JP2018527003A - 安定化尾部領域を含むポリヌクレオチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、３’−安定化領域を含むポリペプチドをコードし、野生型ポリヌクレオチドと比較して向上した安定性を有するポリヌクレオチドを特徴とする。

Description

本発明は、安定化尾部領域を含むポリヌクレオチドに関する。
タンパク質発現を引き起こす従来の方法には多くの問題がある。例えば、細胞に導入された異種ＤＮＡは、娘細胞（異種ＤＮＡが染色体に組み込まれたか否かにかかわらず）に、または子孫に継承され得る。導入されたＤＮＡは、ある頻度で宿主細胞ゲノムＤＮＡに組み込まれて、宿主細胞ゲノムＤＮＡに変化および／または損傷をもたらし得る。さらに、タンパク質が作製される前に多くのステップが存在しなければならない。一旦細胞内に入ると、ＤＮＡは、核内に輸送されなければならず、そこでＲＮＡに転写される。ＤＮＡから転写されたＲＮＡは、細胞質に入らなければならず、そこでタンパク質に翻訳される。複数の処理ステップに対するこの必要性は、目的のタンパク質の生成前に時間差を生み出す。さらに、細胞内のＤＮＡ発現を得ることは難しく；多くの場合、ＤＮＡは細胞に入るが、発現されないか、または妥当な率または濃度で発現されない。これは、ＤＮＡが、初代細胞または修飾細胞株などの細胞に導入されるとき、特に問題になり得る。
天然のＲＮＡは、４つの塩基性リボヌクレオチド：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰから合成されるが、転写後修飾ヌクレオチドを含有し得る。さらに、およそ１００個の異なるヌクレオシド改変が、ＲＮＡにおいて同定されている（非特許文献１）。
ロゼンスキーＪ（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ）、クレインＰ（Ｃｒａｉｎ，Ｐ）、およびマクロスキーＪ（ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ）著。１９９９年。ＲＮＡ修飾データベース（ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ）：１９９９年更新。ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ）第２７巻、ｐ．１９６〜１９７
核酸の細胞内翻訳の調節に対処する生物学的様式が当該技術分野において必要とされている。本発明は、治療法の開発に有利な特性を与える化学的改変（ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ）を組み込んだ新規なｍＲＮＡ分子を提供することによって、この問題を解決する。
本開示は、特に、３’−安定化領域（例えば、改変核酸塩基、糖、または骨格を含有する）を含むポリヌクレオチドを提供する。
第１の態様において、本発明は、ポリペプチドをコードし、式Ｉ：
Ａ’−Ｌ−Ｂ’
式Ｉ
（式中、Ａ’が、
（ａ）少なくとも１つの５’−キャップ構造；
（ｂ）５’−ＵＴＲ（例えば、コザック配列を含む５’−ＵＴＲ）；
（ｃ）コード領域；および
（ｄ）３’−ＵＴＲ
を含み；
Ｂ’が、１〜５００個（例えば、１〜２００、１〜４００、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、４５〜６５、５０〜７０、６５〜８５、７０〜９０、８５〜１０５、９０〜１１０、１０５〜１３５、１２０〜１５０、１３０〜１７０、１５０〜２００または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００個）のヌクレオシドを含む３’−安定化領域を含み；
Ｌがリンカーである）
の構造を含むポリヌクレオチドを特徴とする。
ある実施形態において、３’−安定化領域が、１つのヌクレオシドからなる場合、ヌクレオシドは、２’−デオキシヌクレオシド、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、２’−Ｏ−メチルヌクレオシド、３’−Ｏ−メチルヌクレオシド、３’−Ｏ−エチル−ヌクレオシド、または３’−アラビノシドではない。ある実施形態において、３’−安定化領域が、１つのヌクレオシドからなる場合、ヌクレオシドは、Ｌ−ヌクレオシド、α−チオ−２’−Ｏ−メチル−アデノシン、２’−フルオロ−アデノシン、アラビノ−アデノシン、ヘキシトール−アデノシン、ＬＮＡ−アデノシン、ＰＮＡ−アデノシン、逆方向チミジン、または３’−アジド−２’，３’−ジデオキシアデノシンである。
ある実施形態において、Ａ’が、（ｅ）ポリ−Ａ領域をさらに含む。
ある実施形態において、３’−安定化領域中の１つ以上のヌクレオシドは、構造：
（式中、Ｂ１が核酸塩基であり；
各ＵおよびＵ’が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここで、ｎｕが、１または２（例えば、Ｎ（ＲＵ）ｎｕについては１、およびＣ（ＲＵ）ｎｕについては２）であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ２”、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれが、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意に置換されるアミノ、アジド、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；またはＲ３および／またはＲ５が、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２、Ｒ２’、またはＲ２”のうちの１つと結合して、それらが結合される炭素と一緒に、任意に置換されるＣ３〜Ｃ１０炭素環または任意に置換されるＣ３〜Ｃ９ヘテロシクリルを形成することができ；
ｍおよびｎのそれぞれが、独立して、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３のそれぞれが、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ハロ、チオール、ボラニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、または任意に置換されるアミノであり；
Ｙ５が、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンである）；
またはその塩を含む。
