CN109072223B - 多聚体编码核酸及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其提供了多聚体编码核酸，其显示出用于体内和体外使用的优异稳定性。在一些实施例中，多聚体编码核酸(MCNA)包含经由3'末端连接的两种或更多种编码多核苷酸，使得多聚体编码核酸化合物包含两个或更多个5'末端。

Description

多聚体编码核酸及其用途
相关申请
本专利申请要求于2016年4月8日提交的美国临时申请序列号62/320,073的优先权，所述美国临时申请的公开内容在此以引用的方式并入。
序列表
本说明书参考了序列表(于2017年4月7日电子提交的命名为“SL_SHR-1237WO”的.txt文件)。.txt文件于2017年4月7日生成，并且大小为49,249字节。序列表的全部内容以引用的方式并入本文。
背景技术
基于核酸的技术对于各种治疗应用越来越重要，所述治疗应用包括但不限于信使RNA治疗、基因治疗和基因编辑，仅举几例。此类治疗应用通常需要施用外源多核苷酸(例如DNA或RNA)，所述外源多核苷酸经常受到此类多核苷酸的有限稳定性阻碍。例如，在其施用于受试者后，多种多核苷酸可经受核酸酶(例如外切核酸酶和/或核酸内切酶)降解。核酸酶降解可负面影响多核苷酸到达靶细胞或被转录和/或翻译的能力，其结果是阻止外源多核苷酸发挥预期的疗效。
发明内容
本发明尤其提供了多聚体编码核酸，其显示出用于体内和体外使用的优异稳定性。本发明还允许基于核酸的治疗剂的复杂性和效率增加。
在一些方面，本发明提供了多聚体编码核酸(MCNA)，其包含经由两种或更多种多核苷酸(编码或非编码)之间的3'末端键与一种或多种非编码多核苷酸连接的一种或多种编码多核苷酸，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端。在一些实施例中，修饰5'末端中的一个或多个，以包括5’末端帽结构。在某些实施例中，具有5'末端的一种或多种编码多核苷酸包含5’末端帽结构，以促进编码多核苷酸的翻译。在某些实施例中，具有5'末端结构的一种或多种多核苷酸包含5’末端帽结构，以促进MCNA的稳定性。
在一些方面，本发明提供了多聚体编码核酸(MCNA)，其包含经由3'末端连接的两种或更多种编码多核苷酸，使得多聚体编码核酸化合物包含两个或更多个5'末端。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种是合成的多核糖核苷酸。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种是合成的多脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种是合成的多脱氧核糖核苷酸或多核糖核苷酸。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种编码目的蛋白质。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种编码相同的蛋白质。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种编码不同的蛋白质。
在一些实施例中，MCNA化合物包含三种或更多种编码多核苷酸。在一些实施例中，化合物包含四种或更多种编码多核苷酸。在一些实施例中，化合物包含五种或更多种编码多核苷酸。
在一些实施例中，编码多核苷酸中的一种或多种包含5'非翻译区(5’UTR)和/或3'非翻译区(3’UTR)。在一些实施例中，编码多核苷酸中的一种或多种包含3’UTR。在一些实施例中，3’UTR为长度5-2,000个核苷酸。在一些实施例中，3’UTR包含其间具有间隔物的多个多A区段。在一些实施例中，多A区段中的每一个包含8-50个连续的腺苷。在一些实施例中，多A区段的多个范围为1-100。在一些实施例中，间隔物具有范围为5-100的不同长度。在一些实施例中，间隔物包含DNA、RNA和/或经修饰的碱基。在一些实施例中，经修饰的碱基选自2’-OMe-A、2’-OMe-G、2’-OMe-C、2’-OMe-U、2’-F-A、2’-F-G、2’-F-C、2’-F-U、LNA-A、LNA-G、LNA-C、LNA-U、N6-甲基-腺苷、2-硫代尿苷(2sU)、5-甲基-胞苷(5mC)、假尿苷(ΨU)和1-甲基-假尿苷。在一些实施例中，3’UTR包含假结结构。在一些实施例中，3’UTR随后不含多聚腺苷酸化(多聚A)尾。在一些实施例中，编码多核苷酸中的一种或多种包含多聚A尾。在一些实施例中，多聚A尾为长度25-5,000个核苷酸。在一些实施例中，3’UTR结合多聚A结合蛋白(PABP)。在一些实施例中，3’UTR包含“吻合环”序列基序。
在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸的3'末端经由包含3'-3'反向磷酸二酯键的寡核苷酸桥连接。在一些实施例中，包含寡核苷酸桥的核苷酸选自2’-OMe-A、2’-OMe-G、2’-OMe-C、2’-OMe-U、2’-F-A、2’-F-G、2’-F-C、2’-F-U、LNA-A、LNA-G、LNA-C、LNA-U、N6-甲基-腺苷、2-硫代尿苷(2sU)、5-甲基-胞苷(5mC)、假尿苷(ΨU)和1-甲基-假尿苷。在一些实施例中，寡核苷酸桥包含与活性部分的至少一个共价连接。在一些实施例中，活性部分是靶向基团、肽、造影剂、小分子、蛋白质、DNA和/或RNA。在一些实施例中，接近3'-3'反向连接的核苷酸用一种或多种三触角GalNac靶向试剂功能化。
在一些实施例中，编码多核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷酸。在一些实施例中，经修饰的核苷酸选自2’-OMe-A、2’-OMe-G、2’-OMe-C、2’-OMe-U、2’-F-A、2’-F-G、2’-F-C、2’-F-U、LNA-A、LNA-G、LNA-C、LNA-U、N6-甲基-腺苷、2-硫代尿苷(2sU)、5-甲基-胞苷(5mC)、假尿苷(ΨU)和1-甲基-假尿苷。在一些实施例中，经修饰的核苷酸取代1-100％的相应天然碱基。在一些实施例中，至少25％的尿嘧啶被2-硫代尿苷替换。在一些实施例中，100％的胞苷被5-甲基胞苷替换。在一些实施例中，经修饰的核苷酸在核糖环上用4'-硫代取代进一步修饰。在一些实施例中，天然核苷酸在核糖环上用4'-硫代取代修饰。
在一些实施例中，MCNA中的编码多核苷酸中的一种或多种包含编码治疗性蛋白质的多核苷酸部分。在一些实施例中，MCNA中的编码多核苷酸中的一种或多种包含编码酶、受体、配体、抗体的轻链或重链、核酸酶或DNA结合蛋白的多核苷酸部分。在某些实施例中，MCNA中的编码多核苷酸中的一种或多种包含编码核酸酶的多核苷酸部分。
在一些实施例中，MCNA中的两种或更多种编码多核苷酸各自包含编码治疗性蛋白质的多核苷酸部分。在一些实施例中，MCNA中的两种或更多种编码多核苷酸各自包含编码酶、受体、配体、抗体的轻链或重链、核酸酶和/或DNA结合蛋白的多核苷酸部分。在一些实施例中，MCNA中的两种或更多种编码多核苷酸各自包含编码核酸酶的多核苷酸部分。
在一些实施例中，MCNA中的第一编码多核苷酸包含编码第一蛋白质的多核苷酸部分，并且MCNA中的第二编码多核苷酸包含编码与第一蛋白质相同的第二蛋白质的多核苷酸部分。在一些实施例中，MCNA中的第一编码多核苷酸包含编码第一蛋白质的多核苷酸部分，并且MCNA中的第二编码多核苷酸包含编码与第一蛋白质不同的第二蛋白质的多核苷酸部分。在某些实施例中，MCNA中的第一编码多核苷酸包含编码第一蛋白质的多核苷酸部分，所述第一蛋白质在酶、受体、配体、抗体的轻链或重链、核酸酶或DNA-结合蛋白的类别中，并且MCNA中的第二编码多核苷酸包含编码第二蛋白质的多核苷酸部分，所述第二蛋白质不同于第一蛋白质，但在与第一蛋白质相同的类别中。在某些实施例中，MCNA中的第一编码多核苷酸包含编码第一蛋白质的多核苷酸部分，所述第一蛋白质在酶、受体、配体、抗体的轻链或重链、核酸酶或DNA-结合蛋白的类别中，并且MCNA中的第二编码多核苷酸包含编码第二蛋白质的多核苷酸部分，所述第二蛋白质不同于第一蛋白质，且在与第一蛋白质不同的类别中。在某些实施例中，MCNA中的第一编码多核苷酸包含编码抗体的轻链的多核苷酸部分，并且MCNA中的第二编码多核苷酸包含编码抗体中的重链的多核苷酸部分。
在一些方面，本发明提供了多聚体核酸(MNA)，其包含经由两种或更多种多核苷酸之间的至少一个3'末端键连接的两种或更多种多核苷酸，使得MNA化合物包含两个或更多个5'末端。在一些实施例中，修饰5'末端中的一个或多个，以促进MNA的稳定性。在某些实施例中，经由至少一个3'末端键连接的两种或更多种多核苷酸各自是非编码核苷酸。
在一些方面，本发明提供了包含如上所述的MCNA的组合物，所述MCNA用递送媒介物包封或与递送媒介物复合。在一些实施例中，递送媒介物选自脂质体、脂质纳米颗粒、固体-脂质纳米颗粒、聚合物、病毒、溶胶-凝胶和纳米凝胶。
在一些方面，本发明提供了递送MCNA用于体内蛋白质生产的方法，其包括将如上所述的MCNA施用于需要递送的受试者。在一些实施例中，MCNA经由选自以下的递送途径施用：静脉内递送、皮下递送、经口递送、皮下递送、眼部递送、气管内注射肺部递送(例如雾化)、肌内递送、鞘内递送、或关节内递送。
应理解，如上所述的所有实施例都适用于本发明的所有方面。
附图说明
附图仅用于说明性目的，而不是限制。
图1显示了示例性MCNA，其包含经由3'-3'反向RNA核苷酸二聚体连接的两个RNA种类。
图2显示了示例性MCNA，其包含经由3'-3'反向RNA核苷酸二聚体连接的两个RNA种类，其中所述MCNA用三触角GalNac靶向试剂功能化。
图3显示了示例性MCNA，其包含经由3'-3'反向RNA核苷酸二聚体连接的两个RNA种类，其中所述MCNA用两种三触角GalNac靶向试剂功能化。
图4显示了用于MCNA合成的一般方案。
图5显示了经由凝胶电泳检测的合成EPO MCNA的示例性结果。在下述条件下合成构建体：RNA连接酶1(A)；RNA连接酶1+10％PEG(B)；和RNA连接酶2(C)。
图6显示了经由凝胶电泳检测的合成EPO MCNA的示例性结果。泳道1显示了不含尾的加帽的EPO RNA。泳道2显示了不含DNA酶处理的EPO MCNA混合物。泳道3显示了用DNA酶处理的EPO MCNA混合物。
图7显示了用包含无尾的EPO mRNA或包含hEPO mRNA的MCNA(每个构建体1微克)的合成构建体转染HEK293T细胞后，分泌的hEPO蛋白水平的示例性图。
图8显示了经由凝胶电泳检测的合成EPO MCNA的示例性结果。泳道1含有RNA梯，泳道2含有关于未纯化的EPO MCNA的连接产物，泳道3含有纯化的未反应/部分反应的产物，并且泳道4含有纯化的EPO MCNA连接产物。
图9显示了用包含无尾的EPO mRNA或包含hEPO mRNA的纯化MCNA(每个构建体250纳克)的合成构建体转染HEK293T细胞后，分泌的hEPO蛋白水平的示例性图。
图10显示了用包含无尾的hOTC mRNA(hOTC单体)或包含hOTC mRNA的MCNA的合成构建体转染HEK293T细胞后，在细胞裂解产物中测量的hOTC蛋白活性水平的示例性图。
图11显示了用包含无尾的hPAH mRNA(hPAH单体)或包含hPAH mRNA的MCNA的合成构建体转染HEK293T细胞后，产生的hPAH蛋白水平的示例性图。
图12显示了示例性蛋白质印迹，证实在用包含无尾的hCFTR mRNA(hCFTR单体)或包含hCFTR mRNA的MCNA的合成构建体转染HEK293T细胞后的hCFTR蛋白产生。
图13显示了用包封在脂质纳米颗粒中的hOTC MCNA处理后，在小鼠肝脏中测量的瓜氨酸产生的示例性图。
图14显示了示例性蛋白质印迹，证实在用包封在脂质纳米颗粒中的hOTC MCNA或hOTC单体处理后，在小鼠肝脏中检测到的hOTC产生。
图15显示了用包封在脂质纳米颗粒中的hOTC mRNA处理后，在小鼠肝脏中测量的瓜氨酸产生的示例性图。
图16显示了作为用包封在脂质纳米颗粒中的hOTC mRNA或hOTC MCNA处理的小鼠中施用后24小时的瓜氨酸产生百分比，比较施用后1周的瓜氨酸产生的示例性图。
图17显示了在它们施用包封在脂质纳米颗粒中的hPAH MCNA或hPAH单体后24小时，在PAH敲除(KO)小鼠的肝脏中检测到的hPAH蛋白的示例性图。
图18显示了在它们施用包封在脂质纳米颗粒中的hPAH MCNA或hPAH单体后24小时，在PAH敲除(KO)小鼠中的血清苯丙氨酸水平的示例性图。
图19显示了在它们施用包封在脂质纳米颗粒中的hEPO MCNA或hEPO单体后24小时，在野生型小鼠的血清中检测到的hEPO蛋白的示例性图。
图20显示了经由雾化用包封在脂质纳米颗粒中的hCFTR MCNA处理后24小时和7天，CFTR KO小鼠肺中的人囊性纤维化跨膜传导调节因子(hCFTR)蛋白的示例性免疫组织化学检测。
定义
为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。下述术语和其它术语的另外定义在说明书各处阐述。本文引用的出版物和其它参考材料描述本发明的背景且提供关于其实践的其它细节，在此以引用的方式并入。
氨基酸：如本文使用的，术语“氨基酸”，在其最广泛的意义上，指可掺入多肽链内的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有一般结构H2N–C(H)(R)–COOH。在一些实施例中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”指天然存在的肽中常见的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”指除标准氨基酸外的任何氨基酸，无论它是合成制备的还是从天然源获得的。如本文使用的，“合成氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或取代。氨基酸，包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，可通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或用其它化学基团的取代来修饰，所述其它化学基团可改变肽的循环半衰期，而不会不利地影响其活性。氨基酸可参与二硫键。氨基酸可包括一个或翻译后修饰，例如与一个或多个化学实体(例如，甲基、乙酸基、乙酰基、磷酸基、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸基、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)结合。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并且可指肽的游离氨基酸和/或氨基酸残基。从其中使用该术语的上下文中显而易见它是指游离氨基酸还是肽的残基。
动物：如本文使用的，术语“动物”指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”指处于任何发育阶段的人。在一些实施例中，“动物”指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施例中，非人动物是哺乳动物(例如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可以为转基因动物、基因改造的动物和/或克隆。
大约或约：如本文使用的，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”指落入所述值任一方向(大于或小于)中的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的一系列值，除非另有说明或从上下文中另外显而易见的(除非该数字超过可能值的100％)。
生物活性的：如本文使用的，术语“生物活性”指在生物系统中，且特别是在生物中具有活性的任何试剂的特征。例如，当施用于生物时，对该生物体具有生物效应的试剂视为生物活性的。
递送：如本文使用的，术语“递送”涵盖局部递送和全身递送两者。例如，MCNA的递送涵盖其中将MCNA递送至靶组织并且编码的蛋白质在靶组织内表达且保留的情况(也称为“局部分布”或“局部递送”)，以及其中将MCNA递送至靶组织并且编码的蛋白质表达且分泌到患者的循环系统(例如血清)内，并且全身分布且被其它组织吸收的情况(也称为“全身分布”或“全身递送”)。
表达：如本文使用的，核酸序列的“表达”指MCNA翻译成多肽，将多个多肽组装成完整蛋白质(例如酶)和/或多肽或完全组装的蛋白质(例如酶)的翻译后修饰。在本专利申请中，术语“表达”和“产生”以及语法等价物可互换使用。
功能性：如本文使用的，“功能性”生物分子是以其中它显示出通过其表征的性质和/或活性的形式的生物分子。
半衰期：如本文使用的，术语“半衰期”指数量例如核酸或蛋白质浓度或活性降至如在时间段开始时测量的其值的一半所需的时间。
改善、增加或减少：如本文使用的，术语“改善”、“增加”或“减少”或语法等价物指示相对于基线测量的值，所述基线测量例如在本文所述的治疗开始之前相同个体中的测量，或在不存在本文所述的治疗的情况下在对照受试者(或多个对照受试者)中的测量。“对照受试者”是患有与正在接受治疗的受试者相同形式的疾病的受试者，其与正在接受治疗的受试者大约相同的年龄。
体外：如本文使用的，术语“体外”指在人造环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养等中，而不是在多细胞生物体内发生的事件。
体内：如本文使用的，术语“体内”指在多细胞生物内，例如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的背景下，该术语可用于指在活细胞内(与例如体外系统相反)发生的事件。
分离的：如本文使用的，术语“分离的”指(1)在最初生产时(无论在自然界中和/或在实验环境中)，已与它结合的至少一些组分分开，和/或(2)通过人为产生、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可与它们最初结合的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的其他组分分开。在一些实施例中，分离的试剂是约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯的。如本文使用的，如果物质基本上不含其它组分，则它是“纯的”。如本文使用的，分离的物质和/或实体的纯度百分比的计算不应包括赋形剂(例如缓冲液、溶剂、水等)。
信使RNA(mRNA)：如本文使用的，术语“信使RNA(mRNA)”或“mRNA”指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文使用的，mRNA涵盖经修饰的RNA和未修饰的RNA两者。mRNA可含有一个或多个编码和非编码区。mRNA可从天然源纯化，使用重组表达系统产生且任选地纯化，化学合成等。适当时，例如，在化学合成的分子的情况下，mRNA可包含核苷类似物，例如具有化学修饰的碱基或糖、主链修饰等的类似物。除非另有说明，否则mRNA序列以5'至3'方向呈现。典型的mRNA分子具有5'末端和3'末端。在一些实施例中，mRNA是或包含天然核苷(例如腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物学修饰的碱基(例如甲基化碱基)；插入碱基；经修饰的糖(例如2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基(例如硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺键)。
核酸：如本文使用的，术语“核酸”在其最广泛的意义上，指掺入或可掺入多核苷酸链内的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是经由磷酸二酯键掺入或可掺入多核苷酸链内的化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”指个别核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施例中，“核酸”指包含个别核酸残基的多核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。
患者：如本文使用的，术语“患者”或“受试者”指所提供的组合物可施用于其的任何生物，例如用于实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的。典型的患者包括动物(例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在一些实施例中，患者是人。人包括出生前和出生后形式。
药学可接受的：如本文使用的，术语“药学可接受的”指这样的物质，在合理的医学判断范围内，所述物质适用于与人类和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应、或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
药学可接受的盐：药学可接受的盐是本领域众所周知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences(1977)66:1-19中详细描述了药学可接受的盐。本发明化合物的药学可接受的盐包括源自合适的无机和有机酸和碱的那些盐。药学可接受的、无毒的酸加成盐的例子是与无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或者有机酸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸，或者通过使用本领域中使用的其它方法如离子交换形成的氨基的盐。其它药学可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等等。源自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4盐。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等等。进一步的药学可接受的盐包括(适当时)无毒铵盐、季铵盐和使用抗衡离子形成的胺阳离子，例如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、磺酸盐和芳基磺酸盐。进一步的药学可接受的盐包括使用适当的亲电子试剂(例如卤代烷)的胺季铵化形成的盐，以形成季铵化的烷基化氨基盐。
全身分布或递送：如本文使用的，术语“全身分布”、“全身递送”或语法等价物指影响整个身体或整个生物的递送或分布机制或方法。通常，全身分布或递送经由身体的循环系统例如血流来完成。与“局部分布或递送”的定义相比。
受试者：如本文使用的，术语“受试者”指人或任何非人动物(例如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施例中，受试者是人类。受试者可以为患者，其指提供给医疗提供者用于疾病的诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可患有或易患疾病或病症，但可表现出或可不表现出疾病或病症的症状。
基本上：如本文使用的，术语“基本上”指显示出目的特征或性质的总体或接近总体程度或范围的定性条件。生物领域的普通技术人员应理解，生物学现象和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行至完成或达到或避免绝对结果。术语“基本上”因此在本文中用于捕获许多生物学现象和化学现象固有的潜在缺乏的完整性。
靶组织：如本文使用的，术语“靶组织”指受待治疗疾病影响的任何组织。在一些实施例中，靶组织包括展示疾病相关病理学、症状或特征的那些组织。
治疗有效量：如本文使用的，术语治疗剂的“治疗有效量”意指当施用于患有或易患疾病、病症和/或状况的受试者时，足以治疗、诊断、预防和/或延迟疾病、病症和/或状况的症状发作的量。本领域普通技术人员应了解，治疗有效量通常经由包含至少一个单位剂量的给药方案施用。
治疗：如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”指用于部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、预防、延迟以下的发作、减少以下的严重性和/或减少以下的发生率：特定疾病、病症和/或状况的一种或多种症状或特征。治疗可施用于未表现出疾病征兆和/或仅表现出疾病早期征兆的受试者，用于降低与疾病相关病理发展的风险。
具体实施方式
本发明尤其提供了包含多聚体编码核酸(MCNA)的合成方法和组合物。特别地，本发明提供了MCNA化合物及其合成方法，所述MCNA化合物包含经由其3'末端连接的两种或更多种编码多核苷酸的，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种是合成的多核糖核苷酸。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种是合成的多脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，本发明的合成多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸编码多肽、蛋白质、酶、抗体或受体。在一些实施例中，本发明提供了多聚体核酸(MNA)，其包含经由两种或更多种多核苷酸之间的至少一个3'末端键连接的两种或更多种多核苷酸，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端。在一些实施例中，修饰5'末端中的一个或多个，以促进MNA的稳定性。在某些实施例中，经由至少一个3'末端键连接的两种或更多种多核苷酸各自是非编码核苷酸。在一些实施例中，MNA包含不编码多肽、蛋白质、酶、抗体或受体的合成多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，包含合成多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸的MNA抑制基因表达。在一些实施例中，抑制基因表达的本发明的合成多核糖核苷酸是小干扰核糖核酸(siRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)。
虽然外源多核苷酸(例如DNA或RNA)的施用代表了用于疾病治疗的有意义的进步，但此类外源多核苷酸的施用经常受到此类多核苷酸的有限稳定性的阻碍，特别是在其体内施用后。例如，在其施用于受试者后，多种多核苷酸可经受核酸酶(例如外切核酸酶和/或核酸内切酶)降解。核酸酶降解可负面影响多核苷酸到达靶细胞或被转录和/或翻译的能力，其结果是阻止外源多核苷酸发挥预期的疗效。
在一些实施例中，与不通过其3'末端与另一种多核苷酸连接的单个多核苷酸(下文中称为“单体多核苷酸”)相比，本发明的MCNA显示出增加的体内稳定性。在一些实施例中，与编码相同蛋白质的单体多核苷酸相比，当在体内递送时，本发明的MCNA导致增强的蛋白质产生。在一些实施例中，与相应的单体多核苷酸相比，当递送至受试者时，本发明的MCNA被受试者更好地耐受。
多聚体编码核酸(MCNA)
在一些实施例中，本发明提供了包含多聚体编码核酸(MCNA)的组合物及其合成方法。特别地，本发明提供了MCNA化合物及其合成方法，所述MCNA化合物包含经由其3'末端连接的两种或更多种编码多核苷酸的，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种是合成的多核糖核苷酸。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种是合成的多脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种是合成的多脱氧核糖核苷酸或多核糖核苷酸。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种编码目的蛋白质。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种编码相同的蛋白质。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸中的每一种编码不同的蛋白质。在一些实施例中，编码不同蛋白质的两种或更多种编码多核苷酸中的每一种以相等数目存在。在一些实施例中，编码不同蛋白质的两种或更多种编码多核苷酸中的每一种以不等数目存在(例如，编码目的蛋白质#1的多核苷酸的2个拷贝和编码目的蛋白质#2的多核苷酸1个拷贝)。在一些实施例中，MCNA化合物包含三种或更多种编码多核苷酸。在一些实施例中，MCNA化合物包含四种或更多种编码多核苷酸。在一些实施例中，MCNA化合物包含五种或更多种编码多核苷酸。
在一些实施例中，本发明提供了多聚体核酸(MNA)，其包含经由两种或更多种多核苷酸之间的至少一个3'末端键连接的两种或更多种多核苷酸，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端。在一些实施例中，修饰5'末端中的一个或多个，以促进MNA的稳定性。在某些实施例中，经由至少一个3'末端键连接的两种或更多种多核苷酸中的至少一种是编码多核苷酸，并且经由至少一个3'末端键连接的两种或更多种多核苷酸中的至少一种是非编码多核苷酸，从而构成多聚体编码核酸(MCNA)。在某些实施例中，编码多核苷酸编码目的蛋白质，并且非编码多核苷酸抑制基因表达(例如，小干扰核糖核酸(siRNA)、微RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)。
在一些实施例中，包含两种或更多种编码多核苷酸的MCNA化合物编码抗体或抗体片段的一条或多条链。在一些实施例中，两种或更多种编码多核苷酸编码抗体的重链和轻链。在一些实施例中，抗体是完整的免疫球蛋白、(Fab)2、(Fab′)2、Fab、Fab′或scFv。在一些实施例中，抗体是IgG。在一些实施例中，抗体选自抗CCL2、抗赖氨酰氧化酶样-2(LOXL2)、抗Flt-1、抗TNF-α、抗白细胞介素-2Rα受体(CD25)、抗TGFβ、抗B细胞活化因子、抗α-4整合蛋白、抗BAGE、抗β-连环蛋白/m、抗Bcr-abl、抗CS、抗CA125、抗CAMEL、抗CAP-1、抗CASP-8、抗CD4、抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD25、抗CDC27/m、抗CD 30、抗CD33、抗CD52、抗CD56、抗CD80、抗CDK4/m、抗CEA、抗CT、抗CTL4、抗Cyp-B、抗DAM、抗EGFR、抗ErbB3、抗ELF2M、抗-EMMPRIN、抗EpCam、抗ETV6-AML1、抗HER2、抗G250、抗GAGE、抗GnT-V、抗Gp100、抗HAGE、抗HER-2/neu、抗HLA-A*0201-R170I、抗IGF-1R、抗IL-2R、抗IL-S、抗MC1R、抗肌球蛋白/m、抗-MUC1、抗-MUM-1、-2、-3、抗蛋白酶-3、抗p190次要bcr-abl、抗Pml/RARα、抗PRAMS、抗PSA、抗PSM、抗PSMA、抗RAGE、抗RANKL、抗RU1或RU2、抗SAGE、抗SART-1或抗SART-3、抗存活素、抗TEL/AML1、抗TPI/m、抗TRP-1、抗TRP-2、抗TRP-2/INT2和抗VEGF或抗VEGF受体。
在一些实施例中，包含两种或更多种编码多核苷酸的MCNA化合物编码一种或多种核酸酶。在一些实施例中，一种或多种核酸酶中的每一种选自Cas9、锌指核酸酶(ZFN)、TALEN、归巢核酸内切酶、归巢大范围核酸酶及其组合。示例性核酸酶包括Afu尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、Tma核酸内切酶III、Tth核酸内切酶IV、南极不耐热UDG、APE 1、Cas9核酸酶NLS(酿脓链球菌(S.pyogenes))、Cas9核酸酶(酿脓链球菌)、DNA酶I、核酸内切酶IV、核酸内切酶V、核酸内切酶VIII、核酸外切酶I、核酸外切酶III(大肠杆菌(E.coli、核酸外切酶T、核酸外切酶V(RecBCD)、核酸外切酶VII、核酸外切酶VIII(截短的)、Fpg、hAAG、hOGG1、hSMUG1、λ核酸外切酶、微球菌核酸酶、绿豆核酸酶、核酸酶BAL-31、RecAf、RecJf、T4PDG(T4核酸内切酶V)、T5核酸外切酶、T7核酸内切酶I、T7核酸外切酶、热稳定FEN1、尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)。示例性的归巢核酸酶包括I-AabMI、I-AniI、I-CeuI、I-CkaMI、I-CpaMI、I-CreI、I-DmoI、I-GpeMI、I-GpiI、I-GzeI、I-GzeII、I-HjeMI、I-LtrI、I-LtrWI、I-MpeMI、I-MsoI、I-OnuI、I-PanMI、I-SceI、I-SmaMI、I-Vdi141I、PI-SceI、I-CreI(m)、I-MsoI(m)、I-OnuI(E2)、I-AniI/I-OnuI、I-DmoI/I-CreI、I-GpiI/I-OnuI、I-GzeI/I-PanMI、I-LtrI/I-PanMI、I-OnuI/I-LtrI、I-AaeMIP、I-ApaMIP、I-GzeMIIIP.I-NcrMIP、I-OsoMIIP、I-OsoMIP、I-PanMIIIP、I-PanMIIP、I-ScuMIIIP、I-ScuMIIP、I-ScuMIP和I-ScuMIVP。
