ES2350055T3 - Poli(beta-amino-ésteres) biodegradables y usos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un poli(beta-amino-éster) preparado a partir de un bis(éster de acrilato) y una amina, en el que la amina se selecciona del grupo que consiste en las fórmulas 6-94: **(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)** y sus derivados y sales.
Description
Poli(\beta-amino-ésteres)
biodegradables y usos de los mismos.
El trabajo descrito en el presente documento fue
apoyado, en parte, por subvenciones de la National Science
Foundation (acuerdo cooperativo nº ECC9843342 con el MIT
Biotechnology Process Engineering Center), los National Institutes
of Health (GM26698; NRSA beca de investigación nº 1 F32
GM20227-01), y el Department of the Army (acuerdo
cooperativo nº DAMD
17-99-2-9-001
con el Center for Innovative Minimally Invasive Therapy). El
gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en la
invención.
El tratamiento de enfermedades humanas a través
de la aplicación de fármacos a base de nucleótidos tales como ADN y
ARN tiene el potencial para revolucionar el campo médico (Anderson
Nature 392 (supl.):25-30, 1996; Friedman Nature
Med. 2:144-147, 1996; Crystal Science
270:404-410, 1995; Mulligan Science
260:926-932, 1993). Hasta ahora, el uso de virus
modificados como vectores de transferencia génica ha representado
generalmente el enfoque clínicamente más satisfactorio para la
terapia génica. Aunque los vectores virales son actualmente los
agentes de transferencia génica más eficaces, problemas referentes
a la seguridad global de los vectores virales, que incluyen el
potencial para respuestas inmunitarias no buscadas, han dado como
resultado esfuerzos paralelos para desarrollar alternativas no
virales (para referencias destacadas, véase: Luo y otros, Nat.
Biotechnol. 18:33-37, 2000; Behr Acc. Chem. Res.
26:274-278, 1993).
Las alternativas actuales a los vectores virales
incluyen sistemas de administración poliméricos (Zauner y otros,
Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov y
otros, Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995),
formulaciones liposómicas (Miller Angew. Chem. Int. Ed.
37:1768-1785, 1998; Hope y otros, Molecular Membrane
Technology 15:1-14, 1998; Deshmukh y otros, New J.
Chem. 21:113-124, 1997), y protocolos de inyección
de ADN "desnudo" (Sanford Trends Biotechnol.
6:288-302, 1988).
Aunque estas estrategias tienen que conseguir
aún la eficacia clínica de los vectores virales, la seguridad
potencial, el procesamiento y los beneficios económicos ofrecidos
por estos métodos (Anderson Nature 392
(supl.):25-30, 1996) han avivado el interés en el
desarrollo continuado de enfoques no virales para la terapia génica
(Boussif y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:7297-7301, 1995; Putnam y otros, Macromolecules
32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J Am. Chem. Soc.
121: 5633-5639, 1999; Gonzalez y otros, Bioconjugate
Chem. 10:1068-1074, 1999;
Kukowska-Latallo y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:4897-4902, 1996; Tang y otros, Bioconjugate Chem.
7:703-714, 1996; Haensler y otros, Bioconjugate
Chem. 4:372-379, 1993).
Se han usado ampliamente polímeros catiónicos
como vectores de transfección debido a la facilidad con la que
condensan y protegen hebras de ADN cargadas negativamente. Los
polímeros que contienen amina tales como poli(lisina)
(Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113,
1998; Kabanov y otros, Bioconjugate Chem. 6.-7-20,
1995), poli(etilenimina) (PEI) (Boussif y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 92:7297-7301, 1995) y dendrímeros de
poli(amidoamina) (Kukowska-Latallo y otros,
Proc. Natl. Acad Sci. USA 93: 4897-4902, 1996; Tang
y otros, Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996;
Haensler y otros, Bioconjugate Chem. 4:372-379,
1993) están cargados positivamente a pH fisiológico, forman pares
iónicos con ácidos nucleicos y median la transfección en una
variedad de líneas celulares. Sin embargo, a pesar de su uso común,
los polímeros catiónicos tales como poli(lisina) y PEI pueden
ser significativamente citotóxicos (Zauner y otros, Adv. Drug Del.
Rev. 30:97-113, 1998; Deshmukh y otros, New J.
Chem. 21;113-124, 1997; Choksakulnimitr y otros,
Controlled Release 34:233-241, 1995; Brazeau y
otros, Pharm. Res. 15:680-684, 1998). Como
resultado, la elección de un polímero catiónico para una aplicación
de transferencia génica requiere generalmente un equilibrio entre
eficiencia de transfección y citotoxicidad a corto y largo plazo.
Adicionalmente, la biocompatibilidad a largo plazo de estos
polímeros sigue siendo una cuestión importante para su uso en
aplicaciones terapéuticas in vivo, puesto que varios de estos
polímeros no son fácilmente biodegradables (Uhrich Trends Polim.
Sci. 5:388-393, 1997; Roberts y otros, J. Biomed.
Mater. Res. 30:53-65, 1996).
Con el fin de desarrollar alternativas seguras a
los vectores poliméricos existentes y otros biomateriales
funcionalizados, se han desarrollado poliésteres degradables que
portan cadenas laterales catiónicas (Putnam y otros, Macromolecules
32:3658-3662, 1999; Barrera y otros, J. Am. Chem.
Soc. 115:11010-11011, 1993; Kwon y otros,
Macromolecules 22:3250-3255, 1989; Lim y otros, J.
Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Zhou y otros,
Macromolecules 23:3399-3406, 1990). Los ejemplos de
estos polímeros incluyen
poli(L-lactida-co-L-lisina)
(Barrera y otros, J. Am. Chem. Soc.
115:11010-11011, 1993), poli(éster de serina) (Zhou
y otros, Macromolecules 23:3399-3406, 1990),
poli(éster de
4-hidroxi-L-prolina)
(Putnam y otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999;
Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999)
y, más recientemente, poli[ácido
\alpha-(4-aminobutil)-L-glicólico].
Recientemente se demostró que el poli(éster de
4-hidroxi-L-prolina)
y el poli[ácido
\alpha-(4-aminobutil)-L-glicólico]
condensaban el ADN de plásmido a través de interacciones
electrostáticas, y que mediaban la transferencia génica (Putnam y
otros, Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y
otros, J. Am. Chem. Soc. 121:S633-5639, 1999). De
manera importante, estos nuevos polímeros son significativamente
menos tóxicos que la poli(lisina) y PEI, y se degradan dando
metabolitos no tóxicos. Queda claro a partir de estas
investigaciones que el diseño racional de poliésteres que contienen
amina puede ser una vía productiva para el desarrollo de vectores de
transfección eficaces y seguros. Sin embargo, desafortunadamente,
las presentes síntesis de estos polímeros requieren o bien la
preparación independiente de monómeros especializados (Barrera y
otros, J, Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993), o
bien el uso de cantidades estequiométricas de agentes de
acoplamiento caros (Putnam y otros, Macromolecules
32:3658-3662, 1999). Adicionalmente, las
funcionalidades amina en los monómeros deben protegerse antes de la
polimerización (Putnam y otros, Macromolecules
32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc.
121;5633-5639, 1999; Gonzalez y otros, Bioconjugate
Chem. 10:1068-1074, 1999; Barrera y otros, J. Am.
Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993; Kwon y otros,
Macromolecules 22:3250-3255, 1989), necesitándose
etapas de desprotección tras la polimerización adicionales antes de
que los polímeros puedan usarse como agentes de transfección.
Existe una necesidad continua de polímeros no
tóxicos, biodegradables, biocompatibles que puedan usarse para
transfectar ácidos nucleicos y que se preparen fácilmente de manera
económica y eficaz. Tales polímeros tendrían varios usos,
incluyendo la administración de ácidos nucleicos en la terapia
génica así como en el empaquetamiento y/o administración de agentes
de diagnóstico, terapéuticos y profilácticos.
La presente invención es tal como se define en
las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención proporciona polímeros
útiles en la preparación de dispositivos de administración de
fármacos y composiciones farmacéuticas de los mismos. La invención
también proporciona métodos de preparación de los polímeros y
métodos de preparación de microesferas y otras composiciones
farmacéuticas que contienen los polímeros de la invención.
Los polímeros de la presente invención son
poli(\beta-amino-ésteres) y sales y
derivados de los mismos. Los polímeros preferidos son
biodegradables y biocompatibles. Normalmente, los polímeros tienen
una o más aminas terciarias en la estructura principal del
polímero. Los polímeros preferidos tienen una o dos aminas
terciarias por unidad de repetición de la estructura principal. Los
polímeros también pueden ser copolímeros en los que uno de los
componentes es un poli(\beta-amino-éster).
Los polímeros de la invención pueden prepararse fácilmente
condensando bis(aminas secundarias) o aminas primarias con
bis(ésteres de acrilato).
Un polímero de la presente invención se prepara
a partir de un bis(éster de acrilato) y una amina, seleccionándose
la amina del grupo que consiste en las fórmulas
6-94:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Un polímero de la presente invención puede
representarse mediante la fórmula a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
preparado por adición conjugada de
una amina
primaria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a un bis(éster de
acrilato)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en el que la amina primaria es de
fórmula:
en
donde:
R_{1} se proporciona mediante las aminas
primarias 6, 7, 16, 17, 18, 37, 38, 39, 41, 47, 51, 72, 73, 74, 76,
77, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92 ó 94;
B es una cadena de átomos de carbono o
heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida
en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo,
alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino,
hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo
heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido
carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y
ureido;
n es un número entero que corresponde a un
polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta
20.000 g/mol.
Un polímero de la presente invención también
puede representarse mediante la fórmula a continuación:
preparado por adición conjugada de
una bis(amina
secundaria)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a un bis(éster de
acrilato)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
siendo la bis(amina
secundaria) de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde:
R_{1}, R_{2} y A se proporcionan mediante la
bis(amina secundaria) 60, 61, 62, 963, 64, 65, 66, 67, 68,
69, 70 ó 71;
cuando la bis(amina secundaria) es 70 ó
71, R_{1} y R_{2} están unidos formando una estructura cíclica
con A;
B es una cadena de átomos de carbono o
heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida
en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo,
alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino,
hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo
heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido
carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y
ureido;
n es un número entero que corresponde a un
polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta
20.000 g/mol.
En ciertas realizaciones, los polímeros están
terminados en amina; y en otras realizaciones, los polímeros están
terminados en acrilato. En una realización particularmente
preferida, los grupos R_{1} y/o R_{2} forman estructuras
cíclicas con el conector A (véase la sección de Descripción
detallada a continuación). Los polímeros que contienen tales restos
cíclicos tienen la característica de ser más solubles a pH inferior.
Polímeros específicamente preferidos son aquéllos que son
insolubles en disoluciones acuosas a pH fisiológico (pH
7,2-7,4) y son solubles en disoluciones acuosas por
debajo del pH fisiológico (pH < 7,2). Otros polímeros preferidos
son aquéllos que son solubles en disolución acuosa a pH fisiológico
(pH 7,2-7,4) y por debajo. Los polímeros preferidos
son útiles en la transfección de polinucleótidos al interior de
células.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un método de preparación de los polímeros de la
invención. Se someten monómeros, bis(aminas secundarias),
aminas primarias y bis(ésteres de acrilato) comercialmente
disponibles o fácilmente disponibles a condiciones que conducen a la
adición conjugada de la amina al bis(éster de acrilato). En una
realización particularmente preferida, cada uno de los monómeros se
disuelve en un disolvente orgánico (por ejemplo, DMSO, DMF, THF,
dietil éter, cloruro de metileno, hexanos, etc.), y las disoluciones
resultantes se combinan y se calientan durante un tiempo suficiente
como para conducir a la polimerización de los monómeros. En otras
realizaciones, la polimerización se lleva a cabo en ausencia de
disolvente. El polímero resultante puede purificarse entonces y
caracterizarse opcionalmente usando técnicas conocidas en la
técnica.
Aún en otro aspecto de la invención, los
polímeros se usan para formar complejos a escala nanométrica con
ácidos nucleicos. Los complejos de polinucleótido/polímero pueden
formarse añadiendo una disolución de polinucleótido a una
disolución con agitación con vórtex del polímero a una concentración
de ADN/polímero deseada. La razón de peso con respecto a peso del
polinucleótido con respecto al polímero puede oscilar de desde 1:0,1
hasta 1:200, preferiblemente desde 1:10 hasta 1:150, más
preferiblemente desde 1:50 hasta 1:150. La razón de monómero de
amina con respecto a fosfato de polinucleótido puede ser de
aproximadamente 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1,
50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1,
110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1 y
200:1. Los polímeros catiónicos condensan el polinucleótido en
partículas solubles normalmente de 50-500 nm de
tamaño. Estos complejos de polinucleótido/polímero pueden usarse en
la administración de polinucleótidos a células. En una realización
particularmente preferida, estos complejos se combinan con
excipientes farmacéuticos formando composiciones farmacéuticas
adecuadas para su administración a animales incluyendo seres
humanos. En ciertas realizaciones, se usa un polímero con una alta
razón de peso molecular con respeto a átomo de nitrógeno (por
ejemplo, polilisina, polietilenimina) para aumentar la eficiencia
de transfección.
En otro aspecto de la invención, los polímeros
se usan para encapsular agentes terapéuticos, de diagnóstico y/o
profilácticos incluyendo polinucleótidos para formar
micropartículas. Normalmente estas micropartículas son un orden de
magnitud mayores que los complejos de polinucleótido/polímero. Las
micropartículas oscilan desde 1 micra hasta 500 micras. En una
realización particularmente preferida, estas micropartículas
permiten la administración de polinucleótidos, péptidos, proteínas
y/o moléculas pequeñas lábiles a un individuo. Las micropartículas
pueden prepararse usando cualquiera de las técnicas conocidas en la
técnica para preparar micropartículas, tales como, por ejemplo,
doble emulsión, inversión de fases y secado por pulverización. En
una realización particularmente preferida, las micropartículas
pueden usarse para una administración desencadenada por pH del
contenido encapsulado debido a la naturaleza sensible al pH de los
polímeros (es decir, ser más solubles a pH inferior).
Aún en otro aspecto, la invención proporciona un
sistema para sintetizar y examinar una colección de polímeros. En
ciertas realizaciones, el sistema aprovecha técnicas conocidas en la
técnica de robótica y manejo de líquidos automatizado. El sistema
de síntesis y examen puede usarse con
poli(beta-amino-ésteres) así como otros tipos
de polímeros incluyendo poliamidas, poliésteres, poliéteres,
policarbamatos, policarbonatos, poliureas, poliaminas, etc. La
colección de polímeros puede ser una colección de todos un tipo de
polímero (por ejemplo, todos
poli(beta-amino-ésteres)) o puede ser una
colección diversa de polímeros. Pueden sintetizarse y examinarse
miles de polímeros en paralelo usando el sistema de la invención.
En ciertas realizaciones, los polímeros se examinan para determinar
propiedades útiles en el campo de la administración génica,
transfección o terapia génica. Algunas de estas propiedades
incluyen solubilidad a diversos pH, capacidad para complejar
polinucleótidos, capacidad para transfectar un polinucleótido al
interior de una célula, etc. Ciertos
poli(beta-amino-ésteres) que se encuentra que
son útiles en la transfección de células incluyen M17, KK89, LL6 y
D94 tal como se describe en los ejemplos 4 y 5.
Los siguientes son términos químicos usados en
la memoria descriptiva y las reivindicaciones:
El término acilo tal como se usa en el presente
documento se refiere a un grupo que tiene la fórmula general
-C(=O)R, en la que R es alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo,
grupo carbocíclico, grupo heterocíclico o grupo heterocíclico
aromático. Un ejemplo de un grupo acilo es acetilo.
El término alquilo tal como se usa en el
presente documento se refiere a radicales hidrocarbonados saturados,
de cadena lineal o ramificada derivados de un resto hidrocarbonado
que contiene entre uno y veinte átomos de carbono mediante
eliminación de un único átomo de hidrógeno. En algunas
realizaciones, el grupo alquilo empleado en la invención contiene
1-10 átomos de carbono. En otra realización, el
grupo alquilo empleado contiene 1-8 átomos de
carbono. Todavía en otras realizaciones, el grupo alquilo contiene
1-6 átomos de carbono, aún en otras realizaciones,
el grupo alquilo contiene 1-4 carbonos. Los ejemplos
de radicales alquilo incluyen, pero no se limitan a, metilo, etilo,
n-propilo, isopropilo, n-butilo,
iso-butilo, sec-butilo,
sec-pentilo, iso-pentilo,
terc-butilo, n-pentilo, neopentilo,
n-hexilo, sec-hexilo,
n-heptilo, n-octilo,
n-decilo, n-undecilo, dodecilo y
similares, que pueden portar uno o más
sustituyentes.
sustituyentes.
El término alcoxilo tal como se usa en el
presente documento se refiere a un grupo saturado (es decir,
alquil-O-) o insaturado (es decir,
alquenil-O- y alquinil-O-) unido al
resto molecular original a través de un átomo de oxígeno. En
ciertas realizaciones, el grupo alquilo contiene
1-20 átomos de carbono alifáticos. En otras ciertas
realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo empleados
en la invención contienen 1-8 átomos de carbono
alifáticos. Todavía en otras realizaciones, el grupo alquilo
contiene 1-6 átomos de carbono alifáticos. Aún en
otras realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-4
átomos de carbono alifáticos. Los ejemplos incluyen, pero no se
limitan a, metoxilo, etoxilo, propoxilo, isopropoxilo,
n-butoxilo, terc-butoxilo,
i-butoxilo, sec-butoxilo,
neopentoxilo, n-hexoxilo y
similares.
similares.
El término alquenilo indica un grupo monovalente
derivado de un resto hidrocarbonado que tiene al menos un doble
enlace carbono-carbono mediante la eliminación de un
único átomo de hidrógeno. En ciertas realizaciones, el grupo
alquenilo empleado en la invención contiene 1-20
átomos de carbono. En algunas realizaciones, el grupo alquenilo
empleado en la invención contiene 1-10 átomos de
carbono. En otra realización, el grupo alquenilo empleado contiene
1-8 átomos de carbono. Todavía en otras
realizaciones, el grupo alquenilo contiene 1-6
átomos de carbono. Aún en otras realizaciones, el grupo alquenilo
contiene 1-4 carbonos. Los grupos alquenilo
incluyen, por ejemplo, etenilo, propenilo, butenilo,
1-metil-2-buten-1-ilo
y similares.
El término alquinilo tal como se usa en el
presente documento se refiere a un grupo monovalente derivado de un
hidrocarburo que tiene al menos un triple enlace
carbono-carbono mediante la eliminación de un único
átomo de hidrógeno. En ciertas realizaciones, el grupo alquinilo
empleado en la invención contiene 1-20 átomos de
carbono. En algunas realizaciones, el grupo alquinilo empleado en la
invención contiene 1-10 átomos de carbono. En otra
realización, el grupo alquinilo empleado contiene
1-8 átomos de carbono. Todavía en otras
realizaciones, el grupo alquinilo contiene 1-6
átomos de carbono. Los grupos alquinilo representativos incluyen,
pero no se limitan a, etinilo, 2-propinilo
(propargilo), 1-propinilo y similares.
El término alquilamino, dialquilamino y
trialquilamino tal como se usa en el presente documento se refiere
a uno, dos o tres grupos alquilo, respectivamente, tal como se
definió anteriormente, unidos al resto molecular original a través
de un átomo de nitrógeno. El término alquilamino se refiere a un
grupo que tiene la estructura -NHR', en la que R' es un grupo
alquilo, tal como se definió anteriormente; y el término
dialquilamino se refiere a un grupo que tiene la estructura
-NR'R'', en la que R' y R'' se seleccionan cada uno
independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo. El
término trialquilamino se refiere a un grupo que tiene la estructura
-NR'R''R''', en la que R', R'' y R''' se seleccionan cada uno
independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo. En
ciertas realizaciones, el grupo alquilo contiene
1-20 átomos de carbono alifáticos. En otras ciertas
realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-10 átomos
de carbono alifáticos. Aún en otras realizaciones, el grupo alquilo
contiene 1-8 átomos de carbono alifáticos. Todavía
en otras realizaciones, el grupo alquilo contiene
1-6 átomos de carbono alifáticos. Aún en otras
realizaciones, el grupo alquilo contiene 1-4 átomos
de carbono alifáticos. Adicionalmente, R', R'' y/o R''' tomados
juntos pueden ser opcionalmente -(CH_{2})_{k}- en el que
k es un número entero desde 2 hasta 6. Los ejemplos incluyen, pero
no se limitan a, metilamino, dimetilamino, etilamino, dietilamino,
dietilaminocarbonilo, metiletilamino,
iso-propilamino, piperidino, trimetilamino y
propilamino.
Los términos alquiltioéter y tioalcoxilo se
refieren a un grupo saturado (es decir, alquil-S-) o
insaturado (es decir, alquenil-S- y
alquinil-S-) unido al resto molecular original a
través de un átomo de azufre. En ciertas realizaciones, el grupo
alquilo contiene 1-20 átomos de carbono alifáticos.
En otras ciertas realizaciones, el grupo alquilo contiene
1-10 átomos de carbono alifáticos. Aún en otras
ciertas realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo
contienen 1-8 átomos de carbono alifáticos. Todavía
en otras realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo
contienen 1-6 átomos de carbono alifáticos. Aún en
otras realizaciones, los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo
contienen 1-4 átomos de carbono alifáticos. Los
ejemplos de restos tioalcoxilo incluyen, pero no se limitan a,
metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio,
n-butiltio y similares.
El término arilo tal como se usa en el presente
documento se refiere a un resto cíclico insaturado que comprende al
menos un anillo aromático. En ciertas realizaciones, grupo arilo se
refiere a un sistema de anillo carbocíclico mono o bicíclico que
tiene uno o dos anillos aromáticos incluyendo, pero sin limitarse a,
fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, indenilo y similares.
Los grupos arilo pueden estar no sustituidos o sustituidos con
sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquilo,
alquenilo, alquinilo, haloalquilo, alcoxilo, tioalcoxilo, amino,
alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, acilamino, ciano,
hidroxilo, halógeno, mercapto, nitro, carboxialdehído, carboxilo,
alcoxicarbonilo y carboxamida ramificados y no ramificados. Además,
los grupos arilo sustituidos incluyen tetrafluorofenilo y
pentafluorofenilo.
El término ácido carboxílico tal como se usa en
el presente documento se refiere a un grupo de fórmula
-CO_{2}H.
Los términos halo y halógeno tal como se usan en
el presente documento se refieren a un átomo seleccionado de flúor,
cloro, bromo y yodo.
El término heterocíclico, tal como se usa en el
presente documento, se refiere a un sistema de anillo de 3 a 10
miembros, aromático o no aromático, parcialmente insaturado o
completamente saturado, que incluye anillos individuales de 3 a 8
átomos de tamaño y sistemas de anillo bi y tricíclicos que pueden
incluir grupos heterocíclicos aromáticos o arilo de cinco o seis
miembros aromáticos condensados con un anillo no aromático. Estos
anillos heterocíclicos incluyen los que tienen desde uno hasta tres
heteroátomos seleccionados independientemente de oxígeno, azufre y
nitrógeno, en los que los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden
oxidarse opcionalmente y el heteroátomo de nitrógeno puede estar
opcionalmente cuaternizado. En ciertas realizaciones, el término
heterocíclico se refiere a un grupo policíclico o un anillo de 5, 6
ó 7 miembros no aromático en el que al menos un átomo de anillo es
un heteroátomo seleccionado de O, S y N (en el que los heteroátomos
de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados),
incluyendo, pero sin limitarse a, un grupo bi o tricíclico, que
comprende anillos de seis miembros condensados que tienen entre uno
y tres heteroátomos seleccionados independientemente del oxígeno,
azufre y nitrógeno, en el que (i) cada anillo de 5 miembros tiene de
0 a 2 dobles enlaces, cada anillo de 6 miembros tiene de 0 a 2
dobles enlaces y cada anillo de 7 miembros tiene de 0 a 3 dobles
enlaces; (ii) los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar
opcionalmente oxidados, (iii) el heteroátomo de nitrógeno puede
estar opcionalmente cuaternizado y (iv) cualquiera de los anillos
heterocíclicos anteriores puede estar condensado con un anillo de
arilo o
heteroarilo.
heteroarilo.
El término grupo heterocíclico aromático, tal
como se usa en el presente documento, se refiere a un radical
aromático cíclico que tiene desde cinco hasta diez átomos de anillo
de los cuales un átomo de anillo se selecciona de azufre, oxígeno y
nitrógeno; cero, uno o dos átomos de anillo son heteroátomos
adicionales seleccionados independientemente de azufre, oxígeno y
nitrógeno; y los átomos de anillo restantes son carbono, estando
unido el radical al resto de la molécula a través de cualquiera de
los átomos de anillo, tales como, por ejemplo, piridilo,
pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo,
tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo,
tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo y similares. Los
grupos heterocíclicos aromáticos pueden estar no sustituidos o
sustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo que consiste
en alquilo, alquenilo, alquinilo, haloalquilo, alcoxilo,
tioalcoxilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino,
acilamino, ciano, hidroxilo, halógeno, mercapto, nitro,
carboxialdehído, carboxilo, alcoxicarbonilo y carboxamida
ramificados y no
ramificados.
ramificados.
Los grupos heterocíclicos aromáticos y
heterocíclicos específicos que pueden incluirse en los compuestos de
la invención incluyen:
3-metil-4-(3-metilfenil)piperazina,
3-metilpiperidina,
4-(bis-(4-fluorofenil)metil)piperazina,
4-(difenilmetil)piperazina,
4-(etoxicarbonil)piperazina,
4-(etoxicarbonilmetil)piperazina,
4-(fenilmetil)piperazina,
4-(1-feniletil)piperazina,
4-(1,1-dimetiletoxicarbonil)piperazina,
4-(2-(bis-(2-propenil)amino)etil}piperazina,
4-(2-(dietila-
mino)etil)piperazina, 4-(2-clorofenil)piperazina, 4-(2-cianofenil)piperazina, 4-(2-etoxifenil)piperazina, 4-(2-etilfenil)piperazina, 4-(2-fluorofenil)piperazina, 4-(2-hidroxietil)piperazina, 4-(2-metoxietil)piperazina, 4-(2-metoxifenil)piperazina, 4-(2-metilfenil)piperazina, 4-(2-metiltiofenil)piperazina, 4-(2-nitrofenil)piperazina, 4-(2-nitrofenil)piperazina, 4-(2-feniletil)piperazina, 4-(2-piridil)piperazina, 4-(2-pirimidinil)piperazina, 4-(2,3-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,4-difluorofenil)piperazina, 4-(2,4-dimetoxifenil)piperazina, 4-(2,4-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,5-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,6-dimetilfenil)piperazina, 4-(3-clorofenil)piperazina, 4-(3-metilfenil)piperazina, 4-(3-trifluorometilfenil)piperazina, 4-(3,4-diclorofenil)piperazina, 4-(3,4-dimetoxifenil)piperazina, 4-(3,4-dimetilfenil)piperazina, 4-(3,4-metilendioxifenil)piperazina, 4-(3,4,5-trimetoxifenil)piperazina, 4-(3,5-diclorofenil)piperazina, 4-(3,5-dimetoxifenil)piperazina, 4-(4-(fenilmetoxi)fenil)piperazina, 4-(4-(3,1-dimetiletil)fenilmetil)piperazina, 4-(4-cloro-3-trifluorometilfenil)piperazina, 4-(4-clorofenil)-3-metilpiperazina, 4-(4-clorofenil)piperazina, 4-(4-clorofenil)piperazina, 4-(4-clorofenilmetil)piperazina, 4-(4-fluorofenil)piperazina, 4-(4-metoxifenil)piperazina, 4-(4-metilfenil)piperazina, 4-(4-nitrofenil)piperazina, 4-(4-trifluorometilfenil)piperazina, 4-ciclohexilpiperazina, 4-etilpiperazina, 4-hidroxi-4-(4-clorofenil)metilpiperidina, 4-hidroxi-4-fenilpiperidina, 4-hidroxipirrolidina, 4-metilpiperazina, 4-fenilpiperazina, 4-piperidinilpiperazina, 4-(2-furanil)carbonil)piperazina, 4-((1,3-dioxolan-5-il)metil)piperazina, 6-fluoro-1,2,3,4-tetrahidro-2-metilquinolina, 1,4-diazacicloheptano, 2,3-dihidroindolilo, 3,3-dimetilpiperidina, 4,4-etilendioxipiperidina, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 1,2,3,4-tetrahidroquinolina, azaciclooctano, decahidroquinolina, piperazina, piperidina, pirrolidina, tiomorfolina y triazol.
mino)etil)piperazina, 4-(2-clorofenil)piperazina, 4-(2-cianofenil)piperazina, 4-(2-etoxifenil)piperazina, 4-(2-etilfenil)piperazina, 4-(2-fluorofenil)piperazina, 4-(2-hidroxietil)piperazina, 4-(2-metoxietil)piperazina, 4-(2-metoxifenil)piperazina, 4-(2-metilfenil)piperazina, 4-(2-metiltiofenil)piperazina, 4-(2-nitrofenil)piperazina, 4-(2-nitrofenil)piperazina, 4-(2-feniletil)piperazina, 4-(2-piridil)piperazina, 4-(2-pirimidinil)piperazina, 4-(2,3-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,4-difluorofenil)piperazina, 4-(2,4-dimetoxifenil)piperazina, 4-(2,4-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,5-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,6-dimetilfenil)piperazina, 4-(3-clorofenil)piperazina, 4-(3-metilfenil)piperazina, 4-(3-trifluorometilfenil)piperazina, 4-(3,4-diclorofenil)piperazina, 4-(3,4-dimetoxifenil)piperazina, 4-(3,4-dimetilfenil)piperazina, 4-(3,4-metilendioxifenil)piperazina, 4-(3,4,5-trimetoxifenil)piperazina, 4-(3,5-diclorofenil)piperazina, 4-(3,5-dimetoxifenil)piperazina, 4-(4-(fenilmetoxi)fenil)piperazina, 4-(4-(3,1-dimetiletil)fenilmetil)piperazina, 4-(4-cloro-3-trifluorometilfenil)piperazina, 4-(4-clorofenil)-3-metilpiperazina, 4-(4-clorofenil)piperazina, 4-(4-clorofenil)piperazina, 4-(4-clorofenilmetil)piperazina, 4-(4-fluorofenil)piperazina, 4-(4-metoxifenil)piperazina, 4-(4-metilfenil)piperazina, 4-(4-nitrofenil)piperazina, 4-(4-trifluorometilfenil)piperazina, 4-ciclohexilpiperazina, 4-etilpiperazina, 4-hidroxi-4-(4-clorofenil)metilpiperidina, 4-hidroxi-4-fenilpiperidina, 4-hidroxipirrolidina, 4-metilpiperazina, 4-fenilpiperazina, 4-piperidinilpiperazina, 4-(2-furanil)carbonil)piperazina, 4-((1,3-dioxolan-5-il)metil)piperazina, 6-fluoro-1,2,3,4-tetrahidro-2-metilquinolina, 1,4-diazacicloheptano, 2,3-dihidroindolilo, 3,3-dimetilpiperidina, 4,4-etilendioxipiperidina, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 1,2,3,4-tetrahidroquinolina, azaciclooctano, decahidroquinolina, piperazina, piperidina, pirrolidina, tiomorfolina y triazol.