ある実施形態において、３’−安定化領域は、複数のアデノシンを含む。ある実施形態において、３’−安定化領域のヌクレオシドの全てが、アデノシンである。ある実施形態において、３’−安定化領域は、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個）の改変ヌクレオシド（例えば、Ｌ−アデノシンなどのＬ−ヌクレオシド、２’−Ｏ−メチル−アデノシン、α−チオ−２’−Ｏ−メチル−アデノシン、２’−フルオロ−アデノシン、アラビノ−アデノシン、ヘキシトール−アデノシン、ＬＮＡ−アデノシン、ＰＮＡ−アデノシン、または逆方向チミジン）を含む。ある実施形態において、改変ヌクレオシドは、Ｌ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン、または逆方向チミジンである。ある実施形態において、３’−安定化領域は、複数の改変ヌクレオシドを含む。ある実施形態において、３’−安定化領域中のヌクレオチドの全てが、改変ヌクレオシドである。ある実施形態において、３’−安定化領域は、少なくとも２つの異なる改変ヌクレオシドを含む。ある実施形態において、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンである。ある実施形態において、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、逆方向チミジンである。ある実施形態において、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、逆方向チミジンである。
ある実施形態において、安定化領域は、構造：
（式中、各Ｘが、独立して、ＯまたはＳであり；
Ａがアデニンを表し、Ｔがチミンを表す）、
またはその塩を含む。
ある実施形態において、複数の改変ヌクレオシドの全てが同じである（例えば、改変ヌクレオシドの全てが、Ｌ−アデノシンである）。ある実施形態において、安定化領域は、１０個のヌクレオシドを含む。ある実施形態において、安定化領域は、１１個のヌクレオシドを含む。
上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、リンカーは、構造：
（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇがそれぞれ、独立して、０または１であり；
ｄが、０、１、２、または３であり；
Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１０、およびＲ１２のそれぞれが、独立して、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニレン、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリーレン、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、およびＮＲ１３であり；
Ｒ７およびＲ１１がそれぞれ、独立して、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、またはホスホリルであり、ここで、Ｒ７がホスホリルであり、−（Ｒ９）ｄ−が結合であり、ｅ、ｆ、およびｇが０である場合、Ｒ６またはＲ８の少なくとも１つがＯではなく；Ｒ１１がホスホリルであり、−（Ｒ９）ｄ−が結合であり、ａ、ｂ、およびｃが０である場合、Ｒ１０またはＲ１２の少なくとも１つがＯではなく；
各Ｒ９が、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０ヘテロシクリレン、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、または（Ｒ６）ａ−（Ｒ７）ｂ−（Ｒ８）ｃを（Ｒ１０）ｅ−（Ｒ１１）ｆ−（Ｒ１２）ｇに連結する結合であり、ここで、−（Ｒ９）ｄ−が結合である場合、ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、またはｇの少なくとも１つが１であり；
Ｒ１３が、水素、任意に置換されるＣ１〜Ｃ４アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリール、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルである）を有する。
ある実施形態において、リンカーは、
（式中、Ｂ１が、核酸塩基、水素、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意に置換されるアミノ、アジド、任意に置換されるＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリール、任意に置換されるＣ２〜Ｃ９複素環であり；
Ｒ１４およびＲ１５がそれぞれ、独立して、水素またはヒドロキシである）を含む。
ある実施形態において、Ｂ１が、核酸塩基または水素である。ある実施形態において、Ｂ１が、核酸塩基である。
ある実施形態において、リンカーは、
（式中、ｏが、０、１、２、または３であり；
Ｙ６が、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり；
各Ｙ７およびＹ８が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
各Ｙ９が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ハロ、チオール、ボラニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、または任意に置換されるアミノであり；
Ｙ１０が、Ｏ、結合、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０ヘテロシクリレン、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレンである）を含む。
ある実施形態において、Ｙ１０が、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレンである。
ある実施形態において、リンカーは、
（式中、ｐが、０、１、２、３、４、または５である）を含む。
ある実施形態において、Ｒ１４およびＲ１５が両方ともヒドロキシである。ある実施形態において、ｏが１であり、Ｙ６がメチレンであり、Ｙ７およびＹ８が両方ともＯであり、Ｙ９がヒドロキシである。ある実施形態において、ｐが３である。
ある実施形態において、Ｙ１０が、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレンである。
ある実施形態において、リンカーは、
（式中、ｑおよびｒがそれぞれ、独立して、１、２、３、４、または５である）を含む。ある実施形態において、Ｒ１４およびＲ１５が両方ともヒドロキシである。ある実施形態において、ｑが５であり、Ｙ６がメチレンであり、Ｙ７およびＹ８が両方ともＯであり、Ｙ９がヒドロキシである。ある実施形態において、ｒが３である。
