Ausführungsformen wird kein Lösungsmittel in der Synthese des Polymers verwendet. Die Vialenanordnung oder Multiwell-Platte wird bei einer Temperatur und Zeitdauer inkubiert, die ausreichend ist, um es zu erlauben, Polymerisation der Monomere wie hierin beschrieben stattfinden zu lassen. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen werden die Zeit und Temperatur gewählt, um fast vollständigen Einschluss (z.B. 50% Umwandlung, 75% Umwandlung, 80% Umwandlung, 90% Umwandlung, 95% Umwandlung, > 95% Umwandlung, 98% Umwandlung, 99% Umwandlung oder > 99% Umwandlung) aller Monomere in Polymer zu bewirken. Die Polymerisationsumsetzung kann bei jeder Temperatur im Bereich von 0°C bis 200°C betrieben werden. In einer Ausführungsform werden die Umsetzungsgemische bei annähernd 45°C für annähernd 5 Tage inkubiert. In einer anderen Ausführungsform werden die Umsetzungsgemische bei annähernd 56°C für annähernd 5 Tage inkubiert. In einer weiteren Ausführungsform werden die Umsetzungsgemische bei annähernd 100°C für annähernd 5 Stunden inkubiert. Die Polymere können dann unter Verwendung von nach Stand der Technik bekannten Techniken isoliert und gereinigt werden oder die sich ergebenden Lösungen von Polymeren können ohne weitere Isolierung oder Reinigung verwendet werden. In bestimmten Ausführungsformen werden über 1000 unterschiedliche Polymere parallel hergestellt. In anderen Ausführungsformen werden über 2000 unterschiedliche Polymere parallel hergestellt. In noch anderen Ausführungsformen werden über 3000 unterschiedliche Polymere parallel hergestellt. Die Polymere können dann unter Verwendung von Techniken mit hohem Durchsatz gescreent werden, um Polymere mit einem gewünschten Kennzeichen (z.B. Löslichkeit in Wasser, Löslichkeit bei unterschiedlichen pHs, Löslichkeit in verschiedenen organischen Lösungsmitteln, Fähigkeit, Polynucleotide zu binden, Fähigkeit, Heparin zu binden, Fähigkeit, kleine Moleküle zu binden, Fähigkeit, Mikropartikel zu bilden, Fähigkeit, Transfektionseffizienz zu erhöhen usw.) zu identifizieren. Die Polymere der Erfindung können gescreent oder nach Synthese ohne weitere Ausfällung, Reinigung oder Isolation des Polymers verwendet werden. Die Verwendung von nicht-toxischem Lösungsmittel wie DMSO in der Synthese des Polymers erlaubt die einfache Handhabung und Verwendung der Polymere nach der Synthese des Polymers. Zum Beispiel kann die Lösung von Polymer in DMSO zu einer Zellkultur oder anderem lebenden System ohne toxische Wirkung auf die Zellen zugegeben werden. In bestimmten Ausführungsformen können die Polymere nach Eigenschaften oder Kennzeichen gescreent werden, welche in Gentherapie brauchbar sind (z.B. Fähigkeit, Polynucleotide zu binden, Erhö hung der Transfektionseffizienz usw.). In anderen Ausführungsformen können die Polymere nach Eigenschaften oder Kennzeichen gescreent werden, welche in der Kunst der Gewebetechnik brauchbar sind (z.B. Fähigkeit, Gewebe- oder Zellwachstum zu unterstützen, Fähigkeit, Zellanbindung zu fördern). In bestimmten Ausführungsformen werden die Polymere synthetisiert und unter Verwendung von halbautomatisierten Techniken und/oder Roboter-Flüssigkeitshandhabungssystemen getestet.
  • Polynucleotid-Komplexe
  • Die Fähigkeit kationischer Verbindungen, mit negativ geladenen Polynucleotiden durch elektrostatische Interaktionen zu interagieren ist gut bekannt. Kationische Polymere wie Poly(lysin) sind für ihre Fähigkeit hergestellt und untersucht worden, Polynucleotide zu komplexieren. Jedoch haben bis jetzt untersuchte Polymere Amine an den terminalen Enden von kurzen, konformational-flexiblen Seitenketten (z.B. Poly(lysin)) oder zugängliche Amine an der Oberfläche von sphärischen oder kugelförmigen Polyaminen (z.B. PEI und PAMAM Dendrimere) eingeschlossen. Von der Interaktion des Polymers mit dem Polynucleotid wird angenommen, dass sie mindestens teilweise die Degradation des Polynucleotids verhindert. Durch Neutralisieren der Ladung an dem Grundgerüst des Polynucleotids ist der neutrale oder leicht positiv geladene Komplex ebenfalls in der Lage, leichter durch die hydrophoben Membranen (z.B. cytoplasmisch, lysosomal, endosomal, nuklear) der Zellen zu passieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Komplex leicht positiv geladen. In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform hat der Komplex ein positives ζ-Potential, bevorzugter ist das ζ-Potential zwischen +1 und +30. In bestimmten Ausführungsformen können Wirkstoffe wie Polyacrylsäure (PAA), Polyasparaginsäure, Polyglutaminsäure oder Polymaleinsäure verwendet werden, um die Serum-Hemmung des Polynucleotid/Polymer-Komplexes in kultivierten Zellen in Medien mit Serum zu verhindern (Trubetskoy et al. „Recharging cationic DNA complexes with highly charged polyanions for in vitro and in vivo gene delivery" Gene Therapy 10: 261-271, 2003; hierin durch Verweis eingeschlossen).
  • Die Poly(β-aminoester) der vorliegenden Erfindung besitzen tertiäre Amine im Grundgerüst des Polymers. Obwohl diese Amine gehinderter sind, sind sie verfügbar, mit einem Polynucleotid zu interagieren. Poplynucleotide oder Derivate davon werden mit den Polymeren der Erfindung unter Bedingungen kontaktiert, welche geeignet sind, um Polynucleotid/Polymer-Komplexe zu bilden. In bestimmten Ausführungsformen ist das Verhältnis von Stickstoff in dem Polymer (N) zu Phosphat in dem Polynucleotid 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1 oder 120:1. In bestimmten Ausführungsformen ist das Polymer-zu-DNA (Gew./Gew.) Verhältnis 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1 oder 200:1. Das Polymer ist vorzugsweise mindestens teilweise protoniert, um so einen Komplex mit dem negativ geladenen Polynucleotid zu bilden. In einer bevorzugten Ausführungsform bilden die Polynucleotid/Polymer-Komplexe Nanopartikel, die in der Abgabe von Polynucleotiden an Zellen brauchbar sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform reicht der Durchmesser der Nanopartikel von 50-500 nm, bevorzugter reicht der Durchmesser der Nanopartikel von 50-200 nm und insbesondere bevorzugt von 90-150 nm. Die Nanopartikel können mit einem Zielwirkstoff wie unten beschrieben assoziiert werden.
  • In bestimmten Ausführungsformen können weitere Wirkstoffe zu den Polynucleotid:Poly(beta-aminoester)-Komplexen zugegeben werden. In bestimmten Ausführungsformen wird ein co-komplexierender Wirkstoff verwendet. Von co-komplexierenden Wirkstoffen ist bekannt, dass sie Polynucleotide binden und/oder Transfektionseffizienz erhöhen. Co-komplexierende Wirkstoffe haben üblicherweise eine hohe Stickstoffdichte. Polylysin (PLL) und Polyethylenimin (PEI) sind zwei Beispiele für polymere co-komplexierende Wirkstoffe. PLL hat ein Molekulargewicht zu Stickstoffatom Verhältnis von 65 und PEI hat ein Molekulargewicht zu Stickstoffatom Verhältnis von 43. Jedes Polymer mit einem Molekulargewicht zu Stickstoffatom Verhältnis im Bereich von 10-100, vorzugsweise 25-75, bevorzugter 40-70 kann als co-komplexierender Wirkstoff brauchbar sein. Der Einschluss eines co-komplexierenden Wirkstoffs in einem Komplex kann es einem erlauben, die Menge an Poly(beta-aminoester) in dem Komplex zu verringern. Dies wird besonders wichtig, falls der Poly(beta-aminoester) bei hohen Konzentrationen cytotoxisch ist. In den sich ergebenden Komplexen mit co-komplexierenden Wirkstoffen kann das co-komplexieren der Wirkstoff zu Polynucleotid (Gew./Gew.) Verhältnis von 0 bis 2,0, vorzugsweise von 0,1 zu 1,2, bevorzugter von 0,1 bis 0,6 und sogar noch bevorzugter von 0,1 bis 0,4 reichen.
  • Die Transfektionseigenschaften verschiedener Komplexe der Erfindung können durch in vitro Transfektionsstudien (z.B. GTP Transfektion in kultivierten Zellen) oder in Tiermodellen bestimmt werden. In bestimmten Ausführungsformen wird der für Transfektion verwendete Komplex für einen bestimmten Zelltyp, abzugebendes Polynucleotid, Poly(beta-aminoester), co-komplexierenden Wirkstoff (falls einer verwendet wird), Krankheitsprozess, Verabreichungsmethode (z.B. Inhalation, oral, parenteral, IV, intrathekal usw.), Dosierungsplan usw. optimiert werden.
  • Polynucleotid
  • Das durch die Polymere der Erfindung zu komplexierende oder einzukapselnde Polynucleotid kann jede Nucleinsäure sein, einschließlich, aber nicht begrenzt auf RNA und DNA. Die Polynucleotide können jede Größe oder Sequenz haben und sie können einzel- oder doppelsträngig sein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Polynucleotid größer als 100 Basenpaare lang. In bestimmten anderen bevorzugten Ausführungsformen ist das Polynucleotid größer als 1000 Basenpaare lang und kann größer als 10000 Basenpaare lang sein. Das Polynucleotid ist vorzugsweise gereinigt und im Wesentlichen rein. Vorzugsweise ist das Polynucleotid mehr als 50% rein, bevorzugter mehr als 75% rein und insbesondere bevorzugt mehr als 95% rein. Das Polynucleotid kann durch jedes nach Stand der Technik bekannte Mittel vorgesehen werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Polynucleotid unter Verwendung von rekombinanten Techniken konstruiert worden (für eine detailliertere Beschreibung dieser Techniken siehe bitte Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Hrsg. Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); von welchen jede hier durch Verweis eingeschlossen ist). Das Polynucleotid kann auch aus natürlichen Quellen erhalten und von verunreinigenden Bestandteilen gereinigt werden, welche normalerweise in der Natur gefunden werden. Das Polynucleotid kann auch in einem Labor chemisch synthetisiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Polynucleotid unter Verwen dung von Standard Festphasenchemie synthetisiert.
  • Das Polynucleotid kann durch chemische oder biologische Mittel modifiziert sein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen führen diese Modifikationen zu erhöhter Stabilität des Polynucleotids. Modifikationen schließen Methylierung, Phosphorylierung, End-Abdeckung usw. ein.
  • Derivate von Polynucleotiden können in der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden. Diese Derivate schließen Modifikationen in den Basen, Zuckern und/oder Phosphatbindungen des Polynucleotids ein. Modifizierte Basen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf jene, welche in den folgenden Nucleosid-Analoga gefunden werden: 2-Aminoadenosin, 2-Thiothymidin, Inosin, Pyrrolopyrimidin, 3-Methyladenosin, 5-Methylcytidin, C5-Bromuridin, C5-Fluoruridin, C5-Ioduridin, C5-Propinyluridin, C5-Propinylcytidin, C5-Methylcytidin, 7-Deazaadenosin, 7-Deazaguanosin, 8-Oxoadenosin, 8-Oxoguanosin, O(6)-Methylguanin und 2-Thiocytidin. Modifizierte Zucker schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf 2'-Fluorribose, Ribose, 2'-Deoxyribose, 3'-Azido-2',3'-dideoxyribose, 2',3'-Dideoxyribose, Arabinose (das 2'-Epimer von Ribose), acyclische Zucker und Hexosen. Die Nucleoside können durch andere Bindung als die Phosphodiester-Bindungen, welche in natürlich vorkommender DNA und RNA gefunden werden, zusammen gebunden sein. Modifizierte Bindungen schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Phosphorthioat und 5'-N-Phosphoramidit-Bindungen. Kombinationen der verschiedenen Modifikationen können in einem einzelnen Polynucleotid verwendet werden. Diese modifizierten Polynucleotide können durch jedes nach Stand der Technik bekannte Mittel vorgesehen werden; wie durch die Fachleute verstanden werden wird, werden die modifizierten Polynucleotide jedoch vorzugsweise unter Verwendung von synthetischer Chemie in vitro hergestellt.
  • Die abzugebenden Polynucleotide können jede Form haben. Zum Beispiel kann das Polynucleotid ein kreisförmiges Plasmid, ein linearisiertes Plasmid, ein Cosmid, ein virales Genom, ein modifiziertes virales Genom, ein künstliches Chromosom usw. sein.
  • Das Polynucleotid kann jede Sequenz haben. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Polynucleotid für ein Protein oder Peptid. Die kodierten Proteine können Enzyme, Strukturproteine, Rezeptoren, lösliche Rezeptoren, Innenkanäle, phar mazeutisch wirksame Proteine, Cytokine, Interleukine, Antikörper, Antikörperfragmente, Antigene, Koagulationsfaktoren, Albumin, Wachstumsfaktoren, Hormone, Insulin usw. sein. Das Polynucleotid kann ebenfalls regulatorische Bereiche umfassen, um die Expression eines Gens zu steuern. Diese regulatorischen Bereiche können einschließen, sind aber nicht begrenzt auf Promotor, Verstärker-Elemente, Repressor-Elemente, TATA-Box, ribosomale Bindestellen, Stopstelle für Transkription usw. In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das Polynucleotid nicht dazu beabsichtigt, für ein Protein zu kodieren. Zum Beispiel kann das Polynucleotid verwendet werden, um einen Fehler in dem Genom der Zelle zu reparieren, welche transfiziert wird.
  • Das Polynucleotid kann auch als ein Antisense-Wirkstoff oder RNA Interferenz (RNAi) vorgesehen werden (Fire et al. Nature 391: 806-811, 1998; hierin durch Verweis eingeschlossen). Antisense-Therapie ist so gemeint, dass sie z.B. Verabreichung oder in situ Vorsehung von einzel- oder doppelsträngigen Oligonucleotiden oder ihren Derivaten einschließen, welche spezifisch hybridisieren, z.B. unter zellulären Bedingungen mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA oder Mutanten davon binden, um so Expression des kodierten Proteins zu hemmen, z.B. durch Hemmen von Transkription und/oder Translation (Crooke „Molecular mechanisms of action of antisense drugs" Biochim. Biophys. Acta 1489(1): 31-44, 1999; Crooke „Evaluating the mechanism of action of antiproliferative antisense drugs" Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10(2): 123-126, Diskussion 127, 2000; Methods in Enzymology Volumen 313-314, 1999). Die Bindung kann durch konventionelle Hasenpaar-Komplementarität oder zum Beispiel im Fall von Bindung an DNA-Duplexe durch spezifische Interaktionen in der Hauptvertiefung der Doppelhelix (also Tripelhelix-Bildung) sein (Chan et al. J. Mol. Med. 75(4): 267-282, 1997).
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das abzugebende Polynucleotid eine Sequenz, welche für ein antigenes Peptid oder Protein kodiert. Nanopartikel, welche diese Polynucleotide enthalten, können an ein Individuum abgegeben werden, um eine immunologische Antwort herbeizuführen, welche ausreichend ist, um die Chance für eine nachfolgende Infektion zu senken und/oder die Symptome zu verringern, welche mit solch einer Infektion zusammenhängen. Das Polynucleotid dieser Impfstoffe kann mit Interleukinen, Interferon, Cytokinen und Adjuvantien wie Choleratoxin, Alaun, Freund-Adjuvans usw. kombiniert werden. Eine große Anzahl an Adjuvans-Verbindungen ist bekannt; ein brauchbares Kompendium von vielen solcher Verbindungen wird durch die National Institutes of Health hergestellt und kann im World Wide Web gefunden werden (http:/www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf, siehe ebenfalls Allison Dev. Biol. Stand. 92: 3-11, 1998; Unkeless et al. Annu. Rev. Immunol. 6: 251-281, 1998; und Phillips et al. Vaccine 10: 151-158, 1992).
  • Die antigenen Proteine oder Peptide, welche durch das Polynukleotid kodiert werden, können von solchen bakteriellen Organismen abgeleitet werden wie Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes, Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Leptospirosis interrogans, Borrelia burgdorferi, Camphylobacter jejuni und Ähnlichen; von solchen Viren wie Pocken, Influenza A und B, respiratorischem Syncytialvirus, Parainfluenza, Masern, HIV, Varicella-Zoster, Herpes Simplex 1 und 2, Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus, Rotavirus, Rhinovirus, Adenovirus, Papillomavirus, Poliovirus, Mumps, Tollwut, Röteln, Coxsackieviren, Pferdeenzephalitis, Japanische Enzephalitis, Gelbfieber, Rift Valley Fieber, Hepatitis A, B, C, D und E Virus und Ähnlichen; und von solchen Pilz-, Protozoen- und Parasiten-Organismen wie Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis, Schistosoma mansoni und Ähnlichen.
  • Mikropartikel
  • Die Poly(β-aminoester) der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um Arzneimittelabgabevorrichtungen zu bilden. Die Polymere der Erfindung können verwendet werden, um Wirkstoffe einzukapseln, einschließlich Polynucleotide, kleine Moleküle, Proteine, Peptide, Metalle, organometallische Verbindungen usw. Die Polymere der Erfindung haben mehrere Eigenschaften, die sie in der Herstellung von Arzneimittelabgabevorrichtungen besonders geeignet machen. Diese schließen ein: 1) die Fähigkeit des Polymers, labile Wirkstoffe zu komplexieren und zu „schützen"; 2) die Fähigkeit, den pH in dem Endosom zu Puffern; 3) die Fähigkeit, als „Protonenschwamm" zu fungieren und Endosomolyse zu verursachen; und 4) die Fähigkeit, die Ladung an negativ geladenen Wirkstoffen zu neutralisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Polymere verwendet, um Mikropartikel zu bilden, welche den abzugebenden Wirkstoff enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform reicht der Durchmesser der Mikropartikel von zwischen 500 nm bis 50 Mikrometern, bevorzugter von 1 Mikrometer bis 20 Mikrometern und insbesondere bevorzugt von 1 Mikrometer bis 10 Mikrometern. In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform reichen die Mikropartikel von 1-5 Mikrometern. Das einkapselnde Polymer der Erfindung kann mit anderen Polymeren kombiniert werden (z.B. PEG, PLGA), um die Mikrokugeln zu bilden.
  • Verfahren zum Herstellen von Mikropartikeln
  • Die Mikropartikel der Erfindung können unter Verwendung von jedem nach Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Diese schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Sprühtrocknen, Einzel- und Doppelemulsion Lösungsmittelevaporation, Lösungsmittelextraktion, Phasentrennung, einfache und komplexe Koazervation und andere Verfahren, welche den gewöhnlichen Fachleuten gut bekannt sind. Besonders bevorzugte Verfahren zum Herstellen der Partikel sind das Doppelemulsionsverfahren und Sprühtrocknen. Die Bedingungen, welche beim Herstellen der Mikropartikel verwendet werden, können verändert werden, um Partikel einer gewünschten Größe oder Eigenschaft (z.B. Hydrophobie, Hydrophilie, externe Morphologie, „Klebrigkeit", Form usw.) zu ergeben. Das verwendete Verfahren zum Herstellen des Partikels und die Bedingungen (z.B. Lösungsmittel, Temperatur, Konzentration, Luftflussrate usw.) können auch von dem Wirkstoff abhängen, welcher eingekapselt wird, und/oder der Zusammensetzung der Polymermatrix.
  • Verfahren, welche zum Herstellen von Mikropartikeln für Ab gabe von eingekapselten Wirkstoffen entwickelt wurden, werden in der Literatur beschrieben (zum Beispiel siehe bitte Doubrow, M., Hrsg., „Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz und Langer, J. Controlled Release 5: 13-22, 1987; Mathiowitz et al. Reactive Polymers 6: 275-283, 1987; Mathiowitz et al. J. Appl. Polymer Sci. 35: 755-774, 1988; von welchen jedes hierin durch Verweis eingeschlossen wird).
  • Falls die durch eines der obigen Verfahren hergestellten Partikel eine Größenbandbreite haben, welche sich außerhalb der gewünschten Bandbreite befindet, können die Partikel zum Beispiel unter Verwendung eines Siebs sortiert werden.
  • Wirkstoff
  • Die durch das System der vorliegenden Erfindung abzugebenden Wirkstoffe können therapeutische, diagnostische oder prophylaktische Wirkstoffe sein. Jede an ein Individuum zu verabreichende chemische Verbindung kann unter Verwendung der Mikropartikel der Erfindung abgegeben werden. Der Wirkstoff kann ein kleines Molekül, eine organometallische Verbindung, Nucleinsäure, Protein, Peptid, Polynucleotid, Metall, eine isotopisch markierte chemische Verbindung, Arznei, Impfstoff, immunologischer Wirkstoff usw. sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Wirkstoffe organische Verbindungen mit pharmazeutischer Wirksamkeit. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist der Wirkstoff eine klinisch verwendete Arznei. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Arznei ein antibiotischer, antiviraler Wirkstoff, ein Anästhetikum, ein steroidaler Wirkstoff, ein Antientzündungsmittel, anti-neoplastischer Wirkstoff, Antigen, Impfstoff, Antikörper, Abschwellungsmittel, Antihypertensivum, Sedativ, Geburtenkontrollmittel, progestationaler Wirkstoff, anti-cholinerger, analgetischer, anti-depressiver, anti-psychotischer, β-adrenerger blockierender Wirkstoff, Diuretikum, kardiovaskulärer Wirkstoff, vasoaktiver Wirkstoff, nicht-steroidaler anti-entzündlicher Wirkstoff, Ernährungswirkstoff usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der abzugebende Wirkstoff ein Gemisch aus Wirkstoffen sein. Zum Beispiel kann ein lokales Anästhetikum in Kombination mit einem anti-entzündlichen Wirkstoff wie einem Steroid abgege ben werden. Lokale Anästhetika können auch mit vasoaktiven Wirkstoffen wie Epinephrin verabreicht werden. Um ein weiteres Beispiel zu geben, kann ein Antibiotikum mit einem Hemmer des Enzyms kombiniert werden, welches gewöhnlich durch Bakterien hergestellt wird, um das Antibiotikum zu inaktivieren (z.B. Penicillin und Clavulansäure).
  • Diagnostische Wirkstoffe schließen Gase ein; Metalle; kommerziell erhältliche abbildende Wirkstoffe, welche in Positronenemissionstomographie (PET), computergestützter Tomographie (CAT), Einzel-Photonenemission computerisierter Tomographie, Röntgen, Fluoroskopie und magnetischer Resonanzabbildung (MRI) verwendet werden; und Kontrastmittel. Beispiele für geeignete Materialien zur Verwendung als Kontrastmittel in MRI schließen Gadoliniumchelate, als auch Eisen, Magnesium, Mangan, Kupfer und Chrom ein. Beispiele für Materialien, welche für CAT und Röntgen-Abbildung brauchbar sind, schließen auf Iod basierende Materialien ein.
  • Prophylaktische Wirkstoffe schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Antibiotika, Nahrungsergänzungsmittel und Impfstoffe. Impfstoffe können isolierte Proteine oder Peptide, inaktivierte Organismen und Viren, tote Organismen und Viren, genetisch veränderte Organismen oder Viren und Zellextrakte umfassen. Prophylaktische Wirkstoffe können mit Interleukinen, Interferon, Cytokinen und Adjuvantien wie Cholera-Toxin, Alaun, Freund-Adjuvans usw. kombiniert werden. Prophylaktische Wirkstoffe schließen Antigene von solchen bakteriellen Organismen wie Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes, Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis. Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Leptospirosis interrogans, Borrelia burgdorferi, Camphylobacter jejuni und Ähnlichen; Antigene von solchen Viren wie Pocken, Influenza A und B, respiratorischem Syncytialvirus, Parainfluenza, Masern, HIV, Varicella-Zoster, Herpes Simplex 1 und 2, Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus, Rotavirus, Rhinovirus, Adenovirus, Papillomavirus, Polio virus, Mumps, Tollwut, Röteln, Coxsackieviren, Pferdeenzephalitis, Japanische Enzephalitis, Gelbfieber, Rift Valley Fieber, Hepatitis A, B, C, D und E Virus und Ähnlichen; Antigene von Pilz-, Protozoen- und Parasiten-Organismen wie Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis, Schistosoma mansoni und Ähnlichen ein. Diese Antigene können die Form von ganzen getöteten Organismen, Peptiden, Proteinen, Glycoproteinen, Kohlenhydraten oder Kombinationen davon haben.
  • Zielmittel
  • Die Mikro- und Nanopartikel der Erfindung können modifiziert werden, um Zielmittel einzuschließen, da es häufig wünschenswert ist, auf eine bestimmte Zelle, Sammlung von Zellen oder Gewebe zu zielen. Eine Vielfalt an Zielmitteln, die pharmazeutische Zusammensetzungen auf bestimmte Zellen richten können, sind nach Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel Cotten et al. Methods Enzym. 217: 618, 1993; hierin durch Verweis eingeschlossen). Die Zielmittel können durch den ganzen Partikel hindurch eingeschlossen werden oder nur an der Oberfläche sein. Das Zielmittel kann ein Protein, Peptid, Kohlenhydrat, Glycoprotein, Lipid, kleines Molekül usw. sein. Das Zielmittel kann verwendet werden, um auf spezifische Zellen oder Gewebe zu zielen, oder kann verwendet werden, um Endocytose oder Phagocytose des Partikels zu fördern. Beispiele für Zielmittel schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Antikörper, Fragmente von Antikörpern, Lipoproteine mit niedriger Dichte (LDLs), Transferrin, Asialycoproteine, gp120 Envelope-Protein des humanen Immunschwächevirus (HIV), Kohlenhydrate, Rezeptorligande, Sialsäure usw. Wenn das Zielmittel durch den Partikel hindurch eingeschlossen wird, kann das Zielmittel in das Gemisch eingeschlossen werden, das verwendet wird, um die Partikel zu bilden. Falls das Zielmittel nur an der Oberfläche ist, kann das Zielmittel mit (z.B. durch kovalente, hydrophobe, Wasserstoffbindung, van-der-Waals oder andere Interaktionen) den gebildeten Partikeln unter Verwendung von chemischen Standardtechniken verbunden werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Sobald die Mikropartikel oder Nanopartikel (Polymer komplexiert mit Polynucleotid) hergestellt worden sind, können sie mit einem oder mehreren pharmazeutischen Arzneimittelträgern kombiniert werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden, die geeignet ist, an Tiere einschließlich Menschen verabreicht zu werden. Wie durch einen Fachmann verstanden würde, können die Arzneimittelträger basierend auf dem Verabreichungsweg wie unten beschrieben, dem abgegebenen Wirkstoff, dem Zeitverlauf der Abgabe des Wirkstoffs usw. gewählt werden.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung und zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger oder Träger einschließen. Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff „pharmazeutisch annehmbarer Träger" einen nicht-toxischen, inerten, festen, halbfesten oder flüssigen Füllstoff, Verdünnungsmittel, Einkapselungsmaterial oder Formulierungshilfe irgend einer Art. Einige Beispiele für Materialien, welche als pharmazeutisch annehmbare Träger dienen können, sind Zucker wie Lactose, Glucose und Sucrose, Stärken wie Maisstärke und Kartoffelstärke; Cellulose und ihre Derivate wie Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; pulverisiertes Tragant; Malz; Gelatine; Talk; Arzneimittelträger wie Kakaobutter und Zäpfchen-Wachse; Öle wie Erdnussöl, Baumwollsaatöl; Safloröl; Sesamöl; Olivenöl; Maisöl und Sojaöl; Glycole wie Propylenglycol; Ester wie Ethyloleat und Ethyllaurat; Agar; Detergentien wie Tween 80; Puffermittel wie Magnesiumhydroxid und Aluminiumhydroxid; Alginsäure; Pyrogen-freies Wasser; isotonische Kochsalzlösung; Ringer-Lösung; Ethylalkohol und Phosphat-gepufferte Lösungen, als auch andere nicht-toxische kompatible Schmiermittel wie Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat, als auch Farbstoffe, Aufschlussmittel, Überzugsmittel, Süßstoffe, Geschmacksstoffe und parfümierende Mittel, Konservierungsstoffe und Antioxidantien können in den Zusammensetzungen gemäß der Beurteilung des Formulierers ebenfalls vorhanden sein. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung können Menschen und/oder Tieren oral, rektal, parenteral, intrazisternal, intravaginal, intranasal, intraperitoneal, topisch (wie durch Pulver, Cremes, Salben oder Tropfen), buckal oder als ein orales oder nasales Spray verabreicht werden.
  • Flüssige Dosierungsformen für orale Verabreichung schließen pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere ein. Zusätzlich zu den wirksamen Inhaltsstoffen (also Mikropartikeln, Nanopartikeln, Polynucleotid/Polymer-Komplexen) können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel enthalten, welche gewöhnlich nach Stand der Technik verwendet werden, zum Beispiel Wasser oder andere Lösungsmittel, Aufschlussmittel und Emulgatoren wie Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-Butylenglycol, Dimethylformamid, Öle) insbesondere Baumwollsaat-, Erdnuss-, Mais-, Keim-, Oliven-, Castor- und Sesamöle), Glycerol, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglycole und Fettsäureester von Sorbitan und Gemische davon. Neben inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen auch Hilfsstoffe wie Benetzungsmittel, emulgierende und suspendierende Mittel, süßende, aromatisierende und parfümierende Mittel einschließen.
