ES2350055T3 - Poli(beta-amino-ésteres) biodegradables y usos de los mismos. - Google Patents

Poli(beta-amino-ésteres) biodegradables y usos de los mismos. Download PDF

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Abstract

Un poli(beta-amino-éster) preparado a partir de un bis(éster de acrilato) y una amina, en el que la amina se selecciona del grupo que consiste en las fórmulas 6-94: **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** y sus derivados y sales.

Description

Poli(\beta-amino-ésteres) biodegradables y usos de los mismos.
Apoyo gubernamental
El trabajo descrito en el presente documento fue apoyado, en parte, por subvenciones de la National Science Foundation (acuerdo cooperativo nº ECC9843342 con el MIT Biotechnology Process Engineering Center), los National Institutes of Health (GM26698; NRSA beca de investigación nº 1 F32 GM20227-01), y el Department of the Army (acuerdo cooperativo nº DAMD 17-99-2-9-001 con el Center for Innovative Minimally Invasive Therapy). El gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en la invención.
Antecedentes de la invención
El tratamiento de enfermedades humanas a través de la aplicación de fármacos a base de nucleótidos tales como ADN y ARN tiene el potencial para revolucionar el campo médico (Anderson Nature 392 (supl.):25-30, 1996; Friedman Nature Med. 2:144-147, 1996; Crystal Science 270:404-410, 1995; Mulligan Science 260:926-932, 1993). Hasta ahora, el uso de virus modificados como vectores de transferencia génica ha representado generalmente el enfoque clínicamente más satisfactorio para la terapia génica. Aunque los vectores virales son actualmente los agentes de transferencia génica más eficaces, problemas referentes a la seguridad global de los vectores virales, que incluyen el potencial para respuestas inmunitarias no buscadas, han dado como resultado esfuerzos paralelos para desarrollar alternativas no virales (para referencias destacadas, véase: Luo y otros, Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Behr Acc. Chem. Res. 26:274-278, 1993).
Las alternativas actuales a los vectores virales incluyen sistemas de administración poliméricos (Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov y otros, Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995), formulaciones liposómicas (Miller Angew. Chem. Int. Ed. 37:1768-1785, 1998; Hope y otros, Molecular Membrane Technology 15:1-14, 1998; Deshmukh y otros, New J. Chem. 21:113-124, 1997), y protocolos de inyección de ADN "desnudo" (Sanford Trends Biotechnol. 6:288-302, 1988).
Aunque estas estrategias tienen que conseguir aún la eficacia clínica de los vectores virales, la seguridad potencial, el procesamiento y los beneficios económicos ofrecidos por estos métodos (Anderson Nature 392 (supl.):25-30, 1996) han avivado el interés en el desarrollo continuado de enfoques no virales para la terapia génica (Boussif y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995; Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J Am. Chem. Soc. 121: 5633-5639, 1999; Gonzalez y otros, Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999; Kukowska-Latallo y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4897-4902, 1996; Tang y otros, Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler y otros, Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993).
Se han usado ampliamente polímeros catiónicos como vectores de transfección debido a la facilidad con la que condensan y protegen hebras de ADN cargadas negativamente. Los polímeros que contienen amina tales como poli(lisina) (Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov y otros, Bioconjugate Chem. 6.-7-20, 1995), poli(etilenimina) (PEI) (Boussif y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995) y dendrímeros de poli(amidoamina) (Kukowska-Latallo y otros, Proc. Natl. Acad Sci. USA 93: 4897-4902, 1996; Tang y otros, Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler y otros, Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993) están cargados positivamente a pH fisiológico, forman pares iónicos con ácidos nucleicos y median la transfección en una variedad de líneas celulares. Sin embargo, a pesar de su uso común, los polímeros catiónicos tales como poli(lisina) y PEI pueden ser significativamente citotóxicos (Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Deshmukh y otros, New J. Chem. 21;113-124, 1997; Choksakulnimitr y otros, Controlled Release 34:233-241, 1995; Brazeau y otros, Pharm. Res. 15:680-684, 1998). Como resultado, la elección de un polímero catiónico para una aplicación de transferencia génica requiere generalmente un equilibrio entre eficiencia de transfección y citotoxicidad a corto y largo plazo. Adicionalmente, la biocompatibilidad a largo plazo de estos polímeros sigue siendo una cuestión importante para su uso en aplicaciones terapéuticas in vivo, puesto que varios de estos polímeros no son fácilmente biodegradables (Uhrich Trends Polim. Sci. 5:388-393, 1997; Roberts y otros, J. Biomed. Mater. Res. 30:53-65, 1996).
Con el fin de desarrollar alternativas seguras a los vectores poliméricos existentes y otros biomateriales funcionalizados, se han desarrollado poliésteres degradables que portan cadenas laterales catiónicas (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Barrera y otros, J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993; Kwon y otros, Macromolecules 22:3250-3255, 1989; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Zhou y otros, Macromolecules 23:3399-3406, 1990). Los ejemplos de estos polímeros incluyen poli(L-lactida-co-L-lisina) (Barrera y otros, J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993), poli(éster de serina) (Zhou y otros, Macromolecules 23:3399-3406, 1990), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999) y, más recientemente, poli[ácido \alpha-(4-aminobutil)-L-glicólico]. Recientemente se demostró que el poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) y el poli[ácido \alpha-(4-aminobutil)-L-glicólico] condensaban el ADN de plásmido a través de interacciones electrostáticas, y que mediaban la transferencia génica (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:S633-5639, 1999). De manera importante, estos nuevos polímeros son significativamente menos tóxicos que la poli(lisina) y PEI, y se degradan dando metabolitos no tóxicos. Queda claro a partir de estas investigaciones que el diseño racional de poliésteres que contienen amina puede ser una vía productiva para el desarrollo de vectores de transfección eficaces y seguros. Sin embargo, desafortunadamente, las presentes síntesis de estos polímeros requieren o bien la preparación independiente de monómeros especializados (Barrera y otros, J, Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993), o bien el uso de cantidades estequiométricas de agentes de acoplamiento caros (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999). Adicionalmente, las funcionalidades amina en los monómeros deben protegerse antes de la polimerización (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121;5633-5639, 1999; Gonzalez y otros, Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999; Barrera y otros, J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993; Kwon y otros, Macromolecules 22:3250-3255, 1989), necesitándose etapas de desprotección tras la polimerización adicionales antes de que los polímeros puedan usarse como agentes de transfección.
Existe una necesidad continua de polímeros no tóxicos, biodegradables, biocompatibles que puedan usarse para transfectar ácidos nucleicos y que se preparen fácilmente de manera económica y eficaz. Tales polímeros tendrían varios usos, incluyendo la administración de ácidos nucleicos en la terapia génica así como en el empaquetamiento y/o administración de agentes de diagnóstico, terapéuticos y profilácticos.
Sumario de la invención
La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención proporciona polímeros útiles en la preparación de dispositivos de administración de fármacos y composiciones farmacéuticas de los mismos. La invención también proporciona métodos de preparación de los polímeros y métodos de preparación de microesferas y otras composiciones farmacéuticas que contienen los polímeros de la invención.
Los polímeros de la presente invención son poli(\beta-amino-ésteres) y sales y derivados de los mismos. Los polímeros preferidos son biodegradables y biocompatibles. Normalmente, los polímeros tienen una o más aminas terciarias en la estructura principal del polímero. Los polímeros preferidos tienen una o dos aminas terciarias por unidad de repetición de la estructura principal. Los polímeros también pueden ser copolímeros en los que uno de los componentes es un poli(\beta-amino-éster). Los polímeros de la invención pueden prepararse fácilmente condensando bis(aminas secundarias) o aminas primarias con bis(ésteres de acrilato).
Un polímero de la presente invención se prepara a partir de un bis(éster de acrilato) y una amina, seleccionándose la amina del grupo que consiste en las fórmulas 6-94:
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1
1000 
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Un polímero de la presente invención puede representarse mediante la fórmula a continuación:
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2 
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preparado por adición conjugada de una amina primaria
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3 
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a un bis(éster de acrilato)
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4 
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en el que la amina primaria es de fórmula:
5
6
en donde:
R_{1} se proporciona mediante las aminas primarias 6, 7, 16, 17, 18, 37, 38, 39, 41, 47, 51, 72, 73, 74, 76, 77, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92 ó 94;
B es una cadena de átomos de carbono o heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y ureido;
n es un número entero que corresponde a un polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta 20.000 g/mol.
Un polímero de la presente invención también puede representarse mediante la fórmula a continuación:
7
preparado por adición conjugada de una bis(amina secundaria)
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8 
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a un bis(éster de acrilato)
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9 
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siendo la bis(amina secundaria) de fórmula:
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10
11 
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en donde:
R_{1}, R_{2} y A se proporcionan mediante la bis(amina secundaria) 60, 61, 62, 963, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ó 71;
cuando la bis(amina secundaria) es 70 ó 71, R_{1} y R_{2} están unidos formando una estructura cíclica con A;
B es una cadena de átomos de carbono o heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y ureido;
n es un número entero que corresponde a un polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta 20.000 g/mol.
En ciertas realizaciones, los polímeros están terminados en amina; y en otras realizaciones, los polímeros están terminados en acrilato. En una realización particularmente preferida, los grupos R_{1} y/o R_{2} forman estructuras cíclicas con el conector A (véase la sección de Descripción detallada a continuación). Los polímeros que contienen tales restos cíclicos tienen la característica de ser más solubles a pH inferior. Polímeros específicamente preferidos son aquéllos que son insolubles en disoluciones acuosas a pH fisiológico (pH 7,2-7,4) y son solubles en disoluciones acuosas por debajo del pH fisiológico (pH < 7,2). Otros polímeros preferidos son aquéllos que son solubles en disolución acuosa a pH fisiológico (pH 7,2-7,4) y por debajo. Los polímeros preferidos son útiles en la transfección de polinucleótidos al interior de células.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación de los polímeros de la invención. Se someten monómeros, bis(aminas secundarias), aminas primarias y bis(ésteres de acrilato) comercialmente disponibles o fácilmente disponibles a condiciones que conducen a la adición conjugada de la amina al bis(éster de acrilato). En una realización particularmente preferida, cada uno de los monómeros se disuelve en un disolvente orgánico (por ejemplo, DMSO, DMF, THF, dietil éter, cloruro de metileno, hexanos, etc.), y las disoluciones resultantes se combinan y se calientan durante un tiempo suficiente como para conducir a la polimerización de los monómeros. En otras realizaciones, la polimerización se lleva a cabo en ausencia de disolvente. El polímero resultante puede purificarse entonces y caracterizarse opcionalmente usando técnicas conocidas en la técnica.
Aún en otro aspecto de la invención, los polímeros se usan para formar complejos a escala nanométrica con ácidos nucleicos. Los complejos de polinucleótido/polímero pueden formarse añadiendo una disolución de polinucleótido a una disolución con agitación con vórtex del polímero a una concentración de ADN/polímero deseada. La razón de peso con respecto a peso del polinucleótido con respecto al polímero puede oscilar de desde 1:0,1 hasta 1:200, preferiblemente desde 1:10 hasta 1:150, más preferiblemente desde 1:50 hasta 1:150. La razón de monómero de amina con respecto a fosfato de polinucleótido puede ser de aproximadamente 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1 y 200:1. Los polímeros catiónicos condensan el polinucleótido en partículas solubles normalmente de 50-500 nm de tamaño. Estos complejos de polinucleótido/polímero pueden usarse en la administración de polinucleótidos a células. En una realización particularmente preferida, estos complejos se combinan con excipientes farmacéuticos formando composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a animales incluyendo seres humanos. En ciertas realizaciones, se usa un polímero con una alta razón de peso molecular con respeto a átomo de nitrógeno (por ejemplo, polilisina, polietilenimina) para aumentar la eficiencia de transfección.
En otro aspecto de la invención, los polímeros se usan para encapsular agentes terapéuticos, de diagnóstico y/o profilácticos incluyendo polinucleótidos para formar micropartículas. Normalmente estas micropartículas son un orden de magnitud mayores que los complejos de polinucleótido/polímero. Las micropartículas oscilan desde 1 micra hasta 500 micras. En una realización particularmente preferida, estas micropartículas permiten la administración de polinucleótidos, péptidos, proteínas y/o moléculas pequeñas lábiles a un individuo. Las micropartículas pueden prepararse usando cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica para preparar micropartículas, tales como, por ejemplo, doble emulsión, inversión de fases y secado por pulverización. En una realización particularmente preferida, las micropartículas pueden usarse para una administración desencadenada por pH del contenido encapsulado debido a la naturaleza sensible al pH de los polímeros (es decir, ser más solubles a pH inferior).
Aún en otro aspecto, la invención proporciona un sistema para sintetizar y examinar una colección de polímeros. En ciertas realizaciones, el sistema aprovecha técnicas conocidas en la técnica de robótica y manejo de líquidos automatizado. El sistema de síntesis y examen puede usarse con poli(beta-amino-ésteres) así como otros tipos de polímeros incluyendo poliamidas, poliésteres, poliéteres, policarbamatos, policarbonatos, poliureas, poliaminas, etc. La colección de polímeros puede ser una colección de todos un tipo de polímero (por ejemplo, todos poli(beta-amino-ésteres)) o puede ser una colección diversa de polímeros. Pueden sintetizarse y examinarse miles de polímeros en paralelo usando el sistema de la invención. En ciertas realizaciones, los polímeros se examinan para determinar propiedades útiles en el campo de la administración génica, transfección o terapia génica. Algunas de estas propiedades incluyen solubilidad a diversos pH, capacidad para complejar polinucleótidos, capacidad para transfectar un polinucleótido al interior de una célula, etc. Ciertos poli(beta-amino-ésteres) que se encuentra que son útiles en la transfección de células incluyen M17, KK89, LL6 y D94 tal como se describe en los ejemplos 4 y 5.
Definiciones
Los siguientes son términos químicos usados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones:
El término acilo tal como se usa en el presente documento se refiere a un grupo que tiene la fórmula general -C(=O)R, en la que R es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, grupo carbocíclico, grupo heterocíclico o grupo heterocíclico aromático. Un ejemplo de un grupo acilo es acetilo.
El término alquilo tal como se usa en el presente documento se refiere a radicales hidrocarbonados saturados, de cadena lineal o ramificada derivados de un resto hidrocarbonado que contiene entre uno y veinte átomos de carbono mediante eliminación de un único átomo de hidrógeno. En algunas realizaciones, el grupo alquilo empleado en la invención contiene 1-10 átomos de carbono. En otra realización, el grupo alquilo empleado contiene 1-8 átomos de carbono. Todavía en otras realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-6 átomos de carbono, aún en otras realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-4 carbonos. Los ejemplos de radicales alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, sec-pentilo, iso-pentilo, terc-butilo, n-pentilo, neopentilo, n-hexilo, sec-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-decilo, n-undecilo, dodecilo y similares, que pueden portar uno o más
sustituyentes.
El término alcoxilo tal como se usa en el presente documento se refiere a un grupo saturado (es decir, alquil-O-) o insaturado (es decir, alquenil-O- y alquinil-O-) unido al resto molecular original a través de un átomo de oxígeno. En ciertas realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-20 átomos de carbono alifáticos. En otras ciertas realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados en la invención contienen 1-8 átomos de carbono alifáticos. Todavía en otras realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-6 átomos de carbono alifáticos. Aún en otras realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-4 átomos de carbono alifáticos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, metoxilo, etoxilo, propoxilo, isopropoxilo, n-butoxilo, terc-butoxilo, i-butoxilo, sec-butoxilo, neopentoxilo, n-hexoxilo y
similares.
El término alquenilo indica un grupo monovalente derivado de un resto hidrocarbonado que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono mediante la eliminación de un único átomo de hidrógeno. En ciertas realizaciones, el grupo alquenilo empleado en la invención contiene 1-20 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el grupo alquenilo empleado en la invención contiene 1-10 átomos de carbono. En otra realización, el grupo alquenilo empleado contiene 1-8 átomos de carbono. Todavía en otras realizaciones, el grupo alquenilo contiene 1-6 átomos de carbono. Aún en otras realizaciones, el grupo alquenilo contiene 1-4 carbonos. Los grupos alquenilo incluyen, por ejemplo, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-1-ilo y similares.
El término alquinilo tal como se usa en el presente documento se refiere a un grupo monovalente derivado de un hidrocarburo que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono mediante la eliminación de un único átomo de hidrógeno. En ciertas realizaciones, el grupo alquinilo empleado en la invención contiene 1-20 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el grupo alquinilo empleado en la invención contiene 1-10 átomos de carbono. En otra realización, el grupo alquinilo empleado contiene 1-8 átomos de carbono. Todavía en otras realizaciones, el grupo alquinilo contiene 1-6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo representativos incluyen, pero no se limitan a, etinilo, 2-propinilo (propargilo), 1-propinilo y similares.
El término alquilamino, dialquilamino y trialquilamino tal como se usa en el presente documento se refiere a uno, dos o tres grupos alquilo, respectivamente, tal como se definió anteriormente, unidos al resto molecular original a través de un átomo de nitrógeno. El término alquilamino se refiere a un grupo que tiene la estructura -NHR', en la que R' es un grupo alquilo, tal como se definió anteriormente; y el término dialquilamino se refiere a un grupo que tiene la estructura -NR'R'', en la que R' y R'' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo. El término trialquilamino se refiere a un grupo que tiene la estructura -NR'R''R''', en la que R', R'' y R''' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo. En ciertas realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-20 átomos de carbono alifáticos. En otras ciertas realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-10 átomos de carbono alifáticos. Aún en otras realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-8 átomos de carbono alifáticos. Todavía en otras realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-6 átomos de carbono alifáticos. Aún en otras realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-4 átomos de carbono alifáticos. Adicionalmente, R', R'' y/o R''' tomados juntos pueden ser opcionalmente -(CH_{2})_{k}- en el que k es un número entero desde 2 hasta 6. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, metilamino, dimetilamino, etilamino, dietilamino, dietilaminocarbonilo, metiletilamino, iso-propilamino, piperidino, trimetilamino y propilamino.
Los términos alquiltioéter y tioalcoxilo se refieren a un grupo saturado (es decir, alquil-S-) o insaturado (es decir, alquenil-S- y alquinil-S-) unido al resto molecular original a través de un átomo de azufre. En ciertas realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-20 átomos de carbono alifáticos. En otras ciertas realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-10 átomos de carbono alifáticos. Aún en otras ciertas realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo contienen 1-8 átomos de carbono alifáticos. Todavía en otras realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo contienen 1-6 átomos de carbono alifáticos. Aún en otras realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo contienen 1-4 átomos de carbono alifáticos. Los ejemplos de restos tioalcoxilo incluyen, pero no se limitan a, metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, n-butiltio y similares.
El término arilo tal como se usa en el presente documento se refiere a un resto cíclico insaturado que comprende al menos un anillo aromático. En ciertas realizaciones, grupo arilo se refiere a un sistema de anillo carbocíclico mono o bicíclico que tiene uno o dos anillos aromáticos incluyendo, pero sin limitarse a, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, indenilo y similares. Los grupos arilo pueden estar no sustituidos o sustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, alcoxilo, tioalcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, acilamino, ciano, hidroxilo, halógeno, mercapto, nitro, carboxialdehído, carboxilo, alcoxicarbonilo y carboxamida ramificados y no ramificados. Además, los grupos arilo sustituidos incluyen tetrafluorofenilo y pentafluorofenilo.
El término ácido carboxílico tal como se usa en el presente documento se refiere a un grupo de fórmula -CO_{2}H.
Los términos halo y halógeno tal como se usan en el presente documento se refieren a un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.
El término heterocíclico, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un sistema de anillo de 3 a 10 miembros, aromático o no aromático, parcialmente insaturado o completamente saturado, que incluye anillos individuales de 3 a 8 átomos de tamaño y sistemas de anillo bi y tricíclicos que pueden incluir grupos heterocíclicos aromáticos o arilo de cinco o seis miembros aromáticos condensados con un anillo no aromático. Estos anillos heterocíclicos incluyen los que tienen desde uno hasta tres heteroátomos seleccionados independientemente de oxígeno, azufre y nitrógeno, en los que los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden oxidarse opcionalmente y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado. En ciertas realizaciones, el término heterocíclico se refiere a un grupo policíclico o un anillo de 5, 6 ó 7 miembros no aromático en el que al menos un átomo de anillo es un heteroátomo seleccionado de O, S y N (en el que los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados), incluyendo, pero sin limitarse a, un grupo bi o tricíclico, que comprende anillos de seis miembros condensados que tienen entre uno y tres heteroátomos seleccionados independientemente del oxígeno, azufre y nitrógeno, en el que (i) cada anillo de 5 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces, cada anillo de 6 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces y cada anillo de 7 miembros tiene de 0 a 3 dobles enlaces; (ii) los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, (iii) el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado y (iv) cualquiera de los anillos heterocíclicos anteriores puede estar condensado con un anillo de arilo o
heteroarilo.
El término grupo heterocíclico aromático, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un radical aromático cíclico que tiene desde cinco hasta diez átomos de anillo de los cuales un átomo de anillo se selecciona de azufre, oxígeno y nitrógeno; cero, uno o dos átomos de anillo son heteroátomos adicionales seleccionados independientemente de azufre, oxígeno y nitrógeno; y los átomos de anillo restantes son carbono, estando unido el radical al resto de la molécula a través de cualquiera de los átomos de anillo, tales como, por ejemplo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo y similares. Los grupos heterocíclicos aromáticos pueden estar no sustituidos o sustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, alcoxilo, tioalcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, acilamino, ciano, hidroxilo, halógeno, mercapto, nitro, carboxialdehído, carboxilo, alcoxicarbonilo y carboxamida ramificados y no
ramificados.
Los grupos heterocíclicos aromáticos y heterocíclicos específicos que pueden incluirse en los compuestos de la invención incluyen: 3-metil-4-(3-metilfenil)piperazina, 3-metilpiperidina, 4-(bis-(4-fluorofenil)metil)piperazina, 4-(difenilmetil)piperazina, 4-(etoxicarbonil)piperazina, 4-(etoxicarbonilmetil)piperazina, 4-(fenilmetil)piperazina, 4-(1-feniletil)piperazina, 4-(1,1-dimetiletoxicarbonil)piperazina, 4-(2-(bis-(2-propenil)amino)etil}piperazina, 4-(2-(dietila-
mino)etil)piperazina, 4-(2-clorofenil)piperazina, 4-(2-cianofenil)piperazina, 4-(2-etoxifenil)piperazina, 4-(2-etilfenil)piperazina, 4-(2-fluorofenil)piperazina, 4-(2-hidroxietil)piperazina, 4-(2-metoxietil)piperazina, 4-(2-metoxifenil)piperazina, 4-(2-metilfenil)piperazina, 4-(2-metiltiofenil)piperazina, 4-(2-nitrofenil)piperazina, 4-(2-nitrofenil)piperazina, 4-(2-feniletil)piperazina, 4-(2-piridil)piperazina, 4-(2-pirimidinil)piperazina, 4-(2,3-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,4-difluorofenil)piperazina, 4-(2,4-dimetoxifenil)piperazina, 4-(2,4-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,5-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,6-dimetilfenil)piperazina, 4-(3-clorofenil)piperazina, 4-(3-metilfenil)piperazina, 4-(3-trifluorometilfenil)piperazina, 4-(3,4-diclorofenil)piperazina, 4-(3,4-dimetoxifenil)piperazina, 4-(3,4-dimetilfenil)piperazina, 4-(3,4-metilendioxifenil)piperazina, 4-(3,4,5-trimetoxifenil)piperazina, 4-(3,5-diclorofenil)piperazina, 4-(3,5-dimetoxifenil)piperazina, 4-(4-(fenilmetoxi)fenil)piperazina, 4-(4-(3,1-dimetiletil)fenilmetil)piperazina, 4-(4-cloro-3-trifluorometilfenil)piperazina, 4-(4-clorofenil)-3-metilpiperazina, 4-(4-clorofenil)piperazina, 4-(4-clorofenil)piperazina, 4-(4-clorofenilmetil)piperazina, 4-(4-fluorofenil)piperazina, 4-(4-metoxifenil)piperazina, 4-(4-metilfenil)piperazina, 4-(4-nitrofenil)piperazina, 4-(4-trifluorometilfenil)piperazina, 4-ciclohexilpiperazina, 4-etilpiperazina, 4-hidroxi-4-(4-clorofenil)metilpiperidina, 4-hidroxi-4-fenilpiperidina, 4-hidroxipirrolidina, 4-metilpiperazina, 4-fenilpiperazina, 4-piperidinilpiperazina, 4-(2-furanil)carbonil)piperazina, 4-((1,3-dioxolan-5-il)metil)piperazina, 6-fluoro-1,2,3,4-tetrahidro-2-metilquinolina, 1,4-diazacicloheptano, 2,3-dihidroindolilo, 3,3-dimetilpiperidina, 4,4-etilendioxipiperidina, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 1,2,3,4-tetrahidroquinolina, azaciclooctano, decahidroquinolina, piperazina, piperidina, pirrolidina, tiomorfolina y triazol.
El término carbamoílo, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo amida de fórmula -CONH_{2}.
El término carbonildioxilo, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo carbonato de fórmula -O-CO-OR.
El término hidrocarburo, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier grupo químico que comprende hidrógeno y carbono. El hidrocarburo puede estar sustituido o no sustituido. El hidrocarburo puede ser insaturado, saturado, ramificado, no ramificado, cíclico, policíclico o heterocíclico. Los hidrocarburos ilustrativos incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, alilo, vinilo, n-butilo, terc-butilo, etinilo, ciclohexilo, metoxilo, dietilamino y similares. Tal como conocería un experto en esta técnica, deben satisfacerse todas las valencias al hacer cualquier sustitución.
Los términos sustituido, esté precedido o no por el término "opcionalmente", y sustituyente, tal como se usan en el presente documento, se refieren a la capacidad, tal como aprecia un experto en esta técnica, para cambiar un grupo funcional por otro grupo funcional siempre que se mantenga la valencia de todos los átomos. Cuando más de una posición en cualquier estructura dada puede estar sustituida con más de un sustituyente seleccionado de un grupo especificado, el sustituyente puede ser igual o diferente en cada posición. Los sustituyentes pueden estar también sustituidos adicionalmente (por ejemplo, un sustituyente de grupo arilo puede tener otro sustituyente fuera del mismo, tal como otro grupo arilo, que está sustituido adicionalmente con flúor en una o más posiciones).
El término tiohidroxilo o tiol, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de fórmula -SH.
El término ureido, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo urea de fórmula: -NH-CO-NH_{2}.
Los siguientes son términos más generales usados durante toda la presente memoria descriptiva:
"Animal": El término animal, tal como se usa en el presente documento, se refiere a seres humanos así como animales no humanos, incluyendo, por ejemplo, mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces. Preferiblemente, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, un primate o un cerdo). El animal puede ser un animal domesticado. El animal puede ser un animal transgénico.
"Asociado con": Cuando dos entidades están "asociadas con" entre sí tal como se describe en el presente documento, están unidas mediante una interacción covalente o no covalente directa o indirecta. Preferiblemente, la asociación es covalente. Las interacciones no covalentes deseables incluyen enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones hidrófobas, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas, etc.
"Biocompatible": El término "biocompatible", tal como se usa en el presente documento, pretende describir compuestos que no son tóxicos para las células. Los compuestos son "biocompatibles" si su adición a células in vitro da como resultado una muerte celular inferior o igual al 20%, y su administración in vivo no induce inflamación ni ningún otro efecto adverso de este tipo.
"Biodegradable": Tal como se usa en el presente documento, compuestos "biodegradables" son aquéllos que, cuando se introducen en las células, se descomponen mediante la maquinaria celular o mediante hidrólisis dando componentes que las células pueden o bien volver a usar o bien desechar sin efecto tóxico significativo sobre las células (es decir, se destruye menos de aproximadamente el 20% de las células cuando se añaden los componentes a las células in vitro). Preferiblemente, los componentes no inducen inflamación ni ningún otro efecto adverso in vivo. En ciertas realizaciones preferidas, las reacciones químicas en las que se confía para descomponer los compuestos biodegradables no están catalizadas.
