CN105026411A - 含4’-硫代修饰的核苷酸的核糖核酸及相关方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了在至少一个核苷酸残基的呋喃糖环中并入4’-硫代修饰的信使RNA分子和相关组合物，以及使用这些mRNA在体内产生编码的治疗性蛋白质和治疗或预防疾病或病症的方法。在某些实施方案中，所述4’-硫代修饰的mRNA使体内疗法具有增强的稳定性和/或降低的免疫原性。

Description

含4’-硫代修饰的核苷酸的核糖核酸及相关方法

本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2013年3月14日提交的美国专利申请号61/785,098的权益，该案的内容通过引用并入本文中。

背景

本发明涉及包含4’-硫代修饰的核苷酸残基的信使核糖核酸(mRNA)、包含这些mRNA的组合物及其制备和使用方法。

已经提出使用信使RNA的基因疗法作为治疗多种疾病的方法。先前已经报导过引入信使RNA(mRNA)作为在宿主内产生蛋白质的一种手段的观点。Yamamoto,A.等人，Eur.J.Pharm.71:484-489(2009)；Debus,H.等人，J.Control Rel.148:334-343(2010)。然而，成功地施用mRNA以在体内产生蛋白质典型地需要对mRNA进行包装(如使mRNA与聚合物或脂质载体形成复合物)。参见例如，国际专利申请公开号WO 2011/06810和WO 2012/170930。施用未包装的(裸)mRNA需要将化学修饰的核苷酸并入mRNA内以产生更稳定并且更有益的治疗剂。参见例如，M.Kormann等人，Nature Biotech.29:154-159(2011)；K.Kariko,Molecular Therapy 16(11):1833–1840(2008)。

施用编码能够在体内产生的治疗性蛋白质的mRNA可以提供优于施用编码该治疗性蛋白质的DNA以及直接施用该治疗性蛋白质的显著益处。然而，尽管编码治疗性蛋白质的治疗性mRNA的研发是药物疗法的一个颇具前景的进步，但此类治疗的效用仍受到mRNA，特别是编码全长蛋白质的那些mRNA的体内弱稳定性的限制。

明确地说，在基因替代疗法中使用的mRNA的稳定性较弱会使得体内所编码的治疗性蛋白质的产生不足或不太理想。在施用了编码治疗性蛋白质的mRNA之后，该mRNA可能发生降解，例如在体内暴露于一种或多种核酸酶之后发生降解。核糖核酸酶(例如内切核糖核酸酶和外切核糖核酸酶)是能够催化RNA降解成较小组分并由此使mRNA无法产生治疗性蛋白质的一类核酸酶。因此，核酸酶(例如RNA酶)能够缩短例如以合成方式制备或重组制备的mRNA的循环半衰期。在核酸溶解降解之后，mRNA不能翻译，并因此无法发挥预期的治疗益处，这会显著降低mRNA基因疗法的功效。

概述

本发明提供了一种改进的经过修饰的mRNA，用于更稳定、更稳固并且持续地在体内产生蛋白质。本发明部分是基于认识到，用于在体内产生治疗性蛋白质的mRNA的稳定性可以通过并入核糖部分中的4’氧被硫取代的经过修饰的核糖核苷酸而得到进一步提高。尽管先前S.Hoshika等人(Nuc.Ac.Res.Supp.3:209-210(2003))和M.Takahashi,M.等人(Nuc.Ac.Res.37:1353-1362(2009))已经报导用硫取代核糖核苷酸的核糖部分中的4’氧，但两篇报导都涉及含4’-硫代残基的至多15个残基长的短合成RNA区段用于RNA干扰；也已经报导包含4’-硫代修饰的核苷酸的具有19-21个残基的短RNA用于RNA干扰(Dande等人，J.Med.Chem.49:1624-1634(2006))及适配体开发(长度达59个残基；Hoshika等人，Nuc.Ac.Res.32:3815-3825(2004)；Kato等人，Nuc.Ac.Res.33:2942-2951(2005)；Minakawa等人，Bioorg.Med.Chem.16:9450-9456(2008))。然而，这些报导都未预测将4’-硫代核糖核苷酸并入全长mRNA(即，编码全长功能性治疗性蛋白质并且任选地含有一个或多个非编码区的mRNA)中的作用，这种全长mRNA具有比现有技术中所测试的任何干扰RNA或适配体长得多的长度，并且不是以均一的双链体状态存在，而且呈现的构象具有较大非螺旋和/或单链组分。更重要的是，在本发明之前，尚不了解并入了4’-硫代修饰的核苷酸的mRNA是否能成功地用于在体内产生蛋白质。如本文(包括实施例)中所描述，本发明人已经成功地合成了并入一个或多个4’-硫代修饰的核苷酸(例如，4’-硫代-ATP、4’-硫代-UTP、4’-硫代-GTP和/或4’-硫代-CTP)的全长mRNA。尽管在mRNA的长度方面存在问题，但本发明人能够合成并入了多达100％的4’-硫代-ATP、100％的4’-硫代-UTP、100％的4’-硫代-GTP和/或100％的4’-硫代-CTP的全长mRNA。如实施例中所示，此类修饰的mRNA比未修饰的mRNA稳定，并且意外的是，此类广泛修饰似乎不会影响修饰的mRNA在体内有效翻译的能力。

因此，本发明提供了允许更好地控制例如mRNA的稳定性、免疫原性及翻译效率的mNRA，及包含这些mRNA和任选地载体的组合物，以及使用这些mRNA和组合物在体内诱导治疗性蛋白质的表达以治疗疾病和/或病症的方法。

在一些实施方案中，本发明提供了一种具有编码区和任选地一个或多个非编码区的mRNA分子，其中所述mRNA包含至少一个并入了4’-硫代取代呋喃糖环的核苷酸残基。在一些实施方案中，提供的mRNA含有的核苷酸残基中有至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％并入了4’-硫代取代呋喃糖环。在一些实施方案中，提供的mRNA含有的核苷酸残基中100％并入了4’-硫代取代呋喃糖环。在一些实施方案中，提供的mRNA含有多达约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的4’-硫代-ATP。在一些实施方案中，提供的mRNA含有多达约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的4’-硫代-UTP。在一些实施方案中，提供的mRNA含有多达约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的4’-硫代-GTP。在一些实施方案中，提供的mRNA含有多达约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的4’-硫代-CTP。在一些实施方案中，提供的mRNA含有本文所描述的各种4’-硫代修饰的NTP的组合。

在一些实施方案中，提供的mRNA包含非编码区。在一些实施方案中，提供的mRNA包含多聚腺苷酸尾和/或多聚尿苷酸尾。在一些实施方案中，提供的mRNA包含5’帽结构。

在一些实施方案中，提供的mRNA另外包含至少一个非标准核苷酸残基。在一些实施方案中，所述至少一个非标准核苷酸残基选自5-甲基-胞苷、假尿苷和2-硫代尿苷中的一个或多个。在一些实施方案中，所述至少一个非标准核苷酸残基并入了4’-硫代呋喃糖环。在一些实施方案中，多达5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的非标准核苷酸残基并入了4’-硫代呋喃糖环。

在一些实施方案中，提供的mRNA的长度是至少60个残基。在一些实施方案中，提供的mRNA的长度是至少约70个、约80个、约90个、约100个、约150个、约200个、约300个、约400个、约500个、约1,000个、约1,500个、约2,000个、约2,500个、约3,000个、约3,500个、约4,000个、约4,500个或约5,000个残基。

本发明的其它实施方案提供了包含至少一个mRNA分子和载体的组合物，所述mRNA分子具有编码区和任选地一个或多个非编码区，其中所述mRNA包含至少一个并入了4’-硫代取代呋喃糖环的核苷酸残基。在一些实施方案中，提供的组合物包含至少一个mRNA和载体，所述mRNA具有编码区和任选地一个或多个非编码区，其中所述mRNA包含至少一个并入了4’-硫代取代呋喃糖环的核苷酸残基，并且所述mRNA的长度是至少60个残基。在某些实施方案中，本发明的组合物包含至少一个mRNA分子，所述mRNA分子具有编码区和任选地一个或多个非编码区，其中所述mRNA包含至少一个并入了4’-硫代取代呋喃糖环的核苷酸残基，并且与基于聚合物的载体或脂质纳米粒子形成复合物。

本发明另外提供在体内产生治疗性蛋白质的方法，所述方法包括向受试者施用至少一个mRNA分子，或包含此类mRNA和载体的组合物，所述mRNA分子具有编码区和任选地一个或多个非编码区，其中所述mRNA包含至少一个并入了4’-硫代取代呋喃糖环的核苷酸残基。本发明还提供了治疗需要治疗性蛋白质的受试者的方法，所述方法包括施用至少一个mRNA分子，或包含此类mRNA和载体的组合物，所述mRNA分子具有编码区和任选地非编码区，其中所述mRNA包含至少一个并入了4’-硫代取代呋喃糖环的核苷酸残基。在一些实施方案中，提供的方法中施用的mRNA是至少60个残基长度。本文所描述的各种修饰的mRNA可以用于产生治疗性蛋白质或用于治疗各种疾病、病症或病况。

在一些实施方案中，本发明提供了一种使用本文所描述的修饰的mRNA来产生蛋白质的方法。这种产生蛋白质的方法可以用于体外无细胞系统、体外基于细胞的系统或体内系统中。在各种实施方案中，适合的mRNA包含至少一个并入了4’-硫代取代呋喃糖环的核苷酸残基。在一些实施方案中，适合的mRNA包含的核苷酸残基(例如ATP、CTP、GTP、UTP，和/或非标准NTP)中有至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％并入了4’-硫代取代呋喃糖环。在一些实施方案中，提供的mRNA包含多聚腺苷酸尾和/或多聚尿苷酸尾。在一些实施方案中，提供的mRNA的长度是至少60个残基。

在一些实施方案中，本发明提供了所提供的mRNA分子的用途，所述mRNA分子用于制造能够在体内产生治疗性蛋白质的药物。

在一些其它实施方案中，本发明提供了一种用于制备所提供的mRNA的方法。在一些其它实施方案中，本发明提供了一种用于在体外合成所提供的mRNA的方法。在一些其它实施方案中，本发明提供了一种用于制备(例如在体外合成)所提供的mRNA的方法，所述mRNA包含的核苷酸残基(例如ATP、CTP、GTP、UTP，和/或非标准NTP)中有至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％并入了4’-硫代取代呋喃糖环。在一些实施方案中，本发明提供了一种用于制备(例如在体外合成)所提供的mRNA的方法，所述mRNA的长度是至少约60个、约70个、约80个、约90个、约100个、约150个、约200个、约300个、约400个、约500个、约1,000个、约1,500个、约2,000个、约2,500个、约3,000个、约3,500个、约4,000个、约4,500个或约5,000个残基。

本发明的其它目的和优势将部分陈述于以下说明中，并且部分将从该说明易于了解，或者可以通过本发明的实践来学习。借助于所附权利要求书中特别指出的要素和组合，将认识并获得本发明的目的和优势。

应了解，前述大体说明和以下详细说明都只是示例性和解释性的，而不是对所要求保护的发明的限制。附图结合于本说明书中并构成本说明书的一部分，示出了本发明的若干实施方案并且结合说明一起用于进一步解释本发明的原理。

附图简述

这些图只是用于说明而非限制性目的。

图1显示了示例性4'-硫代RNA碱基的分子结构：4'-硫代-腺苷、4'-硫代-鸟苷、4'-硫代-胞苷、4'-硫代-尿苷、4'-硫代-5-甲基-胞苷、4'-硫代-假尿苷及4'-硫代-2-硫代尿苷。