El término carbamoílo, tal como se usa en el
presente documento, se refiere a un grupo amida de fórmula
-CONH_{2}.
El término carbonildioxilo, tal como se usa en
el presente documento, se refiere a un grupo carbonato de fórmula
-O-CO-OR.
El término hidrocarburo, tal como se usa en el
presente documento, se refiere a cualquier grupo químico que
comprende hidrógeno y carbono. El hidrocarburo puede estar
sustituido o no sustituido. El hidrocarburo puede ser insaturado,
saturado, ramificado, no ramificado, cíclico, policíclico o
heterocíclico. Los hidrocarburos ilustrativos incluyen, por
ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo,
ciclopropilo, alilo, vinilo, n-butilo,
terc-butilo, etinilo, ciclohexilo, metoxilo,
dietilamino y similares. Tal como conocería un experto en esta
técnica, deben satisfacerse todas las valencias al hacer cualquier
sustitución.
Los términos sustituido, esté precedido o no por
el término "opcionalmente", y sustituyente, tal como se usan
en el presente documento, se refieren a la capacidad, tal como
aprecia un experto en esta técnica, para cambiar un grupo funcional
por otro grupo funcional siempre que se mantenga la valencia de
todos los átomos. Cuando más de una posición en cualquier
estructura dada puede estar sustituida con más de un sustituyente
seleccionado de un grupo especificado, el sustituyente puede ser
igual o diferente en cada posición. Los sustituyentes pueden estar
también sustituidos adicionalmente (por ejemplo, un sustituyente de
grupo arilo puede tener otro sustituyente fuera del mismo, tal como
otro grupo arilo, que está sustituido adicionalmente con flúor en
una o más posiciones).
El término tiohidroxilo o tiol, tal como se usa
en el presente documento, se refiere a un grupo de fórmula -SH.
El término ureido, tal como se usa en el
presente documento, se refiere a un grupo urea de fórmula:
-NH-CO-NH_{2}.
Los siguientes son términos más generales usados
durante toda la presente memoria descriptiva:
"Animal": El término animal, tal como se
usa en el presente documento, se refiere a seres humanos así como
animales no humanos, incluyendo, por ejemplo, mamíferos, aves,
reptiles, anfibios y peces. Preferiblemente, el animal no humano es
un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo,
un mono, un perro, un gato, un primate o un cerdo). El animal puede
ser un animal domesticado. El animal puede ser un animal
transgénico.
"Asociado con": Cuando dos entidades están
"asociadas con" entre sí tal como se describe en el presente
documento, están unidas mediante una interacción covalente o no
covalente directa o indirecta. Preferiblemente, la asociación es
covalente. Las interacciones no covalentes deseables incluyen
enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones
hidrófobas, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas,
etc.
"Biocompatible": El término
"biocompatible", tal como se usa en el presente documento,
pretende describir compuestos que no son tóxicos para las células.
Los compuestos son "biocompatibles" si su adición a células
in vitro da como resultado una muerte celular inferior o
igual al 20%, y su administración in vivo no induce
inflamación ni ningún otro efecto adverso de este tipo.
"Biodegradable": Tal como se usa en el
presente documento, compuestos "biodegradables" son aquéllos
que, cuando se introducen en las células, se descomponen mediante
la maquinaria celular o mediante hidrólisis dando componentes que
las células pueden o bien volver a usar o bien desechar sin efecto
tóxico significativo sobre las células (es decir, se destruye menos
de aproximadamente el 20% de las células cuando se añaden los
componentes a las células in vitro). Preferiblemente, los
componentes no inducen inflamación ni ningún otro efecto adverso
in vivo. En ciertas realizaciones preferidas, las reacciones
químicas en las que se confía para descomponer los compuestos
biodegradables no están catalizadas.
"Cantidad eficaz": En general, la
"cantidad eficaz" de un agente activo o dispositivo de
administración de fármacos se refiere a la cantidad necesaria para
provocar la respuesta biológica deseada. Tal como apreciarán los
expertos habituales en esta técnica, la cantidad eficaz de un agente
o dispositivo puede variar dependiendo de factores tales como el
criterio de valoración biológico deseado, el agente que va a
administrarse, la composición de la matriz de encapsulación, el
tejido diana, etc. Por ejemplo, la cantidad eficaz de
micropartículas que contienen un antígeno que va a administrarse
para inmunizar a un individuo es la cantidad que da como resultado
una respuesta inmunitaria suficiente para prevenir la infección con
un organismo que tiene el antígeno administrado.
"Péptido" o "proteína": Según la
presente invención, un "péptido" o una "proteína"
comprende una cadena de al menos tres aminoácidos unidos entre sí
mediante enlaces peptídicos. Los términos "proteína" y
"péptido" pueden usarse de manera intercambiable. Péptido
puede referirse a un péptido individual o a una colección de
péptidos. Los péptidos de la invención contienen preferiblemente
sólo aminoácidos naturales, aunque pueden emplearse
alternativamente aminoácidos no naturales (es decir, compuestos que
no se producen en la naturaleza pero que pueden incorporarse en una
cadena polipeptídica) y/o análogos de aminoácido tal como se conocen
en la técnica. Además, uno o más de los aminoácidos en un péptido
de la invención pueden estar modificados, por ejemplo, mediante la
adición de una entidad química tal como un grupo hidrato de carbono,
un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un
grupo ácido graso, un conector para la conjugación, funcionalización
u otra modificación, etc. En una realización preferida, las
modificaciones del péptido conducen a un péptido más estable (por
ejemplo, mayor semivida in vivo). Estas modificaciones pueden
incluir la ciclación del péptido, la incorporación de
D-aminoácidos, etc. Ninguna de las modificaciones
debe interferir sustancialmente con la actividad biológica deseada
del
péptido.
péptido.
"Polinucleótido" u "oligonucleótido":
Polinucleótido u oligonucleótido se refiere a un polímero de
nucleótidos. Normalmente, un polinucleótido comprende al menos tres
nucleótidos. El polímero puede incluir nucleósidos naturales (es
decir, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina,
desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina),
análogos de nucleósido (por ejemplo,
2-aminoadenosina, 2-tiotimidina,
inosina, pirrolo-pirimidina,
3-metiladenosina,
C5-propinilcitidina,
C5-propiniluridina, C5-bromouridina,
C5-fluorouridina, C5-yodouridina,
C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina,
7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina,
8-oxoguanosina,
O(6)-metilguanina y
2-tiocitidina), bases modificadas químicamente,
bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas),
bases intercaladas, azúcares modificados (por ejemplo,
2'-fluororribosa, ribosa,
2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa), o grupos
fosfato modificados (por ejemplo, enlaces de fosforotioato y
5'-N-fosforamidita).
"Molécula pequeña": Tal como se usa en el
presente documento, la expresión "molécula pequeña" se refiere
a compuestos orgánicos, ya se produzcan de manera natural o se
creen artificialmente (por ejemplo, mediante síntesis química) que
tienen un peso molecular relativamente bajo y que no son proteínas,
polipéptidos ni ácidos nucleicos. Normalmente, las moléculas
pequeñas tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 1500
g/mol. Además, las moléculas pequeñas tienen normalmente múltiples
enlaces carbono-carbono. Las moléculas pequeñas que
se producen de manera natural conocidas incluyen, pero no se limitan
a, penicilina, eritromicina, taxol, ciclosporina y rapamicina. Las
moléculas pequeñas sintéticas conocidas incluyen, pero no se limitan
a, ampicilina, meticilina, sulfametoxazol y sulfonamidas.
La figura 1 muestra el perfil de tiempo para la
degradación de los polímeros 1-3 a 37ºC a pH 5,1 y
pH 7,4. La degradación se expresa como el porcentaje de degradación
a lo largo del tiempo basándose en los datos de CPG.
La figura 2 muestra los perfiles de
citotoxicidad de los polímeros 1-3 y PEI. La
viabilidad de células NIH 3T3 se expresa como función de la
concentración de polímero. Los pesos moleculares de los polímeros 1,
2 y 3 eran 5800, 11300 y 22500, respectivamente. El peso molecular
de la PEI empleada era de 25000.
La figura 3 muestra el retardo del ADN de
pCMV-Luc mediante el polímero 1 en electroforesis en
gel de agarosa. Cada carril corresponde a una razón en peso de
ADN/polímero diferente. Las razones son las siguientes: 1) 1:0 (ADN
sólo); 2) 1:0,5; 3) 1:1; 4) 1:2; 5) 1:3; 6) 1:4; 7) 1:5; 8) 1:6; 9)
1:7; y 10) 1:8.
La figura 4 muestra los diámetros eficaces
promedio de complejos de ADN/polímero formados a partir del plásmido
pCMV-Luc y el polímero 3 (M_{n} = 31.000) como
función de la concentración de polímero.
La figura 5 muestra los potenciales \zeta
promedio de complejos de ADN/polímero formados a partir del plásmido
pCMV-Luc y el polímero 3 (M_{n} = 31.000) como
función de la concentración de polímero. Los números para cada
complejo corresponden a los números de complejo en la figura 4.
La figura 6 es una imagen de MEB de microesferas
cargadas con rodamina/dextrano fabricadas a partir del polímero
1.
La figura 7 muestra los perfiles de liberación
de rodamina/dextrano a partir de microesferas de PLGA y polímero 1
a diversos valores de pH. Las flechas indican los puntos a los que
el tampón HEPES (pH 7,4) se intercambió por tampón acetato (pH
5,1).
La figura 8 muestra a) una imagen de microscopía
de fluorescencia representativa de microesferas de polímero 1
cargadas con rodamina/dextrano suspendidas en tampón HEPES (pH 7,4).
La figura 8b muestra una muestra de microesferas de polímero 1
cargadas a pH 7,4 tras la adición de tampón acetato (pH 5,1). La
dirección de la difusión del ácido es desde la parte superior
derecha hasta la inferior izquierda de la imagen (tiempo
transcurrido \approx 5
segundos).
segundos).
La figura 9 muestra el ensayo de electroforesis
en gel usado para identificar polímeros complejantes de ADN. Las
anotaciones de los carriles corresponden a los 70 miembros solubles
en agua de la biblioteca de examen. Para cada polímero, los ensayos
se realizaron a razones de ADN/polímero de 1:5 (pocillo izquierdo) y
1:20 (pocillo derecho). Los carriles marcados con C* contienen ADN
solo (sin polímero) y se usaron como control.
La figura 10 muestra los datos de transfección
como una función de la estructura para un ensayo que emplea
pCMV-Luc (600 ng/pocillo, ADN/polímero = 1:20). Las
unidades de luz son arbitrarias y no están normalizadas con
respecto a la proteína celular total; los experimentos se realizaron
por triplicado (barras de error no mostradas). Los cuadrados negros
representan polímeros insolubles en agua, los cuadrados blancos
representan polímeros solubles en agua que no complejaron el ADN en
la figura 9. La columna de derecha (marcada con "*") presenta
valores para los siguientes experimentos control: sin polímero
(verde), PEI (rojo) y Lipofectamine (azul claro).
La figura 11 muestra una síntesis de
poli(beta-amino-ésteres). Los
poli(beta-amino-ésteres) pueden sintetizarse
por adición conjugada de aminas primarias (ecuación 1) o
bis(aminas secundarias) (ecuación 2) a diacrilatos.
La figura 12 muestra una variedad de monómeros
de amina (A) y diacrilato (B) usados en la síntesis de la biblioteca
de polímeros.
La figura 13 es un histograma de las eficiencias
de transfección de polímeros. En el primer examen se sometieron a
prueba los 2350 polímeros para determinar su capacidad para
administrar ADN de pCMV-luc a razones de N:P de
40:1, 20:1 y 10:1 a células COS-7. La eficiencia de
transfección se presenta en ng de luciferasa por pocillo. Para
referencia, se muestra la eficiencia de transfección de PEI. Las
células COS-7 captan fácilmente ADN desnudo, y en
estas condiciones producen 0,15 \pm 0,05 ng por pocillo, y el
reactivo lipídico, Lipofectamine 2000, produce 13,5 \pm 1,9 ng
por pocillo.
Figura 14. A) eficiencia de transfección
optimizada para los 50 polímeros superiores en relación con PEI y
Lipofectamine 2000. Se sometieron a prueba los polímeros tal como se
describe en los métodos. En el primer examen amplio, se sometieron
a prueba razones de N:P de 40:1, 20:1 y 10:1 con una n de 1.
Volvieron a examinarse los 93 superiores a seis razones de N:P
diferentes = (N:P óptima del primer examen) x 1,75, 1,5, 1,25, 1,0,
0,75 y 0,5, por triplicado. Las reacciones control están marcadas en
rojo, y los polímeros que no se unen al ADN en un ensayo de
electroforesis en gel se muestran en negro. B) Polímeros que se unen
al ADN tal como se determina mediante electroforesis en gel de
agarosa. Los datos se tabularon de la siguiente manera: 1) el ADN
completamente desplazado está representado por (+), 2) el ADN
parcialmente desplazado está representado por (+/-), 3) el ADN no
unido está representado por
(-).
(-).
La figura 15 muestra la transfección de células
COS-7 usando plásmido de proteína fluorescente verde
potenciado. Se transfectaron las células a una razón de N:P de (N:P
óptima del examen amplio) x 1,25 con 600 ng de ADN. Se muestran
regiones del pocillo que muestran alta transfección para los
siguientes polímeros: a) C36, b) D94.
La figura 16 muestra cómo el peso molecular del
polímero y el grupo terminal de la cadena se ven afectados al
variar la razón de amina/diacrilato en la mezcla de reacción. Los
pesos moleculares (M_{w}) (en relación con patrones de
poliestireno) se determinaron mediante CPG en fase orgánica. Los
polímeros sintetizados con razones de amina/diacrilato de >1
tienen grupos terminales amina, y los polímeros sintetizados con
razones de amina/diacrilato de <1 tienen grupos terminales
acrilato.
La figura 17 muestra los resultados de
transfección de luciferasa para Poli-1 como función
del peso molecular del polímero, la razón de polímero/ADN (p/p) y
el grupo terminal del polímero. (A) cadenas terminadas en amina;
(B) cadenas terminadas en acrilato, (n=4, las barras de error no se
muestran).
La figura 18 muestra los resultados de
transfección de luciferasa para Poli-2 como función
del peso molecular del polímero, la razón de polímero/ADN (p/p) y
el grupo terminal del polímero. (A) cadenas terminadas en amina;
(B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, barras de error no
mostradas).
Figura 19 muestra la citotoxicidad de complejos
de poli-1/ADN como función del peso molecular del
polímero, la razón de polímero/ADN (p/p) y el grupo terminal del
polímero. (A) cadenas terminadas en amina; (B) cadenas terminadas
en acrilato. (n=4, las barras de error no se muestran).
La figura 20 muestra la citotoxicidad de
complejos de poli-2/ADN como función del peso
molecular del polímero, la razón de polímero/ADN (p/p) y el grupo
terminal del polímero. (A) cadenas terminadas en amina; (B) cadenas
terminadas en acrilato. (n=4, las barras de error no se
muestran).
La figura 21 muestra el nivel de captación
celular relativo de complejos de poli-1/ADN como
función del peso molecular del polímero, la razón de polímero/ADN
(p/p) y el grupo terminal del polímero. (A) cadenas terminadas en
amina; (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, las barras de error
no se muestran).
La figura 22 muestra el nivel de captación
celular relativo de complejos de poli-2/ADN como
función del peso molecular del polímero, la razón de polímero/ADN
(p/p) y el grupo terminal del polímero. (A) cadenas terminadas en
amina (los cuadrados blancos representan condiciones en las que la
citotoxicidad de los complejos impidió una medición fiable de la
captación celular); (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, barras
de error no mostradas).
La figura 23 muestra la potenciación de la
actividad de transfección de vectores de administración a base de
poli-1 (cadenas terminadas en amina, M_{w} =
13.100) a través del uso de agentes co-complejantes.
(A) polilisina (PLL); (B) polietilenimina (PEI), (n=4, las barras
de error no se muestran).
La figura 24 muestra la potenciación de la
actividad de transfección de vectores de administración a base de
poli-2 (cadenas terminadas en amina, M_{w} =
13.400) a través del uso de agentes co-complejantes.
(A) polilisina (PLL); (B) polietilenimina (PEI). (n=4, las barras
de error no se muestran).
La figura 25 es una comparación de la
transferencia del gen de GFP en células COS-7 usando
Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN =
60:0,1:1 (p/p/p)), Poli-2/PLL
(Poli-2:PLL:ADN = 15:0,4:1 (p/p/p)), Lipofectamine
2000 (\mul de reactivo: \mug de ADN = 1:1), PEI (PEI:ADN 1:1
(p/p), N/P \sim 8) y ADN desnudo. Se sembraron las células en
placas de 6 pocillos y se hicieron crecer hasta nueva confluencia.
Se incubaron las células con complejos (5 \mug de ADN/pocillo)
durante 1 hora, tiempo tras el cual se retiraron los complejos y se
añadió medio de crecimiento nuevo. Dos días más tarde se sometió a
ensayo la expresión de GFP mediante citometría de flujo. (n=3, las
barras de error indican una desviación estándar).
La figura 26 muestra la expresión de GFP en
células COS-7 transfectadas usando
Poli-1/PLL.
La figura 27 muestra la transferencia del gen de
GFP en cuatro líneas celulares diferentes usando
Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN =
60:0,1:1 (p/p/p). Se sembraron las células en placas de 6 pocillos y
se hicieron crecer casi hasta la confluencia. Se incubaron entonces
las células con complejos (5 \mug de ADN/pocillo) durante 1 hora,
tiempo tras el cual se retiraron los complejos y se añadió medio de
crecimiento nuevo. Dos días más tarde se sometió a ensayo la
expresión de GFP mediante citometría de flujo. (n=5, las barras de
error indican una desviación estándar).
La figura 28 muestra los pesos moleculares
(M_{w} y M_{n}) del polímero G5 como función de la razón molar
de monómeros de amina:diacrilato en la síntesis.
La figura 29 muestra los pesos moleculares
(M_{w} y M_{n}) del polímero B14 como función de la razón molar
de monómeros de amina:diacrilato en la síntesis de polímero.
La figura 30 es una comparación de la función de
peso molecular con respecto a la razón molar de amina:diacrilato
para los polímeros B14 y G5.
La presente invención proporciona sistemas de
administración y encapsulación poliméricos mejorados basados en el
uso de polímeros de polímeros de
\beta-amino-éster. Los sistemas pueden usarse en
las técnicas de administración de fármacos/farmacéutica para
administrar polinucleótidos, proteínas, moléculas pequeñas,
péptidos, antígenos, fármacos, etc. a un paciente, tejido, órgano,
célula, etc. La presente invención también proporciona la
preparación y el examen de grandes colecciones de polímeros para
determinar "resultados positivos" que son útiles en las
técnicas de administración de fármacos y farmacéutica.
Los polímeros de
\beta-amino-éster de la presente invención
proporcionan varios usos diferentes en la técnica de administración
de fármacos. Los polímeros con sus estructuras principales que
contienen aminas terciarias pueden usarse para complejar
polinucleótidos y de ese modo potenciar la administración de
polinucleótido e impedir su degradación. Los polímeros también
pueden usarse en la formación de nanopartículas o micropartículas
que contienen agentes encapsulados. Debido a las propiedades de los
polímeros de ser biocompatibles y biodegradables, estas partículas
formadas son también biodegradables y biocompatibles y pueden usarse
para proporcionar una liberación controlada, sostenida del agente
encapsulado. Estas partículas también pueden ser sensibles a cambios
en el pH dado el hecho de que estos polímeros normalmente no son
sustancialmente solubles en disolución acuosa a pH fisiológico sino
que son más solubles a pH inferior.
Los polímeros de la presente invención son
poli(\beta-amino-ésteres) que contienen
aminas terciarias en sus estructuras principales y sales de los
mismos. Los pesos moleculares de los polímeros de la invención
pueden oscilar desde 5.000 g/mol hasta más de 100.000 g/mol, más
preferiblemente desde 4.000 g/mol hasta 50.000 g/mol. En una
realización particularmente preferida, los polímeros de la invención
son relativamente no citotóxicos. En otra realización
particularmente preferida, los polímeros de la invención son
biocompatibles y biodegradables. En una realización particularmente
preferida, los polímeros de la presente invención tienen pK_{a} en
el intervalo de 5,5 a 7,5, más preferiblemente entre 6,0 y 7,0. En
otra realización particularmente preferida, el polímero puede
diseñarse para que tenga un pK_{a} deseado de entre 3,0 y 9,0, más
preferiblemente entre 5,0 y 8,0. Los polímeros de la invención son
particularmente atractivos para la administración de fármacos por
varios motivos: 1) contienen grupos amino para interaccionar con el
ADN y otros agentes cargados negativamente, para tamponar el pH,
para provocar endosomolisis, etc.; 2) contienen enlaces poliéster
degradables; 3) pueden sintetizarse a partir de materiales de
partida comercialmente disponibles; y 4) son sensibles al pH y
podrían diseñarse por ingeniería genética futuras generaciones con
un pK_{a} deseado. En el examen para determinar la eficiencia de
transfección, los polímeros que tenían un mejor rendimiento eran
hidrófobos o los monómeros de diacrilato eran hidrófobos, y muchos
tenían cadenas laterales de mono o dihidroxilo y/o bis(aminas
secundarias) lineales como parte de su estructura.
Los polímeros de la presente invención se
preparan a partir de un bis(éster de acrilato) y una amina,
seleccionándose la amina del grupo que consiste en las fórmulas
6-94:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertas realizaciones, los polímeros incluyen
las aminas 6, 17, 60, 61, 70, 86, 87, 89 ó 94.
En ciertas realizaciones, los polímeros de la
presente invención pueden definirse generalmente mediante la
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
preparado por adición conjugada de
una amina
primaria
a un bis(éster de
acrilato)
siendo la amina primaria de
fórmula:
en
donde:
R_{1} se proporciona mediante las aminas
primarias 6, 7, 16, 17, 18, 37, 38, 39, 41, 47, 51, 72, 73, 74, 76,
77, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92 ó 94;
B es una cadena de átomos de carbono o
heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida
en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo,
alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino,
hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo
heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido
carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y
ureido;
n es un número entero que corresponde a un
polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta
20.000 g/mol.
En otra realización, los polímeros de la
presente invención pueden definirse generalmente mediante la
fórmula:
preparado por adición conjugada de
una bis(amina
secundaria)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
a un bis(éster de
acrilato)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
siendo la bis(amina
secundaria) de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde:
R_{1}, R_{2} y A se proporcionan mediante la
bis(amina secundaria) 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,
69, 70 ó 71;
cuando la bis(amina secundaria) es 70 ó
71, R_{1} y R_{2} están unidos formando una estructura cíclica
con A;
B es una cadena de átomos de carbono o
heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida
en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo,
alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino,
hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo
heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido
carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y
ureido;
n es un número entero que corresponde a un
polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta
20.000 g/mol.
\newpage
En otra realización, la unidad de bis(éster de
acrilato) en el polímero de la invención se elige del siguiente
grupo de unidades (A-PP) de bis(éster de
acrilato):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los bis(ésteres de acrilato) particularmente
preferidos en este grupo incluyen B, C, D, E, F, M, O, U, AA, II,
JJ, KK y LL.
Los
poli(beta-amino-ésteres) particularmente
útiles incluyen:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Otros
poli(beta-amino-ésteres) particularmente
útiles incluyen C86, D60, D61, U94, LL6, C94, F94, JJ94, JJ86, C86,
U86, E86, B17, D70, U87, D87, C94, D86, F86, AA94, AA60, A61, D94,
U94, E94, B17, M17 y AA61.
En una realización particularmente preferida,
uno o los dos conectores A y B son polímeros de polietileno. En
otra realización particularmente preferida, uno o los dos conectores
A y B son polímeros de polietilenglicol. Pueden usarse otros
polímeros biodegradables y biocompatibles como uno o los dos
conectores A y B.
En ciertas realizaciones preferidas, los
polímeros de la presente invención están terminados en amina. En
otras realizaciones, los polímeros de la presente invención están
terminados en acrilato. En gran parte, la unidad de terminación del
polímero se determina mediante la razón de amina frente a acrilato
en la reacción de síntesis de polímero. Un exceso de monómero de
amina produce un polímero terminado en amina. Y un exceso de
monómero de acrilato produce un polímero terminado en acrilato.
En ciertas realizaciones, el peso molecular
promedio de los polímeros de la presente invención oscila desde
1.000 g/mol hasta 50.000 g/mol, preferiblemente desde 2.000 g/mol
hasta 40.000 g/mol, más preferiblemente desde 5.000 g/mol hasta
20.000 g/mol, e incluso más preferiblemente desde 10.000 g/mol hasta
17.000 g/mol. Puesto que los polímeros de la presente invención se
preparan mediante una polimerización por etapas, se obtiene
normalmente una distribución estadística, amplia de longitudes de
cadena. En ciertas realizaciones, la distribución de pesos
moleculares en una muestra de polímeros se estrecha mediante etapas
de purificación y aislamiento conocidas en la técnica. El peso
molecular del polímero también puede variarse mediante la síntesis
del polímero, por ejemplo, a medida que la cantidad de monómeros de
amina aumenta, el peso molecular del polímero resultante disminuye.
En otras realizaciones, la mezcla de polímeros puede ser una
combinación de polímeros de diferentes pesos molecu-
lares.
lares.
En otra realización particularmente preferida,
el polímero de la presente invención es un copolímero en el que una
de las unidades de repetición es un
poli(\beta-amino-éster) de la presente
invención. Otras unidades de repetición que van a usarse en el
copolímero incluyen, pero no se limitan a, polietileno,
poli(glicolida-co-lactida)
(PLGA), ácido poliglicólico, polimetacrilato, etc.
Los polímeros de la invención pueden prepararse
mediante cualquier método conocido en la técnica. Preferiblemente,
los polímeros se preparan a partir de materiales de partida
comercialmente disponibles. En otra realización preferida, los
polímeros se preparan a partir de materiales de partida preparados
de manera fácil y/o económi-
ca.
ca.
En una realización particularmente preferida, el
polímero de la invención se prepara por adición conjugada de
bis(aminas secundarias) a bis(ésteres de acrilato). Este
esquema de reacción se muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los monómeros de bis(amina secundaria)
que son útiles en el presente método de la invención incluyen, pero
no se limitan a, N,N'-dimetiletilendiamina y
1,2-bis(N-etilamino)etileno.
Los monómeros de diacrilato que son útiles en la presente invención
incluyen, pero no se limitan a, diacrilato de
1,4-butanodiol, dimetacrilato de
1,4-butanodiol, diacrilato de
1,2-etanodiol, diacrilato de
1,6-hexanodiol, diacrilato de
1,5-pentanodiol, diacrilato de
2,5-hexanodiol y diacrilato de
1,3-propanodiol. Cada uno de los monómeros se
disuelve en un disolvente orgánico (por ejemplo, THF,
CH_{2}Cl_{2}, MeOH, EtOH, CHCl_{3}, hexanos, tolueno, benceno,
CCl_{4}, glima, dietil éter, DMSO, DMF, etc.), preferiblemente
DMSO. Las disoluciones resultantes se combinan, y la mezcla de
reacción se calienta para producir el polímero deseado. En otras
realizaciones, la reacción se realiza sin el uso de un disolvente
(es decir, puro) obviando de ese modo la necesidad de eliminar el
disolvente tras la síntesis. La mezcla de reacción se calienta
entonces hasta una temperatura que oscila desde 30ºC hasta 200ºC,
preferiblemente de 40ºC a 150ºC, más preferiblemente de 50ºC a
100ºC. En una realización particularmente preferida, la mezcla de
reacción se calienta hasta aproximadamente 40ºC, 50ºC, 60ºC, 70ºC,
80ºC o 90ºC. En otra realización particularmente preferida, la
mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 75ºC. En otra
realización, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente
100ºC. La reacción de polimerización también puede estar
catalizada. El tiempo de reacción puede oscilar desde horas hasta
días dependiendo de la reacción de polimerización y las condiciones
de reacción. Tal como apreciaría un experto en la técnica, el
calentamiento de la reacción tiende a acelerar la velocidad de
reacción requiriendo un tiempo de reacción más corto. En ciertas
realizaciones, la síntesis de polímeros se lleva a cabo en DMSO a
aproximadamente 60ºC durante aproximadamente 2 días. En otras
realizaciones, la síntesis de polímeros se lleva a cabo sin
disolvente a 95ºC durante 8-16 horas. Tal como
apreciaría un experto en esta técnica, el peso molecular del
polímero sintetizado puede determinarse mediante las condiciones de
reacción (por ejemplo, temperatura, materiales de partida,
concentración, catalizador, disolvente, tiempo de reacción, etc.)
usadas en la
síntesis.
síntesis.
\newpage
En otra realización particularmente preferida,
los polímeros de la invención se preparan por adición conjugada de
una amina primaria a un bis(éster de acrilato). El uso de aminas
primarias en vez de bis(aminas secundarias) permite una
variedad mucho más amplia de materiales de partida comercialmente
disponibles. El esquema de reacción que usa aminas primarias en vez
de aminas secundarias se muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las aminas primarias útiles en este método
incluyen, pero no se limitan a, anilinas sustituidas. Los
bis(ésteres de acrilato) útiles en este método incluyen, pero no se
limitan a, diacrilato de 1,4-butanodiol,
dimetacrilato de 1,4-butanodiol, diacrilato de
1,2-etanodiol, diacrilato de
1,6-hexanodiol, diacrilato de
1,5-pentanodiol, diacrilato de
2,5-hexanodiol y diacrilato de
1,3-propanodiol. Cada uno de los monómeros se
disuelve en un disolvente orgánico (por ejemplo, THF, DMSO, DMF,
CH_{2}Cl_{2}, MeOH, EtCH, CHCl_{3}, hexanos, CCl_{4},
glima, dietil éter, etc.). Se prefieren disolventes orgánicos debido
a la sensibilidad de los poliésteres a la hidrólisis.
Preferiblemente, el disolvente orgánico usado es relativamente no
tóxico en sistemas vivos. En ciertas realizaciones, se usa DMSO
como disolvente orgánico porque es relativamente no tóxico y se usa
frecuentemente como disolvente en cultivo celular y en el
almacenamiento de reservas de células congeladas. Otros disolventes
preferidos incluyen los miscibles con agua tales como DMSO, etanol y
metanol. Se combinan las disoluciones de monómeros resultantes que
están preferiblemente a una concentración de entre 0,01 M y 5 M,
entre aproximadamente 0,1 M y 2 M, más preferiblemente entre 0,5 M y
2 M, y lo más preferiblemente entre 1,3 M y 1,8 M, y la mezcla de
reacción se calienta hasta producir el polímero deseado. En ciertas
realizaciones, la reacción se lleva a cabo sin disolvente. Llevar a
cabo la polimerización sin disolvente puede disminuir la cantidad
de productos de ciclación que resultan de reacciones de adición
conjugada intramoleculares. La polimerización puede llevarse a cabo
a una temperatura que oscila desde 20ºC hasta 200ºC, preferiblemente
desde 40ºC hasta 100ºC, más preferiblemente desde 50ºC hasta 75ºC,
incluso más preferiblemente desde 50ºC hasta 60ºC. En una
realización particularmente preferida, la mezcla de reacción se
mantiene a 20ºC. En otra realización particularmente preferida, la
mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 50ºC. En
algunas realizaciones, la mezcla de reacción se calienta hasta
aproximadamente 56ºC. Aún en otra realización particularmente
preferida, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente
75ºC. La mezcla de reacción también puede enfriarse hasta
aproximadamente 0ºC. La reacción de polimerización también puede
estar catalizada tal como con un catalizador organometálico, ácido
o base. En otra realización preferida, pueden usarse uno o más tipos
de monómeros de amina y/o monómeros de diacrilato en la reacción de
polimerización. Por ejemplo, puede usarse una combinación de
etanolamina y etilamina para preparar un polímero más hidrófilo que
uno preparado usando etilamina sólo, y también más hidrófobo que
uno preparado usando etanolamina sólo.
