KR20150127582A - 4''-티오 개질된 뉴클레오티드를 갖는 리보핵산 및 관련 방법 - Google Patents

4''-티오 개질된 뉴클레오티드를 갖는 리보핵산 및 관련 방법 Download PDF

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KR20150127582A
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샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크.
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Abstract

적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기의 푸라노스 환에 4'-티오 개질을 도입한 메신저 RNA 분자 및 관련 조성물, 및 생체내에서 인코딩된 치료 단백질을 생성하고 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위해 이러한 mRNA를 사용하는 방법이 개시된다. 특정 구현예에서, 4'-티오 개질된 mRNA가 생체내 치료에서 증강된 안정성 및/또는 저하된 면역원성을 제공한다.

Description

4'-티오 개질된 뉴클레오티드를 갖는 리보핵산 및 관련 방법{RIBONUCLEIC ACIDs WITH 4'-THIO-MODIFIED NUCLEOTIDES AND RELATED METHODS}
본 출원은 35 U.S.C. §119(e)하에 전문이 본원에 참조로 인용된, 2013년 3월 14일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/785,098호의 이점을 주장한다.
본 발명은 4'-티오 개질된 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 메신저 리보핵산(mRNA) 및 이들 mRNA를 포함하는 조성물, 및 이의 제조방법 및 사용방법에 관한 것이다.
메신저 RNA를 사용하는 유전자 치료는 각종 질환의 치료를 위한 접근법으로서 제안되어 왔다. 숙주 내에서 단백질 생성 수단으로서 메신저 RNA(mRNA)의 도입계획은 이미 보고되었다(참조: Yamamoto, A. et al. Eur. J. Pharm. 71:484-489 (2009); Debus, H. et al. J. Control Rel. 148:334-343 (2010)). 그러나, 생체내 단백질 생성을 위한 mRNA의 성공적인 투여는 전형적으로 패키징된 mRNA(예를 들면, 중합체 또는 지질 담체와 복합체화된 mRNA)를 필요로 했다(참조: 예를 들면, 국제 특허 출원 공보 제WO 2011/06810호 및 제WO 2012/170930호). 패키징되지 않은(누드) mRNA의 투여는 보다 안정하고 유리한 치료를 초래하기 위해 화학적으로 개질된 뉴클레오티드가 mRNA 내에 도입되는 것을 필요로 했다(참조: 예를 들면, M. Kormann et al. Nature Biotech. 29:154-159 (2011); K. Kariko, Molecular Therapy 16(11):1833-1840 (2008)).
생체내에서 생성될 수 있는 치료 단백질을 인코딩하는 mRNA의 투여는 치료 단백질을 인코딩하는 DNA의 투여뿐만 아니라 치료 단백질의 직접 투여에 비해 상당한 이점을 제공할 수 있다. 그러나, 치료 단백질을 인코딩하는 치료 mRNA의 개발은 의학적 치료에 있어서 유망한 진보를 나타내지만, 이러한 치료의 유용성은 생체내에서 mRNA, 특히 전장 단백질을 인코딩하는 것들의 불량한 안정성에 의해 여전히 제한될 수 있다.
특히, 유전자 대체 요법에 사용된 mRNA의 불량한 안정성은 생체내에서 인코딩된 치료 단백질의 불충분하거나 덜 최적화 생성을 초래할 수 있다. 치료 단백질을 인코딩하는 mRNA의 투여 후, mRNA는, 예를 들면, 생체내에서 하나 이상의 뉴클레아제에 노출시 분해될 수 있다. 리보뉴클레아제(예: 엔도리보뉴클레아제 및 엑소리보뉴클레아제)는 RNA의 보다 작은 성분으로의 분해를 촉매작용할 수 있고, 이에 의해 mRNA가 치료 단백질을 생성할 수 없도록 하는 뉴클레아제 효소의 부류를 나타낸다. 따라서, 뉴클레아제 효소(예: RNase)는, 예를 들면, 합성적으로 또는 재조합적으로 제조된 mRNA의 순환 반감기를 단축시킬 수 있다. 핵산 분해 후, mRNA는 번역되지 않고, 따라서 의도된 치료 이점을 발휘하는 것이 방지되고, 이는 mRNA 유전자 치료의 유효성을 상당히 감소시킬 수 있다.
요약
본 발명은 보다 안정한 견고하고 지속된 생체내 단백질 생성을 위한 개선된 변형 mRNA를 제공한다. 본 발명은, 생체내에서 치료 단백질을 생성하는데 사용되는 mRNA의 안정성이 리보스 잔기 중의 4' 산소가 황으로 치환된 개질된 리보뉴클레오티드를 도입함으로써 추가로 개선될 수 있다는 이해에 부분적으로 기초한다. 황에 의한 리보뉴클레오티드의 리보스 잔기 중의 4' 산소의 치환이 에스. 호시카 등(S. Hoshika et al.)(참조: Nuc. Ac. Res. Supp. 3:209-210 (2003)) 및 엠. 다카하시, 엠 등(M. Takahashi, M. et al.)(참조: Nuc. Ac. Res. 37:1353-1362 (2009))에 의해 이미 보고되었지만, 두 리포트는 RNA 간섭을 위한 길이 최대 15개 잔기의 4'-티오 잔기를 함유하는 RNA의 짧은 합성 세그먼트에 관련되고; 4'-티오 개질된 뉴클레오티드를 포함하는 19 내지 21개 잔기의 짧은 RNA도 또한 RNA 간섭(Dande et al., J. Med. Chem. 49:1624-1634 (2006)) 및 압타머 개발(길이 최대 59개 잔기; Hoshika et al., Nuc. Ac. Res. 32:3815-3825(2004); Kato et al., Nuc. Ac. Res. 33:2942-2951 (2005); Minakawa et al., Bioorg. Med. Chem. 16:9450-9456 (2008))을 위해 보고되었다. 그러나, 이러한 리포트는 4'-티오리보뉴클레오티드의 전장 mRNA(즉, 전장 기능성 치료 단백질을 인코딩하고 임의로 하나 이상의 비코딩 영역을 함유하는 mRNA)로의 도입 효과를 예측하지 않고, 이는 일반적으로 종래 기술에서 시험된 간섭성 RNA 또는 압타머 중의 어떤 것보다 더욱 더 긴 길이를 갖고, 균일하게 이중화 상태로 존재하지 않고, 대형 비나선형 및/또는 단일 스트랜드 성분을 갖는 형태를 채택할 수 있다. 보다 중요하게는, 4'-티오 개질된 뉴클레오티드를 도입하는 mRNA가 본 발명 이전에 생체내 단백질 생성을 위해 성공적으로 사용될 수 있었는지는 불분명하였다. 실시예를 포함하는 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 하나 이상의 4'-티오 개질된 뉴클레오티드(예: 4'-티오-ATP, 4'-티오-UTP, 4'-티오-GTP 및/또는 4'-티오-CTP)를 도입하는 전장 mRNA를 성공적으로 합성하였다. mRNA의 길이에 대한 우려에도 불구하고, 본 발명자들은 최대 100% 4'-티오-ATP, 100% 4'-티오-UTP, 100% 4'-티오-GTP 및/또는 100% 4'-티오-CTP를 도입하는 전장 mRNA를 합성할 수 있었다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 이러한 개질된 mRNA는 비개질된 mRNA보다 더 안정하고, 놀랍게도 이러한 대규모 변형은 생체 내에서 효과적으로 변역되는 개질된 mRNA의 능력에 영형을 미치는 것으로 나타나지 않는다.
따라서, 본 발명은, 예를 들면, mRNA의 안정성, 면역원성 및 번역 효율에 대해 우수한 억제를 허용하는 mRNA 및 이러한 mRNA 및, 임의로, 담체를 포함하는 조성물 뿐만 아니라 질환 및/또는 장애를 치료하기 위해 생체내에서 치료 단백질의 발현을 유도하기 위해 이러한 mRNA 및 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 코딩 영역 및 임의로, 하나 이상의 비코딩 영역을 갖는 mRNA 분자를 제공하고, 여기서 mRNA는 4'-티오 치환된 푸라노스 환을 도입하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 4'-티오 치환된 푸라노스 환을 도입하는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 뉴클레오티드 잔기를 함유한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 4'-티오 치환된 푸라노스 환을 도입하는 100% 뉴클레오티드 잔기를 함유한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 4'-티오-ATP를 함유한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 4'-티오-UTP를 함유한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 4'-티오-GTP를 함유한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 4'-티오-CTP를 함유한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 본원에 기재된 다양한 4'-티오-개질된 NTP의 조합을 함유한다.
일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 비코딩 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 폴리-A 및/또는 폴리-U 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 5' 캡 구조를 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 적어도 하나의 비표준 뉴클레오티드 잔기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비표준 뉴클레오티드 잔기는 5-메틸-시티딘, 슈도우리딘 및 2-티오-우리딘 중의 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비표준 뉴클레오티드 잔기는 4'-티오-푸라노스 환을 도입한다. 일부 구현예에서, 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 비표준 뉴클레오티드 잔기는 4'-티오-푸라노스 환을 도입한다.
일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 길이가 적어도 60개 잔기이다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 길이가 적어도 약 70개, 약 80개, 약 90개, 약 100개, 약 150개, 약 200개, 약 300개, 약 400개, 약 500개, 약 1,000개, 약 1,500개, 약 2,000개, 약 2,500개, 약 3,000개, 약 3,500개, 약 4,000개, 약 4,500개 또는 약 5,000개 잔기이다.
본 발명의 추가의 구현예는 코딩 영역 및 임의로, 하나 이상의 비코딩 영역을 갖는 적어도 하나의 mRNA 분자 및 담체를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 mRNA는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물은 코딩 영역 및 임의로, 하나 이상의 비코딩 영역을 갖는 적어도 하나의 mRNA 및 담체를 포함하고, 여기서 mRNA는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기를 포하하고, mRNA는 길이가 적어도 60개 잔기이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 코딩 영역 및 임의로, 하나 이상의 비코딩 영역을 갖는 적어도 하나의 mRNA 분자를 포함하고, 여기서 mRNA는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하고, 중합체계 담체 또는 지질 나노입자와 복합체화된 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기를 포함한다.
본 발명은 코딩 영역 및 임의로, 하나 이상의 비코딩 영역을 갖는 적어도 하나의 mRNA 분자(여기서, mRNA는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기를 포함한다) 또는 이러한 mRNA 및 담체를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함을 포함하는, 생체내에서 치료 단백질을 생성하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 코딩 영역 및 임의로, 비코딩 영역을 갖는 적어도 하나의 mRNA 분자(여기서, mRNA는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기를 포함한다) 또는 이러한 mRNA 및 담체를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하는, 치료 단백질을 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 제공된 방법에 투여된 mRNA는 길이가 적어도 60개 잔기이다. 본원에 기재된 각종 개질된 mRNA는 치료 단백질의 생성용 또는 각종 질환, 장애 또는 상태의 치료용으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 개질된 mRNA를 사용하여 단백질을 생성하는 방법을 제공한다. 이러한 단백질 생성 방법은 시험관내 세포 비함유 시스템, 시험관내 세포계 시스템 또는 생체내 시스템에 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 적합한 mRNA는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 mRNA는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는 뉴클레오티드 잔기(예: ATP, CTP, GTP, UTP, 및/또는 비표준 NTP)를 최대 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 폴리(A) 또는 폴리(U) 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 길이가 적어도 60개 잔기이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 생체내에서 치료 단백질을 생성할 수 있는 약물을 제조하기 위한, 제공된 mRNA 분자의 용도를 제공한다.
일부 기타 구현예에서, 본 발명은 제공된 mRNA의 제조방법을 제공한다. 일부 기타 구현예에서, 본 발명은 제공된 mRNA의 시험관내 합성 방법을 제공한다. 일부 기타 구현예에서, 본 발명은 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는 뉴클레오티드 잔기(예: ATP, CTP, GTP, UTP 및/또는 비표준 NTP)를 최대 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 함유하는 제공된 mRNA의 제조(예: 시험관내 합성) 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이가 적어도 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300, 약 400, 약 500, 약 1,000, 약 1,500, 약 2,000, 약 2,500, 약 3,000, 약 3,500, 약 4,000, 약 4,500 또는 약 5,000개 잔기인 제공된 mRNA의 제조(예: 시험관내 합성) 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 목적 및 이점은 이하 설명에 부분적으로 기재되고, 일부는 설명으로부터 명백해지거나, 본 발명의 실시에 의해 습득할 수 있다. 본 발명의 목적 및 이점은 첨부된 특허청구범위에서 특별히 지적된 요소 및 조합에 의해 실현되고 달성될 것이다.
전술된 일반적 설명 및 하기 상세한 설명 모두가 단지 예시적이고 설명적이며, 청구된 바와 같이 본 발명을 제한하는 것은 아니다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에 도입되어 일부를 구성하는 첨부되는 도면은 본 발명의 다수의 구현예를 예시하고, 설명과 함께 본 발명의 원리를 추가로 설명하는 역할을 한다.
도면은 단지 예시 목적을 위한 것이고 제한을 위한 것은 아니다.
도 1은 예시적인 4'-티오RNA 염기: 4'-티오-아데노신, 4'-티오-구아노신, 4'-티오-시티딘, 4'-티오-우리딘, 4'-티오-5-메틸-시티딘, 4'-티오-슈도우리딘 및 4'-티오-2-티오우리딘의 분자 구조를 도시한다.
도 2는 개질된 및 비개질된 FFL mRNA의 형질감염 후 HEK 293T 세포에서 FFL 루시퍼라제 생성으로부터 루시퍼라제 검출을 도시한다.
도 3은 개질된 및 비개질된 FFL mRNA의 안정성 연구 결과를 도시한다.
도 4는 개질된 및 비개질된 FFL mRNA의 투여 후 마우스 간에서 FFL 루시퍼라제 생성으로부터 루시퍼라제 검출을 도시한다.
본원에 사용된 용어 "mRNA"는 코딩 영역 및 임의로, 비코딩 영역을 포함하는 개질된 및/또는 비개질된 RNA를 의미하기 위해 사용된다. 용어 "코딩 영역"은 아미노산의 쇄, 즉, 펩티드 결합으로 연결된 둘 이상의 아미노산으로 변역될 수 있는 mRNA의 부분 및 영역을 의미한다. 아미노산의 쇄는 또한 단백질(예: 치료 단백질)로 중첩시킬 수 있는 펩티드 또는 폴리펩티드로서 칭명된다. 용어 "비코딩 영역"은 전형적으로 번역되지 않은 mRNA의 부분 또는 영역을 의미한다. 비코딩 영역은 전형적으로 폴리(A) 또는 폴리(U) 테일을 포함하나, 이에 국한되지 않는 5' 비번역된 영역 및/또는 3' 비번역된 영역을 포함한다.
