ES2290737T3 - Poli(esteres de beta-amino) y sus usos. - Google Patents
Poli(esteres de beta-amino) y sus usos. Download PDFInfo
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Abstract
Un compuesto de la fórmula: en donde cada R¿ está independientemente seleccionado del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de cadena corta C1-C6, alcoxi de cadena corta C1-C6, hidroxi, amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, tiol, heteroaril, aril, fenil, heterociclo, carbociclo, y halógeno; n es un número entero ente 3 y 10.000; x es un número entero entre 1 y 10; y cuando X es metil o NR2; y R se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y heteroaril; o cuando X es OR; y R se selecciona del grupo que consiste en alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y heteroaril; y es un número entero entre 1 y 10; o cuando X es OR; y R es hidrógeno, y es 5 o un número entero entre 1 y 2 o 6 y 10 y derivados y sales del mismo.
Description
Poli(ésteres de \beta-amino) y
sus usos.
El trabajo descrito aquí fue financiado, en
parte, por becas de la Nacional Science Foundation (Acuerdo de
cooperación #ECC9843342 para el MIT Biotechnology Process
Engineering Center), el Nacional Institutes of Health (GM26698; NRSA
Beca #1F32 GM20227-01), y el Department of the Army
(Acuerdo de cooperación #DAMD
17-99-2-9-001
para el Center for Innovative Minimally Invasive Therapy). El
gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos sobre la
invención.
El tratamiento de enfermedades humanas a través
de la aplicación de fármacos basados en nucleótidos tales como ADN
y ARN tiene el potencial de revolucionar el campo médico (Anderson
Nature 392 (Suppl.): 25-30, 1996; Friedman
Nature Med. 2:144-147, 1996; Cristal
Science 270:404-410, 1995; Mulligan
Science 260:926-932, 1993. Hasta ahora, el
empleo de virus modificados como vectores de transferencia de genes
ha representado generalmente la aproximación clínicamente más
exitosa de la terapia génica. Mientras que los vectores virales son
actualmente los agentes de transferencia de genes más eficientes,
las preocupaciones acerca de la seguridad total de los vectores
virales, que incluye el potencial de respuestas inmunes no deseadas,
han producido esfuerzos paralelos para desarrollar alternativas no
virales (para referencias principales, véase: Luo et al. Nat.
Biotechnol. 18:33-37, 2000; Behr Acc. Chem.
Res. 26:274-278, 1993). Las alternativas
actuales para los vectores virales incluyen sistemas de trasporte
poliméricos (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev.
30:97-113,1998; Kabanov et al. Bioconjugate
Chem. 6:7-20, 1995), formulaciones de liposomas
(Miller Angew. Chem. Int. Ed. 37:1768-1785,
1998; Hope et al. Molecular Membrane Technology
15:1-14, 1998; Deshmukh et al. New J. Chem.
21:113-124, 1997; y protocolos de inyección de ADN
"desnudo" (Sanford Trends Biotechnol
6:288-302, 1988). Mientras que estas estrategias
tienen todavía que alcanzar la eficacia clínica de los vectores
virales, la seguridad potencial, el procesamiento, y los beneficios
económicos ofrecidos por estos métodos (Anderson Nature 392
(suplemento): 25-30, 1996) han despertado el
interés por el desarrollo continuado de aproximaciones no virales
para terapia génica (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 92:7297-7301, 1995; Putnam et al.
Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al
J. AM. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Gonzalez
et al. Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999;
Kukowska-Latallo et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93:4897-4902, 1996; Tang et al.
Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler
et al. Bioconjugate Chem. 4:372-379,
1993).
Los polímeros catiónicos se han usados
ampliamente como vectores de transfección debidos a la facilidad
con que se condensan y protegen las hebras de ADN cargadas
negativamente. Los polímeros que contienen amina tales como
poli(lisina) (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev.
30:97-113, 1998; Kabanov et al. Bioconjugate
Chem. 6:7-20, 1995), poli(etilenimina)
(PE) (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:7297-7301, 1995), y dendrímeros de
poli(amidoamina) (Kukowska-Latallo et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:4897-4902, 1996;
Tang et al. Bioconjugate Chem. 7:703-714,
1996; Haensler et al. Bioconjugate Chem.
4:372-379, 1993) están cargados positivamente al pH
fisiológico, forman pares de iones con los ácidos nucleicos, y
median la transfección en una variedad de líneas celulares. A pesar
de su uso común, sin embargo, los polímeros catiónicos tales como
poli(lisina) y PEI pueden ser significativamente citotóxicos
(Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113,
1998; Deshmukh et al. New J. Chem.
21:113-124, 1997; Choksakulnimitr et al.
Controlled Release 34:233-241, 1995; Brazeau
et al. Pharm. Res. 15:680-684, 1998). Corno
resultado, la elección del polímero catiónico para una aplicación
de transferencia de genes generalmente requiere un compromiso entre
la transfección eficiente y la toxicidad a corto y largo plazo.
Adicionalmente, la biocompatibilidad a largo plazo de estos
polímeros permanece como un problema importante para el uso en
aplicaciones terapéuticas in vivo, ya que varios de estos
polímeros no son fácilmente biodegradables (Uhrich Trends Polym.
Sci. 5:388-393, 1997; Roberts et al. J.
Biomed. Mater.Res. 30:53-65, 1996).
Para desarrollar alternativas seguras a los
vectores poliméricos existentes y otros biomateriales
funcionalizados, han sido desarrollados poliésteres degradables que
portan cadenas laterales catiónicas (Putnam et al.
Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Barrera
et al. J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011,
1993; Kwon et al. Macromolecules
22:3250-3255, 1989; Lim et al J.Am: Chem.
Soc. 121:5633-5639, 1999; Zhou et al.
Macromolecules 23:3399-3406, 1990). Ejemplos de
estos poliésteres incluyen
poli(L-lactida-co-L-lisina)
(Barrera et al J. Am. Chem. Soc.
115:11010-11011, 1993), poli(éster de serina) (Zhou
et al. Macromolecules 23:3399-3406,
1990),poli(éster de
4-hidroxi-L-prolina)
(Putnam et al. Macromolecules 32:3658-3662,
1999; Lim et al. J. AM. Chem. Soc.
121:5633-5639, 1999), y más recientemente,
poli[ácido de
\alpha-(4-aminobutil)-L-glicólico].
El poli(éster de
4-hidroxi-L-prolina;
y poli[ácido de
\alpha-(4-aminobutil)-L-glicólico
se demostró recientemente que condensan el ADN plasmídico a través
de interacciones electrostáticas, y que median la transferencia de
genes (Putnam et al. Macromolécules
32:3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem.
Soc. 121:5633-5639, 1999). Es importante que
estos nuevos polímeros son significativamente menos tóxicos que
poli(lisina) y PEI, y se degradan como metabolitos no
tóxicos. Está claro por estas investigaciones que el diseño
racional de poliésteres que contienen amina pueden ser una ruta
productiva para el desarrollo de vectores de transfección eficaces,
seguros. Desgraciadamente, sin embargo, la síntesis actual de estos
polímeros requiere o la preparación independiente de los monómeros
especializados (Barrera et al. J. AM. Chem. Soc,
115:11010-11011, 1993), o el uso de cantidades
estequiométricas de reactivos de acoplamiento caros (Putnam et
al. Macromolecules 32:3658-3662, 1999).
Adicionalmente, las funcionalidades de amina en los monómeros deben
estar protegidas antes de la polimerización (Putnam et al
Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al
J. Am. Chem. Soc 121:5633-5639, 1999; Gonzalez
et al. Bioconjugate Chem. 10: 1068-1074,
1999; Barrera et al. J. Am. Chem. Soc.
115:11010-11011, 1993; Kwon et al
Macromolecules 22:3250-3255, 1989), necesitando
etapas adicionales de desprotección posteriores a la polimerización
antes de que los polímeros puedan usarse como agentes de
transfección.
El documento de patente de los Estados Unidos
2002/0131951 describe poli(ésteres de
\beta-amino) preparados por la adición de
conjugados de bis(aminas secundarias) o aminas primarias a un
bis(éster de acrilato) y su uso en sistemas de dispensación de
fármacos.
Hay una necesidad continuada de polímeros
biocompatibles, biodegradables, no tóxicos que puedan usarse para
transfectar ácidos nucleicos y que sean preparados fácil eficiente
y económicamente. Tales polímeros tendrían varios usos, incluyendo
la dispensación de ácidos nucleicos en terapia génica así como en el
empaquetado y/o dispensación de agentes de diagnóstico,
terapéuticos, y profilácticos.
La presente invención proporciona polímeros
útiles en la preparación de dispositivos para la dispensación de
fármacos y composiciones farmacéuticas de los mismos. La invención
también proporciona métodos de preparar los polímeros y métodos de
preparar microesferas y otras composiciones farmacéuticas que
contienen los polímeros de la invención.
Los polímeros de la presente invención son
poli(ésteres de \beta-amino) y sales y derivados
de los mismos. Los polímeros preferidos son biodegradables y
biocompatibles. Típicamente, los polímeros tienen una o más aminas
terciarias en el esqueleto del polímero. Los polímeros preferidos
tienen una o dos aminas terciarias por unidad repetida del
esqueleto. Los polímeros pueden también ser copolímeros en los que
uno de los componentes es un poli(éster de
Í3-amino). Los polímeros de la invención pueden
fácilmente prepararse condensando bis(aminas secundarias) o
aminas primarias con bis(ésteres de acrilato). Un polímero de la
presente invención se define generalmente como sigue:
en
donde
X se selecciona del grupo que consiste en
alquilo de cadena corta C_{1}-C_{6}, alcoxi de
cadena corta C_{1}-C_{6}, halógeno, OR y
NR_{2}; más preferiblemente, metil, OH, o NH_{2};
R se selecciona del grupo que consiste en
hidrógeno, alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y
heteroaril;
Cada R' está independientemente seleccionada del
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de cadena corta
C_{1}-C_{6}, alcoxi de cadena corta
C_{1}-C_{6}, hidroxi, amino, alquilamino,
dialquilamino, ciano, tiol, heteroaril, aril, fenil, heterociclo,
carbociclo, y halógeno; preferiblemente, R' es hidrógeno, metil,
etil, propil, isopropil, butil, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi,
hidroxi, amino, fluoro, cloro, o bromo; más preferiblemente, R'' es
fluoro, hidrógeno, o metil;
n es un número entero ente 3 y 10.000;
x es un número entero entre 1 y 10;
preferiblemente, x es un número entero entre 2 y 6;
y es un número entero entre 1 y 10;
preferiblemente, x es un número entero entre 2 y 6;
y
derivados y sales del mismos. Polímeros
alternativos que no son parte de la invención se representan por
cualquiera de las fórmulas a continuación:
donde A y B son enlazadores que
pueden ser cualquier cadena sustituida o no sustituida, lineal o
ramificada de átomos de carbono o heteroátomos. Los pesos
moleculares de los polímeros pueden estar en el intervalo desde
1000 g/mol a 20.000 g/mol, preferiblemente de 5.000 g/mol a 15.000
g/mol. B puede ser una cadena alquílica de uno a doce átomos de
carbono. B puede ser una cadena heteroalifática que contiene un
total de uno a doce átomos de carbono y heteroátomos. Los grupos
R_{1} y R_{2} pueden ser cualquiera de una amplia variedad de
sustituyentes. R_{1} y R_{2} pueden contener aminas primarias,
aminas secundarias, aminas terciarias, grupos hidroxi, y grupos
alcoxi. Los polímeros pueden ser terminados en amina; y los
polímeros pueden estar terminados en acrilato. Los grupos R_{1}
y/o R_{2} pueden formar estructuras cíclicas con el enlazador A
(véase la sección Descripción detallada más tarde). Los polímeros
que contienen tales restos cíclicos tienen la característica de ser
más solubles a pH bajo. Específicamente los polímeros preferidos
son aquellos que son insolubles en soluciones acuosas a pH
fisiológico (pH 7,2-7,4) y son solubles en
soluciones acuosas por debajo de pH fisiológico (pH<7,2). Otros
polímeros preferidos son aquellos que son solubles en solución
acuosa a pH fisiológico (pH 7,2-7,4) y por debajo.
Los polímeros preferidos son útiles en la transfección de
polinucleótidos dentro de las
células.
Se proporciona un método de preparar los
polímeros de la invención. Monómeros comercialmente disponibles o
monómeros fácilmente disponibles, bis(aminas secundarias),
aminas primarias, y bis(ésteres de acrilato) pueden ser sometidos a
condiciones que conduzcan a la adición del conjugado de la amina a
el bis(éster de acrilato). En una realización particularmente
preferida, cada uno ,je los monómeros se disuelve en un disolvente
orgánico (por ejemplo, DMSO, DMF, THF, éter dietílico, cloruro de
metileno, hexanos, etc), y las soluciones obtenidas se combinan y
calientan por un tiempo suficiente para conducir a la
polimerización de los monómeros. En otras realizaciones, la
polimerización se lleva a cabo en la ausenoia de disolvente. El
polímero obtenido puede después purificarse y opcionalmente
caracterizarse usando las técnicas conocidas en la técnica.
En todavía otro aspecto de la invención, los
polímeros se usan para formar complejos de escala nanométrica con
los ácidos nucleicos. Los complejos de polinucleótido/polímero
pueden formarse añadiendo una solución de polinucleótido a una
solución agitada (con vortex) del polímero a una concentración
ADN/polímero deseada. La relación peso a peso del polinucleótido al
polímero puede estar en el intervalo de 1:0,1 a 1:200,
preferiblemente de 1:10 a 1:150, más preferiblemente de 1:50 a
1:150. La relación de monómero de amina a fosfato de polinucleótido
puede ser aproximadamente 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1,
45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1,
100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 14C:1, 150;1, 160:1, 170:1, 180:1,
190:1, y 200:1. Los polímeros catiónicos condensan el polinucleótido
en partículas solubles típicamente de 50-500 nm de
tamaño. Estos complejos polinucleótido/polímero pueden usarse en la
dispensación de polinucleótidos a las células. En una realización
particularmente preferida, estos complejos se combinan con
excipientes farmacéuticos para formar composiciones farmacéuticas
adecuadas para la administración a animales incluyendo humanos. En
ciertas realizaciones, se usa un polímero con una relación peso
molecular a átomos de nitrógeno alta (por ejemplo, polilisina,
polietilenimina) para aumentar la eficiencia de la transfección.
En otro aspecto de la invención, los polímeros
se usan para encapsular agentes terapéuticos, para diagnosis, y/o
profiláticos incluyendo polinucleótidos para formar
micropartículas. Típicamente estas micropartículas son de un orden
de magnitud mayor que los complejos polinucleótido/polímero. Las
micropartículas están en el intervalo de desde 1 micrómetro a 500
micrómetros. En una realización particularmente preferida, estas
micropartículas permiten la administración de moléculas pequeñas
lábiles, proteínas, péptidos, y/o polinucleótidos a un individuo.
Las micropartículas pueden prepararse usando cualquiera de las
técnicas conocidas en la técnica de hacer micropartículas, tales
como, por ejemplo, doble emulsión, inversión de fase, y secado por
pulverización. En una realización particularmente preferida, las
micropartículas pueden usarse para la administración dirigida por
el pH de los contenidos encapsulados debido a la naturaleza de la
respuesta de los polímeros al pH (por ejemplo, siendo más solubles
a pH bajo).
En todavía otro aspecto, se proporciona un
sistema pira sintetizar y cribar una colección de polímeros. En
ciertas realizaciones, el sistema aprovecha la ventaja de técnicas
conocidas en la técnica automática de manejo de líquidos y la
robótica. El sistema de sintetizar y cribar puede usarse con
poli(ésteres de beta-amino) así como otros tipos de
polímeros que incluyen poliamidas, poliésteres, poliéteres,
policarbamatos, policarbonatos, poliureas, poliaminas, etc. La
colección de polímeros puede ser una colección de un tipo de
polímero por ejemplo, todos poli(ésteres de
beta-amino) o puede ser una colección diversa de
polímeros. Miles de polímeros pueden sintetizarse y cribarse en
paralelo usando el sistema de la invención. En ciertas
realizaciones, los polímeros se criban por propiedades útiles en el
campo de dispensación de genes, transfección, o terapia génica.
Algunas de estas propiedades incluyen la solubilidad a varios pHs,
habilidad para complejar polinucleótidos, habilidad para transfectar
un polinucleótido dentro de una célula, etc. Ciertos
poli(ésteres de beta-amino) encontrados útiles para
transfectar células incluyen M17, KK89, C32, C36, JJ28, JJ32, JJ36,
LL6, y D94 como se describe en los ejemplos 4 y 5.
Lo que sigue son términos químicos usados en la
solicitud y reivindicaciones:
El término acil como se usa aquí se
refiere a un grupo que tiene la fórmula general C(=O)R,
donde R es alquil, alquenil, alquinil, aril, carbociclo,
heterociclo, o heterociclo aromático. Un ejemplo de un grupo acil
es acetil.
El término alquil como se usa aquí se
refiere a radicales de hidrocarburo saturado de cadena lineal o
ramificada derivada de un resto de hidrocarburo que contiene entre
uno y veinte átomos de carbono por eliminación de un átomo de
hidrógeno único. En algunas realizaciones, el grupo alquil empleado
en la invención contiene 1-10 átomos de carbono. En
otra realización, el grupo alquil empleado contiene
1-8 átomos de carbono. En todavía otras
realizaciones, el grupo alquil contiene 1-6 átomos
de carbono. En todavía otras realizaciones, el grupo alquil
contiene 1-4 carbonos. Ejemplos de radicales alquil
incluyen, pero no están limitados a, metil, etil,
n-propil, isopropil, n-butil,
iso-butil, sec-butil,
sec-pentil, iso-pentil,
terc-butil, n-pentil, neopentil,
n-hexil, sec-hexil,
n-heptil, n-octil,
n-decil, n-undecil, dodecil, y
semejantes, que pueden llevar uno o más sustituyentes.
El término alcoxi como se usa aquí se
refiere a un grupo saturado (por ejemplo,
alquil-O-) o insaturado (por ejemplo,
alquenil-O- y alquinil-O-) unido al
resto molecular de origen a través de un átomo de oxígeno. En
ciertas realizaciones, el grupo alquil contiene
1-20 átomos de carbono alifáticos. En ciertas otras
realizaciones, los grupos alquil, alquenil, y alquinil empleados en
la invención contienen 1-8 átomos de carbono
alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo alquil contiene
1-6 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras
realizaciones, el grupo alquíl contiene 1-4 átomos
de carbono alifáticos. Los ejemplos incluyen pero no están
limitados a, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi,
n-butoxi, terc-butoxi, i-butoxi,
sec-butoxi, neopentoxi, n-hexoxy, y
semejantes.
El término alquenil denota un grupo
monovalente derivado de un resto hidrocarburo que tiene al menos un
doble enlace carbono-carbono por la eliminación de
un único átomo de hidrógeno. En ciertas realizaciones, el grupo
alquenil empleado en la invención contiene 1-20
átomos de carbono. En algunas realizaciones, el grupo alquenil
empleado en la invención contiene 1-10 átomos de
carbono. En otra realización, el grupo alquenil empleado contiene
1-8 átomos de carbono. En todavía otras
realizaciones, el grupo alquenil contiene 1-6
átomos de carbono. En todavía otras realizaciones, el grupo
alquenil contiene 1-4 carbonos. Los grupos alquenil
incluyen, por ejemplo, etenil, propenil, butenil,
1-metil-2-buten-1-il,
y semejantes.
El término alquinil como se usa aquí se
refiere a un grupo monovalente derivado de un hidrocarburo que
tiene al menos un triple enlace carbono-carbono por
la eliminación de un único átomo de hidrógeno. En ciertas
realizaciones, el grupo alquinil empleado en la invención contiene
1-20 átomos de carbono. En algunas realizaciones,
el grupo alquinil empleado en la invención contiene
1-10 átomos de carbono. En otra realización, el
grupo alquinil empleado contiene 1-8 átomos de
carbono. En todavía otras realizaciones, el grupo alquinil contiene
1-6 átomos de carbono. Grupos alquinil
representativos incluyen, pero no están limitados a, etinil,
2-propinil (propargil), 1-propinil,
y
semejantes.
semejantes.
Los términos alquilamino, dialquilamino,
y trialquilamino como se usan aquí se refieren a uno, dos,
tres, grupos alquil, respectivamente, como se ha definido
previamente, unidos al resto molecular de origen a través de un
átomo de nitrógeno. El término alquilamino se refiere a un
grupo que tiene la estructura –NHR' en donde R' es un grupo alquil,
como se definió previamente; y el término dialquilamino se
refiere a un grupo que tiene la estructura –NR'R'', en donde R'y
R'' se seleccionan cada una independientemente del grupo que
consiste en grupos alquil. El término trialquilamino se
refiere a un grupo que tiene la estructura –NR'R''R''', en donde R',
R'', y R''' son cada uno independientemente seleccionados del grupo
que consiste en grupos alquil. En ciertas realizaciones, el grupo
alquil contiene 1-20 átomos de carbono alifáticos.
En ciertas otras realizaciones, el grupo alquil contiene
1-10 átomos de carbono alifáticos. En todavía otras
realizaciones, el grupo alquil contiene 1-8 átomos
de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, el grupo
alquil contiene 1-6 átomos de carbono alifáticos.
En todavía otras realizaciones, el grupo alquil contiene
1-4 átomos de carbono alifáticos. Adicionalmente,
R', R'', y/o R''' tomados juntos pueden opcionalmente ser
-(CH_{2})_{k}- donde k es un número entero de 2 a 6.
Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, metilamino,
dimetilamino, etilamino, dietilamino, dietilaminocarbonil,
metiletilamino, iso-propilamino, piperidino,
trimetilamino, y propilamino.
Los términos alquiltioéter y
tioalcoxi se refieren a un grupo saturado (por ejemplo,
alquil-S-) o insaturado (por ejemplo,
alquenil-S- y alquinil-S-) unidos al
resto molecular de origen a través de un átomo de azufre. En
ciertas realizaciones, el grupo alquil contiene
1-20 átomos de carbono alifáticos. En ciertas otras
realizaciones, el grupo alquil contiene 1-10 átomos
de carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, los grupos
alquil, alquenil, y alquinil contienen 1-8 átomos de
carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, los grupos
alquil, alquenil, y alquinil contienen 1-6 átomos de
carbono alifáticos. En todavía otras realizaciones, los grupos
alquil, alquenil, y alquinil contienen 1-4 átomos
de carbono alifáticos. Ejemplos de restos tioalcoxi incluyen, pero
no están limitados a, metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio,
n-buliltio, y semejantes.
El término aril como se usa aquí se
refiere a un resto insaturado cíclico que comprende al menos un
anillo aromático. En ciertas realizaciones, el grupo aril se refiere
a un sistema de anillo carbocíclico mono o bicíclico que tiene uno
o dos anillos aromáticos que incluyen, pero no están limitados a,
fenil, naftil, tetrahidronaftil, indanil, indenil, y semejantes.
Los grupos aril pueden estar sustituidos o no sustituidos con
sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en alquil,
alquenil, alquinil, haloalquil, alcoxi, tioalcoxi, amino,
alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, acilamino, ciano,
hidroxi, halo, mercapto, nitro, carboxialdehído, carboxi,
alcoxicarbonilo, y carboxamida, lineales o ramificados. Además, los
grupos aril sustituidos incluyen tetrafluorofenil y
pentafluorofenil.
El término ácido carboxílico como se usa
aquí se refiere a grupos de fórmula -CO_{2}H.
Los términos halo y halógeno como
se usan aquí se refieren a un átomo seleccionado de fluoro, cloro,
bromo, y yodo.
El término heterocíclico, como se usa
aquí, se refiere a un sistemas de anillo de 3 a 10 miembros,
aromático o no aromático, parcialmente insaturado o totalmente
saturado, que incluye anillos sencillos de 3 a 8 átomos de tamaño y
sistemas de anillos bi- y tri-cíclicos que pueden
incluir arilos de cinco o seis miembros aromáticos o grupos
aromáticos heterocíclicos fusionados a anillos no aromáticos. Estos
anillos heterocíclicos incluyen aquellos que tienen de uno a tres
heteroátomos, independientemente seleccionados de oxígeno, azufre,
y nitrógeno, en los que los heteroátomos nitrógeno y azufre pueden
opcionalmente estar oxidados y el heteroátomo nitrógeno puede
opcionalmente estar cuaternizado. En ciertas realizaciones, el
término heterocíclico se refiere a anillos de 5, 6, o 7 miembros no
aromáticos o un grupo policíclico en donde al menos un átomo del
anillo es un heteroátomo seleccionado de O, S, y N (en donde los
heteroátomos nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente
oxidados), incluyendo, pero no limitado a, un grupo bi o
tricíclico, que comprende anillos de seis miembros fusionados que
tienen entre uno y tres heteroátomos independientemente
seleccionados de oxígeno, azufre, y nitrógeno, en donde (i) cada
anillo de 5 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces, cada anillo de
6 miembros tiene de 0 a 2 dobles enlaces, y cada anillo de 7
miembros tiene de 0 a 3 dobles enlaces, (ii) los heteroátomos
nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, (iii) el
heteroátomo nitrógeno puede opcionalmente estar cuaternizado, y
(iv) cualquiera de los anillas heterocíclicos anteriores puede
estar fusionado a un anillo arito o heteroarilo.
El término heterocíclico aromático, como
se usa aquí, se refiere a un radical cíclico aromático que tiene de
cinco a diez átomos en el anillo de los cuales un átomo de anillo
se selecciona de azufre, oxígeno, y nitrógeno; cero, uno, o dos
átomos del anillo son heteroátomos adicionales independientemente
seleccionados de azufre, oxígeno y nitrógeno; y los átomos del
anillo restantes son carbono, el radical se une al resto de la
molécula vía cualquiera de los átomos del anillo, tales son, por
ejemplo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo,
imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo,
oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolonilo, y
semejantes. Los grupos aromáticos heterocíclicos pueden ser no
sustituidos o sustituidos con sustituyentes seleccionados del grupo
que consisten en alquil, alquenil, alquinil, haloalquil, alcoxi,
tioalcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino,
acilamino, ciano, hidroxi, halo, mercapto, nitro, carboxialdehido,
carboxi, alcoxicarbonil, y carboxamida lineales o
ramificados.
ramificados.
Los grupos heterocíclicos y aromáticos
heterocíclicos específicos que pueden estar incluidos en los
compuestos de la invención incluyen:
3-metil-4-(3-metilfenil)piperazina,
3 metilpiperidina,
4-(bis-(4-fluorofenil)metil)piperazina,
4-(difenilmetil)piperazina,
4-(etoxicarbonil)piperazina,
4-(etoxicarbonilmetil)piperazina,
4-(fenilmetil)piperazina,
4-(1-feniletil)piperazina,
4-(1,1-dimetiletoxicarbonil)piperazina,
4-(2-(bis-(2-propenil)amino)etil)piperazina,
4-(2-(dietilamino;etil)piperazina,
4-(2-clorofenil)piperazina,
4-(2-cianofenil)piperazina,
4-(2-etoxifenil)piperazina,
4-(2-etilfenil)piperazina,
4-(2-fluorofenil)piperazina,
4-(2-hidroxietil)piperazina,
4-(2-metoxietil)piperazina,
4-(2-metoxifenil)piperazina,
4-(2-metilfenil)piperazina,
4(2-metiltiofenil)piperazina,
4-(2-nitrofenil)piperazina,
4-(2-nitrofenil)piperazina,
4-(2-feniletil)piperazina,
4-(2-piridil)piperazina,
4-(2-pirímidinil)piperazina,
4-(2,3-dimetilfenilpiperazina,
4-(2,4-difluorofenil)piperazina,
4-(2,4-dirnetoxifenil)piperazina,
4-(2,4-dimetilfenil)piperazina,
4-(2,5-dimetilfenil)piperazina,
4-(2,6-dimetilfenil)piperazina,
4-(3-clorofenil)piperazina,
4-(3-metilfenil)piperazina,
4-(3-trifluorometilfenil)piperazina,
4-(3,4-diclorofenil)piperazina,
4-(3,4-dimetoxifenil)piperazina,
4-(3,4-dimetilfenil)piperazina,
4-(3,4-metillenodioxifenil)piperazina,
4-(3,4,5-trimetoxifenil)piperazina,
4-(3,5-diclorofenil)piperazina,
4-(3,5-dimetoxifenil)piperazina,
4-(4-(fenilmetoxi)fenil)piperazina,
4-(4-(3,1-dimetiletil)fenilmetil)piperazina,
4-(4-cloro-3-trifluorometilfenil)piperazina,
4-(4-clorofenil)-3-metilpiperazina,
4-(4-clorofenil)piperazina,
4-(4-clorofenil)piperazina,
4-(4-clorofenilmetil)piperazina,
4-(4-fluorofenil)piperazina,
4-(4-metoxifenil)piperazina,
4-(4-melilfenil)piperazina,
4-(4-nitrofenil)piperazina,
4-(4-trifluorometilfenil)piperazina,
4-ciclohexilpiperazina,
4-etilpiperazina,
4-hidroxi-4-(4-clorofenil)metilpiperidina,
4-hidroxi-4-fenilpiperidina,
4-hidroxipirrolidina,
4-metilpiperazina,
4-fenilpiperazina,
4-piperidinilpiperazina,
4-(2-furanil)carbonil)piperazina,
4-((1,3-dioxolan-5-il)metil)piperazina,
6-fluoro-1,2,
3,4-tetrahidro-2-metilquinolina, 1,4-diazacicloheptano,2,3-dihidroindolil,3,3-dimetilpiperidina, 4,4-etilenodioxipiperidina, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 1,2,3,4-tetrahidroquinolina, azaciclooctano, decahidroquinolina, piperazina, piperidina, pirrolidina, tiomorfolina, y triazol.
3,4-tetrahidro-2-metilquinolina, 1,4-diazacicloheptano,2,3-dihidroindolil,3,3-dimetilpiperidina, 4,4-etilenodioxipiperidina, 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina, 1,2,3,4-tetrahidroquinolina, azaciclooctano, decahidroquinolina, piperazina, piperidina, pirrolidina, tiomorfolina, y triazol.
El término carbamoil, como se usa aquí,
se refiere a un grupo amida de la fórmula -CONH_{2}.
El término carbonildioxil, como se usa
aquí, se refiere .a un grupo carbonato de la fórmula
-O-CO-OR.
El término hidrocarburo, como se usa
aquí, se refiere a cualquier grupo químico que comprende hidrógeno
y carbono. El hidrocarburo puede estar sustituido o no sustituido.
El hidrocarburo puede ser no saturado, saturado, lineal. ramificado,
cíclico, policíclico, o heterocíclico. Hidrocarburos ilustrativos
incluyen, por ejemplo, metil, etil, n-propil,
iso-propil, ciclopropil, alil, vinil, n-butil,
terc-butil, etinil, ciclohexil, metoxi, dietilamino, y
semejantes. Como sería conocido para una persona conocedora de esta
técnica, todas las valencias tienen que estar satisfechas haciendo
cualquiera de las sustituciones.