Al preparar los polímeros de la presente
invención, los monómeros en la mezcla de reacción pueden combinarse
en una razón diferente para afectar al peso molecular, rendimiento,
terminación de extremos, etc. del polímero resultante. La razón de
monómeros de amina con respecto a monómeros de diacrilato puede
oscilar desde 1,6 hasta 0,4, preferiblemente desde 1,4 hasta 0,6,
más preferiblemente desde 1,2 hasta 0,8, incluso más preferiblemente
desde 1,1 hasta 0,9. En ciertas realizaciones, la razón de
monómeros de amina con respecto a monómeros de diacrilato es
aproximadamente de 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,050, 1,025, 1,0, 0,975,
0,950, 0,900, 0,800 y 0,600. Por ejemplo, combinar los monómeros a
una razón de 1:1 da como resultado normalmente polímeros de peso
molecular superior y rendimientos globales superiores. Además,
proporcionar un exceso de monómeros de amina (es decir, razón de
amina con respecto a acrilato > 1) da como resultado cadenas
terminadas en amina mientras que proporcionar un exceso de monómero
de acrilato (es decir, razón de amina con respecto a acrilato <
1) da como resultado cadenas terminadas en acrilato. La razón de
monómeros de amina con respecto a monómeros de acrilato en la
síntesis de polímeros puede afectar a cómo están terminadas las
cadenas de polímero, al peso molecular de los polímeros producidos,
a la distribución de pesos moleculares y al grado de
reticulación.
El polímero sintetizado puede purificarse
mediante cualquier técnica conocida en la técnica incluyendo, pero
sin limitarse a, precipitación, cristalización, extracción,
cromatografía, etc. En una realización particularmente preferida,
el polímero se purifica a través de precipitaciones repetidas en
disolvente orgánico (por ejemplo, dietil éter, hexano, etc.). En
una realización particularmente preferida, el polímero se aísla como
clorhidrato, fosfato, acetato u otra sal. Preferiblemente, la sal
es farmacéuticamente aceptable en ciertas realizaciones. El
polímero resultante también puede usarse tal como está sin
purificación ni aislamiento adicionales; haciendo ventajoso de ese
modo usar un disolvente compatible con los ensayos que van a usarse
en la evaluación de los polímeros. Por ejemplo, los polímeros
pueden prepararse en un disolvente no tóxico tal como DMSO, y la
disolución de polímero resultante puede usarse entonces en ensayos
de cultivo celular que implican transfectar un ácido nucleico en
una célula. Tal como apreciaría un experto en esta técnica, el peso
molecular del polímero sintetizado y el grado de reticulación
pueden determinarse mediante las condiciones de reacción (por
ejemplo, temperatura, materiales de partida, concentración,
equivalentes de amina, equivalentes de acrilato, orden de adición,
disolvente, etc.) usadas en la síntesis (Odian Principles in
Polimerization 3ª ed., Nueva York: John Wiley & Sons, 1991;
Stevens Polymer Chemistry: An Introduction 2ª ed., Nueva York:
Oxford University Press, 1990). El grado de reticulación del
polímero preparado puede minimizarse hasta entre el
1-20%, preferiblemente entre el
1-10%, más preferiblemente entre el
1-5% y lo más preferiblemente menos del 2%. Tal como
apreciarían los expertos en esta técnica, las aminas o los
bis(ésteres de acrilato) con grupos nucleófilos son más susceptibles
a la reticulación, y puede ser necesario tomar medidas para reducir
la reticulación tal como disminuir la temperatura o cambiar la
concentración de los materiales de partida en la mezcla de reacción.
Los acrilatos y otros restos con insaturación o halógenos son
también sensibles a la polimerización por radicales que puede
conducir a reticulación. El grado de polimerización por radicales y
reticulación puede reducirse reduciendo la temperatura de la mezcla
de reacción o mediante otros medios conocidos en la
técnica.
técnica.
En una realización, se prepara en paralelo una
biblioteca de diferentes polímeros. La síntesis de una biblioteca
de polímeros puede llevarse a cabo usando cualquiera de las
enseñanzas conocidas en la técnica o descritas en el presente
documento referentes a la síntesis de polímeros de la invención. En
una realización, se añade a cada vial una amina y/o bis(éster de
acrilato) diferentes a una razón de amina con respecto a acrilato
particular en un conjunto de viales usados para preparar la
biblioteca o a cada pocillo en una placa de múltiples pocillos (por
ejemplo, placa de 96 pocillos). En una realización, los monómeros se
diluyen hasta entre 0,1 M y 5 M, más preferiblemente de 0,5 M a 2 M
y lo más preferiblemente a aproximadamente 1,6 M, en un disolvente
orgánico tal como DMSO. Los monómeros pueden combinarse en una
razón diferente para afectar al peso molecular, rendimiento,
terminación de extremos, etc. Por ejemplo, combinar los monómeros a
una razón de 1:1 produce normalmente polímeros de peso molecular
superior y rendimientos globales superiores. Proporcionar un exceso
de monómero de amina da como resultado cadenas terminadas en amina
mientras que proporcionar un exceso de monómero de acrilato da como
resultado cadenas terminadas en acrilato. En algunas realizaciones,
no se usa disolvente en la síntesis del polímero. La serie de
viales o placa de múltiples pocillos se incuba a una temperatura y
durante un periodo de tiempo suficientes para permitir que se
produzca la polimerización de los monómeros tal como se describe en
el presente documento. En ciertas realizaciones preferidas, el
tiempo y la temperatura se eligen para efectuar una incorporación
casi completa (por ejemplo, 50% de conversión, 75% de conversión,
80% de conversión, 90% de conversión, 95% de conversión, >95% de
conversión, 98% de conversión, 99% de conversión o >99% de
conversión) de todo el monómero en polímero. La reacción de
polimerización puede llevarse a cabo a cualquier temperatura que
oscile desde 0ºC hasta 200ºC. En una realización, las mezclas de
reacción se incuban a aproximadamente 45ºC durante aproximadamente
5 días. En otra realización, las mezclas de reacción se incuban a
aproximadamente 56ºC durante aproximadamente 5 días. En otra
realización, las mezclas de reacción se incuban a aproximadamente
100ºC durante aproximadamente 5 horas. Los polímeros pueden aislarse
y purificarse entonces usando técnicas conocidas en la técnica, o
pueden usarse las disoluciones de polímeros resultantes sin
aislamiento ni purificación adicionales. En ciertas realizaciones,
se preparan más de 1000 polímeros diferentes en paralelo. En otras
realizaciones, se preparan más de 2000 polímeros diferentes en
paralelo. Todavía en otras realizaciones, se preparan más de 3000
polímeros diferentes en paralelo. Los polímeros pueden examinarse
entonces usando técnicas de alto rendimiento para identificar
polímeros con una característica deseada (por ejemplo, solubilidad
en agua, solubilidad a diferentes pH, solubilidad en diversos
disolventes orgánicos, capacidad para unirse a polinucleótidos,
capacidad para unirse a heparina, capacidad para unirse a moléculas
pequeñas, capacidad para formar micropartículas, capacidad para
aumentar la eficiencia de transfección, etc.). Los polímeros de la
invención pueden examinarse o usarse tras la síntesis sin
precipitación, purificación ni aislamiento adicionales del
polímero. El uso de un disolvente no tóxico tal como DMSO en la
síntesis de los polímeros permite el fácil manejo y uso de los
polímeros tras la síntesis del polímero. Por ejemplo, la disolución
de polímero en DMSO puede añadirse a un cultivo celular u otro
sistema vivo sin un efecto tóxico sobre las células. En ciertas
realizaciones, los polímeros pueden examinarse para determinar
propiedades o características útiles en terapia génica (por
ejemplo, capacidad para unirse a polinucleótidos, aumento en la
eficiencia de transfección, etc.). En otras realizaciones los
polímeros pueden examinarse para determinar propiedades o
características útiles en la técnica de la ingeniería de tejidos
(por ejemplo, capacidad para ayudar al crecimiento celular o
tisular, capacidad para promover la unión celular). En ciertas
realizaciones, los polímeros se sintetizan y se someten a ensayo
usando sistemas de manejo de fluidos robotizado y/o técnicas
semiautomatizadas.
semiautomatizadas.
Se conoce bien la capacidad de compuestos
catiónicos para interaccionar con polinucleótidos cargados
negativamente a través de interacciones electrostáticas. Se han
preparado polímeros catiónicos tales como poli(lisina) y
estudiado para determinar su capacidad para complejar
polinucleótidos. Sin embargo, los polímeros estudiados hasta la
fecha han incorporado aminas en los extremos terminales de aminas
accesibles o cadenas laterales conformacionalmente flexibles,
cortas (por ejemplo, poli(lisina)) en la superficie de
poliaminas esféricas o globulares (por ejemplo, dendrímeros de
PAMAM y PEI). Se cree que la interacción del polímero con el
polinucleótido impide al menos parcialmente la degradación del
polinucleótido. Neutralizando la carga en la estructura principal
del polinucleótido, el complejo neutro o ligeramente cargado
positivamente también puede pasar más fácilmente a través de
membranas hidrófobas (por ejemplo, citoplasmática, lisosómica,
endosómica, nuclear) de la célula. En una realización
particularmente preferida, el complejo está ligeramente cargado
positivamente. En otra realización particularmente preferida, el
complejo tiene un potencial \zeta positivo, más preferiblemente
el potencial \zeta es de entre +1 y +30. En ciertas realizaciones,
pueden usarse agentes tales como poli(ácido acrílico) (pAA),
poli(ácido aspártico), poli(ácido glutámico) o poli(ácido maleico)
para impedir la inhibición sérica de los complejos de
polinucleótido/polímero en células cultivadas en medios con suero
(Trubetskoy y otros, "Recharging cationic DNA complexes with
highly charged polianions for in vitro and in vivo
gene delivery" Gene Therapy 10:261-271,
2003).
2003).
Los
poli(\beta-amino-ésteres) de la presente
invención presentan aminas terciarias en la estructura principal
del polímero. Aunque estas aminas están más impedidas, están
disponibles para interaccionar con un polinucleótido. Los
polinucleótidos o derivados de los mismos se ponen en contacto con
los polímeros de la invención en condiciones adecuadas para formar
complejos de polinucleótido/polímero. En ciertas realizaciones, la
razón de nitrógeno en el polímero (N) con respecto a fosfato en el
polinucleótido es de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1,
45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1,
100:1, 110:1 o 120:1. En ciertas realizaciones, la razón de
polímero con respecto a ADN (p/p) es de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1,
30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1,
85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1 o 200:1.
El polímero está preferiblemente al menos parcialmente protonado
para formar un complejo con el polinucleótido cargado
negativamente. En una realización preferida, los complejos de
polinucleótido/polímero forman nanopartículas que son útiles en la
administración de polinucleótidos a células. En una realización
particularmente preferida, el diámetro de las nanopartículas oscila
desde 50-500 nm, más preferiblemente el diámetro de
las nanopartículas oscila desde 50-200 nm y lo más
preferiblemente desde 90-150 nm. Las nanopartículas
pueden estar asociadas con un agente de direccionamiento tal como
se describe a
continuación.
continuación.
En ciertas realizaciones, pueden añadirse otros
agentes a los complejos de
polinucleótido:poli(beta-amino-éster). En
ciertas realizaciones, se usa un agente
co-complejante. Se sabe que los agentes
co-complejantes se unen a polinucleótidos y/o
aumentan la eficiencia de transfección. Los agentes
co-complejantes tienen habitualmente una alta
densidad de nitrógeno. La polilisina (PLL) y la polietilenimina
(PEI) son dos ejemplos de agentes co-complejantes
poliméricos. La PLL tiene una razón de peso molecular con respecto a
átomo de nitrógeno de 65, y la PEI tiene una razón de peso
molecular con respecto a átomo de nitrógeno de 43. Cualquier
polímero con una razón de peso molecular con respecto a átomo de
nitrógeno en el intervalo de 10-100, preferiblemente
25-75, más preferiblemente 40-70,
puede ser útil como agente co-complejante. La
inclusión de un agente co-complejante en un
complejo puede permitir reducir la cantidad de
poli(beta-amino-éster) en el complejo. Esto
se hace particularmente importante si el
poli(beta-amino-éster) es citotóxico a
concentraciones superiores. En los complejos resultantes con
agentes co-complejantes, la razón de agente
co-complejante con respecto a polinucleótido (p/p)
puede oscilar desde 0 hasta 2,0, preferiblemente desde 0,1 hasta
1,2, más preferiblemente desde 0,1 hasta 0,6, e incluso más
preferiblemente desde 0,1 hasta
0,4.
0,4.
Las propiedades de transfección de diversos
complejos de la invención pueden determinarse mediante estudios de
transfección in vitro (por ejemplo, transfección de GFP en
células cultivadas) o en modelos animales. En ciertas
realizaciones, el complejo usado para la transfección se optimiza
para un tipo de célula particular, el polinucleótido que va a
administrarse, poli(beta-amino-éster), el
agente co-complejante (si se usa uno), el proceso
de enfermedad, el método de administración (por ejemplo, inhalación,
vía oral, vía parenteral, vía i.v., vía intratecal, etc.), el
régimen de dosificación, etc.
El polinucleótido que va a complejarse o
encapsularse mediante los polímeros de la invención puede ser
cualquier ácido nucleico incluyendo pero sin limitarse a ARN y ADN.
Los polinucleótidos pueden ser de cualquier tamaño o secuencia, y
pueden ser mono o bicatenarios. En ciertas realizaciones preferidas,
el polinucleótido es mayor de 100 pares de bases de longitud. En
otras ciertas realizaciones preferidas, el polinucleótido es mayor
de 1000 pares de bases de longitud y puede ser mayor de 10.000
pares de bases de longitud. El polinucleótido está preferiblemente
purificado y sustancialmente puro. Preferiblemente, el
polinucleótido tiene una pureza mayor del 50%, más preferiblemente
una pureza mayor del 75% y lo más preferiblemente una pureza mayor
del 95%. El polinucleótido puede proporcionarse mediante cualquier
medio conocido en la técnica. En ciertas realizaciones preferidas,
el polinucleótido se ha diseñado por ingeniería genética usando
técnicas recombinantes (para una descripción más detallada de estas
técnicas, véase Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular
Biology (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1999); Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., ed. por Sambrook, Fritsch, y
Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)). El
polinucleótido puede obtenerse también de fuentes naturales y
purificarse de componentes contaminantes encontrados normalmente en
la naturaleza. El polinucleótido también puede sintetizarse
químicamente en un laboratorio. En una realización preferida, el
polinucleótido se sintetiza usando química en fase sólida
convencional.
convencional.
El polinucleótido puede modificarse por medios
químicos o biológicos. En ciertas realizaciones preferidas, estas
modificaciones conducen a un aumento de estabilidad del
polinucleótido. Las modificaciones incluyen metilación,
fosforilación, ocupación de extremos, etc.
Pueden usarse también derivados de
polinucleótidos en la presente invención. Estos derivados incluyen
modificaciones en las bases, azúcares y/o enlaces fosfato del
polinucleótido. Las bases modificadas incluyen, pero no se limitan
a, las encontradas en los siguientes análogos de nucleósido:
2-aminoadenosina, 2-tiotimidina,
inosina, pirrolo-pirimidina,
3-metiladenosina, 5-metilcitidina,
C5-bromouridina, C5-fluorouridina,
C5-yodouridina,
C5-propinil-uridina,
C5-propinil-citidina,
C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina,
7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina,
8-oxoguanosina,
O(6)-metilguanina y
2-tiocitidina. Los azúcares modificados incluyen,
pero no se limitan a, 2'-fluororribosa, ribosa,
2'-desoxirribosa,
3'-azido-2',3'-didesoxirribosa,
2',3'-didesoxirribosa, arabinosa (el epímero 2' de
la ribosa), azúcares acíclicos y hexosas. Los nucleósidos pueden
unirse entre sí mediante enlaces distintos del enlace fosfodiéster
encontrado en ADN y ARN que se producen de manera natural. Los
enlaces modificados incluyen, pero no se limitan a, enlaces de
fosforotioato y 5'-N-fosforamidita.
Pueden usarse combinaciones de las diversas modificaciones en un
único polinucleótido. Estos polinucleótidos modificados pueden
proporcionarse mediante cualquier medio conocido en la técnica; sin
embargo, tal como apreciarán los expertos en esta técnica, los
polinucleótidos modificados se preparan preferiblemente usando
química sintética in vitro.
Los polinucleótidos que van a administrarse
pueden estar en cualquier forma. Por ejemplo, el polinucleótido
puede ser un plásmido circular, un plásmido linealizado, un cósmido,
un genoma viral, un genoma viral modificado, un cromosoma
artificial, etc.
El polinucleótido puede ser de cualquier
secuencia. En ciertas realizaciones preferidas, el polinucleótido
codifica para una proteína o un péptido. Las proteínas codificadas
pueden ser enzimas, proteínas estructurales, receptores, receptores
solubles, canales iónicos, proteínas farmacéuticamente activas,
citocinas, interleucinas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo,
factores de coagulación, albúmina, factores de crecimiento,
hormonas, insulina, etc. El polinucleótido puede comprender también
regiones reguladoras para controlar la expresión de un gen. Estas
regiones reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a,
promotores, elementos potenciadores, elementos represores, caja
TATA, sitios de unión ribosómicos, sitios de terminación para la
transcripción, etc. En otras realizaciones particularmente
preferidas, el polinucleótido no está destinado a codificar para
una proteína. Por ejemplo, el polinucleótido puede usarse para fijar
un error en el genoma de la célula que está transfectándose.
El polinucleótido también puede proporcionarse
como un agente antisentido o ARN de interferencia (ARNi) (Fire y
otros, Nature 391; 806-811, 1998).
La terapia antisentido pretende incluir, por
ejemplo, la administración o provisión in situ de
oligonucleótidos mono o bicatenarios o sus derivados que se
hibridan específicamente, por ejemplo, se unen, en condiciones
celulares, con ARNm celular y/o ADN genómico, o mutantes de los
mismos, de modo que inhiben la expresión de la proteína codificada,
por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción (Crooke
"Molecular mechanisms of action of antisense drugs" Biochim,
Biophys. Acta 1489(1):31-44, 1999; Crooke
"Evaluating the mechanism of action of antiproliferative
antisense drugs" Antisense Nucleic Acid Drug Dev.
10(2):123-126, discussion 127, 2000; Methods
in Enzymology volúmenes 313-314, 1999). La unión
puede ser mediante complementariedad de pares de bases convencional
o, por ejemplo, en el caso de la unión a dúplex de ADN, a través de
interacciones específicas en el surco mayor de la doble hélice (es
decir, formación de triple hélice) (Chan y otros, J. Mol. Med.
75(4):267-282,
1997).
1997).
En una realización particularmente preferida, el
polinucleótido que va a administrarse comprende una secuencia que
codifica para una proteína o un péptido antigénico. Pueden
administrarse nanopartículas que contienen estos polinucleótidos a
un individuo para inducir una respuesta inmunológica suficiente para
disminuir la posibilidad de una infección posterior y/o aliviar los
síntomas asociados con una infección de este tipo. El
polinucleótido de estas vacunas puede combinarse con interleucinas,
interferones, citocinas y adyuvantes tales como toxina del cólera,
alumbre, adyuvante de Freund, etc. Se conoce un gran número de
compuestos adyuvantes; los National Institutes of Health han
preparado un compendio útil de muchos de tales compuestos y puede
encontrarse en el sitio web
(http:/www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf; véase
también Allison Dev. Biol. Stand. 92:3-11, 1998;
Unkeless y otros, Annu. Rev. Immunol. 6:251-281,
1998; y Phillips y otros, Vaccine 10:151-158,
1992).
La proteína o los péptidos antigénicos
codificados por el polinucleótido pueden derivarse de organismos
bacterianos tales como Streptococccus pneumoniae, Haemophilus
influenzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes,
Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes, Bacillus
anthracis, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium
perfringens, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae,
Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi,
Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella
tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Legionella
pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae,
Treponema pallidum, Leptospirosis interrogans, Borrelia
burgdorferi, Camphylobacter jejuni y similares; de virus tales
como de la viruela, de la gripe A y B, virus sincitial respiratorio,
parainfluenza, del sarampión, VIH, de la varicela zóster, del
herpes simple 1 y 2, citomegalovirus, virus de
Epstein-Barr, rotavirus, rinovirus, adenovirus,
papilomavirus, poliovirus, de las paperas, de la rabia, de la
rubéola, virus de coxsackie, de la encefalitis equina, de la
encefalitis japonesa, de la fiebre amarilla, de la fiebre del valle
del Rift, virus de la hepatitis A, B, C, D y E, y similares; y de
organismos fúngicos, protozoarios y parasitarios tales como
Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida
albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia
ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial
psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum,
Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii,
Trichomonas vaginalis, Schistosoma mansoni, y similares.
Los
poli(\beta-amino-ésteres) de la presente
invención pueden usarse también para formar dispositivos de
administración de fármacos. Los polímeros de la invención pueden
usarse para encapsular agentes incluyendo polinucleótidos,
moléculas pequeñas, proteínas, péptidos, metales, compuestos
organometálicos, etc. Los polímeros de la invención tienen varias
propiedades que los hacen particularmente adecuados en la
preparación de dispositivos de administración de fármacos. Éstas
incluyen 1) la capacidad del polímero para complejar y
"proteger" agentes lábiles; 2) la capacidad para tamponar el
pH en el endosoma; 3) la capacidad para actuar como una "esponja
de protones" y provocar endosomolisis; y 4) la capacidad para
neutralizar la carga en agentes cargados negativamente. En una
realización preferida, los polímeros se usan para formar
micropartículas que contienen el agente que va a administrarse. En
una realización particularmente preferida, el diámetro de las
micropartículas oscila entre 500 nm y 50 micras, más
preferiblemente desde 1 micra hasta 20 micras y lo más
preferiblemente desde 1 micra hasta 10 micras. En otra realización
particularmente preferida, las micropartículas oscilan desde
1-5 micras. El polímero de encapsulación de la
invención puede combinarse con otros polímeros (por ejemplo, PEG,
PLGA) para formar las micro-
esferas.
esferas.
Las micropartículas de la invención pueden
prepararse usando cualquier método conocido en esta técnica. Éstos
incluyen, pero no se limitan a, secado por pulverización, emulsión
simple y doble emulsión - evaporación del disolvente, extracción
con disolvente, separación de fases, coacervación simple y compleja
y otros métodos bien conocidos por los expertos habituales en la
técnica. Métodos particularmente preferidos de preparación de las
partículas son el secado por pulverización y el procedimiento de
doble emulsión. Las condiciones usadas en la preparación de las
micropartículas pueden alterarse para producir partículas de una
propiedad o un tamaño deseado (por ejemplo, hidrofobicidad,
hidrofilicidad, morfología externa, "pegajosidad", forma,
etc.). El método de preparación de la partícula y las condiciones
(por ejemplo, disolvente, temperatura, concentración, velocidad de
flujo de aire, etc.) usados pueden depender también del agente que
está encapsulándose y/o de la composición de la matriz de
polímero.
polímero.
Se describen en la bibliografía métodos
desarrollados para preparar micropartículas para la administración
de agentes encapsulados (por ejemplo, véase Doubrow, M., Ed.,
"Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy",
CRC Press, Boca Raton, 1992; Mathiowitz y Langer, J. Controlled
Release 5:13-22, 1987; Mathiowitz y otros, Reactive
Polymers 6; 275-283, 1987; Mathiowitz y otros, J.
Appl. Polymer Sci. 35:755-774, 1988).
Si las partículas preparadas mediante cualquiera
de los métodos anteriores tienen un tamaño que oscila fuera del
intervalo deseado, las partículas pueden clasificarse por tamaños,
por ejemplo, usando un tamiz.
Los agentes que van a administrarse mediante el
sistema de la presente invención pueden ser agentes terapeúticos,
de diagnóstico o profilácticos. Cualquier compuesto químico que vaya
a administrarse a un individuo puede administrarse usando las
micropartículas de la invención. El agente puede ser una molécula
pequeña, un compuesto organometálico, un ácido nucleico, una
proteína, un péptido, un polinucleótido, un metal, un compuesto
químico marcado isotópicamente, un fármaco, una vacuna, un agente
inmunológico, etc.
En una realización preferida, los agentes son
compuestos orgánicos con actividad farmacéutica. En otra realización
de la invención, el agente es un fármaco usado clínicamente. En una
realización particularmente preferida, el fármaco es un
antibiótico, un agente antiviral, un anestésico, un agente
esteroideo, un agente antiinflamatorio, un agente antineoplásico,
un antígeno, una vacuna, un anticuerpo, un descongestivo, un
antihipertensor, un sedante, un agente anticonceptivo, un agente
progestacional, un anticolinérgico, un analgésico, un antidepresivo,
un antipsicótico, un agente bloqueante
\beta-adrenérgico, un diurético, un agente activo
cardiovascular, un agente vasoactivo, un agente antiinflamatorio no
esteroideo, un agente nutricional, etc.
En una realización preferida de la presente
invención, el agente que va a administrarse puede ser una mezcla de
agentes. Por ejemplo, puede administrarse un anestésico local en
combinación con un agente antiinflamatorio tal como un esteroide.
Pueden administrarse también anestésicos locales con agentes
vasoactivos tales como epinefrina. Para dar otro ejemplo, puede
combinarse un antibiótico con un inhibidor de la enzima producida
comúnmente por bacterias para inactivar el antibiótico (por ejemplo,
penicilina y ácido clavulánico).
Los agentes de diagnóstico incluyen gases;
metales; agentes de obtención de imágenes comercialmente disponibles
usados en tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía
asistida por ordenador (CAT), tomografía computerizada por emisión
de fotón único, rayos X, fluoroscopía y obtención de imágenes por
resonancia magnética (MRI); y agentes de contraste. Los ejemplos de
materiales adecuados para su uso como agentes de contraste en MRI
incluyen quelatos de gadolinio, así como hierro, magnesio,
manganeso, cobre y cromo. Los ejemplos de materiales útiles para la
obtención de imágenes por CAT y rayos X incluyen materiales a base
de yodo.
Los agentes profilácticos incluyen, pero no se
limitan a, antibióticos, complementos nutricionales y vacunas. Las
vacunas pueden comprender proteínas o péptidos aislados, virus y
organismos inactivados, virus y organismos muertos, virus u
organismos alterados genéticamente, y extractos celulares. Pueden
combinarse agentes profilácticos con interleucinas, interferones,
citocinas y adyuvantes tales como toxina del cólera, alumbre,
adyuvante de Freund, etc. Los agentes profilácticos incluyen
antígenos de organismos bacterianos tales como Streptococccus
pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyrogenes, Corynebacterium diphtheriae, Listeria
monocytogenes, Bacillus anthracis, Clostridium tetani, Clostridium
botulinum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis,
Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella typhi, Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis,
Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae,
Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
leprae, Treponema pallidum, Leptospirosis interrogans, Borrelia
burgdorferi, Camphylobacter jejuni, y similares; antígenos de
virus tales como de la viruela, de la gripe A y B, virus sincitial
respiratorio, parainfluenza, del sarampión, VIH, de la varicela
zóster, del herpes simple 1 y 2, citomegalovirus, virus de
Epstein-Barr, rotavirus, rinovirus, adenovirus,
papilomavirus, poliovirus, de las paperas, de la rabia, de la
rubéola, virus de coxsackie, de la encefalitis equina, de la
encefalitis japonesa, de la fiebre amarilla, de la fiebre del valle
del Rift, virus de la hepatitis A, B, C, D y E, y similares; y de
organismos fúngicos, protozoarios y parásitarios tales como
Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida
albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia
ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial
psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum,
Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii,
Trichomonas vaginalis, Schistosoma mansoni, y similares. Estos
antígenos pueden estar en forma de organismos completos muertos,
péptidos, proteínas, glicoproteínas, hidratos de carbono o
combinaciones de los
mismos.
mismos.
Las micro y nanopartículas de la invención
pueden modificarse para incluir agentes de direccionamiento puesto
que a menudo es deseable seleccionar como diana una célula,
colección de células o un tejido particular. Se conocen en la
técnica una variedad de agentes de direccionamiento que dirigen
composiciones farmacéuticas a células particulares (véase, por
ejemplo, Cotten y otros, Methods Enzym. 217:618, 1993). Los agentes
de direccionamiento pueden incluirse por toda la partícula o pueden
estar sólo en la superficie. El agente de direccionamiento puede
ser una proteína, un péptido, un hidrato de carbono, una
glicoproteína, un lípido, una molécula pequeña, etc. El agente de
direccionamiento puede usarse para seleccionar como diana células o
tejidos específicos o puede usarse para promover la endocitosis o
fagocitosis de la partícula. Los ejemplos de agentes de
direccionamiento incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos,
fragmentos de anticuerpos, lipoproteínas de baja densidad (LSL),
transferrina, asialicoproteínas, proteína de la envuelta gp120 del
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), hidratos de carbono,
ligandos de receptor, ácido siálico, etc. Si el agente de
direccionamiento se incluye por toda la partícula, el agente de
direccionamiento puede incluirse en la mezcla que se usa para
formar las partículas. Si el agente de direccionamiento está sólo en
la superficie, el agente de direccionamiento puede estar asociado
(por ejemplo, mediante interacciones covalentes, hidrófobas, por
enlaces de hidrógeno, de van der Waals u otras interacciones) con
las partículas formadas usando técnicas químicas convencionales.
Una vez que se han preparado las micropartículas
o nanopartículas (polímero complejado con polinucleótido), pueden
combinarse con uno o más excipientes farmacéuticos para formar una
composición farmacéutica que es adecuada para administrarse a
animales incluyendo seres humanos. Tal como apreciaría un experto en
esta técnica, los excipientes pueden elegirse basándose en la vía
de administración tal como se describe a continuación, el agente
que está administrándose, el transcurso de tiempo de la
administración del agente, etc.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención y para su uso según la presente invención pueden incluir
un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se
usa en el presente documento, la expresión "vehículo
farmacéuticamente aceptable" significa una carga, un diluyente,
un material de encapsulación o un adyuvante de formulación de
cualquier tipo no tóxico, inerte, sólido, semisólido o líquido.
Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos
farmacéuticamente aceptables son azúcares tales como lactosa,
glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón
de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa
de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo;
malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y
ceras de supositorio; aceites tales como aceite de cacahuete,
aceite de semilla de algodón; aceite de cártamo; aceite de sésamo;
aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tales
como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de
etilo; agar; detergentes tales como Tween 80; agentes tamponantes
tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido
algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica;
solución de Ringer; alcohol etílico; y también pueden estar
presentes soluciones de tampón fosfato, así como otros lubricantes
compatibles no tóxicos tales como laurilsulfato de sodio y
estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de
liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y
agentes de perfume, conservantes y antioxidantes, según el juicio
del formulador. Las composiciones farmacéuticas de esta invención
pueden administrarse a seres humanos y/o animales por vía oral, por
vía rectal, por vía parenteral, por vía intracisternal, por vía
intravaginal, por vía intranasal, por vía intraperitoneal, por vía
tópica (como mediante polvos, cremas, pomadas o gotas), por vía
bucal o como una pulverización oral o nasal.
