RS58405B1

RS58405B1 - Stereoidni derivati za isporuku irnk u humanim genetskim oboljenjima

Info

Publication number: RS58405B1
Application number: RS20190197A
Authority: RS
Inventors: Braydon Charles Guild; Frank Derosa; Michael Heartlein; Michael Concino
Original assignee: Translate Bio Inc
Priority date: 2009-12-01
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2019-04-30
Also published as: LT3338765T; TR201901311T4; US20110244026A1; SMT201800220T1; DK3338765T3; CY1121516T1; US20220111075A1; EP3318248B1; EP3318248A1; ES2713852T3; US10143758B2; EP2506857A1; EP4115874A1; HRP20180696T1; AU2010326132B2; NZ733634A; AU2010326132A1; RS57314B1; EP3403647A1; NZ716192A

Description

Opis

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0001] Za lečenje proteinskih i enzimskih deficijencija su još uvek potrebni novi pristupi i terapije, pre svega strategije i terapije koji prevazilaze izazove i ograničenja vezane za primenu nukleinskih kiselina i transfekciju ciljnih ćelija. Dodatni pristupi koji bi modulisali ili dopunili ekspresiju deficijentnih proteina ili enzima i time pobošali stanje deficijencije koje se nalazi u osnovi, bi bili korisni u razvoju odgovarajućih terapija za poremećaje koji su sa njima asocirani.

[0002] Na primer, poremećaji metaboličkog ciklusa uree predstavljaju deficijencije proteina i enzima za koje trenutno ne postoje dostupni lekovi. Ciklus uree podrazumeva serije biohemijskih reakcija koje se odvijaju kod mnogih životinja koje proizvode ureu ((NH2)2CO) iz amonijaka (NH3), a kod sisara se odvija samo u jetri. Preciznije, ciklus uree čine serije pet biohemijskih reakcija sa dve primarne funkcije: eliminacija azota u vidu uree i sinteza arginina. Defekti u ciklusu uree dovode do nagomilavanja amonijaka i njegovih prekursorskih aminokiselina (glutamina, glutaminske kiseline, asparaginske kiseline i glicina). Rezultujući visoki nivoi amonijaka su neurotoksični, a trijada hiperamonemije, encefalopatije i respiratorne alkaloze karakteriše poremećaje ciklusa uree.

[0003] Deficijencija ornitin transkarbamilaze (OTC) predstavlja jedan takav genetski poremećaj ciklusa uree. Osobe sa OTC deficijencijom obično karakteriše smanjen nivo OTC enzima. U klasičnom ozbiljnom obliku OTC deficijencije, kod pacijenata su u prvim danima života prisutni letargija, konvulzije, koma i teška hiperamonemija koji brzo dovode do pogoršanja i smrtonosnog ishoda ukoliko izostane odgovarajuća medicinska intervencija. Ukoliko se OTC deficijencija ne leči, komplikacije mogu uključiti kašnjenje u razvoju, mentalnu retardaciju i/ili smrt.

[0004] Lečenje pacijenata sa OTC deficijencijom primarno podrazumeva regulaciju serumskog amonijaka, a hemodijaliza ostaje kao jedino efikasno sredstvo za brzo snižavanje nivoa amonijaka u serumu. U principu, cilj tretmana metaboličkih poremećaja ciklusa uree je da se obezbedi dovoljno proteina i arginina za rast, razvoj i energetske potrebe, uz prevenciju razvoja hiperamonemije i hiperglutaminemije. Terapijski pristupi koji su trenutno dostupni za terapijsko zbrinjavanje metaboličkih poremećaja ciklusa uree, kao što je OTC deficijencija, velikim delom se oslanjaju na regulisanje ishrane. Trenutno ne postoje dugotrajni tretmani ili lekovi za metaboličke poremećaje ciklusa uree. Nove terapije koje povećavaju nivo ili proizvodnju pogođenog proteina ili enzima u ciljnim ćelijama, kao što su hepatociti, ili koje modulišu ekspresiju nukleinskih kiselina koje kodiraju protein ili enzim koji nedostaje, mogu obezbediti tretman ili čak lek za poremećaje metabolizma, uključujući metaboličke poremećaje poput OTC deficijencije.

Arch. Pharm. Res. 31(7), 1 July 2008, STRANE 924-931 opisuje testiranje tri katjonska lipida na bazi hidrofobnog holesterola vezanog za L-lizin, L-histidin ili L-arginin kao vektore za dostavljanje DNK.

KRATKA SUŠTINA PRONALASKA

[0005] Predviđeni su postupci unutarćelijske isporuke nukleinskih kiselina koje su sposobne da koriguju postojeće genetske defekte i/ili da obezbede korisne funkcije za jednu ili više ciljnih ćelija. Nakon uspešne isporuke ciljnim tkivima i ćelijama, kompozicije predmetnog pronalaska vrše transfekciju ciljne ćelije, a nukleinske kiseline (tj. iRNK) mogu biti translatirane u genski proizvod od interesa (tj. funkcionalni protein ili enzim ) ili mogu biti na drugi način modulisati ili regulisati prisustvo ili ekspresiju genskog proizvoda od interesa.

[0006] Kompozicije i postupci koji su ovde obezbeđene su korisne za zbrinjavanje i lečenje velikog broja oboljenja, naročito oboljenja koja su rezultat deficijencije proteina /ili enzima. Osobe koje boluju od navedenih bolesti mogu u osnovi imati genetske nedostatke koji dovode do kompromitovane ekspresije proteina ili enzima, uključujući, na primer, izostanak sinteze proteina, smanjenu sintezu proteina ili sintezu proteina kome nedostaje ili je smanjena biološka aktivnost. Preciznije, postupci i kompozije koje su ovde obezbeđene su korisne za lečenje metaboličkih poremećaja ciklusa uree koji se javljaju kao rezultat jednog ili više defekata u biosintezi enzima koji su uključeni u ciklus uree. Postupci i kompozicije koje su ovde predviđeni su takođe korisni za razne vidove in vitro i in vivo primene u kojima su poželjni dopremanje nukleinske kiseline (npr. iRNK) do ciljne ćelije i transfekcija navedene ciljne ćelije.

[0007] U jednom izvođenju, kompozicije sadrže nukelinsku kiselinu, nosač transfera, kao i sredstvo koje olakšava kontakt sa njom i naknadnu transfekciju ciljne ćelije. Nukelinska kiselina može kodirati klinički koristan genski proizvod ili protein. Na primer, nukleinska kiselina može kodirati funkcionalni enzim u ciklusu uree. U poželjnim izvođenjima, nukleinska kiselina je RNK, ili poželjnije mRNK kodira funkcionali protein ili enzim.

[0008] U nekim izvođenjima, ovde su predviđene kompozicije i postupci za povećavanje ekspresije funkcionalnog proteina ili enzima u ciljnoj ćeliji. Na primer, kompozicije i postupci ovde predviđeni mogu biti korišćeni da povećaju ekspresiju enzima ciklusa uree (npr., OTC, CPS1, ASS1, ASL ili ARG1). U nekim izvođenjima, kompozicija sadrži iRNK i nosač transfera. U nekim izvođenjima iRNK kodira enzim ciklusa uree. U nekim izvođenjima iRNK može sadržati jednu ili više modifikacija koje doprinose stabilnosti iRNK (npr, u odnosu na originalni tip ili prirodan tip iRNK) i može takođe sadržati jednu ili više modifikacija u odnosu na originalni tip koja koriguje defekt koji je ukazuje i u vezi je sa pogoršanom ekspresijom proteina. Na primer, nukleinske kiseline prema prikazanom pronalasku mogu sadržati modifikacije u jednom ili oba 5‘ i 3’ netranslatirajućim regionima. Takve modifikacije mogu uključiti, ali nisu ograničene samo na njih, uključivanje parcijalnih skevenci citomegalovirusnog (CMV) neposrednog-ranog 1 (IE1) gena, poli A kraja, Cap 1 strukture ili sekvence koja kodira humani hormon rasta (hGH))

[0009] Postupci lečenja subjekta su takođe opisanii, pri čemu je kod subjekta prisutna deficijencija proteina ili enzima. Postupci mogu podrazumevati primenu kompozicija koje su ovde obezbeđene. Na primer, opisani su postupci lečenja ili prevencije stanja u kojima je proizvodnja određenog proteina i/ili upotreba određenog proteina neadekvatna ili ugrožena. U jednom primeru primene, postupci koji su ovde opisani mogu biti upotrebljeni za lečenje subjekta sa deficijencijom jednog ili više enzima iz ciklusa uree. Postupak se može sastojati od kontakta i transfekcije ciljnih ćelija ili tkiva (kao što su hepatociti deficijentni u jednom ili više enzima iz ciklusa uree) sa kompozicijom koja je ovde obezbeđena, pri čemu nukleinska kiselina kodira enzim iz ciklusa uree koji je deficijentan. Na navedeni način, ekspesija deficijentnog proteina u ciljnoj ćeliji se povećava, a očekuje se da navedeno poboljša efekte deficijencije koja se nalazi u osnovi poremećaja. Protein ili enzim koji se eksprimira od strane ciljne ćelije, translacijom iRNK, može biti zadržan unutar citosola ciljne ćelije ili, alternativno, može biti sekretovan van ćelije. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina je iRNK. U pojedinim primerima primene, iRNK sadrži modifikaciju koja obezbeđuje stabilnost iRNK koda (npr. u odnosu na stabilnost originalne ili nativne verzije iRNK). Na primer, iRNK koja kodira funkcionalni enzim može sadržavati jednu ili više modifikacija jednog ili oba od 5' i 3' netranslatirajućih regiona.

[0010] U poželjnom izvođenju, nukleinske kiseline (npr.iRNK) koje su ovde obezbeđene su formulisane kao lipidni ili lipozomalni nosač transfera da bi se olakšala isporuka u ciljnu ćeliju i/ili stabilizovala nukleinskih kiselina koju nosač sadrži. Razmatrani nosači transfera koji su uzeti u obzir mogu sadržati jedan ili više katjonskih lipida, nekatjonskih lipida i lipida modifikovanih sa PEG. Na primer, nosač transfera može sadržavati smešu lipida CHOL, DOPE, DLinDMA i DMG-PEG-2000. U drugom primeru primene, nosač transfera može sadržavati lipide ICE, DOPE i DMG-PEG-2000. U još jednom primeru primene, nosač transfera može da sadrži jedan ili više lipida izabranih iz grupe koju čine ICE, DSPC, CHOL, DODAP, DOTAP i C8-PEG-2000 ceramid. U poželjnom izvođenju, nosač transfera je lipozom ili lipidna nanočestica koji je sposoban da se prioritetno distribuira u ciljne ćelije i tkiva in vivo.

[0011] Postupci ekspresije funkcionalog proteina ili enzima (npr. enzima ciklusa uree) u ciljnoj ćeliji su takođe obezbeđeni. U nekim izvođenjima, ciljnoj ćelije nedostaje enzim ciklusa uree. Postupci obuhvataju dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa kompozicijom koja sadrži iRNK i nosač tranfera. Nakon ekspresije proteina ili enzima koga kodira iRNK, eksprimirani protein ili enzim se može zadržati u citosolu ciljne ćelije ili se, alternativno, može sekretovati van ćelije. U pojedinim primerima primene, iRNK kodira enzim iz ciklusa uree. U pojedinim primerima primene, iRNK može da sadrži jednu ili više modifikacija koje obezbeđuju stabilnost iRNK i takođe može da sadrži jednu ili više modifikacija u odnosu na originalnu iRNK koje koriguju defekte za koje je pokazano da su asocirani sa aberantnom ekspresijom proteina. U pojedinim primerima primene, kompozicije i postupci predmetnog pronalaska se oslanjaju na ciljne ćelije da eksprimiraju funkcionalan protein koga kodira egzogeno davana nukleinska kiselina (npr. iRNK). Pošto se protein ili enzim koga kodira egzogena iRNK translatira u ciljnoj ćeliji, eksprimirani proteini i enzimi mogu biti okarakterisani kao manje imunogeni u odnosu na njihove rekombinanto pripremljene parnjake.

[0012] Takođe su obezbeđene kompozicije i postupci korisni za olakšavanje transfekcije i dostavljanja jedne ili više nukleinskih kiselina (npr., iRNA) u ciljane ćelije. Na primer, kompozicije i postupci prema prikazanom pronalasku su uzeli u obzir upotrebu ciljajućih liganada koji su u stanju da poboljšaju afinitet kompozicije prema jednoj ili više ciljnih ćelija. U jednom izvođenju, ciljajući ligand je apolipoprotein-B ili apolipoprotein-E i odgovarajuće ciljne ćelije ekspimuju lipoproteinske receptore niske gustine, na taj način olakšavajući prepoznavaljenje ciljajućeg liganda. Postupci i kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu biti korišećene za preferencijalnu metu kao ogroman broj ciljnih ćelija. Na primer, razmatrane ciljne ćelije uključuju, ali bez ograničenja, hepatocite, epitelne ćelije, hematopoietske ćelije, epitelne ćelije, endotelijalne ćelije, plućne ćelije, koštane ćelije, stem ćelije, mezenhimalne ćelije, neutralne ćelije, srčane ćelije, adipocite, ćelije vaskularnih glatkih mišića , kardiomiocite, skeletne mišićne ćelije, beta ćelije, hipofizne ćelije, ćelije sinovijalne opne, ćelije jajnika, ćelije testisa, fibroblasta, B ćelija, T ćelija, retikulocite, leukocite, granulocite i ćelije tumora.

[0013] Prethodno diskutovane i mnoge druge karakteristike i prateće prednosti predmetnog pronalaska će postati lakše za razumevanje nakon detaljnog opisa pronalaska koji sledi, kao i pridruženih primera pronalaska. Različita ovde opisana izvođenja su komplementarna i mogu biti kombinovana ili korišćena zajedno na način koji razume stručnjak iz ove oblasti u odnosu na sadržaj ovog opisa.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0014]

Nacrt 1 ilustruje sintezu imidazolnog lipidnog estra holesterola, ICE.

Nacrt 2 ilustruje prisustvo aktivnosti luciferaze svica proizvedene isporukom egzogene iRNK u jetre i slezine tretiranih i netretiranih CD-1 miševa.

Nacrt 3 ilustruje in situ hibridizaciju kodon optimizovane (CO) iRNK luciferaze svica (FF) u jetrama kontrolnih i tretiranih (BI i B2) miševa koja se uočava na rendgenskom filmu pod malim (2X) uvećanjem. (A) predstavlja bojenje preseka jetri kontrolnih (Ct) i tretiranih B1 i B2 miševa krezilljubičastom bojom; (B) predstavlja rentgenski film autoradiografske detekcije CO-FF luciferazne iRNK, sa “antisens” probama, u jetrama B1 i B2 miševa; i (C) predstavlja kontrolnu (“sens”) hibridizaciju. Skraćenice "cv", "as" i "s" se odnose na krezil-ljubičasto, ”antisens” i “sens”, tim redom.

Nacrt 4 ilustruje obeležavanje kodon optimizovane iRNK za luciferazu svica u jetrama tretiranih (B1) i kontrolnih miševa. (A) predstavlja emulzionu autoradiografsku detekciju CO-FF luciferazne iRNK na presecima jetre B1 miševa koja se uočava kao svetlo obeležavanje pod mikroskopom sa tamnim osvetljenjem polja; (B) predstavlja isti region koji je prikazan pod (A), slikan na svetlosnom mikroskopu nakon upotrebe krezil-ljubičaste kao kontrastne boje; (C) predstavlja preseke jetre B1 miševa tretirane sa kontrolnom (“sens”) riboprobom CO-FF luciferaze čime se utvrđuje nivo nespecifičnog obeležavanja; (D) predstavlja isti region koji je prikazan pod (C), slikan na svetlosnom mikroskopu; (E) predstavlja presek kontrolne jetre netretirane životinje koji je tretiran “antisens” probom za CO-FF luciferazu; nije utvrđeno prisustvo signala; (F) predstavlja isti region koji je prikazan pod (E), slikan na svetlosnom mikroskopu; (G) predstavlja presek kontrolne jetre tretirane kontrolnom (“sens”) riboprobom za CO-FF luciferazu čime se utvrđuje nivo nespecifičnog obeležavanja; i (H) predstavlja isti region koji je prikazan pod (G), slikan na svetlosnom mikroskopu. Skraćenice "BD", "HA", "H", "PV", "as" i "s" se odnose na žučni kanal, hepatičnu arteriju, hepatocit, portnu venu, “antisens” i “sens”, tim redom. Uvećanje: 100X.

Nacrt 5 ilustruje imunohistohemijsko bojenje jetri miša zarad detekcije proteina luciferaze svica. (A) predstavlja negativno bojenje na luciferazu u kontrolnoj jetri miša tretiranog sa 1xPBS puferom (20X); (B) predstavlja pozitivnu rekaciju detekcije proteina luciferaze upotrebom imunohistohemijskih postupaka koji se baziraju na fluorescenci, a koja prikazuje da se protein luciferaze svica uočava u hepatocitima (20X), kao i u malom broju sinusoidalnih endotelijanih ćelija koje su takođe bile pozitivne na protein luciferaze; (C) predstavlja pozitivno bojenje na protein luciferaze svica pod većim uvećenjem (40X). Protein luciferaze se uočava širom citoplazme hepatocita. Skraćenice (S) i (H) se odnose na sinusoidalne ćelije i hepatocite, tim redom.

Nacrt 6 prikazuje nukleotidnu sekvencu iRNK CO-FF luciferaze (SEQ ID NO: 1).

Nacrt 7 prikazuje nukleotidne sekvence 5' CMV sekvence (SEQ ID NO: 2) i 3' hGH sekvence (SEQ ID NO: 3) koje mogu biti upotrebljene kao bočne sekvence za iRNK sekvencu od interesa.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0015] Ovde su predviđene kompozicije koje olakšavaju dopremanje nukleinskih kiselina do ciljnih ćelija, kao i njihovu potonju transfekciju. Posebno, kompozicije koje su ovde obezbeđene su korisne za lečenje oboljenja koje nastaju usled deficijentne proiozvodnje proteina i/ili enzima. Na primer, pogodne bolesti koje se mogu lečiti predstavljaju one u kojima genetska mutacija u određenom genu uzrokuje da pogođene ćelije ne eksprimiraju, smanjeno eksprimiraju ili eksprimiraju nefunkcionalan proizvod toga gena. Kontakt navedenih ciljnih ćelija sa kompozicijama predmetnog pronalaska koji omogućava da se ciljne ćelije transfektuju sa nukleinskom kiselinom koja kodira funkcionalnu verziju genskog proizvoda, omogućava proizvodnju funkcionalnog proizvoda proteina ili enzima, koji je koristan u lečenju navedne deficijencije.

[0016] Ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije za modulaciju ekspresije proteina u ciljnoj ćeliji. U nekim izvođenjima, kompozicija sadrži RNK molekul i nosač transfera. Kompozicije za povećanje ekspresije enzima iz ciklusa uree u ciljnoj ćeliji su takođe obezbeđeni. Kompozicije koje sadrže, na primer, iRNK i nosač transfera. iRNK kodira, na primer funkcionalni enzim ciklusa uree. U nekim izvođenjima, iRNK kompozicije može biti modifikovan da doprnese poboljšanoj stabilnosti (npr. relativno u odnosu na veriziju originalnog tipa iRNK i/ili verziju IRNk koja je nađena endogeno u ciljnoj ćeliji). Na primer, uRNK kompozicije može uključivati modifikacije u odnosu na verziju originalnog tipa iRNK, gde modifiakcije doprinose stabilnosti iRNK kompozcije

[0017] Obezbeđeni su postupci za ekspresiju enzima ciklusa uree u ciljnoj ćeliji. U nekim izvođenjima, ciljna ćelija je deficijena u enzimu ciklusa uree. Ovde obezbeđeni postupci obuhvataju dovođenje ciljne ćelije sa kompozicijom koja sadrži iRNK i nosač transfera, u kome iRNK kodira, jedan ili više enzima ciklusa uree. U pojedinim primerima primene, iRNK kompozicije je stabilnija od verzije originalnog tipa iRNK i/ili je stabilnija od verzije iRNK koja se nalazi endogeno u ciljnoj ćeliji.