"비표준 핵산염기"는 천연 염기 아데닌(A), 시토신(C), 구아닌(G), 티민(T) 또는 우라실(U) 이외의 염기 잔기이다. 비표준 핵산염기는, 핵산 이중 나선 중의 이의 염기 쌍 특성 및 핵산 이중 나선(RNA 폴리머라제에 의한 DNA 주형의 전사 동안 형성된 것과 같은 로컬 RNA-DNA 나선 포함) 중의 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의한 도입 유전자좌가 5개의 이전에 나열된 핵산염기 중의 하나와 가장 유사한 경우, T의 유사체가 일반적으로 또한 U의 유사체이고, 그 반대이다는 예외로, 특정 핵산염기(A, C, G, T 또는 U)의 유사체이다. "뉴클레오시드", "염기", "뉴클레오티드" 또는 "잔기"를 포함하나, 이에 국한되지 않는 용어와 함께 사용된 용어 "비표준"은 "핵산염기"와 함께 사용되었을 경우와 동일한 방식으로 해석되어야 한다.
본원에 사용된 용어 "치료 단백질"은 대상체에게 투여될 경우, 대상체의 건강 및 복지에 유리한 효과를 제공하는 임의의 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 그 단백질의 결핍, 결여 또는 비정상 발현은 질환 또는 상태를 생성시킨다. "치료 단백질"은 또한 통상적으로 존재하지 않거나 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 대상체에게 충분한 양으로 통상적으로 존재하지 않는 단백질을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "헬퍼 지질"은 콜레스테롤을 포함하는 임의의 중성 또는 쯔비터이온성 지질 물질을 의미한다. 특정 이론에 구속되는 것을 원하지 않고, 헬퍼 지질은 지질 이중층/나노입자 내에서 안정성, 강성 및/또는 유동성을 추가할 수 있다.
본 발명의 mRNA는 대상체에게 투여시 이의 생물학적 특성을 향상시키기 위해 메신저 리보핵산 분자로 치환하기 위해, 뉴클레오티드 잔기의 리보스 잔기 중의 4' 산소가 황으로 치환된 특정의 화학적으로 개질된 염기를 사용한다. 본 발명의 mRNA로 도입하기 위한 예시적 4'-티오 개질된 뉴클레오티드 잔기가 (티오-치환된 푸라노스 환을 함유하는 개질된 뉴클레오티드 잔기를 나타내는) 도 1에 도시된다. 일부 구현예에서, 푸라노스 환의 4'-티오 변형은 인간 혈청 중의 엑소뉴클레아제, 엔도뉴클레아제 및/또는 다른 RNA 분해 효소에 대한 개선된 내성을 제공한다. 이러한 안정성은 증가된 RNA 반감기를 제공할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 푸라노스 환에 4'-티오 변형을 갖는 mRNA 또는 이러한 mRNA를 포함하는 조성물의 투여는 생체내에서 증가된 단백질 생성에 또한 기여하는 개선된 생물학적 특성, 예를 들면, 증가된 반감기를 갖는 mRNA의 세포상 흡수를 유도한다.
특정 구현예에서, RNA 중의 아데노신 뉴클레오티드 잔기의 적어도 1%가 푸라노스 환에 4'-티오 변형을 갖는다. 예를 들면, mRNA 중의 아데노신의 약 1-5%, 5-15%, 15-30%, 30-50%, 50-75%, 75-90%, 90-99% 또는 99-100%는 4'-티오-아데노신일 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA 중의 아데노신 잔기의 적어도 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%는 4'-티오-아데노신이다. 일부 구현예에서, mRNA 중의 아데노신 잔기의 약 100%는 4'-티오-아데노신이다.
특정 구현예에서, RNA 중의 구아노신 뉴클레오티드 잔기의 적어도 1%는 푸라노스 환에 4'-티오 변형을 갖는다. 예를 들면, mRNA 중의 구아노신의 약 1-5%, 5-15%, 15-30%, 30-50%, 50-75%, 75-90%, 90-99% 또는 99-100%는 4'-티오-구아노신일 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA 중의 구아노신 잔기의 적어도 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%는 4'-티오-구아노신이다. 일부 구현예에서, mRNA 중의 구아노신 잔기의 약 100%는 4'-티오-구아노신이다.
특정 구현에에서, RNA 중의 우리딘 뉴클레오티드 잔기의 적어도 1%는 푸라노스 환에 4'-티오 변형을 갖는다. 예를 들면, mRNA 중의 우리딘의 약 1-5%, 5-15%, 15-30%, 30-50%, 50-75%, 75-90%, 90-99% 또는 99-100%는 4'-티오-우리딘일 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA 중의 우리딘 잔기의 적어도 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%는 4'-티오-우리딘이다. 일부 구현예에서, mRNA 중의 우리딘 잔기의 약 100%는 4'-티오-우리딘이다.
특정 구현예에서, RNA 중의 시티딘 뉴클레오티드 잔기의 적어도 1%는 푸라노스 환에 4'-티오 변형을 갖는다. 예를 들면, mRNA 중의 시티딘의 약 1-5%, 5-15%, 15-30%, 30-50%, 50-75%, 75-90%, 90-99% 또는 99-100%는 4'-티오-시티딘일 수 있다.
일부 구현예에서, mRNA 중의 시티딘 잔기의 적어도 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%는 4'-티오-시티딘이다. 일부 구현예에서, mRNA 중의 시티딘 잔기의 약 100%는 4'-티오-시티딘이다.
일부 구현예에서, 제공된 mRNA 중의 각각의 4'-티오 개질된 뉴클레오티드는 4'-티오-우리딘이다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA 중의 각각의 4'-티오 개질된 뉴클레오티드는 4'-티오-시티딘이다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA 중의 각각의 4'-티오 개질된 뉴클레오티드는 독립적으로 4'-티오-우리딘 또는 4'-티오-시티딘이다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 이상의 4'-티오-우리딘 또는 4'-티오-시티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 적어도 하나의 4'-티오-아데노신 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 적어도 하나의 4'-티오-구아노신 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 적어도 하나의 4'-티오-구아노신 또는 4'-티오-아데노신 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 이상의 4'-티오-구아노신 또는 4'-티오-아데노신 잔기를 포함한다.
특정 구현예에서, 하나의 염기 형태(예: 아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘)의 푸라노스 환에 4'-티오 변형을 갖는 뉴클레오티드 잔기의 분획은 다른 염기 형태의 개질된 뉴클레오티드 잔기의 분획과 독립적으로 변화한다.
특정 구현예에서, 10% 미만의 뉴클레오티드 잔기는 푸라노스 환에 4'-티오 변형을 갖는다. 예를 들면, 약 1-5%, 5-10%, 3-5%, 1-3%, 0.1-1% 또는 0.01-0.1%의 뉴클레오티드 잔기는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입할 수 있다.
기타 구현예에서, 10% 이상의 뉴클레오티드 잔기는 푸라노스 환에 4'-티오 변형을 갖는다. 예를 들면, 약 10-15%, 15-20%, 20-25%, 25-30%, 30-35%, 35-40%, 40-45% 또는 45-50%의 뉴클레오티드 잔기는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입할 수 있다. 일부 구현예에서, 50% 이상의 뉴클레오티드 잔기는 푸라노스 환에 4'-티오RNA 변형을 갖는다. 예를 들면, 약 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-100%, 95-97%, 97-98%, 98-99%, 99-99.9% 또는 99.9-100%의 뉴클레오티드 잔기는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입한다.
일부 구현예에서, 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 뉴클레오티드 잔기는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입할 수 있다. 일부 구현예에서, 약 100% 뉴클레오티드 잔기는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입할 수 있다.
본 발명의 mRNA 중의 코딩 및 비코딩 영역은 서열의 비연속 영역을 포함할 수 있다. 임의의 비코딩 영역은 5' 비번역된 영역(UTR), 3' UTR, 폴리-A, 폴리-U 또는 폴리-C 테일, 및/또는 5' 캡 구조 중의 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 비코딩 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 5' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 3' UTR을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 5' 캡 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 폴리-A 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 5'-UTR 서열, 3'-UTR 서열 및 폴리-A 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 5'-UTR 서열, 코딩 영역, 3'-UTR 서열 및 폴리-A 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 5'-UTR 서열, 5' 캡, 3'-UTR 서열 및 폴리-A 테일을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 5'-UTR 서열, 5' 캡, 코딩 영역, 3'-UTR 서열 및 폴리-A 테일을 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리-A, 폴리-U 또는 폴리-C 테일은 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 단지 폴리-A, 폴리-U 또는 폴리-C 테일 또는 비코딩 영역의 다른 성분은 푸라노스 환에 4'-티오 치환을 갖는 뉴클레오티드 잔기를 도입하는 반면, mRNA 분자 중의 뉴클레오티드 잔기의 나머지는 4'-티오-푸라노스 변형을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 코딩 영역은 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 특정 구현예에서, 코딩 및 비코딩 영역은 모두 (존재할 경우) 푸라노스 환에 4'-티오 치환을 갖는 뉴클레오티드 잔기를 도입한다. 특정 구현예에서, 폴리-A, 폴리-U 또는 폴리-C 테일의 길이는 변할 수 있다. 예를 들면, 폴리-A, 폴리-U 또는 폴리-C 테일의 길이는 길이가 적어도 약 50, 70, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500개 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리-A, 폴리-U 또는 폴리-C 테일의 길이는 길이가 약 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400 또는 500개 미만의 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, mRNA 분자는 4'-티오-치환된 푸라노스 환 이외에 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, 분자는 임의의 비표준 핵산염기를 도입할 수 있다. 특정 구현예는 뉴클레오티드 잔기 변형, 예를 들면, 5-메틸-시티딘("5mC"), 슈도우리딘("ΨU"), 2-티오-우리딘("2sU"), 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린 및 2-클로로-6-아미노퓨린 시토신 뿐만 아니라 이러한 변형 및 다른 뉴클레오티드 잔기 변형의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예는 뉴클레오티드 잔기, 예를 들면, 핵산염기의 푸라노스 환 또는 다른 부분에 대한 추가의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 4'-티오 치환된 푸라노스 환은 변형되지 않거나 개질된 염기, 예를 들면, 슈도우리딘, 2-티오우리딘 및 5-메틸시티딘 내에 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, 임의의 이러한 변형은 뉴클레오티드 잔기의 0-100% - 예를 들면, 0%, 1%, 10%, 50%, 90% 또는 95% 이상 또는 100%의 뉴클레오티드 잔기에 개별적으로 또는 조합으로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 적어도 하나의 비표준 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비표준 뉴클레오티드 잔기는 5-메틸-시티딘, 슈도우리딘 및 2-티오-우리딘 중의 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 5--메틸-시티딘 중의 적어도 하나의 비표준 뉴클레오티드 잔기. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비표준 뉴클레오티드 잔기는 4'-티오-푸라노스 환을 도입한다. 일부 구현예에서, 최대 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 비표준 뉴클레오티드 잔기는 4'-티오-푸라노스 환을 도입한다.
추가의 변형은, 예를 들면, 당 변형 또는 치환(예: 하나 이상의 2'-O-알킬 변형, 잠금 핵산(LNA))을 포함할 수 있다. 당 변형이 2'-O-알킬 변형인 구현예에서, 이러한 변형은 2'-데옥시-2'-플루오로 변형, 2'-O-메틸 변형, 2'-O-메톡시에틸 변형 및 2'-데옥시 변형을 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다.
특정 구현예에서, 0-100%의 mRNA는 단일 스트랜드일 수 있다. 특정 구현예에서, 0-100%의 RNA는 비나선형 형태를 채택할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 100%의 우리딘 잔기가 4'-티오-우리딘으로 치환된 mRNA를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 100%의 우리딘 잔기가 4'-티오-우리딘으로 치환되고, 약 100%의 시티딘 잔기가 5-메틸-시티딘으로 치환된 mRNA를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 100%의 우리딘 잔기가 4'-티오-슈도우리딘으로 치환된 mRNA를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 100%의 우리딘 잔기가 4'-티오-슈도우리딘으로 치환되고, 약 100%의 시티딘 잔기가 5-메틸-시티딘으로 치환된 mRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 상응하는 천연 mRNA와 비교하여, 유리한 생물학적 효과, 예를 들면, 증가된 안정성, 개선된 단백질 생성 속도 및/또는 높은 단백질 수율을 제공하지만, 이에 국한되지 않는다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 상응하는 천연 mRNA(즉, 변형 없이 상응하는 mRNA)와 비교하여, 생체내 투여시 증가된 안정성(예: 더 긴 혈청 반감기)을 갖는다.
본 발명의 mRNA는 변형 없는 상응하는 mRNA와 비교하여, 대상체에게 투여시 mRNA 전사물로부터 번역된 치료 단백질의 양에서 적어도 약 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 33%, 36%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%, 110%, 120%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 750%, 800%, 900% 또는 1,000% 증가를 초래하는 정도까지 뉴클레아제(예: 엔도뉴클레아제) 분해에 더욱 내성일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 중의 개질된 mRNA 분자의 길이는 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드 잔기이다. 예를 들면, mRNA는 길이가 적어도 약 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 또는 5000개 뉴클레오티드 잔기일 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 길이가 적어도 60개 잔기이다. 일부 구현예에서, 제공된 mRNA는 길이가 적어도 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 150, 약 200, 약 300, 약 400, 약 500, 약 600, 약 700, 약 800, 약 900, 약 1,000, 약 1,500, 약 2,000, 약 2,500, 약 3,000, 약 4,000, 약 5,000, 약 6,000 또는 약 7000개 잔기이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명의 mRNA에 의해 인코딩된 치료 단백질은 그 단백질의 결핍, 결여 또는 비정상 발현이 질환 및/또는 상태를 일으키는 임의의 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 효소일 수 있다. 기타 구현예에서, 치료 단백질은 통상적으로 존재하지 않거나 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 대상체에서 충분한 양으로 통상적으로 존재하지 않는 것이다.