Las formas farmacéuticas líquidas para
administración oral incluyen emulsiones, microemulsiones,
disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente
aceptables. Además de los principios activos (es decir,
micropartículas, nanopartículas, complejos de
polinucleótido/polímero), las formas farmacéuticas líquidas pueden
contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica tales
como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes de
solubilización y emulsionantes tales como alcohol etílico, alcohol
isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol
bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol,
1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en
particular, aceites de semilla de algodón, de cacahuete, de maíz, de
germen, de oliva, de ricino y de sésamo), glicerol, alcohol
tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos
de sorbitano, y mezclas de los mismos. Además de diluyentes
inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes
tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de
suspensión, edulcorantes, aromatizantes y agentes de perfume.
Pueden formularse preparaciones inyectables, por
ejemplo suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles
según la técnica conocida usando agentes de suspensión y agentes de
dispersión o humectantes adecuados. La preparación inyectable
estéril también puede ser una disolución, suspensión o emulsión
inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico
parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una disolución en
1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes
aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer,
disolución de cloruro de sodio isotónica y según la U.S.P. Además,
se emplean convencionalmente aceites fijados, estériles como
disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse
cualquier aceite fijado insípido incluyendo mono o diglicéridos
sintéticos. Además, se usan ácidos grasos tales como ácido oleico en
la preparación de inyectables. En una realización particularmente
preferida, las partículas se suspenden en un fluido vehículo que
comprende carboximetilcelulosa de sodio al 1% (p/v) y Tween 80 al
0,1% (v/v).
Las formulaciones inyectables pueden
esterilizarse, por ejemplo, mediante filtración a través de un
filtro que retiene bacterias, o incorporando agentes de
esterilización en forma de composiciones sólidas estériles que
pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio
inyectable estéril antes de su uso.
Las composiciones para administración rectal o
vaginal son preferiblemente supositorios que pueden prepararse
mezclando las partículas con vehículos o excipientes no irritantes
adecuados tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera
de supositorio que son sólidos a temperatura ambiente pero líquidos
a la temperatura corporal y por tanto se funden en la cavidad
rectal o vaginal y liberan las micropartículas.
Las formas farmacéuticas sólidas para
administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos
y gránulos. En tales formas farmacéuticas sólidas, las partículas
se mezclan con al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente
aceptable, inerte, tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio
y/o a) cargas o extendedores tales como almidones, lactosa,
sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, b) aglutinantes tales
como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina,
polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga, c) humectantes tales
como glicerol, d) agentes disgregantes tales como
agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o
tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio, e)
agentes retardantes de la disolución tales como parafina, f)
aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio
cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo,
alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales
como caolín y arcilla de bentonita, e i) lubricantes tales como
talco, estearato de calcio, estearato de magnesio,
polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los
mismos. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, la forma
farmacéutica también puede comprender agentes de tamponamiento.
También pueden emplearse composiciones sólidas
de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina llenas duras
y blandas usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche
así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Las formas farmacéuticas sólidas de comprimidos,
comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas, píldoras y gránulos
pueden prepararse con recubrimientos y vainas tales como
recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en
la técnica de formulación farmacéutica. Pueden contener
opcionalmente agentes opacificantes y también pueden ser de una
composición tal que liberan el/los principio(s)
activo(s) sólo, o preferentemente, en una cierta parte del
tubo digestivo, opcionalmente, de una manera retardada. Los ejemplos
de composiciones de incrustación que pueden usarse incluyen
sustancias poliméricas y ceras.
Pueden emplearse también composiciones sólidas
de un tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina llenas duras
y blandas usando excipientes tales como lactosa o azúcar de la leche
así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Las formas farmacéuticas para administración
tópica o transdérmica de una composición farmacéutica de la
invención incluyen pomadas, pastas, cremas, lociones, geles,
polvos, disoluciones, pulverizaciones, inhalantes o parches. Las
partículas se mezclan en condiciones estériles con un vehículo
farmacéuticamente aceptable y cualquier conservante o tampón
necesario según se requiera. Se contempla también que las
formulaciones oftálmicas, gotas para los oídos y gotas oculares
están dentro del alcance de esta invención.
Las pomadas, pastas, cremas y geles pueden
contener, además de las partículas de esta invención, excipientes
tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas,
almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles,
siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o
mezclas de los mismos.
Los polvos y pulverizaciones pueden contener,
además de las partículas de esta invención, excipientes tales como
lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de
calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Las
pulverizaciones pueden contener adicionalmente propelentes
habituales tales como clorofluorohidrocarburos.
Los parches transdérmicos tienen la ventaja
añadida de proporcionar la administración controlada de un compuesto
al organismo. Tales formas farmacéuticas pueden prepararse
disolviendo o dispensando las micropartículas o nanopartículas en
un medio apropiado. También pueden usarse potenciadores de la
absorción para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel.
La velocidad puede controlarse o bien proporcionando una membrana
de control de la velocidad o bien dispersando las partículas en un
gel o una matriz polimérica.
Éstos y otros aspectos de la presente invención
se apreciarán adicionalmente tras la consideración de los
siguientes ejemplos, que pretenden ilustrar ciertas realizaciones
particulares de la invención pero no pretenden limitar su alcance,
tal como se define mediante las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Consideraciones generales. Todas las
manipulaciones que implicaban células vivas o materiales estériles
se realizaron en un flujo laminar usando técnica estéril
convencional. Se registraron espectros de
^{1}H-RMN (300,100 MHz) y
^{13}C-RMN (75,467 MHz) en un espectrómetro Varian
Mercury. Todos los valores de desplazamientos químicos se dan en
ppm y se mencionan con respecto a una señal de carbono o protón
residual del disolvente. Se realizó la cromatografía de permeación
en gel (CPG) de la fase orgánica usando una bomba isocrática serie
1100 de Hewlett Packard, un inyector modelo 7125 de Rheodyne con un
bucle de inyección de 100 \mul y dos columnas
PL-Gel mixed-D en serie (5 \mum,
300 x 7,5 mm, Polymer Laboratories, Amherst, MA). Se usó
THF/piperidina 0,1 M como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0
ml/min. Se recogieron los datos usando un refractómetro
interferométrico Optilab DSP (Wyatt Technology, Santa Bárbara, CA) y
se procesaron usando el paquete informático TriSEC GPC (Viscotek
Corporation, Houston, TX). Los pesos moleculares y las
polidispersidades de los polímeros se notifican con respecto a
patrones de poliestireno monodispersados. La CPG de la fase acuosa
la realizó American Polymer Standards (Mentor, OH) usando columnas
Ultrahydrogel L y 120A en serie (Waters Corporation, Milford, MA).
Se usó agua (ácido acético al 1%, NaCl 0,3 M) como eluyente a una
velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Se recogieron los datos usando un
refractómetro diferencial Knauer y se procesaron usando un paquete
informático GPC-PRO 3.13 para IBM/PC (Viscotek
Corporaction, Houston, TX). Los pesos moleculares y las
polidispersidades de los polímeros se notifican con respecto a
patrones de poli(2-vinilpiridina). Para los
ensayos de citotoxicidad, se midió la absorbancia usando un lector
de microplacas MR5000 de Dynatech Laboratories a 560 nm.
Materiales. Se adquirieron
N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina y
4,4'-trimetilendipiperidina de Aldrich Chemical
Company (Milwaukee, WI). Se adquirió diacrilato de
1,4-butanodiol de Alfa Aesar Organics (Ward Hill,
MA). Se adquirió bromuro de
(3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio
(MTT) de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Se produjo ADN de
plásmido (pCMV-Luc) en E. coli (DH5\alpha,
un regalo por generosidad de Zycos, Inc., Cambridge, MA), se aisló
con un kit Qiagen, y se purificó mediante precipitación en etanol.
Se adquirieron células NIH 3T3 de la Colección Americana de Cultivos
Tipo (Manassas, VA) y se hicieron crecer a 37ºC, CO_{2} al 5% en
medio de Eagle modificado por Dulbecco, 90%; suero bovino fetal,
10%; penicilina, 100 unidades/ml; estreptomicina, 100 \mug/ml.
Todos los demás materiales y disolventes se usaron tal como se
recibieron sin purificación
adicional.
adicional.
Procedimiento de polimerización general.
En un experimento típico, se pesaron diacrilato de
1,4-butanodiol (0,750 g, 0,714 ml, 3,78 mmoles) y
diamina (3,78 mmoles) en dos viales separados y se disolvieron en
THF (5 ml). Se añadió la disolución que contenía la diamina a la
disolución de diacrilato por medio de una pipeta. Se añadió una
barra agitadora recubierta de teflón, se selló el vial con un tapón
de rosca revestido de teflón y se calentó la reacción a 50ºC. Tras
48 horas, se enfrió la reacción hasta temperatura ambiente y se
añadió mediante goteo lentamente agitando enérgicamente dietil éter
o hexanos. Se recogió el polímero y se secó a vacío antes del
análisis.
Síntesis del polímero 1. Se preparó el
polímero 1 según el procedimiento general resumido anteriormente.
^{1}H-RMN \delta (CDCl_{3}, 300 MHz) 4,11 (t
a, 4H), 2,75 (t a, J=7,05 Hz, 4 H), 2,53 (s a, 4H), 2,50 (t a,
(osc.), J=7,20 Hz, 4H), 2,28 (s a, 6H), 1,71, (m a, 4H),
^{13}C-RMN \delta (CDCl_{3}, 75,47 MHz)
172,55, 64,14, 55,31, 53,39, 42,47, 32,54,
25,53.
25,53.
Síntesis del polímero comparativo 2. Se
preparó el polímero 2 según el procedimiento general resumido
anteriormente. ^{1}H-RMN \delta (CDCl_{3},
300 MHz) 4,11 (t a, 4H), 2,74 (t a, J=7,35, 4H), 2,56 (m a, 12H),
1,71 (t a, 4H). ^{13}C-RMN \delta (CDCl_{3},
75,47 MHz) 172,24, 64,19, 53,55, 52,75, 32,27, 25,52.
Síntesis del polímero comparativo 2. Se
preparó el polímero 2 según el procedimiento general resumido
anteriormente. ^{1}H-RMN \delta (CDCl_{3},
300 MHz) 4,11 (t a, 4H), 3,00 (m a, 4H), 2,79 (m a, 4H), 2,65 (m a,
4H), 2,11 (m a, 4H), 1,70 (m a, 8H), 1,25 (m a, 12H).
^{13}C-RMN \delta (CDCl_{3}, 75,47 MHz)
172,37, 64,13, 53,89 (a), 36,74, 35,58, 32,11 (a), 25,45,
24,05.
Estudios de degradación de polímeros. Se
disolvieron las sales de clorhidrato de los polímeros
1-3 en tampón acetato (1 M, pH = 5,1) o tampón
HEPES (1 M, pH = 7,4) a una concentración de 5 mg/ml (el uso de
concentraciones milimolares de tampón dio como resultado una
reducción sustancial del pH durante la degradación debido a la
producción de productos de degradación ácidos). Se incubaron las
muestras a 37ºC en un rotor mecánico, y se extrajeron alícuotas (1
ml) a intervalos de tiempo apropiados. Se congelaron las alícuotas
inmediatamente en nitrógeno líquido y se liofilizaron. Se extrajo
el polímero de las sales de tampón secadas usando THF/piperidina
0,1 M (1 ml), y se analizaron las muestras directamente mediante
CPG.
Formación de complejos de ADN/polímero y
ensayos de retardo en gel de agarosa. Se formaron complejos de
ADN/polímero añadiendo 50 \mul de una disolución de ADN de
plásmido (pCMV Luc, 2 \mug/50 \mul en agua) a una disolución
con agitación suave con vórtex de la sal de clorhidrato de los
polímeros 1-3 (50 \mul en MES 25 mM, pH = 6,0,
concentraciones ajustadas para proporcionar la razones en peso
deseadas de ADN/polímero). Se incubaron las muestras a temperatura
ambiente durante 30 minutos, tras lo cual se hicieron pasar 20
\mul en un gel de agarosa al 1% (HEPES, 20 mM, pH = 7,2, 65 V, 30
min.). Se cargaron las muestras sobre el gel con un tampón de carga
que consistía en Ficoll 400 al 10% (Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Suecia) en HEPES (25 mM, pH = 7,2). No se incluyó azul de
bromofenol como indicador visual en el tampón de carga, puesto que
este colorante cargado parecía interferir con la complejación del
polímero y el ADN. Se visualizaron bandas de ADN bajo iluminación
UV mediante tinción con bromuro de etidio.
Dispersión de luz láser
cuasi-elástica (Quasi-Elastic Laser
Light Scattering) (QELS) y medición de los potenciales \zeta.
Se realizaron experimentos de QELS y mediciones del potencial
\zeta usando un detector de dispersión de luz dinámica ZetaPALS
(Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, láser de 15 mW,
haz incidente = 676 nm). Se formaron complejos de ADN/polímero tal
como se describió anteriormente para los ensayos de retardo en gel
de agarosa. Se diluyeron las muestras con 900 \mul de HEPES (20
mM, pH = 7,0), se añadieron a una muestra de complejo de
ADN/polímero con agitación suave con vórtex (volumen total = 1 ml,
pH = 7,0). Se determinaron los tamaños de partícula promedio y los
potenciales \zeta a 25ºC. Se recogieron funciones de correlación
a un ángulo de dispersión de 90º, y se calcularon los tamaños de
partícula usando la opción MAS del software de determinación de
tamaños de partícula de BIC (versión 2.30) usando la viscosidad y el
índice de refracción del agua pura a 25ºC. Los tamaños de partícula
se expresan como diámetros eficaces suponiendo una distribución
logarítmica normal. Se midieron las movilidades electroforéticas
promedio a 25ºC usando el software de análisis del potencial zeta
BIC PALS y se calcularon los potenciales zeta usando el modelo de
Smoluchowsky para suspensiones acuosas. Se realizaron tres
mediciones en cada muestra, y los resultados se notifican como
diámetros promedio y potenciales
zeta.
zeta.
Ensayos de citotoxicidad. Se hicieron
crecer células NIH 3T3 inmortalizadas en placas de 96 pocillos a una
densidad de siembra inicial de 10.000 células/pocillo en 200 \mul
de medio de crecimiento (medio de Eagle modificado por Dulbecco al
90%, suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 unidades/ml,
estreptomicina 100 \mug/ml). Se hicieron crecer las células
durante 24 horas, tras lo cual se retiró el medio de crecimiento y
se sustituyó por 180 \mul de medio libre de suero. Se añadieron
cantidades apropiadas de polímero en alícuotas de 20 \mul. Se
incubaron las muestras a 37ºC durante 5 horas y se determinó la
actividad metabólica de cada pocillo usando un ensayo de MTT/azul
de tiazolilo: a cada pocillo se le añadieron 25 \mul de una
disolución 5 mg/ml de disolución madre de MTT en tampón PBS
estéril. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 2 horas, y se
añadieron 100 \mul de tampón de extracción (SDS al 20% p/v en
DMF/agua (1:1), pH = 4,7) a cada pocillo. Se incubaron las muestras
a 37ºC durante 24 horas. Se midió la absorbancia óptica a 560 nm con
un lector de microplacas y se expresó como un porcentaje con
respecto a las células
control.
control.
La síntesis de
poli(amido-aminas) lineales que contenían
aminas terciarias en sus estructuras principales se notificó por
Ferruti y otros en 1970 por medio de la adición de aminas
bifuncionales a bisacrilamidas (Anderson Nature 392
(Supl.):25-30, 1996; Friedman Nature Med.
2:144-147, 1996; Crystal Science
270:404-410, 1995; Mulligan Science
260:926-932, 1993). Las
poli(amido-aminas) lineales se investigaron
inicialmente como heparina y biomateriales complejantes de iones
(Ferruti y otros, Advances in Polymer Science
58:55-92, 1984; Ferruti y otros, Biomaterials 15:
1235-1241, 1994; Ferruti y otros, Macromol Chem.
Phys. 200:1644-1654, 1999; Ferruti y otros,
Biomaterials 15:1235-1241, 1994). Se ha visto
aumentado el uso de poli(amido-aminas)
dendríticas (PAMAM) en aplicaciones de transferencia génica debido
a su capacidad para complejar ADN (Kukowska-Latallo
y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4897-4902,
1996; Tang y otros, Bioconjugate Chem. 7:703-714,
1996; Haensler y otros, Bioconjugate Chem.
4:372-379, 1993), y un informe reciente describe la
aplicación de una familia de
poli(amido-aminas) lineales en estudios de
citotoxicidad y transfección celular (Hill y otros, Biochim.
Biophys. Acta 1427:161-174, 1999). Por el
contrario, las poli(éster-aminas) análogas formadas
a partir de la adición de tipo Michael de aminas bifuncionales a
ésteres de diacrilato han recibido una menor atención (Danusso y
otros, Polymer 11:88-113, 1970; Ferruti y otros,
Polymer 26:1336, 1985; Ferruti y otros, Advances in Polymer Science
58:55-92, 1984; Ferruti y otros, Biomaterials 15;
1235-1241, 1994; Ferruti y otros, Macromol. Chem.
Phys. 200:1644-1654, 1999; Ferruti y otros,
Biomaterials 15:1235-1241, 1994; Kargina y otros,
Vysokomol. Soedin. Seriya A 28:1139-1144, 1986; Rao
y otros, J. Bioactive and Compatible Polymers
14:54-63, 1999).
El enfoque de poli(amino-éster) presenta
una base particularmente atractiva para el desarrollo de nuevos
vectores de transfección poliméricos por diversos motivos: 1) los
polímeros contienen las aminas requeridas y enlaces fácilmente
degradables, 2) posiblemente podrían sintetizarse múltiples análogos
directamente a partir de materiales de partida comercialmente
disponibles y 3) si los polímeros resultantes eran útiles como
agentes de condensación de ADN, podrían diseñarse fácilmente por
ingeniería genética futuras generaciones de polímero para presentar
valores de pK_{a} de amina que abarquen el intervalo de pH
fisiológicamente relevante. Este último punto era particularmente
interesante, debido a que la capacidad de tamponamiento de las
poliaminas se ha implicado recientemente como un factor que influye
en el escape de ADN de endosomas celulares tras la endocitosis
(Boussif y otros, Proc. Natl. Acad Sci. USA
92:7297-7301, 1995; Haensler y otros, Bioconjugate
Chem. 4:372-379, 1993; Behr Chimia
51:34-36, 1997; Demeneix y otros, en Artificial
Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner
y otros, Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996,
págs. 146-151; Kabanov y otros, en
Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From
Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York,
1998). Aunque se requiere la complejación de ADN con un polímero
catiónico para compactar y proteger el ADN durante acontecimientos
tempranos en el proceso de transfección, el ADN y el polímero deben
descomplejarse en última instancia en el núcleo para permitir una
transcripción eficaz (Luo y otros, Nat. Biotechnol,
18:33-37, 2000). En vista de este requisito, los
policationes degradables podrían desempeñar un papel importante en
acontecimientos de "desempaquetamiento de vectores" en el
núcleo (Luo y otros, Nat. Biotechnol. 18:33-37,
2000; Schaffer y otros, Biotechnol. Bioeng.
67:598-606, 2000; Kabanov Pharm. Sci. Technol. Today
2:365-372, 1999). Finalmente, se hace la hipótesis
de que los polímeros de esta estructura general, y los derivados de
\beta-aminoácido en los que supuestamente se
degradarían, serían significativamente menos tóxicos que la
poli(lisina) y PEI. Tal como se resumió anteriormente, los
policationes degradables (Putnam y otros, Macromolecules
32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc.
121:5633-5639, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc.
122:6524-6525, 2000) y los polímeros lineales que
contienen aminas relativamente impedidas ubicadas cerca de la
estructura principal del polímero (Gonzalez y otros, Bioconjugate
Chem. 10:1068-1074, 1999) son menos tóxicos que la
poli(lisina) y PEI.
Se investigó la síntesis de los polímeros
1-3 por medio de la adición de las bis(aminas
secundarias), N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina
y 4,4'-trimetilendipiperidina, a diacrilato de
1,4-butanodiol (Danusso y otros, Polymer 11:
88-113, 1970; Kargina y otros, Vysokomol. Soedin.
Seriya A 28:1139-1144, 1986).
La polimerización de estos monómeros tuvo lugar
en THF y CH_{2}Cl_{2} a 50ºC proporcionando los polímeros
correspondientes en rendimientos de hasta el 86% (tabla 1). Se
purificaron los polímeros a través de precipitación repetida en
dietil éter o hexano. Se aisló el polímero 1 como un líquido viscoso
transparente; se obtuvieron los polímeros 2 y 3 como sólidos
blancos tras secar a alto vacío. Alternativamente, los polímeros
1-3 pudieron aislarse como sales de clorhidrato
sólidas tras la adición de dietil éter/HCl a una disolución de
polímero en THF o CH_{2}Cl_{2}. Los tres polímeros eran
solubles en disolventes orgánicos tales como THF, CH_{2}Cl_{2},
CHCl_{3} y MeOH y también eran solubles en agua a pH reducido. El
polímero 1 y las sales de clorhidrato de los polímeros
1-3 eran abundantemente solubles en
agua.
agua.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los pesos moleculares de los polímeros
1-3 y sus correspondientes sales de clorhidrato se
determinaron mediante cromatografía de permeación en gel (CPG)
tanto de la fase orgánica como de la fase acuosa. Los pesos
moleculares de los polímeros (M_{n}) oscilaban desde 5.800 para
el polímero 1 hasta 32.000 para el polímero 3, con respecto a los
patrones de poliestireno. Las distribuciones del peso molecular para
estos polímeros eran monomodales con índices de polidispersidad
(PDI) que oscilaban desde 1,55 hasta 2,55. En la tabla 1 se
presentan datos de pesos moleculares representativos. Mientras que
la síntesis de poli(amido-aminas) lineales se
realiza generalmente usando alcoholes o agua como disolventes
(Danusso y otros, Polymer 11:88-113, 1970; Ferruti y
otros, Polymer 26:1336, 1985; Ferruti y otros, Advances in Polymer
Science 58:55-92, 1984; Ferruti y otros,
Biomaterials 15:1235-1241, 1994; Ferruti y otros,
Macromol. Chem. Phys. 200:1644-1654, 1999; Ferruti y
otros, Biomaterials 15:1235-1241, 1994), se
emplearon THF anhidro y CH_{2}Cl_{2} en la síntesis de
poli(\beta-amino-ésteres) para minimizar
las reacciones de hidrólisis durante la síntesis. Los rendimientos y
los pesos moleculares de los polímeros sintetizados empleando
CH_{2}Cl_{2} como disolvente fueron generalmente mayores que los
de los polímeros sintetizados en THF (tabla 1) (el polímero 1 no
pudo sintetizarse en CH_{2}Cl_{2}). El color de la disolución
de reacción evolucionó desde incoloro hasta un color rosa intenso
casi inmediatamente tras la introducción de una disolución de
N,N'-dimetiletilendiamina en CH_{2}Cl_{2} en una
disolución de diacrilato de 1,4-butanodiol en
CH_{2}Cl_{2} (véase la sección experimental anterior). El color
evolucionó hasta naranja claro a lo largo del transcurso de la
reacción, y se aisló un polímero naranja tras la precipitación en
hexano. El polímero aislado era insoluble en CH_{2}Cl_{2}, THF y
agua a pH reducido y no se caracterizó estructuralmente. Este
problema no se encontró para la reacción análoga en THF.).
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\vskip1.000000\baselineskip
Se confirmaron las estructuras de los polímeros
1-3 mediante espectroscopía de ^{1}H y
^{13}C-RMN. Estos datos indican que los polímeros
se formaron a través de la adición conjugada de las aminas
secundarias a los restos acrilato del diacrilato de
1,4-butanodiol y no a través de la formación de
enlaces amida en las presentes condiciones de reacción.
Adicionalmente, las aminas terciarias recién formadas en las
estructuras principales de polímero no participan en reacciones de
adición posteriores con monómero de diacrilato, lo que conduciría a
la ramificación o la reticulación del polímero. Este resultado
afortunado parece ser exclusivo de los polímeros de este tipo
producidos a partir de monómeros de bis(amina secundaria). La
síntesis de polímeros análogos empleando aminas primarias
bifuncionales como monómeros (tales como
1,4-diaminobutano) puede conducir a la ramificación
del polímero y a la formación de redes poliméricas reticuladas
insolubles si las condiciones no se controlan explícitamente.
En vista de la yuxtaposición de aminas y ésteres
dentro de las estructuras principales de los polímeros
1-3, inicialmente la preocupación era que la
hidrólisis pudiera producirse demasiado rápidamente para que los
polímeros tuvieran un uso práctico. Por ejemplo, poli(éster de
4-hidroxi-L-prolina)
y poli[ácido
\alpha-(4-aminobutil)-L-glicólico]
se degradan bastante rápidamente a pH casi neutro, teniendo
semividas de aproximadamente 2 h (Lim y otros, J. Am. Chem. Soc.
121:5633-5639, 1999) y 30 min. (Lim y otros, J. Am.
Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000), respectivamente
(tales tiempos de degradación rápidos no excluyeron la aplicación de
estos polímeros para la administración génica (véanse las
referencias, Lim y otros, J. Am. Chem. Soc.
121:5633-5639, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc.
122:6524-6525, 2000). Sin embargo, velocidades de
degradación extremadamente rápidas generalmente introducen
preocupaciones adicionales en cuanto a la manipulación, el
almacenamiento y la aplicación de polímeros degradables). Sin
embargo, el análisis de los polímeros 1 y 2 mediante CPG acuosa
usando ácido acético al 1%/agua como eluyente, reveló que la
degradación era suficientemente lenta en medios ácidos. Por ejemplo,
los perfiles de CPG de los polímeros 1 y 2 muestreados en estas
condiciones a lo largo de un periodo de 4 - 5 horas no revelaron
ningún cambio en los pesos moleculares o las polidispersidades (el
polímero 3 no pudo analizarse mediante CPG acuosa). También estaba
la preocupación de que pudiera producirse hidrólisis significativa
de la estructura principal durante el aislamiento de las sales de
clorhidrato de los polímeros 1-3. Para impedir la
hidrólisis durante la protonación y el aislamiento de estos
polímeros, se emplearon disolventes anhidro y se realizaron las
reacciones bajo una atmósfera de argón. El análisis de los polímeros
antes y después de la protonación no reveló hidrólisis observable.
Por ejemplo, el perfil de CPG de una muestra del polímero 3 tras
precipitación en CH_{2}Cl_{2} con dietil éter 1,0 M/HCl
(M_{n} = 15.300; PDI =1,90) era prácticamente idéntico al peso
molecular del polímero antes de la protonación (M_{n} = 15.700;
PDI = 1,92) y no se manifestó ninguna especie de menor peso
molecular (se recogieron datos de CPG comparativos empleando
THF/piperidina 0,1 M como eluyente (véase la sección experimental
anterior). Las sales de HCl de los polímeros eran insolubles en THF,
pero eran solubles en THF/piperidina 0,1 M concomitante con la
producción de un precipitado blanco fino que se filtró antes de la
inyección). Pudieron almacenarse muestras sólidas de los polímeros
1-3 durante varios meses sin disminuciones
detectables en el peso molecular.
Los polímeros 1-3 se diseñaron
específicamente para degradarse por medio de hidrólisis de los
enlaces éster en las estructuras principales de polímero. Sin
embargo, una preocupación adicional en cuanto a la estabilidad y la
biocompatibilidad globales de estos polímeros es el potencial para
que se produzca degradación no deseada a través de una reacción de
retro-Michael en condiciones fisiológicas. Debido a
que estos polímeros se sintetizaron por medio de la reacción de
tipo Michael de una amina secundaria con un éster de acrilato, es
posible que los polímeros pudieran experimentar una reacción de
retro-Michael para regenerar grupos acrilato libres,
particularmente en condiciones ácidas. Los ésteres de acrilato son
agentes alquilantes del ADN potenciales y, por tanto, son presuntos
carcinógenos (para ejemplos recientes, véase: Schweikl y otros,
Mutat. Res. 438:P71-P78, 1999; Yang y otros,
Carcinogenesis 19:P1117-P1125, 1998). Debido a que
se espera que estos polímeros se encuentren con el entorno de pH
reducido dentro de las vesículas endosómicas de las células (pH =
5,0 - 5,5) durante la transfección, se abordó el potencial para que
se produjera la degradación de estos polímeros a través de una ruta
de retro-Michael.
En condiciones extremadamente ácidas (pH < 3)
o básicas (pH > 12), los polímeros 1-3 se
degradan rápida y exclusivamente para dar
1,4-butanodiol y los subproductos de
bis(\beta-aminoácido) anticipados
4a-6a tal como se determina mediante espectroscopía
de ^{1}H-RMN. No se halló ninguna evidencia
espectroscópica de adición de retro-Michael en
estas condiciones. Cabe mencionar que sería menos probable que los
productos de degradación de
bis(\beta-aminoácido) 4a-6a
experimentaran una reacción de retro-Michael, ya que
los ácidos acrílicos son generalmente reactivos de la adición de
Michael menos activados (Perlmutter, P., en Conjugate Addition
Reactions in Organic Synthesis, Pergamon Press, Nueva York, 1992).
No se observó degradación adicional de los compuestos
4a-6a en estas
condiciones.
condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigó la cinética de la degradación de
polímero en la gama de condiciones que era posible que se
encontraran estos polímeros durante la transfección. Se monitorizó
la degradación a 37ºC a valores de pH tamponado de 5,1 y 7,4 con el
fin de aproximarse al pH de los entornos en el interior de vesículas
endosómicas y el citoplasma, respectivamente. Se añadieron las
sales de clorhidrato de los polímeros 1-3 al tampón
apropiado, se incubaron a 37ºC, y se extrajeron alícuotas en los
tiempos apropiados. Se congelaron las alícuotas inmediatamente, se
liofilizaron y se extrajo el polímero en THF/piperidina 0,1 M para
el análisis mediante CPG. La figura 1 muestra los perfiles de
degradación de los polímeros 1-3 como función del
tiempo. Los polímeros se degradaban más lentamente a pH 5,1 que a
pH 7,4. Los polímeros 1-3 mostraron perfiles de
degradación similares a pH 5,1, teniendo cada polímero una semivida
de aproximadamente 7-8 horas. Por el contrario, los
polímeros 1 y 3 se degradaron completamente en menos de 5 horas a
pH 7,4. Estos resultados concuerdan con los perfiles de
pH-degradación de otros poliésteres que contienen
amina, tales como poli(éster de
4-hidroxi-L-prolina),
en los que se hace la hipótesis de que las funcionalidades de amina
colgantes actúan como catalizadores nucleófilos intramoleculares y
contribuyan a una degradación más rápida a mayor pH (Lim y otros, J.
Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim y otros, J.
Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000). Aunque no puede
descartarse la posibilidad de ayuda intramolecular, es menos
probable para los polímeros 1-3 debido a que las
aminas terciarias en estos polímeros deben ser menos nucleófilas.
La degradación del polímero 2 se producía más lentamente a pH 7,4
que a pH 5,1 (figura 1). Este comportamiento anómalo se debe lo más
probablemente a la solubilidad incompleta del polímero 2 a pH 7,4 y
a la naturaleza heterogénea resultante del medio de degradación (los
polímeros 2 y 3 no son completamente solubles en agua a pH 7,4).