上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、リンカーは、クリックケミストリー反応対の間のクリックケミストリー反応によって形成され得る。
ある実施形態において、リンカーは、構造：
、またはアミド結合を含む。
ある実施形態において、リンカーは、構造：
を含む。
ある実施形態において、リンカーは、構造：
を含む。
ある実施形態において、リンカーは、Ａ’の３’末端およびＢ’の５’末端に結合される。
別の態様において、本発明は、ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、ジ−アルデヒド含有ポリヌクレオチドを形成するための第１のポリヌクレオチドのシス−ジオール（例えば、３’末端におけるヌクレオシドなどのヌクレオシドの糖におけるシス−ジオール）の酸化（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによる処理による）、続いて、好適な条件下での、反応性アミン部分（例えば、反応性アルコキシアミノ部分）を含む第２のポリヌクレオチドによる処理によって調製されるポリヌクレオチドを特徴とする。
別の態様において、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、
（ａ）少なくとも１つの５’−キャップ構造；
（ｂ）５’−ＵＴＲ（例えば、コザック配列を含む５’−ＵＴＲ）；
（ｃ）コード領域；
（ｄ）３’−ＵＴＲ；および
（ｅ）１〜５００個（例えば、１〜２００、１〜４００、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、４５〜６５、５０〜７０、６５〜８５、７０〜９０、８５〜１０５、９０〜１１０、１０５〜１３５、１２０〜１５０、１３０〜１７０、１５０〜２００または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００個）のヌクレオシドを含む３’−安定化領域
を含み、ここで、ヌクレオシドの１つ以上が、Ｌ−ヌクレオシド（例えば、Ｌ−アデノシン）、α−チオ−２’−Ｏ−メチル−アデノシン、２’−フルオロ−アデノシン、ヘキシトール−アデノシン、ＬＮＡ−アデノシン、ＰＮＡ−アデノシン、逆方向チミジン、または３’−アジド−２’，３’−ジデオキシアデノシンであるポリヌクレオチドと特徴とする。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、（ｆ）ポリ−Ａ領域をさらに含む。
ある実施形態において、Ｌ−ヌクレオシドは、構造：
（式中、Ｂ１が核酸塩基であり；
Ｕが、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここで、ｎｕが、１または２（例えば、Ｎ（ＲＵ）ｎｕについては１、およびＣ（ＲＵ）ｎｕについては２）であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ５のそれぞれが、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意に置換されるアミノ、アジド、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；またはＲ３またはＲ５が、Ｒ１またはＲ２のうちの１つと結合して、それらが結合される炭素と一緒に、任意に置換されるＣ３〜Ｃ１０炭素環または任意に置換されるＣ３〜Ｃ９ヘテロシクリルを形成することができ；
ｍおよびｎのそれぞれが、独立して、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３のそれぞれが、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ハロ、チオール、ボラニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、または任意に置換されるアミノであり；
Ｙ５が、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンである）；
またはその塩を有する。
ある実施形態において、３’−安定化領域は、少なくとも１つのＬ−ヌクレオシド（例えば、Ｌ−アデノシン）を含む。
ある実施形態において、３’−安定化領域は、複数の改変ヌクレオシドを含む。
ある実施形態において、複数の改変ヌクレオシドの全てが同じである（例えば、改変ヌクレオシドの全てが、Ｌ−アデノシンなどのＬ−ヌクレオシドである）。
ある実施形態において、安定化領域は、１０個のヌクレオシドを含む。ある実施形態において、安定化領域は、１１個のヌクレオシドを含む。
ある実施形態において、３’−安定化領域の５’末端は、３’−ＵＴＲの３’末端に結合される。
ある実施形態において、３’−安定化領域の５’末端は、ポリ−Ａ領域の３’末端に結合される。
別の態様において、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ポリヌクレオチドが、
（ａ）少なくとも１つの５’−キャップ構造；
（ｂ）５’−ＵＴＲ（例えば、コザック配列を含む５’−ＵＴＲ）；
（ｃ）コード領域；
（ｄ）３’−ＵＴＲ；および
（ｅ）１〜５００個（例えば、１〜２００、１〜４００、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、４５〜６５、５０〜７０、６５〜８５、７０〜９０、８５〜１０５、９０〜１１０、１０５〜１３５、１２０〜１５０、１３０〜１７０、１５０〜２００または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００個）のヌクレオシドを含む３’−安定化領域
を含み、ここで、３’−安定化領域が、複数の改変ヌクレオシドを含むポリヌクレオチドを特徴とする。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、（ｆ）ポリ−Ａ領域をさらに含む。
ある実施形態において、１つ以上の改変ヌクレオシドは、構造：
（式中、Ｂ１が核酸塩基であり；