  • Injizierbare Präparate, zum Beispiel sterile injizierbare wässerige oder ölartige Suspensionen, können gemäß dem Stand der Technik unter Verwendung geeigneter Dispersions- oder Benetzungsmittel und Suspensionsmittel formuliert werden. Die sterilen injizierbaren Präparate können auch eine sterile injizierbare Lösung, Suspension oder Emulsion in einem nicht-toxischen, parenteral annehmbaren Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, zum Beispiel wie eine Lösung in 1,3-Butandiol. Unter den annehmbaren Vehikeln und Lösungsmitteln, die eingesetzt werden können, sind Wasser, Ringer-Lösung, U.S.P. und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden sterile, fixierte Öle herkömmlicherweise als Lösungsmittel oder Suspensionsmedium eingesetzt. Zu diesem Zweck kann jedes milde fixierte Öl eingesetzt werden, einschließlich synthetische Mono- oder Diglyceride. Zusätzlich werden Fettsäuren wie Oleinsäure in den injizierbaren Präparaten verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Partikel in einer Trägerflüssigkeit suspendiert, welche 1% (Gew./Vol.) Natriumcarboxymethylcellulose und 0,1% (Vol./Vol.) Tween 80 umfasst.
  • Die injizierbaren Formulierungen können zum Beispiel durch Filtration durch einen Bakterien-zurückhaltenden Filter sterilisiert werden, oder durch Einschließen von Sterilisierungsmitteln in Form von sterilen festen Zusammensetzungen, welche in steri lem Wasser oder anderem sterilen injizierbaren Medium vor der Verwendung gelöst oder dispergiert werden können.
  • Zusammensetzungen für rektale oder vaginale Verabreichung sind vorzugsweise Zäpfchen, welche durch Mischen der Partikel mit geeigneten nicht-reizenden Arzneimittelträgern oder Trägern hergestellt werden können wie Kakaobutter, Polyethylenglycol oder ein Zäpfchen-Wachs, welche bei Umgebungstemperatur fest sind aber bei Körpertemperatur flüssig, und daher im Rektum oder der vaginalen Höhle schmelzen und die Mikropartikel freisetzen.
  • Feste Dosierungsformen für orale Verabreichung schließen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granalien ein. In solchen festen Dosierungsformen werden die Partikel mit mindestens einem inerten, pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger oder Träger wie Natriumcitrat oder Dicalciumphosphat und/oder a) Füllstoffen oder Streckmitteln wie Stärken, Lactose, Sucrose, Glucose, Mannitol und Kieselsäure, b) Bindemitteln wie zum Beispiel Carboxymethylcellulose, Alginaten, Gelatine, Polyvinylpyrrolidinon, Sucrose und Acacia, c) Befeuchtungsmitteln wie Glycerol, d) Aufschlussmitteln wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmte Silicate und Natriumcarbonat, e) Lösung-verzögernde Wirkstoffe wie Paraffin, f) Absorption-Beschleuniger wie quaternäre Ammoniumverbindungen, g) Benetzungsmittel wie zum Beispiel Cetylalkohol und Glycerolmonostearat, h) Absorptionsmittel wie Kaolin und Bentonit-Ton, und i) Schmiermittel wie Talk, Calciumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglycole, Natriumlaurylsulfat und Gemische daraus. Im Fall von Kapseln, Tabletten und Pillen kann die Dosierungsform auch Puffermittel umfassen.
  • Feste Zusammensetzungen einer ähnlichen Art können auch als Füllstoffe in weichen oder harten gefüllten Gelatinekapseln unter Verwendung von solchen Arzneimittelträgern wie Lactose oder Milchzucker, als auch Polyethylenglycolen mit einem hohen Molekulargewicht und Ähnlichem eingesetzt werden.
  • Die festen Dosierungsformen von Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granalien können mit Überzügen und Schalen wie enterischen Überzügen und anderen Überzügen hergestellt werden, welche nach Stand der pharmazeutischen Formulierungstechnik gut bekannt sind. Sie können gegebenenfalls Trübungsmittel enthalten und können auch von einer Zusammensetzung sein, die den/die Wirkstoff(e) nur oder bevorzugt in einem bestimmten Teil des Verdauungstrakts, gegebenenfalls auf verzögerte Weise freisetzt. Beispiele für einbettende Zusammensetzungen, welche verwendet werden können, schließen polymere Substanzen und Wachse ein.
  • Feste Zusammensetzungen einer ähnlichen Art können ebenfalls als Füllstoffe in weichen oder harten gefüllten Gelatinekapseln unter Verwendung von solchen Arzneimittelträgern wie Lactose oder Milchzucker, als auch Polyethylenglycolen mit einem hohen Molekulargewicht und Ähnlichem eingesetzt werden.
  • Dosierungsformen für topische oder transdermale Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung können Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gels, Pulver, Lösungen, Sprays, Inhalationsmittel oder Pflaster einschließen. Die Partikel werden unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und allen benötigten Konservierungsstoffen oder Puffern wie erforderlich sein kann vermischt. Ophthalmische Formulierungen, Ohrentropfen und Augentropfen werden ebenfalls als innerhalb des Umfangs dieser Erfindung erwogen.
  • Die Salben, Pasten, Cremes und Gels können zusätzlich zu den Partikeln dieser Erfindung Arzneimittelträger wie Tier- und Pflanzenfette, Öle, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silicone, Bentonite, Kieselsäure, Talk und Zinkoxid oder Gemische daraus enthalten.
  • Pulver und Sprays können zusätzlich zu den Partikeln dieser Erfindung Arzneimittelträger wie Lactose, Talk, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilicate und Polyamidpulver oder Gemische aus diesen Substanzen enthalten. Sprays können zusätzlich übliche Treibmittel wie Chlorfluorkohlenwasserstoffe enthalten.
  • Transdermale Pflaster haben den zusätzlichen Vorteil, kontrollierte Abgabe einer Verbindung an den Körper vorzusehen. Solche Dosierungsformen können durch Lösen oder Dispergieren der Mikropartikel oder Nanopartikel in einem passenden Medium hergestellt werden. Absorptionsverstärker können ebenfalls verwendet werden, um den Fluss der Verbindung über die Haut zu erhöhen. Die Geschwindigkeit kann durch entweder Vorsehen einer Geschwindigkeit-kontrollierenden Membran oder durch Dispergieren der Partikel in einer Polymermatrix oder Gel kontrolliert werden.
  • Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden beim Bedenken der folgenden Beispiele weiter erkannt werden, welche beabsichtigt sind, bestimmte besondere Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen, aber nicht beabsichtigt sind, ihren Umfang wie durch die Ansprüche definiert einzuschränken.
  • Beispiele
  • Beispiel 1 – Abbaubare Poly(β-aminoester): Synthese, Kennzeichnung und Selbstmontage mit Plasmid DNA
  • Experimenteller Abschnitt
  • Allgemeine Erwägungen.
  • Alle Manipulationen, welche lebende Zellen oder sterile Materialien einbeziehen, wurden in einer Sterilbank unter Verwendung von sterilen Standardtechniken durchgeführt. 1H NMR (300,100 MHz) und 13C NMR (75,467 MHz) Spektren wurden an einem Varian Mercury Spektrometer aufgezeichnet. Alle chemischen Verschiebungswerte werden in ppm angegeben und werden mit Bezug auf rückständiges Protonen- oder Kohlenstoffsignal vom Lösungsmittel erwähnt. Gelpermeationschromatographie (GPC) der organischen Phase wurde unter Verwendung einer Hewlett Packard 1100 Serie isokratischen Pumpe, einem Rheodyne Model 7125 Injektor mit einem 100-μl Injektionsloop und zwei PL-Gel gemischten-D Säulen in Folge (5 μm, 300 × 7,5 mm, Polymer Laboratories, Amherst, MA) durchgeführt. THF/0,1 M Piperidin wurde als Eluent bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min. verwendet. Die Daten wurden unter Verwendung eines Optilab DSP interferometrischen Refraktometers (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) gesammelt und unter Verwendung des TriSEC GPC Softwarepakets (Viscotek Corporation, Houston, TX) verarbeitet. Die Molekulargewichte und Polydispersitäten der Polymere werden relativ zu monodispergierten Polystyrol-Standards angegeben. GPC der wässerigen Phase wurde durch American Polymer Standards (Mentor, OH) unter Verwendung von Ultrahydrogel L und 120A Säulen in Folge (Waters Corporation, Milford, MA) durchgeführt. Wasser (1% Essigsäure, 0,3 M NaCl) wurde als Eluent bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min. verwendet. Die Daten wurden unter Verwendung eines Knauer-Differentialrefraktometers gesammelt und unter Verwendung eines IBM/PC GPC-PRO 3.13 Softwarepakets (Viscotek Corporation, Houston, TX) verarbeitet. Die Molekulargewichte und Polydispersitäten der Polymere werden bezogen auf Poly(2-vinylpyridin)-Standards angegeben. Für cytotoxische Tests wurde Extinktion unter Verwendung eines Dynatech Laboratories MR5000 Mikroplatten lesers bei 560 nm gemessen.
  • Materialien.
  • N,N'-Dimethylethylendiamin, Piperazin und 4,4'-Trimethylendipiperidin wurden von Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI) erworben. 1,4-Butandioldiacrylat wurde von Alfa Aesar Organics (Ward Hill, MA) erworben. (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) wurde von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erworben. Plasmid DNA (pCMV-Luc) wurde in E. coli hergestellt (DH5α, einem gütigen Geschenk von Zycos, Inc., Cambridge, MA), isoliert mit einem Qiagen-Kit und durch Ethanol-Ausfällung gereinigt. NIH 3T3 Zellen wurden von American Type Culture Collection (Manassas, VA) erworben und bei 37°C, 5% CO2 in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, 90%; fötalem Rinderserum, 10%; Penicillin, 100 Einheiten/ml; Streptomycin, 100 μg/ml wachsen gelassen. Alle anderen Materialien und Lösungsmittel wurden wie erhalten ohne weitere Reinigung verwendet. Allgemeines Polymerisationsverfahren. In einem typischen Experiment wurden 1,4-Butandioldiacrylat (0,750 g, 0,714 ml, 3,78 mmol) und Diamin (3,78 mmol) in zwei getrennte Vialen eingewogen und in THF (5 ml) gelöst. Die Lösung, welche das Diamin enthielt, wurde durch eine Pipette zur Diacrylat-Lösung zugegeben. Ein mit Teflon überzogener Rührstab wurde zugegeben, die Viale wurde mit einem Teflon-ausgekleideten Schraubverschluss versiegelt und die Umsetzung wurde bei 50°C erhitzt. Nach 48 Stunden wurde die Umsetzung auf Raumtemperatur gekühlt und langsam in kräftig gerührten Diethylether oder Hexane getropft. Polymer wurde gesammelt und unter Vakuum vor der Analyse getrocknet.
  • Synthese von Vergleichspolymer 1.
  • Polymer 1 wurde gemäß dem oben skizzierten allgemeinen Verfahren hergestellt. 1H NMR δ (CDCl3, 300 MHz) 4,11 (br t, 4H), 2,75 (br t, J = 7,05 Hz, 4H), 2,53 (br s, 4H), 2,50 (br t, (obsk.), J = 7,20 Hz, 4H), 2,28 (br s, 6H), 1,71 (br m, 4H). 13C NMR δ (CDCl3, 75,47 MHz) 172,55, 64,14, 55,31, 53,39, 42,47, 32,54, 25,53.
  • Synthese von Vergleichspolymer 2.
  • Polymer 2 wurde gemäß dem oben skizzierten allgemeinen Verfahren hergestellt. 1H NMR δ (CDCl3, 300 MHz) 4,11 (br t, 4H), 2,74 (br t, J = 7,35, 4H), 2,56 (br m, 12H), 1,71 (br t, 4H). 13C NMR δ (CDCl3, 75,47 MHz) 172,24, 64,19, 53,55, 52,75, 32,27, 25,52.
  • Synthese von Vergleichspolymer 3.
  • Polymer 3 wurde gemäß dem oben skizzierten allgemeinen Verfahren hergestellt. 1H NMR δ (CDCl3, 300 MHz) 4,11 (br t, 4H), 3,00 (br m, 4H), 2,79 (br m, 4H), 2,65 (br m, 4H), 2,11 (br m, 4H), 1,70 (br m, 8H), 1,25 (br m, 12H). 13C NMR δ (CDCl3, 75,47 MHz) 172,37, 64,13, 53,89 (br), 36,74, 35,58, 32,11 (br), 25,45, 24,05.
  • Polymer-Degradationsstudien.
  • Die Hydrochloridsalze von Polymeren 1-3 wurden in Acetatpuffer (1 M, pH = 5,1) oder HEPES-Puffer (1 M, pH = 7,4) bei einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst (die Verwendung von millimolaren Konzentrationen von Puffer ergab wesentliche Verringerung von pH während der Degradation wegen der Herstellung von sauren Degradationsprodukten). Proben wurden bei 37°C auf einem mechanischen Rotator inkubiert und Aliquoten (1 ml) wurden bei passenden Zeitintervallen entfernt. Die Aliquoten wurden sofort in flüssigem Stickstoff gefroren und lyophilisiert. Polymer wurde von getrockneten Puffersalzen unter Verwendung von THF/0,1 M Piperidin (1 ml) extrahiert und Proben wurden direkt durch GPC analysiert.
  • Bildung von DNA/Polymer-Komplexen und Agarosegel-Verzögerungstests.
  • DNA/Polymer-Komplexe wurden durch Zugeben von 50 μl einer Plasmid DNA Lösung (pCMV Luc, 2 μg/50 μl in Wasser) zu einer sanft wirbelnden Lösung aus dem Hydrochloridsalz von Polymeren 1-3 (50 μl in 25 mM MES, pH = 6,0, Konzentrationen angepasst, um gewünschte DNA/Polymer-Gewichtsverhältnisse zu erreichen) gebildet. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, wonach 20 μl an einem 1% Agarosegel (HEPES, 20 mM, pH = 7,2, 65V, 30 Min.) laufen gelassen wurden. Die Proben wurden mit einem Ladungspuffer auf das Gel geladen, bestehend aus 10% Ficoll 400 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) in HEPES (25 mM, pH = 7,2). Bromphenol-Blau wurde als visueller Indikator nicht in den Ladungspuffer eingeschlossen, da dieser geladene Farbstoff die Komplexation von Polymer und DNA zu stören schien. DNA-Bänder wurden unter UV-Beleuchtung durch Ethidiumbromid-Anfärbung visualisiert.
  • Quasi-elastische Laser-Lichtstreuung (QELS) und Messung von ζ-Potentialen.
  • QELS-Versuche und Messungen von ζ-Potential wurden unter Verwendung eines ZetaPALS dynamischen Lichtstreuungsdetektors (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, 15 mW Laser, einfallender Strahl = 676 nm) durchgeführt. DNA/Polymer-Komplexe wurden wie oben für Agarosegel-Verzögerungstests beschrieben gebildet. Proben wurden mit 900 μl HEPES (20 mM, pH = 7,0) verdünnt, zu einer sanft wirbelnden Probe von DNA/Polymer-Komplex (Gesamtvolumen = 1 ml, pH = 7,0) zugegeben. Durchschnittliche Partikelgrößen und ζ-Potentiale wurden bei 25°C bestimmt. Korrelationsfunktionen wurden bei einem Streuungswinkel von 90° gesammelt und Partikelgrößen wurden unter Verwendung der MAS-Option von BIC Partikelklassifizierungssoftware (Ver. 2.30) unter Verwendung der Viskosität und des Refraktionsindexes von reinem Wasser bei 25°C berechnet. Partikelgrößen werden als effektive Durchmesser unter Annahme von Log-normaler Verteilung ausgedrückt. Durchschnittliche elektrophoretische Beweglichkeiten wurden bei 25°C unter Verwendung von BIC PALS Zeta-Potential Analysesoftware gemessen und Zeta-Potentiale wurden unter Verwendung des Smoluchowsky-Modells für wässerige Suspensionen berechnet. Drei Messungen wurden an jeder Probe durchgeführt und die Ergebnisse werden als durchschnittliche Durchmesser und Zeta-Potentiale angegeben.
  • Cytotoxische Tests.
  • Immortalisierte NIH 3T3 Zellen wurden in 96-Mulden-Platten bei einer anfänglichen Saatdichte von 10000 Zellen/Mulde in 200 μl Wachstumsmedium (90% Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, 10% fötales Rinderserum, Penicillin 100 Einheiten/ml, Streptomycin 100 μg/ml) wachsen gelassen. Die Zellen wurden für 24 Stunden wachsen gelassen, wonach das Wachstumsmedium entfernt wurde und durch 180 μl Serum-freies Medium ersetzt wurde. Passende Mengen an Polymer wurden in 20 μl Aliquoten zugegeben. Proben wurden bei 37°C für 5 Stunden inkubiert und die metabolische Aktivität jeder Mulde wurde unter Verwendung eines MTT/Thiazolyl-Blau-Tests bestimmt: zu jeder Mulde wurden 25 μl einer 5 mg/ml Lösung aus MTT Stammlösung in sterilem PBS-Puffer zugegeben. Die Proben wurden bei 37°C für 2 Stunden inkubiert und 100 μl Extraktionspuffer (20% Gew./Vol. SDS in DMF/Wasser (1:1), pH = 4,7) wurden zu jeder Mulde zugegeben. Die Proben wurden bei 37°C für 24 Stunden inkubiert. Optische Extinktion wurde bei 560 nm mit einem Mikroplattenleser gemessen und als ein Prozentsatz bezogen auf Kontrollzellen ausgedrückt.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Polymersynthese und Kennzeichnung
  • Von der Synthese von linearen Poly(amidoaminen), welche tertiäre Amine in ihren Grundgerüsten enthalten, wurde durch Ferruti et al. in 1970 durch die Addition von bifunktionalen Aminen an Bisacrylamide berichtet (Anderson Nature 392 (Beil.): 25-30, 1996; Friedman Nature Med. 2: 144-147, 1996; Crystal Science 270: 404-410; 1995; Mulligan Science 260: 926-932, 1993). Lineare Poly(amidoamine) wurden anfänglich als Heparin und Ion-komplexierende Biomaterialien untersucht (Ferruti et al. Advances in Polymer Science 58: 55-92, 1984; Ferruti et al. Biomaterials 15: 1235-1241, 1994; Ferruti et al. Macromol. Chem. Phys. 200: 1644-1654, 1999; Ferruti et al. Biomaterials 15: 1235-1241, 1994).
  • Dendritische Poly(amidoamine) (PAMAMs) haben wegen ihrer Fähigkeit, DNA zu komplexieren, steigende Verwendung in Gentransferanwendungen gefunden (Kukowska-Latallo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4897-4902, 1996; Tang et al. Bioconjugate Chem. 7: 703-714, 1996; Haensler et al. Bioconjugate Chem. 4: 372-379, 1993), und ein kürzlicher Bericht beschreibt die Anwendung einer Familie von linearen Poly(amidoaminen) auf Zelltransfektion und cytotoxische Studien (Hill et al. Biochim. Biophys: Acta 1427: 161-174, 1999). Im Gegensatz dazu haben analoge Poly(esteramine), gebildet aus der Michael-artigen Addition von bifunktionalen Aminen an Diacrylatester weniger Aufmerksamkeit erhalten (Danusso et al. Polymer 11: 88-113, 1970; Ferruti et al. Polymer 26: 1336, 1985; Ferruti et al. Advances in Polymer Science 58: 55-92, 1984; Ferruti et al. Biomaterials 15: 1235-1241, 1994; Ferruti et al. Macromol. Chem. Phys. 200: 1644-1654, 1999; Ferruti et al. Biomaterials 15: 1235-1241, 1994; Kargina et al. Vysokomol. Soedin. Seriya A 28: 1139-1144, 1986; Rao et al. J. Bioactive and Compatible Polymers 14: 54-63, 1999).
  • Die Poly(aminoester) Herangehensweise bietet aus mehreren Gründen eine besonders attraktive Basis für die Entwicklung von neuen polymeren Transfektionsvektoren: 1) Die Polymere enthalten die erforderlichen Amine. und leicht abbaubare Bindungen, 2) multiple Analoga könnten potentiell direkt aus kommerziell erhältlichen Ausgangsmaterialien synthetisiert werden und 3) falls die sich ergebenden Polymere als DNA-kondensierende Wirkstoffe brauchbar wären, könnten zukünftige Polymer-Generationen leicht konstruiert werden, um Amin pKa-Werte zu besitzen, welche die Bandbreite von physiologisch relevantem pH überspannen. Dieser letzte Punkt war besonders faszinierend, weil die Pufferkapazität von Polyaminen kürzlich als ein Faktor einbezogen wurde, welcher das Entweichen von DNA aus Zell-Endosomen nach Endocytose beein flusst (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297-7301, 1995; Haensler et al. Bioconjugate Chem. 4: 372-379, 1993; Behr Chimia 51: 34-36, 1997; Demeneix et al., in Artificial Self-Assembling-Systems for Gene Delivery (Felgner et al., Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, pp. 146-151; Kabanov et al., in Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998).
  • Während die Komplexation von DNA mit einem kationischen Polymer erforderlich ist, um DNA während früher Ereignisse in dem Transfektionsverfahren zu kompaktieren und zu schützen, müssen DNA und Polymer schließlich im Nucleus dekomplexieren, um effiziente Transkription zu ermöglichen (Luo et al. Nat. Biotechnol. 18: 33-37, 2000). Hinsichtlich dieser Anforderung konnten abbaubare Polykatione eine wichtige Rolle in „Vektor-entpackenden" Ereignissen im Nucleus spielen (Luo et al. Nat. Biotechnol. 18: 33-37, 2000; Schaffer et al. Biotechnol. Bioeng. 67: 598-606, 2000; Kabanov Pharm. Sci. Technol. Today 2: 365-372, 1999). Schließlich hypothetisieren wir, dass Polymere dieser allgemeinen Struktur und die β-Aminosäurederivate, in welche sie vermutlich zerfallen würden, signifikant weniger toxisch wären, als Poly(lysin) und PEI. Wie oben skizziert sind abbaubare Polykatione (Putnam et al. Macromolecules 32: 3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122: 6524-6525, 2000) und lineare Polymere, welche relativ gehinderte Amine enthalten, welche sich nahe am Polymer-Grundgerüst befinden (Gonzalez et al. Bioconjugate Chem. 10: 1068-1074, 1999) weiniger toxisch als Poly(lysin) und PEI.
  • Die Synthese von Polymeren 1-3 durch die Zugabe der Bis(sekundären Amine), N,N'-Dimethylethylendiamin, Piperazin und 4,4'-Trimethylendipiperidin zu 1,4-Butandioldiacrylat wurde untersucht (Danusso et al. Polymer 11: 88-113, 1970; Kargina et al. Vysokomol. Soedin. Seriya A 28: 1139-1144, 1986).
  • Die Polymerisation dieser Monomere ging in THF und CH2Cl2 bei 50°C vonstatten, um die entsprechenden Polymere in bis zu 86% Ausbeuten zu ergeben (Tabelle 1). Polymere wurden durch wiederholte Ausfällung in Diethylether oder Hexan gereinigt. Polymer 1 wurde als eine klare viskose Flüssigkeit isoliert; Polymere 2 und 3 wurden als weiße Feststoffe nach Trocknen unter hohem Va kuum erhalten. Alternativ konnten Polymere 1-3 als feste Hydrochloridsalze nach Zugabe von Diethylether/HCl zu einer Lösung aus Polymer in THF oder CH2Cl2 isoliert werden. Alle drei Polymere waren in organischen Lösungsmitteln wie THF, CH2Cl2, CHCl3 und MeOH löslich und waren ebenfalls in Wasser bei verringertem pH löslich. Polymer 1 und die Hydrochloridsalze von Polymeren 1-3 waren in Wasser frei löslich.
  • Figure 00630001
  • Die Molekulargewichte von Polymeren 1-3 und ihren entsprechenden Hydrochloridsalzen wurden durch Gelpermeationschromatographie (GPC) von organischer, als auch wässeriger Phase bestimmt. Polymer-Molekulargewichte (Mn) reichten von bis zu 5800 für Polymer 1 und bis zu 32000 für Polymer 3 bezogen auf Polystyrol-Standards. Molekulargewichtverteilungen für diese Polymere waren monomodal mit Polydispersitätsindizes (PDIs) im Bereich von 1,55 bis 2,55. Repräsentative Molekulargewichtsdaten werden in Tabelle 1 gezeigt. Während die Synthese von linearen Poly(amidoaminen) im Allgemeinen unter Verwendung von Alkoholen oder Wasser als Lösungsmittel durchgeführt wird (Danusso et al. Polymer 11: 88-113, 1970; Ferruti et al. Polymer 26: 1336, 1985; Ferruti et al. Advances in Polymer Science 58:55-92, 1984; Ferruti et al. Biomaterials 15: 1235-1241, 1994; Ferruti et al. Macromol. Chem. Phys. 200: 1644-1654, 1999; Ferruti et al. Biomaterials 15: 1235-1241, 1994), wurden wasserfreies THF und CH2Cl2 in der Synthese von Poly(β-aminoestern) eingesetzt, um Hydrolyseumsetzungen während der Synthese zu minimieren. Die Ausbeuten an Molekulargewichten von Polymeren, welche unter Einsatz von CH2Cl2 als Lösungsmittel synthetisiert wurden, waren im Allgemeinen höher als jene von Polymeren, welche in THF synthetisiert wurden (Tabelle 1) (Polymer 1 konnte nicht in CH2Cl2 synthetisiert werden. Die Farbe der Umsetzungslösung entwickelte sich von farblos zu einer intensiven rosa Farbe fast sofort nach der Einführung einer Lösung aus N,N'-Dimethylethylendiamin in CH2Cl2 zu einer Lösung von 1,4-Butandioldiacrylat in CH2Cl2 (siehe experimenteller Abschnitt oben). Die Farbe entwickelte sich über den Verlauf der Umsetzung zu einem hellen Orange und ein oranges Polymer wurde nach Ausfällung in Hexan isoliert. Das isolierte Polymer war in CH2Cl2, THF und Wasser bei verringertem pH unlöslich und nicht strukturell gekennzeichnet. Dieses Problem wurde für die analoge Umsetzung in THF nicht angetroffen.). Tabelle 1 Repräsentative Molekulargewichtsdaten für Polymere 1-3.
    Polymer Lösungsmittel Mn c PDI Ausbeute, %
    1a THF -- -- ---d
    1a CH2Cl2 -- --- 82 %
    2a THF 10000 1,77 64 %
    2a CH2Cl2 17500 2,15 75 %
    3a THF 24400 1,55 58 %
    3a CH2Cl2 30800 2,02 70 %
    1b THF 5800 2,83 55 %
    2b CH2Cl2 16500 2,37 80 %e
    3b CH2Cl2 31200 2,55 86 %e
    • a Bedingungen: [Diamin] = [1,4-Butandioldiacrylat] = 0,38 M, 50°C, 48 Std.
    • b Bedingungen: [Diamin] = [1,4-Butandioldiacrylat] = 1,08 M, 50°C, 48 Std.
    • c GPC-Analyse wurde in THF/0,1M Piperidin durchgeführt und Molekulargewichte werden gegenüber Polystyrol-Standards angegeben. d Kein Polymer wurde unter diesen Bedingungen isoliert. e Die Umsetzungslösung wurde sehr viskos und verfestigte sich schließlich unter diesen Bedingungen.
  • Die Strukturen von Polymeren 1-3 wurden durch 1H und 13C NMR Spektroskopie bestätigt. Diese Daten zeigen an, dass die Polymere durch die Konjugat-Addition der sekundären Amine an die Acrylat-Komponenten von 1,4-Butandioldiacrylat und nicht durch die Bildung von Amidbindungen unter unseren Umsetzungsbedingungen gebildet wurden. Zusätzlich nehmen diese neuartig gebildeten tertiären Amine in den Polymer-Grundgerüsten nicht in nachfolgenden Additionsumsetzungen mit Diacrylat-Monomer teil, was zu Verzweigung oder Polymer-Quervernetzung führen würde. Dieses günstige Ergebnis scheint für Polymere dieser Art, hergestellt aus Bis sekundäres Amin)-Monomeren, einzigartig zu sein. Die Synthese von analogen Polymeren unter Einsatz von difunktionalen primären Aminen als Monomere (wie 1,4-Diaminobutan) kann zu Polymerverzweigung und der Bildung von unlöslichen quervernetzten Polymernetzwerken führen, falls die Bedingungen nicht ausdrücklich kontrolliert werden.
  • In Anbetracht der Nebeneinanderstellung von Aminen und Estern innerhalb der Grundgerüste von Polymeren 1-3 waren wir anfangs besorgt, dass Hydrolyse für die Polymere zu schnell stattfinden könnte, um von praktischem Nutzen zu sein. Zum Beispiel zerfallen Poly(4-hydroxy-L-prolinester) und Poly[α-(4-aminobutyl)-L-glycolsäure] ziemlich schnell nahe neutralem pH, mit Halbwertszeiten von grob 2 Std. (Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999), beziehungsweise 30 Min. (Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122: 6524-6525, 2000), (Solche schnellen Degradationszeiten schlossen die Verwendung dieser Polymere für Genabgabe nicht aus (Siehe Verweise, Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122: 6524-6525, 2000).