Aunque el polímero 3 se disolvió de manera relativamente rápida
durante el experimento de degradación, fueron visibles partículas
sólidas del polímero 2 durante varios días.
Se han estudiado ampliamente poli(lisina)
y PEI como agentes de condensación de ADN y vectores de transfección
(Luo y otros, Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Behr
Acc. Chem. Res. 26:274-278, 1993; Zauner y otros,
Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov y
otros, Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; Boussif y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301,
1995; Behr Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix y otros,
en Artificial Self-Assembling Systems for Gene
Delivery (Felgner y otros, Eds.), American Chemical Society,
Washington, D.C., 1996, págs. 146-151; Kabanov y
otros, en Self-Assembling Complexes for Gene
Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons,
Nueva York, 1998) y son los patrones con los que a menudo se
comparan nuevos vectores poliméricos (Putnam y otros,
Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J.
Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim y otros, J.
Am. Chem. Soc. 122: 6524-6525, 2000; Gonzalez y
otros, Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999).
Desafortunadamente, tal como se resumió anteriormente, estos
polímeros están asociados también con niveles significativos de
citotoxicidad y los altos niveles de expresión génica se realizan
habitualmente sólo con un coste sustancial para la viabilidad
celular. Para determinar el perfil de toxicidad de los polímeros
1-3, se realizó un ensayo de reducción con colorante
MTT/azul de tiazolilo usando la línea celular NIH 3T3 y las sales
de clorhidrato de los polímeros 1-3 como indicadores
iniciales. La línea celular 3T3 se emplea comúnmente como población
de examen de primer nivel para nuevos vectores de transfección, y el
ensayo de MTT se usa generalmente como indicador inicial de
citotoxicidad, ya que determina las influencias de las sustancias
añadidas sobre el metabolismo y crecimiento celulares (Hansen y
otros, Immunol. Methods 119: 203-210, 1989).
Se incubaron células con el polímero 1 (M_{n}
= 5.800), el polímero 2 (M_{n} =11.300) y el polímero 3 (M_{n}
= 22.500) tal como se describió en la sección experimental. Tal como
se muestra en la figura 2, las células incubadas con estos
polímeros permanecieron viables al 100% con respecto a los controles
a concentraciones de polímero de hasta 100 \mug/ml. Estos
resultados concuerdan extraordinariamente con los datos obtenidos
para poblaciones de células tratadas con PEI (M_{n} \approx
25.000), incluidas como control positivo para el presente ensayo
así como para facilitar la comparación con este agente de
transfección bien conocido. Menos del 30% de las células tratadas
con PEI siguieron siendo viables a una concentración de polímero de
25 \mug/ml, y la viabilidad celular fue de tan sólo un 10% a
mayores concentraciones de PEI en condiciones por lo demás
idénticas. Se realizó un ensayo de MTT análogo usando
bis(\beta-aminoácidos)
4a-6a sintetizados independientemente para examinar
la citotoxicidad de los productos de degradación hidrolítica de
estos polímeros. (Los
bis(\beta-aminoácidos)
4a-6a deben o bien ser biológicamente inertes o bien
presentar toxicidades leves o agudas que son inferiores que en los
vectores de transfección policatiónicos tradicionales. En cualquier
caso, la degradación de estos materiales debe facilitar un
aclaramiento metabólico rápido). Los compuestos
4a-6a y 1,4-butanodiol no
perturbaron el crecimiento celular ni el metabolismo en este ensayo
de examen inicial (datos no mostrados). No puede hacerse una
comparación más directa basada en la estructura/función entre los
polímeros 1-3 y PEI debido a diferencias en el peso
molecular y la estructura del polímero, contribuyendo ambos a la
toxicidad de los policationes. No obstante, los excelentes perfiles
de citotoxicidad de los polímeros 1-3 solos
sugirieron que eran candidatos interesantes para un estudio
adicional como agentes de condensación de
ADN.
ADN.
Se conoce bien la tendencia de las poliaminas
catiónicas a interaccionar electrostáticamente con la estructura
principal polianiónica del ADN en disolución acuosa. Siempre que los
polímeros estén suficientemente protonados a pH fisiológico, y que
las aminas sean estéricamente accesibles, tales interacciones pueden
dar como resultado un proceso de autoensamblaje en el que los
polímeros cargados negativa y positivamente forman conjugados bien
definidos (Kabanov y otros, en Self-Assembling
Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial,
John Wiley and Sons, Nueva York, 1998). La mayoría de las poliaminas
investigadas como agentes complejantes de ADN y vectores de
transfección han incorporado aminas en los extremos terminales de
cadenas laterales cortas, conformacionalmente flexibles (por
ejemplo, poli(lisina) y polímeros de
metacrilato/metacrilamida) (Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev.
30:97-113, 1998; Kabanov y otros, Bioconjugate Chem.
6: 7-20, 1995; van de Wetering y otros,
Bioconjugate Chem. 10:589-597, 1999), o aminas
accesibles sobre las superficies de poliaminas esféricas o
globulares (por ejemplo, dendrímeros de PEI y PAMAM) (Boussif y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301,
1995; Kukowska-Latallo y otros, Proc. Natl. Acad,
Sci. USA 93: 4897-4902, 1996; Tang y otros,
Bioconjugate Chem. 7.703-714, 1996; Haensler y
otros, Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993).
Debido a que los polímeros 1-3
contienen aminas terciarias, y esas aminas terciarias están ubicadas
en un entorno estéricamente ocupado (flanqueado en dos lados por
las estructuras principales de polímero), inicialmente la
preocupación era que las aminas protonadas no pudieran interaccionar
de manera suficientemente íntima con el
ADN.
ADN.
La capacidad de los polímeros
1-3 para complejar ADN de plásmido se demostró a
través de un ensayo de desplazamiento en gel de agarosa. La
electroforesis en gel de agarosa separa macromoléculas basándose
tanto en la carga como en el tamaño. Por tanto, la inmovilización
del ADN en un gel de agarosa en presencia de concentraciones
crecientes de un policatión se ha usado ampliamente como ensayo
para determinar el punto en el que se consigue la neutralización de
la carga del ADN completa (Putnam y otros, Macromolecules
32:3658-3662, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc.
121:5633-5639, 1999; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc.
122:6524-6525, 2000; Gonzalez y otros, Bioconjugate
Chem. 10:1068-1074, 1999). Tal como se mencionó
anteriormente, las sales de clorhidrato de los polímeros
1-3 son solubles en agua. Sin embargo, los
polímeros 2 y 3 no son completamente solubles a pH 7,2 a lo largo
del intervalo completo de concentraciones de polímero deseadas. Por
tanto, se prepararon complejos de ADN/polímero en tampón MES (25
mM, pH = 6,0). Se prepararon complejos de ADN/polímero añadiendo una
disolución acuosa de ADN a disoluciones con agitación con vórtex de
polímero en MES a concentraciones deseadas de ADN/polímero (véase
la sección experimental). Los complejos de ADN/polímero resultantes
siguieron siendo solubles tras la dilución en el tampón de
ejecución de electroforesis (HEPES 20 mM, pH = 7,2) y se obtuvieron
los datos a pH fisiológico. Como ejemplo representativo, la figura
3 representa la migración de ADN de plásmido
(pCMV-Luc) en un gel de agarosa en presencia de
concentraciones crecientes del polímero 1.
Tal como se muestra en la figura 3, el retardo
de la migración del ADN comienza a razones de ADN/1 de tan sólo
1:0,5 (p/p) y la migración se retarda completamente a razones de
ADN/polímero por encima de 1:1,0 (p/p) (en el presente documento se
notifican razones en peso de ADN/polímero en vez de razones de carga
de ADN/polímero. Aunque en la bibliografía se usan ambas
convenciones, se encuentra que las razones en peso son más prácticas
y universales, puesto que la carga global en una poliamina está
sometida a variaciones del entorno en el pH y la temperatura.
Aunque las razones de carga de ADN/polímero son descriptivas para
polímeros tales como poli(lisina), son menos significativas
para polímeros tales como PEI y 1-3 que incorporan
menos aminas básicas). Los polímeros 2 y 3 inhiben completamente la
migración del ADN de plásmido a razones (p/p) de ADN/polímero por
encima de 1:10 y 1:1,5, respectivamente (datos no mostrados). Estos
resultados varían notablemente con respecto a experimentos de
retardo en gel realizados usando "monómeros" modelo. Puesto que
los verdaderos monómeros y los productos de degradación de los
polímeros 1-3 no representan adecuadamente las
unidades de repetición de los polímeros, se usaron los
bis(metil-ésteres) 4b - 6b para examinar el grado en el que
son necesarias la polivalencia y la unión cooperativa de los
policationes 1-3 para lograr la inmovilización del
ADN. Los "monómeros" 4b - 6b no inhibieron la migración del
ADN a razones (p/p) de ADN/"monómero" de hasta 1:30 (datos
no
mostrados).
mostrados).
Los motivos para la complejación menos eficaz
empleando el polímero 2 en los ensayos de electroforesis en gel
anteriores resultan lo más probablemente de diferencias en los
valores de pK_{a} de las aminas en estos polímeros. La medición
directa de los valores de pK_{a} de los polímeros
1-3 es complicada por su degradabilidad. Sin
embargo, se predice que el intervalo de valores de pK_{a} de las
aminas en los polímeros 1 y 2 se extiende desde aproximadamente 4,5
y 8,0 para el polímero 1, hasta 3,0 y 7,0 para el polímero 2,
basándose en comparaciones con
poli(\beta-amino-amidas)
estructuralmente relacionadas. (Se han notificado los valores de
pK_{a} de
poli(\beta-amino-amidas)
estructuralmente relacionadas que contienen unidades de piperazina y
dimetiletilendiamina en sus estructuras principales. Barbucci y
otros, Polymer 21:81-85, 1980; Barbucci y otros,
Polymer 19:1329-1334, 1978; Barbucci y otros,
Macromolecules 14:1203-1209, 1981). Como resultado,
el polímero 2 debe protonarse en menor grado que el polímero 1 a pH
fisiológico o casi neutro y, por tanto, sería un agente de
condensación de ADN menos eficaz. El intervalo de valores de
pK_{a} para el polímero 3 debe ser mayor que el intervalo para
los polímeros 1 y 2 debido al aumento de distancia entre los átomos
de nitrógeno. Por consiguiente, el polímero 3 forma complejos con
ADN a concentraciones sustancialmente reducidas con respecto al
polímero 2.
Los ensayos de retardo en gel de agarosa son
útiles en la determinación del grado en el que los policationes
interaccionan con el ADN. Sin embargo, para ser agentes de
transfección útiles, los policationes deben poder autoensamblar
también ADN de plásmido para dar complejos de polímero/ADN
suficientemente pequeños como para entrar en una célula a través de
endocitosis. Para la mayoría de los tipos de células, este requisito
de tamaño es del orden de 200 nm o menos (Zauner y otros, Adv. Drug
Del. Rev. 30:97-113, 1998), aunque pueden acomodarse
también partículas más grandes (Demeneix y otros, en Artificial
Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Feigner
y otros, Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996,
págs. 146-151; Kabanov y otros, en
Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From
Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York,
1998). La capacidad de los polímeros 1-3 para
compactar ADN de plásmido para dar estructuras de tamaño
nanométrico se determinó mediante dispersión de luz láser
cuasi-elástica (QELS), y las cargas superficiales
relativas de los complejos resultantes se cuantificaron a través de
mediciones de potenciales \zeta. Las partículas de ADN/polímero
usadas para determinar el tamaño de partícula y las mediciones de
potenciales \zeta se formaron tal como se describió anteriormente
para ensayos de electroforesis en gel de agarosa y se diluyeron en
tampón HEPES 20 mM (pH = 7,0) para el análisis, tal como se
describió en la sección experimental.
El polímero 1 formó complejos con diámetros que
oscilaban desde 90-150 nm a razones de ADN/polímero
por encima de 1:2 (p/p), y el polímero 2 condensó ADN dando
partículas del orden de 60-125 nm a razones de
ADN/polímero por encima de 1:10. Estos resultados concuerdan con
los datos obtenidos a partir de los experimentos anteriores de
electroforesis en gel de agarosa. Sin embargo, las partículas en
estos experimentos se agregaron a lo largo de un periodo de horas
proporcionando complejos más grandes con diámetros en el intervalo
de 1-2 micras. La tendencia de estas partículas a
agregarse puede racionalizarse mediante los bajos potenciales
\zeta de las partículas de ADN/polímero observadas en estas
condiciones. Por ejemplo, los complejos formados a partir del
polímero 1 a razones de ADN/polímero por encima de 1:10 tenían
potenciales \zeta promedio de +4,51 (\pm0,50) mV. Los
potenciales \zeta de los complejos formados a partir del polímero
2 a razones de ADN/polímero por encima de 1:20 fueron inferiores,
alcanzando un valor limitante de +1,04 (0,57) mV. Estas diferencias
se correlacionan con los valores de pK_{a} estimados para estos
polímeros, ya que se esperaría que las superficies de las
partículas formadas a partir del polímero 1 estuvieran ligeramente
más protonadas que las partículas formadas a partir del polímero 2
a pH = 7,0.
El polímero 3 formó complejos con diámetros en
el intervalo de 50-150 nm a razones de ADN/polímero
por encima de 1:2. Como ejemplo representativo, la figura 4 muestra
los diámetros eficaces promedio de partículas formadas con el
polímero 3 como función de la concentración de polímero. Los
diámetros de las partículas variaban dentro del intervalo anterior
de experimento a experimento en condiciones por lo demás idénticas,
posiblemente debido a diferencias sutiles durante la agitación o la
adición de las disoluciones de ADN durante la formación de los
complejos. (El orden de adición de las disoluciones de polímero y de
ADN tuvo un impacto considerable sobre la naturaleza de los
complejos de ADN/polímero resultantes. Con el fin de formar
partículas pequeñas, por ejemplo, fue necesario añadir la
disolución de ADN a una disolución de polímero con agitación con
vórtex. Para los casos en los que se añadieron disoluciones de
polímero a ADN, sólo se observaron agregados de tamaño
micrométrico. Por tanto, es posible que las diferencias sutiles en
la agitación o la velocidad de adición pudieran ser responsables de
la variación en el tamaño de partícula). Los potenciales \zeta
para los complejos formados a partir del polímero 3 eran del orden
de +10 a +15 mV a razones de ADN/polímero por encima de 1:1, y los
complejos no se agregaron de manera extensa a lo largo de un periodo
de 18 horas (pH = 7, 25ºC). Los potenciales \zeta positivos de
estos complejos pueden ser significativos más allá del contexto de
estabilidad de partícula, ya que las cargas positivas netas en las
superficies de las partículas pueden desempeñar un papel en el
desencadenamiento de la endocitosis (Kabanov y otros, Bioconjugate
Chem. 6:7-20, 1995; Lim y otros, J. Am. Chem. Soc.
122:6524-6525, 2000; Behr Chimia
51:34-36, 1997; Demeneix y otros, en Artificial
Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner
y otros, Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996,
págs. 146-151; Kabanov y otros, en
Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From
Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York,
1998).
Las partículas formadas a partir del polímero 3
también eran relativamente estables a 37ºC. Por ejemplo, se incubó
una muestra de ADN/3 (ADN/3 = 1:5, diámetro promedio = 83 nm) a 37ºC
durante 4 horas. Tras 4 horas, se observó una distribución bimodal
que consistía en una fracción con un promedio de 78 nm (>98% en
número, 70% en volumen) y una fracción de agregados más grandes con
diámetros promedio de aproximadamente 2,6 micras. Estos resultados
sugieren que la degradación de complejos formados a partir del
polímero 3 se producía más lentamente que la degradación del
polímero en disolución, o que la degradación parcial no afectaba
significativamente a la estabilidad de las partículas. También se
ha observado la estabilidad aparentemente aumentada de los
complejos de ADN/polímero formados a partir de policationes
degradables con respecto a la degradación de los polímeros en
disolución para complejos de ADN/polímero formados a partir de
poli(éster de
4-hidroxi-L-prolina)
(Lim y otros, J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639,
1999).
Los datos de tamaños de partícula y potenciales
\zeta en las figuras 4 y 5 concuerdan con modelos de condensación
de ADN observados con otros policationes (Kabanov y otros,
Bioconjugate Chem. 6; 7-20, 1995; Putnam y otros,
Macromolecules 32: 3658-3662, 1999; Lim y otros, J.
Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim y otros, J.
Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Gonzalez y
otros, Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999). El
ADN se compacta para dar partículas pequeñas cargadas negativamente
a concentraciones de polímero muy bajas y los tamaños de partícula
aumentan con la concentración de polímero creciente. (No pudieron
obtenerse datos exactos de dispersión de luz para especies
asociadas a ADN solo o ADN/polímero a razones de ADN/polímero
inferiores a 1:0,5, puesto que el ADN flexible, no condensado no
dispersa la luz de manera tan extensa como el ADN compactado
(Kabanov y otros, en Self-Assembling Complexes for
Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and
Sons, Nueva York, 1998). Los complejos alcanzan un diámetro máximo a
medida que se logra la neutralidad de carga y se produce la
agregación. Los tamaños de partícula disminuyen bruscamente a
concentraciones de ADN/polímero por encima de la neutralidad de
carga hasta las razones a las que el polímero adicional no
contribuye a una reducción en el diámetro de partícula. Este modelo
se confirma mediante mediciones de los potenciales \zeta
realizadas en complejos formados a partir de estos polímeros. Tal
como se muestra en la figura 5, los potenciales \zeta de
partículas de polímero/ADN formadas a partir del polímero 3 fueron
negativos a concentraciones de polímero bajas y la neutralidad de
carga se logró cerca de razones de ADN/polímero de 1:0,75, dando
como resultado una agregación extensa. Los potenciales \zeta de
las partículas se aproximaban a un valor limitante que oscilaba
desde +10 hasta +15 mV a razones de ADN/polímero por encima de
1:2.
Los diámetros promedio de los complejos
descritos anteriormente entran dentro de los requisitos generales
de tamaño para la endocitosis celular. Se han iniciado experimentos
de transfección empleando la línea celular NIH 3T3 y el gen
indicador de luciferasa (pCMV-Luc). Hasta ahora, los
polímeros 1 y 2 no han mostrado ninguna actividad de transfección
en los ensayos de examen iniciales. Por el contrario, el polímero 3
ha demostrado eficiencias de transfección que superan las de PEI en
ciertas condiciones. Se realizaron experimentos de transfección
según el siguiente protocolo general: Se hicieron crecer células en
placas de 6 pocillos a una densidad de siembra inicial de 100.000
células/pocillo en 2 ml de medio de crecimiento. Se hicieron crecer
las células durante 24 horas tras lo cual se retiró el medio de
crecimiento y se sustituyó por 2 ml de medio libre de suero. Se
formaron complejos de ADN/polímero tal como se describió en la
sección experimental [2 \mug de ADN, ADN/3 = 1:2 (p/p), 100
\mul en MES (pH = 6,0)] y se añadieron a cada pocillo. Se formaron
complejos de ADN/PEI a una razón en peso de 1:0,75, una razón que
se halló generalmente en el laboratorio que era óptima para
transfecciones de PEI. Se llevaron a cabo las transfecciones en
medio libre de suero durante 4 horas, tras lo cual se sustituyó el
medio por medio de crecimiento durante 20 horas adicionales. Se
determinaron las eficiencias de transfección relativas usando kits
de ensayo de proteína celular (Pierce) y de luciferasa (Promega).
Los resultados se expresan como unidades relativas de luz (URL) por
mg de proteína celular total: para complejos del polímero 3, 1,07
(\pm43) x 10^{6} URL/mg; para complejos de PEI, 8,07 (\pm16)
x10^{5} URL/mg). No se detectó expresión de luciferasa para los
experimentos control empleando ADN desnudo o realizados en ausencia
de ADN. Estos datos de transfección son los resultados de
experimentos de examen iniciales. Estos datos sugieren que los
polímeros de esta estructura general tienen potencial como vectores
sintéticos para la administración génica y son candidatos
interesantes para un estudio adicional. La eficacia relativa del
polímero 3 con respecto a PEI es interesante ya que los presentes
experimentos de examen iniciales se realizaron en ausencia de
cloroquina y el polímero 3 no incorpora actualmente un medio obvio
para facilitar el escape endosómico. Sin embargo, debe observarse
que los valores de pK_{a} de las aminas en estos polímeros pueden
"afinarse" para entrar más directamente dentro del intervalo de
pH fisiológicamente relevante usando este enfoque sintético
modular. Por tanto, será posible modificar por ingeniería genética
adicionalmente el carácter de "esponja de protones" (Behr
Chimia 51:34-36,1997; Demeneix y otros, en
Artificial Self-Assembling Systems for Gene
Delivery (Felgner y otros, Eds.), American Chemical Society,
Washington, D.C., 1996, págs. 146-151; Kabanov y
otros, en Self-Assembling Complexes for Gene
Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons,
Nueva York, 1998) de estos polímeros y, por tanto, potenciar sus
eficiencias de transfección, directamente a través de la
incorporación de o la copolimerización con diferentes monómeros de
diamina.
Se notifica una estrategia general para la
preparación de nuevos vectores de transfección de ADN poliméricos
degradables. Se sintetizaron los
poli(\beta-amino-ésteres)
1-3 por medio de la adición conjugada de
N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina y
4,4'-trimetilendipiperidina a diacrilato de
1,4-butanodiol. Las aminas en los monómeros de
bis(amina secundaria) participan activamente en los procesos
de formación de enlaces durante la polimerización, obviando la
necesidad de procesos de protección/desprotección de amina que
caracterizan la síntesis de otros poli(amino-ésteres). Por
consiguiente, este enfoque permite la generación de una variedad de
poliésteres estructuralmente diversos que contienen aminas
terciarias en sus estructuras principales en una sola etapa a partir
de materiales de partida comercialmente disponibles. Los polímeros
1-3 se degradaban hidrolíticamente en medios ácidos
y alcalinos proporcionando 1,4-butanodiol y los
\beta-aminoácidos 4a-6a y se
investigó la cinética de degradación a pH 5,1 y 7,4. Los polímeros
se degradaban más rápidamente a pH 7,4 que a pH 5,1, concordando con
los perfiles de pH/degradación notificados para otros
poli(amino-ésteres). Un ensayo de examen inicial diseñado
para determinar los efectos de los polímeros 1-3
sobre el metabolismo y crecimiento celulares sugirió que estos
polímeros y sus productos de degradación hidrolítica no eran
citotóxicos con respecto a PEI, un polímero catiónico no degradable
empleado convencionalmente como vector de transfección.
Los polímeros 1-3
interaccionaban electrostáticamente con ADN de plásmido a pH
fisiológico, iniciando procesos de autoensamblaje que daban como
resultado complejos de ADN/polímero a escala nanométrica. Se usaron
electroforesis en gel de agarosa, dispersión de luz dinámica
cuasi-elástica (QEIS) y mediciones de potenciales
zeta para determinar el grado de las interacciones entre los
polielectrolitos con cargas opuestas. Se encontró que los tres
polímeros condensaban ADN dando partículas de ADN/polímero solubles
del orden de 50-200 nm. Las partículas formadas a
partir de los polímeros 1 y 2 se agregaron de manera extensa,
mientras que las partículas formadas a partir del polímero 3
mostraron potenciales \zeta positivos (por ejemplo, de +10 a +15
mV) y no se agregaron durante hasta 18 horas. Las dimensiones de
tamaño nanométrico y las citotoxicidades reducidas de estos
complejos de ADN/polímero sugieren que los polímeros
1-3 pueden ser útiles como vectores de transfección
génica poliméricos degradables. Una perfecta comprensión de las
relaciones estructura/actividad existentes para esta clase de
polímero acelerará el diseño de alternativas a base de polímeros más
seguras con respecto a vectores de transfección virales para
terapia
génica.
génica.
Ejemplo
2
Fabricación de microesferas. Se realizó
el procedimiento optimizado para la fabricación de microesferas de
la siguiente manera general: se suspendió una disolución acuosa de
dextrano conjugado con rodamina (200 \mul de una disolución 10
\mug/\mul, M_{n} \approx 70 kD) en una disolución de
poli-1 en CH_{2}Cl_{2} (200 mg de
poli-1 en 4 ml de CH_{2}Cl_{2}, M_{n}
\approx 10 kD), y se sonicó la mezcla durante 10 segundos
formando una emulsión primaria. Se añadió la emulsión rosa turbio
directamente a una disolución rápidamente homogeneizada (5.000 rpm)
de poli(alcohol vinílico) [50 ml, PVA al 1% (p/p)] formando
la emulsión secundaria. Se homogeneizó la emulsión secundaria
durante 30 segundos antes de añadirla a una segunda disolución
acuosa de PVA [100 ml, PVA al 0,5% (p/p)]. El análisis directo de
la suspensión de microesferas usando un analizador de
micropartículas Coulter reveló un tamaño de partícula medio de
aproximadamente 5 micrómetros. Se agitó la emulsión secundaria
durante 2,5 horas a temperatura ambiente, se transfirió a una sala
fría (4ºC) y se agitó durante 30 minutos adicionales. Se aislaron
las microesferas a 4ºC por medio de centrifugación, se
resuspendieron en agua fría y se centrifugaron de nuevo para
eliminar el PVA en exceso. Se resuspendieron las esferas en agua
(15 ml) y se liofilizaron proporcionando un polvo rosa esponjoso. Se
realizó la caracterización de las microesferas liofilizadas
mediante microscopías óptica, de fluorescencia y electrónica de
barrido tal como se describe. Se determinó el potencial zeta usando
un analizador ZetaPALS de Brookhaven
Instruments.
Instruments.
Las micropartículas formadas a partir de
polímeros biodegradables son atractivas para su uso como
dispositivos de administración, y se ha empleado una variedad de
microesferas a base de polímero para la liberación sostenida de
compuestos terapéuticos (Anderson Nature 392 (supl.):
25-30, 1996; Friedman Nature Med. 2;
144-147, 1996; Crystal Science
270:404-410, 1995; Mulligan Science
260:926-932, 1993; Luo y otros, Nat. Biotechnol.
18:33-37, 2000; Behr Acc. Chem. Res.
26:274-278, 1993). Sin embargo, para compuestos
terapéuticos a base de moléculas pequeñas, proteínas y ADN que
requieren administración intracelular y traslado hasta el
citoplasma, existe una demanda creciente de nuevos materiales que
faciliten la liberación desencadenada en respuesta a estímulos
ambientales tales como pH (Zauner y otros, Adv. Drug Del. Rev.
30:97-113, 1998). Tras la endocitosis, se reduce el
pH dentro de los compartimentos endosómicos celulares, y el material
extraño se degrada tras la fusión con vesículas lisosómicas
(Kabanov y otros, Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995).
Nuevos materiales que liberan cargas útiles moleculares tras
cambios en el pH dentro del intervalo intracelular y facilitan el
escape de entornos intracelulares hostiles podrían tener un impacto
fundamental y de amplio alcance sobre la administración de fármacos
hidrolítica y/o enzimáticamente lábiles (Zauner y otros, Adv. Drug
Del. Rev. 30: 97-113, 1998; Kabanov y otros,
Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995). En el presente
documento, se notifica la fabricación de microesferas de polímero
sensibles al pH que liberan el contenido encapsulado cuantitativa y
esencialmente de manera instantánea tras cambios en el pH dentro
del intervalo
intracelular.
intracelular.
La síntesis del
poli(\beta-amino-éster) 1 se ha descrito
anteriormente en el ejemplo 1 (Miller Angew. Chem. Int. Ed.
37:1768-1785,1998; Hope y otros, Molecular Membrane
Technology 15:1-14, 1998; Deshmukh y otros, New J.
Chem. 21: 113-124, 1997). Poli-1 es
hidrolíticamente degradable, no fue citotóxico en ensayos de examen
iniciales y actualmente está en investigación como vector sintético
para la administración de ADN en aplicaciones de terapia génica. La
solubilidad del polímero en medios acuosos se ve influida
directamente por el pH de la disolución. Específicamente, el
polímero sólido, no protonado, es insoluble en medios acuosos en el
intervalo de pH de 7,0 a 7,4, y la transición entre solubilidad e
insolubilidad se produce a un pH de alrededor de 6,5. Basándose en
las diferencias entre pH extracelular y endosómico (7,4 y 5,0 - 6,5,
respectivamente), se hace la hipótesis de que las microesferas
formadas a partir de poli-1 podrían ser útiles para
la encapsulación y la liberación desencadenada de compuestos dentro
del intervalo de pH intracelular.
La encapsulación de compuestos terapéuticos
dentro de microesferas de polímero se logra a menudo empleando un
proceso de doble emulsión (O'Donnell y otros, Adv. Drug Delivery
Rev. 28:25-42, 1997). El proceso de doble emulsión
está bien establecido para la fabricación de microesferas a partir
de polímeros hidrófobos tales como poli(ácido
láctico-co-glicólico) (PLGA), un
polímero biodegradable empleado convencionalmente en el desarrollo
de dispositivos de administración de fármacos (Anderson y otros,
Adv. Drug Delivery Rev, 28:5-24, 1997; Okada Adv.
Drug Delivery Rev. 28:43-70, 1997). Experimentos
preliminares demostraron la viabilidad del proceso de doble
emulsión para la encapsulación de compuestos solubles en agua usando
poli-1. Se eligió dextrano conjugado con rodamina
como modelo para estudios posteriores de encapsulación y liberación
por diversos motivos: 1) la rodamina es fluorescente, permitiendo
que se determinen perfiles de carga y de liberación mediante
espectroscopía de fluorescencia, 2) podían obtenerse imágenes de
las microesferas cargadas directamente mediante microscopía de
fluorescencia y 3) la intensidad de fluorescencia de la rodamina no
se ve relativamente afectada por el pH dentro del intervalo
fisiológico (Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research
Chemicals, 6ª ed., Molecular Probes, Inc., 1996, pág.
29).
29).
Se fabricaron microesferas que encapsulaban
dextrano marcado a partir de poli-1, y se compararon
con los controles formados a partir de PLGA. Las distribuciones de
tamaño de las microesferas formadas a partir de
poli-1 se correlacionaban bien con las
distribuciones de las microesferas de PLGA dentro del intervalo de
5-30 \mum. Los tamaños de partícula promedio
podían controlarse mediante variaciones en parámetros experimentales
tales como las velocidades de homogenización y las razones de
disolvente acuoso/orgánico (O'Donnell y otros, Adv. Drug Delivery
Rev. 28:25-42, 1997). Al contrario que las
microesferas de PLGA, sin embargo, las esferas formadas a partir de
poli-1 se agregaban de manera extensa durante las
etapas de centrifugación y lavado (véase la sección experimental
anterior). Las microesferas resuspendidas a pH 7,4 consistían
principalmente en agregados grandes, y las imágenes de microscopía
electrónica de barrido (MEB) revelaron agrupaciones de esferas que
parecían estar unidas o "soldadas" físicamente (datos no
mostrados).
Se encontró que la agregación podía limitarse si
la centrifugación y el lavado se realizaban a temperaturas
reducidas (4ºC), presumiblemente debido al endurecimiento de las
esferas de polímero a esta menor temperatura. Las imágenes de MEB
de microesferas de poli-1 cargadas con dextrano
preparadas en el intervalo de 8-10 \mum revelaron
fracturas significativas y la formación de grandes orificios en sus
superficies. Las microesferas seleccionadas en el intervalo de
4-6 \mum, sin embargo, estaban esencialmente
libres de grietas, orificios y otros defectos (figura 6). Se
fabricaron microesferas formuladas para experimentos de liberación
posteriores en el intervalo menor (< 6 \mum). Las eficiencias
de encapsulación para microesferas de poli-1
cargadas, determinadas disolviendo las esferas a pH 5,1 y midiendo
la intensidad de fluorescencia, fueron de tanto como el 53%.