各ＵおよびＵ’が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここで、ｎｕが、１または２（例えば、Ｎ（ＲＵ）ｎｕについては１、およびＣ（ＲＵ）ｎｕについては２）であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ２”、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれが、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意に置換されるアミノ、アジド、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；またはＲ３および／またはＲ５が、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ１”、Ｒ２、Ｒ２’、またはＲ２”のうちの１つと結合して、それらが結合される炭素と一緒に、任意に置換されるＣ３〜Ｃ１０炭素環または任意に置換されるＣ３〜Ｃ９ヘテロシクリルを形成することができ；
ｍおよびｎのそれぞれが、独立して、０、１、２、３、４、または５であり；
Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３のそれぞれが、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ハロ、チオール、ボラニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、または任意に置換されるアミノであり；
Ｙ５が、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンである）；
またはその塩を含む。
ある実施形態において、改変ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンまたはアラビノ−アデノシンである。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、３’末端に複数の改変ヌクレオシドを含む。ある実施形態において、複数の改変ヌクレオシドは、少なくとも２つの異なるヌクレオシドを含む。ある実施形態において、複数の改変ヌクレオシドは全て、同じヌクレオシドである。ある実施形態において、３’−安定化領域中のヌクレオシドの全てが、改変ヌクレオシドである。
ある実施形態において、安定化領域は、１０個のヌクレオシドを含む。ある実施形態において、安定化領域は、１１個のヌクレオシドを含む。
ある実施形態において、３’−安定化領域の５’末端は、３’−ＵＴＲの３’末端に結合される。
ある実施形態において、３’−安定化領域の５’末端は、ポリ−Ａ領域の３’末端に結合される。
上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、５’−ＵＴＲは、コザック配列を含む。
上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、３’−安定化領域は、ポリヌクレオチドの３’末端を含む。
上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、３’−安定化領域は、少なくとも１つの非ヌクレオシドを含む。ある実施形態において、少なくとも１つの非ヌクレオシドは、３’−安定化領域の５’末端、３’末端、または内部位置にある。ある実施形態において、非ヌクレオシドは、脱塩基リボースである。
上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、コード領域、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、および／または５’−キャップ構造の少なくとも１つは、少なくとも１つの改変（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個）ヌクレオシド（例えば、５−置換ウリジン、例えば、５−メトキシ−ウリジン、１−置換プソイドウリジン、または５−置換シチジン、例えば、５−メチル−シチジンなどの本明細書に記載される任意の改変ヌクレオシド）を含む。
上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、ポリ−Ａ領域は、存在する場合、少なくとも１つの改変（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個）ヌクレオシド（例えば、５−置換ウリジン、例えば、５−メトキシ−ウリジン、１−置換プソイドウリジン、または５−置換シチジン、例えば、５−メチル−シチジンなどの本明細書に記載される任意の改変ヌクレオシド）を含む。
上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、ポリ−Ａ領域は、存在する場合、約２０〜約４００個のヌクレオシド（例えば、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、４５〜６５、５０〜７０、６０〜７０、６５〜８５、７０〜９０、８５〜１０５、９０〜１１０、１０５〜１３５、１２０〜１５０、１３０〜１７０、１５０〜２００または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００個）を含む。上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、ポリ−Ａ領域は、存在する場合、６４個のヌクレオシドを含む。上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、ポリ−Ａ領域は、存在する場合、ポリアデニル化シグナルを含む。
上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリ−Ｃ領域をさらに含む。上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、存在する場合、１〜５００個のヌクレオシド（例えば、１〜２００、１〜４００、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、４５〜６５、５０〜７０、６０〜７０、６５〜８５、７０〜９０、８５〜１０５、９０〜１１０、１０５〜１３５、１２０〜１５０、１３０〜１７０、１５０〜２００または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００個）を含む。上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、存在する場合、３０個のヌクレオシドを含む。上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、存在する場合、３’−安定化領域の５’末端に結合される。上記のポリヌクレオチドのいずれかのある実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、存在する場合、ポリ−Ａ領域の３’末端および３’−安定化領域の５’末端に結合される。