"Cantidad eficaz": En general, la "cantidad eficaz" de un agente activo o dispositivo de administración de fármacos se refiere a la cantidad necesaria para provocar la respuesta biológica deseada. Tal como apreciarán los expertos habituales en esta técnica, la cantidad eficaz de un agente o dispositivo puede variar dependiendo de factores tales como el criterio de valoración biológico deseado, el agente que va a administrarse, la composición de la matriz de encapsulación, el tejido diana, etc. Por ejemplo, la cantidad eficaz de micropartículas que contienen un antígeno que va a administrarse para inmunizar a un individuo es la cantidad que da como resultado una respuesta inmunitaria suficiente para prevenir la infección con un organismo que tiene el antígeno administrado.
"Péptido" o "proteína": Según la presente invención, un "péptido" o una "proteína" comprende una cadena de al menos tres aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Los términos "proteína" y "péptido" pueden usarse de manera intercambiable. Péptido puede referirse a un péptido individual o a una colección de péptidos. Los péptidos de la invención contienen preferiblemente sólo aminoácidos naturales, aunque pueden emplearse alternativamente aminoácidos no naturales (es decir, compuestos que no se producen en la naturaleza pero que pueden incorporarse en una cadena polipeptídica) y/o análogos de aminoácido tal como se conocen en la técnica. Además, uno o más de los aminoácidos en un péptido de la invención pueden estar modificados, por ejemplo, mediante la adición de una entidad química tal como un grupo hidrato de carbono, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un grupo ácido graso, un conector para la conjugación, funcionalización u otra modificación, etc. En una realización preferida, las modificaciones del péptido conducen a un péptido más estable (por ejemplo, mayor semivida in vivo). Estas modificaciones pueden incluir la ciclación del péptido, la incorporación de D-aminoácidos, etc. Ninguna de las modificaciones debe interferir sustancialmente con la actividad biológica deseada del
péptido.
"Polinucleótido" u "oligonucleótido": Polinucleótido u oligonucleótido se refiere a un polímero de nucleótidos. Normalmente, un polinucleótido comprende al menos tres nucleótidos. El polímero puede incluir nucleósidos naturales (es decir, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina), análogos de nucleósido (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metiladenosina, C5-propinilcitidina, C5-propiniluridina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina), bases modificadas químicamente, bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas), bases intercaladas, azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa), o grupos fosfato modificados (por ejemplo, enlaces de fosforotioato y 5'-N-fosforamidita).
"Molécula pequeña": Tal como se usa en el presente documento, la expresión "molécula pequeña" se refiere a compuestos orgánicos, ya se produzcan de manera natural o se creen artificialmente (por ejemplo, mediante síntesis química) que tienen un peso molecular relativamente bajo y que no son proteínas, polipéptidos ni ácidos nucleicos. Normalmente, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 1500 g/mol. Además, las moléculas pequeñas tienen normalmente múltiples enlaces carbono-carbono. Las moléculas pequeñas que se producen de manera natural conocidas incluyen, pero no se limitan a, penicilina, eritromicina, taxol, ciclosporina y rapamicina. Las moléculas pequeñas sintéticas conocidas incluyen, pero no se limitan a, ampicilina, meticilina, sulfametoxazol y sulfonamidas.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra el perfil de tiempo para la degradación de los polímeros 1-3 a 37ºC a pH 5,1 y pH 7,4. La degradación se expresa como el porcentaje de degradación a lo largo del tiempo basándose en los datos de CPG.
La figura 2 muestra los perfiles de citotoxicidad de los polímeros 1-3 y PEI. La viabilidad de células NIH 3T3 se expresa como función de la concentración de polímero. Los pesos moleculares de los polímeros 1, 2 y 3 eran 5800, 11300 y 22500, respectivamente. El peso molecular de la PEI empleada era de 25000.
La figura 3 muestra el retardo del ADN de pCMV-Luc mediante el polímero 1 en electroforesis en gel de agarosa. Cada carril corresponde a una razón en peso de ADN/polímero diferente. Las razones son las siguientes: 1) 1:0 (ADN sólo); 2) 1:0,5; 3) 1:1; 4) 1:2; 5) 1:3; 6) 1:4; 7) 1:5; 8) 1:6; 9) 1:7; y 10) 1:8.
La figura 4 muestra los diámetros eficaces promedio de complejos de ADN/polímero formados a partir del plásmido pCMV-Luc y el polímero 3 (M_{n} = 31.000) como función de la concentración de polímero.
La figura 5 muestra los potenciales \zeta promedio de complejos de ADN/polímero formados a partir del plásmido pCMV-Luc y el polímero 3 (M_{n} = 31.000) como función de la concentración de polímero. Los números para cada complejo corresponden a los números de complejo en la figura 4.
La figura 6 es una imagen de MEB de microesferas cargadas con rodamina/dextrano fabricadas a partir del polímero 1.
La figura 7 muestra los perfiles de liberación de rodamina/dextrano a partir de microesferas de PLGA y polímero 1 a diversos valores de pH. Las flechas indican los puntos a los que el tampón HEPES (pH 7,4) se intercambió por tampón acetato (pH 5,1).
La figura 8 muestra a) una imagen de microscopía de fluorescencia representativa de microesferas de polímero 1 cargadas con rodamina/dextrano suspendidas en tampón HEPES (pH 7,4). La figura 8b muestra una muestra de microesferas de polímero 1 cargadas a pH 7,4 tras la adición de tampón acetato (pH 5,1). La dirección de la difusión del ácido es desde la parte superior derecha hasta la inferior izquierda de la imagen (tiempo transcurrido \approx 5
segundos).
La figura 9 muestra el ensayo de electroforesis en gel usado para identificar polímeros complejantes de ADN. Las anotaciones de los carriles corresponden a los 70 miembros solubles en agua de la biblioteca de examen. Para cada polímero, los ensayos se realizaron a razones de ADN/polímero de 1:5 (pocillo izquierdo) y 1:20 (pocillo derecho). Los carriles marcados con C* contienen ADN solo (sin polímero) y se usaron como control.
La figura 10 muestra los datos de transfección como una función de la estructura para un ensayo que emplea pCMV-Luc (600 ng/pocillo, ADN/polímero = 1:20). Las unidades de luz son arbitrarias y no están normalizadas con respecto a la proteína celular total; los experimentos se realizaron por triplicado (barras de error no mostradas). Los cuadrados negros representan polímeros insolubles en agua, los cuadrados blancos representan polímeros solubles en agua que no complejaron el ADN en la figura 9. La columna de derecha (marcada con "*") presenta valores para los siguientes experimentos control: sin polímero (verde), PEI (rojo) y Lipofectamine (azul claro).
La figura 11 muestra una síntesis de poli(beta-amino-ésteres). Los poli(beta-amino-ésteres) pueden sintetizarse por adición conjugada de aminas primarias (ecuación 1) o bis(aminas secundarias) (ecuación 2) a diacrilatos.
La figura 12 muestra una variedad de monómeros de amina (A) y diacrilato (B) usados en la síntesis de la biblioteca de polímeros.
La figura 13 es un histograma de las eficiencias de transfección de polímeros. En el primer examen se sometieron a prueba los 2350 polímeros para determinar su capacidad para administrar ADN de pCMV-luc a razones de N:P de 40:1, 20:1 y 10:1 a células COS-7. La eficiencia de transfección se presenta en ng de luciferasa por pocillo. Para referencia, se muestra la eficiencia de transfección de PEI. Las células COS-7 captan fácilmente ADN desnudo, y en estas condiciones producen 0,15 \pm 0,05 ng por pocillo, y el reactivo lipídico, Lipofectamine 2000, produce 13,5 \pm 1,9 ng por pocillo.
Figura 14. A) eficiencia de transfección optimizada para los 50 polímeros superiores en relación con PEI y Lipofectamine 2000. Se sometieron a prueba los polímeros tal como se describe en los métodos. En el primer examen amplio, se sometieron a prueba razones de N:P de 40:1, 20:1 y 10:1 con una n de 1. Volvieron a examinarse los 93 superiores a seis razones de N:P diferentes = (N:P óptima del primer examen) x 1,75, 1,5, 1,25, 1,0, 0,75 y 0,5, por triplicado. Las reacciones control están marcadas en rojo, y los polímeros que no se unen al ADN en un ensayo de electroforesis en gel se muestran en negro. B) Polímeros que se unen al ADN tal como se determina mediante electroforesis en gel de agarosa. Los datos se tabularon de la siguiente manera: 1) el ADN completamente desplazado está representado por (+), 2) el ADN parcialmente desplazado está representado por (+/-), 3) el ADN no unido está representado por
(-).
La figura 15 muestra la transfección de células COS-7 usando plásmido de proteína fluorescente verde potenciado. Se transfectaron las células a una razón de N:P de (N:P óptima del examen amplio) x 1,25 con 600 ng de ADN. Se muestran regiones del pocillo que muestran alta transfección para los siguientes polímeros: a) C36, b) D94.
La figura 16 muestra cómo el peso molecular del polímero y el grupo terminal de la cadena se ven afectados al variar la razón de amina/diacrilato en la mezcla de reacción. Los pesos moleculares (M_{w}) (en relación con patrones de poliestireno) se determinaron mediante CPG en fase orgánica. Los polímeros sintetizados con razones de amina/diacrilato de >1 tienen grupos terminales amina, y los polímeros sintetizados con razones de amina/diacrilato de <1 tienen grupos terminales acrilato.
La figura 17 muestra los resultados de transfección de luciferasa para Poli-1 como función del peso molecular del polímero, la razón de polímero/ADN (p/p) y el grupo terminal del polímero. (A) cadenas terminadas en amina; (B) cadenas terminadas en acrilato, (n=4, las barras de error no se muestran).
La figura 18 muestra los resultados de transfección de luciferasa para Poli-2 como función del peso molecular del polímero, la razón de polímero/ADN (p/p) y el grupo terminal del polímero. (A) cadenas terminadas en amina; (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, barras de error no mostradas).
Figura 19 muestra la citotoxicidad de complejos de poli-1/ADN como función del peso molecular del polímero, la razón de polímero/ADN (p/p) y el grupo terminal del polímero. (A) cadenas terminadas en amina; (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, las barras de error no se muestran).
La figura 20 muestra la citotoxicidad de complejos de poli-2/ADN como función del peso molecular del polímero, la razón de polímero/ADN (p/p) y el grupo terminal del polímero. (A) cadenas terminadas en amina; (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, las barras de error no se muestran).
La figura 21 muestra el nivel de captación celular relativo de complejos de poli-1/ADN como función del peso molecular del polímero, la razón de polímero/ADN (p/p) y el grupo terminal del polímero. (A) cadenas terminadas en amina; (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, las barras de error no se muestran).
La figura 22 muestra el nivel de captación celular relativo de complejos de poli-2/ADN como función del peso molecular del polímero, la razón de polímero/ADN (p/p) y el grupo terminal del polímero. (A) cadenas terminadas en amina (los cuadrados blancos representan condiciones en las que la citotoxicidad de los complejos impidió una medición fiable de la captación celular); (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, barras de error no mostradas).
La figura 23 muestra la potenciación de la actividad de transfección de vectores de administración a base de poli-1 (cadenas terminadas en amina, M_{w} = 13.100) a través del uso de agentes co-complejantes. (A) polilisina (PLL); (B) polietilenimina (PEI), (n=4, las barras de error no se muestran).
La figura 24 muestra la potenciación de la actividad de transfección de vectores de administración a base de poli-2 (cadenas terminadas en amina, M_{w} = 13.400) a través del uso de agentes co-complejantes. (A) polilisina (PLL); (B) polietilenimina (PEI). (n=4, las barras de error no se muestran).
La figura 25 es una comparación de la transferencia del gen de GFP en células COS-7 usando Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 (p/p/p)), Poli-2/PLL (Poli-2:PLL:ADN = 15:0,4:1 (p/p/p)), Lipofectamine 2000 (\mul de reactivo: \mug de ADN = 1:1), PEI (PEI:ADN 1:1 (p/p), N/P \sim 8) y ADN desnudo. Se sembraron las células en placas de 6 pocillos y se hicieron crecer hasta nueva confluencia. Se incubaron las células con complejos (5 \mug de ADN/pocillo) durante 1 hora, tiempo tras el cual se retiraron los complejos y se añadió medio de crecimiento nuevo. Dos días más tarde se sometió a ensayo la expresión de GFP mediante citometría de flujo. (n=3, las barras de error indican una desviación estándar).
La figura 26 muestra la expresión de GFP en células COS-7 transfectadas usando Poli-1/PLL.
La figura 27 muestra la transferencia del gen de GFP en cuatro líneas celulares diferentes usando Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 (p/p/p). Se sembraron las células en placas de 6 pocillos y se hicieron crecer casi hasta la confluencia. Se incubaron entonces las células con complejos (5 \mug de ADN/pocillo) durante 1 hora, tiempo tras el cual se retiraron los complejos y se añadió medio de crecimiento nuevo. Dos días más tarde se sometió a ensayo la expresión de GFP mediante citometría de flujo. (n=5, las barras de error indican una desviación estándar).
La figura 28 muestra los pesos moleculares (M_{w} y M_{n}) del polímero G5 como función de la razón molar de monómeros de amina:diacrilato en la síntesis.
La figura 29 muestra los pesos moleculares (M_{w} y M_{n}) del polímero B14 como función de la razón molar de monómeros de amina:diacrilato en la síntesis de polímero.
La figura 30 es una comparación de la función de peso molecular con respecto a la razón molar de amina:diacrilato para los polímeros B14 y G5.
Descripción detallada de ciertas realizaciones preferidas de la invención
La presente invención proporciona sistemas de administración y encapsulación poliméricos mejorados basados en el uso de polímeros de polímeros de \beta-amino-éster. Los sistemas pueden usarse en las técnicas de administración de fármacos/farmacéutica para administrar polinucleótidos, proteínas, moléculas pequeñas, péptidos, antígenos, fármacos, etc. a un paciente, tejido, órgano, célula, etc. La presente invención también proporciona la preparación y el examen de grandes colecciones de polímeros para determinar "resultados positivos" que son útiles en las técnicas de administración de fármacos y farmacéutica.
Los polímeros de \beta-amino-éster de la presente invención proporcionan varios usos diferentes en la técnica de administración de fármacos. Los polímeros con sus estructuras principales que contienen aminas terciarias pueden usarse para complejar polinucleótidos y de ese modo potenciar la administración de polinucleótido e impedir su degradación. Los polímeros también pueden usarse en la formación de nanopartículas o micropartículas que contienen agentes encapsulados. Debido a las propiedades de los polímeros de ser biocompatibles y biodegradables, estas partículas formadas son también biodegradables y biocompatibles y pueden usarse para proporcionar una liberación controlada, sostenida del agente encapsulado. Estas partículas también pueden ser sensibles a cambios en el pH dado el hecho de que estos polímeros normalmente no son sustancialmente solubles en disolución acuosa a pH fisiológico sino que son más solubles a pH inferior.
Polímeros
Los polímeros de la presente invención son poli(\beta-amino-ésteres) que contienen aminas terciarias en sus estructuras principales y sales de los mismos. Los pesos moleculares de los polímeros de la invención pueden oscilar desde 5.000 g/mol hasta más de 100.000 g/mol, más preferiblemente desde 4.000 g/mol hasta 50.000 g/mol. En una realización particularmente preferida, los polímeros de la invención son relativamente no citotóxicos. En otra realización particularmente preferida, los polímeros de la invención son biocompatibles y biodegradables. En una realización particularmente preferida, los polímeros de la presente invención tienen pK_{a} en el intervalo de 5,5 a 7,5, más preferiblemente entre 6,0 y 7,0. En otra realización particularmente preferida, el polímero puede diseñarse para que tenga un pK_{a} deseado de entre 3,0 y 9,0, más preferiblemente entre 5,0 y 8,0. Los polímeros de la invención son particularmente atractivos para la administración de fármacos por varios motivos: 1) contienen grupos amino para interaccionar con el ADN y otros agentes cargados negativamente, para tamponar el pH, para provocar endosomolisis, etc.; 2) contienen enlaces poliéster degradables; 3) pueden sintetizarse a partir de materiales de partida comercialmente disponibles; y 4) son sensibles al pH y podrían diseñarse por ingeniería genética futuras generaciones con un pK_{a} deseado. En el examen para determinar la eficiencia de transfección, los polímeros que tenían un mejor rendimiento eran hidrófobos o los monómeros de diacrilato eran hidrófobos, y muchos tenían cadenas laterales de mono o dihidroxilo y/o bis(aminas secundarias) lineales como parte de su estructura.
Los polímeros de la presente invención se preparan a partir de un bis(éster de acrilato) y una amina, seleccionándose la amina del grupo que consiste en las fórmulas 6-94:
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12
13 
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En ciertas realizaciones, los polímeros incluyen las aminas 6, 17, 60, 61, 70, 86, 87, 89 ó 94.
En ciertas realizaciones, los polímeros de la presente invención pueden definirse generalmente mediante la fórmula:
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14 
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preparado por adición conjugada de una amina primaria
15
a un bis(éster de acrilato)
16
siendo la amina primaria de fórmula:
17
en donde:
R_{1} se proporciona mediante las aminas primarias 6, 7, 16, 17, 18, 37, 38, 39, 41, 47, 51, 72, 73, 74, 76, 77, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92 ó 94;
B es una cadena de átomos de carbono o heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y ureido;
n es un número entero que corresponde a un polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta 20.000 g/mol.
En otra realización, los polímeros de la presente invención pueden definirse generalmente mediante la fórmula:
18
preparado por adición conjugada de una bis(amina secundaria)
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19 
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a un bis(éster de acrilato)
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20 
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siendo la bis(amina secundaria) de fórmula:
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21 
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\vskip1.000000\baselineskip
en donde:
R_{1}, R_{2} y A se proporcionan mediante la bis(amina secundaria) 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ó 71;
cuando la bis(amina secundaria) es 70 ó 71, R_{1} y R_{2} están unidos formando una estructura cíclica con A;
B es una cadena de átomos de carbono o heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y ureido;
n es un número entero que corresponde a un polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta 20.000 g/mol.
\newpage
En otra realización, la unidad de bis(éster de acrilato) en el polímero de la invención se elige del siguiente grupo de unidades (A-PP) de bis(éster de acrilato):
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22 
\vskip1.000000\baselineskip
Los bis(ésteres de acrilato) particularmente preferidos en este grupo incluyen B, C, D, E, F, M, O, U, AA, II, JJ, KK y LL.
Los poli(beta-amino-ésteres) particularmente útiles incluyen:
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23 
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Otros poli(beta-amino-ésteres) particularmente útiles incluyen C86, D60, D61, U94, LL6, C94, F94, JJ94, JJ86, C86, U86, E86, B17, D70, U87, D87, C94, D86, F86, AA94, AA60, A61, D94, U94, E94, B17, M17 y AA61.
En una realización particularmente preferida, uno o los dos conectores A y B son polímeros de polietileno. En otra realización particularmente preferida, uno o los dos conectores A y B son polímeros de polietilenglicol. Pueden usarse otros polímeros biodegradables y biocompatibles como uno o los dos conectores A y B.
En ciertas realizaciones preferidas, los polímeros de la presente invención están terminados en amina. En otras realizaciones, los polímeros de la presente invención están terminados en acrilato. En gran parte, la unidad de terminación del polímero se determina mediante la razón de amina frente a acrilato en la reacción de síntesis de polímero. Un exceso de monómero de amina produce un polímero terminado en amina. Y un exceso de monómero de acrilato produce un polímero terminado en acrilato.
En ciertas realizaciones, el peso molecular promedio de los polímeros de la presente invención oscila desde 1.000 g/mol hasta 50.000 g/mol, preferiblemente desde 2.000 g/mol hasta 40.000 g/mol, más preferiblemente desde 5.000 g/mol hasta 20.000 g/mol, e incluso más preferiblemente desde 10.000 g/mol hasta 17.000 g/mol. Puesto que los polímeros de la presente invención se preparan mediante una polimerización por etapas, se obtiene normalmente una distribución estadística, amplia de longitudes de cadena. En ciertas realizaciones, la distribución de pesos moleculares en una muestra de polímeros se estrecha mediante etapas de purificación y aislamiento conocidas en la técnica. El peso molecular del polímero también puede variarse mediante la síntesis del polímero, por ejemplo, a medida que la cantidad de monómeros de amina aumenta, el peso molecular del polímero resultante disminuye. En otras realizaciones, la mezcla de polímeros puede ser una combinación de polímeros de diferentes pesos molecu-
lares.
En otra realización particularmente preferida, el polímero de la presente invención es un copolímero en el que una de las unidades de repetición es un poli(\beta-amino-éster) de la presente invención. Otras unidades de repetición que van a usarse en el copolímero incluyen, pero no se limitan a, polietileno, poli(glicolida-co-lactida) (PLGA), ácido poliglicólico, polimetacrilato, etc.
Síntesis de polímeros
Los polímeros de la invención pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica. Preferiblemente, los polímeros se preparan a partir de materiales de partida comercialmente disponibles. En otra realización preferida, los polímeros se preparan a partir de materiales de partida preparados de manera fácil y/o económi-
ca.
En una realización particularmente preferida, el polímero de la invención se prepara por adición conjugada de bis(aminas secundarias) a bis(ésteres de acrilato). Este esquema de reacción se muestra a continuación:
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Los monómeros de bis(amina secundaria) que son útiles en el presente método de la invención incluyen, pero no se limitan a, N,N'-dimetiletilendiamina y 1,2-bis(N-etilamino)etileno. Los monómeros de diacrilato que son útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, diacrilato de 1,4-butanodiol, dimetacrilato de 1,4-butanodiol, diacrilato de 1,2-etanodiol, diacrilato de 1,6-hexanodiol, diacrilato de 1,5-pentanodiol, diacrilato de 2,5-hexanodiol y diacrilato de 1,3-propanodiol. Cada uno de los monómeros se disuelve en un disolvente orgánico (por ejemplo, THF, CH_{2}Cl_{2}, MeOH, EtOH, CHCl_{3}, hexanos, tolueno, benceno, CCl_{4}, glima, dietil éter, DMSO, DMF, etc.), preferiblemente DMSO. Las disoluciones resultantes se combinan, y la mezcla de reacción se calienta para producir el polímero deseado. En otras realizaciones, la reacción se realiza sin el uso de un disolvente (es decir, puro) obviando de ese modo la necesidad de eliminar el disolvente tras la síntesis. La mezcla de reacción se calienta entonces hasta una temperatura que oscila desde 30ºC hasta 200ºC, preferiblemente de 40ºC a 150ºC, más preferiblemente de 50ºC a 100ºC. En una realización particularmente preferida, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 40ºC, 50ºC, 60ºC, 70ºC, 80ºC o 90ºC. En otra realización particularmente preferida, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 75ºC. En otra realización, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 100ºC. La reacción de polimerización también puede estar catalizada. El tiempo de reacción puede oscilar desde horas hasta días dependiendo de la reacción de polimerización y las condiciones de reacción. Tal como apreciaría un experto en la técnica, el calentamiento de la reacción tiende a acelerar la velocidad de reacción requiriendo un tiempo de reacción más corto. En ciertas realizaciones, la síntesis de polímeros se lleva a cabo en DMSO a aproximadamente 60ºC durante aproximadamente 2 días. En otras realizaciones, la síntesis de polímeros se lleva a cabo sin disolvente a 95ºC durante 8-16 horas. Tal como apreciaría un experto en esta técnica, el peso molecular del polímero sintetizado puede determinarse mediante las condiciones de reacción (por ejemplo, temperatura, materiales de partida, concentración, catalizador, disolvente, tiempo de reacción, etc.) usadas en la
síntesis.
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En otra realización particularmente preferida, los polímeros de la invención se preparan por adición conjugada de una amina primaria a un bis(éster de acrilato). El uso de aminas primarias en vez de bis(aminas secundarias) permite una variedad mucho más amplia de materiales de partida comercialmente disponibles. El esquema de reacción que usa aminas primarias en vez de aminas secundarias se muestra a continuación:
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Las aminas primarias útiles en este método incluyen, pero no se limitan a, anilinas sustituidas. Los bis(ésteres de acrilato) útiles en este método incluyen, pero no se limitan a, diacrilato de 1,4-butanodiol, dimetacrilato de 1,4-butanodiol, diacrilato de 1,2-etanodiol, diacrilato de 1,6-hexanodiol, diacrilato de 1,5-pentanodiol, diacrilato de 2,5-hexanodiol y diacrilato de 1,3-propanodiol. Cada uno de los monómeros se disuelve en un disolvente orgánico (por ejemplo, THF, DMSO, DMF, CH_{2}Cl_{2}, MeOH, EtCH, CHCl_{3}, hexanos, CCl_{4}, glima, dietil éter, etc.). Se prefieren disolventes orgánicos debido a la sensibilidad de los poliésteres a la hidrólisis. Preferiblemente, el disolvente orgánico usado es relativamente no tóxico en sistemas vivos. En ciertas realizaciones, se usa DMSO como disolvente orgánico porque es relativamente no tóxico y se usa frecuentemente como disolvente en cultivo celular y en el almacenamiento de reservas de células congeladas. Otros disolventes preferidos incluyen los miscibles con agua tales como DMSO, etanol y metanol. Se combinan las disoluciones de monómeros resultantes que están preferiblemente a una concentración de entre 0,01 M y 5 M, entre aproximadamente 0,1 M y 2 M, más preferiblemente entre 0,5 M y 2 M, y lo más preferiblemente entre 1,3 M y 1,8 M, y la mezcla de reacción se calienta hasta producir el polímero deseado. En ciertas realizaciones, la reacción se lleva a cabo sin disolvente. Llevar a cabo la polimerización sin disolvente puede disminuir la cantidad de productos de ciclación que resultan de reacciones de adición conjugada intramoleculares. La polimerización puede llevarse a cabo a una temperatura que oscila desde 20ºC hasta 200ºC, preferiblemente desde 40ºC hasta 100ºC, más preferiblemente desde 50ºC hasta 75ºC, incluso más preferiblemente desde 50ºC hasta 60ºC. En una realización particularmente preferida, la mezcla de reacción se mantiene a 20ºC. En otra realización particularmente preferida, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 50ºC. En algunas realizaciones, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 56ºC. Aún en otra realización particularmente preferida, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 75ºC. La mezcla de reacción también puede enfriarse hasta aproximadamente 0ºC. La reacción de polimerización también puede estar catalizada tal como con un catalizador organometálico, ácido o base. En otra realización preferida, pueden usarse uno o más tipos de monómeros de amina y/o monómeros de diacrilato en la reacción de polimerización. Por ejemplo, puede usarse una combinación de etanolamina y etilamina para preparar un polímero más hidrófilo que uno preparado usando etilamina sólo, y también más hidrófobo que uno preparado usando etanolamina sólo.
Al preparar los polímeros de la presente invención, los monómeros en la mezcla de reacción pueden combinarse en una razón diferente para afectar al peso molecular, rendimiento, terminación de extremos, etc. del polímero resultante. La razón de monómeros de amina con respecto a monómeros de diacrilato puede oscilar desde 1,6 hasta 0,4, preferiblemente desde 1,4 hasta 0,6, más preferiblemente desde 1,2 hasta 0,8, incluso más preferiblemente desde 1,1 hasta 0,9. En ciertas realizaciones, la razón de monómeros de amina con respecto a monómeros de diacrilato es aproximadamente de 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,050, 1,025, 1,0, 0,975, 0,950, 0,900, 0,800 y 0,600. Por ejemplo, combinar los monómeros a una razón de 1:1 da como resultado normalmente polímeros de peso molecular superior y rendimientos globales superiores. Además, proporcionar un exceso de monómeros de amina (es decir, razón de amina con respecto a acrilato > 1) da como resultado cadenas terminadas en amina mientras que proporcionar un exceso de monómero de acrilato (es decir, razón de amina con respecto a acrilato < 1) da como resultado cadenas terminadas en acrilato. La razón de monómeros de amina con respecto a monómeros de acrilato en la síntesis de polímeros puede afectar a cómo están terminadas las cadenas de polímero, al peso molecular de los polímeros producidos, a la distribución de pesos moleculares y al grado de reticulación.