图2显示了在用修饰的FFL mRNA和未修饰的FFL mRNA转染后，通过HEK 293T细胞中FFL荧光素酶的产生进行的荧光素酶检测。

图3显示了有关修饰的FFL mRNA和未修饰的FFL mRNA的稳定性研究的结果。

图4显示了在施用修饰的FFL mRNA和未修饰的FFL mRNA后，通过小鼠肝中FFL荧光素酶的产生进行的荧光素酶检测。

发明详述

如本文中所使用，术语“mRNA”用于指包括编码区和任选地非编码区的修饰和/或未修饰的RNA。术语“编码区”是指mRNA中可以翻译成氨基酸链(即，由肽键连接的两个或更多个氨基酸)的一部分或区域。氨基酸链又称为肽或多肽，其可以折叠成蛋白质(例如，治疗性蛋白质)。术语“非编码区”是指mRNA中典型地不被翻译的一部分或区域。非编码区典型地包括5’非翻译区和/或3’非翻译区，包括但不限于，多聚腺苷酸尾或多聚尿苷酸尾。

“非标准核碱基”是除天然碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)外的碱基部分。非标准核碱基是特定核碱基(A、C、G、T或U)的类似物，其在核酸双螺旋中的碱基配对特性以及在核酸双螺旋(包括局部RNA-DNA螺旋，如在RNA聚合酶转录DNA模板期间形成的RNA-DNA螺旋)中通过DNA或RNA聚合酶并入的位点与先前所列的五个核碱基之一极其类似，不过T的类似物一般也会是U的类似物，并且反之亦然。结合术语包括但不限于“核苷”、“碱基”、“核苷酸”或“残基”的术语使用的术语“非标准”应与该术语结合“核碱基”使用时相同的方式解释。

如本文中所使用，术语“治疗性蛋白质”包括在施用给受试者时会对受试者的健康和幸福提供有益作用的任何蛋白质。在一些实施方案中，受试者体内该蛋白质的缺陷、缺乏或异常表达引起疾病或病况。“治疗性蛋白质”还可以指并非通常存在或并非通常以足量存在于受试者体内以实现希望的治疗作用的蛋白质。

如本文中所使用，术语“辅助脂”是指包括胆固醇在内的任何中性或两性离子型脂质材料。不希望受特定理论束缚，辅助脂可以使脂质双层/纳米粒子内的稳定性、刚性和/或流动性增加。

本发明的mRNA采用了特定的化学修饰的碱基取代入信使核糖核酸分子中以在施用给受试者后增强该信使核糖核酸分子的生物特性，在所述化学修饰的碱基中，核苷酸残基的核糖部分中的4’氧被硫置换。图1中描绘了用于并入本发明的mRNA中的示例性4’-硫代修饰的核苷酸残基(显示了含有硫代取代呋喃糖环的修饰的核苷酸残基)。在一些实施方案中，呋喃糖环的4’-硫代修饰改善了对外切核酸酶、内切核酸酶和/或人血清中的其它RNA降解酶的抗性。这种稳定性可以使RNA的半衰期增加。因此，举例来说，施用在呋喃糖环中具有4’-硫代修饰的mRNA或包含此类mRNA的组合物引起细胞对具有改善的生物特性(例如半衰期增加)的mRNA的吸收，而这又促成体内蛋白质产生的增加。

在某些实施方案中，RNA中至少1％的腺苷核苷酸残基在呋喃糖环中具有4’-硫代修饰。举例来说，mRNA中约1-5％、5-15％、15-30％、30-50％、50-75％、75-90％、90-99％或99-100％的腺苷可以是4’-硫代-腺苷。

在一些实施方案中，mRNA中至少约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的腺苷残基是4’-硫代-腺苷。在一些实施方案中，mRNA中约100％的腺苷残基是4’-硫代-腺苷。

在某些实施方案中，RNA中至少1％的鸟苷核苷酸残基在呋喃糖环中具有4’-硫代修饰。举例来说，mRNA中约1-5％、5-15％、15-30％、30-50％、50-75％、75-90％、90-99％或99-100％的鸟苷可以是4’-硫代-鸟苷。

在一些实施方案中，mRNA中至少约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的鸟苷残基是4’-硫代-鸟苷。在一些实施方案中，mRNA中约100％的鸟苷残基是4’-硫代-鸟苷。

在某些实施方案中，RNA中至少1％的尿苷核苷酸残基在呋喃糖环中具有4’-硫代修饰。举例来说，mRNA中约1-5％、5-15％、15-30％、30-50％、50-75％、75-90％、90-99％或99-100％的尿苷可以是4’-硫代尿苷。

在一些实施方案中，mRNA中至少约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的尿苷残基是4’-硫代-尿苷。在一些实施方案中，mRNA中约100％的尿苷残基是4’-硫代-尿苷。

在某些实施方案中，RNA中至少1％的胞苷核苷酸残基在呋喃糖环中具有4’-硫代修饰。举例来说，mRNA中约1-5％、5-15％、15-30％、30-50％、50-75％、75-90％、90-99％或99-100％的胞苷可以是4’-硫代-胞苷。

在一些实施方案中，mRNA中至少约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的胞苷残基是4’-硫代-胞苷。在一些实施方案中，mRNA中约100％的胞苷残基是4’-硫代-胞苷。

在一些实施方案中，提供的mRNA中的每个4’-硫代修饰的核苷酸都是4’-硫代-尿苷。在一些实施方案中，提供的mRNA中的每个4’-硫代修饰的核苷酸都是4’-硫代-胞苷。在一些实施方案中，提供的mRNA中的每个4’-硫代修饰的核苷酸独立地是4’-硫代-尿苷或4’-硫代-胞苷。在一些实施方案中，提供的mRNA包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个4’-硫代-尿苷或4’-硫代-胞苷。在一些实施方案中，提供的mRNA包含至少一个4’-硫代-腺苷残基。在一些实施方案中，提供的mRNA包含至少一个4’-硫代-鸟苷残基。在一些实施方案中，提供的mRNA包含至少一个4’-硫代-鸟苷或4’-硫代-腺苷残基。在一些实施方案中，提供的mRNA包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个4’-硫代-鸟苷或4’-硫代-腺苷残基。

在某些实施方案中，核苷酸残基在一种碱基类型(例如，腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷)的呋喃糖环中具有4’-硫代修饰的部分与其它碱基类型的修饰的核苷酸碱基的部分不同。

在某些实施方案中，少于10％的核苷酸残基在呋喃糖环中具有4’-硫代修饰。举例来说，约1-5％、5-10％、3-5％、1-3％、0.1-1％或0.01-0.1％的核苷酸残基可以并入4’-硫代取代呋喃糖环。

在其它实施方案中，超过10％的核苷酸残基在呋喃糖环中具有4’-硫代修饰。举例来说，约10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％或45-50％的核苷酸残基可以并入4’-硫代取代呋喃糖环。在一些实施方案中，超过50％的核苷酸残基在呋喃糖环中具有4’-硫代RNA修饰。举例来说，约50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-100％、95-97％、97-98％、98-99％、99-99.9％或99.9-100％的核苷酸残基并入了4’-硫代取代呋喃糖环。

在一些实施方案中，至少约1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸残基可以并入4’-硫代取代呋喃糖环。在一些实施方案中，约100％的核苷酸残基可以并入4’-硫代取代呋喃糖环。

本发明的mRNA中的编码区和非编码区可以涵盖不相邻的序列区域。可任选的非编码区可以包括5’非翻译区(UTR)、3’UTR、多聚腺苷酸尾、多聚尿苷酸尾或多聚胞苷酸尾，和/或5’帽结构中的一种或多种。在一些实施方案中，提供的mRNA包含非编码区。在一些实施方案中，提供的mRNA包含5’UTR。在一些实施方案中，提供的mRNA包含3’UTR。在一些实施方案中，提供的mRNA包含5’帽结构。在一些实施方案中，提供的mRNA包含多聚腺苷酸尾。在一些实施方案中，提供的mRNA包含5’-UTR序列、3’-UTR序列和多聚腺苷酸尾。在一些实施方案中，提供的mRNA包含5’-UTR序列、编码区、3’-UTR序列和多聚腺苷酸尾。在一些实施方案中，提供的mRNA包含5’-UTR序列、5’帽、3’-UTR序列和多聚腺苷酸尾。在一些实施方案中，提供的mRNA包含5’-UTR序列、5’帽、编码区、3’-UTR序列和多聚腺苷酸尾。

在某些实施方案中，多聚腺苷酸尾、多聚尿苷酸尾或多聚胞苷酸尾包含并入了4’-硫代取代呋喃糖环的核苷酸残基。在一些实施方案中，仅仅多聚腺苷酸尾、多聚尿苷酸尾或多聚胞苷酸尾，或者非编码区的其它组分并入了在呋喃糖环中具有4’-硫代的核苷酸残基，而mRNA分子中的其余核苷酸残基不含4’-硫代-呋喃糖修饰。在一些实施方案中，编码区包含并入了4’-硫代取代呋喃糖环的核苷酸残基。在某些实施方案中，编码区和非编码区(如果存在)并入了在呋喃糖环中具有4’-硫代的核苷酸残基。在某些实施方案中，多聚腺苷酸尾、多聚尿苷酸尾或多聚胞苷酸尾的长度可以变化。举例来说，多聚腺苷酸尾、多聚尿苷酸尾或多聚胞苷酸尾的长度可以是至少约50、70、90、100、150、200、250、300、400或500个核苷酸长。在一些实施方案中，多聚腺苷酸尾、多聚尿苷酸尾或多聚胞苷酸尾的长度低于约90、100、150、200、250、300、400或500个核苷酸长。在某些实施方案中，mRNA分子可以包括除4’-硫代取代呋喃糖环外的修饰。举例来说，所述分子可以并入任何非标准核碱基。某些实施方案可以包括核苷酸残基修饰，如5-甲基-胞苷(“5mC”)、假尿苷(“ψU”)、2-硫代尿苷(“2sU”)、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤及2-氯-6-氨基嘌呤胞嘧啶，以及这些修饰与其它核苷酸残基修饰的组合。某些实施方案还可以包括对呋喃糖环或核苷酸残基其它部分(例如核碱基)的另外的修饰。举例来说，在一些实施方案中，可以在未修饰或修饰的碱基，如假尿苷、2-硫代尿苷及5-甲基胞苷内包括4’-硫代呋喃糖环。在某些实施方案中，这些修饰中的任一种可以存在于0-100％的核苷酸残基中，例如，超过0％、1％、10％、50％、90％或95％，或者100％的个别或组合的核苷酸残基。在一些实施方案中，提供的mRNA包含至少一个非标准核苷酸残基。在一些实施方案中，所述至少一个非标准核苷酸残基选自5-甲基-胞苷、假尿苷和2-硫代尿苷中的一个或多个。在一些实施方案中，所述至少一个非标准核苷酸残基是5-甲基-胞苷。在一些实施方案中，所述至少一个非标准核苷酸残基并入了4’-硫代呋喃糖环。在一些实施方案中，多达5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的非标准核苷酸残基并入了4’-硫代呋喃糖环。

另外的修饰可以包括例如糖修饰或取代(例如2‘-O-烷基修饰、锁核酸(LNA)中的一种或多种)。在糖修饰是2‘-O-烷基修饰的实施方案中，此类修饰可以包括但不限于，2‘-脱氧-2‘-氟代修饰、2‘-O-甲基修饰、2‘-O-甲氧基乙基修饰及2‘-脱氧修饰。

在某些实施方案中，0-100％的mRNA可以是单链的。在某些实施方案中，0-100％的RNA可以呈现非螺旋式构象。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含其中约100％的尿苷残基被4’-硫代-尿苷置换的mRNA。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含其中约100％的尿苷残基被4’-硫代-尿苷置换并且约100％的胞苷残基被5-甲基-胞苷置换的mRNA。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含其中约100％的尿苷残基被4’-硫代-假尿苷置换的mRNA。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含其中约100％的尿苷残基被4’-硫代-假尿苷置换并且约100％的胞苷残基被5-甲基-胞苷置换的mRNA。