Los términos sustituido, cuando está
precedido del término "opcionalmente" o no, y
sustituyente, como se usa aquí, se refiere a la habilidad,
como puede ser apreciado por una persona conocedora de la técnica,
para cambiar un grupo funcional por otro grupo funcional siempre
que la valencia de todos los átomos se mantenga. Cuando más de una
posición en una estructura dada puede ser sustituida con más de un
sustituyente seleccionado de un grupo específico, el sustituyente
puede ser o el mismo o diferente en cada posición. Los
sustituyentes pueden también posteriormente sustituirse (por
ejemplo, un sustituyente del grupo arilo puede tener otro
sustituyente tal como otro grupo arilo, que está además sustituido
con fluora en una o más posiciones).
El término tiohidroxi o tiol, como
se usa aquí, se refiere a un grupo de la fórmula SH.
El término ureido, como se usa aquí, se
refiere a un grupo urea de la fórmula:
-NH-CO-NH_{2}.
Lo que sigue son los términos más generales
usados a lo largo de la presente solicitud:
"Animal": el término animal, como se usa
aquí, se refiere a seres humanos así como a animales, incluyendo,
por ejemplo, mamíferos, pájaros, reptiles, anfibios, y peces.
Preferiblemente, los animales son mamíferos (por ejemplo, un roedor,
un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, un
primate. o un cerdo). Un animal puede ser un animal doméstico. Un
animal puede ser un animal transgénico.
"Asociado con": cuando dos entidades están
"asociadas con" una con otra como se describe aquí, están
unidas por una interacción covalente o no covalente directa o
indirecta. Preferiblemente, la asociación es covalente.
Interacciones deseables no covalentes incluyen enlaces de
hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones
hidrofóbas, interacciones magnéticas, interacciones electrostáticas,
etc.
"Biocompatible": el término
"biocompatible", como se usa aquí se intenta que describa
compuestos que no son tóxicos para las células. Los compuestos son
"biocompatibles" si su adición a células in vitro
producen resultados de menos o igual al 20% de muerte célular, y su
administración in vivo no induce inflamación u otros de
tales efectos adversos.
"Biodegradable": como se usa aquí,
compuestos "biodegradables" son aquellos que, cuando se
introducen dentro de las células, se rompen mediante la maquinaria
celular o por hidrólisis en componentes que las células pueden o
reusar o deshechar sin efecto tóxico significativo sobre las
células (o sea, menos de alrededor del 20% de las células se mueren
cuando los componentes se añaden a las células in vitro). Los
componentes preferiblemente no inducen inflamación u otros efectos
adversos in vivo. En ciertas aplicaciones preferidas, las
reacciones químicas en las que se confía para romper los compuestos
biodegradables no están catalizadas.
"Cantidad eficaz": en general, la
"cantidad eficaz" de un agente activo o aparato de
dispensación de fármacos se refiere a la cantidad necesaria para
elicitar la respuesta biológica deseada. Como se apreciará por
aquellos con conocimiento de la técnica, la cantidad eficaz de un
agente o aparato puede variar dependiendo de factores tales como el
punto final biológico deseado, el agente que se va a dispensar, la
composición de la matriz de encapsulamiento, el tejido diana,
etc. Por ejemplo, la cantidad eficaz de micropartículas que
contienen un antígeno para ser dispensado para inmunizar a un
individuo es la cantidad que produce una respuesta inmune suficiente
para prevenir la infección con un organismo que tiene el antígeno
administrado.
"Péptido" o "proteína": según la
presente invención, un "péptido" o "proteína" comprende
una cadena de al menos tres aminoácidos unidos juntos por enlaces
peptídicos. El término "proteína" y "péptido" puede ser
usado indistintamente. Péptido puede referirse a un péptido
individual o a una colección de péptidos. Los péptidos de la
invención preferiblemente contienen solamente aminoácidos naturales,
aunque aminoácidos no naturales (por ejemplo, compuestos que no
ocurren en la naturaleza pero que pueden ser incorporados en una
cadena polipeptídica) y/o análogos de aminoácidos que se conocen en
la técnica pueden emplearse alternativamente. También, uno o más de
los aminoácidos en un péptido de la invención puede ser modificado,
por ejemplo, por la adición de una entidad química tal como un
grupo carbohidrato, un grupo fosfato, un grupo farnesil, un grupo
isofarnesil, un grupo de ácido graso, un grupo enlazador por
conjugación, funcionalización, u otra modificación, etc. En
una realización preferida, las modificaciones del compuesto
peptídico conducen a un péptido más estable (por ejemplo de
semivida más larga in vivo). Estas modificaciones pueden
incluir ciclación del péptido, la incorporación de
D-aminoácidos, etc. Ninguna de las
modificaciones debería interferir sustancialmente con la actividad
biológica deseada del péptido.
"Polinucleótido" u "oligonucleótido":
polinucleótido u oligonucleótido se refiere a un polímero de
nucleótidos. Típicamente, un polinucleótido comprende al menos tres
nucleótidos. El polímero puede incluir nucleósidos naturales (por
ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina,
deoxiadenosina, deoxitirnidina, deoxiguanosina y deoxicitidina),
análogos de nucleósido (por ejemplo,
2-aminaadenosina, 2-tiotimidina,
inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina,
C5-propinilcitidina,
C5-propiniluridina, C5-bromouridina,
C5-fluorouridina, C5-yodouridina,
C5-metilcitidina, 7-deazaadenosina,
7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina,
8-oxoguanosina,
O(6)-metilguanina, y
2-tiocitidina), bases modificadas químicamente,
bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas),
bases intercaladas, azúcares modificados (por ejemplo,
2'-fluororibosa, ribosa,
2'-deoxiribosa, arabinosa, y hexosa), o grupos
fosfato modificados (por ejemplo, fósforotioatos y uniones de
5'-N-fosforoamidita).
\newpage
"Molécula pequeña": como se usa aquí, el
término "molécula pequeña" se refiere a compuestos orgánicos,
tanto creados naturalmente como artificialmente (por ejemplo, vía
síntesis química) que tienen un peso molecular relativamente bajo y
que no son proteínas, polipéptidos, o ácidos nucleicos.
Típicamente, las pequeñas moléculas tienen un peso molecular de
menos de alrededor de 1500 g/mol. También, las moléculas pequeñas
tienen típicamente enlaces múltiples
carbono-carbono. Moléculas pequeñas conocidas de
origen natural incluyen, pero no están limitadas a, la penicilina,
eritromicina, taxol, ciclosporina, y rapamicina. Pequeñas moléculas
sintéticas conocidas incluyen, pero no están limitadas a, la
ampicilina, meticilina, sufametoxazol, y sulfonamidas.
La figura 1 comparativa muestra el perfil del
tiempo para la degradación de los polímeros 1-3 a
37ºC a pH 5,1 y pH 7,4. La degradación se expresa como degradación
en porcentaje en el tiempo basado en datos de cromatografía por
permeabilidad a través de gel.
La figura 2 comparativa muestra los perfiles de
toxicidad de los polímeros 1-3 y PEI. La viabilidad
de las células NIH 3T3 se expresa como una función de la
concentración del polímero. Los pesos moleculares de los polímeros
1, 2 y 3 fueron 5800, 11300, y 22500, respectivamente. El peso
molecular del PEI empleado fue 25000.
La figura 3 comparativa muestra la ralentización
del ADN de pCMV-Luc por el polímero 1 en la
electroforesis de gel de agarosa. Cada calle corresponde a una
relación diferente de ADN/peso de polímero. Las relaciones son como
siguen: 1) 1:0 (ADN solamente); 2) 1:0,5; 3) 1:1; 4) 1:2; 5) 1:3;
6) 1:4; 7) 1:5; 8) 1:6; 9) 1:7; y 10) 1:8.
La figura 4 comparativa muestra los diámetros
efectivos medios de los complejos ADN/polímero formados a partir
del plásmido pCMV-Luc: y el polímero 3 (Pm =
31.000) como una función de la concentración del polímero.
La figura 5 comparativa muestra los
potenciales-\zeta medios de los complejos
ADN/polímero formados a partir del plásmido pCMV-Luc
y el polímero 3 (Pm = 31.000) como una función de la concentración
del polímero. Los números de cada complejo corresponden a los
números de los complejos en la figura 4.
La figura 6 comparativa es una imagen SEM de
microesferas cargadas de rodamina/dextrano fabricadas con el
polímero 1.
La figura 7 comparativa muestra los perfiles de
liberación de rodamina/dextrano del polímero 1 y las microesferas
de PLGA a varios valores de, pH. Las flechas indican los puntos a
los que el tampón de HEPES (pH 7,4) se intercambió con el tampón de
acetato (pH 5,1).
La figura 8 comparativa muestra a) una imagen de
microscopio de fluorescencia representativa de microesferas del
polímero 1 cargado de rodamina/dextrano suspendidas en tampón de
HEPES (pH 7,4). La figura 8b muestra una muestra de microesferas
del polímero 1 cargado a pH 7,4 después de la adición de tampón de
acetato (pH 5,1). La dirección de la difusión del ácido es desde el
extremo superior derecho al extremo inferior izquierdo de la imagen
(tiempo transcurrido \approx 5 segundos).
La figura 9 muestra el ensayo de electroforesis
de gel usado para identificar los polímeros complejantes de ADN.
Las anotaciones de la calle corresponden a los 70 miembros solubles
en agua de la biblioteca de cribado. Por cada polímero, los ensayos
se llevaron a cabo en las relaciones ADN/polímero de 1:5 (pocillo
izquierdo) y 1:20 (pocillo derecho). Las calles marcadas C*
contienen ADN solo (sin polímero) y se usaron como control.
La figura 10 muestra los datos de transfección
en función de la estructura para un ensayo que empleó
pCMV-Luc (600 ng/pocillo, ADN/polímero = 1:20). Las
unidades de luz son arbitrarias y no están normalizadas para la
proteína total de la célula; los experimentos se llevaron a cabo
por triplicado (las barras de error no se muestran). Los cuadrados
negros representan polímeros insolubles en agua, los cuadrados en
blanco representan polímeros solubles en agua que no complejaron ADN
en la Figura 9. La columna derecha (marcada "\bullet"
muestra valores de los experimentos de control siguientes: ningún
polímero (verde), PEI (rojo), y Lipofectamina (azul pálido).
La figura 11 comparativa muestra una síntesis de
poli¡ésteres de beta-amino). Los poli(ésteres de
beta-amino) pueden sintetizarse por la adición del
conjugado de las aminas primarias (ecuación 1) o bis(aminas
secundarias) (ecuación 2) a diacrilatos.
La figura 12 muestra una variedad de monómeros
de amina (A) y diacrilato (B) usados en la síntesis de la
biblioteca de polímeros.
La figura 13 es un histograma de las eficiencias
de transfección de los polímeros. En el primer cribado todos los
2350 polímeros se probaron por su habilidad para dispensar
pCMV-luc ADN en relaciones N:P de 40:1, 20:1, y 10:1
a células COS-7. La eficiencia de transfección se
presenta en ng de Lucíferasa popocillo. Para referencia, se muestra
la eficiencia de la transfección de PEI. Las células
COS-7 fácilmente captan el ADN desnudo, yen
nuestras condiciones producen 0,15 \pm 0,05 ng por pocillo, y el
reactivo lípidico, Lipofectamina 2000, produce 13,5 \pm 1,9 ng
por
pocillo.
pocillo.
La figura 14. A) La eficiencia de la
transfección optimizada de los primeros 50 polímeros con relación a
PEI y lipofectamina 2000. Los polímeros fueron comprobados como se
describe en los métodos. En el primer cribado amplio se probaron las
relaciones N:P de 40:1, 20:1, y 10:1 con un n de 1. Los primeros 93
fueron recribados a seis relaciones N:P diferentes = (N:P óptimo
del primer cribado) x 1,75, 1,5, 1,25, 1,0, 0,75, y 0,5, por
triplicado. Las reacciones de control se marcaron en rojo, y los
polímeros que no se unieron a ADN en el ensayo de electroforesis de
gel se muestran en negro. B) Los polímeros que se unieron a ADN se
determinaron por electroforesis de gel de agarosa. Los datos se
tabularon de la forma siguiente: 1) ADN totalmente desplazado se
representa por (+), 2) ADN parcialmente desplazado se representa por
(+/-), 3) ADN no unido se representa por (-).
La figura 15 muestra la transfección de células
COS-7 usando plásmido de proteína verde
fluorescente mejorado. Las células se transfectaron en una relación
N:P de (N:P óptima del cribado amplio) x 1,25 con 600 ng de ADN.
Las regiones del pocillo que muestran transfección alta se muestran
para los polímeros siguientes: a) C36, b) D94.
La figura 16 muestra cómo el peso molecular de
los polímeros y el grupo del final de la cadena está afectado por
variación de la relación amina/diacrilato en la mezcla de reacción.
Los pesos moleculares (Pm) (relativo a los estándares de
poliestireno) se determinaron por GPC en fase orgánica. Los
polímeros sintetizados con relaciones amina/diacrilato>1 tienen
los grupos finales de amina y los polímeros sintetizados con
relaciones amina/diacrilato <1 tienen los grupos finales de
acrilato.
La figura 17 muestra los resultados de la
transfección de luciferasa para Poli-1 como una
función del peso molecular del polímero, la relación polímero/ADN
(p/p), y el grupo final del polímero. (A) Cadenas terminadas en
amina; (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, las barras de
error no se muestran.)
La figura 18 muestra los resultados de la
transfección de luciferasa para Poli-2 como una
función del peso molecular del polímero, la relación polímero/ADN
(p/p), y el grupo final del polímero. (A) Cadenas terminadas en
amina; (B) cadenas terminadas en acrilato. (n=4, las barras de
error no se muestran.)
La figura 19 muestra la citotoxicidad de los
complejos poli-1/ADN como una función del peso
molecular del polímero, la relación polímero/ADN (p/p), y el grupo
final del polímero. (A) Cadenas terminadas en amina; (B) cadenas
terminadas en acrilato. (n=4, las barras de error no se
muestran.)
La figura 20 muestra la citotoxicidad de los
complejos poli-2(ADN) como una función de
los pesos moleculares del polímero, la relación polímero/ADN (p/p),
y el grupo final del polímero. (A) Cadenas terminadas de amina; (B)
cadenas terminadas de acrilato. (n=4, las barras de error no se
muestran.)
La figura 21 muestra el nivel relativo de
recaptación celular de los complejos poli-1/ADN
como una función de los pesos moleculares del polímero, la relación
polímero/ADN (p/p), y el grupo final del polímero. (A) Cadenas
terminadas de amina; (B) cadenas terminadas de acrilato. (n=4, las
barras de error no se muestran.)
La figura 22 muestra el nivel relativo de
recaptación celular de los complejos poli-2/ADN
como una función de los pesos moleculares del polímero, la relación
polímero/ADN (p/p), y el grupo final del polímero. (A) Cadenas
terminadas de amina (los cuadrados en blanco representan las
condiciones donde la toxicidad de los complejos impidieron una
medida fiable de la recaptación celular) (B) cadenas terminadas en
acrilato. (n=4, las barras de error no se
muestran.)
muestran.)
La figura 23 muestra el aumento de la actividad
de la transfección de los vectores de dispensación basados en
poli-1 (cadenas terminadas en amina, Pm = 13.100) a
través del uso de los agentes cocomplejantes. (A) Polilisina (PLL);
(B) polietilenimina (PEI). (n=4, las barras de error no se
muestran).
La figura 24 muestra el aumento de la actividad
de la transfección de los vectores de dispensación basados en
poli-2 (cadenas terminadas en amina, Pm = 13.400) a
través del uso de los agentes cocomplejantes. (A) Polilisina (PLL);
(B) polietilenimina (PEI). (n=4, las barras de error no se
muestran).
La figura 25 es una comparación de la
transferencia del gen GFP dentro de las células
COS-7 usando Poli-1/PLL
(Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 (p/p/p)),
Poli-2/PLL (Poli-2:PLL:ADN =
15:0,4:1 (p/p/p)), Lipofectamina 2000 (\mul reactivo:\mug ADN =
1:1), PEI (PEI:ADN 1:1 (p/p), N/P\sim8), y ADN desnudo. Las
células se sembraron en placas de 6 pocillos y se crecieron hasta
nueva confluencia. Las células se incubaron con complejos (5 \mug
ADN/pocillo) durante 1 hora, después de este tiempo los complejos se
retiraron y se añadió medio de crecimiento nuevo. Dos días más
tarde la expresión de GFP se ensayó por citometría de flujo. (n=3,
las barras de error indican una desviación estándar).
La figura 26 muestra la expresión GFP en células
COS-7 transfectadas usando
Poli-1/PLL.
La figura 27 muestra la transfeccion del gen GFP
dentro de diferentes líneas celulares usando
Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN =
60:0,1:1 (p/p/p). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos
y se crecieron hasta cerca de la confluencia. Las células se
incubaron después con los complejos (5 \mug ADN/pocillo) durante 1
hora, después de este tiempo los complejos se retiraron y se añadió
medio de crecimiento nuevo. Dos días más tarde la expresión de GFP
se ensayó por citometría de flujo. (n=5, las barras de error
indican una desviación estándar).
La figura comparativa 28 muestra los pesos
moleculares (Pm y Mn) del polímero G5 como una función de la
relación molar de los monómeros de amina:monómeros de diacrilato en
la síntesis.
La figura comparativa 29 muestra los pesos
moleculares (Pm y Mn) del polímero B14 como una función de la
relación molar de los monómeros de amina:monómeros de diacrilato en
la síntesis del polímero.
La figura 30 comparativa es una comparación de
la función del peso molecular a la relación molar amina:diacrilato
para los polímeros B14 y G5.
La presente invención proporciona encapsulación
polimérica y sistemas de dispensación mejorados basados en el uso
de polímeros de ésteres de \beta-amino. Los
sistemas pueden usarse en las técnicas de dispensación de
medicinas/fármacos para dispensar polinucleótidos, proteínas,
pequeñas moléculas, péptidos, antígenos, fármacos etc a un
paciente, tejido, órgano, célula, etc. La presente invención también
proporciona la preparación y cribado de grandes colecciones de
polímeros para "cabezas de serie" que son útiles en las
técnicas de dispensación de medicinas y fármacos.
Los polímeros de éster de
6-amino de la presente invención proporcionan varios
usos diferentes en la técnica de la dispensación de fármacos. Los
polímeros con sus esqueletos que contienen aminas terciarias pueden
usarse para complejar polinucleótidos y por tanto mejorar la
dispensación de polinucleótidos y prevenir su degradación. Los
polímeros pueden también usarse en la formación de nanopartículas o
micropartículas que contienen agentes encapsulados. Debido a las
propiedades de los polímeros de ser biocompatibles y
biodegradables, estas partículas formadas son también
biodegradables y biocompatibles y pueden usarse para proporcionar
liberación sostenida controlada del agente encapsulado. Estas
partículas pueden también ser susceptibles a cambios de pH dado el
hecho de que estos polímeros son típicamente substancialmente
insolubles en solución acuosa a pH fisiológicos pero más solubles a
pH más bajos.
Los polímeros de la presente invención son
poli(ésteres de \beta-amino) que contienen aminas
terciarias en sus esqueletos y sales de los mismos. Los pesos
moleculares de los polímeros de la invención pueden estar en el
intervalo de desde 5.000 g/mol a más de 100.000 g/mol, más
preferiblemente de 4.000 g/mol a 50.000 g/mol. En una realización
particularmente preferida, los polímeros de la invención son
relativamente no citotóxicos. En otra realización particularmente
preferida, los polímeros de la invención, son biocompatibles y
biodegradables. En una realización particularmente preferida, los
polímeros de la presente invención tienen pKas en el intervalo de
5,5 a 7,5, más preferiblemente entre 6,0 y 7,0. En otra realización
particularmente preferida, el polímero puede diseñarse para tener
un pKa deseado entre 3,0 y 9,0, más preferiblemente entre 5,0 y
8,0. Los polímeros de la invención son particularmente atractivos
para la dispensación de fármacos por varias razones: 1) contienen
grupos aminos para interaccionar con ADN y otros agentes cargados
negativamente, para tamponar el pH, para causar endosomolisis,
etc.; 2) contienen uniones de poliéster degradables; 3)
pueden sintetizarse de materiales de partida comercialmente
disponibles; y 4) son susceptibles al pH y generaciones futuras
podrían ser diseñadas con un pKa deseado. En la investigación de la
eficiencia de la transfección, los polímeros que se comportaron
mejor fueron hidrófobos o los monómeros de diacrilato fueron
hidrófobos, y muchos tenían grupos laterales mono o dihidroxílicos,
y/o bis(aminas secundarias) lineales como parte de su
estructura.
Los polímeros de la presente invención se
definen generalmente como sigue:
en
donde
cada R' se selecciona independientemente del
grupo que consiste en hidrógeno,
alquilC_{1}-C_{6} de cadena corta,
alcoxiC_{1}-C_{6} de cadena corta, hidroxi,
amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, tiol, heteroaril, aril,
fenil, heterociclo, carbociclo y halógeno;
n es un número entero entre 3 y 10.000;
x en un número entero entre 1 y 10; y
cuando X es metil o NR_{2}; y
R se selecciona del grupo que consiste en
hidrógeno, alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y
heteroaril; o cuando X es OR; y R se selecciona del grupo que
consiste en alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril y
heteroaril;
y es un número entero entre 1 y 10;
o cuando X es OR, y R es hidrógeno, y es 5 o un
número entero entre 1 y 2 o 6 y 10
y
derivados y sales de los mismos.
y es un número entero entre 1 y 10;
preferiblemente, x es un número entero entre 2 y 6.
En ciertas realizaciones, los polímeros de la
presente invención se definen generalmente como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
X se selecciona del grupo que consiste en
alquilC,-C6 de cadena corta, alcoxiC_{1}-C_{6}
de cadena corta, halógeno, OR y NR_{2}; más preferiblemente,
metil, OH, o NH_{2};
R se selecciona del grupo que consiste en
hidrógeno, alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y
heteroaril;
cada R' se selecciona independientemente del
grupo que consiste en hidrógeno,
alquilC_{1}-C_{6} de cadena corta,
alcoxiC_{1}-C_{6} de cadena corta, hidroxi,
amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, tiol, heteroaril, aril,
fenil, heterociclo, carbociclo, y halógeno; preferiblemente R' es
hidrógeno, metil, etil, propil, isopropil, butil, metoxi, etoxi,
propoxi, isopropoxi, hidroxi, amino, fluoro, cloro, o bromo; más
preferiblemente, R' es fluoro, hidrógeno, o metil;
n es un número entero entre 3 y 10.000;
x en un número entero entre 1 y 10;
preferiblemente, x es un número entero entre 2 y 6;
y es un número entero entre 1 y 10;
preferiblemente, y es un número entero entre 2 y 6;
z en un número entero entre 1 y 10;
preferiblemente, z es un número entero entre 2 y 6;
y
derivados y sales de los mismos.
En otra realización, la unidad bis(éster de
acrilato) en el polímero de la invención se elige del grupo que
sigue de unidades de bis(éster de acrilato)
Los bis(ésteres de acrilato) particularmente
preferidos en este grupo incluyen B, C, E, F, II, JJ, KK, y LL.
En otra realización, la amina en el polímero de
la invención se elige del grupo de aminas siguiente
(1'-20'):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertas realizaciones, el polímero comprende
la amina 5'.
En otra realización la amina en el polímero de
la invención se elige del grupo siguiente de aminas
(1-94):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertas realizaciones, los polímeros incluyen
las aminas 6, 8, 20, 24, 25, 28, 32, 36, 75 o 80.
\newpage
Ejemplos particulares de la presente invención
incluyen:
Otros poli(ésteres de
beta-amino) particularmente útiles incluyen F32,
F28, JJ36, JJ32, LL8, E36, E32, C80, JJ28, C28, C36, E28.
En una realización particularmente preferida,
uno o ambos de los grupos enlazadores A y B son polímeros de
polietileno. En otra realización particularmente preferida, uno o
ambos de los grupos enlazadores A y B son polímeros de
polietilenglicol. Otros polímeros biodegradables biocompatibles
pueden usarse como uno o ambos de los grupos enlazadores A y B.
Los polímeros que siguen no son parte de la
presente invención y pueden definirse generalmente por la fórmula
(I):
Los grupos enlazadores A y B son cada uno una
cadena de átomos uniendo covalentemente los grupos amino y los
grupos éster, respectivamente. Estos grupos enlazadores pueden
contener átomos de carbono o heteroátomos (por ejemplo, nitrógeno,
oxígeno, azufre, etc).Típicamente, estos grupos enlazadores
son de 1 a 30 átomos de longitud, más preferiblemente de
1-15 átomos de longitud. Los grupos enlazadores
pueden estar sustituidos con varios sustituyentes que incluyen, pero
no limitan a, átomos de hidrógeno, grupos alquil, alquenil,
aminoalquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxi, alcoxi,
halógeno, aril, heterociclo, heterociclo aromático, ciano, amida,
carbamoil, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, y
ureido. Como se apreciaría por una persona con conocimiento de la
técnica, cada uno de estos grupos puede a su vez estar sustituido.
Estos grupos R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6},
R_{7} y R_{8} pueden ser cualquier grupo químico que incluye,
pero no está limitado a, átomos de hidrógeno, grupos alquil,
alquenil, alquinil, amino, alquilamino, dialquilamino,
trialquilamino, hidroxi, alcoxi, halógeno, aril, heterociclo,
heterociclo aromático, ciano, amida, carbamoil, ácido carboxílico,
éster, alquiltioéter, tiol, y ureido. En los polímeros de la
invención, n es un número entero que está en el intervalo de 5 a
10.000, más preferiblemente de 10 a 500.
En una realización particularmente preferida, la
bis(amina secundaria) es una estructura cíclica, y el
polímero se representa generalmente por la fórmula II:
En esta realización, R_{1} y R_{2} están
directamente unidos juntos como se muestra en la fórmula II.
\newpage
Ejemplos de los polímeros de la invención en
esta realización incluyen, pero no están limitados a las fórmulas
III y IV:
\vskip1.000000\baselineskip
Como se describió anteriormente en el párrafo
precedente, cualquier grupo químico que satisface la valencia de
cada átomo puede sustituirse por un átomo de hidrógeno.
En otra realización particularmente preferida,
los grupos R_{1} y/o R_{2} están covalentemente unidos al grupo
enlazador A para formar una o dos estructuras cíclicas. Los
polímeros de la presente realización están generalmente
representados por la fórmula V en la que ambos R_{1} y R_{2}
están unidos al grupo enlazador A para formar dos estructuras
cíclicas:
Las estructuras cíclicas pueden ser anillos de
3, 4, 5, 6, 7, o 8- miembros o mayores. Los anillos pueden contener
heteroátomos y ser insaturados. Ejemplos de polímeros de la fórmula
V incluyen las fórmulas VI, VII, y VIII:
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Como se describió anteriormente, cualquier grupo
químico que satisface la valencia de cada átomo en la molécula puede
ser sustituido por cualquier átomo de hidrógeno.
\newpage
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En otra realización, los polímeros pueden
generalmente definirse por la fórmula (IX):
El grupo enlazador B es una cadena de átomos
uniendo covalentemente los grupos éster. El grupo enlazador puede
contener átomos de carbono o heteroátomos (por ejemplo, nitrógeno,
oxígeno, azufre, etc). Típicamente, el grupo enlazador es de
1 a 30 átomos de longitud, preferiblemente de 1-15
átomos de longitud, y más preferiblemente de 2-10
átomos de longitud. En ciertas realizaciones, el grupo enlazador B
es una cadena de alquil ramificada o lineal sustituida o no
sustituida, preferiblemente con 3-10 átomos de
carbono, más preferiblemente con 3, 4, 5, 6, o 7 átomos de carbono.
En otras realizaciones, el grupo enlazador B es una cadena
heteroalifática ramificada o lineal sustituida o no sustituida,
preferiblemente con 3-10 átomos, más preferiblemente
con 3, 4, 5, 6, o 7 átomos. En ciertas realizaciones, el grupo
enlazador B está comprendido de unidades repetidas de átomos de
oxígeno y carbono. El grupo enlazador puede estar sustituido con
varios sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a, átomos de
hidrógeno, grupos de alquil, alquenil, alquinil, amino, alquilamino,
dialquilamino, trialquilamino, hidroxi, alcoxi, halógeno, aril,
heterociclo, heterociclo aromático, ciano, amida, carbamoil, ácido
carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, acil, acetil, y
ureido. Como se apreciaría por alguien con conocimiento de la
técnica, cada uno de estos grupos puede a su vez estar sustituido.
Cada uno de R1, R3, R4, R5, R6, R7, y R8 pueden ser
independientemente cualquier grupo químico que incluye, pero no está
limitado a un átomo de hidrógeno, grupos de alquil, alquenil,
alquinil, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino,
hidroxi, alcoxi, halógeno, ad, heterociclo, heterociclo aromático,
ciano, amida, carbamoil, ácido carboxílico, éster, tioéter,
alquiltioéter, tiol, acil, acetil, y ureido. En ciertas
realizaciones, R_{1} incluye grupos hidroxi. En otras
realizaciones, R_{1} incluye grupos amino, alquilamino, o
dialquilamino. En el polímero de la invención, n es un número
entero que está en el intervalo de 5 a 10.000, más preferiblemente
de 10 a 500.
En otra realización, la unidad bis(éster de
acrilato) en el polímero de la invención se elige del siguiente
grupo de unidades de bis(éster de acrilato)
(A'-G'):
En ciertas realizaciones, el polímero comprende
el bis(éster de acrilato)G'.
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En otra realización, la unidad bis(éster de
acrilato) en el polímero se elige del siguiente grupo de unidades
de bis(éster de acrilato) (A-PP):
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\vskip1.000000\baselineskip
Los bis(ésteres de acrilato) particularmente
preferidos en este grupo incluyen B, C, D, E, F, M, O, U, AA, II,
JJ, KK, y LL.
En otra realización, la amina en el polímero se
elige del siguiente grupo de aminas (1'-20'):
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\vskip1.000000\baselineskip
En ciertas realizaciones, el polímero comprende
la amina 5'. En otras realizaciones, el polímero comprende la amina
14'.
\newpage
En otra realización, la amina en el polímero se
elige del siguiente grupo de aminas (1-94):
En ciertas realizaciones, los polímeros incluyen
las aminas 6, 3, 17, 20, 24, 25, 28, 32, 36, 60, 61, 70, 75, 80,
86, 87, 89, 93, o 94.
Ejemplos particulares de los polímeros
incluyen:
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\newpage
Otros poli(ésteres de
beta-amino) particularmente útiles incluyen:
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\vskip1.000000\baselineskip
Otros poli(ésteres de
beta-amino) particularmente útiles incluyen: C86,
D60, D61, U94, F32, F28, JJ36, JJ32, LL6, LL8, U28, E28, U36, E36,
U32, E32, C94, F94, JJ94, U28, JJ86, C86, U86, E86, C80, E80, JJ80,
U80, D24, E24, JJ24, B17, 1128, 1136, 1132, C20, JJ20, E20, C25,
U25, D25, D70, D28, D32, D36, D93, U87, D87, C75, U75, 020, 028,
C94, AA20, AA28, D86, F86, AA36, AA24, AA94, 024, AA60, A61, C32,
JJ28, C28, JJ20, D94, U32, D24, C36, E28, D36, U94, E24, E32, D28,
U36, E80, E36, JJ80, E94, D93, B17, M17, AA61, U93, y C25.