在一些实施例中，MCNA化合物包含两种或更多种多核苷酸，其包括一种、两种或更多种编码多核苷酸，其中每种编码多核苷酸包含多核苷酸部分，其是基因和/或选自表1、表2、表3、表4、表5或表6的蛋白质的mRNA转录物。
表1
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表2
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表3
Figure BDA0001815864400000212
Figure BDA0001815864400000221
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表4
Figure BDA0001815864400000382
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表5
Figure BDA0001815864400000432
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表6-分泌蛋白
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在一组实施例中，MCNA化合物包含两种编码多核苷酸。例如，MCNA化合物可为具有两种编码多核苷酸的回文编码核酸(PCNA)，所述编码多核苷酸各自具有编码相同蛋白质的多核苷酸部分。
在一些实施例中，MCNA化合物包含编码囊性纤维化跨膜传导调节因子(hCFTR)mRNA的编码多核苷酸，其经由多核苷酸之间的3'末端键与非编码多核苷酸连接。在一些实施例中，MCNA化合物包含经由多核苷酸之间的3'末端键连接的两种或更多种编码多核苷酸，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端，其中编码多核苷酸中的至少一种编码hCFTR。在一些实施例中，MCNA化合物是回文编码核酸(PCNA)，其包含经由多核苷酸之间的3'末端键连接的两种编码多核苷酸，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端，其中每种编码多核苷酸编码hCFTR。在一些实施例中，MCNA化合物包含经由多核苷酸之间的3'末端键连接的两种或更多种多核苷酸，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端，其中至少一种多核苷酸是编码hCFTR的编码多核苷酸，并且至少一种多核苷酸充当保护基团。
在一些实施例中，MCNA化合物包含编码人苯丙氨酸羟化酶(hPAH)mRNA的编码多核苷酸，其经由多核苷酸之间的3’末端键与非编码多核苷酸连接。在一些实施例中，MCNA化合物包含经由多核苷酸之间的3'末端键连接的两种或更多种编码多核苷酸，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端，其中编码多核苷酸中的至少一种编码hPAH。在一些实施例中，MCNA化合物是回文编码核酸(PCNA)，其包含经由多核苷酸之间的3'末端键连接的两种编码多核苷酸，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端，其中每种编码多核苷酸编码hPAH。在一些实施例中，MCNA化合物包含经由多核苷酸之间的3'末端键连接的两种或更多种多核苷酸，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端，其中至少一种多核苷酸是编码hPAH的编码多核苷酸，并且至少一种多核苷酸充当保护基团。
在一些实施例中，MCNA化合物包含编码人鸟氨酸转氨甲酰酶(hOTC)mRNA的编码多核苷酸，其经由多核苷酸之间的3’末端键与非编码多核苷酸连接。在一些实施例中，MCNA化合物包含经由多核苷酸之间的3'末端键连接的两种或更多种编码多核苷酸，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端，其中编码多核苷酸中的至少一种编码hOTC。在一些实施例中，MCNA化合物是回文编码核酸(PCNA)，其包含经由多核苷酸之间的3'末端键连接的两种编码多核苷酸，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端，其中每种多核苷酸编码hOTC。在一些实施例中，MCNA化合物包含经由多核苷酸之间的3'末端键连接的两种或更多种多核苷酸，使得所述MCNA化合物包含两个或更多个5'末端，其中至少一种多核苷酸是编码hOTC的编码多核苷酸，并且至少一种多核苷酸充当保护基团。
桥(w/3'-3'键)
在一些实施例中，MCNA化合物包含两种或更多种多核苷酸，其中每种多核苷酸的3'末端经由包含3'-3'反向磷酸二酯键的寡核苷酸桥(也称为“桥接寡核苷酸(bridgingoligonucleotide)”或“桥接寡核苷酸(bridging olio)”)连接。在一些实施例中，寡核苷酸桥包含经修饰的核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸桥包含2'-O-甲基RNA。在一些实施例中，寡核苷酸桥包含DNA。在一些实施例中，寡核苷酸桥为长度2至1000个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸桥包含通过共价连接与桥结合的一个或多个活性部分。在一些实施例中，活性部分是靶向基团、肽、造影剂、小分子、蛋白质、DNA和/或RNA。在一些实施例中，活性部分结合细胞表面受体的受体配体。在一些实施例中，活性部分是一种或多种三触角GalNac靶向试剂。
MCNA合成
在一些实施例中，本发明提供了合成MCNA的方法。在一些实施例中，MCNA的合成包括连接两种或更多种多核苷酸，使得每种多核苷酸的3'末端连接至寡核苷酸桥的5'末端，其中所述寡核苷酸桥包含两个5'末端和内部3'-3'反向磷酸二酯键。在一些实施例中，合成MCNA的方法包括使用与两种或更多种多核苷酸的区域互补的寡核苷酸夹板，使得连接酶可将每种多核苷酸连接至寡核苷酸桥的5'末端。在一些实施例中，寡核苷酸夹板与两种或更多种多核苷酸的区域互补，使得连接酶将每种多核苷酸的完美末端连接至寡核苷酸桥的5'末端。在一些实施例中，寡核苷酸夹板与两种或更多种多核苷酸的区域互补，使得连接酶将每种多核苷酸的3'末端连接至寡核苷酸桥的5'末端。在一些实施例中，寡核苷酸夹板包含DNA。在一些实施例中，连接酶是RNA连接酶。在一些实施例中，连接酶是T4RNA连接酶1。在一些实施例中，连接酶是T4RNA连接酶2。
在一些实施例中，当合成MCNA时，多核苷酸/寡核苷酸桥接/寡核苷酸夹板的摩尔比为2:1:2。在一些实施例中，当合成MCNA时，多核苷酸/寡核苷酸桥的摩尔比为2:1。在一些实施例中，当合成MCNA时，多核苷酸/寡核苷酸夹板的摩尔比为2:2。在一些实施例中，MCNA的合成还包含PEG。
在一些实施例中，可通过将RNA的两个拷贝的3'末端夹板连接到单个寡核苷酸的5'末端来制备MCNA，所述单个寡核苷酸在序列内含有两个5'末端和连接的3'-3'磷酸二酯键。简言之，使用T7RNA聚合酶转录含有侧接RNA编码序列的5'非翻译区(UTR)和3’UTR的5’加帽的RNA，酶促加帽以含有5’帽1结构且纯化。然后使用(A)T4RNA连接酶1、(B)T4RNA连接酶1+PEG 8K、或(C)T4RNA连接酶2以及与3’UTR和桥接寡核苷酸互补的DNA寡核苷酸“夹板”，将该转录物一步连接到含有20个核苷酸(nt)回文序列的“桥”寡核苷酸，其中在第10个和第11个nt之间具有3'-3'磷酸二酯键。为了制备用于连接的样品，桥接寡核苷酸在含有50μM寡核苷酸、ATP、1x PNK缓冲液和T4多核苷酸激酶的反应中在37℃下5'末端磷酸化1小时。然后使用Sephadex G-25脱盐柱，将磷酸化的桥接寡核苷酸脱盐，并且通过加热至75℃共5分钟，随后经过5分钟逐渐冷却至室温，在含有加帽的RNA转录物、1x桥接寡核苷酸和2x夹板寡核苷酸的反应中，与转录物和夹板杂交。随后制备RNA连接反应，以包含50％稀释的杂交反应和(A)1X RNA连接酶缓冲液、ATP和T4RNA连接酶1(NEB)，(B)1x RNA连接酶缓冲液、ATP、10％PEG和T4RNA连接酶1(NEB)，或(C)1X T4RNA连接酶2缓冲液和T4RNA连接酶2(NEB)。各自在37℃下反应90分钟。然后使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化完成的连接反应。随后用DNA酶I处理纯化的MCNA产物，以去除残留的桥寡核苷酸。
在一些实施例中，MCNA可通过RNA的两个拷贝的3'末端与单个寡核苷酸的5'末端的夹板不依赖性连接来制备，所述单个寡核苷酸在序列内含有两个5'末端和连接的3'-3'磷酸二酯键。
非翻译区
通常，mRNA合成包括在5'末端上添加“帽”和在3'末端上添加“尾”。帽的存在对于提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性是重要的。“尾”的存在作用于保护mRNA免于核酸外切酶降解。
在一些实施例中，MCNA的一种或多种多核苷酸包括5'和/或3'非翻译区。在一些实施例中，5'非翻译区(5’UTR)包括影响mRNA的稳定性或翻译的一种或多种元件，例如铁应答元件。在一些实施例中，5'非翻译区可为长度约50至500个核苷酸。
在一些实施例中，3'非翻译区(3’UTR)包括多腺苷酸化信号、影响MCNA在细胞中的定位稳定性的蛋白质的结合位点、或miRNA的一个或多个结合位点中的一种或多种。在一些实施例中，3'非翻译区可为长度50至500个核苷酸或更长。在一些实施例中，3'非翻译区可为长度5至2,000个核苷酸。
示例性的3'和/或5’UTR序列可源自稳定的核酸分子(例如，珠蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)，以增加感觉MCNA分子的稳定性。例如，5’UTR序列可包括CMV立即早期1(IE1)基因的部分序列或其片段，以改善核酸酶抗性和/或改善多核苷酸的半衰期。还考虑了将编码人生长激素(hGH)或其片段的序列包括在多核苷酸(例如MCNA)的3'末端或非翻译区，以进一步稳定多核苷酸。一般地，这些修饰相对于其未修饰的对应物改善了多核苷酸的稳定性和/或药代动力学性质(例如，半衰期)，并且包括例如为改善此类多核苷酸对体内核酸酶消化的抗性而进行的修饰。
3’UTR
在一些实施例中，3’UTR包含其间具有间隔物的多个多A区段。在一些实施例中，间隔物包含DNA、RNA和/或经修饰的碱基。在一些实施例中，多A区段中的每一个包含8-50个连续的腺苷。在一些实施例中，多个A-A段在数目中范围为1-100。在一些实施例中，间隔物具有范围为5-100的不同长度。在一些实施例中，3’UTR包含假结结构。假结可定义为最低限度由通过单链区或环连接的两个螺旋区段组成的RNA结构(Staple,D.W.等人，PLoS Biology,2005,3,e213)。它们占优势地通过二级结构例如发夹或茎环和远侧单链区域形成。在一些实施例中，3’UTR包含“吻合环”序列基序。广义地限定，吻合环可描述为当一个RNA分子的茎/发夹环中的未配对核苷酸与分开RNA分子的第二茎/发夹环的未配对核苷酸碱基配对时形成的结构。在一些实施例中，3’UTR随后不含多聚腺苷酸化(多聚A)尾。在一些实施例中，3’UTR结合多聚A结合蛋白(PABP)。
在一些实施例中，MCNA包括3'多聚(A)尾结构。在一些实施例中，多聚A尾为长度25-5,000个核苷酸。MCNA的3'末端上的多聚A尾通常包含约10至300个腺苷核苷酸(例如，约10至200个腺苷核苷酸、约10至150个腺苷核苷酸、约10至100个腺苷核苷酸、约20至70个腺苷核苷酸、或约20至60个腺苷核苷酸)。在一些实施例中，mRNA包括3'多聚(C)尾结构。MCNA的3'末端上合适的多聚C尾通常包括约10至200个胞嘧啶核苷酸(例如，约10至150个胞嘧啶核苷酸、约10至100个胞嘧啶核苷酸、约20至70个胞嘧啶核苷酸、约20至60个胞嘧啶核苷酸、或约10至40个胞嘧啶核苷酸)。多聚C尾可加入多聚A尾中或可取代多聚A尾。
通常，“尾”的存在作用于保护MCNA免于核酸外切酶降解。多聚A尾视为稳定自然信使和合成感知MCNA。因此，在某些实施例中，可将长多聚A尾加入MCNA分子中，因此致使MCNA更稳定。多聚A尾可使用各种领域公认的技术添加。例如，可使用多聚A聚合酶将长多聚A尾加入合成或体外转录的RNA中(Yokoe等人Nature Biotechnology.1996；14:1252-1256)。转录载体也可编码长多聚A尾。另外，多聚A尾可通过直接从PCR产物转录而加入。多聚A也可用RNA连接酶连接到有义RNA的3'末端(参见例如，Molecular Cloning A LaboratoryManual，第2版，由Sambrook、Fritsch和Maniatis编辑(Cold Spring Harbor LaboratoryPress：1991版))。
在一些实施例中，MCNA的一种或多种多核苷酸包括3'多聚(A)尾结构。通常，多聚A尾的长度可为至少约10、50、100、200、300、400、至少500个核苷酸。在一些实施例中，MCNA的3'末端上的多聚A尾通常包括约10至300个腺苷核苷酸(例如，约10至200个腺苷核苷酸、约10至150个腺苷核苷酸、约10至100个腺苷核苷酸、约20至70个腺苷核苷酸、或约20至60个腺苷核苷酸)。在一些实施例中，MCNA包括3'多聚C尾结构。MCNA的3'末端上合适的多聚C尾通常包括约10至200个胞嘧啶核苷酸(例如，约10至150个胞嘧啶核苷酸、约10至100个胞嘧啶核苷酸、约20至70个胞嘧啶核苷酸、约20至60个胞嘧啶核苷酸、或约10至40个胞嘧啶核苷酸)。多聚C尾可加入多聚A尾中或可取代多聚A尾。
在一些实施例中，调节多聚A或多聚C尾的长度，以控制本发明的经修饰的有义MCNA分子的稳定性，并且因此控制由MCNA的编码多核苷酸中的一种或多种编码的蛋白质的转录。例如，因为多聚A尾的长度可影响有义MCNA分子的半衰期，所以可调节多聚A尾的长度，以修饰MCNA对核酸酶的抗性水平，且从而控制靶细胞中的多核苷酸表达和/或多肽产生的时间过程。
5’UTR
在一些实施例中，MCNA包括5'帽结构。5'帽通常如下添加：首先，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸中去除一个末端磷酸基，留下两个末端磷酸盐；然后经由鸟苷酸转移酶将鸟苷三磷酸(GTP)加入末端磷酸盐中，产生5'5'5三磷酸键；然后通过甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的例子包括但不限于m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。
天然存在的帽结构包含7-甲基鸟苷，其经由三磷酸桥连接至第一转录核苷酸的5'末端，导致m7G(5')ppp(5')N的二核苷酸帽，其中N是任何核苷。在体内，帽是酶促添加的。将帽加入核中且由酶鸟苷酰转移酶催化。帽对RNA的5'末端的添加在转录起始后立即发生。末端核苷通常是鸟苷，并且与所有其它核苷酸相反定向，即G(5')ppp(5')GpNpNp。
通过体外转录产生的MCNA的一个帽是m7G(5')ppp(5')G，其已用作在体外使用T7或SP6RNA聚合酶的转录中的二核苷酸帽，以获得在其5’末端中具有帽结构的MCNA。用于体外合成加帽的MCNA的方法采用预形成的二核苷酸形式m7G(5')ppp(5')G(“m7GpppG”)作为转录起始子。
迄今为止，在体外翻译实验中使用的通常形式的合成二核苷酸帽是抗反向帽类似物(“ARCA”)或经修饰的ARCA，其一般是经修饰的帽类似物，其中2'或3”OH基团被替换为-OCH3。
另外的帽类似物包括但不限于选自以下的化学结构：m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化的帽类似物(例如，GpppG)；二甲基化的帽类似物(例如，m2,7GpppG)、三甲基化的帽类似物(例如，m2,2,7GpppG)、二甲基化的对称帽类似物(例如，m7Gpppm7G)、或抗反向帽类似物(例如，ARCA；m7,2'OmeGpppG、m72'dGpppG、m7,3'OmeGpppG、m7,3'dGpppG及其四磷酸盐衍生物)(参见例如，Jemielity,J.等人，“Novel‘anti-reverse’cap analogs with superiortranslational properties”,RNA,9:1108-1122(2003))。
在一些实施例中，合适的帽是7-甲基鸟苷酸(“m7G”)，其经由三磷酸桥连接至第一转录核苷酸的5'末端，导致m7G(5')ppp(5')N，其中N是任何核苷。在本发明的实施例中利用的m7G帽的优选实施例是m7G(5')ppp(5')G。
在一些实施例中，帽是帽0结构。帽0结构缺少与碱基1和2连接的核糖的2'-O-甲基残基。在一些实施例中，帽是帽1结构。帽1结构在碱基2处具有2'-O-甲基残基。在一些实施例中，帽是帽2结构。帽2结构具有与碱基2和3两者附着的2'-O-甲基残基。
本领域已知各种m7G帽类似物，其中许多是商购可得的。这些包括上述m7GpppG，以及ARCA 3'-OCH3和2'-OCH3帽类似物(Jemielity,J.等人，RNA,9:1108-1122(2003))。用于本发明的实施例中的另外帽类似物包括N7-苄化的二核苷四磷酸类似物(在Grudzien,E.等人，RNA,10:1479-1487(2004)中描述)、硫代磷酸酯帽类似物(在Grudzien-Nogalska,E.等人，RNA,13:1745-1755(2007)中描述)、以及以引用的方式并入本文的美国专利号8,093,367和8,304,529中描述的帽类似物(包括生物素化的帽类似物)。
核苷酸修饰
在一些实施例中，根据本发明的MCNA可合成为未修饰或经修饰的核酸。通常，修饰核酸以增强稳定性。MCNA的修饰可包括例如MCNA的核苷酸的修饰。因此，根据本发明的经修饰的MCNA可包括例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施例中，MCNA可由天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)合成，包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))，以及作为嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物，例如2’-OMe-A、2’-OMe-G、2’-OMe-C、2’-OMe-U、2’-F-A、2’-F-G、2’-F-C、2’-F-U、LNA-A、LNA-G、LNA-C、LNA-U、N6-甲基-腺苷、2-硫代尿苷(2sU)、5-甲基-胞苷(5mC)、假尿苷(ΨU)和1-甲基-假尿苷、1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、Q核苷、β-D-甘露糖基-Q核苷、wybutoxosine和氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。这些类似物的制备是本领域技术人员已知的，例如根据美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和5,700,642，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入。
在一些实施例中，本发明的MCNA包含编码多核苷酸，其包含一个或多个经修饰的核苷酸。在一些实施例中，一个或多个经修饰的核苷酸选自2’-OMe-A、2’-OMe-G、2’-OMe-C、2’-OMe-U、2’-F-A、2’-F-G、2’-F-C、2’-F-U、LNA-A、LNA-G、LNA-C、LNA-U、N6-甲基-腺苷、2-硫代尿苷(2sU)、5-甲基-胞苷(5mC)、假尿苷(ΨU)和1-甲基-假尿苷。在一些实施例中，经修饰的核苷酸取代1-100％的相应天然碱基。在一些实施例中，至少25％的尿嘧啶被2-硫代尿苷替换。在一些实施例中，100％的胞苷被5-甲基胞苷替换。在一些实施例中，经修饰的核苷酸在核糖环上用4'-硫代取代进一步修饰。在一些实施例中，天然核苷酸在核糖环上用4'-硫代取代修饰。
在一些实施例中，MCNA可含有核酸主链修饰。通常，主链修饰是其中包含在MCNA中的核苷酸主链的磷酸酯进行化学修饰的修饰。示例性的主链修饰通常包括但不限于来自甲基膦酸酯、甲基氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(例如胞苷5'-O-(1-硫代磷酸酯))、硼烷磷酸酯、带正电荷的胍基团等的修饰，其意指通过其它阴离子、阳离子或中性基团替换磷酸二酯键。
在一些实施例中，MCNA可含有糖修饰。典型的糖修饰是其包含的核苷酸的糖的化学修饰，包括但不限于选自以下的糖修饰：2'-脱氧-2'-氟-寡核糖核苷酸(2'-氟-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氟-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-脱氧-2'-脱胺-寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-O-烷基寡核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-C-烷基寡核糖核苷酸(2'-O-甲基胞苷5'-三磷酸、2'-甲基尿苷5'-三磷酸)、2'-C-烷基寡核糖核苷酸及其异构体(2'-阿糖胞苷5'-三磷酸、2'-阿糖尿苷5'-三磷酸)或叠氮三磷酸(2'-叠氮基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-叠氮基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)。
在一些实施例中，MCNA可含有核苷酸碱基的修饰(碱基修饰)。含有碱基修饰的经修饰的核苷酸也称为碱基修饰的核苷酸。此类碱基修饰的核苷酸的例子包括但不限于2-氨基-6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、2-氨基腺苷5'-三磷酸、2-硫代胞苷5'-三磷酸、2-硫代尿苷5'-三磷酸、4-硫代尿苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基胞苷5'-三磷酸、5-氨基烯丙基尿苷5'-三磷酸、5-溴胞苷5'-三磷酸、5-溴尿苷5'-三磷酸、5-碘胞苷5'-三磷酸、5-碘尿苷5'-三磷酸、5-甲基胞苷5'-三磷酸、5-甲基尿苷5'-三磷酸、6-氮杂胞苷5'-三磷酸、6-氮杂尿苷5'-三磷酸、6-氯嘌呤核苷5'-三磷酸、7-脱氮腺苷5'-三磷酸、7-脱氮鸟苷5'-三磷酸、8-氮杂腺苷5'-三磷酸、8-叠氮基腺苷5'-三磷酸、苯并咪唑核苷5'-三磷酸、N1-甲基腺苷5'-三磷酸、N1-甲基鸟苷5'-三磷酸、N6-甲基腺苷5'-三磷酸、O6-甲基鸟苷5'-三磷酸、假尿苷5'-三磷酸、嘌呤霉素5'-三磷酸或黄苷5'-三磷酸。在一些实施例中，MCNA包含选自以下的经修饰的碱基：2’-OMe-A、2’-OMe-G、2’-OMe-C、2’-OMe-U、2’-F-A、2’-F-G、2’-F-C、2’-F-U、LNA-A、LNA-G、LNA-C、LNA-U、N6-甲基-腺苷、2-硫代尿苷(2sU)、5-甲基-胞苷(5mC)、假尿苷(ΨU)和1-甲基-假尿苷。
递送媒介物
根据本发明，如本文所述的MCNA可作为裸露多核苷酸或经由递送媒介物递送。如本文使用的，术语“递送媒介物”、“转移媒介物”、“纳米颗粒”或语法等价物可互换使用。
在一些实施例中，MCNA可经由单一递送媒介物递送。在一些实施例中，MCNA可经由各自具有不同组成的一种或多种递送媒介物递送。根据各种实施例，合适的递送媒介物包括但不限于基于聚合物的载体，例如聚乙烯亚胺(PEI)、脂质纳米颗粒和脂质体、纳米脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体、蛋白脂质体、天然和合成衍生的外来体两者、天然的、合成和半合成板层体、纳米颗粒、磷酸钙-硅酸盐纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、纳米晶颗粒、半导体纳米颗粒、聚(D-精氨酸)、溶胶-凝胶、纳米树枝状聚合物、淀粉基递送系统、胶束、乳液、类脂质体(noisome)、多结构域嵌段聚合物(乙烯基聚合物、聚丙基丙烯酸聚合物、动态聚缀合物)、干粉制剂、质粒、病毒、磷酸钙核苷酸、适体、肽和其它载体标签。
脂质体递送媒介物
在一些实施例中，合适的递送媒介物是脂质体递送媒介物，例如脂质纳米颗粒。如本文使用的，脂质体递送媒介物，例如脂质纳米颗粒，通常表征为微观囊泡，其具有通过一个或多个双层膜与外部介质隔离的内部水性空间。脂质体的双层膜通常由两亲分子形成，所述两亲分子例如合成或天然源的脂质，其包含空间上分离的亲水和疏水结构域(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可由两亲聚合物和表面活性剂(例如，聚合物囊泡(polymerosome)、类脂质体等)形成。在本发明的上下文中，脂质体递送媒介物通常作用于将所需MCNA转运至靶细胞或组织。
阳离子脂质
在一些实施例中，脂质体可包含一种或多种阳离子脂质。如本文使用的，短语“阳离子脂质”指许多脂质物质中的任一种，其在选择的pH(例如生理pH)下具有净正电荷。在文献中已描述了几种阳离子脂质，其中许多是商购可得的。用于本发明的组合物和方法中的特别合适的阳离子脂质包括国际专利公开WO 2010/053572(且特别是，在段落[00225]处描述的CI 2-200)和WO 2012/170930中描述的那些，所述两个专利均以引用的方式并入本文。在某些实施例中，本发明的组合物和方法采用脂质纳米颗粒，其包含于2012年3月29日提交的美国临时专利申请61/617,468(以引用的方式并入本文)中描述的可电离的阳离子脂质，例如(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-1-胺(HGT5001)和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)。
在一些实施例中，提供的脂质体包括WO2013/063468和美国临时申请中描述的阳离子脂质，所述专利与本专利申请在同一天同时提交，名称为“Lipid Formulations forDelivery of Messenger RNA”，所述两个专利均以引用的方式并入本文。
在一些实施例中，阳离子脂质包含式I-c1-a的化合物：
Figure BDA0001815864400001111
或其药学可接受的盐，其中：
每个R2独立地为氢或C1-3烷基；
每个q独立地为2至6；
每个R'独立地为氢或C1-3烷基；
并且每个RL独立地为C8-12烷基。
在一些实施例中，每个R2独立地为氢、甲基或乙基。在一些实施例中，每个R2独立地为氢或甲基。在一些实施例中，每个R2为氢。
在一些实施例中，每个q独立地为3至6。在一些实施例中，每个q独立地为3至5。在一些实施例中，每个q为4。
在一些实施例中，每个R'独立地为氢、甲基或乙基。在一些实施例中，每个R'独立地为氢或甲基。在一些实施例中，每个R'独立地为氢。
在一些实施例中，每个RL独立地为C8-12烷基。在一些实施例中，每个RL独立地为n-C8-12烷基。在一些实施例中，每个RL独立地为C9-11烷基。在一些实施例中，每个RL独立地为n-C9-11烷基。在一些实施例中，每个RL独立地为C10烷基。在一些实施例中，每个RL独立地为n-C10烷基。
在一些实施例中，每个R2独立地为氢或甲基；每个q独立地为3至5；每个R'独立地为氢或甲基；并且每个RL独立地为C8-12烷基。
在一些实施例中，每个R2为氢；每个q独立地为3至5；每个R'为氢；并且每个RL独立地为C8-12烷基。
在一些实施例中，每个R2为氢；每个q为4；每个R'为氢；并且每个RL独立地为C8-12烷基。
在一些实施例中，阳离子脂质包含式I-g的化合物：
Figure BDA0001815864400001121
或其药学可接受的盐，其中每个RL独立地为C8-12烷基。在一些实施例中，每个RL独立地为n-C8-12烷基。在一些实施例中，每个RL独立地为C9-11烷基。在一些实施例中，每个RL独立地为n-C9-11烷基。在一些实施例中，每个RL独立地为C10烷基。在一些实施例中，每个RL是n-C10烷基。
在特定实施例中，提供的脂质体包括阳离子脂质cKK-E12、或(3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮)。cKK-E12的结构显示于下文：
Figure BDA0001815864400001122
另外的示例性阳离子脂质包括式I的那些：
Figure BDA0001815864400001131
及其药学可接受的盐，
其中，
R是
Figure BDA0001815864400001132
(“OF-00”)，
R是
Figure BDA0001815864400001133
(“OF-01”)，
R是
Figure BDA0001815864400001134
(“OF-02”)，或
R是
Figure BDA0001815864400001135
(“OF-03”)
(参见例如，Fenton,Owen S.等人"Bioinspired Alkenyl Amino AlcoholIonizable Lipid Materials for Highly Potent In Vivo mRNA Delivery."Advancedmaterials(2016))。
在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质可为N-[l-(2,3-二油氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵或“DOTMA”(Feigner等人(Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355)。DOTMA可单独配制，或者可与中性脂质、二油酰磷脂酰乙醇胺或“DOPE”或其它阳离子或非阳离子脂质组合到脂质体转移媒介物或脂质纳米颗粒内，并且此类脂质体可用于增强核酸进入靶细胞内的递送。其它合适的阳离子脂质包括例如5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺或“DOGS”、2,3-二油氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙胺(propanaminium)或“DOSPA”(Behr等人，Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)；美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)、l,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷或“DODAP”、l,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷或“DOTAP”。