[0018] Postupci lečenja subjekta sa deficijencijom enzima iz ciklusa uree su takođe opisani. Postupci podrazumevaju davanje kompozicije koja sadrži iRNK i nosač transfera, pri čemu iRNK kodira enzim iz ciklusa uree. U pojedinim primerima primene, iRNK kompozicije je stabilnija od originalne verzije iRNK i/ili je stabilnije od verzije iRNK koja se nalazi endogeno u ciljnoj ćeliji.

[0019] Ovde su obezbeđeni postupci i kompozicije za modulaciju nivoa mRNK i/ili ekspresije proteina. U nekim izvođenjima, ovde obezbeđene kompozicije su u stanju da moduliraju ekspresiju određenog proteina smanjivanjem ekspresije iRNk koja kodira taj protein u ciljnoj ćeliji ili tkivu. Na primer, u jednom izvođenju kompozicije sadrže mikroRNK ili nukleinsku kiselinu koja kodira mikroRNK gde je mikroRNK u stanju da smanji ili eliminiše ekspresiju naročito mRNK u ciljnoj ćeliji. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kompozicije je stabilnija (npr. ograničena nukleazna osetljivost) u poređenju sa originalnom i/ili endogenom verzijom nukleinske kiseline.

[0020] U kontekstu pronalaska, termin "nukleinska kiselina" se odnosi na genetski materijal (npr. oligonukleotide ili polinukleotide koji sadrže DNK ili RNK). U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kompozicije je iRNK. Pogodne RNK uključuju iRNK, siRNK, mikroRNK, snRNK i snoRNK. Razmatrane nukleinske kiseline takođe uključuju duge intergenske nekodirajuće RNK (lincRNK), koje generalno ne kodiraju protein, nego funkciju, na primer u imunom signaliziranju, biologiji stem ćelija i razvoju bolesti (videti, npr., Guttman, et al., 458: 223-227 (2009); i Ng, et al., Nature Genetics 42: 1035-1036 (2010).U poželjnom izvođenju, nukleinske kiseline prema pronalasku obuhvataju iRNK ili stabilizovane iRNK koje kodiraju protein ili enzim. Prikazani pronalazak razmatra upotrebu takvih nukelinskih kiselina (a naročito RNK ili stabilizovane RNK) kao terapeutika koji je sposoban da olakša ekspresiju funkcionalnog enzima ili proteina, a posebno ekspresiju funkcionalnog enzima proteina koji je deficijentan kod subjekta (npr. enzima iz ciklusa uree). Termin "funkcionalan" se ovde upotrebljava da bi se kvalifikovao protein ili enzim, odnosno da bi se naznačilo da protein ili enzim ima biološku aktivnost, ili, alternativno, da je sposoban da ispoljava istu ili sličnu funkciju kao nativan ili normalno funkcionalan protein ili enzim. Predmente kompozicije nukleinske kiseline predmetnog pronalaska su korisne za lečenje raznih metaboličkih ili genetskih poremećaja, a posebno onih genetskih ili metaboličkih poremećaja koji uključuju odsustvo ekspresije, pogrešnu ekspresiju ili deficijenciju proteina ili enzima.

[0021] U kontekstu predmetnog pronalaska, termin "ekspresija" se upotrebljava u svom najširem smislu da bi se naznačila bilo transkripcija specifičnog gena ili nukleinske kiseline u najmanje jedan transkript iRNK ili pak translacija najmanje jedne iRNK ili nukleinske kiseline u protein ili enzim. Na primer, razmatrane kompozicije predmetnog pronalaska predstavljaju kompozicije koje sadrže jednu ili više iRNK nukleinskih kiselina koje kodiraju funkcionalne proteine ili enzime, a u kontekstu navedenih iRNK nukleinskih kiselina, termin ekspresija se odnosi na translaciju navedene iRNK da bi se proizveo protein ili enzim koji je njome kodiran.

[0022] Nukleinske kiseline ovde obezbeđene mogu biti unete u ćelije ili tkiva od interesa. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina je u stanju da eksprimuje (npr., transkripcijom iRNA iz gena), translatira (npr., translacija kodiranih proteina ili enzima iz sintetičkih ili egzogenih iRNK transkripta) ili na drugi način je u stanju da doprinosi korisnim osobinama ciljnim ćelijama ili tkivu (npr., smanjenjem ekspresije ciljane nukleinske kiseline ili gena). Nukleinska kiselina može kodirati, na primer, hormon, enzim, receptor, polipeptid, peptid ili drugi protein od interesa. Nukleinska kiselina može takođe kodirati male interferirajuće RNK (siRNA) ili antisens RNK za svrhe smanjenje ili eliminisanje ekspresije endogene nukleinske kiseline ili gena. U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, nukleinska kiselina (npr. iRNK koja kodira deficijentan protein) može opciono sadržavati hemijske ili biološke modifikacije koje, na primer, poboljšavaju stabilnost i/ili poluživot navedene nukleinske kiseline ili koje poboljšavaju ili na drugačiji način olakšavaju translaciju.

[0023] Nukleisnke kiseline prema prikazanom pronalasku mogu biti prirodne ili rekombinantne po svojoj prirodi i mogu pokazivati njihovi terapeutsku aktivnost pomoću ili sens ili antisens mehanizama dejstva.

[0024] Predmetni pronalazak takođe razmatra istovremenu isporuku jedne ili više jedinstvenih nukleinskih kiselina u ciljne ćelije, na primer, kombinovanjem dve jedinstvene nukleinske kiseline u jedan nosač tranfera. U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, prva terapijska nukleinska kiselina, kao što je iRNK koja kodira galaktoza-1-fosfat uridiltransferazu (GALT), i druga terapijska nukleinska kiselina, kao što je iRNK koja kodira galatokinazu (GALK), mogu biti formulisane u jedan nosač transfera i primenjene kao takve (npr. za lečenje galaktozemije). Predmetni pronalazak takođe razmatra istovremenu isporuku i/ili istovremenu primenu prve terapijske nukleinske kiseline i druge nukleinske kiseline radi olakšavanja i/ili poboljšanja funkcije ili isporuke prve terapijske nukleinske kiseline. Na primer, navedena druga nukleinska kiselina (npr. egzogena ili sintetska iRNK) može kodirati membranski transporterski protein koji nakon ekspresije (npr. translacije egzogene ili sintetske iRNK) olakšava dopremanje ili pojačava biološku aktivnost prve nukleinske kiseline. Alternativno, prva terapijska nukleinska kiselina može biti primenjena sa drugom nukleinskom kiselinom koja, na primer, funkcioniše kao "šaperon" zarad usmeravanja načina na koji se uvija bilo prva terapijska nukleinska kiselina ili endogene nukleinske kiseline.

[0025] Pronalazak takođe razmatra isporuku jedne ili više terapijskih nukleinskih kiselina za lečenje pojedinačnog poremećaja ili deficijencije, pri čemu svaka navedena terapijska nukleinska kiselina funkcioniše drugim mehanizmom dejstva. Na primer, kompozicije predmetnog pronalaska mogu sadržavati prvu terapijsku nukleinsku kiselinu, na primer koja se primenjuje da bi se korigovala deficijencija endogenog proteina ili enzima, a što dalje prati isporuka druge nukleinske kiseline koja se primenjuje da bi se deaktivirali ili "izbacili" (“knock-down”) endogena nukleinska kiselina koja nepravnilno funkcioniše i njen proteinski ili enzimski proizvod. Navedene nukleinske kiseline mogu kodirati, na primer, iRNK i siRNK.

[0026] Dok in vitro transkribovane nukleinske kiseline (npr. iRNK) mogu biti transfektovane u ciljne ćelije, navedene nukleinske kiseline se lako i efikasno degradiraju od strane ćelije in vivo čime navedene nukleinske kiseline postaju neefikasne. Štaviše, pojedine nukleinske kiseline su nestabilne u telesnim tečnostima (posebno u humanom serumu) i mogu biti degradirane pre stizanja do ciljne ćelije. Dodatno, unutar ćelije, prirodna iRNK može biti degradirana uz poluživot od između 30 minuta i nekoliko dana.

[0027] Nukleinske kiseline koje su ovde obezbeđene i naročito tipa iRNK koje su ovde obezbeđene zadržavaju bar neku sposobnost da budu translatirane, čime dolazi do proizvodnje funkcionalnog proteina ili enzima unutar ciljne ćelije. Prema tome, predmetni pronalazak se odnosi na primenu stabilizovane nukleinske kiseline (npr. iRNK koja je stabilizovana u odnosu na in vivo digestiju ili degradaciju nukleazama) koja moduliše ekspresiju gena ili translaciju funkcionalnog enzima ili proteina unutar ciljne ćelije. U prioritetnom primeru primene predmetnog pronalaska, aktivnost nukleinske kiseline (npr. iRNK koja kodira funkcionalni protein ili enzim) se zadržava tokom dužeg vremenskog perioda. Na primer, aktivnost nukleinskih kiselina može biti produžena tako da se kompozicije predmetnog pronalaska primenjuju subjektu dva puta nedeljno ili na dve nedelje, a još prioritetnije na mesečnom, dvomesečnom, tromesečnom ili godišnjem nivou. Proširena ili produžena aktivnost kompozicija predmetnog pronalaska, a posebno iRNK koja je sadržana u njima, je u direktnoj vezi sa količinom funkcionalnog proteina ili enzima koji se translatira sa navedene iRNK. Slično tome, aktivnost kompozicija predmetnog pronalaska se može dalje proširiti ili produžiti modifikacijama koje se sprovode tako da se poboljša ili pojača translacija iRNK nukleinskih kiselina. Na primer, tzv. Kozak konsenzusna sekvenca ima ulogu u inicijaciji translacije protiena, a uključivanje navedene Kozak konsenzusne sekvence u iRNK nukleinsku kiselinu predmetnog pronalaska može dalje proširiti ili produžiti aktivnost iRNK nukleinskih kiselina. Štaviše, količina funkcionalnog proteinaili enzima koji se translatira od strane ciljne ćelije je u funkciji količine nukleinske kiseline (npr. iRNK) koja se doprema ciljnim ćelijama, kao i stabilnosti navedene nukleinske kiseline. Do obima u kome se stabilnost kompozicije nukleinske kiseline predmetnog pronalaska može poboljšati ili pojačati, može se dalje produžiti poluživot, aktivnost prevedenog proteina ili enzima i frekvencija doziranja kompozicije.

[0028] Shodno navedenom, u prioritetnom primeru primene, nukleinske kiseline koje su ovde obezbeđene sadrže najmanje jednu modifikaciju koja obezbeđuje povećanu ili poboljšanu stabilnost nukleinske kiseline, uključujući, na primer, poboljšanu otpornost na digestiju nukleazama in vivo. U kontekstu pronalaska, termini "modifikacija" i "modifikovan" kao takvi se odnose na nukleinske kiseline koje su ovde obezbeđene, uključuju najmanje jednu izmenu koja prioritetno poboljšava stabilnost i čini nukleinsku kiselinu stabilnijom (npr. otpornom na digestiju nukleazama) u odnosu na stabilnost originalne ili verzije nukleinske kiseline koja se javlja u prirodi. U kontekstu pronalaska, termini "stabilan" i "stabilnost" kao takvi se odnose na nukleinske kiseline predmetnog pronalaska, a posebno na iRNK, i označavaju povećanu ili pojačanu otpornost na degradaciju, na primer, nukleazama (tj. endonukleazama ili egzonukleazama) koje su normalno sposobne da degradiraju navedenu RNK. Povećana stabilnost može podrazumevati, na primer, smanjenu osetljivost na hidrolizu ili na druge načine degradacije endogenim enzimima (npr. endonukleazama ili egzonukleazma) ili smanjenu osetljivost na uslove unutar ciljne ćelije ili tkiva čime se povećava ili poboljšava opstanak navedenih nukleinskih kiselina u ciljnoj ćeliji, tkivu, subjektu i/ili citoplazmi. Stabilizovane molekule nukleinskih kiselina koji su ovde obzbeđeni karakterišu duži poluživoti u odnosu na njihove prirodno nastale, nemodifikovane parnjake (na primer, originalnu verziju nukleinske kiseline). Temini "modifikacija" i "modifikovan" kao takvi se takođe odnose na nukleinske kiseline predmetnog pronalaska sa izmenama koje poboljšavaju ili pojačavaju translaciju iRNK nukleinskih kiselina, uključujući, na primer, uključivanje sekvenci sa funkcijom u inicijaciji translacije proteina (npr. Kozak konsenzusne sekvence). (Kozak M.,Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987)).

[0029] U pojedinim primerima primene, nukleinske kiseline predmetnog pronalaska se podvrgavaju hemijskoj ili biološkoj modifikaciji da bi postale stabilnije. Modifikacije nukleinske kiseline za primer uključuju depleciju baze (npr. delecijom ili supstitucijom jednog nukleotida drugim) ili modifikaciju baze, na primer, hemijsku modifikaciju baze. Fraza "hemijske modifikacije", kako se ovde koristi, podrazumeva modifikacije koje uvode hemijske supstance koje se razlikuju od onih koje se javljaju u prirodnim nukleinskim kiselinama, na primer, kovalentne modifikacije poput uvođenja modifikovanih nukleotida (npr. nukleotidnih analoga ili uključivanje bočnih grupa koja se ne javljaju u prirodi u navedene molekule nukleinske kiseline).

[0030] Pored navedenog, pogodne modifikacije podrazumevaju izmene u jednom ili u više nukleotida u okviru kodona, a tako da kodon kodira istu aminokiselinu ali je stabilniji od kodona koji se nalazi u originalnoj verziji nukleinske kiseline. Na primer, pokazan je inverzan odnos između stabilnosti RNK i visokog broja ostataka citidina (C) i/ili uridina (U), a utvrđeno je da su RNK bez C i U ostataka stabilne na dejstvo većine RNaza (Heidenreich i saradnici, J Biol Chem 269, 2131-8 (1994)). U pojedinim primerima primene, broj C i/ili U ostataka u iRNK sekvenci je smanjen. U drugom primeru primene, broj C i/ili U ostataka je smanjen supstitucijom jednog kodona koji kodira određenu amino kiselinu sa drugim kodonom koji kodira istu ili srodnu amino kiselinu. Razmatrane modifikacije iRNK nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska takođe podrazumevaju ugradnju pseudouridina. Ugradnja pseudouridina u iRNK nukleinske kiseline predmetnog pronalaska može povećati stabilnost i kapacitet translacije, kao i smanjiti imunogenost in vivo. (Pogledati, npr. publikaciju Kariko K. i saradnici, Molecular Therapy 16 (11): 1833-1840 (2008)). Supstitucije i modifikacije nukleinskih kiselina predmetnog pronalaska mogu biti izvedene postupcima koji su dobro poznati prosečno iskusnim stručnjacima iz oblasti.

[0031] Ograničenja u smanjenju broja C i U ostataka u sekvenci će verovatno biti veća unutar kodirajućeg regiona iRNK, a u poređenju sa smanjenjima u netranslatirajućim regionom (tj. verovatno neće biti moguće uklanjanje svih C i U ostataka koji su prisutni u kodirajućem region uz zadržavanje sposobnosti iRNK da kodira željenu aminokiselinsku sekvencu). Degeneracija genskog koda, međutim, predstavlja prilika da se omogući smanjenje broja C i/ili U ostataka koji su prisutni u sekvenci uz zadržavanje istog kapaciteta kodiranja (tj. u zavisnosti od toga koja amino kiselina je kodirana kodonom, može biti moguće nekoliko različitih modifikacije RNK sekvenci). Na primer, kodoni za Gly mogu biti promenjeni u GGA ili GGG umesto GGU ili GGC.

[0032] Termin modifikacija takođe podrazumeva, na primer, ugradnju veza u sekvence nukleinske kiseline predmetnog pronalaska koje ne predstavljaju veze između nukleotida ili pak ugradnju modifikovanih nukleotida (npr. modifikacije na jednom ili na oba od 3' i 5' krajeva iRNK molekula koji kodiraju funkcionalan protein ili enzim). Navedene modifikacije uključuju adiciju baza u sekvencu nukleinske kiseline (npr. uključivanje poli A repa ili dužeg poli A repa), promenu 3’ netranslatirajuće (UTR od engl. un-translated) ili 5' UTR sekvence, obrazovanje kompleksa nukleinske kiseline sa agensom (npr. proteinom ili komplementarnim molekulom nukleinske kiseline), kao i uključivanje elemenata koji menjaju strukturu molekula nukleinske kiseline (npr. onih koji obrazuju sekundarne strukture).

[0033] Smatra se da poli A rep stabilizuje prirodne informacione RNK i sintetske “sens” RNK. Stoga, u jednom primeru primene, na molekul iRNK može biti dodat dugi poli A rep čime RNK postaje stabilnija. Poli A rep može biti dodat upotrebom raznih tehnika koje su poznate u stanju tehnike. Na primer, dugi poli A repovi mogu biti dodati na sintetske ili in vitro transkribovane RNK upotrebom poli A polimeraze (Yokoe i saradnici, Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). Transkripcija vektora takođe može kodirati duge poli A repove. Dodatno, poli A repovi mogu biti dodati transkripcijom direktno sa PCR proizvoda. Poli A može biti i ligiran na 3’ kraj “sens” RNK upotrebom RNK ligaze (pogledati, npr. Laboratorijski priručnik molekularnog kloniranja, 2. izd., izd. Sambrook, Fritsch i Maniatis (Cold Spring Harbour Laboratory Press: izdanje 1991)). U jednom primeru primene, dužina poli A repa iznosi najmanje oko 90, 200, 300, 400 ili najmanje 500 nukleotida. U jednom primeru primene, dužina poli A repa je prilagođena tako da kontroliše stabilnost modifikovanog “sens” iRNK molekula pronalaska i, stoga, transkripciju proteina. Na primer, obzirom da dužina poli A repa može uticati na poluživot “sens” iRNK molekula, dužina poli A repa se može prilagoditi tako da se modifikuje nivo otpornosti iRNK na nukleaze i da se time kontroliše vremenski tok ekspresije proteina u ćeliji. U jednom primeru primene, stabilizovani molekuli nukleinske kiseline su dovoljno otporni na in vivo degradaciju (npr. nukleazama), tako da se isti mogu biti dopremljeni do ciljne ćelije bez upotrebe nosača transfera.

[0034] U jednom primeru primene, nukleinska kiselina koja kodira protein može biti modifikovana ugradnjom 3’ i/ili 5' netranslatirajuće (UTR) sekvence koje se prirodno ne nalazi u originalnoj nukleinskoj kiselini. U jednom primeru primene, 3’ i/ili 5' bočna sekvenca koja se u prirodno nalazi bočno u odnosu na iRNK i kodira drugi nesrodan protein, može biti ugrađena u nukleotidnu sekvencu iRNK molekula koji kodira terapijski ili funkcionalni protein da bi je modifikovala. Na primer, 3’ ili 5' sekvence iz iRNK molekula koji su stabilni (npr. globina, aktina, GAPDH, tubulina, histona ili enzima ciklusa limunske kiseline) mogu biti ugrađene u 3’ i/ili 5' region molekula “sens” iRNK nukleinske kiseline da bi se povećala stabilnost “sens” iRNK molekula.

[0035] Predmetni pronalazak razmatra i modifikacije sekvenci nukleinske kiseline koje su uvedene na jedan ili na oba od 3’ i 5' krajeva nukleinske kiseline. Na primer, predmetni pronalazak razmatra modifikacije 5’ kraja nukleinskih kiselina (npr.iRNK) da bi se uključila delimična sekvenca neposredno-ranog 1 (IE1) gena CMV ili njegov fragment (npr. SEQ ID NO: 2) radi poboljšanja otpornosti na nukleaze i/ili radi produžavanja poluživota nukleinske kiseline. Pored povećanja stabilnosti sekvence iRNK nukleinske kiseline, iznenadjujuće je otkriveno da uključivanje parcijalne sekvence neposredno-ranog 1 (IE1) gena CMV pojačava translaciju iRNK i ekspresiju funkcionalnog proteina ili enzima. Takođe se razmatra uključivanje sekvence koja kodira humani hormon rasta (hGH) ili njenog fragmenta (npr. SEQ ID NO: 3) na jedan ili na oba od 3’ i 5' krajeva nukleinskih kiselina (npr. iRNK) da bi se dalje stabilizovala nukleinska kiselina. U principu, prioritetne modifikacije poboljšavaju stabilnost i/ili farmakokinetička svojstva (npr. poluživot) nukleinske kiseline u odnosu na njene nemodifikovane parnjake, i uključuju, na primer, modifikacije uvedene tako da se poboljša navedena otpornost nukleinske kiseline na digestiju nukleazama in vivo.