  • Jedoch eröffnen extrem schnelle Degradationsraten im Allgemeinen zusätzliche Sorgen was die Manipulation, Lagerung und Anwendung von abbaubaren Polymeren umgibt.). Analyse von Polymeren 1 und 2 durch wässerige GPC unter Verwendung von 1% Essigsäure/Wasser als Eluent offenbarte jedoch, dass die Degradation in sauren Medien ausreichend langsam war. Zum Beispiel zeigten die GPC-Spuren von Polymeren 1 und 2, welche unter diesen Bedingungen über einen Zeitraum von 4-5 Stunden geprüft wurden, keine Veränderungen in den Molekulargewichten oder Polydispersitäten (Polymer 3 konnte durch wässerige GPC nicht analysiert werden). Wir waren ebenfalls besorgt, dass signifikante Grundgerüst-Hydrolyse während der Isolierung des Hydrochloridsalzes von Polymeren 1-3 auftreten könnte. Um Hydrolyse während der Protonierung und Isolierung dieser Polymere zu verhindern, wurden wasserfreie Lösungsmittel eingesetzt und Umsetzungen wurden unter einer Argon-Atmosphäre durchgeführt. Analyse der Polymere vor und nach Protonierung offenbarte keine beobachtbare Hydrolyse. Zum Beispiel war die GPC-Spur einer Probe von Polymer 3 nach Ausfällung aus CH2Cl2 mit 1,0 M Diethylether/HCl (Mn = 15300; PDI = 1,90) praktisch identisch mit dem Molekulargewicht des Polymers vor der Protonierung (Mn = 15700; PDI = 1,92) und keine Arten von niedrigerem Molekulargewicht waren offenkundig (Vergleichende GPC-Daten wurden unter Einsatz von THF/0,1M Piperidin als Eluent gesammelt (siehe Versuchsabschnitt oben). Die HCl-Salze der Polymere waren in THF unlöslich, aber waren in THF/0,1 M Piperidin gleichzeitig mit der Herstellung eines feinen weißen Niederschlags löslich, welcher vor Injektion filtriert wurde.). Feste Proben von Polymeren 1-3 konnten für mehrere Monate ohne nachweisbare Verringerungen im Molekulargewicht gelagert werden.
  • Polymere 1-3 waren speziell entworfen, um durch Hydrolyse der Esterbindungen in den Polymer Grundgerüsten zu zerfallen. Jedoch ist eine zusätzliche Sorge um die Gesamtstabilität und Biokompatibilität dieser Polymere das Potential, dass unerwünschte Degradation durch Retro-Michael Umsetzung unter physiologischen Bedingungen auftritt. Weil diese Polymere durch die Michael-artige Umsetzung eines sekundären Amins zu einem Acrylatester synthetisiert wurden, ist es möglich, dass sich die Polymere Retro-Michael-Umsetzung unterziehen könnten, um freie Acrylatgruppen insbesondere unter sauren Bedingungen zu regenerieren. Acrylatester sind potentielle DNA-Alkylierungsmittel und stehen daher unter Karzinogen-Verdacht (für kürzliche Beispiele siehe: Schweikl et al. Mutat. Res. 438: P71-P78, 1999; Yang et al. Carcinogenesis 19: P1117-P1125, 1998).
  • Weil von diesen Polymeren erwartet wird, dass sie die verringerte pH-Umgebung innerhalb der endosomalen Bläschen von Zellen (pH = 5,0-5,5) während der Transfektion antreffen, sprachen wir das Potential für die Degradation dieser Polymere an, durch einen Retro-Michael-Weg stattzufinden.
  • Unter extrem sauren (pH < 3) oder basischen (pH > 12) Bedingungen zerfielen Polymere 1-3 schnell und ausschließlich zu 1,4-Butandiol und den erwarteten Bis(β-aminosäure)-Nebenprodukten 4a-6a wie durch 1H NMR Spektroskopie bestimmt. Es wurde kein spektroskopischer Nachweis für Retro-Michael-Addition unter diesen Bedingungen gefunden. Es ist wert anzumerken, dass Bis(β-aminosaure)-Degradationsprodukte 4a-6a weniger wahrscheinlich einer Retro-Michael-Umsetzung unterzogen würden, da Acrylsäuren im Allgemeinen geringer aktivierte Michael-Additionspartner sind (Perlmutter, P., in Conjugate Addition Reactions in Organic Synthesis, Pergamon Press, New York, 1992).
  • Weiterer Zerfall von Verbindungen 4a-6a unter diesen Bedingungen wurde nicht beobachtet.
  • Figure 00680001
  • Die Kinetik von Polymerdegradation wurde unter der Bandbreite von Bedingungen untersucht, welche wahrscheinlich durch diese Polymere während Transfektion angetroffen werden. Degradation wurde bei 37°C bei gepufferten pH-Werten von 5,1 und 7,4 überwacht, um sich an den pH der Umgebungen innerhalb von endosomalen Bläschen beziehungsweise dem Cytoplasma anzunähern. Die Hydrochloridsalze von Polymeren 1-3 wurden zu dem passenden Puffer zugegeben, bei 37°C inkubiert und Aliquoten wurden zu passenden Zeiten entfernt. Aliquoten wurden sofort gefroren, lyophilisiert und Polymer wurde in THF/0,1 M Piperidin für Analyse durch GPC extrahiert. 1 zeigt die Degradationsprofile von Polymeren 1-3 als eine Funktion von Zeit. Die Polymere zerfielen langsamer bei pH 5,1, als bei pH 7,4. Polymere 1-3 zeigten ähnliche Degradationsprofile bei pH 5,1, wobei jedes Polymer eine Halbwertszeit von annähernd 7-8 Stunden hatte. Im Gegensatz dazu waren Polymere 1 und 3 bei pH 7,4 in weniger als 5 Stunden vollständig zerfallen. Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit den pH-Degradationsprofilen von anderen Amin-enthaltenden Polyestern, wie Poly(4-hydroxy-L-prolinester), bei welchen von pendanten Aminfunktionalitäten hypothetisiert wird, dass sie als intramolekulare nucleophile Katalysatoren fungieren und zu schnellerer Degradation bei höherem pH beitragen (Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122: 6524-6525, 2000). Während die Möglichkeit von intramolekularer Assistenz nicht ausgeschlossen werden kann, ist sie für Polymere 1-3 weniger wahrscheinlich, weil die tertiären Amine in diesen Polymeren weniger nucleophil sein sollten. Die Degradation von Polymer 2 fand bei pH 7,4 langsamer statt, als bei pH 5,1 (1). Dieses anormale Verhalten ist sehr wahrscheinlich Folge der unvollständigen Löslichkeit von Polymer 2 bei pH 7,4 und der sich ergebenden heterogenen Natur des Degradationsmillieus (Polymere 2 und 3 sind in Wasser bei pH 7,4 nicht vollständig löslich. Während sich Polymer 3 relativ schnell während des Degradationsversuchs löste, waren feste Partikel von Polymer 2 für mehrere Tage sichtbar.
  • Cytotoxische Tests
  • Poly(lysin) und PEI sind als DNA-kondensierende Wirkstoffe und Transfektionsvektoren weit untersucht worden (Luo et al. Nat. Biotechnol. 18: 33-37, 2000; Behr Acc. Chem. Res. 26: 274-278, 1993; Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30: 97-113, 1998; Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6: 7-20, 1995; Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297-7301, 1995; Behr Chimia 51: 34-36, 1997; Demeneix et al., in Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, pp. 146-151; Kabanov et al., in Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998) und sind die Standards, mit welchen neue polymere Vektoren häufig verglichen werden (Putnam et al. Macromolecules 32: 3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122: 6524-6525, 2000; Gonzalez et al. Bioconjugate Chem. 10: 1068-1074, 1999).
  • Unglücklicherweise werden wie oben skizziert diese Polymere auch mit signifikanten Graden von Cytotoxizität in Verbindung gebracht und hohe Grade von Genexpression werden üblicherweise nur bei einem wesentlichen Schaden für die Zelllebensfähigkeit realisiert. Um die Toxizitätsprofile von Polymeren 1-3 zu bestimmen, wurde ein MTT/Thiazolyl blauer Farbstoff Reduktionstest unter Verwendung der NIH 3T3 Zelllinie und den Hydrochloridsalzen von Polymeren 1-3 als anfängliche Indikatoren durchgeführt. Die 3T3 Zelllinie wird üblicherweise als eine Screeningpopulation ersten Grades für neue Transfektionsvektoren eingesetzt und der MTT-Test wird im Allgemeinen als ein anfänglicher Indikator von Cytotoxizität verwendet, da er die Einflüsse von zugegebenen Substanzen auf Zellwachstum und Metabolismus bestimmt (Hansen et al. Immunol. Methods 119: 203-210, 1989).
  • Zellen wurden mit Polymer 1 (Mn = 5800), Polymer 2 (Mn = 11300) und Polymer 3 (Mn = 22500) wie im experimentellen Abschnitt beschrieben inkubiert. Wie in 2 gezeigt blieben mit diesen Polymeren inkubierte Zellen 100% lebensfähig bezogen auf Kontrollen bei Konzentrationen von Polymer bis zu 100 μg/ml. Diese Ergebnisse lassen sich beeindruckend mit Daten vergleichen, welche für Zellpopulationen erhalten wurden, die mit PEI (Mn ∼ 25000) behandelt wurden, eingeschlossen als positive Kontrolle für unseren Test, als auch um Vergleich mit diesem gut bekannten Transfektionsmittel zu erleichtern. Weniger als 30% von mit PEI behandelten Zellen blieben bei einer Polymerkonzentration von 25 μg/ml lebensfähig und Zelllebensfähigkeit war so niedrig wie 10% bei höheren Konzentrationen von PEI unter ansonsten identischen Bedingungen. Ein analoger MTT-Test wurde unter Verwendung von unabhängig synthetisierten Bis(β-aminosäure)n 4a-6a durchgeführt, um die Cytotoxizität des hydrolytischen Degradationsprodukts dieser Polymere zu screenen. (Bis(β-aminosäure)n 4a-6a sollten entweder biologisch inert sein oder milde oder spürbare Toxizitäten besitzen, welche geringer sind als traditionelle polykationische Transfektionsvektoren. In jedem Fall sollte die Degradation dieser Materialien schnelles metabolisches Wegräumen erleichtern). Verbindungen 4a-6a und 1,4-Butandiol störten weder Zellwachstum, noch Metabolismus in diesen anfänglichen Screeningtests (Daten nicht gezeigt). Ein direkterer Struktur/Funktion-basierter Vergleich zwischen Polymeren 1-3 und PEI kann aufgrund von Unterschieden in Polymerstruktur und Molekulargewicht nicht durchgeführt werden, welche beide zu Polykation-Toxizität beitragen. Dennoch weisen die hervorragenden cytotoxischen Profile von Polymeren 1-3 allein darauf hin, dass sie interessante Kandidaten für weitere Untersuchung als DNA-kondensierende Wirkstoffe wären.
  • Selbstmontage von Polymeren 1-3 mit Plasmid DNA
  • Die Neigung von kationischen Polyaminen, elektrostatisch mit dem polyanionischen Grundgerüst von DNA in wässeriger Lösung zu interagieren, ist gut bekannt. Vorausgesetzt, dass die Polymere bei physiologischem pH ausreichend protoniert sind und dass die Amine sterisch zugänglich sind, können solche Interaktionen ein Selbstmontageverfahren ergeben, in welchem die positiv und negativ geladenen Polymere gut definierte Konjugate bilden (Kabanov et al., in Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998).
  • Die Mehrzahl der Polyamide, welche als DNA-komplexierende Wirkstoffe und Transfektionsvektoren untersucht wurden, haben Amine an den terminalen Enden von kurzen, konstellatorisch flexiblen Seitenketten eingeschlossen (z.B. Poly(lysin) und Methacrylat/Methacrylamid-Polymere) (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30: 97-113, 1998; Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6: 7-20, 1995; van de Wetering et al. Bioconjugate Chem. 10: 589-597, 1999), oder zugängliche Amine an den Oberflächen von sphärischen oder kugelförmigen Polyaminen (z.B. PEI und PAMAM Dendrimere) (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297-7301, 1995; Kukowska-Latallo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4897-4902, 1996; Tang et al. Bioconjugate Chem. 7: 703-714, 1996; Haensler et al. Bioconjugate Chem. 4: 372-379, 1993).
  • Weil Polymere 1-3 tertiäre Amine enthalten und sich jene tertiären Amine in einer sterisch gedrängten Umgebung befinden (flankiert an zwei Seiten durch die Polymergrundgerüste) waren wir anfänglich besorgt, dass die protonierten Amine nicht ausreichend in der Lage sein könnten, eng mit DNA zu interagieren.
  • Die Fähigkeit von Polymeren 1-3, Plasmid-DNA zu komplexieren, wurde durch einen Agarosegel-Verschiebungstest gezeigt. Agarosegel-Elektrophorese trennt Makromoleküle auf der Basis von sowohl Ladung, als auch Größe. Daher ist die Irrmobilisierung von DNA an einem Agarosegel in Gegenwart von steigenden Konzentrationen eines Polykations weithin als ein Test verwendet worden, um den Punkt zu bestimmen, bei welchem vollständige DNA-Ladungsneutralisierung erreicht wird (Putnam et al. Macromolecules 32: 3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122: 6524-6525, 2000; Gonzalez et al. Bioconjugate Chem. 10: 1068-1074, 1999).
  • Wie oben erwähnt sind die Hydrochloridsalze von Polymeren 1-3 in Wasser löslich. Jedoch sind Polymere 2 und 3 bei pH 7,2 über die volle Bandbreite von gewünschten Polymerkonzentrationen nicht vollständig löslich. Daher wurden DNA/Polymer-Komplexe in MES-Puffer (25 mM, pH = 6,0) hergestellt. DNA/Polymer-Komplexe wurden durch Zugeben einer wässerigen Lösung von DNA zu wirbelnden Lösungen von Polymer in MES bei gewünschten DNA/Polymer-Konzentrationen hergestellt (siehe experimenteller Abschnitt). Die sich ergebenden DNA/Polymer-Komplexe blieben bei Verdünnung im Elektrophorese Betriebspuffer (20 mM HEPES, pH = 7,2) löslich und Daten wurden bei physiologischem pH erhalten. Als repräsentatives Beispiel skizziert 3 die Wanderung von Plasmid-DNA (pCMV-Luc) auf einem Agarosegel in der Gegenwart von steigenden Konzentrationen von Polymer 1.
  • Wie in 3 gezeigt beginnt Verzögerung von DNA-Migration bei so niedrigen DNA/1-Verhältnissen wie 1:0,5 (Gew./Gew.) und Migration ist bei DNA/Polymer-Verhältnissen über 1:1,0 (Gew./Gew.) vollständig verzögert (DNA/Polymer-Gewichtsverhältnisse werden hier eher als DNA/Polymer-Ladungsverhältnisse angegeben. Obwohl beide Konventionen in der Literatur verwendet werden, finden wir Gewichtsverhältnisse praktischer und universeller, da die Gesamtladung an einem Polyamin Umgebungsvariationen im pH und der Temperatur unterworfen ist. Während DNA/Polymer-Ladungsverhältnisse für Polymere wie Poly(lysin) deskriptiv sind, sind sie für Polymere wie PEI und 1-3 weniger bedeutungsvoll, welche weniger basische Amine einschließen). Polymere 2 und 3 hemmen die Migration von Plasmid-DNA bei DNA/Polymer-Verhältnissen (Gew./Gew.) über 1:10, beziehungsweise 1:1,5 vollständig (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse variieren deutlich von Gelverzögerungsversuchen welche unter Verwendung von Modell „Monomeren" durchgeführt wurden. Da die echten Monomere und die Degradationsprodukte von Polymeren 1-3 nicht angemessen die Wiederholungseinheiten der Polymere repräsentieren, verwendeten wir Bis(methylester) 4b-6b, um das Ausmaß zu untersuchen, bis zu welchem die Polyvalenz und co-operative Bindung von Polykationen 1-3 notwendig ist, um DNA-Immobilisierung zu erreichen. „Monomere" 4b-6b hemmten nicht die Migration von DNA bei DNA/"Monomer"-Verhältnissen (Gew./Gew.) von bis zu 1:30 (Daten nicht gezeigt).
  • Die Gründe für die weniger wirksame Komplexation unter Einsatz von Polymer 2 in den obigen Gel-Elektrophoresetests ergeben sich sehr wahrscheinlich aus Unterschieden in den pKa-Werten der Amine in diesen Polymeren. Die direkte Messung der pKa-Werte von Polymeren 1-3 ist durch ihre Degradabilität kompliziert. Jedoch sagen wir die Bandbreite von pKa-Werten der Amine in den Polymeren 1 und 2 so voraus, dass sie sich von annähernd 4,5 und 8,0 für Polymer 1 bis 3,0 und 7,0 für Polymer 2 erstrecken, basierend auf Vergleichen von strukturell verwandten Poly(β-aminoamiden) (Die pKa-Werte von strukturell verwandten Poly(β-aminoamiden), welche Piperazin und Dimethylethylendiamin-Einheiten in ihren Grundgerüsten enthalten, sind berichtet worden. Barbucci et al. Polymer 21: 81-85; 1980; Barbucci et al. Polymer 19: 1329-1334, 1978; Barbucci et al. Macromolecules 14: 1203-1209, 1981).
  • Als Ergebnis sollte Polymer 2 zu einem geringeren Ausmaß als Polymer 1 bei physiologischem oder nahe neutralem pH protoniert sein und wäre daher ein weniger wirksamer DNA kondensierender Wirkstoff. Die Bandbreite von pKa-Werten für Polymer 3 sollte höher sein, als die Bandbreite für Polymere 1 und 2, als Folge der erhöhten Distanz zwischen den Stickstoffatomen. Demgemäß bildet Polymer 3 Komplexe mit DNA bei wesentlich verringerten Konzen trationen bezogen auf Polymer 2.
  • Agarosegel-Verzögerungstests sind beim Bestimmen des Ausmaßes brauchbar, bis zu welchem Polykationen mit DNA interagieren. Um brauchbare Transfektionsmittel zu sein, müssen Polykationen jedoch ebenfalls in der Lage sein, Plasmid-DNA in Polymer/DNA-Komplexe selbstzumontieren, welche klein genug sind, um eine Zelle durch Endocytose zu betreten. Für die meisten Zelltpyen liegt dieses Größenerfordernis in der Größenordnung von 200 nm oder weniger (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30: 97-113, 1998), obwohl größere Partikel ebenfalls beherbergt werden können (Demeneix et al., in Artificial Self-Assembling-Systems for Gene Delivery (Felgner et al., Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, pp. 146-151; Kabanov et al., in Self-Assembling Complexes for Gene Delivery; From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998).
  • Die Fähigkeit von Polymeren 1-3, Plasmid-DNA in Nanometergroße Strukturen zu komprimieren, wurde durch quasi-elastische Laser-Lichtstreuung (QELS) bestimmt, und die relative Oberflächenladungen der sich ergebenden Komplexe wurden durch ζ-Potentialmessungen quantifiziert. DNA/Polymer-Partikel, welche für Partikelklassifizierung und ζ-Potentialmessungen verwendet wurden, wurden wie oben für Agarosegel-Elektrophoresetests beschrieben gebildet und in 20 mM HEPES-Puffer (pH = 7,0) für Analyse wie im experimentellen Abschnitt beschrieben verdünnt.
  • Polymer 1 bildete Komplexe mit Durchmessern im Bereich von 90-150 nm bei DNA/Polymer-Verhältnissen über 1:2 (Gew./Gew.) und Polymer 2 kondensierte DNA in Partikel in der Größenordnung von 60-125 nm bei DNA/Polymer-Verhältnissen über 1:10. Diese Ergebnisse stehen mit den Daten in Einklang, welche von Agarosegel-Elektrophoreseversuchen oben erhalten wurden. Jedoch ballten sich die Partikel in diesen Versuchen über einen Zeitraum von Stunden zusammen, um größere Komplexe mit Durchmessern im Bereich von 1-2 Mikron zu ergeben. Die Neigung dieser Partikel, sich zusammenzuballen, kann durch die niedrigen ζ-Potentiale der DNA/Polymer-Partikel rationalisiert werden, welche unter diesen Bedingungen beobachtet wurden. Zum Beispiel hatten die aus Polymer 1 gebildeten Komplexe bei DNA/Polymer-Verhältnissen über 1:10 durchschnittliche ζ-Potentiale von +4,51 (±0,50) mV. Die ζ-Potentiale von Komplexen, gebildet aus Polymer 2 bei DNA/Polymer-Verhält nissen über 1:20, waren niedriger und erreichten einen Grenzwert von +1,04 (±0,57) mV. Diese Unterschiede korrelieren mit den geschätzten pKa-Werten für diese Polymere, da von den Oberflächen der aus Polymer 1 gebildeten Partikel erwartet würde, dass sie leicht mehr protoniert sind, als aus Polymer 2 gebildete Partikel, bei pH = 7,0.
  • Polymer 3 bildete Komplexe mit Durchmessern im Bereich von 50-150 nm bei DNA/Polymer-Verhältnissen über 1:2. Als repräsentatives Beispiel zeigt 4 die durchschnittlichen wirksamen Durchmesser von Partikeln, gebildet mit Polymer 3, als eine Funktion von Polymerkonzentration. Die Durchmesser der Partikel variierten innerhalb der obigen Bandbreite von Versuch zu Versuch unter ansonsten identischen Bedingungen, möglicherweise als Folge von subtilen Unterschieden während des Rührens oder der Zugabe von DNA-Lösungen während Komplexbildung (Die Reihenfolge der Zugabe von Polymer und DNA-Lösungen hatte beträchtliche Auswirkung auf die Natur der sich ergebenden DNA/Polymer-Komplexe. Um kleine Partikel zu bilden, war es zum Beispiel notwendig, die DNA-Lösung in eine wirbelnde Lösung aus Polymer zu geben. In Fällen, in welchen Polymerlösungen zu DNA zugegeben wurden, wurden nur große, Mikron-große Aggregate beobachtet. Somit ist es möglich, dass subtile Unterschiede beim Rühren oder der Rate der Zugabe für Variationen in der Partikelgröße verantwortlich sein könnten). Die ζ-Potentiale für aus Polymer 3 gebildete Komplexe waren in der Größenordnung von +10 bis +15 mV bei DNA/Polymer-Verhältnissen über 1:1, und die Komplexe ballten sich nicht umfangreich über einen Zeitraum von 18 Stunden zusammen (pH = 7,25 °C). Die positiven ζ-Potentiale dieser Komplexe können signifikant jenseits des Kontextes von Partikelstabilität sein, da netto positive Ladungen an Partikeloberflächen eine Rolle beim Auslösen von Endocytose spielen können (Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6: 7-20, 1995; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122: 6524-6525, 2000; Behr Chimia 51: 34-36, 1997; Demeneix et al., in Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, pp. 146-151; Kabanov et al., in Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998).
  • Aus Polymer 3 gebildete Partikel werden bei 37°C ebenfalls relativ stabil. Zum Beispiel wurde eine Probe von DNA/3 (DNA/3 = 1:5, durchschnittlicher Durchmesser = 83 nm) bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Nach 4 Sunden wurde eine bimodale Verteilung beobachtet, bestehend aus einer Fraktion von durchschnittlich 78 nm (> 98% nach Anzahl, 70% nach Volumen) und einer Fraktion von größeren Aggregaten mit durchschnittlichen Durchmessern von annähernd 2,6 Mikron. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Degradation von aus Polymer 3 gebildeten Komplexen langsamer stattfand, als die Degradation von Polymer in Lösung, oder dass teilweise Degradation die Stabilität der Partikel nicht signifikant beeinflusste. Die offensichtlich erhöhte Stabilität von DNA/Polymer-Komplexen, gebildet aus abbaubaren Polykationen, bezogen auf die Degradation der Polymere in Lösung, ist ebenfalls für DNA/Polymer-Komplexe, gebildet aus Poly(4-hydroxy-L-prolinester) beobachtet worden (Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999).
  • Die Partikelgröße und ζ-Potential Daten in 4 und 5 stehen in Einklang mit Modellen von DNA-Kondensation, beobachtet bei anderen Polykationen (Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6: 7-20, 1995); Putnam et al. Macromolecules 32: 3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122: 6524-6525, 2000; Gonzalez et al. Bioconjugate Chem. 10: 1068-1074, 1999).
  • DNA wird in kleine, negativ geladene Partikel bei sehr niedrigen Polymerkonzentrationen komprimiert und Partikelgrößen steigen mit steigender Polymerkonzentration (Genaue Lichtstreuungsdaten konnten für DNA allein oder für mit DNA/Polymer verbundene Arten bei DNA/Polymer-Verhältnissen kleiner als 1:0,5 nicht erhalten werden, da flexible, unkondensierte DNA Licht nicht so umfangreich streut, wie komprimierte DNA (Kabanov et al., in Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998).
  • Komplexe erreichen einen maximalen Durchmesser wenn Ladungsneutralität erreicht wird und Aggregation stattfindet. Partikelgrößen verringern sich heftig bei DNA/Polymer-Konzentrationen über Ladungsneutralität bis zu Verhältnissen, bei welchen zusätzliches Polymer nicht zu einer Verringerung des Partikeldurchmessers beiträgt. Dieses Modell wird durch ζ-Potential Messungen bestätigt, durchgeführt an aus diesen Polymeren gebildeten Komplexen. Wie in 5 gezeigt, waren die ζ-Potentiale von aus Poly mer 3 gebildeten Polymer/DNA-Partikeln bei niedrigen Polymerkonzentrationen negativ und Ladungsneutralität wurde nahe DNA/Polymer-Verhältnissen von 1:0,75 erreicht, was umfangreiche Aggregation ergab. Die ζ-Potentiale der Partikel näherten sich einem Grenzwert im Bereich von +10 bis +15 mV bei DNA/Polymer-Verhältnissen über 1:2 an.
  • Die durchschnittlichen Durchmesser der oben beschriebenen Komplexe fallen in die allgemeinen Größenanforderungen für zelluläre Endocytose. Wir haben Transfektionsversuche initiiert, welche die NIH 3T3 Zelllinie und das Luciferase-Reportergen (pCMV-Luc) einsetzen. Bislang haben Polymere 1 und 2 keine Transfektionswirksamkeit in anfänglichen Screeningtests gezeigt. Im Gegensatz dazu hat Polymer 3 Transfektionseffizienzen gezeigt, welche jene von PEI unter bestimmten Bedingungen übersteigen. Transfektionsversuche wurden gemäß dem folgenden allgemeinen Protokoll durchgeführt: Zellen wurden in 6-Mulden-Platten bei einer anfänglichen Saatdichte von 100000 Zellen/Mulde in 2 ml Wachstumsmedium wachsen gelassen. Zellen wurden für 24 Stunden wachsen gelassen, wonach das Wachstumsmedium entfernt und mit 2 ml Serum-freiem Medium ersetzt wurde. DNA/Polymer-Komplexe wurden wie im experimentellen Abschnitt beschrieben gebildet (2 μg DNA, DNA/3 = 1:2 (Gew./Gew.), 100 μl in MES (pH = 6,0)] und zu jeder Mulde zugegeben. DNA/PEI-Komplexe wurden bei einem Gewichtsverhältnis von 1:0,75 gebildet, ein Verhältnis, von welchem im Allgemeinen in unserem Labor gefunden wurde, dass es für PEI-Transfektionen optimal ist. Transfektionen wurden in Serum-freiem Medium für 4 Stunden durchgeführt, wonach Medium für 20 zusätzliche Stunden mit Wachstumsmedium ersetzt wurde. Relative Transfektionseffizienzen wurden unter Verwendung von Luciferase (Promega) und Zellproteintest (Pierce) Kits bestimmt. Die Ergebnisse werden als relative Lichteinheiten (RLU) pro mg von Gesamtzellprotein ausgedrückt: für Komplexe von Polymer 3, 1,07 (± 0,43) × 106 RLU/mg; für PEI-Komplexe, 8,07 (± 0,16) × 105 RLU/mg). Es wurde keine Luciferaseexpression für Kontrollversuche nachgewiesen, welche nackte DNA einsetzten oder in Abwesenheit von DNA durchgeführt wurden. Diese Transfektionsdaten sind die Ergebnisse von anfänglichen Screeningversuchen. Diese Daten legen nahe, dass Polymere dieser allgemeinen Struktur als synthetische Vektoren für Genabgaben vielversprechend sind und interessante Kandidaten für wei tere Untersuchung sind. Die relative Wirksamkeit von Polymer 3 bezogen auf PEI ist interessant, da unsere anfänglichen Screeningversuche in Abwesenheit von Chloroquin durchgeführt wurden und Polymer 3 gegenwärtig keine offensichtliche Mittel zum Erleichtern von endosomaler Ausschleusung einschließt. Es sollte jedoch vermerkt werden, dass die pKa-Werte der Amine in diesen Polymeren „eingestellt" werden können, um direkter in die Bandbreite von physiologisch relevantem pH unter Verwendung dieser modularen synthetischen Herangehensweise zu fallen. Daher wird es möglich sein, den „Protonenschwamm"-Charakter (Behr Chimia 51: 34-36, 1997; Demeneix et al., in Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, pp. 146-151; Kabanov et al., in Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998) dieser Polymere weiter zu konstruieren, und somit ihre Transfektionswirksamkeiten direkt durch den Einschluss von oder Co-Polymerisation mit unterschiedlichen Diaurin-Monomeren zu verstärken.