예를 들면, 적합한 치료 단백질의 비제한적 선택은 에리트로포이에틴, 인슐린, 인간 성장 호르몬, 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절인자(CFTR), 인슐린, 알파-갈락토시다제 A, 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-설파타제, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사미니다제, 알파-글루코사미니드 아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민 6-설파타제, N-아세틸갈락토사민-4-설파타제, 베타-글루코시다제, 갈락토스-6-설페이트 설파타제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 글루코세레브로시다제, 헤파란 설파미다제, 히알루로니다제, 갈락토세레브로시다제, 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC), 카바모일-포스페이트 합성효소 1(CPS1), 아르기니노석시네이트 합성효소(ASS1), 아르기니노석시네이트 리아제(ASL), 아르기나제 1(ARG1), 글루코스-6-포스파타제, 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제, 글리코겐 탈분지 효소, 리소좀 알파-글루코시다제, 1,4-알파-글루칸 분지 효소, 글리코겐 포스포릴라제, 포스포프럭토키나제, 간 포스포릴라제, GLUT-2, UDP 글리코겐 합성효소, 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트 설페이트 실파타제, 헤파란 설페이트 설파미다제, 알파-N-아세틸글루코스 아미다제, 알파-글루코사미니드-N-아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민-6-설페이트 설파타제, 아포지단백질 E, 저밀도 지단백질 수용체(LDLR), 응고 인자, 예를 들면, 인자 VIII 및 인자 IX, 척수 운동 뉴런 1(SMN1), 페닐알라닌 하이드록실라제, 프로피오닐-CoA 카복실라제, 포르포빌리노겐 데아미나제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제, 우레이트 옥시다제, C1 에스테라제 억제제 및 산 알파-글루코시다제를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 mRNA 분자는 누드 또는 비패키징된 mRNA로서 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중의 mRNA의 투여는 적합한 담체의 포함으로 촉진시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 담체는 하나 이상의 mRNA에 의한 표적 세포의 형질감염을 촉진시키는 이의 능력에 기초하여 선택된다.
본원에 사용된 용어 "담체"는 일반적으로 mRNA를 포함하는 생물학적 활성제의 투여와 함께 사용하도록 의도된 표준 약제학적 담체, 비히킬, 희석제, 부형제 등 중의 어느 하나를 포함한다. 조성물 및, 특히 본원에 기재된 담체는 이들의 표적 세포 또는 조직에 다양한 크기의 mRNA를 전달하고/하거나 안정화시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대형 mRNA(예: 길이가 적어도 5kDa, 10kDa, 12kDa, 15kDa, 20kDa, 25kDa, 30kDa 또는 그 이상 또는 적어도 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 5,500, 6,000, 6,500 또는 7,000개 잔기인 mRNA)를 전달할 수 있는 담체를 포함한다. 본 발명에 따르는 mRNA는 공지된 다양한 방법 중의 어느 하나에 따라서 합성할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따르는 mRNA는 시험관내 전사(IVT)를 통해 합성할 수 있다. 간단하게, IVT는 전형적으로 프로모터를 함유하는 직쇄상 또는 환상 DNA 주형, 목적하는 양(들)의 4'-티오 개질된 표준 및/또는 비표준 리보뉴클레오티드(예: 하나 이상의 목적하는 4'-티오-NTP(들))를 포함하고 임의로 비개질된 리보뉴클레오티드 트리포스페이트와 혼합된 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충 시스템 및 적합한 RNA 폴리머라제(예: T3, T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제), DNAse I, 피로포스파타제 및/또는 RNAse 억제제로 수행한다. 정확한 조건은 특정 용도에 따라서 변할 것이다. 4'-티오 개질된 표준 및/또는 비표준 리보뉴클레오티드는 임의의 길이의 전장 mRNA에 효과적으로 도입될 수 있다는 것이 관찰된다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따르는 mRNA를 제조하기 위해, DNA 주형은 시험 관내에서 전사된다. 적합한 DNA 주형은 전형적으로 시험관내 전사를 위해 프로모터, 예를 들면, T3, T7 또는 SP6 프로모터, 이어서 목적하는 단백질을 인코딩하기 위한 목적하는 뉴클레오티드 서열 및 종결 신호를 갖는다. 전형적으로, mRNA 합성은 N-말단(5') 단부에 "캡" 및 C-말단(3') 단부에 "테일"의 첨가를 포함한다. 캡의 존재는 대부분의 진핵세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 내성을 제공하는데 중요하다. "테일"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명에 따르는 mRNA는 5' 캡 구조를 포함한다. 5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 첨가한다: 먼저, RNA 말단 포스파타제는 5' 뉴클레오티드로부터 말단 포스페이트 그룹 중의 하나를 제거하여 두 개의 말단 포스페이트를 남기고; 이어서, 구아노신 트리포스페이트(GTP)를 구아닐릴 트랜스퍼라제를 통해 말단 포스페이트에 첨가하여 5'5'5 트리포스페이트 결합을 생성하고; 이어서 구아닌의 7-질소를 메틸트랜스퍼라제에 의해 메틸화한다. 캡 구조의 예로서는 m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A 및 G(5')ppp(5')G를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따르는 mRNA는 3' 테일 구조를 포함한다. 적합한 3' 테일 구조는 폴리-A, 폴리-U 및/또는 폴리-C 테일을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 예시적인 적합한 폴리-A, 폴리-U 및 폴리-C 테일은 상기 기재되어 있다. 폴리-U 또는 폴리-C 테일은 폴리-A 테일에 첨가할 수 있거나 폴리-A 테일을 치환할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따르는 mRNA는 5' 및/또는 3' 비번역 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 mRNA 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들면, 철 반응성 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 비번역 영역은 길이가 약 50 내지 500개 뉴클레오티드(예: 길이 약 50 내지 400개 뉴클레오티드, 길이 약 50 내지 300개 뉴클레오티드, 길이 약 50 내지 200개 뉴클레오티드 또는 길이 약 50 내지 100개 뉴클레오티드)일 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 담체는 표적 세포, 조직 또는 기관으로 mRNA의 전달을 최적화하기 위해 선택되고/되거나 제조될 수 있다. 예를 들면, 표적 세포가 폐포 세포인 경우, 담체의 특성(예: 크기, 전하 및/또는 pH)은 이러한 담체를 표적 세포 또는 기관에 효과적으로 전달하고, 면역 클리어런스를 감소시키고/시키거나 그 표적 기관에서 유지를 촉진시키도록 최적화할 수 있다. 대안적으로, 표적 조직이 중추신경계(예: 표적화 뇌 영역(들) 또는 척수 조직에 mRNA 폴리뉴클레오티드의 전달을 촉진시키기 위해)인 경우, 담체의 선택 및 제조는 혈액 뇌 관문의 침투 및 혈관 뇌 관문 내의 유지 및/또는 이러한 담체를 이러한 표적 조직에 직접 전달하기 위한 대체 수단의 사용을 고려해야 한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 이러한 조성물이 하나 이상의 말초 표적 기관 및 조직에 투여된 국소 조직 또는 기관으로부터 외인성 폴리뉴클레오티드의 전사를 촉진시키는 제제와 결합시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물에 사용된 담체는 표적 세포 및 조직으로 mRNA의 전사를 촉진시키기 위해 리포좀 소포 또는 다른 수단을 포함할 수 있다. 적합한 담체는 중합체계 담체, 예를 들면, 폴리에틸렌이민(PEI), 지질 나노입자 및 리포좀, 나노리포좀, 세라미드 함유 나노리포좀, 프로테오리포좀, 천연 및 합성 유도 엑소솜 둘 다, 천연, 합성 및 반합성 층상체, 나노미립자, 칼슘 형광체-실리케이트 나노미립자. 졸-겔, 인산칼슘 나노미립자, 이산화규소 나노미립자, 나노결정성 미립자, 반도체 나노미립자, 폴리(D-아르기닌), 나노덴드리머, 전분계 전달 시스템, 미셀, 에멀젼, 니오솜, 플라스미드, 바이러스, 인산칼슘 뉴클레오티드, 압타머, 펩티드 및 기타 벡터형 태그를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 적합한 담체로서 바이오나노캡슐 및 기타 바이러스 캡시드 단백질 어셈블리의 사용도 또한 예상된다(참조: Hum. Gene Ther. 19(9):887-95 (2008)).
본 발명의 특정 구현예에서, 담체는 담체로서 중합체를 단독으로 또는 다른 담체와 함께 사용하여 제형화된다. 적합한 중합체는, 예를 들면, 폴리아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리락티드, 폴리락티드-폴리글리콜리드 공중합체, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 알기네이트, 콜라겐, 키토산, 사이클로덱스트린, 프로타민, PEG화 프로타민, PLL, PEG화 PLL 및 분지된 PEI(25kDa)를 포함하지만, 이에 국한되지 않는 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 하나 이상의 다중-도메인-블록 중합체일 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체는 중합체 또는 중합체들의 무수 분말 제형을 포함할 수 있다.
표적 세포로 폴리뉴클레오티드의 전달을 촉진시키기 위해 리포좀 담체의 사용도 또한 본 발명에 의해 예상된다. 리포좀(예: 리포좀 지질 나노입자)은 일반적으로 연구, 산업 및 의학에서 다양한 용도로, 특히 생체 내 진단 또는 치료 화합물의 담체로서의 이들의 사용에 유용하고(참조: Lasic et al., Trends Biotechnol., 16:307-321 (1998); Drummond et al., Pharmacol. Rev., 51:691-743 (1999)), 일반적으로 하나 이상의 이중층의 막에 의해 외측 매체로부터 격리된 내부 아쿠아 공간을 갖는 미소한 소포로서 특성화된다. 리포좀의 이중층 막은 전형적으로 공간적으로 분리된 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 합성 또는 천연 기원 지질과 같은 양쪽성 분자에 의해 형성된다. 리포좀의 이중층 막은 또한 양쪽성 중합체 및 계면활성제(예: 폴리머좀, 니오좀 등)에 의해 형성할 수 있다.
특정 구현예에서, mRNA 분자는 표적 세포로의 전달을 촉진시키기 위해 지질 나노입자와 복합체화된다. 적합한 지질의 예는, 예를 들면, 포스파티딜 화합물(예: 포스파디닐글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로시드 및 강글리오시드)을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 mRNA 분자 및 조성물은 다양한 핵산계 물질을 캡슐화하도록 설계된 하나 이상의 양이온성 지질, 헬퍼 지질 및 PEG화 지질을 사용하여 다양한 비의 다성분 지질 혼합물과 결합시킬 수 있다.
양이온성 지질은 DOTAP (1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판), DODAP (1,2-디올레일-3-디메틸암모늄 프로판), cKK-E12 (3,6-비스(4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부틸)피페라진-2,5-디온), 디알킬아미노계, 이미다졸계, 구아니디늄계, XTC (2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란), MC3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트), ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민)), NC98-5 (4,7,13-트리스(3-옥소-3-(운데실아미노)프로필)-N1,N16-디운데실-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-1,16-디아미드), HGT4003 (제WO 2012/170889호, 이의 교시는 전문이 본원에 참조로 인용된다), ICE (제WO 2011/068810호, 이의 교시는 전문이 본원에 참조로 인용된다), HGT5000 (미국 가특허 출원 제61/617,468호, 이의 교시는 전문이 본원에 참조로 이용된다) 또는 HGT5001(시스 또는 트랜스)(가특허 출원 제61/617,468호), 아미노알콜 리피도이드, 예를 들면, 제WO2010/053572호에 기재된 것들, DOTAP (1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판), DOTMA (1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판), DLinDMA (참조: Heyes, et al., J. Contr. Rel. 107:276-287(2005)), DLin-KC2-DMA (참조: Semple, et al., Nature Biotech. 28:172-176 (2010)), C12-200 (참조: Love, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 107:1864-1869(2010))을 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 cKK-E12이다:
Figure pct00001
적합한 헬퍼 지질은 DSPC (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DPPC (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DOPE (1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DPPE (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DMPE (1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DOPG (,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)) 및 콜레스테롤을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
나노입자 제형에 사용하기 위한 PEG화 지질은 C6-C20 길이의 알킬 쇄(들)를 갖는 지질에 공유결합된 길이 최대 5kDa의 폴리(에틸렌) 글리콜 쇄, DMG-PEG2K, PEG-DSG, PEG-DMG 및 PEG-세라미드를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
특정 구현예에서, 지질 나노입자 담체는 다음 지질 제형 중의 하나를 포함한다:
C12-200, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K;
DODAP, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K;
HGT5000, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K;
HGT5001, DOPE, 콜레스테롤, DMG-PEG2K;
XTC, DSPC, 콜레스테롤, PEG-DMG;
MC3, DSPC, 콜레스테롤, PEG-DMG;
ALNY-100, DSPC, 콜레스테롤, PEG-DSG.
특정 구현예에서, 본 발명의 mRNA 및 이러한 mRNA를 포함하는 조성물은 전신 방식보다 국소로, 예를 들면, 표적화 조직에 약제학적 조성물의 직접 주사를 통해 바람직하게는 서방출 제형으로 투여될 수 있다. 국소 전달은 표적화되는 조직에 따라 다양한 방식으로 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 mRNA 및 조성물을 함유하는 에어로졸은 흡입될 수 있고(비, 기관 또는 기관지 전달을 위해); 본 발명의 mRNA 및 조성물은, 예를 들면, 손상, 질환 증상 또는 통증의 부위로 주입될 수 있고; 조성물은 경구, 기관 또는 식도 적용을 위한 로젠지로 제공될 수 있고; 위 또는 장에 투여하기 위한 액체, 정제 또는 캡슐 형태로 제공될 수 있고, 직장 또는 질 적용을 위한 좌제 형태로 제공될 수 있고; 또는 심지어 크림, 점적제 또는 심지어 주사를 사용하여 눈에 전달될 수 있다.