ある態様において、本開示は、式ＸＩＩＩの構造を含むリンカーを介して、少なくとも１つの第２のポリヌクレオチド（例えば、１〜５００個、例えば、１〜２００、１〜４００、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、４５〜６５、５０〜７０、６５〜８５、７０〜９０、８５〜１０５、９０〜１１０、１０５〜１３５、１２０〜１５０、１３０〜１７０、１５０〜２００または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００個のヌクレオシドを含むポリヌクレオチド）、標的部分、小分子、ポリペプチド、またはポリマーに結合された第１のポリヌクレオチドを含む化合物、またはその塩を提供し、
式中、Ｂ１が、核酸塩基、水素、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意に置換されるアミノ、アジド、任意に置換されるＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリール、任意に置換されるＣ２〜Ｃ９複素環であり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲＵ、またはＣ（ＲＵ）２であり、ここで、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｘ２が、−Ｏ−、−ＮＲＮ１−、−ＮＲＮ１ＮＲＮ１−、結合、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０ヘテロシクリレン、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ３０ヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｍが、１、２、３、４、または５であり；
各Ｌが、独立して、非分枝鎖状または分枝鎖状リンカーであり；
Ｒ１およびＲ２がそれぞれ、独立して、水素、ヒドロキシル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、
ここで、第１のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードし、
ここで、Ｒ１およびＲ２が水素であり、リンカーが、第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドに結合する場合、Ｘ２−（Ｌ）ｍは、フラニルメチル部分、ピラニルメチル部分、−Ｐ（Ｏ）ＯＨ−、または−Ｐ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）２−ではなく、ここで、ＲＮが、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルである。
ある実施形態において、Ｂ１が、水素または核酸塩基である。ある実施形態において、Ｂ１が、核酸塩基である。
ある実施形態において、化合物は、式ＸＩＶ：
（式中、Ａ１が、第１のポリヌクレオチドであり、
（ａ）少なくとも１つの５’−キャップ構造；
（ｂ）５’−ＵＴＲ；
（ｃ）コード領域；および
（ｄ）３’−ＵＴＲ
を含み；
Ｃ１が、３’−安定化領域、アプタマー、ｓｉＲＮＡ、もしくは他の非コードＲＮＡなどの第２のポリヌクレオチド、標的部分、小分子、ポリペプチド、またはポリマーを含み；
Ｌ１が、非分枝鎖状リンカーであり；
Ｌ２が、分枝鎖状リンカーであり；
ｎが、０、１、２、または３であり；
ｏが、０または１であり；
ｐが、１、２、３、４、または５であり；Ｌ１またはＬ２に結合されたＣ１部分の数を表し、ここで、ｏが０である場合、ｐが１である）の構造を含む。
Ｘ２が、−Ｏ−、−ＮＲＮ１−、−ＮＲＮ１ＮＲＮ１−、結合、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０ヘテロシクリレン、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ３０ヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
Ｙ１が、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり；
各Ｙ２およびＹ３が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ハロ、チオール、ボラニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、または任意に置換されるアミノであり、
ここで、Ｙ２、Ｙ３、およびＸ１がそれぞれＯであり、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ水素であり、Ｙ１がＣＨ２であり、Ｙ４がヒドロキシであり、ｎが１であり、ｏが０であり、ｐが１であり、Ｃ１がポリヌクレオチドである場合、Ｘ２−Ｌ１は、−Ｐ（Ｏ）ＯＨ−または−Ｐ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）２−ではなく、ここで、ＲＮが、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
またはその塩。
ある実施形態において、Ｌ２が存在する場合、分枝鎖状リンカーの各分枝の末端に少なくとも１つのＣ１がある。
ある実施形態において、Ｘ１がＯである。ある実施形態において、Ｒ１およびＲ２がそれぞれヒドロキシである。ある実施形態において、Ｙ１が、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン（例えば、メチレン）である。ある実施形態において、ｎが１である。ある実施形態において、Ｙ２がＯである。ある実施形態において、Ｙ３がＯである。ある実施形態において、Ｙ４がヒドロキシである。特定の実施形態において、Ｘ２が結合である。特定の実施形態において、Ｘ２が−Ｏ−である。特定の実施形態において、Ｘ２が−Ｏ−アルキレン−である。特定の実施形態において、Ｘ２が−Ｏ−（ＣＨ２）ｑ−であり、ここで、ｑが、１〜３０（両端の値を含む）の整数であり；好ましくは、ｑが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２である。特定の実施形態において、Ｘ２が−Ｏ−ヘテロアルキレンである。ある実施形態において、Ｘ２が、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレンである。ある実施形態において、Ｘ２が、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレンである。
ある実施形態において、化合物は、式ＸＶ：
（式中、ｑが、０、１、２、３、４、または５である）の構造、
またはその塩を含む。