  • Zusammenfassung
  • Es wird von einer allgemeinen Strategie für die Herstellung von neuartigen, abbaubaren, polymeren DNA-Trans fektionsvektoren berichtet. Poly(β-aminoester) 1-3 wurden durch die Konjugataddition von N,N'-Dimethylethylendiamin, Piperazin und 4,4'-Trimethylendipiperidin an 1,4-Butandioldiacrylat synthetisiert. Die Amine in den Bis(sekundäres Amin)-Monomeren nehmen aktiv an bindungsbildenden Prozessen während der Polymerisation teil und umgehen den Bedarf für Aminschutz/Entschützungsverfahren, welche die Synthese von anderen Poly(aminoestern) kennzeichnen. Demgemäß ermöglicht diese Herangehensweise die Erzeugung einer Vielfalt von strukturell unterschiedlichen Polyestern, welche tertiäre Amine in ihren Grundgerüsten enthalten, in einem einzelnen Schritt aus kommerziell erhältlichen Ausgangsmaterialien. Polymere 1-3 zerfielen hydrolytisch in sauren und alkalischen Medien, um 1,4-Butandiol und β-Aminosäuren 4a-6a zu ergeben, und die Kinetik der Degradation wurde bei pH 5,1 und 7,4 untersucht. Die Polymere zerfielen schneller bei pH 7,4, als bei pH 5,1, was in Einklang mit den pH/Degradationsprofilen steht, welche für andere Poly(aminoester) berichtet wurden. Ein anfänglicher Screeningtest, entworfen, um die Wirkungen von Polymeren 1-3 auf Zell wachstum und Metabolismus zu bestimmen, wies darauf hin, dass diese Polymere und ihre hydrolytischen Degradationsprodukte nicht-cytotoxisch bezogen auf PEI waren, einem nicht-abbaubaren kationischen Polymer, welches herkömmlicherweise als Transfektionsvektor eingesetzt wird.
  • Polymere 1-3 interagierten elektrostatisch mit Plasmid-DNA bei physiologischem pH, initiieren Selbstmontageprozesse, die DNA/Polymer-Komplexe im Nanometer-Maßstab ergaben. Agarosegel-Elektrophorese, quasi-elastische dynamische Lichtstreuung (QELS) und Zeta-Potentialmessungen wurden verwendet, um das Ausmaß der Interaktionen zwischen den gegensätzlich geladenen Polyelektrolyten zu bestimmen. Von allen drei Polymeren wurde gefunden, dass sie DNA in lösliche DNA/Polymer-Partikel in der Größenordnung von 50-200 nm kondensieren. Aus Polymeren 1 und 2 gebildete Partikel ballten sich umfangreich zusammen, während aus Polymer 3 gebildete Partikel positive ζ-Potentiale (z.B. +10 bis +15 mV) aufwiesen und sich für bis zu 18 Stunden nicht zusammenballten. Die Ausmaße in Nanometer-Größe und verringerten Cytotoxizitäten dieser DNA/Polymer-Komplexe legen nahe, dass Polymere 1-3 als abbaubare polymere Gentransfektionsvektoren brauchbar sein können. Ein gründliches Verständnis von Struktur/Wirksamkeit-Beziehungen, welche für diese Polymerklasse bestehen, wird den Entwurf von sicheren Polymer-basierten Alternativen zu viralen Transfektionsvektoren für Gentherapie beschleunigen.
  • Beispiel 2 – Schnelle, pH-getriggerte Abgabe von biologisch abbaubaren Poly(β-aminoester)-Mikrokugeln innerhalb der Bandbreite von intrazellulärem pH
  • Experimenteller Abschnitt
  • Herstellung von Mikrokugeln. Das optimierte Verfahren für die Herstellung von Mikrokugeln wurde auf die folgende allgemeine Weise durchgeführt: Eine wässerige Lösung aus Rhodamin-konjugiertem Dextran (200 μl einer 10 μg/μl Lösung, Mn ~ 70 kD) wurde in einer Lösung aus Poly-1 in CH2Cl2 (200 mg Poly-1 in 4 ml CH2Cl2, Mn ~ 10 kD) suspendiert und das Gemisch wurde für 10 Sekunden beschallt, um eine primäre Emulsion zu bilden. Die getrübte, rosafarbene Emulsion wurde direkt zu einer schnell homogenisierten (5000 U/Min.) Lösung aus Poly(vinylalkohol) [50 ml, 1% PVA (Gew./Gew.)] zugegeben, um die sekundäre Emulsion zu bilden. Die sekundäre Emulsion wurde für 30 Sekunden homogenisiert, bevor sie zu einer zweiten wässerigen PVA-Lösung [100 ml, 0,5% PVA (Gew./Gew.)] zugegeben wurde. Direkte Analyse der Mikrokugel-Suspension unter Verwendung eines Coulter Mikropartikel-Analysators offenbarte eine mittlere Partikelgröße von annähernd 5 Mikrometern. Die sekundäre Emulsion wurde für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, auf einen kalten Raum (4°C) übertragen und für zusätzliche 30 Minuten gerührt. Mikrokugeln wurden bei 4°C durch Zentrifugation isoliert, in kaltem Wasser resuspendiert und wieder zentrifugiert, um überschüssiges PVA zu entfernen. Die Kugeln wurden in Wasser (15 ml) resuspendiert und lyophilisiert, um ein rosafarbenes, flockiges Pulver zu ergeben. Kennzeichnung der lyophilisierten Mikrokugeln wurde durch optische, fluoreszierende und scannende Elektronenmikroskopien wie beschrieben durchgeführt. Zeta-Potential wurde unter Verwendung eines Brookhaven Instruments ZetaPALS Analysators bestimmt.
  • Diskussion
  • Von biologisch abbaubaren Polymeren gebildete Mikropartikel sind attraktiv für die Verwendung als Abgabevorrichtungen und eine Vielfalt an Polymer-basierten Mikrokugeln ist für die Depotabgabe von therapeutischen Verbindungen eingesetzt worden (Anderson Nature 392 (Beil.): 25-30, 1996; Friedman Nature Med. 2: 144-147, 1996; Crystal Science 270: 404-410, 1995; Mulligan Science 260: 926-932, 1993; Luo et al. Nat. Biotechnol. 18: 33-37, 2000; Behr Acc. Chem. Res. 26: 274-278, 1993).
  • Jedoch gibt es für auf kleinen Molekülen, Protein und DNA basierende Therapeutika, die intrazelluläre Verabreichung und Verkehr zum Cytoplasma erfordern, einen steigenden Bedarf an neuen Materialien, die getriggerte Abgabe als Antwort auf Umgebungsstimuli wie pH erleichtern (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30: 97-113, 1998).
  • Nach Endocytose wird der pH innerhalb der zellulären, endosomalen Kammern gesenkt und fremdes Material wird bei Fusion mit lysosomalen Bläschen abgebaut (Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6: 7-20, 1995).
  • Neue Materialien, die molekulare Nutzlasten bei Veränderungen im pH innerhalb der intrazellulären Bandbreite abgeben und Ausschleusung von feindlichen intrazellulären Umgebungen erleichtern könnten eine fundamentale und weit reichende Auswirkung auf die Verabreichung von hydrolytisch- und/oder enzymatisch-labilen Arzneien haben (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30: 97-113, 1998; Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6: 7-20, 1995).
  • Hierin wird von der Herstellung von pH-responsiven Polymer-Mikrokugeln berichtet, die eingekapselte Inhalte quantitativ und im Wesentlichen unverzüglich bei Veränderungen im pH innerhalb der interzellulären Bandbreite abgeben.
  • Die Synthese von Poly(β-aminoester) 1 ist oben in Beispiel 1 beschrieben worden (Miller Angew. Chem. Int. Ed. 37: 1768-1785, 1998; Hope et al. Molecular Membrane Technology 15: 1-14, 1998; Deshmukh et al. New J. Chem. 21: 113-124, 1997).
  • Poly-1 ist hydrolytisch abbaubar, war in anfänglichen Screeningtests nicht-toxisch und wird gegenwärtig als ein synthetischer Vektor für DNA-Abgabe in Gentherapieanwendungen untersucht. Die Löslichkeit des Polymers in wässerigen Medien wird direkt durch Lösungs-pH beeinflusst. Insbesondere das feste, unprotonierte Polymer ist in wässerigen Medien in der pH-Bandbreite 7,0 bis 7,4 unlöslich und der Übergang zwischen Löslichkeit und Unlöslichkeit findet bei einem pH um 6,5 herum statt. Basierend auf den Unterschieden zwischen extrazellulärem und endosomalem pH (7,4 beziehungsweise 5,0-6,5) hypothetisierten wir, dass aus Poly-1 gebildete Mikrokugeln für die Einkapselung und getriggerte Abgabe von Verbindungen innerhalb der Bandbreite von intrazellulärem pH brauchbar sein könnten.
  • Die Einkapselung von therapeutischen Verbindungen innerhalb von Polymer-Mikrokugeln wird häufig unter Einsatz eines Doppelemulsionsverfahrens erreicht (O'Donnell et al. Adv. Drug Delivery Rev. 28: 25-42, 1997). Das Doppelemulsionsverfahren ist für die Herstellung von Mikrokugeln aus hydrophoben Polymeren wie Poly(milch-co-glycolsäure) PLGA), einem biologisch abbaubaren Polymer, welches üblicherweise in der Entwicklung von Arzneiabgabevorrichtungen eingesetzt wird, gut etabliert (Anderson et al. Adv. Drug Delivery Rev. 28: 5-24, 1997; Okada Adv. Drug Delivery Rev. 28: 43-70, 1997). Vorhergehende Versuche zeigten die Durchführbarkeit des Doppelemulsionsverfahrens für die Einkapselung von wasserlöslichen Verbindungen unter Verwendung von Poly-1. Rhodamin-konjugiertes Dextran wurde aus mehreren Gründen als Modell für nachfolgende Einkapselung und Abgabestudien gewählt: 1) Rhodamin ist fluoreszierend, was es ermöglicht, Ladung- und Abga beprofile durch Fluoreszenzspektroskopie zu bestimmen, 2) geladene Mikrokugeln könnten direkt durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet werden und 3) die Fluoreszenzintensität von Rhodamin ist durch den pH innerhalb der physiologischen Bandbreite relativ unbeeinträchtigt (Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6. Auf 1., Molecular Probes, Inc., 1996, p. 29).
  • Mikrokugeln-einkapselndes markiertes Dextran wurde aus Poly-1 hergestellt und mit aus PLGA gebildeten Kontrollen verglichen. Die Größenverteilungen von aus Poly-1 gebildeten Mikrokugeln korrelierten gut mit den Verteilungen von PLGA-Mikrokugeln innerhalb der Bandbreite von 5-30 um. Die durchschnittlichen Partikelgrößen konnten durch Variationen der experimentellen Parameter wie Homogenisierungsraten und wässeriges/organisches Lösungsmittel-Verhältnisse kontrolliert werden. (O'Donnell et al. Adv. Drug Delivery Rev. 28: 25-42, 1997).
  • Im Gegensatz zu PLGA-Mikrokugeln ballten sich jedoch aus Poly-1 gebildete Kugeln umfangreich während der Zentrifugations- und Waschschritte zusammen (siehe experimenteller Abschnitt oben). Bei pH 7,4 resuspendierte Mikrokugeln bestanden primär aus großen Aggregaten und Scanning-Elektronenmikroskopie (SEM) Abbildungen offenbarten Cluster von Kugeln, die physikalisch verbunden oder „verschweißt" schienen (Daten nicht gezeigt).
  • Es wurde gefunden, dass Aggregation beseitigt werden konnte, wenn Zentrifugation und Waschen bei verringerten Temperaturen (4°C) durchgeführt wurden, vermutlich wegen der Verhärtung der Polymerkugeln bei dieser niedrigeren Temperatur. SEM-Abbildungen von Dextran-geladenen Poly-1 Mikrokugeln, hergestellt in der 8-10 μm Bandbreite, offenbarten signifikante Brüche und die Bildung von großen Löchern in ihren Oberflächen. Mikrokugeln, welche in der Bandbreite von 4-6 μm anvisiert wurden, waren jedoch im Wesentlichen frei von Brüchen, Löchern und anderen Defekten (6). Für nachfolgende Abgabeversuche formulierte Mikrokugeln wurden in der kleineren (< 6 μm) Bandbreite hergestellt. Einkapselungseffizienzen für geladene Poly-1 Mikrokugeln, bestimmt durch Lösen der Kugeln bei pH 5,1 und Messen von Fluoreszenzintensität, waren so hoch wie 53%.
  • Suspensionen aus getrockneten Poly-1 Mikrokugeln bei pH = 7,4 bestanden primär aus einzelnen, isolierten Mikrokugeln, wie durch optische und Fluoreszenz-Mikroskopie bestimmt (8a).
  • Das Zeta-Potential (ζ) von Mikropartikelsuspensionen von Poly-1 Mikrokugeln bei pH 7 war +3,75 (± 0,62) mV, was nahelegte, dass die Oberflächen der Mikrokugeln eine insgesamt positive Ladung bei physiologischem pH tragen. Dieses könnte zum Ausrichten dieser Mikrokugeln für zelluläre Aufnahme relevant sein, weil netto positive Ladungen an Partikeloberflächen eine Rolle beim Triggern von Endocytose spielen können (Zauner et al. Adv. Drug Delivery Rev. 30: 97-113, 1998).
  • Poly-1 Mikrokugeln, suspendiert bei pH 7,4, blieben gegenüber Aggregation und Degradation für mehrere Wochen stabil (durch visuelle Inspektion), aber die Mikrokugeln lösten sich sofort, wenn der pH des suspendierenden Mediums auf zwischen 5,1 und 6,5 gesenkt wurde.
  • Figure 00830001
  • Die Abgabe von markiertem Dextran aus Poly-1 Mikrokugeln. wurde durch Fluoreszenzmikroskopie quantitativ bestimmt (7). Das Abgabeprofil bei pH 7,4 war durch einen kleinen anfänglichen Burst in Fluoreszenz gekennzeichnet (7-8%), welcher einen Grenzwert von etwa 15% nach 48 Stunden erreichte. Dieser Versuch zeigte, dass die Degradation von Poly-1 unter diesen Bedingungen relativ langsam war und dass mehr als 90% von eingekapseltem Material für geeignet lange Zeiträume bei physiologischem pH in der Polymermatrix zurückgehalten werden konnten.
  • Um die Anwendung von Poly-1 Mikrokugeln für die getriggerte Abgabe von eingekapselten Arzneien im endosomalen pH-Bereich zu untersuchen, führten wir ein ähnliches Experiment durch, in welchem der pH des Suspensionsmediums während des Verlaufs des Experiments von 7,4 auf 5,1 verändert wurde. Wie in 7 gezeigt, lösten sich die Mikrosphären schnell, wenn der Suspensionspuffer mit Acetatpuffer (0,1 M, pH = 5,1) ausgetauscht wurde, was im Wesentlichen eine sofortige und quantitative Abgabe des in den Polymermatrizen verbleibenden markierten Dextran ergab. In scharfem Gegensatz dazu erhöhte sich die Abgabe von Dextrangeladenen PLGA-Mikrokugeln nicht für bis zu 24 Stunden nachdem der pH des Suspensionsmediums gesenkt worden war (7). 8 zeigt Fluoreszenzmikroskopie-Abbildungen von (a) einer Probe von Dextran-geladenen Mikrokugeln bei pH 7,4; und (b) eine Probe, zu welcher ein Tropfen Acetatpuffer an der oberen rechten Ecke des Mikroskop-Deckglases zugegeben wurde. Die schnelle Abgabe von Rhodamin-konjugiertem Dextran wurde als Streifen visualisiert, welcher sich von den sich lösenden Mikrokugeln in die Richtung der Diffusion von zugegebener Säure und einem Gesamtanstieg der Hintergrundfluoreszenz erstreckte (verstrichene Zeit ∼ 5 Sekunden).
  • Wenn therapeutische Verbindungen auf intrazelluläre Abgabe durch Endocytose oder Phagocytose ausgerichtet werden, ist es nicht nur wichtig, ein Mittel in Erwägung zu ziehen, durch welches die Arznei von ihrem Träger abgegeben werden kann, sondern auch ein Mittel, durch welches die Arznei aus endosomalen Kammern ausgeschleust werden kann, bevor sie zu lysosomalen Bläschen geführt wird. (Luo et al. Nat. Biotechnol. 18: 33-37, 2000; Zauner et al. Adv. Drug Delivery Rev. 30: 97-113, 1998).
  • Eine Strategie, endosomales Ausschleusen zu erleichtern, ist der Einschluss von schwachen Basen oder „Protonenschwämmen", von welchen angenommen wird, dass sie die saure Umgebung innerhalb eines Endosoms Puffern und endosomale Membranen durch Erhöhen des inneren Osmosedrucks innerhalb der Bläschen zerreißen (Demeneix et al., in Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., Hrsg.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, pp. 146-151).
  • Poly-1 Mikrokugeln sind in der Lage, eingekapseltes Material in der endosomalen pH-Bandbreite durch einen Mechanismus (Lösung) abzugeben, der die Protonierung von Aminen in der Polymermatrix einbezieht. Somit können zusätzlich zur schnellen Abgabe von Arznei Poly-1 Mikrokugeln ebenfalls ein Membran-zerreißendes Mittel für endosomales Ausschleusen vorsehen, was Wirksamkeit durch Verlängern der Lebenszeiten von hydrolytisch instabilen Arzneien verstärkt, welche in der Polymermatrix enthalten sind.
  • Aus Poly-1 hergestellte Mikrokugeln können eine wichtige Zugabe zum Arsenal von pH-responsiven Materialien darstellen, welche für intrazelluläre Arzneiabgabe verwendet werden, wie pH-responsive Polymer/Liposom-Formulierungen (Gerasimov et al. Adv. Drug Delivery Rev. 38: 317-338, 1999; Linhart et al. Langmuir 16: 122-127, 2000; Linhardt et al. Macromolecules 32: 4457-4459, 1999).
  • Im Gegensatz zu vielen liposomalen Formulierungen sind polymere Mikrokugeln physikalisch robust und können für verlängerte Zeiträume ohne Verformung, Zerfall oder Degradation getrocknet gelagert werden (Okada Adv. Drug Delivery Rev. 28: 43-70, 1997; hierin durch Verweis eingeschlossen) – eine wichtige Erwägung für die Formulierung und Verpackung von neuen therapeutischen Abgabesystemen. Die in dieser gegenwärtigen Studie untersuchten Mikrokugeln fallen in die Größenbandbreite von Partikeln, welche üblicherweise verwendet werden, um auf Abgabe an Makrophagen zu zielen (Hanes et al. Adv. Drug Delivery Rev. 28: 97-119, 1997).
  • Die schnellen pH-Abgabeprofile für die oben beschriebenen Poly-1 Mikrokugeln können daher im Entwurf von neuen DNA-basierten Impfstoffen brauchbar sein, welche gegenwärtig PLGA als Einkapselungsmaterial einsetzen (Singh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 811-816, 2000; Ando et al. J. Pharm. Sci. 88: 126-130, 1999; Hedley et al. Nat. Med. 4: 365-368, 1998).
  • Beispiel 3 – Beschleunigte Entdeckung von synthetischen Transfektionsvektoren: Parallele Synthese und Screening einer abbau baren Polymer-Bibliothek
  • Einführung
  • Die sichere und effiziente Abgabe von therapeutischer DNA an Zellen stellt ein grundlegendes Hindernis für den klinischen Erfolg von Gentherapie dar (Luo et al. Nat. Biotechnol. 18: 33-37, 2000; Anderson Nature 392 Beil.: 25-30, 1996; von welchen jede hierin durch Verweis eingeschlossen ist). Die Herausforderungen, welche synthetischen Abgabevektoren gegenüberstehen, sind besonders klar, da sowohl kationische Polymere, als auch Liposome beim Vermitteln von Gentransfer weniger wirksam sind als virale Vektoren. Der Einschluss von neuen Entwurfskriterien hat zu kürzlichen Vorstößen zu funktionalen Abgabesystemen geführt (Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 123: 2460-2461, 2001; Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122: 6524-6525, 2000; Hwang et al. Bioconjugate Chem. 12: 280-290, 2001; Putnam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1200-1205, 2001; Benns et al. Bioconjugate Chem. 11: 637-645, 2000; Midoux et al. Bioconjugate Chem. 10: 406-411, 1999).
  • Jedoch bleibt das Paradigma für die Entwicklung von polymeren Genabgabevektoren der Einschluss dieser Entwurfselemente in Materialien als Teil eines iterativen, linearen Prozesses – einer wirksamen, wenngleich langsamen Herangehensweise für die Entdeckung von neuen Vektoren. Hierin berichten wir von einer parallelen Herangehensweise, welche für die Synthese von großen Bibliotheken von abbaubaren kationischen Polymeren und Oligomeren und die Entdeckung von neuen synthetischen Vektorfamilien durch schnelle Zell-basierte Screeningtests geeignet ist (für einen Bericht über parallele Synthese und Screening von abbaubaren Polymeren für Gewebetechnik siehe: Brocchini et al. J. Am. Chem. Soc. 119: 4553-4554, 1997).
  • Experimenteller Abschnitt
  • Allgemeine Erwägungen.
  • Alle Manipulationen, welche lebende Zellen oder sterile Materialien einbeziehen, wurden in einer Sterilbank unter Verwendung von sterilen Standardtechniken durchgeführt. Gel-Permeationschromatographie (GPC) wurde unter Verwendung einer Hewlett Packard 1100 Series isokratischen Pumpe, einem Rheodyne Model 7125 Injektor mit einem 100 μl Injektionsloop und zwei PL-Gel gemischten D-Säulen in Folge (5 μm, 300 × 7,5 mm, Polymer Laboratories, Amherst, MA) durchgeführt. THF/0,1 M Piperidin wurde als Eluent bei einer Fließrate von 1,0 ml/Min. verwendet. Daten wurden unter Verwendung eines Optilab DSP interferometrischen Refraktometers (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) gesammelt und unter Verwendung des TriSEC GPC Softwarepakets (Viscotek Corporation, Houston, TX) verarbeitet. Die Molekulargewichte und Polydispersitäten der Polymere werden bezogen auf monodisperse Polystyrol-Standards angegeben.
  • Materialien.
  • Primäres Amin und sekundäres Amin Monomere 1-20 wurden von Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Lancaster (Lancashire, UK), Alfa Aesar Organics (Ward Hill, MA) und Fluka (Milwaukee, WI) erworben. Diacrylat-Monomere A-G wurden von Polysciences, Inc. (Warrington, PA), Alfa Aesar und Scientific Polymer Products, Inc. (Ontario, NY) erworben. Alle Monomere wurden in der höchsten erhältlichen Reinheit (von 97% bis 99+%) erworben und wurden wie erhalten ohne zusätzliche Reinigung verwendet. Plasmid-DNA, welche das Leuchtkäfer Luciferase-Reportergen (pCMV-Luc) enthielt, wurde von Elim Biopharmaceuticals Inc. (San Francisco, CA) erworben und ohne weitere Reinigung verwendet. (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) wurde von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erworben. Affen nieren-Fibroblaste (COS-7 Zellen), welche in Transfektionstests verwendet wurden, wurden von American Type Culture Collection (Manassas, VA) erworben und bei 37°C, 5% CO2 in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, 90% fötalem Rinderserum; 10% Penicillin, 100 Einheiten/ml; Streptomycin, 100 μg/ml wachsen gelassen. Luciferase-Nachweis-Kits, welche in Transfektionstests mit hohem Durchsatz verwendet wurden, wurden von Tropix (Redford, MA) erworben. Alle anderen Materialien und Lösungsmittel wurden wie erhalten ohne zusätzliche Reinigung verwendet.
  • Synthese von Polymer-Bibliothek.
  • Alle 140 Polymerisationsumsetzungen wurden als eine Anordnung von individuell markierten Vialen gemäß dem folgenden allgemeinen Protokoll gleichzeitig durchgeführt. Einzelne Ausnahmen werden vermerkt wo angemessen. Amin-Monomere 1-20 (2,52 mmol) wurden in passend markierte Vialen geladen (wie unten gezeigt): flüssige Monomere wurden unter Verwendung von Mikroliter-Pipetten quantitativ abgemessen und übertragen; feste Monomere wurden direkt in jede Viale eingewogen. Wasserfreies CH2Cl2 (1 ml) wurde zu jeder Viale zugegeben. Ein Äquivalent von flüssigen Diacrylaten A-F (2,52 mmol) wurde zu jeder passenden Umsetzungsviale unter Verwendung einer Mikroliter-Pipette zugegeben und die Viale wurde mit einem mit Teflon ausgekleideten Verschluss fest verschlossen. Ein Äquivalent von halbfestem Diacrylat G wurde zu den passenden Vialen als eine Lösung in CH2Cl2 (2,52 mmol, 1 ml einer 2,52 M Lösung in CH2Cl2) zugegeben und die Vialen wurden fest verschlossen. Eine zusätzliche Aliquote von CH2Cl2 (2 ml) wurde zu den Umsetzungsvialen zugegeben, welche 19 und 20 enthielt, um die Löslichkeit dieser Monomere zu unterstützen. Die fest verschlossenen Vialen wurden in zwei Teströhrengestellen aus Kunststoff angeordnet und an einem Orbitalschüttler in einem 45°C Ofen gesichert. (VORSICHT: Das Erhitzen von verschlossenen Vialen stellt eine mögliche Explosionsgefahr dar. Die Ofentemperatur wurde periodisch für eine Woche vor dem Versuch überwacht, um verlässliche thermische Stabilität sicherzustellen. Es wurde gefunden, dass die Temperaturen während dieses Zeitraums innerhalb von +/– 1°C variieren. Mehrere Testvialen wurden vor Durchführen des größeren Versuchs überwacht). Die Umsetzungsvialen wurden für 5 Tage bei 45°C kräftig geschüttelt und durften auf Raumtemperatur abkühlen. Die Vialen wurden in einen großen Exsikkator platziert und für 1 Tag unter Saug-Vakuum und für 5 zusätzliche Tage unter hohes Vakuum platziert, um vollständige Entfernung von Lösungsmittel sicherzustellen. Die erhaltenen Proben wurden durch GPC (55% der Gesamtbibliothek, siehe Tabelle 2) analysiert und direkt in allen nachfolgenden Screening-Versuchen verwendet.
  • Tabelle 2:
  • GPC Übersicht von 55% der Screening-Bibliothek, welche Molekulargewichte (Mw) und Polydispersitäten (in Klammern gezeigt) zeigen.
    A B C D E F G
    1 5900 (1,93) 4725 (1,89) 5220 (1,95) 1690 (1,74)
    2 6920 (1,87) 6050 (1,78) 5640 (1,85)
    3 6690 (1,79) 6050 (1,78) 2060 (1,76)
    4 7810 (2,49) 5720 (2,20) 9720 (2,49) 7960 (4,08) 7940 (3,25)
    5 10800 (2,75) 5000 (2,50) 15300 (3,17) 17200 (6,91) 15300 (3,92) Unl. 9170 (2,50)
    6 21000 (3,70) 10200 (3,4) 18000 (6,06)
    7 14300 (3,25) 11880 (3,3) 20200 (3,44) 10300 (4,26) 15500 (4,89) 2250 (3,92)
    8 2310 (1,62) 11520 (3,60) 2230 (1,73)
    9 1010 (1,33) 2505 (1,67) 1240 (1,16) Unl.
    10 < 1000 Unl.
    11 6800 (1,91) Unl. 9440 (1,79) 5550 (2,23) 6830 (1,93) 1990 (1,43) 6420 (1,75)
    12 9310 (2,06) 9100 (2,53) 11900 (2,18) 5810 (1,77) 12300 (1,85)
    13 2990 (1,64) 3180 (2,12) 3680 (1,64) 2550 (1,82) 3230 (1,82) 3580 (1,64)
    14 1350 (1,35) 3180 (2,12) 2110 (1,69) 1400 (1,4) 1752 (1,46) 2025 (1,62)
    15 1550 (1,51)
    16 16380 (2,60)
    17 8520 (2,13) 7290 (1,94)
    18 < 1000
    19 12400 (2,28) 18445 (2,17) 39700 (1,90) 17400 (1,93) 14800 (1,98) 13900 (1,86)
    20 16900 (2,40) 46060 (3,29) 49600 (2,25) 30700 (2,72) 18700 (2,72) 17100 (2,22)
  • Bestimmung von Wasserlöslichkeit.
  • Die Löslichkeiten aller Proben wurden gleichzeitig bei einer Konzentration von 2 mg/ml auf die folgende allgemeine Weise bestimmt. Jede Polymerprobe (5 mg) wurde in eine 12 ml Szintillationsviale eingewogen und 2,5 ml Acetatpuffer (25 mM, pH = 5,0) wurden unter Verwendung eines Pipettierers zu jeder Probe zugegeben. Proben wurden bei Raumtemperatur für 1 Stunde kräftig geschüttelt. Jede Probe wurde visuell beobachtet, um Löslichkeit zu bestimmen.
  • Agarosegel-Elektrophoresetest.