본원에 개시된 하나 이상의 리포좀 나노입자를 포함하는 동결건조된 약제학적 조성물 및, 예를 들면, 이의 교시가 전체로 본원에 참조로 인용된 국제 특허 공보 제WO 2012/170889호에 개시된 이러한 동결건조된 조성물을 사용하기 위한 관련 방법도 또한 본원에서 예상된다. 예를 들면, 본 발명의 동결건조된 mRNA 및 조성물은 투여 전에 재구성될 수 있거나 생체내에서 재구성될 수 있다. 예를 들면, 동결건조된 mRNA 및/또는 조성물은 적합한 투여 형태(예: 디스크, 로드 또는 막과 같은 피내 투여 형태)로 제형화될 수 있고, 투여 형태가 개체의 체액에 의해 생체내에서 경시적으로 재수화되도록 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 mRNA 또는 조성물을 투여함을 포함하는 대상체의 치료 방법도 또한 예상된다. 예를 들면, 본 발명의 특정 구현예는 특별한 단백질의 생성 및/또는 특별한 단백질의 이용이 부적당하거나 손상되는 상태를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 표적 세포에서 하나 이상의 mRNA의 번역 효율을 조절하는(예: 증가시키고, 개선시키거나 또는 강화시키는) 방법을 제공한다. 본원에 사용된 어구 "번역 효율"은 mRNA가 번역되고 인코딩된 치료 단백질이 생성되는 정도를 의미한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 mRNA 분자 또는 이러한 mRNA를 포함하는 조성물이 환자에게 투여된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 mRNA 분자 또는 이러한 mRNA를 포함하는 조성물은 시험관내 또는 생체내 시스템에서 단백질 생성용으로 사용된다. 적합한 시험관내 시스템은 시험관내 세포 부재 시스템 또는 시험관내 세포계 시스템일 수 있다. 적합한 생체내 시스템은 임의의 살아 있는 유기체, 예를 들면, 비-인간 동물(예: 래트, 마우스, 돼지, 개, 닭, 양, 비-인간 영장류 등) 또는 인간일 수 있다.
실시예
하기 구체적인 실시예는 단지 예시로서 해석되어야 하고, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 추가로 상술하지 않고도, 당해 기술분야의 숙련가는 본 명세서의 기재에 기초하여 본 발명을 최대한으로 이용할 수 있는 것으로 생각된다.
실시예 1: 4 '- 티오 -치환된 푸라노스 환을 도입한 mRNA의 합성 및 발현
단백질을 인코딩하는 mRNA를 합성한다. mRNA는 적어도 하나의 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 함유한다. mRNA는 약제학적 조성물로 제형화되고, 대상체에게 투여된다. mRNA는 보다 긴 반감기를 나타낼 수 있고, 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 함유하지 않는 대조군 mRNA보다 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 보다 큰 양의 합성을 가져올 수 있다.
I. 제형화 실험 상세:
I-a. 메신저 RNA 재료
반딧불 루시퍼라제(FFL), 인간 에리트로포이에틴(EPO) 및 인간 알파-갈락토시다제(GLA)는, 5' 캡 구조(Cap1)[참조: Fechter and Brownlee, J. Gen. Virology 86:1239-1249(2005)] 및 겔 전기영동에 의해 측정된 바와 같이 대략 200개 뉴클레오티드 길이의 3' 폴리(A) 테일을 부가하는 유전자를 인코딩하는 플라스미드 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 합성한다. 각각 mRNA 생성물에 존재하는 5' 및 3' 비번역된 영역은 각각 X 및 Y로서 제시되어 있고, 기재된 바와 같이 정의된다(하기 참조).
인간 에리트로포이에틴(EPO) mRNA (서열번호 1):
Figure pct00002
인간 알파-갈락토시다제(GLA) mRNA (서열번호 2):
Figure pct00003
코돈-최적화된 반딧불 루시퍼라제(FFL) mRNA (서열번호 3):
Figure pct00004
X1(5' 비번역된 서열)(서열번호 4):
Figure pct00005
X2(5' 비번역된 서열)(서열번호 5):
Figure pct00006
Y1(3' 비번역된 서열)(서열번호 6):
Figure pct00007
Y2(3' 비번역된 서열)(서열번호 7):
Figure pct00008
I-b. 제형 프로토콜
프로토콜 A: C12-200, DOPE, Chol 및 DMG-PEG2K의 50mg/mL 에탄올계 용액의 분취량을 혼합하고, 에탄올로 3mL 최종 용적으로 희석시킨다. 별도로, GLA mRNA의 완충된 수용액(10mM 시트레이트/150mM NaCl, pH 4.5)을 1mg/mL 스톡으로부터 제조한다. 지질 용액을 mRNA 수용액에 신속하게 주입하고, 진탕시켜 20% 에탄올 중의 최종 현탁액을 수득한다. 수득된 나노입자 현탁액을 여과하고, 1×PBS(pH 7.4)로 투석여과하고, 농축시키고, 2 내지 8℃에서 저장한다. 최종 농도 = 0.85mg/mL GLA mRNA(캡슐화됨). Zave = 81.2nm (Dv(50) = 63.2nm; Dv(90) = 104nm).
프로토콜 B: DODAP, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K의 50mg/mL 에탄올계 용액의 분취량을 혼합하고, 에탄올로 3mL 최종 용적까지 희석시킨다. 별도로, EPO mRNA의 완충 수용액(10mM 시트레이트/150mM NaCl, pH 4.5)을 1mg/mL 스톡으로부터 제조한다. 지질 용액을 mRNA 수용액에 신속하게 주입하고, 진탕시켜 20% 에탄올 중의 최종 현탁액을 수득한다. 수득된 나노입자 현탁액을 여과하고, 1×PBS(pH 7.4)로 투석여과하고, 농축시키고, 2 내지 8℃에서 저장한다. 최종 농도 = 1.35 mg/mL EPO mRNA(캡슐화됨). Zave = 75.9nm(Dv(50) = 57.3nm; Dv(90) = 92.1nm).
프로토콜 C: PEI(분지됨, 25kDa)의 2.0mg/mL 수용액의 분취량을 CFTR mRNA(1.0mg/mL)의 수용액과 혼합한다. 수득된 복합체화 혼합물을 수회 상하로 피펫팅하고, 주입 전에 20분 동안 방치한다. 최종 농도 = 0.60mg/mL CFTR mRNA(캡슐화됨). Zave = 75.9nm(Dv(50) = 57.3nm; Dv(90) = 92.1nm).
II. 개질된 메신저 RNA 대 비개질된 mRNA의 분석:
II-a. 메신저 RNA 작제물 내의 개질된 염기의 정량화
4'-티오 NTP 개질된 메신저 RNA를 다양한 시간 동안 RNase I 또는 뉴클레아제 P1으로 처리하여 충분한 분해를 가능하게 한다. 완료 후, 수득되는 모노포스페이트 뉴클레오티드를 알칼리성 포스파타제로 추가 분해시켜 각각의 뉴클레오시드를 수득한다. 뉴클레오시드 혼합물은 효율적인 효소 제거를 위해 아미콘 회전 컬럼(30,000 MWCO)에 적용한다. 수득되는 뉴클레오시드 용액을 HPLC에 의해 분석하고, 각각의 비개질된 뉴클레오시드와의 피크 면적 비교에 의해 정량화한다.
II-b. 4'- 티오 NTP 개질된 메신저 RNA 작제물의 안정성
4'-티오 NTP 개질된 메신저 RNA를 다양한 시간 동안 RNase I 또는 뉴클레아제 P1으로 처리하여 뉴클레아제 분해에 대한 내성을 평가한다. 유사하게는, 4'-티오 NTP 개질된 메신저 RNA를 다양한 시간 동안 혈청(뉴클레아제 함유)으로 처리하여 뉴클레아제 분해를 평가한다. 특정한 시점에서, 뉴클레아제 반응물을 억제제로 급냉시키고, 수득되는 용액을 효율적인 효소 제거를 위해 아미콘 회전 컬럼(30,000 MWCO)에 적용한다. 완료 후, 잔류물을 1% 아가로즈 겔에 적용하고, mRNA 작제물 생존율(크기, 분해 생성물 등)에 대해 분석한다. 동일한 실험을 비개질된 mRNA에 대해 수행하고, 직접 비교 및 추론을 도출할 수 있다.
II-c. 단백질 생성에 대한 4'- 티오 NTP 개질된 메신저 RNA 효과
시험관내 연구: 4'-티오 NTP 개질된 mRNA 및 비개질된 mRNA의 시험관내 형질감염은 HEK293T 세포를 사용하여 수행한다. 각 mRNA 작제물 1㎍의 형질감염은 리포펙타민을 사용하여 별개의 웰에서 수행한다. 세포를 선택된 시점(예: 4시간, 8시간, 24시간, 48시간, 72시간 등)에서 수거하고, 각각의 단백질 생성을 분석한다. FFL mRNA의 경우, 세포 용해물은 생물발광 검정을 통해 루시퍼라제 생성에 대해 분석한다. EPO 및 GLA mRNA 연구의 경우, 세포 상청액을 수득하고, ELISA-기반 방법을 사용하여 각각 EPO 및 GLA 단백질에 대해 분석한다. 비개질된 mRNA 대 4'-티오 NTP 개질된 mRNA의 경시적 단백질 생성의 비교가 이루어질 수 있다.
생체내 연구: 경시적 단백질 생성의 비교는 동일한 방식으로 전달된 비개질된 mRNA에 대해 야생형 마우스(CD-1) 내로 4'-티오 NTP 개질된 mRNA 캡슐화된 나노입자(지질 또는 중합체)의 주입에 의해 이루어진다. 혈청 및 기관을 선택된 시점(예: 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 등)에서 수집하고, 각각의 단백질 수준을 모니터링한다. FFL mRNA의 경우, 간 균질액을 생물발광 검정을 통해 루시퍼라제 생성에 대해 분석한다. EPO 및 GLA mRNA 연구의 경우, 마우스 혈청을 수득하고, ELISA-기반 방법을 사용하여 각각 EPO 및 GLA 단백질에 대해 분석한다. 비개질된 mRNA 대 4'-티오 NTP 개질된 mRNA의 경시적 단백질 생성의 비교가 이루어진다.
유사하게는, 캡슐화되지 않은(네이키드) 4'-티오 NTP 개질된 mRNA 및 비개질된 mRNA를 정맥내, 피하 또는 기관지내 투여를 통해 주사하고, 동일한 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하여 안정성 및 단백질 생성의 차이를 평가할 수 있다.
III. 투여된 네이키드 개질된 mRNA 또는 mRNA - 부하된 나노입자를 통해 생성된 FFL , EPO 및 GLA의 분석:
III-a. 주입 프로토콜
모든 연구는 각 실험 개시 시점에서 대략 6 내지 8주령의 수컷 CD-1 마우스를 사용하여 수행한다. 샘플은 캡슐화되지 않거나 캡슐화된 FFL, EPO 또는 GLA mRNA(개질된 또는 비개질된) 30 내지 200㎍의 동등한 총 용량의 단일 볼러스 꼬리-정맥 주사에 의해 도입한다. 마우스를 희생시키고, 지정된 시점에서 염수로 관류시킨다.
III-b. 분석을 위한 기관 조직의 단리
각 마우스의 간 및 비장을 수거하고, 3개 부분으로 배분하고, 10% 중성 완충 포르말린에 저장하거나 분석을 위해 -80℃에서 스냅-동결 및 저장한다.
III-c. 분석을 위한 혈청의 단리
모든 동물은 용량 투여(±5%) 48시간 후 CO2 질식에 의해 안락사시킨 다음, 개흉 및 말단 심장 혈액 수집을 수행한다. 전혈(최대 수득가능한 용적)은 혈청 분리관에 안락사시킨 동물에서 심장 천공을 통해 수집하고, 실온에서 적어도 30분 동안 응고시키고, 22℃±5℃에서 10분 동안 9300 g으로 원심분리하고, 혈청을 추출한다. 중간 혈액 수집을 위해, 대략 40 내지 50μL의 전혈을 안면 정맥 천공 또는 꼬리 스닙을 통해 수집한다. 무처리 동물로부터 수집한 샘플을 동물을 연구하기 위한 비교용 기준선 GLA 수준으로 사용한다.
III-d. 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA) 분석
EPO ELISA: EPO 단백질의 정량화는 인간 EPO ELISA 키트(Quantikine IVD, R&D Systems, Catalog # Dep-00)에 대해 보고된 절차에 따라 수행한다.
사용될 수 있는 양성 대조군은 초순도 및 조직 배양 등급 재조합 인간 에리트로포이에틴 단백질(R&D Systems, 각각 Catalog # 286-EP 및 287-TC)로 구성되어 있다. 혈액 샘플을 지정된 시점에서 채취하고, 상기 기재된 바와 같이 처리한다. 검출은 몰레큘러 디바이스 플렉스 스테이션 장치(Molecular Device Flex Station instrument) 상에서 흡광도(450nm)에 의해 모니터링한다.
GLA ELISA: 표준 ELISA 공정은 제2 (검출) 항체(Shire Human Genetic Therapies)로서 래빗 항-REPLAGAL® TK-88 IgG와 함께 포획 항체로서 양 항-REPLAGAL® G-188 IgG를 사용하여 수행했다. 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 염소 항-래빗 IgG는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 용액의 활성화에 사용한다. 반응은 20분 후 2N H2SO4를 사용하여 급냉시킨다. 검출은 몰레큘러 디바이스 플렉스 스테이션 장치 상에서 흡광도(450nm)에 의해 모니터링한다. 무처리 마우스 혈청 및 인간 REPLAGAL® 단백질을 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용한다.
III-e. 생물발광 분석
루시퍼라제 검정: 생물발광 검정은 프로메가 루시퍼라제 검정 시스템(Item # E1500)을 사용하여 수행한다. 루시퍼라제 검정 시약은 루시퍼라제 검정 기질에 루기퍼라제 검정 완충제 10mL를 첨가하여 제조하고, 와동에 의해 혼합한다. 대략 20μL의 균질물 샘플을 96-웰 플레이트에 부하한 다음, 각각의 샘플에 20μL의 플레이트 대조군을 부하한다. 별도로, 120μL의 루시퍼라제 검정 시약(상기 기재된 바와 같이 제조)을 96-웰 평저 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 이어서, 각 플레이트는 몰레큘러 디바이스 플렉스 스테이션 장치를 사용하여 적절한 챔버에 삽입하고, 발광을 측정한다(상대 광 단위(RLU)로 측정됨).
실시예 2. 4'- 티오 변형을 갖는 mRNA의 전달 및 발현에 대한 예시적 리포좀 제형
본 실시예는 생체내에서 4'-티오 개질된 mRNA의 효과적 전달 및 발현을 위한 예시적 리포좀 제형을 제공한다.