在一些实施方案中，当与相应的天然mRNA相比较时，提供的mRNA提供了有益的生物作用，例如但不限于，增加的稳定性、改善的蛋白质产生率和/或较高的蛋白质产量。在一些实施方案中，如与相应的天然mRNA(即，未经修饰的相应mRNA)相比较，提供的mRNA当在体内施用时具有增加的稳定性(例如较长血清半衰期)。

本发明的mRNA可以对核酸酶(例如内切核酸酶)降解具有更高的抗性，其抗性程度使得在施用给受试者之后，从mRNA转录物翻译的治疗性蛋白质的量相较于未经修饰的相应mRNA增加至少约2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、25％、30％、33％、36％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％、100％、110％、120％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、750％、800％、900％或1,000％。

在某些实施方案中，本发明的组合物中修饰的mRNA分子的长度是至少200个核苷酸残基长。举例来说，mRNA的长度可以是至少约200、300、400、500、1000、2000、3000、4000或5000个核苷酸残基。在一些实施方案中，提供的mRNA的长度是至少60个残基。在一些实施方案中，提供的mRNA的长度是至少约70个、约80个、约90个、约100个、约150个、约200个、约300个、约400个、约500个、约600个、约700个、约800个、约900个、约1,000个、约1,500个、约2,000个、约2,500个、约3,000个、约4,000个、约5,000个、约6,000个或约7000个残基。

在本发明的一些实施方案中，由本发明的mRNA编码的治疗性蛋白质可以是任何蛋白质，其中该蛋白质的缺陷、缺乏或异常表达引起疾病和/或病况。在一些实施方案中，治疗性蛋白质可以是酶。在其它实施方案中，治疗性蛋白质是并非通常存在或并非通常以足量存在于受试者体内以达到希望的治疗作用的蛋白质。

举例来说，适合治疗性蛋白质的非限制性选择包括促红细胞生成素、胰岛素、人生长激素、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、胰岛素、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、葡糖脑苷脂酶、乙酰肝素磺酰胺酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨基琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)及精氨酸酶1(ARG1)、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸移位酶、糖原脱支酶、溶酶体α-葡糖苷酶、1,4-α-葡聚糖分支酶、糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、肝磷酸化酶、GLUT-2、UDP糖原合成酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、硫酸艾杜糖醛酸硫酸酯酶、硫酸乙酰肝素磺酰胺酶、α-N-乙酰葡萄糖酰胺酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、载脂蛋白E、低密度脂蛋白受体(LDLR)、凝血因子(如因子VIII和因子IX)、脊髓运动神经元1(SMN1)、苯丙氨酸羟化酶、丙酰-CoA羧化酶、胆色素原脱氨酶、甲基丙二酰-CoA变位酶、尿酸氧化酶、C1酯酶抑制剂及酸性α-葡萄糖苷酶。

在某些实施方案中，本发明的mRNA分子可以呈裸mRNA或未包装的mRNA的形式施用。在一些实施方案中，可以通过包括适合载体来促进本发明的组合物中的mRNA的施用。在某些实施方案中，载体是基于促进一个或多个mRNA转染靶细胞的能力进行选择。

如本文中所使用，术语“载体”包括任何标准药物载体、媒剂、稀释剂、赋形剂等，其一般打算结合生物活性剂(包括mRNA)的施用来使用。本文所描述的组合物，明确地说载体能够将不同大小的mRNA递送到其靶细胞或靶组织和/或使不同大小的mRNA稳定。在某些实施方案中，本发明的组合物包含能够递送较大mRNA(例如，至少5kDa、10kDa、12kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa或更高分子量，或长度是至少60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500、6,000、6,500或7,000个残基的mRNA)的载体。根据本发明的mRNA可以根据多种已知方法中的任一种合成。举例来说，根据本发明的mRNA可以经由体外转录(IVT)合成。简单地说，IVT典型地是在以下各物存在下进行：含有启动子的线性或环状DNA模板；包括希望量的4’-硫代修饰的标准和/或非标准核糖核苷酸(例如，一个或多个希望的4’-硫代-NTP)的一组三磷酸核糖核苷酸，其中任选地混有未修饰的三磷酸核糖核苷酸；缓冲液系统，该缓冲液系统可以包括DTT和镁离子；以及适当RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。确切条件将根据具体应用而变化。据观察，4’-硫代修饰的标准和/或非标准核糖核苷酸可以被有效地并入任何长度的全长mRNA中。

在一些实施方案中，为了制备根据本发明的mRNA，在体外转录DNA模板。适合的DNA模板典型地具有供体外转录的启动子，例如T3、T7或SP6启动子，随后是用于编码相关蛋白质和终止信号的希望的核苷酸序列。典型地，mRNA的合成包括在N末端(5’末端)添加“帽”，并且在C末端(3’末端)添加“尾”。帽的存在对于提供针对大多数真核细胞中所见的核酸酶的抗性极为重要。“尾”的存在用于防止mRNA被外切核酸酶降解。

因此，在一些实施方案中，根据本发明的mRNA包括5’帽结构。5’帽典型地添加如下：首先，RNA末端磷酸酶从5’核苷酸去除一个末端磷酸酯基团，留下两个末端磷酸酯；然后经由鸟苷酰基转移酶将三磷酸鸟苷(GTP)添加到末端磷酸酯上，产生5’5’5三磷酸酯键；接着，通过甲基转移酶使鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的实例包括但不限于，m7G(5')ppp(5'(A、G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。

在一些实施方案中，根据本发明的mRNA包括3’尾结构。适合的3’尾结构包括但不限于，多聚腺苷酸尾、多聚尿苷酸尾和/或多聚胞苷酸尾。以上描述了示例性适合多聚腺苷酸尾、多聚尿苷酸尾和多聚胞苷酸尾。多聚尿苷酸尾或多聚胞苷酸尾可以添加到多聚腺苷酸尾上，或者可以代替多聚腺苷酸尾。

在一些实施方案中，根据本发明的mRNA包括5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，5’非翻译区包括一个或多个影响mRNA的稳定性或翻译的元件，例如铁反应性元件。在一些实施方案中，5’非翻译区的长度可以介于约50个与500个核苷酸之间(例如长度在约50个与400个核苷酸之间，长度在约50个与300个核苷酸之间，长度在约50个与200个核苷酸之间，或长度在约50个与100个核苷酸之间)。

在本发明的某些实施方案中，载体可以选择和/或制备用于优化mRNA向靶细胞、靶组织或靶器官的递送。举例来说，如果靶细胞是肺细胞，那么可以优化载体的特性(例如，大小、电荷和/或pH)以将此类载体有效地递送到靶细胞或靶器官中，降低免疫清除率，和/或促进在该靶器官中的保留。或者，如果靶组织是中枢神经系统(例如，为促进将mRNA多聚核苷酸递送到靶脑区或脊髓组织)，那么载体的选择和制备必须考虑穿过血脑屏障和保留在血脑屏障内，和/或使用将此类载体直接递送到此类靶组织的替代手段。在某些实施方案中，本发明的组合物可以与促进将外源多聚核苷酸从施用了此类组合物的局部组织或器官转移到一个或多个周围靶器官或靶组织的试剂组合。

在某些实施方案中，本发明的组合物中使用的载体可包含脂质体媒剂，或促进将mRNA转移到靶细胞或靶组织的其它手段。适合载体包括但不限于，基于聚合物的载体，如聚乙烯亚胺(PEI)；脂质纳米粒子和脂质体；纳米脂质体；含神经酰胺的纳米脂质体；蛋白脂质体；天然和合成来源的外泌体；天然、合成及半合成的层状小体；纳米颗粒；硅酸钙磷光体纳米颗粒；溶胶-凝胶；磷酸钙纳米颗粒；二氧化硅纳米颗粒；纳米结晶颗粒；半导体纳米颗粒；聚(D-精氨酸)；纳米树状聚合物(nanodendrimer)；淀粉类递送系统；微胞；乳液；非离子体(niosome)；质粒；病毒；磷酸钙核苷酸；适配体；肽；及其它媒介物标记。还涵盖使用生物纳米胶囊和其它病毒衣壳组件作为适合载体。(Hum.Gene Ther.19(9):887-95(2008))。

在本发明的某些实施方案中，载体是使用单独聚合物或聚合物与其它载体的组合作为载体来配制的。适合的聚合物可以包括例如，聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、海藻酸盐、胶原蛋白、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、聚乙二醇化鱼精蛋白、PLL、聚乙二醇化PLL，以及聚乙烯亚胺(PEI)，包括但不限于分支PEI(25kDa)。在一些实施方案中，聚合物可以是一种或多种多域嵌段聚合物。在一些实施方案中，聚合物可以包含一种或多种聚合物的干粉配制物。

本发明还涵盖使用脂质体载体来促进将多聚核苷酸递送到靶细胞中。脂质体(例如，脂质体脂质纳米粒子)一般可用于研究、工业和医学的众多应用中，特别适用作体内诊断性或治疗性化合物的载体(Lasic等人，Trends Biotechnol.，16:307-321(1998)；Drummond等人，Pharmacol.Rev.，51:691-743(1999))，并且通常其特征在于具有通过一个或多个双层膜与外部介质隔开的内部含水空间的微观囊泡。脂质体的双层膜典型地是由两亲分子形成，如包含空间上分开的亲水性域和疏水性域的合成或天然来源的脂质。脂质体的双层膜还可以由两亲聚合物和表面活性剂(例如高分子囊泡(polymerosome)、非离子体等)形成。

在某些实施方案中，mRNA分子与脂质纳米粒子形成复合物以便于递送到靶细胞中。适合脂质的实例包括例如磷脂酰基化合物(例如，磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、脑苷酯及神经节苷脂)。在某些实施方案中，本发明的mRNA分子和组合物可以与具有不同比率的多组分脂质混合物组合，所述多组分脂质混合物采用了被设计用于包封各种核酸类物质的一种或多种阳离子脂质、辅助脂及聚乙二醇化脂质。

阳离子脂质可以包括但不限于，DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷)、DODAP(1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷)、cKK-E12(3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮)、二烷基氨基类、咪唑类、胍类、XTC(2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)、MC3(((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)、ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺))、NC98-5(4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺)、HGT4003(WO 2012/170889，其教导通过引用整体并入本文中)、ICE(WO 2011/068810，其教导通过引用整体并入本文中)、HGT5000(美国临时专利申请号61/617,468，其教导通过引用整体并入本文中)或HGT5001(顺式或反式)(临时专利申请号61/617,468)、氨基醇类脂质(如WO2010/053572中公开的那些)、DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷)、DOTMA(1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷)、DLinDMA(Heyes等人，J.Contr.Rel.107:276-287(2005))、DLin-KC2-DMA(Semple等人，Nature Biotech.28:172-176(2010))、C12-200(Love等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.107:1864-1869(2010))。在一些实施方案中，阳离子脂质是cKK-E12：

适合的辅助脂包括但不限于，DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油))及胆固醇。

用于纳米粒子配制物中的聚乙二醇化脂质包括但不限于，与烷基链长度是C6-C20的脂质共价连接的长度达5kDa的聚(乙二醇)链、DMG-PEG2K、PEG-DSG、PEG-DMG及PEG-脑苷酯。