En una realización particularmente preferida,
uno o ambos de los grupos enlazadores A y B son polímeros de
polietileno. En otra realización particularmente preferida, uno o
ambos de los grupos enlazadores A y B son polírneros de
polietilenglicol. Otros polímeros biodegradables, biocompatibles
pueden usarse como uno o ambos grupos enlazadores A y B.
En ciertas realizaciones preferidas, los
polímeros de la presente invención están terminados en amina. En
otras realizaciones, los polímeros de la presente invención están
terminados en acrilato. En gran parte, la unidad de terminación del
polímero está determinada por la relación de la amina frente al
acrilato en la reacción de síntesis del polímero. Un exceso de
monómero de amina produce un polímero terminado en amina. Y un
exceso de monómero de acrilato produce un polímero terminado en
acrilato.
En ciertas realizaciones, el peso molecular
medio de los polímeros de la presente invención está en el
intervalo de 1.000 g/mol a 50.000 g/mol, preferiblemente de 2.000
g/mol a 40.000 g/mol, más preferiblemente de 5.000 g/mol a 20.000
g/mol, y aún más preferiblemente de 10.000 g/mol a 17.000 g/mol.
Puesto que los polímeros de la presente invención están preparados
por una etapa de polimerización, se obtiene típicamente una
distribución estadística amplia de longitudes de la cadena. En
ciertas realizaciones, la distribución de los pesos moleculares en
una muestra de polímero se estrecha por etapas de purificación y
aislamiento conocidas en la técnica. El peso molecular del polímero
puede también variarse por la síntesis del polímero, por ejemplo,
cuando la cantidad de los monómeros de amina aumenta, el peso
molecular del polímero obtenido disminuye. En otras realizaciones,
la mezcla de polímero puede ser una mezcla de polímeros de
diferentes pesos moleculares.
\newpage
En otra realización particularmente preferida,
el polímero de la presente invención es un copolímero en donde una
de las unidades repetidas es un poli(éster de \beta amino) de la
presente invención. Otras unidades repetidas que se usan en el
co-polímero incluyen, pero no están limitada a,
polietileno, poli(ácido láctico co-glicólico)
(PLGA), ácido poliglicólico, polimetacrilato, etc.
Los polímeros de la invención pueden prepararse
por cualquier método conocido en la técnica. Preferiblemente los
polímeros se preparan de materiales de partida comercialmente
disponibles. En otra realización preferida, los polímeros se
preparan de materiales de partida fácilmente preparados y/o
baratos.
En una realización particularmente preferida, el
polímero de la invención se prepara vía la adición del conjugado de
bis(aminas secundarias) a bis (ésteres de acrilato). Este
esquema de reacción se muestra a continuación:
Los monómeros de bis(amina secundaria)
que son útiles en el método presente incluyen, pero no están
limitados a, N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina,
2-metilpiperazina,
1,2-bis(N-etilamino)etileno, y
4,4'-trimetilendi Diperidina. Los monómeros de
diacrilato que son útiles incluyen, pero no están limitados a,
diacrilato de 1,4-butanodiol, dimetacrilato de
1,4-butanodiol, diacrilato de 1,2 etanodiol,
diacrilato de 1,6-hexanodiol, diacrilato de
1,5-pentanodiol, diacrilato de
2,5-hexanodiol, y diacrilato de
1,3-propanodiol. Cada uno de los monómeros se
disuelve en un disolvente orgánico (por ejemplo, THF,
CH_{2}Cl_{2}, MeOH, EtOH, CHCl_{3}, hexanos, tolueno, benceno,
CCl_{4}, glime, éter dietílico, DMSO, DMF, etc),
preferiblemente DMSC. Las soluciones obtenidas se combinan, y la
mezcla de reacción se calienta para producir el polímero deseado.
En otras realizaciones, la reacción se lleva a cabo sin el uso de un
disolvente (o sea, neto) por tanto obviando la necesidad de
eliminar el disolvente después de la síntesis. La mezcla de
reacción se calienta después a una temperatura en el intervalo de
30ºC a 200ºC, preferiblemente de 40ºC a 150ºC, más preferiblemente
50ºC a 100ºC. En una realización particularmente preferida, la
mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente 40ºC, 50ºC,
60ºC, 70ºC, 80ºC, o 90ºC. En otra realización particularmente
preferida, la mezcla de reacción se calienta hasta aproximadamente
75ºC. En otra realización, la mezcla de reacción se calienta hasta
aproximadamente 100ºC. La reacción de polimerización puede también
estar catalizada. El tiempo de reacción puede estar en el intervalo
de horas a días dependiendo de la reacción de polimerización y las
condiciones de reacción. Como sería apreciado por alguien con
conocimiento de la técnica, la calefacción de la reacción tiende a
acelerar la velocidad de la reacción requiriendo un tiempo más
corto de reacción. En ciertas realizaciones, la síntesis del
polímero se lleva a cabo en DMSO a aproximadamente 60ºC durante
aproximadamente 2 días. En otras realizaciones, la síntesis del
polímero se lleva a cabo sin disolvente a 95ºC durante
8-16 horas. Como sería apreciado por alguien con
conocimiento de la técnica, el peso molecular del polímero
sintetizado puede determinarse por las condiciones de reacción (por
ejemplo, temperatura, materiales de partida, concentración,
catalizador, disolvente, tiempo de reacción, etc) usadas en la
síntesis.
En otra realización particularmente preferida,
los polímeros se preparan por la adición del conjugado de una amina
primaria a un bis(éster de acrilato). El uso de las aminas
primarias más que la bis(aminas secundarias) permite una
variedad mucho más amplia de materiales de partida comercialmente
disponibles. El esquema de reacción usando aminas primarias en vez
de aminas secundarias se muestra debajo:
Las aminas primarias útiles en este método
incluyen, pero no están limitadas a, metilamina, etilamina,
isopropilamina, anilina, anilinas sustituidas, y etanolamina. Los
bis(ésteres de acrilato) útiles en este método incluyen, pero no
están limitados a, diacrilato de 1,4-butanodiol,
dimetacrilato de 1,4-butanodiol, diacrilato de
1,2-etanodiol, diacrilato de
1,6-hexanodiol, diacrilato de
1,5-pentanodiol, diacrilato de
2,5-hexanodiol, y diacrilato de
1,3-propanodiol. Cada uno de los monómeros se
disuelve en un disolvente orgánico (por ejemplo, THF, DMSO, DMF,
CH_{2}Cl_{2}, MeOH, EtOH, CHCl_{3}, hexanos, CCl_{4},
glime, éter dietílico, etc). Los disolventes orgánicos se
prefieren debido a la susceptibilidad de los poliésteres a la
hidrólisis. Preferiblemente el disolvente orgánico usado es
relativamente no tóxico para los organismos vivos. En ciertas
realizaciones, DMSO se usa como disolvente orgánido debido a que es
relativamente no tóxico y se usa frecuentemente como disolvente en
cultivo celular y en depósitos congelados de células. Otros
disolventes preferidos incluyen aquellos miscibles con agua tales
como DMSO, etanol, y metanol. Las soluciones obtenidas de monómeros
que están preferiblemente a concentraciones entre 0,01 M y 5 M,
entre aproximadamente 0,1 M y 2 M, más preferiblemente entre 0,5 M
y 2 M, y lo más preferido entre 1,3 M y 1,8 M, se combinan, y la
mezcla de reacción se calienta para producir el polímero deseado. En
ciertas realizaciones, la reacción se lleva a cabo sin disolvente.
El llevar a cabo la polimerización sin disolvente puede disminuir
la cantidad de productos de ciclación resultantes de las reacciones
intramoleculares de adición del conjugado. La polimerización puede
llevarse a cabo a una temperatura que en el intervalo de 20ºC a
200ºC, preferiblemente de 40ºC a 100ºC, más preferiblemente de 50ºC
a 75ºC, aún más preferiblemente de 50ºC a 60ºC. En una realización
particularmente preferida, la mezcla de reacción se mantiene a
20ºC. En otra realización particularmente preferida, la mezcla de
reacción se calienta a aproximadamente 50ºC. En algunas
realizaciones, la mezcla de reacción se calienta a aproximadamente
56ºC. En todavía otra realización particularmente preferida, la
mezcla de reacción se calienta a aproximadamente 75ºC. La mezcla de
reacción puede también enfriarse a aproximadamente 0ºC. La reacción
de polimerización puede también catalizarse tal como con un
catalizador organometálico, ácido o base. En otra realización
preferida, uno o más tipos de monómeros de amina y/o monómeros de
diacrilato pueden usarse en la reacción de polimerización. Por
ejemplo, una combinación de etanolamina y etilamina puede usarse
para preparar un polímero más hidrófilo que uno preparado usando
etilamina sola, y también más hidrófobo que uno preparado usando
etanolamina sola.
En la preparación de los polímeros de la
presente invención, los monómeros en la mezcla de reacción pueden
combinarse en relaciones diferentes para afectar el peso molecular,
rendimiento, terminación del extremo, etc del polímero
obtenido. La relación de monómeros de amina a monómeros de
diacrilato puede estar en el intervalo de 1,6 a 0,4,
preferiblemente de 1,4 a 0,6, más preferiblemente:e de 1,2 a 0,8,
aún más preferiblemente de 1,1 a 0,9. En ciertas realizaciones, la
relación de los monómeros de amina a monómeros de diacrilato es
aproximadamente 1,4, 1, 3, 1,2, 1,1, 1,050, 1,025, 1,0, 0,975,
0,950, 0,900, 0,800, y 0,600. Por ejemplo, combinando los monómeros
en una relación de 1:1 típicamente se obtiene polímeros de peso
molecular mayor y rendimientos totales más altos. También,
proporcionando un exceso de monómero de amina (por ejemplo,
relación amina a acrilato >1) produce cadenas terminadas en
amina mientras que proporcionando un exceso de monómero de acrilato
por ejemplo, (relación amina a acrilato <1) produce cadenas
terminadas en acrilato. La relación de monómeros de amina a
monómeros de acrilato en la síntesis del polímero puede afectar
cómo las cadenas del polímero se terminan, el peso molecular de los
polímeros producidos, la distribución de los pesos moleculares, y
la extensión del entrecruzamiento.
El polímero sintetizado puede purificarse por
cualquier técnica conocida en la técnica incluyendo, pero no
limitado a, precipitación, cristalización, extracción,
cromatografía, etc. En una realización particularmente
preferida, el polímero se purifica a través de precipitaciones
repetidas en disolventes orgánicos (por ejemplo, éter dietílico,
hexano, etc). En una realización particularmente preferida,
el polímero se aísla como hidrocloruro, fosfato, acetato, u otra
sal. Preferiblemente la sal es farmacéuticamente aceptable, en
ciertas realizaciones. El polímero obtenido puede también usarse
como es sin más purificaciones y aislamiento; por tanto haciendo
ventajoso el uso de un disolvente compatible con los ensayos que se
usen para evaluar los polímeros. Por ejemplo, los polímeros pueden
prepararse en un disolvente no tóxico tal como DMSO, y la solución
de polímero obtenida puede usarse después en los ensayos de cultivo
celular que envuelven la transfección de un ácido nucleico dentro de
una célula. Como sería apreciado por una persona con conocimiento
de la técnica, el peso molecular del polímero sintetizado y la
extensión del entrecruzado puede determinarse por las condiciones
de reacción (por ejemplo, temperatura, materiales de partida,
concentración, equivalentes de amina, equivalentes de acrilato,
orden de adición, disolvente, etc) usados en la síntesis
(Odian Principies of Polymerization 3ª Ed., Nueva York: John
Wiley & Sons, 1991; Stevens Polymer Chemistry: An
Introduction 2nd Ed., Nueva York: Oxford University Press,
(1990). La extensión del entrecruzamiento del polímero preparado
puede minimizarse a entre 1-20%, preferiblemente
entre 1-10%, más preferiblemente entre
1-5%, y más preferiblemente menos del 2%. Como sería
apreciado por aquellos con conocimiento de la técnica, las aminas o
bis(ésteres de acrilato) con grupos nucleófilos son más
susceptibles al entrecruzamiento, y puede necesitarse tomar medidas
para reducir el entrecruzamiento tal como bajar la temperatura o
cambiar la concentración de los materiales de partida en la mezcla
de reacción. Los acrilatos y otros restos con insaturación o
halógenos son también susceptibles de polimerización por radicales
que puede conducir a entrecruzamiento. La extensión de la
polimerización por radicales y el entrecruzamiento puede reducirse
reduciendo la temperatura de la mezcla de reacción o por otros
medios conocidas en la técnica.
En otra realización se prepara una biblioteca de
polímeros diferentes en paralelo. La síntesis de una biblioteca de
polímeros puede llevarse a cabo usando cualquiera de las enseñanzas
conocidas en la técnica o descritas aquí con relación a la síntesis
de los polímeros de la invención. En una realización, una amina
diferente y/o bis(éster de acrilato) en una relación particular
amina a acrilato se añade a cada vial en una colección de viales
usados para preparar la biblioteca o a cada pocillo en una placa de
múltiples pocillos (por ejemplo placa de 96 pocillos). En una
realización, los monómeros se diluyen a entre 0,1 M y 5 M, más
preferiblemente de 0,5 M a 2 M, y más preferiblemente a
aproximadamente 1,6 M, en un disolvente orgánico tal como DMSO. Los
monómeros pueden combinarse en diferentes relaciones para afectar al
peso molecular, rendimiento, terminación del extremo, etc. Por
ejemplo, combinando los monómeros en una relación 1:1 típicamente
produce monómeros de mayor peso molecular y rendimientos totales
más altos. Proporcionando un exceso de monómero de amina se produce
cadenas terminadas en amina mientras que proporcionando un exceso de
monómero de acrilato se produce cadenas terminadas en acrilato. En
algunas realizaciones, no se usa disolvente en la síntesis del
polímero. El conjunto de los viales o de la placa multipocillo se
incuba a una temperatura y longitud de tiempo suficientes para
permitir que ocurra la polimerización de los monómeros corno se
describe aquí. En ciertas realizaciones preferidas, el tiempo y la
temperatura se eligen para lograr casi la incorporación completa
(por ejemplo, 50% de conversión, 75% de conversión, 80% de
conversión, 90% de conversión, 95% de conversión, >95% de
conversión, 98% de conversión, 99% de conversión, o >99% de
conversión) de todo el monómero en polímero. La reacción de
polimerización puede llevarse a cabo a cualquier temperatura en el
intervalo de 0ºC y 200ºC. En una realización, las mezclas de
reacción se incuban a aproximadamente 45ºC por aproximadamente 5
días. En otra realización, las mezclas de reacción se incuban a
aproximadamente 56ºC por aproximadamente 5 días En otra
realización, las mezclas de reacción se incuban a aproximadamente
100ºC por aproximadamente 5 horas. Los polímeros pueden aislarse
después y purificarse siguiendo técnicas conocidas en la técnica o
las soluciones obtenidas de los polímeros pueden usarse sin más
aislamiento o purificación. En ciertas realizaciones, se preparan
más de 1000 polímeros diferentes en paralelo. En ciertas
realizaciones, se preparan más de 2000 polímeros diferentes en
paralelo. En otras realizaciones, se preparan más de 3000 polímeros
en paralelo. Los polímeros se pueden después cribar usando técnicas
de alto rendimiento para identificar los polímeros con una
característica deseada (por ejemplo, solubilidad en agua,
solubilidad a diferentes pHs, solubilidad en varios disolventes
orgánicos, la habilidad para unirse a polinucleótidos, la habilidad
para unir heparina, habilidad para unirse a pequeñas moléculas, la
habilidad para formar micropartículas, la habilidad para aumentar
la eficiencia de la transfección, etc). Los polímeros de la
invención pueden cribarse o usarse después de la síntesis sin más
precipitación, purificación, o aislamiento del polímero. El uso de
un disolvente no tóxico tal como DMSO en la síntesis de los
polímeros permite el fácil manejo y uso de los polímeros después de
la síntesis del polímero. Por ejemplo, la solución del polímero en
DMSO puede añadirse a un cultivo celular u otro sistema vivo sin
efectos tóxicos sobre las células. En ciertas realizaciones los
polímeros pueden cribarse por propiedades o características útiles
en la terapia génica (por ejemplo, la habilidad para unir
polinucleótidos, aumento en la eficiencia de la transfección, etc).
En otras realizaciones los polímeros pueden cribarse por
propiedades o características útiles en la técnica de ingeniería de
tejidos (por ejemplo, la habilidad para mantener el crecimiento de
tejidos o células, habilidad para promover la unión celular). En
ciertas realizaciones, los polímeros se sintetizan y ensayan usando
técnicas semi-automáticas y/o sistemas de manejo de
fluidos robotizados.
Es bien conocida la habilidad de compuestos
catiónicos para interaccionar con polinucleótidos negativamente
cargados a través de las integraciones electroestáticas. Los
polímeros catiónicos tales como poli(lisina) se han preparado
y estudiado por su habilidad para complejar polinucleósidos. Sin
embargo, los polímeros estudiados hasta hoy han incorporado aminas
en los extremos de cadenas laterales cortas conformacionalmente
flexibles (por ejemplo, poli(lisina)) o aminas accesibles en
la superficie de poliaminas globulares o esféricas (por ejemplo,
dendrímeros PEI y PAMAM). Se piensa que la interación del polímero
con el polinucleótido previere al menos parcialmente la degradación
del polinucleótido. Por la neutralización de la carga en el
esqueleto del polinucleótido, el complejo neutro o cargado
ligeramente positivo puede también más fácilmente atravesar las
membranas hidrófobas (por ejemplo, la citoplásmica, lisosomal,
endosomal, nuclear) de la célula. En una realización particularmente
preferida el complejo está ligeramente cargado positivamente. En
otra realización particularmente preferida, el complejo tiene un
potencial-\zeta positivo, más preferiblemente el
potencial-\zeta está entre +1 y +30. En ciertas
realizaciones, agentes tales como el ácido poliacrílico (pAA),
ácido poliaspártico, ácido poliglutámico, o ácido polimaleico pueden
usarse para prevenir la inhibición del suero de los complejos
polinucleótidos/polímero en las células cultivadas en medios con
suero (Trubetskoy et al "Recharging cationic DNA complexes
with highly charged polianions for in vitro and in
vivo gene delivery" Gene Therapy
10:261-271, 2003; incorporado aquí como referencia.
Los poli(ésteres de \beta-amino) de la presente
invención poseen aminas terciarias en el esqueleto del polímero.
Aunque estas aminas están más impedidas, están disponibles para
interaccionar con un polinucleótido. Los polinucleótidos o
derivados de los mismos se ponen en contacto con los polímeros de
la invención en condiciones adecuadas para formar complejos
polinucleótido/polímero. En ciertas realizaciones, la relación de
nitrógeno en el polímero (N) a fosfato en el polinucleótido es
10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1,
65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, o 120:1. En
ciertas realizaciones, la relación polímero a ADN (p/p) es 10:1,
15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1,
70:1, 75:1, 80:1. 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1,
140:1, 150:1, o 200:1. El polímero está preferiblemente al menos
parcialmente protonado así como para formar un complejo con el
polinucleótido cargado negativamente. En una realización preferida,
los complejos polinucleótido/polímero forman nanopartículas que son
útiles en la dispensación de los polinucleótidos a las células. En
una realización particularmente preferida, el diámetro de las
nanopartículas está en el intervalo de 50-500 nm,
más preferiblemente el diámetro de las nanopartículas está en el
intervalo de 50-200 nm, y más preferiblemente de
90-150 nm. Las nanopartículas pueden estar
asociadas con un agente diana coma se describe a continuación.
En ciertas realizaciones, pueden añadirse otros
agentes a los complejos de polinucleótido:poli(éster de
beta-amino). En ciertas realizaciones, se usa un
agente cocomplejante. Se sabe que los agentes cocomplejantes se
unen a polinucleótidos y/o aumentan la eficiencia de la
transfección. Los agentes cocomplejantes usualmente tienen una
densidad de nitrógeno alta. Polilisina (PLL) y polietilenimina (PEI)
son dos ejemplos de agentes poliméricos cocomplejantes. PLL tiene
una relación de peso molecular a átomo de nitrógeno de 65, y PEI
tiene una relación de peso molecular a átomos de nitrógeno de 43.
Cualquier polímero con una relación peso molecular a átomos de
nitrógeno en el intervalo de 10-100, preferiblemente
25-75, más preferiblemente 40-70,
puede ser útil como un agente cocomplejante. La inclusión de un
agente cocomplejante en un complejo puede permitir reducir la
cantidad de poli(éster de beta-amino) en el
complejo. Esto es particularmente importante si el poli(éster de
beta-amino) es citotóxico a altas concentraciones.
En los complejos obtenidos con los agentes cocomplejantes, la
relación de agente cocomplejante a polinucleótido (p/p) puede estar
en el intervalo de 0 a 2,0, preferiblemente de 0,1 a 1,2, más
preferiblemente de 0,1 a 0,6, y aún más preferiblemente de 0,1 a
0,4.
Las propiedades de transfección de varios
complejos de la invención pueden determinarse por estudios de
transfección in vitro (por ejemplo, transfección de GFP en
células cultivadas) o en modelos animales. En ciertas realizaciones,
el complejo usado para la transfección se optimiza para un tipo
determinado de célula, polinucleótido para ser dispensado,
poli(éster de beta-amino), agente cocomplejante (si
se usa uno), proceso de enfermedad, método de administración (por
ejemplo, inhalación, oral, parenteral, intravenoso, intratecal,
etc),régimen de dosificación, etc.
Los nucleótidos para ser complejados o
encapsulados por los polímeros de la invención pueden ser cualquier
ácido nucleico incluyendo pero no limitado a ARN y ADN. Los
polinucleótidos pueden ser de cualquier tamaño o secuencia, y pueden
ser de hebra única o doble. En ciertas realizaciones preferidas, el
polinucleótido es mayor de 100 pares de bases de longitud. En
ciertas otras realizaciones preferidas, el polinucleótido es mayor
de 1000 pares de bases de longitud y puede ser mayor de 10.000
pares de bases de longitud. El polinucleótido es preferiblemente
purificado y sustancialmente puro. Preferiblemente, el
polinucleótido es mayor de 50%, más preferiblemente mayor de 75%
puro, y lo más preferido mayor de 95% puro. El polinucleótido puede
ser proporcionado por cualquiera de los medios conocidos en la
técnica. En ciertas realizaciones preferidas, el polinucleótido ha
sido realizado usando técnicas recombinantes (para una descripción
más detallada de estas técnicas, véase por favor Ausubel et al.
Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons,
Inc., New York, 1999); Molecular cloning: A Laboratory
Manual, 2ª Ed., editado por Sambrook, Fritsch, y Maniatis (Cold
Spring Harbor Laboratory Press: 1989); cada una de las cuales se
incorpora aquí como referencia). Los polinucleótidos pueden también
obtenerse de fuentes naturales y purificarse de compuestos
contaminantes encontrados normalmente en la naturaleza. Los
polinucleótidos pueden también ser sintetizados químicamente en un
laboratorio. En una realización preferida, el polinucleótido se
sintetiza usando química de fase sólida estándar.
Los polinucleótidos pueden modificarse por
medios químicos y biológicos. En ciertas realizaciones preferidas,
estas modificaciones conducen a mayor estabilidad del
polinucleótido. Las modificaciones incluyen metilación,
fosforilación, protección del extremo, etc.
Los derivados de los polinucleótidos pueden
usarse también en la presente invención. Estos derivados incluyen
modificaciones en las bases, azúcares, y/o uniones fosfato de los
polinucleótidos. Las bases modificadas incluyen, pero no están
limitadas a, aquellas encontradas en los siguientes análogos de
nucleósidos: 2-aminoadenosina,
2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina,
3-metiladenosina, 5-metilcitidina,
C5-bromouridina, C5-fluorouridina,
C5-yodouridina, C5-propiniluridina,
C5-propinilcitidina,
C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina,
7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina,
8-oxoguanosina,
O(6)-metilguanina, y
2-tiociticina. Los azúcares modificados incluyen,
pero no están limitados a, 2'-fluororribosa, ribosa,
2'-desoxirribosa,
3'-azido-2',3'-didesoxirribosa,
2',3'-didesoxirribosa, arabinosa (el epímero 2 de
ribosa), azúcares acíclicos, y hexosas. Los nucleóxidos pueden
estar unidos juntos por enlaces diferentes a los enlaces
fosfodiéster encontrados en ADN y ARN encontrados en la naturaleza.
Las uniones modificadas incluyen, pero no están limitadas a, uniones
de fósforotioato y uniones de
5'-N-fosforamidita. Las
combinaciones de las varias modificaciones pueden usarse en un
polinucleótido único. Estos polinucleótidos modificados pueden ser
proporcionados por cualquier medio conocido en la técnica; sin
embargo, como se apreciará por aquellos con conocimientos de la
técnica, los polinucleótidos modificados se preparan
preferiblemente usando química sintética in vitro.
Los polinucleótidos para ser dispensados pueden
estar en cualquier forma. Por ejemplo, el polinucleótido puede ser
un plásmido circular, un plásmido lineal, un cósmido, un genoma
viral, un genoma viral modificado, un cromosoma artificial, etc.
El polinucleótido puede ser de cualquier
secuencia. En ciertas realizaciones preferidas, el polinucleótido
codifica una proteína o un péptido. Las proteínas codificadas
pueden ser enzimas, proteínas estructurales, receptores, receptores
solubles, canales iónicos, proteínas farmacéuticamente activas,
citoquinas, interleuquinas, anti-cuerpos,
fragmentos de anticuerpos, antígenos, factores de coagulación,
albúmina, factores de crecimiento, hormonas, insulina, etc. El
polinucleótido puede también comprender regiones regulatorias para
controlar la expresión de un gen. Estas regiones regulatorias
pueden incluir, pero no están limitadas a, promotores, elementos
potenciadores, elementos represores, cajas TATA, lugares de unión
de ribosomas, lugares de parada para la transcripción, etc.
En otras realizaciones particularmente preferidas, no se pretende
que el polinucleótido codifique una proteína. Por ejemplo, el
polinucleótido puede usarse para fijar un error en el genoma de la
célula que se va a transfectar. El polinucleótido puede también
proporcionarse como un agente antisentido o como interferencia de
ARN (ARNi) (FIRE et al. Nature 391:806-811.
1998; incorporado aquí como referencia). La terapia antisentido
significa que incluye, por ejemplo, administración o provisión
in situ de oligonucleótidos de hebra única o doble o sus
derivados que específicamente se hibridan, o sea, se unen, en las
condiciones celulares, con mARN celular y/o ADN genómico, o
mutaciones de los mismos, para así inhibir la expresión de la
proteína codificada, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y /o
translación (Crooque "Molecular mecanisms of action of antisense
drugs" Biochim Biophis, Acta 1489(1):
31-44, 1999; Crooque "Evaluating the mechanism of
action of antiproliferative antisense drugs" Antisense
Nucleic Acid Drug Dev. 10(2):123-126,
discusión 127, 2000; Method in Enzymology volúmenes
313-314, 1999). La unión puede ser por
complementariedad convencional de los pares de bases, o, por
ejemplo, en el caso de unión de los dupletes de ADN, a través de
interaciones específicas en el surco mayor de la doble hélice (por
ejemplo formación de triple hélice) (Chan et al. J. Mol. Med.
75(4):267-282,1997).
En una realización particularmente preferida, el
polinucleótido que se dispensa comprende una secuencia que codifica
un péptido antigénico o proteína. Las nanopartículas que contienen
estos polinucleótidos pueden dispensarse a un individuo para
inducir una respuesta inmunológica suficiente para disminuir la
posibilidad de una infección posterior y/o disminuir los síntomas
asociados con tal infección. El polinucleótido de estas vacunas
pueden combinarse con interleuquinas, interferón, citoquinas, y
adyuvantes tales como la toxina del cólera, alumbre, adyuvante de
Freund, etc. Se conoce un gran número de compuestos
adyuvantes; un compendio útil de muchos de tales compuestos ha sido
preparado por los Nacional Institutes of Health y pueden encontrase
en la red (http:/www.niaid.nih.gov/daids/vacine/pdf/
compendium.pdf, véase también Allison Dev. Biol. Stand. 92:3-11, 1998; Unkeless et al. Annu. Rev. Immunol. 6:251-281, 1998; y Phillips et al. Vaccine 10:151-158, 1992).
compendium.pdf, véase también Allison Dev. Biol. Stand. 92:3-11, 1998; Unkeless et al. Annu. Rev. Immunol. 6:251-281, 1998; y Phillips et al. Vaccine 10:151-158, 1992).
La proteína antigénica o los péptidos
codificados por el nucleótido pueden derivarse de organismos
bacterianos tales como Streptococccus pneumoniae, Haemophilus
influenzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes.
Corynebacterium diphtheriae. Listeria monocytogenes, Bacillus
anthracis. Clostridium tetani. Clostridium botulinum., Clostridium
perfringens, Neisseria. meningitidis, Neisseria gonorrhoeae.
Streptococcus mutans. Pseudomonas aeruginosa, Salmonellel typhi,
Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella
tularensis, Yersinia pestís, Vibrio cholerae, Legionella
pneumophila, Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium leprae,
Treponema pallidum, Leptospirosis interrogaos, Borrelia burgdorferi,
Camphylobacter jejuni, y semejantes; antígenos de virus tales
como viruela, gripe A y B, el virus sincicial respiratorio,
parainfluenza, sarampión, VIH, varicela-zoster,
herpes simplex 1 y 2, citomegalovirus, el virus de
Epstein-Barr, rotavirus, rinovirus, ;adenovirus,
virus del papiloma, virus de la polio, paperas, rabia, rubeola,
virus de coxsackie, encefalitis equina, encefalitis japonesa,
fiebre amarilla, fiebre del valle de Rift, hepatitis A, B, C, D y E
y semejantes; y de hongos, protozoos y organismos parasitarios
tales como Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum,
Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides,
Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae,
Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum,
Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii,
Tricomonas vaginalis, Schistosoma mansoni, y semejantes.
Los poli(ésteres de
\beta-amino) de la presente invención pueden
también usarse para formar aparatos de dispensación de fármacos.
Los polímeros de la invención pueden usarse para encapsular agentes
que incluyen polinucleótidos, pequeñas moléculas, proteínas,
péptidos, metales, compuestos organometálicos etc. Los polímeros de
la invención tienen varias propiedades que los hacen particularmente
adecuados para la preparación de aparatos de dispensación de
fármacos. Estas incluyen 1) la habilidad del polímero para
complejar y "proteger" agentes lábiles; 2) la habilidad para
tamponar el pH en el endosoma; 3) la habilidad para actuar como
"esponja de protones" y causar endosomolisis; y 4) la
habilidad para neutralizar la carga de agentes cargados
negativamente. En una realización preferida, los polímeros se usan
para formar micropartículas que contienen el agente que se va a
dispensar. En una realización particularmente preferida, el
diámetro de las micropartículas está en el intervalo desde entre
500 nm a 50 micrómetros, más preferiblemente desde 1 micrómetro a 20
micrómetros, y más preferiblemente desde 1 micrómetro a 10
micrómetros. En otra realización particularmente preferida, las
micropartículas están en el intervalo de 1-5
micrómetros. El polímero de la invención encapsulante puede
combinarse con otros polímeros (por ejemplo, PEG, PLGA) para formar
las microesferas.