지질 재료
본원에 기재된 제형은 다양한 핵산계 재료를 캡슐화하도록 설계된 하나 이상의 양이온성 지질, 헬퍼 지질(예: 비-양이온성 지질 및/또는 콜레스테롤계 지질) 및 PEG화 지질을 사용하여 다양한 비율의 다성분 지질 혼합물을 포함한다. 양이온성 지질은 (배타적인 것은 아니지만) DOTAP (1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판), DODAP(1,2-디올레일-3-디메틸암모늄 프로판), DOTMA(1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판), DLinDMA[참조: Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I. "Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids" J. Contr. Rel. 2005, 107, 276-287], DLin-KC2-DMA[참조: Semple, S.C. et al. "Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery" Nature Biotech. 2010, 28, 172-176], C12-200[참조: Love, K.T. et al. "Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing" PNAS 2010, 107, 1864-1869], HGT4003, HGT5000, HGT5001, MC3, cKK-E12(3,6-비스(4-(비스(2-하이드록시도데실)아미노)부틸)피페라진-2,5-디온), ICE, 디알킬아미노계, 이미다졸계, 구아니디늄계 등을 포함할 수 있다. 헬퍼 지질은 (배타적인 것은 아니지만) DSPC(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DPPC(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DOPE(1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DPPE(1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DMPE(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DOPG(1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)), 콜레스테롤 등을 포함할 수 있다. PEG화 지질은 (배타적인 것은 아니지만) C6-C20 길이의 알킬 쇄(들)를 갖는 지질에 공유 결합된 길이 최대 5kDa의 폴리(에틸렌) 글리콜 쇄를 포함할 수 있다.
중합체 재료
본원에 기재된 추가의 제형은 (배타적인 것은 아니지만) 분지화 폴리에틸렌이민(PEI)(25kDa)(Sigma #408727), 프로타민, PEG화 프로타민, PLL, PEG화 PLL 등을 포함할 수 있는 각종 하전된 중합체 재료를 포함한다.
mRNA 재료
반딧불 루시퍼라제(FFL), 인간 에리트로포이에틴(EPO) 및 인간 알파-갈락토시다제(GLA)는 5' 캡 구조(Cap1)[참조: Fechter, P.; Brownlee, G.G. "Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249] 및 겔 전기영동에 의해 측정된 바와 같이 대략 200개 뉴클레오티드 길이의 3' 폴리(A) 테일의 첨가를 수반하는 유전자를 인코딩하는 플라스미드 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 합성했다. 각각의 mRNA 생성물에 존재하는 5' 및 3' 비번역된 영역은 각각 X 및 Y로 제시되어 있고, 언급된 바와 같이 정의된다(하기 참조).
인간 에리트로포이에틴(EPO), 인간 알파-갈락토시다제(GLA) 및 코돈-최적화 반딧불 루시퍼라제(FFL)의 예시적 mRNA 서열은 각각 서열번호 1, 2 및 3에 도시되어 있다. 예시적 5' 및 3' UTR 서열은 서열번호 4, 5, 6 및 7에 기재되어 있다.
예시적 제형화 프로토콜
A. C12-200 및 GLA
C12-200, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K의 50mg/mL 에탄올계 용액의 분취량을 혼합하고, 에탄올로 3mL 최종 용적까지 희석시킨다. 별도로, GLA mRNA의 완충 수용액(10mM 시트레이트/150mM NaCl, pH 4.5)은 1mg/mL 스톡으로부터 제조한다. 지질 용액을 mRNA 수용액에 신속하게 주입하고, 진탕시켜 20% 에탄올 중의 최종 현탁액을 수득한다. 수득되는 나노입자 현탁액을 여과하고, 1×PBS(pH 7.4)로 투석여과하고, 농축시키고, 2 내지 8℃에서 저장한다. 최종 농도 = 0.85mg/mL GLA mRNA(캡슐화됨). Zave = 81.2nm(Dv(50) = 63.2nm; Dv(90) = 104nm).
B. DODAP 및 EPO
DODAP, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K의 50mg/mL 에탄올계 용액의 분취량을 혼합하고, 에탄올로 3mL 최종 용적까지 희석시킨다. 별도로, EPO mRNA의 완충 수용액(10mM 시트레이트/150mM NaCl, pH 4.5)은 1mg/mL 스톡으로부터 제조한다. 지질 용액은 mRNA 수용액에 신속하게 주입하고, 진탕시켜 20% 에탄올 중의 최종 현탁액을 수득한다. 수득되는 나노입자 현탁액을 여과하고, 1×PBS(pH 7.4)로 투석여과하고, 농축시키고, 2 내지 8℃에서 저장한다. 최종 농도 = 1.35mg/mL EPO mRNA (캡슐화됨). Zave = 75.9nm(Dv(50) = 57.3nm; Dv(90) = 92.1nm).
C. PEI 및 CFTR
PEI(분지됨, 25kDa)의 2.0mg/mL 수용액의 분취량을 CFTR mRNA(1.0mg/mL)의 수용액과 혼합했다. 수득되는 복합체화 혼합물을 수회 상하로 피펫팅하고, 주사 전에 20분 동안 방치한다. 최종 농도 = 0.60mg/mL CFTR mRNA(캡슐화됨). Zave = 75.9nm (Dv(50) = 57.3nm; Dv(90) = 92.1nm).
실시예 3. 개질된 mRNA 대 비개질된 mRNA의 생체내 안정성 및 단백질 생성의 분석
본 실시예는 생체내에서 다양한 표적 조직에서 개질된 mRNA의 안정성 및 단백질 발현을 분석하는 예시적 방법을 설명한다.
mRNA 작제물 내의 개질된 염기의 정량화
4'-티오 NTP 개질된 mRNA를 다양한 시간 동안 RNase I 또는 뉴클레아제 P1으로 처리하여 충분한 분해를 가능하게 했다. 완료 후, 수득되는 모노포스페이트 뉴클레오티드를 알칼리성 포스파타제로 추가로 분해시켜 각각의 뉴클레오시드를 제공했다. 뉴클레오시드 혼합물은 효율적 효소 제거를 위해 아미콘 회전 컬럼(30,000MWCO)에 적용했다. 수득되는 뉴클레오시드 용액을 HPLC에 의해 분석하고, 각각의 비개질된 뉴클레오시드와의 피크 면적 비교에 의해 정량화했다.
4'- 티오 NTP 개질된 mRNA 작제물의 안정성
4'-티오 NTP 개질된 mRNA는 다양한 시간 동안 RNase I 또는 뉴클레아제 P1으로 처리하여 뉴클레아제 분해에 대한 내성을 평가했다. 특정한 시점에서, 뉴클레아제 반응물을 억제제로 급냉시키고, 수득되는 용액을 효율적 효소 제거를 위해 아미콘 회전 컬럼(30,000MWCO)에 적용한다. 완류 후, 잔류물을 1% 아가로즈 겔에 적용하고, mRNA 작제물 생존률(크기, 분해 생성물 등)에 대해 분석했다. 동일한 실험을 비개질된 mRNA에 대해 수행하고, 직접 비교 및 추론을 도출했다.
단백질 생성에 대한 4'-티오 NTP 개질된 mRNA 효과
시험관내 연구:
4'-티오 NTP 개질된 mRNA 및 비개질된 mRNA의 시험관내 형질감염은 HEK293T 세포를 사용하여 수행한다. 1㎍의 각각의 mRNA 작제물의 형질감염은 리포펙타민을 사용하여 별개의 웰에서 수행했다. 세포를 선택된 시점(예: 4시간, 8시간, 32시간, 48시간, 56시간, 80시간 등)에서 수거하고, 각각의 단백질 생성을 분석했다. FFL mRNA의 경우, 세포 용해물은 생물발광 검정에 의해 루시퍼라제 생성에 대해 분석했다. EPO 및 GLA mRNA 연구의 경우, 세포 상청액을 수득하고, ELISA-기반 방법을 사용하여 각각 EPO 및 GLA 단백질에 대해 분석했다. 비개질된 mRNA 대 4'-티오 NTP 개질된 mRNA의 경시적 단백질 생성의 비교가 이루어졌다. 예시적 결과는 도 2에 제시되어 있다.
생체내 연구:
경시적 단백질 생성의 비교는 동일한 방식으로 전달된 비개질된 mRNA에 대해 야생형 마우스(CD-1)에 4'-티오 NTP 개질된 mRNA 캡슐화된 나노입자(지질 또는 중합체)의 주입에 의해 이루어졌다. 혈청 및 기관을 선택된 시점(예: 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 등)에서 수집하고, 각각의 단백질 수준을 모니터링했다. FFL mRNA의 경우, 간 균질화물은 생물발광 검정에 의해 루시퍼라제 생성에 대해 분석했다. EPO 및 GLA mRNA 연구의 경우, 마우스 혈청을 수득하고, ELISA-기반 방법을 사용하여 각각 EPO 및 GLA 단백질에 대해 분석했다. 비개질된 mRNA 대 4'-티오 NTP 개질된 mRNA의 경시적 단백질 생성의 비교가 이루어졌다.
유사하게는, 비캡슐화된(네이키드) 4'-티오 NTP 개질된 mRNA 및 비개질된 mRNA를 정맥내, 피하 또는 기관지내 투여에 의해 주입하고, 동일한 분석을 수행하여 안정성 및 단백질 생성의 차이를 평가했다.
실시예 4. 네이키드 개질된 mRNA 또는 mRNA - 부하된 나노입자의 투여 후에 FFL, EPO 및 GLA 단백질 생성의 분석
본 실시예는 네이키드, 개질된, mRNA 또는 mRNA-부하된 나노입자를 투여한 후에 예시적 단백질 생성을 분석하는 프로토콜을 기재하고, 비개질된 mRNA와 비교하여 4'-티오 개질된 mRNA의 mRNA 안정성 및 단백질 생성을 입증한다.
모든 연구는 각 실험의 개시 시점에서 대략 6 내지 8주령의 수컷 CD-1 마우스를 사용하여 수행했다. 샘플은 비캡슐화되거나 캡슐화된 FFL, EPO 또는 GLA mRNA(변형되거나 비변형됨) 30 내지 200㎍의 동등한 총 용량의 단일 볼루스 꼬리-정맥 주사에 의해 도입했다. 마우스를 희생시키고, 지정된 시점에서 염수로 관류시켰다.
각 마우스의 간 및 비장을 수거하고, 3개 부분으로 배분하고, 10% 중성 완충된 포르말린에 저장하거나 분석을 위해 -80℃에서 스냅-동결 및 저장한다.
모든 동물을 용량 투여(±5%) 48시간후 CO2 질식에 의해 안락사시킨 다음, 개흉 및 말단 심장 혈액 수집을 수행했다. 전혈(최대 수득가능한 용적)은 혈청 분리관에 안락사시킨 동물로부터 심장 천공에 의해 수집하고, 실온에서 적어도 30분 동안 응고시키고, 22℃±5℃에서 9300g으로 10분 동안 원심분리한 후, 이어서 혈청을 추출했다. 중간 혈액 수집의 경우, 대략 40 내지 50μL의 전혈을 안면 정맥 천공 또는 꼬리 스닙에 의해 수집했다. 무처리 동물로부터 수집한 샘플은 동물을 연구하기 위해 비교용 기준선 GLA 수준으로 사용했다.
효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA) 분석
EPO 단백질의 정량화는 인간 EPO ELISA 키트(Quantikine IVD, R&D Systems, Catalog # Dep-00)에 대해 보고된 절차에 따라 수행했다. 사용된 양성 대조군은 초순도 및 조직 배양 등급 재조합 인간 에리트로포이에틴 단백질(R&D Systems, 각각 Catalog # 286-EP 및 287-TC)로 구성되었다. 혈액 샘플은 지정된 시점에서 채취하고, 하기 기재된 바와 같이 처리했다. 검출은 몰레큘러 디바이스 플렉스 스테이션 장치 상에서 흡광도(450nm)에 의해 모니터링했다.
GLA 단백질의 분석을 위해, 표준 ELISA 공정은 제2 (검출) 항체로서 래빗 항-Replagal IgG와 함께 포획 항체로서 양 항-Replagal G-188 IgG를 사용하여 수행했다. 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 염소 항-래빗 IgG는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 용액의 활성화에 사용했다. 반응물은 20분 후 2N H2SO4를 사용하여 급냉시켰다. 검출은 몰레큘러 디바이스 플렉스 스테이션 장치 상에서 흡광도(450nm)에 의해 모니터링했다. 무처리 마우스 혈청 및 인간 Replagal® 단백질은 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용했다.
생물발광 분석
생물발광 분석은 프로메가 루시퍼라제 검정 시스템(Item # E1500)을 사용하여 수행했다. 루시퍼라제 검정 시약은 루시퍼라제 검정 기질에 10mL의 루시퍼라제 검정 완충액을 첨가하여 제조하고, 와동에 의해 혼합했다. 20μL의 균질화물 샘플을 96-웰 플레이트에 부하한 다음, 각각의 샘플에 20μL의 플레이트 대조군을 부하했다. 별도로, 120μL의 루시퍼라제 검정 시약(상기 기재된 바와 같이 제조)을 96-웰 평저 플레이트의 각 웰에 부하했다. 이어서, 각각의 플레이트는 몰레큘러 디바이스 플렉스 스테이션 장치를 사용하여 적절한 챔버에 삽입하고, 발광은 상대 광 단위(RLU)로 측정했다.
예시적 결과
4'-티오 변형되거나 비개질된 FFL mRNA의 형질감염에 의한 FFL 단백질의 생성은 HEK 293T 세포에서 시험했다. 도 2는 형질감염후 4시간, 8시간, 32시간, 56시간 및 80시간에서 취득한 칭량된 상대 형광 단위(RLU) 스코어를 나타낸다. 각각의 시점에서, 25% 4'-티오 우리딘(25% 4'-S-U) 또는 100% 4'-티오 우리딘(100% 4'-S-U) FFL mRNA로 형질감염시킨 세포는 SNIM® FFL 또는 통상의 FFL로 형질감염시킨 세포보다 높은 칭량된 RLU 스코어를 가졌다.
경시적인 4'-티오 개질된 및 비개질된 FFL mRNA의 안정성을 또한 시험했다. 3㎍의 mRNA를 마우스 혈청에 노출시키고, 1시간에 걸쳐 모니터링했다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, SNIM® FFL 및 통상의 FFL mRNA와 비교하여, 4'-티오 개질된 mRNA, 특히 100% 4'-티오 우리딘(100% 4'-S-U) FFL mRNA는 경시적으로 보다 안정한 것으로 나타난다.