在某些实施方案中，脂质纳米粒子载体包含以下脂质配制物之一：

C12-200、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K；

DODAP、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K；

HGT5000、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K；

HGT5001、DOPE、胆固醇、DMG-PEG2K；

XTC、DSPC、胆固醇、PEG-DMG；

MC3、DSPC、胆固醇、PEG-DMG；

ALNY-100、DSPC、胆固醇、PEG-DSG。

在某些实施方案中，本发明的mRNA和包含这些mRNA的组合物可以通过局部而非全身方式施用，例如经由将药物组合物直接注射到靶组织中，优选呈持续释放配制物形式。取决于被靶向的组织，局部递送可以通过各种方式实现。举例来说，可以吸入(对于经鼻、气管或支气管递送)含有本发明的mRNA和组合物的气雾剂；可以将本发明的mRNA和组合物注射到例如损伤、疾病表现或疼痛部位；对于口服、气管或食道应用，提供的组合物可以呈锭剂形式；对于施用到胃或肠，可以呈液体、片剂或胶囊形式；对于直肠或阴道应用，可以呈栓剂形式；或者甚至可以通过使用乳膏、滴液，或甚至通过注射递送到眼部。

本文中还涵盖包含一种或多种本文所公开的脂质体纳米粒子的冻干的药物组合物，及使用此类冻干组合物的相关方法，如例如国际专利公开WO 2012/170889中所公开，其教导通过引用整体并入本文中。举例来说，本发明的冻干mRNA和组合物可以在施用之前复水，或者可以在体内复水。举例来说，冻干的mRNA和/或组合物可以配制成适当的剂型(例如，皮内剂型，如圆片、条杆或膜)并施用，由此使该剂型在体内通过个体的体液随时间发生再水合。

在某些实施方案中，还涵盖治疗受试者的方法，所述方法包括施用本发明的mRNA或组合物。举例来说，本发明的某些实施方案提供了治疗或预防特定蛋白质的产生和/或特定蛋白质的利用不当或削弱的病况的方法。在一些实施方案中，本发明提供了调节(例如，增加、改善或在其它方面增强)靶细胞中一种或多种mRNA的翻译效率的方法。如本文中所使用，短语“翻译效率”是指mRNA翻译以及编码的治疗性蛋白质产生的程度。

在某些实施方案中，将本发明的mRNA分子或包含此类mRNA的组合物施用给患者。

在一些实施方案中，本发明的mRNA分子或包含此类mRNA的组合物被用于在体外或体内系统中产生蛋白质。适合的体外系统可以是体外无细胞系统或体外基于细胞的系统。适合的体内系统可以是任何活生物体，如非人类动物(例如，大鼠、小鼠、猪、狗、鸡、绵羊、非人类灵长类动物等)或人类。

实施例

以下具体实施例应当仅解释为说明性的，而不是对本发明范围的限制。无需另外详细说明，相信本领域的技术人员可以基于本文中的说明，最大程度地利用本发明。

实施例1：并入4’-硫代取代呋喃糖环的mRNA的合成和表达

合成编码蛋白质的mRNA。该mRNA含有至少一个4’-硫代取代呋喃糖环。将mRNA配制成药物组合物并施用给受试者。相较于不含4’-硫代取代呋喃糖环的对照mRNA，该mRNA可以展现较长的半衰期并且合成较大量的由该mRNA编码的蛋白质。

I.配制实验详情：

I-a.信使RNA材料

通过以下方式合成萤火虫荧光素酶(FFL)、人促红细胞生成素(EPO)及人α-半乳糖苷酶(GLA)：在体外由编码所述基因的质粒DNA模板进行转录，随后添加5’帽结构(帽1)(Fechter和Brownlee，J.Gen.Virology 86:1239-1249(2005))和长度是约200个核苷酸的3’多聚腺苷酸尾(如通过凝胶电泳法测定)。每一mRNA产物中存在的5’非翻译区和3’非翻译区分别以X和Y表示，并且如所陈述来定义(见下文)。

人促红细胞生成素(EPO)mRNA(SEQ ID NO：1)：

X₁AUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGAY₁

人α-半乳糖苷酶(GLA)mRNA(SEQ ID NO：2)：

X₁AUGCAGCUGAGGAACCCAGAACUACAUCUGGGCUGCGCGCUUGCGCUUCGCUUCCUGGCCCUCGUUUCCUGGGACAUCCCUGGGGCUAGAGCACUGGACAAUGGAUUGGCAAGGACGCCUACCAUGGGCUGGCUGCACUGGGAGCGCUUCAUGUGCAACCUUGACUGCCAGGAAGAGCCAGAUUCCUGCAUCAGUGAGAAGCUCUUCAUGGAGAUGGCAGAGCUCAUGGUCUCAGAAGGCUGGAAGGAUGCAGGUUAUGAGUACCUCUGCAUUGAUGACUGUUGGAUGGCUCCCCAAAGAGAUUCAGAAGGCAGACUUCAGGCAGACCCUCAGCGCUUUCCUCAUGGGAUUCGCCAGCUAGCUAAUUAUGUUCACAGCAAAGGACUGAAGCUAGGGAUUUAUGCAGAUGUUGGAAAUAAAACCUGCGCAGGCUUCCCUGGGAGUUUUGGAUACUACGACAUUGAUGCCCAGACCUUUGCUGACUGGGGAGUAGAUCUGCUAAAAUUUGAUGGUUGUUACUGUGACAGUUUGGAAAAUUUGGCAGAUGGUUAUAAGCACAUGUCCUUGGCCCUGAAUAGGACUGGCAGAAGCAUUGUGUACUCCUGUGAGUGGCCUCUUUAUAUGUGGCCCUUUCAAAAGCCCAAUUAUACAGAAAUCCGACAGUACUGCAAUCACUGGCGAAAUUUUGCUGACAUUGAUGAUUCCUGGAAAAGUAUAAAGAGUAUCUUGGACUGGACAUCUUUUAACCAGGAGAGAAUUGUUGAUGUUGCUGGACCAGGGGGUUGGAAUGACCCAGAUAUGUUAGUGAUUGGCAACUUUGGCCUCAGCUGGAAUCAGCAAGUAACUCAGAUGGCCCUCUGGGCUAUCAUGGCUGCUCCUUUAUUCAUGUCUAAUGACCUCCGACACAUCAGCCCUCAAGCCAAAGCUCUCCUUCAGGAUAAGGACGUAAUUGCCAUCAAUCAGGACCCCUUGGGCAAGCAAGGGUACCAGCUUAGACAGGGAGACAACUUUGAAGUGUGGGAACGACCUCUCUCAGGCUUAGCCUGGGCUGUAGCUAUGAUAAACCGGCAGGAGAUUGGUGGACCUCGCUCUUAUACCAUCGCAGUUGCUUCCCUGGGUAAAGGAGUGGCCUGUAAUCCUGCCUGCUUCAUCACACAGCUCCUCCCUGUGAAAAGGAAGCUAGGGUUCUAUGAAUGGACUUCAAGGUUAAGAAGUCACAUAAAUCCCACAGGCACUGUUUUGCUUCAGCUAGAAAAUACAAUGCAGAUGUCAUUAAAAGACUUACUUUAAY₁

密码子优化的萤火虫荧光素酶(FFL)mRNA(SEQ ID NO：3)：

X₂AUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAtJACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAY₂

X₁(5’非翻译序列)(SEQ ID NO：4)：

GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG

X₂(5’非翻译序列)(SEQ ID NO：5)：

GGGAUCCUACC

Y₁(3’非翻译序列)(SEQ ID NO：6)：

CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC

Y₂(3’非翻译序列)(SEQ lD NO：7)：

UUUGAAUU

I-b.配制方案

方案A：将50mg/mL含C12-200、DOPE、Chol及DMG-PEG2K的乙醇溶液的等分试样混合，并用乙醇稀释到3mL最终体积。独立地由1mg/mL储备液制备GLA mRNA的水性缓冲溶液(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl，pH 4.5)。将脂质溶液迅速注射到水性mRNA溶液中并振荡，得到于20％乙醇中的最终悬浮液。过滤所得纳米粒子悬浮液，用1×PBS(pH 7.4)透滤，浓缩并在2-8℃下储存。最终浓度＝0.85mg/mL GLA mRNA(被包封)。Zave＝81.2nm(Dv(50)＝63.2nm；Dv(90)＝104nm)。

方案B：将50mg/mL含DODAP、DOPE、胆固醇及DMG-PEG2K的乙醇溶液的等分试样混合，并用乙醇稀释到3mL最终体积。独立地由1mg/mL储备液制备EPO mRNA的水性缓冲溶液(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl，pH 4.5)。将脂质溶液迅速注射到水性mRNA溶液中并振荡，得到于20％乙醇中的最终悬浮液。过滤所得纳米粒子悬浮液，用1×PBS(pH 7.4)透滤，浓缩并在2-8℃下储存。最终浓度＝1.35mg/mL EPO mRNA(被包封)。Zave＝75.9nm(Dv(50)＝57.3nm；Dv(90)＝92.1nm)。

方案C：将2.0mg/mL的PEI(分支状，25kDa)水溶液的等分试样与CFTR mRNA的水溶液(1.0mg/mL)混合。用移液管来回抽吸所得复合的混合物数次并放置20分钟，随后注射。最终浓度＝0.60mg/mL CFTR mRNA(被包封)。Zave＝75.9nm(Dv(50)＝57.3nm；Dv(90)＝92.1nm)。

II.有关修饰的信使RNA与未修饰的mRNA的对比分析：

II-a.信使RNA构建体内修饰的碱基的定量

使4’-硫代NTP修饰的信使RNA经历RNA酶I或核酸酶P1处理不同时间段，以实现充分降解。完成后，再用碱性磷酸酶降解所得到的单磷酸核苷酸，得到对应的核苷。将核苷混合物施加到Amicon旋转离心柱(30,000MWCO)上以有效去除酶。经由HPLC分析所得核苷溶液，并经由与对应的未修饰核苷进行峰面积比较来定量。

II-b.4’-硫代NTP修饰的信使RNA构建体的稳定性

使4’-硫代NTP修饰的信使RNA经历RNA酶I或核酸酶P1处理不同时间段，以评估对核酸酶降解的抗性。类似地，用血清(含有核酸酶)处理4’-硫代NTP修饰的信使RNA不同时间段，以评估核酸酶降解。在指定时间点，用抑制剂中止核酸酶反应，并将所得溶液施加到Amicon旋转离心柱(30,000MWCO)上以有效去除酶。完成后，将滞留物施加到1％的琼脂糖凝胶上并分析mRNA构建体的活力(大小、降解产物等)。对未修饰的mRNA进行相同实验并且可以作出直接比较和推论。

II-c.4’-硫代NTP修饰的信使RNA对蛋白质产生的影响

体外研究：使用HEK293T细胞进行4’-硫代NTP修饰的mRNA和未修饰mRNA的体外转染。使用脂染胺(lipofectamine)在不同孔中进行一微克的各mRNA构建体的转染。在选定时间点(例如4小时、8小时、24小时、48小时、72小时等)收集细胞并分析对应蛋白质的产量。对于FFL mRNA，经由生物发光检验来分析细胞溶解产物中荧光素酶的产生。对于EPO和GLA mRNA研究，获得细胞上清液并使用基于ELISA的方法分别分析EPO和GLA蛋白质。可以对未修饰mRNA与4’-硫代NTP修饰的mRNA随时间的蛋白质产量进行比较。

体内研究：经由将包封4’硫代NTP修饰的mRNA的纳米粒子(脂质或聚合物纳米粒子)注射到野生型小鼠(CD-1)中，以及以相同方式递送未修饰mRNA，来比较二者随时间的蛋白质产量。在选定时间点(例如6小时、12小时、24小时、48小时、72小时等)收集血清和器官，并监测对应蛋白质的水平。对于FFL mRNA，经由生物发光检验来分析肝匀浆中荧光素酶的产生。对于EPO和GLA mRNA研究，获得小鼠血清并使用基于ELISA的方法分别分析EPO和GLA蛋白质。对未修饰mRNA与4’-硫代NTP修饰的mRNA随时间的蛋白质产量进行比较。

类似地，经由静脉内、皮下或气管内施用来注射未包封的(裸)4’硫代NTP修饰的mRNA和未修饰的mRNA，并且可以如以上所描述，进行相同分析来评估稳定性和蛋白质产量的差异。