El polímero sintetizado puede purificarse mediante cualquier técnica conocida en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, precipitación, cristalización, extracción, cromatografía, etc. En una realización particularmente preferida, el polímero se purifica a través de precipitaciones repetidas en disolvente orgánico (por ejemplo, dietil éter, hexano, etc.). En una realización particularmente preferida, el polímero se aísla como clorhidrato, fosfato, acetato u otra sal. Preferiblemente, la sal es farmacéuticamente aceptable en ciertas realizaciones. El polímero resultante también puede usarse tal como está sin purificación ni aislamiento adicionales; haciendo ventajoso de ese modo usar un disolvente compatible con los ensayos que van a usarse en la evaluación de los polímeros. Por ejemplo, los polímeros pueden prepararse en un disolvente no tóxico tal como DMSO, y la disolución de polímero resultante puede usarse entonces en ensayos de cultivo celular que implican transfectar un ácido nucleico en una célula. Tal como apreciaría un experto en esta técnica, el peso molecular del polímero sintetizado y el grado de reticulación pueden determinarse mediante las condiciones de reacción (por ejemplo, temperatura, materiales de partida, concentración, equivalentes de amina, equivalentes de acrilato, orden de adición, disolvente, etc.) usadas en la síntesis (Odian Principles in Polimerization 3ª ed., Nueva York: John Wiley & Sons, 1991; Stevens Polymer Chemistry: An Introduction 2ª ed., Nueva York: Oxford University Press, 1990). El grado de reticulación del polímero preparado puede minimizarse hasta entre el 1-20%, preferiblemente entre el 1-10%, más preferiblemente entre el 1-5% y lo más preferiblemente menos del 2%. Tal como apreciarían los expertos en esta técnica, las aminas o los bis(ésteres de acrilato) con grupos nucleófilos son más susceptibles a la reticulación, y puede ser necesario tomar medidas para reducir la reticulación tal como disminuir la temperatura o cambiar la concentración de los materiales de partida en la mezcla de reacción. Los acrilatos y otros restos con insaturación o halógenos son también sensibles a la polimerización por radicales que puede conducir a reticulación. El grado de polimerización por radicales y reticulación puede reducirse reduciendo la temperatura de la mezcla de reacción o mediante otros medios conocidos en la
técnica.
En una realización, se prepara en paralelo una biblioteca de diferentes polímeros. La síntesis de una biblioteca de polímeros puede llevarse a cabo usando cualquiera de las enseñanzas conocidas en la técnica o descritas en el presente documento referentes a la síntesis de polímeros de la invención. En una realización, se añade a cada vial una amina y/o bis(éster de acrilato) diferentes a una razón de amina con respecto a acrilato particular en un conjunto de viales usados para preparar la biblioteca o a cada pocillo en una placa de múltiples pocillos (por ejemplo, placa de 96 pocillos). En una realización, los monómeros se diluyen hasta entre 0,1 M y 5 M, más preferiblemente de 0,5 M a 2 M y lo más preferiblemente a aproximadamente 1,6 M, en un disolvente orgánico tal como DMSO. Los monómeros pueden combinarse en una razón diferente para afectar al peso molecular, rendimiento, terminación de extremos, etc. Por ejemplo, combinar los monómeros a una razón de 1:1 produce normalmente polímeros de peso molecular superior y rendimientos globales superiores. Proporcionar un exceso de monómero de amina da como resultado cadenas terminadas en amina mientras que proporcionar un exceso de monómero de acrilato da como resultado cadenas terminadas en acrilato. En algunas realizaciones, no se usa disolvente en la síntesis del polímero. La serie de viales o placa de múltiples pocillos se incuba a una temperatura y durante un periodo de tiempo suficientes para permitir que se produzca la polimerización de los monómeros tal como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones preferidas, el tiempo y la temperatura se eligen para efectuar una incorporación casi completa (por ejemplo, 50% de conversión, 75% de conversión, 80% de conversión, 90% de conversión, 95% de conversión, >95% de conversión, 98% de conversión, 99% de conversión o >99% de conversión) de todo el monómero en polímero. La reacción de polimerización puede llevarse a cabo a cualquier temperatura que oscile desde 0ºC hasta 200ºC. En una realización, las mezclas de reacción se incuban a aproximadamente 45ºC durante aproximadamente 5 días. En otra realización, las mezclas de reacción se incuban a aproximadamente 56ºC durante aproximadamente 5 días. En otra realización, las mezclas de reacción se incuban a aproximadamente 100ºC durante aproximadamente 5 horas. Los polímeros pueden aislarse y purificarse entonces usando técnicas conocidas en la técnica, o pueden usarse las disoluciones de polímeros resultantes sin aislamiento ni purificación adicionales. En ciertas realizaciones, se preparan más de 1000 polímeros diferentes en paralelo. En otras realizaciones, se preparan más de 2000 polímeros diferentes en paralelo. Todavía en otras realizaciones, se preparan más de 3000 polímeros diferentes en paralelo. Los polímeros pueden examinarse entonces usando técnicas de alto rendimiento para identificar polímeros con una característica deseada (por ejemplo, solubilidad en agua, solubilidad a diferentes pH, solubilidad en diversos disolventes orgánicos, capacidad para unirse a polinucleótidos, capacidad para unirse a heparina, capacidad para unirse a moléculas pequeñas, capacidad para formar micropartículas, capacidad para aumentar la eficiencia de transfección, etc.). Los polímeros de la invención pueden examinarse o usarse tras la síntesis sin precipitación, purificación ni aislamiento adicionales del polímero. El uso de un disolvente no tóxico tal como DMSO en la síntesis de los polímeros permite el fácil manejo y uso de los polímeros tras la síntesis del polímero. Por ejemplo, la disolución de polímero en DMSO puede añadirse a un cultivo celular u otro sistema vivo sin un efecto tóxico sobre las células. En ciertas realizaciones, los polímeros pueden examinarse para determinar propiedades o características útiles en terapia génica (por ejemplo, capacidad para unirse a polinucleótidos, aumento en la eficiencia de transfección, etc.). En otras realizaciones los polímeros pueden examinarse para determinar propiedades o características útiles en la técnica de la ingeniería de tejidos (por ejemplo, capacidad para ayudar al crecimiento celular o tisular, capacidad para promover la unión celular). En ciertas realizaciones, los polímeros se sintetizan y se someten a ensayo usando sistemas de manejo de fluidos robotizado y/o técnicas
semiautomatizadas.
Complejos de polinucleótido
Se conoce bien la capacidad de compuestos catiónicos para interaccionar con polinucleótidos cargados negativamente a través de interacciones electrostáticas. Se han preparado polímeros catiónicos tales como poli(lisina) y estudiado para determinar su capacidad para complejar polinucleótidos. Sin embargo, los polímeros estudiados hasta la fecha han incorporado aminas en los extremos terminales de aminas accesibles o cadenas laterales conformacionalmente flexibles, cortas (por ejemplo, poli(lisina)) en la superficie de poliaminas esféricas o globulares (por ejemplo, dendrímeros de PAMAM y PEI). Se cree que la interacción del polímero con el polinucleótido impide al menos parcialmente la degradación del polinucleótido. Neutralizando la carga en la estructura principal del polinucleótido, el complejo neutro o ligeramente cargado positivamente también puede pasar más fácilmente a través de membranas hidrófobas (por ejemplo, citoplasmática, lisosómica, endosómica, nuclear) de la célula. En una realización particularmente preferida, el complejo está ligeramente cargado positivamente. En otra realización particularmente preferida, el complejo tiene un potencial \zeta positivo, más preferiblemente el potencial \zeta es de entre +1 y +30. En ciertas realizaciones, pueden usarse agentes tales como poli(ácido acrílico) (pAA), poli(ácido aspártico), poli(ácido glutámico) o poli(ácido maleico) para impedir la inhibición sérica de los complejos de polinucleótido/polímero en células cultivadas en medios con suero (Trubetskoy y otros, "Recharging cationic DNA complexes with highly charged polianions for in vitro and in vivo gene delivery" Gene Therapy 10:261-271,
2003).
Los poli(\beta-amino-ésteres) de la presente invención presentan aminas terciarias en la estructura principal del polímero. Aunque estas aminas están más impedidas, están disponibles para interaccionar con un polinucleótido. Los polinucleótidos o derivados de los mismos se ponen en contacto con los polímeros de la invención en condiciones adecuadas para formar complejos de polinucleótido/polímero. En ciertas realizaciones, la razón de nitrógeno en el polímero (N) con respecto a fosfato en el polinucleótido es de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1 o 120:1. En ciertas realizaciones, la razón de polímero con respecto a ADN (p/p) es de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1 o 200:1. El polímero está preferiblemente al menos parcialmente protonado para formar un complejo con el polinucleótido cargado negativamente. En una realización preferida, los complejos de polinucleótido/polímero forman nanopartículas que son útiles en la administración de polinucleótidos a células. En una realización particularmente preferida, el diámetro de las nanopartículas oscila desde 50-500 nm, más preferiblemente el diámetro de las nanopartículas oscila desde 50-200 nm y lo más preferiblemente desde 90-150 nm. Las nanopartículas pueden estar asociadas con un agente de direccionamiento tal como se describe a
continuación.
En ciertas realizaciones, pueden añadirse otros agentes a los complejos de polinucleótido:poli(beta-amino-éster). En ciertas realizaciones, se usa un agente co-complejante. Se sabe que los agentes co-complejantes se unen a polinucleótidos y/o aumentan la eficiencia de transfección. Los agentes co-complejantes tienen habitualmente una alta densidad de nitrógeno. La polilisina (PLL) y la polietilenimina (PEI) son dos ejemplos de agentes co-complejantes poliméricos. La PLL tiene una razón de peso molecular con respecto a átomo de nitrógeno de 65, y la PEI tiene una razón de peso molecular con respecto a átomo de nitrógeno de 43. Cualquier polímero con una razón de peso molecular con respecto a átomo de nitrógeno en el intervalo de 10-100, preferiblemente 25-75, más preferiblemente 40-70, puede ser útil como agente co-complejante. La inclusión de un agente co-complejante en un complejo puede permitir reducir la cantidad de poli(beta-amino-éster) en el complejo. Esto se hace particularmente importante si el poli(beta-amino-éster) es citotóxico a concentraciones superiores. En los complejos resultantes con agentes co-complejantes, la razón de agente co-complejante con respecto a polinucleótido (p/p) puede oscilar desde 0 hasta 2,0, preferiblemente desde 0,1 hasta 1,2, más preferiblemente desde 0,1 hasta 0,6, e incluso más preferiblemente desde 0,1 hasta
0,4.
Las propiedades de transfección de diversos complejos de la invención pueden determinarse mediante estudios de transfección in vitro (por ejemplo, transfección de GFP en células cultivadas) o en modelos animales. En ciertas realizaciones, el complejo usado para la transfección se optimiza para un tipo de célula particular, el polinucleótido que va a administrarse, poli(beta-amino-éster), el agente co-complejante (si se usa uno), el proceso de enfermedad, el método de administración (por ejemplo, inhalación, vía oral, vía parenteral, vía i.v., vía intratecal, etc.), el régimen de dosificación, etc.
Polinucleótido
El polinucleótido que va a complejarse o encapsularse mediante los polímeros de la invención puede ser cualquier ácido nucleico incluyendo pero sin limitarse a ARN y ADN. Los polinucleótidos pueden ser de cualquier tamaño o secuencia, y pueden ser mono o bicatenarios. En ciertas realizaciones preferidas, el polinucleótido es mayor de 100 pares de bases de longitud. En otras ciertas realizaciones preferidas, el polinucleótido es mayor de 1000 pares de bases de longitud y puede ser mayor de 10.000 pares de bases de longitud. El polinucleótido está preferiblemente purificado y sustancialmente puro. Preferiblemente, el polinucleótido tiene una pureza mayor del 50%, más preferiblemente una pureza mayor del 75% y lo más preferiblemente una pureza mayor del 95%. El polinucleótido puede proporcionarse mediante cualquier medio conocido en la técnica. En ciertas realizaciones preferidas, el polinucleótido se ha diseñado por ingeniería genética usando técnicas recombinantes (para una descripción más detallada de estas técnicas, véase Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1999); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., ed. por Sambrook, Fritsch, y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)). El polinucleótido puede obtenerse también de fuentes naturales y purificarse de componentes contaminantes encontrados normalmente en la naturaleza. El polinucleótido también puede sintetizarse químicamente en un laboratorio. En una realización preferida, el polinucleótido se sintetiza usando química en fase sólida
convencional.
El polinucleótido puede modificarse por medios químicos o biológicos. En ciertas realizaciones preferidas, estas modificaciones conducen a un aumento de estabilidad del polinucleótido. Las modificaciones incluyen metilación, fosforilación, ocupación de extremos, etc.
Pueden usarse también derivados de polinucleótidos en la presente invención. Estos derivados incluyen modificaciones en las bases, azúcares y/o enlaces fosfato del polinucleótido. Las bases modificadas incluyen, pero no se limitan a, las encontradas en los siguientes análogos de nucleósido: 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina. Los azúcares modificados incluyen, pero no se limitan a, 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, 3'-azido-2',3'-didesoxirribosa, 2',3'-didesoxirribosa, arabinosa (el epímero 2' de la ribosa), azúcares acíclicos y hexosas. Los nucleósidos pueden unirse entre sí mediante enlaces distintos del enlace fosfodiéster encontrado en ADN y ARN que se producen de manera natural. Los enlaces modificados incluyen, pero no se limitan a, enlaces de fosforotioato y 5'-N-fosforamidita. Pueden usarse combinaciones de las diversas modificaciones en un único polinucleótido. Estos polinucleótidos modificados pueden proporcionarse mediante cualquier medio conocido en la técnica; sin embargo, tal como apreciarán los expertos en esta técnica, los polinucleótidos modificados se preparan preferiblemente usando química sintética in vitro.
Los polinucleótidos que van a administrarse pueden estar en cualquier forma. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser un plásmido circular, un plásmido linealizado, un cósmido, un genoma viral, un genoma viral modificado, un cromosoma artificial, etc.
El polinucleótido puede ser de cualquier secuencia. En ciertas realizaciones preferidas, el polinucleótido codifica para una proteína o un péptido. Las proteínas codificadas pueden ser enzimas, proteínas estructurales, receptores, receptores solubles, canales iónicos, proteínas farmacéuticamente activas, citocinas, interleucinas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, factores de coagulación, albúmina, factores de crecimiento, hormonas, insulina, etc. El polinucleótido puede comprender también regiones reguladoras para controlar la expresión de un gen. Estas regiones reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, promotores, elementos potenciadores, elementos represores, caja TATA, sitios de unión ribosómicos, sitios de terminación para la transcripción, etc. En otras realizaciones particularmente preferidas, el polinucleótido no está destinado a codificar para una proteína. Por ejemplo, el polinucleótido puede usarse para fijar un error en el genoma de la célula que está transfectándose.
El polinucleótido también puede proporcionarse como un agente antisentido o ARN de interferencia (ARNi) (Fire y otros, Nature 391; 806-811, 1998).
La terapia antisentido pretende incluir, por ejemplo, la administración o provisión in situ de oligonucleótidos mono o bicatenarios o sus derivados que se hibridan específicamente, por ejemplo, se unen, en condiciones celulares, con ARNm celular y/o ADN genómico, o mutantes de los mismos, de modo que inhiben la expresión de la proteína codificada, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción (Crooke "Molecular mechanisms of action of antisense drugs" Biochim, Biophys. Acta 1489(1):31-44, 1999; Crooke "Evaluating the mechanism of action of antiproliferative antisense drugs" Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10(2):123-126, discussion 127, 2000; Methods in Enzymology volúmenes 313-314, 1999). La unión puede ser mediante complementariedad de pares de bases convencional o, por ejemplo, en el caso de la unión a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco mayor de la doble hélice (es decir, formación de triple hélice) (Chan y otros, J. Mol. Med. 75(4):267-282,
1997).
En una realización particularmente preferida, el polinucleótido que va a administrarse comprende una secuencia que codifica para una proteína o un péptido antigénico. Pueden administrarse nanopartículas que contienen estos polinucleótidos a un individuo para inducir una respuesta inmunológica suficiente para disminuir la posibilidad de una infección posterior y/o aliviar los síntomas asociados con una infección de este tipo. El polinucleótido de estas vacunas puede combinarse con interleucinas, interferones, citocinas y adyuvantes tales como toxina del cólera, alumbre, adyuvante de Freund, etc. Se conoce un gran número de compuestos adyuvantes; los National Institutes of Health han preparado un compendio útil de muchos de tales compuestos y puede encontrarse en el sitio web (http:/www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf; véase también Allison Dev. Biol. Stand. 92:3-11, 1998; Unkeless y otros, Annu. Rev. Immunol. 6:251-281, 1998; y Phillips y otros, Vaccine 10:151-158, 1992).
La proteína o los péptidos antigénicos codificados por el polinucleótido pueden derivarse de organismos bacterianos tales como Streptococccus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes, Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Leptospirosis interrogans, Borrelia burgdorferi, Camphylobacter jejuni y similares; de virus tales como de la viruela, de la gripe A y B, virus sincitial respiratorio, parainfluenza, del sarampión, VIH, de la varicela zóster, del herpes simple 1 y 2, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, rotavirus, rinovirus, adenovirus, papilomavirus, poliovirus, de las paperas, de la rabia, de la rubéola, virus de coxsackie, de la encefalitis equina, de la encefalitis japonesa, de la fiebre amarilla, de la fiebre del valle del Rift, virus de la hepatitis A, B, C, D y E, y similares; y de organismos fúngicos, protozoarios y parasitarios tales como Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis, Schistosoma mansoni, y similares.
Micropartículas
Los poli(\beta-amino-ésteres) de la presente invención pueden usarse también para formar dispositivos de administración de fármacos. Los polímeros de la invención pueden usarse para encapsular agentes incluyendo polinucleótidos, moléculas pequeñas, proteínas, péptidos, metales, compuestos organometálicos, etc. Los polímeros de la invención tienen varias propiedades que los hacen particularmente adecuados en la preparación de dispositivos de administración de fármacos. Éstas incluyen 1) la capacidad del polímero para complejar y "proteger" agentes lábiles; 2) la capacidad para tamponar el pH en el endosoma; 3) la capacidad para actuar como una "esponja de protones" y provocar endosomolisis; y 4) la capacidad para neutralizar la carga en agentes cargados negativamente. En una realización preferida, los polímeros se usan para formar micropartículas que contienen el agente que va a administrarse. En una realización particularmente preferida, el diámetro de las micropartículas oscila entre 500 nm y 50 micras, más preferiblemente desde 1 micra hasta 20 micras y lo más preferiblemente desde 1 micra hasta 10 micras. En otra realización particularmente preferida, las micropartículas oscilan desde 1-5 micras. El polímero de encapsulación de la invención puede combinarse con otros polímeros (por ejemplo, PEG, PLGA) para formar las micro-
esferas.
Métodos de preparación de micropartículas
Las micropartículas de la invención pueden prepararse usando cualquier método conocido en esta técnica. Éstos incluyen, pero no se limitan a, secado por pulverización, emulsión simple y doble emulsión - evaporación del disolvente, extracción con disolvente, separación de fases, coacervación simple y compleja y otros métodos bien conocidos por los expertos habituales en la técnica. Métodos particularmente preferidos de preparación de las partículas son el secado por pulverización y el procedimiento de doble emulsión. Las condiciones usadas en la preparación de las micropartículas pueden alterarse para producir partículas de una propiedad o un tamaño deseado (por ejemplo, hidrofobicidad, hidrofilicidad, morfología externa, "pegajosidad", forma, etc.). El método de preparación de la partícula y las condiciones (por ejemplo, disolvente, temperatura, concentración, velocidad de flujo de aire, etc.) usados pueden depender también del agente que está encapsulándose y/o de la composición de la matriz de
polímero.
Se describen en la bibliografía métodos desarrollados para preparar micropartículas para la administración de agentes encapsulados (por ejemplo, véase Doubrow, M., Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy", CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz y Langer, J. Controlled Release 5:13-22, 1987; Mathiowitz y otros, Reactive Polymers 6; 275-283, 1987; Mathiowitz y otros, J. Appl. Polymer Sci. 35:755-774, 1988).
Si las partículas preparadas mediante cualquiera de los métodos anteriores tienen un tamaño que oscila fuera del intervalo deseado, las partículas pueden clasificarse por tamaños, por ejemplo, usando un tamiz.
Agente
Los agentes que van a administrarse mediante el sistema de la presente invención pueden ser agentes terapeúticos, de diagnóstico o profilácticos. Cualquier compuesto químico que vaya a administrarse a un individuo puede administrarse usando las micropartículas de la invención. El agente puede ser una molécula pequeña, un compuesto organometálico, un ácido nucleico, una proteína, un péptido, un polinucleótido, un metal, un compuesto químico marcado isotópicamente, un fármaco, una vacuna, un agente inmunológico, etc.
En una realización preferida, los agentes son compuestos orgánicos con actividad farmacéutica. En otra realización de la invención, el agente es un fármaco usado clínicamente. En una realización particularmente preferida, el fármaco es un antibiótico, un agente antiviral, un anestésico, un agente esteroideo, un agente antiinflamatorio, un agente antineoplásico, un antígeno, una vacuna, un anticuerpo, un descongestivo, un antihipertensor, un sedante, un agente anticonceptivo, un agente progestacional, un anticolinérgico, un analgésico, un antidepresivo, un antipsicótico, un agente bloqueante \beta-adrenérgico, un diurético, un agente activo cardiovascular, un agente vasoactivo, un agente antiinflamatorio no esteroideo, un agente nutricional, etc.
En una realización preferida de la presente invención, el agente que va a administrarse puede ser una mezcla de agentes. Por ejemplo, puede administrarse un anestésico local en combinación con un agente antiinflamatorio tal como un esteroide. Pueden administrarse también anestésicos locales con agentes vasoactivos tales como epinefrina. Para dar otro ejemplo, puede combinarse un antibiótico con un inhibidor de la enzima producida comúnmente por bacterias para inactivar el antibiótico (por ejemplo, penicilina y ácido clavulánico).
Los agentes de diagnóstico incluyen gases; metales; agentes de obtención de imágenes comercialmente disponibles usados en tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía asistida por ordenador (CAT), tomografía computerizada por emisión de fotón único, rayos X, fluoroscopía y obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI); y agentes de contraste. Los ejemplos de materiales adecuados para su uso como agentes de contraste en MRI incluyen quelatos de gadolinio, así como hierro, magnesio, manganeso, cobre y cromo. Los ejemplos de materiales útiles para la obtención de imágenes por CAT y rayos X incluyen materiales a base de yodo.
Los agentes profilácticos incluyen, pero no se limitan a, antibióticos, complementos nutricionales y vacunas. Las vacunas pueden comprender proteínas o péptidos aislados, virus y organismos inactivados, virus y organismos muertos, virus u organismos alterados genéticamente, y extractos celulares. Pueden combinarse agentes profilácticos con interleucinas, interferones, citocinas y adyuvantes tales como toxina del cólera, alumbre, adyuvante de Freund, etc. Los agentes profilácticos incluyen antígenos de organismos bacterianos tales como Streptococccus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes, Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Leptospirosis interrogans, Borrelia burgdorferi, Camphylobacter jejuni, y similares; antígenos de virus tales como de la viruela, de la gripe A y B, virus sincitial respiratorio, parainfluenza, del sarampión, VIH, de la varicela zóster, del herpes simple 1 y 2, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, rotavirus, rinovirus, adenovirus, papilomavirus, poliovirus, de las paperas, de la rabia, de la rubéola, virus de coxsackie, de la encefalitis equina, de la encefalitis japonesa, de la fiebre amarilla, de la fiebre del valle del Rift, virus de la hepatitis A, B, C, D y E, y similares; y de organismos fúngicos, protozoarios y parásitarios tales como Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis, Schistosoma mansoni, y similares. Estos antígenos pueden estar en forma de organismos completos muertos, péptidos, proteínas, glicoproteínas, hidratos de carbono o combinaciones de los
mismos.
Agentes de direccionamiento
Las micro y nanopartículas de la invención pueden modificarse para incluir agentes de direccionamiento puesto que a menudo es deseable seleccionar como diana una célula, colección de células o un tejido particular. Se conocen en la técnica una variedad de agentes de direccionamiento que dirigen composiciones farmacéuticas a células particulares (véase, por ejemplo, Cotten y otros, Methods Enzym. 217:618, 1993). Los agentes de direccionamiento pueden incluirse por toda la partícula o pueden estar sólo en la superficie. El agente de direccionamiento puede ser una proteína, un péptido, un hidrato de carbono, una glicoproteína, un lípido, una molécula pequeña, etc. El agente de direccionamiento puede usarse para seleccionar como diana células o tejidos específicos o puede usarse para promover la endocitosis o fagocitosis de la partícula. Los ejemplos de agentes de direccionamiento incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, lipoproteínas de baja densidad (LSL), transferrina, asialicoproteínas, proteína de la envuelta gp120 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), hidratos de carbono, ligandos de receptor, ácido siálico, etc. Si el agente de direccionamiento se incluye por toda la partícula, el agente de direccionamiento puede incluirse en la mezcla que se usa para formar las partículas. Si el agente de direccionamiento está sólo en la superficie, el agente de direccionamiento puede estar asociado (por ejemplo, mediante interacciones covalentes, hidrófobas, por enlaces de hidrógeno, de van der Waals u otras interacciones) con las partículas formadas usando técnicas químicas convencionales.
Composiciones farmacéuticas
Una vez que se han preparado las micropartículas o nanopartículas (polímero complejado con polinucleótido), pueden combinarse con uno o más excipientes farmacéuticos para formar una composición farmacéutica que es adecuada para administrarse a animales incluyendo seres humanos. Tal como apreciaría un experto en esta técnica, los excipientes pueden elegirse basándose en la vía de administración tal como se describe a continuación, el agente que está administrándose, el transcurso de tiempo de la administración del agente, etc.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención y para su uso según la presente invención pueden incluir un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa una carga, un diluyente, un material de encapsulación o un adyuvante de formulación de cualquier tipo no tóxico, inerte, sólido, semisólido o líquido. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables son azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón; aceite de cártamo; aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; detergentes tales como Tween 80; agentes tamponantes tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; y también pueden estar presentes soluciones de tampón fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y agentes de perfume, conservantes y antioxidantes, según el juicio del formulador. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse a seres humanos y/o animales por vía oral, por vía rectal, por vía parenteral, por vía intracisternal, por vía intravaginal, por vía intranasal, por vía intraperitoneal, por vía tópica (como mediante polvos, cremas, pomadas o gotas), por vía bucal o como una pulverización oral o nasal.
Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los principios activos (es decir, micropartículas, nanopartículas, complejos de polinucleótido/polímero), las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes de solubilización y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, de cacahuete, de maíz, de germen, de oliva, de ricino y de sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitano, y mezclas de los mismos. Además de diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, edulcorantes, aromatizantes y agentes de perfume.
Pueden formularse preparaciones inyectables, por ejemplo suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles según la técnica conocida usando agentes de suspensión y agentes de dispersión o humectantes adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución, suspensión o emulsión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer, disolución de cloruro de sodio isotónica y según la U.S.P. Además, se emplean convencionalmente aceites fijados, estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite fijado insípido incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, se usan ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de inyectables. En una realización particularmente preferida, las partículas se suspenden en un fluido vehículo que comprende carboximetilcelulosa de sodio al 1% (p/v) y Tween 80 al 0,1% (v/v).
Las formulaciones inyectables pueden esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro que retiene bacterias, o incorporando agentes de esterilización en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.
Las composiciones para administración rectal o vaginal son preferiblemente supositorios que pueden prepararse mezclando las partículas con vehículos o excipientes no irritantes adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera de supositorio que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos a la temperatura corporal y por tanto se funden en la cavidad rectal o vaginal y liberan las micropartículas.
Las formas farmacéuticas sólidas para administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas farmacéuticas sólidas, las partículas se mezclan con al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, inerte, tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio y/o a) cargas o extendedores tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga, c) humectantes tales como glicerol, d) agentes disgregantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio, e) agentes retardantes de la disolución tales como parafina, f) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales como caolín y arcilla de bentonita, e i) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma farmacéutica también puede comprender agentes de tamponamiento.
También pueden emplearse composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina llenas duras y blandas usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Las formas farmacéuticas sólidas de comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas, píldoras y gránulos pueden prepararse con recubrimientos y vainas tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Pueden contener opcionalmente agentes opacificantes y también pueden ser de una composición tal que liberan el/los principio(s) activo(s) sólo, o preferentemente, en una cierta parte del tubo digestivo, opcionalmente, de una manera retardada. Los ejemplos de composiciones de incrustación que pueden usarse incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Pueden emplearse también composiciones sólidas de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina llenas duras y blandas usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Las formas farmacéuticas para administración tópica o transdérmica de una composición farmacéutica de la invención incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, disoluciones, pulverizaciones, inhalantes o parches. Las partículas se mezclan en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o tampón necesario según se requiera. Se contempla también que las formulaciones oftálmicas, gotas para los oídos y gotas oculares están dentro del alcance de esta invención.
Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden contener, además de las partículas de esta invención, excipientes tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos.
Los polvos y pulverizaciones pueden contener, además de las partículas de esta invención, excipientes tales como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Las pulverizaciones pueden contener adicionalmente propelentes habituales tales como clorofluorohidrocarburos.
Los parches transdérmicos tienen la ventaja añadida de proporcionar la administración controlada de un compuesto al organismo. Tales formas farmacéuticas pueden prepararse disolviendo o dispensando las micropartículas o nanopartículas en un medio apropiado. También pueden usarse potenciadores de la absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La velocidad puede controlarse o bien proporcionando una membrana de control de la velocidad o bien dispersando las partículas en un gel o una matriz polimérica.
Éstos y otros aspectos de la presente invención se apreciarán adicionalmente tras la consideración de los siguientes ejemplos, que pretenden ilustrar ciertas realizaciones particulares de la invención pero no pretenden limitar su alcance, tal como se define mediante las reivindicaciones.
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Ejemplos
Ejemplo 1
Poli(\beta-amino-ésteres) degradables: Síntesis, caracterización y autoensamblaje con ADN de plásmido Sección experimental
Consideraciones generales. Todas las manipulaciones que implicaban células vivas o materiales estériles se realizaron en un flujo laminar usando técnica estéril convencional. Se registraron espectros de ^{1}H-RMN (300,100 MHz) y ^{13}C-RMN (75,467 MHz) en un espectrómetro Varian Mercury. Todos los valores de desplazamientos químicos se dan en ppm y se mencionan con respecto a una señal de carbono o protón residual del disolvente. Se realizó la cromatografía de permeación en gel (CPG) de la fase orgánica usando una bomba isocrática serie 1100 de Hewlett Packard, un inyector modelo 7125 de Rheodyne con un bucle de inyección de 100 \mul y dos columnas PL-Gel mixed-D en serie (5 \mum, 300 x 7,5 mm, Polymer Laboratories, Amherst, MA). Se usó THF/piperidina 0,1 M como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Se recogieron los datos usando un refractómetro interferométrico Optilab DSP (Wyatt Technology, Santa Bárbara, CA) y se procesaron usando el paquete informático TriSEC GPC (Viscotek Corporation, Houston, TX). Los pesos moleculares y las polidispersidades de los polímeros se notifican con respecto a patrones de poliestireno monodispersados. La CPG de la fase acuosa la realizó American Polymer Standards (Mentor, OH) usando columnas Ultrahydrogel L y 120A en serie (Waters Corporation, Milford, MA). Se usó agua (ácido acético al 1%, NaCl 0,3 M) como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Se recogieron los datos usando un refractómetro diferencial Knauer y se procesaron usando un paquete informático GPC-PRO 3.13 para IBM/PC (Viscotek Corporaction, Houston, TX). Los pesos moleculares y las polidispersidades de los polímeros se notifican con respecto a patrones de poli(2-vinilpiridina). Para los ensayos de citotoxicidad, se midió la absorbancia usando un lector de microplacas MR5000 de Dynatech Laboratories a 560 nm.
Materiales. Se adquirieron N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina y 4,4'-trimetilendipiperidina de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). Se adquirió diacrilato de 1,4-butanodiol de Alfa Aesar Organics (Ward Hill, MA). Se adquirió bromuro de (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Se produjo ADN de plásmido (pCMV-Luc) en E. coli (DH5\alpha, un regalo por generosidad de Zycos, Inc., Cambridge, MA), se aisló con un kit Qiagen, y se purificó mediante precipitación en etanol. Se adquirieron células NIH 3T3 de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA) y se hicieron crecer a 37ºC, CO_{2} al 5% en medio de Eagle modificado por Dulbecco, 90%; suero bovino fetal, 10%; penicilina, 100 unidades/ml; estreptomicina, 100 \mug/ml. Todos los demás materiales y disolventes se usaron tal como se recibieron sin purificación
adicional.
Procedimiento de polimerización general. En un experimento típico, se pesaron diacrilato de 1,4-butanodiol (0,750 g, 0,714 ml, 3,78 mmoles) y diamina (3,78 mmoles) en dos viales separados y se disolvieron en THF (5 ml). Se añadió la disolución que contenía la diamina a la disolución de diacrilato por medio de una pipeta. Se añadió una barra agitadora recubierta de teflón, se selló el vial con un tapón de rosca revestido de teflón y se calentó la reacción a 50ºC. Tras 48 horas, se enfrió la reacción hasta temperatura ambiente y se añadió mediante goteo lentamente agitando enérgicamente dietil éter o hexanos. Se recogió el polímero y se secó a vacío antes del análisis.
Síntesis del polímero 1. Se preparó el polímero 1 según el procedimiento general resumido anteriormente. ^{1}H-RMN \delta (CDCl_{3}, 300 MHz) 4,11 (t a, 4H), 2,75 (t a, J=7,05 Hz, 4 H), 2,53 (s a, 4H), 2,50 (t a, (osc.), J=7,20 Hz, 4H), 2,28 (s a, 6H), 1,71, (m a, 4H), ^{13}C-RMN \delta (CDCl_{3}, 75,47 MHz) 172,55, 64,14, 55,31, 53,39, 42,47, 32,54,
25,53.
Síntesis del polímero comparativo 2. Se preparó el polímero 2 según el procedimiento general resumido anteriormente. ^{1}H-RMN \delta (CDCl_{3}, 300 MHz) 4,11 (t a, 4H), 2,74 (t a, J=7,35, 4H), 2,56 (m a, 12H), 1,71 (t a, 4H). ^{13}C-RMN \delta (CDCl_{3}, 75,47 MHz) 172,24, 64,19, 53,55, 52,75, 32,27, 25,52.
Síntesis del polímero comparativo 2. Se preparó el polímero 2 según el procedimiento general resumido anteriormente. ^{1}H-RMN \delta (CDCl_{3}, 300 MHz) 4,11 (t a, 4H), 3,00 (m a, 4H), 2,79 (m a, 4H), 2,65 (m a, 4H), 2,11 (m a, 4H), 1,70 (m a, 8H), 1,25 (m a, 12H). ^{13}C-RMN \delta (CDCl_{3}, 75,47 MHz) 172,37, 64,13, 53,89 (a), 36,74, 35,58, 32,11 (a), 25,45, 24,05.
Estudios de degradación de polímeros. Se disolvieron las sales de clorhidrato de los polímeros 1-3 en tampón acetato (1 M, pH = 5,1) o tampón HEPES (1 M, pH = 7,4) a una concentración de 5 mg/ml (el uso de concentraciones milimolares de tampón dio como resultado una reducción sustancial del pH durante la degradación debido a la producción de productos de degradación ácidos). Se incubaron las muestras a 37ºC en un rotor mecánico, y se extrajeron alícuotas (1 ml) a intervalos de tiempo apropiados. Se congelaron las alícuotas inmediatamente en nitrógeno líquido y se liofilizaron. Se extrajo el polímero de las sales de tampón secadas usando THF/piperidina 0,1 M (1 ml), y se analizaron las muestras directamente mediante CPG.
Formación de complejos de ADN/polímero y ensayos de retardo en gel de agarosa. Se formaron complejos de ADN/polímero añadiendo 50 \mul de una disolución de ADN de plásmido (pCMV Luc, 2 \mug/50 \mul en agua) a una disolución con agitación suave con vórtex de la sal de clorhidrato de los polímeros 1-3 (50 \mul en MES 25 mM, pH = 6,0, concentraciones ajustadas para proporcionar la razones en peso deseadas de ADN/polímero). Se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos, tras lo cual se hicieron pasar 20 \mul en un gel de agarosa al 1% (HEPES, 20 mM, pH = 7,2, 65 V, 30 min.). Se cargaron las muestras sobre el gel con un tampón de carga que consistía en Ficoll 400 al 10% (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) en HEPES (25 mM, pH = 7,2). No se incluyó azul de bromofenol como indicador visual en el tampón de carga, puesto que este colorante cargado parecía interferir con la complejación del polímero y el ADN. Se visualizaron bandas de ADN bajo iluminación UV mediante tinción con bromuro de etidio.
Dispersión de luz láser cuasi-elástica (Quasi-Elastic Laser Light Scattering) (QELS) y medición de los potenciales \zeta. Se realizaron experimentos de QELS y mediciones del potencial \zeta usando un detector de dispersión de luz dinámica ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, láser de 15 mW, haz incidente = 676 nm). Se formaron complejos de ADN/polímero tal como se describió anteriormente para los ensayos de retardo en gel de agarosa. Se diluyeron las muestras con 900 \mul de HEPES (20 mM, pH = 7,0), se añadieron a una muestra de complejo de ADN/polímero con agitación suave con vórtex (volumen total = 1 ml, pH = 7,0). Se determinaron los tamaños de partícula promedio y los potenciales \zeta a 25ºC. Se recogieron funciones de correlación a un ángulo de dispersión de 90º, y se calcularon los tamaños de partícula usando la opción MAS del software de determinación de tamaños de partícula de BIC (versión 2.30) usando la viscosidad y el índice de refracción del agua pura a 25ºC. Los tamaños de partícula se expresan como diámetros eficaces suponiendo una distribución logarítmica normal. Se midieron las movilidades electroforéticas promedio a 25ºC usando el software de análisis del potencial zeta BIC PALS y se calcularon los potenciales zeta usando el modelo de Smoluchowsky para suspensiones acuosas. Se realizaron tres mediciones en cada muestra, y los resultados se notifican como diámetros promedio y potenciales
zeta.
Ensayos de citotoxicidad. Se hicieron crecer células NIH 3T3 inmortalizadas en placas de 96 pocillos a una densidad de siembra inicial de 10.000 células/pocillo en 200 \mul de medio de crecimiento (medio de Eagle modificado por Dulbecco al 90%, suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 \mug/ml). Se hicieron crecer las células durante 24 horas, tras lo cual se retiró el medio de crecimiento y se sustituyó por 180 \mul de medio libre de suero. Se añadieron cantidades apropiadas de polímero en alícuotas de 20 \mul. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 5 horas y se determinó la actividad metabólica de cada pocillo usando un ensayo de MTT/azul de tiazolilo: a cada pocillo se le añadieron 25 \mul de una disolución 5 mg/ml de disolución madre de MTT en tampón PBS estéril. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 2 horas, y se añadieron 100 \mul de tampón de extracción (SDS al 20% p/v en DMF/agua (1:1), pH = 4,7) a cada pocillo. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 24 horas. Se midió la absorbancia óptica a 560 nm con un lector de microplacas y se expresó como un porcentaje con respecto a las células
control.
Resultados y discusión Síntesis y caracterización de polímeros
La síntesis de poli(amido-aminas) lineales que contenían aminas terciarias en sus estructuras principales se notificó por Ferruti y otros en 1970 por medio de la adición de aminas bifuncionales a bisacrilamidas (Anderson Nature 392 (Supl.):25-30, 1996; Friedman Nature Med. 2:144-147, 1996; Crystal Science 270:404-410, 1995; Mulligan Science 260:926-932, 1993). Las poli(amido-aminas) lineales se investigaron inicialmente como heparina y biomateriales complejantes de iones (Ferruti y otros, Advances in Polymer Science 58:55-92, 1984; Ferruti y otros, Biomaterials 15: 1235-1241, 1994; Ferruti y otros, Macromol Chem. Phys. 200:1644-1654, 1999; Ferruti y otros, Biomaterials 15:1235-1241, 1994). Se ha visto aumentado el uso de poli(amido-aminas) dendríticas (PAMAM) en aplicaciones de transferencia génica debido a su capacidad para complejar ADN (Kukowska-Latallo y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4897-4902, 1996; Tang y otros, Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler y otros, Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993), y un informe reciente describe la aplicación de una familia de poli(amido-aminas) lineales en estudios de citotoxicidad y transfección celular (Hill y otros, Biochim. Biophys. Acta 1427:161-174, 1999). Por el contrario, las poli(éster-aminas) análogas formadas a partir de la adición de tipo Michael de aminas bifuncionales a ésteres de diacrilato han recibido una menor atención (Danusso y otros, Polymer 11:88-113, 1970; Ferruti y otros, Polymer 26:1336, 1985; Ferruti y otros, Advances in Polymer Science 58:55-92, 1984; Ferruti y otros, Biomaterials 15; 1235-1241, 1994; Ferruti y otros, Macromol. Chem. Phys. 200:1644-1654, 1999; Ferruti y otros, Biomaterials 15:1235-1241, 1994; Kargina y otros, Vysokomol. Soedin. Seriya A 28:1139-1144, 1986; Rao y otros, J. Bioactive and Compatible Polymers 14:54-63, 1999).
El enfoque de poli(amino-éster) presenta una base particularmente atractiva para el desarrollo de nuevos vectores de transfección poliméricos por diversos motivos: 1) los polímeros contienen las aminas requeridas y enlaces fácilmente degradables, 2) posiblemente podrían sintetizarse múltiples análogos directamente a partir de materiales de partida comercialmente disponibles y 3) si los polímeros resultantes eran útiles como agentes de condensación de ADN, podrían diseñarse fácilmente por ingeniería genética futuras generaciones de polímero para presentar valores de pK_{a} de amina que abarquen el intervalo de pH fisiológicamente relevante. Este último punto era particularmente interesante, debido a que la capacidad de tamponamiento de las poliaminas se ha implicado recientemente como un factor que influye en el escape de ADN de endosomas celulares tras la endocitosis (Boussif y otros, Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:7297-7301, 1995; Haensler y otros, Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993; Behr Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix y otros, en Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner y otros, Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, págs. 146-151; Kabanov y otros, en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998). Aunque se requiere la complejación de ADN con un polímero catiónico para compactar y proteger el ADN durante acontecimientos tempranos en el proceso de transfección, el ADN y el polímero deben descomplejarse en última instancia en el núcleo para permitir una transcripción eficaz (Luo y otros, Nat. Biotechnol, 18:33-37, 2000). En vista de este requisito, los policationes degradables podrían desempeñar un papel importante en acontecimientos de "desempaquetamiento de vectores" en el núcleo (Luo y otros, Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Schaffer y otros, Biotechnol. Bioeng. 67:598-606, 2000; Kabanov Pharm. Sci. Technol. Today 2:365-372, 1999). Finalmente, se hace la hipótesis de que los polímeros de esta estructura general, y los derivados de \beta-aminoácido en los que supuestamente se degradarían, serían significativamente menos tóxicos que la poli(lisina) y PEI. Tal como se resumió anteriormente, los policationes degradables (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000) y los polímeros lineales que contienen aminas relativamente impedidas ubicadas cerca de la estructura principal del polímero (Gonzalez y otros, Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999) son menos tóxicos que la poli(lisina) y PEI.
Se investigó la síntesis de los polímeros 1-3 por medio de la adición de las bis(aminas secundarias), N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina y 4,4'-trimetilendipiperidina, a diacrilato de 1,4-butanodiol (Danusso y otros, Polymer 11: 88-113, 1970; Kargina y otros, Vysokomol. Soedin. Seriya A 28:1139-1144, 1986).
La polimerización de estos monómeros tuvo lugar en THF y CH_{2}Cl_{2} a 50ºC proporcionando los polímeros correspondientes en rendimientos de hasta el 86% (tabla 1). Se purificaron los polímeros a través de precipitación repetida en dietil éter o hexano. Se aisló el polímero 1 como un líquido viscoso transparente; se obtuvieron los polímeros 2 y 3 como sólidos blancos tras secar a alto vacío. Alternativamente, los polímeros 1-3 pudieron aislarse como sales de clorhidrato sólidas tras la adición de dietil éter/HCl a una disolución de polímero en THF o CH_{2}Cl_{2}. Los tres polímeros eran solubles en disolventes orgánicos tales como THF, CH_{2}Cl_{2}, CHCl_{3} y MeOH y también eran solubles en agua a pH reducido. El polímero 1 y las sales de clorhidrato de los polímeros 1-3 eran abundantemente solubles en
agua.
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Los pesos moleculares de los polímeros 1-3 y sus correspondientes sales de clorhidrato se determinaron mediante cromatografía de permeación en gel (CPG) tanto de la fase orgánica como de la fase acuosa. Los pesos moleculares de los polímeros (M_{n}) oscilaban desde 5.800 para el polímero 1 hasta 32.000 para el polímero 3, con respecto a los patrones de poliestireno. Las distribuciones del peso molecular para estos polímeros eran monomodales con índices de polidispersidad (PDI) que oscilaban desde 1,55 hasta 2,55. En la tabla 1 se presentan datos de pesos moleculares representativos. Mientras que la síntesis de poli(amido-aminas) lineales se realiza generalmente usando alcoholes o agua como disolventes (Danusso y otros, Polymer 11:88-113, 1970; Ferruti y otros, Polymer 26:1336, 1985; Ferruti y otros, Advances in Polymer Science 58:55-92, 1984; Ferruti y otros, Biomaterials 15:1235-1241, 1994; Ferruti y otros, Macromol. Chem. Phys. 200:1644-1654, 1999; Ferruti y otros, Biomaterials 15:1235-1241, 1994), se emplearon THF anhidro y CH_{2}Cl_{2} en la síntesis de poli(\beta-amino-ésteres) para minimizar las reacciones de hidrólisis durante la síntesis. Los rendimientos y los pesos moleculares de los polímeros sintetizados empleando CH_{2}Cl_{2} como disolvente fueron generalmente mayores que los de los polímeros sintetizados en THF (tabla 1) (el polímero 1 no pudo sintetizarse en CH_{2}Cl_{2}). El color de la disolución de reacción evolucionó desde incoloro hasta un color rosa intenso casi inmediatamente tras la introducción de una disolución de N,N'-dimetiletilendiamina en CH_{2}Cl_{2} en una disolución de diacrilato de 1,4-butanodiol en CH_{2}Cl_{2} (véase la sección experimental anterior). El color evolucionó hasta naranja claro a lo largo del transcurso de la reacción, y se aisló un polímero naranja tras la precipitación en hexano. El polímero aislado era insoluble en CH_{2}Cl_{2}, THF y agua a pH reducido y no se caracterizó estructuralmente. Este problema no se encontró para la reacción análoga en THF.).
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TABLA 1 Datos de pesos moleculares representativos para los polímeros 1-3
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Se confirmaron las estructuras de los polímeros 1-3 mediante espectroscopía de ^{1}H y ^{13}C-RMN. Estos datos indican que los polímeros se formaron a través de la adición conjugada de las aminas secundarias a los restos acrilato del diacrilato de 1,4-butanodiol y no a través de la formación de enlaces amida en las presentes condiciones de reacción. Adicionalmente, las aminas terciarias recién formadas en las estructuras principales de polímero no participan en reacciones de adición posteriores con monómero de diacrilato, lo que conduciría a la ramificación o la reticulación del polímero. Este resultado afortunado parece ser exclusivo de los polímeros de este tipo producidos a partir de monómeros de bis(amina secundaria). La síntesis de polímeros análogos empleando aminas primarias bifuncionales como monómeros (tales como 1,4-diaminobutano) puede conducir a la ramificación del polímero y a la formación de redes poliméricas reticuladas insolubles si las condiciones no se controlan explícitamente.
En vista de la yuxtaposición de aminas y ésteres dentro de las estructuras principales de los polímeros 1-3, inicialmente la preocupación era que la hidrólisis pudiera producirse demasiado rápidamente para que los polímeros tuvieran un uso práctico. Por ejemplo, poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) y poli[ácido \alpha-(4-aminobutil)-L-glicólico] se degradan bastante rápidamente a pH casi neutro, teniendo semividas de aproximadamente 2 h (Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999) y 30 min. (Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000), respectivamente (tales tiempos de degradación rápidos no excluyeron la aplicación de estos polímeros para la administración génica (véanse las referencias, Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000). Sin embargo, velocidades de degradación extremadamente rápidas generalmente introducen preocupaciones adicionales en cuanto a la manipulación, el almacenamiento y la aplicación de polímeros degradables). Sin embargo, el análisis de los polímeros 1 y 2 mediante CPG acuosa usando ácido acético al 1%/agua como eluyente, reveló que la degradación era suficientemente lenta en medios ácidos. Por ejemplo, los perfiles de CPG de los polímeros 1 y 2 muestreados en estas condiciones a lo largo de un periodo de 4 - 5 horas no revelaron ningún cambio en los pesos moleculares o las polidispersidades (el polímero 3 no pudo analizarse mediante CPG acuosa). También estaba la preocupación de que pudiera producirse hidrólisis significativa de la estructura principal durante el aislamiento de las sales de clorhidrato de los polímeros 1-3. Para impedir la hidrólisis durante la protonación y el aislamiento de estos polímeros, se emplearon disolventes anhidro y se realizaron las reacciones bajo una atmósfera de argón. El análisis de los polímeros antes y después de la protonación no reveló hidrólisis observable. Por ejemplo, el perfil de CPG de una muestra del polímero 3 tras precipitación en CH_{2}Cl_{2} con dietil éter 1,0 M/HCl (M_{n} = 15.300; PDI =1,90) era prácticamente idéntico al peso molecular del polímero antes de la protonación (M_{n} = 15.700; PDI = 1,92) y no se manifestó ninguna especie de menor peso molecular (se recogieron datos de CPG comparativos empleando THF/piperidina 0,1 M como eluyente (véase la sección experimental anterior). Las sales de HCl de los polímeros eran insolubles en THF, pero eran solubles en THF/piperidina 0,1 M concomitante con la producción de un precipitado blanco fino que se filtró antes de la inyección). Pudieron almacenarse muestras sólidas de los polímeros 1-3 durante varios meses sin disminuciones detectables en el peso molecular.
Los polímeros 1-3 se diseñaron específicamente para degradarse por medio de hidrólisis de los enlaces éster en las estructuras principales de polímero. Sin embargo, una preocupación adicional en cuanto a la estabilidad y la biocompatibilidad globales de estos polímeros es el potencial para que se produzca degradación no deseada a través de una reacción de retro-Michael en condiciones fisiológicas. Debido a que estos polímeros se sintetizaron por medio de la reacción de tipo Michael de una amina secundaria con un éster de acrilato, es posible que los polímeros pudieran experimentar una reacción de retro-Michael para regenerar grupos acrilato libres, particularmente en condiciones ácidas. Los ésteres de acrilato son agentes alquilantes del ADN potenciales y, por tanto, son presuntos carcinógenos (para ejemplos recientes, véase: Schweikl y otros, Mutat. Res. 438:P71-P78, 1999; Yang y otros, Carcinogenesis 19:P1117-P1125, 1998). Debido a que se espera que estos polímeros se encuentren con el entorno de pH reducido dentro de las vesículas endosómicas de las células (pH = 5,0 - 5,5) durante la transfección, se abordó el potencial para que se produjera la degradación de estos polímeros a través de una ruta de retro-Michael.
En condiciones extremadamente ácidas (pH < 3) o básicas (pH > 12), los polímeros 1-3 se degradan rápida y exclusivamente para dar 1,4-butanodiol y los subproductos de bis(\beta-aminoácido) anticipados 4a-6a tal como se determina mediante espectroscopía de ^{1}H-RMN. No se halló ninguna evidencia espectroscópica de adición de retro-Michael en estas condiciones. Cabe mencionar que sería menos probable que los productos de degradación de bis(\beta-aminoácido) 4a-6a experimentaran una reacción de retro-Michael, ya que los ácidos acrílicos son generalmente reactivos de la adición de Michael menos activados (Perlmutter, P., en Conjugate Addition Reactions in Organic Synthesis, Pergamon Press, Nueva York, 1992). No se observó degradación adicional de los compuestos 4a-6a en estas
condiciones.
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Se investigó la cinética de la degradación de polímero en la gama de condiciones que era posible que se encontraran estos polímeros durante la transfección. Se monitorizó la degradación a 37ºC a valores de pH tamponado de 5,1 y 7,4 con el fin de aproximarse al pH de los entornos en el interior de vesículas endosómicas y el citoplasma, respectivamente. Se añadieron las sales de clorhidrato de los polímeros 1-3 al tampón apropiado, se incubaron a 37ºC, y se extrajeron alícuotas en los tiempos apropiados. Se congelaron las alícuotas inmediatamente, se liofilizaron y se extrajo el polímero en THF/piperidina 0,1 M para el análisis mediante CPG. La figura 1 muestra los perfiles de degradación de los polímeros 1-3 como función del tiempo. Los polímeros se degradaban más lentamente a pH 5,1 que a pH 7,4. Los polímeros 1-3 mostraron perfiles de degradación similares a pH 5,1, teniendo cada polímero una semivida de aproximadamente 7-8 horas. Por el contrario, los polímeros 1 y 3 se degradaron completamente en menos de 5 horas a pH 7,4. Estos resultados concuerdan con los perfiles de pH-degradación de otros poliésteres que contienen amina, tales como poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina), en los que se hace la hipótesis de que las funcionalidades de amina colgantes actúan como catalizadores nucleófilos intramoleculares y contribuyan a una degradación más rápida a mayor pH (Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000). Aunque no puede descartarse la posibilidad de ayuda intramolecular, es menos probable para los polímeros 1-3 debido a que las aminas terciarias en estos polímeros deben ser menos nucleófilas. La degradación del polímero 2 se producía más lentamente a pH 7,4 que a pH 5,1 (figura 1). Este comportamiento anómalo se debe lo más probablemente a la solubilidad incompleta del polímero 2 a pH 7,4 y a la naturaleza heterogénea resultante del medio de degradación (los polímeros 2 y 3 no son completamente solubles en agua a pH 7,4). Aunque el polímero 3 se disolvió de manera relativamente rápida durante el experimento de degradación, fueron visibles partículas sólidas del polímero 2 durante varios días.
Ensayos de citotoxicidad
Se han estudiado ampliamente poli(lisina) y PEI como agentes de condensación de ADN y vectores de transfección (Luo y otros, Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Behr Acc. Chem. Res. 26:274-278, 1993; Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov y otros, Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; Boussif y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995; Behr Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix y otros, en Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner y otros, Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, págs. 146-151; Kabanov y otros, en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998) y son los patrones con los que a menudo se comparan nuevos vectores poliméricos (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 122: 6524-6525, 2000; Gonzalez y otros, Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999). Desafortunadamente, tal como se resumió anteriormente, estos polímeros están asociados también con niveles significativos de citotoxicidad y los altos niveles de expresión génica se realizan habitualmente sólo con un coste sustancial para la viabilidad celular. Para determinar el perfil de toxicidad de los polímeros 1-3, se realizó un ensayo de reducción con colorante MTT/azul de tiazolilo usando la línea celular NIH 3T3 y las sales de clorhidrato de los polímeros 1-3 como indicadores iniciales. La línea celular 3T3 se emplea comúnmente como población de examen de primer nivel para nuevos vectores de transfección, y el ensayo de MTT se usa generalmente como indicador inicial de citotoxicidad, ya que determina las influencias de las sustancias añadidas sobre el metabolismo y crecimiento celulares (Hansen y otros, Immunol. Methods 119: 203-210, 1989).
Se incubaron células con el polímero 1 (M_{n} = 5.800), el polímero 2 (M_{n} =11.300) y el polímero 3 (M_{n} = 22.500) tal como se describió en la sección experimental. Tal como se muestra en la figura 2, las células incubadas con estos polímeros permanecieron viables al 100% con respecto a los controles a concentraciones de polímero de hasta 100 \mug/ml. Estos resultados concuerdan extraordinariamente con los datos obtenidos para poblaciones de células tratadas con PEI (M_{n} \approx 25.000), incluidas como control positivo para el presente ensayo así como para facilitar la comparación con este agente de transfección bien conocido. Menos del 30% de las células tratadas con PEI siguieron siendo viables a una concentración de polímero de 25 \mug/ml, y la viabilidad celular fue de tan sólo un 10% a mayores concentraciones de PEI en condiciones por lo demás idénticas. Se realizó un ensayo de MTT análogo usando bis(\beta-aminoácidos) 4a-6a sintetizados independientemente para examinar la citotoxicidad de los productos de degradación hidrolítica de estos polímeros. (Los bis(\beta-aminoácidos) 4a-6a deben o bien ser biológicamente inertes o bien presentar toxicidades leves o agudas que son inferiores que en los vectores de transfección policatiónicos tradicionales. En cualquier caso, la degradación de estos materiales debe facilitar un aclaramiento metabólico rápido). Los compuestos 4a-6a y 1,4-butanodiol no perturbaron el crecimiento celular ni el metabolismo en este ensayo de examen inicial (datos no mostrados). No puede hacerse una comparación más directa basada en la estructura/función entre los polímeros 1-3 y PEI debido a diferencias en el peso molecular y la estructura del polímero, contribuyendo ambos a la toxicidad de los policationes. No obstante, los excelentes perfiles de citotoxicidad de los polímeros 1-3 solos sugirieron que eran candidatos interesantes para un estudio adicional como agentes de condensación de
ADN.