[0036] U pojedinim primerima primene, kompozicija može sadržavati stabilizujući reagens. Kompozicije mogu uključivati jedan ili više reagensa za formulisanje koji se direktno ili indirektno vezuju za i stabilizuju nukleinsku kiselinu, čime se povećava vreme opstanka u citoplazmi ciljne ćelije. Navedeni reagensi prioritetno dovode do poboljšanja poluživota nukleinske kiseline u ciljnim ćelijama. Na primer, stabilnost iRNK i efikasnost translacije mogu biti povećani ugradnjom "stabilizujućih reagenasa" koji obrazuju komplekse sa nukleinskim kiselinama (npr. iRNK) koja se prirodno javlja unutar ćelije (pogledati npr. SAD patentni spis br.5677124). Ugradnja stabilizujućeg reagensa može biti postignuta, na primer, kombinovanjem poli A i proteina sa iRNK da bi se iRNK stabilizovala in vitro pre pakovanja ili inkapsulacije u nosač transfera. Stabilizujući reagensi za primer podrazumevaju jedan ili više proteina, peptida, aptamera, proteina koji omogućavaju pristup enzimima translacije, kao i iRNK vezujuće proteine i/ili faktore inicijacije translacije.

[0037] Stabilizacija kompozicija takođe može biti poboljšana upotrebom grupa koje inhibiraju opsonizaciju, a koji uobičajeno predstavljaju velike hidrofilne polimere koji su hemijski ili fizički vezani za nosač transfera (npr. interkalacijom domena za usidravanje koji je rastvorljiv u lipidima u samu membranu, ili pak direktnim vezivanjem za aktivne grupe membranskih lipida). Navedeni hidrofilni polimeri koji inhibiraju opsonizaciju obrazuju zaštitni površinski sloj koji značajno umanjuje preuzimanje lipozoma od strane makrofagno-monocitnog sistema i retikulo-endotelijalnog sistema (npr. kao što je opisano u Patetnom spisu SAD br.4,920,016 čije je sadržaj ovde u celini uključen kao referenca). Nosač transfera koji je modifikovan grupama koje inhibiraju opsonizaciju ostaje stoga u cirkulaciji znatno duže u odnosu na njegove nemodifikovane parnjake.

[0038] Kada RNK hibridizuje sa komplementarnim molekulom nukleinske kiseline (npr. DNK ili RNK), ona može biti zaštićena od dejstva nukleaza (Krieg i saradnici, Melton. Methods in Enzymology.

1987; 155, 397-415). Stabilnost hibridizovane iRNK je verovatno posledica jedinstvene inherentne specifičnosti većine RNaza za jedan lanac. U pojedinim primerima primene, stabilizujući reagens koji je izabran za obrazovanje kompleksa sa nukleinskom kiselinom označava eukariotski protein (npr. protein sisara). U još jednom primeru primene, molekul nukleinske kiseline (npr. iRNK) za upotrebu u terapiji može biti modifikovana hibridizacijom sa drugim molekulom nukleinske kiseline. Ukoliko je čitav iRNK molekul hibridizovan sa komplementarnim molekulom nukleinske kiseline, inicijacija translacije može biti smanjena. U pojedinim primerima primene, 5’ netranslatirajući region i AUG start region iRNK molekula mogu opciono biti ostavljeni nehibridizovanima. Nakon inicijacije translacije, aktivnost odvijanja ribozomalnog kompleksa može biti funkcionalna, čak i pri visokom afinitetu dupleksa, tako da se translacija može nastaviti (Liebhaber J., Mo!. Biol. 1992; 226: 2-13; Monia i saradnici, J Biol Chem.1993; 268: 14514-22.)

[0039] Podrazumeva se da bilo koji od prethodno opisanih postupaka za poboljšanje stabilnosti nukleinskih kiselina može biti upotrebljen ili samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili sa više bilo kojih drugih postupka koji su prethodno opisani i/ili kompozicija.

[0040] U jednom primeru primene, kompozicije predmetnog pronalaska olakšavaju dopremanje nukleinskih kiselina do ciljnih ćelija. U pojedinim primerima primene, olakšavanje isporuke ciljnim ćelijama uključuje povećanje količine nukleinske kiseline koja dolazi u kontakt sa ciljnim ćelijama. U pojedinim primerima primene, olakšavanje isporuke ciljnim ćelijama uključuje smanjenje količine nukleinske kiseline koja dolazi u kontakt sa ćelijama koje nisu ciljne ćelije. U pojedinim primerima primene, olakšavanje isporuke ciljnim ćelijama uključuje omogućavanje transfekcije barem nekih ciljnih ćelija nukleinskom kiselinom. U pojedinim primerima primene, nivo ekspresije proizvoda koga kodira isporučena nukleinska kiselina je povećan u ciljnim ćelijama.

[0041] Nukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu opciono biti kombinovane sa reporterskim genom (npr. pozicioniranim ushodno ili nishodno od kodirajućeg regiona nukleinske kiseline) koji, na primer, olakšava određivanje stepena dopremanja nukleinske kiseline do ciljnih ćelija ili tkiva. Pogodni reporterski geni mogu uključivati, na primer, iRNK zelenog fluorescentnog protein (GFP iRNK, od engl. Green Fluorescent Protein), iRNK Renilla luciferaze (iRNK luciferaze), iRNK luciferaze svica ili bilo koju od njihovih kombinacija. Na primer, GFP iRNK može biti fuzionisana sa nukleinskom kiselinom koja kodira OTC iRNK da bi se olakšala potvrda lokalizacije iRNK u ciljnim ćelijama, tkivima ili organima.

[0042] U kontekstu pronalaska, termini "transfektovan" ili "transfekcija" označavaju unutarćelijsko uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju, ili prioritetno u ciljnu ćeliju. Uvedena nukleinska kiselina može biti stabilno ili tranzientno zadžavana u ciljnoj ćeliji. Izraz "efikasnost transfekcije" se odnosi na relativnu količinu nukleinske kiseline preuzetu od strane ciljne ćelije koja je predmet transfekcije. U praksi, efikasnost transfekcije se procenjuje količinom proizvoda reporterske nukleinske kiseline koja je eksprimirana od stane ciljnih ćelija nakon transfekcije. Prioritetne su kompozicije sa visokim efekasnostima transfekcije, a posebno one kompozicije koje minimizuju štetne efekte koji su posredovani transfekcijom ćelija i tkiva koji ne predstavljaju ciljne ćelije i tkiva. Kompozicije predmetnog pronalaska koje karakteriše visoka efikasnost transfekcije poboljšavaju verovatnoću da će odgovarajuće doze nukleinske kiseline biti dopremljene na mesto patologije, uz smanjenje potencijalnih sistemskih neželjenih efekata.

[0043] Ovde obezbeđene kompozicije mogu sadržati nosač transfera. U kontekstu pronalaska, termin "nosač transfera" obuhvata bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača, diluenata, ekscipijenasa i sličnih koji su u principu namenjeni za upotrebu prilikom primene biološki aktivnih agenasa, uključujući nukleinske kiseline. Kompozicije, a posebno nosači transfera koji su ovde opisani, su sposobni da dopreme nukleinske kiseline raznih veličina u ciljne ćelije ili tkiva. U jednom primeru primene predmetnog pronalaska, nosači transfera predmetnog pronalaska su sposobni da dopreme velike sekvence nukleinske kiseline (npr. nukleinske kiseline od najmanje 1 kDa, 1,5k Da, 2 kDa, 2,5 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25kDa, 30 kDa ili više). Nukleinske kiseline mogu biti formulisane sa jednim ili sa više prihvatljivih reagensa koji obezbeđuju nosač za dopremanje navedenih nukleinskih kiselina do ciljnih ćelija. Pogodni reagensi se, u principu, biraju uzimajući u obzir niz faktora, koji uključuju, između ostalog, biološka ili hemijska svojstva nukleinskih kiselina (npr. naelektrisanje), nameravan način primene, očekivano biološko okruženje kome će navedene nukleinske kiseline biti izložene, kao i specifična svojstva ciljnih ćelija do kojih se dopremanje namerava. U pojedinim primerima primene, nosači transfera, kao što su lipozomi, inkapsuliraju nukleinske kiseline bez ugrožavanja biološke aktivnosti. U pojedinim primerima primene, nosač transfera pokazuje preferencijalno i/ili značajno vezivanje za ciljnu ćeliju u odnosu na ćelije koje nisu ciljne. U prioritetnom primeru primene, nosač transfera doprema svoj sadržaj ciljnoj ćeliji tako da se nukleinske kiseline doprema u odgovarajući subćelijski odeljak, kao što je citoplazma.

[0044] U nekim izvođenjima, nosač transfera predmetnog pronalaska označava lipozomalnu vezikulu ili drugo sredstvo koje olakšava prenos nukleinske kiseline do ciljne ćelije i tkiva. Pogodni nosači transfera uključuju, ali bez ograničenja, lipozome, nanolipozome, nanolipozome koji sadrže ceramid, proteolipozome, nanočestice, kalcijum fosfor-silikatne nanočestice, kalcijum fosfatne nanočestice, silicijum dioksid nanočestice, nanokristalne čestice, poluprovodne nanočestice, poli(D-arginin), nanodendrimere, sisteme za dostavljanje na bazi skroba, micele, emulzije, niozome, plazmide, viruse, kalcijum fosfatne nukleotide, aptamere, peptide i druge vektroske oznake. Takođe je razmatrana upotreba bionanokapsula i drugih virusnih spojeva proteina kaspida kao pogodnih nosača transfera. (Hum. Gene Ther. 2008 Sep;19(9):887-95). U poželjnom izvođenju prema prikazanom pronalasku, nosač transfera je formulisana kao lipidna nanočestica. Ovde korišćena fraza "lipidna nanočestica" odnosi se na nosač transfera koji sadrži jedan ili više lipida (npr., katjonske i/ili nekatjonske lipide). Poželjno, lipidne nonočestice su formulsiane da dostave jednu ili više nukleinskih kiselina (npr., iRNA) u jednu ili više ciljnih ćeljija ili tkiva. Upotreba lipida, ili samih ili kao komponenta nosača transfera, i naročito je poželjna lipidna nanočestica. Primeri pogodnih lipida uključuju, na primer, fosfatidilna jedinjenja (npr. fosfatidilglicerol, fosfatidilholin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, sfingolipide, cerebrozide, i gangliozide). Takođe je razmatrana upotreba polimera kao nosača transfera, bilo sama ili u kombinaciji sa drugim nosačima transfera. Pogodni polimeri mogu uključivati, na primer, poliakrilate, polialkicijanoakrilate, polilaktide, polilaktidpoliglikolidne kopolimere, polikaprolacktone, dekstran, albumin, želatin, alginat, kolagen, hitosan, ciklodekstrine i polietilenimine. U jednom izvođenju, nosač transfera je izabran na osnovu njegove sposobnosti da olakša transfekciju nukleinskih kiselina u ciljanu ćeliju.

[0045] U jednom izvođenju prikazanog pronalska, nosač transfera može biti izabran i/ili pripremljen tako da optimizuje dopremanje nukleinske kiseline do ciljne ćelije, tkiva ili organa. Na primer, ako karakteristike nosača transfera (npr. veličina, naelektrisanje i/ili pH) mogu biti optimizovani tako da dopremanje navedenog nosača za transfer bude efikasno do ciljne ćelije ili organa, da se smanji imunološki klirens i/ili podstakne zadržavanje u datom ciljnom organu. Alternativno, ukoliko je ciljno tkivo centralni nervni sistem (npr., iRNA davana u lečenju neurodegenerativnih bolesti može specifično ciljati mozak ili tkivo kičme) odabir i prirpemanje nosača transfera mora uzeti u obzir prodiranje i zadržavanje u krvno moždanoj barijeri i/ili upotrebu alternativnih sredstava direktnog davanja takvih nosača transfera u takva ciljna tkiva. U jednom izvođenju, kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu biti kombinovane sa sredstvima koja olakšavaju transfer egzogenih nukleisnkih kiselina (npr., sredstva koja ometaju ili poboljšavaju propustljivost krvno moždane barijere i tako pospešuju transfer egozogenih iRNA u ciljne ćelije).

[0046] Uporeba lipozomalnih nosača transfera za olakšavanje dostavljanja nuklenskih kiselina u ciljne ćelije je razmatrana u prikazanom pronalasku. Lipozomi (npr. lipozomalne lipidne nanopartikule) su uglavnom od koristi u raznim primenama u istraživanju, industriji i medicini, posebno prilikom njihove upotrebe kao nosača za transfer dijagnostičkih ili terapijskih jedinjenja in vivo (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998; Drummond i saradnici, Pharmacol. Rev., 5: 691-743, 1999), a obično se karakterišu kao mikroskopske vezikle sa unutrašnjim prostorom ispunjenim vodenom fazom i koji je odvojen od spoljašenjeg medijuma membranom koju zapravo čine jedna ili više dvoslojnih membrana. Dvoslojne membrane lipozoma se obično obrazuju od amfifilnih molekula poput lipida sintetskog ili pripodnog porekla koje čine prostorno razdvojeni hidrofilni i hidrofobni domeni (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). Dvoslojne membrane lipozoma se takođe mogu obrazovati od amfifilnih polimera i surfaktanata (npr. polimerozoma, niozoma, itd.).

[0047] U kontekstu predmetnog pronalaska, lipozomalni nosač transfera obično služi za transport nukleinske kiseline do ciljne ćelije. Za potrebe predmetnog pronalaska, lipozomalni nosači transfera se pripremaju tako da sadrže željene nukleinske kiseline. Postupak ugradnje željene nukleinske kiseline u lipozom se često označava kao "opterećivanje" (Lasic i saradnici, FEBS Lett., 312: 255-258, 1992). Nukleinske kiseline koje su ugrađene u lipozom mogu biti potpuno ili delimično locirane u unutrašnjem prostoru lipozoma, unutar dvoslojne membrane lipozoma, ili vezane za spoljnu površinu membrane lipozoma. Ugrađivanje nukleinske kiseline u lipozome se ovde takođe označava kao "inkapsulacija", pri čemu se nukleinska kiselina u potpunosti nalazi unutar unutrašnjeg prostora lipozoma.

[0048] Svrha ugradnje nukleinske kiseline u nosač transfera poput lipozoma često podrazumeva zaštitu nukleinske kiseline od okruženja koje može sadržavati enzime ili hemikalije koje razgrađuju nukleinske kiseline i/ili sisteme ili receptore koji dovode do brzog izlučivanja nukleinskih kiselina. Prema tome, u prioritetnom primeru primene predmetnog pronalaska, izabrani nosač transfera je sposoban da poboljša stabilnost nukleinske kiseline/nukleinskih kiselina (npr.iRNK koje kodiraju funkcionalni protein) koju sadrži u sebi. Lipozom može omogućiti da inkapsulirana nukleinska kiselina stigne do ciljne ćelije i/ili može preferencijalno omogućiti da inkapsulirana nukleinska kiselina stigne do ciljne ćelije ili pak, alternativno, ograničava isporuku navedenih nukleinskih kiselina na druga mesta ili do drugih ćelija gde prisustvo primenjenje nukleinske kiseline kiselina može biti beskorisno ili nepoželjno. Štaviše, ugradnja nukleinskih kiselina u nosač transfera, kao što je npr. katjonski lipozom, takođe olakšava dopremanje navedenih nukleinskih kiselina do ciljne ćelije.

[0049] Idealno, nosači transfera se pripremaju za inapsuliranje jedne ili više željenih nukleinskih kiselina (npr. iRNK koja kodira enzim iz ciklusa uree) tako da kompozicije ispoljavaju visoku efikasnost transfekcije i poboljšanu stabilnost. Dok lipozomi mogu olakšati uvođenje nukleinskih kiselina u ciljne ćelije, dodavanje polikatjona (npr. poli L-lizina i protamina), kao kopolimera, može olakšati, a u pojedinim slučajevima značajno povećati, efikasnost transfekcije nekoliko tipova katjonskih lipozoma za 2-28 puta u brojnim ćelijskim linijama kako in vitro tako i in vivo (pogledati N.J. Caplen i saradnici, Gene Ther.1995; 2: 603; S. Li i saradnici, Gene Ther.1997; 4, 891).

[0050] Prikazani pronalazak razmatra upotrebu katjonskih lipida i lipozoma za inkapsulaciju i/ili povećanje dopremanja nukleinskih kiselina do njihovih ciljnih ćelija i tkiva. U kontektu pronalaska, fraza "katjonski lipid" se odnosi na bilo koju od brojnih vrsta lipida sa pozitivnim neto naelektrisanjem na odabranom pH, kao što je fiziološki pH. Predviđeni lipozomalni nosači transfera i lipidne nanopartikule se mogu pripremiti uključivanjem višekomponentnih lipidnih smeša u različitim odnosima u kojima se koriste jedan ili više katjonskih lipida, nekatjonskih lipida i lipida modifikovanih sa PEG. Nekoliko katjonskih lipida je opisano u literaturi, od kojih su mnogi komercijalno dostupni. U pojedinim primerima primene, upotrebljava se katjonski lipid N-[1-(2,3-dioliloksi)propil] -N,N,N-trimetilamonijum hlorid ili "DOTMA" (Feigner i sar. (Proc. Nat'lAcad. Sci 84, 7413 (1987); Patentni spis SAD br. 4,897,355). DOTMA može biti formulisan samostalno ili može biti u kombinaciji sa dioleoilfosfatidiletanolaminom ili "DOPE" ili drugim katjonskim ili nekatjonskim lipidima u lipozomalnom nosaču transfera ili lipidnoj nanopartikuli, a navedeni lipozomi mogu biti upotrebljeni za poboljšanje isporuke nukleinskih kiselina u ciljne ćelije. Drugi pogodni katjonski lipidi uključuju, na primer, 5-karboksispermilglicindioktadecilamid ili "DOGS", 2,3-dioliloksi-N-[2(sperminkarboksamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminijum ili "DOSPA" (Behr i saradnici, Proc. Nat.'l Acad. Sci.86, 6982 (1989); Patentni spis SAD br.5,171,678; Patentni spis SAD br.5,334,761), 1,2-dioleoil-3-dimetilamonijum-propan ili "DODAP", 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan ili "DOTAP". Razmatrani katjonski lipidi takođe uključuju 1,2-disteariloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan ili "DSDMA", 1,2-dioliloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan ili "DODMA", 1,2-dilinoliloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan ili "DLinDMA", 1,2-dilinoleniloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan ili "DLenDMA", N-dioleil-N,N-dimetilamonijum hlorid ili "DODAC", N,N-distearil-N,N-dimetilamonijum bromid ili "DDAB", N-(1,2-dimiristiloksipropil-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroksietil amonijum bromid ili "DMRIE", 3-dimetilamino-2-(holest-5-en-3-beta-oksibutan-4-oksi)-1- (cis,cis-9,12-oktadekadienoksi)propan ili "CLinDMA", 2- [5’-(holest-5-en-3-beta-oksi)-3'-oksapentoksi)-3-dimeti 1-1- (cis, cis-9',1-2'-oktadekadienoksi)propan ili "CpLinDMA", N,N-dimetil-3,4-dioliloksibenzilamin ili "DMOBA", 1,2-N,N'-dioleilkarbamil-3-dimetilaminopropan ili "DOcarbDAP", 2,3-dilinoleoiloksi-N,N-dimetilpropilamin ili "DLinDAP", 1,2-N,N'-dilinolilkarbamil-3-dimetilaminopropan ili "DLincarbDAP", 1,2-dilinoleoilkarbamil-3-dimetilaminopropan ili "DLinCDAP", 2,2-dilinolil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioksolan ili "DLin-K-DMA", 2,2-dilinolil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolan ili" DLin-K-XTC2-DMA" ili njihove smeše. (Heyes J. i saradnici, J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey DV. i saradnici, Nat. Biotechnol.23(8): 1003-1007 (2005); PCT publikacija WO2005/121348A1).

[0051] Upotreba katjonskih lipida baziranih na holesterolu je takođe predmet predmetnog pronalaska. Navedeni katjonski lipidi na bazi holesterola se mogu upotrebljavati sami ili u kombinaciji sa drugim katjonskim i nekatjonskim lipidima. Pogodni katjonski lipidi na bazi holesterola uključuju, na primer, DC-Chol (N,N-dimetil-N-etilkarboksamidoholesterol), 1,4-bis(3-N-oleilaminopropil)piperazin (Gao i saradnici, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf i saradnici, BioTechniques 23, 139 (1997); Patentni spis SAD br.5,744,335).