4'-티오 변형되거나 비개질된 FFL mRNA의 형질감염에 의한 FFL 단백질의 생성은 야생형 마우스에서 시험했다. C12-200-부하된 지질 나노입자 1.0mg/kg 용량을 정맥내 투여하고, 동물을 희생시키고, 이들의 간을 상기 기재된 바와 같이 분석을 위해 제거했다. 도 4는 투여후 6시간에서 취득한 RLU/ml 총 단백질 스코어를 나타낸다. 25% 4'-티오 우리딘(25% 4'-S-U) 및 100% 4'-티오 우리딘(100% 4'-S-U)로 처리한 마우스의 간은 비개질된 mRNA로 처리한 마우스의 간보다 높은 RLU/mg 스코어를 가졌다.
그 중에서, 본원에 기재된 예시적 결과는 4'-티오-개질된 뉴클레오티드를 포함하는 제공된 mRNA가 성공적으로 합성될 수 있고 증가된 안정성을 가지며 세포에서 단백질의 생성에 성공적으로 사용될 수 있음을 입증했다.
실시예 5. 4'- 티오 -개질된 뉴클레오티드의 예시적 합성
합성 절차:
중간체의 제조:
Figure pct00009
2,3-O-이소프로필리덴-D-리본산-1,4-락톤의 합성
Figure pct00010
아세톤(2.79L) 중의 D-리본산-1,4-락톤(270.0g, 1.823mol) 및 황산(18.0g, 0.182mol, 0.1당량)의 용액을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 고체 중탄산나트륨(약 450g)을 첨가하여 급냉시키고, 여과하고, 여액을 증발시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트 및 물에 분배하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출시키고, 합한 유기 층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켜 목적하는 생성물을 백색 고체(318.8g, 93%)로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 4.83 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.77 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.64-4.62 (m, 1H), 3.99 (ddd, J = 2.3, 5.5 및 12.4 Hz, 1H), 3.81 (ddd, J = 2.3, 5.5 및 12.4 Hz, 1H), 2.67 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 1.46 (s, 3H), 1.37 (s, 3H).
5-O-메탄설포닐-2,3-O-이소프로필리덴-D-리본산-1,4-락톤의 합성
Figure pct00011
메탄설포닐 클로라이드(116.0g, 1.014mol, 1.2당량)를 0℃에서 디클로로메탄(2.43L) 중의 2,3-O-이소프로필리덴-D-리본산-1,4-락톤(159.0g, 0.845mol) 및 트리에틸아민(128.0g, 1.267mol)의 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시킨 다음, 디클로로메탄으로 희석시키고, 물, 포화 수성 NaHCO3 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고 감압하에 농축시켜 5-O-메탄설포닐-2,3-O-이소프로필리덴-D-리본산-1,4-락톤을 오렌지색 오일(231.0g, 약 100%)로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 4.82-4.77 (m, 3H), 4.49-4.41 (m, 2H), 3.04 (s, 3H), 1.47 (s, 3H), 1.38 (s, 3H).
2,3-O-이소프로필리덴-L-릭손산-1,4-락톤의 합성
Figure pct00012
물(1.1L) 중의 수산화칼륨(137.0g, 2.45mol)을 5-O-메탄설포닐-2,3-O-이소프로필리덴-D-리본산-1,4-락톤(225.0g, 0.85mol)에 첨가하고, 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 2M 수성 HCl(pH 미터 사용)을 사용하여 pH 3으로 산성화한 다음, 증발시켰다. 잔사를 아세톤 중에서 환류 가열시키고, 아세톤을 경사 제거하였다(x 3). 합한 추출물을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축시켜 2,3-O-이소프로필리덴-L-릭손산-1,4-락톤을 담황색 고체(115.4g, 73%)로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 4.89-4.84 (m, 2H), 4.63-4.59 (m, 1H), 4.08-3.91 (m, 2H), 1.46 (s, 3H), 1.38 (s, 3H).
5-O-3급-부틸디메틸실릴-2,3-O-이소프로필리덴-L-릭손산-1,4-락톤의 합성
Figure pct00013
디클로로메탄(85.0ml) 중의 2,3-O-이소프로필리덴-L-릭손산-1,4-락톤(5.0g, 0.027mol)의 용액에 이미다졸(2.2g, 32mmol)에 이어 3급-부틸디메틸실릴 클로라이드(4.4g, 29mmol, 1.1당량)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석시키고, 포화 수성 NaHCO3, 염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고 감압하에 농축시켜 5-O-3급-부틸디메틸실릴-2,3-O-이소프로필리덴-L-릭손산-1,4-락톤을 담황색 오일(7.3g, 89%)로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 4.79 (s, 2H), 4.54-4.49 (m, 1H), 4.00-3.86 (m, 2H), 1.45 (s, 3H), 1.38 (s, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.08 (s, 6H).
5-O-3급-부틸디메틸실릴-2,3-O-이소프로필리덴-L-릭시톨의 합성
Figure pct00014
테트라하이드로푸란(63ml) 및 메탄올(13ml) 중의 5-O-3급-부틸디메틸실릴-2,3-O-이소프로필리덴-L-릭손산-1,4-락톤(7.2g, 24mmol)의 용액에 수소화붕소나트륨(1.4g, 0.036mol, 1.5당량)을 실온에서 분량으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시킨 다음, 감압하에 농축시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트 및 1M 수성 시트르산에 분배시켰다. 유기 층을 1M 수성 시트르산, 염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고 감압하에 농축시켜 5-O-3급-부틸디메틸실릴-2,3-O-이소프로필리덴-L-릭시톨을 정치시 결정화되는 무색 오일(6.3g, 86%)로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 4.26-4.20 (m, 2H), 3.84-3.59 (m, 5H), 1.51 (s, 3H), 1.37 (s, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.07 (s, 6H).
5-O-3급-부틸디메틸실릴-2,3-O-이소프로필리덴-1,4-디-O-메탄설포닐-L-릭시톨의 합성
Figure pct00015
메탄설포닐 클로라이드(15.2ml, 0.196mol, 10당량)를 <10℃에서 피리딘(15.8ml, 0.196mol, 10당량)에 적가하였다. 디클로로메탄(16ml) 중의 5-O-3급-부틸디메틸실릴-2,3-O-이소프로필리덴-L-릭시톨(6g, 0.0196mol)의 용액을 <10℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 냉각 욕을 교체하고, 과량의 메탄설포닐 클로라이드를 얼음을 첨가하여 가수분해시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 물(300ml)에 붓고, Et2O(3x50ml)로 추출시켰다. 합한 유기 층을 1M 수성 시트르산, 포화된 수성 NaHCO3 및 염수로 세척하고, 건조시키고(MgSO4), 여과하고 감압하에 농축시켰다. 조 생성물을 1:6 에틸 아세테이트/헵탄을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 5-O-3급-부틸디메틸실릴-2,3-O-이소프로필리덴-1,4-디-O-메탄설포닐-L-릭시톨을 황색 오일(8g, 91%)로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 4.76-4.69 (m, 1H), 4.46-4.34 (m, 4H), 3.95 (dd, J = 5.5 and 11.0 Hz, 1H), 3.82 (dd, J = 6.0 and 11.0 Hz, 1H), 3.11 (s, 3H), 3.07 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.37 (s, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.09 (s, 6H).
3급-부틸(((3aS,4R,6aR)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)메톡시)디메틸실란의 합성
Figure pct00016
디메틸포름아미드(250ml) 중의 5-O-3급-부틸디메틸실릴-2,3-O-이소프로필리덴-1,4-디-O-메탄설포닐-L-릭시톨(25.1g, 0.056mol)의 용액에 Na2S.9H2O(16.1g, 0.067mol, 1.2당량)를 첨가하고, 반응 혼합물을 80℃에서 3시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 물 및 에틸 아세테이트에 분배시켰다. 층을 분리하고, 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출시켰다. 합한 유기 층을 건조시키고(MgSO4), 여과시키고 감압하에 농축시켰다. 조 생성물을 에틸 아세테이트/헵탄(10:1)을 사용하여 실리카 겔 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 3급-부틸(((3aS,4R,6aR)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)메톡시)-디메틸-실란(10.3g, 60%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 4.89 (dt, J = 1.4 및 4.6 Hz, 1H), 4.79 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 5.0 및 10.5 Hz, 1H), 3.60 (dd, J = 6.4 및 10.6 Hz, 1H), 3.33 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 3.16 (dd, J = 5.0 및 12.4 Hz, 1H), 2.85 (dd, J = 0.9 및 12.8 Hz, 1H), 1.52 (s, 3H), 1.32 (s, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.06 (s, 6H).
(3aS,4R,5R,6aR)-4-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔 5-옥사이드의 합성
Figure pct00017
디클로로메탄(150ml) 중의 약 70% m-클로로퍼벤조산(16g, 66mmol)의 용액을 황산마그네슘으로 건조시키고 여과시켰다. 디클로로메탄(50ml)으로 세척한 후, 합한 여액을 -78℃에서 디클로로메탄(400ml) 중의 3급-부틸(((3aS,4R,6aR)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)메톡시)디메틸실란(20g, 66mmol)의 용액에 적가하였다. -78℃에서 1시간 동안 교반시킨 후, 반응물을 포화된 중탄산나트륨 용액으로 급냉시키고, 디클로로메탄으로 희석시켰다. 층을 분리하고, 유기물을 염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과시키고 농축시켰다. 수득된 잔사를 플래시 크로마토그래피(실리카 겔 / 디클로로메탄:디에틸 에테르(30:1)로 정제하여 (3aS,4R,5S,6aR)-4-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔 5-옥사이드(8.8g, 42%) 및 (3aS,4R,5R,6aR)-4-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸테트라-하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔 5-옥사이드(7.3g, 35%)를 수득하였다.
뉴클레오시드 중간체의 합성:
1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(하이드록시메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온
Figure pct00018
1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸-테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온의 합성
Figure pct00019
톨루엔(62ml) 중의 우라실(1.40g, 12.5mmol)의 현탁액에 트리에틸아민(3.5ml, 2.53g, 25mmol) 및 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(9.01ml, 11.1g, 50mmol)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 디클로로메탄(34ml)을 2상 혼합물에 첨가하여 용액을 수득하고, 이어서 이를 디클로로메탄(34ml) 중의 (3aS,4R,5R,6aR)-4-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔 5-옥사이드(2.0g, 6.25mmol)의 용액에 적가한 다음, 트리에틸아민(3.5ml, 25mmol)을 첨가하였다. 실온에서 90분 동안 교반한 후, 반응물을 얼음으로 급냉시킨 다음, 에틸 아세테이트로 희석시켰다. 층을 분리하고, 유기물을 포화된 중탄산나트륨 용액(x 2)에 이어 염수로 세척하였다. 황산마그네슘으로 건조시키고, 감압하에 농축시켜 조 생성물을 수득하고, 이를 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, 에틸 아세테이트:디클로로메탄 1:5)로 정제하여 1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸-테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온(1.55g, 60%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 8.43 (s, 1H), 7.96 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.12 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.74 (dd, J = 1.9 및 7.8 Hz, 1H), 4.71 (m, 2H), 3.89 (m, 2H), 3.74 (m, 1H), 1.60 (s, 3H), 1.32 (s, 3H), 0.92 (s, 9H), 0.11 (s, 3H), 0.10 (s, 3H).
1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(하이드록시메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온의 합성
Figure pct00020
테트라하이드로푸란(85ml) 중의 1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸-테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온(3.70g, 8.92mmol)의 용액을 아르곤하에 빙욕에서 냉각시키고; 테트라하이드로푸란(10.7ml, 10.7mmol) 중의 1M 테트라부틸암모늄 플루오라이드의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 여과 수집하고, 테트라하이드로푸란으로 세척하고, 플래시 크로마토그래피(실리카 겔; 메탄올:디클로로메탄 1:30)로 정제하여 1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(하이드록시메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-디온(2.30g, 86%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 8.97 (brs, 1H), 7.76 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.93 (s, 1H), 5.76 (d, J = 8.3 Hz), 4.91 (s, 2H), 3.96 (dd, J = 4.6 및 11.0 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 4.6 및 11.0 Hz, 1H), 3.79 (t, J= 4.6 Hz, 1H), 2.64 (brs, 1H), 1.59 (s, 3H), 1.33 (s, 3H).
4-아미노-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(하이드록시메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)-5-메틸피리미딘-2(1H)-온
Figure pct00021
티미딘을 시토신으로 치환하는 것 이외에는 다음과 유사한 절차를 사용하여 4-아미노-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(하이드록시메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(13.1)을 합성할 수 있다.
1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)-5-메틸피리미딘-2,4(1H,3H)-디온
Figure pct00022
톨루엔(112ml) 중의 티민(2.60g, 20.6mmol)의 현탁액에 트리에틸아민(4.17g, 41.2mmol) 및 트리메틸실릴 트리플루오로메탄설포네이트(18.3g, 82.5mmol)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 디클로로메탄(34ml)을 2상 혼합물에 첨가하여 용액을 수득하고; 이어서, 이를 디클로로메탄(56ml) 중의 (3aS,4R,5R,6aR)-4-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔 5-옥사이드(3.30g, 10.3mmol)의 용액에 적가한 다음, 트리에틸아민(4.17g, 41.2mmol)을 첨가하였다. 실온에서 60분 동안 교반한 후, 반응물을 얼음으로 급냉시킨 다음, 에틸 아세테이트로 희석시켰다. 층을 분리하고, 유기물을 포화 중탄산나트륨 용액(x 2)에 이어 염수로 세척하였다. 황산마그네슘으로 건조시킨 후, 감압하에 농축시켜 조 생성물을 수득하고, 이를 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, 에틸 아세테이트:헵탄 0-50%)로 정제하여 1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)-5-메틸피리미딘-2,4(1H,3H)-디온(2.9g, 66%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 8.43 (s, 1H), 7.46 (d, J = 1.4 Hz, 1H), 6.07 (d, J = 32 Hz, 1H), 5.72 (m, 2H), 3.87 (m, 2H), 3.71 (m, 1H), 1.93 (s, 3H), 1.59 (s, 3H), 1.32 (s, 3H), 0.92 (s, 9H), 0.10 (s, 3H), 0.09 (s, 3H).