Autoensamblaje de los polímeros 1-3 con ADN de plásmido
Se conoce bien la tendencia de las poliaminas catiónicas a interaccionar electrostáticamente con la estructura principal polianiónica del ADN en disolución acuosa. Siempre que los polímeros estén suficientemente protonados a pH fisiológico, y que las aminas sean estéricamente accesibles, tales interacciones pueden dar como resultado un proceso de autoensamblaje en el que los polímeros cargados negativa y positivamente forman conjugados bien definidos (Kabanov y otros, en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998). La mayoría de las poliaminas investigadas como agentes complejantes de ADN y vectores de transfección han incorporado aminas en los extremos terminales de cadenas laterales cortas, conformacionalmente flexibles (por ejemplo, poli(lisina) y polímeros de metacrilato/metacrilamida) (Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov y otros, Bioconjugate Chem. 6: 7-20, 1995; van de Wetering y otros, Bioconjugate Chem. 10:589-597, 1999), o aminas accesibles sobre las superficies de poliaminas esféricas o globulares (por ejemplo, dendrímeros de PEI y PAMAM) (Boussif y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995; Kukowska-Latallo y otros, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 93: 4897-4902, 1996; Tang y otros, Bioconjugate Chem. 7.703-714, 1996; Haensler y otros, Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993).
Debido a que los polímeros 1-3 contienen aminas terciarias, y esas aminas terciarias están ubicadas en un entorno estéricamente ocupado (flanqueado en dos lados por las estructuras principales de polímero), inicialmente la preocupación era que las aminas protonadas no pudieran interaccionar de manera suficientemente íntima con el
ADN.
La capacidad de los polímeros 1-3 para complejar ADN de plásmido se demostró a través de un ensayo de desplazamiento en gel de agarosa. La electroforesis en gel de agarosa separa macromoléculas basándose tanto en la carga como en el tamaño. Por tanto, la inmovilización del ADN en un gel de agarosa en presencia de concentraciones crecientes de un policatión se ha usado ampliamente como ensayo para determinar el punto en el que se consigue la neutralización de la carga del ADN completa (Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Gonzalez y otros, Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999). Tal como se mencionó anteriormente, las sales de clorhidrato de los polímeros 1-3 son solubles en agua. Sin embargo, los polímeros 2 y 3 no son completamente solubles a pH 7,2 a lo largo del intervalo completo de concentraciones de polímero deseadas. Por tanto, se prepararon complejos de ADN/polímero en tampón MES (25 mM, pH = 6,0). Se prepararon complejos de ADN/polímero añadiendo una disolución acuosa de ADN a disoluciones con agitación con vórtex de polímero en MES a concentraciones deseadas de ADN/polímero (véase la sección experimental). Los complejos de ADN/polímero resultantes siguieron siendo solubles tras la dilución en el tampón de ejecución de electroforesis (HEPES 20 mM, pH = 7,2) y se obtuvieron los datos a pH fisiológico. Como ejemplo representativo, la figura 3 representa la migración de ADN de plásmido (pCMV-Luc) en un gel de agarosa en presencia de concentraciones crecientes del polímero 1.
Tal como se muestra en la figura 3, el retardo de la migración del ADN comienza a razones de ADN/1 de tan sólo 1:0,5 (p/p) y la migración se retarda completamente a razones de ADN/polímero por encima de 1:1,0 (p/p) (en el presente documento se notifican razones en peso de ADN/polímero en vez de razones de carga de ADN/polímero. Aunque en la bibliografía se usan ambas convenciones, se encuentra que las razones en peso son más prácticas y universales, puesto que la carga global en una poliamina está sometida a variaciones del entorno en el pH y la temperatura. Aunque las razones de carga de ADN/polímero son descriptivas para polímeros tales como poli(lisina), son menos significativas para polímeros tales como PEI y 1-3 que incorporan menos aminas básicas). Los polímeros 2 y 3 inhiben completamente la migración del ADN de plásmido a razones (p/p) de ADN/polímero por encima de 1:10 y 1:1,5, respectivamente (datos no mostrados). Estos resultados varían notablemente con respecto a experimentos de retardo en gel realizados usando "monómeros" modelo. Puesto que los verdaderos monómeros y los productos de degradación de los polímeros 1-3 no representan adecuadamente las unidades de repetición de los polímeros, se usaron los bis(metil-ésteres) 4b - 6b para examinar el grado en el que son necesarias la polivalencia y la unión cooperativa de los policationes 1-3 para lograr la inmovilización del ADN. Los "monómeros" 4b - 6b no inhibieron la migración del ADN a razones (p/p) de ADN/"monómero" de hasta 1:30 (datos no
mostrados).
Los motivos para la complejación menos eficaz empleando el polímero 2 en los ensayos de electroforesis en gel anteriores resultan lo más probablemente de diferencias en los valores de pK_{a} de las aminas en estos polímeros. La medición directa de los valores de pK_{a} de los polímeros 1-3 es complicada por su degradabilidad. Sin embargo, se predice que el intervalo de valores de pK_{a} de las aminas en los polímeros 1 y 2 se extiende desde aproximadamente 4,5 y 8,0 para el polímero 1, hasta 3,0 y 7,0 para el polímero 2, basándose en comparaciones con poli(\beta-amino-amidas) estructuralmente relacionadas. (Se han notificado los valores de pK_{a} de poli(\beta-amino-amidas) estructuralmente relacionadas que contienen unidades de piperazina y dimetiletilendiamina en sus estructuras principales. Barbucci y otros, Polymer 21:81-85, 1980; Barbucci y otros, Polymer 19:1329-1334, 1978; Barbucci y otros, Macromolecules 14:1203-1209, 1981). Como resultado, el polímero 2 debe protonarse en menor grado que el polímero 1 a pH fisiológico o casi neutro y, por tanto, sería un agente de condensación de ADN menos eficaz. El intervalo de valores de pK_{a} para el polímero 3 debe ser mayor que el intervalo para los polímeros 1 y 2 debido al aumento de distancia entre los átomos de nitrógeno. Por consiguiente, el polímero 3 forma complejos con ADN a concentraciones sustancialmente reducidas con respecto al polímero 2.
Los ensayos de retardo en gel de agarosa son útiles en la determinación del grado en el que los policationes interaccionan con el ADN. Sin embargo, para ser agentes de transfección útiles, los policationes deben poder autoensamblar también ADN de plásmido para dar complejos de polímero/ADN suficientemente pequeños como para entrar en una célula a través de endocitosis. Para la mayoría de los tipos de células, este requisito de tamaño es del orden de 200 nm o menos (Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998), aunque pueden acomodarse también partículas más grandes (Demeneix y otros, en Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Feigner y otros, Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, págs. 146-151; Kabanov y otros, en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998). La capacidad de los polímeros 1-3 para compactar ADN de plásmido para dar estructuras de tamaño nanométrico se determinó mediante dispersión de luz láser cuasi-elástica (QELS), y las cargas superficiales relativas de los complejos resultantes se cuantificaron a través de mediciones de potenciales \zeta. Las partículas de ADN/polímero usadas para determinar el tamaño de partícula y las mediciones de potenciales \zeta se formaron tal como se describió anteriormente para ensayos de electroforesis en gel de agarosa y se diluyeron en tampón HEPES 20 mM (pH = 7,0) para el análisis, tal como se describió en la sección experimental.
El polímero 1 formó complejos con diámetros que oscilaban desde 90-150 nm a razones de ADN/polímero por encima de 1:2 (p/p), y el polímero 2 condensó ADN dando partículas del orden de 60-125 nm a razones de ADN/polímero por encima de 1:10. Estos resultados concuerdan con los datos obtenidos a partir de los experimentos anteriores de electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo, las partículas en estos experimentos se agregaron a lo largo de un periodo de horas proporcionando complejos más grandes con diámetros en el intervalo de 1-2 micras. La tendencia de estas partículas a agregarse puede racionalizarse mediante los bajos potenciales \zeta de las partículas de ADN/polímero observadas en estas condiciones. Por ejemplo, los complejos formados a partir del polímero 1 a razones de ADN/polímero por encima de 1:10 tenían potenciales \zeta promedio de +4,51 (\pm0,50) mV. Los potenciales \zeta de los complejos formados a partir del polímero 2 a razones de ADN/polímero por encima de 1:20 fueron inferiores, alcanzando un valor limitante de +1,04 (0,57) mV. Estas diferencias se correlacionan con los valores de pK_{a} estimados para estos polímeros, ya que se esperaría que las superficies de las partículas formadas a partir del polímero 1 estuvieran ligeramente más protonadas que las partículas formadas a partir del polímero 2 a pH = 7,0.
El polímero 3 formó complejos con diámetros en el intervalo de 50-150 nm a razones de ADN/polímero por encima de 1:2. Como ejemplo representativo, la figura 4 muestra los diámetros eficaces promedio de partículas formadas con el polímero 3 como función de la concentración de polímero. Los diámetros de las partículas variaban dentro del intervalo anterior de experimento a experimento en condiciones por lo demás idénticas, posiblemente debido a diferencias sutiles durante la agitación o la adición de las disoluciones de ADN durante la formación de los complejos. (El orden de adición de las disoluciones de polímero y de ADN tuvo un impacto considerable sobre la naturaleza de los complejos de ADN/polímero resultantes. Con el fin de formar partículas pequeñas, por ejemplo, fue necesario añadir la disolución de ADN a una disolución de polímero con agitación con vórtex. Para los casos en los que se añadieron disoluciones de polímero a ADN, sólo se observaron agregados de tamaño micrométrico. Por tanto, es posible que las diferencias sutiles en la agitación o la velocidad de adición pudieran ser responsables de la variación en el tamaño de partícula). Los potenciales \zeta para los complejos formados a partir del polímero 3 eran del orden de +10 a +15 mV a razones de ADN/polímero por encima de 1:1, y los complejos no se agregaron de manera extensa a lo largo de un periodo de 18 horas (pH = 7, 25ºC). Los potenciales \zeta positivos de estos complejos pueden ser significativos más allá del contexto de estabilidad de partícula, ya que las cargas positivas netas en las superficies de las partículas pueden desempeñar un papel en el desencadenamiento de la endocitosis (Kabanov y otros, Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Behr Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix y otros, en Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner y otros, Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, págs. 146-151; Kabanov y otros, en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998).
Las partículas formadas a partir del polímero 3 también eran relativamente estables a 37ºC. Por ejemplo, se incubó una muestra de ADN/3 (ADN/3 = 1:5, diámetro promedio = 83 nm) a 37ºC durante 4 horas. Tras 4 horas, se observó una distribución bimodal que consistía en una fracción con un promedio de 78 nm (>98% en número, 70% en volumen) y una fracción de agregados más grandes con diámetros promedio de aproximadamente 2,6 micras. Estos resultados sugieren que la degradación de complejos formados a partir del polímero 3 se producía más lentamente que la degradación del polímero en disolución, o que la degradación parcial no afectaba significativamente a la estabilidad de las partículas. También se ha observado la estabilidad aparentemente aumentada de los complejos de ADN/polímero formados a partir de policationes degradables con respecto a la degradación de los polímeros en disolución para complejos de ADN/polímero formados a partir de poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999).
Los datos de tamaños de partícula y potenciales \zeta en las figuras 4 y 5 concuerdan con modelos de condensación de ADN observados con otros policationes (Kabanov y otros, Bioconjugate Chem. 6; 7-20, 1995; Putnam y otros, Macromolecules 32: 3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Gonzalez y otros, Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999). El ADN se compacta para dar partículas pequeñas cargadas negativamente a concentraciones de polímero muy bajas y los tamaños de partícula aumentan con la concentración de polímero creciente. (No pudieron obtenerse datos exactos de dispersión de luz para especies asociadas a ADN solo o ADN/polímero a razones de ADN/polímero inferiores a 1:0,5, puesto que el ADN flexible, no condensado no dispersa la luz de manera tan extensa como el ADN compactado (Kabanov y otros, en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998). Los complejos alcanzan un diámetro máximo a medida que se logra la neutralidad de carga y se produce la agregación. Los tamaños de partícula disminuyen bruscamente a concentraciones de ADN/polímero por encima de la neutralidad de carga hasta las razones a las que el polímero adicional no contribuye a una reducción en el diámetro de partícula. Este modelo se confirma mediante mediciones de los potenciales \zeta realizadas en complejos formados a partir de estos polímeros. Tal como se muestra en la figura 5, los potenciales \zeta de partículas de polímero/ADN formadas a partir del polímero 3 fueron negativos a concentraciones de polímero bajas y la neutralidad de carga se logró cerca de razones de ADN/polímero de 1:0,75, dando como resultado una agregación extensa. Los potenciales \zeta de las partículas se aproximaban a un valor limitante que oscilaba desde +10 hasta +15 mV a razones de ADN/polímero por encima de 1:2.
Los diámetros promedio de los complejos descritos anteriormente entran dentro de los requisitos generales de tamaño para la endocitosis celular. Se han iniciado experimentos de transfección empleando la línea celular NIH 3T3 y el gen indicador de luciferasa (pCMV-Luc). Hasta ahora, los polímeros 1 y 2 no han mostrado ninguna actividad de transfección en los ensayos de examen iniciales. Por el contrario, el polímero 3 ha demostrado eficiencias de transfección que superan las de PEI en ciertas condiciones. Se realizaron experimentos de transfección según el siguiente protocolo general: Se hicieron crecer células en placas de 6 pocillos a una densidad de siembra inicial de 100.000 células/pocillo en 2 ml de medio de crecimiento. Se hicieron crecer las células durante 24 horas tras lo cual se retiró el medio de crecimiento y se sustituyó por 2 ml de medio libre de suero. Se formaron complejos de ADN/polímero tal como se describió en la sección experimental [2 \mug de ADN, ADN/3 = 1:2 (p/p), 100 \mul en MES (pH = 6,0)] y se añadieron a cada pocillo. Se formaron complejos de ADN/PEI a una razón en peso de 1:0,75, una razón que se halló generalmente en el laboratorio que era óptima para transfecciones de PEI. Se llevaron a cabo las transfecciones en medio libre de suero durante 4 horas, tras lo cual se sustituyó el medio por medio de crecimiento durante 20 horas adicionales. Se determinaron las eficiencias de transfección relativas usando kits de ensayo de proteína celular (Pierce) y de luciferasa (Promega). Los resultados se expresan como unidades relativas de luz (URL) por mg de proteína celular total: para complejos del polímero 3, 1,07 (\pm43) x 10^{6} URL/mg; para complejos de PEI, 8,07 (\pm16) x10^{5} URL/mg). No se detectó expresión de luciferasa para los experimentos control empleando ADN desnudo o realizados en ausencia de ADN. Estos datos de transfección son los resultados de experimentos de examen iniciales. Estos datos sugieren que los polímeros de esta estructura general tienen potencial como vectores sintéticos para la administración génica y son candidatos interesantes para un estudio adicional. La eficacia relativa del polímero 3 con respecto a PEI es interesante ya que los presentes experimentos de examen iniciales se realizaron en ausencia de cloroquina y el polímero 3 no incorpora actualmente un medio obvio para facilitar el escape endosómico. Sin embargo, debe observarse que los valores de pK_{a} de las aminas en estos polímeros pueden "afinarse" para entrar más directamente dentro del intervalo de pH fisiológicamente relevante usando este enfoque sintético modular. Por tanto, será posible modificar por ingeniería genética adicionalmente el carácter de "esponja de protones" (Behr Chimia 51:34-36,1997; Demeneix y otros, en Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner y otros, Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, págs. 146-151; Kabanov y otros, en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998) de estos polímeros y, por tanto, potenciar sus eficiencias de transfección, directamente a través de la incorporación de o la copolimerización con diferentes monómeros de diamina.
Sumario
Se notifica una estrategia general para la preparación de nuevos vectores de transfección de ADN poliméricos degradables. Se sintetizaron los poli(\beta-amino-ésteres) 1-3 por medio de la adición conjugada de N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina y 4,4'-trimetilendipiperidina a diacrilato de 1,4-butanodiol. Las aminas en los monómeros de bis(amina secundaria) participan activamente en los procesos de formación de enlaces durante la polimerización, obviando la necesidad de procesos de protección/desprotección de amina que caracterizan la síntesis de otros poli(amino-ésteres). Por consiguiente, este enfoque permite la generación de una variedad de poliésteres estructuralmente diversos que contienen aminas terciarias en sus estructuras principales en una sola etapa a partir de materiales de partida comercialmente disponibles. Los polímeros 1-3 se degradaban hidrolíticamente en medios ácidos y alcalinos proporcionando 1,4-butanodiol y los \beta-aminoácidos 4a-6a y se investigó la cinética de degradación a pH 5,1 y 7,4. Los polímeros se degradaban más rápidamente a pH 7,4 que a pH 5,1, concordando con los perfiles de pH/degradación notificados para otros poli(amino-ésteres). Un ensayo de examen inicial diseñado para determinar los efectos de los polímeros 1-3 sobre el metabolismo y crecimiento celulares sugirió que estos polímeros y sus productos de degradación hidrolítica no eran citotóxicos con respecto a PEI, un polímero catiónico no degradable empleado convencionalmente como vector de transfección.
Los polímeros 1-3 interaccionaban electrostáticamente con ADN de plásmido a pH fisiológico, iniciando procesos de autoensamblaje que daban como resultado complejos de ADN/polímero a escala nanométrica. Se usaron electroforesis en gel de agarosa, dispersión de luz dinámica cuasi-elástica (QEIS) y mediciones de potenciales zeta para determinar el grado de las interacciones entre los polielectrolitos con cargas opuestas. Se encontró que los tres polímeros condensaban ADN dando partículas de ADN/polímero solubles del orden de 50-200 nm. Las partículas formadas a partir de los polímeros 1 y 2 se agregaron de manera extensa, mientras que las partículas formadas a partir del polímero 3 mostraron potenciales \zeta positivos (por ejemplo, de +10 a +15 mV) y no se agregaron durante hasta 18 horas. Las dimensiones de tamaño nanométrico y las citotoxicidades reducidas de estos complejos de ADN/polímero sugieren que los polímeros 1-3 pueden ser útiles como vectores de transfección génica poliméricos degradables. Una perfecta comprensión de las relaciones estructura/actividad existentes para esta clase de polímero acelerará el diseño de alternativas a base de polímeros más seguras con respecto a vectores de transfección virales para terapia
génica.
Ejemplo 2
Liberación rápida, desencadenada por pH de microesferas de poli(\beta-amino-éster) biodegradables dentro del intervalo de pH intracelular Sección experimental
Fabricación de microesferas. Se realizó el procedimiento optimizado para la fabricación de microesferas de la siguiente manera general: se suspendió una disolución acuosa de dextrano conjugado con rodamina (200 \mul de una disolución 10 \mug/\mul, M_{n} \approx 70 kD) en una disolución de poli-1 en CH_{2}Cl_{2} (200 mg de poli-1 en 4 ml de CH_{2}Cl_{2}, M_{n} \approx 10 kD), y se sonicó la mezcla durante 10 segundos formando una emulsión primaria. Se añadió la emulsión rosa turbio directamente a una disolución rápidamente homogeneizada (5.000 rpm) de poli(alcohol vinílico) [50 ml, PVA al 1% (p/p)] formando la emulsión secundaria. Se homogeneizó la emulsión secundaria durante 30 segundos antes de añadirla a una segunda disolución acuosa de PVA [100 ml, PVA al 0,5% (p/p)]. El análisis directo de la suspensión de microesferas usando un analizador de micropartículas Coulter reveló un tamaño de partícula medio de aproximadamente 5 micrómetros. Se agitó la emulsión secundaria durante 2,5 horas a temperatura ambiente, se transfirió a una sala fría (4ºC) y se agitó durante 30 minutos adicionales. Se aislaron las microesferas a 4ºC por medio de centrifugación, se resuspendieron en agua fría y se centrifugaron de nuevo para eliminar el PVA en exceso. Se resuspendieron las esferas en agua (15 ml) y se liofilizaron proporcionando un polvo rosa esponjoso. Se realizó la caracterización de las microesferas liofilizadas mediante microscopías óptica, de fluorescencia y electrónica de barrido tal como se describe. Se determinó el potencial zeta usando un analizador ZetaPALS de Brookhaven
Instruments.
Discusión
Las micropartículas formadas a partir de polímeros biodegradables son atractivas para su uso como dispositivos de administración, y se ha empleado una variedad de microesferas a base de polímero para la liberación sostenida de compuestos terapéuticos (Anderson Nature 392 (supl.): 25-30, 1996; Friedman Nature Med. 2; 144-147, 1996; Crystal Science 270:404-410, 1995; Mulligan Science 260:926-932, 1993; Luo y otros, Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Behr Acc. Chem. Res. 26:274-278, 1993). Sin embargo, para compuestos terapéuticos a base de moléculas pequeñas, proteínas y ADN que requieren administración intracelular y traslado hasta el citoplasma, existe una demanda creciente de nuevos materiales que faciliten la liberación desencadenada en respuesta a estímulos ambientales tales como pH (Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998). Tras la endocitosis, se reduce el pH dentro de los compartimentos endosómicos celulares, y el material extraño se degrada tras la fusión con vesículas lisosómicas (Kabanov y otros, Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995). Nuevos materiales que liberan cargas útiles moleculares tras cambios en el pH dentro del intervalo intracelular y facilitan el escape de entornos intracelulares hostiles podrían tener un impacto fundamental y de amplio alcance sobre la administración de fármacos hidrolítica y/o enzimáticamente lábiles (Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev. 30: 97-113, 1998; Kabanov y otros, Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995). En el presente documento, se notifica la fabricación de microesferas de polímero sensibles al pH que liberan el contenido encapsulado cuantitativa y esencialmente de manera instantánea tras cambios en el pH dentro del intervalo
intracelular.
La síntesis del poli(\beta-amino-éster) 1 se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1 (Miller Angew. Chem. Int. Ed. 37:1768-1785,1998; Hope y otros, Molecular Membrane Technology 15:1-14, 1998; Deshmukh y otros, New J. Chem. 21: 113-124, 1997). Poli-1 es hidrolíticamente degradable, no fue citotóxico en ensayos de examen iniciales y actualmente está en investigación como vector sintético para la administración de ADN en aplicaciones de terapia génica. La solubilidad del polímero en medios acuosos se ve influida directamente por el pH de la disolución. Específicamente, el polímero sólido, no protonado, es insoluble en medios acuosos en el intervalo de pH de 7,0 a 7,4, y la transición entre solubilidad e insolubilidad se produce a un pH de alrededor de 6,5. Basándose en las diferencias entre pH extracelular y endosómico (7,4 y 5,0 - 6,5, respectivamente), se hace la hipótesis de que las microesferas formadas a partir de poli-1 podrían ser útiles para la encapsulación y la liberación desencadenada de compuestos dentro del intervalo de pH intracelular.
La encapsulación de compuestos terapéuticos dentro de microesferas de polímero se logra a menudo empleando un proceso de doble emulsión (O'Donnell y otros, Adv. Drug Delivery Rev. 28:25-42, 1997). El proceso de doble emulsión está bien establecido para la fabricación de microesferas a partir de polímeros hidrófobos tales como poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), un polímero biodegradable empleado convencionalmente en el desarrollo de dispositivos de administración de fármacos (Anderson y otros, Adv. Drug Delivery Rev, 28:5-24, 1997; Okada Adv. Drug Delivery Rev. 28:43-70, 1997). Experimentos preliminares demostraron la viabilidad del proceso de doble emulsión para la encapsulación de compuestos solubles en agua usando poli-1. Se eligió dextrano conjugado con rodamina como modelo para estudios posteriores de encapsulación y liberación por diversos motivos: 1) la rodamina es fluorescente, permitiendo que se determinen perfiles de carga y de liberación mediante espectroscopía de fluorescencia, 2) podían obtenerse imágenes de las microesferas cargadas directamente mediante microscopía de fluorescencia y 3) la intensidad de fluorescencia de la rodamina no se ve relativamente afectada por el pH dentro del intervalo fisiológico (Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6ª ed., Molecular Probes, Inc., 1996, pág.
29).
Se fabricaron microesferas que encapsulaban dextrano marcado a partir de poli-1, y se compararon con los controles formados a partir de PLGA. Las distribuciones de tamaño de las microesferas formadas a partir de poli-1 se correlacionaban bien con las distribuciones de las microesferas de PLGA dentro del intervalo de 5-30 \mum. Los tamaños de partícula promedio podían controlarse mediante variaciones en parámetros experimentales tales como las velocidades de homogenización y las razones de disolvente acuoso/orgánico (O'Donnell y otros, Adv. Drug Delivery Rev. 28:25-42, 1997). Al contrario que las microesferas de PLGA, sin embargo, las esferas formadas a partir de poli-1 se agregaban de manera extensa durante las etapas de centrifugación y lavado (véase la sección experimental anterior). Las microesferas resuspendidas a pH 7,4 consistían principalmente en agregados grandes, y las imágenes de microscopía electrónica de barrido (MEB) revelaron agrupaciones de esferas que parecían estar unidas o "soldadas" físicamente (datos no mostrados).
Se encontró que la agregación podía limitarse si la centrifugación y el lavado se realizaban a temperaturas reducidas (4ºC), presumiblemente debido al endurecimiento de las esferas de polímero a esta menor temperatura. Las imágenes de MEB de microesferas de poli-1 cargadas con dextrano preparadas en el intervalo de 8-10 \mum revelaron fracturas significativas y la formación de grandes orificios en sus superficies. Las microesferas seleccionadas en el intervalo de 4-6 \mum, sin embargo, estaban esencialmente libres de grietas, orificios y otros defectos (figura 6). Se fabricaron microesferas formuladas para experimentos de liberación posteriores en el intervalo menor (< 6 \mum). Las eficiencias de encapsulación para microesferas de poli-1 cargadas, determinadas disolviendo las esferas a pH 5,1 y midiendo la intensidad de fluorescencia, fueron de tanto como el 53%.
Las suspensiones de microesferas de poli-1 secadas a pH = 7,4 consistían principalmente en microesferas individuales, aisladas, tal como se determina mediante microscopía óptica y de fluorescencia (figura 8a). El potencial zeta (\zeta) de las suspensiones de micropartículas de microesferas de poli-1 a pH 7 fue de +3,75 (\pm0,62) mV, lo que sugiere que las superficies de las microesferas portan una carga positiva global a pH fisiológico. Esto podría ser relevante para la selección de estas microesferas para la captación celular, debido a que cargas positivas netas en las superficies de las partículas pueden desempeñar un papel en el desencadenamiento de la endocitosis (Zauner y otros, Adv. Drug Delivery Rev. 30:97-113, 1998).
Las microesferas de poli-1 suspendidas a pH 7,4 siguieron siendo estables frente a la agregación y la degradación durante varias semanas (mediante inspección visual), pero las microesferas se disolvieron instantáneamente cuando el pH del medio de suspensión se redujo a entre 5,1 y 6,5.
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30 
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La liberación de dextrano marcado a partir de microesferas de poli-1 se determinó cuantitativamente mediante microscopía de fluorescencia (figura 7). El perfil de liberación a pH 7,4 se caracterizaba por una pequeña ráfaga inicial en fluorescencia (7-8%) que alcanzó un valor limitante de aproximadamente el 15% tras 48 horas. Este experimento demostró que la degradación de poli-1 era relativamente lenta en estas condiciones y que podía retenerse más del 90% de material encapsulado en la matriz de polímero durante periodos de tiempo adecuadamente largos a pH
fisiológico.