Las suspensiones de microesferas de
poli-1 secadas a pH = 7,4 consistían principalmente
en microesferas individuales, aisladas, tal como se determina
mediante microscopía óptica y de fluorescencia (figura 8a). El
potencial zeta (\zeta) de las suspensiones de micropartículas de
microesferas de poli-1 a pH 7 fue de +3,75
(\pm0,62) mV, lo que sugiere que las superficies de las
microesferas portan una carga positiva global a pH fisiológico.
Esto podría ser relevante para la selección de estas microesferas
para la captación celular, debido a que cargas positivas netas en
las superficies de las partículas pueden desempeñar un papel en el
desencadenamiento de la endocitosis (Zauner y otros, Adv. Drug
Delivery Rev. 30:97-113, 1998).
Las microesferas de poli-1
suspendidas a pH 7,4 siguieron siendo estables frente a la
agregación y la degradación durante varias semanas (mediante
inspección visual), pero las microesferas se disolvieron
instantáneamente cuando el pH del medio de suspensión se redujo a
entre 5,1 y 6,5.
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\vskip1.000000\baselineskip
La liberación de dextrano marcado a partir de
microesferas de poli-1 se determinó
cuantitativamente mediante microscopía de fluorescencia (figura 7).
El perfil de liberación a pH 7,4 se caracterizaba por una pequeña
ráfaga inicial en fluorescencia (7-8%) que alcanzó
un valor limitante de aproximadamente el 15% tras 48 horas. Este
experimento demostró que la degradación de poli-1
era relativamente lenta en estas condiciones y que podía retenerse
más del 90% de material encapsulado en la matriz de polímero durante
periodos de tiempo adecuadamente largos a pH
fisiológico.
fisiológico.
Para examinar la aplicación de microesferas de
poli-1 en la liberación desencadenada de fármacos
encapsulados en el intervalo de pH endosómico, se realizó un
experimento similar en el que el pH del medio de suspensión se
cambió desde 7,4 hasta 5,1 durante el transcurso del experimento.
Tal como se muestra en la figura 7, las microesferas se disolvieron
rápidamente cuando el tampón de suspensión se intercambió por tampón
acetato (0,1 M, pH = 5,1), dando como resultado una liberación
esencialmente instantánea y cuantitativa del dextrano marcado que
permanecía en las matrices de polímero. Muy al contrario, la
liberación a partir de microesferas de PLGA cargadas con dextrano
no aumentó durante hasta 24 horas después de que se redujera el pH
del medio de suspensión (figura 7). La figura 8 muestra imágenes de
microscopía de fluorescencia de: (a) una muestra de microesferas
cargadas con dextrano a pH 7,4; y (b) una muestra a la que se añadió
una gota de tampón acetato en el borde superior derecho del
cubreobjetos del microscopio. La rápida liberación de dextrano
conjugado con rodamina se visualizó como rayas que se extendían
desde las microesferas que se disolvían en la dirección de la
difusión del ácido añadido y un aumento global en la fluorescencia
del fondo (tiempo transcurrido \approx 5 segundos).
Cuando se seleccionan compuestos terapéuticos
para administración intracelular por medio de endocitosis o
fagocitosis, no sólo es importante considerar un medio mediante el
que el fármaco pueda liberarse de su vehículo, sino también un
medio mediante el que el fármaco pueda escapar de los compartimentos
endosómicos antes de enviarse a vesículas lisosómicas (Luo y otros,
Nat. Biotechnol. 18: 33-37,2000; Zauner y otros,
Adv. Drug Delivery Rev. 30:97-113, 1998). Una
estrategia para facilitar el escape endosómico es la incorporación
de bases débiles, o "esponjas de protones", que se cree que
tamponan el entorno ácido dentro de un endosoma y perturban las
membranas endosómicas aumentando la presión osmótica interna dentro
de la vesícula (Demeneix y otros, en Artificial
Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner y
otros, Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996,
págs. 146-151). Las microesferas de
poli-1 pueden liberar material encapsulado en el
intervalo de pH endosómico por medio de un mecanismo (disolución)
que implica la protonación de aminas en la matriz de polímero. Por
tanto, además de la rápida liberación del fármaco, las microesferas
de poli-1 pueden proporcionar también un medio de
perturbación de la membrana de escape endosómico, potenciando la
eficacia prolongando las vidas útiles de fármacos hidrolíticamente
inestables contenidos en la matriz de polímero.
Las microesferas fabricadas a partir de
poli-1 podrían representar una importante adición al
arsenal de materiales sensibles al pH aplicados para la
administración de fármacos intracelular, tales como formulaciones de
polímero/liposoma sensibles al pH (Gerasimov y otros, Adv. Drug
Delivery Rev. 38:317-338, 1999; Linhart y otros,
Langmuir 16:122-127, 2000; Linhardt y otros,
Macromolecules 32.4457-4459, 1999). Al contrario que
muchas formulaciones liposómicas, las microesferas de polímero son
físicamente robustas y pueden secarse en almacenamiento durante
periodos prolongados sin deformación, descomposición ni degradación
(Okada Adv. Drug Delivery Rev. 28:43-70, 1997), una
importante consideración para la formulación y el envasado de nuevos
sistemas de administración terapéutica. Las microesferas
investigadas en este estudio actual entran dentro de intervalo de
tamaños de las partículas comúnmente usadas para dirigir la
administración a macrófagos (Hanes y otros, Adv. Drug Delivery Rev.
28:97-119, 1997). Los perfiles de
pH-liberación rápidos para las microesferas de
poli-1 descritos anteriormente pueden por tanto ser
útiles en el diseño de nuevas vacunas a base de ADN que actualmente
emplean PLGA como material de encapsulación (Singh y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 97:811-816, 2000; Ando y otros,
J. Pharm. Sci. 88:126-130, 1999; Hedley y otros,
Nat. Med. 4:365-368, 1998).
Ejemplo de referencia
3
La administración segura y eficaz de ADN
terapéutico a células representa un obstáculo fundamental para el
éxito clínico de la terapia génica (Luo y otros, Nat. Biotechnol.
18:33-37, 2000; Anderson Nature 392
supl.:25-30, 1996). Los desafíos a los que se
enfrentan los vectores de administración sintéticos están
particularmente claros, ya que tanto los polímeros catiónicos como
los liposomas son menos eficaces en la mediación de la
transferencia génica que los vectores virales. La incorporación de
nuevos criterios de diseño ha conducido a avances recientes hacia
sistemas de administración funcionales (Lim y otros, J. Am. Chem.
Soc. 123: 2460-2461, 2001; Lim y otros, J. Am.
Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Hwang y otros,
Bioconjugate Chem. 12:280-290,2001; Putnam y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1200-1205,2001; Benns
y otros, Bioconjugate Chem, 11:637-645, 2000;
Midoux y otros, Bioconjugate Chem. 10:406-411,
1999). Sin embargo, el paradigma para el desarrollo de vectores de
administración génica poliméricos sigue siendo la incorporación de
estos elementos de diseño en materiales como parte de un proceso
lineal iterativo, un enfoque eficaz, aunque lento, para el
descubrimiento de nuevos vectores. En el presente documento, se
notifica un enfoque en paralelo adecuado para la síntesis de
grandes bibliotecas de oligómeros y polímeros catiónicos degradables
y el descubrimiento de nuevas familias de vectores sintéticos a
través de ensayos de selección basados en células rápidos (para un
informe sobre la síntesis en paralelo y la selección de polímeros
degradables para la ingeniería de tejidos, véase: Brocchini y
otros, J. Am. Chem. Soc. 119:4553-4554,
1997).
1997).
Consideraciones generales. Todas las
manipulaciones que implicaban células vivas o materiales estériles
se realizaron en una cabina de flujo laminar usando técnica estéril
convencional. Se realizó la cromatografía de permeación en gel
(CPG) usando una bomba isocrática serie 1100 de Hewlett Packard, un
inyector modelo 7125 de Rheodyne con un bucle de inyección de 100
\mul y dos columnas PL-Gel mixed-D
en serie (5 \mum, 300 x 7,5 mm, Polymer Laboratories, Amherst,
MA). Se usó THF/piperidina 0,1 M como eluyente a una velocidad de
flujo de 1,0 ml/min. Se recogieron los datos usando un refractómetro
interferométrico Optilab DSP (Wyatt Technology, Santa Bárbara, CA)
y se procesaron usando el paquete informático TriSEC GPC (Viscotek
Corporation, Houston, TX). Los pesos moleculares y las
polidispersidades de los polímeros se notifican con respecto a
patrones de poliestireno
monodispersados.
monodispersados.
Materiales. Se adquirieron los monómeros
1-20 de amina primaria y amina secundaria de Aldrich
Chemical Company (Milwaukee, WI), Lancaster (Lancashire, UK), Alfa
Aesar Organics (Ward Hill, MA) y Fluka (Milwaukee, WI). Se
adquirieron los monómeros A-G de Polysciences, Inc.
(Warrington, PA), Alfa Aesar y Scientific Polymer Products, Inc,
(Ontario, NY). Se adquirieron todos los monómeros con la mayor
pureza disponible (desde el 97% hasta 99+%) y se usaron tal como se
recibieron sin purificación adicional. Se adquirió ADN de plásmido
que contenía el gen indicador de luciferasa de luciérnaga
(pCMV-Luc) de Elim Biopharmaceuticals, Inc. (San
Francisco, CA) y se usó sin purificación adicional. Se adquirió
bromuro de
3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio
(MTT) de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Se adquirieron los
fibroblastos de riñón de mono (células COS-7)
usados en los ensayos de transfección de la Colección Americana de
Cultivos Tipo (Manassas, VA) y se hicieron crecer a 37ºC, CO_{2}
al 5% en medio de Eagle modificado por Dulbecco, 90%; suero bovino
fetal, 10%; penicilina, 100 unidades/ml; estreptomicina, 100
\mug/ml. Se adquirieron los kits de detección de luciferasa
detección usados en los ensayos de transfección de alto rendimiento
de Tropix (Bedford, MA). Todos los demás materiales y disolventes
se usaron tal como se recibieron sin purificación adicional.
Síntesis de la biblioteca de polímeros.
Las 140 reacciones de polimerización se realizaron simultáneamente
como una serie de viales etiquetados individualmente según el
siguiente protocolo general. Se indican excepciones individuales
cuando sea apropiado. Se cargaron los monómeros 1-20
de amina (2,52 mmoles) en viales etiquetados apropiadamente (tal
como se muestra a continuación): se midieron los monómeros líquidos
y se transfirieron cuantitativamente usando pipetas de microlitros;
se pesaron los monómeros sólidos directamente en cada vial. Se
añadió CH_{2}Cl_{2} anhidro (1 ml) a cada vial. Se añadió un
equivalente de diacrilatos A-F líquidos (2,52
mmoles) a cada vial de reacción apropiado usando una pipeta de
microlitros, y se tapó el vial de manera apretada con un tapón
revestido de teflón. Se añadió un equivalente de diacrilato G
semisólido a los viales apropiados como una disolución en
CH_{2}Cl_{2} (2,52 mmoles, 1 ml de una disolución 2,52 M en
CH_{2}Cl_{2}) y se taparon los viales de manera apretada. Se
añadió una alícuota adicional de CH_{2}Cl_{2} (2 ml) a los
viales de reacción que contenían 19 y 20 para ayudar a la
solubilidad de estos monómeros. Se dispusieron los viales tapados
de manera apretada en dos rejillas de tubos de ensayo de plástico y
se fijaron a un agitador orbital en un horno a 45ºC. (PRECAUCIÓN:
el calentamiento de los viales tapados representa un posible peligro
de explosión. Se monitorizó la temperatura del horno periódicamente
durante una semana antes del experimento para garantizar una
estabilidad térmica fiable. Se encontró que las temperaturas
variaban dentro de +/- 1ºC durante este periodo de tiempo. Se
monitorizaron varios viales de prueba antes de realizar el
experimento mayor). Se agitaron los viales de reacción
enérgicamente a 45ºC durante 5 días y se dejaron enfriar hasta
temperatura ambiente. Se colocaron los viales en un desecador grande
y se colocaron a vacío de aspirador durante 1 día y a alto vacío
durante 5 días adicionales para garantizar la eliminación completa
del disolvente. Se analizaron las muestras obtenidas mediante CPG
(55% de la biblioteca total, véase la tabla 2) y se usaron
directamente en todos los experimentos de examen posteriores.
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Determinación de la solubilidad en agua.
Se determinaron las solubilidades de todas las muestras
simultáneamente a una concentración de 2 mg/ml de la siguiente
manera general. Se pesó cada muestra de polímero (5 mg) en un vial
de centelleo de 12 ml y se añadieron 2,5 ml de tampón acetato (25
mM, pH = 5,0) a cada muestra usando una pipeta. Se agitaron las
muestras enérgicamente a temperatura ambiente durante 1 hora. Se
observó cada muestra visualmente para determinar la
solubilidad.
Ensayo de electroforesis en gel de
agarosa. Se realizó el ensayo de electroforesis en gel de
agarosa usado para determinar la capacidad de los polímeros para
formar complejos con el ADN de la siguiente manera. Usando las
disoluciones preparadas en el ensayo de solubilidad anterior (2
mg/ml en tampón acetato, 25 mM, pH = 5,0), se dispusieron
disoluciones madre de los 70 polímeros solubles en agua en una placa
de cultivo celular de 96 pocillos. Se formaron complejos de
ADN/polímero a una razón de 1:5 (p/p) transfiriendo 10 \mul de
cada disolución de polímero desde la placa de disolución madre
hasta una nueva placa usando una pipeta multicanal. Se diluyó
adicionalmente cada polímero con 90 \mul de tampón acetato (25 mM,
pH = 5,0, volumen total = 100 \mul) y se agitó la placa durante
30 segundos en un agitador mecánico. Se añadió una disolución acuosa
de ADN de plásmido (100 \mul de una disolución 0,04
\mug/\mul) a cada pocillo en la placa y se mezclaron
enérgicamente las disoluciones usando una pipeta multicanal y un
agitador mecánico. Se formaron complejos de ADN/polímero a una
razón de 1:20 (p/p) de la misma manera con las siguientes
excepciones: se transfirieron 40 \mul de disolución madre de
polímero a una nueva placa y se diluyeron con 60 \mul de tampón
acetato (volumen total =100 \mul) antes de añadir la disolución
acuosa de ADN (100 \mul). Se incubaron complejos de ADN/polímero
a temperatura ambiente durante 30 minutos, tras lo cual se cargaron
muestras de cada disolución (15 \mul) en un gel de agarosa al 1%
(HEPES, 20 mM, pH = 7,2, bromuro de etidio 500 ng/ml) usando una
pipeta multicanal. NOTA: Se cargaron las muestras en el gel con un
tampón de carga que consistía en Ficoll 400 al 10% (Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) en HEPES (25 mM, pH = 7,2). No
se incluyó azul de bromofenol como indicador visual en el tampón de
carga, puesto que este colorante cargado parecía interferir con la
complejación del polímero y el ADN. Se cargaron las muestras según
el patrón mostrado en la figura 9, de modo que las muestras
correspondientes a razones de ADN/polímero de 1:5 y 1:20 se
sometieron a ensayo en posiciones adyacentes en el gel. Se procesó
el gel a 90 V durante 30 minutos y se visualizaron bandas de ADN
mediante tinción con bromuro de etidio.
Protocolo general para ensayos de
transfección celular. Se realizaron ensayos de transfección por
triplicado de la siguiente manera general. Se hicieron crecer
células COS-7 en placas de 96 pocillos a una
densidad de siembra inicial de 15.000 células/pocillo en 200 \mul
de medio de crecimiento libre de rojo de fenol (medio de Eagle
modificado por Dulbecco al 90%, suero bovino fetal al 10%,
penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 \mug/ml). Se
hicieron crecer las células durante 24 horas en un incubador, tras
lo cual se retiró el medio de crecimiento y se sustituyó por 200
\mul de medio Optimem (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)
complementado con HEPES (concentración total = 25 mM). Se
prepararon complejos de polímero/ADN preparados a partir de los 56
polímeros de complejación de ADN/solubles en agua identificados
previamente tal como se describió anteriormente a una razón de 1:20
(p/p)) usando un plásmido comercialmente disponible que contenía el
gen indicador de luciferasa de luciérnaga
(pCMV-Luc). Se añadió un volumen apropiado de cada
muestra a las células usando una pipeta multicanal (por ejemplo, 15
\mul proporcionaban 300 ng de ADN/pocillo; 30 \mul
proporcionaban 600 ng de ADN/pocillo). Se realizaron controles
empleando poli(etilenimina) (PEI) y polilisina, preparadas a
razones de ADN/polímero de 1:1, de manera similar y se incluyeron
con controles de ADN y no de ADN. Se realizaron controles empleando
Lipofectamine 2000 (invitrogen Corp.) a varias concentraciones (0,1,
0,2, 0,4 y 0,6 \mul) tal como se describe en el manual técnico
para este producto (http://lifetechnologies.com). Se incubaron las
células durante 4 horas, tras lo cual se retiró el medio de
crecimiento libre de suero y se sustituyó por 100 \mul de medio
de crecimiento libre de rojo de fenol. Se incubaron las células
durante un periodo de tiempo adicional (normalmente variaba entre
36 y 60 horas) y se determinó la expresión de luciferasa usando un
kit de ensayo comercialmente disponible (Tropix, Inc., Bedford,
MA). Se cuantificó la luminiscencia en placas de polipropileno
blancas, de fondo sólido, de 96 pocillos, usando un lector de
placas de bioluminiscencia de 96 pocillos. Se expresó la
luminiscencia en unidades relativas de luz y no se normalizó con
respecto a la proteína celular total en este ensayo.
Los
poli(\beta-amino-ésteres) son
hidrolíticamente degradables, condensan ADN de plásmido a pH
fisiológico y se sintetizan fácilmente por medio de la adición
conjugada de aminas primarias o secundarias a diacrilatos (ec. 1 y
2) (Lynn y otros, J. Am. Chem. Soc. 122:10761-10768,
2000). Un examen inicial de polímeros modelo identificó estos
materiales como vehículos génicos potenciales y demostró que las
variaciones estructurales podían tener un impacto significativo
sobre la eficiencias de transfección y de unión a ADN (Lynn y otros,
J. Am. Chem. Soc. 122:10761-10768, 2000). Se razona
que este enfoque proporcionaba un marco atractivo para la
elaboración de grandes bibliotecas de polímeros estructuralmente
únicos por diversos motivos: 1) los monómeros de diamina y
diacrilato son materiales de partida económicos, comercialmente
disponibles, 2) la polimerización puede lograrse directamente en
una única etapa sintética y 3) las etapas de purificación son
generalmente innecesarias ya que no se generan subproductos durante
la polimerización.
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La escasez de bis(aminas secundarias)
comercialmente disponibles limita el grado de diversidad estructural
que puede lograrse usando el enfoque sintético anterior. Sin
embargo, el conjunto de monómeros útiles, comercialmente
disponibles, se expande significativamente cuando las aminas
primarias se consideran potenciales elementos de construcción de
bibliotecas. Debido a que la adición conjugada de aminas a grupos
acrilato tolera generalmente funcionalidades tales como alcoholes,
éteres y aminas terciarias (Ferruti y otros, Adv. Polym. Sci.
58:55-92, 1984), se cree que la incorporación de
monómeros de amina primaria funcionalizados en la presente
estrategia sintética serviría para ampliar la diversidad
estructural. Se seleccionaron los monómeros A-G de
acrilato y los monómeros 1-20 de amina para la
síntesis de una biblioteca de examen inicial.
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Se eligió el tamaño de la biblioteca construida
a partir de este conjunto de monómeros (7 diacrilatos x 20 aminas =
140 polímeros estructuralmente únicos) para que fuera
suficientemente grande como para incorporar suficiente diversidad,
pero suficientemente pequeño como para ser práctico sin necesidad de
automatización en los estudios iniciales. Al principio no estaba
claro si un polímero tal como G16 (formado a partir de los
monómeros G y 16 hidrófobos y estéricamente voluminosos) sería
soluble en agua a pH fisiológico o si podría condensar ADN de
manera suficiente. Sin embargo, se incorporaron deliberadamente
monómeros de este tipo para explorar completamente el espacio de la
diversidad, y previendo que esta biblioteca puede ser útil en última
instancia como población de examen para el descubrimiento de
materiales para aplicaciones distintas de la administración génica.
(Para un informe sobre la síntesis en paralelo y la selección de
polímeros degradables para ingeniería de tejidos, véase: Brocchini
y otros, J. Am. Chem. Soc. 119:4553-4554, 1997),
Lynn y otros, Angew. Chem. Int, Ed.
40:1707-1710,
2001).
2001).
Se realizaron reacciones de polimerización
simultáneamente como una serie de viales etiquetados
individualmente. Las reacciones se realizaron en cloruro de
metileno a 45ºC durante 5 días, y se aislaron los polímeros mediante
eliminación del disolvente proporcionando 600-800
mg de cada material. Las reacciones realizadas en esta escala
proporcionaron cantidades de cada material suficientes para el
análisis de rutina mediante CPG y todos los ensayos posteriores de
unión a ADN, de toxicidad y de transfección. Una inspección del 55%
de la biblioteca mediante CPG indicó pesos moleculares que
oscilaban desde 2000 hasta 50000 (con respecto a los patrones de
poliestireno). Ya que para la transfección y complejación de ADN no
se requieren altos pesos moleculares (tal como se muestra a
continuación) (Kabanov y otros, en Self-Assembling
Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial,
John Wiley and Sons, Nueva York, 1998), esta biblioteca proporcionó
una colección de polímeros y oligómeros adecuados para ensayos de
examen posteriores.
De los 140 miembros de la biblioteca de examen,
70 muestras eran suficientemente solubles en agua (2 mg/ml, tampón
acetato 25 mM, pH = 5,0) como para incluirse en un ensayo de unión a
ADN electroforético (figura 9). Para realizar este ensayo tan
rápida y eficazmente como fuera posible, se mezclaron las muestras
con ADN de plásmido a razones de 1:5 y 1:20 (ADN/polímero, p/p) en
placas de 96 pocillos y se cargaron en una placa de gel de agarosa
que podía someter a ensayo hasta 500 muestras usando una pipeta
multicanal. Se sometieron a ensayo las 70 muestras de polímero
soluble en agua simultáneamente a dos razones de ADN/polímero
diferentes en menos de 30 minutos. Tal como se muestra en la figura
9, 56 de las 70 muestras de polímero soluble en agua
interaccionaron suficientemente con el ADN como para retardar la
migración a través de la matriz de gel (por ejemplo, A4 o A5),
empleando la razón de ADN/polímero de 1:20 como criterio de
exclusión. Se descartaron catorce polímeros de una consideración
adicional (por ejemplo, A7 y A8), ya que estos polímeros no
complejaban ADN suficientemente.
Los materiales de complejación de ADN
identificados en el ensayo anterior se investigaron adicionalmente
en ensayos de transfección empleando ADN de plásmido y la línea
celular COS-7. Se realizaron todos los ensayos
simultáneamente con el gen indicador de luciferasa de luciérnaga
(pCMV-Luc) y se determinaron los niveles de
proteína expresada usando un kit de ensayo comercialmente disponible
y un lector de placas de luminiscencia de 96 pocillos. La figura 10
muestra los datos generados a partir de un ensayo empleando
pCMV-Luc (600 ng/pocillo) a razones de ADN/poli de
1:20 (p/p). La mayoría de los polímeros examinados no mediaba la
transfección por encima de un nivel típico de los controles de ADN
"desnudo" (sin polímero) en estas condiciones. Sin embargo,
varios pocillos expresaron niveles mayores de proteína y los
polímeros correspondientes se identificaron como "resultados
positivos" en este ensayo. Los polímeros B14 (M_{w} = 3180) y
G5 (M_{w} = 9170), por ejemplo, proporcionaron niveles de
transfección 4-8 veces superiores que los
experimentos control empleando poli(etilenimina) (PEI), un
polímero empleado convencionalmente como vector de transfección
sintético (Boussif y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:7297-7301, 1995), y niveles de transfección
dentro de o superando el intervalo de proteína expresada usando
Lipofectamine 2000 (disponible de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)),
un destacado sistema de vector de transfección a base de lípidos
comercialmente disponible. Los polímeros A14, C5, G7, G10 y G12 se
identificaron también como "resultados positivos" en el
experimento anterior, pero los niveles de expresión génica fueron
inferiores que con B14 y
G5.
G5.
Las diferencias estructurales entre los
polímeros sintéticos descartan normalmente un conjunto general de
condiciones de transfección óptimas. Por ejemplo, los polímeros C5,
C14 y G14 eran tóxicos a las concentraciones más altas empleadas
anteriormente (determinado por la ausencia de células en los
pocillos que contenían estos polímeros tal como se observó con
inspección visual. Estos polímeros eran menos tóxicos y mediaban la
transfección a menor concentración), pero mediaban la transfección
a menores concentraciones de ADN y polímero (datos no mostrados).
El sistema de ensayo descrito anteriormente puede modificarse
fácilmente para evaluar los polímeros como función de la
concentración de ADN, la razón de ADN/polímero, las densidades de
siembra de células o los tiempos de incubación. Se requerirá
investigación adicional para evaluar más completamente el potencial
de esta biblioteca de examen, y experimentos para este fin se
encuentra actualmente en marcha.
Los ensayos anteriores se realizaron en ausencia
de cloroquina, una base débil añadida comúnmente para potenciar la
transfección in vitro (Putnam y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 98:1200-1205, 2001; Benns y otros, Bioconjugate
Chem. 11:637-645, 2000; Midoux y otros, Bioconjugate
Chem. 10:406-411, 1999; Kabanov y otros, en
Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From
Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York,
1998), y los resultados reflejan por tanto las capacidades
intrínsecas de esos materiales para mediar la transfección. Los
polímeros que contienen monómero 14 son estructuralmente similares a
otros polímeros "esponja de protones" que contienen histidina
(Putnam y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
98:1200-1205, 2001; Benns y otros, Bioconjugate
Chem. 11:637-645, 2000; Midoux y otros, Bioconjugate
Chem, 10:406-411, 1999), y podrían potenciar la
transfección tamponando compartimentos intracelulares ácidos y
mediando el escape endosómico (Putnam y otros, Proc. Natl. Acad
Sci. USA 98:1200-1205, 2001; Benns y otros,
Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux y otros,
Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999; Boussif y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301,
1995). La eficacia de los polímeros que contienen monómero 5 es
sorprendente en este contexto, ya que estos materiales no incorporan
un medio obvio para facilitar el escape endosómico. Aunque todavía
no se entiende la eficacia de estos últimos polímeros, su
descubrimiento ayuda a validar el presente enfoque en paralelo y
destaca el valor de incorporar diversidad estructural, ya que estos
polímeros no pueden haberse descubierto según iban surgiendo. Los
polímeros que incorporan los diacrilatos D y E hidrófilos no han
producido "resultados positivos" en ninguna condición hasta
ahora, proporcionando una posible base para el desarrollo de
bibliotecas más centradas útiles para la dilucidación de las
relaciones estructura/
actividad.
actividad.
Se ha generado una biblioteca de 140 oligómeros
y polímeros degradables útiles para el descubrimiento de nuevos
materiales de complejación de ADN y vectores de administración
génica. Varios de estos materiales pueden condensar ADN para dar
estructuras suficientemente pequeñas como para internalizarse por
células y liberar el ADN en una forma transcripcionalmente activa.
El tiempo total requerido actualmente para ensayos de diseño,
síntesis y examen inicial de bibliotecas es aproximadamente de dos
semanas. Sin embargo, la incorporación de robótica y monómeros
adicionales podría acelerar significativamente el ritmo al que se
identifican nuevos materiales de complejación de ADN y vectores de
transfección competentes.
Ejemplo
4
Una de las principales barreras para el éxito de
la terapia génica en la práctica clínica es la falta de métodos
seguros y eficaces de administración de ácidos nucleicos.
Actualmente, la mayoría de los ensayos clínicos usan virus
modificados como vehículos de administración, que, aunque eficaces
para transferir ADN a células, se ven afectados por problemas de
producción y toxicidad potencialmente graves (Somia y otros, Nat Rev
Genet, 1:91 (2000)). Por el contrario, los sistemas no virales
ofrecen varias ventajas potenciales, incluyendo facilidad de
producción, estabilidad, bajas inmunogenicidad y toxicidad, y
limitaciones reducidas del tamaño de los vectores (Ledley Human
Gene Therapy 6:1129 (1995)).
Sin embargo, a pesar de estas ventajas, los
sistemas de administración no viral existentes son, con mucho,
menos eficaces que los vectores virales (Luo y otros, Nature
Biotechnology 18:33 (2000)).
Un grupo prometedor de compuestos de
administración no virales son los polímeros catiónicos, que
espontáneamente se unen a y condensa ADN. Se ha caracterizado una
amplia variedad de polímeros catiónicos que transfectan in
vitro, tanto sistemas naturales, tales como proteína (Fominaya y
otros, Journal of Biological Chemistry 271:10560 (1996)) como
sistemas peptídicos (Schwartz y otros, Curr Opin Mol Ther. 2:162
(2000)), y polímeros sintéticos tales como poli(etilenimina)
(Boussif y otros, Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America 92:7297 (1995)) y dendrímeros
(Kabanov y otros, Self-assembling complexes for
gene delivery: from laboratory to clinical trial, Wiley, Chichester;
Nueva York, 1998). Avances recientes en la administración génica
polimérica se han centrado en parte en hacer los polímeros más
biodegradables para reducir la toxicidad. Normalmente, estos
polímeros contienen tanto grupos amino que pueden cargarse, para
permitir interacciones iónicas con la estructura principal de
fosfato cargada negativamente de los ácidos nucleicos, como un
enlace biodegradable tal como un enlace éster hidrolizable. Varios
ejemplos de los mismos incluyen poli(ácido
alfa-(4-aminobutil)-L-glicólico)
(Lim y otros, Journal of the American Chemical Society 122:6524
(2000)), poli(amino-éster) en red (Lim y otros, Bioconjugate
Chemistry 13:952 (2002)), y
poli(beta-amino-ésteres) (Lynn y otros,
Journal of the American Chemical Society 122:10761 (2000); Lynn y
otros, Journal of the American Chemical Society 123:8155 (2001);
cada uno de los cuales se incorpora al presente documento como
referencia). Los poli(beta-amino-ésteres)
son particularmente interesantes debido a que muestran una baja
citotoxicidad y se sintetizan fácilmente por medio de la adición
conjugada de una amina primaria o bis(amina secundaria) a un
diacrilato (figura 11) (Lynn y otros, Journal of the American
Chemical Society 122:10761 (2000); Lynn y otros, Journal of the
American Chemical Society 123:8155
(2001)).
(2001)).