[0052] Dodatno, nekoliko reagensa je komercijalno dostupno da bi se poboljšala efikasnost transfekcije. Pogodni primeri uključuju LIPOFECTIN (DOTMA:DOPE) (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija), LIPOFECTAMINE (DOSPA:DOPE) (Invitrogen), LIPOFECTAMINE2000 (Invitrogen), FUGENE, TRANSFECTAM (DOGS) i EFFECTENE.

[0053] Takođe su razmatrani katjonski lipidi, kao što su lipidi na bazi dialkilamina, na bazi imidazola i na bazi guanidinijuma. Na primer, određeni primeri primene su usmereni na kompoziciju koja sadrži jedan ili više katjonskih lipida na bazi imidazola, na primer, imidazolski estar holesterola ili "ICE" lipid (3S, 10R, 13R, 17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 3-(1H-imidazol-4-il)propanoat, predstavljen strukturom (I) u nastavku teksta. U prioritetnom primeru primene, nosač transfera (npr. lipidna nanočestica) za isporuku RNK (npr. iRNK) ili proteina (npr. enzima), na primer, terapijske količine RNK ili proteina, može sadržati jedan ili više katjonskih lipida na bazi imidazola, na primer, imidazolski estar holesterola ili "ICE" lipid (3S, 10R, 13R, 17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 3-(1H-imidazol-4-il)propanoat, predstavljen strukturom (I).

Bez želje da bude vezano za određenu teoriju, veruje se da je fuzogenost katjonskog lipidna ICE na bazi imidazola povezana sa remećenjem endozoma koje je olakšano usled prisustva imidazolne grupe koju karakteriše niža pKa vrednost u odnosu na tradicionalne katjonske lipide. Remećenje endozoma pospešuje zauzvat osmotsko bubrenje i razlaganje lipozomalne membrane, nakon čega sledi transfekcija ili unutarćelijsko oslobađanje sadržaja, nukleinske kiseline/nukleinskih kiselina, u ciljnu ćeliju.

[0054] Katjonske lipide na bazi imidazola takođe karakteriše njihova smanjena toksičnost u odnosu na druge katjonske lipide. Katjonski lipidi na bazi imidazola (na pr. ICE) mogu biti upotrebljeni kao jedini katjonski lipidi u nosaču za transfer ili lipidna nanočestica ili alternativno mogu biti kombinovani sa tradicionalnim katjonskim lipidima (npr. DOPE, DC-Chol), nekatjonskim lipidima, lipidima modifikovanim sa PEG i/ili pomoćnim lipidima. Sadržaj katjonskog lipida može biti takav njihov molarni odnos izanosi od približno 1% do približno 90%, približno 2% do približno 70%, približno 5% do približno 50%, približno 10% do približno 40% od ukupnih lipida prisutnih u nosaču za transfer, ili prioritetno od približno 20% do približno 70% od ukupnih lipida prisutnih u nosaču za transfer.

[0055] Upotreba fosfolipida modifikovanih polietilen glikolom (PEG) i derivatizovanih lipida kao što su derivati ceramida (PEG-CER), uključujući N-oktanoil-sfingozin-1-[sukcinil(metoksi polietilen glikol)-2000] (CS PEG-2000 ceramid) takođe je predmet pronalaska, bilo samostalno ili prioritetno u kombinaciji sa drugim lipidnim formulacijama sa kojima zajedno čini nosač transfera (npr. lipidna nanočestica). Razmatrani lipidi koji su modifikovani sa PEG uključuju, ali nisu ograničeni na, lanac polietilen glikola dužine do 5 kDa koji je kovalentno vezan za lipid sa alkilnim lancem/lancima dužine C6-C20. Dodavanje navednih komponenti može sprečiti složenu agregaciju i takođe može obezbediti način za povećanje vremena zadržavanja u cirkulaciji, kao i poboljšanje isporuke kompozicije koja sadrži lipid i nukleinsku kiselinu do ciljnih tkiva (Klibanov i saradnici (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237) ili komponente mogu biti izabrane tako da dolazi do brze izmene iz formulacije in vivo (pogledati Patentni spis SAD br. 5,885,613). Posebno korisni izmenjivi lipidi su PEG-ceramidi sa kraćim acilnim lancima (npr. C14 ili C18). Fosfolipidi koji su modifikovani sa PEG i derivati lipida predmetnog pronalaska mogu biti prisutni sa molarnim odnosom od približno 0% do približno 20%, približno 0,5% do približno 20%, približno 1% do približno 15%, približno 4% do približno 10% ili približno 2% od ukupnih lipida prisutnih u lipozomalnom nosaču transfera.

[0056] Predmetni pronalazak takođe razmatra upotrebu nekatjonskih lipida. U kontekstu pronalaska, fraza "nekatjonski lipid" se odnosi na bilo koji neutralni, cviterjonski ili anjonski lipid. U kontekstu pronalaska, fraza "anjonski lipid" se odnosi na bilo koju od brojnih vrsta lipida sa negativnim neto naelektrisanjem na odabranom pH, kao što je fiziološki pH. Nekatjonski lipidi uključuju, ali nisu ograničeni na, distearoilfosfatidilholin (DSPC), dioleoilfosfatidilholin (DOPC), dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamine (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilholin (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamin (POPE), dioleoil-fosfatidiletanolamin 4-(N-maleimidometil)-cikloheksan-1-karbokilat (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamin (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamin (DMPE), distearoil-fosfatidil-etanolamin (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-stearoil-2-oleoil-fosfatidetanolamin (SOPE), holesterol ili njihove smeše. Navedeni nekatjonski lipidi mogu se upotrebljavaju sami ili, ali poželjno su korišćeni u kombinaciji sa drugim ekscipijensima, npr katjonskim lipidima i nekatjonskim lipidima. Kada se upotrebljavaju u kombinaciji sa katjonskim lipidom, moralni odnos nekatjonskih lipid može iznositi od 5% do približno 90% ili prioritetno od približno 10% do približno 70% od ukupnih lipida koji su prisutni u nosaču transfera.

[0057] Poželjno, nosač transfera (npr. lipidna nanočestica) se priprema kombinovanjem više komponenti lipida i/ili polimera. Na primer, nosač transfera može biti pripremljen upotrebom DSPC/CHOL/DODAP/C8-PEG-5000 ceramida u molarnim odnosima od približno 1 do 50 : 5 do 65 : 5 do 90 : 1 do 25, tim redom. Nosač transfera može da sadrži dodatne kombinacije lipida u različitim odnosima, uključujući, na primer, DSPC/CHOL/DODAP/mPEG-5000 (npr. kombinovane u molarnom odnosu od približno 33:40:25:2), DSPC/CHOL/DODAP/C8 PEG-2000-Cer (npr. kombinovane u molarnom odnosu od približno 31:40:25:4), POPC/DODAP/CS-PEG-2000-Cer (npr. kombinovane u molarnom odnosu od približno 75-87:3-14:10) ili DSPC/CHOL/DOTAP/C8 PEG-2000-Cer (npr. kombinovane u molarnom odnosu od približno 31:40:25:4). Izbor katjonskih lipida, nekatjonskih lipida i/ili lipida modifikovanih sa PEG koji čine lipozomalni nosač transfera ili lipidne nanočetice, kao i relativni molarni odnosi navedenih lipida jednih u odnosu na druge, se bazira na karakteristikama izabranog/izabranih lipida, na prirodi ciljnih ćelija ili tkiva koje je potrebno transfektovati, kao i na karakteristikama nukleinskih kiselina koje treba isporučiti limpozomalnim nosačem transfera. Dodatna razmatranja uključuju, na primer, zasićenje alkilnog lanca, kao i veličinu, naelektrisanje, pH, pKa, fuzogenost i toksičnost odabranog/odabranih lipida.

[0058] Lipozomalni nosači transfera za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu biti pripremljeni raznim tehnikama koje su trenutno poznate u struci. Višeslojne vezikle (MLV) mogu biti pripremljene konvencionalnim tehnikama, na primer, deponovanjem izabranog lipida na unutrašnjem zidu odgovarajućeg kontejnera ili suda, rastvaranjem lipida u odgovarajućem rastvaraču, a zatim uparavanjem rastvarača da bi na unutrašnjoj strani posude ostao tanak sloj ili pak sušenjem pod mlazom. U posudu se dalje može dodati vodena faza, uz mešanje na vorteksu, što dovodi do obrazovanja MLV. Jednoslojne vezikule (ULV) se zatim mogu obrazovati homogenizacijom, sonikacijom ili ekstruzijom višeslojnih vezikula. Pored toga, jednoslojne vezikule mogu biti sintetisane tehnikom uklanjanja deterdžentima.

[0059] U određenim primerima primene predmetnog pronalaska, kompozicije predmetnog pronalaska sadrže nosač transfera u kome je terapijska iRNK (npr. iRNK koja kodira OTC) vezana za obe površine nosača transfera (npr. lipozoma) i inkapsulirana unutar istog nosača transfera. Na primer, tokom pripreme kompozicija predmetnog pronalaska, katjonski lipozomalni nosači transfera mogu biti vezani za nukleinske kiseline (npr.iRNK) elektrostatičkim interakcijama sa navedenom terapijskom iRNK.

[0060] U određenim primerima primene, kompozicije predmetnog pronalaska mogu nositi dijagnostičke radionuklide, fluorescentne materijale ili druge materijale koji se mogu detektovati nakon i in vitro i in vivo primene. Na primer, pogodni dijagnostički materijali za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu uključivati rodamin-dioleoilfosfatidiletanolamin (Rh-PE), iRNK zelenog fluorescentnog proteina (GFP iRNK), iRNK Renilla luciferaze i iRNK luciferaze svica.

[0061] Tokom pripreme lipozomalnih nosača transfera, noseći agensi koji su rastvorljivi u vodi mogu biti inkapsulirani u unutrašnji prostor na bazi vode, uključivanjem u rastvor za hidrataciju, dok lipofilni molekuli mogu biti uključeni u lipidnu formulaciju ugrađivanjem u lipidni dvosloj. U slučaju određenih molekula (npr. katjonskih ili anjonskih lipofilnih nukleinskih kiselina), ugrađivanje nukleinske kiseline u prethodno formirane lipozome može biti postignuto, na primer, postupcima opisanim u Patentnom spisu SAD br. 4,946,683. Nakon inkapsulacije nukleinske kiseline, lipozomi mogu biti obrađeni da bi se uklonila neinkapsulirana iRNK, procesima poput hromatografije na gelu, dijafiltracije ili ultrafiltracije. Na primer, ukoliko je poželjno da se ukloni nukleinska kiselina koja je vezana za spoljašnju površinu formulacije lipozomalnog nosača transfera, navedeni lipozomi mogu biti podvrgnuti postupku u kome se upotrebljavaju dietilaminoetil SEPHACEL kolone.

[0062] Pored inkapsulirane nukleinske kiseline, jedan ili više terapijskih ili dijagnostičkih agenasa može biti uključen u nosač transfera. Na primer, navedeni dodatni terapijski agensi mogu biti vezani za površinu lipozoma, mogu biti ugrađeni u lipidni dvosloj lipozoma i tako uključeni u lipidne formulacije ili pak mogu uvedeni u prethodno pripremljene lipozome (pogledati Patentne spise SAD br. 5,194,654 i 5,223,263).

[0063] Postoji nekoliko postupaka za smanjenje veličine ili "dimenzioniranje" lipozomalnih nosača tranfera, a bilo koji od navedenih postupaka se u principu može upotrebiti kada se dimenzioniranje upotrebljava kao deo pronalaska. Postupak ekstruzije je prioritetan postupak dimenzioniranja lipozoma. (Hope MJ i saradnici, Reduction of Liposome Size and Preparation of Unilamellar Vesicles by Extrusion Techniques, u: Liposome Technology (izd. G. Gregoriadis) volume 1, str. 123 (1993). Postupak se sastoji od ekstruzije lipozoma kroz polikarbonatnu membranu malih pora ili asimetričnu keramičku membranu da bi se smanjila veličina lipozoma dok se ne postigne relativno dobro definisana distribucija veličina. Uobičajeno je da se suspenzija ciklično propušta kroz memranu, jedan ili više puta, dok se ne postigne željena distribucija veličine lipozoma. Lipozomi mogu biti ekstrudirani kroz membrane sukcesivno manjih pora da bi se postiglo postepeno smanjenje veličine lipozoma.

[0064] Za dimenzioniranje populacije lipozomalnih nosača tranfera su dostupni razni alternativni postupci koji su poznati u stanju tehnike. Jedan takav postupak je opisan u Patentnom spisu SAD br.

4,737,323. Sonikacija suspenzije lipozoma bilo sonikacijom u kupatilu ili upotrebom sonde dovodi do progresivnog smanjenja veličine i do obrazovanja malih ULV, manjih od približno 0,05 mikrona u prečniku. Homogenizacija je još jedan postupak koji se oslanja na silu cepanja fragmenata velikih lipozoma do onih manjih. U uobičajenoj proceduri homogenizacije, MLV se više puta uvode u standardan emulzioni homogenizer dok se ne utvrdi prisustvo izabrane veličine lipozoma, obično između 0,1 i 0,5 mikrona. Veličina lipozomskih vezikla može biti određena upotrebom kvazielektričnog rasejavanja svetla (QELS), kao što je opisano u publikaciji Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421-450 (1981).

Prosečan prečnik lipozoma može biti smanjen sonikacijom prethodno obrazovanih lipozoma. Intermitentni ciklusi sonikacije se mogu smenjivati sa procenom veličine upotrebom QELS postupka, a da bi se sprovela efikasna sinteza lipozoma.

[0065] Izbor pogodne veličine lipozomalnih nosača tranfera mora uzeti u razmatranje poziciju ciljne ćelije ili tkiva i, do određene mere, primenu za koju se lipozom pravi. U nekim izvođenjima, poželjno je da se transfekcija nukleinskih kiselina ograniči na određene ćelije ili tkiva. Na primer, jetra predstavlja ciljni organ za kompozicije predmetnog pronalaska, delom zbog svoje centralne uloge u metabolizmu i proizvodnji proteina, a delom zbog oboljenja koja nastaju usled deficijencije produkata gena koji su specifični za jetru (npr. poremećaji ciklusa uree) i za koje može biti od koristi specifična ekspresija u ciljnim ćelijama (npr. hepatocitima). Prema tome, u jednom izvođenju predmetnog pronalaska strukturne karakteristike ciljnog tkiva mogu se iskoristiti za usmeravanje distribucije lipozomalnog nosača transfera u navedena ciljna tkiva. Na primer, da bi se specifično dopremio do hepatocita, lipozomalni nosač za transfer može biti dimenzioniran tako da su dimenzije manje od veličine fenestriranih pora endotelijalnog sloja koji oblaže hepatične sinusoide u jetri; prema tome, lipozomalni nosač transfera može lako prodreti kroz navedene endotelne pore da bi došao do ciljnih hepatocita. Alternativno, lipozomalni nosač transfera može biti prilagođen takivm dimenzijama da su dimenzije lipozoma pogodnog prečnika da se ograniči ili ekspresno izbegne distribucija u izvesne ćelije ili tkiva. Na primer, lipozomalni nosač transfera može biti prilagođen takvim dimenzijama, da su dimenzije veće od fenestracije endotelijalnog obloženog sloja sinusoida jetre na taj način ograničavajući distribuciju lipozomalnog nosača transfera u hepatocite.U takvom izvođenju, veliki lipozomalni nosači transfera ne bi lako prodrli u endotelijalne fenestirane pore i umesto toga bi bile očišćeni sa makrofagom Kupffferovih ćelija koji oblažu sinusoide u jetri. Generalno velićna nosača transfera je u opsegu od oko 25 do 250 nm, poželjno manje od oko 250nm, 175nm, 150nm, 125nm, 100nm, 75nm, 50nm, 25nm ili 10nm.

[0066] Slično, kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu biti pripremljene da se preferencijalno rastpoređuju u druga ciljna tkiva, ćelije, ili organe, kao što su srce, pluća, bubrezi, slezina. Na primer, nosači transfera prema prikazanom pronalasku mogu biti pripremljeni da bi se postiglo pospešeno davanje u ciljne ćelije i tkiva. Prema tome, kompozicije prema prikazanom pronalsku mogu biti obogaćene sa dodatnim katjonski, nekatjonskim i PEG-modifiikovanim lipidima da bi se dalje ciljala tkiva ili ćelije.

[0067] U nekim izvođenjima, kompozicije predmetnog pronalaska se distribuiraju u ćelije i tkiva jetre da bi se olakšala isporuka i naknadna ekspresije nukleinskih kiselina (npr. iRNK) koja se unutar njih nalaze, u ćelije i tkiva jetre (npr. hepatocite). Dok se navedene kompozicije mogu preferencijalno distribuirati u ćelije i tkiva jetre, terapijski efekti eksprimiranih nukleinskih kiselina ne moraju biti ograničeni na ciljne ćelije i tkiva. Na primer, ciljni hepatociti mogu funkcionisati kao "rezervoar" ili "depo" sposoban za ekspresiju ili proizvodnju i sistemsko izlučivanje funkcionalnog proteina ili enzima. Shodno tome, u jednom primeru primene predmetnog pronalaska, lipozomalni nosač tranfera može biti specifičan za dopremanje do hepatocita i/ili se može preferencijalno distribuirati do ćelija i tkiva jetre i nakon isporuke. Nakon transfekcije ciljnih hepatocita, iRNK nukleinska kiselina/nukleinske kiseline koje lipozomalni nosač sadrži se translatira/ju, a funkcionalni proteinski proizvod se eksprimira, izlučuje i sistemski distribuira.

[0068] U pojedinim primerima primene, kompozicije predmetnog pronalaska sadrže jedan ili više dodatnih molekula (npr. proteina, peptida, aptamera ili oliogonukleotida) koji olakšavaju prenos nukleinskih kiselina (npr., iRNA, mikroRNA, snRNA i snoRNA) iz nosača transfera do unutarćelijskog odeljka ciljne ćelije. U jednom primeru primene, dodatni molekul olakšava isporuku nukleinskih kiselina u, na primer, citosol, lizozom, mitohondriju, jedro, nukleolus ili proteozom ciljne ćelije. Obuhvaćeni su i agensi koji olakšavaju transport translatiranog proteina od interesa iz citoplazme do njegove normalne unutarćelijske lokacije (npr. u mitohondriji) da bi se lečila deficijencije u navedenoj organeli. U pojedinim primerima primene, agens se bira iz grupe koju čine protein, peptid, aptamer i oligonukleotid.

[0069] U jednom izvođenju, kompozicije predmetnog pronalaska olakšavaju endogenu proizvodnju jednog ili više funkcionalnih proteina i/ili enzima kod subjekta, a posebno proizvodnju proteina i/ili enzima koji pokazuju manju imunogenost u odnosu na njihove parnjake koji su rekombinantno pripremljeni. U poželjnom izvođenju prikazanog pronalaska, nosači transfera sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju iRNK deficijentnog proteina i/ili enzima. Nakon distribucije tih kompozicija u ciljna tkiva i naknadne transfekcije navedenih ciljnih ćelija, egzogena iRNK koju sadrži lipozomalni nosač transfera (npr, lipidna nanočestica) može biti prevedena in vivo da bi se proizveo funkcionalan protein i/ili enzim koga kodira egzogeno primenjena iRNK (tj. protein i/ili enzim koji je deficijentan kod subjekta). Shodno tome, kompozicije predmetnog pronalaska koriste sposobnost subjekta da translatira egzogenu ili iRNK koja je rekombinantno pripremljena, a da bi se proizveo endogeno translatiran protein ili enzim i time proizveo (i gde je primenjivo, izlučio) funkcionalan protein ili enzim. Eksprimirani ili translatirani proteini ili enzimi mogu takođe biti okarakterisani in vivo, uključivanjem prirodnih post-translacionih modifikacija koje često mogu biti odsutne kod rekombinantno pripremljenih proteina ili enzima, a čime se dodatno smanjuje imunogenost translatiranog proteina ili enzima.

[0070] Primenom iRNK koja kodira deficijentan protein ili enzim se izbegava potreba isporuke nukleinske kiseline specifičnim organelima unutar ciljne ćelije (npr. mitohondrijama). Pre svega, nakon transfekcije ciljne ćelije i isporuke nukleinskih kiselina u citoplazmu ciljne ćelije, iRNK sadržaj nosača za tranfer može biti translatiran, a funkcionalan protein ili enzim eksprimiran.