Para examinar la aplicación de microesferas de poli-1 en la liberación desencadenada de fármacos encapsulados en el intervalo de pH endosómico, se realizó un experimento similar en el que el pH del medio de suspensión se cambió desde 7,4 hasta 5,1 durante el transcurso del experimento. Tal como se muestra en la figura 7, las microesferas se disolvieron rápidamente cuando el tampón de suspensión se intercambió por tampón acetato (0,1 M, pH = 5,1), dando como resultado una liberación esencialmente instantánea y cuantitativa del dextrano marcado que permanecía en las matrices de polímero. Muy al contrario, la liberación a partir de microesferas de PLGA cargadas con dextrano no aumentó durante hasta 24 horas después de que se redujera el pH del medio de suspensión (figura 7). La figura 8 muestra imágenes de microscopía de fluorescencia de: (a) una muestra de microesferas cargadas con dextrano a pH 7,4; y (b) una muestra a la que se añadió una gota de tampón acetato en el borde superior derecho del cubreobjetos del microscopio. La rápida liberación de dextrano conjugado con rodamina se visualizó como rayas que se extendían desde las microesferas que se disolvían en la dirección de la difusión del ácido añadido y un aumento global en la fluorescencia del fondo (tiempo transcurrido \approx 5 segundos).
Cuando se seleccionan compuestos terapéuticos para administración intracelular por medio de endocitosis o fagocitosis, no sólo es importante considerar un medio mediante el que el fármaco pueda liberarse de su vehículo, sino también un medio mediante el que el fármaco pueda escapar de los compartimentos endosómicos antes de enviarse a vesículas lisosómicas (Luo y otros, Nat. Biotechnol. 18: 33-37,2000; Zauner y otros, Adv. Drug Delivery Rev. 30:97-113, 1998). Una estrategia para facilitar el escape endosómico es la incorporación de bases débiles, o "esponjas de protones", que se cree que tamponan el entorno ácido dentro de un endosoma y perturban las membranas endosómicas aumentando la presión osmótica interna dentro de la vesícula (Demeneix y otros, en Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner y otros, Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, págs. 146-151). Las microesferas de poli-1 pueden liberar material encapsulado en el intervalo de pH endosómico por medio de un mecanismo (disolución) que implica la protonación de aminas en la matriz de polímero. Por tanto, además de la rápida liberación del fármaco, las microesferas de poli-1 pueden proporcionar también un medio de perturbación de la membrana de escape endosómico, potenciando la eficacia prolongando las vidas útiles de fármacos hidrolíticamente inestables contenidos en la matriz de polímero.
Las microesferas fabricadas a partir de poli-1 podrían representar una importante adición al arsenal de materiales sensibles al pH aplicados para la administración de fármacos intracelular, tales como formulaciones de polímero/liposoma sensibles al pH (Gerasimov y otros, Adv. Drug Delivery Rev. 38:317-338, 1999; Linhart y otros, Langmuir 16:122-127, 2000; Linhardt y otros, Macromolecules 32.4457-4459, 1999). Al contrario que muchas formulaciones liposómicas, las microesferas de polímero son físicamente robustas y pueden secarse en almacenamiento durante periodos prolongados sin deformación, descomposición ni degradación (Okada Adv. Drug Delivery Rev. 28:43-70, 1997), una importante consideración para la formulación y el envasado de nuevos sistemas de administración terapéutica. Las microesferas investigadas en este estudio actual entran dentro de intervalo de tamaños de las partículas comúnmente usadas para dirigir la administración a macrófagos (Hanes y otros, Adv. Drug Delivery Rev. 28:97-119, 1997). Los perfiles de pH-liberación rápidos para las microesferas de poli-1 descritos anteriormente pueden por tanto ser útiles en el diseño de nuevas vacunas a base de ADN que actualmente emplean PLGA como material de encapsulación (Singh y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:811-816, 2000; Ando y otros, J. Pharm. Sci. 88:126-130, 1999; Hedley y otros, Nat. Med. 4:365-368, 1998).
Ejemplo de referencia 3
Descubrimiento acelerado de vectores de transfección sintéticos: Síntesis en paralelo y examen de una biblioteca de polímeros degradables Introducción
La administración segura y eficaz de ADN terapéutico a células representa un obstáculo fundamental para el éxito clínico de la terapia génica (Luo y otros, Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Anderson Nature 392 supl.:25-30, 1996). Los desafíos a los que se enfrentan los vectores de administración sintéticos están particularmente claros, ya que tanto los polímeros catiónicos como los liposomas son menos eficaces en la mediación de la transferencia génica que los vectores virales. La incorporación de nuevos criterios de diseño ha conducido a avances recientes hacia sistemas de administración funcionales (Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 123: 2460-2461, 2001; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Hwang y otros, Bioconjugate Chem. 12:280-290,2001; Putnam y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1200-1205,2001; Benns y otros, Bioconjugate Chem, 11:637-645, 2000; Midoux y otros, Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999). Sin embargo, el paradigma para el desarrollo de vectores de administración génica poliméricos sigue siendo la incorporación de estos elementos de diseño en materiales como parte de un proceso lineal iterativo, un enfoque eficaz, aunque lento, para el descubrimiento de nuevos vectores. En el presente documento, se notifica un enfoque en paralelo adecuado para la síntesis de grandes bibliotecas de oligómeros y polímeros catiónicos degradables y el descubrimiento de nuevas familias de vectores sintéticos a través de ensayos de selección basados en células rápidos (para un informe sobre la síntesis en paralelo y la selección de polímeros degradables para la ingeniería de tejidos, véase: Brocchini y otros, J. Am. Chem. Soc. 119:4553-4554,
1997).
Sección experimental
Consideraciones generales. Todas las manipulaciones que implicaban células vivas o materiales estériles se realizaron en una cabina de flujo laminar usando técnica estéril convencional. Se realizó la cromatografía de permeación en gel (CPG) usando una bomba isocrática serie 1100 de Hewlett Packard, un inyector modelo 7125 de Rheodyne con un bucle de inyección de 100 \mul y dos columnas PL-Gel mixed-D en serie (5 \mum, 300 x 7,5 mm, Polymer Laboratories, Amherst, MA). Se usó THF/piperidina 0,1 M como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Se recogieron los datos usando un refractómetro interferométrico Optilab DSP (Wyatt Technology, Santa Bárbara, CA) y se procesaron usando el paquete informático TriSEC GPC (Viscotek Corporation, Houston, TX). Los pesos moleculares y las polidispersidades de los polímeros se notifican con respecto a patrones de poliestireno
monodispersados.
Materiales. Se adquirieron los monómeros 1-20 de amina primaria y amina secundaria de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Lancaster (Lancashire, UK), Alfa Aesar Organics (Ward Hill, MA) y Fluka (Milwaukee, WI). Se adquirieron los monómeros A-G de Polysciences, Inc. (Warrington, PA), Alfa Aesar y Scientific Polymer Products, Inc, (Ontario, NY). Se adquirieron todos los monómeros con la mayor pureza disponible (desde el 97% hasta 99+%) y se usaron tal como se recibieron sin purificación adicional. Se adquirió ADN de plásmido que contenía el gen indicador de luciferasa de luciérnaga (pCMV-Luc) de Elim Biopharmaceuticals, Inc. (San Francisco, CA) y se usó sin purificación adicional. Se adquirió bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Se adquirieron los fibroblastos de riñón de mono (células COS-7) usados en los ensayos de transfección de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA) y se hicieron crecer a 37ºC, CO_{2} al 5% en medio de Eagle modificado por Dulbecco, 90%; suero bovino fetal, 10%; penicilina, 100 unidades/ml; estreptomicina, 100 \mug/ml. Se adquirieron los kits de detección de luciferasa detección usados en los ensayos de transfección de alto rendimiento de Tropix (Bedford, MA). Todos los demás materiales y disolventes se usaron tal como se recibieron sin purificación adicional.
Síntesis de la biblioteca de polímeros. Las 140 reacciones de polimerización se realizaron simultáneamente como una serie de viales etiquetados individualmente según el siguiente protocolo general. Se indican excepciones individuales cuando sea apropiado. Se cargaron los monómeros 1-20 de amina (2,52 mmoles) en viales etiquetados apropiadamente (tal como se muestra a continuación): se midieron los monómeros líquidos y se transfirieron cuantitativamente usando pipetas de microlitros; se pesaron los monómeros sólidos directamente en cada vial. Se añadió CH_{2}Cl_{2} anhidro (1 ml) a cada vial. Se añadió un equivalente de diacrilatos A-F líquidos (2,52 mmoles) a cada vial de reacción apropiado usando una pipeta de microlitros, y se tapó el vial de manera apretada con un tapón revestido de teflón. Se añadió un equivalente de diacrilato G semisólido a los viales apropiados como una disolución en CH_{2}Cl_{2} (2,52 mmoles, 1 ml de una disolución 2,52 M en CH_{2}Cl_{2}) y se taparon los viales de manera apretada. Se añadió una alícuota adicional de CH_{2}Cl_{2} (2 ml) a los viales de reacción que contenían 19 y 20 para ayudar a la solubilidad de estos monómeros. Se dispusieron los viales tapados de manera apretada en dos rejillas de tubos de ensayo de plástico y se fijaron a un agitador orbital en un horno a 45ºC. (PRECAUCIÓN: el calentamiento de los viales tapados representa un posible peligro de explosión. Se monitorizó la temperatura del horno periódicamente durante una semana antes del experimento para garantizar una estabilidad térmica fiable. Se encontró que las temperaturas variaban dentro de +/- 1ºC durante este periodo de tiempo. Se monitorizaron varios viales de prueba antes de realizar el experimento mayor). Se agitaron los viales de reacción enérgicamente a 45ºC durante 5 días y se dejaron enfriar hasta temperatura ambiente. Se colocaron los viales en un desecador grande y se colocaron a vacío de aspirador durante 1 día y a alto vacío durante 5 días adicionales para garantizar la eliminación completa del disolvente. Se analizaron las muestras obtenidas mediante CPG (55% de la biblioteca total, véase la tabla 2) y se usaron directamente en todos los experimentos de examen posteriores.
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TABLA 2 Inspección por CPG del 55% de la biblioteca de examen que muestra pesos moleculares (M_{w}) y polidispersidades (mostradas entre paréntesis)
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Determinación de la solubilidad en agua. Se determinaron las solubilidades de todas las muestras simultáneamente a una concentración de 2 mg/ml de la siguiente manera general. Se pesó cada muestra de polímero (5 mg) en un vial de centelleo de 12 ml y se añadieron 2,5 ml de tampón acetato (25 mM, pH = 5,0) a cada muestra usando una pipeta. Se agitaron las muestras enérgicamente a temperatura ambiente durante 1 hora. Se observó cada muestra visualmente para determinar la solubilidad.
Ensayo de electroforesis en gel de agarosa. Se realizó el ensayo de electroforesis en gel de agarosa usado para determinar la capacidad de los polímeros para formar complejos con el ADN de la siguiente manera. Usando las disoluciones preparadas en el ensayo de solubilidad anterior (2 mg/ml en tampón acetato, 25 mM, pH = 5,0), se dispusieron disoluciones madre de los 70 polímeros solubles en agua en una placa de cultivo celular de 96 pocillos. Se formaron complejos de ADN/polímero a una razón de 1:5 (p/p) transfiriendo 10 \mul de cada disolución de polímero desde la placa de disolución madre hasta una nueva placa usando una pipeta multicanal. Se diluyó adicionalmente cada polímero con 90 \mul de tampón acetato (25 mM, pH = 5,0, volumen total = 100 \mul) y se agitó la placa durante 30 segundos en un agitador mecánico. Se añadió una disolución acuosa de ADN de plásmido (100 \mul de una disolución 0,04 \mug/\mul) a cada pocillo en la placa y se mezclaron enérgicamente las disoluciones usando una pipeta multicanal y un agitador mecánico. Se formaron complejos de ADN/polímero a una razón de 1:20 (p/p) de la misma manera con las siguientes excepciones: se transfirieron 40 \mul de disolución madre de polímero a una nueva placa y se diluyeron con 60 \mul de tampón acetato (volumen total =100 \mul) antes de añadir la disolución acuosa de ADN (100 \mul). Se incubaron complejos de ADN/polímero a temperatura ambiente durante 30 minutos, tras lo cual se cargaron muestras de cada disolución (15 \mul) en un gel de agarosa al 1% (HEPES, 20 mM, pH = 7,2, bromuro de etidio 500 ng/ml) usando una pipeta multicanal. NOTA: Se cargaron las muestras en el gel con un tampón de carga que consistía en Ficoll 400 al 10% (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) en HEPES (25 mM, pH = 7,2). No se incluyó azul de bromofenol como indicador visual en el tampón de carga, puesto que este colorante cargado parecía interferir con la complejación del polímero y el ADN. Se cargaron las muestras según el patrón mostrado en la figura 9, de modo que las muestras correspondientes a razones de ADN/polímero de 1:5 y 1:20 se sometieron a ensayo en posiciones adyacentes en el gel. Se procesó el gel a 90 V durante 30 minutos y se visualizaron bandas de ADN mediante tinción con bromuro de etidio.
Protocolo general para ensayos de transfección celular. Se realizaron ensayos de transfección por triplicado de la siguiente manera general. Se hicieron crecer células COS-7 en placas de 96 pocillos a una densidad de siembra inicial de 15.000 células/pocillo en 200 \mul de medio de crecimiento libre de rojo de fenol (medio de Eagle modificado por Dulbecco al 90%, suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 \mug/ml). Se hicieron crecer las células durante 24 horas en un incubador, tras lo cual se retiró el medio de crecimiento y se sustituyó por 200 \mul de medio Optimem (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) complementado con HEPES (concentración total = 25 mM). Se prepararon complejos de polímero/ADN preparados a partir de los 56 polímeros de complejación de ADN/solubles en agua identificados previamente tal como se describió anteriormente a una razón de 1:20 (p/p)) usando un plásmido comercialmente disponible que contenía el gen indicador de luciferasa de luciérnaga (pCMV-Luc). Se añadió un volumen apropiado de cada muestra a las células usando una pipeta multicanal (por ejemplo, 15 \mul proporcionaban 300 ng de ADN/pocillo; 30 \mul proporcionaban 600 ng de ADN/pocillo). Se realizaron controles empleando poli(etilenimina) (PEI) y polilisina, preparadas a razones de ADN/polímero de 1:1, de manera similar y se incluyeron con controles de ADN y no de ADN. Se realizaron controles empleando Lipofectamine 2000 (invitrogen Corp.) a varias concentraciones (0,1, 0,2, 0,4 y 0,6 \mul) tal como se describe en el manual técnico para este producto (http://lifetechnologies.com). Se incubaron las células durante 4 horas, tras lo cual se retiró el medio de crecimiento libre de suero y se sustituyó por 100 \mul de medio de crecimiento libre de rojo de fenol. Se incubaron las células durante un periodo de tiempo adicional (normalmente variaba entre 36 y 60 horas) y se determinó la expresión de luciferasa usando un kit de ensayo comercialmente disponible (Tropix, Inc., Bedford, MA). Se cuantificó la luminiscencia en placas de polipropileno blancas, de fondo sólido, de 96 pocillos, usando un lector de placas de bioluminiscencia de 96 pocillos. Se expresó la luminiscencia en unidades relativas de luz y no se normalizó con respecto a la proteína celular total en este ensayo.
Resultados y discusión
Los poli(\beta-amino-ésteres) son hidrolíticamente degradables, condensan ADN de plásmido a pH fisiológico y se sintetizan fácilmente por medio de la adición conjugada de aminas primarias o secundarias a diacrilatos (ec. 1 y 2) (Lynn y otros, J. Am. Chem. Soc. 122:10761-10768, 2000). Un examen inicial de polímeros modelo identificó estos materiales como vehículos génicos potenciales y demostró que las variaciones estructurales podían tener un impacto significativo sobre la eficiencias de transfección y de unión a ADN (Lynn y otros, J. Am. Chem. Soc. 122:10761-10768, 2000). Se razona que este enfoque proporcionaba un marco atractivo para la elaboración de grandes bibliotecas de polímeros estructuralmente únicos por diversos motivos: 1) los monómeros de diamina y diacrilato son materiales de partida económicos, comercialmente disponibles, 2) la polimerización puede lograrse directamente en una única etapa sintética y 3) las etapas de purificación son generalmente innecesarias ya que no se generan subproductos durante la polimerización.
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La escasez de bis(aminas secundarias) comercialmente disponibles limita el grado de diversidad estructural que puede lograrse usando el enfoque sintético anterior. Sin embargo, el conjunto de monómeros útiles, comercialmente disponibles, se expande significativamente cuando las aminas primarias se consideran potenciales elementos de construcción de bibliotecas. Debido a que la adición conjugada de aminas a grupos acrilato tolera generalmente funcionalidades tales como alcoholes, éteres y aminas terciarias (Ferruti y otros, Adv. Polym. Sci. 58:55-92, 1984), se cree que la incorporación de monómeros de amina primaria funcionalizados en la presente estrategia sintética serviría para ampliar la diversidad estructural. Se seleccionaron los monómeros A-G de acrilato y los monómeros 1-20 de amina para la síntesis de una biblioteca de examen inicial.
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Se eligió el tamaño de la biblioteca construida a partir de este conjunto de monómeros (7 diacrilatos x 20 aminas = 140 polímeros estructuralmente únicos) para que fuera suficientemente grande como para incorporar suficiente diversidad, pero suficientemente pequeño como para ser práctico sin necesidad de automatización en los estudios iniciales. Al principio no estaba claro si un polímero tal como G16 (formado a partir de los monómeros G y 16 hidrófobos y estéricamente voluminosos) sería soluble en agua a pH fisiológico o si podría condensar ADN de manera suficiente. Sin embargo, se incorporaron deliberadamente monómeros de este tipo para explorar completamente el espacio de la diversidad, y previendo que esta biblioteca puede ser útil en última instancia como población de examen para el descubrimiento de materiales para aplicaciones distintas de la administración génica. (Para un informe sobre la síntesis en paralelo y la selección de polímeros degradables para ingeniería de tejidos, véase: Brocchini y otros, J. Am. Chem. Soc. 119:4553-4554, 1997), Lynn y otros, Angew. Chem. Int, Ed. 40:1707-1710,
2001).
Se realizaron reacciones de polimerización simultáneamente como una serie de viales etiquetados individualmente. Las reacciones se realizaron en cloruro de metileno a 45ºC durante 5 días, y se aislaron los polímeros mediante eliminación del disolvente proporcionando 600-800 mg de cada material. Las reacciones realizadas en esta escala proporcionaron cantidades de cada material suficientes para el análisis de rutina mediante CPG y todos los ensayos posteriores de unión a ADN, de toxicidad y de transfección. Una inspección del 55% de la biblioteca mediante CPG indicó pesos moleculares que oscilaban desde 2000 hasta 50000 (con respecto a los patrones de poliestireno). Ya que para la transfección y complejación de ADN no se requieren altos pesos moleculares (tal como se muestra a continuación) (Kabanov y otros, en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998), esta biblioteca proporcionó una colección de polímeros y oligómeros adecuados para ensayos de examen posteriores.
De los 140 miembros de la biblioteca de examen, 70 muestras eran suficientemente solubles en agua (2 mg/ml, tampón acetato 25 mM, pH = 5,0) como para incluirse en un ensayo de unión a ADN electroforético (figura 9). Para realizar este ensayo tan rápida y eficazmente como fuera posible, se mezclaron las muestras con ADN de plásmido a razones de 1:5 y 1:20 (ADN/polímero, p/p) en placas de 96 pocillos y se cargaron en una placa de gel de agarosa que podía someter a ensayo hasta 500 muestras usando una pipeta multicanal. Se sometieron a ensayo las 70 muestras de polímero soluble en agua simultáneamente a dos razones de ADN/polímero diferentes en menos de 30 minutos. Tal como se muestra en la figura 9, 56 de las 70 muestras de polímero soluble en agua interaccionaron suficientemente con el ADN como para retardar la migración a través de la matriz de gel (por ejemplo, A4 o A5), empleando la razón de ADN/polímero de 1:20 como criterio de exclusión. Se descartaron catorce polímeros de una consideración adicional (por ejemplo, A7 y A8), ya que estos polímeros no complejaban ADN suficientemente.
Los materiales de complejación de ADN identificados en el ensayo anterior se investigaron adicionalmente en ensayos de transfección empleando ADN de plásmido y la línea celular COS-7. Se realizaron todos los ensayos simultáneamente con el gen indicador de luciferasa de luciérnaga (pCMV-Luc) y se determinaron los niveles de proteína expresada usando un kit de ensayo comercialmente disponible y un lector de placas de luminiscencia de 96 pocillos. La figura 10 muestra los datos generados a partir de un ensayo empleando pCMV-Luc (600 ng/pocillo) a razones de ADN/poli de 1:20 (p/p). La mayoría de los polímeros examinados no mediaba la transfección por encima de un nivel típico de los controles de ADN "desnudo" (sin polímero) en estas condiciones. Sin embargo, varios pocillos expresaron niveles mayores de proteína y los polímeros correspondientes se identificaron como "resultados positivos" en este ensayo. Los polímeros B14 (M_{w} = 3180) y G5 (M_{w} = 9170), por ejemplo, proporcionaron niveles de transfección 4-8 veces superiores que los experimentos control empleando poli(etilenimina) (PEI), un polímero empleado convencionalmente como vector de transfección sintético (Boussif y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995), y niveles de transfección dentro de o superando el intervalo de proteína expresada usando Lipofectamine 2000 (disponible de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)), un destacado sistema de vector de transfección a base de lípidos comercialmente disponible. Los polímeros A14, C5, G7, G10 y G12 se identificaron también como "resultados positivos" en el experimento anterior, pero los niveles de expresión génica fueron inferiores que con B14 y
G5.
Las diferencias estructurales entre los polímeros sintéticos descartan normalmente un conjunto general de condiciones de transfección óptimas. Por ejemplo, los polímeros C5, C14 y G14 eran tóxicos a las concentraciones más altas empleadas anteriormente (determinado por la ausencia de células en los pocillos que contenían estos polímeros tal como se observó con inspección visual. Estos polímeros eran menos tóxicos y mediaban la transfección a menor concentración), pero mediaban la transfección a menores concentraciones de ADN y polímero (datos no mostrados). El sistema de ensayo descrito anteriormente puede modificarse fácilmente para evaluar los polímeros como función de la concentración de ADN, la razón de ADN/polímero, las densidades de siembra de células o los tiempos de incubación. Se requerirá investigación adicional para evaluar más completamente el potencial de esta biblioteca de examen, y experimentos para este fin se encuentra actualmente en marcha.
Los ensayos anteriores se realizaron en ausencia de cloroquina, una base débil añadida comúnmente para potenciar la transfección in vitro (Putnam y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1200-1205, 2001; Benns y otros, Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux y otros, Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999; Kabanov y otros, en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998), y los resultados reflejan por tanto las capacidades intrínsecas de esos materiales para mediar la transfección. Los polímeros que contienen monómero 14 son estructuralmente similares a otros polímeros "esponja de protones" que contienen histidina (Putnam y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1200-1205, 2001; Benns y otros, Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux y otros, Bioconjugate Chem, 10:406-411, 1999), y podrían potenciar la transfección tamponando compartimentos intracelulares ácidos y mediando el escape endosómico (Putnam y otros, Proc. Natl. Acad Sci. USA 98:1200-1205, 2001; Benns y otros, Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux y otros, Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999; Boussif y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995). La eficacia de los polímeros que contienen monómero 5 es sorprendente en este contexto, ya que estos materiales no incorporan un medio obvio para facilitar el escape endosómico. Aunque todavía no se entiende la eficacia de estos últimos polímeros, su descubrimiento ayuda a validar el presente enfoque en paralelo y destaca el valor de incorporar diversidad estructural, ya que estos polímeros no pueden haberse descubierto según iban surgiendo. Los polímeros que incorporan los diacrilatos D y E hidrófilos no han producido "resultados positivos" en ninguna condición hasta ahora, proporcionando una posible base para el desarrollo de bibliotecas más centradas útiles para la dilucidación de las relaciones estructura/
actividad.
Se ha generado una biblioteca de 140 oligómeros y polímeros degradables útiles para el descubrimiento de nuevos materiales de complejación de ADN y vectores de administración génica. Varios de estos materiales pueden condensar ADN para dar estructuras suficientemente pequeñas como para internalizarse por células y liberar el ADN en una forma transcripcionalmente activa. El tiempo total requerido actualmente para ensayos de diseño, síntesis y examen inicial de bibliotecas es aproximadamente de dos semanas. Sin embargo, la incorporación de robótica y monómeros adicionales podría acelerar significativamente el ritmo al que se identifican nuevos materiales de complejación de ADN y vectores de transfección competentes.
Ejemplo 4
Síntesis semi-automatizada y examen de una biblioteca grande de polímeros catiónicos degradables para administración génica
Una de las principales barreras para el éxito de la terapia génica en la práctica clínica es la falta de métodos seguros y eficaces de administración de ácidos nucleicos. Actualmente, la mayoría de los ensayos clínicos usan virus modificados como vehículos de administración, que, aunque eficaces para transferir ADN a células, se ven afectados por problemas de producción y toxicidad potencialmente graves (Somia y otros, Nat Rev Genet, 1:91 (2000)). Por el contrario, los sistemas no virales ofrecen varias ventajas potenciales, incluyendo facilidad de producción, estabilidad, bajas inmunogenicidad y toxicidad, y limitaciones reducidas del tamaño de los vectores (Ledley Human Gene Therapy 6:1129 (1995)).
Sin embargo, a pesar de estas ventajas, los sistemas de administración no viral existentes son, con mucho, menos eficaces que los vectores virales (Luo y otros, Nature Biotechnology 18:33 (2000)).
Un grupo prometedor de compuestos de administración no virales son los polímeros catiónicos, que espontáneamente se unen a y condensa ADN. Se ha caracterizado una amplia variedad de polímeros catiónicos que transfectan in vitro, tanto sistemas naturales, tales como proteína (Fominaya y otros, Journal of Biological Chemistry 271:10560 (1996)) como sistemas peptídicos (Schwartz y otros, Curr Opin Mol Ther. 2:162 (2000)), y polímeros sintéticos tales como poli(etilenimina) (Boussif y otros, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92:7297 (1995)) y dendrímeros (Kabanov y otros, Self-assembling complexes for gene delivery: from laboratory to clinical trial, Wiley, Chichester; Nueva York, 1998). Avances recientes en la administración génica polimérica se han centrado en parte en hacer los polímeros más biodegradables para reducir la toxicidad. Normalmente, estos polímeros contienen tanto grupos amino que pueden cargarse, para permitir interacciones iónicas con la estructura principal de fosfato cargada negativamente de los ácidos nucleicos, como un enlace biodegradable tal como un enlace éster hidrolizable. Varios ejemplos de los mismos incluyen poli(ácido alfa-(4-aminobutil)-L-glicólico) (Lim y otros, Journal of the American Chemical Society 122:6524 (2000)), poli(amino-éster) en red (Lim y otros, Bioconjugate Chemistry 13:952 (2002)), y poli(beta-amino-ésteres) (Lynn y otros, Journal of the American Chemical Society 122:10761 (2000); Lynn y otros, Journal of the American Chemical Society 123:8155 (2001); cada uno de los cuales se incorpora al presente documento como referencia). Los poli(beta-amino-ésteres) son particularmente interesantes debido a que muestran una baja citotoxicidad y se sintetizan fácilmente por medio de la adición conjugada de una amina primaria o bis(amina secundaria) a un diacrilato (figura 11) (Lynn y otros, Journal of the American Chemical Society 122:10761 (2000); Lynn y otros, Journal of the American Chemical Society 123:8155
(2001)).
El desarrollo tradicional de nuevos polímeros biomédicos ha sido un proceso iterativo. Los polímeros se diseñaron normalmente de uno en uno y luego se sometieron a prueba individualmente para determinar sus propiedades. Más recientemente, la atención se ha centrado en el desarrollo de enfoques en paralelo, combinatorios que faciliten la generación de bibliotecas estructuralmente diversas de biomateriales poliméricos (Brocchini Advanced Drug Delivery Reviews 53:123 (2001)). Este enfoque combinatorio se ha aplicado también al descubrimiento de polímeros de administración génica. Por ejemplo, Murphy y otros, generaron una biblioteca combinatoria seleccionada de 67 peptoides por medio de síntesis en fase sólida y los examinaron para identificar nuevos agentes de administración génica (Murphy y otros, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95:1517
(1998)).