另外的示例性阳离子脂质还包括1,2-二硬脂氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DSDMA”、1,2-二油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DODMA”、1,2-二亚油氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLinDMA”、1,2-二亚油烯氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或“DLenDMA”、N-二油基-N,N-二甲基氯化铵或“DODAC”、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵或“DDAB”、N-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵或“DMRIE”、3-二甲氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧丁-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷或“CLinDMA”、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基]-3-二甲基l-l-(顺式,顺式-9',l-2'-十八碳二烯氧基)丙烷或“CpLinDMA”、N,N-二甲基-3,4-二油氧基苄胺或“DMOBA”、1,2-N,N'-二油酰基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DOcarbDAP”、2,3-二亚油酰氧基-N,N-二甲基丙胺或“DLinDAP”、l,2-N,N'-二亚油基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLincarbDAP”、l,2-二亚油酰基氨基甲酰基-3-二甲基氨基丙烷或“DLinCDAP”、2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基甲基-[l,3]-二氧戊环或“DLin--DMA”、2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环或"DLin-K-XTC2-DMA"、以及2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,l 2-二烯-1-基)-1,3-二氧戊环-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLin-KC2-DMA))(参见，WO2010/042877；Semple等人，NatureBiotech.28:172-176(2010))、或其混合物。(Heyes,J.等人，J Controlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,DV.等人，Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；PCT公开WO2005/121348A1)。在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍鎓部分中的至少一种。
在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质可选自XTC(2,2-二亚油酰基-4-二甲基氨基乙基-1-[1,3]-二氧戊环)、MC3(((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯)、ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊二烯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺))、NC98-5(4,7,13-三(3-氧代-3)-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺)、DODAP(1,2-二油基-3-二甲基铵丙烷)、HGT4003(WO2012/170889，其教导以引用的方式整体并入本文)、ICE(WO2011/068810，其教导以引用的方式整体并入本文)、HGT5000(美国临时专利申请号61/617,468，其教导以引用的方式整体并入本文)或HGT5001(顺式或反式)(临时专利申请号61/617,468)、氨基醇类脂质如WO2010/053572中公开的那些、DOTAP(1,2-二油基-3-三甲基铵丙烷)、DOTMA(1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷)、DLinDMA(eyes,J.；Palmer,L.；Bremner,K.；MacLachlan,I.“Cationic lipid saturationinfluences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids”J.Contr.Rel.2005,107,276-287)、DLin-KC2-DMA(Semple,S.C.等人“Rational Design ofCationic Lipids for siRNA Delivery”Nature Biotech.2010,28,172-176)、C12-200(Love,K.T.等人“Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing”PNAS2010,107,1864-1869)。
在一些实施例中，脂质体中阳离子脂质的百分比可大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％或大于70％。在一些实施例中，阳离子脂质构成按重量计约30-50％(例如，约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％、或约35-40％的脂质体。在一些实施例中，阳离子脂质(例如，cKK-E12)构成按摩尔比计约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的脂质体。
非阳离子/辅助脂质
在一些实施例中，提供的脂质体含有一种或多种非阳离子(“辅助”)脂质。如本文使用的，短语“非阳离子脂质”指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文使用的，短语“阴离子脂质”指在选择的pH，例如生理pH下携带净负电荷的许多脂质物质中的任一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、或其混合物。
在一些实施例中，此类非阳离子脂质可单独使用，但优选与其它赋形剂例如阳离子脂质组合使用。在一些实施例中，非阳离子脂质可包含脂质体中存在的总脂质的约5％至约90％、或约10％至约70％的摩尔比。在一些实施例中，非阳离子脂质是中性脂质，即在其下配制和/或施用组合物的条件下不携带净电荷的脂质。在一些实施例中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可大于5％、大于10％、大于20％、大于30％或大于40％。
基于胆固醇的脂质
在一些实施例中，提供的脂质体包含一种或多种基于胆固醇的脂质。例如，合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括例如DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)、l,4-双(3-N-油基氨基-丙基)哌嗪(Gao等人Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人BioTechniques 23,139(1997)；美国专利号5,744,335)或ICE。在一些实施例中，基于胆固醇的脂质可包含脂质体中存在的总脂质的约2％至约30％、或约5％至约20％的摩尔比。在一些实施例中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可大于5％、10％、大于20％、大于30％或大于40％。
PEG化脂质
在一些实施例中，提供的脂质体包含一种或多种PEG化脂质。例如，聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生的脂质，例如衍生的神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-l-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8PEG-2000神经酰胺)的使用也由本发明考虑与一种或多种阳离子组合，并且在一些实施例中，连同包含脂质体的其它脂质一起。考虑的PEG-修饰的脂质包括但不限于长度高达5kDa的聚乙二醇链，其与具有C6-C20长度的烷基链的脂质共价附着。在一些实施例中，PEG修饰的或PEG化的脂质是PEG化的胆固醇或PEG-2K。此类组分的添加可防止复杂的聚集，并且还可提供用于增加循环寿命和增加脂质-核酸组合物对靶细胞的递送的手段(Klibanov等人(1990)FEBS Letters,268(1):235-237)，或者它们可选择为在体内快速更换制剂(参见美国专利号5,885,613)。
在一些实施例中，特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。本发明的PEG修饰的磷脂和衍生的脂质可包含脂质体中存在的总脂质的约0％至约15％、约0.5％至约15％、约1％至约15％、约4％至约10％、或约2％的摩尔比。
根据各种实施例，包含脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或PEG修饰的脂质的选择，以及这些脂质与彼此的相对摩尔比基于所选择的脂质的特征、预期靶细胞的性质、待递送的MCNA的特征。另外的考虑包括例如烷基链的饱和度，以及所选择的脂质的大小、电荷、pH、pKa、融合性和毒性。因此，可相应地调节摩尔比。
脂质体的形成
用于本发明的组合物中的脂质体转移媒介物可通过本领域目前已知的各种技术制备。用于所提供的组合物中的脂质体可通过本领域目前已知的各种技术制备。例如，多层囊泡(MLV)可根据常规技术制备，例如通过将脂质溶解在合适的溶剂中，将所选择的脂质沉积在合适的器皿或容器的内壁上，然后蒸发溶剂以在容器的内部上留下薄膜或喷雾干燥。然后可用涡旋运动将水相加入容器中，这导致MLV的形成。然后可通过多层囊泡的均质化、超声处理或挤出来形成单层囊泡(ULV)。另外，可通过去污剂去除技术形成单层囊泡。
在某些实施例中，提供的组合物包含脂质体，其中MCNA在脂质体的两个表面上结合且包封在相同脂质体内。例如，在本发明的组合物的制备过程中，阳离子脂质体可通过静电相互作用与MCNA结合。例如，在本发明的组合物的制备过程中，阳离子脂质体可通过静电相互作用与MCNA结合。
在一些实施例中，本发明的组合物和方法包含包封在脂质体中的MCNA。在一些实施例中，一种或多种MCNA物质可包封在相同的脂质体中。在一些实施例中，一种或多种MCNA物质可包封在不同的脂质体中。在一些实施例中，MCNA包封在一种或多种脂质体中，所述脂质体在其脂质组成、脂质组分的摩尔比、大小、电荷(ζ电位)、靶向配体和/或其组合方面不同。在一些实施例中，一种或多种脂质体可具有不同组成的阳离子脂质、中性脂质、PEG修饰的脂质和/或其组合。在一些实施例中，一种或多种脂质体可具有不同摩尔比的用于产生脂质体的阳离子脂质、中性脂质、胆固醇和PEG修饰的脂质。
将所需MCNA掺入脂质体内的过程经常称为“加载”。示例性方法在Lasic等人，FEBSLett.,312:255-258,1992中描述，所述参考文献以引用的方式并入本文。掺入脂质体的核酸可完全或部分地位于脂质体的内部空间中、脂质体的双层膜内、或者与脂质体膜的外表面结合。将核酸掺入脂质体内在本文中也称为“包封”，其中核酸完全包含在脂质体的内部空间内。将MCNA掺入转移媒介物(例如脂质体)内的目的经常是保护核酸免于环境，所述环境可能含有降解核酸的酶或化学物质和/或促使核酸快速排泄的系统或受体。相应地，在一些实施例中，合适的递送媒介物能够增强其中包含的MCNA的稳定性和/或促进MCNA递送至靶细胞或组织。
脂质体大小
根据本发明的合适的脂质体可以各种大小制备。在一些实施例中，提供的脂质体可制备得小于先前已知的包封mRNA的脂质体。在一些实施例中，脂质体的尺寸降低与更有效的MCNA递送相关。适当脂质体大小的选择可考虑到靶细胞或组织的位点，以及在某种程度上对于其制备脂质体的应用。
在一些实施例中，选择合适大小的脂质体以促进由MCNA编码的多肽的全身分布。在一些实施例中，可能期望限制MCNA对某些细胞或组织的转染。例如，为了靶向肝细胞，脂质体的大小可设定为使得其尺寸小于肝脏中衬里肝血窦的内皮层的开窗；在这种情况下，脂质体可容易地穿透这种内皮开窗以到达靶肝细胞。
可替代地或另外地，脂质体的大小可设定为使得脂质体的尺寸具有足够的直径，以限制或明确地避免分布到某些细胞或组织内。例如，脂质体的大小可设定为使得其尺寸大于衬里肝血窦的内皮层的开窗，从而限制脂质体对肝细胞的分布。
在一些实施例中，脂质体的大小由脂质体颗粒的最大直径的长度确定。在一些实施例中，合适的脂质体具有的大小不大于约250nm(例如，不大于约225nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm或50nm)。在一些实施例中，合适的脂质体具有的大小范围为约10-250nm(例如，范围为约10–225nm、10–200nm、10–175nm、10–150nm、10-125nm、10–100nm、10–75nm或10–50nm)。在一些实施例中，合适的脂质体具有的大小范围为约100-250nm(例如，范围为约100–225nm、100–200nm、100–175nm、100–150nm)。在一些实施例中，合适的脂质体具有的大小范围为约10-100nm(例如，范围为约10–90nm、10–80nm、10–70nm、10–60nm或10–50nm)。在一个特定实施例中，合适的脂质体具有的大小小于约100nm。
本领域已知的各种替代方法可用于测定脂质体群体的大小。一种这样的尺寸测定方法在美国专利号4,737,323中描述，所述专利以引用的方式并入本文。通过浴或探针超声处理对脂质体悬浮液进行超声处理产生渐进的尺寸减少，降至直径小于约0.05微米的小ULV。均质化是依靠剪切能量将大脂质体断裂成较小脂质体的另一种方法。在典型的均质化程序中，MLV通过标准乳液均化器再循环，直到观察到选择的脂质体大小，通常在约0.1至0.5微米之间。脂质体的大小可通过准电光散射(QELS)进行测定，如以引用的方式并入本文的Bloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421-150(1981)中所述。通过所形成的脂质体的超声处理可减少平均脂质体直径。间歇性超声处理循环可与QELS评价交替，以指导有效的脂质体合成。
聚合物
在一些实施例中，使用聚合物作为载体，单独或与包括本文所述的各种脂质的其它载体组合，配制合适的递送媒介物。因此，在一些实施例中，如本文使用的，脂质体递送媒介物还涵盖含有聚合物的纳米颗粒。合适的聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、海藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、PEG化鱼精蛋白、PLL、PEG化PLL和聚乙烯亚胺(PEI)。当存在PEI时，它可为分子量范围为10至40kDa的支化PEI，例如25kDa支化PEI(Sigma#408727)。
用于本发明的合适脂质体可包括以各种比率的本文所述的任何阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇脂质、PEG化脂质和/或聚合物中的一种或多种。作为非限制性例子，合适的脂质体制剂可包括选自cKK-E12、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；C12-200、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；HGT4003、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；或ICE、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K的组合。
在各种实施例中，阳离子脂质(例如，cKK-E12、C12-200、ICE和/或HGT4003)构成按摩尔比计约30-60％(例如，约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％、或约35-40％)的脂质体。在一些实施例中，阳离子脂质(例如，cKK-E12、C12-200、ICE和/或HGT4003)的百分比为或大于按摩尔比计约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％的脂质体。
在一些实施例中，阳离子脂质/非阳离子脂质/基于胆固醇的脂质/PEG化脂质的比率可分别在约30-60:25-35:20-30:1-15之间。在一些实施例中，阳离子脂质/非阳离子脂质/基于胆固醇的脂质/PEG化脂质的比率分别为大约40:30:20:10。在一些实施例中，阳离子脂质/非阳离子脂质/基于胆固醇的脂质/PEG化脂质的比率分别为大约40:30:25:5。在一些实施例中，阳离子脂质/非阳离子脂质/基于胆固醇的脂质/PEG化脂质的比率分别为大约40:32:25:3。在一些实施例中，阳离子脂质/非阳离子脂质/基于胆固醇的脂质/PEG化脂质的比率为大约50:25:20:5。
药物组合物
为了促进MCNA在体内的表达，可将递送媒介物如脂质体与一种或多种另外的核酸、载体、靶向配体或稳定剂组合，或在药理学组合物中配制，在所述药理学组合物中它与合适的赋形剂混合。用于配制和施用药物的技术可在"Remington's PharmaceuticalSciences,"Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，最新版本中找到。
在一些实施例中，组合物包含用递送媒介物包封或与递送媒介物复合的MCNA。在一些实施例中，递送媒介物选自脂质体、脂质纳米颗粒、固体-脂质纳米颗粒、聚合物、病毒、溶胶-凝胶和纳米凝胶。
所提供的脂质体包封的或脂质体结合的MCNA，以及含有其的组合物，可根据当前的医学实践施用且给药，考虑到受试者的临床状况、施用部位和施用方法、施用的时间安排、受试者的年龄、性别、体重以及与本领域普通技术人员相关的其它因素。用于本文目的的“有效量”可通过如实验临床研究、药理学、临床和医学领域的普通技术人员已知的此类相关考虑来确定。在一些实施例中，所施用的量有效实现如本领域技术人员选择作为疾病进展、退化或改善的适当测量的症状和其它指标的至少一些稳定、改善或消除。例如，合适的量和给药方案是引起至少瞬时蛋白质(例如酶)产生的那种。
本发明提供了递送MCNA用于体内蛋白质生产的方法，其包括将MCNA施用于需要递送的受试者。在一些实施例中，MCNA经由选自以下的递送途径施用：静脉内递送、皮下递送、经口递送、皮下递送、眼部递送、气管内注射肺部递送(例如雾化)、肌内递送、鞘内递送、或关节内递送。
合适的施用途径包括例如经口、直肠、阴道、透粘膜、肺部包括气管内或吸入、或肠内施用；肠胃外递送，包括皮内、透皮(局部)、肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内或鼻内。在特定实施例中，肌内施用针对选自骨骼肌、平滑肌和心肌的肌肉。在一些实施例中，施用导致MCNA递送至肌细胞。在一些实施例中，施用导致MCNA递送至肝细胞(即肝脏细胞)。在一个特定实施例中，肌内施用导致MCNA递送至肌细胞。
可替代地或另外地，本发明的脂质体包封的MCNA和组合物可以局部而不是全身方式施用，例如，经由将药物组合物直接注射到靶组织内，优选以持续释放制剂。根据要靶向的组织，局部递送可以各种方式受到影响。例如，可吸入含有本发明的组合物的气溶胶(用于鼻、气管或支气管递送)；例如，可将本发明的组合物注射到损伤、疾病表现或疼痛部位内；组合物可在用于经口、气管或食道应用的锭剂中提供；可以用于施用于胃或肠的液体、片剂或胶囊形式供应，可以用于直肠或阴道应用的栓剂形式供应；或者甚至可通过使用乳膏、滴剂或甚至注射剂递送到眼。含有与治疗分子或配体复合的所提供的组合物的制剂甚至可通过外科手术施用，例如与可允许组合物从植入部位扩散到周围细胞的聚合物或其它结构或物质结合。可替代地，它们可通过外科手术施用，而无需使用聚合物或支持物。
本发明的方法考虑了本文所述的治疗剂(例如MCNA)的治疗有效量的单次施用以及多次施用。治疗剂可以规则间隔施用，取决于受试者状况的性质、严重性和程度。在一些实施例中，本发明的治疗剂(例如，MCNA)的治疗有效量可以规则间隔(例如，每年一次、每六个月一次、每五个月一次、每三个月一次、双月(每两个月一次)、每月(每月一次)、每两周(每两周一次)、每月两次、每30天一次、每28天一次、每14天一次、每10天一次、每7天一次、每周、每周两次、每天或连续)定期鞘内施用。
在一些实施例中，提供的脂质体和/或组合物被配制成使得它们适合于其中包含的MCNA的延长释放。此类延长释放的组合物可以延长的给药间隔方便地施用于受试者。例如，在一个实施例中，本发明的组合物每天两次、每天或每隔一天施用于受试者。在一个优选实施例中，本发明的组合物每周两次、每周一次、每7天一次、每10天一次、每14天一次、每28天一次、每30天一次、每两周一次、每三周一次、或更优选每四周一次、每月一次、每月两次、每六周一次、每八周一次、每隔一个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每六个月一次、每八个月一次、每九个月一次或每年一次施用于受试者。还考虑了配制用于储存施用(例如，肌内、皮下、玻璃体内)的组合物和脂质体，以经过延长的时间段递送或释放MCNA。优选地，所采用的延长释放手段与对MCNA进行的修饰组合，以增强稳定性。
如本文使用的，术语“治疗有效量”在很大程度上基于本发明药物组合物中包含的治疗剂的总量来确定。一般地，治疗有效量足以实现对受试者有意义的益处(例如，治疗、调节、治愈、预防和/或改善疾病或病症)。例如，治疗有效量可为足以实现所需疗效和/或预防效果的量。一般地，施用于有此需要的受试者的治疗剂(例如，MCNA)的量将取决于受试者的特征。这些特征包括受试者的状况、疾病严重性、一般健康、年龄、性别和体重。本领域普通技术人员将能够根据这些和其它相关因素容易地确定适当剂量。另外，客观和主观测定两者可任选用于鉴定最佳剂量范围。
治疗有效量通常以可包含多个单位剂量的给药方案施用。对于任何特定的治疗性蛋白质，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可变化，例如取决于施用途径、与其它药物试剂的组合。另外，用于任何特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于各种因素，包括待治疗的病症和病症的严重性；所采用的特定药物试剂的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；所采用的特定蛋白质的施用时间、施用途径和/或排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及医学领域中众所周知的相似因素。
在一些实施例中，治疗有效剂量范围为约0.005mg/kg体重至500mg/kg体重，例如约0.005mg/kg体重至400mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至300mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至200mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至100mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至90mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至80mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至70mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至60mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至50mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至40mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至30mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至25mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至20mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至15mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至10mg/kg体重。
在一些实施例中，治疗有效剂量大于约0.1mg/kg体重、大于约0.5mg/kg体重、大于约1.0mg/kg体重、大于约3mg/kg体重、大于约5mg/kg体重、大于约10mg/kg体重、大于约15mg/kg体重、大于约20mg/kg体重、大于约30mg/kg体重、大于约40mg/kg体重、大于约50mg/kg体重、大于约60mg/kg体重、大于约70mg/kg体重、大于约80mg/kg体重、大于约90mg/kg体重、大于约100mg/kg体重、大于约150mg/kg体重、大于约200mg/kg体重、大于约250mg/kg体重、大于约300mg/kg体重、大于约350mg/kg体重、大于约400mg/kg体重、大于约450mg/kg体重、大于约500mg/kg体重。在一个特定实施例中，治疗有效剂量为1.0mg/kg。在一些实施例中，肌内或静脉内施用1.0mg/kg的治疗有效剂量。
本文还考虑了包含本文公开的一种或多种脂质体的冻干药物组合物和使用此类组合物的相关方法，如例如在于2011年6月8日提交的美国临时申请号61/494,882中公开的，所述美国临时申请的教导以引用的方式整体并入本文。例如，根据本发明的冻干药物组合物可在施用前重构或可在体内重构。例如，冻干的药物组合物可配制成适当的剂型(例如皮内剂型，例如圆盘、棒或膜)，并且这样施用使得剂型通过个体的体液在体内随着时间过去再水合。
提供的脂质体和组合物可施用于任何所需组织。在一些实施例中，通过提供的脂质体或组合物递送的MCNA在其中施用脂质体和/或组合物的组织中表达。在一些实施例中，递送的MCNA在与其中施用脂质体和/或组合物的组织不同的组织中表达。递送的MCNA可在其中递送和/或表达的示例性组织包括但不限于肝脏、肾脏、心脏、脾、血清、脑、骨骼肌、淋巴结、皮肤和/或脑脊髓液。
在一些实施例中，与治疗前的基线表达水平相比，施用所提供的组合物导致来自受试者的生物样品中的MCNA表达水平增加。通常，在治疗前立即测量基线水平。生物样品包括例如全血、血清、血浆、尿和组织样品(例如肌肉、肝脏、皮肤成纤维细胞)。在一些实施例中，与紧在治疗前的基线水平相比，施用所提供的组合物导致MCNA表达水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，与未治疗的受试者中的MCNA表达水平相比，施用所提供的组合物导致MCNA表达水平增加。
根据各种实施例，可调整递送的MCNA的表达时机，以适应特定的医学需要。在一些实施例中，由递送的MCNA编码的蛋白质的表达在所提供的脂质体和/或组合物施用后1、2、3、6、12、24、48、72和/或96小时是可检测的。在一些实施例中，由递送的MCNA编码的蛋白质的表达在施用后1周、2周和/或1个月是可检测的。
实例
虽然已根据某些实施例特异性地描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但下述实例仅作用于说明本发明的化合物，而不是预期限制其。
实例1.多聚体编码核酸(MCNA)的示例性合成
该实例提供了用于合成本专利申请中描述的MCNA的示例性方案，用于在体内有效递送和表达编码治疗性蛋白质的MCNA。
通过使用互补DNA夹板将含有3'-3'磷酸二酯键的合成寡核苷酸连接到多重多核苷酸来尝试MCNA的合成。使用互补DNA夹板测试几种不同的T4RNA连接酶将含有3'-3'磷酸二酯键的合成寡核苷酸连接到多重多核苷酸的能力。第一RNA连接酶(“RNA连接酶1”)是“单链”RNA连接酶，其连接单个RNA链、双重RNA链和设计为实现单链突出端的双重RNA链。第二RNA连接酶(“RNA连接酶2”)是“双链”RNA连接酶，其连接与互补寡核苷酸结合的RNA中的切口。RNA连接酶1和RNA连接酶2两者均需要寡核苷酸桥的磷酸化5'末端，以进行腺苷酸化用于连接反应。
作为非限制性例子，使用互补DNA夹板将促红细胞生成素(EPO)mRNA连接至含有3'-3'磷酸二酯键的桥接寡核苷酸。下文描述了含有3'-3'磷酸二酯键的桥接寡核苷酸和DNA夹板的例子。下文列出了本文实例中使用的EPO的示例性序列。
促红细胞生成素(EPO)mRNA(包括5'和3’UTR)：
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU(SEQ ID NO:1)
促红细胞生成素(EPO)mRNA(包括具有200A多聚(A)尾的5'和3’UTR)：GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:2)
促红细胞生成素(EPO)mRNA(包括5'和3’UTR，其中在3’UTR中具有内部65A多聚(A)区)：
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU(SEQ ID NO:3)
促红细胞生成素(EPO)mRNA(包括5'和3’UTR，其中在3’UTR中具有多重短内部多聚(A)区)：
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAAAAAAAAAAAAAAAUCCCUGUGACCCCUCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAAAAAAAAAAAAAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAAAAAAAAAAAAAAAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU(SEQ ID NO:4)
桥接寡核苷酸1：
5'-CGA CUC UCG G-3'-PO4-3'-G GCU CUC AGC-5'(SEQ ID NO:5)
包括在SEQ ID NO:5中的碱基是2'-O-甲基RNA，并且3'-3'桥包含PO4。
桥接寡核苷酸2：
5’-AAAAAAAAAA-3'-PO4-3'-AAAAAAAAAA-5’(SEQ ID NO:6)
桥接寡核苷酸3：
5’-AAA-3'-PO4-3'-AAA-5’(SEQ ID NO:7)
桥接寡核苷酸4：
5’-A-3'-PO4-3'-A-5’(SEQ ID NO:8)
夹板寡核苷酸1：
5'-CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G-3'(SEQ ID NO:9)
夹板寡核苷酸2：
5'-CCG AGA GTG ATG CAA CTT AAT TTT ATT AGG-3'(SEQ ID NO:10)夹板寡核苷酸3：
5'-TTT TTT TTT TAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G-3'(SEQ ID NO:11)
夹板寡核苷酸4：
5'-CCG AGA GTC GTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3'(SEQ ID NO:12)夹板寡核苷酸5：
3’-G GAT TAT TTT AAT TCA ACG TAG TTC GAG CTG AGA GCC-5’-PO4-5'-CCGAGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G-3'(SEQ ID NO:13)
夹板寡核苷酸6：
3’-GGA TTA TTT TAA TTC AAC GTA GTG AGA GCC-5’-PO4-5'-CCG AGA GTG ATGCAA CTT AAT TTT ATT AGG-3'(SEQ ID NO:14)
夹板寡核苷酸7：
3’-G GAT TAT TTT AAT TCA ACG TAG TTC GAT TTT TTT TTT-5’-PO4-5'-TTTTTT TTT TAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G-3'(SEQ ID NO:15)
夹板寡核苷酸8：
3’-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG CTG AGA GCC-5’-PO4-5'-CCG AGA GTC GTTTTT TTT TTT TTT TTT TTT-3'(SEQ ID NO:16)
EPO MCNA#1(无多聚A尾)
通过将编码人促红细胞生成素(hEPO)蛋白的RNA的两个拷贝的3'末端夹板连接到单个寡核苷酸的5'末端来制备MCNA 1(SEQ ID NO:17)，所述单个寡核苷酸在序列内含有两个5'末端和连接的3'-3'磷酸二酯键。简言之，使用T7RNA聚合酶转录含有侧接编码hEPO的RNA序列的5'非翻译区(UTR)和3’UTR的5’-加帽的RNA，酶促加帽以含有5’-帽1结构且纯化。然后使用(A)T4RNA连接酶1+PEG 8K、(B)T4RNA连接酶1、或(C)T4RNA连接酶2以及与3’UTR和桥接寡核苷酸1互补的DNA寡核苷酸“夹板”(夹板寡核苷酸1(SEQ ID NO:9)；5'CCG AGA GTCGAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G 3'；所有碱基DNA)，将该hEPO转录物一步连接到含有20个核苷酸(nt)回文序列的2'-羟甲基化RNA(OMeRNA)“桥接”寡核苷酸，其中在第10个和第11个nt之间具有3'-3'磷酸二酯键(桥接寡核苷酸1(SEQ ID NO:5)；