[0071] Predmetni pronalazak takođe razmatra diskriminatorno dopremanje do ciljnih ćelija i tkiva kako pasivnim tako i aktivnim načinima ciljanja. Fenomen pasivnog ciljanja iskorišćava prirodne obrasce distribucije nosača za transfer in vivo, bez oslanjanja na upotrebu dodatnih ekcipijenasa ili načina za poboljšanje prepoznavanja nosača za transfer od strane ciljnih ćelija. Na primer, nosači tranfera koji podležu fagocitozi od strane ćelija retikulo-endotelijalnog sistema će se verovatno akumulirati u jetri ili slezini, a navedeno može obezbediti načine za direknu pasivnu isporuku kompozicija navedenim ciljnim ćelijama.

[0072] Alternativno, predmetni pronalazak razmatra aktivnu ciljnu isporuku koja podrazumeva upotrebu dodatnih ekscipijenasa, ovde označenih kao "ciljani ligandi" koji mogu biti vezani (bilo kovalentno ili nekovalentno) za nosač tranfera da bi se podstakla lokalizacija navedenog nosača transfera u određene ciljne ćelije ili ciljne tkiva. Na primer, ciljna isporuka može biti posredovana uključivanjem jednog ili više endogenih ciljanih liganada (npr. apolipoproteina E) u ili na nosaču tranfera da bi se podstakla distribucija do ciljnih ćelija ili tkiva. Prepoznavanje ciljanog liganda od strane ciljnog tkiva aktivno olakšava distribuciju i prezimanje nosača transfera od strane ćelije i/ili njegovog sadržaja do ciljnih ćelija i tkiva (npr. uključivanje liganda koji ciljano vezuje apolipoprotein-E u ili na nosaču tranfera, a što podstiče prepoznavanje i vezivanje nosača transfera za endogene lipoproteinske receptore male gustine koje eksprimiraju hepatociti). Kao što je ovde obezbeđeno, kompozicija može sadržavati ligand sposoban da poveća afinitet kompozicije za ciljnu ćeliju. Ciljani ligandi mogu biti vezani za spoljni dvosloj lipidne čestice tokom formulisanja ili nakon formulacije. Navedeni postupci su dobro poznati u stanju tehnike. Pored toga, pojedine formulacije lipidne partikule mogu koristiti fuzogene polimer poput PEAA, hemaglutinina, drugih lipopeptida (pogledati Patentne spise SAD br. 08/835,281 i 60/083,294), kao i druge osobine korisne za in vivo i/ili unutarćelijsku isporuku. U pojedinim drugim primerima primene, kompozicije predmetnog pronalaska karakterišu poboljšane efikasnosti transfekcije i/ili poboljšana selektivnost prema ciljnim ćelijama ili tkivima od interesa. Razmatraju se stoga kompozicije koje sadrže jedan ili više liganda (npr. peptide, aptamere, oligonukleotide, vitamina ili drugih molekula) koji su sposobni da poboljšavaju afinitet kompozicija, i nukleinskih kiselina koje sadrže, za ciljne ćelije ili tkiva. Pogodni ciljani ligandi opciono biti vezani ili linkovani za površinu nosača tranfera. U pojedinim primerima primene, ciljani ligand može prolaziti kroz površinu nosača tranfera ili biti inkapsuliran unutar nosača tranfera. Pogodni ligandi se biraju se na osnovu svojih fizičkih, hemijskih ili bioloških osobina (npr. selektivnog afiniteta i/ili prepoznavanja markera na površini, kao i karakteristika ciljne ćelije). Ciljna mesta koja su specifična za ćelije i njihovi odgovarajući ciljani ligandi mogu široko varirati. Pogodni ciljani ligandi se biraju tako da se iskoriste jedinstvene karakteristike ciljne ćelije, čime se omogućava da kompozicija vrši diskriminaciju između ciljnih i ćelija koje nisu ciljne. Na primer, kompozicije predmetnog pronalaska mogu nositi površinske markere (npr. apolipoprotein-B ili apolipoprotein-E) koji selektivno povećavaju prepoznavanje od strane ili afinitet prema hepatocitima (npr. prepoznavanje koje je posredovano receptorom i vezivanjem za ovake površinske markere). Dodatno, očekuje se da upotreba galaktoze kao ciljanog liganda usmerava kompozicije predmetnog pronalaska ka parenhimskim hepatocitima ili, alternativno, očekuje se da upotreba ugljeno-hidratnih ostataka koji sadrže manozu kao ciljani ligand usmeri kompozicije predmetnog pronalaska ka endotelijalnim ćelijama jetre (npr. ugljeno-hidratni ostaci koji sadrže manozu se preferencijlno mogu vezivati za receptor azijaloglikoproteina koji je prisutan u hepatocitima). (Pogledati Hillery AM i saradnici, "Drug Delivery and Targeting: For Pharmacists and Pharmaceutical Scientists" (2002) Taylor & Francis, Inc.). Prezentacija navedenih ciljanih liganda konjugovanih sa strukturama prisutnim u nosaču transfera (npr. lipidne nanočestice) stoga olakšava prepoznavanje i preuzimanje kompozicija predmetnog pronalaska u ciljne ćelije i tkiva. Primeri pogodnih ciljnih liganda uključuju jedan ili više peptida, proteina, aptamera, vitamina i oligonukleotida.

[0073] U kontekstu pronalaska, termin "subjekat" se odnosi na bilo koju životinju (npr. sisara), uključujući, ali ne ograničavajući se na, ljude, nehumane primate, glodare i slično, kojima se primenjuju kompozicije predmetnog pronalaska. Uobičajeno je da se termini "subjekat" i "pacijent" ovde koriste naizmenično kada se odnose na ljude kao subjekte.

[0074] U kontekstu pronalaska, termin "ciljna ćelija" se odnosi na ćeliju ili tkivo prema kojima je potrebno kompoziciju pronalaska usmeriti ili ciljano dopremiti. U pojedinim primerima primene, ciljne ćelije su deficitarne u proteinu ili enzimu od interesa. Na primer, obzirom da je poželjno dopremanje nukleinske kiseline do hepatocita, hepatocit predstavlja ciljnu ćeliju. U pojedinim primerima primene, nukleinske kiseline i kompozicije predmetnog pronalaska transfektuju ciljne ćelije na osnovi diskriminacije (tj. ne tranfektuju ćelije koje nisu ciljne). Kompozcije i postupci prema prikazanom pronalasku mogu biti pripremljeni da preferencijalno ciljaju različite ciljne ćelije , koje uključuju , ali bez ograničenja samo na njih, hepatocite, epitelne ćelije, hematopoietske ćelijes, epitelne ćelije, endotelijalne ćelije ćelije pluća, ćelije kosti, stem ćelije, mezenhimalne ćelije, nervne ćelije (npr., meninge, astrocite, motorni neuroni, ćelije ganglija dorzalnog korena i anteriornog roga motornih neurona), ćelije fotoreceptora (npr., štapići i čepići), pigmentisane epitelne ćelije retine, sekretorne ćelije, srčane ćelije, adipocite, ćelije vaskularnih glatkih mišića, cardiomiocite, ćelije skeletnih mišića, beta ćelije, ćelije hipofize, ćelije sinovijalne opne, ćelije jajnika, testikularne ćelije, fibroblasti, B ćelije, T ćelije, retikulocite, leukocite, granulociti i ćelije tumora.

[0075] Nakon transfekcije jedne ili više ciljnih ćelija kompozicijama i nukleinskim kiselinama predmetnog pronalaska, prioritetno se stimuliše ekspresija proteina koga kodira navedena nukleinska kiselina, a sposobnost navednih ciljnih ćelija da eksprimiraju protein od interesa je poboljšana. Na primer, transfekcija ciljne ćelije sa OTC iRNK će omogućiti ekspresiju OTC proteinskog proizvoda nakon translacije nukleinske kiseline.

[0076] Metabolički poremećaji ciklusa uree i proteinske ili enzimske deficijencije u pricipu mogu biti pogodni za tretman postupcima i kompozicijama koje su ovde obezbeđene. Nukleinske kiseline kompozicija i/ili postupaka koji su ovde obezbeđene kodiraju proizvod (npr. protein, enzim, polipeptid, peptid, funkcionalni RNK i/ili antisens molekul) i prioritetno kodiraju proizvod čija je in vivo proizvodnja poželjna.

[0077] Metabolički poremećaji ciklusa uree su primere deficijencije proteina i enzima koji mogu biti lečeni upotrebom postupaka i kompozicija koje su ovde opisani. Navedeni poremećaji metaboličkog ciklusa uree uključuju OTC deficijenciju, deficijenciju arginosukcinat sintetaze (ASD) i deficijenciju argininosukcinat liaze (ALD). Stoga, u pojedinim primerima primene, nukleinska kiselina upotrebljena u postupcima i kompozicijma koje su ovde opisani kodira enzim uključen u ciklus uree, uključujući, na primer, ornitin transkarbamilazu (OTC), karbamil fosfat sintetazu (CPS), argininosukcinat sintetazu 1 (ASS1), argininosukcinat liazu (ASL) i arginazu (ARG).

[0078] Opisano je pet metaboličkih poremećaja koji nastaju usled defekata u biosintezi enzima uključenih u ciklus uree, a isti uključuju deficijenciju ornitin transkarbamilaze (OTC), deficijenciju karbamil fosfat sintetaze (CPS), deficijenciju argininosukcinat sintetaze 1 (ASS1) (citrulinemiju), deficijenciju argininosukcinat liaze (ASL) i deficijenciju arginaze (ARG). Od navedenih pet metaboličkih poremećaja, OTC deficijencija predstavlja najčešći poremećaj za koji je proceno da se javlja sa učestalošću od jedan na svakih 80.000 rođenih.

[0079] OTC je homotrimerni mitohondrijalni enzim koji se eksprimira skoro isključivo u jetri i koga kodira prekursorski OTC protein, koji se cepa u dva koraka nakon inkorporacije u mitohondrijalni matriks. (Horwich AL. i saradnici, Cell 1986; 44: 451-459). OTC deficijencija je genetski poremećaj koji nastaje usled prisustva mutiranog i biološki neaktivnog oblika enzima ornitin transkarbamilaze. OTC deficijencija često postaje očigledna u prvih nekoliko dana života, obično nakon ingestije proteina. U klasičnom ozbiljnom obliku OTC deficijencije, u prvim danima života pacijenata su prisutne letargija, konvulzije, koma i teška hiperamonemija, što brzo dovodi do pogoršanja i smrtonosnog ishoda ukoliko izostane odgovarajuća medicinska intervencija. (Monish S. i saradnici, Genetics for Pediatricians; Remedica, Cold Spring Harbour Laboratory (2005)). Ukoliko se nepravno leče ili ne leče, komplikacije OTC deficijencije mogu uključiti kašnjenje u razvoju i mentalnu retardaciju. OTC deficijentni subjekti mogu takođe ispoljavati progresivno oštećenje jetre, lezije na koži i krtu kosu. Kod pojedinih obolelih subjekata, znaci i simptomi OTC deficijencije mogu biti manje ozbiljni i mogu se javiti tek kasnije u životu.

[0080] OTC gen koji se nalazi na kratkom kraku X hromozoma unutar Xp21.1 trake, prostire se na više od 85 kb i sastoji se od 10 egzona koji kodiraju protein od 1062 aminokiseline. (Lindgren V. i saradnici, Science 1984; 226: 698-7700; Horwich AL. i saradnici, Science 224: 1068-1074, 1984; Horwich AL. i saradnici, Cell 44: 451-459, 1986; Hata A. i saradnici, J. Biochem.100: 717-725, 1986). OTC enzim katalizuje prevođenje ornitina i karbamoil fosfata do citrulina. Pošto je OTC na X hromosomu, ženke su primarni nosioci, dok mužjaci sa nekonzervativnim mutacijama retko preživljavaju 72 sata od rođenja.

[0081] Kod zdravih subjekata, OTC se eksprimira gotovo isključivo u hepatocelularnim mitohondrijama. Iako nije eksprimiran u mozgu zdravih subjekata, OTC deficijencija može dovesti do neuroloških poremećaja. Na primer, jedan od uobičajenih simptoma OTC deficijencije, koja je heterogena u svojoj prezentaciji, je hiperamonemična koma (Gordon N., Eur J Pediatr Neurol 2003; 7: 115-121.).

[0082] OTC deficijencija je veoma heterogena, sa više od 200 jedinstvenih mutacija koje su prijavljene, kao i sa velikim delecijama koje čine otprilike 10-15% svih mutacija, dok ostatak generalno podrazumeva “ missens” tačkaste mutacije (mutacije promene smisla kodona), kao i manji broj “ nonsens” mutacija (kojima se gubi smisao kodona), mutacije mesta obrade i mutacije tipa manjih delecija. (Monish A. i saradnici). Fenotip OTC deficijencije je izuzetno heterogen i može varirati od akutne neonatalne hiperamonemične kome do asimptomatskih hemizigotnih odraslih osoba. (Gordon N., Eur J Paediatr Neurol 2003; 7: 115-121). Navedene mutacije koje dovode do ozbiljne i životno-ugrožavajuće neonatalne bolesti su grupisane u važnim strukturalnim i funkcionalnim domenima u unutrašnjosti proteina, na mestima aktivnosti enzima ili na površinama koje se nalaz između lanaca, dok se mutacije asocirane sa oboljenjem koje se javlja kasnije tokom života nalaze na površini proteina (Monish A. i saradnici). Pacijente sa blažim ili parcijalnim oblicima OTC deficijencije može karakterisati početak bolesti u kasnijem životnom dobu, kao i simptotomi tipa ponavljanog povraćanja, neurobihejvioralnih promena ili epileptičkih napada koji su povezani sa hiperamonemijom.

[0083] Kompozicije i postupci predmetnog pronalaska su široko primenjive za dopremanje nukleinskih kiselina, a posebno iRNK, i lečenje brojnih poremećaja. Posebno, kompozicije i postupci predmetnog pronalaska su pogodne za lečenje bolesti ili poremećaja koji se odnose na deficijenciju proteina i/ili enzima. U jednom primeru primene, nukleinske kiseline predmetnog pronalaska kodiraju funkcionalne proteine ili enzime koji se izlučuju ili sekretuju od strane ciljne ćelije u okolnu vanćelijsku tečnost (npr. iRNK koja kodira hormone i neurotransmitere). Alternativno, u još jednom primeru primene, nukleinske kiseline predmetnog pronalaska kodiraju funkcionalne proteine ili enzime koji ostanu u citosolu ciljne ćelije (npr. iRNK koja kodira enzime bitne za metaboličke poremećaje ciklusa uree). Ostali poremećaji za koje je predmetni pronalazak koristan uključuju poremećaje kao što su spinalna mišićna atrofija (SMA) povezana sa SMNI; amiotrofična lateralna skleroza (ALS); galaktozemija povezana sa GALT; cistična fibroza (CF); poremećaji povezani sa SLC3Al uključujući cistinuriju; poremećaji povezani sa COL4A5 uključujući Alportov sindrom; deficijenciju galaktoceribrozidaze; X-vezanu adrenoleukodistrofiju i adrenomijeloneuropatiju; Fridrihovu ataksiju; Pelizeus-Mercbaherovu bolest; tuberoznu sklerozu povezanu sa TSC1 i TSC2; Sanfilipo B sindrom (MPS IIIB); cistinozu povezanu sa CTNS; poremećaje povezane sa FMR1 koji uključuju fragilni X sindrom, fragilni X-vezani sindrom sa tremorom/ataksijom i fragilni X sindrom preuranjene insuficijencije jajnika; Prader-Vilijev sindrom; naslednu hemoragičnu telangiektaziju (AT); Njuman-Pikovu bolest tipa C1; oboljenja povezana sa neuronalnim ceroidnim lipofuscinozama uključujući juvenilnu insuficijenciju neuronalne ceroidne lipofuscinoze (JNCL), juvenilnu Batenovu bolest, Satavuori-Haltia, Janski-Bielšovski bolest i PTT-1 i TPP1 deficijencije; dečije ataksije povezane se EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 i EIF2B5 praćene hipomijelinizacijom/nestankom bele mase centralnog nervnog sistema; epizodne ataksije tipa 2 povezane sa CACNA1A i CACNB4; poremećaje povezane sa MECP2 uključujući klasičan Retov sindrom, tešku neonatalnu encefalopatiju povezanu sa MECP2 i PPM-X sindrom; atipičan Retov sindrom povezan sa CDKL5; Kenedijevu bolest (SBMA); cerebralnu autozomno-dominantnu arteriopatiju povezanu sa Notch-3 praćenu subkortikalnim infarktima i leukoencefalopatijom (CADASIL); poremećaje sa epileptičnim napadima povezane sa SCN1A i SCN1B; poremećaje povezane sa polimerazom G koji uključuju Alpers-Hutenloherov sindrom, senzornu ataksičnu neuropatsku disartriju i oftalmoparezu povezanu sa POLG i dalje autozomno-dominantnu i recesivno-progresivnu eksternu oftalmoplegiju sa delecijama mitohondrijalne DNK; X-vezanu adrenalnu hipoplaziju; X-vezanu agamaglobulinemiju; i Vilsonovu bolest. U jednom primeru primene, nukleinske kiseline, a posebno iRNK, mogu kodirati funkcionalne proteine ili enzime. Na primer, kompozicije predmetnog pronalaska mogu sadržavati iRNK koja kodira eritropoetin, α1-antitripsin, karboksipeptidazu N ili humani hormona rasta.

[0084] Alternativno, nukleinske kiseline mogu kodirati antitela pune dužine ili manja antitela (npr. i teški i lake lance) da bi se obezbedio imunitet subjektu. Dok se jedan primer primene predmetnog pronalaska odnosi na postupke i kompozicije korisne za obezbeđivanje imuniteta subjekta (npr. putem translacije iRNK nukleinskih kiselina koji kodiraju funkcionalna antitela), pronalasci koji su ovde predviđeni i time razmatrani su široko primenljivi. U alternativnom primeru primene, kompozicije predmetnog pronalaska kodiraju antitela koja mogu biti upotrebljena za prolazan ili hroničan efekat na funcionalni odgovor kod subjekta. Na primer, iRNK nukleinske kiseline mogu kodirati funkcionalno monoklonsko ili poliklonsko antitelo koje nakon translacije (a po potrebi i sistemskog izlučivanja iz ciljnih ćelija) može biti korisno za ciljno vezivanje za i/ili inaktivaciju biološke mete (npr. stimulatorni citokin poput faktora nekroze tumora). Slično tome, iRNK nukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu kodirati, na primer, funkcionalna antitela za nefritički faktor koja su korisna za lečenje membranoproliferativnog glomerulonefritisa tipa II ili akutnog hemolitičkog uremičnog sindroma ili iste alternativno mogu kodirati antitela za vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF) koja su od koristi za lečenje oboljenja koja su povezana sa VEGF-om, poput kancera.

[0085] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti davane subjektu. U pojedinim primerima primene, kompozicija je formulisana tako daj je u kombinaciji sa jednim ili sa više dodatnih nukleinskih kiselina, nosača, ciljnih liganada ili stabilizujućih reagensa, ili je pak u vidu farmakološke kompozicije u kojoj su prisutne smeše sa odgovarajućim ekscipijensima. Na primer, u jednom primeru primene, kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti pripremljene tako da dopremaju nukleinske kiseline (npr. iRNK) koje kodiraju dva ili više različitih proteina ili enzima. Alternativno, kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti pripremljene tako da dopremaju jednu nukleinsku kiselinu, a dve ili više populacija ovakvih kompozicija može biti iskombinovano u pojedinačnom doznom obliku ili primenjeno zajedno subjektu. Tehnike formulisanja i primene lekova se mogu naći u publikaciji "Remington’s Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., najnovije izdanje.

[0086] Široki opseg molekula koji može prikazivati farmaceutske ili terapeutske efekte može biti dostavljen u ciljne ćelije pomoću kompozicija i postupaka prikazanog pronalaska . Molekuli mogu biti organski ili neorganski. Organski molekuli mogu biti peptidi, proteini, ugljeni hidrati, lipidi, steroli, nukleinske kiseline (uključujući peptidne nukleinske kiseline), ili bilo koju njihovu kombinaciju. Formulacija za dostavljanje u ciljne ćelije može sadžati više od jednog tipa molekula , na primer, dve različite nukleotidne sekvence, ili protein, enzim ili steroid.