Las micropartículas de la invención pueden
prepararse usando cualquier método conocido en la técnica. Estos
incluyen, pero no están limitados a, secado por pulverización,
evaporación del disolvente de emulsión sencilla o doble, extracción
del disolvente, separación de la fase, coacervación simple y
compleja, y otros métodos bien conocidos para aquellos conocedores
de la técnica. Los métodos de preparar las micropatículas
particularmente preferidos son el proceso de emulsión doble y secado
por pulverización. Las condiciones usadas para preparar las
micropartículas pueden alterarse para producir partículas de un
tamaño o propiedad deseada (por ejemplo, hidrofobicidad,
hidrofilicidad, morfología externa, "pegajosidad", forma,
etc.). El método de preparar las partículas y las
condiciones (por ejemplo, disolvente, temperatura, concentración,
velocidad de la corriente de aire, etc) usados, puede también
depender del agente que se encapsula y lo la composición de la
matriz del polímero.
Los métodos desarrollados para hacer
micropartículas para dispensación de los agentes encapsulados se
describen en la bibliografía (por favor véase Doubrow, M., Ed.,
"Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy", CRC
Press, Boca Ratón, 1992; Mathiowitz and Langer, J. Controlled
Release 5:13-22, 1987; Mathiowitz et al.
Reactive Polymers 6:275-283, 1987; Mathiowitz
et al. J. Appl. Polymer Sci. 35:755-774,
1988; cada uno de las cuales se incorpora aquí para referencia).
Si las partículas preparadas por cualquiera de
los métodos anteriores tienen un intervalo de tamaños fuera del
intervalo deseado, las partículas pueden separarse por tamaño, por
ejemplo, usando una criba.
Los agentes para dispensarse mediante el sistema
de la presente invención pueden ser agentes terapéuticos,
diagnósticos, o profilácticos. Cualquier compuesto químico que se
va a administrar a un individuo puede dispensarse usando las
micropartículas de la invención. El agente puede ser una molécula
pequeña, compuesto organometálico, ácido nucleico, proteína,
péptido, polinucleótido, metal, un compuesto químico marcado
isotópicamente, fármaco, vacuna, agente inmunológico, etc.
En una realización preferida, los agentes son
compuestos orgánicos con actividad farmacéutica. En otra
realización de la invención, el agente es un fármaco usado
clínicamente. En una realización particularmente preferida, el
fármaco es un antibiótico, agente antiviral, anestésico, agente
esteroídico, agente antiinflamatorio, agente antineoplásico,
antígeno, vacuna, anticuerpo, descongestivo, antihipertensivo,
sedante, agente contraceptivo, agente progestágeno,
anticolinérgico, analgésico, antidepresivo, antipsicótico, agente
bloqueante \beta-adrenérgico, diurético, agente
activo cardiovascular, agente vasoactivo, agente antiinflamatorio
no esteroídico, agente nutricional, etc.
En una realización preferida de la presente
invención, el agente que se va a dispensar puede ser una mezcla de
agentes. Por ejemplo, un anestésico local puede dispensarse en
combinación con un agente antiinflamatorio tal como un esteroide.
Los anestésicos locales pueden también administrarse con agentes
vasoactivos tales como epinefrina. Para dar otro ejemplo, un
antibiótico puede combinarse con un inhibidor del enzima comúnmente
producido por bacterias para inactivar el antibiótico (por ejemplo,
penicilina y ácido clavulánico).
Los agentes de diagnóstico incluyen gases;
metales; agentes de imagen comercialmente disponibles usados en la
tomografía de emisiones de positrones (PET), tomografía asistida
por ordenador (CAT), tomografía computarizada de emisión de fotón
único, rayos X, fluoroscopía, e imagen de resonancia magnética
(MRI); y agentes de contraste. Ejemplos de materiales adecuados
para usar como agentes de contraste en MRI incluyen quelatos de
gadolineo, asi como hierro, magnesio, manganeso, cobre, y cromo.
Ejemplos de materiales útiles para CAT e imagen de rayos X incluye
materiales basados en yodo.
Los agentes profilácticos incluyen pero no están
limitados a, antibióticos, suplementos nutricionales, y vacunas.
Las vacunas pueden comprender proteínas o péptidos aislados,
organismos y virus inactivados, organismos y virus muertos,
organismos o virus genéticamente alterados, y extractos celulares.
Los agentes profilácticos pueden combinarse con interleuquinas,
interferón, citoquinas, y adyuvantes tales como toxina del cólera,
alumbre, adyuvante de Freund, etc. Los agentes profilácticos
incluyen antígenos de organismos bacterianos tales como
Streptococccus pneumoniae, Haemophilus influenzae,
Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes. Corynebacterium
diphtheriae, Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis. Clostridium
tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Neisseria.
meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus mutans.
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi. Haemophilus
parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella turarensis,
Yersinia pestís, Vibrio cholerae, Legionella pneumophila,
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema
pallidum, Leptospirosis interrogans, Borrelia burgdorferi,
Camphylobacter jejuni, y semejantes; los antígenos de virus
tales como viruela, gripe A y B, virus sincicial respiratorio,
parainfluenza, sarampión, VIH, varicela zoster, herpes simplex 1 y
2, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr,
rotavirus, rirovirus, adenovirus, virus del papiloma, virus de la
polio, paperas, rabia, rubeola, virus de coxsackie, encefalitis
equina, encefalitis japonesa, fiebre amarilla, fiebre del valle del
Riff, virus de la hepatitis A, B, C, D, y E, y semejantes;
antígenos de hongos, protozoos, y organismos parasitarios tales
como Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida
albicans, Candida tropicales, Nocardia asteroides, Rickettsia
ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia
psittaci, Chlamydia trachornatis, Plasmodium falciparum,
Trypanosoma brucei, Entamoeba histolítica, Toxoplasma gondii,
Tricomonas vaginales, Schistosoma mansoni, y semejantes. Estos
antígenos pueden estar en la forma de organismos completos muertos,
péptidos, proteínas, glicoproteínas, carbohidratos, o combinaciones
de los mismos.
Las micro y nanopartículas de la invención
pueden modificarse para incluir agentes diana ya que a menudo es
deseable dirigirse a la célula particular, colección de células, o
tejidos. Una variedad de agentes diana que dirigen las composiciones
farmacéuticas a células determinadas se conocen en la técnica
(véase, por ejemplo, Cotten et al. Methods Enzym. 217:618,
1993; incorporada aquí como referencia). Los agentes diana pueden
incluirse en toda la partícula o pueden estar solamente sobre la
superficie. El agente diana puede ser una proteína, péptido,
carbohidrato, glicoproteína, lípido, pequeña molécula, etc.
El agente diana puede usarse para alcanzar células específicas o
tejidos o puede usarse para promover la endocitosis o fagocitosis de
la partícula. Ejemplos de agentes diana incluyen, pero no se
limitan a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, lipoproteínas de
baja densidad (LDLs), tranferrina, sialiproteinas, proteínas de
sobre gp 120 del virus de la inmunodeficiencia (VIH), carbohidratos,
ligandos del receptor, ácido siálico, etc. Si el agente diana se
incluye en toda la partícula, el agente diana puede incluirse en
una mezcla que se usa para formar partículas. Si el agente diana
está solamente sobre la superficie, el agente diana puede estar
asociado con (por ejemplo enlace covalente, hidrófobo, enlace de
hidrógeno, fuerzas de van der Waals, u otras interaciones) las
partículas formarlas usando técnicas químicas estándar.
Una vez que las micropartículas o nanopartículas
(polímero complejado con polinucleótido) han sido preparadas,
pueden combinarse con uno o más excipientes farmacéuticos para
formar la composición farmacéutica que es adecuada para ser
administrada a animales incluyendo el ser humano. Como se
apreciaría por una persona con conocimiento de la técnica, los
excipientes pueden elegirse basados en la ruta de administración
como se describe más tarde, el agente que se va a administrar, la
pauta de administración del agente, etc.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención y para uso según la presente invención pueden incluir un
excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa
aquí, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable"
significa un sólido inerte, semisólido o fluido líquido, diluyente,
material encapsulante o formulación auxiliar de cualquier tipo no
tóxico. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como
vehículos farmacéuticamente aceptables son azúcares tales como
lactosa, glucosa, y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz
y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como
carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa, y acetato de celulosa;
tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como
manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites tales como aceite
de cacahuete, aceite de semilla de algodón; aceite de girasol;
aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja;
glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de
etilo y laurato de etilo; agar; detergentes tales como Tween 80;
agentes tamponantes tales como hidróxido magnésico e hidróxido
alumínico; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina
isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; y soluciones
tamponadas de fosfato; así como otros lubricantes compatibles no
tóxicos tales como laurilsulfato sódico y estearato magnésico, así
como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de
recubrimiento, edulcorantes, agentes savorizantes y aromatizantes,
preservantes y antioxidantes pueden estar presentes también en la
composición, según el juicio del formulador. Las composiciones
farmacéuticas de esta invención pueden administrarse a seres
humanos y/o animales, por vía oral, rectal, parenteral,
intracisternal, intravaginal, intranasal, intraperitoneal, por vía
tópica (como polvos, cremas, ungüentos, o gotas), por boca, o como
un pulverizado oral o nasal.
Las formas de dosificación líquidas para la
administración oral incluyen emulsiones farmacéuticamente
aceptables, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes, y
elixires. En adición a los ingredientes activos (por ejemplo,
micropartículas, nanopartículas, complejos de
polinucleótido/polímero), las formas de dosificación líquida pueden
contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica tales
como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes
y agentes emulsificantes tales como alcohol etílico, alcohol
isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol
bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol,
1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en
particular, de semilla de algodón, nuez molida, maíz, germen, oliva,
ricino, y sésamo), glicerol, alcohol de tetrahidrofurfurilo,
glicoles de polietileno y ésteres de ácidos grasos de sorbitano, y
mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las
composiciones orales pueden también incluir adyuvantes tales como
agentes de humectación, agentes emulsificantes dispersantes,
agentes edulcorantes, saborizantes y aromatizantes.
Las preparaciones inyectables, por ejemplo,
suspensiones acuosos u oleaginosas estériles inyectables pueden
formularse según la técnica conocida usando agentes dispersantes o
humectantes adecuados y agentes de suspensión. Las preparaciones
inyectables estériles pueden ser también soluciones inyectable:
estériles, suspensiones, o emulsiones en un disolvente o eluyente
aceptable parenteral no tóxico, por ejemplo, como una solución en
1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes
aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer,
solución de cloruro sódico isotónica U.S.P. Además, los aceites de
fijación estériles se emplean convencionalmente como un disolvente
o medio de suspensión. Para este propósito cualquier aceite de
fijación insípido puede emplearse incluyendo mono o diglicéridos
sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico se
usan en la preparación de inyectables. En una realización
particularmente preferida, las partículas se suspenden en un
vehículo fluido que comprende 1% (p/v) carboximetilcelulosa sódica y
0,1% (v/v) Tween 80.
Las formulaciones inyectables pueden
esterilizarse, por ejemplo, por filtración a través de un filtro
que retiene bacterias, o por incorporación de agentes esterilizantes
en la forma de composiciones sólidas estériles que pueden
disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio estéril
inyectable antes de usar.
Las composiciones para la administración vaginal
o rectal son preferiblemente supositorios que pueden prepararse
mezclando las partículas con excipientes o vehículos no irritantes
adecuados tales como la manteca de cacao, el polietilenglicol, o la
cera de supositorios que son sólidos a temperatura ambiente pero
líquidos a la temperatura corporal y por tanto funden en el recto o
en la cavidad vaginal y liberan las micropartículas.
Las formas de dosificación sólida para la
administración oral incluyen cápsulas, comprimidos, píldoras,
polvos, y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, las
partículas se mezclan con al menos un excipiente inerte,
farmacéuticamente aceptable o vehículo tal como citrato sódico o
fosfato dicálcico y/o a) rellerios o aumentadores tales como
almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, y ácido silícico, b)
aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa,
alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa, y acacia, c)
humectantes tales como glicerol, d) agentes desintegrantes tales
como agar-agar, carbonato cálcico, almidón de patata
o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos, y carbonato sódico e)
agentes retardantes de solución tales como parafina, f)
aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio
cuaternario, g) agentes humectantes tales como, por ejemplo,
alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, h) absorbentes tales
como caolín y arcilla de bentonita, e i) lubricantes tales como
talco, estearato cálcico, estearato magnésico, glicoles de
polietileno sólidos, laurelsulfato sódico, y mezclas de los mismos.
En el caso de
cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación pueden también comprender agentes de tamponamiento.
cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación pueden también comprender agentes de tamponamiento.
Las composiciones sólidas de un tipo similar
pueden también emplearse como rellenos en cápsulas de gelatina
blandas y duras usando excipientes tales como la lactosa o el
azúcar de la leche así como glicoles polietilénicos de alto peso
molecular y semejantes.
Las formas de dosificación sólidas de
comprimidos, pastillas, cápsulas, píldoras, y gránulos pueden
prepararse con recubrimientos y capas tales como recubrimientos
entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de
formulación farmacéutica. Pueden opcionalmente contener agentes de
opacidad y pueden también ser de una composición que libere el
ingrediente(s) activo(s) solamente, o preferiblemente,
en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente en forma
retardada. Ejemplos de composiciones embebidas que pueden usarse
incluyen sustancias poliméricas y ceras.
Las composiciones sólidas de un tipo similar
pueden también emplearse como rellenos en cápsulas de gelatina
blanda y dura usando excipientes como la lactosa o el azúcar de la
leche así como glicoles polietilénicos de altos pesos moleculares y
semejantes.
Las formas de dosificación para la
administración transdémica o tópica de una composición farmacéutica
de la invención incluyen ungüentos, pastas, cremas, lociones,
geles, polvos, soluciones, pulverizadores, inhaladores, o parches.
Las partículas se mezclan en condiciones estériles con un vehículo
farmacéuticamente aceptable y cualquier preservante o tampón
necesario que se precise. La formulación oftálmica, gotas para los
oídos, gotas para los ojos se contemplan también como que están
dentro del alcance de la invención.
Los ungüentos, pastas, cremas, y geles pueden
contener, además de las partículas de la invención, excipientes
tales como grasas animales y vegetales, aceites ceras, parafinas,
almidón, tragacanto, derivados de celulosa, glicoles polietilénicos,
siliconas, bentonitas, ácido silícico, talco, y óxido de zinc, o
mezclas de los mismos.
Los polvos y pulverizados pueden contener,
además de las partículas de la invención, excipientes tales como
lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos
cálcicos, y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los
pulverizados pueden contener además propelentes habituales tales
como clorofluorohidrocarbonos.
Los parches transdérmicos tienen la ventaja
añadida de proporcionar dispensación controlada de un compuesto en
el cuerpo. Tales formas de dosificación pueden hacerse disolviendo
o dispensando las micropartículas o nanopartículas en un medio
apropiado. Los potenciadores de la absorción pueden también usarse
para aumentar el flujo del compuesto a través de la piel. La
velocidad puede controlarse o proporcionando una membrana de
control de la velocidad o dispersando las partículas en una matriz
del polímero o gel.
Estos y otros aspectos de la presente invención
serán apreciados más tarde considerando los ejemplos a
continuación, los cuales están para ilustrar ciertas realizaciones
particulares de la invención pero no intentan limitar su alcance,
como se define en las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Consideraciones generales. Todas las
manipulaciones que envolvían células vivas o materiales estériles
se realizaron en una vitrina de flujo laminar usando técnicas
estándares estériles. Los espectros de ^{1}H RMN (300,100 MHz) y
^{13}C RMN (75,467 MHz) se realizaron con un espectrómetro Varian
Mercury. Todos los valores de desplazamiento químico se dan en ppm
y están referenciados en relación al protón residual o señal de
carbono del disolvente. La cromatografía de permeabilidad de gel en
fase orgánica (GPC) se realizó usando una bomba de Hewlett Packard
serie 1100 isocrática, un inyector de Rheodyne modelo 7125 con un
bucle inyector de 100 \muI, y dos columnas PL-Gel
D-mezcladas en serie (5 \mum, 300 x 7,5 mm,
Polymer Laboratorios, Amherst, MA). Se usó THF/piperidina 0,1 M
como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Los datos se
recogieron usando un refractómetro interferométrico Optilab DSP
(Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) y se procesaron con el paquete
de software TriSEC GPC (Viscotek Corporation, Houston, TX). Los
pesos moleculares y polidispersidades de los polímeros se describen
en relación a estándares monodispersos de poliestireno. La
cromatografía GPC en fase acuosa se realizó con American Polymer
Standards (Mentor, OH) usando las columnas Ultrahidrogel L y 120A en
serie (Waters Corporation, Milford, MA). Se usó agua (con ácido
acético al 1%, y NaCl 0,3 M) como eluyente a una velocidad de flujo
de 1,0 ml/min. Los datos se recogieron usando un refractómetro
diferencial de Knauer y se procesaron con el paquete de software
IBM/PC GPC PRO 3,13 (Viscotek Corporation, Houston, TX). Los pesos
moleculares y polidispersidades de los polímeros se dan en relación
a estándares de poli(2-vinilpiridina). En
los ensayos de citotoxicidad, se midió la absorbancia usando un
lector de microplaca de Dynatech Laboratories MR5000 a 560 nm.
Materiales. La
N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina y
4,4'-trimetilendipiperidina se obtuvieron
comercialmente de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). El
diacrilato de 1,4-butanodiol se obtuvo cae Alfa
Aesar Organics (Ward Hill, MA). El bromuro de
(3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio
(MTT) se obtuvo de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). El ADN
plasmídico (pCMV-Luc) se produjo con E. coli
(DH5\alpha, un amable regalo de Zycos, Inc., Cambridge, MA), fue
aislado con un kit de Qiagen, y se purificó por precipitación coro
etanol. Las células NIH 3T3 se obtuvieron comercialmente de
American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se cultivaron a
37ºC, en 5% de CO_{2} en 90% de medio de Eagle modificado por
Dulbecco; 10% de suero bovino fetal; 100 unidades/ml de penicilina;
100 \mug/ml de estreptomicina. Todos los demás materiales y
disolventes se usaron como se recibieron sin purificación
adicional.
Procedimiento general de polimerización.
En un experimento típico, se pesaron el diacrilato de
1,4-butanodiol (0,750 g, 0,714 ml, 3,78 mmoles) y la
diamina (3,78 mmoles) en dos viales separados y se disolvieron en
-i HF (5 ml). Se añadió la solución que contenía la diamina a la
solución de diacrilato con una pipeta. Se añadió una barra
giratoria magnética recubierta de Teflón, se tapó el vial con una
tapa de rosca recubierta de Teflón, y se calentó la reacción a
50ºC. Después de 48 horas, se enfrió la reacción a temperatura
ambiente y se dejó gotear lentamente en éter dietílico o hexanos
con agitación fuerte. Se recogió el polímero y se secó al vacío
antes del análisis.
Síntesis del polímero comparativo 1. Se
preparó 1 polímero 1 según el procedimiento general descrito
anteriormente. ^{1}H RMN \delta (CDCl_{3}, 300 MHz) 4,11 (t
ancho, 4H), 2,75 (t ancho, J = 7,05 Hz, 41-1), 2,53
(s ancho, 4H), 2,50 (t ancho, (solapado), J = 7,20 Hz, 4H), 2,28 (s
ancho, 6H), 1,71 (m ancho, 4H), ^{13}C RMN \delta (CDCl_{3},
75,47 MHz) 172, 55, 64,14, 55, 31, 53, 39, 42, 47, 32, 54, 25,
53.
Síntesis del polímero comparativo 2. Se
preparó el polímero 2 según el procedimiento general descrito
anteriormente. ^{1}H RMN \delta (CDCl_{3}, 330 MHz) 4,11 (t
ancho, 4H), 2,74 (t ancho, J = 7,35, 4H), 2,56 (m ancho, 12H), 1,71
(t ancho, 4H). ^{13}C RMN 5 (CDCl_{3}, 75,47 MHz) 172,24,
64,19, 53,55, 52,75, 32,27, 25,52. Síntesis del polímero comparativo
3. Se preparó el polímero 3 según el procedimiento general descrito
anteriormente. 5 (CDCl_{3}, 300 MHz) 4,11 (t ancho, 4H), 3,00 (m
ancho, 4H), 2,79 (m ancho, 4H), 2,65 (m ancho, 4H), 2,11 (m ancho,
4H), 1,70 (m ancho, 8H), 1,25 (m ancho, 12H). ^{13}C RMN 5
(CDCl_{3}, 75,47 MHz) 172,37, 64,13, 53,89 (ancho), 36,74, 35,58,
32,11 (ancho), 25,45, 24,05.
Estudios de degradación de polímeros. Las
sales de hidrocloruro de los polímeros 1-3 se
disolvieron en tampón de acetato (1 M, pH = 5,1) o tampón de HEPES
(1 M, pH = 7,4) a una concentración de 5 mg/ml (el uso de
concentraciones milimolares del tampón produjo una reducción
sustancial del pH durante la degradación debido a la producción de
productos de degradación ácidos). Se incubaron las muestras a 37ºC
con un agitador mecánico, y se tomaron alícuotas (1 ml) a intervalos
de tiempo adecuados. Se congelaron las alícuotas inmediatamente en
nitrógeno líquido y se liofilizaron. Se extrajeron los polímeros de
las sales de tampón secas usando THF/piperidina 0,1 M (1 ml), y se
analizaron las muestras directamente por GPC.
Formación de los complejos ADN/polímero y
pruebas de ralentización en el gel de agarosa. Se formaron los
complejos ADN/polímero añadiendo 50 \mul de una solución de ADN
plasmídico (pCMV Luc, 2 \mug/50 \mul en agua) a una solución
agitada por vórtex suave de las sales de hidrocloruro de los
polímeros 1-3 (50 \mul en MES 25 mM, pH = 6,0,
las concentraciones se ajustaron para dar las relaciones de peso de
ADN/polímero deseadas). Se incubaron las muestras a temperatura
ambiente durante 30 minutos, después de lo cual se cargaron 20
\mul en un gel de agarosa de 1% (HEPES, 20 mM, pH = 7,2, 65 V, 30
minutos). Se cargaron las muestras en el gel en un tampón de carga
que consistía en Ficoll 400 al 10% (Anersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Suecia) en HEPES (25 mM, pH = 7,2). No se incluyó el azul
de bromofenol como indicador visual en el tampón de carga, puesto
que este tinte cargado parecía interferir con el complejamiento del
polímero y el ADN. Se visualizaron las bandas de ADN con luz
ultravioleta por mancha con bromuro de etidio.
Medidas de dispersión de rayo de láser casi
elástico (QELS) y medidas de los potenciales \xi. Los
experimentos de QELS y medidas de los potenciales \xi se
realizaron usando un detector ZetaPals dinámico de dispersión de la
luz (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, láser de
15 mW, rayo incidente = 676 nm). Los complejos ADN/polímero se
formaron como se describió anteriormente en las pruebas de
ralentización de gel de agarosa. Se diluyeron las muestras con 900
\mul de HEPES (20 mM, pH=7,0), se añadieron a una muestra en
agitación de vórtex suave del complejo ADN/polímero (volumen total
= 1 ml, pH = 7,0). Se determinaron los tamaños medios de las
partículas y los potenciales \xi a 25ºC. Las funciones de
correlación se tomaron a un ángulo de dispersión de 90ºC, y se
calculó el tamaño de las partículas usando la opción de MAS del
software de tamaño de partícula BIC (versión 2.30) usando la
viscosidad y el índice de refracción del agua pura a 25ºC. Los
tamaños de partícula se expresan como los diámetros efectivos
asumiendo una distribución logarítmica normal. Las movilidades
electroforéticas medias se midieron a 25ºC usando el software de
análisis de potencial zeta BIC PALS y los potenciales zeta se
calcularon usando el modelo de Smoluchowsky para suspensiones
acuosas. Se realizaron tres medidas de cada muestra, y se
presentaron los resultados como diámetros medios y potenciales zeta
medios.
Ensayos de citotoxicidad. Se cultivaron
células NIH 3T3 inmortalizadas en placas de 96 pocillos con una
densidad inicial de 10.000 células/pocillo en 200 \mul de medio
de crecimiento (90% de medio de Eagle modificado por Dulbecco; 10%
de suero bovino fetal; 100 unidades/ml de penicilina; 100 \mug/ml
de estreptomicina). Se cultivaron las células durante 24 horas,
después de lo cual se eliminó el medio de cultivo y se reemplazó
con 180 \mul de medio sin suero. Se añadieron las cantidades
adecuadas de polímero en alícuotas de 20 \mul. Se incubaron las
muestras a 37ºC durante 5 horas y se determinó la actividad
metabólica de cada pocillo usando un ensayo de tinte azul MTT/azul
de tiazolilo: se añadió a cada pocillo 25 \mul de una solución de
5 mg/ml de solución madre de MTT en tampón de PBS estéril. Se
incubaron las muestras a 37ºC durante 2 horas, y se añadió a cada
pocillo 100 \mul de tampón de extracción (20% p/v de SDS en
DMF/agua (1:1), pH = 4,7). Se incubaron las muestras a 37ºC durante
24 horas. Se midió la absorbancia óptica a 560 nm con un lector de
microplaca y se expresó como el porcentaje en relación a las
células de control.
La síntesis de poli(amidoiminas) lineales
que contienen aminas terciarias en sus esqueletos se ha descrito
por Ferruti et al. en 1970 vía la adición de aminas
bifuncionales a bisacrilamidas (Anderson Nature 392
(Suppl.): 25-30, 1996; Friedman Nature Med.
2:144-147, 1996; Cristal Science
270:404-410, 1995; Muligan Science
260:926-932, 1993). Se investigaron inicialmente
poli(amidoiminas) lineales como la heparina y biomateriales
complejantes de iones (Ferruti et al Advances in Polymer
Science 58:55-92, 1984; Ferruti et al.
Biomaterials 15:1235-1241, 1994; Ferruti et
al Macromol. Chem. Phys. 200:1644-1654, 1999;
Ferruti et al. Biomaterials 15:1235-1241,
1994). Las poli(amidoiminas) dendríticas (PAMAMs) se han
usado cada vez más en aplicaciones de transferencia de genes debido
a su habilidad de complejar el ADN (Kukowska-Latallo
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93:4897-4902, 1996; Tang et al. Bioconjugate
Chem. 7:703-714, 1996; Haensler et al.
Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993), y una
publicación reciente describe la aplicación de una familia de
poli(amidoiminas) lineales a los estudios de transfección
celular y de citotoxicidad (Hill et al. Biochim. Biophys.
Acta 1427:161-174, 1999). Por el contrario,
poliéster aminas) análogas formadas por la adición tipo Michael de
aminas bifuncionales a ésteres de diacrilato han recibido menos
atención (Danusso et al. Polymer 11:88-113,
1970; Ferruti et al. Polymer 26:1336, 1985; Ferruti et al
Advances in Polymer Science 58:55-92, 1984;
Ferruti et al Biomaterials 15:1235-1241,
1994; Ferruti et al Macromol. Chem. Phys.
200:1644-1654, 1999; Ferruti et al
Biomaterials 15:1235-1241, 1994; Kargina et
al. Vysokomol. Soedin. Seriya A 28:1139-1144,
1986; Rao et al. J. Bioactive and Compatible Polymers
14:54-63, 1999).
La aproximación de poli(amino éster)
presenta una base particularmente atractiva para el desarrollo de
vectores de transfección nuevos poliméricos por varias razones: 1)
los polímeros contienen las aminas requeridas y uniones fácilmente
degradables, 2) potencialmente podrían sintetizarse análogos
múltiplas directamente con materiales de partida comercializados, y
3) si los polímeros obtenidos fueran útiles como agentes de
condensación del ADN, podrían fácilmente entramarse generaciones
futuras de polímeros que poseyeran valores de pKa de amina
cubriendo el intervalo de pH fisiológicamente relevante. Este
último punto era particularmente intrigante, ya que la capacidad de
tampón de las poliaminas se ha implicado recientemente como un
factor que influye en la fuga del ADN de los endosomas celulares
después de la endocitosis (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 92:7297-7301, 1995; Haensler et al.
Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993; Behr Chimia
51:34-36, 1997; Demeneix et al., en Artificial
Self-Assembling Systems for Gene Delivery
(Felgner et al., editores), American Chemical Society,
Washington, D.C., 1996, páginas 146-151; Kabanov
et al., en Self-Assembling Complexes for Gene
Delivery: From Laboratory to Clínical Trial, John Wiley and
Sons, Nueva York, 1998). Mientras que el complejamiento del ADN con
un polímero catiónico es requerido para compactar y proteger el ADN
durante los eventos iniciales en el proceso de transfección, el ADN
y el polímero deben últimamente descomplejarse en el núcleo para
permitir una transcripción eficiente (Luo et al. Nat.
Biotechnol. 18:33-37, 2000). En vista de este
requerimiento, las policaciones degradables podrían jugar un papel
importante en los eventos de "deshacer el paquete del vector"
en el núcleo (Luo et al. Nat. Biotechnol.
18:33-37, 2000; Schaffer et al. Biotechnol.
Bioeng. 67:598-606, 2000; Kabanov Pharm. Sci.
Technol. Today 2:365-372, 1999). Finalmente, se
propuso la hipótesis que los polímeros de esta estructura general, y
los derivados de \beta-aminoácidos a los que
presumiblemente se degradan, serían significativamente menos
tóxicos que la poli(lisina) y PEI. Como se describió
anteriormente, las policaciones degradables (Putnam et al.
Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et
al. J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim
et al. J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525,
2000) y los polímeros lineales que contienen aminas relativamente
impedidas situadas cerca del esqueleto del polímero (Gonzalez et
al. Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999) son
menos tóxicos que la poli(lisina) y PEI.
Se investigó la síntesis de los polímeros
1-3 vía la adición de las bis(aminas
secundarias), N,N'-dimetiletilendiamina, piperazina,
y 4,4'-trimetilendipiperidina al diacrilato de
1,4-butanodiol (Danusso et al. Polymer
11:88-113, 1970; Kargina et al. Vysokomol.
Soedin. Seriya A 28:1139-1144, 1986). La
polimerización de estos monómeros procedió en THF y
CH_{2}Cl_{2} a 50ºC para dar los polímeros correspondientes en
rendimientos de hasta 86% (Tabla 1). Se purificaron los polímeros
por medio de precipitaciones repetidas en éter dietílico o hexano.
El polímero 1 se aisló como un líquido transparente viscoso; los
polímeros 2 y 3 se obtuvieron como sólidos blancos después de secar
a alto vacío. Alternativamente, los polímeros 1-3
pueden aislarse como sales sólidas de hidrocloruro después de la
adición de éter dietílico/HCl a una solución del polímero en THF o
CH_{2}Cl_{2}. Los tres polímeros fueron solubles en disolventes
orgánicos tales como THF, CH_{2}Cl_{2}, CHCl_{3} y MeOH y
fueron también solubles en agua a pH reducido. El polímero 1 y las
sales de hidrocloruro de los polímeros 1-3 fueron
totalmente solubles en agua.