Figure BDA0001815864400001273
Figure BDA0001815864400001272
粗体碱基OMeRNA)。可替代地，使用夹板寡核苷酸5(SEQ ID NO:13)、含有由5'-5'磷酸二酯键连接的寡核苷酸2的2个拷贝的回文序列来制备MCNA。为了制备用于连接的样品，桥接寡核苷酸1在含有50μM桥接寡核苷酸1、1mM ATP、1X PNK缓冲液(NEB；70mM Tris-HCl、10mM MgCl2、5mM DTT pH 7.6，在25℃下)和0.5U/μL T4多核苷酸激酶(NEB)的反应中在37℃下5'末端磷酸化1小时。然后使用Sephadex G-25脱盐柱(Princeton Separations)，将磷酸化的桥接寡核苷酸1脱盐，并且通过加热至75℃共5分钟，随后经过5分钟逐渐冷却至室温，在含有3.2μM加帽的hEPO转录物、1.5μM桥接寡核苷酸1和3μM夹板寡核苷酸1(或1.5uM夹板寡核苷酸5)的反应中，与转录物和夹板杂交。随后制备RNA连接反应，以包含50％稀释的杂交反应和(A)1X RNA连接酶缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT pH 7.5，在25℃下)、1mM ATP和1U/μL T4RNA连接酶1(NEB)，(B)1X RNA连接酶缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT pH 7.5，在25℃下)、1mM ATP、10％PEG和1U/μL T4RNA连接酶1(NEB)，或(C)1X T4RNA连接酶2缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP以pH 7.5，在25℃下)和1U/μL T4RNA连接酶2(NEB)。各自在37℃下反应90分钟。然后使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化完成的连接反应。随后用DNA酶I处理纯化的MCNA 1产物的一部分，以去除残留的桥寡核苷酸，以防止细胞中PCNA 1的潜在内源RNA酶H切割。
可替代地，通过将编码人促红细胞生成素(hEPO)蛋白的RNA的两个拷贝的3'末端夹板连接到单个寡核苷酸的5'末端来制备MCNA 1(SEQ ID NO:17)，所述单个寡核苷酸在序列内含有两个5'末端和连接的3'-3'磷酸二酯键。简言之，使用T7RNA聚合酶转录含有侧接编码hEPO的RNA序列的5'-非翻译区(UTR)和3’UTR的5’-加帽的RNA，酶促加帽以含有5’-帽1结构且纯化。然后使用(A)T4RNA连接酶1+PEG 8K、(B)T4RNA连接酶1、或(C)T4RNA连接酶2以及与3’UTR和桥接寡核苷酸1互补的DNA寡核苷酸“夹板”(夹板寡核苷酸1(SEQ ID NO:9)；5'CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G 3'；所有碱基DNA)，将该hEPO转录物一步连接到含有20个核苷酸(nt)回文序列的2'-羟甲基化RNA(OMeRNA)“桥接”寡核苷酸，其中在第10个和第11个nt之间具有3'-3'磷酸二酯键(桥接寡核苷酸1(SEQ ID NO:5)；
Figure BDA0001815864400001284
Figure BDA0001815864400001283
粗体碱基OMeRNA)。可替代地，使用夹板寡核苷酸6(SEQ ID NO:14)、以及含有由5'-5'磷酸二酯键连接的寡核苷酸2的2个拷贝的回文序列来制备MCNA。为了制备用于连接的样品，桥接寡核苷酸1在含有50μM桥接寡核苷酸1、1mM ATP、1X PNK缓冲液(NEB；70mM Tris-HCl、10mM MgCl2、5mM DTT pH 7.6，在25℃下)和0.5U/μL T4多核苷酸激酶(NEB)的反应中在37℃下5'末端磷酸化1小时。然后使用Sephadex G-25脱盐柱(Princeton Separations)，将磷酸化的桥接寡核苷酸1脱盐，并且通过加热至75℃共5分钟，随后经过5分钟逐渐冷却至室温，在含有3.2μM加帽的hEPO转录物、1.5μM桥接寡核苷酸1和3μM夹板寡核苷酸1(或1.5uM夹板寡核苷酸6)的反应中，与转录物和夹板杂交。随后制备RNA连接反应，以包含50％稀释的杂交反应和(A)1X RNA连接酶缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT pH 7.5，在25℃下)、1mM ATP和1U/μL T4RNA连接酶1(NEB)，(B)1X RNA连接酶缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT pH 7.5，在25℃下)、1mM ATP、10％PEG和1U/μL T4RNA连接酶1(NEB)，或(C)1X T4RNA连接酶2缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、2mM MgCl2、1mM DTT、400μM ATP pH 7.5，在25℃下)和1U/μL T4RNA连接酶2(NEB)。各自在37℃下反应90分钟。然后使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化完成的连接反应。随后用DNA酶I处理纯化的MCNA 1产物的一部分，以去除残留的桥寡核苷酸，以防止细胞中PCNA 1的潜在内源RNA酶H切割。
MCNA 1(无多聚(A)尾序列)：
5'-
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
Figure BDA0001815864400001291
Figure BDA0001815864400001292
Figure BDA0001815864400001293
UCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(SEQ ID NO:17)
EPO MCNA#2
通过将编码人促红细胞生成素(hEPO)蛋白的RNA的两个拷贝的3'末端夹板连接到单个寡核苷酸的5'末端来制备MCNA 2(SEQ ID NO:18)，所述单个寡核苷酸在序列内含有两个5'末端和连接的3'-3'磷酸二酯键。简言之，使用T7 RNA聚合酶转录含有侧接编码hEPO的RNA序列的5'-非翻译区(UTR)和3’UTR的5’-加帽的RNA，酶促加帽以含有5’-帽1结构且纯化。然后使用T4 RNA连接酶1+PEG 8K以及与3’UTR和桥接寡核苷酸2互补的DNA寡核苷酸“夹板”(夹板寡核苷酸3(SEQ ID NO:11)；5'TTT TTT TTT TAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TATTAG G 3'；所有碱基DNA)，将该hEPO转录物一步连接到含有20个核苷酸(nt)回文序列的RNA“桥接”寡核苷酸，其中在第10个和第11个nt之间具有3'-3'磷酸二酯键(桥接寡核苷酸2(SEQ ID NO:6)；5'-AAA AAA AAA A-3'-3'-A AAA AAA AAA-5'，加下划线的碱基RNA)。可替代地，使用夹板寡核苷酸7(SEQ ID NO:15)、含有由5'-5'磷酸二酯键连接的夹板寡核苷酸7的2个拷贝的回文序列来制备MCNA。为了制备用于连接的样品，桥接寡核苷酸2在含有50μM寡核苷酸3、1 mM ATP、1X PNK缓冲液(NEB；70 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、5 mM DTT pH7.6，在25℃下)和0.5 U/μL T4多核苷酸激酶(NEB)的反应中在37℃下5'末端磷酸化1小时。然后使用Sephadex G-25脱盐柱(Princeton Separations)，将磷酸化的桥接寡核苷酸2脱盐，并且通过加热至75℃共5分钟，随后经过5分钟逐渐冷却至室温，在含有3.2μM加帽的hEPO转录物、1.5μM桥接寡核苷酸2和3μM夹板寡核苷酸3(或1.5 uM夹板寡核苷酸7)的反应中，与转录物和夹板杂交。随后制备RNA连接反应，以包含50％稀释的杂交反应和1x RNA连接酶缓冲液(NEB；50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM DTT pH 7.5，在25℃下)、1 mM ATP、10％PEG和1U/μL T4RNA连接酶1(NEB)，并且在37℃下反应90分钟。然后使用RNeasy MiniKit(Qiagen)纯化完成的连接反应。
EPO PCNA#2(10A-10A桥)：
5'-
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCUA AA
Figure BDA0001815864400001311
AAAAAAAAAAUCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(SEQ ID NO:18)
EPO MCNA#3
通过将编码人促红细胞生成素(hEPO)蛋白的RNA的两个拷贝的3'末端夹板连接到单个寡核苷酸的5'末端来制备MCNA 3(SEQ ID NO:19)，所述单个寡核苷酸在序列内含有两个5'末端和连接的3'-3'磷酸二酯键。简言之，使用T7RNA聚合酶转录含有5'非翻译区(UTR)、3’UTR的5’加帽的RNA，其中两个UTR均侧接编码hEPO的RNA序列，酶促加帽以含有5’帽1结构且纯化。使用多聚(A)聚合酶进一步处理构建体，以掺入～200A的多聚(A)尾长度。然后使用T4RNA连接酶1+PEG 8K以及与3’UTR和桥接寡核苷酸1互补的DNA寡核苷酸“夹板”(夹板寡核苷酸4(SEQ ID NO:12)；5'CCG AGA GTC GTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT 3'；所有碱基DNA)，将该hEPO转录物一步连接到含有20个核苷酸(nt)回文序列的OMeRNA“桥”寡核苷酸，其中在第10个和第11个nt之间具有3'-3'磷酸二酯键(桥接寡核苷酸1(SEQ ID NO:5)；
Figure BDA0001815864400001321
粗体碱基OMeRNA)。可替代地，可使用夹板寡核苷酸8(SEQ ID NO:16)、含有由5'-5'磷酸二酯键连接的夹板寡核苷酸4的2个拷贝的回文序列来制备MCNA。为了制备用于连接的样品，桥接寡核苷酸1在含有50μM寡核苷酸1、1mM ATP、1x PNK缓冲液(NEB；70mM Tris-HCl、10mM MgCl2、5mM DTT pH 7.6，在25℃下)和0.5U/μL T4多核苷酸激酶(NEB)的反应中在37℃下5'末端磷酸化1小时。然后使用Sephadex G-25脱盐柱(Princeton Separations)，将磷酸化的桥接寡核苷酸1脱盐，并且通过加热至75℃共5分钟，随后经过5分钟逐渐冷却至室温，在含有3.2μM加帽的hEPO转录物、1.5μM桥接寡核苷酸1和3μM夹板寡核苷酸4的反应中，与转录物和夹板杂交。随后制备RNA连接反应，以包含50％稀释的杂交反应和1X RNA连接酶缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、10mMMgCl2、1mM DTT pH 7.5，在25℃下)、1mM ATP、10％PEG和1U/μL T4RNA连接酶1(NEB)，并且在37℃下反应90分钟。然后使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化完成的连接反应。
EPO PCNA#3(包括200A多聚(A)尾)：
5’-
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-
Figure BDA0001815864400001331
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5’(SEQ ID NO:19)
EPO MCNA#4
通过将编码人促红细胞生成素(hEPO)蛋白的RNA的两个拷贝的3'末端夹板不依赖性连接到单个二核苷酸的5'末端来制备MCNA 4(SEQ ID NO:20)，所述单个二核苷酸含有由3'-3'磷酸二酯键连接的两个A。简言之，使用T7RNA聚合酶转录含有5'-非翻译区(UTR)、3’UTR的5’-加帽的RNA，其中两个UTR均侧接编码hEPO的RNA序列，酶促加帽以含有5’-帽1结构且纯化。使用多聚(A)聚合酶进一步处理构建体，以掺入～200A的多聚(A)尾长度。然后使用T4RNA连接酶1+PEG 8K，经由两步将该hEPO转录物连接到RNA桥寡核苷酸，所述RNA桥寡核苷酸含有A的三聚体重复，具有与A的另一个三聚体重复的3'-3'磷酸二酯连接(桥接寡核苷酸3(SEQ ID NO:7)；5'-AAA-3'-3'-AAA-5'，加下划线的碱基RNA)。为了制备用于连接的样品，桥接寡核苷酸3在含有50μM寡核苷酸7、1mM ATP、1x PNK缓冲液(NEB；70mM Tris-HCl、10mMMgCl2、5mM DTT pH 7.6，在25℃下)和0.5U/μL T4多核苷酸激酶(NEB)的反应中在37℃下5'末端磷酸化1小时。然后使用Sephadex G-25脱盐柱(Princeton Separations)，将磷酸化的桥接寡核苷酸3脱盐，并且通过加热至75℃共5分钟，随后经过5分钟逐渐冷却至室温，在含有2.4μM加帽和加尾的hEPO转录物以及50μM桥接寡核苷酸3的反应中变性。随后制备RNA连接反应，以包含50％稀释的杂交反应和1X RNA连接酶缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、10mMMgCl2、1mM DTT pH 7.5，在25℃下)、1mM ATP、10％PEG和1U/μL T4RNA连接酶1(NEB)，并且在37℃下反应90分钟。然后使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化部分连接反应。使用1:1摩尔比的部分连接产物与另外的加帽和加尾的hEPO转录物重复连接反应，并且如前进行纯化。
EPO PCNA#4(包括具有3A-3A桥的200A多聚(A)尾)：
5’-
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-
Figure BDA0001815864400001351
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5’(SEQ ID NO:20)
EPO MCNA#5
通过将编码人促红细胞生成素(hEPO)蛋白的RNA的两个拷贝的3'末端夹板不依赖性连接到单个二核苷酸的5'末端来制备MCNA 5(SEQ ID NO:21)，所述单个二核苷酸含有由3'-3'磷酸二酯键连接的两个A。简言之，使用T7RNA聚合酶转录含有5'-非翻译区(UTR)、3’UTR的5’-加帽的RNA，其中两个UTR均侧接编码hEPO的RNA序列，酶促加帽以含有5’-帽1结构且纯化。使用多聚(A)聚合酶进一步处理构建体，以掺入～200A的多聚(A)尾长度。然后使用T4RNA连接酶1+PEG 8K，经由两步将该hEPO转录物连接到RNA“桥接”二核苷酸，所述RNA“桥接”二核苷酸含有与另一个A具有3'-3'磷酸二酯连接的A(桥接寡核苷酸4(SEQ ID NO:8)；5'-A-3'-3'-A-5'，加下划线的碱基RNA)。为了制备用于连接的样品，桥接寡核苷酸4在含有50μM桥接寡核苷酸4、1mM ATP、1x PNK缓冲液(NEB；70mM Tris-HCl、10mM MgCl2、5mM DTTpH 7.6，在25℃下)和0.5U/μL T4多核苷酸激酶(NEB)的反应中在37℃下5'末端磷酸化1小时。然后使用Sephadex G-25脱盐柱(Princeton Separations)，将磷酸化的桥接寡核苷酸4脱盐，并且通过加热至75℃共5分钟，随后经过5分钟逐渐冷却至室温，在含有2.4μM加帽和加尾的hEPO转录物以及50μM桥接寡核苷酸4的反应中变性。随后制备RNA连接反应，以包含50％稀释的杂交反应和1X RNA连接酶缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTTpH 7.5，在25℃下)、1mM ATP、10％PEG和1U/μL T4RNA连接酶1(NEB)，并且在37℃下反应90分钟。然后使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化部分连接反应。使用1:1摩尔比的部分连接产物与另外的加帽和加尾的hEPO转录物重复连接反应，并且如前进行纯化。
EPO PCNA#5(包括具有1A-1A桥的200A多聚(A)尾)：
5’-
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-
Figure BDA0001815864400001371
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5’(SEQ ID NO:21)
EPO PCNA#6
通过将编码人促红细胞生成素(hEPO)蛋白的RNA的两个拷贝的3'末端夹板连接到单个寡核苷酸的5'末端来制备PCNA 6(SEQ ID NO:22)，所述单个寡核苷酸在序列内含有两个5'末端和连接的3'-3'磷酸二酯键。简言之，使用T7 RNA聚合酶转录含有5’非翻译区(UTR)、含有65个连续A的内部区段的3’UTR的5’加帽的RNA，其中两个UTR均侧接编码hEPO的RNA序列，酶促加帽以含有5’帽1结构且纯化。然后使用T4 RNA连接酶1+PEG 8K以及与3’UTR和桥接寡核苷酸1互补的DNA寡核苷酸“夹板”(夹板寡核苷酸1(SEQ ID NO:9)；5'CCG AGAGTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G 3'；所有碱基DNA)，将该hEPO转录物一步连接到含有20个核苷酸(nt)回文序列的OMeRNA”桥接”寡核苷酸，其中在第10个和第11个nt之间具有3'-3'磷酸二酯键(桥接寡核苷酸1 SEQ ID NO:5)；5'-CGA CUC UCG G-3'-3'-G GCU CUC AGC-5'，加下划线的碱基OMeRNA)。为了制备用于连接的样品，桥接寡核苷酸1在含有50μM桥接寡核苷酸1、1 mM ATP、1x PNK缓冲液(NEB；70 mM Tris-HCl、10mM MgCl2、5 mMDTT pH 7.6，在25℃下)和0.5 U/μL T4多核苷酸激酶(NEB)的反应中在37℃下5'末端磷酸化1小时。然后使用Sephadex G-25脱盐柱(Princeton Separations)，将磷酸化的桥接寡核苷酸1脱盐，并且通过加热至75℃共5分钟，随后经过5分钟逐渐冷却至室温，在含有3.2μM加帽的hEPO转录物、1.5μM桥接寡核苷酸1和3μM夹板寡核苷酸1的反应中，与转录物和夹板杂交。随后制备RNA连接反应，以包含50％稀释的杂交反应和1X RNA连接酶缓冲液(NEB；50mMTris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT pH 7.5，在25℃下)、1mM ATP、10％PEG和1U/μL T4RNA连接酶1(NEB)，并且在37℃下反应90分钟。然后使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化完成的连接反应。
EPO PCNA#6(包括内部65A多聚(A)区)：
5'-
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
Figure BDA0001815864400001391
GGCUCUCAGCUCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(SEQ ID NO:22)
EPO PCNA#7
通过将编码人促红细胞生成素(hEPO)蛋白的RNA的两个拷贝的3'末端夹板连接到单个寡核苷酸的5'末端来制备PCNA 7(SEQ ID NO:23)，所述单个寡核苷酸在序列内含有两个5'末端和连接的3'-3'磷酸二酯键。简言之，使用T7 RNA聚合酶转录含有5’非翻译区(UTR)、含有3段15个A和1段16个A的3’UTR的5’加帽的RNA，其中两个UTR均侧接编码hEPO的RNA序列，酶促加帽以含有5’帽1结构且纯化。然后使用T4 RNA连接酶1+PEG 8K以及与3’UTR和桥接寡核苷酸1互补的DNA寡核苷酸“夹板”(夹板寡核苷酸1(SEQ ID NO:9)；5'CCG AGAGTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TAT TAG G 3'；所有碱基DNA)，将该hEPO转录物一步连接到含有20个核苷酸(nt)回文序列的OMeRNA”桥”寡核苷酸，其中在第10个和第11个nt之间具有3'-3'磷酸二酯键(桥接寡核苷酸1(SEQ ID NO:5)；5'-CGA CUC UCG G-3'-3'-G GCU CUC AGC-5'，加下划线的碱基OMeRNA)。为了制备用于连接的样品，寡核苷酸1在含有50μM桥接寡核苷酸1、1 mM ATP、1x PNK缓冲液(NEB；70 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、5 mM DTT pH7.6，在25℃下)和0.5 U/μL T4多核苷酸激酶(NEB)的反应中在37℃下5'末端磷酸化1小时。然后使用Sephadex G-25脱盐柱(Princeton Separations)，将磷酸化的桥接寡核苷酸1脱盐，并且通过加热至75℃共5分钟，随后经过5分钟逐渐冷却至室温，在含有3.2μM加帽的hEPO转录物、1.5μM桥接寡核苷酸1和3μM夹板寡核苷酸1的反应中，与转录物和夹板杂交。随后制备RNA连接反应，以包含50％稀释的杂交反应和1X RNA连接酶缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT pH 7.5，在25℃下)、1mM ATP、10％PEG和1U/μL T4RNA连接酶1(NEB)，并且在37℃下反应90分钟。然后使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化完成的连接反应。
EPO PCNA#7(包括多个短内部多聚(A)区)：
5'-
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGACGGGUGGCAAAAAAAAAAAAAAAUCCCUGUGACCCCUCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAAAAAAAAAAAAAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAAAAAAAAAAAAAAAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
Figure BDA0001815864400001411
GGCUCUCAGCUCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGAAAAAAAAAAAAAAACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAAAAAAAAAAAAAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGAAAAAAAAAAAAAAAACCCCUCCCCAGUGUCCCUAAAAAAAAAAAAAAACGGUGGGCAGUAGACAGGGGACAGGACGUCCGGAGGGGACACAUGUCGAAGUCGAAAGGGGCCUCCUUUAACCUCAUCUGAGCCUUCUCAAACGCCUUUCACAGUCGUCACUAACAAGCCUCACCUCGUCGACUCCGGCGUAGACCUCCCCUCUACCGAAGGAAGACCCGAGGGUCUCGGGCUUCGUCUCACCACUCCGACGCUUCCGGUGACUGCCGAAAUAGGUGUACGUCGACGUCCCCGAGGGUGCCGACCCUUCUCAACUGGUUGUCCCGGACCGGGGCGUCCUGUCGAAGGCUGUCGUCCCGGUCCGGGACGGUCUGAAGAUGCCGGACGACGGGCUGGAGGUAGGAGAAGGUCCGUAUCUUUAAUUGAAACCACAGACCCUGUCACUAUAAGAGUAAGUUCGACGUCACAAGUCGUGUCGGGCAGCACUAUAAGAGCCGGAGGAACCGGAGGUUCUCCAUGGAGAGGUCCUGAGCCGACAGUGUCUACUCCGCACCACCCCGCGGGUCCUGACCCUCCGGGUCUCCCUCGCUGUCGUCCCUGUCCUCUUCGGUGUCGGUCCGUCCUGUAAGCACGUGGGGGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(SEQ ID NO:23)
图5显示了经由凝胶电泳检测的MCNA的结果。在泳道1-15中运行的MCNA是包含摩尔比为2:1:2的EPO mRNA与桥接寡核苷酸与DNA夹板(SEQ ID NO:9)的连接反应的结果。EPOmRNA和RNA连接酶的摩尔量包括在下表中：
Figure BDA0001815864400001421
Figure BDA0001815864400001431
图5证实了RNA连接酶1在测试的条件下在产生包含EPO RNA的MCNA方面优于RNA连接酶2。此外，向反应条件中添加10％PEG增强了连接。
图6显示了经由凝胶电泳检测的MCNA。泳道1显示加帽的EPO mRNA(无多聚(A)尾)。泳道2显示了与未反应/部分反应的EPO RNA产物混合的全长MCNA连接产物的MCNA混合物(不含DNA酶处理)。泳道3显示了与未反应/部分反应的EPO RNA产物混合的全长MCNA连接产物的MCNA混合物(具有DNA酶处理)。
图8显示了经由凝胶电泳检测的MCNA。泳道1显示了RNA尺寸确定梯。泳道2显示了与未反应/部分反应的EPO RNA产物混合的全长MCNA连接产物的MCNA混合物。泳道3显示了纯化的未反应/部分反应的EPO RNA产物。泳道4显示了纯化的EPO MCNA连接产物。
MCNA-OTC制备
通过将编码hOTC蛋白的RNA的两个拷贝的3'末端夹板连接到单个寡核苷酸的5'末端来制备包含人鸟氨酸转氨甲酰酶(hOTC)RNA的MCNA-OTC(SEQ ID NO:24)，所述单个寡核苷酸在序列内含有两个5'末端和连接的3'-3'磷酸二酯键。简言之，使用RNA聚合酶转录含有侧接编码hOTC的RNA序列的5'非翻译区(UTR)和3’UTR的5’加帽的RNA，酶促加帽以含有5’帽1结构且纯化。然后使用T4RNA连接酶1+PEG 8K以及与3’UTR和寡核苷酸1互补的DNA寡核苷酸“夹板”(寡核苷酸2(夹板)(SEQ ID NO:9)；5'CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAATTT TAT TAG G 3'；所有碱基DNA)，将该hOTC转录物一步连接到含有20个核苷酸(nt)回文序列的2'-羟甲基化RNA(OMeRNA)”桥”寡核苷酸，其中在第10个和第11个nt之间具有3'-3'磷酸二酯键(寡核苷酸1(桥)(SEQ ID NO:5)；
Figure BDA0001815864400001432
粗体碱基OMeRNA)。为了制备用于连接的样品，寡核苷酸1在含有50μM寡核苷酸1、1mM ATP、1X PNK缓冲液(NEB；70mM Tris-HCl、10mM MgCl2、5mM DTT pH 7.6，在25℃下)和0.5U/μLT4多核苷酸激酶(NEB)的反应中在37℃下5'末端磷酸化1小时。然后使用Sephadex G-25脱盐柱(Princeton Separations)，将磷酸化的寡核苷酸1(桥)脱盐，并且通过加热至75℃共5分钟，随后经过5分钟逐渐冷却至室温，在含有3.3μM加帽的hOTC转录物、1.5μM寡核苷酸1和3.3μM寡核苷酸2的反应中，与转录物和夹板杂交。随后制备RNA连接反应，以包含50％稀释的杂交反应和1X RNA连接酶缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT pH 7.5，在25℃下)、1mM ATP、10％PEG和0.33U/μL T4RNA连接酶1。各自在37℃下反应60分钟。然后使完成的连接反应与DNA酶I反应，随后使用RNeasy Maxi Kit(Qiagen)纯化。使用TBE/琼脂糖凝胶电泳评估反应产物的连接效率。将分离的MCNA-OTC产物用Lipofectamine平衡，并且转染到贴壁HEK293细胞内。然后测定未分级的细胞裂解产物从鸟氨酸和氨基甲酰磷酸酯的瓜氨酸产生(图10)。
MCNA-OTC
5'-
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGCUGUUCAACCUUCGGAUCUUGCUGAACAACGCUGCGUUCCGGAAUGGUCACAACUUCAUGGUCCGGAACUUCAGAUGCGGCCAGCCGCUCCAGAACAAGGUGCAGCUCAAGGGGAGGGACCUCCUCACCCUGAAAAACUUCACCGGAGAAGAGAUCAAGUACAUGCUGUGGCUGUCAGCCGACCUCAAAUUCCGGAUCAAGCAGAAGGGCGAAUACCUUCCUUUGCUGCAGGGAAAGUCCCUGGGGAUGAUCUUCGAGAAGCGCAGCACUCGCACUAGACUGUCAACUGAAACCGGCUUCGCGCUGCUGGGAGGACACCCCUGCUUCCUGACCACCCAAGAUAUCCAUCUGGGUGUGAACGAAUCCCUCACCGACACAGCGCGGGUGCUGUCGUCCAUGGCAGACGCGGUCCUCGCCCGCGUGUACAAGCAGUCUGAUCUGGACACUCUGGCCAAGGAAGCCUCCAUUCCUAUCAUUAAUGGAUUGUCCGACCUCUACCAUCCCAUCCAGAUUCUGGCCGAUUAUCUGACUCUGCAAGAACAUUACAGCUCCCUGAAGGGGCUUACCCUUUCGUGGAUCGGCGACGGCAACAACAUUCUGCACAGCAUUAUGAUGAGCGCUGCCAAGUUUGGAAUGCACCUCCAAGCAGCGACCCCGAAGGGAUACGAGCCAGACGCCUCCGUGACGAAGCUGGCUGAGCAGUACGCCAAGGAGAACGGCACUAAGCUGCUGCUCACCAACGACCCUCUCGAAGCCGCCCACGGUGGCAACGUGCUGAUCACCGAUACCUGGAUCUCCAUGGGACAGGAGGAGGAAAAGAAGAAGCGCCUGCAAGCAUUUCAGGGGUACCAGGUGACUAUGAAAACCGCCAAGGUCGCCGCCUCGGACUGGACCUUCUUGCACUGUCUGCCCAGAAAGCCCGAAGAGGUGGACGACGAGGUGUUCUACAGCCCGCGGUCGCUGGUCUUUCCGGAGGCCGAAAACAGGAAGUGGACUAUCAUGGCCGUGAUGGUGUCCCUGCUGACCGAUUACUCCCCGCAGCUGCAGAAACCAAAGUUCUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
Figure BDA0001815864400001451
Figure BDA0001815864400001452
UCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAGUCUUGAAACCAAAGACGUCGACGCCCCUCAUUAGCCAGUCGUCCCUGUGGUAGUGCCGGUACUAUCAGGUGAAGGACAAAAGCCGGAGGCCUUUCUGGUCGCUGGCGCCCGACAUCUUGUGGAGCAGCAGGUGGAGAAGCCCGAAAGACCCGUCUGUCACGUUCUUCCAGGUCAGGCUCCGCCGCUGGAACCGCCAAAAGUAUCAGUGGACCAUGGGGACUUUACGAACGUCCGCGAAGAAGAAAAGGAGGAGGACAGGGUACCUCUAGGUCCAUAGCCACUAGUCGUGCAACGGUGGCACCCGCCGAAGCUCUCCCAGCAACCACUCGUCGUCGAAUCACGGCAAGAGGAACCGCAUGACGAGUCGGUCGAAGCAGUGCCUCCGCAGACCGAGCAUAGGGAAGCCCCAGCGACGAACCUCCACGUAAGGUUUGAACCGUCGCGAGUAGUAUUACGACACGUCUUACAACAACGGCAGCGGCUAGGUGCUUUCCCAUUCGGGGAAGUCCCUCGACAUUACAAGAACGUCUCAGUCUAUUAGCCGGUCUUAGACCUACCCUACCAUCUCCAGCCUGUUAGGUAAUUACUAUCCUUACCUCCGAAGGAACCGGUCUCACAGGUCUAGUCUGACGAACAUGUGCGCCCGCUCCUGGCGCAGACGGUACCUGCUGUCGUGGGCGCGACACAGCCACUCCCUAAGCAAGUGUGGGUCUACCUAUAGAACCCACCAGUCCUUCGUCCCCACAGGAGGGUCGUCGCGCUUCGGCCAAAGUCAACUGUCAGAUCACGCUCACGACGCGAAGAGCUUCUAGUAGGGGUCCCUGAAAGGGACGUCGUUUCCUUCCAUAAGCGGGAAGACGAACUAGGCCUUAAACUCCAGCCGACUGUCGGUGUCGUACAUGAACUAGAGAAGAGGCCACUUCAAAAAGUCCCACUCCUCCAGGGAGGGGAACUCGACGUGGAACAAGACCUCGCCGACCGGCGUAGACUUCAAGGCCUGGUACUUCAACACUGGUAAGGCCUUGCGUCGCAACAAGUCGUUCUAGGCUUCCAACUUGUCGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(粗体碱基是OMeRNA)(SEQ ID NO:24)
MCNA-PAH制备
通过将编码hPAH蛋白的RNA的两个拷贝的3'末端夹板连接到单个寡核苷酸的5'末端来制备包含人苯丙氨酸羟化酶(hPAH)RNA的MCNA-PAH(SEQ ID NO:25)，所述单个寡核苷酸在序列内含有两个5'末端和连接的3'-3'磷酸二酯键。简言之，使用RNA聚合酶转录含有侧接编码hPAH的RNA序列的5'非翻译区(UTR)和3’UTR的5’加帽的RNA，酶促加帽以含有5’帽1结构且纯化。然后使用T4RNA连接酶1+PEG 8K以及与3’UTR和寡核苷酸1互补的DNA寡核苷酸“夹板”(寡核苷酸2(夹板)(SEQ ID NO:9)；5'CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACT TAA TTT TATTAG G 3'；所有碱基DNA)，将该hPAH转录物一步连接到含有20个核苷酸(nt)回文序列的2'-羟甲基化RNA(OMeRNA)”桥”寡核苷酸，其中在第10个和第11个nt之间具有3'-3'磷酸二酯键(寡核苷酸1(桥)(SEQ ID NO:5)；
Figure BDA0001815864400001463
Figure BDA0001815864400001462
粗体碱基OMeRNA)。为了制备用于连接的样品，寡核苷酸1在含有50μM寡核苷酸1、1mM ATP、1XPNK缓冲液(NEB；70mM Tris-HCl、10mM MgCl2、5mM DTT pH 7.6，在25℃下)和0.5U/μL T4多核苷酸激酶(NEB)的反应中在37℃下5'末端磷酸化1小时。然后使用Sephadex G-25脱盐柱(Princeton Separations)，将磷酸化的寡核苷酸1(桥)脱盐，并且通过加热至75℃共5分钟，随后经过5分钟逐渐冷却至室温，在含有2.7μM加帽的hPAH转录物、1.2μM寡核苷酸1和2.7μM寡核苷酸2的反应中，与转录物和夹板杂交。随后制备RNA连接反应，以包含50％稀释的杂交反应和1X RNA连接酶缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT pH 7.5，在25℃下)、1mM ATP、10％PEG和0.33U/μL T4RNA连接酶1。各自在37℃下反应60分钟。然后使完成的连接反应与DNA酶I反应，随后使用RNeasy Maxi Kit(Qiagen)纯化。使用TBE/琼脂糖凝胶电泳评估反应产物的连接效率。将分离的MCNA-PAH反应产物用Lipofectamine平衡，并且转染到贴壁HEK293细胞内。然后使用PAH特异性ELISA测定未分级的细胞裂解产物的PAH蛋白表达(图11)。
MCNA-PAH
5'-
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGAGCACCGCCGUGCUGGAGAACCCCGGCCUGGGCCGCAAGCUGAGCGACUUCGGCCAGGAGACCAGCUACAUCGAGGACAACUGCAACCAGAACGGCGCCAUCAGCCUGAUCUUCAGCCUGAAGGAGGAGGUGGGCGCCCUGGCCAAGGUGCUGCGCCUGUUCGAGGAGAACGACGUGAACCUGACCCACAUCGAGAGCCGCCCCAGCCGCCUGAAGAAGGACGAGUACGAGUUCUUCACCCACCUGGACAAGCGCAGCCUGCCCGCCCUGACCAACAUCAUCAAGAUCCUGCGCCACGACAUCGGCGCCACCGUGCACGAGCUGAGCCGCGACAAGAAGAAGGACACCGUGCCCUGGUUCCCCCGCACCAUCCAGGAGCUGGACCGCUUCGCCAACCAGAUCCUGAGCUACGGCGCCGAGCUGGACGCCGACCACCCCGGCUUCAAGGACCCCGUGUACCGCGCCCGCCGCAAGCAGUUCGCCGACAUCGCCUACAACUACCGCCACGGCCAGCCCAUCCCCCGCGUGGAGUACAUGGAGGAGGAGAAGAAGACCUGGGGCACCGUGUUCAAGACCCUGAAGAGCCUGUACAAGACCCACGCCUGCUACGAGUACAACCACAUCUUCCCCCUGCUGGAGAAGUACUGCGGCUUCCACGAGGACAACAUCCCCCAGCUGGAGGACGUGAGCCAGUUCCUGCAGACCUGCACCGGCUUCCGCCUGCGCCCCGUGGCCGGCCUGCUGAGCAGCCGCGACUUCCUGGGCGGCCUGGCCUUCCGCGUGUUCCACUGCACCCAGUACAUCCGCCACGGCAGCAAGCCCAUGUACACCCCCGAGCCCGACAUCUGCCACGAGCUGCUGGGCCACGUGCCCCUGUUCAGCGACCGCAGCUUCGCCCAGUUCAGCCAGGAGAUCGGCCUGGCCAGCCUGGGCGCCCCCGACGAGUACAUCGAGAAGCUGGCCACCAUCUACUGGUUCACCGUGGAGUUCGGCCUGUGCAAGCAGGGCGACAGCAUCAAGGCCUACGGCGCCGGCCUGCUGAGCAGCUUCGGCGAGCUGCAGUACUGCCUGAGCGAGAAGCCCAAGCUGCUGCCCCUGGAGCUGGAGAAGACCGCCAUCCAGAACUACACCGUGACCGAGUUCCAGCCCCUGUACUACGUGGCCGAGAGCUUCAACGACGCCAAGGAGAAGGUGCGCAACUUCGCCGCCACCAUCCCCCGCCCCUUCAGCGUGCGCUACGACCCCUACACCCAGCGCAUCGAGGUGCUGGACAACACCCAGCAGCUGAAGAUCCUGGCCGACAGCAUCAACAGCGAGAUCGGCAUCCUGUGCAGCGCCCUGCAGAAGAUCAAGUAACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
Figure BDA0001815864400001471
Figure BDA0001815864400001472
Figure BDA0001815864400001481
UCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAAUGAACUAGAAGACGUCCCGCGACGUGUCCUACGGCUAGAGCGACAACUACGACAGCCGGUCCUAGAAGUCGACGACCCACAACAGGUCGUGGAGCUACGCGACCCACAUCCCCAGCAUCGCGUGCGACUUCCCCGCCCCCUACCACCGCCGCUUCAACGCGUGGAAGAGGAACCGCAGCAACUUCGAGAGCCGGUGCAUCAUGUCCCCGACCUUGAGCCAGUGCCACAUCAAGACCUACCGCCAGAAGAGGUCGAGGUCCCCGUCGUCGAACCCGAAGAGCGAGUCCGUCAUGACGUCGAGCGGCUUCGACGAGUCGUCCGGCCGCGGCAUCCGGAACUACGACAGCGGGACGAACGUGUCCGGCUUGAGGUGCCACUUGGUCAUCUACCACCGGUCGAAGAGCUACAUGAGCAGCCCCCGCGGGUCCGACCGGUCCGGCUAGAGGACCGACUUGACCCGCUUCGACGCCAGCGACUUGUCCCCGUGCACCGGGUCGUCGAGCACCGUCUACAGCCCGAGCCCCCACAUGUACCCGAACGACGGCACCGCCUACAUGACCCACGUCACCUUGUGCGCCUUCCGGUCCGGCGGGUCCUUCAGCGCCGACGAGUCGUCCGGCCGGUGCCCCGCGUCCGCCUUCGGCCACGUCCAGACGUCCUUGACCGAGUGCAGGAGGUCGACCCCCUACAACAGGAGCACCUUCGGCGUCAUGAAGAGGUCGUCCCCCUUCUACACCAACAUGAGCAUCGUCCGCACCCAGAACAUGUCCGAGAAGUCCCAGAACUUGUGCCACGGGGUCCAGAAGAAGAGGAGGAGGUACAUGAGGUGCGCCCCCUACCCGACCGGCACCGCCAUCAACAUCCGCUACAGCCGCUUGACGAACGCCGCCCGCGCCAUGUGCCCCAGGAACUUCGGCCCCACCAGCCGCAGGUCGAGCCGCGGCAUCGAGUCCUAGACCAACCGCUUCGCCAGGUCGAGGACCUACCACGCCCCCUUGGUCCCGUGCCACAGGAAGAAGAACAGCGCCGAGUCGAGCACGUGCCACCGCGGCUACAGCACCGCGUCCUAGAACUACUACAACCAGUCCCGCCCGUCCGACGCGAACAGGUCCACCCACUUCUUGAGCAUGAGCAGGAAGAAGUCCGCCGACCCCGCCGAGAGCUACACCCAGUCCAAGUGCAGCAAGAGGAGCUUGUCCGCGUCGUGGAACCGGUCCCGCGGGUGGAGGAGGAAGUCCGACUUCUAGUCCGACUACCGCGGCAAGACCAACGUCAACAGGAGCUACAUCGACCAGAGGACCGGCUUCAGCGAGUCGAACGCCGGGUCCGGCCCCAAGAGGUCGUGCCGCCACGAGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(粗体碱基是OMeRNA)(SEQ ID NO:25)
MCNA-CFTR制备
通过将编码hCFTR蛋白的RNA的两个拷贝的3'末端夹板连接到单个寡核苷酸的5'末端来制备包含人囊性纤维化跨膜传导调节因子(hCFTR)RNA的MCNA-CFTR(SEQ ID NO:26)，所述单个寡核苷酸在序列内含有两个5'末端和连接的3'-3'磷酸二酯键。简言之，使用RNA聚合酶转录含有侧接编码hCFTR的RNA序列的5'非翻译区(UTR)和3’UTR的5’加帽的RNA，酶促加帽以含有5’帽1结构且纯化。然后使用T4RNA连接酶1+PEG 8K以及与3’UTR和寡核苷酸1互补的DNA寡核苷酸“夹板”(寡核苷酸2(夹板)(SEQ ID NO:9)；5'CCG AGA GTC GAG CTT GAT GCA ACTTAA TTT TAT TAG G 3'；所有碱基DNA)，将该hCFTR转录物一步连接到含有20个核苷酸(nt)回文序列的2'-羟甲基化RNA(OMeRNA)”桥”寡核苷酸，其中在第10个和第11个nt之间具有3'-3'磷酸二酯键(寡核苷酸1(桥)(SEQ ID NO:5)；
Figure BDA0001815864400001491
粗体碱基OMeRNA)。为了制备用于连接的样品，寡核苷酸1在含有50μM寡核苷酸1、1mM ATP、1X PNK缓冲液(NEB；70mM Tris-HCl、10mM MgCl2、5mM DTT pH 7.6，在25℃下)和0.5U/μLT4多核苷酸激酶(NEB)的反应中在37℃下5'末端磷酸化1小时。然后使用Sephadex G-25脱盐柱(Princeton Separations)，将磷酸化的寡核苷酸1(桥)脱盐，并且通过加热至75℃共5分钟，随后经过5分钟逐渐冷却至室温，在含有0.92μM加帽的hCFTR转录物、0.42μM寡核苷酸1和0.92μM寡核苷酸2的反应中，与转录物和夹板杂交。随后制备RNA连接反应，以包含50％稀释的杂交反应和1X RNA连接酶缓冲液(NEB；50mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT pH7.5，在25℃下)、1mM ATP、10％PEG和0.33U/μL T4RNA连接酶1。各自在37℃下反应60分钟。然后使完成的连接反应与DNA酶I反应，随后使用RNeasy Maxi Kit(Qiagen)纯化。使用TBE/琼脂糖凝胶电泳评估反应产物的连接效率。将分离的MCNA-CFTR产物用Lipofectamine平衡，并且转染到贴壁HEK293细胞内。然后使用CFTR特异性蛋白质印迹测定未分级的细胞裂解产物的CFTR蛋白表达(图12)。
MCNA-CFTR
5'-
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGCAACGCUCUCCUCUUGAAAAGGCCUCGGUGGUGUCCAAGCUCUUCUUCUCGUGGACUAGACCCAUCCUGAGAAAGGGGUACAGACAGCGCUUGGAGCUGUCCGAUAUCUAUCAAAUCCCUUCCGUGGACUCCGCGGACAACCUGUCCGAGAAGCUCGAGAGAGAAUGGGACAGAGAACUCGCCUCAAAGAAGAACCCGAAGCUGAUUAAUGCGCUUAGGCGGUGCUUUUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGCAUCUUCCUCUACCUGGGAGAGGUCACCAAGGCCGUGCAGCCCCUGUUGCUGGGACGGAUUAUUGCCUCCUACGACCCCGACAACAAGGAAGAAAGAAGCAUCGCUAUCUACUUGGGCAUCGGUCUGUGCCUGCUUUUCAUCGUCCGGACCCUCUUGUUGCAUCCUGCUAUUUUCGGCCUGCAUCACAUUGGCAUGCAGAUGAGAAUUGCCAUGUUUUCCCUGAUCUACAAGAAAACUCUGAAGCUCUCGAGCCGCGUGCUUGACAAGAUUUCCAUCGGCCAGCUCGUGUCCCUGCUCUCCAACAAUCUGAACAAGUUCGACGAGGGCCUCGCCCUGGCCCACUUCGUGUGGAUCGCCCCUCUGCAAGUGGCGCUUCUGAUGGGCCUGAUCUGGGAGCUGCUGCAAGCCUCGGCAUUCUGUGGGCUUGGAUUCCUGAUCGUGCUGGCACUGUUCCAGGCCGGACUGGGGCGGAUGAUGAUGAAGUACAGGGACCAGAGAGCCGGAAAGAUUUCCGAACGGCUGGUGAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCAGUGAAGGCCUACUGCUGGGAAGAGGCCAUGGAAAAGAUGAUUGAAAACCUCCGGCAAACCGAGCUGAAGCUGACCCGCAAGGCCGCUUACGUGCGCUAUUUCAACUCGUCCGCUUUCUUCUUCUCCGGGUUCUUCGUGGUGUUUCUCUCCGUGCUCCCCUACGCCCUGAUUAAGGGAAUCAUCCUCAGGAAGAUCUUCACCACCAUUUCCUUCUGUAUCGUGCUCCGCAUGGCCGUGACCCGGCAGUUCCCAUGGGCCGUGCAGACUUGGUACGACUCCCUGGGAGCCAUUAACAAGAUCCAGGACUUCCUUCAAAAGCAGGAGUACAAGACCCUCGAGUACAACCUGACUACUACCGAGGUCGUGAUGGAAAACGUCACCGCCUUUUGGGAGGAGGGAUUUGGCGAACUGUUCGAGAAGGCCAAGCAGAACAACAACAACCGCAAGACCUCGAACGGUGACGACUCCCUCUUCUUUUCAAACUUCAGCCUGCUCGGGACGCCCGUGCUGAAGGACAUUAACUUCAAGAUCGAAAGAGGACAGCUCCUGGCGGUGGCCGGAUCGACCGGAGCCGGAAAGACUUCCCUGCUGAUGGUGAUCAUGGGAGAGCUUGAACCUAGCGAGGGAAAGAUCAAGCACUCCGGCCGCAUCAGCUUCUGUAGCCAGUUUUCCUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAGGAAAACAUCAUCUUCGGCGUGUCCUACGAUGAAUACCGCUACCGGUCCGUGAUCAAAGCCUGCCAGCUGGAAGAGGAUAUUUCAAAGUUCGCGGAGAAAGAUAACAUCGUGCUGGGCGAAGGGGGUAUUACCUUGUCGGGGGGCCAGCGGGCUAGAAUCUCGCUGGCCAGAGCCGUGUAUAAGGACGCCGACCUGUAUCUCCUGGACUCCCCCUUCGGAUACCUGGACGUCCUGACCGAAAAGGAGAUCUUCGAAUCGUGCGUGUGCAAGCUGAUGGCUAACAAGACUCGCAUCCUCGUGACCUCCAAAAUGGAGCACCUGAAGAAGGCAGACAAGAUUCUGAUUCUGCAUGAGGGGUCCUCCUACUUUUACGGCACCUUCUCGGAGUUGCAGAACUUGCAGCCCGACUUCUCAUCGAAGCUGAUGGGUUGCGACAGCUUCGACCAGUUCUCCGCCGAAAGAAGGAACUCGAUCCUGACGGAAACCUUGCACCGCUUCUCUUUGGAAGGCGACGCCCCUGUGUCAUGGACCGAGACUAAGAAGCAGAGCUUCAAGCAGACCGGGGAAUUCGGCGAAAAGAGGAAGAACAGCAUCUUGAACCCCAUUAACUCCAUCCGCAAGUUCUCAAUCGUGCAAAAGACGCCACUGCAGAUGAACGGCAUUGAGGAGGACUCCGACGAACCCCUUGAGAGGCGCCUGUCCCUGGUGCCGGACAGCGAGCAGGGAGAAGCCAUCCUGCCUCGGAUUUCCGUGAUCUCCACUGGUCCGACGCUCCAAGCCCGGCGGCGGCAGUCCGUGCUGAACCUGAUGACCCACAGCGUGAACCAGGGCCAAAACAUUCACCGCAAGACUACCGCAUCCACCCGGAAAGUGUCCCUGGCACCUCAAGCGAAUCUUACCGAGCUCGACAUCUACUCCCGGAGACUGUCGCAGGAAACCGGGCUCGAAAUUUCCGAAGAAAUCAACGAGGAGGAUCUGAAAGAGUGCUUCUUCGACGAUAUGGAGUCGAUACCCGCCGUGACGACUUGGAACACUUAUCUGCGGUACAUCACUGUGCACAAGUCAUUGAUCUUCGUGCUGAUUUGGUGCCUGGUGAUUUUCCUGGCCGAGGUCGCGGCCUCACUGGUGGUGCUCUGGCUGUUGGGAAACACGCCUCUGCAAGACAAGGGAAACUCCACGCACUCGAGAAACAACAGCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCCACCUCCUCUUAUUACGUGUUCUACAUCUACGUCGGAGUGGCGGAUACCCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCAGAGGACUGCCGCUGGUCCACACCUUGAUCACCGUCAGCAAGAUUCUUCACCACAAGAUGUUGCAUAGCGUGCUGCAGGCCCCCAUGUCCACCCUCAACACUCUGAAGGCCGGAGGCAUUCUGAACAGAUUCUCCAAGGACAUCGCUAUCCUGGACGAUCUCCUGCCGCUUACCAUCUUUGACUUCAUCCAGCUGCUGCUGAUCGUGAUUGGAGCAAUCGCAGUGGUGGCGGUGCUGCAGCCUUACAUUUUCGUGGCCACUGUGCCGGUCAUUGUGGCGUUCAUCAUGCUGCGGGCCUACUUCCUCCAAACCAGCCAGCAGCUGAAGCAACUGGAAUCCGAGGGACGAUCCCCCAUCUUCACUCACCUUGUGACGUCGUUGAAGGGACUGUGGACCCUCCGGGCUUUCGGACGGCAGCCCUACUUCGAAACCCUCUUCCACAAGGCCCUGAACCUCCACACCGCCAAUUGGUUCCUGUACCUGUCCACCCUGCGGUGGUUCCAGAUGCGCAUCGAGAUGAUUUUCGUCAUCUUCUUCAUCGCGGUCACAUUCAUCAGCAUCCUGACUACCGGAGAGGGAGAGGGACGGGUCGGAAUAAUCCUGACCCUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACCCUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUCGACGUGGACAGCCUGAUGCGAAGCGUCAGCCGCGUGUUCAAGUUCAUCGACAUGCCUACUGAGGGAAAACCCACUAAGUCCACUAAGCCCUACAAAAAUGGCCAGCUGAGCAAGGUCAUGAUCAUCGAAAACUCCCACGUGAAGAAGGACGAUAUUUGGCCCUCCGGAGGUCAAAUGACCGUGAAGGACCUGACCGCAAAGUACACCGAGGGAGGAAACGCCAUUCUCGAAAACAUCAGCUUCUCCAUUUCGCCGGGACAGCGGGUCGGCCUUCUCGGGCGGACCGGUUCCGGGAAGUCAACUCUGCUGUCGGCUUUCCUCCGGCUGCUGAAUACCGAGGGGGAAAUCCAAAUUGACGGCGUGUCUUGGGAUUCCAUUACUCUGCAGCAGUGGCGGAAGGCCUUCGGCGUGAUCCCCCAGAAGGUGUUCAUCUUCUCGGGUACCUUCCGGAAGAACCUGGAUCCUUACGAGCAGUGGAGCGACCAAGAAAUCUGGAAGGUCGCCGACGAGGUCGGCCUGCGCUCCGUGAUUGAACAAUUUCCUGGAAAGCUGGACUUCGUGCUCGUCGACGGGGGAUGUGUCCUGUCGCACGGACAUAAGCAGCUCAUGUGCCUCGCACGGUCCGUGCUCUCCAAGGCCAAGAUUCUGCUGCUGGACGAACCUUCGGCCCACCUGGAUCCGGUCACCUACCAGAUCAUCAGGAGGACCCUGAAGCAGGCCUUUGCCGAUUGCACCGUGAUUCUCUGCGAGCACCGCAUCGAGGCCAUGCUGGAGUGCCAGCAGUUCCUGGUCAUCGAGGAGAACAAGGUCCGCCAAUACGACUCCAUUCAAAAGCUCCUCAACGAGCGGUCGCUGUUCAGACAAGCUAUUUCACCGUCCGAUAGAGUGAAGCUCUUCCCGCAUCGGAACAGCUCAAAGUGCAAAUCGAAGCCGCAGAUCGCAGCCUUGAAGGAAGAGACUGAGGAAGAGGUGCAGGACACCCGGCUUUAACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
Figure BDA0001815864400001521
Figure BDA0001815864400001522
Figure BDA0001815864400001523
UCGAACUACGUUGAAUUAAAAUAAUCCUGUUCCGACCACCCGUGACCUCACCGUUGAAGGUCCCGGUCCUCUCCGUGACCCCUCCCCAGUGUCCCUACGGUGGGCAAUUUCGGCCCACAGGACGUGGAGAAGGAGUCAGAGAAGGAAGUUCCGACGCUAGACGCCGAAGCUAAACGUGAAACUCGACAAGGCUACGCCCUUCUCGAAGUGAGAUAGCCUGCCACUUUAUCGAACAGACUUGUCGCUGGCGAGCAACUCCUCGAAAACUUACCUCAGCAUAACCGCCUGGAACAAGAGGAGCUACUGGUCCUUGACGACCGUGAGGUCGUACCGGAGCUACGCCACGAGCGUCUCUUAGUGCCACGUUAGCCGUUUCCGGACGAAGUCCCAGGAGGACUACUAGACCAUCCACUGGCCUAGGUCCACCCGGCUUCCAAGCAGGUCGUCGUCUUAGAACCGGAACCUCUCGUGCCUGGCACGCUCCGUGUACUCGACGAAUACAGGCACGCUGUCCUGUGUAGGGGGCAGCUGCUCGUGCUUCAGGUCGAAAGGUCCUUUAACAAGUUAGUGCCUCGCGUCCGGCUGGAGCAGCCGCUGGAAGGUCUAAAGAACCAGCGAGGUGACGAGCAUUCCUAGGUCCAAGAAGGCCUUCCAUGGGCUCUUCUACUUGUGGAAGACCCCCUAGUGCGGCUUCCGGAAGGCGGUGACGACGUCUCAUUACCUUAGGGUUCUGUGCGGCAGUUAAACCUAAAGGGGGAGCCAUAAGUCGUCGGCCUCCUUUCGGCUGUCGUCUCAACUGAAGGGCCUUGGCCAGGCGGGCUCUUCCGGCUGGGCGACAGGGCCGCUUUACCUCUUCGACUACAAAAGCUCUUACCGCAAAGGAGGGAGCCACAUGAAACGCCAGUCCAGGAAGUGCCAGUAAACUGGAGGCCUCCCGGUUUAUAGCAGGAAGAAGUGCACCCUCAAAAGCUACUAGUACUGGAACGAGUCGACCGGUAAAAACAUCCCGAAUCACCUGAAUCACCCAAAAGGGAGUCAUCCGUACAGCUACUUGAACUUGUGCGCCGACUGCGAAGCGUAGUCCGACAGGUGCAGCUAGCUCGACAAGUGACGGGUGACGUCCCACGAGUAUUACAAGUACCGCUCCCAGUCCUAAUAAGGCUGGGCAGGGAGAGGGAGAGGCCAUCAGUCCUACGACUACUUACACUGGCGCUACUUCUUCUACUGCUUUUAGUAGAGCUACGCGUAGACCUUGGUGGCGUCCCACCUGUCCAUGUCCUUGGUUAACCGCCACACCUCCAAGUCCCGGAACACCUUCUCCCAAAGCUUCAUCCCGACGGCAGGCUUUCGGGCCUCCCAGGUGUCAGGGAAGUUGCUGCAGUGUUCCACUCACUUCUACCCCCUAGCAGGGAGCCUAAGGUCAACGAAGUCGACGACCGACCAAACCUCCUUCAUCCGGGCGUCGUACUACUUGCGGUGUUACUGGCCGUGUCACCGGUGCUUUUACAUUCCGACGUCGUGGCGGUGGUGACGCUAACGAGGUUAGUGCUAGUCGUCGUCGACCUACUUCAGUUUCUACCAUUCGCCGUCCUCUAGCAGGUCCUAUCGCUACAGGAACCUCUUAGACAAGUCUUACGGAGGCCGGAAGUCUCACAACUCCCACCUGUACCCCCGGACGUCGUGCGAUACGUUGUAGAACACCACUUCUUAGAACGACUGCCACUAGUUCCACACCUGGUCGCCGUCAGGAGACUUCUUUGGGUAGCGCUCGUCCCAUAGGCGGUGAGGCUGCAUCUACAUCUUGUGCAUUAUUCUCCUCCACCUUCACUAUUAGUGCCGUAUCGACAACAAAGAGCUCACGCACCUCAAAGGGAACAGAACGUCUCCGCACAAAGGGUUGUCGGUCUCGUGGUGGUCACUCCGGCGCUGGAGCCGGUCCUUUUAGUGGUCCGUGGUUUAGUCGUGCUUCUAGUUACUGAACACGUGUCACUACAUGGCGUCUAUUCACAAGGUUCAGCAGUGCCGCCCAUAGCUGAGGUAUAGCAGCUUCUUCGUGAGAAAGUCUAGGAGGAGCAACUAAAGAAGCCUUUAAAGCUCGGGCCAAAGGACGCUGUCAGAGGCCCUCAUCUACAGCUCGAGCCAUUCUAAGCGAACUCCACGGUCCCUGUGAAAGGCCCACCUACGCCAUCAGAACGCCACUUACAAAACCGGGACCAAGUGCGACACCCAGUAGUCCAAGUCGUGCCUGACGGCGGCGGCCCGAACCUCGCAGCCUGGUCACCUCUAGUGCCUUUAGGCUCCGUCCUACCGAAGAGGGACGAGCGACAGGCCGUGGUCCCUGUCCGCGGAGAGUUCCCCAAGCAGCCUCAGGAGGAGUUACGGCAAGUAGACGUCACCGCAGAAAACGUGCUAACUCUUGAACGCCUACCUCAAUUACCCCAAGUUCUACGACAAGAAGGAGAAAAGCGGCUUAAGGGGCCAGACGAACUUCGAGACGAAGAAUCAGAGCCAGGUACUGUGUCCCCGCAGCGGAAGGUUUCUCUUCGCCACGUUCCAAAGGCAGUCCUAGCUCAAGGAAGAAAGCCGCCUCUUGACCAGCUUCGACAGCGUUGGGUAGUCGAAGCUACUCUUCAGCCCGACGUUCAAGACGUUGAGGCUCUUCCACGGCAUUUUCAUCCUCCUGGGGAGUACGUCUUAGUCUUAGAACAGACGGAAGAAGUCCACGAGGUAAAACCUCCAGUGCUCCUACGCUCAGAACAAUCGGUAGUCGAACGUGUGCGUGCUAAGCUUCUAGAGGAAAAGCCAGUCCUGCAGGUCCAUAGGCUUCCCCCUCAGGUCCUCUAUGUCCAGCCGCAGGAAUAUGUGCCGAGACCGGUCGCUCUAAGAUCGGGCGACCGGGGGGCUGUUCCAUUAUGGGGGAAGCGGGUCGUGCUACAAUAGAAAGAGGCGCUUGAAACUUUAUAGGAGAAGGUCGACCGUCCGAAACUAGUGCCUGGCCAUCGCCAUAAGUAGCAUCCUGUGCGGCUUCUACUACAAAAGGAAUUACCAAGGCCCGUACUAGGUCCUUUUGACCGAUGUCUUCGACUACGCCGGCCUCACGAACUAGAAAGGGAGCGAUCCAAGUUCGAGAGGGUACUAGUGGUAGUCGUCCCUUCAGAAAGGCCGAGGCCAGCUAGGCCGGUGGCGGUCCUCGACAGGAGAAAGCUAGAACUUCAAUUACAGGAAGUCGUGCCCGCAGGGCUCGUCCGACUUCAAACUUUUCUUCUCCCUCAGCAGUGGCAAGCUCCAGAACGCCAACAACAACAAGACGAACCGGAAGAGCUUGUCAAGCGGUUUAGGGAGGAGGGUUUUCCGCCACUGCAAAAGGUAGUGCUGGAGCCAUCAUCAGUCCAACAUGAGCUCCCAGAACAUGAGGACGAAAACUUCCUUCAGGACCUAGAACAAUUACCGAGGGUCCCUCAGCAUGGUUCAGACGUGCCGGGUACCCUUGACGGCCCAGUGCCGGUACGCCUCGUGCUAUGUCUUCCUUUACCACCACUUCUAGAAGGACUCCUACUAAGGGAAUUAGUCCCGCAUCCCCUCGUGCCUCUCUUUGUGGUGCUUCUUGGGCCUCUUCUUCUUUCGCCUGCUCAACUUUAUCGCGUGCAUUCGCCGGAACGCCCAGUCGAAGUCGAGCCAAACGGCCUCCAAAAGUUAGUAGAAAAGGUACCGGAGAAGGGUCGUCAUCCGGAAGUGACUGACCUACAAAAGCUAGUAAAGGCUUCACUAGUGGUCGGCAAGCCUUUAGAAAGGCCGAGAGACCAGGGACAUGAAGUAGUAGUAGGCGGGGUCAGGCCGGACCUUGUCACGGUCGUGCUAGUCCUUAGGUUCGGGUGUCUUACGGCUCCGAACGUCGUCGAGGGUCUAGUCCGGGUAGUCUUCGCGGUGAACGUCUCCCCGCUAGGUGUGCUUCACCCGGUCCCGCUCCGGGAGCAGCUUGAACAAGUCUAACAACCUCUCGUCCCUGUGCUCGACCGGCUACCUUUAGAACAGUUCGUGCGCCGAGCUCUCGAAGUCUCAAAAGAACAUCUAGUCCCUUUUGUACCGUUAAGAGUAGACGUACGGUUACACUACGUCCGGCUUUUAUCGUCCUACGUUGUUCUCCCAGGCCUGCUACUUUUCGUCCGUGUCUGGCUACGGGUUCAUCUAUCGCUACGAAGAAAGAAGGAACAACAGCCCCAGCAUCCUCCGUUAUUAGGCAGGGUCGUUGUCCCCGACGUGCCGGAACCACUGGAGAGGGUCCAUCUCCUUCUACGGCAUCUUGUACUUGGCGGUCUUUUUCGUGGCGGAUUCGCGUAAUUAGUCGAAGCCCAAGAAGAAACUCCGCUCAAGAGACAGGGUAAGAGAGAGCUCGAAGAGCCUGUCCAACAGGCGCCUCAGGUGCCUUCCCUAAACUAUCUAUAGCCUGUCGAGGUUCGCGACAGACAUGGGGAAAGAGUCCUACCCAGAUCAGGUGCUCUUCUUCUCGAACCUGUGGUGGCUCCGGAAAAGUUCUCCUCUCGCAACGUAGCACAGUUCCUGCCACUCAGUGAGAACCGUGCCCCUUAGGCGCAAGGUUACGUGGCAAGGGCCGGCGCCUCCGACCUAGCCAGGGCCACAGAAGAUACCUCCAGUUUUGUCGCACCUACCGCAGAGGUCCGCUAGACAGG-5'(粗体碱基是OMeRNA)(SEQ ID NO:26)