4-아미노-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)-5-메틸피리미딘-2(1H)-온의 합성
Figure pct00023
아세토니트릴(140ml) 중의 1,2,4-트리아졸(6.55g, 94.8mmol)의 현탁액을 빙욕에서 0℃로 냉각시키고; 옥시염화인(2.53ml, 27.1mmol)에 이어, 트리에틸아민(18.9ml, 135mmol)을 적가하였다. 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반시킨 다음, 아세토니트릴(25ml) 중의 1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)-5-메틸피리미딘-2,4(1H,3H)-디온(2.9g, 6.77mmol)의 용액을 적가하였다. 반응물을 실온으로 가온시키고, 150분 동안 교반시킨 다음, 에틸 아세테이트 및 포화된 중탄산나트륨 용액에 분배시켰다. 유기 층을 염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 수득된 잔사를 오토클레이브에서 디옥산(62ml)에 용해시키고; 수산화암모늄(62ml)을 첨가하고, 용기를 밀봉시키고, 실온에서 밤새 교반시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 및 물에 분배하고, 유기 층을 염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피(실리카 겔: 메탄올:에틸 아세테이트 1:10)로 정제하여 아미노-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)-5-메틸피리미딘-2(1H)-온(2.60g, 90%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 8.74 (brs, 2H), 7.49 (s, 1H), 6.00 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 4.82 (dd, J = 2.3 및 5.5 Hz, 1H), 4.74 (dd, J = 3.2 및 5.5 Hz, 1H), 3.91 (dd, J= 5.5 및 10.5 Hz, 1H), 3.81 (dd, J= 6.4 및 10.5 Hz, 1H), 3.65 (m, 1H), 1.91 (s, 3H), 1.56 (s, 3H), 1.27 (s, 3H), 0.89 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.06 (s, 3H).
4-아미노-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(하이드록시메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)-5-메틸피리미딘-2(1H)-온의 합성
Figure pct00024
테트라하이드로푸란(1.4ml) 중의 4-아미노-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((3급-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)-5-메틸피리미딘-2(1H)-온(500mg, 1.17mmol)의 용액을 아르곤하에 빙욕에서 냉각시키고; 테트라하이드로푸란(1.4ml, 1.90mmol) 중의 1M 테트라부틸암모늄의 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 여과 수집하고, 테트라하이드로푸란으로 세척하고, 플래시 크로마토그래피(실리카 겔; 메탄올:에틸 아세테이트 1:10)로 정제하여 4-아미노-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(하이드록시메틸)-2,2-디메틸테트라하이드로티에노[3,4-d][1,3]디옥솔-4-일)-5-메틸피리미딘-2(1H)-온(436mg, 정량적)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO)δ 7.64 (s, 1H), 7.38 (brs, 1H), 6.85 (brs, 1H), 5.97 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.19 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.88 (dd, J = 2.8 및 5.35 Hz, 1H), 4.80 (dd, J = 3.2 및 5.9 Hz, 1H), 3.67 (m, 1H), 3.54 (m, 1H), 3.47 (td, J = 2.8 및 6.4 Hz, 1H), 1.80 (s, 3H), 1.43 (s, 3H), 1.21 (s, 3H).
뉴클레오티드 표적의 합성:
일반적 반응식
Figure pct00025
뉴클레오시드 5'-트리포스페이트의 합성은 상기 도시된다. 뉴클레오시드 A를 디메틸포름아미드 중의 이미다졸.HCl/이미다졸의 존재하에 포스포르아미디트 시약과 반응시킨 후 H2O2에 의한 인의 후속 산화로 화합물 B를 우수한 수율로 수득한다(실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제 후, 전형적으로 60 내지 83% 수율). H2O/디클로로메탄 중의 트리플루오로아세트산을 사용하는 처리로 보호 그룹을 절단하여 전형적으로 정량적 수율로 모노포스페이트 C를 수득한다. 최종적으로, 트리포스페이트 D는 보가치브(Bogachev)에 의해 개발된 방법(참조: Bogachev, V.S. Synthesis of deoxynucleoside 5'-트리포스페이트s using trifluoroacetic anhydride as activation reagent. Russ. J. Bioorg. Chem., 1996, 22, 599-604)을 사용하여 수득한다.
일반적 실험 절차:
화합물 B의 합성
Figure pct00026
디메틸포름아미드(3ml/화합물 A 1mmol) 중의 화합물 A(1당량), 이미다졸.HCl(1.5당량) 및 이미다졸(1당량)의 용액에 아르곤하에 실온에서 디-3급-부틸 디이소프로필포스포르아미디트(1.5당량)를 적가하였다. 반응 혼합물을 출발 물질의 완전한 소비가 관찰될 때까지(LC-MS 또는 TLC)(전형적으로 30 내지 90분) 교반시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 빙수욕에서 냉각시키고, 35% H2O2(2.6당량)로 적가 처리한다. 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 완전한 반응이 관찰될 때까지(LC-MS 또는 TLC) 교반시키고; 이어서, 이를 빙수욕에서 냉각시키고, 포화된 수성 티오황산나트륨으로 조심스럽게 급냉시킨다. 생성물을 에틸 아세테이트로 추출시키고, 유기 층을 염수로 세척하고, 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고 감압하에 농축시켰다. 적합한 용출제(일반적으로, 메탄올/디클로로메탄)를 사용하여 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 B를 전형적으로 60 내지 85% 수율로 수득한다.
화합물 C의 합성
Figure pct00027
디클로로메탄(2ml/화합물 B 1mmol) 중의 화합물 B(1당량), 물(3ml/화합물 B 1mmol) 및 트리플루오로아세트산(3ml/화합물 B 1mmol)의 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨다. 반응 혼합물을 감압하에(수욕 < 50℃) 화합물 C를 전형적으로 정량적 수율로 수득한다.
화합물 D의 합성
Figure pct00028
아세토니트릴(0.3ml/트리플루오로아세트산 무수물 1mmol) 중의 트리플루오로아세트산 무수물(5당량)의 냉각된 용액(빙수욕)을 아르곤하에 아세토니트릴(4ml/화합물 C 1mmol), 트리에틸아민(1당량) 및 N,N-디메틸아닐린(4당량) 중의 화합물 C(1당량)의 냉각된 현탁액에 적가한다. 이어서, 반응물을 실온으로 가온시키고, 실온에서 30분 동안 교반시키고, 휘발물을 감압하에 제거한다.
수득되는 시럽을 아세토니트릴(4ml/화합물 C 1mmol)에 용해시키고, 빙수욕에서 냉각시키고, 1-메틸이미다졸(3당량) 및 트리에틸아민(5당량)을 아르곤하에 첨가한다. 반응 혼합물을 15분 동안 교반시킨 다음, 실온으로 가온시킨다.
아르곤하에 아세토니트릴(1ml/피로포스페이트 1mmol) 중의 트리스(테트라부틸암모늄)피로포스페이트(1.5당량)의 용액을 실온에서 적가하고, 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반시킨다. 이어서, 반응물을 탈이온수(약 10-15ml/화합물 C 1mmol)로 급냉시키고, 1시간 동안 교반시킨다. 혼합물을 클로로포름(3 x 10ml)으로 세척하고, 합한 유기 층을 탈이온수(5ml)로 한번 역추출시킨다. 합한 수성 층을 DEAE 세파로스 신속 유동으로 팩킹되고 0.01M 내지 0.5M의 트리에틸암모늄 비카보네이트 완충제의 구배로 용출된 컬럼 상에 직접 부하한다. 생성물 함유 분획을 합하고, 동결 건조시킨다. 수득되는 뉴클레오시드 트리포스페이트 트리에틸아민 염을 탈이온수에 용해시킨 다음, 다우엑스 50 W 8 이온 교환 컬럼에 적용한다. UV 활성을 나타내는 분획을 합하고, 물을 동결건조시켜 제거하여 뉴클레오시드 5'-트리포스페이트를 이의 나트륨 염으로서 수득한다.
((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-디옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)-3,4-디하이드록시테트라-하이드로티오펜-2-일)메틸 트리포스페이트 나트륨 염
Figure pct00029
화합물 A에서 화합물 B로 전환시키기 위한 상기한 방법을 사용하여, 화합물 10(935mg, 3.11mmol)을 화합물 14(1.25g, 81%)로 전환시켰다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 8.38 (brs, 1H), 7.74 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.05 (s, 1H), 5.79 (d, J = 8.3 Hz), 4.85 (m, 2H), 4.19 (m, 2H), 3.83 (t, J= 5.0 Hz, 1H), 1.54 (s, 3H), 1.49 (s, 18H), 1.31 (s, 3H).
화합물 B에서 화합물 C로 전환시키기 위한 상기한 방법을 사용하여, 화합물 14(1.25g, 2.58mmol)를 화합물 15(0.9g 정량적)로 전환시켰다. 1H NMR (300 MHz, D2O)δ 8.13 (d, J = 7.8Hz, 1H), 5.81 (d, J = 5.5Hz, 1H), 5.76 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.24 (dd, J = 4.1 및 6.0 Hz, 1H), 4.11 (t, J = 4.1 Hz, 1H), 3.98 (m, 2H), 3.43 (m, 1H).
화합물 C에서 화합물 D로 전환시키기 위한 상기한 방법을 사용하여, 화합물 15(200mg, 0.59mmol)를 4'- 티오 -UTP(215mg, 62% (4Na+ 염일 경우))로 전환시켰다. 1H NMR (300 MHz, D2O)δ 8.14 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.85 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 5.81 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.31 (dd, J = 3.7 및 6.4 Hz, 1H), 4.24 (t, J = 3.7 Hz, 1H), 4.12 (m, 1H), 4.00 (m, 1H), 3.44 (m, 1H). 31P NMR (300 MHz, D2O)δ -8.57 (d), -10.91 (d), -22.09 (t). HPLC/MS: RT 9.638분, m/z 501 (M+H)+.
(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-아미노-5-메틸-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-3,4-디하이드록시테트라-하이드로티오펜-2-일)메틸 트리포스페이트) 나트륨 염
화합물 A를 화합물 B로 전환시키기 위한 상기한 방법을 사용하여, 화합물 13(400mg, 1.28mmol)을 화합물 16(910mg 65%)으로 전환시켰다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 8.19 (brs, 2H), 7.45 (s, 1H), 5.92 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 4.98 (dd, J = 1.8 및 6.0 Hz, 1H), 4.95 (dd, J = 2.3 및 5.5 Hz, 1H), 4.24 (m, 2H), 3.80 (td, J = 1.8 및 6.0 Hz, 1H), 1.99 (s, 3H), 1.56 (s, 3H), 1.49 (s, 9H), 1.48 (s, 9H), 1.29 (s, 3H).
화합물 B를 화합물 C로 전환시키기 위한 상기한 방법을 사용하여, 화합물 16(480mg, 0.977mmol)을 화합물 17(350mg, 정량적)로 전환시켰다. 1H NMR (300 MHz, D2O)δ 8.16 (s, 1H), 5.80 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 4.25 (dd, J = 4.1 및 5.5 Hz, 1H), 4.10 (t, J = 4.6 Hz, 1H), 4.00 (m, 2H), 3.45 (m, 1H), 1.92 (s, 3H). 31P NMR (300 MHz, D2O)δ 0.41.
화합물 C를 화합물 D로 전환시키기 위한 상기한 방법을 사용하여, 화합물 15(300mg, 0.849mmol)를 4'- 티오 -5- 메틸CTP(136mg, 28% (4Na+ 염일 경우))로 전환시켰다. 1H NMR (300 MHz, D2O)δ 7.84 (s, 1H), 5.85 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.23 (m, 2H), 4.09 (m, 1H), 3.97 (m, 1H), 3.40 (m, 1H), 1.82 (s, 3H). 31P NMR (300 MHz, D2O)δ -8.96 (d), -11.00 (d), -22.28 (t). 13C NMR (300 MHz, D2O)δ 165.52 (Cq), 158.09 (Cq), 139.80 (CH), 105.40 (Cq), 77.26 (CH), 73.25 (CH), 66.06 (CH), 64.04 (CH2), 50.09 (CH), 12.33 (CH3). HPLC/MS: RT 10.280분, m/z 514 (M+H)+.
화합물 13을 화합물 13.1로 치환하는 것 이외에는 4'-티오-5-메틸CTP의 상기 합성과 유사한 절차를 사용하여 4'-티오-CTP를 제조할 수 있다.
((2R,3S,4R,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로티오펜-2-일)메틸 트리포스페이트 나트륨 염
Figure pct00031
화합물 A를 화합물 B로 전환시키기 위한 상기한 방법을 사용하여, 화합물 19(504mg, 1.81mmol)를 화합물 20(444mg, 52%)으로 전환시켰다. 1H NMR (300 MHz, CDCl3)δ 8.24 (s, 1H), 8.19 (brs, 1H), 7.71 (brs, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.20 (brs, 2H), 6.01 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.76 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.23 (m, 2H), 3.77 (m, 1H), 1.48 (s, 18H).
화합물 B를 화합물 C로 전환시키기 위한 상기한 방법을 사용하여, 화합물 20(430mg, 0.904mmol)을 화합물 21(330mg 정량적)로 전환시켰다. 1H NMR (300 MHz, D2O)δ 8.64 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 5.86 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 4.54 (m, 1H), 4.26 (m, 1H), 4.06 (m, 2H), 3.54 (m, 1H).
화합물 C를 화합물 D로 전환시키기 위한 상기한 방법을 사용하여, 화합물 21(82mg, 0.162mmol)을 4'- 티오 -ATP(35mg, 26% (4Na+ 염일 경우))로 전환시켰다. 1H NMR (300 MHz, D2O)δ 8.49 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 5.76 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 4.54 (dd, J = 3.7 및 5.6 Hz, 1H), 4.35 (t, J = 4.1 Hz, 1H), 4.13 (m, 2H), 3.54 (dd, J = 4.1 및 8.7 Hz, 1H). 31P NMR (300 MHz, D2O)δ -9.07 (d), -10.81 (d), -22.15 (t). HPLC/MS: RT 10.467분, m/z 524 (M+H)+.
5-((3R,4S,5R)-3,4-디하이드록시-5-(하이드록시메틸)테트라하이드로티오펜-2-일)피리미딘 2,4(1H,3H) 디온(4'-S-슈도우리딘). 이 화합물은 당업자에게 공지된 절차를 사용하여 이하 반응식에 따라 제조할 수 있다.
Figure pct00032
((2R,3S,4R,5S)-5-(2,4-디옥소-1,2,3,4-테트라하이드로피리미딘-5-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로티오펜-2-일)메틸 트리포스페이트 나트륨 염(4'-티오-ΨUTP). 이 화합물은 당업자에게 공지된 절차를 사용하여 이하 반응식에 따라 제조할 수 있다.
Figure pct00033
((2R,3S,4R,5R)-3,4-디하이드록시-5-(4-옥소-2-티옥소-3,4-디하이드로피리미딘-1(2H)-일)테트라하이드로티오펜-2-일)메틸 테트라하이드로겐 트리포스페이트(4'-S-2-S-UTP). 이 화합물은 당업자에게 공지된 절차를 사용하여 이하 반응식에 따라 제조할 수 있다.