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\newpage
Los pesos moleculares de los polímeros
1-3 y de sus sales de hidrocloruro correspondientes
se determinaron por cromatografía de permeabilidad de gel (GPC)
tanto en fase orgánica como en fase acuosa. Los pesos moleculares
de los polímeros (Mn) estuvieron en el intervalo de hasta 5.800
para el polímero 1 hasta 32.000 para el polímero 3, en relación a
estándares de poliestireno. La distribución de peso molecular en
estos polímeros fue monomodal con índices de polidispersidad (PDIs)
en el intervalo de 1,55 a 2,55. Los datos representativos de peso
molecular se presentan en la tabla 1. Mientras que la síntesis de
poli(amidoiminas) lineales generalmente se realiza usando
alcoholes o agua como disolventes (Danusso et al. Polymer
11:88-113, 1970; Ferruti et al. Polymer
26:1336, 1985; Ferruti et al Advances in Polymer Science
58:55-92, 1984; Ferruti et al Biomaterials
15:1235-1241, 1994; Ferruti et al Macromol. Chem.
Phys. 200:1644-1654, 1999; Ferruti et al
Biomaterials 15:1235-1241, 1994), se usaron THF
anhidro y CH_{2}Cl_{2} en la síntesis de los
poli(\beta-aminoésteres) para minimizar las
reacciones de hidrólisis durante la síntesis. Los rendimientos y
pesos moleculares de los polímeros sintetizados empleando
CH_{2}Cl_{2} como disolvente fueron generalmente más altos que
los de los polímeros sintetizados en THF (Tabla 1) (el polímero 1 no
pudo sintetizarse en CH_{2}Cl_{2}. El color de la solución de
reacción progresó desde incoloro a un color rosa intenso casi
inmediatamente después de la introducción de una solución de
N,N'-dimetiletilendiamina en CH_{2}Cl_{2} a una
solución de diacrilato de 1,4-butanodiol en
CH_{2}Cl_{2} (véase la sección experimental anterior). El color
progresó a naranja ligero en el curso de la reacción, y se aisló un
polímero naranja después de precipitación con hexano. El polímero
aislado fue insoluble en CH_{2}Cl_{2}, THF y agua a pH reducido
y no fue caracterizado estructuralmente. No se encontró este
problema en la reacción análoga con THF).
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Las estructuras de los polímeros
1-3 se confirmaron por espectroscopia de RMN de
^{1}H y ^{13}C. Estos datos indican que los polímeros se
formaron por la adición del conjugado de las aminas secundarias a
los restos de acrilato del diacrilato de
1,4-butanodiol y no por la formación de enlaces de
amida en nuestras condiciones de reacción. Adicionalmente, las
aminas terciarias nuevamente formadas en los esqueletos poliméricos
no participan en las reacciones de adición subsiguientes con el
monómero de diacrilato, lo que conduciría a la ramificación o el
entrecruzamiento polimérico. Este resultado afortunado parece ser
único para los polímeros de este tipo producidos de monómeros de
bis(aminas secundarias). La síntesis de polímeros análogos
empleando aminas primarias difuncionales como monómeros
(tales como 1,4-diaminobutano) puede conducir a la
ramificación del polímero y a la formación de redes de polímeros
entrecruzados insolubles si las condiciones no son controladas
explícitamente.
\newpage
Vista la yuxtaposición de aminas y ésteres en
los esqueletos de los polímeros 1-3, inicialmente
estábamos preocupados de que la hidrólisis, pudiera ocurrir
demasiado rápidamente en los polímeros para ser de uso práctico.
Por ejemplo, el poli(éster de
4-hidroxi-L-prolina)
y el
poli[\alpha-(4-aminobutil)-L-ácido
glicólico] se degradan bastante rápidamente cerca de pH neutro,
teniendo semividas de aproximadamente 2 horas (Lim et al. J. Am.
Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999) y 30 minutos
(Lim et al. J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525,
2000), respectivamente (dichos tiempos de degradación rápida no
impiden la aplicación de estos polímeros para la dispensación de
genes (véase las referencias, Lim et al. J. Am. Chem. Soc.
121:5633-5639, 1999; Lim et al. J. Am. Chem.
Soc. 122:6524-6525, 2000). Sin embargo, las
velocidades de degradación extremadamente rápidas introducen
generalmente preocupaciones adicionales relacionadas con la
manipulación, almacenaje, y aplicación de los polímeros
degradables). Sin embargo, el análisis de los polímeros 1 y 2 por
GPC acuosa usando 1% ácido acético/agua como eluyente, reveló que
la degradación era lo suficientemente lenta en medio ácido. Por
ejemplo, las muestras de GPC de los polímeros 1 y 2 muestreados en
estas condiciones en un periodo de 4-5 horas
mostraron que no hubo cambios en los pesos moleculares o
polidispersidades (el polímero 3 no pudo ser analizado por GPC
acuosa). Estábamos también preocupados de que pudiera ocurrir
hidrólisis significativa del esqueleto durante el aislamiento de
las sales de hidrocloruro de los polímeros 1 y 3. Para prevenir la
hidrólisis durante la protonación y aislamiento de estos polímeros,
se emplearon disolventes anhidros y se realizaron las reacciones en
atmósfera de argón. Análisis de los polímeros antes y después de la
protonación no reveló hidrólisis observable. Por ejemplo, el
trazado por GPC de una muestra del polímero 3 después de la
precipitación con CH_{2}Cl_{2} con éter dietílico 1,0 M/HCl
(M_{n} = 15.300; PDI = 1,90) fue virtualmente idéntico al peso
molecular del polímero antes de la protonación (M_{n} = 15.700;
PDI = 1,92) y ninguna especie de peso molecular más bajo fue
evidente (los datos de GPC comparativos se obtuvieron empleando
THF/piperidina 0,1 M como eluyente (véase la sección experimental
anterior). Las sales de hidrocloruro de los polímeros eran
insolubles en THF, pero eran solubles en THF/piperidina 0,1 M
formando al mismo tiempo un precipitado fino blanco que se filtró
antes de la inyección). Las muestras sólidas de los polímeros
1-3 pudieron ser almacenadas durante varios meses
sin disminución apreciable de los pesos
moleculares.
moleculares.
Los polímeros 1-3 fueron
específicamente diseñados para degradarse vía hidrólisis de los
enlaces éster en los esqueletos de los polímeros. Sin embargo, una
preocupación adicional relacionada con la estabilidad total y
biocompatibilidad de estos polímeros es el potencial de que ocurra
una degradación no deseada por una reacción
retro-Michael en condiciones fisológicas. Puesto que
estos polímeros fueron sintetizados vía la reacción tipo Michael de
una amina secundaria con un éster de acrilato, es posible que los
polímeros pudieran sufrir una reacción retro-Michael
para regenerar los grupos acrilatos libres, particularmente en
condiciones ácidas. Los ésteres de acrilato son agentes potenciales
de alquilación del ADN y se sospecha por lo tanto que puedan ser
carcinógenos (para ejemplos recientes, véase: Schweikl et al.
Mutat. Res. 438:P71-P78, 1999; Yang et al.
Carcinogenesis 19:P1117-P1125, 1998). Ya que se
espera que estos polímeros se encuentren con un medio de pH reducido
en las vesículas endosomiales de las células (pH = 5,0 - 5,5)
durante la transfección, estudiamos el potencial de que ocurriera
la degradación de estos polímeros a través de la vía
retro-Michael.
Los polímeros 1-3 se degradaron
rápidamente en condiciones extremadamente ácidas (pH < 3) o
básicas (pH > 12), polímeros 1-3 se degradaron
rápidamente y exclusivamente a 1,4-butanodiol y los
productos secundarios bis (13-aminoácido) esperados
4a-6a como se determinó por espectroscopia de
^{1}H RMN. No se encontró ninguna evidencia de espectroscopia
para la adición retro-Michael en estas condiciones.
Vale la pena mencionar que sería menos probable que a los productos
bis(\beta-aminoácido) de degradación
4a-6a les ocurriera una reacción retro Michael, ya
que los ácidos acrílicos son en general partes menos activadas de
una adición de Michael (Perlmutter, P., en Conjugate Addition
Reactions in Organic Síntesis, Pergarion Press, Nueva York,
1992). No se observó ninguna degradación adicional de los compuestos
4a-6a en estas condiciones.
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Se investigó la cinética de degradación de los
polímeros en el intervalo de las condiciones probables que se
encuentren los polímeros durante la transfección. La degradación se
monitorizó a 37ºC a valores de pH tamponados de 5,1 y 7,4 para
acercarse al pH del medio dentro de las vesículas endosomales y el
citoplasma, respectivamente. Se añadieron las sales de hidrocloruro
de los polímeros 1-3 al tampón apropiado, se
incubaron a 37ºC, y se tomaron alícuotas en los tiempos apropiados.
Se congelaron las alícuotas inmediatamente, se liofilizaron, y se
extrajo el polímero con THF/piperidina 0,1 M para el análisis por
GPC. La figura 1 muestra los perfiles de degradación de los
polímeros 1-3 en función del tiempo. Los polímeros
se degradaron más lentamente a pH 5,1 que a pH 7,4. Los polímeros
1-3 mostraron perfiles de degradación similares a
pH 5,1, cada polímero tuvo una semivida de aproximadamente
7-8 horas. Por el contrario, los polímeros
1-3 fueron completamente degradados en menos de 5
horas a pH 7,4. Estos resultados son consistentes con los perfiles
de degradación de pH de otros poliésteres que contienen aminas,
tales como
poli(4-hidroxi-L-éster de
prolina), en los que se piensa que las funciones amina colgantes
actúan como catalizadores nucleófilos intramoleculares y
contribuyen a la degradación más rápida a pH más alto (Lim et
al. J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim
et al. J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525,
2000). Mientras que no puede eliminarse la posibilidad de una
asistencia intramolecular, es menos probable para los polímeros
1-3 ya que las aminas terciarias de estos polímeros
deberían ser menos nucleófilas. La de- gradación del polímero 2
ocurrió más lentamente a pH 7,4 que a pH 5,1 (figura 1). Lo más
probable es que este comportamiento anómalo se deba a la total
insolublilidad del polímero 2 a pH 7,4 y la naturaleza heterogénea
resultante en el medio de degradación (los polímero 2 y 3 no son
completamente solubles en agua a pH 7,4. Mientras que el polímero 3
se disolvió relativamente rápidamente durante el experimento de
degradación, partículas sólidas del polímero 2 fueron visibles
durante varios días.
La poli(lisina) y el PEI se han
investigado ampliamente como agentes de condensación del ADN y
vectores de transfección de ADN (Luo et al. Nat. Biotechnol.
18:33-37, 2000; Behr Acc. Chem. Res.
26:274-278, 1993; Zauner et al. Adv. Drug Del.
Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov et al.
Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; Boussif et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301,
1995; Behr Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix
et al., en Artificial Self-Assembling Systems for
Gene Delivery (Felgner et al., editores), American
Chemical Society, Washington, D.C., 1996 páginas
146-151; Kabanov et al., en
Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From
Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York,
1998) y son los estándares con los que a menudo se comparan los
vectores poliméricos nuevos (Putnam et al., Macromolecules
32:3658-3662, 1999; Lim et al. J. Am. Chem.
Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et al. J. Am.
Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Gonzalez et
al., Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999).
Desgraciadamente, como se ha descrito anteriormente, estos polímeros
están también asociados con niveles significativos de citotoxicidad
y los niveles altos de expresión genética se realizan
corrientemente sólo con un coste sustancial de la viabilidad
celular. Para determinar el perfil de toxicidad de los polímeros
1-3, se realizó como indicador inicial una prueba
de reducción del tinte azul MTT/tiazolilo usando la línea celular
NIH 3T3 y las sales de hidrocloruro de los polímeros
1-3. La línea celular 3T3 se usa corrientemente
como población de primer nivel de cribado de los nuevos vectores de
transfección, y la prueba de MTT se usa generalmente como indicador
inicial de citotoxicidad, puesto que determina la influencia de
sustancias añadidas en el crecimiento celular y metabolismo (Hansen
et al. Immunol. Methods 119:203-210,
1989).
1989).
Se incubaron las células con el polímero 1
(M_{n} = 5.800), el polímero 2 (M_{n} = 11.300) y el polímero 3
(M_{n} = 22.500), como se describe en la sección experimental.
Como se muestra en la figura 2, las células incubadas con estos
polímeros permanecieron viables en un 100% comparadas con los
controles, a concentraciones de los polímeros de hasta 100
\mug/ml. Estos resultados se comparan impresionantemente con los
datos obtenidos con poblaciones celulares tratadas con PEI (Mn =
25.000), incluidas como controles positivos en nuestra prueba así
como para facilitar la comparación con este agente de transfección
bien conocido. Menos del 30% de las células tratadas con PEI
permanecieron viables a una concentración del polímero de 25
\mug/ml, y la viabilidad celular fue tan baja como el 10% a
concentraciones mayores de PEI en condiciones por lo demás
idénticas. Se realizó un ensayo de MTT análogo usando
bis(\beta-aminoácido)s
4a-6a para cribar la citotoxicidad de los productos
de degradación hidrolítica de estos polímeros. (Los
bis(\beta-aminoácido)s
4a-6a deberían ser o biológicamente inertes o
poseer una toxicidad ligera o una toxicidad aguda que sea menor que
la de los vectores de transfección policatiónicos tradicionales. En
cualquier caso, la degradación de estos materiales debería
facilitar la eliminación metabólica rápida). Los compuestos
4a-6a y el 1,4-butanodiol no
perturbaron el crecimiento celular o metabolismo en esta prueba
inicial de cribado (no se muestran los datos). No puede hacerse una
comparación más directa basada en estructura/función entre los
polímeros 1-3 y PEI debido a las diferencias en la
estructura de los polímeros y el peso molecular, ambos de los
cuales contribuyen a la toxicidad de policación. A pesar de todo,
solo los perfiles de toxicidad excelentes de los polímeros
1-3 sugirieron que eran candidatos muy interesantes
para estudios adicionales como agentes de condensación de ADN.
Es bien conocida la tendencia de las poliaminas
catiónicas a interaccionar electrostáticamente con el esqueleto
polianiónico del ADN en solución acuosa. Siempre que los polímeros
tengan los protones suficientes a pH fisiológico, y que las aminas
sean accesibles estéricamente, dichas interacciones pueden producir
un proceso de autoensamblaje en el que los polímeros positiva y
negativamente cargados forman conjugados bien definidos (Kabanov
et al. en Self-Assembling Complexes for
Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley
and Sons, Nueva York, 1998). La mayoría de las poliaminas
investigadas como agentes complejantes del ADN y vectores de
transfección del ADN tienen aminas incorporadas en los extremos de
cadenas laterales cortas, flexibles desde un punto de vista
conformacional (por ejemplo, poli(lisina) y polímeros de
metacrilato/metacrilamida) (Zauner et al., Adv. Drug Del.
Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov et al.
Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; van de Wetering
et al. Bioconjugate Chem. 10:589-597, 1999),
o aminas accesibles en las superficies de poliaminas esféricas o
globulares (por ejemplo, PEI y dendrímeros de PAMAM) (Boussif et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301,
1995; Kukowska-Latallo et al. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93:4897-4902, 1996; Tang et al.,
Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler
et al., Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993).
Ya que los polímeros 1-3 contienen aminas
terciarias, y esas aminas terciarias están situadas en un entorno
abarrotado estéricamente (flanqueado en dos lados por los esqueletos
del polímero), inicialmente estábamos preocupados de que las aminas
protonadas pudieran no ser suficientemente capaces de interaccionar
íntimamente con el ADN.
Se demostró la habilidad de los polímeros
1-3 para complejar el ADN plasmídico con una prueba
de desplazamiento en gel de agarosa. La electroforesis en gel de
agarosa separa las macromoléculas tanto en base a su carga como a su
tamaño. Por lo tanto, la inmovilización del ADN en el gel de
agarosa en presencia de concentraciones cada vez mayores de una
policación se ha usado ampliamente como una prueba para determinar
el punto en el que se consigue la completa neutralización de la
carga de ADN (Putnam et al., Macromolecules
32:3658-3662, 1999; Lim et al., J. Am. Chem.
Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et al., J. Am.
Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Gonzalez et
al., Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999).
Como se ha mencionado anteriormente, las sales de hidrocloruro de
los polímeros 1-3 son solubles en agua. Sin
embargo, los polímeros 2 y 3 no son totalmente solubles en agua a pH
7,2 en el intervalo completo de concentraciones poliméricas
deseado. Por lo tanto, se prepararon los complejos ADN/polímero en
tampón MES (25 mM, pH = 6,0;1. Se prepararon los complejos
ADN/polímero añadiendo una solución acuosa de ADN a soluciones del
polímero en MES agitado con vortex en las concentraciones
ADN/polímero deseadas (véase la sección experimental). Los
complejos ADN/polímero obtenidos permanecieron solubles después de
su dilución con el tampón de la electroforesis (HEPES 20 mM, pH =
7,2) y se obtuvieron los datos a pH fisiológico. Como un ejemplo
representativo, la figura 3 describe la migración de un ADN
plasmídico (pCMV-Luc) en gel de agarosa en
presencia de concentraciones en aumento del polímero 1.
Como se muestra en la figura 3, la ralentización
de la migración del ADN empieza en relaciones ADN/1 tan bajas como
1:0,5 (p/p) y la migración está completamente ralentizada a
relaciones ADN/polímero por encima de 1:1,0 (p/p) (aquí se refiere
a proporciones ADN/peso de polímero más que a relaciones ADN/carga
de polímero. Aunque se usan ambas formas en la bibliografía,
encontramos que las relaciones en peso son más prácticas y
universales, ya que la carga total de una poliamina está sujeta a
variaciones del entorno de pH y la temperatura. Mientras que las
relaciones ADN/carga de polímero son descriptivas para polímeros
tales como la poli(lisina), tienen menos significado para
los polímeros tales como el PEI y los polímeros 1-3
que incorporan aminas menos básicas). Los polímeros 2 y 3 inhiben
completamente la migración del ADN plasmídico a relaciones
ADN/polímero (p/p) mayores de 1:10 y 1:1,5, respectivamente (datos
no mostrados). Estos resultados varían marcadamente de los
experimentos de ralentización en gel conducidos usando
"monómeros" modélicos. Puesto que los monómeros verdaderos y
los productos de degradación de los polímeros 1-3
no representan adecuadamente las unidades de repetición de los
polímeros, usamos los bis(éster(es) metílico)s
4b-6b para examinar la extensión necesaria de
polivalencia y unión cooperativa de las policaciones
1-3 para conseguir la inmovilización del ADN. Los
"monómeros" 4b-6b no inhibieron la migración
del ADN en relaciones ADN/"monómero" (p/p) hasta de 1:30
(datos no mostrados).
Lo más probable es que las razones para el
complejamiento menos eficiente empleando el polímero 2 en los
ensayos anteriores de electroforesis sean las diferencias en los
valores de pK_{a} de las aminas en estos polímeros. La medida
directa de los valores de pK_{a} de los polímeros
1-3 está complicada por su capacidad de degradación.
Sin embargo, predecimos que el intervalo de valores de pK_{a} de
las aminas en los polímeros 1 y 2 se extiende desde aproximadamente
4,5 a 8,0 en el polímero 1, y de 3,0 a 7,0 en el polímero 2, basado
en comparaciones con poli(\beta-amino
imidas) relacionadas estructuralmente. (Se han publicado los
valores de pK_{a} de las poli(\beta-amino
amidas) relacionadas estructuralmente que contienen unidades de
piperazina y dimetiletilendiamina en sus esqueletos. Barbucci et
al. Polymer 21:81-85, 1980; Barbucci et al.
Polymer 19:1329-1334, 1978; Barbucci et al.
Macromolecules 14:1203-1209, 1981).
Como resultado, el polímero 2 debería estar
menos protonado que el polímero 1 a pH fisiológico o casi neutro, y
sería por lo tanto un agente de condensación del ADN menos eficaz.
El intervalo de valores de pK_{a} del polímero 3 debería ser mayor
que el intervalo de los polímeros 1 y 2 debido a la mayor distancia
entre los átomos de nitrógeno. Según esto, el polímero 3 forma
complejos con el ADN a concentraciones sustancialmente reducidas en
relación al polímero 2.
Las pruebas de ralentización en el gel de
agarosa son útiles para determinar la extensión a la que la
policaciones interacionan con el ADN. Sin embargo, para que sean
útiles como agentes de transfección, las policaciones deben ser
también capaces de autoensamblar el ADN plasmídico como complejos
polímero/ADN lo suficientemente pequeños para penetrar una célula
por endocitosis. En la mayor parte de los tipos de células, este
requerimiento de tamaño está en el orden de 200 nm o menor (Zauner
et al., Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998),
aunque pueden también acomodarse partículas más grandes (Demeneix
et al. en Artificial Self-Assembling
Systems for Gene Delivery (Felgner et al., editores),
American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, páginas
146-151; Kabanov et al., en
Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to
Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York, 1998).
La habilidad de los polímeros
1-3 para comprimir ADN plasmídico en estructuras
con tamaño de nanómetros se determinó por dispersión de rayo láser
casi elástico (QELS), y las cargas superficiales relativas de los
complejos obtenidos se cuantificaron con medidas de potencial 1.
Las partículas de ADN/polímeros usadas para calcular el tamaño de
las partículas y las medidas de potencial \xi se formaron como se
describió anteriormente para las pruebas de electroforesis en el
gel de agarosa y se diluyeron en tampón de HEPES 20 mM (pH = 7,0)
para el análisis como se describió en la sección experimental.
El polímero 1 formó complejos con diámetros en
el intervalo de 90-150 nm a relaciones ADN/polímero
por encima de 1:2 (p/p), y el polímero 2 condensó el ADN en
partículas de tamaño de 60-125 nm a relaciones
ADN/polímero por encima de 1:10. Estos resultados son consistentes
con los datos obtenidos en los experimentos de electroforesis
anteriores en el gel de agarosa. Sin embargo, las partículas en
estos experimentos se agregaron durante un periodo de horas para
producir grandes complejos de diámetros en el intervalo de
1-2 micras. La tendencia de estas partículas para
agregarse puede racionalizarse por los potenciales \xi bajos de
las partículas ADN/polímero observados en estas condiciones. Por
ejemplo, los complejos formados con el polímero 1 en relaciones
ADN/polímero por encima de 1:10 tuvieron potenciales \xi; medios
de 4,51 (\pm0,50) mV. Los potenciales \xi de los complejos
formados con el polímero 2 en relaciones ADN/polímero por encima de
1:20 fueron más bajos, alcanzando un valor límite de 1,04
(\pm0,57) mV. Estas diferencias se correlacionan con los valores
pK_{a} estimados para estos polímeros, ya que se esperaría que las
superficies de las partículas formadas con el polímero 1 estuvieran
ligeramente más protonadas que las partículas formadas con el
polímero 2 a pH = 7,0.
El polímero 3 formó complejos con diámetros en
el intervalo de 50-150 nm en relaciones
ADN/polímero por encima de 1:2. La figura 4 muestra, como ejemplo
representativo, el diámetro eficaz medio de las partículas formadas
con el polímero 3 en función de la concentración del polímero. Los
diámetros de las partículas variaron dentro del intervalo anterior
de experimento a experimento en condiciones por lo demás idénticas,
posiblemente debido a diferencias sutiles durante la agitación o
adición de las soluciones de ADN durante la formación de los
complejos. (El orden de adición del polímero y las soluciones de
ADN tuvo un impacto considerable en la naturaleza de los complejos
ADN/polímeros. Para formar partículas pequeñas, por ejemplo, fue
necesario añadir la solución de ADN a una solución de polímero
agitado con vórtex. En los casos en que se añadieron las soluciones
de polímeros al ADN, solo se observaron agregados grandes de tamaño
micra. Así, es posible que diferencias sutiles en la agitación o
ritmo de adición pudieran ser responsables de la variación en el
tamaño de la partícula). Los potenciales \xi de los complejos
formados con el polímero 3 fueron del orden de +10 a +15 mV en
relaciones ADN/polímero por encima de 1:1, y los complejos no se
agregaron mucho durante un periodo de 18 horas (pH = 7, 25ºC). Los
potenciales \xi positivos de estos complejos pueden ser
significativos más allá del contexto de estabilidad de la
partícula, ya que cargas positivas netas en las superficies de las
partículas podrían jugar un papel en precipitar la endocitosis
(Kabanov et al. Bioconjugate Chem. 6:7-20,
1995; Lim et al., J. Am. Chem. Soc.
122:6524-6525, 2000; Behr Chimia
51:34-36, 1997; Demeneix et al., en
Artificial Self-Assembling Systems for Gene
Delivery (Felgner et al., editores), American Chemical
Society, Washington, D.C., 1996, páginas 146-151;
Kabanov et al., en Self-Assembling
Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial,
John Wiley and Sons, Nueva York, 1998).
Las partículas formadas con el polímero 3 fueron
también relativamente estables a 37ºC. Por ejemplo, se incubó una
muestra de ADN/3 (ADN/3 = 1:5, diámetro medio = 83 nm) a 37ºC
durante 4 horas. Después de 4 horas, se observó una distribución
bimodal que consistía en una fracción de 78 nm de media (>98% en
número, 70% en volumen) y una fracción de agregados mayores con
diámetros medios de aproximadamente 2,6 micras. Estos resultados
sugieren que la degradación de complejos formados por el polímero 3
ocurrió más lentamente que la degradación del polímero en solución,
o que la degradación parcial no afectó significativamente la
estabilidad de las partículas. La aparentemente mayor estabilidad
de los complejos ADN/polímero formados por policaciones degradables
en relación a la degradación de los polímeros en solución se ha
observado también en complejos ADN/polímero formados con poliéster
de
4-hidroxi-L-prolina)
(Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639,
1999).
Los datos de tamaño de partícula y potencial
\xi de las figuras 4 y 5 son consistentes con los modelos de
condensación de ADN observados con otras policaciones (Kabanov
et al. Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995;
Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662,
1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc.
121:5633-5639, 1999; Lim et al., J. Am. Chem.
Soc. 122:6524-6525, 2000; Gonzalez et al.,
Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999). A
concentraciones de polímero muy bajas el ADN se compacta como
partículas pequeñas negativamente cargadas y los tamaños de
partícula aumentan con concentraciones de polímero mayores. (Datos
de dispersión de luz exactos no pudieron obtenerse para el ADN solo
o para las especies asociadas con ADN/polímero a relaciones de
ADN/polímero menores de 1:0,5, puesto que el ADN flexible, no
condensado no dispersa la luz tan extensivamente como el ADN
compactado (Kabanov et al., en
Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From
Laboratory to Clínical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York,
1998). Los complejos alcanzan un diámetro máximo a medida que se
consigue la neutralización de la carga y ocurre la agregación. El
tamaño de partícula disminuye rápidamente a relaciones ADN/polímero
por encima de la neutralización de las cargas hasta las relaciones
en las que más polímero no contribuye a una reducción en el
diámetro de la partícula. Este modelo se confirma con medidas de
potencial \xi realizadas en complejos formados con estos
polímeros. Como se muestra en la figura 5, los potenciales \xi de
las partículas polímero/ADN formadas con el polímero 3 fueron
negativos a concentraciones bajas del polímero y se consiguió la
neutralización de la carga cerca de relaciones de ADN/polímero de
1:0,75, lo que resultó en una agregación grande. Los potenciales
\xi de las partículas alcanzaron un valor límite en el intervalo
de +10 a +15 mV a relaciones ADN/polímero por encima
de 1:2.
de 1:2.
Los diámetros medios de los complejos descritos
anteriormente están dentro de los requerimientos de tamaño
generales para la endocitosis celular. Hemos iniciado experimentos
de transfección empleando la línea celular NIH 3T3 y el gen
reportero de la luciferasa (pCMV-Luc). Hasta ahora,
los polímeros 1 y 2 no han mostrado actividad de transfección en
pruebas de cribado iniciales. Por contraste, el polímero 3 ha
demostrado eficiencias de transfección mayores que las de PEI en
ciertas condiciones. Se realizaron los experimentos de transfección
según el protocolo general siguiente: se cultivaron las células en
placas de 6 pocillos con una densidad inicial de semilla de 100.000
células/pocillo en 2 ml de medio de crecimiento. Se cultivaron las
células durante 24 horas después de lo cual se eliminó el medio de
cultivo y se reemplazó con 2 ml de medio libre de suero. Se
formaron complejos ADN/polímero como se describió en la sección
experimental (2 \mug de ADN, ADN/3 = 1:2 (p/p), 100 \mul en MES
(pH = 6,0) y se añadieron a cada pocillo. Los complejos ADN/PEI se
formaron en una relación de peso de 1:0,75, una relación que
generalmente se ha encontrado en nuestro laboratorio que es óptima
para las transfecciones de PEI. Se realizaron las transfecciones en
medio libre de suero durante 4 horas, después de lo cual el medio se
reemplazó con medio de cultivo durante 20 horas adicionales. Se
determinaron las eficiencias relativas de transfección usando kits
de luciferasa (Promega) y kits de ensayo de proteínas celulares
(Pierce). Los resultados se expresan como unidades luminosas
relativas (RLU) por mg de proteína celular total; para los
complejos de polímero 3, 1,07 (\pm0,43) x 10^{6} RLU/mg; para
los complejos de PEI, 8,07 (\pm0,16) x 10^{5} RLU/mg). No se
detectó la expresión de luciferasa en los experimentos de control
empleando ADN desnudo o realizados en la ausencia de ADN. Estos
datos de transfección son los resultados de experimentos de cribado
iniciales. Estos datos sugieren que IDs polímeros de esta estructura
general son prometedores como vectores sintéticos para la
dispensación de genes y son candidatos interesantes de estudios
adicionales. La eficacia relativa del polímero 3 en relación con
PEI es interesante, ya que nuestros experimentos de cribado
iniciales se realizaron sin la cloroquina y el polímero 3 no
incorpora actualmente ninguna forma obvia de facilitar la fuga
endosomal. Debería apreciarse, sin embargo, que los valores de
pK_{a} de las aminas en estos polímeros pueden ser "afinados"
para que estén mas directamente dentro del intervalo de pH
fisológicamente relevante usando esta aproximación sintética
modular. Por lo tanto, será posible estructurar adicionalmente el
carácter de "esponja protónica" de estos polímeros, (Behr
Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix et
al., en Artificial Self-Assembling Systems
for Gene Delivery (Felgner et al., editores), American
Chemical Society, Washington, D.C., 1996, páginas
146-151; Kabanov et al., en
Self-Assembling Complexes for Gene Delivery:
From Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva
York, 1998) y así aumentar su eficacia de transfección,
directamente por medio de la incorporación o copolimerización con
monómeros de diaminas diferentes.