III.有关经由施用裸的修饰的mRNA或载有mRNA的纳米粒子产生的FFL、EPO和GLA蛋白质的分析：

III-a.注射方案

所有研究在每一实验开始时都是使用约6-8周龄的雄性CD-1小鼠进行。通过单次尾静脉推注注射30-200微克等效总剂量的未包封或包封的FFL、EPO或GLA mRNA(修饰或未修饰的)来引入样品。在指定时间点，处死小鼠并灌注生理盐水。

III-b.分离器官组织用于分析

收集每只小鼠的肝和脾，均分成三份，并储存于10％的中性缓冲福尔马林中或速冻并储存于-80℃下以供分析。

III-c.分离血清用于分析

在用药后48小时(±5％)，通过CO₂窒息法对所有动物实施安乐死，随后行开胸术，并收集终末心脏血。经由在安乐死的动物上实行心脏穿刺，将全血(可获得的最大体积)收集到血清分离管中，使其在室温下凝固至少30分钟，在22℃±5℃下以9300g离心10分钟，并提取血清。为临时收集血液，经由面静脉穿刺或断尾法收集约40-50μL的全血。使用从未处理动物收集的样品作为基线GLA水平以与研究动物相比较。

III-d.酶联免疫吸附检验(ELISA)分析

EPO ELISA：遵循关于人EPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD，R&D Systems，目录号Dep-00)所报导的程序，进行EPO蛋白质的定量。所用阳性对照物由超纯和组织培养级重组人促红细胞生成蛋白(R&D Systems，目录号分别是286-EP和287-TC)组成。在指定时间点取得血液样品并如以上所描述进行处理。在Molecular Device FlexStation仪器上，经由吸光度(450nm)监测检测过程。

GLA ELISA：遵循标准ELISA程序，使用绵羊抗G-188IgG作为捕获抗体并且使用兔抗TK-88IgG作为二级(检测)抗体(Shire Human Genetic Therapies)。使用辣根过氧化酶(HRP)偶联的山羊抗兔IgG来活化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液。20分钟之后，使用2N H₂SO₄中止反应。在Molecular Device FlexStation仪器上，经由吸光度(450nm)监测检测过程。未处理的小鼠血清和人蛋白分别用作阴性对照物和阳性对照物。

III-e.生物发光分析

荧光素酶检验：生物发光检验是使用Promega荧光素酶检验系统(项目编号E1500)进行的。荧光素酶检验试剂是通过将10mL荧光素酶检验缓冲液添加到荧光素酶检验基质中并经由涡旋进行混合来制备。将约20μL匀浆样品装载到96孔板上，随后将20μL板对照物添加到每一样品。独立地将120μL荧光素酶检验试剂(如以上所描述制备)添加到96孔平底板的每个孔中。然后，使用Molecular DeviceFlex Station仪器将每个板插入适当腔室中，并测量发光度(以相对光度单位(RLU)测量)。

实施例2.用于递送和表达含4’-硫代修饰的mRNA的示例性脂质体配制物

本实施例提供了用于在体内有效递送和表达4’-硫代修饰的mRNA的示例性脂质体配制物。

脂质材料

本文中所描述的配制物包括不同比率的多组分脂质混合物，所述多组分混合物采用了被设计用于包封各种核酸类物质的一种或多种阳离子脂质、辅助脂(例如，非阳离子脂质和/或基于胆固醇的脂质)及聚乙二醇化脂质。阳离子脂质可以包括(但不限于)DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷)、DODAP(1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷)、DOTMA(1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷)、DLinDMA(Heyes,J.；Palmer,L.；Bremner,K.；MacLachlan,I.“Cationic lipid saturationinfluences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids)”，J.Contr.Rel.2005,107,276-287)、DLin-KC2-DMA(Semple,S.C.等人，“RationalDesign of Cationic Lipids for siRNA Delivery”，Nature Biotech.2010,28,172-176)、C12-200(Love,K.T.等人，“Lipid-like materials for low-dose invivo gene silencing)”PNAS 2010,107,1864-1869)、HGT4003、HGT5000、HGT5001、MC3、cKK-E12(3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮)、ICE、二烷基氨基类、咪唑类、胍类等。辅助脂包括(但不限于)DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油))、胆固醇等。聚乙二醇化脂质可以包括(但不限于)与烷基链长度是C₆-C₂₀的脂质共价连接的长度达5kDa的聚(乙二醇)链。

聚合材料

本文所描述的其它配制物包括各种带电的聚合材料，这些聚合材料可以包括(但不限于)分支聚乙烯亚胺(PEI)(25kDa)(Sigma#408727)、鱼精蛋白、聚乙二醇化鱼精蛋白、PLL、聚乙二醇化PLL等。

mRNA材料

通过以下方式合成萤火虫荧光素酶(FFL)、人促红细胞生成素(EPO)及人α-半乳糖苷酶(GLA)：在体外由编码所述基因的质粒DNA模板进行转录，随后添加5’帽结构(帽1)(Fechter,P.；Brownlee,G.G.，“Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins”J.Gen.Virology 2005,86,1239-1249)和长度是约200个核苷酸的3’多聚腺苷酸尾(如通过凝胶电泳法测定)。每一mRNA产物中存在的5’非翻译区和3’非翻译区分别以X和Y表示，并且如所陈述来定义(见下文)。

人促红细胞生成素(EPO)、人α-半乳糖苷酶(GLA)及密码子优化的萤火虫荧光素酶(FFL)的示例性mRNA序列分别描述于SEQ ID No.1、2和3中。示例性5’UTR和3’UTR序列描述于SEQ ID No.4、5、6及7中。

示例性配制方案

A.C12-200和GLA

将50mg/mL含C12-200、DOPE、胆固醇及DMG-PEG2K的乙醇溶液的等分试样混合，并用乙醇稀释到3mL最终体积。独立地由1mg/mL储备液制备GLA mRNA的水性缓冲溶液(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl，pH 4.5)。将脂质溶液迅速注射到水性mRNA溶液中并振荡，得到于20％乙醇中的最终悬浮液。过滤所得纳米粒子悬浮液，用1×PBS(pH 7.4)透滤，浓缩并在2-8℃下储存。最终浓度＝0.85mg/mL GLA mRNA(被包封)。Z_ave＝81.2nm(Dv₍₅₀₎＝63.2nm；Dv₍₉₀₎＝104nm)。

B.DODAP和EPO

将50mg/mL含DODAP、DOPE、胆固醇及DMG-PEG2K的乙醇溶液的等分试样混合，并用乙醇稀释到3mL最终体积。独立地由1mg/mL储备液制备EPO mRNA的水性缓冲溶液(10mM柠檬酸盐/150mM NaCl，pH 4.5)。将脂质溶液迅速注射到水性mRNA溶液中并振荡，得到于20％乙醇中的最终悬浮液。过滤所得纳米粒子悬浮液，用1×PBS(pH 7.4)透滤，浓缩并在2-8℃下储存。最终浓度＝1.35mg/mL EPO mRNA(被包封)。Z_ave＝75.9nm(Dv₍₅₀₎＝57.3nm；Dv₍₉₀₎＝92.1nm)。

C.PEI和CFTR

将2.0mg/mL的PEI(分支状，25kDa)水溶液的等分试样与CFTRmRNA的水溶液(1.0mg/mL)混合。用移液管来回抽吸所得复合的混合物数次并放置20分钟，随后注射。最终浓度＝0.60mg/mL CFTRmRNA(被包封)。Z_ave＝75.9nm(Dv₍₅₀₎＝57.3nm；Dv₍₉₀₎＝92.1nm)。

实施例3.有关修饰的mRNA与未修饰mRNA的体内稳定性和蛋白质产量的对比分析

本实施例说明了用于分析体内各种靶组织中修饰的mRNA的稳定性和蛋白质表达的示例性方法。

mRNA构建体内修饰的碱基的定量

使4’-硫代NTP修饰的mRNA经历RNA酶I或核酸酶P1处理不同时间段，以实现充分降解。完成后，再用碱性磷酸酶降解所得到的单磷酸核苷酸，得到对应的核苷。将核苷混合物施加到Amicon旋转离心柱(30,000MWCO)上以有效去除酶。经由HPLC分析所得核苷溶液，并经由与对应的未修饰核苷进行峰面积比较来定量。

4’-硫代NTP修饰的mRNA构建体的稳定性

使4’-硫代NTP修饰的mRNA经历RNA酶I或核酸酶P1处理不同时间段，以评估对核酸酶降解的抗性。在指定时间点，用抑制剂中止核酸酶反应，并将所得溶液施加到Amicon旋转离心柱(30,000MWCO)上以有效去除酶。完成后，将滞留物施加到1％的琼脂糖凝胶上并分析mRNA构建体的活力(大小、降解产物等)。对未修饰mRNA进行相同实验并且作出直接比较和推论。

4’-硫代NTP修饰的mRNA对蛋白质产生的影响

体外研究：

使用HEK293T细胞进行4’-硫代NTP修饰的mRNA和未修饰mRNA的体外转染。使用脂染胺在不同孔中进行一微克的各mRNA构建体的转染。在选定时间点(例如4小时、8小时、32小时、48小时、56小时、80小时等)收集细胞并分析对应蛋白质的产量。对于FFLmRNA，经由生物发光检验来分析细胞溶解产物中荧光素酶的产生。对于EPO和GLA mRNA研究，获得细胞上清液并使用基于ELISA的方法分别分析EPO和GLA蛋白质。对未修饰mRNA与4’-硫代NTP修饰的mRNA随时间的蛋白质产量进行比较。示例性结果显示于图2中。

体内研究：

经由将包封4’硫代NTP修饰的mRNA的纳米粒子(脂质或聚合物纳米粒子)注射到野生型小鼠(CD-1)中，以及以相同方式递送未修饰mRNA，来比较二者随时间的蛋白质产量。在选定时间点(例如6小时、12小时、24小时、48小时、72小时等)收集血清和器官，并监测对应蛋白质的水平。对于FFL mRNA，经由生物发光检验来分析肝匀浆中荧光素酶的产生。对于EPO和GLA mRNA研究，获得小鼠血清并使用基于ELISA的方法分别分析EPO和GLA蛋白质。对未修饰mRNA与4’-硫代NTP修饰的mRNA随时间的蛋白质产量进行比较。

类似地，经由静脉内、皮下或气管内施用来注射未包封的(裸)4’硫代NTP修饰的mRNA和未修饰的mRNA，并且进行相同分析来评估稳定性和蛋白质产量的差异。

实施例4.有关在施用裸的修饰的mRNA或载有mRNA的纳米粒子之后FFL、EPO和GLA蛋白质产量的分析

本实施例描述了用于分析在施用裸的修饰的mRNA或载有mRNA的纳米粒子之后的示例性蛋白质产量的方案，并且描述了4’-硫代修饰的mRNA与未修饰mRNA的mRNA稳定性和蛋白质产量的比较。

所有研究在每一实验开始时都是使用约6-8周龄的雄性CD-1小鼠进行。通过单次尾静脉推注注射30-200微克等效总剂量的未包封或包封的FFL、EPO或GLA mRNA(修饰或未修饰的)来引入样品。在指定时间点，处死小鼠并灌注生理盐水。

收集每只小鼠的肝和脾，均分成三份，并储存于10％的中性缓冲福尔马林中或速冻并储存于-80℃下以供分析。

在用药后48小时(±5％)，通过CO₂窒息法对所有动物实施安乐死，随后行开胸术，并收集终末心脏血。经由对安乐死的动物实行心脏穿刺，将全血(可获得的最大体积)收集到血清分离管中，使其在室温下凝固至少30分钟，在22℃±5℃下以9300g离心10分钟，随后提取血清。为临时收集血液，经由面静脉穿刺或断尾法收集约40-50μL的全血。使用从未处理动物收集的样品作为基线GLA水平以与研究动物相比较。