Figure pct00034
((2R,3S,4R,5R)-5-(2-아미노-6-옥소-1H-퓨린-9(6H)-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로티오펜-2-일)메틸 테트라하이드로겐 트리포스페이트(4'-S-GTP). 이 화합물은 당업자에게 공지된 절차를 사용하여 이하 반응식에 따라 제조할 수 있다.
Figure pct00035
명세서는 명세서 내에 인용된 참고문헌의 교시에 비추어 대부분 완전히 이해된다. 명세서 내의 구현예는 본 발명의 구현예의 예시를 제공하고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 당업자는 다수의 다른 구현예가 본 발명에 포함된다는 것을 용이하게 인식한다. 본 개시에 인용된 모든 공보 및 특허는 이들의 전문이 참고로 인용된다. 참조로 인용된 재료가 모순되거나 본 명세서와 일치하지 않는 정도까지 명세서는 임의의 이러한 재료를 대체한다. 본원에서 임의의 참조문헌의 인용은 이러한 참조문헌이 본 발명의 종래 기술이다는 것을 인정하지 않는다.
다르게 명시되지 않는 한, 특허청구범위를 포함하여 명세서에 사용된 성분의 양, 반응 조건 등을 나타내는 모든 수는 근사치로서 이해되어야 하고, 본 발명에 의해 수득하고자 하는 목적하는 특성에 따라 변할 수 있다. 적어도, 특허청구범위의 범위에 균등론의 적용을 제한하는 시도로서가 아니라, 각 수치 변수는 유효 숫자 및 통상의 반올림 접근법의 수의 견지에서 해석되어야 한다. 명세서에서 상이한 양의 유효 숫자를 갖는 일련의 수의 열거는 제공된 보다 적은 유효 숫자가 제공된 다수의 유효 숫자를 갖는 수와 동일한 정밀도를 갖는다는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 안된다.
특허청구범위 및/또는 명세서에 용어 "포함하는"과 함께 사용될 경우, 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 이는 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와 일치한다. 특허청구범위에 용어 "또는"의 사용은, 개시가 유일한 대안 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 지지하지만, 유일한 대안을 의미하는 것으로 명시적으로 기술되지 않거나 대안이 상호 배타적이면, "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다.
다르게 명시되지 않는 한, 일련의 요소에 선행하는 용어 "적어도"는 시리즈에서 모든 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 특정 구현예에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 다음 특허청구범위에 포함되도록 의도된다.
다르게 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련가에 의해 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 이하 바람직한 방법 및 재료가 기재된다.
본원에서 논의된 공보는 본원의 출원일 이전 이들의 개시를 위해서만 제공된다. 본원에서 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 공보를 선행할 권리는 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 제공된 공보의 날짜는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 공개일과 상이할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 본원에 개시된 명세서 및 본 발명의 실시를 고려하여 당업자에게 자명해질 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예시로서 고려되고, 본 발명의 진정한 범위 및 취지는 다음 특허청구범위에 의해 나타낸다는 것이 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Shire Human Genetics <120> Ribonucleic Acids with 4'-Thio-Modified Nucleotides and Related Methods <130> 2006685-0457 <140> PCT/US2014/027422 <141> 2014-03-14 <150> 61/785,095 <151> 2013-03-14 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 582 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized oligonucleotide <400> 1 augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc ugucccugcu gucgcucccu 60 cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu gugacagccg aguccuggag 120 agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga cgggcugugc ugaacacugc 180 agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua auuucuaugc cuggaagagg 240 auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc uggcccugcu gucggaagcu 300 guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc cgugggagcc ccugcagcug 360 cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca cucugcuucg ggcucuggga 420 gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag cugcuccacu ccgaacaauc 480 acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca auuuccuccg gggaaagcug 540 aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau ga 582 <210> 2 <211> 1291 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized oligonucleotide <400> 2 augcagcuga ggaacccaga acuacaucug ggcugcgcgc uugcgcuucg cuuccuggcc 60 cucguuuccu gggacauccc uggggcuaga gcacuggaca auggauuggc aaggacgccu 120 accaugggcu ggcugcacug ggagcgcuuc augugcaacc uugacugcca ggaagagcca 180 gauuccugca ucagugagaa gcucuucaug gagauggcag agcucauggu cucagaaggc 240 uggaaggaug cagguuauga guaccucugc auugaugacu guuggauggc uccccaaaga 300 gauucagaag gcagacuuca ggcagacccu cagcgcuuuc cucaugggau ucgccagcua 360 gcuaauuaug uucacagcaa aggacugaag cuagggauuu augcagaugu uggaaauaaa 420 accugcgcag gcuucccugg gaguuuugga uacuacgaca uugaugccca gaccuuugcu 480 gacuggggag uagaucugcu aaaauuugau gguuguuacu gugacaguuu ggaaaauuug 540 gcagaugguu auaagcacau guccuuggcc cugaauagga cuggcagaag cauuguguac 600 uccugugagu ggccucuuua uauguggccc uuucaaaagc ccaauuauac agaaauccga 660 caguacugca aucacuggcg aaauuuugcu gacauugaug auuccuggaa aaguauaaag 720 aguaucuugg acuggacauc uuuuaaccag gagagaauug uugauguugc uggaccaggg 780 gguuggaaug acccagauau guuagugauu ggcaacuuug gccucagcug gaaucagcaa 840 guaacucaga uggcccucug ggcuaucaug gcugcuccuu uauucauguc uaaugaccuc 900 cgacacauca gcccucaagc caaagcucuc cuucaggaua aggacguaau ugccaucaau 960 caggaccccu ugggcaagca aggguaccag cuuagacagg gagacaacuu ugaagugugg 1020 gaacgaccuc ucucaggcuu agccugggcu guagcuauga uaaaccggca ggagauuggu 1080 ggaccucgcu cuuauaccau cgcaguugcu ucccugggua aaggaguggc cuguaauccu 1140 gccugcuuca ucacacagcu ccucccugug aaaaggaagc uaggguucua ugaauggacu 1200 ucaagguuaa gaagucacau aaaucccaca ggcacuguuu ugcuucagcu agaaaauaca 1260 augcagaugu cauuaaaaga cuuacuuuaa y 1291 <210> 3 <211> 1652 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized oligonucleotide <400> 3 auggaagaug ccaaaaacau uaagaagggc ccagcgccau ucuacccacu cgaagacggg 60 accgccggcg agcagcugca caaagccaug aagcgcuacg cccuggugcc cggcaccauc 120 gccuuuaccg acgcacauau cgagguggac auuaccuacg ccgaguacuu cgagaugagc 180 guucggcugg cagaagcuau gaagcgcuau gggcugaaua caaaccaucg gaucguggug 240 ugcagcgaga auagcuugca guucuucaug cccguguugg gugcccuguu caucggugug 300 gcuguggccc cagcuaacga caucuacaac gagcgcgagc ugcugaacag caugggcauc 360 agccagccca ccgucguauu cgugagcaag aaagggcugc aaaagauccu caacgugcaa 420 aagaagcuac cgaucauaca aaagaucauc aucauggaua gcaagaccga cuaccagggc 480 uuccaaagca uguacaccuu cgugacuucc cauuugccac ccggcuucaa cgaguacgac 540 uucgugcccg agagcuucga ccgggacaaa accaucgccc ugaucaugaa caguaguggc 600 aguaccggau ugcccaaggg cguagcccua ccgcaccgca ccgcuugugu ccgauucagu 660 caugcccgcg accccaucuu cggcaaccag aucauccccg acaccgcuau ccucagcgug 720 gugccauuuc accacggcuu cggcauguuc accacgcugg gcuacuugau cugcggcuuu 780 cgggucgugc ucauguaccg cuucgaggag gagcuauucu ugcgcagcuu gcaagacuau 840 aagauucaau cugcccugcu ggugcccaca cuauuuagcu ucuucgcuaa gagcacucuc 900 aucgacaagu acgaccuaag caacuugcac gagaucgcca gcggcggggc gccgcucagc 960 aaggagguag gugaggccgu ggccaaacgc uuccaccuac caggcauccg ccagggcuac 1020 ggccugacag 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gacucaccgu ccuugacacg 140 <210> 5 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized oligonucleotide <400> 5 gggauccuac c 11 <210> 6 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized oligonucleotide <400> 6 cggguggcau cccugugacc ccuccccagu gccucuccug gcccuggaag uugccacucc 60 agugcccacc agccuugucc uaauaaaauu aaguugcauc 100 <210> 7 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized oligonucleotide <400> 7 uuugaauu 8

Claims (29)

  1. 코딩 영역 및 임의로 하나 이상의 비-코딩 영역을 갖는 mRNA 분자로서, 상기 mRNA 분자는 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는, mRNA 분자.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 아데노신 뉴클레오티드 잔기의 적어도 1%가 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는, mRNA 분자.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 구아노신 잔기의 적어도 1%가 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는, mRNA 분자.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 우리딘 잔기의 적어도 1%가 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는, mRNA 분자.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 시티딘 잔기의 적어도 1%가 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는, mRNA 분자.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오티드 잔기의 10% 미만이 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는, mRNA 분자.
  7. 청구항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 잔기의 적어도 50%가 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는, mRNA 분자.
  8. 청구항 1 내지 5 또는 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 뉴클레오티드 잔기의 적어도 99%가 4'-티오-치환된 푸라노스 환을 도입하는, mRNA 분자.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 비-코딩 영역이 폴리-A 테일을 포함하고, 상기 폴리-A 테일이 4'-티오-아데노신 잔기를 포함하는, mRNA 분자.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 폴리-A 테일은 적어도 길이가 약 90개 뉴클레오티드 잔기인, mRNA 분자.
  11. 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서, 상기 폴리-A 테일은 적어도 길이가 약 500개 뉴클레오티드 잔기인, mRNA 분자.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 mRNA는 적어도 하나의 비표준 뉴클레오티드 잔기를 추가로 포함하는, mRNA 분자.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 비표준 뉴클레오티드 잔기는 5-메틸-시티딘, 슈도우리딘 및 2-티오-우리딘 중의 하나 이상으로부터 선택되는, mRNA 분자.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드 잔기는 4'-티오-푸라노스를 포함하도록 추가로 변형되는, mRNA 분자.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 분자는 적어도 200개 뉴클레오티드 잔기를 포함하는, mRNA 분자.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 분자는 적어도 5000개 뉴클레오티드 잔기를 포함하는, mRNA 분자.
  17. 청구항 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 코딩 영역은 치료 단백질을 인코딩하는, mRNA 분자.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 치료 단백질은 에리트로포이에틴, 인간 성장 호르몬, 낭포성 섬유증 막관통 전도 조절인자(CFTR), 인슐린, 알파-갈락토시다제 A, 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트-2-설파타제, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사미니다제, 알파-글루코사미니드 아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민 6-설파타제, N-아세틸갈락토사민-4-설파타제, 베타-글루코시다제, 갈락토스-6-설페이트 설파타제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 글루코세레브로시다제, 헤파란 설파미다제, 히알루로니다제, 갈락토세레브로시다제, 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC), 카바모일-포스페이트 합성효소 1(CPS1), 아르기니노석시네이트 합성효소(ASS1), 아르기니노석시네이트 리아제(ASL) 및 아르기나제 1(ARG1), 글루코스-6-포스파타제, 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제, 글리코겐 탈분지 효소, 리소좀 알파-글루코시다제, 1,4-알파-글루칸 분지 효소, 글리코겐 포스포릴라제, 포스포프럭토키나제, 간 포스포릴라제, GLUT-2, UDP 글리코겐 합성효소, 알파-L-이두로니다제, 이두로네이트 설페이트 실파타제, 헤파란 설페이트 설파미다제, 알파-N-아세틸글루코스 아미다제, 알파-글루코사미니드-N-아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민-6-설페이트 설파타제, 아포지단백질 E, 저밀도 지단백질 수용체(LDLR), 인자 VIII, 인자 IX, 척수 운동 뉴런 1(SMN1), 페닐알라닌 하이드록실라제, 프로피오닐-CoA 카복실라제, 포르포빌리노겐 데아미나제, 페틸말로닐-CoA 뮤타제, 우레이트 옥시다제, C1 에스테라제 억제제 및 산 알파-글루코시다제로부터 선택되는, mRNA 분자.
  19. 청구항 1 내지 18 중 어느 하나의 적어도 하나의 mRNA 분자 및 담체를 포함하는, 조성물.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 담체는 지질을 포함하는, 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 mRNA는 지질 나노입자 내에 캡슐화되는, 조성물.
  22. 청구항 19 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 담체는 XTC (2,2-디리노레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란), MC3 (((6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트), ALNY-100 ((3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)테트라하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-5-아민)), NC98-5 (4,7,13-트리스(3-옥소-3-(운데실아미노)프로필)-N1,N16-디운데실-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-1,16-디아미드), DODAP (1,2-디올레일-3-디메틸암모늄 프로판), HGT4003, ICE, HGT5000, 시스 또는 트랜스 HGT5001, DOTAP (1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판), DOTMA (1,2-디-O-옥타데세닐-3-트리메틸암모늄 프로판), DLinDMA, DLin-KC2-DMA 및 C12-200으로부터 선택된 하나 이상의 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노입자인, 조성물.
  23. 청구항 21 또는 청구항 22에 있어서, 상기 지질 나노입자는 DSPC (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DPPC (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린), DOPE (1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DPPE (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DMPE (1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DOPG (,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)) 및 콜레스테롤로부터 선택된 하나 이상의 헬퍼 지질을 포함하는, 조성물.
  24. 청구항 21 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 나노입자는 페길화 지질을 포함하는, 조성물.
  25. 청구항 21에 있어서, 상기 지질 나노입자는 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질 및 페길화 지질을 포함하는, 조성물.
  26. 청구항 19에 있어서, 상기 담체는 중합체를 포함하는, 조성물.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 중합체는 폴리에틸렌이민인, 조성물.
  28. 청구항 1 내지 18 중 어느 하나의 mRNA 또는 청구항 19 내지 27 중 어느 하나의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 생체내에서 단백질을 생성하는 방법.
  29. 생체내에서 치료 단백질의 발현을 유도할 수 있는 의약을 제조하기 위한, 청구항 1 내지 18 중 어느 하나에 따르는 mRNA 분자의 용도.
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