[0087] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti primenjene i dozirane u skladu sa trenutnom medicinskom praksom, uzimajući u obzir kliničko stanje subjekta, mesto i način primene, kao i raspored primene, starost, pol, telesnu težinu subjekta i drugih faktora koji su relevantni za prosečno iskusne kliničare. U kontekstu pronalaska, "efikasna količina" može biti utvrđena relevantnim razmatranjima koja su poznata iskusnim stučnjacima iz oblasti eksperimentalnih kliničkih istraživanja, farmakološke, kliničke i medicinske oblasti. U pojedinim primerima primene, primenjena količina je efikasna za postizanje barem neke stabilizacije, poboljšanja ili eliminacije simptoma i drugih indikatora koji su izabrani kao odgovarajući parametri progresije, regresije ili poboljšanja oboljenja od strane iskusnih stučnjaka. Na primer, pogodna količina i režim doziranja su oni koji dovode do barem prolazne ekspresije nukleinske kiseline u ciljnoj ćeliji.

[0088] Pogodni načini davanja uključuju, na primer, oralno, rektalno, vaginalno, transmukozno ili intestinalno davanje; parenteralno davanje, uključujući intramuskularnu, subkutanoznu, intramedularnu injekciju, kao i intratekalnu, direktnu intraventrikularnu, intravensku, intraperitonealnu, intranazalnu, ili intraokularnu injekciju.

[0089] Alternativno, kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu biti davane lokalno pre nego sistemski, na primer, pomoću injekcije farmaceutske kompozicije direktno u ciljano tkivno, poželjno kao depo formulacija ili formulacija sa odloženim oslobađanjem. Na lokalno davanje može da se utiče na različite načine, u zavisnosti od tkiva koje se cilja. Na primer, aerosoli koji sadrže kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu biti inhalirani (za nazalno, trahealno ili bronhijalno davanje); kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu na primer biti injektovane u mesto povrede, manifestacije bolesti, ili bola; kompozicije mogu biti obezbeđene kao lozenge za oralno, trahealnu ili ezofagusnu primenu; mogu biti obezbeđene u obliku tečnosti, tablete ili kapsule za davanje u stomak ili creva, mogu biti obezbeđeni u obliku supozitorije za rekatalnu ili vaginalnu primenu ; ili mogu čak biti davani u oko upotrebom krema, kapi ili čak injekcije. Formulacije koje sadrže kompozicije prema prikazanom pronalasku kompleksirane sa terapeutskim molekulima ili ligandima mogu čak biti davani hiruški,. na primer zajedno sa polimenerom ili drugom strukturom ili supstancom koja može dozvoliti kompozicijama da difunduju od mesta implantacije do okolnih ćelija. Alternativno, oni mogu biti primenjeni hiruški bez upotrebe polimera ili nosača.

[0090] U jednom primeru primene, kompozicije su formulisane tako da budu pogodne za produženo oslobađanje nukleinskih kiselina koje sadrže. Navedene kompozicije sa produženim oslobađanjem mogu biti pogodne za primenu subjektu u produženim dozirnim intervalima. Na primer, u jednom primeru primene, kompozicije se primenjuju subjektu dva puta dnevno, svakog dana ili svakog drugog dana. U prioritetnom primeru primene, kompozicije predmetnog pronalaska se primenjuju subjektu dva puta nedeljno, jednom nedeljno, svakih deset dana, svake dve nedelje, svake tri nedelje, ili prioritetnije svake četiri nedelje, jednom mesečno, svake šeste nedelje, svake osme nedelje, svakog drugog meseca, svaka tri meseca, svaka četiri meseca, svakih šest meseci, svakih osam meseci, svakih devet meseci ili godišnje. Takođe su razmatrane kompozicije i lipozomalna sredstva koja su formulisana za depo davanje (npr., intramuskularno, subkutanozno, intravitrealno) za ili dostavljanje ili oslobađanje nukleinskih kiselina (npr., iRNA) u toku produženih vremenskih perioda. Prioritento, upotrebljeni načini produženog oslobađanja se kombinuju sa modifikacijama kojima se nukleinskoj kiselini poboljšava stabilnost.

[0091] Dok su određena jedinjenja, kompozicije i postupci predmetnog pronalaska opisana sa specifičnostima u skladu sa određenim primerima primene, primeri koji slede služe samo za ilustraciju kompozicija predmetnog pronalaska i nisu namenjeni da iste ograniče.

[0092] Termin "jedan" koji se ovde koristi, u specifikaciji i patentnim zahtevima, treba shvatiti tako da podrzumeva množinu pojma, osim ukoliko nije jasno naznačeno suprotno. Patenti zahtevi ili opisi koji sadrže "ili" između jednog ili više članova grupe se smatraju zadovoljavajućim ukoliko su jedan, više od jednog ili svi članovi grupe prisutni u, iskoriščeni za, ili na drugi način relevantni za dati proizvod ili process, osim ukoliko nije naznačeno suprotno ili se to drugačije podrazumeva na osnovu konteksta. Pronalazak u kojima tačno jedan član grupe je prisutan, korišćen u, ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili postupak. Pronalazak takođe uključuje izvođenja u kojima više od jedog, ili cela grupa članova je prisutna u, korišćena u ili na drugi način je relevantna za dati proizvod ili postupak. Pored toga, razume se da pronalazak obuhvata sve varijacije, kombinacije i permutacije u kojima jedno ili više ograničenja, elemenata, uslova, ospisnih izraza itd., iz jednog ili više izlistanih zahteva je uneto u drugi zavisni zahtev istog osnovnog zahteva (ili, kada je relevanto, bilo koji drugi zahtev) osim ako na drugi način nije ukazano ili osim ako nije očigledno stručnjaku iz ove oblasti kao kontradiktorno ili nekonzistento. Ukoliko su elementi predstavljeni u vidu liste, (npr. kao Markušijeva grupa ili sličan format) podrazumeva se da je svaka podgrupa elemenata takođe predviđena, kao i da bilo koji element(i) može/mogu biti uklonjen(i) iz grupe. Podrazumeva se takođe da, u principu, kada se pronalazak, ili aspekti pronalaska, definišu tako da podrazumevaju određene elemente, osobine itd., određeni primeri primene pronalaska ili aspekti pronalaska podrazumevaju, ili suštinski podrazumevaju, navedene elemenate, navedene osobine itd. U svrhu jednostavnosti, ovde navedeni primeri primene nisu navedeni u baš svakom slučaju sa mnogo reči. Takođe se razume da bilo koje izvođenje ili aspekt pronalaska može biti eksplicitno isključen iz patentih zaheva, bez obzira da li specifično isključenje je navedeno u opisu.

PRIMERI

Primer 1

Opšta priprema nosača transfera tehnikom razblaživanja rastvarača

[0093] Navedeni primer u principu ilustruje proces proizvodnje malih (<100 nm) lipozomalnih formulacija koje sadrže iRNK, kao i načina procene količine inkapsulirane iRNK. Parametri koji mogu biti modifikovani zarad dalje optimizacije efikasnosti transfekcije obuhvataju, ali nisu ograničeni na, izbor lipida, odnos lipida, molarni odnos lipida koji sadrži PEG, dužinu domena za usidravanje lipida koji sadrži PEG i dimenzioniranje lipozomalnih nosača za prenos.

[0094] Odgovarajuće količine lipida (npr. DSPC/CHOL/DODAP/C8-PEG2000-Cer) za konstrukciju nosača za prenos sa željenim odnosom lipida (npr. molarni odnos 31:40:25:4) su izmerene i rastvorene u apsolutnom etanolu na 70°C da bi se dobili željeni odnosi lipida i koncentracije. Da bi se sinteza lipida pratila, u lipidni rastvor je rutinski dodata mala količina (obično 0,05 mol%) rodamindioleoilfosfatidiletanolamina (Rh-PE).

[0095] iRNK, na primer, koja kodira GFP, OTC ili luciferazu je denaturisana grejanjem na 70°C tokom 10 minuta, nakon čega je sledilo hlađenje na ledu. Navedeni rastvor je analiziran da bi se potvrdila koncentracija iRNK pre formulisanja. Alikvot iRNK je razblažen vodom, a zatim pomešan sa jednakom zapreminom 10 mM citratnog pufera, pH 5,0, tako da finalna koncentracija citrata nakon dodavanja lipida (iz rastvarača) iznosi 4 mM.

[0096] Rastvori iRNK/citratnog pufera su zatim zagrejani do 90°C tokom 5 minuta da bi se potpuno denaturisala iRNK. Prilikom mešanja ili vorteksovanja denaturisane iRNK, u iRNK je dodat rastvor lipida u etanolu (na 70°C) da bi se obrazovale višeslojne vezikule (MLV). MLV su potom, pre ekstruzije, ohlađene do 70°C. Za uzorke pripremljene u visokim koncentracijama rastvarača (> 20%), MLV su pre ekstruzije razblažene sa 5 mM citratnim puferom pH 5,0 (na 70°C) da bi se dobila koncentracija rastvarača od 20% za generisanje jednoslojnih vezikula (LUY).

[0097] MLV su ekstrudirane na 70°C propuštanjem kroz 3 naslagana polikarbonatna filtera (80 nm), upotrebom ekstrudera sa termoskupljajućim materijalom. Rutinski je sprovođeno pet prolazaka kroz filtere da bi se proizvele velike jednoslone vezikule (LUV) željenog raspona veličina. Nakon ekstruzije, formulacije su profiltrirane kroz filter za špric sa veličinom pora od 0.2μm da bi se uklonila mala količina čestičnih materijala koji su imali tendenciju da ometaju određivanje veličine vezikula.

[0098] iRNK koja nije bila vezana za lipozome ili je bila vezana za spoljnu površinu lipozoma koji su sadržavali DODAP je uklonjena anjonskom izmenom tako da se sva preostala vezana iRNK inkapsulirala u lipozome. Dva pogodna postupka uključuju upotrebu anjonske izmene upotrebom Acrodisc jedinica sa MUSTANG Q membranama (Pall Life Sciences) ili anjonsku izmenu upotrebom DEAE-SEPHACEL kolona (Sigma-Aldrich, suspenzija u 20% etanolu). Navedene tehnike su omogućile efikasno uklanjanje neinkapsulirane iRNK bez značajnog razblaživanja formulacija.

[0099] Nakon uklanjanja spoljašnje iRNK, pufer je mogao biti izmenjen upotrebom PD-10 filtracionih kolona sa gelom (SEPHADEX G-25, GE Healthcare) upotrebom protokola sa centrifugiranjem koji omogućava zadržavanje sastojaka male molekulske mase iz formulacije lipozoma (poput rastvarača i borata) u gelu, kao i zamenu ekvilbracionim puferom bez značajnog razblaženja uzorka. Alternativno, u pojedinim eksperimentima, rastvarač može biti uklonjen upotrebom Spectrum 500,000 MWCO dijafiltracionog kertridža. Uzorci su ultrafiltrirani do 2-10 mL, a zatim su dijafiltrirani upotrebom 10 volumena željenog finalnog pufera za ispiranje da bi se uklonio rastvarač i izmenio pufer. Uzorak je ponekad dalje koncentrovan ultrafiltracijom, a nakon procesa dijafiltracije.

[0100] Da bi se kvantifikovala iRNK u uzorcima sa niskim odnosom lipid:iRNK, pripremljena je standarna kriva razblaživanjem osnovnog koncentrovanog rastvora vodom, a da bi se dobili standardi u rasponu od 0-200μg/mL. Uzorci su razblaživani (na osnovu očekivanih koncentracija iRNK) sa odgovarajućim puferom kako bi se obezbedile koncentracije iRNK unutar opsega standardnih koncentracija. Po 180μL alikvota svih standarda ili uzoraka je pomešano sa 300μL 5% SDS-a i 120μL etanola. Uzorci su inkubirani 10 minuta na 50°C da bi se rastvorio lipid. Nakon hlađenja, uzorci su u duplikatu (alikvoti od po 250μL) razliveni u bunariće UV-transparentne mikrotitar ploče. Izmerena je apsorbanca na 260nm, a koncentracija iRNK u uzorcima je izračunata iz standardne krive. U uzorcima u kojima je odnos lipid:iRNK (težina:težina) iznosio 10:1 (ciljni odnos) ili manje, interferencija lipida sa apsorbancom na 260 nm je bila relativno niska i mogla se zanemariti.

[0101] U uzorcima u kojima je odnos lipid:iRNK (težina:težina) bio veći od 10:1, interferencija lipida je postajala značajnija kako se količina lipida povećavala i stoga je bilo potrebno ukloniti lipid da bi se precizno kvantifikovao sadržaj iRNK. Standardna kriva iRNK je pripremljena razblaživanjem osnovnog koncentrovanog rastvora sa vodom da bi se obezbedili standardi u opsegu od 0-250μg/mL. Uzorci koji je bilo potrebno ispitati su razblaženi (na osnovu očekivanih koncentracija iRNK) sa odgovarajućim puferom da bi se proizvele koncentracije iRNK unutar opsega standardnih koncentracija. Po 180 μL svakog standarda ili uzoraka je pomešano sa 20 μL 0,1 M natrijum borata (da bi se povećao pH, čime je neutralisano naelektrisanje DODAP-a u uzorcima lipozoma što rezultuje disocijacijom iRNK sa DODAP-a). U svaki standard ili uzorak je zatim dodato 600 μL smeše hloroform:metanol (1:2, v:v), pa su uzorci vorteksovani. Uz vorteksovanje je dalje dodato 200 μL hloroforma, a zatim i 200 μL vode. Uzorci su snažno vorteksovani i zatim centrifugirani 2 minuta na 1000xg da bi se razdvojile faze. Po 250 μL alikvota gornje (vodene) faze je razliveno (u duplikatu) u bunare UV-transparentne mikrotitar ploče i izmerena je apsorbanca na 260 nm. Koncentracija iRNK u uzorcima je izračunata iz standardne krive. Treba obratiti pažnu da za lipozomske uzorke koji su sadržavali DOTAP (ili bilo koji drugi katjonski lipid koji se ne može neutralisati inkubacijom na visokom pH), navedeni test nije bio pogodan za određivanje koncentracije iRNK obzirom da se iRNK ne može odvojiti od DOTAP-a, a proporcija iRNK ima tendenciju ekstrakcije u rastvarač (CHCl3) faze zajedno sa lipidom.

[0102] Inkapsulacija iRNK je određena razdvajanjem uzoraka na DEAE-SEPHACEL koloni (sa anjon izmenjivačkim gelom) na sledeći način. Upotrebom staklenih Pasterovih pipeta zapremine 2mL koje su bile zapušene staklenom vunom, na DEAE-SEPHACEL kolone je naneto 5 zapremina (~10 mL) 145 mM natrijum hlorida-10 mM boratnog pufera pH 8,0 čime je kolona ekvilibrisana. Zatim je na kolone nanošeno 0,5 mL uzorna, pa je prikupljen eluat. Kolona je dalje isprana nanošenjem 7 alikvota od po 0,5 mL 145 mM natrijum hlorida-10 mM boratnog pufera pH 8,0 i posebno je prikupljana svaka eluirana frakcija. Početni uzorak i svaki alikvot su ispitani na iRNK i lipid kao što je prethodno opisano. Izračunat je % inkapsulacije kao 100 x (iRNK/lipid) materijala koji je eluiran sa kolone/ (iRNK/lipid) početnog uzorka). Na osnovu izračunate koncentracije iRNK iz ekstrakcione analize koja je prethodno opisana, uzorci lipozomalnih iRNK su razblaženi do željene koncentracije iRNK (1 μg) u ukupnoj zapremini od 5 μL (tj.0,2 mg/mL).

Primer 2

Priprema DSPC/CHOL/DODAP/C8-PEG-2000 ceramida (molarni odnos 31:40:25:4)/iRNK Renilla luciferaze (Formulacija 1)

[0103] Formulacija 1 je pripremljena rastvaranjem odgovarajućih masa DSPC, CHOL, DODAP i C8-PEG-2000 ceramida u apsolutnom etanolu, a zatim dodavanjem navedenog rastvora u rastvor iRNK Renilla luciferaze u puferu da bi se produkovale MLV sa 10,8 mg/mL lipida, 250 μg/mL iRNK, 20% rastvarača. MLV su ekstrudirane da bi se dobile LUV, a zatim su LUV propuštene kroz filter sa porama veličine 0,2 μm. Vrednost pH je povećana kombinovanjem jednake zapremine 100 mM NaCl-50 mM borata pH 8,0, pa je iRNK sa spoljašnjosti uklonjena anjonskom izmenom, upotrebom postupka sa DEAE-Sephacel kolonama i centrifugiranjem koji je opisan u Primeru 1. Rastvarač je uklonjen, spoljašni pufer je zamenjen i uzorak je koncentrovan dijafiltracijom/ultrafiltracijom. Koncentrovani uzorak je zatim propušten kroz filter sa porama veličine 0,2 μm, pa su alikvoti razliveni u bočice i čuvani na 2-8°C

Primer 3

Priprema DSPC/CHOL/DOTAP/C8-PEG-2000 ceramida (molarni odnos 31:40:25:4)/iRNK Renilla luciferaze (Formulacija 2)

[0104] Formulacija 2 je pripremljena upotrebom slične metodologije kao za Formulaciju 1 sa manjim izmenama. Ukratko, odgovarajuće mase DSPC, CHOL, DOTAP i C8-PEG-2000 ceramida su rastvorene u apsolutnom etanolu i zatim dodate u rastvor iRNK Renilla luciferaze u puferu da bi se produkovale MLV sa 10,8 mg/mL lipida, 250 μg/mL iRNK, 20% rastvarača. MLV su ekstrudirane da bi se dobile LUV. Pošto je u navedenoj formulaciji upotrebljen DOTAP, iRNK sa spoljašnjosti nije mogla biti efikasno uklonjena anjonskim izmenom i stoga je navedeni korak izostavljen. Rastvarač je uklonjen, spoljašnji pufer je zamenjen i uzorak je koncentrovan dijafiltracijom/ultrafiltracijom. Koncentrovani uzorak je dalje propušten kroz filter sa porama veličine 0,2 μm, pa su alikvoti razliveni u bočice i čuvani na 2-8°C.

Primer 4

Priprema DSPC/CHOL/DODAP/C8-PEG-2000 ceramida (molarni odnos 31:40:25:4)liRNK luciferaze svica (Formulacija 3)

[0105] Za pripremu formulacija 3, odgovarajuće mase DSPC, CHOL, DODAP i C8-PEG-2000 ceramida su rastvorene u apsolutnom etanolu, a zatim dodate u rastvor iRNK luciferaze svica u puferu da bi se produkovale MLV sa 10,8 mg/mL lipida, 250 μg/mL iRNK, 20% rastvarača. MLV su ekstrudirane da bi proizvele LUV, a zatim su propuštene kroz filter sa porama veličine 0,2 μm. Vrednost pH je povećana kombinovanjem sa 0,1 volumenom 0,1 M natrijum borata, pa je iRNK uklonjena sa spoljašnosti anjonskom izmenom, upotrebom postupka sa DEAE-Sephacel kolonama, kao što je opisano u Primeru 1. Rastvarač je uklonjen, zamenjen je spoljašni pufer i uzorak je koncentrovan dijafiltracijom/ultrafiltracijom. Koncentrovani uzorak je potom propušten kroz filter sa porama veličine 0,2 μm, pa su alikvoti razliveni u bočice i čuvani na 2-8°C.

Primer 5

Priprema DSPC/CHOL/DODAP/C8-PEG-2000 ceramida (molarni odnos 31:40:2:4)/iRNK OTC miša (Formulacija 4)

[0106] Formulacija 4 je pripremljena rastvaranjem odgovarajuće mase DSPC, CHOL, DODAP i C8-PEG-2000 ceramida u apsolutnom etanolu, a zatim dodavanjem rastvora u rastvor iRNK OTC miša u puferu da bi se produkovale MLV sa 10,8 mg/mL lipida, 250 μg/mL iRNK, 20% rastvarača. MLV su ekstrudirane da bi dobile LUV, a zatim su iste propuštene kroz filter sa porama veličine 0,2 μm. Vrednost pH je povećana kombinovanjem sa 0,1 volumenom 0,1 M natrijum borata, pa je iRNK uklonjena sa spoljašnjosti anjonskom izmenom, upotrebom postupka sa DEAE-Sephacel kolonama, kao što je opisano u Primeru 1. Rastvarač je uklonjen, zamenjen je spoljašni pufer i uzorak je koncentrovan dijafiltracijom/ultrafiltracijom. Koncentrovani uzorak je zatim propušten kroz filter sa porama veličine 0,2 μm, pa su alikvoti razliveni u bočice i čuvani na 2-8°C.