酶联免疫吸附检验(ELISA)分析

遵循关于人EPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD，R&D Systems，目录号Dep-00)所报导的程序，进行EPO蛋白质的定量。所用阳性对照物由超纯和组织培养级重组人促红细胞生成蛋白(R&D Systems，目录号分别是286-EP和287-TC)组成。在指定时间点取得血液样品并如以上所描述进行处理。在Molecular Device Flex Station仪器上，经由吸光度(450nm)监测检测过程。

为分析GLA蛋白质，遵循标准ELISA程序，采用绵羊抗ReplagalG-188IgG作为捕获抗体并且使用兔抗Replagal IgG作为二级(检测)抗体。使用辣根过氧化酶(HRP)偶联的山羊抗兔IgG来活化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液。20分钟之后，使用2N H₂SO₄中止反应。在Molecular Device Flex Station仪器上，经由吸光度(450nm)监测检测过程。未处理的小鼠血清和人蛋白分别用作阴性对照物和阳性对照物。

生物发光分析

生物发光检验是使用Promega荧光素酶检验系统(项目编号E1500)进行的。荧光素酶检验试剂是通过将10mL荧光素酶检验缓冲液添加到荧光素酶检验基质中并经由涡旋进行混合来制备。将20μL匀浆样品装载到96孔板上，随后将20μL板对照物添加到每一样品中。独立地将120μL荧光素酶检验试剂(如以上所描述制备)添加到96孔平底板的每个孔中。然后，使用Molecular Device Flex Station仪器将每个板插入适当腔室中，并以相对光度单位(RLU)测量发光度。

示例性结果

在HEK 293T细胞中测试经由4’-硫代修饰的FFL mRNA或未修饰FFL mRNA转染得到的FFL蛋白质产量。图2呈现了在转染后4小时、8小时、32小时、56小时及80小时取得的加权相对荧光单位(RLU)评分。在每一时间点，相较于用FFL或市售FFL转染的细胞，用25％的4’-硫代尿苷(25％的4’-S-U)或100％的4’-硫代尿苷(100％的4’-S-U)FFL mRNA转染的细胞具有较高的加权RLU评分。

还测试了4’-硫代修饰的FFL mRNA和未修饰的FFL mRNA随时间的稳定性。使三微克mRNA暴露于小鼠血清并监测一小时的时间。如图3中可见，相较于FFL和市售FFL mRNA，4’-硫代修饰的mRNA，特别是100％的4’-硫代尿苷(100％的4’-S-U)FFL mRNA看起来随时间更稳定。

在野生型小鼠中测试经由4’-硫代修饰的FFL mRNA或未修饰FFL mRNA转染得到的FFL蛋白质产量。静脉内施用1.0mg/kg剂量的载有C12-200的脂质纳米粒子，并处死动物，并且取出其肝用于分析，如以上所描述。图4呈现了在施用之后六小时取得的RLU评分/mg总蛋白质。相较于来自用未修饰mRNA处理的小鼠的肝，来自用25％的4’-硫代尿苷(25％的4’-S-U)和100％的4’-硫代尿苷(100％的4’-S-U)处理的小鼠的肝具有较高的RLU/mg评分。

另外，本文所描述的示例性结果证实，提供的包含4’-硫代修饰的核苷酸的mRNA可以成功地合成，具有较高稳定性，并且可以成功地用于在细胞中产生蛋白质。

实施例5.4’-硫代修饰的核苷酸的示例性合成

合成程序：

中间体的制备：

2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-1,4-内酯的合成

Carbohydrate Research 2008，1790-1800

在室温下，将D-核糖酸-1,4-内酯(270.0g，1.823mol)和硫酸(18.0g，0.182mol，0.1当量)于丙酮(2.79L)中的溶液搅拌3天。通过添加固体碳酸氢钠(约450g)来中止反应混合物，过滤并蒸发滤液。使残余物在乙酸乙酯与水之间分配。水层用乙酸乙酯萃取；合并的有机层经硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，得到呈白色固体状的希望产物(318.8g，93％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.83(d,J＝5.5Hz,1H),4.77(d,J＝5.5Hz,1H),4.64-4.62(m,1H),3.99(ddd,J＝2.3,5.5和12.4Hz,1H),3.81(ddd,J＝2.3,5.5和12.4Hz,1H),2.67(t,J＝5.5Hz,1H),1.46(s,3H),1.37(s,3H)。

5-O-甲烷磺酰基-2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-1,4-内酯的合成

Organic Process Research and Development 2006，487-492

在0℃下，将甲烷磺酰氯(116.0g，1.014mol，1.2当量)逐滴添加到2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-1,4-内酯(159.0g，0.845mol)和三乙胺(128.0g，1.267mol)于二氯甲烷(2.43L)中的溶液中。在室温下搅拌反应混合物1小时，然后用二氯甲烷稀释，并用水、饱和NaHCO₃水溶液和盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，得到呈橙色油状物的5-O-甲烷磺酰基-2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-1,4-内酯(231.0g，约100％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.82-4.77(m,3H),4.49-4.41(m,2H),3.04(s,3H),1.47(s,3H),1.38(s,3H)。

2,3-O-异亚丙基-L-来苏糖酸-1,4-内酯的合成

Organic Process Research and Development 2006，487-492

将溶于水(1.1L)中的氢氧化钾(137.0g，2.45mol)添加到5-O-甲烷磺酰基-2,3-O-异亚丙基-D-核糖酸-1,4-内酯(225.0g，0.85mol)中并在室温下搅拌18小时。反应混合物用2M HCl水溶液酸化到pH 3(使用pH计)，然后蒸发。残余物在丙酮中加热到回流并倾析丙酮(x3)。合并的萃取物经硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，得到呈浅黄色固体状的2,3-O-异亚丙基-L-来苏糖酸-1,4-内酯(115.4g，73％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.89-4.84(m,2H),4.63-4.59(m,1H),4.08-3.91(m,2H),1.46(s,3H),1.38(s,3H)。

5-O-叔丁基二甲基硅烷基-2,3-O-异亚丙基-L-来苏糖酸-1,4-内酯的合成

Carbohydrate Research 2008，1790-1800

向2,3-O-异亚丙基-L-来苏糖酸-1,4-内酯(5.0g，0.027mol)于二氯甲烷(85.0ml)中的溶液中添加咪唑(2.2g，32mmol)，随后添加叔丁基二甲基硅烷基氯(4.4g，29mmol，1.1当量)并在室温下搅拌反应混合物1.5小时。反应混合物用二氯甲烷稀释，用饱和NaHCO₃水溶液、盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，得到呈浅黄色油状物的5-O-叔丁基二甲基硅烷基-2,3-O-异亚丙基-L-来苏糖酸-1,4-内酯(7.3g，89％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ4.79(s,2H),4.54-4.49(m,1H),4.00-3.86(m,2H),1.45(s,3H),1.38(s,3H),0.89(s,9H),0.08(s,6H)。

5-O-叔丁基二甲基硅烷基-2,3-O-异亚丙基-L-来苏糖醇的合成

Carbohydrate Research 2008，1790-1800

在室温下，向5-O-叔丁基二甲基硅烷基-2,3-O-异亚丙基-L-来苏糖酸-1,4-内酯(7.2g，24mmol)于四氢呋喃(63ml)和甲醇(13ml)中的溶液中逐份添加硼氢化钠(1.4g，0.036mol，1.5当量)。反应混合物在室温下搅拌1小时，然后减压浓缩。使残余物在乙酸乙酯与1M柠檬酸水溶液之间分配。有机层用1M柠檬酸水溶液、盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩，得到呈无色油状物的5-O-叔丁基二甲基硅烷基-2,3-O-异亚丙基-L-来苏糖醇，静置后结晶(6.3g，86％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ4.26-4.20(m,2H),3.84-3.59(m,5H),1.51(s,3H),1.37(s,3H),0.89(s,9H),0.07(s,6H)。

5-O-叔丁基二甲基硅烷基-2,3-O-异亚丙基-1,4-二-O-甲烷磺酰基-L-来苏糖醇的合成

Carbohydrate Research 2008，1790-1800

在<10℃下，将甲烷磺酰氯(15.2ml，0.196mol，10当量)逐滴添加到吡啶(15.8ml，0.196mol，10当量)中。在<10℃下，逐滴添加5-O-叔丁基二甲基硅烷基-2,3-O-异亚丙基-L-来苏糖醇(6g，0.0196mol)于二氯甲烷(16ml)中的溶液。反应混合物在室温下搅拌2小时。通过添加冰来更换冷却浴并水解过量的甲烷磺酰氯。接着，将反应混合物倒入水(300mL)中并用Et₂O(3×50mL)萃取。合并的有机层用1M柠檬酸水溶液、饱和NaHCO₃水溶液及盐水洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤并减压浓缩。粗产物在硅胶上，利用1:6的乙酸乙酯/庚烷通过快速色谱法纯化，得到呈黄色油状物的5-O-叔丁基二甲基硅烷基-2,3-O-异亚丙基-1,4-二-O-甲烷磺酰基-L-来苏糖醇(8g，91％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ4.76-4.69(m,1H),4.46-4.34(m,4H),3.95(dd,J＝5.5和11.0Hz,1H),3.82(dd,J＝6.0和11.0Hz,1H),3.11(s,3H),3.07(s,3H),1.51(s,3H),1.37(s,3H),0.89(s,9H),0.09(s,6H)。

叔丁基(((3aS,4R,6aR)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)甲氧基)二甲基硅烷的合成

向5-O-叔丁基二甲基硅烷基-2,3-O-异亚丙基-1,4-二-O-甲烷磺酰基-L-来苏糖醇(25.1g，0.056mol)于二甲基甲酰胺(250ml)中的溶液中添加Na₂S.9H₂O(16.1g，0.067mol，1.2当量)并且在80℃下加热反应混合物3小时。将反应混合物冷却到室温，使其在水与乙酸乙酯之间分配。分离各层并且用乙酸乙酯萃取水层。干燥(MgSO₄)合并的有机层，过滤并减压浓缩。粗产物在硅胶上，利用乙酸乙酯/庚烷(10:1)通过快速色谱法纯化，得到叔丁基(((3aS,4R,6aR)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)甲氧基)-二甲基-硅烷(10.3g，60％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ4.89(dt,J＝1.4和4.6Hz,1H),4.79(d,J＝6.0Hz,1H),3.80(dd,J＝5.0和10.5Hz,1H),3.60(dd,J＝6.4和10.6Hz,1H),3.33(t,J＝5.0Hz,1H),3.16(dd,J＝5.0和12.4Hz,1H),2.85(dd,J＝0.9和12.8Hz,1H),1.52(s,3H),1.32(s,3H),0.89(s,9H),0.06(s,6H)。

(3aS,4R,5R,6aR)-4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯5-氧化物的合成

用硫酸镁干燥约70％间氯过苯甲酸(16g，66mmol)于二氯甲烷(150ml)中的溶液并过滤。在用二氯甲烷(50ml)洗涤之后，在–78℃下将合并的滤液逐滴添加到叔丁基(((3aS,4R,6aR)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)甲氧基)二甲基硅烷(20g，66mmol)于二氯甲烷(400ml)中的溶液中。在–78℃下搅拌1小时之后，用饱和碳酸氢钠溶液中止反应并用二氯甲烷稀释。分离各层并且有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。所得残余物通过快速色谱法(硅胶/二氯甲烷:乙醚(30:1))纯化，得到(3aS,4R,5S,6aR)-4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯5-氧化物(8.8g，42％)和(3aS,4R,5R,6aR)-4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯5-氧化物(7.3g，35％)。

核苷中间体的合成：

1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(羟甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮

1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮的合成

向尿嘧啶(1.40g，12.5mmol)于甲苯(62ml)中的悬浮液中添加三乙胺(3.5ml，2.53g，25mmol)和三甲基硅烷基三氟甲烷磺酸酯(9.01ml，11.1g，50mmol)。在室温下搅拌1小时之后，将二氯甲烷(34ml)添加到双相混合物中，得到一种溶液；然后，将其逐滴添加到(3aS,4R,5R,6aR)-4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯5-氧化物(2.0g，6.25mmol)于二氯甲烷(34ml)中的溶液中，然后添加三乙胺(3.5ml，25mmol)。在室温下搅拌90分钟之后，用冰中止反应，然后用乙酸乙酯稀释。分离各层并且有机层依序用饱和碳酸氢钠溶液(x2)和盐水洗涤。在经硫酸镁干燥之后，减压浓缩，得到粗产物，将其通过快速色谱法(硅胶，乙酸乙酯:二氯甲烷1:5)纯化，得到1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(1.55g，60％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ8.43(s,1H),7.96(d,J＝8.3Hz,1H),6.12(d,J＝2.3Hz,1H),5.74(dd,J＝1.9和7.8Hz,1H),4.71(m,2H),3.89(m,2H),3.74(m,1H),1.60(s,3H),1.32(s,3H),0.92(s,9H),0.11(s,3H),0.10(s,3H)。

1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(羟甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮的合成

在氩气下，于冰浴中冷却1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基-四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(3.70g，8.92mmol)于四氢呋喃(85ml)中的溶液；添加1M四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(10.7ml，10.7mmol)并且在室温下搅拌混合物2小时。通过过滤收集粗产物，用四氢呋喃洗涤并且通过快速色谱法(硅胶；甲醇:二氯甲烷1:30)纯化，得到1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(羟甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(2.30g，86％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ8.97(brs,1H),7.76(d,J＝8.3Hz,1H),5.93(s,1H),5.76(d,J＝8.3Hz),4.91(s,2H),3.96(dd,J＝4.6和11.0Hz,1H),3.89(dd,J＝4.6和11.0Hz,1H),3.79(t,J＝4.6Hz,1H),2.64(brs,1H),1.59(s,3H),1.33(s,3H)。

4-氨基-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(羟甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-甲基嘧啶-2(1H)-酮

使用与以下所述类似的程序，但用胞嘧啶代替胸腺嘧啶，可以合成4-氨基-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(羟甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)嘧啶-2(1H)-酮(13.1)。

1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮的合成

向胸腺嘧啶(2.60g，20.6mmol)于甲苯(112ml)中的悬浮液中添加三乙胺(4.17g，41.2mmol)和三甲基硅烷基三氟甲烷磺酸酯(18.3g，82.5mmol)。在室温下搅拌1小时之后，将二氯甲烷(34ml)添加到双相混合物中，得到一种溶液；然后将其逐滴添加到(3aS,4R,5R,6aR)-4-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯5-氧化物(3.30g，10.3mmol)于二氯甲烷(56ml)中的溶液中，然后添加三乙胺(4.17g，41.2mmol)。在室温下搅拌60分钟之后，用冰中止反应，然后用乙酸乙酯稀释。分离各层并且依序用饱和碳酸氢钠溶液(x2)和盐水洗涤有机层。经硫酸镁干燥之后，减压浓缩，得到粗产物，将其通过快速色谱法(硅胶，乙酸乙酯:庚烷0–50％)纯化，得到1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(2.9g，66％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ8.43(s,1H),7.46(d,J＝1.4Hz,1H),6.07(d,J＝32Hz,1H),5.72(m,2H),3.87(m,2H),3.71(m,1H),1.93(s,3H),1.59(s,3H),1.32(s,3H),0.92(s,9H),0.10(s,3H),0.09(s,3H)。

4-氨基-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-甲基嘧啶-2(1H)-酮的合成

在冰浴中将1,2,4-三唑(6.55g，94.8mmol)于乙腈(140ml)中的悬浮液冷却到0℃；逐滴添加磷酰氯(2.53ml，27.1mmol)，随后添加三乙胺(18.9ml，135mmol)。在0℃下搅拌混合物30分钟，然后逐滴添加1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-甲基嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(2.9g，6.77mmol)于乙腈(25ml)中的溶液。使反应物升温到室温并搅拌150分钟，然后使其在乙酸乙酯与饱和碳酸氢钠溶液之间分配。有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。在高压釜中，将所得残余物溶解于二噁烷(62ml)中；添加氢氧化铵(62ml)并且密封容器并在室温下搅拌过夜。使反应混合物在乙酸乙酯与水之间分配；有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥并减压浓缩。通过快速色谱法(硅胶；甲醇:乙酸乙酯1:10)纯化，得到氨基-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-甲基嘧啶-2(1H)-酮(2.60g，90％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ8.74(brs,2H),7.49(s,1H),6.00(d,J＝2.3Hz,1H),4.82(dd,J＝2.3和5.5Hz,1H),4.74(dd,J＝3.2和5.5Hz,1H),3.91(dd,J＝5.5和10.5Hz,1H),3.81(dd,J＝6.4和10.5Hz,1H),3.65(m,1H),1.91(s,3H),1.56(s,3H),1.27(s,3H),0.89(s,9H),0.07(s,3H),0.06(s,3H)。

4-氨基-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(羟甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-甲基嘧啶-2(1H)-酮的合成

在氩气下，于冰浴中冷却4-氨基-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-甲基嘧啶-2(1H)-酮(500mg，1.17mmol)于四氢呋喃(1.4ml)中的溶液；添加1M四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1.4ml，1.90mmol)并在室温下搅拌混合物2小时。通过过滤收集粗产物，用四氢呋喃洗涤并通过快速色谱法(硅胶；甲醇:乙酸乙酯1:10)纯化，得到4-氨基-1-((3aR,4R,6R,6aS)-6-(羟甲基)-2,2-二甲基四氢噻吩并[3,4-d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-甲基嘧啶-2(1H)-酮(436mg，定量产率)。¹H NMR(300MHz,DMSO)δ7.64(s,1H),7.38(brs,1H),6.85(brs,1H),5.97(d,J＝2.8Hz,1H),5.19(t,J＝5.5Hz,1H),4.88(dd,J＝2.8和5.35Hz,1H),4.80(dd,J＝3.2和5.9Hz,1H),3.67(m,1H),3.54(m,1H),3.47(td,J＝2.8和6.4Hz,1H),1.80(s,3H),1.43(s,3H),1.21(s,3H)。

核苷酸靶的合成：

通用方案

以上显示了核苷酸5’-磷酸酯的合成。使核苷A与亚磷酰胺试剂在盐酸咪唑/咪唑的存在下于二甲基甲酰胺中反应，随后用H₂O₂氧化磷，得到具有良好产率的B(通过硅胶柱色谱法纯化之后，产率典型地是60％到83％)。通过H₂O/二氯甲烷中用三氟乙酸处理来裂解保护基，得到单磷酸酯C，典型地为定量产率。最后，使用由Bogachev(Bogachev,V.S.，Synthesis of deoxynucleoside 5’-triphosphatesusing trifluoroacetic anhydride as activation reagent.Russ.J.Bioorg.Chem.,1996,22,599-604)开发的方法获得三磷酸酯D。

通用实验程序：

B的合成

在室温下，在氩气下向A(1当量)、盐酸咪唑(1.5当量)和咪唑(1当量)于二甲基甲酰胺(3ml/mmol A)中的溶液中逐滴添加二异丙基亚磷酰胺二叔丁基酯(1.5当量)。搅拌反应混合物，直到观察到起始物质完全消耗(LC-MS或TLC)(典型地是30–90分钟)。然后，在冰水浴中冷却反应混合物并用35％H₂O₂(2.6当量)逐滴处理。使反应混合物升温到室温并搅拌，直到观察到完全反应(LC-MS或TLC)；然后在冰水浴中对其进行冷却，并小心地用饱和硫代硫酸钠水溶液中止反应。用乙酸乙酯萃取产物；有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤并减压浓缩。通过硅胶柱色谱法，利用适当洗脱剂(一般是甲醇/二氯甲烷)纯化，得到B，产率典型地是60％到85％。

C的合成

在室温下，将B(1当量)于二氯甲烷(2ml/mmol B)、水(3ml/mmol B)及三氟乙酸(3ml/mmol B)中的混合物搅拌过夜。减压浓缩反应混合物(水浴<50℃)，得到C，典型地是定量产率。

D的合成

在氩气下，将冷却(冰水浴)的三氟乙酸酐(5当量)于乙腈(0.3ml/mmol三氟乙酸酐)中的溶液逐滴添加到冷却的C(1当量)于乙腈(4ml/mmol C)、三乙胺(1当量)及N,N-二甲基苯胺(4当量)中的悬浮液中。然后，使反应物升温到室温，在室温下搅拌30分钟，并在减压下去除挥发性物质。

将所得浆液溶解于乙腈(4ml/mmol C)中，在冰水浴中冷却并在氩气下添加1-甲基咪唑(3当量)和三乙胺(5当量)。搅拌反应混合物15分钟，然后使其升温到室温。

在氩气下，在室温下逐滴添加三(四丁基铵)焦磷酸盐(1.5当量)于乙腈(1ml/mmol焦磷酸盐)中的溶液，并且在室温下搅拌混合物45分钟。然后用去离子水(约10-15ml/mmol C)中止反应，并搅拌1小时。混合物用氯仿(3×10ml)洗涤，合并的有机层用去离子水(5ml)反萃取一次。将合并的水层直接装载到填有DEAE Sepharose fast flow的柱上，并用从0.01M到0.5M的三乙基碳酸氢铵缓冲液梯度洗脱。合并含产物的级分，并冷冻干燥。将所得核苷三磷酸酯的三乙胺盐溶解于去离子水中，然后使其经历Dowex 50W 8离子交换柱处理。合并显示出UV活性的级分并通过冷冻干燥去除水，得到呈钠盐形式的核苷5’-三磷酸酯。

三磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羟基四氢噻吩-2-基)甲酯钠盐

使用以上关于A转化成B所描述的方法，将10(935mg，3.11mmol)转化成14(1.25g，81％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ8.38(brs,1H),7.74(d,J＝8.3Hz,1H),6.05(s,1H),5.79(d,J＝8.3Hz),4.85(m,2H),4.19(m,2H),3.83(t,J＝5.0Hz,1H),1.54(s,3H),1.49(s,18H),1.31(s,3H)。

使用以上关于B转化成C所描述的方法，将14(1.25g，2.58mmol)转化成15(0.9g，定量产率)。¹HNMR(300MHz,D₂O)δ8.13(d,J＝7.8Hz,1H),5.81(d,J＝5.5Hz,1H),5.76(d,J＝8.3Hz,1H),4.24(dd,J＝4.1和6.0Hz,1H),4.11(t,J＝4.1Hz,1H),3.98(m,2H),3.43(m,1H)。

使用以上关于C转化成D所描述的方法，将15(200mg，0.59mmol)转化成4’-硫代-UTP(215mg，62％(如果是4Na+盐))。¹H NMR(300MHz,D₂O)δ8.14(d,J＝8.3Hz,1H),5.85(d,J＝6.4Hz,1H),5.81(d,J＝7.8Hz,1H),4.31(dd,J＝3.7和6.4Hz,1H),4.24(t,J＝3.7Hz,1H),4.12(m,1H),4.00(m,1H),3.44(m,1H)。³¹P NMR(300MHz,D₂O)δ-8.57(d),-10.91(d),-22.09(t)。HPLC/MS:RT 9.638min,m/z 501(M+H)⁺。

(三磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1(2H)-基)-3,4-二羟基四-氢噻吩-2-基)甲酯)钠盐