ある実施形態において、化合物は、式ＸＶＩ：
の構造；
またはその塩を含む。
ある実施形態において、化合物は、式ＸＶＩＩ：
（式中、ｒおよびｓがそれぞれ、独立して、１、２、３、４、または５である）の構造、
またはその塩を含む。
ある実施形態において、化合物は、式ＸＸＩＩ：
の構造を含む。
上記の化合物のいずれかのある実施形態において、Ｌ１が、式ＸＶＩＩＩ：
（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇがそれぞれ、独立して、０または１であり；
ｄが、０、１、２、または３であり；
Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、およびＲ９のそれぞれが、独立して、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、およびＮＲ１０から選択され；
Ｒ４およびＲ８がそれぞれ、独立して、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、またはホスホリルであり；
各Ｒ６が、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０ヘテロシクリレン、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、または（Ｒ３）ａ−（Ｒ４）ｂ−（Ｒ５）ｃを（Ｒ７）ｅ−（Ｒ８）ｆ−（Ｒ９）ｇに連結する結合であり；
Ｒ１０が、水素、任意に置換されるＣ１〜Ｃ４アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリール、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルである）の構造を含む。
ある実施形態において、Ｌ１が、クリックケミストリー反応対の間のクリックケミストリー反応によって形成され得るリンカーであり、例えば、Ｌ１が、
、またはアミド結合）を含む。
ある実施形態において、化合物は、式ＸＩＸ：
の構造、
またはその塩を含む。
ある実施形態において、ｏが０である。
ある実施形態において、化合物は、式ＸＸ：
の構造、
またはその塩を有する。
ある実施形態において、ｐが１である。
ある実施形態において、Ｌ１が、
を含む。
ある実施形態において、化合物は、式ＸＸＩ：
の構造、
またはその塩を含む。
ある実施形態において、ｏが１である。
ある実施形態において、ｐが３である。
ある実施形態において、Ｌ２が、
を含む。
ある実施形態において、Ｌ２が、
を含む。
ある実施形態において、化合物は、式ＸＸＩＩ：
の構造、
またはその塩を含む。
ある実施形態において、化合物は、式ＸＸＩＩＩ：
（式中、ｔが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
ｕが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）の構造、
またはその塩を含む。
ある実施形態において、ｔが６である。ある実施形態において、ｕが３である。ある実施形態において、ｏが０である。
ある実施形態において、化合物は、式ＸＸＩＶ：
（式中、ｖが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）の構造、
またはその塩を含む。
ある実施形態において、ｖが４である。ある実施形態において、ｏが０である。
ある実施形態において、Ｌ１がＣ１〜Ｃ１０アルキレンである。ある実施形態において、化合物は、式ＸＸＩＩＩ：
の構造を含む。
ある実施形態において、ｏが０である。ある実施形態において、ｐが１である。
上記の化合物のいずれかのある実施形態において、Ｃ１が、第２のポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、複数のアデノシンを含む。ある実施形態において、第２のポリヌクレオチドのヌクレオシドの全てが、アデノシンである。ある実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個）の改変ヌクレオシド（例えば、Ｌ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン、α−チオ−２’−Ｏ−メチル−アデノシン、２’−フルオロ−アデノシン、アラビノ−アデノシン、ヘキシトール−アデノシン、ＬＮＡ−アデノシン、ＰＮＡ−アデノシン、または逆方向チミジン）を含む。ある実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、複数の改変ヌクレオシドを含む。ある実施形態において、第２のポリヌクレオチド中のヌクレオシドの全てが、改変ヌクレオシドである。ある実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、少なくとも２つの異なる改変ヌクレオシドを含む（例えば、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり、少なくとも１つの改変ヌクレオシドは、逆方向チミジンである）。ある実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、構造：
（式中、各Ｘが、独立して、ＯまたはＳであり；
Ａがアデニンを表し、Ｔがチミンを表す）、
またはその塩を含む。
ある実施形態において、複数の改変ヌクレオシドの全てが同じである（例えば、改変ヌクレオシドの全てが、Ｌ−アデノシンである）。
ある実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、１０個または１１個のヌクレオシドを含む。
上記の化合物のいずれかのある実施形態において、Ｃ１が、標的部分（例えば、Ｎ−アセチル−ガラクトサミンなどの炭水化物、脂質、ビタミン、小型受容体リガンド、細胞表面炭水化物結合タンパク質またはそのリガンド、レクチン、ｒ型レクチン、ガレクチン、分化（ＣＤ）抗原のクラスターに対するリガンド、ＣＤ３０、ＣＤ４０、１型サイトカインまたは２型サイトカインなどのサイトカイン、ケモカイン、コロニー刺激因子、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、または突然変異体、誘導体および／またはそれらのいずれかの組合せ）を含む。
上記の化合物のいずれかのある実施形態において、Ｃ１が、ポリペプチド（例えば、配列ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＹ［Ｋ（Ａｏａ］Ｇ−アミド（配列番号１）を有するポリペプチドなどの核局在化ポリペプチド、配列Ａｏａ−ＫＤＥＬ−ＯＨ（配列番号２）を有するポリペプチドなどのＥＲ局在化ポリペプチド、配列Ａｏａ−ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ−アミド（配列番号３）を有するポリペプチドなどのエンドソーム脱出ポリペプチドまたは対応する全てのＤ−アミノ酸ポリペプチド、またはポリ−ヒスチジンなどのアフィニティクロマトグラフィーに使用され得るポリペプチド）を含む。