En este ejemplo se describen nuevas herramientas para la síntesis combinatoria en paralelo, de alto rendimiento, y el examen basado en células de una biblioteca grande de 2350 poli(beta-amino-ésteres) estructuralmente diversos. Este enfoque permite el examen de polímeros en ensayos basados en células sin que los polímeros abandonen nunca la fase de disolución tras la síntesis. Este enfoque combinado con el uso de sistemas de manejo de fluidos robotizados permite la generación y las pruebas de miles de polímeros sintéticos en ensayos basados en células en una cantidad de tiempo relativamente corta. Usando este enfoque se han identificado 46 nuevos polímeros que tenían un rendimiento tan bueno o mejor que los sistemas de administración no viral convencionales tales como poli
(etilenimina).
Resultados y discusión
Síntesis de polímeros de alto rendimiento. Los factores principales que limitan el rendimiento y la automatización de la síntesis y las pruebas de poli(beta-amino-ésteres) eran la viscosidad de las disoluciones de monómero y polímero, y la dificultad en la manipulación de los productos de polímero sólidos. Aunque la automatización del manejo de líquidos es sencillo usando robótica convencional, la manipulación de sólidos y líquidos viscosos a pequeña escala no lo es. Por tanto, se desarrolló un sistema en el que los polímeros podían sintetizarse y examinarse en ensayos basados en células sin abandonar la fase de disolución. Puesto que esto requeriría la presencia de disolvente residual en los ensayos celulares, se eligió el disolvente relativamente no tóxico dimetil sulfóxido (DMSO). DMSO es un disolvente usado comúnmente en cultivo celular y se usa rutinariamente en el almacenamiento de disoluciones madre congeladas de células. DMSO es miscible en agua y generalmente se tolera bien en sistemas
vivos.
La primera etapa en la preparación para la síntesis de alto rendimiento era identificar las condiciones que permitirían la producción de polímero presentando aún una viscosidad manejable. Experimentos piloto, a pequeñas escala, mostraron que la polimerización podía realizarse de manera eficaz a 1,6 M en DMSO a 56ºC durante 5 días. Basándose en estos experimentos, se desarrolló una estrategia general para la síntesis y las pruebas de polímero. Todos los monómeros (figura 12) se diluyeron hasta 1,6 M en DMSO, y luego usando tanto un robot de manejo de fluidos como una pipeta de 12 canales, se añadieron 150 microlitros de cada monómero de amina y diacrilato a una placa de pocillos profundos de polipropileno y luego se selló con papel de aluminio. Se colocaron las placas en un agitador orbital y se incubaron a 56ºC durante 5 días. Para compensar el aumento de viscosidad de las disoluciones poliméricas, se añadió 1 ml de DMSO a cada pocillo de la placa, y luego se almacenaron las placas a 4ºC hasta otro uso. Estos métodos permiten 2350 reacciones en un solo día. Además, la producción y el almacenamiento de polímeros en un formato de 96 pocillos permitieron una fácil transición a las pruebas basadas en células de 96 pocillos de la eficiencia de transfección de polímero.
Pruebas de polímeros de alto rendimiento. Una vez sintetizados, se sometieron a prueba todos los polímeros para determinar su capacidad para administrar el plásmido de expresión de luciferasa, pCMVluc, en la línea celular de fibroblastos de riñón de mono COS-7. Debido al gran tamaño de la biblioteca de polímeros, se desarrolló un método de alto rendimiento para el examen basado en células de la eficiencia de transfección. Puesto que los polímeros se almacenaron en placas de 96 pocillos, todas las diluciones de polímero, complejación de ADN y transfecciones celulares se realizaron en paralelo transfiriendo directamente los polímeros de placa a placa usando un robot de manejo de líquidos. Todos los polímeros se sintetizaron usando la misma concentración de monómero de amina, por tanto, la comparación entre polímeros a una razón de monómero de amina:fosfato de ADN (razón N:P) fijada fue sencilla. Aunque los monómeros de amina contienen o bien una, o bien dos, o bien tres aminas por monómero, los exámenes de base amplia iniciales para determinar la eficiencia de transfección se simplificaron enormemente manteniendo una concentración de monómero constante en todos los pocillos de una placa individual y, por tanto, un volumen constante de la disolución de polímero por reacción (véanse los métodos a
continuación).
La eficiencia de una transfección in vitro usando polímeros catiónicos tales como poli(etilenimina) es muy sensible a la razón de polímero con respecto a ADN presente durante la formación de los complejos (Gebhart y otros, Journal of Controlled Release 73:401 (2001)). Se seleccionaron razones de N:P de 10:1, 20:1 y 40:1 para los exámenes iniciales basados en la experiencia previa con estos tipos de polímeros. Usando el presente sistema de alto rendimiento, se examinaron los 2350 polímeros a estas tres razones. Se tabularon los valores de transfección a la mejor condición para cada polímero en un histograma (figura 13). Se compararon estos resultados con tres controles: ADN desnudo (sin agente de transfección), poli(etilenimina) (PEI) y Lipofectamine 2000. Los niveles residuales, bajos, de DMSO presentes en las disoluciones de transfección no afectaron a la eficiencia de transfección de o bien el ADN desnudo o bien la PEI. Se encontró que treinta y tres de los 2350 polímeros eran tan buenos o mejores que PEI en este sistema no optimizado.
Dado que las transfecciones con polímero catiónico tienen a ser sensibles a la razón de polímero:ADN, se decidió optimizar las condiciones de transfección con los mejores polímeros del presente examen preliminar. Usando los resultados anteriores como una guía aproximada, se optimizaron las condiciones de transfección para los mejores 93 polímeros sometiéndolos a prueba a razones de N:P por encima y por debajo de las condiciones de transfección óptimas identificadas en el examen de base amplia. Con el fin de desarrollar un sistema de optimización de alto rendimiento, se sometieron a prueba éstos usando un sistema multiplicador de la razón de N:P para simplificar las pruebas simultáneas y la transferencia de placa a placa. Comenzando con la mejor razón de N:P identificada en el examen preliminar, volvieron a someterse a prueba los polímeros a seis razones de N:P iguales a 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5 y 1,75 veces la mejor razón, por triplicado. Por ejemplo, si la razón óptima identificada en el examen de un polímero dado era de 20:1, entonces ese polímero volvió a someterse a examen por triplicado a razones de N:P de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1 y 35:1. Se muestran las eficiencias de transfección promedio con la desviación estándar a partir de la mejor condición para los mejores 50 polímeros en la figura 14, junto con datos de control. En este experimento, se identificaron 46 polímeros que transfectan tan bien o mejor que PEI. Volvieron a someterse a prueba los 93 polímeros para determinar su capacidad para unirse a ADN usando electroforesis en gel de agarosa (figura 15). De manera interesante, mientras que casi todos los polímeros se unen al ADN tal como se esperaba, dos polímeros que transfectan a altos niveles no lo hicieron: M17 y KK89 (figura 14).
Para examinar adicionalmente las propiedades de transfección de estos polímeros, se sometieron a prueba diez polímeros de alta transfección para determinar su capacidad para administrar el plásmido de proteína fluorescente verde, pCMV-eGFP. A diferencia de pCMV-luc, pCMV-eGFP proporciona información referente a qué porcentajes de células se transfecta. Se observaron altos niveles de transfección para los 10 polímeros, y dos de los mejores se muestran en la figura 16.
Los "resultados positivos" identificados en los ensayos anteriores revelan una colección de polímeros sorprendentemente diversa e inesperada. Particularmente sorprendente es la gran colección de polímeros a base de D-monómeros, hidrófobos. De hecho, los monómeros de diacrilato usados para preparar los 50 polímeros con mejor rendimiento son casi siempre hidrófobos. Un análisis adicional revela dos características más comunes de los polímeros eficaces: 1) doce de los 26 polímeros que son mejores que el mejor reactivo convencional, Lipofectamine 2000, tienen grupos laterales de mono y dialcohol, y 2) también son prevalentes en las estructuras con resultados positivos bis(aminas secundarias) lineales. También era sorprendente la identificación de dos polímeros que transfectan a altos niveles pero no parecen unirse al ADN (KK89 y M17). Ambos son insolubles a pH 5 y pH 7. Su capacidad para facilitar la captación de ADN puede deberse a la permeabilización de la membrana celular.
También es importante la longitud para la función de los polímeros de administración génica (Remy y otros, Advanced Drug Delivery Reviews 30:85 (1998); Schaffer y otros, Biotechnol Bioeng 67:598 (2000)). Usando estos resultados como marco, puede prepararse una gama de longitudes de polímero para cada polímero con resultado positivo variando cuidadosamente las concentraciones relativas de monómero. Las pruebas muestran que (1) como PEI, la longitud del poli(beta-amino-éster) es importante en la competencia de administración génica de estos polímeros, y (2) que los polímeros con resultado positivo identificados en este caso pueden resintetizarse usando métodos convencionales y todavía administrar ADN eficazmente.
Protocolos experimentales
Síntesis de polímeros. Se adquirieron monómeros de Aldrich (Milwaukee. WI), TCI (Portland, OR), Pfaltz & Bauer (Waterbury, CT), Matrix Scientific (Columbia, SC), Acros-Fisher (Pittsburg, PA), Scientific Polymer (Ontario, NY), Polysciences (Warrington, PA) y Dajac monomer-polymer (Feasterville, PA). Se disolvieron éstos en DMSO (Aldrich) hasta una concentración final de 1,6 M. Se añadieron todas las posibles combinaciones por parejas de monómeros de amina y diacrilato en alícuotas de 150 \mul a cada pocillo de placas de pocillos profundos Masterblock de polipropileno de 96 pocillos de 2 ml (Griener America, Longwood, FL). Se sellaron las placas con papel de aluminio y se incubaron a 56ºC mientras se hacían girar en un agitador orbital. Tras 5 días, se añadió 1 ml de DMSO a cada pocillo, y volvieron a sellarse las placas y se congelaron en almacenamiento a 4ºC hasta que estaban listas para
usarse.
Experimentos de transfección. Se sembraron 14.000 células cos-7 (ATCC, Manassas, VA) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos transparente o blanca maciza (Coming-Costar, Kennebunk, ME) y se dejó que se unieran durante la noche en medio de crecimiento, compuesto por: 500 ml de DMEM menos rojo de fenol, 50 ml de FBS inactivado por calor, 5 ml de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se llenó cada pocillo de una placa de 96 pocillos Master block con 1 ml de acetato de sodio 25 mM pH 5. A esto, se añadieron 40 \mul, 20 \mul o 10 \mul de la disolución de polímero/DMSO. Se añadieron 25 \mul del polímero diluido a 25 \mul de ADN de pCMV-luc 60 \mug/ml (Promega, Madison, WI) o pEGFP-N1 (Invitrogen) en una placa de 96 pocillos de la mitad de volumen. Se incubaron éstas durante 10 minutos, y entonces se añadieron 30 \mul de la disolución de polímero-ADN a 200 \mul de Optimem con bicarbonato de sodio (Invitrogen) en placas de poliestireno de 96 pocillos. Se retiró el medio de las células usando una varilla de 12 canales (V & P Scientific, San Diego, CA) tras lo cual se añadieron inmediatamente 150 \mul de la disolución de optimem-polímero-ADN. Se incubaron los complejos con las células durante 1 hora y entonces se retiraron usando la varilla de 12 canales y se sustituyeron por 105 \mul de medio de crecimiento. Se dejaron crecer las células durante tres días a 37ºC, 5% de CO_{2} y entonces se analizaron para determinar la luminiscencia (pCMV-luc) o fluorescencia (pEGFP-N1). Se realizaron experimentos control tal como se describió anteriormente, pero usando poli(etilenimina) M_{w} 25.000 (Aldrich) sustituyendo al polímero sintetizado, y a razones en peso de polímero:ADN de 0,5:1, 0,75:1, 1:1, 1,25:1, 1,5:1 y 2:1. Se realizaron transfecciones con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) tal como describía el vendedor, excepto porque los complejos se retiraron tras 1
hora.
Se analizó la luminiscencia usando kits de ensayo Bright-Glo (Promega). En resumen, se añadieron 100 \mul de disolución Bright-Glo a cada pocillo de la placa de microtitulación que contenía medios y células. Se midió la luminiscencia usando un luminómetro Mithras (Berthold, Oak Ridge, TN). En algunos casos, se usó un filtro de densidad neutra (Chroma, Brattleboro, VT) para impedir la saturación del luminómetro. Se generó una curva patrón para luciferasa mediante la titulación de la enzima luciferasa (Promega) en medios de crecimiento en placas de microtitulación blancas. Se examinó la expresión de eGFP usando un microscopio invertido Aciovert 200 de
Zeiss.
Se realizaron ensayos de unión a ADN mediante electroforesis en gel de agarosa a una razón de N:P de 40:1, tal como se describió previamente (Lynn y otros, Journal of the American Chemical Society 123:8155 (2001)). Todo el manejo de líquidos se realizó usando un robot EDR384S/96S (Labcyte, Union City, CA) o una micropipeta de 12 canales (Thermo Labsistemas, Vantaa, Finlandia) en una cabina de flujo laminar.
Ejemplo de referencia 5
Síntesis de poli(beta-amino-ésteres) optimizados para una administración génica altamente eficaz
Se determinó el efecto del peso molecular, la razón de polímero/ADN y el grupo terminal de la cadena sobre las propiedades de transfección de dos estructuras de poli(\beta-amino-éster) únicas. Estos factores pueden tener un efecto drástico sobre la función de administración génica. Usando métodos de examen de alto rendimiento, se han descubierto poli(\beta-amino-ésteres) que transfectan mejor que PEI y Lipofectamine 2000 (dos de los mejores reactivos de transfección comercialmente disponibles).
Materiales y métodos
Síntesis de polímeros. Se sintetizaron los polímeros Poli-1 y Poli-2 añadiendo diacrilato de 1,4-butanodiol (99+%) y diacrilato de 1,6-hexanodiol (99%), respectivamente, a 1-aminobutanol (98%). Se adquirieron estos monómeros de Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Se generaron doce versiones de cada uno de Poli-1 y Poli-2 variando la razón estequiométrica de amina/diacrilato. Para sintetizar cada uno de los 24 polímeros únicos, se pesaron 400 mg de 1-aminobutanol en un vial de muestra de 8 ml con tapón de rosca revestido de teflón. A continuación, se añadió la cantidad apropiada de diacrilato al vial para proporcionar una razón estequiométrica de entre 1,4 y 0,6. Se puso entonces una pequeña barra agitadora recubierta de teflón en cada vial. Se taparon bien los viales y se colocaron en una placa de agitación magnética de múltiples posiciones situada en un horno mantenido a 100ºC. Tras un tiempo de reacción de 5 h, se retiraron los viales del horno y se almacenaron a 4ºC. Se analizaron todos los polímeros mediante
CPG.
Cromatografía de permeación en gel (CPG). Se realizó la CPG usando una bomba isocrática serie 1100 de Hewlett Packard, un inyector modelo 7125 de Rheodyne con un bucle de inyección de 100 \mul y una columna Phenogel MXL (5\mu mezclado, 300 x 7,5 mm, Phenomenex, Torrance, CA). Se usó un 70% de THF/30% de DMSO (v/v) + piperidina 0,1 M como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Se recogieron datos usando un refractómetro interferométrico Optilab DSP (Wyatt Technology, Santa Bárbara, CA) y se procesaron usando el paquete de software TriSEC CPG (Viscotek Corporation, Houston, TX). Los pesos moleculares y las polidispersidades de los polímeros se determinaron en relación con patrones de poliestireno monodispersados.
Ensayos de transfección de luciferasa. Se sembraron células COS-7 (ATCC, Manassas, VA) (14.000 células/poci-
llo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos blanca opaca (Corning-Costar, Kennebunk, ME) y se dejaron unir durante la noche en medio de crecimiento. El medio de crecimiento estaba compuesto por un 90% de DMEM libre de rojo de fenol, un 10% de suero bovino fetal, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 \mug/ml (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para facilitar el manejo, se prepararon disoluciones madre de polímeros (100 mg/ml) en disolvente DMSO. Una pequeña cantidad residual de DMSO en la mezcla de transfección no afecta a la eficiencia de transfección y no da como resultado ninguna citotoxicidad observable. Se prepararon diluciones de trabajo de cada polímero (a concentraciones necesarias para producir las diferentes razones en peso de polímero/ADN) en tampón acetato de sodio 25 mM (pH 5). Se añadieron 25 \mul del polímero diluido a 25 \mul de ADN de pCMV-Luc 60 \mug/ml (Elim Biopharmaceuticals, South San Francisco, CA) en un pocillo de una placa de 96 pocillos. Se incubaron las mezclas durante 10 minutos para permitir la formación de complejos, y entonces se añadieron 30 \mul de cada una de las disoluciones de polímero-ADN a 200 \mul de Opti-MEM con bicarbonato de sodio (Invitrogen) en placas de poliestireno de 96 pocillos. Se retiró el medio de crecimiento de las células usando una varilla de aspiración de 12 canales (V&P Scientific, San Diego, CA) tras lo cual se añadieron inmediatamente 150 \mul de la disolución de Opti-MEM-polímero-ADN. Se incubaron los complejos con las células durante 1 h y entonces se retiraron usando la varilla de 12 canales y se sustituyeron por 105 \mul de medio de crecimiento. Se dejaron crecer las células durante tres días a 37ºC, CO_{2} al 5% y entonces se analizaron para determinar la expresión de luciferasa. Se realizaron también experimentos control con PEI (M_{w} = 25.000, Sigma-Aldrich) y Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Se realizaron las transfecciones de PEI tal como se describió anteriormente, pero usando razones en peso de polímero:ADN de 1:1. Se realizaron las transfecciones de Lipofectamine 2000 tal como describía el vendedor, excepto porque se retiraron los complejos tras 1 hora.
Se analizó la expresión de luciferasa usando kits de ensayo Bright-Glo (Promega). En resumen, se añadieron 100 \mul de disolución Bright-Glo a cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contenía medios y células. Se midió la luminiscencia usando un luminómetro Mithras (Berthold, Oak Ridge, TN). Se usó un filtro de densidad neutra del 1% (Chroma, Brattleboro, VT) para impedir la saturación del luminómetro. Se generó una curva patrón para luciferasa mediante la titulación de la enzima luciferasa (Promega) en medios de crecimiento en placas de 96 pocillos blancas opacas.
Medición de la citotoxicidad. Se realizaron ensayos de citotoxicidad de la misma manera que los experimentos de transfección de luciferasa con la siguiente excepción. En lugar de someter a ensayo para determinar la expresión de luciferasa tras 3 días, se sometieron a ensayo las células para determinar la actividad metabólica usando el kit de ensayo de proliferación celular MTT (ATCC) tras 1 día. Se añadieron 10 \mul de reactivo MTT a cada pocillo. Tras 2 h de incubación a 37ºC, se añadieron 100 \mul de reactivo de detergente a cada pocillo. Se dejó entonces la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 4 h. Se midió la absorbancia óptica a 570 nm usando un lector de microplacas SpectaMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y se convirtió a % de viabilidad en relación con células control (no tratadas).
Experimentos de captación celular. Se realizaron experimentos de captación tal como se describió previamente, con la excepción de que se usó un formato de placa de 12 pocillos en lugar de un formato de placa de 6 pocillos (Akinc, A. y otros, Parallel synthesis and biophysical characterization of a degradable polymer library of gene delivery. J. Am. Chem. Soc., 2003). Se sembraron células COS-7 a una concentración de 1,5 x 10^{5} células/pocillo y se hicieron crecer durante 24 horas antes de realizar los experimentos de captación. Se realizó la preparación de complejos de polímero/ADN de la misma manera que en los experimentos de transfección de luciferasa, siendo las únicas diferencias un aumento en la escala (2,5 \mug de ADN por pocillo de la placa de 12 pocillos en contraposición a 600 ng de ADN por pocillo de la placa de 96 pocillos) y el uso de plásmido marcado con Cy5 en lugar de pCMV-Luc (Akine, A. y R. Langer, Measuring the pH environment of ADN delivered using nonviral vectors: Implications for lysosomal trafficking. Biotechnol. Bioeng., 2002. 78(5): págs. 503-8). Como en los experimentos de transfección, se incubaron los complejos con las células durante 1 h para permitir la captación celular mediante endocitosis. Se cuantificó el nivel relativo de captación celular usando un citómetro de flujo para medir la fluorescencia de células cargadas con plásmido marcado con Cy5.
Transfecciones de GFP. Se llevaron a cabo transfecciones de GFP en las líneas celulares COS-7 (riñón de mono verde), NIH 3T3 (fibroblasto murino), HepG2 (hepatocarcinoma humano) y CHO (ovario de hámster chino). Se obtuvieron todas las líneas celulares de la ATCC (Manassas, VA) y se mantuvieron en DMEM que contenía un 10% de suero bovino fetal, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 \mug/ml a 37ºC en atmósfera de CO_{2} al 5%. Se sembraron las células en placas de 6 pocillos y se hicieron crecer hasta aproximadamente un 80-90% de confluencia antes de realizar los experimentos de transfección. Se prepararon complejos de polímero/ADN tal como se describió anteriormente usando el plásmido pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA) (5 \mug/pocillo). Se diluyeron los complejos en 1 ml de Opti-MEM y se añadieron a los pocillos durante 1 h. Se retiraron entonces los complejos y se añadió medio de crecimiento nuevo a los pocillos. Tras 2 días, se recogieron las células y se analizaron para determinar la expresión de GFP mediante citometría de flujo. Se usó tinción con yoduro de propidio para excluir las células muertas del
análisis.
Citometría de flujo. Se realizó la citometría de flujo con un instrumento FACSCalibur (Becton Dickinson) equipado con un láser de ion argón que puede excitar GFP (excitación a 488 nm) y un láser de diodo rojo que puede excitar Cy5 (excitación a 635 nm). Se filtró la emisión de GFP usando un filtro de paso de banda de 530 nm y se filtró la emisión de Cy5 usando un filtro de paso largo de 650. Se activaron apropiadamente las células mediante dispersión lateral y directa y se recogieron 30.000 acontecimientos por muestra.
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Resultados y discusión
Síntesis de polímeros. Tal como se describió previamente (Lynn, D.M. y R. Langer, Degradable poly(\beta-amino esters): synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid ADN. J. Am. Chem. Soc., 2000. 122(44): págs. 10761-10768), la síntesis de poli(\beta-amino-ésteres) avanza por medio de la adición conjugada de aminas a grupos acrilato. Debido a que la reacción es una polimerización por etapas, se obtiene una distribución estadística amplia de longitudes de cadena, con el peso molecular promedio y los grupos terminales de la cadena controlados por la estequiometría de los monómeros (Flory, P., en Principles of Polymer Chemistry. 1953, Cornell University Press: Ithaca, NY. págs. 40-46, 318-323; Odian, G., Step Polimerization, en Principles of Polimerization. 1991, John Wiley & Sons, Inc.: Nueva York. págs. 73-89). El peso molecular aumenta a medida que la razón de monómeros se acerca a la equivalencia estequiométrica, y un exceso de monómero de amina o diacrilato da como resultado cadenas terminadas en amina o acrilato, respectivamente. Para esta clase de polímeros, es esencial un control preciso de la estequiometría para controlar el peso molecular del polímero. Aunque la estequiometría de los monómeros es el factor más importante que afecta a la longitud de cadena, deben considerarse también las reacciones laterales de competición que pueden tener un impacto sobre el peso molecular y la estructura de los productos de polímero. En particular, las reacciones de ciclación intramolecular, en las que una amina en un extremo del polímero en crecimiento reacciona en cadena con un acrilato en el otro extremo, pueden limitar los pesos moleculares obtenidos (Odian, G., Step Polimerization, en Principles of Polimerization. 1991, John Wiley & Sons, Inc.: Nueva York. págs. 73-89). Estas cadenas cíclicas pueden tener también propiedades que difieren de las de sus homólogos
lineales.
En este trabajo, se ha modificado el procedimiento de polimerización notificado anteriormente con el fin de controlar mejor la estequiometría de los monómeros y minimizar las reacciones de ciclación. En primer lugar, se aumentó la escala de la síntesis desde aproximadamente 0,5 g hasta 1 g para permitir el control de la estequiometría dentro del 1%. La mejora adicional en la exactitud está limitada por la pureza (98-99%) de los monómeros comercialmente disponibles usados. En segundo lugar, se pesaron todos los monómeros en viales en lugar de dispersarse volumétricamente. Se encontró que las discrepancias entre las densidades de monómeros reales y notificadas no eran insignificantes en algunos casos, conduciendo a inexactitudes en la masa dispensada. En tercer lugar, se realizaron las polimerizaciones en ausencia de disolvente para maximizar la concentración de monómero, favoreciendo así la reacción de adición intermolecular con respecto a la reacción de ciclación intramolecular. La eliminación del disolvente también proporciona los beneficios añadidos de aumentar la velocidad de reacción y obviar la etapa de eliminación del disolvente. Finalmente, puesto que no se usó el disolvente cloruro de metileno empleado previamente, pudo aumentarse la temperatura de reacción desde 45ºC hasta 100ºC. Aumentar la temperatura dio como resultado un aumento de la velocidad de reacción y una disminución en la viscosidad de la mezcla de reacción, ayudando a compensar la viscosidad superior del sistema sin disolvente. El efecto combinado de aumento de la concentración de monómero y temperatura de reacción dio como resultado una disminución en el tiempo de reacción desde aproximadamente 5 días hasta 5
horas.
Se sintetizaron los polímeros Poli-1 y Poli-2 añadiendo diacrilato de 1,4-butanodiol y diacrilato de 1,6-hexanodiol, respectivamente, a 1-aminobutanol. Se sintetizaron doce versiones únicas de cada polímero variando las razones molares de amina/diacrilato entre 0,6 y 1,4.
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35 
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Para ambos conjuntos de polímeros (Poli-1 y Poli-2), 7 de los 12 tenían razones de amina/diacrilato > 1, dando como resultado polímeros terminados en amina, y 5 de los 12 tenían razones de amina/diacrilato < 1, dando como resultado polímeros terminados en acrilato. Tras 5 h de reacción a 100ºC, se obtuvieron polímeros como líquidos viscosos transparentes, ligeramente amarillentos. Los polímeros tenían diferencias observables en la viscosidad, correspondientes a diferencias en el peso molecular. Se analizaron los polímeros mediante cromatografía de permeación en gel de fase orgánica (CPG) empleando un 70% de THF/30% de DMSO (v/v) + piperidina 0,1 M como eluyente. Los pesos moleculares de los polímeros (M_{w}) oscilaban desde 3350 (Poli-1, amina/diacrilato =1,38) hasta 18.000 (Poli-1, amina/diacrilato = 0,95), en relación con patrones de poliestireno (figura 16). Las distribuciones del peso molecular eran monomodales con índices de polidispersidad (PDI) que oscilaban desde 1,55 hasta
2,20.
Resultados de la transfección de luciferasa. Se realizaron experimentos de transfección con los 24 polímeros sintetizados (12 de cada uno de Poli-1 y Poli-2) a 9 razones de polímero/ADN diferentes para determinar el impacto del peso molecular, la razón de polímero/ADN y el grupo terminal de la cadena sobre la eficiencia de transfección (figuras 17 y 18). Como sistema modelo, se usó la línea celular COS-7 y un plásmido que codificada para el gen indicador de luciferasa de luciérnaga (pCMV-Luc) (600 ng/pocillo). Para facilitar la realización de casi 1000 transfecciones (datos obtenidos por cuadriplicado), se realizaron los experimentos en formato de placa de 96 pocillos. Se determinaron los niveles de expresión de proteína indicadora usando un kit de ensayo de luciferasa comercialmente disponible y un lector de placas de luminiscencia de 96 pocillos.
Los datos presentados en las figuras 17 y 18 demuestran que el peso molecular del polímero, la razón de polímero/ADN y el grupo terminal de la cadena tienen un impacto sobre las propiedades de transfección de ambos polímeros Poli-1 y Poli-2. Un resultado sorprendente y un tanto inesperado fue que ninguno de los polímeros terminados en acrilato mediaban niveles apreciables de transfección en ninguna de las condiciones evaluadas. Este resultado puede aplicarse más ampliamente para poli(\beta-amino-ésteres), ya que hay que sintetizar todavía un polímero, usando un exceso de monómero de acrilato, que medie una expresión del gen indicador apreciable a cualquiera de las razones de polímero/ADN que se han empleado. Estos hallazgos sugieren que quizá sólo los poli(\beta-amino-ésteres) terminados en amina son adecuados para su uso como vehículo de administración génica. Por el contrario, había regiones diferenciadas de actividad de transfección en el espacio de M_{w}-polímero/ADN para versiones terminadas en amina tanto de Poli-1 como Poli-2 (figuras 17-A y 18-A). Se lograron niveles máximos de expresión de gen indicador de 60 ng de luc/pocillo y 26 ng de luc/pocillo usando Poli-1, (M_{w} = 13.100) y Poli-2 (M_{w} = 13.400), respectivamente. Estos resultados concuerdan de manera bastante favorable con PEI (polímero/ADN =1:1 p/p), que mediaba un nivel de expresión de 6 ng de luc/pocillo (datos no mostrados) en las mismas condicio-
nes.