实例2.使用MCNA的示例性蛋白质生产
该实例证实了由mRNA编码的蛋白质的产生，所述mRNA通过其3'末端与桥接寡核苷酸连接。
包含人促红细胞生成素(hEPO)mRNA的MCNA如上所述合成，并且用于转染HEK293T细胞(每个样品1微克RNA转染)。图7显示了当用a)编码缺乏多聚A尾的hEPO的mRNA、b)包含hEPO mRNA的MCNA、或c)已用DNA酶处理的包含hEPO mRNA的MCNA转染细胞时，比较来自HEK293T细胞的分泌的hEPO蛋白的量的实验结果。与无尾的hEPO mRNA相比，当用包含hEPOmRNA的MCNA或包含hEPO mRNA的DNA酶处理的MCNA转染细胞时，实现了蛋白质生产中的明显增加。
图9显示了当用a)编码缺乏多聚A尾的hEPO的mRNA、b)包含具有未反应/部分反应的EPO RNA的hEPO mRNA的MCNA的未纯化混合物、c)纯化的未反应/部分反应的EPO RNA、或d)纯化的EPO MCNA转染细胞时，比较来自HEK293T细胞的分泌的hEPO蛋白的量的实验结果。用总共250纳克RNA转染所有样品。与混合物或未反应的hEPO RNA相比，当用纯化的EPOMCNA转染细胞时，实现了蛋白质生产中的明显增加。图10显示了当用a)编码缺少多聚A尾的hOTC的mRNA(hOTC单体)、或b)包含hOTC mRNA的MCNA转染细胞时，比较HEK293T细胞内的人OTC蛋白活性(如通过瓜氨酸产生测量的)的量的实验结果。与hOTC单体相比，仅当用包含hOTC的MCNA转染细胞时，才能实现可检测的蛋白质生产。
图11显示了当用a)编码缺乏多聚A尾的hPAH的mRNA(hPAH单体)、或b)包含hPAHmRNA的MCNA转染细胞时，比较HEK293T细胞内产生的人PAH蛋白的量的实验结果。与hPAH单体相比，当用包含hPAH的MCNA转染细胞时，实现了显著更高的蛋白质生产。
图12显示了当用a)编码缺乏多聚A尾的hCFTR的mRNA(hCFTR单体)、或b)包含hCFTRmRNA的MCNA转染细胞时，比较HEK293T细胞内产生的人CFTR蛋白的量的实验结果。与hCFTR单体相比，仅当用包含hCFTR的MCNA转染细胞时，才能实现可检测的蛋白质生产。
实例3.使用MCNA的示例性体内蛋白质生产
该实例证实了由mRNA编码的蛋白质的体内产生，所述mRNA通过其3'末端与桥接寡核苷酸连接。
如上所述合成包含人鸟氨酸转氨甲酰酶(hOTC)mRNA的MCNA。用包封在脂质纳米颗粒中的hOTC MCNA静脉内处理spfash小鼠。处死动物并且在施用后24小时或7天分离其肝脏。在肝脏样品中测量瓜氨酸产生，并且发现施用后7天的hOTC蛋白活性水平与施用后24小时的hOTC蛋白活性水平可比较(图13)。在两个时间点，hOTC蛋白活性显著大于对照spfash小鼠的肝脏中。此外，在施用后1天和8天两者时，经由蛋白质印迹检测到显著的hOTC蛋白，但仅对于用hOTC MCNA LNP处理的spfash小鼠，而不是用hOTC单体LNP处理的小鼠(图14)，与观察到的活动数据一致。相比之下，当用hOTC mRNA静脉内处理spfash小鼠时，hOTC蛋白活性的水平在施用后24小时高于它们在施用后7天(图15)。如图16中明确显示的，当施用后7天的hOTC蛋白活性计算为24小时后的活性水平的百分比，对于hOTC MCNA(24小时活性的109％)观察到比hOTC mRNA(24小时活性的38％)更持久的体内活性。
在另一项研究中，如上所述合成包含人苯丙氨酸羟化酶(hPAH)的MCNA。用包封在脂质纳米颗粒中的hPAH MCNA或hPAH单体(具有5'帽但不含多聚A尾的hPAH mRNA)静脉内处理PAH敲除(KO)小鼠。处死动物并且在施用后24小时分离其肝脏。在用hPAH MCNA处理的小鼠的肝脏中检测到的hPAH蛋白质比在用hPAH单体处理的小鼠的肝脏中检测到的多27倍(图17)。
此外，在用hPAH MCNA LNP处理PAH敲除(KO)小鼠后，实现了功效的证实。具体地，用hPAH MCNA处理后24小时血清苯丙氨酸水平显著减少，而用hPAH单体LNP处理后24小时不可见血清苯丙氨酸中的减少(图18)。
在另一项研究中，如上所述合成包含人促红细胞生成素(hEPO)的MCNA。用包封在脂质纳米颗粒中的hEPO MCNA或hEPO单体(具有5'帽但不含多聚A尾的hEPO mRNA)静脉内处理野生型小鼠。施用后24小时获得来自动物的血清样品。在用hEPO MCNA处理的小鼠的血清中检测到的hEPO蛋白比在用hEPO单体处理的小鼠的血清中检测到的多480倍(图19)。
在另一项研究中，如上所述合成包含人囊性纤维化跨膜传导调节因子(hCFTR)的MCNA。经由包封在脂质纳米颗粒中的hCFTR MCNA的雾化来处理CFTR KO小鼠。处死动物并且在施用后24小时或7天分离其肺。如图20所示，在施用后24小时和7天(棕色染色)两者中，在支气管上皮气道(顶行)以及肺泡区域(底行)两者中检测到MCNA衍生的hCFTR蛋白。
等价方案
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等价物。本发明的范围并不限于上文说明书，而是如下述权利要求中所述：
序列表
<110> 川斯勒佰尔公司
<120> 多聚体编码核酸及其用途
<130> MRT-1237WO
<150> 62/320,073
<151> 2016-04-08
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 827
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 1
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180
ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240
gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300
cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360
auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420
uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480
cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540
cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600
cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660
auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720
gacggguggc aucccuguga ccccucccca gugccucucc uggcccugga aguugccacu 780
ccagugccca ccagccuugu ccuaauaaaa uuaaguugca ucaagcu 827
<210> 2
<211> 1027
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 2
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180
ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240
gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300
cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360
auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420
uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480
cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540
cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600
cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660
auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720
gacggguggc aucccuguga ccccucccca gugccucucc uggcccugga aguugccacu 780
ccagugccca ccagccuugu ccuaauaaaa uuaaguugca ucaagcuaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaa 1027
<210> 3
<211> 891
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 3
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180
ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240
gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300
cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360
auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420
uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480
cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540
cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600
cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660
auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720
gacggguggc aucccuguga ccccucccca gugccucucc uggcccugga aguugccacu 780
ccagugccca ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaagcc uuguccuaau aaaauuaagu ugcaucaagc u 891
<210> 4
<211> 883
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 4
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180
ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240
gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300
cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360
auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420
uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480
cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540
cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600
cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660
auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720
gacggguggc aaaaaaaaaa aaaaaucccu gugaccccuc cccaaaaaaa aaaaaaaaag 780
ugccucuccu ggcccuggaa aaaaaaaaaa aaaguugcca cuccagugcc caccaaaaaa 840
aaaaaaaaag ccuuguccua auaaaauuaa guugcaucaa gcu 883
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> MISC_特征
<222> (10)..(11)
<223> 在位置10和11处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 5
cgacucucgg ggcucucagc 20
<210> 6
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> MISC_特征
<222> (10)..(11)
<223> 在位置10和11处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 6
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20
<210> 7
<211> 6
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> MISC_特征
<222> (3)..(4)
<223> 在位置3和4处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 7
aaaaaa 6
<210> 8
<211> 2
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)..(2)
<223> 在位置1和2处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 8
aa 2
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 9
ccgagagtcg agcttgatgc aacttaattt tattagg 37
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 10
ccgagagtga tgcaacttaa ttttattagg 30
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 11
tttttttttt agcttgatgc aacttaattt tattagg 37
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<400> 12
ccgagagtcg tttttttttt tttttttttt 30
<210> 13
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (37)..(38)
<223> 在位置37和38处的核苷酸之间的5'-5'桥包含PO4
<400> 13
ggattatttt aattcaacgt agttcgagct gagagccccg agagtcgagc ttgatgcaac 60
ttaattttat tagg 74
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (30)..(31)
<223> 在位置30和31处的核苷酸之间的5'-5'桥包含PO4
<400> 14
ggattatttt aattcaacgt agtgagagcc ccgagagtga tgcaacttaa ttttattagg 60
<210> 15
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (37)..(38)
<223> 在位置37和38处的核苷酸之间的5'-5'桥包含PO4
<400> 15
ggattatttt aattcaacgt agttcgattt tttttttttt tttttttagc ttgatgcaac 60
ttaattttat tagg 74
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (30)..(31)
<223> 在位置30和31处的核苷酸之间的5'-5'桥包含PO4
<400> 16
tttttttttt tttttttttt gctgagagcc ccgagagtcg tttttttttt tttttttttt 60
<210> 17
<211> 1674
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (837)..(838)
<223> 在位置837和838处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 17
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180
ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240
gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300
cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360
auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420
uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480
cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540
cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600
cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660
auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720
gacggguggc aucccuguga ccccucccca gugccucucc uggcccugga aguugccacu 780
ccagugccca ccagccuugu ccuaauaaaa uuaaguugca ucaagcucga cucucggggc 840
ucucagcucg aacuacguug aauuaaaaua auccuguucc gaccacccgu gaccucaccg 900
uugaaggucc cgguccucuc cgugaccccu ccccaguguc ccuacggugg gcaguagaca 960
ggggacagga cguccggagg ggacacaugu cgaagucgaa aggggccucc uuuaaccuca 1020
ucugagccuu cucaaacgcc uuucacaguc gucacuaaca agccucaccu cgucgacucc 1080
ggcguagacc uccccucuac cgaaggaaga cccgaggguc ucgggcuucg ucucaccacu 1140
ccgacgcuuc cggugacugc cgaaauaggu guacgucgac guccccgagg gugccgaccc 1200
uucucaacug guugucccgg accggggcgu ccugucgaag gcugucgucc cgguccggga 1260
cggucugaag augccggacg acgggcugga gguaggagaa gguccguauc uuuaauugaa 1320
accacagacc cugucacuau aagaguaagu ucgacgucac aagucguguc gggcagcacu 1380
auaagagccg gaggaaccgg agguucucca uggagagguc cugagccgac agugucuacu 1440
ccgcaccacc ccgcgggucc ugacccuccg ggucucccuc gcugucgucc cuguccucuu 1500
cggugucggu ccguccugua agcacguggg gguagcacag uuccugccac ucagugagaa 1560
ccgugccccu uaggcgcaag guuacguggc aagggccggc gccuccgacc uagccagggc 1620
cacagaagau accuccaguu uugucgcacc uaccgcagag guccgcuaga cagg 1674
<210> 18
<211> 1674
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (837)..(838)
<223> 在位置837和838处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 18
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180
ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240
gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300
cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360
auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420
uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480
cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540
cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600
cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660
auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720
gacggguggc aucccuguga ccccucccca gugccucucc uggcccugga aguugccacu 780
ccagugccca ccagccuugu ccuaauaaaa uuaaguugca ucaagcuaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaucg aacuacguug aauuaaaaua auccuguucc gaccacccgu gaccucaccg 900
uugaaggucc cgguccucuc cgugaccccu ccccaguguc ccuacggugg gcaguagaca 960
ggggacagga cguccggagg ggacacaugu cgaagucgaa aggggccucc uuuaaccuca 1020
ucugagccuu cucaaacgcc uuucacaguc gucacuaaca agccucaccu cgucgacucc 1080
ggcguagacc uccccucuac cgaaggaaga cccgaggguc ucgggcuucg ucucaccacu 1140
ccgacgcuuc cggugacugc cgaaauaggu guacgucgac guccccgagg gugccgaccc 1200
uucucaacug guugucccgg accggggcgu ccugucgaag gcugucgucc cgguccggga 1260
cggucugaag augccggacg acgggcugga gguaggagaa gguccguauc uuuaauugaa 1320
accacagacc cugucacuau aagaguaagu ucgacgucac aagucguguc gggcagcacu 1380
auaagagccg gaggaaccgg agguucucca uggagagguc cugagccgac agugucuacu 1440
ccgcaccacc ccgcgggucc ugacccuccg ggucucccuc gcugucgucc cuguccucuu 1500
cggugucggu ccguccugua agcacguggg gguagcacag uuccugccac ucagugagaa 1560
ccgugccccu uaggcgcaag guuacguggc aagggccggc gccuccgacc uagccagggc 1620
cacagaagau accuccaguu uugucgcacc uaccgcagag guccgcuaga cagg 1674
<210> 19
<211> 2074
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1037)..(1038)
<223> 在位置1037和1038处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 19
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180
ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240
gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300
cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360
auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420
uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480
cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540
cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600
cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660
auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720
gacggguggc aucccuguga ccccucccca gugccucucc uggcccugga aguugccacu 780
ccagugccca ccagccuugu ccuaauaaaa uuaaguugca ucaagcuaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaacga cucucggggc ucucagcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaucg aacuacguug 1260
aauuaaaaua auccuguucc gaccacccgu gaccucaccg uugaaggucc cgguccucuc 1320
cgugaccccu ccccaguguc ccuacggugg gcaguagaca ggggacagga cguccggagg 1380
ggacacaugu cgaagucgaa aggggccucc uuuaaccuca ucugagccuu cucaaacgcc 1440
uuucacaguc gucacuaaca agccucaccu cgucgacucc ggcguagacc uccccucuac 1500
cgaaggaaga cccgaggguc ucgggcuucg ucucaccacu ccgacgcuuc cggugacugc 1560
cgaaauaggu guacgucgac guccccgagg gugccgaccc uucucaacug guugucccgg 1620
accggggcgu ccugucgaag gcugucgucc cgguccggga cggucugaag augccggacg 1680
acgggcugga gguaggagaa gguccguauc uuuaauugaa accacagacc cugucacuau 1740
aagaguaagu ucgacgucac aagucguguc gggcagcacu auaagagccg gaggaaccgg 1800
agguucucca uggagagguc cugagccgac agugucuacu ccgcaccacc ccgcgggucc 1860
ugacccuccg ggucucccuc gcugucgucc cuguccucuu cggugucggu ccguccugua 1920
agcacguggg gguagcacag uuccugccac ucagugagaa ccgugccccu uaggcgcaag 1980
guuacguggc aagggccggc gccuccgacc uagccagggc cacagaagau accuccaguu 2040
uugucgcacc uaccgcagag guccgcuaga cagg 2074
<210> 20
<211> 2060
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1030)..(1031)