Se describe una estrategia general para la
preparación de nuevos vectores de transfección de ADN poliméricos
degradables. Se sintetizaron poli(ésteres de
\beta-amino) 1-3 via la
adición de conjugados de N,N'-dimetiletilendiamina,
piperazina, y 4,4'-trimetilendipiperidina a
diacrilato de 1,4-butanodiol. Las aminas en los
monómeros de bis(amina secundaria) participan activamente en
los procesos de formación de enlaces durante la polimerización,
eliminando la necesidad de procesos de protección/desprotección de
aminas que caracterizan la síntesis de otros poli(ésteres de
amino). De esta forma, esta aproximación permite la generación de
una variedad de poliésteres estructuralmente diversos que contienen
aminas terciarias en sus esqueletos en una sola etapa a partir de
materiales de partida comercializados. Los polímeros
1-3 se degradaron de forma hidrolítica en medios
ácidos y alcalinos para dar 1,4- butanodiol y aminoácidos \beta
4a-6a y se investigó la cinética de las
degradaciones a pH 5,1 y 7,4. Los polímeros se degradaron más
rápidamente a pH 7,4 que a pH 5,1, lo que es consistente con los
perfiles de pH/degradación descritos para otros poli(ésteres de
amino). Una prueba inicial de cribado diseñada para determinar los
efectos de los polímeros 1-3 en el crecimiento
celular y metabolismo sugirió que estos polímeros y sus productos
de degradación hidrolítica no eran citotóxicos comparados con PEI,
un polímero catiónico no degradable empleado convencionalmente como
vector de transfección.
Los polímeros 1-3
interaccionaron electrostáticamente con ADN plasmídico a pH
fisiológico, iniciando procesos de autoensamblaje que produjeron
complejos ADN/polímero en la escala de nanómetros. Se usaron las
mediciones de electroforesis en gel de agarosa, dispersión de rayo
láser casi elástico (QELS) y potencial zeta para determinar la
extensión de las interacciones entre los polielectrolitos cargados
de forma opuesta. Se encontró que los tres polímeros condensaban el
ADN a partículas ADN/polímero solubles del orden de
50-200 nm. Las partículas formadas por los polímeros
1 y 2 se agregaron mucho, mientras que las partículas formada por
el polímero 3 mostraron potenciales \xi positivos (esto es, +10 a
+15 mV) y no se agregaron durante un máximo de 18 horas. Las
dimensiones tamaño nanómetros y toxicidades reducidas de estos
complejos de ADN/polímero sugieren que los polímeros
1-3 puedan ser útiles como vectores de transfección
de genes poliméricos degradables. Un conocimiento completo de las
relaciones estructura/actividad existentes en esta clase de
polímeros facilitaría el diseño de alternativas basadas en
polímeros más seguros que los vectores virales de transfección de
la terapia génica.
Fabricación de microesferas. El procedimiento
optimizado para la fabricación de microesteras se realizó de la
forma generalizada siguiente: se suspendió una solución acuosa de
dextrano conjugado con rodamina (200 \mul de una solución de 10
\mug/\mul, M_{n} \approx 70 kD) en una solución de
poli-1 en CH_{2}Cl_{2} (200 mg de
poli-1 en 4 ml de CH_{2}Cl_{2}, M_{n}
\approx 10 kD), y se sonicó la mezcla durante 10 segundos para
formar una emulsión primaria. Se añadió la emulsión rosa opaca
directamente a una solución de poli(alcohol vinílico)
homogeneizada rápidamente (5.000 rpm) [50 ml, PVA al 1% (p/p)] para
formar la emulsión secundaria. Se homogenizó la emulsión secundaria
durante 30 segundos antes de añadirla a una segunda solución de PVA
[100 ml, PVA al 0,5% (p/p)]. El análisis directo de la suspensión
de microesferas usando un analizador de micropartículas de Coulter
reveló un tamaño medio de partícula de aproximadamente 5
micrómetros. La emulsión secundaria se agitó durante 2,5 horas a
temperatura ambiente, se transfirió a una nevera (4ºC), y se agitó
durante 30 minutos adicionales. Se aislaron las microesferas a 4ºC
por centrifugación, se resuspendieron en agua fría, y se
centrifugaron de nuevo para eliminar el exceso de PVA. Se
resuspendieron las esferas en agua (15 ml) y se liofilizaron para
dar un polvo rosa ligero. La caracterización de las microesferas
liofilizadas se realizó por microscopía óptica, de fluorescencia y
de escaneo por electrones como se describió anteriormente. El
potencial zeta se determinó usando un analizador Zeta PALS de
Brookhaven Instruments.
Las micropartículas formadas con polímeros
biodegradables son atractivas para uso como aparatos de
dispensación, y se han empleado una variedad de microesferas
basadas en polímeros para la liberación sostenida de compuestos
terapéuticos (Anderson Nature 392 (Suppl.):
25-30, 1996; Friedman Nature Med.
2:144-147, 1996; Cristal Science
270:404-410, 1995; Mulligan Science
260:9'26-932, 1993; Luo et al. Nat.
Biotechnol. 18:33-37,2000; Behr Acc. Chem.
Res. 26:274-278, 1993). Sin embargo, para la
terapia con moléculas pequeñas, terapia basada en proteínas y
terapia basada en ADN que requieren la administración intracelular
y el tráfico al citoplasma, hay una demanda en aumento de nuevos
materiales que faciliten la liberación inducida como respuesta a
estímulos medioambientales tales como el pH (Zauner et al. Adv.
Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998). Después de la
endocitosis, el pH en los compartimentos endosómicos celulares
baja, y el material extraño se degrada por fusión con las vesículas
lisosomales (Kabanov et al. Bioconjugate Chem.
6:7-20, 1995). Los nuevos materiales que liberan
sus cargas moleculares con cambios de pH dentro del intervalo
intracelular y facilitan la fuga de medios hostiles intracelulares
podrían tener un impacto fundamental y de amplio alcance en la
administración de fármacos lábiles hidrolíticamente y/o
enzimáticamente (Zauner et al. Adv. Drug Del. Rev.
30:97-113, 1998; (Kabanov et al. Bioconjugate
Chem. 6:7-20, 1995). Se describe aquí la
fabricación de microesferas poliméricas sensibles al pH que liberan
contenidos encapsulados cuantitativamente y esencialmente
instantáneamente con los cambios de pH dentro del intervalo
intracelular.
La síntesis del poli(éster de
\beta-amino) 1 se ha descrito anteriormente en el
ejemplo 1 (Miller Angew. Chem. Int. Ed.
37:1768-1785, 1998; Hope et al. Molecular
Membrane Technology 15:1-14, 1998; Deshmukh
et al. New J. Chem. 21:113-124, 1997). El
poli-1 es degradable hidrolíticamente, no fue
citotóxico en las pruebas de criba iniciales, y se está
investigando actualmente como un vector sintético para la
dispensación de ADN en las aplicaciones de terapia génica. La
solubilidad del polímero en medio acuoso está directamente influida
por el pH de la solución. Específicamente, el polímero sólido, no
protonado es insoluble en un medio acuoso en el intervalo de pH de
7,0 a 7,4, y la transición entre la solubilidad e insolubilidad
ocurre a un pH alrededor de 6,5. Basado en las diferencias entre el
pH extracelular y endosómico (7,4 y 5,0-6,5,
respectivamente), establecimos la hipótesis que las microesferas
formadas con el poli-1 podrían ser útiles en la
encapsulación y liberación inducida de compuestos en el intervalo
de pH
intracelular.
intracelular.
La encapsulación de compuestos terapéuticos en
las microesferas poliméricas se consigue a menudo empleando un
proceso de emulsión doble (O'Donnell et al. Adv. Drug Delivery
Rev. 28:25-42, 1997). El proceso de emulsión
doble está bien establecido en la fabricación de microesferas de
polímeros hidrófobos tales como poli(ácido
láctico-co-glicólico) (PLGA), un
polímero biodegradable empleado convencionalmente en el desarrollo
de aparatos de dispensación de fármacos (Anderson et al. Adv.
Drug Delivery Rev. 28:5-24, 1997; Okada Adv.
Drug Delivery Rev. 28:43-70, 1997). Los
experimentos preliminares demostraron la viabilidad del proceso de
emulsión doble en la encapsulación de compuestos solubles en agua
usando el poli-1. Se escogió el dextrano conjugado
con rodamina como modelo para la encapsulación subsiguiente y
estudios de liberación por varias razones: 1) la rodamina es
fluorescente, lo que permite determinar los perfiles de carga y
liberación por espectroscopia de fluorescencia, 2) las microesferas
cargadas pueden ser captadas directamente con espectroscopia de
fluorescencia, y 3) la intensidad de fluorescencia de la rodamina no
es relativamente afectada por el pH dentro del intervalo
fisiológico (Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and
Research Chemicals, 6ª edición, Molecular Probes, Inc., 1996,
p.29).
Se fabricaron microesferas que encapsulaban
dextrano marcado con poli-1 y se compararon con
controles formados con PLGA. Hubo una buena correlación entre la
distribución de tamaño de las microesferas formadas con
poli-1 y las distribuciones de las microesferas de
PLGA dentro del intervalo de 5-30 \mum. Los
tamaños medios de las partículas podrían controlarse con
variaciones en los parámetros experimentales tales como la
velocidad de homogeneización y las proporciones de disolventes
acuosos/orgánicos (O'Donnell et al. Adv. Drug Delivery Rev.
28:25-42, 1997). En contraste con las microesferas
de PLGA, sin embargo, las esferas formadas de poli-1
se agregaron mucho durante las etapas de centrifugación y lavado
(véase la sección experimental anterior). Las microesferas
resuspendidas a pH 7,4 consistían primariamente de agregados
grandes, y las imágenes de microscopia de escaneo por electrones
(SEM) revelaron grupos de esferas que parecían estar unidas
físicamente o "soldadas" (no se muestran los
datos).
datos).
Se encontró que podía eliminarse la agregación
si la centrifugación y el lavado se conducían a temperaturas bajas
(4ºC), presumiblemente debido al endurecimiento de las esferas
poliméricas a esta temperatura más baja. Las imágenes de SEM de
microesferas de poli-1 cargadas de dextrano
preparadas en el intervalo de 8-10 \mum mostraron
una fracturación significativa y la formación de grandes agujeros en
sus superficies. Las microesferas de tamaño dirigido al intervalo
de 4-6 \mum, sin embargo, estaban esencialmente
libres de rajas, agujeros y otros defectos (figura 6). Las
microesferas formuladas para experimentos de liberación
subsiguientes se fabricaron en el intervalo más pequeño (< 6
\mum). Las eficiencias de encapsulación de microesferas de
poli-1 cargadas, determinadas disolviendo las
esferas a pH 5,1 y midiendo la intensidad de la fluorescencia,
fueron tan altas como 53%.
Las suspensiones de microesferas de
poli-1 secas a pH = 7,4 consistían primariamente de
microesferas únicas, aisladas como se determinó por microscopia
óptica y de fluorescencia (figura 8a). El potencial zeta (\xi) de
las suspensiones de micropartículas de microesferas de
poli-1 a pH 7 fue +3,75 (\pm 0,62) mV, sugiriendo
que las superficies de las microesferas llevan una carga total
positiva a pH fisiológico. Esto podría ser relevante cuando se
intente usar estas microesferas para la incorporación celular, ya
que las cargas positivas netas en las superficies de las partículas
pueden tener un papel en la inducción de la endocitosis (Zauner
et al. Adv. Drug Delivery Rev. 30:97-113,
1998).
Las microesferas de poli-1
suspendidas a pH 7,4 permanecieron estables en cuanto a la
agregación y degradación durante varias semanas (inspección visual),
pero las microesferas se disolvieron instantáneamente cuando se
disminuyó el pH del medio de suspensión entre 5,1 y 6,5.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó cuantitativamente la liberación del
dextrano marcado de las microesferas de poli-1 por
microscopia de fluorescencia (figura 7). El perfil de liberación a
pH 7,4 se caracterizó por una pequeña ráfaga inicial de
fluorescencia (7-8%) que alcanzó un valor límite de
alrededor de 15% después de 48 horas. Este experimento demostró que
la degradación de poli-1 fue relativamente lenta en
estas condiciones y que más del 90% del material encapsulado podía
ser retenido en la matriz polimérica durante períodos de tiempo
adecuadamente largos a pH fisiológico.
Para examinar la aplicación de las microesferas
de poli-1 a la liberación inducida de fármacos
encapsulados en el intervalo de pH endosornal, se realizó un
experimento similar en el que el pH del medio de suspensión se
cambió de 7,4 a 5,1 durante el curso del experimento. Como se
muestra en la figura 7, las microesferas se disolvieron rápidamente
cuando se cambió el tampón de suspensión con tampón de acetato (0,1
M, pH = 5,1), produciendo la liberación esencialmente
instantánea y cuantitativa del dextrano marcado que
quedaba en las matrices poliméricas. En marcado contraste, la
liberación de las microesferas de PLGA cargadas de dextrano no
aumentó durante las 24 horas posteriores después de que se
disminuyera el pH del medio de suspensión (figura 7). La figura 8
muestra las imágenes de espectroscopia de fluorescencia de (a) una
muestra de microesferas cargadas de dextrano a pH 7,4; y (b) una
muestra a la que se añadió una gota del tampón de acetato en el
borde superior derecho del cubreobjetos de microscopio. Se
visualizó la rápida liberación del dextrano conjugado con rodamina
como una raya que se extendía desde las microesferas disolviéndose
en la dirección de la difusión del ácido añadido y un aumento en la
fluorescencia total base (tiempo pasado 5 segundos).
Cuando se dirigen los compuestos terapéuticos
para dispensación intracelular vía la endocitosis o fagocitosis, no
es sólo importante considerar los medios por los que el fármaco
puede ser liberado de su transportador, sino también los medios por
los que el fármaco puede escapar de los compartimentos endosomales
antes de ser enviado a las vesículas lisosomales (Luo et al.
Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Zauner et
al. Adv. Drug Delivery Rev. 30:97-113,
1998).
1998).
Una estrategia para facilitar el escape
endosomal es la incorporación de bases débiles, o "esponjas
protónicas", que se cree tamponan el medio ácido en el endosoma
y alteran las membranas endosomales aumentando la presión osmótica
interna dentro de la vesícula (Demeneix et al., en
Artificial Self-Asserrbling Systems for Gene
Delivery (Felgner et al., editores), American Chemical
Society, Washington, D.C., 1996, páginas 146-151).
Las microesferas de poli-1 son capaces de liberar el
material encapsulado en el intervalo de pH endosomal vía un
mecanismo (disolución) que envuelve la protonación de las aminas en
la matriz polimérica. Así, además de la rápida liberación del
fármaco, las microesferas de poli-1 pueden también
proporcionar medios de escape endosomal por alteración de las
membranas, aumentando la eficacia por medio de la prolongación de
las vidas de los fármacos hidrolíticamente inestables contenidos en
la matriz polimérica.
Las microesferas fabricadas con
poli-1 podrían representar una importante adición
al arsenal de materiales sensibles al pH aplicados a la dispensación
intracelular de fármacos, tales como formulaciones de
polímeros/liposomas sensibles al pH (Gerasimov et al. Adv. Drug
Delivery Rev. 38:317-338, 1999; Linhait et
al. Langmuir 16:122-127, 2000; Linhardt et
al. Macromolecules 32:4457-4459, 1999). Al
contrario de lo que sucede con muchas formulaciones de liposomas,
las microesferas poliméricas son físicamente estables y pueden ser
almacenadas secas durante largos periodos de tiempo sin
deformación, descomposición o degradación (Okada Adv. Drug
Delivery Rev. 28:43-70, 1997; incorporado aquí
como referencia), una consideración importante en la formulación y
empaquetado de nuevos sistemas de administración terapéuticos. Las
microesferas investigadas en este estudio actual están dentro del
intervalo de tamaño de partículas que se usan corrientemente para
dirigir la dispensación a los macrófagos (Hanes et al. Adv. Drug
Delivery Rev. 28:97-119, 1997). Los perfiles de
liberación rápida por el pH de las microesferas de
poli-1 descritos anteriormente pueden por lo tanto
ser útiles en el diseño de nuevas vacunas basadas en ADN que
actualmente emplean PLGA como material encapsulador (Singh et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:811-816,
2000; Ando et al. J. Pharm. Sci. 88:126-130,
1999; Hedley et al. Nat. Med. 4:365-368,
1998).
\vskip1.000000\baselineskip
La dispensación segura y eficiente de ADN
terapéutico a las células representa un obstáculo fundamental para
el éxito clínico de la terapia génica (Luo et al. Nat.
Biotechnol. 18:33-37, 2000; Anderson
Nature 392 Suppl.:25-30, 1996; cada uno de
los cuales se incorpora aquí como referencia). Los retos con que se
enfrentan los vectores sintéticos de dispensación están
particularmente claros, puesto que tanto los polímeros catiónicos
como los liposomas son menos eficaces para mediar la transferencia
de genes que los vectores virales. La incorporación de nuevos
criterios de diseño ha conducido a avances recientes hacia sistemas
de dispensación funcionales (Lim et al. J. Am. Chem. Soc.
123:2460-2461, 2001; Lim et al. J. Am. Chem.
Soc. 122:6524-6525, 2000; Hwang et al.
Bioconjugate Chem. 12:280-290, 2001; Putnam
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
98:1200-1205, 2001; Benns et al. Bioconjugate
Chem. 11:637-645, 2000; Midoux et al.
Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999). Sin
embargo, el paradigma para el desarrollo de vectores poliméricos de
dispensación de genes sigue siendo la incorporación de estos
elementos de diseño en materiales como parte de un proceso
iterativo lineal, una aproximación eficaz, si bien lenta, para el
descubrimiento de nuevos vectores. Aquí describimos una
aproximación paralela adecuada para la síntesis de grandes
bibliotecas de polímeros catiónicos degradables y de oligómeros
catiónicos degradables y el descubrimiento de nuevas familias de
vectores sintéticos por medio de ensayos de cribado rápidos basados
en células (como publicación para la síntesis paralela y cribado de
polímeros degradables para la ingeniería de tejidos, véase:
Brocchini et al. J. Am. Chem. Soc.
119:4553-4554,
1997).
1997).
\vskip1.000000\baselineskip
Consideraciones generales. Todas las
manipulaciones que envolvían células vivas o materiales estériles
se realizaron en una vitrina de flujo laminar usando técnicas
estériles estándares. La cromatografía de permeabilidad de gel (GPC)
se realizó usando una bomba de Hewlett Packard serie 1100
isocrática, un inyector de Rheodyne modelo 7125 con un bucle
inyector de 100 \mul, y dos columnas PL-Gel
mezcladas-D en serie (5 \mum, 300 x 7,5 mm,
Polymer Laboratorios, Amherst, MA). Se usó THF/piperidina 0,1 M
como eluyente a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Los datos se
recogieron usando un refractómetro interferométrico Optila b DSP
(Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) y se procesaron con el
paquete de software TriSEC GPC (Viscotek Corporation, Houston, TX).
Los pesos moleculares y polidispersidades de los polímeros se
describen en relación a estándares monodispersos de
poliestireno.
Materiales. Se obtuvieron comercialmente
los monómeros de aminas primarias y secundarias
1-20 de Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI),
Lancaster (Lancashire, UK), Alfa Aesar Organics (Ward Hill, MA), y
Fluka (Milwaukee, WI). Los monómeros de diacrilato
A-G se obtuvieron comercialmente de Polysciences,
Inc. (Warrington, PA), Alfa Aesar y Scientific Polymer Products,
Inc. (Ontario, NY). Todos los monómeros se obtuvieron con la mayor
pureza posible (de 97% a más de 99%) y se usaron como se recibieron
sin purificación adicional. El ADN plasmídico que contenía el gen
reportero de luciferasa de la luciérnaga (pCMV-Luc)
se obtuvo comercialmente de Elim. Biopharmaceuticals, Inc. (San
Francisco, CA) y se usó sin purificación adicional. El bromuro de
(3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolo
(MTT) se obtuvo comercialmente de Sigma Chemical Company (St.
Louis, MO). Los fibroblastos de riñón de mono (células
COS-7) usados en los ensayos de transfección se
obtuvieron comercialmente de American Type Culture Collection
(Manassas, VA) y se cultivaron a 37ºC, en 5% de CO_{2} en 90% de
medio de Eagle modificado por Dulbecco; 10% de suero bovino fetal;
100 unidades/ml de penicilina; 100 \mug/ml de estreptomicina. Los
kits para la detección de la luciferasa usados en las pruebas de
transfección de alto rendimiento se obtuvieron comercialmente de
Tropix (Bedford, MA). Todos los demás materiales y disolventes se
usaron como se recibieron sin purificación adicional.
Síntesis de la biblioteca de polímeros.
Se condujeron todas las 140 reacciones de polimerización
simultáneamente con un conjunto de viales etiquetados
individualmente según el protocolo general siguiente. Las
excepciones individuales se describen cuando es apropiado. Los
monómeros de amina 1-20 (2,52 mmoles) se cargaron
en los viales adecuadamente etiquetados (como se muestra a
continuación): se midieron los monómeros líquidos y se
transfirieron cuantitativamente usando pipetas de microlitro; los
monómeros sólidos se pesaron directamente en cada vial. Se añadió
CH_{2}Cl_{2} anhidro (1 ml) a cada vial. Se añadió un
equivalente de diacrilatos líquidos A-F (2,52
mmoles) a cada vial de reacción adecuado usando una pipeta de
microlitro, y se tapó el vial fuertemente con una tapa recubierta
de Teflón. Se añadió un equivalente de diacrilato G semisólido a
los viales adecuados como una solución en CH_{2}Cl_{2} (2,52
mmoles, 1 ml de una solución 2,52 M en CH_{2}Cl_{2}) y se
taparon fuertemente los viales. Se añadió una alícuota adicional (2
ml) de CH_{2}Cl_{2} a los viales de reacción que contenían 19 y
20 para facilitar la solubilidad de estos monómeros. Los viales
fuertemente tapados se colocaron en dos gradillas de tubos de
ensayo de plástico y se ataron a un agitador orbital en un horno a
45ºC. (PRECAUCIÓN: el calentamiento de viales cerrados presenta un
peligro posible de explosión. Se monitorizó periódicamente la
temperatura del horno durante una semana antes del experimento para
asegurar la estabilidad termal segura. Se encontró que las
temperaturas variaban +/- 1ºC durante este periodo de tiempo. Se
monitorizaron varios viales de prueba antes de conducir el
experimento importante). Los viales de reacción se agitaron
vigorosamente a 45ºC durante 5 días y se dejaron enfriar a
temperatura ambiente. Se colocaron los viales en un secador grande
y se colocaron bajo un aspirador a vacío durante 1 día y a alto
vacío durante 5 días adicionales para asegurar la eliminación
completa del disolvente. Se analizaron las muestras obtenidas por
GPC (55% de la biblioteca total, véase la tabla 2) y se usaron
directamente en todos los experimentos de cribado
subsiguientes.
subsiguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Determinación de la solubilidad en agua.
Se determinó las solubilidades de todas las muestras
simultáneamente a una concentración de 2 mg/ml de la forma general
siguiente. Cada muestra de polímero (5 mg) se pesó en un vial de
centelleo de 12 ml y se añadió 2,5 ml de tampón de acetato (25 mM,
pH = 5,0) a cada muestra usando un aparato de pipetear. Se agitaron
las muestras vigorosamente a temperatura ambiente durante 1 hora.
Para determinar la solubilidad se observó visualmente cada
muestra.
Ensayo de la electroforesis en gel de
agarosa. El ensayo de la electroforesis en gel de agarosa usada
para determinar la habilidad de los polímeros para formar complejos
con el ADN se realizó de la forma siguiente. Usando las soluciones
preparadas en la prueba de solubilidad anterior (2 mg/ml en tampón
de acetato, 25 mM, pH = 5,0), soluciones madres de los 70 polímeros
solubles en agua se colocaron en una placa de cultivo de 96
pocillos. Se formaron los complejos AUN/polímero en una relación de
1:5 (p/p) transfiriendo 10 \mul de cada solución de polímero de la
placa madre a una nueva placa usando un aparato de pipetear
multicanal. Se diluyó cada polímero adicionalmente con 90 \mul de
tampón de acetato (25 mM, pH = 5,0, volumen total 100 \mul) y se
agitó la placa durante 30 segundos en un agitador mecánico. Se
añadió a cada pocillo de la placa una solución acuosa de ADN
plasmídico (100 \mul de una solución de 0,04 \mug/\mul) y se
mezclaron vigorosamente las soluciones usando un aparato de
pipetear multicanal y un agitador mecánico. Se formaron los
complejos ADN/polímero en una relación de 1:20 (p/p) de la misma
manera con las siguientes excepciones: se transfirieron 40 \mul
de solución madre de polímero a una nueva placa y se diluyó con 60
\mul de tampón de acetato (volumen total 100 \mul) antes de
añadir la solución acuosa de ADN (100 \mul). Se incubaron los
complejos ADN/polímero a temperatura ambiente durante 30 minutos,
después de lo cual se cargaron muestras de cada solución (15 \mul)
en un gel de agarosa al 1% (HEPES, 20 mM, pH = 7,2, 500 ng/ml de
bromuro de etidio) usando un aparato de pipetear multicanal. NOTA:
se cargaron las muestras en el gel con un tampón de cargar que
consistía en Ficoll 400 al 10% (Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Suecia) en HEPES (25 mM, pH = 7,2). No se incluyó el azul
de bromofenol como indicador visual en el tampón de carga, puesto
que este tinte parecía interferir con la formación del complejo de
polímero y ADN. Se cargaron las muestras según el patrón mostrado
en la figura 9, de manera que las muestras que correspondían a una
relación ADN/polímero de 1:5 y 1:20 se ensayaron en posiciones
adyacentes del gel. Se mantuvo el gel a 90 V durante 30 minutos y
se visualizaron las bandas de ADN manchando con bromuro de
etidio.
Protocolo general para los ensayos de
transfección de células. Se realizaron los ensayos de
transfección en triplicado de la forma general siguiente. Se
cultivaron células COS-7 en placas de 96 pocillos
con una densidad inicial de semilla de 15.000 células/pocillo en
200 \mul de medio de crecimiento sin rojo de fenol (90% de medio
de Eagle modificado por Dulbecco; 10% de suero bovino fetal; 100
unidades/ml de penicilina; 100 \mug/ml de estreptomicina). Se
cultivaron las células durante 24 horas en un incubador, después de
lo cual se eliminó el medio de cultivo y se reemplazó con 200
\mul de medio de Optimem (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA),
suplementado con HEPES (concentración total = 25 mM). Se prepararon
los complejos polímero/ADN con los 56 polímeros complejantes del
ADN solubles en agua identificados previamente como se describió
anteriormente a una proporción de 1:20 (p/p) usando un plásmido
comercializado que contiene el gen reportero de luciferasa de la
luciérnaga (pCMV-Luc). Se añadió un volumen
apropiado de cada muestra a las células usando un aparato de
pipetear multicanal (esto es, 15 \mul dieron 300 ng de
ADN/pocillo; 30 \mul dieron 600 ng de ADN/pocillo). Se prepararon
controles empleando poli(etilenimina) (PEI) y polilisina,
preparados en relaciones de ADN/polímero de 1:1, de forma similar y
se incluyeron con los controles con ADN y sin ADN. Se realizaron
controles que empleaban Lipofectamina 2000 (Invitrogen Corp.) a
varias concentraciones (0,1, 0,2, 0,4 y 0,6 \mul) como se
describe en el manual técnico de este producto
(http://lifetechnologies.com). Se incubaron las células
durante 4 horas, después de lo cual se eliminó el medio de cultivo
libre de suero y se reemplazó con 100 \mul de medio de cultivo
sin rojo de fenol. Se incubaron las células durante un periodo de
tiempo adicional (típicamente variaba de 36 a 60 horas) y se
determinó a expresión de luciferasa usando un kit de ensayo
comercializado (Tropix, Inc., Bedford, MA). Se cuantificó la
fluorescencia en placas blancas de fondo sólido de polipropileno de
96 pocillos usando un lector de placa de bioluminiscencia de 96
pocillos. Se expresó la luminiscencia en unidades relativas de luz
y no se normalizó a la proteína total de la célula en este
ensayo.
Los poli(ésteres de
\beta-amino) son hidrolíticamente degradables,
condensan el ADN plasmídico a pH fisiológico y son fácilmente
sintetizados vía la adición del conjugado de aminas primarias o
secundarias a los diacrilatos (Ecuación 1 y 2) (Lynn et al. J.
Am. Chem. Soc. 122:10761-10768, 2000). Un
cribado inicial de polímeros modelo identificó estos materiales
como vehículos de genes potenciales y demostró que las variaciones
estructurales podrían tener un impacto significativo en la eficacia
de unión al ADN y en la eficacia de transfección (Lynn et al. J.
Am. Chem. Soc. 122:10761-10768, 2000). Nosotros
razonamos que esta aproximación proporcionaba un entramado
atractivo para la elaboración de bibliotecas grandes de polímeros
estructuralmente únicos por varias razones: 1) los monómeros de
diamina y diacrilato son materiales de partida baratos
comercializados, 2) la polimerización puede llevarse a cabo
directamente en una etapa única de síntesis, y 3) las etapas de
purificación son generalmente innecesarias puesto que no se generan
productos secundarios durante la polimerización.
La escasez de bis(aminas secundarias)
comercializadas limita el grado de diversidad estructural que puede
conseguirse usando la aproximación sintética anterior. Sin embargo,
el conjunto de monómeros disponibles se expande significativamente
cuando se considera a las aminas primarias como bloques de
construcción potenciales de la biblioteca. Ya que la adición
conjugada de aminas a los grupos acrilato es generalmente tolerante
de funcionalidades tales como alcoholes, éteres, y aminas terciarias
(Ferruti et al. Adv. Polym. Sci. 58:55-92,
1984), pensamos que la incorporación de monómeros de aminas
primarias funcionalizadas a nuestra estrategia sintética serviría
para ampliar la diversidad estructural. Los monómeros de diacrilato
A-G y los monómeros de amina 1-20
se seleccionaron para la síntesis de una biblioteca de cribado
inicial
El tamaño de la biblioteca construida con este
conjunto de monómeros (7 diacrilatos x 20 aminas = 140 polímeros
estructuralmente únicos) se escogió por ser lo suficientemente
grande para incorporar diversidad suficiente, sin embargo lo
suficientemente pequeña para ser práctica sin la necesidad de
automatización en nuestros estudios iniciales. No estaba claro al
principio si un polímero tal como G16 (formado por los monómeros
hidrófobos y estéricamente grandes G y 16) sería soluble en agua a
pH fisiológico o sería capaz de suficiente condensación con el ADN.
Sin embargo, se incorporaron deliberadamente monómeros de este tipo
para explorar totalmente el espacio de diversidad, y anticipando
que esta biblioteca podría últimamente ser útil como una población
de cribado en el descubrimiento de materiales para aplicaciones
distintas que la dispensación de genes (para un informe sobre la
síntesis paralela y el cribado de polímeros degradables en la
ingeniería de tejidos, véase: Brocchini et al. J. Am. Chem.
Soc. 119:4553-4554, 1997, Lynn et al. Angew
Chem. Int. Ed. 40:1707-1710, 2001).
Las reacciones de polimerización se condujeron
simultáneamente con un conjunto de viales etiquetados
individualmente. Se realizaron las reacciones en cloruro de metileno
a 45ºC durante 5 días, y se aislaron los polímeros eliminando el
disolvente para dar 600-800 mg de cada material.