Primer 6

Priprema i karakterizacija imidiazolnog lipidnog estra holesterola (3S, 10R, 13R, 17R)-10,13-dimetil-17-((R)-6-metilheptan-2-il)-2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradekahidro-1H-ciklopenta[a]fenantren-3-il 3-(1H-imidazol-4-il) propanoat; Imidazolski estar holesterola (ICE)

[0107] Nacrt 1 prikazuje reakcionu šemu za sintezu ICE. Smeša tritil-deamino-histidina (1), (1,97g; 5,15 mmol), holesterola (2), (1,97 g; 5,1 mmol), dicikloheksilkarbodiimida (DCC), (2,12g; 5,2 mmol) i dimetilaminopiridina (DMAP), (0,13g; 1,0 mmol) u anhidrovanom benzenu (100 ml) je mešana na sobnoj temperaturi tokom dva dana. Dobijena suspenzija je profiltrirana kroz Celit, pa je filtrat uklonjen pod sniženim pritiskom. Dobijena pena je osušena pod visokim vakuumom preko noći da bi se obezbedio sirovi estar (3) koji je upotrebljen u sledećem koraku bez prečišćavanja.

[0108] Sirovi ester (3) je rastvoren u anhidrovanom dihlormetanu (DCM), (200ml), pa je na sobnoj temperaturi dodata trifluorosirćetna kiselina (TFA), (50 ml). Dobijeni rastvor je zatim mešan na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Dalje je pažljivo dodat zasićen vodeni rastvor NaHCO3(250ml), nakon čega je dodat i čvrst Na2CO3dok rastvor nije postao blago bazan.

[0109] Faze su razdvojene i vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (200 ml). Organske faze su isprane koncentrovanim slanim rastvorom (200 ml), osušene (Na2SO4) i profiltrirane. Dobijeni filtrat je uparen, a ostatak je osušen pod visokim vakuumom preko noći. Prečišćavanje fleš hromatografijom (silika gel, 0-10% metanolin hloroform) je obezbedilo čist željeni proizvod (4) (1,07g; prinos 37% u dva koraka) u vidu bele čvrste supstance (tt: 192-194°C).

<1>H NMR (CDCI3): δ 0,66 (s, 3H), 0,84-1,64 (m, 33H), 1,76-2,05 (m, 5H), 2,29 (d, 2H), 2,63 (t, 2H), 2,90 (t, 2H), 4,61 (m, 1H), 5,36 (d, 1H), 6,80 (s, 1H), 7,53 (s, 1H).<13>C NMR (CDCI3): δ 11,9; 18,8; 19,4; 21,1; 21,6; 22,6; 22,9; 23,9; 24,4; 27,8; 28,1; 28,3; 31,9; 34,5; 35,9; 36,3; 36,7; 37,0; 38,2; 39,6; 39,8; 42,4; 50,1; 56,2; 56,8; 74,1; 122,8; 134,7; 139,6; 173,4. APCI(<+>)-MS (m/z): izrač. 509, utvrđeno 509. Elem. Anal. (C,H,N): izrač.77,90; 10,30, 5,51; utvrđeno 77,65; 10,37; 5,55.

Primer 7

Protokol formulisanja

[0110] Informaciona RNK luciferaze svica sa optimizovanim kodonima, predstavljena kao SEQ ID NO: 1 (FFL iRNK), je sintetisana in vitro transkripcijom sa plazmidne DNK matrice koja kodira gen, nakon čega je sledilo dodavanje strukture Cap1 na 5’ kraj i poli(A) repa dužine od približno 200 nukleotida na 3' kraj, što je određeno elektroforezom na gelu. (Pogledati, na primer, Fechter P. i saradnici, J. Gen. Virology, 86, 1239-1249 (2005) čije je sadržaj ovde u celini uključen kao referenca) 5’ i 3' netranslatirajući regioni prisutni u iRNK FFL proizvodu su podvučeni (SEQ ID NO: 1).

[0111] Nosači za transfer tipa nanopartikula su sintetisani upotrebom standardnih postupaka ubrizgavanja etanola. (Pogledati, na primer, Ponsa M. i saradnici, Int. J. Pharm.95, 51-56 (1993). čije je sadržaj ovde u celini uključen kao referenca) Osnovni koncentrovani rastvor lipida u etanolu je prethodno pripremljen (koncentracija 50 mg/mL) i čuvan na -20°C.

FFL iRNK je čuvana u vodi sa finalnom koncentracijom od lmg/mL na -80°C, do vremena upotrebe.

[0112] Sve koncentracije iRNK su određene upotrebom Ribogreen testa (Invitrogen). Inkapsulirana iRNK je izračunata upotrebom Ribogreen testa u prisustvu i u odsustvu 0,1% Triton-X 100. Dimenzije čestica (dinamično rasejavanje svetlosti (DLS)) i zeta potencijali su određeni upotrebom Malvern Zetasizer instrumenata u 1xPBS puferu i ImM KCl rastvoru, tim redom.

[0113] Alikvoti rastvora imidazolnog lipidnog estra holesterola (ICE), DOPE i DMG-PEG-2000 u etanolu, koncentracija 50mg/mL, su pomešani i razblaženi etanolom do finalne zapremine od 3mL. Molarni odnos pripremljenog ICE:DOPE:DMG-PEG-2000 nosača za prenos je iznosio 70:25:5. Posebno je od osnovnog koncentrovanog rastvora (lmg/ml) pripremljen vodeni rastvor (10mM citrat/150mM NaCl, pH 4,5) FFL iRNK u puferu. Lipidni rastvor je brzo injeciran u vodeni rastvor iRNK i smeša je treskana da bi se dobila finalna suspenzija u 20% etanolu. Nastala suspenzija nanopartikula je profiltrirana, dijafiltrirana sa 1xPBS puferom (pH 7,4), koncentrovana i čuvana na 2-8°C. Finalna koncentracija je bila jednaka 1,73 mg/mL CO-FF iRNK (inkapsulirane), Zavebio je jednak 68,0nm (sa Dv(50)od 41,8nm i Dv(90)od 78,0 nm), dok je Zeta potencijal bio jednak 25,7 mV.

Analiza biodistribucije

[0114] Sve studije su urađene upotrebom ženki CD-1 miševa starih približno 3 nedelje na početku svakog eksperimenta. Uzorci su uvedeni jednom bolus injekcijom koja je bila ekvivalentna ukupnoj dozi od 200 μg inkapsulirane FFL iRNK, u repnu venu. Četiri sata nakon injekcije miševi su žrtvovani i perfundovani fiziološkim rastvorom.

[0115] Jetra i slezina svakog miša su prikupljeni, podeljeni na tri dela i sačuvani na jedan od sledećih načina (i) potapanjem u 10% neutralno puferisanog formalina, (ii) trenutnim zamrzavanjem i čuvanjem na -80°C za analizu bioluminiscencije (pogledati ispod) ili za studije in situ hibridizacije ili (iii) zarad pripreme preseka, jetra je najpre potopljena u kupatilo izopentana (2-metilbutana), održavano na -35°C, pa je ispirana sa 1xPBS puferom, lagano obrisana specijalnim upijajućim materijalom (kimwipe) da bi se uklonio sav višak tečnosti i stavljena u kupatilo približno 5 -7 minuta, nakon čega je jetra izvađena, umotana u foliju i čuvana u maloj sterilnoj plastičnoj kesi na -80°C dok sve nije bilo spremno za analizu.

[0116] Analiza bioluminiscencije je urađena upotrebom luciferaznog test sistema firme Promega (artikal # E1500 Promega). Priprema tkiva je izvedena na sledeći način: delovi željenog uzorka tkiva (trenutno zamrznutog) su odleđeni, isprani RODI vodom i prebačeni u epruvetu za homogenizaciju sa keramičkim zrncima. Tkivo je tretirano puferom za liziranje i homogenizovano. Nakon podvrgavanja naizmeničnom zaržavanju/odmrzavanju i potom centrifugiranju na 4°C (5 ciklusa), supernatant je prebačen u nove epruvete za mikrocentrifugu. Ponoviti i ekstrakte tkiva čuvati na -80°C.

[0117] Reagensi luciferaznog testa su pripremljeni dodavanjem 10mL pufera iz testa za luciferazu u supstrat testa za luciferazu i zatim mešanjem na vorteksu. Po 20uL homogenata uzoraka je razliveno u mikrotitar ploču sa 96 bunarića nakon čega je dodato po 20μL kontrole u svaki uzorak. Posebno je razliveno po 120μL reagensa luciferaznoog testa (pripremljenog kao što je prethodno opisano) u svaki bunarić mikrotitar ploče sa 96 mesta sa ravnim dnom. Svaka mikrotitar ploča je ubačena u odgovarajuću komoru Molecular Device Flex Station instrumenta i izmerena je luminescenca (u relativnim jedinicama svetlosti (RLU)).

In situ hibridizacija

Priprema preseka tkiva

[0118] Priprema i analiza preseka je urađena na sledeći način: svaka jetra je zamrznuta na -35°C u skladu sa procedurom koja je prethodno opisana. Zamrznute jetre su isečene na preseke debljine 6 mikrometara koji su zatim postavljeni na staklene mikroskopske pločice. Pre in situ hibridizacije, preseci su fiksirani u 4% formaldehidu u fosfatom puferisanom fiziološkom rastvoru (PBS), nakon čega su preseci tretirani smešom anhidrida trientanolamina i sirćetne kiseline, isprani i dehidratisani provlačenjem kroz seriju rastvora etanola.

Priprema cRNK probe

[0119] DNK matrice su dizajnirane tako da se sastoje od pBSKII+ vektora koji sadrži EcoRI i XbaI restrikciona mesta za dobijanje “antisens” i “sens” lanaca, tim redom. cRNK transkripti su sintetisani na osnovu navedenih DNK matrica (“antisens” i “sens” strane, svaki dužine 700bp) upotrebom T3 i T7 RNK polimeraza, tim redom. Matrice su validirane sintezom RNK probe na hladnom pre pripreme riboproba sa<35>S-UTP. Radioaktivno obeležene i “antisens” i “sens” probe su sintetisane in vitro, praćenjem protokola proizvođača (Ambion) i obeležavanjem sa 35S-UTP (>1,000Ci/mmol).

Hibridizacija i procedura ispiranja

[0120] Preseci su hibridizovani preko noći na 55°C u dejonizovanom formamidu, 0,3 M NaCI, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA, 10 mM Na2HPO4, 10% dektran sulfatu, 1X Denhardovom reagensu, sa 50μg/mL ukupne RNK kvasca i 50-80,000 cpm/μL cRNK probe obeležene sa 35S. Tkiva su podvrgnuta jakom ispiranju na 65°C sa 50% formamidom, 2X SSC, 10 mM DTT i dalje ispiranju sa PBS puferom pre tretmana sa 20 μg/ml RNKaze A na 37°C tokom 30 minuta. Nakon pranja u 2X SSC i 0,1X SSC tokom 10 minuta na 37°C, preseci su dehidratisani i izloženi rendgenskom filmu Kodak BioMaxMR tokom 90 minuta, a potom i emulzionoj autoradiografiji sa vremenom ekspozicije od 11 i 24 sata.

Slikanje preseka jetre

[0121] Razvijanje fotografija je urađeno upotrebom Kodak D-19 aparata. Preseci su blago obojeni krezil-ljubičastom kontrastnom bojom i analizirani upotrebom svetlosne i mikroskopije tamnog polja. “Sens” (kontrolne) riboprobe su upotrebljene za utvrđivanje nivoa signala pozadine.

Rezultati in vivo bioluminiscencije

[0122] Životinje su intravenozno injecirane jednom dozom od 200 μg inkapsulirane iRNK i žrtvovane nakon četiri sata. Aktivnost eksprimiranog luciferaznog proteina svica u jetri i slezini je određena bioluminiscentnim testom. Kao što je prikazano na Slici 2, u svakoj ispitivanoj životinji je uočen detektabilan signal koji je bio iznad bazalne vrednosti. Prisustvo luminescentnog signala intenzivnijeg od signala pozadine je ukazalo na ekspresiju luciferaznog proteina svica sa egzogene iRNK. Luminescenca primećena u jetri je bila povećana u odnosu na slične signale koji su uočeni u slezini.

Rezultati in situ hibridizacije

[0123] Studije in situ hibridizacije su urađene na jetri uzetoj iz dve različite životinje iz grupe miševa koji su bili tretirani upotrebom ICE:DOPE:DMG-PEG-2000 nosača transfera (pripremljenog kao što je prethodno opisano), kao i na jednoj kontrolnoj jetri iz grupe netretiranih miševa. Autoradiografski rendgenski filmovi su iskorišćeni za detekciju kodon optimizovane iRNK luciferaze svica, upotrebom probe obeležene sa<35>S-U. (Pogledati, Wilcox J.N., J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993)). Nacrt 3 prikazuje i mikroskopiju na svetlosnom (kontrastno bojenje krezil-ljubičastim) i na mikroskopu tamnog polja za jetre kontrolnih i tretiranih miševa pod malim uvećanjem (2X). iRNK CO-FF luciferaze je detektovana u jetrama obe tretirane grupe (BI i B2, tanke strelice), ali ne i u kontrolnoj jetri (Ct) kada je upotrebljena “antisens” riboproba (Nacrt 38). Visok nivo obeležavanja iRNK je uočen u marginalnoj traci tkiva jetre (velika strelica). Signal nije bio detektovan ni u jednoj od jetri nakon primene kontrolne (“sens”) riboprobe (Nacrt 3C).

[0124] Mikroskopijom tamnog polja u jetrama injeciranih životinja je detektovana obeležena FFL iRNK u vidu svetlih tačaka (uvećanje 100X) nastalih hibridizacijom “antisens” probe za FFL iRNK (Nacrt 4A), dok je istu jetru karakterisalo prisustvo svega nekoliko svetlih tačaka kada je za hibridizaciju upotrebljen “sens” lanac kao proba (Nacrt 4C). Kontrolnu jetru, uzetu iz životinje koja injeciranjem nije primila bilo koju od nanočestica, nije karakterisao nikakav značajan signal pod mikroskopom tamnog polja kada je za hibridizaciju upotrebljena bilo “antisens” (Nacrt 4E) ili “sens” proba (Nacrt 4G).

Primer 8

Rezultati imunohistohemijske analize

[0125] FFL iRNK je upakovana i isporučena upotrebom formulacije lipidnog nosača za prenos koja se sastojala od holesterola, DOPE, DLinDMA i DMG-PEG2000, na način sličan načinu koji je prethodno opisan.

[0126] Translacija FFL iRNK u njen odgovarajući protein je uspešno identifikovana upotrebom imunohistohemijske analize (Nacrt 5). Upotrebom antitela na protein svica, mogla se uočiti ekspresija proteina svica u hepatocitima tretiranih miševa (Nacrti 5B i 5C). Analiza kontrolnih miševa tretiranih sa 1xPBS puferom nije pokazala nikakav detektabilni nivo proteina svica (Nacrt 5A).

Diskusija

[0127] Sintetska informaciona RNK, inkapsulirana u materijalima na bazi lipida, može biti upotrebljena za dopremanje i ekspresiju gena in vivo u jetri, uključujući ekspresiju u heptocitima. Smeše katjonskih, nekatjonskih i lipida modifikovanih sa PEG su upotrebljene za ekspresiju reporterskog proteinskog molekula. Katjonski lipid na bazi imidazola, ICE, je doveo do obogaćene isporuke iRNK u jetri u odnosu na slezinu in vivo. Uočavanje bioluminescentnog signala je ukazalo na translaciju proteinskog reporterskog molekula sa egzogene iRNK koja je dopremljena u lipidnoj nanopartikuli in vivo. Studije in situ hibridizacije su demonstrirale direktnu detekciju egzogene iRNK upotrebom obeležavanja sa<35>S-U riboprobom. Emulziona autoradiografija je proizvela signal koji je mogao biti upotrebljen za lokalizaciju iRNK u tkivu jetre i precizniju lokalizaciju u hepatocitima koji su bili obeleženi u jetri tretiranih životinja (pogledati Nacrti 3 i 4). FFL iRNK nije detektovana u jetri netretiranih kontrolnih miševa.

[0128] Uspešna isporuka navedene iRNK u jetru, a posebno u hepatocite, podržava zaključak da se postupci, formulacije i kompozicije predmetnog pronalaska mogu upotrebljavati za lečenje i korekciju urođenih grešaka u metabolizmu koje su lokalizovane u jetri. Na primer, oboljenja kao što su ASD, ARO, CPS, ASS1 i OTC deficijencije, kao i drugi poremećaji, se mogu lečiti putem genske terapije tipa zamene iRNK za gene koji nedostaju ili nepravilno funkcionišu. Metabolička zonacija ciklusa uree u hepatocitima podrazumeva da se može očekivati da zamena aktivnosti enzima koji nedostaje u navedenim ćelijama znatno poboljša normalnu biohemijsku obradu kod osoba sa deficijencijom enzima, a posebno kod osoba sa poremećajem ciklusa uree.

Izvođenja

[0129]

1. Kompozicija za modulaciju ekspresije proteina u ciljnoj ćeliji, gde pomenuta kompozicija sadrži bar jedan RNK molekul i nosač transfera.

2. Kompozicija prema izvođenju 1, gde je RNK molekul izabran iz grupe koju čine iRNK, mikroRNK, snRNK, i snoRNK.

3. Kompozicija prema izvođenju 2, gde RNK molekul sadrži bar jednu modifikaciju koja doprinosti stabilnosti RNK molekula.

4. Kompozicija prema izvođenju 3, gde RNK molekul sadrži modifikaciju 5’ netranslatirajućeg regiona pomenutog RNK molekula.

5. Kompozicija prema izvođenju 4, gde pomenuta modifikacija obuhvata parcijalnu sekvencu CMV neposrednog ranog 1 (IE1) gena.

6. Kompozicija prema izvođenju 5, gde pomenuta parcijalna sekvenca CMV neopsrednog ranog 1 (IE1) gena sadrži SEQ ID NO:2.

7. Kompozicija prema izvođenju 4, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje poli A kraja.

8. Kompozicija prema izvođenju 4, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje Cap1 strukture.

9. Kompozicija prema izvođenju 3, gde RNK molekul sadrži modifikaciju 3’ netranslatirajućeg pomenutog RNK molekula.

10. Kompozicija prema izvođenju 9, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje sekvence koja kodira humani hormon rasta (hGH).

11. Kompozicija prema izvođenju 10, gde pomenuta sekvenca koja kodira humani hormone rasta (hGH) sadrži SEQ ID NO: 3.

12. Kompozicija prema izvođenju 9, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje poli A kraja.

13. Kompozicija prema izvođenju 1, gde je nosač transfera lipozom.

14. Kompozicija prema izvođenju 1, gde je nosač transfera lipidna nanočestica.

15. Kompozicija prema izvođenju 1, koja sadrži sredstvo koje olakšava transfer RNK molekula u intracelularni deo ciljna ćelije.

16. Kompozicija prema izvođenju 15, gde je sredstvo izabrano iz grupe koju čine protein, peptid, aptamer i oligonukleotid.

17. Kompozicija prema izvođenju 1, koja sadrži ligand koji je u stanju da pospeši afinitet kompozicije ciljne ćelije.

18. Kompozicija prema izvođenju 17, gde je ligand izabran iz grupe koju čine peptid, protein, aptamer, vitamin, i oligonukleotid.

19. Kompozicija prema izvođenju 17, gde je pomenuti ligand izabran iz grupe koju čine apolipoprotein-B i apolipoprotein-E.

20. Kompozicija prema izvođenju 1, koja sadrži sredstvo za stabilizaciju.

21. Kompozicija prema izvođenju 20, što je sredstvo za stabilizaciju izabrano iz grupe koju čine protein, peptid, i aptamer.