<223> 在位置1030和1031处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 20
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180
ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240
gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300
cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360
auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420
uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480
cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540
cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600
cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660
auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720
gacggguggc aucccuguga ccccucccca gugccucucc uggcccugga aguugccacu 780
ccagugccca ccagccuugu ccuaauaaaa uuaaguugca ucaagcuaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaucgaacu acguugaauu aaaauaaucc 1260
uguuccgacc acccgugacc ucaccguuga aggucccggu ccucuccgug accccucccc 1320
agugucccua cggugggcag uagacagggg acaggacguc cggaggggac acaugucgaa 1380
gucgaaaggg gccuccuuua accucaucug agccuucuca aacgccuuuc acagucguca 1440
cuaacaagcc ucaccucguc gacuccggcg uagaccuccc cucuaccgaa ggaagacccg 1500
agggucucgg gcuucgucuc accacuccga cgcuuccggu gacugccgaa auagguguac 1560
gucgacgucc ccgagggugc cgacccuucu caacugguug ucccggaccg gggcguccug 1620
ucgaaggcug ucgucccggu ccgggacggu cugaagaugc cggacgacgg gcuggaggua 1680
ggagaagguc cguaucuuua auugaaacca cagacccugu cacuauaaga guaaguucga 1740
cgucacaagu cgugucgggc agcacuauaa gagccggagg aaccggaggu ucuccaugga 1800
gagguccuga gccgacagug ucuacuccgc accaccccgc ggguccugac ccuccggguc 1860
ucccucgcug ucgucccugu ccucuucggu gucgguccgu ccuguaagca cgugggggua 1920
gcacaguucc ugccacucag ugagaaccgu gccccuuagg cgcaagguua cguggcaagg 1980
gccggcgccu ccgaccuagc cagggccaca gaagauaccu ccaguuuugu cgcaccuacc 2040
gcagaggucc gcuagacagg 2060
<210> 21
<211> 2056
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1028)..(1029)
<223> 在位置1028和1029处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 21
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180
ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240
gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300
cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360
auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420
uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480
cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540
cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600
cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660
auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720
gacggguggc aucccuguga ccccucccca gugccucucc uggcccugga aguugccacu 780
ccagugccca ccagccuugu ccuaauaaaa uuaaguugca ucaagcuaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaau cgaacuacgu ugaauuaaaa uaauccuguu 1260
ccgaccaccc gugaccucac cguugaaggu cccgguccuc uccgugaccc cuccccagug 1320
ucccuacggu gggcaguaga caggggacag gacguccgga ggggacacau gucgaagucg 1380
aaaggggccu ccuuuaaccu caucugagcc uucucaaacg ccuuucacag ucgucacuaa 1440
caagccucac cucgucgacu ccggcguaga ccuccccucu accgaaggaa gacccgaggg 1500
ucucgggcuu cgucucacca cuccgacgcu uccggugacu gccgaaauag guguacgucg 1560
acguccccga gggugccgac ccuucucaac ugguuguccc ggaccggggc guccugucga 1620
aggcugucgu cccgguccgg gacggucuga agaugccgga cgacgggcug gagguaggag 1680
aagguccgua ucuuuaauug aaaccacaga cccugucacu auaagaguaa guucgacguc 1740
acaagucgug ucgggcagca cuauaagagc cggaggaacc ggagguucuc cauggagagg 1800
uccugagccg acagugucua cuccgcacca ccccgcgggu ccugacccuc cgggucuccc 1860
ucgcugucgu cccuguccuc uucggugucg guccguccug uaagcacgug gggguagcac 1920
aguuccugcc acucagugag aaccgugccc cuuaggcgca agguuacgug gcaagggccg 1980
gcgccuccga ccuagccagg gccacagaag auaccuccag uuuugucgca ccuaccgcag 2040
agguccgcua gacagg 2056
<210> 22
<211> 1802
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (901)..(902)
<223> 在位置901和902处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 22
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180
ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240
gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300
cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360
auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420
uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480
cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540
cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600
cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660
auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720
gacggguggc aucccuguga ccccucccca gugccucucc uggcccugga aguugccacu 780
ccagugccca ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaagcc uuguccuaau aaaauuaagu ugcaucaagc ucgacucucg 900
gggcucucag cucgaacuac guugaauuaa aauaauccug uuccgaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ccacccguga 1020
ccucaccguu gaaggucccg guccucuccg ugaccccucc ccaguguccc uacggugggc 1080
aguagacagg ggacaggacg uccggagggg acacaugucg aagucgaaag gggccuccuu 1140
uaaccucauc ugagccuucu caaacgccuu ucacagucgu cacuaacaag ccucaccucg 1200
ucgacuccgg cguagaccuc cccucuaccg aaggaagacc cgagggucuc gggcuucguc 1260
ucaccacucc gacgcuuccg gugacugccg aaauaggugu acgucgacgu ccccgagggu 1320
gccgacccuu cucaacuggu ugucccggac cggggcgucc ugucgaaggc ugucgucccg 1380
guccgggacg gucugaagau gccggacgac gggcuggagg uaggagaagg uccguaucuu 1440
uaauugaaac cacagacccu gucacuauaa gaguaaguuc gacgucacaa gucgugucgg 1500
gcagcacuau aagagccgga ggaaccggag guucuccaug gagagguccu gagccgacag 1560
ugucuacucc gcaccacccc gcggguccug acccuccggg ucucccucgc ugucgucccu 1620
guccucuucg gugucggucc guccuguaag cacguggggg uagcacaguu ccugccacuc 1680
agugagaacc gugccccuua ggcgcaaggu uacguggcaa gggccggcgc cuccgaccua 1740
gccagggcca cagaagauac cuccaguuuu gucgcaccua ccgcagaggu ccgcuagaca 1800
gg 1802
<210> 23
<211> 1786
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (893)..(894)
<223> 在位置893和894处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 23
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augggggugc acgaaugucc ugccuggcug uggcuucucc 180
ugucccugcu gucgcucccu cugggccucc caguccuggg cgccccacca cgccucaucu 240
gugacagccg aguccuggag agguaccucu uggaggccaa ggaggccgag aauaucacga 300
cgggcugugc ugaacacugc agcuugaaug agaauaucac ugucccagac accaaaguua 360
auuucuaugc cuggaagagg auggaggucg ggcagcaggc cguagaaguc uggcagggcc 420
uggcccugcu gucggaagcu guccugcggg gccaggcccu guuggucaac ucuucccagc 480
cgugggagcc ccugcagcug cauguggaua aagccgucag uggccuucgc agccucacca 540
cucugcuucg ggcucuggga gcccagaagg aagccaucuc cccuccagau gcggccucag 600
cugcuccacu ccgaacaauc acugcugaca cuuuccgcaa acucuuccga gucuacucca 660
auuuccuccg gggaaagcug aagcuguaca caggggaggc cugcaggaca ggggacagau 720
gacggguggc aaaaaaaaaa aaaaaucccu gugaccccuc cccaaaaaaa aaaaaaaaag 780
ugccucuccu ggcccuggaa aaaaaaaaaa aaaguugcca cuccagugcc caccaaaaaa 840
aaaaaaaaag ccuuguccua auaaaauuaa guugcaucaa gcucgacucu cggggcucuc 900
agcucgaacu acguugaauu aaaauaaucc uguuccgaaa aaaaaaaaaa aaccacccgu 960
gaccucaccg uugaaaaaaa aaaaaaaagg ucccgguccu cuccgugaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaccccucc ccaguguccc uaaaaaaaaa aaaaaacggu gggcaguaga caggggacag 1080
gacguccgga ggggacacau gucgaagucg aaaggggccu ccuuuaaccu caucugagcc 1140
uucucaaacg ccuuucacag ucgucacuaa caagccucac cucgucgacu ccggcguaga 1200
ccuccccucu accgaaggaa gacccgaggg ucucgggcuu cgucucacca cuccgacgcu 1260
uccggugacu gccgaaauag guguacgucg acguccccga gggugccgac ccuucucaac 1320
ugguuguccc ggaccggggc guccugucga aggcugucgu cccgguccgg gacggucuga 1380
agaugccgga cgacgggcug gagguaggag aagguccgua ucuuuaauug aaaccacaga 1440
cccugucacu auaagaguaa guucgacguc acaagucgug ucgggcagca cuauaagagc 1500
cggaggaacc ggagguucuc cauggagagg uccugagccg acagugucua cuccgcacca 1560
ccccgcgggu ccugacccuc cgggucuccc ucgcugucgu cccuguccuc uucggugucg 1620
guccguccug uaagcacgug gggguagcac aguuccugcc acucagugag aaccgugccc 1680
cuuaggcgca agguuacgug gcaagggccg gcgccuccga ccuagccagg gccacagaag 1740
auaccuccag uuuugucgca ccuaccgcag agguccgcua gacagg 1786
<210> 24
<211> 2640
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1320)..(1321)
<223> 在位置1320和1321处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 24
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augcuguuca accuucggau cuugcugaac aacgcugcgu 180
uccggaaugg ucacaacuuc augguccgga acuucagaug cggccagccg cuccagaaca 240
aggugcagcu caaggggagg gaccuccuca cccugaaaaa cuucaccgga gaagagauca 300
aguacaugcu guggcuguca gccgaccuca aauuccggau caagcagaag ggcgaauacc 360
uuccuuugcu gcagggaaag ucccugggga ugaucuucga gaagcgcagc acucgcacua 420
gacugucaac ugaaaccggc uucgcgcugc ugggaggaca ccccugcuuc cugaccaccc 480
aagauaucca ucugggugug aacgaauccc ucaccgacac agcgcgggug cugucgucca 540
uggcagacgc gguccucgcc cgcguguaca agcagucuga ucuggacacu cuggccaagg 600
aagccuccau uccuaucauu aauggauugu ccgaccucua ccaucccauc cagauucugg 660
ccgauuaucu gacucugcaa gaacauuaca gcucccugaa ggggcuuacc cuuucgugga 720
ucggcgacgg caacaacauu cugcacagca uuaugaugag cgcugccaag uuuggaaugc 780
accuccaagc agcgaccccg aagggauacg agccagacgc cuccgugacg aagcuggcug 840
agcaguacgc caaggagaac ggcacuaagc ugcugcucac caacgacccu cucgaagccg 900
cccacggugg caacgugcug aucaccgaua ccuggaucuc caugggacag gaggaggaaa 960
agaagaagcg ccugcaagca uuucaggggu accaggugac uaugaaaacc gccaaggucg 1020
ccgccucgga cuggaccuuc uugcacuguc ugcccagaaa gcccgaagag guggacgacg 1080
agguguucua cagcccgcgg ucgcuggucu uuccggaggc cgaaaacagg aaguggacua 1140
ucauggccgu gauggugucc cugcugaccg auuacucccc gcagcugcag aaaccaaagu 1200
ucugacgggu ggcaucccug ugaccccucc ccagugccuc uccuggcccu ggaaguugcc 1260
acuccagugc ccaccagccu uguccuaaua aaauuaaguu gcaucaagcu cgacucucgg 1320
ggcucucagc ucgaacuacg uugaauuaaa auaauccugu uccgaccacc cgugaccuca 1380
ccguugaagg ucccgguccu cuccgugacc ccuccccagu gucccuacgg ugggcagucu 1440
ugaaaccaaa gacgucgacg ccccucauua gccagucguc ccugugguag ugccgguacu 1500
aucaggugaa ggacaaaagc cggaggccuu ucuggucgcu ggcgcccgac aucuugugga 1560
gcagcaggug gagaagcccg aaagacccgu cugucacguu cuuccagguc aggcuccgcc 1620
gcuggaaccg ccaaaaguau caguggacca uggggacuuu acgaacgucc gcgaagaaga 1680
aaaggaggag gacaggguac cucuaggucc auagccacua gucgugcaac gguggcaccc 1740
gccgaagcuc ucccagcaac cacucgucgu cgaaucacgg caagaggaac cgcaugacga 1800
gucggucgaa gcagugccuc cgcagaccga gcauagggaa gccccagcga cgaaccucca 1860
cguaagguuu gaaccgucgc gaguaguauu acgacacguc uuacaacaac ggcagcggcu 1920
aggugcuuuc ccauucgggg aagucccucg acauuacaag aacgucucag ucuauuagcc 1980
ggucuuagac cuacccuacc aucuccagcc uguuagguaa uuacuauccu uaccuccgaa 2040
ggaaccgguc ucacaggucu agucugacga acaugugcgc ccgcuccugg cgcagacggu 2100
accugcuguc gugggcgcga cacagccacu cccuaagcaa gugugggucu accuauagaa 2160
cccaccaguc cuucgucccc acaggagggu cgucgcgcuu cggccaaagu caacugucag 2220
aucacgcuca cgacgcgaag agcuucuagu aggggucccu gaaagggacg ucguuuccuu 2280
ccauaagcgg gaagacgaac uaggccuuaa acuccagccg acugucggug ucguacauga 2340
acuagagaag aggccacuuc aaaaaguccc acuccuccag ggaggggaac ucgacgugga 2400
acaagaccuc gccgaccggc guagacuuca aggccuggua cuucaacacu gguaaggccu 2460
ugcgucgcaa caagucguuc uaggcuucca acuugucgua gcacaguucc ugccacucag 2520
ugagaaccgu gccccuuagg cgcaagguua cguggcaagg gccggcgccu ccgaccuagc 2580
cagggccaca gaagauaccu ccaguuuugu cgcaccuacc gcagaggucc gcuagacagg 2640
<210> 25
<211> 3228
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (1614)..(1615)
<223> 在位置1614和1615处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 25
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augagcaccg ccgugcugga gaaccccggc cugggccgca 180
agcugagcga cuucggccag gagaccagcu acaucgagga caacugcaac cagaacggcg 240
ccaucagccu gaucuucagc cugaaggagg aggugggcgc ccuggccaag gugcugcgcc 300
uguucgagga gaacgacgug aaccugaccc acaucgagag ccgccccagc cgccugaaga 360
aggacgagua cgaguucuuc acccaccugg acaagcgcag ccugcccgcc cugaccaaca 420
ucaucaagau ccugcgccac gacaucggcg ccaccgugca cgagcugagc cgcgacaaga 480
agaaggacac cgugcccugg uucccccgca ccauccagga gcuggaccgc uucgccaacc 540
agauccugag cuacggcgcc gagcuggacg ccgaccaccc cggcuucaag gaccccgugu 600
accgcgcccg ccgcaagcag uucgccgaca ucgccuacaa cuaccgccac ggccagccca 660
ucccccgcgu ggaguacaug gaggaggaga agaagaccug gggcaccgug uucaagaccc 720
ugaagagccu guacaagacc cacgccugcu acgaguacaa ccacaucuuc ccccugcugg 780
agaaguacug cggcuuccac gaggacaaca ucccccagcu ggaggacgug agccaguucc 840
ugcagaccug caccggcuuc cgccugcgcc ccguggccgg ccugcugagc agccgcgacu 900
uccugggcgg ccuggccuuc cgcguguucc acugcaccca guacauccgc cacggcagca 960
agcccaugua cacccccgag cccgacaucu gccacgagcu gcugggccac gugccccugu 1020
ucagcgaccg cagcuucgcc caguucagcc aggagaucgg ccuggccagc cugggcgccc 1080
ccgacgagua caucgagaag cuggccacca ucuacugguu caccguggag uucggccugu 1140
gcaagcaggg cgacagcauc aaggccuacg gcgccggccu gcugagcagc uucggcgagc 1200
ugcaguacug ccugagcgag aagcccaagc ugcugccccu ggagcuggag aagaccgcca 1260
uccagaacua caccgugacc gaguuccagc cccuguacua cguggccgag agcuucaacg 1320
acgccaagga gaaggugcgc aacuucgccg ccaccauccc ccgccccuuc agcgugcgcu 1380
acgaccccua cacccagcgc aucgaggugc uggacaacac ccagcagcug aagauccugg 1440
ccgacagcau caacagcgag aucggcaucc ugugcagcgc ccugcagaag aucaaguaac 1500
ggguggcauc ccugugaccc cuccccagug ccucuccugg cccuggaagu ugccacucca 1560
gugcccacca gccuuguccu aauaaaauua aguugcauca agcucgacuc ucggggcucu 1620
cagcucgaac uacguugaau uaaaauaauc cuguuccgac cacccgugac cucaccguug 1680
aaggucccgg uccucuccgu gaccccuccc cagugucccu acggugggca augaacuaga 1740
agacgucccg cgacgugucc uacggcuaga gcgacaacua cgacagccgg uccuagaagu 1800
cgacgaccca caacaggucg uggagcuacg cgacccacau ccccagcauc gcgugcgacu 1860
uccccgcccc cuaccaccgc cgcuucaacg cguggaagag gaaccgcagc aacuucgaga 1920
gccggugcau cauguccccg accuugagcc agugccacau caagaccuac cgccagaaga 1980
ggucgagguc cccgucgucg aacccgaaga gcgaguccgu caugacgucg agcggcuucg 2040
acgagucguc cggccgcggc auccggaacu acgacagcgg gacgaacgug uccggcuuga 2100
ggugccacuu ggucaucuac caccggucga agagcuacau gagcagcccc cgcggguccg 2160
accgguccgg cuagaggacc gacuugaccc gcuucgacgc cagcgacuug uccccgugca 2220
ccgggucguc gagcaccguc uacagcccga gcccccacau guacccgaac gacggcaccg 2280
ccuacaugac ccacgucacc uugugcgccu uccgguccgg cggguccuuc agcgccgacg 2340
agucguccgg ccggugcccc gcguccgccu ucggccacgu ccagacgucc uugaccgagu 2400
gcaggagguc gacccccuac aacaggagca ccuucggcgu caugaagagg ucgucccccu 2460
ucuacaccaa caugagcauc guccgcaccc agaacauguc cgagaagucc cagaacuugu 2520
gccacggggu ccagaagaag aggaggaggu acaugaggug cgcccccuac ccgaccggca 2580
ccgccaucaa cauccgcuac agccgcuuga cgaacgccgc ccgcgccaug ugccccagga 2640
acuucggccc caccagccgc aggucgagcc gcggcaucga guccuagacc aaccgcuucg 2700
ccaggucgag gaccuaccac gcccccuugg ucccgugcca caggaagaag aacagcgccg 2760
agucgagcac gugccaccgc ggcuacagca ccgcguccua gaacuacuac aaccaguccc 2820
gcccguccga cgcgaacagg uccacccacu ucuugagcau gagcaggaag aaguccgccg 2880
accccgccga gagcuacacc caguccaagu gcagcaagag gagcuugucc gcgucgugga 2940