上記の化合物のいずれかのある実施形態において、Ｃ１が、ポリヌクレオチド（例えば、アプタマー、リボスイッチ、精製ハンドル、ロックド核酸、またはＰＡＢＰアフィニティ配列）を含む。
上記の化合物のいずれかのある実施形態において、Ｃ１が、クリックケミストリーハンドルを含む。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、アルキンである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、アジドである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、シクロオクチンである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、ジエンである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、ジエノフィルである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、末端アルキンである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、歪みアルキンである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、活性化アルキンである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、電子不足アルキンである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、アラインである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、テトラジンである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、アルケンである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、ホスフィンである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、ジチオエステルである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、アルコキシアミンである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、α，β−不飽和カルボニルである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、マレイミドである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、チオールである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、エノンである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、ヒドラジドである。ある実施形態において、クリックケミストリーハンドルは、アミンである。他の好適なクリックケミストリーハンドルは、当業者に公知である。
上記の化合物のいずれかのある実施形態において、Ａ１が、ポリ−Ａ領域をさらに含む。ある実施形態において、ポリ−Ａ領域は、存在する場合、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個）の改変ヌクレオシドを含む。
ある実施形態において、Ａ１のコード領域、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、および／または５’−キャップ構造の少なくとも１つが、少なくとも１つの改変（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個）ヌクレオシド（例えば、５−メトキシ−ウリジンなどの５−置換ウリジン、１−置換プソイドウリジン、または５−メチル−シチジンなどの５−置換シチジン）を含む。
ある態様において、本開示は、ポリヌクレオチドを修飾する方法であって、
式ＸＸＶＩ：
（式中、Ｂが、核酸塩基、水素、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意に置換されるアミノ、アジド、任意に置換されるＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリール、任意に置換されるＣ２〜Ｃ９複素環であり；
Ｘ１が、Ｏ、Ｓ、ＮＲＵ、またはＣ（ＲＵ）２であり、ここで、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルである）の構造を含むポリヌクレオチドを；
式ＸＸＶＩＩ：
Ｈ２Ｎ−Ｒ１１
式ＸＸＶＩＩ
（式中、Ｒ１１が、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルキニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０ヘテロシクリル、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリール、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコール、ポリヌクレオチドに結合された任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキルである）の構造を有する化合物、またはその塩と；
好適な条件下で接触させて、式ＸＩＩＩ：
の構造を含むポリヌクレオチドを生成することを含む方法を提供する。
ある実施形態において、Ｂ１が、水素または核酸塩基である。ある実施形態において、Ｂ１が、核酸塩基である。
ある実施形態において、本方法は、式ＸＸＶＩＩＩ：
の構造を含むポリヌクレオチドまたはその塩を、好適な条件（例えば、ペルヨーデート（ｐｅｒｉｏｄａｔｅ）などの酸化条件を含む条件）下で反応させて、式ＸＩＩの構造を含むポリヌクレオチドを生成することをさらに含む。
ある実施形態において、Ｒ１１が、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキルである。
ある実施形態において、式ＸＩＩＩの化合物、またはその塩は、式ＸＸＩＸ：
Ｈ２Ｎ−ＯＲ１２
式ＸＸＩＸ