Las reacciones se realizaron a esta escala siempre que rindieran
cantidades de material suficientes para análisis rutinario por GPC
y todas los ensayos subsiguientes de unión al ADN, toxicidad, y de
transfección. Un examen del 55% de la biblioteca por GPC indicó
pesos moleculares en el intervalo de 2.000 a 50.000 (en relación a
estándares de poliestireno). Puesto que no se requieren pesos
moleculares elevados para la formación de complejos con ADN y para
la transfección (como se muestra a continuación) (Kabanov et
al., en Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From
Laboratory to Clinical Trial, John Wiley and Sons, Nueva York,
1998), esta biblioteca proporcionó una colección de polímeros y
oligómeros adecuados para las pruebas de cribado subsiguientes.
De los 140 miembros de la biblioteca de cribado,
70 muestras eran lo suficientemente solubles en agua (2 mg/ml,
tampón de acetato 25 mM, pH = 5,0) para ser incluidos en un ensayo
electroforético de unión a ADN (figura 9). Para realizar este ensayo
tan rápida y eficientemente como fuera posible, se mezclaron las
muestras con ADN plasmídico en relaciones de 1:5 y 1:20
(ADN/polímero, p/p) en placas de 96 pocillos y se cargaron en una
lámina de gel de agarosa capaz de ensayar hasta 500 muestras usando
un aparato pipeteador multicanal. Se ensayaron todas las 70 muestras
de polímero solubles en agua simultáneamente a dos relaciones
ADN/polímero diferentes en menos de 30 minutos. Como se muestra en
la figura 9, 56 de las 70 muestras de polímero solubles en agua
interaccionaron lo suficiente con ADN para ralentizar la migración
a través del gel de la matriz (por ejemplo, A4 o A5), empleando la
relación ADN/polímero 1:20 como criterio de exclusión. Catorce
polímeros se eliminaron de consideraciones posteriores (por
ejemplo, A7 y A8), ya que estos polímeros no complejaron el ADN lo
suficientemente.
Los materiales de complejamiento del ADN
identificados en el ensayo anterior se investigaron adicionalmente
en ensayos de transfección usando ADN plasmídico y la línea celular
COS-7. Todos los ensayos se realizaron
simultáneamente con el gen reportero de luciferasa de la luciérnaga
(pCMV-Luc) y se determinaron las concentraciones de
la proteína expresada usando un kit de ensayo comercializado y un
lector de placas de luminiscencia de 96 pocillos. La figura 10
muestra los datos generados en un ensayo empleando
pCMV-Luc (600 ng/pocillo) con relaciones de
ADN/polímero de 1:20 (p/p). La mayor parte de los polímeros
cribados no medió la transfección por encima de un nivel típico de
controles de ADN "desnudo" (sin polímero) en estas condiciones.
Sin embargo, varios pocillos expresaron niveles más altos de
proteínas y los polímeros correspondientes se identificaron como
"cabezas de serie" en este ensayo. Los polímeros B14 (P_{m}
= 3.180) y G5 (P_{m} = 9.170), por ejemplo, dieron niveles de
transfección 4-8 veces más altos que los
experimentos de control empleando poli(etilenimina) (PEI),
un polímero usado convencionalmente como vector sintético de
transfección (Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:7297-7301, 1995), y los niveles de transfección
dentro de o mayores del intervalo de proteína expresada usando
Lipofectamina 2000 (comercializada por Invitrogen Corp. (Carlbad,
CA)), un sistema de vector de transfección comercializado muy usado
basado en lípidos. Los polímeros A14, C5, G7, G10 y G12 fueron
también identificados como "cabezas de serie" positivas en el
experimento anterior, pero los niveles de expresión génica fueron
más bajos que para B14 y G5.
Las diferencias estructurales entre polímeros
sintéticos impiden típicamente un conjunto de condiciones de
transfección óptimas. Por ejemplo, los polímeros C5, C14 y G14
fueron tóxicos a las concentraciones más altas empleadas
anteriormente (toxicidad determinada por la ausencia de células en
los pocillos fue contenían estos polímeros como se observó por
inspección visual. Estos polímeros eran menos tóxicos y mediaron
transfección a concentración más baja), pero mediaron la
transfección a concentraciones de ADN y polímero más bajas (no se
muestran los datos). El sistema de ensayo descrito anteriormente
puede modificarse fácilmente para evaluar los polímeros en función
a la concentración de ADN, relación de ADN/polímero, densidad
celular de semilla, o tiempos de incubación. Se requerirán
investigaciones adicionales para evaluar más completamente el
potencial de esta biblioteca de cribado, y los experimentos para
este fin se están realizando actualmente.
Los ensayos anteriores se realizaron en ausencia
de la cloroquina, una base débil añadida corrientemente para
aumentar la transfección in vitro (Putnam et al. Proc.
Natl. Acad. Sic. USA 98:1200-1205, 2001; Benns
et al. Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000;
Midoux et al. Bioconjugate Chem. 10:406-411,
1999; Kabanov et al., en Self-Assembling
Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinical Trial,
John Wiley and Sons, Nueva York, 1998), y por lo tanto los
resultados reflejan las habilidades intrínsicas de estos materiales
para mediar la transfección. Los polímeros que contienen el
monómero 14 son estructuralmente similares a otros polímeros de
"esponja de protones" que contienen histidina (Putnam et al.
Proc. Natl. Acad. Sic. USA 98:1200-1205, 2001;
Benns et al. Bioconjugate Chem. 11:637-645,
2000; Midoux et al. Bioconjugate Chem.
10:406-411, 1999), y se podría aumentar la
transfección tamponando los compartamentos ácidos intracelulares y
mediando la fuga endosomal (Putnam et al. Proc. Natl. Acad. Sic.
USA 98:1200-1205, 2001; Benns et al.
Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux
et al. Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999;
Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:7297-7301, 1995). La eficacia de los polímeros
que contienen el monómero 5 es sorprendente en este contexto, ya que
estos materiales no incorporan una forma obvia de facilitar la fuga
endosomal. Mientras que aún no se entiende la eficacia de estos
últimos polímeros, su descubrimiento ayuda a validar nuestra
aproximación paralela y remarca el valor de incorporar diversidad
estructural, puesto que estos polímeros podrían no haber sido
descubiertos en bases ad hoc. Los polímeros que incorporan
los diacrilatos hidrófilos D y E no han producido "cabezas de
serie" en ningunas condiciones hasta ahora, proporcionando una
base posible para el desarrollo de bibliotecas más centradas útiles
en la elucidación de las relaciones estructura/
actividad.
actividad.
Hemos generado una biblioteca de 140 polímeros
degradables y oligómeros degradables útil en el descubrimiento de
nuevos materiales que complejan el ADN y de vectores de
dispensación génica. Varios de estos materiales son capaces de
condensar el ADN en estructuras lo bastante pequeñas para ser
internalizadas por las células y liberar el ADN de forma activa
transcripcionalmente. El tiempo total requerido actualmente para el
diseño de la biblioteca, síntesis y pruebas de cribado iniciales es
aproximadamente dos semanas. Sin embargo, la incorporación de la
robótica y de monómeros adicionales podría acelerar
significativamente el paso al que se identifican nuevos materiales
complejantes del ADN y al que se identifican vectores competentes
de transfección.
Una de las mayores barreras para el éxito de la
terapia génica en la medicina clínica es la falta de métodos
seguros y eficientes para la dispensación de ácidos nucleicos.
Actualmente, la mayor parte de los ensayos clínicas usan virus
modificados como vehículos de dispensación, que aunque son eficaces
para transferir el ADN a las células, tienen toxicidad potencial
seria y problemas de producción (Somia et al. Nat Rev Genet.
1:91 (2000)). Por el contrario, los sistemas no víricos frecen un
número de ventajas potenciales, incluyendo la facilidad de
producción, estabilidad, baja inmunogenicidad y toxicidad, y las
limitaciones de tamaño reducido del vector (Ledley Human Gene
Therapy 6:1129 (1995)). A pesar de estas ventajas, sin embargo,
los sistemas de dispensación no víricos son mucho menos eficientes
que los vectores virales (Luo et al. Nature Biotechnology
18:33 (2000)).
Un grupo prometedor de compuestos de
dispensación no víricos son los polímeros catiónicos, que
espontáneamente se unen a y condensan el ADN. Se ha caracterizado
una amplia variedad de polímeros catiónicos que transfeccionan in
vitro, tanto naturales como proteínas (Fominaya et al.
Journal of Biological Chemistry 271:10560 (1996)) y sistemas de
péptidos (Schwartz et al. Curr Opin Mol Ther. 2:162 (2000)),
como polímeros sintéticos tales como poli(etilenimina)
(Boussif et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:7297-7301, 1995)) y dendrímeros (Kabanov et
al., Self-Assembling Complexes for Gene Delivery:
from Laboratory to Clínical Trial, Wiley, Chichester; Nueva
York, 1998). Avances recientes en la dispensación polimérica de
genes se han centrado en parte en hacer los polímeros más
biodegradables para disminuir la toxicidad. Típicamente, estos
polímeros contienen ambos grupos amino susceptibles de carga, lo
que permite las interacciones iónicas con el esqueleto de fosfato
cargado negativamente de los ácidos nucleicos, y una unión
biodegradable tal como una unión éster hidrolizable. Varios
ejemplos de éstos incluyen
poli(alfa-(4-aminobutil)-L-ácido
glicólico) (Lim et al. Journal of the American Chemical
Society 122:6524 (2000)), la red de poli(éster de amino) (Lim
et al. Bioconjugate Chemistry 13:952 (2002)), y
poli(esteres de \beta-amino) (Lynn et
al. Journal of the American Chemical Society 123:8155 (2001)).
Los poli(ésteres de \beta-amino) son
particularmente interesantes ya que muestran poca toxicidad y son
fácilmente sintetizados vía la adición del conjugado de una amina
primaria o bis(amina secundaria) a un diacrilato (figura 11)
(Lynn et al. Journal of the American Chemical Society
122:10761 (2000); Lynn et al. Journal of the American Chemical
Society 123:8155 (2001)).
El desarrollo tradicional de polímeros
biomédicos nuevos ha sido un procedimiento iterativo. Los polímeros
se diseñaban típicamente de uno en uno y después se probaban
individualmente para ver sus propiedades. Más recientemente, se ha
centrado la atención en el desarrollo de aproximaciones paralelas,
combinatorias, que facilitan la generación de bibliotecas
estructuralmente diversas de biomateriales poliméricos (Brocchini
Advanced Drug Delivery Reviews 53:123 (2001)). Esta
aproximación combinatoria se ha aplicado también al descubrimiento
de polímeros de dispensación de genes. Por ejemplo, Murphy et
al. generaron una biblioteca combinatoria dirigida de 67
peptoides vía síntesis en fase sólida y la cribaron para identificar
nuevos agentes de dispensación de genes (Murphy et al.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 95:1517 (1998)).
En este ejemplo se describen nuevas herramientas
para una síntesis paralela, combinatoria de alto rendimiento y un
cribado basada en células de una gran biblioteca de 2.350
poli(ésteres de \beta-amino) estructuralmente
diversos. Esta aproximación permite la criba de polímeros en
ensayos basados en células sin que los polímeros abandonen nunca la
fase de solución después de la síntesis. Esta aproximación combinada
con el uso de sistemas robóticos de manejo de fluidos permite la
generación y prueba de miles de polímeros sintéticos en ensayos
basados en células en una cantidad de tiempo relativamente corta.
Usando esta aproximación, se han identificado 46 polímeros nuevos
que funcionan tan bien o mejor que los sistemas de dispensación no
víricos tales como la poli(etilenimina).
Síntesis de polímeros de alto
rendimiento. Los factores primarios que limitan el rendimiento
y automación de la síntesis de poli(ésteres de
\beta-amino) y su ensayo son la viscosidad de las
soluciones de monómeros y polímeros, y a dificultad de manipulación
de los productos poliméricos sólidos. Mientras que la automación del
manejo de líquidos es sencilla usando robótica convencional, la
manipulación de sólidos y líquidos viscosos a pequeña escala no lo
es. Por lo tanto, se desarrolló un sistema en el que podían
sintetizarse y cribarse los polímeros en ensayos basadas en células
sin que abandonaran la fase de solución. Puesto que esto requeriría
la presencia de disolvente residual en las pruebas celulares, se
escogió el disolvente relativamente no tóxico dimetilsulfóxido
(DMSO). El DMSO es un disolvente usado corrientemente en cultivos
celulares y se usa rutinariamente para el almacenaje de células
congeladas. El DMSO es miscible con el agua y es generalmente bien
tolerado en sistemas vivos.
La primera etapa para preparar la síntesis de
alto rendimiento fue identificar las condiciones que permitieran la
producción de los polímero:3 que todavía poseyeran una viscosidad
manejable. Experimentos piloto a pequeña escala mostraron que la
polimerización podía realizarse eficazmente a 1,6 M en DMSD a 56ºC
durante 5 días. Basada en estos experimentos, se desarrolló una
estrategia general para la síntesis y prueba de los polímeros. Se
diluyeron todos los monómeros (figura 12) a 1,6 M en DMSO, y
después usando ambos, un robot para el manejo de fluidos y una
micropipeta de 12 canales, añadimos 150 microlitros de cada
monómero de amina y diacrilato a un pozo profundo de una placa de
polipropileno que después se selló con papel de aluminio. Se
pusieron las placas en un agitador orbital y se incubaron a 56ºC
durante 5 días. Para compensar la mayor viscosidad de las
soluciones poliméricas, se añadió 1 ml de DMSO a cada pocillo de la
placa, y se almacenaron entonces las placas a 4ºC hasta más uso.
Estos métodos permiten 2.350 reacciones en un día. Además, la
producción y almacenaje de los polímeros en un formato de 96
pocillos per-
mitió una transición fácil a un formato de 96 pocillos para la prueba de eficiencia de transfección basada en
células.
mitió una transición fácil a un formato de 96 pocillos para la prueba de eficiencia de transfección basada en
células.
Ensayo de alto rendimiento de polímeros.
Una vez sintetizados, se probaron todos los polímeros en cuanto a
su habilidad para dispensar el plásmido que expresa la luciferasa,
pCMV-luc en la línea celular COS-7
de fibroblastos renales de mono. Debido al gran tamaño de la
biblioteca de polímeros, se desarrolló un método de alto
rendimiento para el cribado de la eficiencia de la transfección
basado en células. Puesto que los polímeros eran almacenados en
placas de 96 pocillos, todas las diluciones de polímeros,
complejamiento de ADN, y transfecciones celulares se realizaron en
paralelo por transferencia directa de los polímeros de placa a placa
usando un robot de manejo de líquidos. Se sintetizaron todos los
polímeros usando la misma concentración de monómero de amina, así
que la comparación entre polímeros en una relación monómero de
amina:fosfato de ADN fija (relación N:P) fue sencilla. Mientras que
los monómeros de amina contenían uno, dos, o tres aminas por
monómero, los cribados amplios iniciales de las eficiencias de
transfección se simplificaron enormemente manteniendo una
concentración constante de monómero en todos los pocillos de una
placa determinada, y por lo tanto un volumen constante de solución
de polímero por reacción (véase métodos a continuación).
La eficiencia de la transfección in vitro
usando polímeros catiónicos tales como la poli(etilenimina)
es muy sensible a la relación de polímero a ADN presente durante la
formación del complejo (Gebhart et al. Journal of Controlled
Release 73:401 (2001)). Se seleccionaron relaciones de N:P de
10:1, 20:1, y 40:1 para nuestros cribados iniciales basado en
experiencias anteriores con estos tipos de polímeros. Usando nuestro
sistema de alto rendimiento, cribamos los 2.350 polímeros en estas
tres proporciones. Se tabularon los valores de transfección con las
mejores condiciones para cada polímero en un histograma (figura
13). Estos resultados se compararon con tres controles: ADN desnudo
(sin agente de transfección), poli(etilenimina) (PEI), y
Lipofectamina 2000. Las bajas concentraciones residuales de DMSO
presentes en las soluciones de transfección no afectaron la
eficiencia de transfección ni del ADN desnudo ni del PEI. Se
encontró que 33 de los 2.350 polímeros eran tan buenos o mejores que
el PEI en este sistema no
optimizado.
optimizado.
Puesto que las transfecciones de polímeros
catiónicos tienden a ser sensibles a las relaciones polímero:ADN,
decidimos optimizar las condiciones de transfección con los mejores
polímeros de nuestro cribado preliminar. Usando los resultados
anteriores como guía inicial, se optimizaron las condiciones de
transfección para los 93 polímeros mejores probándoles a
proporciones N:P por encima y por debajo de las condiciones de
transfección óptimas identificadas en el cribado de base amplia.
Para desarrollar un sistema de optimización de alto rendimiento,
estos se probaron usando un sistema multiplicador de las
proporciones N:P para simplificar el ensayo simultáneo y las
transferencias placa a placa. Empezando con la mejor proporción N:P
identificada en el cribado preliminar, se probaron de nuevo los
polímeros en seis relaciones N:P iguales a las mejores relaciones
de 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, y 1,75, en triplicado. Por ejemplo,
si la relación óptima identificada en el cribado para un polímero
dado era 20:1, entonces se cribó de nuevo el polímero en triplicado
en relaciones N:P de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, y 35:1. En la
figura 14 se muestran las medias con la desviación estándar de las
eficiencias de transfección de las mejores condiciones para los 50
polímeros mejores, junto con los datos de los controles. En este
experimento, se identificaron 46 polímeros que se transfecctaron
tan bien o mejor que PEI. Todos estos 93 polímeros se probaron
también en cuanto a su habilidad de unión con el ADN usando la
electroforesis en gel de agarosa (figura 15). Interesantemente,
mientras que casi todos los polímeros se unen al ADN como se
esperaba, dos polímeros que transfectan a niveles altos no lo
hacen: M17 y KK89
(figura 14).
(figura 14).
\newpage
Para examinar adicionalmente las propiedades de
transfección de estos polímeros, se probaron diez polímeros de
transfección alta en cuanto a su habilidad para dispensación del
plásmido de la proteína fluorescente verde,
pCMV-eGFP. Al contrario que
pCMV-luc, pCMV-eGFP proporciona
información que concierne el porcentaje de células que se
transfecta. Se observaron altos niveles de transfección para todos
los 10 polímeros, y dos de los mejores se muestran en la figura
16.
Los "cabezas de serie" identificados en el
ensayo anterior revelan una colección de polímeros
sorprendentemente diversa e inesperada. Particularmente sorprendente
es la gran colección de polímeros hidrófobos, basados en el
monómero D. De hecho, los monómeros de diacrilato usados para hacer
los 50 polímeros con mejores resultados son casi siempre
hidrófobos. Análisis adicionales revelan dos características más
comunes a los polímeros eficaces: 1) doce de los 26 polímeros que
son mejores que el reactivo convencional mejor, Lipofectamina 2000,
tienen grupos laterales de mono- y di-alcohol, y 2)
las bis(aminas secundarias) lineales son también prevalentes
en las estructuras cabeza de serie. También fue sorprendente la
identificación de dos polímeros que transfectan a altos niveles
pero no parecen unirse al ADN (KK89 y M17). Ambos son también
insolubles a pH 5 y pH 7. Su habilidad para facilitar la
incorporación de ADN puede ser debida a la permeabilización de la
membrana celular.
También es importante en la función de los
polímeros de dispensación de genes la longitud (Remy et al.
Advanced Drug Delivery Reviews 30:85 (1998); Schaffer et al.
Biotechnol Bioeng 67:598 (2000)). Usando estos resultados como
base, puede prepararse un intervalo de longitudes de polímeros para
cada polímero diana cambiando cuidadosamente las concentraciones
relativas de los monómeros. La evidencia muestra que (1) como con
PEI, la longitud de poli(éster beta-amino) es
importante en la habilidad de dispensación de genes de estos
polímeros, y (2) que los cabezas de serie identificados aquí pueden
sintetizarse de nuevo usando métodos convencionales y seguir
dispensando el ADN eficazmente.
Síntesis de polímeros. Se obtuvieron los
monómeros de Aldrich (Milwaukee, WI), TCI (Portland, OR), Pfaltz
& Bauer (Waterbury, CT), Matrix Scientific (Columbia, SC),
Acros-Fisher (Pittsburg, PA), Scientific Polymer
(Ontario, NY), Polysciences (Warrington, PA), y Dajac
monomer-polymer (Feasterville, PA). Estos se
disolvieron en DMSO (Aldrich) hasta una concentración final de 1,6
M. Se añadieron todas las combinaciones por pares posibles de
monómeros de amina y diacrilato en alícuotas de 150 \mul a cada
pocillo de placas de 96 pocillos de pocillos profundos de 2 ml de
bloques maestros de polipropileno (Griener America, Longwood, FL).
Se sellaron las placas con papel de aluminio, y se incubaron a 56ºC
mientras que giraban en un agitador orbital. Después de 5 días, se
añadió 1 ml de DMSO a cada pocillo y se sellaron de nuevo las
placas y se almacenaron congeladas a 4ºC hasta su uso.
Experimentos de transfección. Se
sembraron 14.000 células cos-7 (ATCC, Manassas, VA)
en cada pocillo de una placa blanca sólida de 96 pocillos
(Corning-Costar, Kennebunk, ME) y se dejó que se
asentaran durante la noche en medio de crecimiento, compuesto de;
500 ml de fenol rojo menos DMEM, 50 ml de suero fetal bovino
inactivado por el calor, 5 ml de penicilina/estreptomicina
(Invitrogen, Carlsbad, CA). Se llenó cada pocillo de una placa de
bloques maestros de 96 pocillos con 1 ml de acetato sódico 25 mM pH
5. A esto se añadió 40 \mul, 20 \mul o 10 \mul de la solución
polímero/DMSO. Se añadió 25 \mul del polímero diluido a 25 \mul
de ADN pCMV-luc a 60 \mug/ml (Promega, Madison,
WI) o pEGFP-NI (Invitrogen) en una place de 96
pocillos de mitad de volumen. Se incubaron estos durante 10
minutos, y a continuación se añadieron 30 \mul de la solución
polímero-ADN a 200 \mul de Optimem con bicarbonato
sódico (Invitrogen) en placas de 96 pocillos de poliestireno. Se
eliminó el medio de las células usando una varilla de 12 canales (V
& P Scientific, San Diego, CA) después de lo cual se añadió
inmediatamente 150 \mul de la solución
optimem-polímero-ADN. Se incubaron
los complejos con las células durante 1 hora y después se eliminaron
usando la varilla de 12 canales y se reemplazaron con 105 \mul de
medio de cultivo. Se dejó a las células crecer durante tres días a
37ºC, CO_{2} al 5% y después se analizó por la luminiscencia
(pCMV-luc) o fluorescencia
(pEGFP-N1). Se realizaron los experimentos de
control como se describió anteriormente, pero usando
poli(etilenimina) Pm 25.000 (Aldrich) como reemplazamiento
del polímero sintetizado, y a relaciones en peso de polímero:ADN de
0,5:1, 0,75:1, 1:1, 1,25:1, 1,5:1, y 2:1. Las transfecciones de
Lipofectamina 2000 (Invitrogen) se realizaron como se describe por
el vendedor, excepto que se eliminaron los complejos después de 1
hora.
Se analizó la luminiscencia usando kits de
ensayo de bright-glo (Promega). Brevemente, se
añadieron 100 \mul de solución de bright-glo a
cada pocillo de la placa de microtítulo que contenía el medio y las
células. Se midió la luminiscencia usando un Luminómetro de Mithras
(Berthold, Oak Ridge, TN). En algunos casos se usó un filtro de
densidad neutral (Chroma, Brattleboro, VT) para prevenir la
saturación del luminómetro. Se generó una curva estándar para la
Luciferasa por titración del enzima de Luciferasa (Promega) en
medio de crecimiento en placas blancas de microtítulo. Se examinó
la expresión de eGFP usando un microscopio invertido Zeiss
Aciovert.
Se realizaron las pruebas de electroforesis en
gel de agarosa-unión al ADN a una proporción N:P
40:1, como se ha descrito previamente (Lynn et al. Journal of the
American Chemical Society 123:8155 (2001)). Todo el manejo de
los líquidos se realizó usando un robot EDR384S/96S (Labcyte, Union
City, CA) o un micropipeteador de 12 canales (Termo Labsystems,
Vantaa, Finland) en una vitrina de flujo laminar.
Se determinó el efecto del peso molecular,
relación polímero/ADN, y grupo final de la cadena en las
propiedades de transfección de dos estructuras únicas de
poli(ésteres de beta-amino). Estos factores pueden
tener un efecto dramático en la función de dispensación de genes.
Usando métodos de cribado de alto rendimiento, se han descubierto
ésteres de poli(beta-amino) que transfectan
mejor que PEI y Lipofectamina 2000 (dos de los mejores agentes de
transfección comercializados).
Síntesis de polímeros. Se sintetizaron
los polímeros Poli-1 y Poli-2
añadiendo diacrilato de 1,4-butanodiol (+99%) y
diacrilato de 1,6-hexanodiol (99%), respectivamente,
a 1-aminobutanol (98%). Estos monómeros se
obtuvieron de Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Se generaron doce
versiones de cada uno de Poli-1 y
Poli-2 variando la relación estequiométrica de
amina/diacrilato. Para sintetizar cada uno de los 24 polímeros
únicos, se pesaron 400 mg de 1-aminobutanol en un
vial de muestra de 8 ml con un tapón de rosca recubierto de Teflón.
A continuación, se añadió la cantidad adecuada de diacrilato al
vial para dar una relación estequiométrica entre 1,4 y 0,6. Se puso
entonces una pequeña barra de agitación magnética recubierta de
Teflón en cada vial. Los viales se taparon fuertemente y se
colocaron en una placa magnética de multiposición que estaba en un
horno mantenido a 100ºC. Después de un tiempo de reacción de 5
horas, se sacaron los viales del horno y se almacenaron a 4ºC. Se
analizaron todos los polímeros por GPC.
Cromatografía por permeabilidad en gel
(GPC). Se realizó GPC usando una bomba de Hewlett Packard serie
1100 isocrática, un inyector de Rheodyne modelo 7125 con un bucle
inyector de 100 \mul, y una columna de Phenogel MXL (5 \mum
mezclada, 300 x 7,5 mm, Phenomenex, Torrance, CA). Se usó 70% de
THF/30% de DMSO (v/v) + piperidina 0,1 M como eluyente a una
velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Los datos se recogieron usando un
refractómetro interferométrico Optilab DSP (Wyatt Technology, Santa
Barbara, CA) y se procesaron con el paquete de software TriSEC GPC
(Viscotek Corporation, Houston, TX). Los pesos moleculares y
polidispersidades de los polímeros se determinaron en relación a
estándares monodispersos de poliestireno.
Ensayos de transfección de la luciferasa.
Se sembraron células COS-7 (ATCC, Manassas, VA)
(14.000 células/pocillo) en cada pocillo de una placa blanca opaca
de 96 pocillos (Corning-Costar, Kennebunk, ME) y se
dejó que se agarraran durante la noche en medio de crecimiento. El
medio de crecimiento estaba compuesto de 90% de DMEM sin rojo
fenol, 10% de suero fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina, 100
\mug/ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para
facilitar el manejo, se prepararon soluciones madre de polímero
(100 mg/ml) en disolvente DMSO. Una pequeña cantidad residual de
DMSO en la mezcla de transfección no afecta la eficiencia de
transfección y no produce ninguna citotoxicidad observable. Se
prepararon diluciones de trabajo de cada polímero (en
concentraciones necesarias para dar las distintas proporciones en
peso polímero/ADN) en tampón de acetato sódico 25 mM (pH 5). Se
añadió 25 \mul del polímero diluido a 25 \mul de ADN
pCMV-Luc a 60 \mug/ml (Elim. Biopharmaceuticals,
South San Francisco, CA) en un pocillo de una placa de 96 pocillos.
Se incubaron las mezclas durante 10 minutos para permitir la
formación del complejo, y a continuación se añadieron 30 \mul de
cada una de las soluciones polímero-ADN a 200
\mul de Opti-MEM con bicarbonato sódico
(Invitrogen) en placas de 96 pocillos de poliestireno. Se eliminó el
medio de las células usando una varilla de aspiración de 12 canales
(V & P Scientific, San Diego, CA) después de lo cual se añadió
inmediatamente 150 \mul de la solución
opti-MEM-polímero-ADN.
Se incubaron los complejos con las células durante 1 hora y después
se eliminaron usando la varilla de 12 canales y se reemplazaron con
105 \mul de medio de cultivo. Se dejó a las células crecer durante
tres días a 37ºC, CO_{2} al 5% y después se analizó en cuanto a
la expresión de la luciferasa. Se realizaron también experimentos
de control con PEI (Pm 25.000, Sigma-Aldrich) y
Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Las transfecciones de PEI se
realizaron como se describió anteriormente pero usando relaciones
en peso polímero/ADN de 1:1. Las transfecciones de Lipofectamina
2000 se realizaron como se describe por el vendedor, excepto que se
eliminaron los complejos después de 1 hora.
Se analizó la expresión de luciferasa usando
kits de ensayo de Bright-Glo (Promega). Brevemente,
se añadieron 100 \mul de solución de Bright-Glo a
cada pocillo de la placa de 96 pocillos que contenía el medio y las
células. Se midió la luminiscencia usando un luminómetro de Mithras
(Berthold, Oak Ridge, TN). Se usó un filtro de densidad neutral al
1% (Chroma, Brattleboro, VT) para prevenir la saturación del
luminómetro. Se generó una curva estándar para la Luciferasa por
valoración de la enzima de Luciferasa (Promega) en medio de cultivo
en placas blancas opacas de 96 pocillos.
Medida de la citotoxicidad. Los ensayos
de citotoxicidad se realizaron de la misma manera que los
experimentos de transfección de luciferasa con la siguiente
excepción. En vez de ensayar la expresión de la luciferasa después
de 3 días, se ensayaron las células en cuanto a su actividad
metabólica usando el kit de ensayo de MTT de proliferación celular
(ATCC) después de 1 día. Se añadieron 10 \mul de reactivo de MTT
a cada pocillo. Después de 2 horas de incubación a 37ºC, se
añadieron 100 \mul de reactivo detergente a cada pocillo. Se dejó
entonces la placa en la habitación sin luz a temperatura ambiente
durante 4 horas. Se midió la absorbancia óptica a 570 nm usando un
lector de microplaca SpectaMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale,
CA) y se convirtió en % de viabilidad en relación con las células
de control (no tratadas).
Experimentos de captación celular. Se
realizaron los experimentos de captación como se describió
anteriormente con la excepción que se usó un formato de placa de 12
pocillos en lugar de un formato de placa de 6 pocillos (Akinc, A.,
et al. Parallel synthesis and biophysical characterization of a
degradable polymer library of gene delivery. J. Am. Chem. Soc.,
2003). Se sembraron las células COS-7 a una
concentración de 1,5 x 10^{5} células/pocillo y se cultivaron
durante 24 horas antes de realizar los experimentos de captación.