  • Der Agarosegel-Elektrophoresetest, welcher verwendet wurde, um die Fähigkeit von Polymeren zu bestimmen, Komplexe mit DNA zu bilden, wurde auf die folgende Weise durchgeführt. Unter Verwendung der in dem obigen Löslichkeitstest hergestellten Lösungen (2 mg/ml in Acetatpuffer, 25 mM, pH = 5,0) wurden Stammlösungen aus den 70 wasserlöslichen Polymeren in einer 96-Mulden Zellkulturplatte angeordnet. DNA/Polymer-Komplexe wurden bei einem Verhältnis von 1:5 (Gew./Gew.) durch Übertragen von 10 μl von jeder Polymerlösung aus der Stammplatte auf eine neue Platte unter Verwendung eines Multikanal-Pipettierers gebildet. Jedes Polymer wurde mit 90 μl Acetatpuffer (25 mM, pH = 5,0, Gesamtvolumen = 100 μl) weiter verdünnt und die Platte wurde für 30 Sekunden auf einem mechanischen Schüttler geschüttelt.
  • Eine wässerige Lösung aus Plasmid-DNA (100 μl einer 0,04 μg/μl Lösung) wurde zu jeder Mulde in der Platte zugegeben und die Lösungen wurden unter Verwendung eines Multikanal-Pipettierers und eines mechanischen Schüttlers kräftig gemischt. Die DNA/Polymer-Komplexe wurden bei einem Verhältnis von 1:20 (Gew./Gew.) auf die gleiche Weise mit den folgenden Ausnahmen gebildet: 40 μl von Polymer-Stammlösung wurden auf eine neue Platte übertragen und mit 60 μl Acetatpuffer (Gesamtvolumen = 100 μl) vor Zugabe der wässerigen DNA-Lösung (100 μl) verdünnt. DNA/Polymer-Komplexe wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert, wonach Proben von jeder Lösung (15 μl) in ein 1% Agarosegel (HEPES, 20 mM, pH = 7,2, 500 ng/ml Ethidiumbromid) unter Verwendung eines Multikanal-Pipettierers geladen wurden. ANMERKUNG: Die Proben wurden mit einem Ladungspuffer, bestehend aus 10% Ficoll 400 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) in HEPES (25 mM, pH = 7,2) auf das Gel geladen. Bromphenol-Blau wurde als visueller Indikator nicht in den Ladungspuffer eingeschlossen, da dieser geladene Farbstoff die Komplexation von Polymer und DNA zu stören schien. Proben wurden gemäß des in 9 gezeigten Musters geladen, so dass Proben entsprechend DNA/Polymer-Verhältnissen von 1:5 und 1:20 in angrenzenden Positionen auf dem Gel getestet wurden. Das Gel wurde bei 90V für 30 Minuten laufen gelassen und DNA-Bänder wurden durch Ethidiumbromid-Färbung visualisiert.
  • Allgemeines Protokoll für Zelltransfektionstests.
  • Transfektionstests wurden dreifach auf die folgende allgemeine Weise durchgeführt. COS-7 Zellen wurden in 96-Mulden-Platten bei einer anfänglichen Saatdichte von 15000 Zellen/Mulde in 200 μl Phenol-Rot freiem Wachstumsmedium (90% Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, 10% fötales Rinderserum, Penicillin 100 Einheiten/ml, Streptomycin 100 μg/ml) wachsen gelassen. Zellen wurden für 24 Stunden in einem Inkubator wachsen gelassen, wonach das Wachstumsmedium entfernt und durch 200 μl Optimem-Medium (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), ergänzt durch HEPES (Gesamtkonzentration = 25 mM) ersetzt wurde. Polymer/DNA-Komplexe, hergestellt aus den 56 vorher identifizierten wasserlöslichen/DNA-komplexierenden Polymeren, wurden wie oben beschrieben bei einem Verhältnis von 1:20 (Gew./Gew.)) unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Plasmids, welches das Leuchtkäfer Luciferase Reportergen (pCMV-Luc) enthält, hergestellt. Ein angemessenes Volumen von jeder Probe wurde unter Verwendung eines Multikanal-Pipettierers zu den Zellen zugegeben (z.B. 15 μl ergaben 300 ng DNA/Mulde; 30 μl ergaben 600 ng DNA/Mulde). Kontrollen unter Einsatz von Poly(ethylenimin) (PEI) und Polylysin, hergestellt bei DNA/Polymer-Verhältnissen von 1:1, wurden auf eine ähnliche Weise hergestellt und mit DNA und kein-DNA Kontrollen eingeschlossen. Kontrollen unter Einsatz von Lipofectamin 2000 (Invitrogen Corp.) wurden bei mehreren Konzentrationen (0,1, 0,2, 0,4 und 0,6 μl) wie in dem technischen Handbuch für dieses Produkt (http://lifetechnologies.com) beschrieben durchgeführt. Zellen wurden für 4 Stunden inkubiert, wonach das Serum-freie Wachstumsmedium entfernt und mit 100 μl Phenol-Rot freiem Wachstumsmedium ersetzt wurde. Zellen wurden für einen zusätzlichen Zeitraum (typischerweise zwischen 36 und 60 Stunden variiert) inkubiert und Luciferase-Expression wurde unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Test-Kits (Tropix, Inc., Redford, MA) bestimmt. Lumineszenz wurde in weißen Polypropylen 96-Mulden-Platten mit festem Boden unter Verwendung eines 96-Mulden Biolumineszenz-Plattenlesers quantifiziert. Lumineszenz wurde in relativen Lichteinheiten ausgedrückt und wurde nicht zu Gesamtzellprotein in diesem Test normalisiert.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Poly(β-aminoester) sind hydrolytisch abbaubar, kondensieren Plasmid-DNA bei physiologischem pH und werden leicht durch die Konjugat-Addition von primären oder sekundären Aminen an Diacrylate (Eq. 1 und 2) synthetisiert (Lynn et al. J. Am. Chem. Soc. 122: 10761-10768, 2000). Ein anfänglicher Screen von Modell-Polymeren identifizierte diese Materialien als potentielle Gen-Träger und zeigte, dass strukturelle Variationen eine signifikante Wirkung auf DNA-Bindung und Transfektionswirksamkeiten haben könnten (Lynn et al. J. Am. Chem. Soc. 122: 10761-10768, 2000).
  • Wir folgerten aus mehreren Gründen, dass diese Herangehensweise einen attraktiven Rahmen für das Ausarbeiten von großen Bibliotheken von strukturell einzigartigen Polymeren vorsieht: 1) Diamin- und Diacrylat-Monomere sind preiswerte, kommerziell erhältliche Ausgangsmaterialien, 2) Polymerisation kann direkt in einem einzelnen synthetischen Schritt erzielt werden und 3) Reinigungsschritte sind im Allgemeinen unnötig, da während der Polymerisation keine Nebenprodukte erzeugt werden.
  • Figure 00910001
  • Die geringe Anzahl von kommerziell erhältlichen Bis sekundären Aminen) begrenzt den Grad der strukturellen Mannigfaltigkeit, die unter Verwendung der obigen synthetischen Herangehensweise erreicht werden kann. Jedoch wird der Pool von brauchbaren, kommerziell erhältlichen Monomeren signifikant erweitert, wenn primäre Amine als potentielle Bibliotheksbausteine in Erwägung gezogen werden. Weil die Konjugat-Addition von Aminen an Acrylat gruppen im Allgemeinen tolerant gegenüber Funktionalitäten wie Alkoholen, Ethern und tertiären Aminen ist (Ferruti et al. Adv. Polym. Sci. 58: 55-92, 1984), nehmen wir an, dass der Einschluss von funktionalisierten primären Amin-Monomeren in unsere synthetische Strategie dazu dienen würde, strukturelle Mannigfaltigkeit zu erweitern. Diacrylat-Monomere A-G und Amin-Monomere 1-20 wurden für die Synthese einer anfänglichen Screening-Bibliothek ausgewählt:
    Figure 00920001
  • Die Größe der Bibliothek, konstruiert aus diesem Satz von Monomeren (7 Diacrylate × 20 Amine = 140 strukturell einzigartige Polymere) wurde gewählt, um groß genug zu sein, um ausreichende Mannigfaltigkeit einzuschließen, jedoch klein genug, um praktisch ohne die Notwendigkeit für Automatisierung in unseren anfänglichen Studien zu sein. Es war am Anfang unklar, ob ein Polymer wie G16 (gebildet aus hydrophoben und sterisch voluminösen Monomeren G und 16) bei physiologischem pH wasserlöslich sein würde oder in der Lage wäre, DNA ausreichend zu kondensieren. Jedoch wurden Monomere dieser Art absichtlich eingeschlossen, um den Raum der Mannigfaltigkeit vollständig zu erforschen, und in der Erwartung, dass diese Bibliothek schließlich als eine Screening-Population für die Entdeckung von Materialen für andere Anwendung als Genabgabe brauchbar sein kann (für einen Bericht über die parallele Synthese und Screening von abbaubaren Polymeren für Gewebetechnik siehe: Brocchini et al. J. Am. Chem. Soc. 119: 4553-4554, 1997, Lynn et al. Angew. Chem. Int. Ed. 40: 1707-1710, 2001).
  • Polymerisationsumsetzungen wurden gleichzeitig als eine Anordnung von individuell markierten Vialen durchgeführt. Umsetzungen wurden in Methylenchlorid bei 45°C für 5 Tage durchgeführt und Polymere wurden durch Entfernung von Lösungsmittel isoliert, um 600-800 mg von jedem Material zu ergeben. In diesem Maßstab durchgeführte Umsetzungen sahen Mengen von jedem Material vor, welche für Routine-Analyse durch GPC und alle nachfolgenden Tests für DNA-Bindung, Toxizität und Transfektion ausreichend waren. Eine Übersicht über 55% der Bibliothek durch GPC zeigte Molekulargewichte im Bereich von 2000 bis 50000 (bezogen auf Polystyrol-Standards) an. Da hohe Molekulargewichte für DNA-Komplexation und Transfektion nicht erforderlich sind (wie oben gezeigt) (Kabanov et al., in Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998), sah diese Bibliothek eine Sammlung von Polymeren und Oligomeren vor, welche für nachfolgende Screening-Tests geeignet ist.
  • Von den 140 Mitgliedern der Screening-Bibliothek waren 70 Proben ausreichend wasserlöslich (2 mg/ml, 25 mM Acetatpuffer, pH = 5,0), um in einen elektrophoretischen DNA-Bindungstest eingeschlossen zu werden (9). Um diesen Test so schnell und effizient wie möglich durchzuführen, wurden Proben mit Plasmid-DNA in Verhältnissen von 1:5 und 1:20 (DNA/Polymer, Gew./Gew.) in 96-Mulden-Platten gemischt und in eine Agarosegel-Platte geladen, welche in der Lage war, bis zu 500 Proben unter Verwendung eines Multikanal-Pipettierers zu testen. Alle 70 wasserlöslichen Polymerproben wurden gleichzeitig bei zwei unterschiedlichen DNA/Polymer-Verhältnissen in weniger als 30 Minuten getestet. Wie in 9 gezeigt, interagierten 56 der 70 wasserlöslichen Polymerproben ausreichend mit DNA, um Migration durch die Gelmatrix zu verzögern (z.B., A4 oder A5), unter Einsatz des 1:20 DNA/Polymer-Verhältnisses als ausschließendem Kriterium. Vierzehn Polymere wurden für weitere Berücksichtigung verworfen (z.B. A7 und A8), da diese Polymere DNA nicht ausreichend komplexierten.
  • Die DNA-komplexierenden Materialien, welche in dem obigen Test identifiziert wurden, wurden in Transfektionstests unter Einsatz von Plasmid-DNA und der COS-7 Zelllinie weiter untersucht. Alle Tests wurden gleichzeitig mit dem Leuchtkäfer Luciferase Reportergen (pCMV-Luc) durchgeführt und Grade von exprimiertem Protein wurden unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Test-Kits und eines 96-Mulden Lumineszenz-Plattenlesers bestimmt. 10 zeigt Daten, erzeugt von einem Test unter Einsatz von pCMV-Luc (600 ng/Mulde) bei DNA/Poly-Verhältnissen von 1:20 (Gew./Gew.). Die Mehrheit der gescreenten Polymere vermittelte Transfektion nicht über einen Grad, welcher für „nackte" DNA (kein Polymer) Kontrollen unter diesen Bedingungen typisch ist. Jedoch exprimierten mehrere Mulden höhere Grade an Protein und die entsprechenden Polymere wurden als „Treffer" in diesem Test identifiziert. Polymere B14 (Mw = 3180) und G5 (Mw = 9170) ergaben zum Beispiel Transfektionsgrade, welche 4-8-mal höher waren, als Kontrollversuche unter Einsatz von Poly(ethylenimin) (PEI), einem Polymer, welches herkömmlich als ein synthetischer Transfektionsvektor eingesetzt wird (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297-7301, 1995), und Transfektionsgrade innerhalb oder über die Bandbreite hinaus von exprimiertem Protein unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (erhältlich von Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)), einem führenden, kommerziell erhältlichen Lipid-basierten Transfektionsvektorsystem. Polymere A14, C5, G7, G10 und G12 wurden ebenfalls als positive „Treffer" in dem obigen Versuch identifiziert, aber Grade von Genexpression waren niedriger als B14 und G5.
  • Strukturelle Unterschiede zwischen synthetischen Polymeren verhindern typischerweise einen allgemeinen Satz von optimalen Transfektionsbedingungen. Zum Beispiel waren Polymere C5, C14 und G14 bei den höheren oben eingesetzten Konzentrationen toxisch (bestimmt durch die Abwesenheit von Zellen in Mulden, welche diese Polymere enthielten, wie bei visueller Inspektion beobachtet. Diese Polymere waren weniger toxisch und vermittelten Transfektion bei niedrigerer Konzentration), aber vermittelten Transfektion bei niedrigeren DNA- und Polymerkonzentrationen (Daten nicht gezeigt). Das oben beschriebene Testsystem kann leicht modifiziert werden, um Polymere als eine Funktion von DNA-Konzentration, DNA/Polymer-Verhältnis, Zellsaatdichten oder Inkubationszeiten zu bewerten. Zusätzliche Untersuchung wird erforderlich sein, um das Potential dieser Screening-Bibliothek vollständiger zu bewerten und diesbezügliche Experimente laufen zur Zeit.
  • Die Tests oben wurden in Abwesenheit von Chloroquin durchgeführt, einer schwachen Base, welche üblicherweise zugegeben wird, um in vitro Transfektion zu verstärken (Putnam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1200-1205, 2001; Benns et al. Bioconjugate Chem. 11: 637-645, 2000; Midoux et al. Bioconjugate Chem. 10: 406-411, 1999; Kabanov et al., in Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998), und die Ergebnisse reflektieren daher die intrinsischen Fähigkeiten jener Materialien, Transfektion zu vermitteln. Die Polymere, welche Monomer 14 enthalten, sind strukturell anderen Histidin enthaltenden „Protonenschwamm"-Polymeren ähnlich (Putnam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1200-1205, 2001; Benns et al. Bioconjugate Chem. 11: 637-645, 2000; Midoux et al. Bioconjugate Chem. 10: 406-411, 1999), und konnten Transfektion durch Puffern saurer intrazellulärer Kammern und Vermitteln von endosomaler Ausschleusung verstärken (Putnam et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1200-1205, 2001; Benns et al. Bioconjugate Chem. 11: 637-645, 2000; Midoux et al. Bioconjugate Chem. 10: 406-411, 1999; Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297-7301, 1995). Die Wirksamkeit von Polymeren, welche Monomer 5 enthalten, ist in diesem Zusammenhang überraschend, da diese Materialien kein offensichtliches Mittel zum Erleichtern von endosomaler Ausschleusung einschließen. Während die Wirksamkeit dieser letzteren Polymere noch nicht verstanden wird, hilft ihre Entdeckung, unsere parallele Herangehensweise zu validieren und betont den Wert, strukturelle Mannigfaltigkeit einzuschließen, da diese Polymere vielleicht auf einer ad hoc Basis nicht entdeckt worden wären. Polymere, welche hydrophile Diacrylate D und E einschließen, haben bis jetzt unter keinen Bedingungen „Treffer" erzeugt, was eine mögliche Basis für die Entwicklung von fokussierteren Bibliotheken vorsieht, welche für die Aufklärung von Struktur/Wirksamkeit-Beziehungen brauchbar sind.
  • Wir haben eine Bibliothek von 140 abbaubaren Polymeren und Oligomeren erzeugt, welche für die Entdeckung neuer DNA-komplexierender Materialien und Genabgabevektoren brauchbar sind. Mehrere dieser Materialien sind in der Lage, DNA in Strukturen zu kondensieren, welche klein genug sind, um durch Zellen internalisiert zu werden und die DNA in einer transkriptional wirksamen Form abzugeben. Die Gesamtzeit, welche gegenwärtig für Bibliotheksentwurf, Synthese und anfängliche Screening-Tests erforderlich ist, sind annähernd zwei Wochen. Jedoch könnte der Einschluss von Robotertechnik und zusätzlichen Monomeren die Gangart signifikant beschleunigen, bei welcher neue DNA-komplexierende Materialien und kompetente Transfektionsvektoren identifiziert werden.
  • Beispiel 4 – Halbautomatische Synthese und Screening einer großen Bibliothek von abbaubaren kationischen Polymeren für
  • Genabgabe
  • Eines der Haupthindernisse für den Erfolg von Gentherapie in der Klinik ist der Mangel an sicheren und effizienten Verfahren für Abgabe von Nucleinsäuren. Gegenwärtig verwendet die Mehrzahl von klinischen Versuchen modifizierte Viren als Abgabevehikel, welche, während sie bei Übertragen von DNA auf Zellen wirksam sind, unter potentiell ernster Toxizität und Produktionsproblemen leiden (Somia et al. Nat. Rev. Genet. 1: 91 (2000)).
  • Im Gegensatz dazu bieten nicht-virale Systeme eine Anzahl an potentiellen Vorteilen, einschließlich Leichtigkeit der Herstellung, Stabilität, niedrige Immunogenizität und Toxizität und verringerte Vektorgrößenbegrenzungen (Ledley Human Gene Therapy 6: 1129 (1995)).
  • Trotz dieser Vorteile sind bestehende nicht-virale Abgabesysteme jedoch weit weniger effizient als virale Vektoren (Luo et al. Nature Biotechnology 18: 33 (2000)).
  • Eine vielversprechende Gruppe von nicht-viralen Abgabeverbindungen sind kationische Polymere, welche DNA spontan binden und kondensieren. Eine breite Vielfalt von kationischen Polymeren, die in vitro transfizieren, ist gekennzeichnet worden, sowohl natürliche, wie Protein (Fominaya et al. Journal of Biological Chemistry 271: 10560 (1996)) und Peptidsysteme (Schwartz et al. Curr. Opin. Mol. Ther. 2: 162 (2000)), als auch synthetische Polymere, wie Poly(ethylenimin) (Boussif et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7297 (1995)), als auch Dendrimere (Kabanov et al. Selfassembling complexes for gene delivery: from laboratory to clinical trial, Wiley, Chichester; New York, 1998). Kürzliche Vorstöße in polymerer Genabgabe haben sich teilweise darauf fokussiert, die Polymere biologisch abbaubarer zu machen, um Toxizität zu verringern. Typischerweise enthalten diese Polymere sowohl aufladbare Aminogruppen, um ionische Interaktionen mit dem negativ geladenen Phosphat-Grundgerüst von Nucleinsäuren zu ermöglichen, als auch eine biologisch abbaubare Bindung wie eine hydrolysierbare Esterbindung. Mehrere Beispiele für diese schließen Poly(alpha-(4-aminobutyl)-L-glycolsäure) (Lim et al. Journal of the American Chemical Society 122: 6524 (2000)), Netzwerk-Poly(aminoester) (Lim et al. Bioconjugate Chemistry 13: 952 (2002)), und Poly(beta-aminoester) (Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 122: 10761 (2000); Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 123: 8155 (2001)) ein. Polybeta-aminoester) sind besonders interessant, weil sie niedrige Cytotoxizitäten zeigen und durch die Konjugat-Addition eines primären Amins oder Bis(sekundären Amins) an ein Diacrylat leicht synthetisiert werden (11) (Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 122: 10761 (2000); Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 123: 8155 (2001)).
  • Traditionelle Entwicklung von neuen biomedizinischen Polymeren ist ein iterativer Prozess gewesen. Polymere wurden typischerweise eines nach dem anderen entworfen und dann individuell auf ihre Eigenschaften getestet. Kürzlicher hat sich die Aufmerksamkeit auf die Entwicklung von parallelen, kombinatorischen Herangehensweisen fokussiert, die die Erzeugung von strukturellmannigfaltigen Bibliotheken von polymeren Biomaterialien erleichtern (Brocchini Advanced Drug Delivery Reviews 53: 123 (2001)). Diese kombinatorische Herangehensweise ist ebenfalls auf die Entdeckung von Genabgabe-Polymeren angewendet worden. Zum Beispiel erzeugten Murphy et al. eine gezielte kombinatorische Bibliothek aus 67 Peptoiden durch Festphasensynthese und screenten sie, um neue Genabgabemittel zu identifizieren (Murphy et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 1517 (1998)).
  • In diesem Beispiel werden neue Werkzeuge für hohen Durchsatz, parallele kombinatorische Synthese und Zell-basiertes Screening einer großen Bibliothek von 2350 strukturell unterschiedlichen Poly(beta-aminoester)n beschrieben. Diese Herangehensweise erlaubt das Screening von Polymeren in Zell-basierte Tests, ohne dass die Polymere je die Lösungsphase nach Synthese verlassen. Diese Herangehensweise, kombiniert mit der Verwendung von Roboter-Flüssigkeitshandhabungssystemen, ermöglicht die Erzeugung und das Testen von Tausenden von synthetischen Polymeren in Zell-basierten Tests in einer relativ kurzen Zeitdauer. Unter Verwendung dieser Herangehensweise sind 46 neue Polymere, die so gut wie oder besser als herkömmliche nicht-virale Abgabesysteme wie Poly(ethylenimin) leisten, identifiziert worden.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Polymersynthese mit hohem Durchsatz. Die primären Faktoren, welche den Durchsatz und die Automatisierung von Poly(beta-aminoes ter)-Synthese und Testen begrenzen, waren die Viskosität von Monomer- und Polymerlösungen und die Schwierigkeit beim Manipulieren der festen Polymerprodukte. Während Automatisierung von Flüssigkeitshandhabung unter Verwendung von herkömmlicher Robotertechnik unkompliziert ist, ist es die Manipulation von Feststoffen und viskosen Flüssigkeiten in kleinem Maßstab nicht. Daher wurde ein System entwickelt, in welchem Polymere in Zell-basierten Tests synthetisiert und gescreent werden konnten, ohne die Lösungsphase zu verlassen. Da dies die Anwesenheit von rückständigem Lösungsmittel in den Zelltests erfordern würde, wurde das relativ nicht-toxische Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) gewählt. DMSO ist ein gewöhnlich in Zellkultur verwendetes Lösungsmittel und wird routinemäßig beim Lagern von gefrorenen Vorräten von Zellen verwendet. DMSO ist mit Wasser mischbar und wird im Allgemeinen in lebenden Systemen gut toleriert.
  • Der erste Herstellungsschritt für Synthese mit hohem Durchsatz war es, Bedingungen zu identifizieren, die die Herstellung von Polymer ermöglichen würden, jedoch eine handhabbare Viskosität besitzen. Pilotversuche in kleinem Maßstab zeigten, dass Polymerisation wirksam bei 1,6 M in DMSO bei 56°C für 5 Tage durchgeführt werden konnte. Basierend auf diesen Versuchen wurde eine allgemeine Strategie für Polymersynthese und Testung entwickelt. Alle Monomere (12) wurden in DMSO auf 1,6 M verdünnt und dann gaben wir unter Verwendung von sowohl eines Flüssigkeitshandhabungsroboters, als auch eines 12-Kanal Mikropipettierers 150 Mikroliter von jedem Amin und Diacrylat-Monomer in eine Polypropylen-Tiefmuldenplatte und versiegelten sie dann mit Aluminiumfolie. Die Platten wurden auf einen Orbitalschüttler platziert und bei 56°C für 5 Tage inkubiert. Um die erhöhte Viskosität von polymeren Lösungen zu kompensieren, wurde 1 ml DMSO zu jeder Mulde der Platte zugegeben und die Platten wurden dann bei 4°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Dieses Verfahren ermöglicht 2350 Umsetzungen an einem einzigen Tag. Ferner ermöglichte die Herstellung und Lagerung von Polymeren in einem 96-Mulden Format einen leichten Übergang in 96-Mulden Format Zell-basierte Testung von Polymertransfektionseffizienz. Polymertestung mit hohem Durchsatz. Sobald sie synthetisiert waren, wurden alle Polymere auf ihre Fähigkeit getestet, das Luciferase-exprimierende Plasmid, pCMV-luc, in die Affennieren-Fibro blast-Zelllinie COS-7 abzugeben. Aufgrund der großen Größe der Polymer-Bibliothek wurde ein Verfahren mit hohem Durchsatz für Zell-basiertes Screening von Transfektionseffizienz entwickelt. Da Polymere in 96-Mulden-Platten gelagert wurden, wurden alle Polymerverdünnungen, DNA-Komplexation und Zelltransfektionen parallel durch direktes Übertragen von Polymeren von Platte zu Platte unter Verwendung eines Flüssigkeitshandhabungsroboters durchgeführt. Alle Polymere wurden unter Verwendung der gleichen Konzentration von Amin-Monomer synthetisiert, somit war Vergleich zwischen Polymeren bei einem festen Amin-Monomer:DNA-Phosphat-Verhältnis (N:P-Verhältnis) unkompliziert. Während die Amin-Monomere entweder ein, zwei oder drei Amine pro Monomer enthalten, wurden anfängliche breit-basierte Screens für Transfektionseffizienz durch Beibehalten einer konstanten Monomerkonzentration in allen Mulden einer einzelnen Platte und daher einem konstanten Volumen von Polymerlösung pro Umsetzung stark vereinfacht (siehe Verfahren unten).
  • Die Effizienz von in vitro Transfektion unter Verwendung von kationischen Polymeren wie Poly(ethylenimin) ist gegenüber dem Verhältnis von Polymer zu DNA, welches während Komplexbildung vorhanden ist, sehr empfindlich (Gebhart et al. Journal of Controlled Release 73: 401 (2001)).
  • N:P-Verhältnisse von 10:1, 20:1 und 40:1 wurden für unsere anfänglichen Screens ausgewählt, basierend auf vorhergehenden Versuchen mit diesen Arten von Polymeren. Unter Verwendung eines Systems mit hohem Durchsatz screenten wir alle 2350 Polymere bei diesen drei Verhältnissen. Transfektionswerte bei der besten Bedingung für jedes Polymer wurden in einem Histogramm tabellarisiert (13). Diese Ergebnisse wurden mit den drei Kontrollen verglichen: nackte DNA (kein Transfektionsmittel), Poly(ethylenimin) (PEI) und Lipofectamin 2000. Die niedrigen rückständigen Gehalte an DMSO, welche in den Transfektionslösungen vorhanden waren, beeinträchtigten weder die Transfektionseffizienz von nackter DNA, noch PEI. Dreiunddreißig der 2350 Polymere wurde als gut oder besser als PEI in diesem unoptimierten System befunden.
  • Da kationische Polymertransfektionen dazu neigen, empfindlich gegenüber Polymer-DNA Verhältnis zu sein, entschieden wir, Transfektionsbedingungen mit den besten Polymeren aus unserem vorläufigen Screen zu optimieren. Unter Verwendung der obigen Ergebnisse als grobe Orientierung wurden die Transfektionsbedingungen für die 93 besten Polymere optimiert, indem man sie bei N:P-Verhältnissen über und unter den in dem breit-basierten Screen identifizierten optimalen Transfektionsbedingungen testete. Um ein Optimierungssystem mit hohem Durchsatz zu entwickeln, wurden diese unter Verwendung eines N:P-Verhältnis Multipliziersystems getestet, um gleichzeitiges Testen und Platte-zu-Platte Übertragung zu vereinfachen. Ausgehend von dem besten im vorläufigen Screen getesteten N:P-Verhältnis wurden die Polymere wieder bei sechs N:P-Verhältnissen gleich dem besten Verhältnis mal 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5 und 1,75 dreifach getestet. Falls das in dem Screen für ein gegebenes Polymer identifizierte optimale Verhältnis beispielsweise 20:1 war, dann wurde das Polymer wieder dreifach bei N:P-Verhältnissen von 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1 und 35:1 gescreent. Die durchschnittlichen Transfektionseffizienzen mit Standardabweichung von den besten Bedingungen für die besten 50 Polymere werden in 14 gezeigt, zusammen mit Kontrolldaten. In diesem Versuch wurden 46 Polymere identifiziert, die so gut wie oder besser als PEI transfizierten. Alle 93 dieser Polymere wurden unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese (15) ebenfalls auf ihre Fähigkeit getestet, DNA zu binden. Während fast alle Polymere DNA wie erwartet binden, machen dies zwei Polymere, die bei hohen Graden transfizieren, interessanterweise nicht: M17 und KK89 (14).
  • Um die Transfektionseigenschaften dieser Polymere weiter zu untersuchen, wurden zehn hoch transfizierende Polymere auf ihre Fähigkeit getestet, das grün fluoreszierende Proteinplasmid pCMV-eGFP abzugeben. Anders als pCMV-luc sieht pCMV-eGFP Informationen bezüglich des Prozentsatzes von transfizierten Zellen vor. Hohe Grade von Transfektion wurden für alle 10 Polymere beobachtet und zwei der besten werden in 16 gezeigt.