El desarrollo tradicional de nuevos polímeros
biomédicos ha sido un proceso iterativo. Los polímeros se diseñaron
normalmente de uno en uno y luego se sometieron a prueba
individualmente para determinar sus propiedades. Más recientemente,
la atención se ha centrado en el desarrollo de enfoques en paralelo,
combinatorios que faciliten la generación de bibliotecas
estructuralmente diversas de biomateriales poliméricos (Brocchini
Advanced Drug Delivery Reviews 53:123 (2001)). Este enfoque
combinatorio se ha aplicado también al descubrimiento de polímeros
de administración génica. Por ejemplo, Murphy y otros, generaron una
biblioteca combinatoria seleccionada de 67 peptoides por medio de
síntesis en fase sólida y los examinaron para identificar nuevos
agentes de administración génica (Murphy y otros, Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America
95:1517
(1998)).
(1998)).
En este ejemplo se describen nuevas herramientas
para la síntesis combinatoria en paralelo, de alto rendimiento, y
el examen basado en células de una biblioteca grande de 2350
poli(beta-amino-ésteres) estructuralmente
diversos. Este enfoque permite el examen de polímeros en ensayos
basados en células sin que los polímeros abandonen nunca la fase de
disolución tras la síntesis. Este enfoque combinado con el uso de
sistemas de manejo de fluidos robotizados permite la generación y
las pruebas de miles de polímeros sintéticos en ensayos basados en
células en una cantidad de tiempo relativamente corta. Usando este
enfoque se han identificado 46 nuevos polímeros que tenían un
rendimiento tan bueno o mejor que los sistemas de administración no
viral convencionales tales como poli
(etilenimina).
(etilenimina).
Síntesis de polímeros de alto
rendimiento. Los factores principales que limitan el rendimiento
y la automatización de la síntesis y las pruebas de
poli(beta-amino-ésteres) eran la viscosidad
de las disoluciones de monómero y polímero, y la dificultad en la
manipulación de los productos de polímero sólidos. Aunque la
automatización del manejo de líquidos es sencillo usando robótica
convencional, la manipulación de sólidos y líquidos viscosos a
pequeña escala no lo es. Por tanto, se desarrolló un sistema en el
que los polímeros podían sintetizarse y examinarse en ensayos
basados en células sin abandonar la fase de disolución. Puesto que
esto requeriría la presencia de disolvente residual en los ensayos
celulares, se eligió el disolvente relativamente no tóxico dimetil
sulfóxido (DMSO). DMSO es un disolvente usado comúnmente en cultivo
celular y se usa rutinariamente en el almacenamiento de
disoluciones madre congeladas de células. DMSO es miscible en agua y
generalmente se tolera bien en sistemas
vivos.
vivos.
La primera etapa en la preparación para la
síntesis de alto rendimiento era identificar las condiciones que
permitirían la producción de polímero presentando aún una viscosidad
manejable. Experimentos piloto, a pequeñas escala, mostraron que la
polimerización podía realizarse de manera eficaz a 1,6 M en DMSO a
56ºC durante 5 días. Basándose en estos experimentos, se desarrolló
una estrategia general para la síntesis y las pruebas de polímero.
Todos los monómeros (figura 12) se diluyeron hasta 1,6 M en DMSO, y
luego usando tanto un robot de manejo de fluidos como una pipeta de
12 canales, se añadieron 150 microlitros de cada monómero de amina
y diacrilato a una placa de pocillos profundos de polipropileno y
luego se selló con papel de aluminio. Se colocaron las placas en un
agitador orbital y se incubaron a 56ºC durante 5 días. Para
compensar el aumento de viscosidad de las disoluciones poliméricas,
se añadió 1 ml de DMSO a cada pocillo de la placa, y luego se
almacenaron las placas a 4ºC hasta otro uso. Estos métodos permiten
2350 reacciones en un solo día. Además, la producción y el
almacenamiento de polímeros en un formato de 96 pocillos permitieron
una fácil transición a las pruebas basadas en células de 96
pocillos de la eficiencia de transfección de polímero.
Pruebas de polímeros de alto rendimiento.
Una vez sintetizados, se sometieron a prueba todos los polímeros
para determinar su capacidad para administrar el plásmido de
expresión de luciferasa, pCMVluc, en la línea celular de
fibroblastos de riñón de mono COS-7. Debido al gran
tamaño de la biblioteca de polímeros, se desarrolló un método de
alto rendimiento para el examen basado en células de la eficiencia
de transfección. Puesto que los polímeros se almacenaron en placas
de 96 pocillos, todas las diluciones de polímero, complejación de
ADN y transfecciones celulares se realizaron en paralelo
transfiriendo directamente los polímeros de placa a placa usando un
robot de manejo de líquidos. Todos los polímeros se sintetizaron
usando la misma concentración de monómero de amina, por tanto, la
comparación entre polímeros a una razón de monómero de amina:fosfato
de ADN (razón N:P) fijada fue sencilla. Aunque los monómeros de
amina contienen o bien una, o bien dos, o bien tres aminas por
monómero, los exámenes de base amplia iniciales para determinar la
eficiencia de transfección se simplificaron enormemente manteniendo
una concentración de monómero constante en todos los pocillos de una
placa individual y, por tanto, un volumen constante de la
disolución de polímero por reacción (véanse los métodos a
continuación).
continuación).
La eficiencia de una transfección in
vitro usando polímeros catiónicos tales como
poli(etilenimina) es muy sensible a la razón de polímero con
respecto a ADN presente durante la formación de los complejos
(Gebhart y otros, Journal of Controlled Release 73:401 (2001)). Se
seleccionaron razones de N:P de 10:1, 20:1 y 40:1 para los exámenes
iniciales basados en la experiencia previa con estos tipos de
polímeros. Usando el presente sistema de alto rendimiento, se
examinaron los 2350 polímeros a estas tres razones. Se tabularon los
valores de transfección a la mejor condición para cada polímero en
un histograma (figura 13). Se compararon estos resultados con tres
controles: ADN desnudo (sin agente de transfección),
poli(etilenimina) (PEI) y Lipofectamine 2000. Los niveles
residuales, bajos, de DMSO presentes en las disoluciones de
transfección no afectaron a la eficiencia de transfección de o bien
el ADN desnudo o bien la PEI. Se encontró que treinta y tres de los
2350 polímeros eran tan buenos o mejores que PEI en este sistema no
optimizado.
Dado que las transfecciones con polímero
catiónico tienen a ser sensibles a la razón de polímero:ADN, se
decidió optimizar las condiciones de transfección con los mejores
polímeros del presente examen preliminar. Usando los resultados
anteriores como una guía aproximada, se optimizaron las condiciones
de transfección para los mejores 93 polímeros sometiéndolos a
prueba a razones de N:P por encima y por debajo de las condiciones
de transfección óptimas identificadas en el examen de base amplia.
Con el fin de desarrollar un sistema de optimización de alto
rendimiento, se sometieron a prueba éstos usando un sistema
multiplicador de la razón de N:P para simplificar las pruebas
simultáneas y la transferencia de placa a placa. Comenzando con la
mejor razón de N:P identificada en el examen preliminar, volvieron
a someterse a prueba los polímeros a seis razones de N:P iguales a
0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5 y 1,75 veces la mejor razón, por
triplicado. Por ejemplo, si la razón óptima identificada en el
examen de un polímero dado era de 20:1, entonces ese polímero volvió
a someterse a examen por triplicado a razones de N:P de 10:1, 15:1,
20:1, 25:1, 30:1 y 35:1. Se muestran las eficiencias de
transfección promedio con la desviación estándar a partir de la
mejor condición para los mejores 50 polímeros en la figura 14,
junto con datos de control. En este experimento, se identificaron 46
polímeros que transfectan tan bien o mejor que PEI. Volvieron a
someterse a prueba los 93 polímeros para determinar su capacidad
para unirse a ADN usando electroforesis en gel de agarosa (figura
15). De manera interesante, mientras que casi todos los polímeros
se unen al ADN tal como se esperaba, dos polímeros que transfectan a
altos niveles no lo hicieron: M17 y KK89 (figura 14).
Para examinar adicionalmente las propiedades de
transfección de estos polímeros, se sometieron a prueba diez
polímeros de alta transfección para determinar su capacidad para
administrar el plásmido de proteína fluorescente verde,
pCMV-eGFP. A diferencia de pCMV-luc,
pCMV-eGFP proporciona información referente a qué
porcentajes de células se transfecta. Se observaron altos niveles
de transfección para los 10 polímeros, y dos de los mejores se
muestran en la figura 16.
Los "resultados positivos" identificados en
los ensayos anteriores revelan una colección de polímeros
sorprendentemente diversa e inesperada. Particularmente
sorprendente es la gran colección de polímeros a base de
D-monómeros, hidrófobos. De hecho, los monómeros de
diacrilato usados para preparar los 50 polímeros con mejor
rendimiento son casi siempre hidrófobos. Un análisis adicional
revela dos características más comunes de los polímeros eficaces:
1) doce de los 26 polímeros que son mejores que el mejor reactivo
convencional, Lipofectamine 2000, tienen grupos laterales de mono y
dialcohol, y 2) también son prevalentes en las estructuras con
resultados positivos bis(aminas secundarias) lineales.
También era sorprendente la identificación de dos polímeros que
transfectan a altos niveles pero no parecen unirse al ADN (KK89 y
M17). Ambos son insolubles a pH 5 y pH 7. Su capacidad para
facilitar la captación de ADN puede deberse a la permeabilización de
la membrana celular.
También es importante la longitud para la
función de los polímeros de administración génica (Remy y otros,
Advanced Drug Delivery Reviews 30:85 (1998); Schaffer y otros,
Biotechnol Bioeng 67:598 (2000)). Usando estos resultados como
marco, puede prepararse una gama de longitudes de polímero para cada
polímero con resultado positivo variando cuidadosamente las
concentraciones relativas de monómero. Las pruebas muestran que (1)
como PEI, la longitud del
poli(beta-amino-éster) es importante en la
competencia de administración génica de estos polímeros, y (2) que
los polímeros con resultado positivo identificados en este caso
pueden resintetizarse usando métodos convencionales y todavía
administrar ADN eficazmente.
Síntesis de polímeros. Se adquirieron
monómeros de Aldrich (Milwaukee. WI), TCI (Portland, OR), Pfaltz
& Bauer (Waterbury, CT), Matrix Scientific (Columbia, SC),
Acros-Fisher (Pittsburg, PA), Scientific Polymer
(Ontario, NY), Polysciences (Warrington, PA) y Dajac
monomer-polymer (Feasterville, PA). Se disolvieron
éstos en DMSO (Aldrich) hasta una concentración final de 1,6 M. Se
añadieron todas las posibles combinaciones por parejas de monómeros
de amina y diacrilato en alícuotas de 150 \mul a cada pocillo de
placas de pocillos profundos Masterblock de polipropileno de 96
pocillos de 2 ml (Griener America, Longwood, FL). Se sellaron las
placas con papel de aluminio y se incubaron a 56ºC mientras se
hacían girar en un agitador orbital. Tras 5 días, se añadió 1 ml de
DMSO a cada pocillo, y volvieron a sellarse las placas y se
congelaron en almacenamiento a 4ºC hasta que estaban listas
para
usarse.
usarse.
Experimentos de transfección. Se
sembraron 14.000 células cos-7 (ATCC, Manassas, VA)
en cada pocillo de una placa de 96 pocillos transparente o blanca
maciza (Coming-Costar, Kennebunk, ME) y se dejó que
se unieran durante la noche en medio de crecimiento, compuesto por:
500 ml de DMEM menos rojo de fenol, 50 ml de FBS inactivado por
calor, 5 ml de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Se llenó cada pocillo de una placa de 96 pocillos Master block con
1 ml de acetato de sodio 25 mM pH 5. A esto, se añadieron 40
\mul, 20 \mul o 10 \mul de la disolución de polímero/DMSO. Se
añadieron 25 \mul del polímero diluido a 25 \mul de ADN de
pCMV-luc 60 \mug/ml (Promega, Madison, WI) o
pEGFP-N1 (Invitrogen) en una placa de 96 pocillos
de la mitad de volumen. Se incubaron éstas durante 10 minutos, y
entonces se añadieron 30 \mul de la disolución de
polímero-ADN a 200 \mul de Optimem con bicarbonato
de sodio (Invitrogen) en placas de poliestireno de 96 pocillos. Se
retiró el medio de las células usando una varilla de 12 canales (V
& P Scientific, San Diego, CA) tras lo cual se añadieron
inmediatamente 150 \mul de la disolución de
optimem-polímero-ADN. Se incubaron
los complejos con las células durante 1 hora y entonces se retiraron
usando la varilla de 12 canales y se sustituyeron por 105 \mul de
medio de crecimiento. Se dejaron crecer las células durante tres
días a 37ºC, 5% de CO_{2} y entonces se analizaron para determinar
la luminiscencia (pCMV-luc) o fluorescencia
(pEGFP-N1). Se realizaron experimentos control tal
como se describió anteriormente, pero usando
poli(etilenimina) M_{w} 25.000 (Aldrich) sustituyendo al
polímero sintetizado, y a razones en peso de polímero:ADN de 0,5:1,
0,75:1, 1:1, 1,25:1, 1,5:1 y 2:1. Se realizaron transfecciones con
Lipofectamine 2000 (Invitrogen) tal como describía el vendedor,
excepto porque los complejos se retiraron tras 1
hora.
hora.
Se analizó la luminiscencia usando kits de
ensayo Bright-Glo (Promega). En resumen, se
añadieron 100 \mul de disolución Bright-Glo a
cada pocillo de la placa de microtitulación que contenía medios y
células. Se midió la luminiscencia usando un luminómetro Mithras
(Berthold, Oak Ridge, TN). En algunos casos, se usó un filtro de
densidad neutra (Chroma, Brattleboro, VT) para impedir la saturación
del luminómetro. Se generó una curva patrón para luciferasa
mediante la titulación de la enzima luciferasa (Promega) en medios
de crecimiento en placas de microtitulación blancas. Se examinó la
expresión de eGFP usando un microscopio invertido Aciovert 200
de
Zeiss.
Zeiss.
Se realizaron ensayos de unión a ADN mediante
electroforesis en gel de agarosa a una razón de N:P de 40:1, tal
como se describió previamente (Lynn y otros, Journal of the American
Chemical Society 123:8155 (2001)). Todo el manejo de líquidos se
realizó usando un robot EDR384S/96S (Labcyte, Union City, CA) o una
micropipeta de 12 canales (Thermo Labsistemas, Vantaa, Finlandia)
en una cabina de flujo laminar.
Ejemplo de referencia
5
Se determinó el efecto del peso molecular, la
razón de polímero/ADN y el grupo terminal de la cadena sobre las
propiedades de transfección de dos estructuras de
poli(\beta-amino-éster) únicas. Estos
factores pueden tener un efecto drástico sobre la función de
administración génica. Usando métodos de examen de alto rendimiento,
se han descubierto
poli(\beta-amino-ésteres) que transfectan
mejor que PEI y Lipofectamine 2000 (dos de los mejores reactivos de
transfección comercialmente disponibles).
Síntesis de polímeros. Se sintetizaron
los polímeros Poli-1 y Poli-2
añadiendo diacrilato de 1,4-butanodiol (99+%) y
diacrilato de 1,6-hexanodiol (99%), respectivamente,
a 1-aminobutanol (98%). Se adquirieron estos
monómeros de Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Se generaron doce versiones
de cada uno de Poli-1 y Poli-2
variando la razón estequiométrica de amina/diacrilato. Para
sintetizar cada uno de los 24 polímeros únicos, se pesaron 400 mg
de 1-aminobutanol en un vial de muestra de 8 ml con
tapón de rosca revestido de teflón. A continuación, se añadió la
cantidad apropiada de diacrilato al vial para proporcionar una razón
estequiométrica de entre 1,4 y 0,6. Se puso entonces una pequeña
barra agitadora recubierta de teflón en cada vial. Se taparon bien
los viales y se colocaron en una placa de agitación magnética de
múltiples posiciones situada en un horno mantenido a 100ºC. Tras un
tiempo de reacción de 5 h, se retiraron los viales del horno y se
almacenaron a 4ºC. Se analizaron todos los polímeros
mediante
CPG.
CPG.
Cromatografía de permeación en gel (CPG).
Se realizó la CPG usando una bomba isocrática serie 1100 de Hewlett
Packard, un inyector modelo 7125 de Rheodyne con un bucle de
inyección de 100 \mul y una columna Phenogel MXL (5\mu
mezclado, 300 x 7,5 mm, Phenomenex, Torrance, CA). Se usó un 70% de
THF/30% de DMSO (v/v) + piperidina 0,1 M como eluyente a una
velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Se recogieron datos usando un
refractómetro interferométrico Optilab DSP (Wyatt Technology, Santa
Bárbara, CA) y se procesaron usando el paquete de software TriSEC
CPG (Viscotek Corporation, Houston, TX). Los pesos moleculares y
las polidispersidades de los polímeros se determinaron en relación
con patrones de poliestireno monodispersados.
Ensayos de transfección de luciferasa. Se
sembraron células COS-7 (ATCC, Manassas, VA) (14.000
células/poci-
llo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos blanca opaca (Corning-Costar, Kennebunk, ME) y se dejaron unir durante la noche en medio de crecimiento. El medio de crecimiento estaba compuesto por un 90% de DMEM libre de rojo de fenol, un 10% de suero bovino fetal, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 \mug/ml (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para facilitar el manejo, se prepararon disoluciones madre de polímeros (100 mg/ml) en disolvente DMSO. Una pequeña cantidad residual de DMSO en la mezcla de transfección no afecta a la eficiencia de transfección y no da como resultado ninguna citotoxicidad observable. Se prepararon diluciones de trabajo de cada polímero (a concentraciones necesarias para producir las diferentes razones en peso de polímero/ADN) en tampón acetato de sodio 25 mM (pH 5). Se añadieron 25 \mul del polímero diluido a 25 \mul de ADN de pCMV-Luc 60 \mug/ml (Elim Biopharmaceuticals, South San Francisco, CA) en un pocillo de una placa de 96 pocillos. Se incubaron las mezclas durante 10 minutos para permitir la formación de complejos, y entonces se añadieron 30 \mul de cada una de las disoluciones de polímero-ADN a 200 \mul de Opti-MEM con bicarbonato de sodio (Invitrogen) en placas de poliestireno de 96 pocillos. Se retiró el medio de crecimiento de las células usando una varilla de aspiración de 12 canales (V&P Scientific, San Diego, CA) tras lo cual se añadieron inmediatamente 150 \mul de la disolución de Opti-MEM-polímero-ADN. Se incubaron los complejos con las células durante 1 h y entonces se retiraron usando la varilla de 12 canales y se sustituyeron por 105 \mul de medio de crecimiento. Se dejaron crecer las células durante tres días a 37ºC, CO_{2} al 5% y entonces se analizaron para determinar la expresión de luciferasa. Se realizaron también experimentos control con PEI (M_{w} = 25.000, Sigma-Aldrich) y Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Se realizaron las transfecciones de PEI tal como se describió anteriormente, pero usando razones en peso de polímero:ADN de 1:1. Se realizaron las transfecciones de Lipofectamine 2000 tal como describía el vendedor, excepto porque se retiraron los complejos tras 1 hora.
llo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos blanca opaca (Corning-Costar, Kennebunk, ME) y se dejaron unir durante la noche en medio de crecimiento. El medio de crecimiento estaba compuesto por un 90% de DMEM libre de rojo de fenol, un 10% de suero bovino fetal, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 \mug/ml (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para facilitar el manejo, se prepararon disoluciones madre de polímeros (100 mg/ml) en disolvente DMSO. Una pequeña cantidad residual de DMSO en la mezcla de transfección no afecta a la eficiencia de transfección y no da como resultado ninguna citotoxicidad observable. Se prepararon diluciones de trabajo de cada polímero (a concentraciones necesarias para producir las diferentes razones en peso de polímero/ADN) en tampón acetato de sodio 25 mM (pH 5). Se añadieron 25 \mul del polímero diluido a 25 \mul de ADN de pCMV-Luc 60 \mug/ml (Elim Biopharmaceuticals, South San Francisco, CA) en un pocillo de una placa de 96 pocillos. Se incubaron las mezclas durante 10 minutos para permitir la formación de complejos, y entonces se añadieron 30 \mul de cada una de las disoluciones de polímero-ADN a 200 \mul de Opti-MEM con bicarbonato de sodio (Invitrogen) en placas de poliestireno de 96 pocillos. Se retiró el medio de crecimiento de las células usando una varilla de aspiración de 12 canales (V&P Scientific, San Diego, CA) tras lo cual se añadieron inmediatamente 150 \mul de la disolución de Opti-MEM-polímero-ADN. Se incubaron los complejos con las células durante 1 h y entonces se retiraron usando la varilla de 12 canales y se sustituyeron por 105 \mul de medio de crecimiento. Se dejaron crecer las células durante tres días a 37ºC, CO_{2} al 5% y entonces se analizaron para determinar la expresión de luciferasa. Se realizaron también experimentos control con PEI (M_{w} = 25.000, Sigma-Aldrich) y Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Se realizaron las transfecciones de PEI tal como se describió anteriormente, pero usando razones en peso de polímero:ADN de 1:1. Se realizaron las transfecciones de Lipofectamine 2000 tal como describía el vendedor, excepto porque se retiraron los complejos tras 1 hora.
Se analizó la expresión de luciferasa usando
kits de ensayo Bright-Glo (Promega). En resumen, se
añadieron 100 \mul de disolución Bright-Glo a
cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contenía medios y
células. Se midió la luminiscencia usando un luminómetro Mithras
(Berthold, Oak Ridge, TN). Se usó un filtro de densidad neutra del
1% (Chroma, Brattleboro, VT) para impedir la saturación del
luminómetro. Se generó una curva patrón para luciferasa mediante la
titulación de la enzima luciferasa (Promega) en medios de
crecimiento en placas de 96 pocillos blancas opacas.
Medición de la citotoxicidad. Se
realizaron ensayos de citotoxicidad de la misma manera que los
experimentos de transfección de luciferasa con la siguiente
excepción. En lugar de someter a ensayo para determinar la
expresión de luciferasa tras 3 días, se sometieron a ensayo las
células para determinar la actividad metabólica usando el kit de
ensayo de proliferación celular MTT (ATCC) tras 1 día. Se añadieron
10 \mul de reactivo MTT a cada pocillo. Tras 2 h de incubación a
37ºC, se añadieron 100 \mul de reactivo de detergente a cada
pocillo. Se dejó entonces la placa en la oscuridad a temperatura
ambiente durante 4 h. Se midió la absorbancia óptica a 570 nm
usando un lector de microplacas SpectaMax 190 (Molecular Devices,
Sunnyvale, CA) y se convirtió a % de viabilidad en relación con
células control (no tratadas).
Experimentos de captación celular. Se
realizaron experimentos de captación tal como se describió
previamente, con la excepción de que se usó un formato de placa de
12 pocillos en lugar de un formato de placa de 6 pocillos (Akinc,
A. y otros, Parallel synthesis and biophysical characterization of a
degradable polymer library of gene delivery. J. Am. Chem. Soc.,
2003). Se sembraron células COS-7 a una
concentración de 1,5 x 10^{5} células/pocillo y se hicieron
crecer durante 24 horas antes de realizar los experimentos de
captación. Se realizó la preparación de complejos de polímero/ADN
de la misma manera que en los experimentos de transfección de
luciferasa, siendo las únicas diferencias un aumento en la escala
(2,5 \mug de ADN por pocillo de la placa de 12 pocillos en
contraposición a 600 ng de ADN por pocillo de la placa de 96
pocillos) y el uso de plásmido marcado con Cy5 en lugar de
pCMV-Luc (Akine, A. y R. Langer, Measuring the pH
environment of ADN delivered using nonviral vectors: Implications
for lysosomal trafficking. Biotechnol. Bioeng., 2002. 78(5):
págs. 503-8). Como en los experimentos de
transfección, se incubaron los complejos con las células durante 1
h para permitir la captación celular mediante endocitosis. Se
cuantificó el nivel relativo de captación celular usando un
citómetro de flujo para medir la fluorescencia de células cargadas
con plásmido marcado con Cy5.
Transfecciones de GFP. Se llevaron a cabo
transfecciones de GFP en las líneas celulares COS-7
(riñón de mono verde), NIH 3T3 (fibroblasto murino), HepG2
(hepatocarcinoma humano) y CHO (ovario de hámster chino). Se
obtuvieron todas las líneas celulares de la ATCC (Manassas, VA) y
se mantuvieron en DMEM que contenía un 10% de suero bovino fetal,
penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 \mug/ml a 37ºC en
atmósfera de CO_{2} al 5%. Se sembraron las células en placas de
6 pocillos y se hicieron crecer hasta aproximadamente un
80-90% de confluencia antes de realizar los
experimentos de transfección. Se prepararon complejos de
polímero/ADN tal como se describió anteriormente usando el plásmido
pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA) (5
\mug/pocillo). Se diluyeron los complejos en 1 ml de
Opti-MEM y se añadieron a los pocillos durante 1 h.
Se retiraron entonces los complejos y se añadió medio de
crecimiento nuevo a los pocillos. Tras 2 días, se recogieron las
células y se analizaron para determinar la expresión de GFP
mediante citometría de flujo. Se usó tinción con yoduro de propidio
para excluir las células muertas del
análisis.
análisis.
Citometría de flujo. Se realizó la
citometría de flujo con un instrumento FACSCalibur (Becton
Dickinson) equipado con un láser de ion argón que puede excitar GFP
(excitación a 488 nm) y un láser de diodo rojo que puede excitar
Cy5 (excitación a 635 nm). Se filtró la emisión de GFP usando un
filtro de paso de banda de 530 nm y se filtró la emisión de Cy5
usando un filtro de paso largo de 650. Se activaron apropiadamente
las células mediante dispersión lateral y directa y se recogieron
30.000 acontecimientos por muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis de polímeros. Tal como se
describió previamente (Lynn, D.M. y R. Langer, Degradable
poly(\beta-amino esters): synthesis,
characterization, and self-assembly with plasmid
ADN. J. Am. Chem. Soc., 2000. 122(44): págs.
10761-10768), la síntesis de
poli(\beta-amino-ésteres) avanza por medio
de la adición conjugada de aminas a grupos acrilato. Debido a que
la reacción es una polimerización por etapas, se obtiene una
distribución estadística amplia de longitudes de cadena, con el
peso molecular promedio y los grupos terminales de la cadena
controlados por la estequiometría de los monómeros (Flory, P., en
Principles of Polymer Chemistry. 1953, Cornell University Press:
Ithaca, NY. págs. 40-46, 318-323;
Odian, G., Step Polimerization, en Principles of Polimerization.
1991, John Wiley & Sons, Inc.: Nueva York. págs.
73-89). El peso molecular aumenta a medida que la
razón de monómeros se acerca a la equivalencia estequiométrica, y
un exceso de monómero de amina o diacrilato da como resultado
cadenas terminadas en amina o acrilato, respectivamente. Para esta
clase de polímeros, es esencial un control preciso de la
estequiometría para controlar el peso molecular del polímero. Aunque
la estequiometría de los monómeros es el factor más importante que
afecta a la longitud de cadena, deben considerarse también las
reacciones laterales de competición que pueden tener un impacto
sobre el peso molecular y la estructura de los productos de
polímero. En particular, las reacciones de ciclación intramolecular,
en las que una amina en un extremo del polímero en crecimiento
reacciona en cadena con un acrilato en el otro extremo, pueden
limitar los pesos moleculares obtenidos (Odian, G., Step
Polimerization, en Principles of Polimerization. 1991, John Wiley
& Sons, Inc.: Nueva York. págs. 73-89). Estas
cadenas cíclicas pueden tener también propiedades que difieren de
las de sus homólogos
lineales.
lineales.
En este trabajo, se ha modificado el
procedimiento de polimerización notificado anteriormente con el fin
de controlar mejor la estequiometría de los monómeros y minimizar
las reacciones de ciclación. En primer lugar, se aumentó la escala
de la síntesis desde aproximadamente 0,5 g hasta 1 g para permitir
el control de la estequiometría dentro del 1%. La mejora adicional
en la exactitud está limitada por la pureza (98-99%)
de los monómeros comercialmente disponibles usados. En segundo
lugar, se pesaron todos los monómeros en viales en lugar de
dispersarse volumétricamente. Se encontró que las discrepancias
entre las densidades de monómeros reales y notificadas no eran
insignificantes en algunos casos, conduciendo a inexactitudes en la
masa dispensada. En tercer lugar, se realizaron las polimerizaciones
en ausencia de disolvente para maximizar la concentración de
monómero, favoreciendo así la reacción de adición intermolecular
con respecto a la reacción de ciclación intramolecular. La
eliminación del disolvente también proporciona los beneficios
añadidos de aumentar la velocidad de reacción y obviar la etapa de
eliminación del disolvente. Finalmente, puesto que no se usó el
disolvente cloruro de metileno empleado previamente, pudo
aumentarse la temperatura de reacción desde 45ºC hasta 100ºC.
Aumentar la temperatura dio como resultado un aumento de la
velocidad de reacción y una disminución en la viscosidad de la
mezcla de reacción, ayudando a compensar la viscosidad superior del
sistema sin disolvente. El efecto combinado de aumento de la
concentración de monómero y temperatura de reacción dio como
resultado una disminución en el tiempo de reacción desde
aproximadamente 5 días hasta 5
horas.
horas.
Se sintetizaron los polímeros
Poli-1 y Poli-2 añadiendo diacrilato
de 1,4-butanodiol y diacrilato de
1,6-hexanodiol, respectivamente, a
1-aminobutanol. Se sintetizaron doce versiones
únicas de cada polímero variando las razones molares de
amina/diacrilato entre 0,6 y 1,4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para ambos conjuntos de polímeros
(Poli-1 y Poli-2), 7 de los 12
tenían razones de amina/diacrilato > 1, dando como resultado
polímeros terminados en amina, y 5 de los 12 tenían razones de
amina/diacrilato < 1, dando como resultado polímeros terminados
en acrilato. Tras 5 h de reacción a 100ºC, se obtuvieron polímeros
como líquidos viscosos transparentes, ligeramente amarillentos. Los
polímeros tenían diferencias observables en la viscosidad,
correspondientes a diferencias en el peso molecular. Se analizaron
los polímeros mediante cromatografía de permeación en gel de fase
orgánica (CPG) empleando un 70% de THF/30% de DMSO (v/v) +
piperidina 0,1 M como eluyente. Los pesos moleculares de los
polímeros (M_{w}) oscilaban desde 3350 (Poli-1,
amina/diacrilato =1,38) hasta 18.000 (Poli-1,
amina/diacrilato = 0,95), en relación con patrones de poliestireno
(figura 16). Las distribuciones del peso molecular eran monomodales
con índices de polidispersidad (PDI) que oscilaban desde 1,55
hasta
2,20.
2,20.
Resultados de la transfección de
luciferasa. Se realizaron experimentos de transfección con los
24 polímeros sintetizados (12 de cada uno de Poli-1
y Poli-2) a 9 razones de polímero/ADN diferentes
para determinar el impacto del peso molecular, la razón de
polímero/ADN y el grupo terminal de la cadena sobre la eficiencia
de transfección (figuras 17 y 18). Como sistema modelo, se usó la
línea celular COS-7 y un plásmido que codificada
para el gen indicador de luciferasa de luciérnaga
(pCMV-Luc) (600 ng/pocillo). Para facilitar la
realización de casi 1000 transfecciones (datos obtenidos por
cuadriplicado), se realizaron los experimentos en formato de placa
de 96 pocillos. Se determinaron los niveles de expresión de proteína
indicadora usando un kit de ensayo de luciferasa comercialmente
disponible y un lector de placas de luminiscencia de 96
pocillos.