Se realizó la preparación de los complejos polímero/ADN de la misma
manera que en los experimentos de transfección de la luciferasa, la
única diferencia fue un aumento en la escala (2,5 \mug de ADN por
pocillo en la placa de 12 pocillos en lugar de 600 ng de ADN por
pocillo en la placa de 96 pocillos) y el uso de un plásmido marcado
con Cy5 en lugar de pCMV-Luc (Akinc, A. y R. Langer,
Measuring the pH environment of DNA delivered using nonviral
vectors: Implications for lysosomal trafficking. Biotechnol.
Bioeng., 2002. 78(5): páginas 503-8). Se
incubaron los complejos con las células durante 1 hora como en los
experimentos de transfección para permitir la captación celular por
endocitosis. Se cuantificó el nivel relativo de captación celular
usando un citómetro de flujo para medir la fluorescencia de las
células cargadas con el plásmido marcado con Cy5.
Transfecciones de GFP. Se llevaron a cabo
las transfecciones de GFP en las líneas celulares
COS-7 (riñón de mono verde), NIH 3T3 (fibroblastos
murinos), HepG2 (hepatocarcinoma humano), y CHO (ovario del hamster
chino). Se obtuvieron todas las líneas celulares de ATCC (Manassas,
VA) y se mantuvieron en DMEM que contenía 10% de suero fetal
bovino, 100 unidades/ml de penicilina, 10D \mug/ml de
estreptomicina a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO_{2}. Se
sembraron las células en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta
aproximadamente 80-90% de confluencia antes de
realizar los experimentos de transfección. Se prepararon los
complejos polímero/ADN como se describió anteriormente usando el
plásmido pEGFP-N1 (Clontech, Palo Alto, CA) (5
\mug/pocillo). Se diluyeron los complejos en 1 ml de
Opti-MEM y se añadieron a los pocillos durante 1
hora. Se eliminaron entonces los complejos y se añadió medio de
cultivo nuevo a los pocillos. Después de 2 días, se recogieron las
células y se analizaron en cuanto a expresión de GFP por citometría
de flujo. Se usó la mancha de yoduro de propidio para excluir las
células muertas del
análisis.
análisis.
Citometría de flujo. La citometría de
flujo se realizó con un FACSCalibur (Becton Dickinson) equipado con
un láser de ión de argón capaz de excitar GFP (excitación a 488 nm)
y un láser de diodo rojo capaz de excitar Cy5 (excitación a 635 nm).
La emisión de GFP se filtró usando un filtro de paso de banda de
530 nm y la emisión de Cy5 se filtró usando un filtro de paso largo
de 650. Las células fueron adecuadamente dirigidas por medio de
dispersión hacia delante y lateral y se recogieron 30.000 eventos
por muestra.
Síntesis de polímeros. Como se ha
descrito anteriormente (Lynn, D.M. y R. Langer, Degradable
poly(\beta-amino esters): síntesis,
characterization and self-assembly with plasmid
DNA. J. Am. Chem. Soc., 2000. 122(44): páginas
10761-10768), la síntesis de los ésteres
poli(\beta-amino) procede vía la adición
del conjugado de aminas a grupos acrilatos. Puesto que la reacción
es una polimerización de paso a paso, se obtiene una distribución
estadística amplia de longitudes de cadena, los pesos moleculares
medios y los grupos finales de cadena están controlados por la
estequiometría de los monómeros (Flory, P., en Principies of
Polymer Chemistry. 1953, Cornell University Press: Ithaca, NY.
páginas 40-46, 318-323; Odian, G.,
Step Polymerization, en Principies of Polymerization.
1991, John Wiley & Sons, Inc.: Nueva York. páginas
73-89). El peso molecular aumenta a medida que la
proporción de monómeros alcance la equivalencia estequiométrica, y
un exceso de monómero de amina o monómero de diacrilato produce
cadenas acabadas en amina o acrilato, respectivamente. En esta clase
de polímeros, un control preciso de la estequiometría es esencial
para controlar el peso molecular del polímero. Mientras que la
estequiometría de los monómeros es el factor más importante que
afecta la longitud de la cadena, debería también considerarse las
reacciones laterales competidoras que pueden impactar el peso
molecular y la estructura de los productos poliméricos. En
particular, las reacciones de ciclación intramoleculares, donde una
amina en un extremo de la cadena polimérica que está creciendo
reacciona con un acrilato en el otro extremo, pueden limitar los
pesos moleculares obtenidos (Odian, G., Step Polymerization,
en Principies of Polymerization. 1991, John Wiley &
Sons, Inc.: Nueva York. páginas 73-89). Estas
cadenas cíclicas pueden también tener propiedades que son
diferentes a las de sus congéneres lineales.
En este trabajo, hemos modificado el
procedimiento de polimerización descrito anteriormente para
controlar mejor la estequiometría de los monómeros y minimizar las
reacciones de ciclación. Primero, se aumentó la escala de la
síntesis de aproximadamente 0,5 g a 1 g para permitir el control de
la estequiometría en un 1%. Mejoras adicionales de la exactitud
están limitadas por la pureza (98.-99%) de los monómeros
comercializados usados. Segundo, se pesaron todos los monómeros en
los viales en lugar de ser dispensados volumétricamente. Se
encontró que las discrepancias entre las densidades de monómeros
actuales y las descritas no eran negligibles en algunos casos
conduciendo a inexactitudes de la masa dispensada. Tercero, se
realizaron las polimerizaciones en ausencia de disolvente para
maximizar la concentración de los monómeros, favoreciendo así la
reacción de adición intermolecular sobre la reacción de ciclación
intramolecular. Eliminar el disolvente proporciona también los
beneficios añadidos de aumentar la velocidad de reacción y obviar
la etapa de eliminación del disolvente. Finalmente, puesto que no
se usó el disolvente fe cloruro de metileno previamente usado, la
temperatura de la reacción pudo aumentarse de 45ºC a 100ºC. El
aumentar la temperatura produjo una mayor velocidad de la reacción y
una disminución de la viscosidad de la mezcla reaccionante,
ayudando a compensar la mayor viscosidad del sistema libre de
disolvente. El efecto combinado de aumentar la concentración de los
monómeros y la temperatura de la reacción produjo una disminución
del tiempo de reacción de aproximadamente 5 días a 5 horas.
Sintetizamos los polímeros
Poli-1 y Poli-2 añadiendo diacrilato
de 1,4- butanodiol y diacrilato de 1,6-hexanodiol,
respectivamente, a 1-aminobutanol. Se sintetizaron
doce versiones únicas de cada polímero variando las relaciones
molares de amina/diacrilato entre 0,6 y 1,4.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En ambos conjuntos de polímeros
(Poli-1 y Poli-2), 7 de los 12
tenían relaciones amina/diacrilato > 1, obteniéndose polímeros
acabados en amina, y 5 de los 12 tenían relaciones amina/diacrilato
< 1, obteniéndose polímeros acabados en acrilato. Después de 5
horas de reacción a 100ºC, se obtuvieron los polímeros como líquidos
viscosos transparentes, ligeramente amarillentos. Los polímeros
tenían diferencias observables de viscosidad, que correspondían a
diferencias en el peso molecular. Los polímeros se analizaron por
cromatografía de permeabilidad en gel (GPC) en fase orgánica
empleando 70% de THF/30% de DMSO (v/v) + pipericina 0,1 M como
eluyente. Los pesos moleculares (PM) de los polímeros estuvieron en
el intervalo de 3.350 (Poli-1, amina/diacrilato =
1,38) a 18.000 (Poli-1, amina/diacrilato = 0,95) en
relación a estándares de poliestireno (figura 16). Las
distribuciones de peso molecular fueron monomodales con índices de
polidispersidad (PDls) en el intervalo de 1,55 a 2,20.
Resultados de la transfección de la
luciferasa. Se realizaron los experimentos de transfección con
todos los 24 polímeros sintetizados (12 cada uno de
Poli-1 y Poli-2) en 9 relaciones
polímero/ADN diferentes para determinar el impacto del peso
molecular, relación polímero/ADN, y grupo final de la cadena en la
eficiencia de la transfección (figuras 17 y 18). Como sistema
modelo, usamos la línea celular COS-7 y un plásmido
que codifica el gen reportero de luciferasa de la luciérnaga
(pCMV-Luc) (600 ng/pocillo). Para facilitar la
ejecución de las cerca de 1.000 transfecciones (datos obtenidos por
cuadruplicado), se realizaron los experimentos en un formato de
placa de 96 pocillos. Los niveles de expresión de la proteína
reportera se determinaron usando un kit de ensayo comercializado de
luciferasa y un lector de placa de luminiscencia de 96
pocillos.
Los datos mostrados en las figuras 17 y 18
demuestran que el peso molecular del polímero, la relación
polímero/ADN, y el grupo al final de la cadena tienen un impacto en
las propiedades de transfección de ambos polímeros
Poli-1 y Poli-2. Un resultado
llamativo, y en cierto modo inesperado, fue que ninguno de los
polímeros acabados en acrilato mediara niveles apreciables de
transfección en ninguna de las condiciones evaluadas. Este
resultado puede ser aplicable de forma más amplia para los ésteres
de poli(\beta-amino), puesto que todavía no
hemos conseguido sintetizar un polímero, usando un exceso de
monómero de diacrilato, que medie la expresión apreciable del gen
reportero con ninguna de las relaciones polímero/ADN que hemos
empleado. Estos resultados sugieren que quizás solo los ésteres de
poli(\beta-amino) terminados en amina son
adecuados para uso como vehículos de dispensación de genes. Por el
contrario, hubo valores diferentes de actividad de transfección
según los diferentes valores de Pm del polímero/ADN con las
versiones terminadas en amina de ambos Poli-1 y
Poli-2 (figuras 17-A y
18-A). Se consiguieron niveles máximos de 60 ng
luc/pocillo y 26 ng luc/pocillo de expresión del gen reportero
usando Poli-1 (P_{M} = 13.100) y
Poli-2 (P_{M} = 13.400), respectivamente. Estos
resultados son bastante favorablemente comparación los de PEI
(polímero/ADN = 1:1 p/p), que mediaron un nivel de expresión de 6
ng luc/pocillo (datos no mostrados) en las mismas condiciones.
Mientras que los niveles más altos de
transfección ocurrieron usando las versiones de peso molecular más
alto de ambas estructuras poliméricas, las relaciones polímero/ADN
óptimas para estos polímeros fueron marcadamente diferentes
(polímero/ADN = 150 para el poli-1, polímero/ADN =
30 para el poli-2). Los resultados de transfección
que hemos obtenido para Poli-1 y
Poli-2 remarcan la importancia de optimizar el peso
molecular del polímero y la relación polímero/ADN, y la importancia
de controlar los grupos al final de la cadena. Además, el hecho de
que dos estructuras poliméricas tan similares, que se diferencian
solo en dos carbonos en la unidad de repetición, tengan parámetros
de transfección óptimos tan diferentes da énfasis a la necesidad de
realizar estas optimizaciones para cada estructura polimérica única.
Para mejorar nuestra comprensión de los resultados de transfección
obtenidos, elegimos estudiar dos características importantes de la
dispensación que tienen un impacto directo en la expresión
transgénica, la citotoxicidad y la habilidad de entrar en las
células vía la endocitosis (Wiethoff, C.M. y C.R. Middaugh,
Barriers to nonviral gene delivery. Journal of
Pharmaceutical Sciences, 2003. 92(2): páginas
203-217).
Citotoxicidad: evaluamos las
citotoxicidades de varios complejos polímero/ADN usando un ensayo
estándar de reducción de MTT/tinte azul de tiazolilo. Los
experimentos se realizaron exactamente como los experimentos de
transfección descritos anteriormente, excepto que en lugar de
ensayar la expresión del gen reportero en el día 3, se realizó el
ensayo de MTT después del día 1 (véase Materiales y Métodos).
Inicialmente formulamos la hipótesis que la falta de actividad de
transfección observada en los polímeros terminados en acrilato
podría haberse debido a la citotoxicidad de los grupos terminales
de acrilato. Las figuras 19-B y 20-B
indican que las concentraciones altas de acrilato son citotóxicas,
puesto que se ve que la viabilidad disminuye a relaciones mayores
de polímero/ADN y Pm más bajo del polímero (el Pm más bajo se
corresponde con una concentración más alta de grupos terminales).
Sin embargo, la toxicidad de los acrilatos no explica
suficientemente la falta de actividad de transfección a relaciones
menores de polímero/ADN o pesos moleculares más altos. Los datos
mostrados en la figura 19-A demuestran que la
citotoxicidad no es un factor limitante para los vectores de
poli-1, puesto que las células permanecen viables
incluso a las relaciones más altas de polímero/ADN. Por otro lado,
los datos mostrados en la figura 20-A sugieren que
la citotoxicidad es un factor importante que limita la eficiencia de
la transfección de los vectores de poli-2,
especialmente en los polímeros de bajo peso molecular. Este
resultado puede explicar por qué la actividad de transfección no
existe o disminuye en los vectores de poli-2 a
polímero/ADN > 30 (véase la figura 18-A).
Captación celular. Se evaluó la habilidad
de los complejos de polímero/ADN para ser captados por las células
usando una técnica basada en citometría de flujo descrita
anteriormente para medir la fluorescencia del ADN dispensado por el
vector (Akinc, A., et al. Parallel synthesis and biophysical
characterization of a degradable polymer library of gene
delivery. J. Am. Chem. Soc., 2003). Brevemente, se prepararon
los complejos polímero/ADN usando ADN plasmídico marcado
covalentemente con el tinte fluorescente Cy5. Para permitir la
comparación de los datos de captación celular con los datos de
expresión de genes descritos anteriormente, se formaron los
complejos con las mismas relaciones polímero/ADN y de la misma
forma que en los experimentos de transfección. Los complejos
marcados se incubaron con células COS-7 durante 1
hora a 37ºC para permitir la captación. Se cuantificó el nivel
relativo de captación celular midiendo la fluorescencia de las
células cargadas con el ADN marcado con Cy5. Los resultados de
estos experimentos de captación se resumen en las figuras 21 y 22.
Los datos mostrados en las figuras 21-B y
22-B sugieren que la falta de actividad de
transfección en los polímeros acabados en acrilato no se debe a la
citotoxicidad, como se pensó inicialmente, sino más bien a una
inhabilidad para penetrar en la célula. De forma similar, los
complejos de poli-1 están severamente limitados en
cuanto a captación en todas las relaciones polímero/ADN excepto las
más altas (figura 21-A). Mientras que estos datos
no se correlacionan exactamente con los resultados de transfección
obtenidos para el poli-1, es consistente con el
hecho de que la actividad de transfección no se observa hasta que
se emplean relaciones polímero/ADN muy altas. Los complejos de
poli-2 no muestran captación celular apreciable en
relaciones polímero/ADN < 30 y mayores niveles de captación a
medida que las relaciones polímero/ADN aumentan más allá de 30
(figura 22-A). Este resultado, combinado con los
resultados anteriores de citotoxicidad, ayuda a explicar la
actividad de transfección de los complejos de
poli-2. En relaciones polímero/ADN menores de 30,
los complejos no penetran eficazmente la célula, pero a medida que
las relaciones polímero/ADN aumentan mucho más allá de 30, la
citoxicidad empieza a limitar la eficiencia de la transfección, lo
que produce una actividad de transfección óptima cerca de
polímero/ADN = 30.
Cuando la endocitosis es la principal ruta de
entrada celular, la formación eficaz de complejos polímero/ADN en
la escala de nanómetros es un requerimiento para conseguir niveles
altos de captación celular (De Smedt, S.C., J. Demester, y W.E.
Henninink, Cationic polimer based gene delivery systems.
Pharmaceutical Research, 2000. 17(2): páginas
113-126; Prabha, S., et al.,
Size-dependency of nanoparticlemediated gene
transfection: studies with fractionated nanoparticles.
International Journal of Pharmaceutics, 2002.
244(1-2): páginas 105-115).
Los niveles de captación bajos observados con muchos de los
complejos polímero/ADN pueden ser atribuibles a la falta de éxito
para formar complejos estables a nanoescala. Desgraciadamente, la
mala solubilidad a pH neutro de los polímeros previnió tomar medidas
dinámicas de dispersión de la luz de tamaño complejo usando el
medio de transfección (Opti-MEM medio de suero
reducido, pH 7,2) como diluyente. Las lecturas obtenidas fueron
atribuibles a precipitados poliméricos, que eran en algunos casos
visibles como una turbidez en las soluciones de polímero en
Opti-MEM. Sin embargo, pudimos medir los diámetros
efectivo de los complejos usando acetato sódico 25 mM (pH 5) como
diluyente de la muestra. Mientras que estos datos no iluminan la
cuestión del tamaño o estabilidad de los complejos en el medio de
transfección, si pueden indicar si hubo éxito en la formación de
los complejos antes de añadir el medio de transfección.
Específicamente, descubrimos que las versiones de
poli-1 de peso molecular más bajo (P_{M} <
10.700) fueron incapaces de formar complejos a nanoescala, incluso
en tampón de acetato. En todos los demás casos encontramos que se
formaron complejos polímero/ADN de tamaño de nanómetro. Mientras
que estos resultados pueden explicar los niveles bajos de captación
asociados con las versiones de poli-1 de peso
molecular más bajo, no explican satisfactoriamente la baja
actividad de captación de los polímeros terminados con acrilato o
la dependencia de la relación polímero/ADN en la captación celular.
Aunque el tamaño de partícula y la estabilidad son factores
importantes que tienen un impacto en la captación celular, es
probable que otros factores, todavía no identificados, deban ser
considerados también para proporcionar una explicación más completa
de los resultados de captación celular obtenidos.
Aumento de la transfección usando un agente
co-complejante. Tanto el poli-1
como el poli-2 requieren relaciones polímero/ADN en
peso relativamente altas para conseguir niveles altos de
transferencia de genes. Una explicación podría ser que, comparados
con otros polímeros usados a menudo para compactar el ADN (por
ejemplo, polilisina (PLL) y PEI), estos polímeros tienen densidades
de nitrógeno relativamente bajas. El poli-1 tiene
un peso molecular por átomo de nitrógeno (Pm/N) de 301, y
poli-2 tiene un Pm/N de 329. En comparación, para
PLL y PEI, estos números son aproximadamente 65 y 43,
respectivamente. Podría ser posible reducir la cantidad de
poli-1 o poli-2 necesaria para
conseguir niveles altos de transfección incorporando una pequeña
cantidad de un agente co-complejante. Esta
aproximación podría ser especialmente beneficiosa para los vectores
de poli-2, puesto que la citotoxicidad parece ser
una importante limitación de estos vectores. Para probar esta
hipótesis, se usaron PLL y PEI como agentes
co-complejantes modelo. Centramos nuestra atención
en el miembro más prometedor en cada uno de los conjuntos de
polímeros de poli-1 (terminados en amina, P_{M} =
13.100) y poli-2 (terminados en amina, P_{M} =
13.400). Los datos mostrados en las figuras 23 y 24 indican que se
pudo conseguir una reducción significativa en polímero, mientras
que se mantienen los altos niveles de eficiencia de transfección,
con el uso de PLL o PEI como agentes
co-complejanles. En algunos casos, se realizó un
aumento significativo de la actividad de transfección. Como se
esperaba, esta aproximación de co-complejamiento
fue particularmente beneficiosa para los vectores
poli-2. Este trabajo, y trabajos anteriores (Wagner,
E., et al., Influenza virus hemagglutinin HA-2
N-terminal fusogenic peptides augment gene transfer
by transferring-polilysine-DNA
complexes: toward a synthetic virus-like
gene-transfer vehicle. Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A., 1992. 89(17): páginas 7934-8;
Fritz, JD., et al., Gene transfer finto mammalian cells using
histone-condensed plasmid DNA. Hum Gene Ther,
1996. 7(12): páginas 1395-1404; Pack, D.W.,
D. Putnam, y R. Langer, Design of imidazolecontaining
endosomolytic biopolymers for gene delivety. Biotechnol.
Bioeng., 2000. 67(2): páginas 217-23; Lim,
Y.B., et al., Self-Assembled Ternary Complex of
Cationic Dendrimer, Cucurbituril, and DNA: Noncovalent Strategy in
Developing a Gene Delivery Carrier. Bioconjug Chem, 2002.
13(6): páginas 1181-5), demuestran que la
mezcla de polímeros con características de transferencia de genes
complementarias puede en algunos casos producir reactivos de
dispensar genes más eficaces.
Para evaluar adicionalmente las propiedades de
transfección de reactivos mezclados Poli-1/PLL y
Poli-2/PLL, realizamos experimentos de transfección
usando un plásmido reportero que codifica la proteína verde
fluorescente (pCMV-EGFP). Aunque tanto las pruebas
de transfección de luciferasa como las de transfección de GFP miden
la actividad de transfección, proporcionan distintos tipos de
información. El sistema de luciferasa cuantifica la cantidad total
de proteína exógena de luciferasa producida por todas las células
en un pocillo dado, proporcionando una medida de actividad de
transfección cumulativa. Por el contrario, el sistema GFP puede
usarse para cuantificar el porcentaje de células que han sido
transfectadas, proporcionando una medida célula por célula de
actividad de transfección. Ambos sistemas son útiles y ofrecen
información complementaria en cuanto a las propiedades de
transfección de un sistema dado de dispensar genes.
Se realizaron las transfecciones de GFP de forma
similar a los experimentos de luciferasa, pero se escalaron a un
formato de placa de 6 pocillos (5 \mug de plásmido/pocillo). Se
realizó la transfección de células COS-7 usando
Poli-1/PLL (Poli-1:PLL:ADN =
60:0,1:1 p/p/p) y Poli-2/PLL
(Poli-2:PLL:ADN = 5:0,4:1 p/p/p). Se usaron la
Lipofectamina 2000 (\mul de reactivo: \mug de ADN = 1:1), PEI
(PEI: ADN = 1:1 p/p, N/P \sim8), y ADN desnudo como controles en
el experimento. Después de 1 hora de incubación con las células, se
eliminaron los vectores y se añadió medio de cultivo nuevo. Dos
días más tarde se probó la expresión de GFP usando un citómetro de
flujo. Casi todas las células que se habían transfectado con
Poli-1/PLL fueron positivas para la expresión de
GFP (figuras 25 y 26). Los experimentos indicaron que los vectores
Poli-2/PLL fueron menos eficaces, produciendo
aproximadamente 25% de células positivas. Los controles positivos
Lipofectamina 2000 y PEI fueron también capaces de mediar
transfecciones eficaces de células COS-7 en las
condiciones empleadas. Aunque las transfecciones de Lipofectamina
2000 y PEI produjeron cerca del mismo porcentaje de células GFP
positivas que el Poli-1/PLL, el nivel de
fluorescencia de las células GFP positivas fue mayor en el caso de
Poli-1/PLL (fluorescencia media = 6033) que en el
caso tanto de Lipofectamina 2000 (fluorescencia media = 5453) como
de PEI (fluorescencia media = 2882). La multiplicación del
porcentaje de células positivas por el nivel medio de fluorescencia
de las células positivas proporciona una medida de la expresión
agregada de la muestra y debería, en teoría, correlacionarse mejor
con los resultados de los experimentos de expresión del gen de
luciferasa. La cuantificación de la expresión de GFP total de esta
manera indica que el nivel de expresión más alto se consigue con
poli-1/PLL, seguido de Lipofectamina 2000 y PEI.
Este resultado está en general de acuerdo con los resultados de
expresión de luciferasa.
Los experimentos han mostrado que
poli-1/PLL (poli-1:PLL:ADN =
60:0,1:1 p/p/p) es un vector altamente eficaz en la transfección de
células COS-7. La habilidad de este vector para
mediar la transfección en tres otras líneas celulares comúnmente
usadas (CHO, NIH 3T3, y HepG2) se investigó también. Es -muy
probable que cada una de estas líneas celulares tenga condiciones
óptimas de transfección que son diferentes de las usadas en la
transfección de células COS-7; sin embargo, como
evaluación preliminar de la habilidad de transfectar líneas
celulares múltiples, se realizaron transfecciones de la misma
manera y en las mismas condiciones que las transfecciones de
COS-7. Los resultados indican que
poli-1/PLL (poli-1:PLL:ADN =
60:0,1:1 p/p/p) es capaz de transfectar con éxito las células CHO,
NIH 3T3, y HepG2, aunque no tan eficazmente como las células
COS-7 (figura 27). Esto no es demasiado sorprendente
puesto que el vector usado se optimizó por cribado de transferencia
de genes en células COS-7. Se esperaría que la
optimización de la composición del vector y de las condiciones
específicas de transfección para cada tipo de célula produjera
incluso niveles de transfección más altos.
En este estudio, se ha investigado el papel del
peso molecular polimérico, el grupo terminal del polímero, y la
relación polímero/ADN en un número de propiedades importantes de
transferencia de genes. Se encontó que los tres factores tenían un
impacto significativo en la transferencia de genes, remarcando el
beneficio de controlar cuidadosamente y optimizar cuidadosamente
estos parámetros. Además, la incorporación de una pequeña cantidad
de PLL, usado para ayudar el complejamiento, aumenta adicionalmente
la transferencia de genes. Con estas aproximaciones los vectores
basados en ésteres degradables de
poli(beta-amino) rivalizan con algunos de los
mejores vectores no virales obtenibles en la transferencia de genes
in vitro.
Para caracterizar adicionalmente y sintetizar
algunos de los ésteres de poli(beta-amino)
identificados en los cribados anteriores, se sintetizaron de nuevo
veintiún polímeros con varas relaciones de monómero de amina a
monómero de acrilato. Los polímeros obtenidos se caracterizaron por
cromatografía de permeabilidad de gel para determinar el peso
molecular y la polidispersidad de cada polímero. Cada uno de los
polímeros se probó en cuanto a su habilidad para transfectar
células.
Síntesis de los polímeros. Se
sintetizaron los polímeros como se describió en el ejemplo 5. Se
crearon varias versiones de cada polímero variando la relación
estequiométrica amina/diacrilato. Por ejemplo,
C36-1 corresponde a la relación estequiométrica de
1,4, y C36-12 a 0,6, con todos los intermediarios
dados en la tabla a continuación:
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Los polímeros se prepararon típicamente en
viales de cristal sin disolvente a 100ºC durante 5 horas. En
algunas síntesis, la polimerización a 100ºC dio polímeros de alto
entrecruzamiento cuando se usaron ciertos monómeros como la amina
94; por lo tanto, se repitieron las reacciones de polimerización a
50ºC con 2 ml de DMSO añadidos para evitar el entrecruzamiento.
Los polímeros obtenidos se analizaron por GPC
como se describió en el ejemplo 5. Los pesos moleculares y
polidispersidades de cada uno de los polímeros se muestran en la
tabla a continuación:
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Ensayo de la transfección de la
luciferasa. Como se describió en el ejemplo 5, células
COS-7 se transfectaron con ADN p
CMV-Luc usando cada uno de los polímeros con
relaciones polímero a ADN en el intervalo de 10:1 a 100:1
(peso:peso). Se analizó la expresión de luciferasa usando los kits
de Bright-Glo (Promega). Se midió la luminiscencia
de cada transfección, y se usó la luminiscencias para calcular los
nanogramos de la enzima luciferasa como se describió en el ejemplo
5. Se realizaron los experimentos por cuadruplicado, y los valores
mostrados en las tablas a continuación son los valores medios de
los cuatro experimentos. Estos da.:os se muestran a continuación
para cada polímero sintetizado.
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La siguiente tabla muestra la síntesis de los
polímeros listados a la izquierda usando relaciones de monómero de
amina a monómero de acrilato en el intervalo de 1,4 a 0,6 como se
describió anteriormente. Cada síntesis de polímero se ensayó a
continuación en cuanto a la transfección de Luciferasa usando seis
relaciones distintas de polímero a ADN (se realizó cada experimento
por cuadruplicado). Los datos de la tabla representan la actividad
de la Luciferasa en la mejor relación polímero a ADN.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (15)
1. Un compuesto de la fórmula:
en
donde
cada R' está independientemente seleccionado del
grupo que consiste en hidrógeno, alquilo de cadena corta
C_{1}-C_{6}, alcoxi de cadena corta
C_{1}-C_{6}, hidroxi, amino, alquilamino,
dialquilamino, ciano, tiol, heteroaril, aril, fenil, heterociclo,
carbociclo, y halógeno;
n es un número entero ente 3 y 10.000;
x es un número entero entre 1 y 10; y
cuando X es metil o NR_{2}; y
R se selecciona del grupo que consiste en
hidrógeno, alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y
heteroaril; o cuando X es OR; y R se selecciona del grupo que
consiste en alquil, alquenil, alquinil, ciclo, heterociclo, aril, y
heteroaril;
y es un número entero entre 1 y 10;
o cuando X es OR; y R es hidrógeno, y es 5 o un
número entero entre 1 y 2 o 6 y 10
y
derivados y sales del mismo.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde el compuesto acaba con amina, o en donde el compuesto acaba
con acrilato.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde x es un número entero entre 2 y 7, preferiblemente en donde x
es 4, 5 o 6.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde y es un número entero entre 2 y 7, preferiblemente en donde y
es 4, 5 o 6.
5. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde R es hidrógeno, metil, etil, propil, butil, pentil y
hexil.
6. El compuesto de la reivindicación 1, en donde
la estructura del compuesto es
en donde R es hidrógeno, x es 4, e
y es
4;
o
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R es hidrógeno, x es 6, e
y es
4;
\vskip1.000000\baselineskip
o
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R es hidrógeno, x es 4, e
y es
5;
\vskip1.000000\baselineskip
o
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R es hidrógeno, x es 5, e
y es
4;
\newpage
o
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R es hidrógeno, x es 5, e
y es
5;
\vskip1.000000\baselineskip
o
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R es hidrógeno, x es 5, e
y es
6.
7. Un compuesto como se ha reivindicado en la
reivindicación 1, de la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde n es un número entero ente
3 y 10,1000; y derivados y sales del
mismo.
\newpage
8. Un compuesto de la reivindicación 1, que
comprende acrilatos de la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y
aminas de la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
9. Un compuesto según la reivindicación 8,
seleccionado del grupo que comprende:
C80, E32, E36, F28, F32 y LL8.
10. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde el compuesto tiene un peso molecular entre 1.000 y 100.000
g/mol, preferiblemente en donde el compuesto tiene un peso
molecular entre 2.000 y 40.000 g/mol.
11. Una composición farmacéutica que comprende
un polinucleótido y un compuesto de la reivindicación 1.
12. Una composición farmacéutica que comprende
nanopartículas que contienen un polinucleótido o un agente
farmacéutico y un compuesto de la reivindicación 1.
13. Una composición farmacéutica que comprende
micropartículas que contienen un agente encapsulado en una matriz
de un compuesto de la reivindicación 1.
14. La composición farmacéutica de la
reivindicación 13, en donde las micropartículas tienen un diámetro
medio de 1-10 micrómetros, o en donde las
micropartículas tienen un diámetro medio menor de 5 micrómetros,
preferiblemente en donde las micropartículas tienen un diámetro
medio menor de 1 micrómetro.
15. La composición farmacéutica de la
reivindicación 13, en donde el agente es una molécula pequeña,
péptido, proteína o polinucleótido, preferiblemente en donde el
polinucleótido es ADN, ARN o siARN.
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