  • Die in den obigen Tests identifizierten „Treffer" offenbaren eine überraschend mannigfaltige und unerwartete Sammlung von Polymeren. Insbesondere überraschend ist die große Sammlung von hydrophoben, D-Monomer basierten Polymeren. Tatsächlich sind die Diacrylat-Monomere, welche verwendet wurden, um die am besten leistenden 50 Polymere herzustellen, fast immer hydrophob. Weitere Analyse zeigt zwei weitere gemeinsame Merkmale der wirksamen Polymere: 1) zwölf der 26 Polymere, die besser als das beste her kömmliche Reagens, Lipofectamin 2000, sind, haben Mono- und Di-Alkohol-Seitengruppen und 2) lineare Bis(sekundäre Amine) sind in diesen Trefferstrukturen ebenfalls vorherrschend. Ebenfalls überraschend war die Identifizierung von zwei Polymeren, die bei hohen Graden transfizieren, aber DNA nicht zu binden scheinen (KK89 und M17). Beide sind ebenfalls bei pH 5 und pH 7 unlöslich. Ihre Fähigkeit, DNA-Aufnahme zu erleichtern, kann Folge von Permeabilisierung der zellulären Membran sein.
  • Ebenfalls wichtig für die Funktion von Genabgabe-Polymeren ist Länge (Remy et al. Advanced Drug Delivery Reviews 30: 85 (1998); Schaffer et al. Biotechnol. Bioeng. 67: 598 (2000)). Unter Verwendung dieser Ergebnisse als Rahmen kann eine Bandbreite von Polymerlängen für jedes Treffer-Polymer durch vorsichtiges Variieren von relativen Monomerkonzentrationen hergestellt werden. Nachweis zeigt, dass (1) wie PEI, Poly(beta-aminoester)-Länge wichtig bei der Genabgabefertigkeit dieser Polymere ist, und (2) dass die hier identifizierten Treffer unter Verwendung herkömmlicher Methoden resynthetisiert werden können und noch wirksam DNA abgeben.
  • Experimentelle Protokolle
  • Polymersynthese.
  • Monomere wurden von Aldrich (Milwaukee, WI), TCI (Portland, OR), Pfaltz & Bauer (Waterbury, CT), Matrix Scientific (Columbia, SC), Acros-Fisher (Pittsburg, PA), Scientific Polymer (Ontario, NY), Polysciences (Warrington, PA) und Dajac Monomer-Polymer (Feasterville, PA) erworben. Diese wurden in DMSO (Aldrich) zu einer Endkonzentration von 1,6 M gelöst. Alle möglichen paarweisen Kombinationen von Amin und Diacrylat-Monomeren wurden in 150 μl Aliquoten zu jeder Mulde von 2 ml 96-Mulden Polypropylen Masterblock Tiefmuldenplatten (Griener America, Longwood, FL) zugegeben. Die Platten wurden mit Aluminiumfolie versiegelt und bei 56°C unter Rotieren auf einem Orbitalschüttler inkubiert. Nach 5 Tagen wurde 1 ml DMSO zu jeder Mulde zugegeben und die Platten wurden wieder versiegelt und gefroren bei 4°C gelagert, bis sie fertig zur Verwendung waren.
  • Transfektionsversuche.
  • 14000 cos-7 Zellen (ATCC, Manassas, VA) wurden in jede Mulde einer festen weißen oder klaren 96-Mulden Platte (Coming-Costar, Kennebunk, ME) gesät und durften über Nacht in einem Wachstumsmedium anhaften, zusammengesetzt aus 500 ml Phenol-Rot minus DMEM, 50 ml Hitze-inaktiviertem FBS, 5 ml Penicillin/Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Jede Mulde einer Masterblock 96-Mulden Platte wurde mit 1 ml von 25 mM Natriumacetat pH 5 gefüllt. Zu diesem wurden 40 μl, 20 μl oder 10 μl der Polymer/DMSO-Lösung zugegeben. 25 μl des verdünnten Polymers wurden zu 25 μl von 60 μg/ml pCMV-luc DNA (Promega, Madison, WI) oder pEGFP-NI (Invitrogen) in einer Halbvolumen 96-Mulden Platte zugegeben. Diese wurden für 10 Minuten inkubiert und dann wurden 30 μl der Polymer-DNA-Lösung zu 200 μl Optimem mit Natriumbicarbonat (Invitrogen) in 96-Mulden Polystyrolplatten zugegeben. Das Medium wurde unter Verwendung einer 12-Kanal-Rute (V & P Scientific, San Diego, CA) entfernt, wonach 150 μl der Optimem-Polymer-DNA-Lösung sofort zugegeben wurden. Komplexe wurden mit den Zellen für 1 Stunde inkubiert und dann unter Verwendung der 12-Kanal-Rute entfernt und durch 105 μl Wachstumsmedium ersetzt. Die Zellen durften für drei Tage bei 37°C, 5% CO2 wachsen und wurden dann auf Lumineszenz (pCMV-luc) oder Fluoreszenz (pEGFP-N1) analysiert. Kontrollversuche wurden wie oben beschrieben durchgeführt, aber unter Verwendung von Poly(ethylenimin) MW 25000 (Aldrich) ersetzend synthetisiertes Polymer und bei Polymer:DNA Gewichtsverhältnissen von 0,5:1, 0,75:1, 1:1, 1,25:1, 1,5:1 und 2:1. Lipofectamin 2000 (Invitrogen) Transfektionen wurden wie durch den Verkäufer beschrieben durchgeführt, außer dass Komplexe nach 1 Stunden entfernt wurden.
  • Lumineszenz wurde unter Verwendung von Bright-Glo Testkits (Promega) analysiert. Kurz: 100 μl Bright-Glo Lösung wurden zu jeder Mulde der Mikrotiterplatte zugegeben, welche Medien und Zellen enthielten. Lumineszenz wurde unter Verwendung eines Mithras Luminometers (Berthold, Oak Ridge, TN) gemessen. In einigen Fällen wurde ein neutraler Dichtefilter (Chroma, Brattleboro, VT) verwendet, um Sättigung des Luminometers zu verhindern. Eine Standardkurve für Luciferase wurde durch Titration von Luciferase-Enzym (Promega) in Wachstumsmedium in weißen Mikrotiterplatten erzeugt. eGFP-Expression wurde unter Verwendung eines Zeiss Aciovert 200 umgekehrten Mikroskops untersucht.
  • Agarosegel-Elektrophorese DNA-Bindungstests wurden bei einem N:P-Verhältnis von 40:1 wie vorhergehend beschrieben durchgeführt (Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 123: 8155 (2001)). Alle Flüssigkeitshandhabung wurde unter Verwendung eines EDR384S/96S Roboters (Labcyte, Union City, CA) oder eines 12-Ka nal Mikropipettierers (Thermo Labsystems, Vantaa, Finnland) in einer Sterilbank durchgeführt.
  • Beispiel 5 – Synthese von Poly(beta-aminoestern), optimiert für hoch wirksame Genabgabe
  • Die Wirkung von Molekulargewicht, Polymer/DNA-Verhältnis und Ketten-Endgruppe auf die Transfektionseigenschaften von zwei einzigartigen Poly(β-aminoester)-Strukturen wurde bestimmt. Diese Faktoren können eine dramatische Wirkung auf Genabgabefunktion haben. Unter Verwendung von Screeningverfahren mit hohem Durchsatz sind Poly(β-aminoester), die besser als PEI und Lipofectamin 2000 (zwei der besten kommerziell erhältlichen Transfektionsreagenzien) transfizieren, entdeckt worden.
  • Materialien und Verfahren
  • Polymersynthese.
  • Poly-1 und Poly-2 Polymere wurden durch Zugeben von 1,4-Butandioldiacrylat (99+%), beziehungsweise 1,6-Hexandioldiacrylat (99%) zu 1-Aminobutanol (98%) synthetisiert. Diese Monomere wurden von Alfa Aesar (Ward Hill, MA) erworben. Zwölf Versionen von jedem Poly-1 und Poly-2 wurden durch Variieren des stöchiometrischen Amin/Diacrylat-Verhältnisses erzeugt. Um jedes der 24 einzigartigen Polymere zu synthetisieren, wurden 400 mg von 1-Aminobutanol in eine 8 ml Probenviale mit Teflon-verkleidetem Schraubverschluss eingewogen. Als nächstes wurde die passende Menge an Diacrylat zu der Viale zugegeben, um ein stöchiometrisches Verhältnis zwischen 1,4 und 0,6 zu ergeben. Ein kleiner Teflon-überzogener Rührstab wurde dann in jede Viale gelegt. Die Vialen wurden fest verschlossen und auf eine Multi-Position magnetische Rührplatte platziert, welche sich in einem bei 100°C gehaltenen Ofen befand. Nach einer Umsetzungszeit von 5 Std. wurden die Vialen aus dem Ofen entfernt und bei 4°C gelagert.
  • Alle Polymere wurden durch GPC analysiert.
  • Gel-Permeationschromatographie (GPC). GPC wurde unter Verwendung einer Hewlett Packard 1100 Series isokratischen Pumpe, einem Rheodyne Model 7125 Injektor mit einem 100 μl Injektionsloop und einer Phenogel MXL Säule (5 μm gemischt, 300 × 7,5 mm, Phenomenex, Torrance CA) durchgeführt. 70% THF/30% DMSO (Vol./Vol.) + 0,1 M Piperidin wurde als Eluent bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min. verwendet. Daten wurden unter Verwendung eines Optilab DSP interferometrischen Refraktometers (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) gesammelt und unter Verwendung des TriSEC GPC Softwarepakets (Viscotek Corporation, Houston, TX) verarbeitet. Die Molekulargewichte und Polydispersitäten der Polymere wurden bezogen auf monodisperse Polystyrol-Standards bestimmt. Luciferase-Transfektionstests. COS-7 Zellen (ATCC, Manassas, VA) wurden (14000 Zellen/Mulde) in jede Mulde einer undurchsichtigen weißen 96-Mulden-Platte (Corning-Costar, Kennebunk, ME) gesät und durften über Nacht in Wachstumsmedium anhaften. Wachstumsmedium setzte sich aus 90% Phenol-Rot freiem DMEM, 10% fötalem Rinderserum, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) zusammen. Um Handhabung zu erleichtern, wurden Polymer-Stammlösungen (100 mg/ml) in DMSO-Lösungsmittel hergestellt. Eine kleine rückständige Menge an DMSO in dem Transfektionsgemisch beeinträchtigt nicht die Transfektionseffizienz und ergibt keine beobachtbare Cytotoxizität. Arbeitsverdünnungen von jedem Polymer wurden (bei Konzentrationen, welche notwendig sind, um die unterschiedlichen Polymer/DNA-Gewichtsverhältnisse zu ergeben) in 25 mM Natriumacetat-Puffer (pH 5) hergestellt. 25 μl des verdünnten Polymers wurden zu 25 μl von 60 μg/ml pCMV-Luc DNA (Elim Biopharmaceuticals, South San Francisco, CA) in einer Mulde einer 96-Mulden-Platte zugegeben. Das Gemisch wurde für 10 Minuten inkubiert, um Komplexbildung zu erlauben, und dann wurden 30 μl von jeder der Polymer-DNA-Lösungen zu 200 μl von Opti-MEM mit Natriumbicarbonat (Invitrogen) in 96-Mulden Polystyrolplatten zugegeben. Das Wachstumsmedium wurde unter Verwendung einer 12-Kanal Ansaugrute (V&P Scientific, San Diego, CA) von den Zellen entfernt, wonach 150 μl der Opti-MEM-Polymer-DNA-Lösung sofort zugegeben wurden. Komplexe wurden mit den Zellen für 1 Std. inkubiert und dann unter Verwendung der 12-Kanal Rute entfernt und durch 105 μl Wachstumsmedium ersetzt. Zellen durften für drei Tage bei 37°C, 5% CO2 wachsen und wurden dann auf Luciferase-Expression analysiert. Kontrollversuche wurden ebenfalls mit PEI (MW = 25000, Sigma-Aldrich) und Lipofectamin 2000 (Invitrogen) durchgeführt. PEI-Transfektionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt, aber unter Verwendung von Polymer:DNA Gewichtsverhältnissen von 1:1. Lipofectamin 2000 Transfektionen wurden wie durch den Verkäufer beschrieben durchgeführt, außer dass Komplexe nach 1 Stunde entfernt wurden.
  • Luciferase-Expression wurde unter Verwendung von Bright-Glo Testkits (Promega) analysiert. Kurz: 100 μl Bright-Glo Lösung wurden zu jeder Mulde der Medien und Zellen enthaltenden 96-Mulden-Platte zugegeben. Lumineszenz wurde unter Verwendung eines Mithras Luminometers (Berthold, Oak Ridge, TN) gemessen. Ein 1% neutraler Dichtefilter (Chroma, Brattleboro, VT) wurde verwendet, um Sättigung des Luminometers zu verhindern. Eine Standardkurve für Luciferase wurde durch Titration von Luciferase-Enzym (Promega) in Wachstumsmedium in einer undurchsichtigen weißen 96-Mulden Platte erzeugt.
  • Messung von Cytotoxizität.
  • Cytotoxizitätstests wurden auf die gleiche Weise durchgeführt, wie die Luciferase-Transfektionsversuche, mit der folgenden Ausnahme. Statt auf Luciferase-Expression nach 3 Tagen zu testen, wurden die Zellen auf metabolische Aktivität unter Verwendung des MTT-Zellproliferationskits (ATCC) nach 1 Tag getestet. 10 μl MTT Reagens wurde zu jeder Mulde zugegeben. Nach 2 Std. Inkubation bei 37°C wurden 100 μl Detergens-Reagens zu jeder Mulde zugegeben. Die Platte wurde dann bei Raumtemperatur für 4 Std. in dem dunklen Raum gelassen. Optische Extinktion wurde bei 570 nm unter Verwendung eines SpectaMax 190 Mikroplattenlesers (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) gemessen und zu % Lebensfähigkeit bezogen auf Kontrollzellen (unbehandelt) umgewandelt.
  • Zelluläre Aufnahmeversuche.
  • Aufnahmeversuche wurden wie vorher beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein 12-Mulden Plattenformat anstelle eines 6-Mulden Plattenformats verwendet wurde (Akinc, A., et al., Parallel synthesis and biophysical characterization of a degradable polymer library of gene delivery. J. Am. Chem. Soc., 2003).
  • COS-7 Zellen wurden bei einer Konzentration von 1,5 × 105 Zellen/Mulde gesät und für 24 Stunden vor Durchführen des Aufnahmeversuchs wachsen gelassen. Herstellung von Polymer/DNA-Komplexen wurde auf die gleiche Weise durchgeführt, wie in den Luciferase-Transfektionsversuchen, wobei die einzigen Unterschiede eine Erhöhung des Maßstabs (2,5 μg DNA pro Mulde von 12-Mulden-Platten im Gegensatz zu 600 ng DNA pro Mulde von 96-Mulden-Platten) und die Verwendung von Cy5-markiertem Plasmid statt pCMV-Luc waren (Akinc, A. und R. Langer, Measuring the pH environment of DNA delivered using nonivral vectors: Implications for lysosomal trafficking. Biotechnol. Bioeng., 2002. 78(5): p. 503-8).
  • Wie in den Transfektionsversuchen wurden die Komplexe für 1 Std. mit Zellen inkubiert, um zelluläre Aufnahme durch Endocytose zu ermöglichen. Die relativen Grade von zellulärer Aufnahme wurden unter Verwendung eines Flusscytometers quantifiziert, um die Fluoreszenz von mit Cy5-markiertem Plasmid geladenen Zellen zu messen.
  • GFP-Transfektionen.
  • GFP-Transfektionen wurden in COS-7 (grüne Affennieren), NIH 3T3 (Maus-Fibroblast), HepG2 (humanes Hepatokarzinom) und CHO (Ovar von Chinesischem Hamster) Zelllinien durchgeführt. Alle Zelllinien wurden von ATCC (Manassas, VA) erhalten und in 10% fötales Rinderserum, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin enthaltendem DMEM bei 37°C in 5% CO2-Atmosphäre gehalten. Zellen wurden auf 6-Mulden-Platten gesät und vor Durchführen des Transfektionsversuchs grob auf 80-90% Konfluenz wachsen gelassen. Polymer/DNA-Komplexe wurden wie oben beschrieben unter Verwendung des pEGFP-NI Plasmids (Clontech, Palo Alto, CA) (5 μg/Mulde) hergestellt. Komplexe wurden in 1 ml Opti-NEM verdünnt und für 1 Std. zu den Mulden zugegeben. Die Komplexe wurden dann entfernt und frisches Wachstumsmedium wurde zu den Mulden zugegeben. Nach 2 Tagen wurden die Zellen geerntet und durch Flusscytometrie auf GFP-Expression analysiert. Propidiumiodid-Färbung wurde verwendet, um tote Zellen von der Analyse auszuschließen.
  • Flusscytometrie.
  • Flusscytometrie wurde mit einem FACSCalibur (Becton Dickinson) durchgeführt, ausgestattet mit einem Argon-Ionenlaser, welcher in der Lage ist, GFP (488 nm Exzitation) anzuregen, und einem Rot-Diodenlaser, welcher in der Lage ist, Cy5 (635 nm Exzitation) anzuregen. Die Emission von GFP wurde unter Verwendung eines 530 nm Bandfilters filtriert und die Emission von Cy5 wurde unter Verwendung eines 650 Langfilters filtriert. Die Zellen wurden durch Streuung nach vorne und zur Seite getort („gated") und 30000 Ereignisse pro Probe wurden gesammelt.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Polymersynthese. Wie vorher beschrieben (Lynn, D. M. und R. Langer, Degradable poly(β-amino esters): synthesis, characterization and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc., 2000. 122(44): p. 10761-10768) schreitet die Synthese von Poly(β-aminoestern) über die Konjugat-Addition von Aminen an Acrylatgruppen voran. Weil die Umsetzung eine Stufenpolymerisation ist, wird eine breite, statistische Verteilung von Kettenlängen erhalten, mit durchschnittlichem Molekulargewicht und Kettenendgruppen kontrolliert durch Monomer-Stöchiometrie (Flory, P., in Principles of Polymer Chemistry, 1953, Cornell University Press: Ithaca, NY. p. 40-46, 318-323; Odian, G., Step Polymerization, in Principles of Polymerization, 1991, John Wiley & Sons, Inc.: New York. p. 73-89).
  • Molekulargewicht erhöht sich, wenn sich das Verhältnis von Monomeren stöchiometrischer Äquivalenz annähert, und ein Überschuss von Amin- oder Diacrylat-Monomeren ergibt Amin-, beziehungsweise Acrylat-terminierte Ketten. Für diese Klasse von Polymeren ist genaue Kontrolle von Stöchiometrie wesentlich für das Kontrollieren des Polymer-Molekulargewichts. Während Monomer-Stöchiometrie der wichtigste Faktor zum Beeinflussen von Kettenlänge ist, sollten konkurrierende Seitenreaktionen ebenfalls bedacht werden, die das Molekulargewicht und die Struktur von Polymerprodukten beeinflussen könnten. Insbesondere können intramolekulare Cyclisierungsumsetzungen, wo sich ein Amin an einem Ende der wachsenden Polymerkette mit einem Acrylat am anderen Ende umsetzt, erhaltene Molekulargewichte begrenzen (Odian, G., Step Polymerization, in Principles of Polymerization. 1991, John Wiley & Sons, Inc.: New York, p. 73-89).
  • Diese cyclischen Ketten können auch Eigenschaften haben, die sich von jenen ihrer linearen Gegenstücke unterscheiden.
  • In dieser Arbeit haben wird das vorhergehend berichtete Polymerisationsverfahren modifiziert, um Monomer-Stöchiometrie besser zu kontrollieren und Cyclisierungsumsetzungen zu minimieren. Zuerst wurde der Synthesemaßstab von grob 0,5 g auf 1 g erhöht, um Kontrolle von Stöchiometrie innerhalb von 1% zu ermöglichen. Weitere Verbesserung der Genauigkeit ist durch die Reinheit (98-99%) der verwendeten kommerziell erhältlichen Monomere begrenzt. Zweitens wurden alle Monomere in Vialen eingewogen, statt volumetrisch dispensiert zu werden. Diskrepanzen zwischen tatsächlichen und berichteten Monomerdichten wurden in einigen Fällen als nicht-vernachlässigbar gefunden und führten zu Ungenauigkeiten in der dispensierten Masse. Drittens wurden Polymerisationen in Abwesenheit von Lösungsmittel durchgeführt, um Monomerkonzentration zu maximieren und so die intramolekulare Additionsumsetzung gegenüber der intramolekularen Cyclisierungsumsetzung zu begünstigen. Eliminieren des Lösungsmittels sieht ebenfalls den zusätzlichen Nutzen vor, die Umsetzungsrate zu erhöhen und den Schritt der Lösungsmittelentfernung zu verhindern. Da das vorher eingesetzte Methylenchlorid-Lösungsmittel nicht verwendet wurde, konnte schließlich die Umsetzungstemperatur von 45°C auf 100°C erhöht werden. Erhöhen der Temperatur ergab eine erhöhte Umsetzungsrate und eine Verringerung der Viskosität des Umsetzungsgemisches, was half, die höhere Viskosität des Lösungsmittel-freien Systems auszugleichen. Die vereinigte Wirkung von erhöhter Monomerkonzentration und Umsetzungstemperatur ergab eine Verringerung der Umsetzungszeit von grob 5 Tagen auf 5 Stunden.
  • Wir synthetisierten Polymere Poly-1 und Poly-2 durch Zugeben von 1,4-Butandioldiacrylat, beziehungsweise 1,6-Hexandioldiacrylat zu 1-Aminobutanol. Zwölf einzigartige Versionen von jedem Polymer wurden durch variierende Amin/Diacrylat-Molverhältnisse zwischen 0,6 und 1,4 synthetisiert.
  • Figure 01080001
  • Für beide Polymer-Sätze (Poly-1 und Poly-2) hatten 7 der 12 Amin/Diacrylat-Verhältnisse > 1, was Amin-terminierte Polymere ergab, und 5 der 12 hatten Amin/Diacrylat-Verhältnisse <1, was Acrylat-terminierte Polymere ergab. Nach 5 Std. Umsetzung bei 100°C wurden Polymere als klare, leicht gelbliche, viskose Flüssigkeiten erhalten. Die Polymere hatten beobachtbare Unterschiede in der Viskosität, entsprechend Unterschieden im Molekulargewicht. Polymere wurden durch Gelpermeationschromatographie (GPC) von organischer Phase unter Einsatz von 70% THF/30% DMSO (Vol./Vol.) + 0,1 M Piperidin-Eluent analysiert. Polymere Molekulargewichte (Mw) reichten von 3350 (Poly-1, Amin/Diacrylat = 1,38) bis 18000 (Poly-1, Amin/Diacrylat = 0,95) bezogen auf Polystyrol-Standards (16). Molekulare Gewichtsverteilungen waren mono modal mit Polydispersitätsindizes (PDIs) im Bereich von 1,55 bis 2,20.
  • Luciferase Transfektionsergebnisse.
  • Transfektionsversuche wurden mit allen 24 synthetisierten Polymeren (jeweils 12 von Poly-1 und Poly-2) bei 9 unterschiedlichen Polymer/DNA-Verhältnissen durchgeführt, um den Einfluss von Molekulargewicht, Polymer/DNA-Verhältnis und Kettenendgruppe auf Transfektionseffizienz zu bestimmen (17 und 18). Als ein Modellsystem verwendeten wir die COS-7 Zelllinie und ein Plasmid, welches für das Leuchtkäfer Luciferase-Reportergen (pCMV-Luc) (600 ng/Mulde) kodiert. Um Durchführung der nahezu 1000 Transfektionen (Daten werden vierfach erhalten) zu erleichtern, wurden die Versuche im 96-Mulden-Platten Format durchgeführt. Reporterprotein-Expressionsgrade wurden unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Luciferase-Testkits und eines 96-Mulden Lumineszenz-Plattenlesers bestimmt.
  • Die in 17 und 18 gezeigten Daten zeigen, dass Polymer-Molekulargewicht, Polymer/DNA-Verhältnis und Kettenendgruppe die Transfektionseigenschaften von sowohl Poly-1, als auch Poly-2 Polymeren beeinflussen. Ein auffallendes und etwas unerwartetes Ergebnis war, dass keines der Acrylat-terminierten Polymere nennenswerte Transfektionsgrade unter einer der bewerteten Bedingungen vermittelte. Dieses Ergebnis kann für Poly(β-aminoester) breiter anwendbar sein, da wir noch ein Polymer unter Verwendung eines Überschusses an Diacrylat-Monomer synthetisieren müssen, das nennenswerte Reportergen-Expression bei einem der Polymer/DNA-Verhältnisse vermittelt, die wir eingesetzt haben. Diese Befunde legen nahe, dass vielleicht nur Amin-terminierte Poly(β-aminoester) zur Verwendung als Genabgabevehikel geeignet sind. Im Gegensatz dazu gab es ausgeprägte Bereiche von Transfektionswirksamkeit in dem MW-Polymer/DNA-Raum für Amin-terminierte Versionen von sowohl Poly-1, als auch Poly-2 (17-A und 18-A). Maximale Reportergen-Expressionsgrade von 60 ng luc/Mulde und 26 ng luc/Mulde wurden unter Verwendung von Poly-1 (Me = 13100), beziehungsweise Poly-2 (Mw = 13400) erreicht. Diese Ergebnisse vergleichen sich ziemlich vorteilhaft mit PEI (Polymer/DNA = 1:1 Gew./Gew.), welches einen Expressionsgrad von 6 ng luc/Mulde (Daten nicht gezeigt) unter den gleichen Bedingungen vermittelte.
  • Während die höchsten Transfektionsgrade unter Verwendung der Versionen mit höherem Molekulargewicht von beiden Polymerstruktu ren auftraten, waren die optimalen Polymer/DNA-Verhältnisse für diese Polymere deutlich unterschiedlich (Polymer/DNA = 150 für Poly-1, Polymer/DNA = 30 für Poly-2). Die Transfektionsergebnisse, die wir für Poly-1 und Poly-2 erhalten haben, betonen die Wichtigkeit der Optimierung von Polymer-Molekulargewicht und Polymer/DNA-Verhältnis und die Wichtigkeit der Kontrolle von Kettenendgruppen. Ferner betont die Tatsache, dass zwei so ähnliche Polymerstrukturen, welche sich nur durch zwei Kohlenstoffe in der Wiederholungseinheit unterscheiden, solche unterschiedlichen optimalen Transfektionsparameter haben, die Notwendigkeit, diese Optimierungen für jede einzigartige Polymerstruktur durchzuführen. Um unser Verständnis der erhaltenen Transfektionsergebnisse zu verbessern, wählten wir, zwei wichtige Abgabekennzeichen zu untersuchen, die Transgenexpression direkt beeinflussen, Cytotoxizität und die Fähigkeit, Zellen durch Endocytose zu betreten (Wiethoff, C.M. Und C.R. Middaugh, Barriers to nonviral gene delivery. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2003, 92(2): p. 203-217).
  • Cytotoxizität.
  • Wir bewerteten die Cytotoxizitäten der verschiedenen Polymer/DNA-Komplexe unter Verwendung eines MTT/Thiazolyl Farbstoff Blau Reduktionsstandardtests. Die Versuche wurden genau wie die oben beschriebenen Transfektionsversuche durchgeführt, außer dass statt Testen auf Reportergenexpression an Tag 3 der MTT-Test nach Tag 1 durchgeführt wurde (siehe Materialien und Verfahren). Wir hypothetisierten anfänglich, dass der für Acrylat-terminierte Polymere beobachtete Mangel an Transfektionswirksamkeit eine Folge der Cytotoxizität der Acrylat-Endgruppen gewesen sein könnte. 19-B und 20-B zeigen tatsächlich an, dass hohe Konzentrationen von Acrylat cytotoxisch sind, da gesehen wird, dass Lebensfähigkeit mit steigendem Polymer/DNA-Verhältnis und abnehmendem Polymer Mw sinkt (niedriger Mw entspricht einer höheren Konzentration von Endgruppen). Jedoch erklärt die Cytotoxizität von Acrylaten nicht ausreichend den Mangel an Transfektionswirksamkeit bei niedrigeren Polymer/DNA-Verhältnissen oder höheren Molekulargewichten. In 19-A gezeigte Daten zeigen, dass Cytotoxizität kein begrenzender Faktor für Poly-1 Vektoren ist, da Zellen selbst bei den höchsten Polymer/DNA-Verhältnissen lebensfähig bleiben. Andererseits legen die in 20-A gezeigten Daten nahe, dass Cytotoxizität ein Haupt faktor ist, der die Transfektionseffizienz von Poly-2 Vektoren begrenzt, insbesondere für die Polymere mit niedrigerem Molekulargewicht. Dieses Ergebnis kann erklären, warum Transfektionswirksamkeit für Poly-2 Vektoren bei Polymer/DNA > 30 nicht vorhanden oder sinkend ist (siehe 18-A).
  • Zelluläre Aufnahme.