使用以上关于A转化成B所描述的方法，将13(400mg，1.28mmol)转化成16(910mg，65％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ8.19(brs,2H),7.45(s,1H),5.92(d,J＝2.1Hz,1H),4.98(dd,J＝1.8和6.0Hz,1H),4.95(dd,J＝2.3和5.5Hz,1H),4.24(m,2H),3.80(td,J＝1.8和6.0Hz,1H),1.99(s,3H),1.56(s,3H),1.49(s,9H),1.48(s,9H),1.29(s,3H)。

使用以上关于B转化成C所描述的方法，将16(480mg，0.977mmol)转化成17(350mg，定量产率)。¹HNMR(300MHz,D₂O)δ8.16(s,1H),5.80(d,J＝6.0Hz,1H),4.25(dd,J＝4.1和5.5Hz,1H),4.10(t,J＝4.6Hz,1H),4.00(m,2H),3.45(m,1H),1.92(s,3H)。³¹P NMR(300MHz,D₂O)δ0.41。

使用以上关于C转化成D所描述的方法，将15(300mg，0.849mmol)转化成4’-硫代-5-甲基CTP(136mg，28％(如果是4Na+盐))。¹HNMR(300MHz,D₂O)δ7.84(s,1H),5.85(d,J＝6.4Hz,1H),4.23(m,2H),4.09(m,1H),3.97(m,1H),3.40(m,1H),1.82(s,3H)。³¹P NMR(300MHz,D₂O)δ-8.96(d),-11.00(d),-22.28(t)。¹³C NMR(300MHz,D₂O)δ165.52(Cq),158.09(Cq),139.80(CH),105.40(Cq),77.26(CH),73.25(CH),66.06(CH),64.04(CH2),50.09(CH),12.33(CH3)。HPLC/MS:RT 10.280min,m/z 514(M+H)⁺。

使用与前述4’-硫代-5-甲基CTP的合成类似的程序，但用13.1代替13，可以制备出4’-硫代-CTP。

三磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢噻吩-2-基)甲酯钠盐

使用以上关于A转化成B所描述的方法，将19(504mg，1.81mmol)转化成20(444mg，52％)。¹HNMR(300MHz,CDCl₃)δ8.24(s,1H),8.19(brs,1H),7.71(brs,1H),7.09(s,1H),6.20(brs,2H),6.01(d,J＝5.0Hz,1H),4.76(m,1H),4.50(m,1H),4.23(m,2H),3.77(m,1H),1.48(s,18H)。

使用以上关于B转化成C所描述的方法，将20(430mg，0.904mmol)转化成21(330mg，定量产率)。¹HNMR(300MHz,D₂O)δ8.64(s,1H),8.26(s,1H),5.86(d,J＝5.5Hz,1H),4.54(m,1H),4.26(m,1H),4.06(m,2H),3.54(m,1H)。

使用以上关于C转化成D所描述的方法，将21(82mg，0.162mmol)转化成4’-硫代-ATP(35mg，26％(如果是4Na+盐))。¹HNMR(300MHz,D₂O)δ8.49(s,1H),8.03(s,1H),5.76(d,J＝5.6Hz,1H),4.54(dd,J＝3.7和5.6Hz,1H),4.35(t,J＝4.1Hz,1H),4.13(m,2H),3.54(dd,J＝4.1和8.7Hz,1H)。³¹P NMR(300MHz,D₂O)δ-9.07(d),-10.81(d),-22.15(t)。HPLC/MS:RT 10.467min,m/z 524(M+H)⁺。

5-((3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢噻吩-2-基)嘧啶2,4(1H,3H)二酮(4'-S-假尿苷)。这一化合物可以遵循以下方案，使用本领域技术人员已知的程序制备。

三磷酸((2R,3S,4R,5S)-5-(2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)-3,4-二羟基四氢噻吩-2-基)甲酯钠盐(4'-硫代-ψUTP)。这一化合物可以遵循以下方案，使用本领域技术人员已知的程序制备。

四氢三磷酸((2R,3S,4R,5R)-3,4-二羟基-5-(4-氧代-2-硫代-3,4-二氢嘧啶-1(2H)-基)四氢噻吩-2-基)甲酯(4'-S-2-S-UTP)。这一化合物可以遵循以下方案，使用本领域技术人员已知的程序制备。

四氢三磷酸((2R,3S,4R,5R)-5-(2-氨基-6-氧代-1H-嘌呤-9(6H)-基)-3,4-二羟基四氢噻吩-2-基)甲酯(4'-S-GTP)。这一化合物可以遵循以下方案，使用本领域技术人员已知的程序制备。

根据说明书内所引用的参考文献的教导将更彻底地理解本说明书。本说明书内的实施方案提供了有关本发明的实施方案的说明并且不应解释为限制本发明的范围。本领域技术人员易于认识到，本发明涵盖许多其它实施方案。本公开中引用的所有出版物和专利都通过引用整体并入。如果通过引用并入的材料与本说明书矛盾或不相符，则本说明书将代替任何此类材料。本文中引用任何参考文献并非承认这些参考文献是本发明的现有技术。

除非另作指示，否则用于在本说明书(包括权利要求书)中表达成分的量、反应条件等的所有数字都应理解为近似值并且可以取决于试图通过本发明获得的希望特性而变化。在最低限度上，并且不打算限制权利要求书范围的等效原则的应用，每一数字参数都应依据有效数位的数字和常用的舍入方法解释。本说明书中陈述的具有不同有效数位的量的数字系列不应解释为表明所给出的具有较小有效数位的数字与所给出的具有较高有效数位的数字具有相同的精度。

在权利要求书和/或说明书中，“一个(种)(a/an)”一词当结合术语“包含”使用时，意思指“一个(种)”，而且该词还符合“一个(种)或多个(种)”、“至少一个(种)”及“一个(种)或超过一个(种)”的含义。除非清楚地指示，否则在权利要求书中使用的术语“或”用于指“和/或”，意思指仅为任选其一的或这些替代选择是互斥的，不过本发明支持的定义是指仅为任选其一的及“和/或”。

除非另作指示，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每一要素。本领域的技术人员将认识到，或能够仅使用常规试验确定本文所描述的本发明的具体实施方案的许多等效内容。这些等效内容拟涵盖在所附权利要求书中。

除非另作定义，否则本文所使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。尽管可以使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料来实施或测试本发明，但现描述的是优选的方法和材料。

本文所论述的出版物只是提供其在本申请提交日期之前的公开内容。本文的任何内容都不应解释为承认本发明无权由于先前发明而先于这些出版物。另外，所提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，这可能需要独立地确认。

本领域技术人员通过考虑本文所公开的说明和实践，将易于了解本发明的其它实施方案。预期这些说明和实施例仅被视为示例性的，而本发明的真实范围和精神是由所附权利要求书所指示。

Claims (29)

1.一种具有编码区和任选地一个或多个非编码区的mRNA分子，其中所述mRNA包含至少一个并入了4’-硫代取代呋喃糖环的核苷酸残基。

2.如权利要求1所述的mRNA分子，其中至少1％的腺苷核苷酸残基并入了4’-硫代取代呋喃糖环。

3.如权利要求1或权利要求2所述的mRNA分子，其中至少1％的鸟苷残基并入了4’-硫代取代呋喃糖环。

4.如权利要求1到3中任一项所述的mRNA分子，其中至少1％的尿苷残基并入了4’-硫代取代呋喃糖环。

5.如权利要求1到4中任一项所述的mRNA分子，其中至少1％的胞苷残基并入了4’-硫代取代呋喃糖环。

6.如权利要求1到5中任一项所述的mRNA分子，其中少于10％的所述核苷酸残基并入了4’-硫代取代呋喃糖环。

7.如权利要求1到5中任一项所述的mRNA分子，其中至少50％的所述残基并入了4’-硫代取代呋喃糖环。

8.如权利要求1到5或7中任一项所述的mRNA分子，其中至少99％的所述核苷酸残基并入了4’-硫代取代呋喃糖环。

9.如权利要求1到8中任一项所述的mRNA分子，其中所述非编码区包含多聚腺苷酸尾，并且其中所述多聚腺苷酸尾包含4’-硫代-腺苷残基。

10.如权利要求9所述的mRNA分子，其中所述多聚腺苷酸尾的长度是至少约90个核苷酸残基。

11.如权利要求9或权利要求10所述的mRNA分子，其中所述多聚腺苷酸尾的长度是至少约500个核苷酸残基。

12.如权利要求1到11中任一项所述的mRNA分子，其中所述mRNA另外包含至少一个非标准核苷酸残基。

13.如权利要求12所述的mRNA分子，其中所述非标准核苷酸残基选自5-甲基-胞苷、假尿苷和2-硫代-尿苷中的一个或多个。

14.如权利要求13所述的mRNA分子，其中所述一个或多个非标准核苷残基另外被修饰成包括4’-硫代-呋喃糖。

15.如权利要求1到14中任一项所述的mRNA分子，其中所述分子包含至少200个核苷酸残基。

16.如权利要求1到15中任一项所述的mRNA分子，其中所述分子包含至少5000个核苷酸残基。

17.如权利要求1到16中任一项所述的mRNA分子，其中所述编码区编码治疗性蛋白质。

18.如权利要求17所述的mRNA分子，其中所述治疗性蛋白质选自促红细胞生成素、人生长激素、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、胰岛素、α-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、α-氨基葡糖苷乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、葡糖脑苷脂酶、乙酰肝素磺酰胺酶、透明质酸酶、半乳糖脑苷脂酶、鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTC)、氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、精氨基琥珀酸合成酶(ASS1)、精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)及精氨酸酶1(ARG1)、葡萄糖-6-磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸移位酶、糖原脱支酶、溶酶体α-葡糖苷酶、1,4-α-葡聚糖分支酶、糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、肝磷酸化酶、GLUT-2、UDP糖原合成酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、硫酸艾杜糖醛酸硫酸酯酶、硫酸乙酰肝素磺酰胺酶、α-N-乙酰葡萄糖酰胺酶、α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、载脂蛋白E、低密度脂蛋白受体(LDLR)、因子VIII、因子IX、脊髓运动神经元1(SMN1)、苯丙氨酸羟化酶、丙酰-CoA羧化酶、胆色素原脱氨酶、甲基丙二酰-CoA变位酶、尿酸氧化酶、C1酯酶抑制剂及酸性α-葡萄糖苷酶。

19.一种组合物，所述组合物包含至少一个如权利要求1到18中任一项所述的mRNA分子以及载体。

20.如权利要求19所述的组合物，其中所述载体包含脂质。

21.如权利要求20所述的组合物，其中所述mRNA被包封在脂质纳米粒子内。

22.如权利要求19到21中任一项所述的组合物，其中所述载体是包含一种或多种阳离子脂质的脂质纳米粒子，所述阳离子脂质选自：XTC(2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)、MC3((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)、ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺))、NC98-5(4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺)、DODAP(1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷)、HGT4003、ICE、HGT5000、顺式或反式HGT5001、DOTAP(1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷)、DOTMA(1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷)、DLinDMA、DLin-KC2-DMA及C12-200。

23.如权利要求21或权利要求22所述的组合物，其中所述脂质纳米粒子包含一种或多种辅助脂，所述辅助脂选自DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油))及胆固醇。

24.如权利要求21到23中任一项所述的组合物，其中所述脂质纳米粒子包含聚乙二醇化的脂质。

25.如权利要求21所述的组合物，其中所述脂质纳米粒子包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂，及聚乙二醇化的脂质。

26.如权利要求19所述的组合物，其中所述载体包含聚合物。

27.如权利要求26所述的组合物，其中所述聚合物是聚乙烯亚胺。

28.一种在体内产生蛋白质的方法，所述方法包括对受试者施用如权利要求1到18中任一项所述的mRNA或如权利要求19到27中任一项所述的组合物。

29.一种如权利要求1到18中任一项所述的mRNA分子的用途，所述mRNA分子用于制造能够在体内诱导治疗性蛋白质表达的药物。