Los datos presentados en las figuras 17 y 18
demuestran que el peso molecular del polímero, la razón de
polímero/ADN y el grupo terminal de la cadena tienen un impacto
sobre las propiedades de transfección de ambos polímeros
Poli-1 y Poli-2. Un resultado
sorprendente y un tanto inesperado fue que ninguno de los polímeros
terminados en acrilato mediaban niveles apreciables de transfección
en ninguna de las condiciones evaluadas. Este resultado puede
aplicarse más ampliamente para
poli(\beta-amino-ésteres), ya que hay que
sintetizar todavía un polímero, usando un exceso de monómero de
acrilato, que medie una expresión del gen indicador apreciable a
cualquiera de las razones de polímero/ADN que se han empleado.
Estos hallazgos sugieren que quizá sólo los
poli(\beta-amino-ésteres) terminados en
amina son adecuados para su uso como vehículo de administración
génica. Por el contrario, había regiones diferenciadas de actividad
de transfección en el espacio de
M_{w}-polímero/ADN para versiones terminadas en
amina tanto de Poli-1 como Poli-2
(figuras 17-A y 18-A). Se lograron
niveles máximos de expresión de gen indicador de 60 ng de
luc/pocillo y 26 ng de luc/pocillo usando Poli-1,
(M_{w} = 13.100) y Poli-2 (M_{w} = 13.400),
respectivamente. Estos resultados concuerdan de manera bastante
favorable con PEI (polímero/ADN =1:1 p/p), que mediaba un nivel de
expresión de 6 ng de luc/pocillo (datos no mostrados) en las mismas
condicio-
nes.
nes.
Aunque los niveles más altos de transfección se
producían usando las versiones de peso molecular superior de ambas
estructuras de polímero, las razones de polímero/ADN óptimas para
estos polímeros eran marcadamente diferentes (polímero/ADN =150
para Poli-1, polímero/ADN = 30 para
Poli-2). Los resultados de transfección que se han
obtenido para Poli-1 y Poli-2
destacan la importancia de optimizar el peso molecular del polímero
y la razón de polímero/ADN, y la importancia de controlar los grupos
terminales de la cadena. Además, el hecho de que dos de tales
estructuras de polímero similares, que difieren sólo en dos carbonos
en la unidad de repetición, tengan tales parámetros de transfección
óptimos diferentes, hace hincapié en la necesidad de realizar estas
optimizaciones para cada estructura de polímero única. Para mejorar
la comprensión de los resultados de transfección obtenidos, se
eligió estudiar dos importantes características de administración
que tienen un impacto directo sobre la expresión transgénica, la
citotoxicidad y la capacidad para entrar en las células por medio de
endocitosis (Wiethoff, C.M, y C.R. Middaugh, Barriers to nonviral
gene delivery, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2003.
92(2): págs. 203-
217).
217).
Citotoxicidad. Se evaluaron las
citotoxicidades de los diversos complejos de polímero/ADN usando un
ensayo de reducción de colorante MTT/azul de tiazolilo
convencional. Se realizaron los experimentos exactamente como los
experimentos de transfección descritos anteriormente, excepto porque
en lugar de someter a ensayo la expresión de gen indicador en el
día 3, se realizó el ensayo de MTT tras el día 1 (véase Materiales y
métodos). Se suponía inicialmente que la falta de actividad de
transfección observada para polímeros terminados en acrilato puede
haberse debido a la citotoxicidad de los grupos terminales acrilato.
Las figuras 19-B y 20-B indican que
las altas concentraciones de acrilato son tóxicas, ya que se
observa que la viabilidad disminuye con el aumento de la razón de
polímero/ADN y la disminución del M_{w} del polímero (un M_{w}
inferior se corresponde con una concentración superior de grupos
terminales). Sin embargo, la citotoxicidad de los acrilatos no
explica suficientemente la falta de actividad de transfección a
razones de polímero/ADN inferiores o pesos moleculares superiores.
Los datos mostrados en la figura 19-A demuestran que
la citotoxicidad no es un factor limitante para vectores de
Poli-1, puesto que las células siguen siendo viables
incluso a las razones de polímero/ADN más altas. Por otro lado, los
datos presentados en la figura 20-A sugieren que la
citotoxicidad es un factor importante que limita la eficiencia de
transfección de vectores de Poli-2, especialmente
para los polímeros de peso molecular inferior. Este resultado puede
explicar por qué la actividad de transfección es inexistente o
decreciente para vectores de Poli-2 a polímero/ADN
> 30 (véase la figura
18-A).
18-A).
Captación celular. Se evaluó la capacidad
de las células para captar complejos de polímero/ADN usando una
técnica basada en citometría de flujo descrita previamente para
medir la fluorescencia de ADN administrado mediante vector (Akinc,
A. y otros, Parallel synthesis and biophysical characterization of a
degradable polymer library of gene delivery. J. Am. Chem. Soc.,
2003). En resumen, se prepararon complejos de polímero/ADN usando
ADN de plásmido unido covalentemente con el colorante fluorescente
Cy5. Para permitir la comparación de los datos de captación celular
con los datos de expresión génica resumidos anteriormente, se
formaron los complejos a las mismas razones de polímero/ADN y de la
misma manera que en los experimentos de transfección. Se incubaron
los complejos marcados con células COS-7 durante 1 h
a 37ºC para permitir la captación. Se cuantificó entonces el nivel
relativo de captación de partículas midiendo la fluorescencia de
células cargadas con ADN marcado con Cy5. Los resultados de estos
experimentos de captación se resumen en las figuras 21 y 22. Los
datos mostrados en la figura 21-B y
22-B sugieren que la falta de actividad de
transfección para los polímeros terminados en acrilato no se debe a
citotoxicidad, tal como se pensaba inicialmente, sino en su lugar a
una incapacidad para entrar en la célula. De manera similar, los
complejos de Poli-1 tienen una captación gravemente
limitada a todas las razones de polímero/ADN menos a la más alta
(figura 21-A). Aunque estos datos no se
correlacionan exactamente con los resultados de transfección
obtenidos para Poli-1, son consecuentes con el hecho
de que no se observa actividad de transfección hasta que se emplean
razones de polímero/ADN muy altas. Los complejos de
Poli-2 no muestran una captación celular apreciable
a razones de polímero/ADN < 30 y muestran niveles de captación
crecientes a medida que las razones de polímero/ADN aumentan más
allá de 30 (figura 22-A). Este resultado, combinado
con los resultados de citotoxicidad anteriores, ayuda a explicar la
actividad de transfección de los complejos de
Poli-2. A razones de polímero/ADN inferiores a 30,
los complejos no entran de manera eficaz en la células, pero a
medida que las razones de polímero/ADN aumentan mucho más allá de
30, la citotoxicidad comienza a limitar la eficiencia de
transfección, dando como resultado una actividad de transfección
óptima cercana a polímero/ADN =
30.
30.
Cuando la endocitosis es la vía principal de
entrada celular, la formación eficaz de complejos de polímero/ADN a
escala nanométrica es un requisito para lograr altos niveles de
captación celular (De Smedt, S. C., J. Demeester, y W. E. Hennink,
Cationic polymer based gene delivery Systems. Pharmaceutical
Research, 2000. 17(2): págs. 113-126;
Prabha, S. y otros, Size-dependency of
nanoparticle-mediated gene transfection: studies
with fractionated nanoparticles. International Journal of
Pharmaceutics, 2002. 244(1-2): págs.
105-115). Los malos niveles de captación observados
para muchos de los complejos de polímero/ADN pueden haber sido
atribuibles a la formación insatisfactoria de complejos estables, a
escala nanométrica. Desfortunadamente, la escasa solubilidad a pH
neutro de los polímeros impidió realizar mediciones por dispersión
de luz dinámica del tamaño de los complejos usando el medio de
transfección (medios Opti-MEM con suero reducido, pH
7,2) como diluyente. Las lecturas obtenidas eran atribuibles a
precipitados de polímero, que en algunos casos eran visibles como
turbidez en disoluciones de polímero en Opti-MEM.
Sin embargo, pudieron medirse los diámetros eficaces de los
complejos usando acetato de sodio 25 mM (pH 5) como diluyente de la
muestra. Aunque estos datos no pueden arrojar luz sobre el tamaño o
la estabilidad de los complejos en el medio de transfección, pueden
indicar si los complejos se formaron satisfactoriamente antes de la
adición del medio de transfección. Específicamente, se encontró que
las versiones de peso molecular inferior (M_{w} < 10.700) de
Poli-1 no podían formar complejos a escala
nanométrica, incluso en tampón acetato. En todos los demás casos se
encontró que se formaban complejos de polímero/ADN de tamaño
nanométrico. Aunque estos resultados pueden explicar los malos
niveles de captación asociados con versiones de bajo peso molecular
de Poli-1, no explican satisfactoriamente la baja
actividad de captación de los polímeros terminados en acrilato ni
la dependencia de la razón de polímero/ADN de la captación celular.
Aunque el tamaño de partícula y la estabilidad son factores
importantes que tienen un impacto sobre la captación celular, es
probable que otros factores, aún no identificados, deban
considerarse también con el fin de proporcionar una explicación más
completa de los resultados de captación celular
obtenidos.
obtenidos.
Potenciación de la transfección usando un
agente co-complejante. Tanto
Poli-1 como Poli-2 requieren razones
en peso de polímero/ADN relativamente altas para lograr altos
niveles de transferencia génica. Una explicación puede ser que, en
comparación con otros polímeros usados con frecuencia para compactar
ADN (por ejemplo, polilisina (PLL) y PEI), estos polímeros tienen
densidades de nitrógeno relativamente bajas. Poli-1
tiene un peso molecular por átomo de nitrógeno (M_{w}/N) de 301,
y Poli-2 tiene un M_{w}/N de 329. En comparación,
para PLL y PEI, estas cifras son aproximadamente 65 y 43,
respectivamente. Podría ser posible reducir la cantidad de
Poli-1 o Poli-2 necesaria para
lograr altos niveles de transfección incorporando una pequeña
cantidad de agente co-complejante. Este enfoque
podría ser especialmente beneficioso para vectores de
Poli-2, puesto que la citotoxicidad parece ser una
limitación importante para estos vectores. Para someter a prueba
esta hipótesis, se usaron PLL y PEI como agentes
co-complejantes modelo. Se centró la atención en los
miembros más prometedores de los conjuntos Poli-1
(terminado en amina, M_{w} = 13.100) y Poli-2
(terminado en amina, M_{w} = 13.400) de polímeros. Los datos
presentados en las figuras 23 y 24 indican que podría lograrse una
reducción significativa en el polímero, mientras que se mantienen
altos niveles de eficiencia de transfección, a través del uso de
PLL o PEI como agentes co-complejantes. En algunos
casos, se realizó una potenciación significativa de la actividad de
transfección. Tal como se esperaba, este enfoque de
co-complejación era particularmente beneficioso
para vectores de Poli-2. Este trabajo, y el trabajo
previo (Wagner, E. y otros, Influenza virus hemagglutinin
HA-2 N-terminal fusogenic peptides
augment gene transfer by
transferrin-polylysine-DNA
complexes: toward a synthetic virus-like
gene-transfer vehicle. Proc. Natl. Acad, Sci. U. S.
A., 1992. 89(17): págs. 7934-8; Fritz, J. D.
y otros, Gene transfer into mammalian cells using
histone-condensed plasmid DNA. Hum Gene Ther, 1996.
7(12): págs. 1395-404; Pack, D. W., D.
Putnam, y R. Langer, Design of imidazole-containing
endosomolytic biopolymers for gene delivery. Biotechnol. Bioeng.,
2000. 67(2): págs. 217-23; Lim, Y. B. y
otros, Self-Assembled Ternary Complex of Cationic
Dendrimer, Cucurbituril, and DNA: Noncovalent Strategy in Developing
a Gene Delivery Carrier. Bioconjug Chem, 2002. 13(6): págs.
1181-5), demuestra que la combinación de polímeros
con características de transferencia génica complementarias puede
producir en algunos casos reactivos de administración génica más
eficaces.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar adicionalmente las propiedades de
transfección de los reactivos combinados Poli-1/PLL
y Poli-2/PLL, se realizaron experimentos de
transfección usando un plásmido indicador que codificaba para la
proteína fluorescente verde (pCMV-EGFP). Aunque los
sistemas de ensayo de transfección de GFP y luciferasa miden ambos
la actividad de transfección, proporcionan diferentes tipos de
información. El sistema de luciferasa cuantifica la cantidad total
de proteína luciferasa exógena producida por todas las células en un
pocillo dado, proporcionando una medición de la actividad de
transfección acumulativa. Por el contrario, el sistema de GFP puede
usarse para cuantificar el porcentaje de células que se han
transfectado, proporcionando una medición célula a célula de la
actividad de transfección. Ambos sistemas son útiles y ofrecen
información complementaria referente a las propiedades de
transfección de un sistema de administración génica dado.
Se realizaron transfecciones de GFP de una
manera similar que los experimentos de luciferasa, pero se ampliaron
a escala hasta un formato de placa de 6 pocillos (5 \mug de
plásmido/pocillo). Se transfectaron células COS-7
usando Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN =
60:0,1:1 p/p/p) y Poli-2/PLL
(Poli-2:PLL:ADN =15:0,4:1 p/p/p). Se usaron como
controles Lipofectamine 2000 (\mul de reactivo: \mug de ADN =
1:1), PEI (PEI:ADN = 1:1 p/p, N/P \sim 8) y ADN desnudo como
controles en el experimento. Tras 1 h de incubación con las células,
se retiraron los vectores y se añadió medio de crecimiento nuevo.
Dos días más tarde, se sometió a ensayo la expresión de GFP usando
un citómetro de flujo. Casi todas las células transfectadas con
Poli-1/PLL eran positivas para la expresión de GFP
(figuras 25 y 26). Los experimentos indicaron que los vectores de
Poli-2/PLL eran menos eficaces, dando como
resultado aproximadamente un 25% de células positivas. Los controles
positivos Lipofectamine 2000 y PEI pudieron mediar también una
transfección eficaz de células COS-7 en las
condiciones empleadas. Aunque las transfecciones de Lipofectamine
2000 y PEI dieron como resultado casi el mismo porcentaje de células
positivas para GFP que Poli-1/PLL, el nivel de
fluorescencia de las células positivas para GFP era superior para
Poli-1/PLL (fluorescencia media = 6033) que el de
tanto Lipofectamine 2000 (fluorescencia media = 5453) como PEI
(fluorescencia media = 2882). Multiplicar el porcentaje de células
positivas por el nivel de fluorescencia media de células positivas
proporciona una medición de la expresión de agregados para la
muestra y, en teoría, debe correlacionarse mejor con los resultados
de los experimentos de expresión del gen de luciferasa. Cuantificar
la expresión de GFP total de esta manera indica que el nivel de
expresión más alto se logra mediante Poli-1/PLL,
seguido por Lipofectamine 2000 y PEI. Este resultado está de acuerdo
en general con los resultados de la expresión de
luciferasa.
luciferasa.
Experimentos han mostrado que
Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN =
60:0,1:1 p/p/p) es un vector altamente eficaz para transfectar
células COS-7. Se investigó también la capacidad de
este vector para mediar la transfección en otras tres líneas
celulares comúnmente usadas (CHO, NIH 3T3 y HepG2). Es muy probable
que cada una de estas líneas celulares tenga condiciones de
transfección óptimas que difieren de las usadas para transfectar
células COS-7; sin embargo, como evaluación
preliminar de la capacidad para transfectar múltiples líneas
celulares, se realizaron las transfecciones de la misma manera y en
las mismas condiciones que las transfecciones de
COS-7. Los resultados indican que
Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN =
60:0,1:1 p/p/p) puede transfectar satisfactoriamente células CHO,
NIH 3T3 y HepG2, aunque no tan eficazmente como células
COS-7 (figura 27). Esto no es demasiado
sorprendente puesto que el vector usado se optimizó examinando la
transferencia génica en células COS-7. Se esperaría
que la optimización de la composición de vectores y las condiciones
de transfección específicas para cada tipo de célula diese como
resultado niveles de transfecciones incluso superiores.
\vskip1.000000\baselineskip
En este trabajo, se ha investigado el papel del
peso molecular del polímero, el grupo terminal de la cadena de
polímero y la razón de polímero/ADN sobre varias propiedades de
transferencia génica importantes. Se encontró que los tres factores
tienen un impacto significativo sobre la transferencia génica,
destacando el beneficio de controlar y optimizar cuidadosamente
estos parámetros. Además, la incorporación de una pequeña cantidad
de PLL, usada como ayuda en la complejación, potencia adicionalmente
la transferencia génica. A través de estos enfoques, pueden
preparase vectores a base de
poli(beta-amino-ésteres) degradables que
rivalizan con algunos de los mejores vectores no virales
disponibles para la transferencia génica in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Para sintetizar y caracterizar adicionalmente
algunos de los poli(beta-amino-ésteres)
identificados en exámenes previos, volvieron a sintetizarse
veintiún polímeros a diversas razones de monómero de amina con
respecto a monómero de acrilato. Se caracterizaron los polímeros
resultantes mediante cromatografía de permeación en gel para
determinar el peso molecular y la polidispersidad de cada polímero.
Se sometió a prueba entonces cada uno de los polímeros para
determinar su capacidad para transfectar células.
Dentro del experimento 6, las referencias a los
polímeros C36, F28, C32, U85, JJ32, JJ36, JJ28, U32, U28, E28, LL8,
U36, E32, C80, E80, JJ80 y U80 se proporcionan para comparación.
Síntesis de polímeros. Se sintetizaron
los polímeros tal como se describió en el ejemplo 5. Se crearon
varias versiones de cada polímero variando la razón estequiométrica
de amina/diacrilato. Por ejemplo, C36-1 corresponde
a la razón estequiométrica de 1,4, y C36-12 a 0,6,
facilitándose todos los valores intermedios en la tabla a
continuación:
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Normalmente, se prepararon los polímeros en
viales de vidrio sin disolvente a 100ºC durante 5 horas. En algunas
síntesis, la polimerización a 100ºC proporcionó polímeros altamente
reticulados cuando se usaron ciertos monómeros tales como amina 94;
por tanto, se repitieron las reacciones de polimerización a 50ºC con
2 ml de DMSO añadidos para evitar la reticulación.
Se analizaron los polímeros resultantes mediante
CPG tal como se describió en el ejemplo 5. Los pesos moleculares y
las polidispersidades de cada uno de los polímeros se muestran en la
tabla a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayo de transfección de luciferasa. Tal
como se describe en el ejemplo 5, se transfectaron células
COS-7 con ADN de pCMV-Luc usando
cada uno de los polímeros a razones de polímero con respecto a ADN
que oscilaban desde 10:1 hasta 100:1 (peso:peso). Se analizó la
expresión de luciferasa usando kits de ensayo
Bright-Glo (Promega). Se medió la luminiscencia
para cada transfección, y se usó la luminiscencia para calcular los
nanogramos de enzima luciferasa tal como se describe en el ejemplo
5. Se realizaron los experimentos por cuadruplicado, y los valores
mostrados en las tablas a continuación son los valores promediados
de los cuatro experimentos. Estos datos se muestran a continuación
para cada polímero sintetizado.
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La siguiente tabla muestra la síntesis de los
polímeros enumerados a la derecha usando razones de monómero de
amina con respecto a monómero de acrilato que oscilan desde 1,4
hasta 0,6 tal como se describió anteriormente. Cada síntesis del
polímero se sometió a prueba entonces para determinar la
transfección de luciferasa usando seis razones de polímero con
respecto a ADN diferentes (cada experimento se realizó por
cuadruplicado). Los datos de la tabla representan la actividad de
luciferasa con la mejor razón de polímero con respecto a ADN.
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Claims (80)
1. Un
poli(beta-amino-éster) preparado a partir de
un bis(éster de acrilato) y una amina, en el que la amina se
selecciona del grupo que consiste en las fórmulas
6-94:
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y sus derivados y
sales.
2. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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3. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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4. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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5. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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6. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
7. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
8. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
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9. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
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10. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, en el que la amina es de fórmula:
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11. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, en el que el acrilato es de fórmula
A-PP:
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12. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 11, en el que el bis(éster de acrilato) es de
fórmula:
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\vskip1.000000\baselineskip
13. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 11, en el que el bis(éster de acrilato) es de
fórmula:
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\vskip1.000000\baselineskip
14. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 11, en el que el bis(éster de acrilato) es de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
15. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 11, en el que el bis(éster de acrilato) es de
fórmula:
16. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 11, en el que el
poli(beta-amino-éster) se selecciona del
grupo que consiste en: C86, D60, D61, U94, LL6, C94, F94, JJ94,
JJ86, C86, U86, E86, B17, D70, U87, D87, C94, D86, F86, AA94, AA60,
A61, D94, U94, E94, B17, M17 y AA61.
17. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 11, de fórmula:
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\vskip1.000000\baselineskip
en el que n es un número entero
entre 3 y 10.000; y sus derivados y
sales.
18. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 11, de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el que n es un número entero
entre 3 y 10.000; y sus derivados y
sales.
19. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 11, de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en el que n es un número entero
entre 3 y 10.000; y sus derivados y
sales.
20. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, de fórmula:
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preparado por adición conjugada de
una amina
primaria
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a un bis(éster de
acrilato)
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en el que la amina primaria es de
fórmula:
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en
donde:
R_{1} se proporciona mediante las aminas
primarias 6, 7, 16, 17, 18, 37, 38, 39, 41, 47, 51, 72, 73, 74, 76,
77, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 92 ó 94;
B es una cadena de átomos de carbono o
heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida
en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo,
alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino,
hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo
heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido
carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y
ureido;
n es un número entero que corresponde a un
polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta
20.000 g/mol y derivados y sales del mismo.
21. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 20, en el que la amina es de fórmula:
22. El
poli(beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, de fórmula
preparado por adición conjugada de
una bis(amina
secundaria)
a un bis(éster de
acrilato)
en el que la bis(amina
secundaria) es de
fórmula:
en
donde:
R_{1}, R_{2} y A se proporcionan mediante la
bis(amina secundaria) 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,
69, 70 ó 71;
cuando la bis(amina secundaria) es 70 ó
71, R_{1} y R_{2} están unidos formando una estructura cíclica
con A;
B es una cadena de átomos de carbono o
heteroátomos ramificada o no ramificada, sustituida o no sustituida
en la que los sustituyentes incluyen hidrógeno, alquilo, alquenilo,
alquinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino,
hidroxilo, alcoxilo, halógeno, arilo, grupo heterocíclico, grupo
heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoílo, ácido
carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, arilo, acetilo y
ureido;
n es un número entero que corresponde a un
polímero con un peso molecular que oscila desde 1000 g/mol hasta
20.000 g/mol y derivados y sales del mismo.
23. El
poli(beta-amino-éster) según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 22, en el que el polímero está terminado
en amina.
24. El
poli(beta-amino-éster) según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 22, en el que el polímero está terminado
en acrilato.
25. Una composición que comprende:
un poli(beta-amino-éster)
según la reivindicación 1,
un polinucleótido, y
un agente co-complejante
seleccionado del grupo que consiste en polímeros catiónicos,
proteínas catiónicas, PLGA, espermina, espermidina, poliaminas,
polietilenimina (PEI) y polilisina (PLL).
26. La composición según la reivindicación 25,
en la que la razón de agente co-complejante con
respecto a polinucleótido oscila desde 0,1 hasta 1,2 (p/p/p).
27. La composición según la reivindicación 25,
en la que la razón de poli(beta-amino-éster)
con respecto a polinucleótido oscila desde 10 hasta 120.
28. Un método de síntesis de un
poli(\beta-amino-éster) según la
reivindicación 1, comprendiendo el método las etapas de:
proporcionar una amina primaria o
bis(amina secundaria) seleccionada del grupo que consiste en
las fórmulas 6, 7, 16-18, 37-39,
41, 47, 51, 60-74, 76, 77, 83, 84,
86-89, 92 y 94 según la reivindicación 1;
proporcionar un bis(éster de acrilato); y
hacer reaccionar la amina y el bis(éster de
acrilato) en condiciones adecuadas para formar el
poli(\beta-amino-éster).
29. El método según la reivindicación 28, en el
que la amina es de fórmula:
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30. El método según la reivindicación 28, que
comprende además la etapa de examinar el polímero para determinar
una característica deseada, en el que el
poli(\beta-amino-éster) no se precipita,
purifica ni aísla antes de la etapa de examinar.
31. El método según la reivindicación 28, en el
que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina
y el bis(éster de acrilato) en un disolvente orgánico.
32. El método según la reivindicación 28, en el
que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina
y el bis(éster de acrilato) en ausencia de un disolvente.
33. El método según la reivindicación 28, en el
que el disolvente orgánico se selecciona del grupo que consiste en
THF, dietil éter, glima, hexanos, metanol, etanol, isopropanol,
cloruro de metileno, cloroformo, tetracloruro de carbono,
dimetilformamida, acetonitrilo, benceno, DMSO y tolueno.
34. El método según la reivindicación 28, en el
que el disolvente orgánico es DMSO.
35. El método según la reivindicación 28, en el
que la concentración de la amina es de entre aproximadamente 0,01 M
y 5 M.
36. El método según la reivindicación 28, en el
que la concentración de la amina es de entre aproximadamente 0,1 M
y 2 M.
37. El método según la reivindicación 28, en el
que la concentración de la amina es de entre aproximadamente 1 M y
2 M.
38. El método según la reivindicación 28, en el
que la concentración del bis(éster de acrilato) es de entre
aproximadamente 0,01 M y 5 M.
39. El método según la reivindicación 28, en el
que la concentración del bis(éster de acrilato) es de entre
aproximadamente 0,1 M y 2 M.
40. El método según la reivindicación 28, en el
que la concentración del bis(éster de acrilato) es de entre
aproximadamente 1 M y 2 M.
41. El método según la reivindicación 28, en el
que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina
y el bis(éster de acrilato) a una temperatura de entre 0 y 75ºC.
42. El método según la reivindicación 28, en el
que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina
y el bis(éster de acrilato) a una temperatura de entre 20 y
50ºC.
43. El método según la reivindicación 28, en el
que la etapa de hacer reaccionar comprende la reacción de la amina
y el bis(éster de acrilato) a una temperatura de entre 30 y
60ºC.
44. Un método de encapsulación de un agente en
una matriz de poli(\beta-amino-ésteres)
para formar micropartículas, comprendiendo el método las etapas
de:
proporcionar un agente;
proporcionar un
poli(\beta-amino-éster) según la
reivindicación 1; y
poner en contacto el agente y el
poli(\beta-amino-éster) en condiciones
adecuadas para formar micropartículas.
45. El método según la reivindicación 44, en el
que el agente es un polinucleótido.
46. El método según la reivindicación 45, en el
que el polinucleótido es ADN.
47. El método según la reivindicación 45, en el
que el polinucleótido es ARN.
48. El método según la reivindicación 44, en el
que el agente es una molécula pequeña.
49. El método según la reivindicación 44, en el
que el agente es una proteína.
50. El método según la reivindicación 44, en el
que la etapa de poner en contacto comprende secar por pulverización
una mezcla del agente y el
poli(\beta-amino-éster).
51. El método según la reivindicación 44, en el
que la etapa de poner en contacto comprende técnicas doble emulsión
- evaporación del disolvente.
52. El método según la reivindicación 44, en el
que la etapa de poner en contacto comprende una técnica de
inversión de fases.
53. Un método de examinar una biblioteca de
polímeros, comprendiendo el método las etapas de:
proporcionar una pluralidad de polímeros, siendo
los polímeros poli(beta-amino-ésteres) según
la reivindicación 1; y
examinar los polímeros para determinar una
propiedad deseada útil en terapia génica.
54. El método según la reivindicación 53, en el
que la etapa de proporcionar comprende sintetizar los polímeros en
paralelo.
55. El método según la reivindicación 54, en el
que la etapa de sintetizar comprende sintetizar los polímeros en
DMSO.
56. El método según la reivindicación 54, en el
que la etapa de sintetizar no incluye precipitar, purificar ni
aislar el polímero antes de la etapa de examinar.
57. El método según la reivindicación 53, en el
que la pluralidad de poli(beta-amino-ésteres)
comprende al menos 500
poli(beta-amino-ésteres).
58. El método según la reivindicación 53, en el
que la pluralidad de poli(beta-amino-ésteres)
comprende al menos 1000
poli(beta-amino-ésteres).
59. El método según la reivindicación 53, en el
que la pluralidad de poli(beta-amino-ésteres)
comprende al menos 1500
poli(beta-amino-ésteres).
60. El método según la reivindicación 53, en el
que la pluralidad de poli(beta-amino-ésteres)
comprende al menos 2000
poli(beta-amino-ésteres).
61. El método según la reivindicación 53, en el
que la propiedad deseada es una capacidad para unirse a un
polinucleótido.
62. El método según la reivindicación 53, en el
que la propiedad deseada es solubilidad en una disolución
acuosa.
63. El método según la reivindicación 53, en el
que la propiedad deseada es solubilidad en una disolución acuosa a
un pH inferior a 7.
64. El método según la reivindicación 53, en el
que la propiedad deseada es solubilidad en una disolución acuosa a
pH 5 y no ser soluble en una disolución acuosa a pH 7.
65. El método según la reivindicación 53, en el
que la propiedad deseada es la capacidad para unirse a heparina.
66. El método según la reivindicación 53, en el
que la propiedad deseada es la capacidad para aumentar la
eficiencia de transfección.
67. El método según la reivindicación 53, en el
que la propiedad deseada es útil en la ingeniería de tejidos.
68. El método según la reivindicación 53, en el
que la propiedad deseada es la capacidad para ayudar al crecimiento
celular.
69. El método según la reivindicación 53, en el
que la propiedad deseada es la capacidad para ayudar a la unión
celular.
70. El método según la reivindicación 53, en el
que la propiedad deseada es la capacidad para ayudar al crecimiento
tisular.
71. Un método de examinar una colección de
poli(beta-amino-ésteres), comprendiendo el
método las etapas de:
proporcionar una pluralidad de
poli(beta-amino-ésteres) según la
reivindicación 1;
proporcionar un polinucleótido que incluye un
gen indicador;
proporcionar células;
poner en contacto cada uno de los polímeros con
el polinucleótido dando como resultado una mezcla de
polinucleótido:polímero;
poner en contacto las células con la mezcla de
polinucleótido:polímero; y
determinar si las células expresan el gen
indicador.
72. El método según la reivindicación 71, en el
que la etapa de proporcionar una pluralidad de polímeros comprende
sintetizar los polímeros en paralelo.
73. El método según la reivindicación 71, en el
que la pluralidad de polímeros comprende al menos 500 polímeros
diferentes.
74. El método según la reivindicación 71, en el
que la pluralidad de polímeros comprende al menos 1000 polímeros
diferentes.
75. El método según la reivindicación 71, en el
que el gen indicador codifica para la proteína fluorescente
verde.
76. El método según la reivindicación 71, en el
que las células son células de mamífero.
77. El método según la reivindicación 71, en el
que las células son células bacterianas.
78. El método según la reivindicación 71, en el
que las células son células COS-7.
79. El método según la reivindicación 71, en el
que la razón de polímero con respecto a polinucleótido es de 10:1,
15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1,
70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 105:1, 110:1, 120:1,
130:1, 140:1, 150:1 y 200:1.
80. El método según la reivindicación 71, en el
que la etapa de determinar comprende cuantificar la cantidad de
expresión del gen indicador.
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