  • Die Stabilität von durch Zellen aufzunehmenden Polymer/DNA-Komplexen wurde unter Verwendung einer vorher beschriebenen Flusscytometrie-basierten Technik bewertet, um die Fluoreszenz von Vektor-abgegebener DNA zu messen (Akinc, A., et al., Parallel synthesis and biophysical characterization of a degradable polymer library of gene delivery. J. Am. Chem. Soc., 2003). Kurz: Polymer/DNA-Komplexe wurden unter Verwendung von Plasmid-DNA hergestellt, kovalent markiert mit dem fluoreszierenden Farbstoff Cy5. Um Vergleich der zellulären Aufnahmedaten mit den oben skizzierten Genexpressionsdaten zu ermöglichen, wurden Komplexe in den gleichen Polymer/DNA-Verhältnissen und auf die gleiche Weise gebildet, wie in den Transfektionsversuchen. Markierte Komplexe wurden mit COS-7 Zellen für 1 Std. bei 37°C inkubiert, um Aufnahme zu ermöglichen. Der relative Grad der Partikelaufnahme wurde dann durch Messen der Fluoreszenz von mit Cy5-markierter DNA geladenen Zellen quantifiziert. Die Ergebnisse dieser Aufnahmeversuche werden in 21 und 22 zusammengefasst. In 21-B und 22-B gezeigte Daten legen nahe, dass der Mangel an Transfektionswirksamkeit für die Acrylat-terminierten Polymere keine Folge von Cytotoxizität ist, wie anfänglich angenommen, sondern eher von Unfähigkeit, in die Zelle einzudringen. Auf ähnliche Weise sind Poly-1 Komplexe bei allen außer den höchsten Polymer/DNA-Verhältnissen stark aufnahmebegrenzt (21-A). Während diese Daten nicht genau mit den für Poly-1 erhaltenen Transfektionsergebnissen korrelieren, sind sie mit der Tatsache konsistent, dass Transfektionswirksamkeit nicht beobachtet wird, bis sehr hohe Polymer/DNA-Verhältnisse eingesetzt werden. Poly-2 Komplexe zeigen keine nennenswerte zelluläre Aufnahme, bei Polymer/DNA-Verhältnissen < 30 und steigende Aufnahmegrade, wenn Polymer/DNA-Verhältnisse über 30 stiegen (22-A). Dieses Ergebnis, kombiniert mit den obigen Cytotoxizitätsergebnissen, hilft dabei, die Transfektionswirksamkeit von Poly-2 Komplexen zu erklären. Bei Polymer/DNA-Verhältnissen unter 30 dringen Komplexe nicht wirksam in die Zelle ein, aber wenn die Polymer/DNA-Verhältnisse weit über 30 steigen, beginnt Cytotoxizität Transfektionseffizienz einzuschränken, was optimale Transfektionswirksamkeit nahe Polymer/DNA = 30 ergibt.
  • Wo Endocytose der Hauptweg von zellulärem Eindringen ist, ist die wirksame Bildung von Polymer/DNA-Komplexen im Nanometer-Maßstab eine Anforderung zum Erreichen hoher Grade von zellulärer Aufnahme (De Smedt, S.C., J. Demeester und W.E. Hennink, Cationic polymer based gene delivery systems. Pharmaceutical Research, 2000. 17(2) p. 113-126; Prabha, S., et al., Size-dependency of nanoparticle-mediated gene transfection: studies with fractionated nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics, 2002, 244(1-2): p. 105-115). Die für viele der Polymer/DNA-Komplexe beobachteten schlechten Aufnahmegrade können der erfolglosen Bildung von stabilen Komplexen im Nanomaßstab zuzuschreiben sein. Unglücklicherweise verhinderte die schlechte Löslichkeit der Polymere bei neutralem pH das Durchführen von dynamischen Lichtstreuungsmessungen von Komplexgröße unter Verwendung des Transfektionsmediums (Opti-MEM reduziertes Serum Medien, pH 7,2) als Verdünnungsmittel. Die erhaltenen Ablesungen waren Polymerniederschlägen zuschreibbar, welche in einigen Fällen als Trübung in Lösungen von Polymer in Opti-MEM sichtbar waren. Jedoch waren wir in der Lage, die wirksamen Durchmesser von Komplexen unter Verwendung von 25 mM Natriumacetat (pH 5) als Probenverdünnungsmittel zu messen. Während diese Daten kein Licht auf die Größe oder Stabilität von Komplexen in dem Transfektionsmedium werfen können, können sie anzeigen, ob Komplexe vor Zugabe zum Transfektionsmedium erfolgreich gebildet wurden. Insbesondere fanden wir, das Versionen mit niedrigerem Molekulargewicht (Mw < 10700) von Poly-1 selbst in Acetatpuffer nicht in der Lage waren, Komplexe im Nanomaßstab zu bilden. In allen anderen Fällen fanden wir, dass Polymer/DNA-Komplexe in Nanometer-Größe gebildet wurden. Während diese Ergebnisse die schlechten Aufnahmegrade in Verbindung mit Versionen von Poly-1 mit niedrigem Molekulargewicht erklären können, erklären sie nicht zufriedenstellend die niedrige Aufnahmewirksamkeit der Acrylat-terminierten Polymere oder die Abhängigkeit von Polymer/DNA-Verhältnis von zellulärer Aufnahme. Obwohl Partikelgröße und Stabilität wichtige Faktoren sind, welche die zelluläre Aufnahme beeinflussen, ist es wahrscheinlich, dass weitere, noch nicht identifizierte Faktoren ebenfalls erwogen werden müssen, um eine komplexere Erklärung der erhaltenen Ergebnisse der zellulären Aufnahme vorzusehen. Verstärkung von Transfektion unter Verwendung eines Co-Komplexierungsmittels. Sowohl Poly-1, als auch Poly-2 erfordern relativ hohe Polymer/DNA-Gewichtsverhältnisse, um hohe Grade von Gentransfer zu erreichen. Eine Erklärung kann sein, dass verglichen mit anderen Polymeren, die häufig verwendet werden, um DNA zu kompaktieren (z.B. Polylysin (PLL) und PEI), diese Polymere relativ niedrige Stickstoffdichten haben. Poly-1 hat ein Molekulargewicht pro Stickstoffatom (MW/N) von 301, und Poly-2 hat ein MW/N von 329. Im Vergleich sind diese Zahlen für PLL und PEI grob 65, beziehungsweise 43. Es könnte möglich sein, die Menge an Poly-1 oder Poly-2, welche notwendig ist, um hohe Transfektionsgrade zu erreichen, durch Einschließen einer kleinen Menge an cokomplexierendem Wirkstoff zu verringern. Diese Herangehensweise könnte für Poly-2 Vektoren besonders zuträglich sein, weil Cytotoxizität eine wichtige Einschränkung für diese Vektoren zu sein scheint. Um diese Hypothese zu testen, wurden PLL und PEI als co-komplexierende Modellwirkstoffe verwendet. Wir fokussierten unsere Aufmerksamkeit auf das vielversprechenste Mitglied in jedem Polymersatz von Poly-1 (Amin-terminiert, Mw = 13100) und Poly-2 (Amin-terminiert, Mw = 13400). Die in 23 und 24 gezeigten Daten zeigen an, dass durch die Verwendung von PLL oder PEI als co-komplexierende Wirkstoffe eine signifikante Verringerung im Polymer erreicht werden konnte, während hohe Grade von Transfektionswirksamkeit beibehalten wurden. In einigen Fallen wurde signifikante Verstärkung von Transfektionswirksamkeit realisiert. Wie erwartet, war dieser Co-Komplexierungsansatz für Poly-2 Vektoren besonders zuträglich. Diese Arbeit und vorhergehende Arbeit (Wagner, E., et al., Influenza virus hemagglutinin HA-2 N-terminal fusogenic peptides augment gene transfer by transferrin-polylysine-DNA complexes: toward a synthetic viruslike gene-transfer vehicle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89(17): p. 7934-8; Fritz, J.D., et al., Gene transfer into mammalian cells using histone-condensed plasmid DNA. Hum. Gene Ther., 1996, 7(12): p. 1395-404; Pack, D.W., D. Putnam und R. Langer, Design of imidazole-containing endosomolytic biopolymers for gene delivery. Biotechnol. Bioeng., 2000. 67(2): p. 217-23; Lim, Y.B. et al., Self-Assembled Ternary Complex of Cationic Dendrimer, Cucurbituril, and DNA: Noncovalent Strategy in Developing a Gene Delivery Carrier. Bioconjug. Chem., 2002. 13(6): p. 1181-5), zeigt, dass die Mischung von Polymeren mit komplementären Gentransfer-Kennzeichen in einigen Fällen wirksamere Genabgabereagenzien erzeugen kann.
  • GFP-Transfektionen
  • Um die Transfektionseigenschaften der Poly-1/PLL und Poly-2/PLL gemischten Reagenzien weiter zu bewerten, führten wir Transfektionsversuche unter Verwendung eines für grünfluoreszierendes Protein (pCMV-EGFP) kodierenden Reporter-Plasmids durch. Obwohl die Luciferase- und GFP-Transfektionstestsysteme beide Transfektionswirksamkeit messen, sehen sie unterschiedliche Arten von Informationen vor. Das Luciferasesystem quantifiziert die Gesamtmenge an exogenem Luciferaseprotein, hergestellt durch alle Zellen in einer gegebenen Mulde, und liefert eine Messung von kumulativer Transfektionswirksamkeit Im Gegensatz dazu kann das GFP-System verwendet werden, um den Prozentsatz von Zellen zu quantifizieren, die transfiziert worden sind, und liefern ein Zelle-für-Zelle Maß für Transfektionswirksamkeit. Beide Systeme sind brauchbar und bieten sich ergänzende Informationen hinsichtlich der Transfektionseigenschaften eines gegebenen Genabgabesystems.
  • GFP-Transfektionen wurden auf ähnliche Weise wie die Luciferase-Experimente durchgeführt, aber wurden auf 6-Mulden-Plattenformat maßstäblich vergrößert (5 μg Plasmid/Mulde). COS-7 Zellen wurden unter Verwendung von Poly-1/PLL (Poly-1:PLL:DNA = 60/0,1/1 Gew./Gew./Gew.) und Poly-2/PLL (Poly-2:PLL:DNA = 15:0,4:1 Gew./Gew./Gew.) transfiziert. Lipofectamin 2000 (μl Reagens: μg DNA = 1:1), PEI (PEI:DNA = 1:1 Gew./Gew., N/P ~ 8) und nackte DNA wurden in dem Versuch als Kontrolle verwendet. Nach 1 Std. Inkubation mit Zellen wurden Vektoren entfernt und frisches Wachstumsmedium wurde zugegeben. Zwei Tage später wurde GFP-Expression unter Verwendung eines Flusscytometers getestet. Beinahe alle mit Poly-1/PLL transfizierten Zellen waren positiv für GFP-Expression (25 und 26). Experimente zeigten an, dass Poly-2/PLL Vektoren weniger wirksam waren, was grob 25% positive Zellen ergab. Positive Kontrollen Lipofectamin 2000 und PEI waren ebenfalls in der Lage, wirksame Transfektion von COS-7 Zellen unter den eingesetzten Bedingungen zu vermitteln. Obwohl Lipofectamin 2000 und PEI Transfektionen nahezu den gleichen Prozentsatz von GFP-positiven Zellen wie Poly-1/PLL ergaben, war der Fluoreszenzgrad von GFP-positiven Zellen für Poly-1/PLL (mittlere Fluoreszenz = 6033) höher, als von sowohl Lipofectamin 2000 (mittlere Fluoreszenz = 5453), als auch PEI (mittlere Fluoreszenz = 2882). Multiplizieren des Prozentsatzes von positiven Zellen mit dem mittleren Fluoreszenzgrad von positiven Zellen sieht ein Maß für Aggregat-Expression für die Probe vor und sollte in der Theorie besser mit den Ergebnissen von Luciferase-Genexpressionsversuchen korrelieren. Quantifizieren von gesamter GFP-Expression auf diese Weise zeigt an, dass der höchste Expressionsgrad durch Poly-1/PLL erreicht wird, gefolgt von Lipofectamin 2000 und PEI. Dieses Ergebnis steht in allgemeiner Übereinstimmung mit den Luciferase-Expressionsergebnissen.
  • Versuche haben gezeigt, dass Poly-1/PLL (Poly-1:PLL:DNA = 60:0,1:1 Gew./Gew./Gew.) ein hochgradig wirksamer Vektor zum Transfizieren von COS-7 Zellen ist. Die Fähigkeit dieses Vektors, Transfektion in drei anderen gewöhnlich verwendeten Zelllinien (CHO, NIH 3T3 und HepG2) zu vermitteln, wurde ebenfalls untersucht. Es ist sehr wahrscheinlich, dass jede dieser Zelllinien optimale Transfektionsbedingungen hat, die sich von jenen unterscheiden, welche verwendet wurden, um COS-7 Zellen zu transfizieren; jedoch wurden als vorläufige Bewertung der Fähigkeit, multiple Zelllinien zu transfizieren, Transfektionen auf die gleiche Weise und unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wie die COS-7 Transfektionen. Ergebnisse zeigen an, dass Poly-1/PLL (Poly-1:PLL:DNA = 60:0,1:1 Gew./Gew./Gew.) in der Lage ist, CHO, NIH 3T3 und HepG2 Zellen erfolgreich zu transfizieren, jedoch nicht so wirksam wie COS-7 Zellen (27). Dies ist nicht zu überraschend, da der verwendete Vektor durch Screening nach Gentransfer in COS-7 Zellen optimiert wurde. Optimierung von Vektorzusammensetzung und Transfektionsbedingungen, welche für jeden Zelltyp spezifisch sind, würden erwarten lassen, dass sich sogar höhere Transfektionsgrade ergeben.
  • Zusammenfassung
  • In dieser Arbeit ist die Rolle von Polymer-Molekulargewicht, Polymer-Kettenendgruppe und Polymer/DNA-Verhältnis auf eine Anzahl von wichtigen Gentransfereigenschaften untersucht worden. Von allen drei Faktoren wurde gefunden, dass sie eine signifikan te Wirkung auf Gentransfer haben, was den Nutzen betont, diese Parameter sorgfältig zu kontrollieren und zu optimieren. Zusätzlich verstärkt der Einschluss einer kleinen Menge an PLL, welche verwendet wird, um Komplexation zu unterstützen, Gentransfer weiter. Durch diese Herangehensweisen, abbaubare Poly(beta-aminoester)-basierte Vektoren, die mit einigen der besten verfügbaren nicht-viralen Vektoren für in vitro Gentransfer konkurrieren.
  • Beispiel 6 – Weitere Studien von ausgewählten Poly(beta-aminoestern)
  • Um einige der in vorhergehenden Screens identifizierten Poly(beta-aminoester) weiter zu kennzeichnen und zu synthetisieren wurden einundzwanzig Polymere bei verschiedenen Verhältnissen von Amin-Monomer zu Acrylat-Monomer resynthetisiert. Die sich ergebenden Polymere wurden durch Gelpermeationschromatographie gekennzeichnet, um das Molekulargewicht und Polydispersität von jedem Polymer zu bestimmen. Jedes der Polymere wurde dann auf seine Fähigkeit getestet, Zellen zu transfizieren.
  • Polymersynthese.
  • Die Polymere wurden wie in Beispiel 5 beschrieben synthetisiert. Mehrere Versionen jedes Polymers wurden durch Variieren des Amin/diacrylierten stöchiometrischen Verhältnisses erzeugt. Zum Beispiel entspricht C36-1 dem stöchiometrischen Verhältnis von 1,4 und C36-12 von 0,6, wobei alle Zwischenverbindungen in der Tabelle unten gezeigt werden:
    Version von C36 Amin:Acrylat stöchiometrisches Verhältnis
    C36-1 1,4
    C36-2 1,3
    C36-3 1,2
    C36-4 1,1
    C36-5 1,05
    C36-6 1,025
    C36-7 1,0
    C36-8 0,975
    C36-9 0,950
    C36-10 0,9
    C36-11 0,8
    C36-12 0,6
  • Die Polymere wurden typischerweise in Glasvialen ohne Lösungsmittel bei 100°C für 5 Stunden hergestellt. In einigen Synthesen ergab die Polymerisation bei 100°C hochgradig quervernetzte Polymere wenn bestimmte Monomere wie Amin 94 verwendet wurden; daher wurden die Polymerisationsumsetzungen bei 50°C mit 2 ml zugegebenen DMSO wiederholt, um Quervernetzung zu vermeiden.
  • Die sich ergebenden Polymere wurden durch GPC wie in Beispiel 5 beschrieben analysiert. Die Molekulargewichte und Polydispersitäten von jedem der Polymere werden in der Tabelle unten gezeigt:
    Polymer Mw Mn Polydispersität
    F28-1 5540 2210 2.50678733
    F28-2 6250 2460 2.5
    F28-3 8310 2920 2.845890411
    F28-4 11600 3660 3.169398907
    F28-5 16800 4360 3.853211009
    F28-6 16100 4850 3.319587629
    F28-7 18000 5440 3.571428571
    F28-8 18200 5710 3.187390543
    F28-9 22300 7884 2.829949239
    F28-10 23700 8780 2.699316629
    F28-11 12100 5660 2.137809187
    F28-12 4850 2920 1.660958904
    C36-1 7080 3270 2.165137615
    C36-2 5100 2640 1.931818182
    C36-3 21200 8090 2.620519159
    C36-4 20500 6710 3.05514158
    C36-5 112200 33200 3.379518072
    C36-6 21700 6890 3.149492017
    C36-7 36800 15700 2.343949045
    C36-8 35700 12600 2.833333333
    C36-9 35200 15100 2.331125828
    C36-10 22500 9890 2.275025278
    C36-11 26000 6060 4.290429043
    D60-1 1890 1400 1.35
    D60-2 2050 1520 1.348684211
    D60-3 2670 1720 1.552325581
    D60-4 3930 2210 1.778280543
    D60-5 5130 2710 1.89298893
    D60-6 5260 2800 1.878571429
    D60-7 1130 1090 1.036697248
    D60-8 1840 1510 1.218543046
    D60-9 6680 3440 1.941860465
    D60-10 8710 4410 1.975056689
    D60-11 9680 4410 2.195011338
    D60-12 7450 3470 2.146974063
    D61-1 1710 1410 1.212765957
    D61-2 2600 1790 1.452513966
    D61-3 3680 2280 1.614035088
    D61-4 4630 2550 1.815686275
    D61-5 NA NA NA
    D61-6 NA NA NA
    D61-7 6110 3250 1.88
    D61-8 6410 3250 2.009404389
    D61-9 6790 3440 1.973837209
    D61-10 8900 4350 2.045977011
    D61-11 10700 4600 2.326086957
    D61-12 6760 2900 2.331034483
    F32-1 10300 3260 3.159509202
    F32-2 11100 3490 3.180515759
    F32-3 16600 4820 3.443983402
    F32-4 17300 5390 3.209647495
    F32-5 18600 5830 3.190394511
    F32-6 26200 8290 3.160434258
    C32-1 6670 2810 2.37366548
    C32-2 18100 5680 3.186619718
    C32-3 19300 6060 3.184818482
    C32-4 25600 9100 2.813186813
    C32-5 25000 7860 3.180661578
    C32-6 25700 8440 3.045023697
    C86-1 14200 2900 4.896551724
    C86-2 21000 2900 7.24137931
    C86-3 27500 4590 5.991285403
    U94-1 10700 3530 3.031161473
    U94-2 NA NA NA
    U94-3 NA NA NA
    F32-1 10300 3260 3.159509202
    F32-2 11100 3490 3.180515759
    F32-3 16600 4820 3.443983402
    F32-4 17300 5390 3.209647495
    F32-5 25000 7860 3.180661578
    F32-6 26200 8290 3.160434258
    C32-1 6670 2810 3.186619718
    C32-2 18100 5680 3.186619718
    C32-3 19300 6060 3.184818482
    C32-4 25600 9100 2.813186813
    C32-5 25000 7860 3.180661578
    C32-6 25700 8440 3.045023697
    U86-1 ungewöhnlich NA NA
    U86-2 ungewöhnlich NA NA
    U86-3 ungewöhnlich NA NA
    U86-4 ungewöhnlich NA NA
    U85-5 ungewöhnlich NA NA
    JJ32-1 9730 4010 2.426433915
    JJ32-2 12100 4580 2.641921397
    JJ32-3 19400 6510 2.980030722
    JJ32-4 27900 10000 2.79
    JJ32-5 32600 9720 3.353909465
    JJ32-6 28900 9870 2.928064843
    JJ36-1 7540 3550 2.123943662
    JJ36-2 143500 59600 2.407718121
    JJ36-3 20100 7310 2.749658003
    JJ36-4 30200 10200 2.960784314
    JJ36-5 33900 10600 3.198113208
    JJ36-6 36100 12500 2.888
    JJ28-1 7550 3240 2.330246914
    JJ28-2 9490 3460 2.742774566
    JJ28-3 16800 5420 3.099630996
    JJ28-4 23300 8090 2.880098888
    JJ28-5 25500 7700 3.311688312
    JJ28-6 32100 10900 2.944954128
    U28-1 7190 2580 2.786821705
    U28-2 10700 3990 2.681704261
    U28-3 15600 7300 2.136986301
    U28-4 20400 9880 2.064777328
    U28-5 20500 9670 2.119958635
    U28-6 24200 13000 1.861538462
    E28-1 5900 3280 1.798780488
    E28-2 7950 3550 2.23943662
    E28-3 14300 6300 2.26984127
    E28-4 6990 3320 2.105421687
    E28-5 17400 8180 2.127139364
    E28-6 19300 9030 2.137320044
    LL6-1 2380 1570 1.515923567
    LL6-2 3350 2070 1.618357488
    LL6-3 4110 2340 1.756410256
    LL6-4 5750 3010 1.910299003
    LL6-5 7810 5050 1.546534653
    LL6-6 6950 4190 1.658711217
    LL8-1 3160 1910 1.654450262
    LL8-2 3630 2560 1.41796875
    LL8-3 5300 3520 1.505681818
    LL8-4 6000 3320 1.807228916
    LL8-5 8160 4730 1.725158562
    LL8-6 7190 4650 1.546236559
    U36-1 7290 3370 2.163204748
    U36-2 11100 5000 2.22
    U36-3 12600 5470 2.303473492
    U36-4 21500 8550 2.514619883
    U36-5 24700 9430 2.619300106
    U36-6 31700 10700 2.962616822
    E36-1 6030 3130 1.926517572
    E36-2 8510 4040 2.106435644
    E36-3 12800 5730 2.233856894
    E36-4 18200 762 2.388451444
    E36-5 20100 8050 2.49689441
    E36-6 32900 10900 3.018348624
    U32-1 9830 3790 2.593667546
    U32-2 12000 4460 2.69058296
    U32-3 18200 6780 2.684365782
    U32-4 25200 11100 2.27027027
    U32-5 26500 9360 2.831196581
    U32-6 26200 10600 2.471698113
    E32-1 7070 3310 2.135951662
    E32-2 9920 4180 2.373205742
    E32-3 14700 6080 2.417763158
    E32-4 23500 9160 2.565502183
    E32-5 28800 10000 2.88
    E32-6 26900 10300 2.611650485
    C94-1 6760 3110 2.173633441
    C94-2 10800 4190 2.577565632
    C94-3 18000 5330 3.377110694
    C94-4 38900 6660 5.840840841
    C94-5 löste sich nicht NA NA
    C94-6 löste sich nicht NA NA
    D94-1 6030 2980 2.023489933
    D94-2 6620 3370 1.964391691
    D94-3 9680 3950 2.450632911
    D94-4 11500 4510 2.549889135
    D94-5 13700 4940 2.773279352
    D94-6 18800 5650 3.327433628
    F94-1 5570 2740 2.032846715
    F94-2 7670 3180 2.411949686
    F94-3 12600 4230 2.978723404
    F94-4 20300 5160 3.934108521
    F94-5 21500 5390 3.988868275
    F94-6 27300 6310 4.326465927
    JJ94-1 7750 3360 2.306547619
    JJ94-2 12700 4590 2.766884532
    JJ94-3 30500 7280 4.18956044
    JJ94-4 löste sich nicht NA NA
    JJ94-5 löste sich nicht NA NA
    JJ94-6 löste sich nicht NA NA
    F86-1 3940 2630 1.498098859
    F86-2 5300 3190 1.661442006
    F86-3 7790 4040 1.928217822
    F86-4 11000 5410 2.033271719
    F86-5 10600 5650 1.876106195
    F86-6 13300 6440 2.065217391
    D86-1 4610 2830 1.628975265
    D86-2 5570 3290 1.693009119
    D86-3 7120 3770 1.888594164
    D86-4 8310 4440 1.871621622
    D86-5 8950 4710 1.900212314
    D86-6 10400 5010 2.075848303
    U86-1 5940 350 1.697142857
    U86-2 7780 4430 1.756207675
    U86-3 11900 6540 1.819571865
    U86-4 15100 7630 1.979030144
    U86-5 16300 8950 1.82122905
    U86-6 18100 9810 1.845056065
    E86-1 4880 3140 1.554140127
    E86-2 6300 3790 1.662269129
    E86-3 9780 5140 1.902723735
    E86-4 12500 6350 1.968503937
    E86-5 13400 6820 1.964809384
    E86-6 15500 7280 2.129120879
    JJ86-1 5460 3370 1.620178042
    JJ86-2 6880 4080 1.68627451
    JJ86-3 11900 6180 1.925566343
    JJ86-4 14200 7000 2.028571429
    JJ86-5 20500 9090 2.255225523
    JJ86-6 16300 7770 2.097812098
    C86-1 4870 3030 1.607260726
    C86-2 5720 3460 1.653179191
    C86-3 9970 5060 1.970355731
    C86-4 14200 7000 2.028571429
    C86-5 17700 8500 2.082352941
    C86-6 17800 8500 2.094117647
    C80-1 2450 1790 1.368715084
    C80-2 3770 2370 1.5907173
    C80-3 6080 3370 1.804154303
    C80-4 7960 4310 1.846867749
    C80-5 9030 4660 1.93776824
    C80-6 12600 6050 2.082644628
    E80-1 2840 2010 1.412935323
    E80-2 3720 2420 1.537190083
    E80-3 6080 3650 1.665753425
    E80-4 7210 4240 1.700471698
    E80-5 7640 4290 1.780885781
    E80-6 9000 5310 1.694915254
    JJ80-1 3410 2180 1.564220183
    JJ80-2 4590 2890 1.588235294
    JJ80-3 8430 4750 1.774736842
    JJ80-4 11300 6560 1.722560976
    JJ80-5 13200 7160 1.843575419
    JJ80-6 11600 6540 1.773700306
    U80-1 4300 2680 1.604477612
    U80-2 5130 3020 1.698675497
    U80-3 8320 4700 1.770212766
    U80-4 9130 4880 1.870901639
    U80-5 11300 5750 1.965217391
    U80-6 11200 5920 1.891891892
  • Luciferase-Transfektionstest.
  • Wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden COS-7 Zellen mit pCMV-Luc DNA unter Verwendung jedes der Polymere bei Polymer-zu-DNA Verhältnissen im Bereich von 10:1 bis 100:1 (Gewicht:Gewicht) transfiziert. Luciferase-Expression wurde unter Verwendung von Bright-Glo Testkits (Promega) analysiert. Lumineszenz wurde für jede Transfektion gemessen und die Lumineszenz wurde verwendet, um Nanogramm Luciferase-Enzym zu berechnen, wie in Beispiel 5 beschrieben. Versuche wurden vierfach durchgeführt und die in den Tabellen unten gezeigten Werte sind die durchschnittlichen Werte von den vier Versuchen. Diese Daten werden unten für jedes synthetisierte Polymer gezeigt.