Aunque los niveles más altos de transfección se producían usando las versiones de peso molecular superior de ambas estructuras de polímero, las razones de polímero/ADN óptimas para estos polímeros eran marcadamente diferentes (polímero/ADN =150 para Poli-1, polímero/ADN = 30 para Poli-2). Los resultados de transfección que se han obtenido para Poli-1 y Poli-2 destacan la importancia de optimizar el peso molecular del polímero y la razón de polímero/ADN, y la importancia de controlar los grupos terminales de la cadena. Además, el hecho de que dos de tales estructuras de polímero similares, que difieren sólo en dos carbonos en la unidad de repetición, tengan tales parámetros de transfección óptimos diferentes, hace hincapié en la necesidad de realizar estas optimizaciones para cada estructura de polímero única. Para mejorar la comprensión de los resultados de transfección obtenidos, se eligió estudiar dos importantes características de administración que tienen un impacto directo sobre la expresión transgénica, la citotoxicidad y la capacidad para entrar en las células por medio de endocitosis (Wiethoff, C.M, y C.R. Middaugh, Barriers to nonviral gene delivery, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2003. 92(2): págs. 203-
217).
Citotoxicidad. Se evaluaron las citotoxicidades de los diversos complejos de polímero/ADN usando un ensayo de reducción de colorante MTT/azul de tiazolilo convencional. Se realizaron los experimentos exactamente como los experimentos de transfección descritos anteriormente, excepto porque en lugar de someter a ensayo la expresión de gen indicador en el día 3, se realizó el ensayo de MTT tras el día 1 (véase Materiales y métodos). Se suponía inicialmente que la falta de actividad de transfección observada para polímeros terminados en acrilato puede haberse debido a la citotoxicidad de los grupos terminales acrilato. Las figuras 19-B y 20-B indican que las altas concentraciones de acrilato son tóxicas, ya que se observa que la viabilidad disminuye con el aumento de la razón de polímero/ADN y la disminución del M_{w} del polímero (un M_{w} inferior se corresponde con una concentración superior de grupos terminales). Sin embargo, la citotoxicidad de los acrilatos no explica suficientemente la falta de actividad de transfección a razones de polímero/ADN inferiores o pesos moleculares superiores. Los datos mostrados en la figura 19-A demuestran que la citotoxicidad no es un factor limitante para vectores de Poli-1, puesto que las células siguen siendo viables incluso a las razones de polímero/ADN más altas. Por otro lado, los datos presentados en la figura 20-A sugieren que la citotoxicidad es un factor importante que limita la eficiencia de transfección de vectores de Poli-2, especialmente para los polímeros de peso molecular inferior. Este resultado puede explicar por qué la actividad de transfección es inexistente o decreciente para vectores de Poli-2 a polímero/ADN > 30 (véase la figura
18-A).
Captación celular. Se evaluó la capacidad de las células para captar complejos de polímero/ADN usando una técnica basada en citometría de flujo descrita previamente para medir la fluorescencia de ADN administrado mediante vector (Akinc, A. y otros, Parallel synthesis and biophysical characterization of a degradable polymer library of gene delivery. J. Am. Chem. Soc., 2003). En resumen, se prepararon complejos de polímero/ADN usando ADN de plásmido unido covalentemente con el colorante fluorescente Cy5. Para permitir la comparación de los datos de captación celular con los datos de expresión génica resumidos anteriormente, se formaron los complejos a las mismas razones de polímero/ADN y de la misma manera que en los experimentos de transfección. Se incubaron los complejos marcados con células COS-7 durante 1 h a 37ºC para permitir la captación. Se cuantificó entonces el nivel relativo de captación de partículas midiendo la fluorescencia de células cargadas con ADN marcado con Cy5. Los resultados de estos experimentos de captación se resumen en las figuras 21 y 22. Los datos mostrados en la figura 21-B y 22-B sugieren que la falta de actividad de transfección para los polímeros terminados en acrilato no se debe a citotoxicidad, tal como se pensaba inicialmente, sino en su lugar a una incapacidad para entrar en la célula. De manera similar, los complejos de Poli-1 tienen una captación gravemente limitada a todas las razones de polímero/ADN menos a la más alta (figura 21-A). Aunque estos datos no se correlacionan exactamente con los resultados de transfección obtenidos para Poli-1, son consecuentes con el hecho de que no se observa actividad de transfección hasta que se emplean razones de polímero/ADN muy altas. Los complejos de Poli-2 no muestran una captación celular apreciable a razones de polímero/ADN < 30 y muestran niveles de captación crecientes a medida que las razones de polímero/ADN aumentan más allá de 30 (figura 22-A). Este resultado, combinado con los resultados de citotoxicidad anteriores, ayuda a explicar la actividad de transfección de los complejos de Poli-2. A razones de polímero/ADN inferiores a 30, los complejos no entran de manera eficaz en la células, pero a medida que las razones de polímero/ADN aumentan mucho más allá de 30, la citotoxicidad comienza a limitar la eficiencia de transfección, dando como resultado una actividad de transfección óptima cercana a polímero/ADN =
30.
Cuando la endocitosis es la vía principal de entrada celular, la formación eficaz de complejos de polímero/ADN a escala nanométrica es un requisito para lograr altos niveles de captación celular (De Smedt, S. C., J. Demeester, y W. E. Hennink, Cationic polymer based gene delivery Systems. Pharmaceutical Research, 2000. 17(2): págs. 113-126; Prabha, S. y otros, Size-dependency of nanoparticle-mediated gene transfection: studies with fractionated nanoparticles. International Journal of Pharmaceutics, 2002. 244(1-2): págs. 105-115). Los malos niveles de captación observados para muchos de los complejos de polímero/ADN pueden haber sido atribuibles a la formación insatisfactoria de complejos estables, a escala nanométrica. Desfortunadamente, la escasa solubilidad a pH neutro de los polímeros impidió realizar mediciones por dispersión de luz dinámica del tamaño de los complejos usando el medio de transfección (medios Opti-MEM con suero reducido, pH 7,2) como diluyente. Las lecturas obtenidas eran atribuibles a precipitados de polímero, que en algunos casos eran visibles como turbidez en disoluciones de polímero en Opti-MEM. Sin embargo, pudieron medirse los diámetros eficaces de los complejos usando acetato de sodio 25 mM (pH 5) como diluyente de la muestra. Aunque estos datos no pueden arrojar luz sobre el tamaño o la estabilidad de los complejos en el medio de transfección, pueden indicar si los complejos se formaron satisfactoriamente antes de la adición del medio de transfección. Específicamente, se encontró que las versiones de peso molecular inferior (M_{w} < 10.700) de Poli-1 no podían formar complejos a escala nanométrica, incluso en tampón acetato. En todos los demás casos se encontró que se formaban complejos de polímero/ADN de tamaño nanométrico. Aunque estos resultados pueden explicar los malos niveles de captación asociados con versiones de bajo peso molecular de Poli-1, no explican satisfactoriamente la baja actividad de captación de los polímeros terminados en acrilato ni la dependencia de la razón de polímero/ADN de la captación celular. Aunque el tamaño de partícula y la estabilidad son factores importantes que tienen un impacto sobre la captación celular, es probable que otros factores, aún no identificados, deban considerarse también con el fin de proporcionar una explicación más completa de los resultados de captación celular
obtenidos.
Potenciación de la transfección usando un agente co-complejante. Tanto Poli-1 como Poli-2 requieren razones en peso de polímero/ADN relativamente altas para lograr altos niveles de transferencia génica. Una explicación puede ser que, en comparación con otros polímeros usados con frecuencia para compactar ADN (por ejemplo, polilisina (PLL) y PEI), estos polímeros tienen densidades de nitrógeno relativamente bajas. Poli-1 tiene un peso molecular por átomo de nitrógeno (M_{w}/N) de 301, y Poli-2 tiene un M_{w}/N de 329. En comparación, para PLL y PEI, estas cifras son aproximadamente 65 y 43, respectivamente. Podría ser posible reducir la cantidad de Poli-1 o Poli-2 necesaria para lograr altos niveles de transfección incorporando una pequeña cantidad de agente co-complejante. Este enfoque podría ser especialmente beneficioso para vectores de Poli-2, puesto que la citotoxicidad parece ser una limitación importante para estos vectores. Para someter a prueba esta hipótesis, se usaron PLL y PEI como agentes co-complejantes modelo. Se centró la atención en los miembros más prometedores de los conjuntos Poli-1 (terminado en amina, M_{w} = 13.100) y Poli-2 (terminado en amina, M_{w} = 13.400) de polímeros. Los datos presentados en las figuras 23 y 24 indican que podría lograrse una reducción significativa en el polímero, mientras que se mantienen altos niveles de eficiencia de transfección, a través del uso de PLL o PEI como agentes co-complejantes. En algunos casos, se realizó una potenciación significativa de la actividad de transfección. Tal como se esperaba, este enfoque de co-complejación era particularmente beneficioso para vectores de Poli-2. Este trabajo, y el trabajo previo (Wagner, E. y otros, Influenza virus hemagglutinin HA-2 N-terminal fusogenic peptides augment gene transfer by transferrin-polylysine-DNA complexes: toward a synthetic virus-like gene-transfer vehicle. Proc. Natl. Acad, Sci. U. S. A., 1992. 89(17): págs. 7934-8; Fritz, J. D. y otros, Gene transfer into mammalian cells using histone-condensed plasmid DNA. Hum Gene Ther, 1996. 7(12): págs. 1395-404; Pack, D. W., D. Putnam, y R. Langer, Design of imidazole-containing endosomolytic biopolymers for gene delivery. Biotechnol. Bioeng., 2000. 67(2): págs. 217-23; Lim, Y. B. y otros, Self-Assembled Ternary Complex of Cationic Dendrimer, Cucurbituril, and DNA: Noncovalent Strategy in Developing a Gene Delivery Carrier. Bioconjug Chem, 2002. 13(6): págs. 1181-5), demuestra que la combinación de polímeros con características de transferencia génica complementarias puede producir en algunos casos reactivos de administración génica más eficaces.
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Transfecciones de GFP
Para evaluar adicionalmente las propiedades de transfección de los reactivos combinados Poli-1/PLL y Poli-2/PLL, se realizaron experimentos de transfección usando un plásmido indicador que codificaba para la proteína fluorescente verde (pCMV-EGFP). Aunque los sistemas de ensayo de transfección de GFP y luciferasa miden ambos la actividad de transfección, proporcionan diferentes tipos de información. El sistema de luciferasa cuantifica la cantidad total de proteína luciferasa exógena producida por todas las células en un pocillo dado, proporcionando una medición de la actividad de transfección acumulativa. Por el contrario, el sistema de GFP puede usarse para cuantificar el porcentaje de células que se han transfectado, proporcionando una medición célula a célula de la actividad de transfección. Ambos sistemas son útiles y ofrecen información complementaria referente a las propiedades de transfección de un sistema de administración génica dado.
Se realizaron transfecciones de GFP de una manera similar que los experimentos de luciferasa, pero se ampliaron a escala hasta un formato de placa de 6 pocillos (5 \mug de plásmido/pocillo). Se transfectaron células COS-7 usando Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 p/p/p) y Poli-2/PLL (Poli-2:PLL:ADN =15:0,4:1 p/p/p). Se usaron como controles Lipofectamine 2000 (\mul de reactivo: \mug de ADN = 1:1), PEI (PEI:ADN = 1:1 p/p, N/P \sim 8) y ADN desnudo como controles en el experimento. Tras 1 h de incubación con las células, se retiraron los vectores y se añadió medio de crecimiento nuevo. Dos días más tarde, se sometió a ensayo la expresión de GFP usando un citómetro de flujo. Casi todas las células transfectadas con Poli-1/PLL eran positivas para la expresión de GFP (figuras 25 y 26). Los experimentos indicaron que los vectores de Poli-2/PLL eran menos eficaces, dando como resultado aproximadamente un 25% de células positivas. Los controles positivos Lipofectamine 2000 y PEI pudieron mediar también una transfección eficaz de células COS-7 en las condiciones empleadas. Aunque las transfecciones de Lipofectamine 2000 y PEI dieron como resultado casi el mismo porcentaje de células positivas para GFP que Poli-1/PLL, el nivel de fluorescencia de las células positivas para GFP era superior para Poli-1/PLL (fluorescencia media = 6033) que el de tanto Lipofectamine 2000 (fluorescencia media = 5453) como PEI (fluorescencia media = 2882). Multiplicar el porcentaje de células positivas por el nivel de fluorescencia media de células positivas proporciona una medición de la expresión de agregados para la muestra y, en teoría, debe correlacionarse mejor con los resultados de los experimentos de expresión del gen de luciferasa. Cuantificar la expresión de GFP total de esta manera indica que el nivel de expresión más alto se logra mediante Poli-1/PLL, seguido por Lipofectamine 2000 y PEI. Este resultado está de acuerdo en general con los resultados de la expresión de
luciferasa.
Experimentos han mostrado que Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 p/p/p) es un vector altamente eficaz para transfectar células COS-7. Se investigó también la capacidad de este vector para mediar la transfección en otras tres líneas celulares comúnmente usadas (CHO, NIH 3T3 y HepG2). Es muy probable que cada una de estas líneas celulares tenga condiciones de transfección óptimas que difieren de las usadas para transfectar células COS-7; sin embargo, como evaluación preliminar de la capacidad para transfectar múltiples líneas celulares, se realizaron las transfecciones de la misma manera y en las mismas condiciones que las transfecciones de COS-7. Los resultados indican que Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 p/p/p) puede transfectar satisfactoriamente células CHO, NIH 3T3 y HepG2, aunque no tan eficazmente como células COS-7 (figura 27). Esto no es demasiado sorprendente puesto que el vector usado se optimizó examinando la transferencia génica en células COS-7. Se esperaría que la optimización de la composición de vectores y las condiciones de transfección específicas para cada tipo de célula diese como resultado niveles de transfecciones incluso superiores.
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Sumario
En este trabajo, se ha investigado el papel del peso molecular del polímero, el grupo terminal de la cadena de polímero y la razón de polímero/ADN sobre varias propiedades de transferencia génica importantes. Se encontró que los tres factores tienen un impacto significativo sobre la transferencia génica, destacando el beneficio de controlar y optimizar cuidadosamente estos parámetros. Además, la incorporación de una pequeña cantidad de PLL, usada como ayuda en la complejación, potencia adicionalmente la transferencia génica. A través de estos enfoques, pueden preparase vectores a base de poli(beta-amino-ésteres) degradables que rivalizan con algunos de los mejores vectores no virales disponibles para la transferencia génica in vivo.
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Ejemplo 6
Estudios adicionales de los poli(beta-amino-ésteres) seleccionados
Para sintetizar y caracterizar adicionalmente algunos de los poli(beta-amino-ésteres) identificados en exámenes previos, volvieron a sintetizarse veintiún polímeros a diversas razones de monómero de amina con respecto a monómero de acrilato. Se caracterizaron los polímeros resultantes mediante cromatografía de permeación en gel para determinar el peso molecular y la polidispersidad de cada polímero. Se sometió a prueba entonces cada uno de los polímeros para determinar su capacidad para transfectar células.
Dentro del experimento 6, las referencias a los polímeros C36, F28, C32, U85, JJ32, JJ36, JJ28, U32, U28, E28, LL8, U36, E32, C80, E80, JJ80 y U80 se proporcionan para comparación.
Síntesis de polímeros. Se sintetizaron los polímeros tal como se describió en el ejemplo 5. Se crearon varias versiones de cada polímero variando la razón estequiométrica de amina/diacrilato. Por ejemplo, C36-1 corresponde a la razón estequiométrica de 1,4, y C36-12 a 0,6, facilitándose todos los valores intermedios en la tabla a
continuación:
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36
37 
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Normalmente, se prepararon los polímeros en viales de vidrio sin disolvente a 100ºC durante 5 horas. En algunas síntesis, la polimerización a 100ºC proporcionó polímeros altamente reticulados cuando se usaron ciertos monómeros tales como amina 94; por tanto, se repitieron las reacciones de polimerización a 50ºC con 2 ml de DMSO añadidos para evitar la reticulación.
Se analizaron los polímeros resultantes mediante CPG tal como se describió en el ejemplo 5. Los pesos moleculares y las polidispersidades de cada uno de los polímeros se muestran en la tabla a continuación:
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38
39
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46 
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Ensayo de transfección de luciferasa. Tal como se describe en el ejemplo 5, se transfectaron células COS-7 con ADN de pCMV-Luc usando cada uno de los polímeros a razones de polímero con respecto a ADN que oscilaban desde 10:1 hasta 100:1 (peso:peso). Se analizó la expresión de luciferasa usando kits de ensayo Bright-Glo (Promega). Se medió la luminiscencia para cada transfección, y se usó la luminiscencia para calcular los nanogramos de enzima luciferasa tal como se describe en el ejemplo 5. Se realizaron los experimentos por cuadruplicado, y los valores mostrados en las tablas a continuación son los valores promediados de los cuatro experimentos. Estos datos se muestran a continuación para cada polímero sintetizado.
47 
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48 
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50
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La siguiente tabla muestra la síntesis de los polímeros enumerados a la derecha usando razones de monómero de amina con respecto a monómero de acrilato que oscilan desde 1,4 hasta 0,6 tal como se describió anteriormente. Cada síntesis del polímero se sometió a prueba entonces para determinar la transfección de luciferasa usando seis razones de polímero con respecto a ADN diferentes (cada experimento se realizó por cuadruplicado). Los datos de la tabla representan la actividad de luciferasa con la mejor razón de polímero con respecto a ADN.
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81

Claims (80)

1. Un poli(beta-amino-éster) preparado a partir de un bis(éster de acrilato) y una amina, en el que la amina se selecciona del grupo que consiste en las fórmulas 6-94:
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82 
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83 
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y sus derivados y sales.
2. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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84 
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3. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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85 
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4. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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86 
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5. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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87 
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6. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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88
7. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
89
8. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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90 
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9. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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91 
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10. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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92 
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11. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, en el que el acrilato es de fórmula A-PP:
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93
12. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, en el que el bis(éster de acrilato) es de fórmula:
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94 
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13. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, en el que el bis(éster de acrilato) es de fórmula:
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95 
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14. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, en el que el bis(éster de acrilato) es de fórmula:
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96 
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15. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, en el que el bis(éster de acrilato) es de fórmula:
97
16. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, en el que el poli(beta-amino-éster) se selecciona del grupo que consiste en: C86, D60, D61, U94, LL6, C94, F94, JJ94, JJ86, C86, U86, E86, B17, D70, U87, D87, C94, D86, F86, AA94, AA60, A61, D94, U94, E94, B17, M17 y AA61.
17. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, de fórmula:
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98 
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en el que n es un número entero entre 3 y 10.000; y sus derivados y sales.
18. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, de fórmula:
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99 
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en el que n es un número entero entre 3 y 10.000; y sus derivados y sales.
19. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 11, de fórmula:
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100 
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en el que n es un número entero entre 3 y 10.000; y sus derivados y sales.
20. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, de fórmula:
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101 
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preparado por adición conjugada de una amina primaria
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102 
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a un bis(éster de acrilato)
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103
en el que la amina primaria es de fórmula:
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104 
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en donde:
R_{1} se proporciona mediante las aminas primarias 6, 7, 16, 17, 18, 37, 38, 39, 41, 47, 51, 72, 73, 74, 76, 77, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92 ó 94;
B es una cadena de átomos de carbono o heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y ureido;
n es un número entero que corresponde a un polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta 20.000 g/mol y derivados y sales del mismo.
21. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 20, en el que la amina es de fórmula:
105
22. El poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1, de fórmula
106
preparado por adición conjugada de una bis(amina secundaria)
107
a un bis(éster de acrilato)
108
en el que la bis(amina secundaria) es de fórmula:
109
110
en donde:
R_{1}, R_{2} y A se proporcionan mediante la bis(amina secundaria) 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 ó 71;
cuando la bis(amina secundaria) es 70 ó 71, R_{1} y R_{2} están unidos formando una estructura cíclica con A;
B es una cadena de átomos de carbono o heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y ureido;
n es un número entero que corresponde a un polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta 20.000 g/mol y derivados y sales del mismo.
23. El poli(beta-amino-éster) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que el polímero está terminado en amina.
24. El poli(beta-amino-éster) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que el polímero está terminado en acrilato.
25. Una composición que comprende:
un poli(beta-amino-éster) según la reivindicación 1,
un polinucleótido, y
un agente co-complejante seleccionado del grupo que consiste en polímeros catiónicos, proteínas catiónicas, PLGA, espermina, espermidina, poliaminas, polietilenimina (PEI) y polilisina (PLL).
26. La composición según la reivindicación 25, en la que la razón de agente co-complejante con respecto a polinucleótido oscila desde 0,1 hasta 1,2 (p/p/p).
27. La composición según la reivindicación 25, en la que la razón de poli(beta-amino-éster) con respecto a polinucleótido oscila desde 10 hasta 120.
28. Un método de síntesis de un poli(\beta-amino-éster) según la reivindicación 1, comprendiendo el método las etapas de:
proporcionar una amina primaria o bis(amina secundaria) seleccionada del grupo que consiste en las fórmulas 6, 7, 16-18, 37-39, 41, 47, 51, 60-74, 76, 77, 83, 84, 86-89, 92 y 94 según la reivindicación 1;
proporcionar un bis(éster de acrilato); y
hacer reaccionar la amina y el bis(éster de acrilato) en condiciones adecuadas para formar el poli(\beta-amino-éster).
29. El método según la reivindicación 28, en el que la amina es de fórmula:
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111 
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30. El método según la reivindicación 28, que comprende además la etapa de examinar el polímero para determinar una característica deseada, en el que el poli(\beta-amino-éster) no se precipita, purifica ni aísla antes de la etapa de examinar.
31. El método según la reivindicación 28, en el que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina y el bis(éster de acrilato) en un disolvente orgánico.
32. El método según la reivindicación 28, en el que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina y el bis(éster de acrilato) en ausencia de un disolvente.
33. El método según la reivindicación 28, en el que el disolvente orgánico se selecciona del grupo que consiste en THF, dietil éter, glima, hexanos, metanol, etanol, isopropanol, cloruro de metileno, cloroformo, tetracloruro de carbono, dimetilformamida, acetonitrilo, benceno, DMSO y tolueno.
34. El método según la reivindicación 28, en el que el disolvente orgánico es DMSO.
35. El método según la reivindicación 28, en el que la concentración de la amina es de entre aproximadamente 0,01 M y 5 M.
36. El método según la reivindicación 28, en el que la concentración de la amina es de entre aproximadamente 0,1 M y 2 M.
37. El método según la reivindicación 28, en el que la concentración de la amina es de entre aproximadamente 1 M y 2 M.
38. El método según la reivindicación 28, en el que la concentración del bis(éster de acrilato) es de entre aproximadamente 0,01 M y 5 M.
39. El método según la reivindicación 28, en el que la concentración del bis(éster de acrilato) es de entre aproximadamente 0,1 M y 2 M.
40. El método según la reivindicación 28, en el que la concentración del bis(éster de acrilato) es de entre aproximadamente 1 M y 2 M.
41. El método según la reivindicación 28, en el que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina y el bis(éster de acrilato) a una temperatura de entre 0 y 75ºC.
42. El método según la reivindicación 28, en el que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina y el bis(éster de acrilato) a una temperatura de entre 20 y 50ºC.
43. El método según la reivindicación 28, en el que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina y el bis(éster de acrilato) a una temperatura de entre 30 y 60ºC.
44. Un método de encapsulación de un agente en una matriz de poli(\beta-amino-ésteres) para formar micropartículas, comprendiendo el método las etapas de:
proporcionar un agente;
proporcionar un poli(\beta-amino-éster) según la reivindicación 1; y
poner en contacto el agente y el poli(\beta-amino-éster) en condiciones adecuadas para formar micropartículas.
45. El método según la reivindicación 44, en el que el agente es un polinucleótido.
46. El método según la reivindicación 45, en el que el polinucleótido es ADN.
47. El método según la reivindicación 45, en el que el polinucleótido es ARN.
48. El método según la reivindicación 44, en el que el agente es una molécula pequeña.
49. El método según la reivindicación 44, en el que el agente es una proteína.
50. El método según la reivindicación 44, en el que la etapa de poner en contacto comprende secar por pulverización una mezcla del agente y el poli(\beta-amino-éster).
51. El método según la reivindicación 44, en el que la etapa de poner en contacto comprende técnicas doble emulsión - evaporación del disolvente.
52. El método según la reivindicación 44, en el que la etapa de poner en contacto comprende una técnica de inversión de fases.
53. Un método de examinar una biblioteca de polímeros, comprendiendo el método las etapas de:
proporcionar una pluralidad de polímeros, siendo los polímeros poli(beta-amino-ésteres) según la reivindicación 1; y
examinar los polímeros para determinar una propiedad deseada útil en terapia génica.
54. El método según la reivindicación 53, en el que la etapa de proporcionar comprende sintetizar los polímeros en paralelo.
55. El método según la reivindicación 54, en el que la etapa de sintetizar comprende sintetizar los polímeros en DMSO.
56. El método según la reivindicación 54, en el que la etapa de sintetizar no incluye precipitar, purificar ni aislar el polímero antes de la etapa de examinar.
57. El método según la reivindicación 53, en el que la pluralidad de poli(beta-amino-ésteres) comprende al menos 500 poli(beta-amino-ésteres).
58. El método según la reivindicación 53, en el que la pluralidad de poli(beta-amino-ésteres) comprende al menos 1000 poli(beta-amino-ésteres).
59. El método según la reivindicación 53, en el que la pluralidad de poli(beta-amino-ésteres) comprende al menos 1500 poli(beta-amino-ésteres).
60. El método según la reivindicación 53, en el que la pluralidad de poli(beta-amino-ésteres) comprende al menos 2000 poli(beta-amino-ésteres).
61. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es una capacidad para unirse a un polinucleótido.
62. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es solubilidad en una disolución acuosa.
63. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es solubilidad en una disolución acuosa a un pH inferior a 7.
64. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es solubilidad en una disolución acuosa a pH 5 y no ser soluble en una disolución acuosa a pH 7.
65. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es la capacidad para unirse a heparina.
66. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es la capacidad para aumentar la eficiencia de transfección.
67. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es útil en la ingeniería de tejidos.
68. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es la capacidad para ayudar al crecimiento celular.
69. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es la capacidad para ayudar a la unión celular.
70. El método según la reivindicación 53, en el que la propiedad deseada es la capacidad para ayudar al crecimiento tisular.
71. Un método de examinar una colección de poli(beta-amino-ésteres), comprendiendo el método las etapas de:
proporcionar una pluralidad de poli(beta-amino-ésteres) según la reivindicación 1;
proporcionar un polinucleótido que incluye un gen indicador;
proporcionar células;
poner en contacto cada uno de los polímeros con el polinucleótido dando como resultado una mezcla de polinucleótido:polímero;
poner en contacto las células con la mezcla de polinucleótido:polímero; y
determinar si las células expresan el gen indicador.
72. El método según la reivindicación 71, en el que la etapa de proporcionar una pluralidad de polímeros comprende sintetizar los polímeros en paralelo.
73. El método según la reivindicación 71, en el que la pluralidad de polímeros comprende al menos 500 polímeros diferentes.
74. El método según la reivindicación 71, en el que la pluralidad de polímeros comprende al menos 1000 polímeros diferentes.
75. El método según la reivindicación 71, en el que el gen indicador codifica para la proteína fluorescente verde.
76. El método según la reivindicación 71, en el que las células son células de mamífero.
77. El método según la reivindicación 71, en el que las células son células bacterianas.
78. El método según la reivindicación 71, en el que las células son células COS-7.
79. El método según la reivindicación 71, en el que la razón de polímero con respecto a polinucleótido es de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1 y 200:1.
80. El método según la reivindicación 71, en el que la etapa de determinar comprende cuantificar la cantidad de expresión del gen indicador.
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