22. Kompozicija prema izvođenju 21, gde se sredstvo za stabilizaciju vezuje za RNK molekul.

23. Kompozicija prema izvođenju 1, gde pomenuti nosač transfera sadrži jedan ili više katjonskih lipida.

24. Kompozicija prema izvođenju 1, gde pomenuti nosač transfera sadrži jedan ili više ne-katjonskih lipida.

25. Kompozicija prema izvođenju 1, gde pomenuti nosač transfera sadrži jedan ili više PEG-modifikovanih lipida.

26. Kompozicija prema izvođenju 1, gde pomenuti nosač transfera sadrži CHOL, DOPE, DLinDMA i DMGPEG-2000.

27. Kompozicija prema izvođenju 1, gde pomenuti nosač transera sadrži ICE, DOPE i DMG-PEG-2000.

28. Kompozicija prema izvođenju 1, gde nosač transfera sadrži jedan ili više lipida izabranih iz grupe koju čine ICE, DSPC, CHOL, DODAP, DOTAP i CS-PEG-2000 ceramid.

29. Kompozicija prema izvođenju 14, gde nosač transfera sadrži DSPC, CHOL, DODAP i CSPEG-2000 ceramid.

30. Kompozicija prema izvođenju 1, gde je pomenuta ciljna ćelija izabrana iz grupe koju čine hepatocite, epitelne ćelije, hematopoietske ćelije, epitelne ćelije, endotelijalne ćelije, plućne ćelije, koštane ćelije, stem ćelije, mezenhimalne ćelije, neutralne ćelije, srčane ćelije, adipocite, ćelije vaskularnih glatkih mišića , kardiomiocite, skeletne mišićne ćelije, beta ćelije, hipofizne ćelije, ćelije sinovijalne opne, ćelije jajnika, ćelije testisa, fibroblasta, B ćelija, T ćelija, retikulocite, leukocite, granulocite i ćelije tumora.

31. Kompozicija prema izvođenju 1, gde RNK molekul je iRNK i gde je pomenuti iRNK veći od 1 kDa.

32. Kompozicija za povećanje ekspresije enzima ciklusa uree u ciljnoj ćeliji, gde kompozicija sadrži iRNK i nosač transfera, gde iRNK kodira enzim ciklusa uree i gde iRNK sadrži modifikaciju, pri čemu modifikacija doprinosi stabilnosti iRNK.

33. Kompozicija prema izvođenju 32, gde modifikacija obuhvata izmenu 5’ netranslatirajućeg pomenutog iRNK.

34. Kompozicija prema izvođenju 33, gde pomenuta modifikacija obuhvata parcijalnu sekvencu CMV neopsrednog ranog 1 (IE1) gena.

35. Kompozicija prema izvođenju 34, gde pomenuta parcijalna sekvenca CMV neopsrednog ranog 1 (IE1) gena sadrži SEQ ID NO: 2.

36. Kompozicija prema izvođenju 33, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje poli A kraja.

37. Kompozicija prema izvođenju 33, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje Cap1 strukture.

38. Kompozicija prema izvođenju 32, gde modifikacija sadrži izmenu 3’ netranslatirajućeg regiona pomenute iRNK.

39. Kompozicija prema izvođenju 38, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje sekvence koja kodira humani hormon rasta (hGH).

40. Kompozicija prema izvođenju 39, gde pomenuta skevenca koja kodira humani hormon rasta (hGH) sadrži SEQ ID NO: 3.

41. Kompozicija prema izvođenju 38, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje poli A kraja.

42. Kompozicija prema izvođenju 32, gde je enzim ciklusa uree izabran iz grupe koju čine ornitin transkarbamilaza (OTC), karbamoil-fosfat sintetaza 1 (CPS1), argininosukcinat sintetaza (ASSl), argininosukcinat liaza (ASL), i arginaza 1 (ARG1).

43. Kompozicija prema izvođenju 32, gde sledeći ekspresiju pomenutog enzima uree od pomenute ciljne ćelije, pomenuti enzim ciklusa uree je sekretovan iz pomenute ciljne ćelije.

44. Kompozicija prema izvođenju 32, gde pomenuti nosač transfera sadrži jedan ili više katjonskih lipida.

45. Kompozicija prema izvođenju 32, gde pomenuti nosač transfera sadrži jedan ili više nekatjonskih lipida.

46. Kompozicija prema izvođenju 32, gde pomenuti nosač transfera sadrži jedan ili više PEG-modifikovanih lipida.

47. Kompozicija prema izvođenju 32, gde pomenuti nosač transfera sadrži CHOL, DOPE, DLinDMA i DMGPEG- 2000.

48. Kompozicija prema izvođenju 32, gde pomenuti nosač transfera obuhvata ICE, DOPE i DMG-PEG-2000.

49. Kompozicija prema izvođenju 32, gde nosač transfera sadrži jedan ili više lipida izabranih iz grupe koju čine ICE, DSPC, CHOL, DODAP, DOTAP i CS-PEG-2000 ceramid.

50. Kompozicija prema izvođenju 49, gde nosač transfera obuhvata DSPC, CHOL, DODAP i CSPEG-2000 ceramid.

51. Kompozicija prema izvođenju 32, gde je nosač transfera lipozom.

52. Kompozicija prema izvođenju 32, gde je pomenuti nosač transfera lipidna nanočestica.

53. Kompozicija prema izvođenju 32, dalje sadrži sredstvo za olakšavanje transfera iRNK u intracelularni odeljak cljine ćelije .

54. Kompozicija prema izvođenju 53, gde je sredstvo izabrano iz grupe koju čine protein, peptid, aptamer, i oligonukleotid.

55. Kompozicija prema izvođenju 32, dalje obuhvata ligand koji je u stanju da pospeši afinitet kompozicije za ciljnu ćeliju.

56. Kompozicija prema izvođenju 55, gde je ligand izabran iz grupe koju čine peptid, protein, aptamer, vitamin, i oligonukleotid.

57. Kompozicija prema izvođenju 55, gde je pomenuti ligand izabran iz grupe koju čine apolipoprotein- B i apolipoprotein-E.

58. Kompozicija prema izvođenju 32, dalje sadrži sredstvo za stabilizaciju.

59. Kompozicija prema izvođenju 58, gde je sredstvo za stabilizaciju izabrano iz grupe koju čine protein, peptid, i aptamer.

60. Kompozicija prema izvođenju 58, gde se sredstvo za stabilizaciju vezuje za iRNK.

61. Kompozicija prema izvođenju 32, gde pomenuta ciljna ćelija je hepatocit.

62. Kompozicija prema izvođenju 32, gde pomenuta iRNK je veća od 1 kDa.

63. Postupak lečenja subjekta, gde subjekt ima deficijenciju proteina, koji obuhvata davanje kompozicije koja sadrži iRNK i nosač transfera, gde iRNK kodira funkcionalni protein i gde iRNK obuhvata modifikaciju, gde modifikacija doprinosi stabilnosti iRNK koja se daje.

64. Postupak prema izvođenju 63, gde je ekspresijom pomenute iRNK od strane ciljnih ćelija proizveden funkcionalni protein.

65. Postupak prema izvođenju 64, gde je pomenuti funkcionalni protein sekretovan iz pomenute ciljne ćelije.

66. Postupak prema izvođenju 63, gde iRNK kodira funkcionalni enzim ciklusa uree

67. Postupak prema izvođenju 66, gde je enzim ciklusa uree izabran iz grupe koju čine OTC,CPS1, ASS1, ASL, i ARG1.

68. Postupak prema izvođenju 63, gde modifikacija sadrži izmenu 5’ netranslatirajućeg regiona pomenute iRNK.

69. Postupak prema izvođenju 68, gde pomenuta modifikacija obuhvata parcijalnu sekvencu CMV neposrednog ranog 1 (IE1) gena.

70. Postupak prema izvođenju 69, gde pomenuta pracijalna sekvenca CMV neposrednog ranog 1 (IE1) gena obuhvata SEQ ID NO: 2.

71. Postupak prema izvođenju 68, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivane poli A kraja.

72. Postupak prema izvođenju 68, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje Cap1 strukture.

73. Postupak prema izvođenju 63, gde modifikacija obuhvata izmenu 3’ netranslatirajućeg regiona pomenute iRNK.

74. Postupak prema izvođenju 73, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje sekvence koja kodira humani hormon rasta (hGH).

75. Postupak prema izvođenju 74, gde pomenuta sekvenca koja kodira humani hormon rasta (hGH) sadrži SEQ ID NO: 3.

76. Postupak prema izvođenju 73, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje poli A kraja.

77. Postupak prema izvođenju 63, gde pomenuti nosač transfera sadrži jedan ili više katjonskih lipida.

78. Postupak prema izvođenju 63, gde pomenuti nosač transfera sadrži jedan ili više nekatjonskih lipida

79. Postupak prema izvođenju 63, gde pomenuti nosač transfera sadrži jedan ili više PEG-modifikovanih lipida.

80. Postupak prema izvođenju 63, gde pomenuti nosač transfera sadrži CHOL, DOPE, DLinDMA i DMGPEG-2000.

81. Postupak prema izvođenju 63, gde pomenuti nosač transfera obuhvata ICE, DOPE i DMG-PEG-2000.

82. Postupak prema izvođenju 63, gde je nosač transfera lipozom.

83. Postupak prema izvođenju 63, gde je pomenuti nosač transfera lipidna noanočestica.

84. Postupak prema izvođenju 63, gde kompozicija sadrži sredstvo za olakšavanje transfera iRNK u intracelularni odeljak ciljne ćelije subjekta .

85. Postupak prema izvođenju 84, gde je sredstvo izrabrano iz grupe koj čine protein, peptid, aptamer, i oligonukleotid.

86. Postupak prema izvođenju 63, gde kompozicija sadrži ligand u stanju da poveća afinitet kompozicije za ciljnu ćeliju subjekta.

87. Postupak prema izvođenju 86, gde je ligand izabran iz grupe koju čine peptid, protein, aptamer, vitamin, i oligonukleotid.

88. Postupak prema izvođenju 87, gde je pomenuti ligand izabran iz grupe koju čine apolipoprotein-B i apolipoprotein-E.

89. Postupak prema izvođenju 63, gde kompozicija sadrži sredsvo za stabilizaciju.

90. Postupak prema izvođenju 89, gde sredstvo za stabilizaciju je izabrano iz grupe koju čine protein, peptid, i aptamer.

91. Postupak prema izvođenju 89, gde se sredstvo za stabilizaciju vezuje za iRNK.

92. Postupak prema izvođenju 63, gde je pomenuti iRNK je veći od 1 kDa.

93. Postupak ekspresije funkcionalnog proteina u ciljnoj ćeliji gde je ciljna ćelija deficijenta u pomenutom funkcionalnom proetinu, koji obuhvata dovođenje u kontakt ciljne ćelije sa kompozicijom koja sadrži iRNK i nosač transfera, gde iRNK kodira pomenuti funkcionalni protein i gde iRNK sadrži modifikaciju, u kojoj modifikacija doprinosi stabilnosti iRNK.

94. Postupak izvođenja 93, gde je posle ekspresije pomenute iRNK od strane ciljne ćelije dobijen funkcionalni protein.

95. Postupak prema izvođenju 94, gde je pomenuti funkcionalni proteina sekretovan iz pomenute ciljne ćelije.

96. Postupak prema izvođenju 93, gde je pomenuti deficijentni funkcionalni pretein enzim ciklusa uree.

97. Postupak prema izvođenju 96, gde je enzim ciklusa uree izabran iz grupe koju čine OTC, CPS1, ASS1, ASL, i ARG1.

98. Postupak prema izvođenju 93, gde modifikacija sadrži izmenu 5’ netranslatirajućeg regiona pomenute iRNK.

99. Postupak prema izvođenju 98, gde pomenuta modifikacija obuhvata parcijalnu sekvencu CMV neposrednog ranog 1 (IE1) gena.

100. Postupak prema izvođenju 99, gde pomenuta parcijalna sekvenca CMV neposrednog ranog 1 (IE1) gena sadrži SEQ ID NO: 2.

101. Postupak prema izvođenju 98, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje poli A kraja.

102. Postupak prema izvođenju 98, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje Cap1 strukture.

103. Postupak prema izvođenju 93, gde modifikacija obuhvata izmenu 3’ netranslatirajućeg regiona pomenute iRNK.

104. Postupak prema izvođenju 103, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje sekvence koja kodira humani hormon rasta (hGH).

105. Postupak prema izvođenju 104, gde pomenuta sekvenca koja kodira humani hormon rasta (hGH) sadrži SEQ ID NO: 3.

106. Postupak prema izvođenju 103, gde pomenuta modifikacija obuhvata uključivanje poli A kraja.

107. Postupak prema izvođenju 93, gde pomenuti nosač transfera sadrži jedan ili više katjonskih lipida

108. Postupak prema izvođenju 93, gde pomenuti nosač transfera sadrži jedan ili više nekatjonskih lipida.

109. Postupak prema izvođenju 93, gde pomenuti nosač transfera sadrži jedan ili više PEG-modifikovanih lipida

110. Postupak prema izvođenju 93, gde pomenuti nosač transfera sadrži CHOL, DOPE, DLinDMA i DMGPEG-2000.

111. Postupak prema izvođenju 93, gde pomenuti nosač transfera sadrži ICE, DOPE i DMG-PEG-2000.

112. Postupak prema izvođenju 93, gde je nosač transfera lipozom.

113. Postupak prema izvođenju 93, gde je pomenuti nosač transfera lipidna nanočestica.

114. Postupak prema izvođenju 93, gde kompozicija sadrži sredstvo za olakšavanje transfera iRNK u intracelularni odeljak ciljne ćelije.

115. Postupak prema izvođenju 114, gde je sredstvo izrabrano iz grupe koju čine protein, peptid, aptamer, i oligonukleotid.

116. Postupak prema izvođenju 93, gde kompozicija sadrži ligand koji je u stanju da poveća afinitet kompozicije za ciljnu ćeliju.

117. Postupak prema izvođenju 116, gde je pomeuti ligand izabran iz grupe koju čine apolipoprotein-B i apolipoprotein-E.

118. Postupak prema izvođenju 117, gde pomenuta ciljna ćelija eksprimuje jedan ili više lipoproteinskih receptora male gustine.

119. Postupak prema izvođenju 116, gde je ligand izabran iz grupe koju čine peptid, protein, aptamer, vitamin, i oligonukleotid.

120. Postupak prema izvođenju 93, gde kompozicija sadrži sredstvo za stabilizaciju.

121. Postupak prema izvođenju 120, gde je sredstvo za stabilizaciju izabrano iz grupe koju čine protein, peptid, i aptamer.

122. Postupak prema izvođenju 120, gde se sredstvo za stabilizaciju veže za iRNK.

123. Postupak prema izvođenju 93, gde nosač transfera sadrži jedan ili više lipida izabranih iz grupe koju čine ICE, DSPC, CHOL, DODAP, DOTAP i C8-PEG-2000 ceramid.

124. Postupak prema izvođenju 93, gde nosač transfera sadrži DSPC, CHOL, DODAP i C8-PEG- 2000 ceramid.

125. Postupak prema izvođenju 93, gde je pomenuta ciljna ćelija izabrana iz grupe koju čine hepatocite, epitelne ćelije, hematopoietske ćelije, epitelne ćelije, endotelijalne ćelije, plućne ćelije, koštane ćelije, stem ćelije, mezenhimalne ćelije, neutralne ćelije, srčane ćelije, adipocite, ćelije vaskularnih glatkih mišića , kardiomiocite, skeletne mišićne ćelije, beta ćelije, hipofizne ćelije, ćelije sinovijalne opne, ćelije jajnika, ćelije testisa, fibroblasta, B ćelija, T ćelija, retikulocite, leukocite, granulocite i ćelije tumora.

126. Postupak prema izvođenju 93, gde je pomenuti iRNK veći od 1 kDa.

LISTA SEKVENCI

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje koje ima sledeću strukturu:
2. Nosač transfera koji sadrži jedinjenje prema zahtevu 1 i terapeutsku količinu: (a) nukleinske kiseline, ili (b) proteina.
3. Nosač transfera prema zahtevu 2, još sadrži jedan ili više katjonskih lipida, nekatjonskih lipida, i/ili PEGmodifikovanih lipida.
4. Nosač transfera prema zahtevu 2 ili zahtevu 3, gde je nukleinska kiselina RNK.
5. Nosač transfera prema zahtevu 4, gde je RNK iRNK.
6. Nosač transfera prema zahtevu 2, gde je protein enzim.
7. Nosač transfera prema bilo kom od zahteva 2 do 6, gde je nosač transfera lipidna nanočestica ili lipozom.
8. Nosač transfera prema bilo kom od zahteva 2 do 7, gde nosač transfera inkapsulira nukleinsku kiselinu ili protein.
9. Nosač transfera prema bilo kom od zahteva 2 do 8, gde nosač transfera još obuhvata jedno ili više terapeutskih ili dijagnostičkih sredstava.
10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži nosač transfera prema bilo kom od zahteva 2 do 9.
11. Nosač transfera ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 2 do 10, za upotrebu u lečenju bolesti koja su rezultat deficijencije proteina kod subjekta, gde nukleisnka kiselina kodira protein koji je deficijentan za subjekta, ili protein je protein koji je deficijentan za subjekta.
12. Nosač za transfer ili farmaceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 11, gde je bolest kod subjekta posledica deficijencije proteina izabrana između: spinalne mišićne atrofije (SMA) povezane sa SMN1; amiotrofične lateralne skleroze (ALS); galaktozemije povezana sa GALT; cistične fibroze (CF); poremećaja povezanih sa SLC3Al uključujući cistinuriju; poremećaja povezanih sa COL4A5 uključujući Alportov sindrom; deficijencije galaktoceribrozidaze; X-vezane adrenoleukodistrofije i adrenomijeloneuropatije; Fridrihove ataksije; Pelizeus-Mercbaherove bolesti; tuberozne skleroze povezane sa TSC1 i TSC2; Sanfilipo B sindroma (MPS IIIB); cistinoze povezane sa CTNS; poremećaja povezanih sa FMR1 koji uključuju fragilni X sindrom, fragilni X-vezani sindrom sa tremorom/ataksijom i fragilni X sindrom preuranjene insuficijencije jajnika; Prader-Vilijevog sindroma; nasledne hemoragične telangiektazije (AT); Njuman-Pikove bolest tipa C1; oboljenja povezanih sa neuronalnim ceroidnim lipofuscinozama uključujući juvenilnu insuficijenciju neuronalne ceroidne lipofuscinoze (JNCL), juvenilnu Batenovu bolest, Satavuori-Haltia, Janski-Bielšovski bolest i PTT-1 i TPP1 deficijenciju; dečije ataksije povezane se EIF2B1, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4 i EIF2B5 praćene hipomijelinizacijom/nestankom bele mase centralnog nervnog sistema; epizodne ataksije tipa 2 povezane sa CACNA1A i CACNB4; poremećaja povezanih sa MECP2 uključujući klasičan Retov sindrom, tešku neonatalnu encefalopatiju povezanu sa MECP2 i PPM-X sindrom; atipičanog Retovog sindroma povezanog sa CDKL5; Kenedijeve bolesti (SBMA); cerebralne autozomno-dominantne arteriopatije povezane sa Notch-3 praćene subkortikalnim infarktima i leukoencefalopatijom (CADASIL); poremećaja sa epileptičnim napadima povezanim sa SCN1A i SCN1B; poremećaja povezanih sa polimerazom G koji uključuju Alpers-Hutenloherov sindrom, senzorne ataksične neuropatske disartrije i oftalmopareze povezanu sa POLG i dalje autozomnodominantne i recesivno-progresivne eksterne oftalmoplegije sa delecijama mitohondrijalne DNK; X-vezane adrenalne hipoplazije; X-vezane agamaglobulinemije; i Vilsonove bolesti.
13. Postupak dobijanja jedinjenj prema zahtevu 1, pri čemu postupak obuhvata korak (a), obrazovanja jedinjenja 3 iz jedinjenja 1 i 2: Korak (a)
14. Postupak prema zahtevu 13, gde postupak dalje obuhvata korak (b) tretiranja jedinjenja 3 sa jakom kiselinom da bi se dobilo jedinjenje prema zahtevu 1: Korak (b)
15. Postupak prema zahtevu 13 ili zahtevu 14, gde korak (a) još obuhvata dicikloheksilkarbodiimid (DCC) i dimetilaminopiridin (DMAP).
16. Postupak prema zahtevu 14 ili zahtevu 15, gde je jaka kiselina korišćena u koraku (b) trifluorosirćetna kiselina (TFA).