    C36-1 C36-2 C36-3 C36-4 C36-5 C36-6 Verhältnis
    0.168527 0.345149 0.62799 0.152258 0.06835 0.094073 10
    3.5846 0.12639 21.2786 2.145388 0.16304 0.184298 20
    4.295966 0.927605 18.8404 4.750661 0.287989 1.06383 30
    7.150343 1.137242 17.04771 7.529555 0.080757 0.332789 40
    3.74705 1.180274 6.875879 9.710764 0.582186 1.963895 60
    0.705683 0.212297 0.560245 7.221382 5.00384 5.813189 100
    C36-7 C36-8 C36-9 C36-10 C36-11 C-36-12 Verhältnis
    0.164373 0.085336 0.116502 0.042173 0.062905 0.1887 10
    0.13413 0.096043 0.091152 0.032851 0.032115 0.383965 20
    0.020768 0.021203 0.0665 0.021953 0.017807 0.288102 30
    0.05027 0.060731 0.017768 0.011885 0.008923 0.128469 40
    0.031233 0.048807 0.025626 0.012516 0.002606 0.213173 60
    0.116587 0.129504 0.332497 0.123413 0.058442 0.250788 100
    C86-1 C86-2 C86-3 Verhältnis
    0.157713 0.475708 1.093272 10
    0.242481 0.616621 1.439904 20
    0.396888 0.992601 1.758045 30
    0.300173 1.27670 1.901677 40
    D60-1 D60-2 D60-3 D60-4 D60-5 D60-6 Verhältnis
    0.604984 0.443875 0.363271 0.260475 0.498462 0.466087 10
    0.11574 0.174976 0.250613 0.40783 0.587186 0.89381 20
    0.138372 0.45915 0.81101 0.773161 1.264634 1.438474 30
    0.135287 0.506303 2.344053 1.695591 2.302305 2.959638 40
    0.203804 0.679718 3.908348 2.216808 3.129304 4.335511 60
    0.233546 0.640246 0.251146 3.112999 7.65786 6.759895 100
    D60-7 D60-8 D60-9 D60-10 D60-11 060-12 Verhältnis
    0.299777 0.333863 0.434027 0.4686 0.387458 0.211083 10
    0.237477 0.266398 1.211246 1.38523 1.034892 0.215027 20
    0.339709 0.665539 2.958346 5.60766 3.514454 0.485295 30
    0.499842 1.216181 4.406196 6.73627 5.121445 0.444359 40
    1.297394 1.009228 5.951785 9.565956 7.193687 0.35831 60
    5.399266 3.135852 5.725666 10.4556 5.414051 0.245279 100
    D61-1 D61-2 D61-3 D61-4 D61-5 D61-6 Verhältnis
    0.329886 0.29803 0.190101 0.142813 0.11456 0.227593 10
    0.299409 0.710035 0.29550 0.288845 0.247909 0.32839 20
    0.155568 0 . 680763 0 . 61802 0.651633 0.402721 1.831437 30
    0.085824 0.620294 3.722971 4.572264 3.010274 11.69027 40
    0.188357 0 . 1879791 3 . 970054 7.147033 10.25674 9.238981 60
    0.019321 0.0013591 0.034958 0.033062 0.202601 0.131544 100
    D61-7 D61-8 D61-9 D61-10 D61-11 D61-12 Verhältnis
    0.153122 0.180646 0.107 0.244713 0.231561 0.18571 10
    0.203312 0.217288 0.19110 0.185759 0.270723 0.119897 20
    0.539455 0.239807 0.140418 0.174014 0.320869 0.094186 30
    1.679507 1.020126 0.584908 0.229946 0.474142 0.154025 40
    12.69543 5.9829 7.008946 1.308281 0.301803 0.067526 60
    1.271189 2.402989 3.186707 5.576734 1.343239 0.115366 100
    U94-1 U94-2 U94-3 Verhältnis
    0.233894 0.127165 0.804911 10
    0.179855 1.35532 13.53974 20
    0.275078 16.26098 20.65427 30
    1.161574 19.93922 13.08098 40
    1.961067 18.39299 9.319949 60
    13.0485 7.591092 1.647718 100
    C32-1 C32-2 C32-3 C32-4 C32-5 C32-6 Verhältnis
    0.137436 0.544141 0.138034 0.112832 0.087552 0.131699 10
    0.159782 28.93062 14.3276 0.316178 0.125792 0.242881 20
    0.166661 53.90695 24.83791 0.67551 0.193545 0.181321 30
    0.392402 90.62006 49.11244 2.271509 0.563168 0.632798 40
    6.034825, 73.59378 46.31 2.490156 0.111248 0.273411 60
    38.17463 60.21433 51.86994 16.4340 2.01284 2.61928 100
    F32-1 F32-2 F32-3 F32-4 F32-5 F32-6 Verhältnis
    0.746563 2.446604 1.288067 0.210478 0.202798 0.112283 10
    20.84138 20.94165 11.46963 1.780569 10.90572 0.100889 20
    23.8042 23.7095 13.34488 5.01115 9.510119 0.255589 30
    17.47681 17.35353 14.74619 8.361793 6.436393 0.599084 40
    10.54807 11.78762 13.58168 7.499322 4.865577 0.322946 60
    0.072034 0.090408 0.332458 2.300951 2.434663 1.644695 100
    F28-1 F28-2 F28-3 F28-4 F28-5 F28-6 Verhältnis
    0.245612 0.247492 0.140455 0.203674 0.0942 0.131075 10
    0.464885 0.192584 0.217777 0.213391 0.171565 0.39771 20
    0.290643 0.19239 0.396845 0.433955 0.361789 2.02073 30
    0.325066 0.189405 1.048323 2.088649 3.888705 19.95507 40
    0.108766 0.164709 13.95859 0.411927 7.851029 21.77709 60
    0.163978 6.619239 6.832291 8.409421 6.682506 2.958283 100
    F28-7 F28-8 F28-9 F28-10 F28-11 F28-12 Verhältnis
    0.094505 0.043474 0.05224 0.050384 0.104016 0.149513 10
    0.173987 0.098512 0.069287 0.057704 0.131067 0.028219 20
    0.705917 0.254424 0.083005 0.04454 0.133842 0.001619 30
    2.860034 0.928959 0.226468 0.076503 0.095093 0.003896 40
    7.786755 1.932506 0.42898 0.028744 0.063298 0.001342 60
    8.655579 12.729 1.396803 0.281853 0.115513 0.001145 100
    JJ28-1 JJ28-2 JJ28-3 JJ28-4 JJ28-5 JJ28-6 Verhältnis
    0.122351 0.056864 0.030798 0.041065 0.02373 0.051849 10
    0.060598 0.059073 22.46575 2.229717 0.076134 0.053754 20
    0.174243 0.211589 21.92396 4.089533 0.121043 0.115906 30
    0.133603 36.42899 69.60415 19.16868 0.292215 0.337099 40
    1.011778 64.69601 71.50927 47.49171 0.755335 0.654333 60
    60.46546 56.7025 53.44758 39.13032 25.81403 3.936471 100
    JJ36-1 JJ36-2 JJ36-3 JJ36-4 JJ36-5 JJ36-6 Verhältnis
    0.506359 1.634649 0.146132 0.053268 0.035023 0.03360 10
    2.185596 4.332834 0.677853 0.017846 0.010687 0.004264 20
    2.339652 5.039758 0.773873 0.024164 0.06932 0.009318 30
    0.681878 1.871844 1.539743 0.087428 0.017886 0.009752 40
    0.521703 1.592328 2.000554 0.201203 0.027165 0.004975 60
    0.003277 0.067895 1.031285 0.284902 0.159879 0.008844 100
    JJ32-1 JJ32-2 JJ32-3 JJ32-4 JJ32-5 JJ32-6 Verhältnis
    0.392821 1.158486 0.19153 0.127891 0.099083 0.076569 10
    17.51289 21.24103 1.803172 0.065286 0.160362 0.108887 20
    38.08705 43.77517 24.76927 0.09612 0.063692 0.044659 30
    25.9567 34.88211 26.36994 0.201907 0.015214 0.026165 40
    11.37519 17.48944 29.59326 0.175101 0.052321 0.098545 60
    1.3311 1.288845 6.86144 0.70071 0.178921 0.70361 100
    LL6-1 LL6-2 LL6-3 LL6-4 LL6-5 LL6-6 Verhältnis
    0.405305 0.583416 0.520853 0.50183 0.656802 1.060478 10
    0.411758 0.747731 0.460075 0.287671 0.382454 1.099616 20
    0.809416 0.377302 1.253481 1.099976 2.59164 1.138122 30
    0.475903 0.854576 1.812577 2.018906 2.837056 0.69298 40
    0.139647 0.29034 0.939013 1.992525 2.250511 3.059824 60
    0.00154 0.002408 0.223682 2.932931 3.939451 6.879564 100
    LL8-1 LL8-2 LL8-3 LL8-4 LL8-5 LL8-6 Verhältnis
    0.533009 1.180815 1.581011 2.254195 1.73015 1.76882 10
    1.174539 1.228513 1.002632 2.369943 1.958308 2.928439 20
    1.182611 1.620962 3.771897 3.988759 3.936124 0.000474 30
    1.366191 1.875091 4.594308 4.253834 4.07168 0.000948 40
    0.120086 0.866135 1.925861 4.423822 4.081074 5.08313 60
    0.003316 0.029499 0.33677 4.077347 4.416413 4.241522 100
    U28-1 U28-2 U28-3 U28-4 U28-5 U28-6 Verhältnis
    0.049477 0.044465 0.045254 0.034669 0.031628 0.025942 10
    0.111915 0.050661 0.03988 0.015399 0.049004 0.020729 20
    0.041895 0.050582 0.048212 0.064917 0.069067 0.02756 30
    0.122271 0.078429 1.647405 0.488561 1.036216 0.058913 40
    0.059982 0.051095 18.03734 5.718868 1.991446 0.176516 60
    0.059585 44.91463 51.17075 34.01612 32.39362 3.488256 100
    E28-1 E28-2 E28-3 E28-4 E28-5 E28-6 Verhältnis
    0.109892 0.150078 0.630192 0.187585 0.311968 0.168724 10
    0.088189 0.509429 0.589377 0.106743 0.70723 0.144608 20
    1.672278 12.4166 21.41889 3.405963 8.337341 1.32881 30
    5.658186 12.17055 13.3351 7.272109 17.92266 5.089686 40
    6.016333 5.424512 5.549474 5.185252 15.62457 8.706483 60
    1.146098 0.804227 0.592348 0.529551 1.752402 5.438448 100
    U36-1 U36-2 U36-3 U36-4 U36-5 U36-6 Verhältnis
    0.158334 0.388325 0.255439 0.139618 0.069735 0.054654 10
    0.281155 2.119615 0.34803 0.196109 0.111805 0.067406 20
    0.968904 2.501669 3.74982 0.370814 0.103744 0.077397 30
    0.559332 1.595139 4.650123 0.65127 0.078343 0.029797 40
    0.565322 0.540675 4.182981 1.59494 0.250723 0.029297 60
    0.238507 0.008686 1.052448 2,269889 1.310025 0.23654 100
    E36-1 E36-2 E36-3 E36-4 E36-5 E36-6 Verhältnis
    0.130066 2.940734 0.350723 0.077836 0.051293 0.018123 10
    1.044698 1.866482 2.236257 0.135236 0.0636655 0.020018 20
    1.044698 0.617286 4.27308 0.882725 0.187495 0.01532 30
    0.342085 0.025849 1.935655 1.170393 0.23494 0.004896 40
    0.112427 0.211108 1.068847 1.362371 0.628612 0.070175 60
    0.002566 0.003672 0.131476 1.367514 1.194649 0.11883 100
    U32-1 U32-2 U32-3 U32-4 U32-5 U32-6 Verhältnis
    0.202681 0.107654 0.035536 0.037195 0.041027 0.047701 10
    0.106511 0.084192 0.067327 0.012951 0.028982 0.012003 20
    1.497135 2.867785 1.828273 0.056586 0.033682 0.010305 30
    4.411592 13.8534 0.272404 0.056588 0.029377 0.021045 40
    17.28347 38.37457 3.026925 0.017452 0.015556 0.060968 60
    11.81885 13.6584 15.23297 0.673546 0.121004 0.15261 100
    E32-1 E32-2 E32-3 E32-4 E32-5 E32-6 Verhältnis
    0.481414 0.898699 0.149685 0.093788 0.086886 0.046001 10
    5.170892 6.057429 1.52106 0.054373 0.099557 0.01378 20
    0.965091 2.279423 4.380769 0.112159 0.027166 0.038894 30
    0.848062 1.086906 3.971834 0.13767 0.068236 0.090555 40
    0.225141 0.688091 2.653561 0.570809 0.080796 0.01603 60
    0.046762 0.176583 0.897883 1.365759 0.845009 0.111133 100
    C94-1 C94-2 C94-3 C94-4 Verhältnis
    0.289113 0.086166 0.151651 0.203119 10
    0.133487 0.045908 0.067867 7.650297 20
    0.293536 0.086328 0.853319 10.31612 30
    0.198737 0.170611 1.955433 9.745005 40
    0.312808 0.908991 3.536115 3.580573 60
    0.32801 0.853063 2.414853 1.731594 100
    D94-1 D94-2 D94-3 D94-4 D94-5 D94-6 Verhältnis
    0.223798 0.091225 9.083876 0.272732 0.46751 5.545365 10
    9.682036 15.16589 24.65534 25.45656 27.30727 25.52283 20
    14.53736 22.28715 29.68042 38.12112 42.28773 33.35092 30
    9.804481 14.97104 18.63768 28.87773 35.67401 28.4263 40
    6.36291 11.60176 16.02556 27.2195 29.006 16.62105 60
    2.681942 2.585502 3.03267 9.218975 12.48001 9.63693 100
  • Die folgenden Tabellen zeigen die Synthese der rechts aufgelisteten Polymere unter Verwendung von Verhältnissen von Amin-Monomer zu Acrylat-Monomer im Bereich von 1,4 bis 0,6, wie oben beschrieben. Jede Synthese des Polymers wurde dann unter Verwendung von sechs unterschiedlichen Polymer zu DNA Verhältnissen auf Luciferase-Transfektion getestet (jeder Versuch wurde vierfach durchgeführt). Die Daten in der Tabelle repräsentieren die Luciferasewirksamkeit unter dem besten Polymer zu DNA Verhältnis. Mol-Verhältnis von Amin-Monomer zu Acrylat-Monomer
    Polymer 1.400 1.300 1.200 1.100 1.050 1.025 1.000 0.975 0.950 0.900 0.800 0.600
    C36 1.18 7.150343 21.27867 9.710764 5.003849 5.813189 0.184373 0.129504 0.332497 0.123413 0.062905 0.383965
    C86-1 0.396888 1.276707 1.901677
    D60-NoDMS 0.604984 0.679718 3.908348 3.112999 7.65786 6.759895 5.399266 1.216181 5.951785 10.45568 7.193687 0.485295
    D61-NoDMSO 0.329886 0.710035 3.970054 7.147033 10.85674 11.69027 12,69543 5.9829 7.008948 5.576734 1.343239 0.18571
    U94-1 13.0485 19.93922 20.65427
    F32 23.8042 23.7095 14.74619 8.361793 10.90572 1.644695
    F28 0.464885 6.619239 13.95859 8.408421 7.851029 21.77709 8.655579 12.729 1.396803 0.281853 0.133842 0.149513
    JJ36 2.339652 5.039758 2.000554 0.284902 0.159879 0.033605
    JJ32 38.08705 43.77517 29.59326 0.70071 0.178921 0.70361
    LL6 0.809416 0.854576 1.812577 2.932931 3.939451 6.879564
    LL8 1.366191 1.875091 4.594308 4.423822 4.416413 5.083137
    U28 0.122271 44.91463 51.17075 34.01612 32.39362 3.488256
    E28 6.016333 12.4166 21.41889 7.272109 17.92266 8306468
    U36 0.968904 2.501669 4.650123 2.269889 1.310025 0.23654
    E36 1.044698 2.940734 4.27308 1.367514 1.194849 0.11883
    U32 17.28347 38.37457 15.23297 0.673546 0.121004 0.15261
    E32 5.170892 6.057429 4.380769 1.365759 0.845009 0.111133
    C94 0.32801 0.908991 3.536115 10.31612
    D94 14.53736 22.28715 29.68042 38.12112 42.28773 33.35092
    F94 0.490553 4.108079 3.530146 8.596197 8.200005 9.692867
    JJ94 1.908203 3.87783 11.99391 0.422621 0.590515 0.787162
    E28 8.572344 20.89276 14.87007
    U28 0.221192 0.515945 0.290904 0.237264
    JJ86 0.503544 0.775429 0.794641 0.5377706 1.491694 0.707425
    C86 0.159044 0.279389 0.637804 1.055779 1.025192 1.422756
    U86 0.435638 0.196901 0.124174 0.304979 0.193936 0.189116
    E86 0.27629 0.248666 3.633516 8.288459 9.202082 8.484492
    C80 0.578045 0.102763 0.111304 0.528832 0.887811 0.961981
    E80 1.697744 2.624376 3.868368 3.757709 4.412999 1.895016
    JJ80 0.5771 0.4786 2.199535 3.226941 3.173297 2.653163
    U80 0.119897 0.514079 2.658899 3.552453 4.456214 9.776965
    D24 0.528541 2.021508 0.324894 36.64054 0244347 0.365902
    E24 0.098517 0.057019 7.404745 1.12791 0.329197 0.326384
    JJ24 0.199154 0.188046 0.090045 0.064921 0.085989 0.032536
    B17 0.72135 0.44715 0.995508 1.067002 1.098275 2.197846
    M17 0.433646 0.580405 0.484853 0.515332 0.672973 0.763891 1.360645 2.580579 2.016952 7.131925 2.21044 0.743141
    M17-DMSO 0.550188 0.409299 0.304933 0.35066 0.404506 0.356775 0.392121 0.376042 0.34777 0.315241 0.468629 0.705352
    B17 D 0.814141 0.505597 0.339601 0.319609 0.399828 0.406147
    U28 0.334806 0.137402 0.079535 0.165612 0.097702 0.126852
    U36 0.331156 0.344857 0.209068 0.107622 0.151587 0.170145
    U32 0.046949 0.026455 0.070335 0.047503 0.033368 0.0261
    C20 0.126573 0.098883 0.088576 1.003372 0.11883 0.138726
    JJ20 0.085338 40.19751 47.297 5.655104 0.142257 0.099295
    E20 18.94919 36.04742 31.97179 24.49528 21.63777 10.55303
    C25 0.11105 0.044342 0.09737 0.031668 0.088061 0.05876
    U25 0.055718 0.056074 0.069147 0.047859 0.04537 0.088747
    D25 0.105104 0.352229 3.212175 6.167455 1.617246 1.792186
    D70 8.351581 5.601882 9.168348 14.68248 6.364419 0.469952
    D60 7.304436 11.02975 23.49095 28.06659 33.97336 37.83182
    D61 1.380167 4.035848 11.99391 13.699 17.53849 13.43072
    D28 0.413278 0.514204 3.603404 3.728115 4.341368 5.008521
    U94 0.221982 1.599895 8.333159 7.73556 4.522964
    D32 1.575371 3.507692 5.129846 4.854435 4.354122 1.223865
    D38 1.223865 3.23725 10.5529 13.66078 16.39008 10.61988
    D93 0.431042 1.393065 2.759499 1.938168 2.074542 1.899193
    U93 0.378613 0.265617 0.269287 0265163 0.469461 0234903
    D87 3.470383 5.898457 6.532941 4.89156 6.953568 8.573921
    U87 0.508655 4.4622 1.069028 2.533226 3.684956 11.63637
    C75 1.30574 0.85262 0.67639 1.163913 0.657287 0.424571
    U75 1.14537 0.966531 1.593702 1.795307 1.200891 0.996441
    O20 12.02047 30.23826 24.32419
    O28 4.713009 18.89851 18.38595 5.343957 3.177194
    C94 2.131856 1.441007 2.383634 3.570587
    LL6
    DMSO 1.085814 1.91664 2.079375 3.927835 3.569052 1.05484
    LL8 7.580783 3.919499 2288471 1.802625 1.78288 2.587781
    AA20 9.741539 28.79155 49.99779 35.07 19.7298 29.80328
    AA28 12.25819 21.71281 45.51628 21.78183 19.18808 0.728069
    E94 2.628722 3.159991 1.967481 2.126174
    D86 1.921027 1.570282 1.432655 3.219622 2.415026 8.751029
    F86 0.17035 0.215518 0.282999 0.337696 0.484268 0.711768
    AA36 4.711737 21.29782 1.774284 10.77378 5.006065
    AA24 40.22306 0.044737 0.017176 0.009595 0.044026 0.013425
    AA94 3.146781 0.013148
    AA24 37.20033 50.33195 31.79067 7.632073 4.029482 0.311914
    O24 21.68262 21.08162 18.4584 6.134765 0.401993 0.014254
    AA60 3.475337 14.91753 0.695475
    AA61 0.656416 0.329589 0.543264 0.257434 0.577986 0.307582
    C32 38.17463 90.62006 51.86994 16.43407 2.01284 2.619288
    JJ28 60.46546 64.69601 71.50927 47.49171 25.81403 3.936471
    C28 0.310004 0.760135 55.91046 60.63145 57.30086 6.495379
    AA28 50.34727 55.18143
    U28 0.122271 44.91463 51.17075 34.01612 32.39362 3.488256
    AA24 37.20033 50.33195 31.79067 7.632073 4.029482 0.311914
    AA20 9.741539 25.79155 49.99779 35.07 19.7298 29.80328
    JJ20 0.085338 40.19751 47.297 5.655104 0.142257 0.099295
    AA28 12.25819 21.71281 45.51628 21.78183 19.18808 0.728069
    JJ32 38.08705 43.27517 29.59326 0.70071 0.178921 0.70361
    D94 14.53736 22.28715 29.68042 38.12112 42.28773 33.35092
    AA24 40.22306 0.044737 0.017176 0.009595 0.044026 0.013425
    U32 17.28347 38.37457 15.23297 0.673546 0.121004 0.15261
    D60* 7.304436 11.02975 23.49095 28.06859 33.97336 37.83182
    D24* 0.526541 2.021508 0.324894 36.64054 0.244347 0.365902
    E20 18.94919 36.04742 31.97179 24.49526 21.63777 10.55303
    O20 12.02047 30.23826 24.32419
    F32 23.8042 23.7095 14.74619 8.361793 10.90572 1.644695
    F28 0.464885 6.619239 13.95859 8.409421 7.851029 2127709 8.655579 12.729 1.396803 0.281853 0.133842 0.149513
    O24* 21.68262 21.08162 18.4584 6.134765 0.401993 0.014254
    AA36* 4.711737 21.29782 1.774264 10.77378 5.006065
    C36 7.150343 1.180274 21.27467 9.710764 5.003849 5.813189 0.164373 0.129504 0.332497 0.123413 0.062905 0.383965
    E28 8.572344 20.89276 14.87007
    U94 13.0485 19.93922 20.65427
    O28 4.713009 18.89861 18.38595 5.343957 3.177194
    D81* 1.380167 4.035848 11.99391 13.699 17.53849 13.43072
    D38 1.223885 3.236725 10.5529 13.66078 16.39008 10.61988
    AA60* 3.475337 14.91753 0.695475
    D70* 8.351581 5.601802 9.168348 14.68248 6.364419 0.469952
    D61 0.329886 0.710035 3.970054 7.147033 10.85674 11.69027 12.69543 5.9829 7.008946 5.576734 1.343239 0.18571
    JJ94 1.906203 3.87783 11.99391 0.422621 0.590515 0.787162
    U87* 0.508655 4.4262 1.069028 2.533226 3.684956 11.63637
    D60 0.604984 0.679718 3.908348 3.112999 7.65786 6.759895 5.399266 1.216181 5.951785 10.45568 7.193687 0.485295
    C94* 0.32801 0.908991 3.536115 10.31612
    F94* 0.490553 4.108079 3.530146 8.596197 8.200005 9.892867
    U80* 0.119897 0.514079 2.658899 3.552453 4.456214 9.776965
    E86* 0.27629 0.248666 3.633516 6.288459 9.202082 8.484492
    D86* 1.921027 1.570262 1.432655 3.219622 2.415026 8.751029
    D87* 3.470383 5.898457 6.532941 4.89156 6.953566 8.573921
    U94* 0.221982 1.599895 8.333159 7.73556 4.522984
    LL8 7.580783 3.919499 2.288471 1.802625 1.78288 2.567781
    E24 0.098517 0.057019 7.404745 1.12791 0.329197 0.326384
    M17 0.580405 0.433646 0.484853 0.515332 0.672973 0.783891 1.360645 2.580579 2.016952 7.131925 2.21044 0.743141
    LL6 0.809416 0.854576 1.812577 2.932931 3.939451 6.679564
    D25* 0.105104 0.352229 3.212175 6.167455 1.617246 1.792186
    E32 5.170892 6.057429 4.380769 1.365759 0.845009 0.111133
    D32* 1.575371 3.507692 5.125846 4.854435 4.354122 1.223865
    LL8* 1.366191 1.875091 4.594308 4.423822 4.416413 5.083137
    JJ36 2.339652 5.039758 2.000554 0.284902 0.159879 0.033605
    D28* 0.413278 0.514204 3.603404 3.728115 4.341368 5.008521
    U36 0.968904 2.501669 4.650123 2.269889 1.310025 0.23654
    E80 1.697744 2.624376 3.868368 3.757709 4.412999 1.895016
    E36 1.044698 2.940234 4.27308 1.367514 1.194649 0.11883
    LL6* 1.085814 1.91654 2.079375 3.927835 3.569052 1.05464
    C94* 2.131856 1.441007 2.383634 3.570587
    JJ80 0.5771 0.4786 2.199535 3.226941 3.173297 2.653163
    E94* 2.628722 3.159991 1.967481 2.126174
    AA94* 3.146781 0.013148
    D93* 0.431042 1.393065 2.759499 1.938168 2.074542 1.899193
    B17 0.72135 0.44715 0.996508 1.067002 1.098275 2.197846
    C86 0.159044 0.279389 0.637804 1.055779 1.025192 1.422756
    U75* 1.14537 0.966531 1.593702 1.795307 1.200891 0.998441
    JJ86 0.503544 0.775429 0.794641 0.537708 1.491694 0.707425
    C86 0.159044 0.279389 0.637804 1.055779 1.025192 1.422758
    C75* 1.30574 0.85262 0.67639 1.163913 0.657267 0.424571
    C20 0.126573 0.098883 0.088576 1.003372 0.11883 0.138726
    C80* 0.578045 0.102763 0.111304 0.528832 0.887811 0.961981
    F86* 0.17035 0.215518 0.282999 0.337696 0.484268 0.711768
    M17* 0.550188 0.409299 0.304933 0.35068 0.404506 0.356775 0.392121 0.376042 0.34777 0.315241 0.468629 0.705352
    AA61* 0.856418 0.329589 0.543264 0.257434 0.577986 0.307982
    B17* 0.614141 0.505597 0.339801 0.319609 0.399828 0.406147
    U28 0.221192 0.515945 0.290904 0.237264
    U93 0.378613 0.265617 0.269287 0.265163 0.469461 0.234903
    U86* 0.435638 0.196901 0.124174 0.304979 0.193936 0.189116
    U36 0.331166 0.344857 0.209068 0.107622 0.151587 0.170145
    U28 0.334806 0.137402 0.079535 0.165612 0.097702 0.126852
    JJ24 0.199154 0.188046 0.090045 0.064921 0.085969 0.032536
    C25* 0.11105 0.044342 0.06737 0.031668 0.088061 0.05876
    U25 0.055718 0.056074 0.069147 0.047859 0.04537 0.088747
    U32 0.046949 0.026455 0.070335 0.047503 0.033368 0.0261
    • *Polymere mit Sternchen wurden mit zu dem Umsetzungsgemisch zugegebenem DMSO (2 ml) synthetisiert. Andere Polymere wurden pur synthetisiert.

Claims (15)

  1. Verbindung der Formel:
    Figure 01320001
    worin jedes R' unabhängig ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, C1-C6-nied.-Alkyl, C1-C6-nied.-Alkoxy, Hydroxy, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Cyano, Thiol, Heteroaryl, Aryl, Phenyl, heterocyclisch, carbocyclisch und Halogen; n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10000 ist; x eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; und wenn X für Methyl oder NR2 steht; und R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, cyclisch, heterocyclisch, Aryl und Heteroaryl; oder wenn X für OR steht; und R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, cyclisch, heterocyclisch, Aryl und Heteroaryl; y eine ganze Zahl zwischen 1 und 10 ist; oder wenn X für OR steht; und R für Wasserstoff steht, y 5 oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 2 oder 6 und 10 ist, und Derivate und Salze davon.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Verbindung Amin-terminiert ist, oder worin die Verbindung Acrylat-terminiert ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 1, worin x eine ganze Zahl zwischen 2 und 7 ist, vorzugsweise worin x 4, 5 oder 6 ist.
  4. Verbindung nach Anspruch 1, worin y eine ganze Zahl zwischen 2 und 7 ist, vorzugsweise worin y 4, 5 oder 6 ist.
  5. Verbindung nach Anspruch 1, worin R für Wasserstoff, Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl und Hexyl steht.
  6. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Struktur der Verbindung
    Figure 01330001
    ist, worin R für Wasserstoff steht, x 4 ist und y 4 ist; oder
    Figure 01330002
    worin R für Wasserstoff steht, x 6 ist und y 4 ist; oder
    Figure 01330003
    worin R für Wasserstoff steht, x 4 ist und y 5 ist; oder
    Figure 01330004
    worin R für Wasserstoff steht, x 5 ist und y 4 ist; oder
    Figure 01340001
    worin R für Wasserstoff steht, x 5 ist und y 5 ist; oder
    Figure 01340002
    worin R für Wasserstoff steht, x 5 ist und y 6 ist.
  7. Verbindung wie in Anspruch 1 beansprucht der Formel:
    Figure 01340003
    worin n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10.1000 ist; und Derivate und Salze davon.
  8. Verbindung nach Anspruch 1, umfassend ein Acrylate der Formel:
    Figure 01350001
    und ein Amine der Formel:
    Figure 01350002
    Figure 01360001
  9. Verbindung wie in Anspruch 8 beansprucht, ausgewählt aus der Gruppe umfassend: C80, E32, E36, F28, F32 und LL8.
  10. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Verbindung ein Molekulargewicht zwischen 1000 und 100000 g/mol hat, vorzugsweise worin die Verbindung ein Molekulargewicht zwischen 2000 und 40000 g/mol hat.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Polynucleotid und eine Verbindung nach Anspruch 1.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Nanopartikel, welche ein Polynucleotid oder einen pharmazeutischen Wirkstoff und eine Verbindung nach Anspruch 1 enthalten.
  13. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend Mikropartikel, welche einen Wirkstoff, eingekapselt in eine Matrix einer Verbindung nach Anspruch 1 enthalten.
  14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin die Mikropartikel einen mittleren Durchmesser von 1-10 Mikrometern haben, oder worin die Mikropartikel einen mittleren Durchmesser von weniger als 5 Mikrometern haben, vorzugsweise worin die Mikropartikel einen mittleren Durchmesser von weniger als 1 Mikrometer haben.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin der Wirkstoff ein kleines Molekül, ein Peptid, ein Protein oder ein Polynucleotid ist, vorzugsweise worin das Polynucleotid DNA, RNA oder siRNA ist.
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