accggucccg cggguggagg aggaaguccg acuucuaguc cgacuaccgc ggcaagacca 3000
acgucaacag gagcuacauc gaccagagga ccggcuucag cgagucgaac gccggguccg 3060
gccccaagag gucgugccgc cacgaguagc acaguuccug ccacucagug agaaccgugc 3120
cccuuaggcg caagguuacg uggcaagggc cggcgccucc gaccuagcca gggccacaga 3180
agauaccucc aguuuugucg caccuaccgc agagguccgc uagacagg 3228
<210> 26
<211> 9396
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成的核苷酸
<220>
<221> misc_特征
<222> (4698)..(4699)
<223> 在位置4698和14699处的核苷酸之间的3'-3'桥包含PO4
<400> 26
ggacagaucg ccuggagacg ccauccacgc uguuuugacc uccauagaag acaccgggac 60
cgauccagcc uccgcggccg ggaacggugc auuggaacgc ggauuccccg ugccaagagu 120
gacucaccgu ccuugacacg augcaacgcu cuccucuuga aaaggccucg guggugucca 180
agcucuucuu cucguggacu agacccaucc ugagaaaggg guacagacag cgcuuggagc 240
uguccgauau cuaucaaauc ccuuccgugg acuccgcgga caaccugucc gagaagcucg 300
agagagaaug ggacagagaa cucgccucaa agaagaaccc gaagcugauu aaugcgcuua 360
ggcggugcuu uuucuggcgg uucauguucu acggcaucuu ccucuaccug ggagagguca 420
ccaaggccgu gcagccccug uugcugggac ggauuauugc cuccuacgac cccgacaaca 480
aggaagaaag aagcaucgcu aucuacuugg gcaucggucu gugccugcuu uucaucgucc 540
ggacccucuu guugcauccu gcuauuuucg gccugcauca cauuggcaug cagaugagaa 600
uugccauguu uucccugauc uacaagaaaa cucugaagcu cucgagccgc gugcuugaca 660
agauuuccau cggccagcuc gugucccugc ucuccaacaa ucugaacaag uucgacgagg 720
gccucgcccu ggcccacuuc guguggaucg ccccucugca aguggcgcuu cugaugggcc 780
ugaucuggga gcugcugcaa gccucggcau ucugugggcu uggauuccug aucgugcugg 840
cacuguucca ggccggacug gggcggauga ugaugaagua cagggaccag agagccggaa 900
agauuuccga acggcuggug aucacuucgg aaaugaucga aaacauccag ucagugaagg 960
ccuacugcug ggaagaggcc auggaaaaga ugauugaaaa ccuccggcaa accgagcuga 1020
agcugacccg caaggccgcu uacgugcgcu auuucaacuc guccgcuuuc uucuucuccg 1080
gguucuucgu gguguuucuc uccgugcucc ccuacgcccu gauuaaggga aucauccuca 1140
ggaagaucuu caccaccauu uccuucugua ucgugcuccg cauggccgug acccggcagu 1200
ucccaugggc cgugcagacu ugguacgacu cccugggagc cauuaacaag auccaggacu 1260
uccuucaaaa gcaggaguac aagacccucg aguacaaccu gacuacuacc gaggucguga 1320
uggaaaacgu caccgccuuu ugggaggagg gauuuggcga acuguucgag aaggccaagc 1380
agaacaacaa caaccgcaag accucgaacg gugacgacuc ccucuucuuu ucaaacuuca 1440
gccugcucgg gacgcccgug cugaaggaca uuaacuucaa gaucgaaaga ggacagcucc 1500
uggcgguggc cggaucgacc ggagccggaa agacuucccu gcugauggug aucaugggag 1560
agcuugaacc uagcgaggga aagaucaagc acuccggccg caucagcuuc uguagccagu 1620
uuuccuggau caugcccgga accauuaagg aaaacaucau cuucggcgug uccuacgaug 1680
aauaccgcua ccgguccgug aucaaagccu gccagcugga agaggauauu ucaaaguucg 1740
cggagaaaga uaacaucgug cugggcgaag gggguauuac cuugucgggg ggccagcggg 1800
cuagaaucuc gcuggccaga gccguguaua aggacgccga ccuguaucuc cuggacuccc 1860
ccuucggaua ccuggacguc cugaccgaaa aggagaucuu cgaaucgugc gugugcaagc 1920
ugauggcuaa caagacucgc auccucguga ccuccaaaau ggagcaccug aagaaggcag 1980
acaagauucu gauucugcau gagggguccu ccuacuuuua cggcaccuuc ucggaguugc 2040
agaacuugca gcccgacuuc ucaucgaagc ugauggguug cgacagcuuc gaccaguucu 2100
ccgccgaaag aaggaacucg auccugacgg aaaccuugca ccgcuucucu uuggaaggcg 2160
acgccccugu gucauggacc gagacuaaga agcagagcuu caagcagacc ggggaauucg 2220
gcgaaaagag gaagaacagc aucuugaacc ccauuaacuc cauccgcaag uucucaaucg 2280
ugcaaaagac gccacugcag augaacggca uugaggagga cuccgacgaa ccccuugaga 2340
ggcgccuguc ccuggugccg gacagcgagc agggagaagc cauccugccu cggauuuccg 2400
ugaucuccac ugguccgacg cuccaagccc ggcggcggca guccgugcug aaccugauga 2460
cccacagcgu gaaccagggc caaaacauuc accgcaagac uaccgcaucc acccggaaag 2520
ugucccuggc accucaagcg aaucuuaccg agcucgacau cuacucccgg agacugucgc 2580
aggaaaccgg gcucgaaauu uccgaagaaa ucaacgagga ggaucugaaa gagugcuucu 2640
ucgacgauau ggagucgaua cccgccguga cgacuuggaa cacuuaucug cgguacauca 2700
cugugcacaa gucauugauc uucgugcuga uuuggugccu ggugauuuuc cuggccgagg 2760
ucgcggccuc acugguggug cucuggcugu ugggaaacac gccucugcaa gacaagggaa 2820
acuccacgca cucgagaaac aacagcuaug ccgugauuau cacuuccacc uccucuuauu 2880
acguguucua caucuacguc ggaguggcgg auacccugcu cgcgaugggu uucuucagag 2940
gacugccgcu gguccacacc uugaucaccg ucagcaagau ucuucaccac aagauguugc 3000
auagcgugcu gcaggccccc auguccaccc ucaacacucu gaaggccgga ggcauucuga 3060
acagauucuc caaggacauc gcuauccugg acgaucuccu gccgcuuacc aucuuugacu 3120
ucauccagcu gcugcugauc gugauuggag caaucgcagu gguggcggug cugcagccuu 3180
acauuuucgu ggccacugug ccggucauug uggcguucau caugcugcgg gccuacuucc 3240
uccaaaccag ccagcagcug aagcaacugg aauccgaggg acgauccccc aucuucacuc 3300
accuugugac gucguugaag ggacugugga cccuccgggc uuucggacgg cagcccuacu 3360
ucgaaacccu cuuccacaag gcccugaacc uccacaccgc caauugguuc cuguaccugu 3420
ccacccugcg gugguuccag augcgcaucg agaugauuuu cgucaucuuc uucaucgcgg 3480
ucacauucau cagcauccug acuaccggag agggagaggg acgggucgga auaauccuga 3540
cccucgccau gaacauuaug agcacccugc agugggcagu gaacagcucg aucgacgugg 3600
acagccugau gcgaagcguc agccgcgugu ucaaguucau cgacaugccu acugagggaa 3660
aacccacuaa guccacuaag cccuacaaaa auggccagcu gagcaagguc augaucaucg 3720
aaaacuccca cgugaagaag gacgauauuu ggcccuccgg aggucaaaug accgugaagg 3780
accugaccgc aaaguacacc gagggaggaa acgccauucu cgaaaacauc agcuucucca 3840
uuucgccggg acagcggguc ggccuucucg ggcggaccgg uuccgggaag ucaacucugc 3900
ugucggcuuu ccuccggcug cugaauaccg agggggaaau ccaaauugac ggcgugucuu 3960
gggauuccau uacucugcag caguggcgga aggccuucgg cgugaucccc cagaaggugu 4020
ucaucuucuc ggguaccuuc cggaagaacc uggauccuua cgagcagugg agcgaccaag 4080
aaaucuggaa ggucgccgac gaggucggcc ugcgcuccgu gauugaacaa uuuccuggaa 4140
agcuggacuu cgugcucguc gacgggggau guguccuguc gcacggacau aagcagcuca 4200
ugugccucgc acgguccgug cucuccaagg ccaagauucu gcugcuggac gaaccuucgg 4260
cccaccugga uccggucacc uaccagauca ucaggaggac ccugaagcag gccuuugccg 4320
auugcaccgu gauucucugc gagcaccgca ucgaggccau gcuggagugc cagcaguucc 4380
uggucaucga ggagaacaag guccgccaau acgacuccau ucaaaagcuc cucaacgagc 4440
ggucgcuguu cagacaagcu auuucaccgu ccgauagagu gaagcucuuc ccgcaucgga 4500
acagcucaaa gugcaaaucg aagccgcaga ucgcagccuu gaaggaagag acugaggaag 4560
aggugcagga cacccggcuu uaacgggugg caucccugug accccucccc agugccucuc 4620
cuggcccugg aaguugccac uccagugccc accagccuug uccuaauaaa auuaaguugc 4680
aucaagcucg acucucgggg cucucagcuc gaacuacguu gaauuaaaau aauccuguuc 4740
cgaccacccg ugaccucacc guugaagguc ccgguccucu ccgugacccc uccccagugu 4800
cccuacggug ggcaauuucg gcccacagga cguggagaag gagucagaga aggaaguucc 4860
gacgcuagac gccgaagcua aacgugaaac ucgacaaggc uacgcccuuc ucgaagugag 4920
auagccugcc acuuuaucga acagacuugu cgcuggcgag caacuccucg aaaacuuacc 4980
ucagcauaac cgccuggaac aagaggagcu acugguccuu gacgaccgug aggucguacc 5040
ggagcuacgc cacgagcguc ucuuagugcc acguuagccg uuuccggacg aagucccagg 5100
aggacuacua gaccauccac uggccuaggu ccacccggcu uccaagcagg ucgucgucuu 5160
agaaccggaa ccucucgugc cuggcacgcu ccguguacuc gacgaauaca ggcacgcugu 5220
ccuguguagg gggcagcugc ucgugcuuca ggucgaaagg uccuuuaaca aguuagugcc 5280
ucgcguccgg cuggagcagc cgcuggaagg ucuaaagaac cagcgaggug acgagcauuc 5340
cuagguccaa gaaggccuuc caugggcucu ucuacuugug gaagaccccc uagugcggcu 5400
uccggaaggc ggugacgacg ucucauuacc uuaggguucu gugcggcagu uaaaccuaaa 5460
gggggagcca uaagucgucg gccuccuuuc ggcugucguc ucaacugaag ggccuuggcc 5520
aggcgggcuc uuccggcugg gcgacagggc cgcuuuaccu cuucgacuac aaaagcucuu 5580
accgcaaagg agggagccac augaaacgcc aguccaggaa gugccaguaa acuggaggcc 5640
ucccgguuua uagcaggaag aagugcaccc ucaaaagcua cuaguacugg aacgagucga 5700
ccgguaaaaa caucccgaau caccugaauc acccaaaagg gagucauccg uacagcuacu 5760
ugaacuugug cgccgacugc gaagcguagu ccgacaggug cagcuagcuc gacaagugac 5820
gggugacguc ccacgaguau uacaaguacc gcucccaguc cuaauaaggc ugggcaggga 5880
gagggagagg ccaucagucc uacgacuacu uacacuggcg cuacuucuuc uacugcuuuu 5940
aguagagcua cgcguagacc uugguggcgu cccaccuguc cauguccuug guuaaccgcc 6000
acaccuccaa gucccggaac accuucuccc aaagcuucau cccgacggca ggcuuucggg 6060
ccucccaggu gucagggaag uugcugcagu guuccacuca cuucuacccc cuagcaggga 6120
gccuaagguc aacgaagucg acgaccgacc aaaccuccuu cauccgggcg ucguacuacu 6180
ugcgguguua cuggccgugu caccggugcu uuuacauucc gacgucgugg cgguggugac 6240
gcuaacgagg uuagugcuag ucgucgucga ccuacuucag uuucuaccau ucgccguccu 6300
cuagcagguc cuaucgcuac aggaaccucu uagacaaguc uuacggaggc cggaagucuc 6360
acaacuccca ccuguacccc cggacgucgu gcgauacguu guagaacacc acuucuuaga 6420
acgacugcca cuaguuccac accuggucgc cgucaggaga cuucuuuggg uagcgcucgu 6480
cccauaggcg gugaggcugc aucuacaucu ugugcauuau ucuccuccac cuucacuauu 6540
agugccguau cgacaacaaa gagcucacgc accucaaagg gaacagaacg ucuccgcaca 6600
aaggguuguc ggucucgugg uggucacucc ggcgcuggag ccgguccuuu uagugguccg 6660
ugguuuaguc gugcuucuag uuacugaaca cgugucacua cauggcgucu auucacaagg 6720
uucagcagug ccgcccauag cugagguaua gcagcuucuu cgugagaaag ucuaggagga 6780
gcaacuaaag aagccuuuaa agcucgggcc aaaggacgcu gucagaggcc cucaucuaca 6840
gcucgagcca uucuaagcga acuccacggu cccugugaaa ggcccaccua cgccaucaga 6900
acgccacuua caaaaccggg accaagugcg acacccagua guccaagucg ugccugacgg 6960
cggcggcccg aaccucgcag ccuggucacc ucuagugccu uuaggcuccg uccuaccgaa 7020
gagggacgag cgacaggccg uggucccugu ccgcggagag uuccccaagc agccucagga 7080
ggaguuacgg caaguagacg ucaccgcaga aaacgugcua acucuugaac gccuaccuca 7140
auuaccccaa guucuacgac aagaaggaga aaagcggcuu aaggggccag acgaacuucg 7200
agacgaagaa ucagagccag guacuguguc cccgcagcgg aagguuucuc uucgccacgu 7260
uccaaaggca guccuagcuc aaggaagaaa gccgccucuu gaccagcuuc gacagcguug 7320
gguagucgaa gcuacucuuc agcccgacgu ucaagacguu gaggcucuuc cacggcauuu 7380
ucauccuccu ggggaguacg ucuuagucuu agaacagacg gaagaagucc acgagguaaa 7440
accuccagug cuccuacgcu cagaacaauc gguagucgaa cgugugcgug cuaagcuucu 7500
agaggaaaag ccaguccugc agguccauag gcuucccccu cagguccucu auguccagcc 7560
gcaggaauau gugccgagac cggucgcucu aagaucgggc gaccgggggg cuguuccauu 7620
augggggaag cgggucgugc uacaauagaa agaggcgcuu gaaacuuuau aggagaaggu 7680
cgaccguccg aaacuagugc cuggccaucg ccauaaguag cauccugugc ggcuucuacu 7740
acaaaaggaa uuaccaaggc ccguacuagg uccuuuugac cgaugucuuc gacuacgccg 7800
gccucacgaa cuagaaaggg agcgauccaa guucgagagg guacuagugg uagucguccc 7860
uucagaaagg ccgaggccag cuaggccggu ggcgguccuc gacaggagaa agcuagaacu 7920
ucaauuacag gaagucgugc ccgcagggcu cguccgacuu caaacuuuuc uucucccuca 7980
gcaguggcaa gcuccagaac gccaacaaca acaagacgaa ccggaagagc uugucaagcg 8040
guuuagggag gaggguuuuc cgccacugca aaagguagug cuggagccau caucagucca 8100
acaugagcuc ccagaacaug aggacgaaaa cuuccuucag gaccuagaac aauuaccgag 8160
ggucccucag caugguucag acgugccggg uacccuugac ggcccagugc cgguacgccu 8220
cgugcuaugu cuuccuuuac caccacuucu agaaggacuc cuacuaaggg aauuaguccc 8280
gcauccccuc gugccucucu uuguggugcu ucuugggccu cuucuucuuu cgccugcuca 8340
acuuuaucgc gugcauucgc cggaacgccc agucgaaguc gagccaaacg gccuccaaaa 8400
guuaguagaa aagguaccgg agaagggucg ucauccggaa gugacugacc uacaaaagcu 8460
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aguaguagua ggcgggguca ggccggaccu ugucacgguc gugcuagucc uuagguucgg 8580
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cuccccgcua ggugugcuuc acccgguccc gcuccgggag cagcuugaac aagucuaaca 8700
accucucguc ccugugcucg accggcuacc uuuagaacag uucgugcgcc gagcucucga 8760
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cguccggcuu uuaucguccu acguuguucu cccaggccug cuacuuuucg uccgugucug 8880
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cuccucucgc aacguagcac aguuccugcc acucagugag aaccgugccc cuuaggcgca 9300
agguuacgug gcaagggccg gcgccuccga ccuagccagg gccacagaag auaccuccag 9360
uuuugucgca ccuaccgcag agguccgcua gacagg 9396

Claims (47)

1.一种多聚体编码核酸，其包含两种或更多种编码多核苷酸，所述两种或更多种编码多核苷酸经由包含3'-3'反向磷酸二酯键的寡核苷酸桥于其3'末端连接，使得所述多聚体编码核酸化合物包含两个或更多个5'末端；其中所述两种或更多种编码多核苷酸中的每一种是编码目的蛋白质的合成的多核糖核苷酸。
2.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中所述两种或更多种编码多核苷酸中的每一种编码相同的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中所述两种或更多种编码多核苷酸中的每一种编码不同的蛋白质。
4.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中所述化合物包含两种编码多核苷酸。
5.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中所述化合物包含三种或更多种编码多核苷酸。
6.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中所述化合物包含四种或更多种编码多核苷酸。
7.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中所述化合物包含五种或更多种编码多核苷酸。
8.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中编码多核苷酸中的一种或多种包含5’UTR、3’UTR，或两者。
9.根据权利要求8所述的多聚体编码核酸，其中所述编码多核苷酸中的一种或多种包含3’UTR。
10.根据权利要求9所述的多聚体编码核酸，其中3’UTR为长度5-2,000个核苷酸。
11.根据权利要求9所述的多聚体编码核酸，其中所述3’UTR包含其间具有间隔物的多个多A区段。
12.根据权利要求11所述的多聚体编码核酸，其中所述多A区段中的每一个包含8-50个连续的腺苷。
13.根据权利要求11所述的多聚体编码核酸，其中所述多A区段的多个范围为1-100。
14.根据权利要求11所述的多聚体编码核酸，其中所述间隔物具有范围为5-100的不同长度。
15.根据权利要求11所述的多聚体编码核酸，其中所述间隔物包含DNA、RNA、经修饰的碱基，或其组合；并且其中所述经修饰的碱基选自2’-OMe-A、2’-OMe-G、2’-OMe-C、2’-OMe-U、2’-F-A、2’-F-G、2’-F-C、2’-F-U、LNA-A、LNA-G、LNA-C、LNA-U、N6-甲基-腺苷、2-硫代尿苷、5-甲基-胞苷、假尿苷和1-甲基-假尿苷。
16.根据权利要求9所述的多聚体编码核酸，其中所述3’UTR包含假结结构。
17.根据权利要求9所述的多聚体编码核酸，其中所述3’UTR随后不含多聚A尾。
18.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中所述编码多核苷酸中的一种或多种包含多聚A尾。
19.根据权利要求18所述的多聚体编码核酸，其中所述多聚A尾为长度25-5,000个核苷酸。
20.根据权利要求9所述的多聚体编码核酸，其中所述3’UTR结合多聚A结合蛋白。
21.根据权利要求9所述的多聚体编码核酸，其中所述3’UTR包含“吻合环”序列基序。
22.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中包含寡核苷酸桥的所述核苷酸选自2’-OMe-A、2’-OMe-G、2’-OMe-C、2’-OMe-U、2’-F-A、2’-F-G、2’-F-C、2’-F-U、LNA-A、LNA-G、LNA-C、LNA-U、N6-甲基-腺苷、2-硫代尿苷、5-甲基-胞苷、假尿苷和1-甲基-假尿苷。
23.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中所述寡核苷酸桥包含与活性部分的至少一个共价连接。
24.根据权利要求23所述的多聚体编码核酸，其中所述活性部分是小分子、蛋白质、DNA、RNA，或其组合。
25.根据权利要求23所述的多聚体编码核酸，其中所述活性部分是靶向基团。
26.根据权利要求23所述的多聚体编码核酸，其中所述活性部分是造影剂。
27.根据权利要求23所述的多聚体编码核酸，其中所述活性部分是肽。
28.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中接近3'-3'反向连接的核苷酸用一种或多种三触角GalNac靶向试剂功能化。
29.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中所述编码多核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷酸；其中所述经修饰的核苷酸选自2’-OMe-A、2’-OMe-G、2’-OMe-C、2’-OMe-U、2’-F-A、2’-F-G、2’-F-C、2’-F-U、LNA-A、LNA-G、LNA-C、LNA-U、N6-甲基-腺苷、2-硫代尿苷、5-甲基-胞苷、假尿苷和1-甲基-假尿苷。
30.根据权利要求29所述的多聚体编码核酸，其中所述经修饰的核苷酸取代1-100％的相应天然碱基。
31.根据权利要求30所述的多聚体编码核酸，其中至少25％的尿嘧啶被2-硫代尿苷替换。
32.根据权利要求30所述的多聚体编码核酸，其中100％的胞苷被5-甲基胞苷替换。
33.根据权利要求29中任一项所述的多聚体编码核酸，其中所述经修饰的核苷酸在核糖环上用4'-硫代取代进一步修饰。
34.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中天然核苷酸在核糖环上用4'-硫代取代而修饰。
35.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中所述两种或更多种编码多核苷酸包含编码治疗性蛋白质的多核苷酸。
36.根据权利要求1所述的多聚体编码核酸，其中所述两种或更多种编码多核苷酸包含编码酶、受体、配体、抗体的轻链或重链、核酸酶和/或DNA结合蛋白的多核苷酸。
37.根据权利要求36所述的多聚体编码核酸，其中所述两种或更多种编码多核苷酸包含编码核酸酶的多核苷酸。
38.一种包含根据权利要求1-37中任一项所述的多聚体编码核酸的组合物，所述多聚体编码核酸用递送媒介物包封或与递送媒介物复合。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述递送媒介物选自脂质体、脂质纳米颗粒、固体-脂质纳米颗粒、聚合物、病毒、溶胶-凝胶和纳米凝胶。
40.根据权利要求1-37中任一项所述的多聚体编码核酸在制备用于治疗的药物中的用途。
41.根据权利要求40所述的用途，其中所述多聚体编码核酸用递送媒介物包封或与递送媒介物复合。
42.根据权利要求41所述的用途，其中所述递送媒介物选自脂质体、脂质纳米颗粒、固体-脂质纳米颗粒、聚合物、病毒、溶胶-凝胶和纳米凝胶。
43.根据权利要求40所述的用途，其中所述多聚体编码核酸被制备以经由选自以下的递送途径而施用：静脉内递送、皮下递送、经口递送、眼部递送、气管内注射肺部递送、肌内递送、鞘内递送、或关节内递送。
44.根据权利要求43所述的用途，其中所述气管内注射肺部递送是雾化。
45.根据权利要求40所述的用途，其中所述多聚体编码核酸包含编码囊性纤维化跨膜传导调节因子mRNA的编码多核苷酸。
46.根据权利要求40所述的用途，其中所述多聚体编码核酸包含编码人苯丙氨酸羟化酶mRNA的编码多核苷酸。
47.根据权利要求40所述的用途，其中所述多聚体编码核酸包含编码人鸟氨酸转氨甲酰酶mRNA的编码多核苷酸。
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