（式中、Ｒ１２が、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコール、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０アルキル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル、またはポリヌクレオチドに結合された任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル、例えば、Ｃ１である）の構造を有する。
ある実施形態において、Ｒ１１が、アジド部分、カルボキシレート部分、またはチオールを含む。
ある実施形態において、式ＸＸＩＸの化合物は、構造：
を有する。
ある実施形態において、本方法は、式Ｉの構造を含むポリヌクレオチドを、アルキン部分を含む第２のポリヌクレオチドと、好適な条件下で反応させて、トリアゾール部分を含むリンカーを介して結合された、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む化合物を生成することをさらに含む。
ある実施形態において、アルキン部分は、構造：
を含む。
ある実施形態において、本方法は、式Ｉの化合物を、マレイミド部分を含む第２のポリヌクレオチドと、好適な条件下で反応させて、構造：
を含むリンカーを介して結合された、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む化合物を生成することをさらに含む。
ある実施形態において、本方法は、式Ｉの化合物を、アミノ部分を含む第２のポリヌクレオチドと、好適な条件下で反応させて、アミド結合を含むリンカーを介して結合された、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む化合物を生成することをさらに含む。
上記の化合物または方法のある実施形態において、標的部分、小分子、ポリペプチド、またはポリマーは、細胞毒素、放射性イオン、化学療法剤、または他の治療剤などの治療剤である。細胞毒素または細胞毒性剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール（米国特許第５，２０８，０２０号明細書を参照）、ＣＣ−１０６５（米国特許第５，４７５，０９２号明細書、同第５，５８５，４９９号明細書、同第５，８４６，５４５号明細書を参照）およびそれらの類似体または同族体が挙げられる。放射性イオンとしては、限定はされないがヨウ素（例えば、ヨウ素１２５またはヨウ素１３１）、ストロンチウム８９、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、ホスフェート、コバルト、イットリウム９０、サマリウム１５３およびプラセオジムが挙げられる。他の治療剤としては、限定はされないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、ＣＣ−１０６５、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソールおよびマイタンシノイド）が挙げられる。
上記の化合物または方法のある実施形態において、標的部分、小分子、ポリペプチド、またはポリマーは、検出可能な物質である。検出可能な物質の例としては、様々な有機小分子、無機化合物、ナノ粒子、酵素または酵素基質、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、化学発光材料、放射性材料、および造影剤が挙げられる。このような光学的に検出可能な標識としては、例えば、限定はされないが、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよび誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−ｌ−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’５”−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］−ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、塩化ダンシル）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリトロシンおよび誘導体；エリトロシンＢ、エリトロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレンブチレート、スクシンイミジル１−ピレン；ブチレート量子ドット；リアクティブレッド４（シバクロン（Ｃｉｂａｃｒｏｎ）（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；シアニン−３（Ｃｙ３）；シアニン−５（Ｃｙ５）；シアニン−５．５（Ｃｙ５．５）、シアニン−７（Ｃｙ７）；ＩＲＤ ７００；ＩＲＤ ８００；アレキサ（Ａｌｅｘａ）６４７；ラジョルタブルー（Ｌａ Ｊｏｌｔａ Ｂｌｕｅ）；フタロシアニン；およびナフタロシアニンが挙げられる。ある実施形態において、検出可能な標識は、Ｃｙ５およびＣｙ３などの蛍光色素である。ある実施形態において、検出可能な薬剤は、活性化の際に検出可能になる検出不可能な前駆体である。例としては、蛍光性テトラジン−蛍光色素構築物（例えば、テトラジン−ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、テトラジン−オレゴングリーン４８８、またはテトラジン−ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ）または酵素で活性化可能な蛍光性薬剤（例えば、プロセンス（ＰＲＯＳＥＮＳＥ）（ビゼンメディカル（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ）））が挙げられる。
上記の化合物または方法のある実施形態において、標的部分、小分子、ポリペプチド、またはポリマーは、発光材料である。発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびイクオリンが挙げられる。
上記の化合物または方法のある実施形態において、標的部分、小分子、ポリペプチド、またはポリマーは、放射性材料を含む。好適な放射性材料の例としては、直接または間接的に検出可能な、１８Ｆ、６７Ｇａ、８１ｍＫｒ、８２Ｒｂ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３３Ｘｅ、２０１Ｔｌ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈ、９９ｍＴｃ（例えば、過テクネチウム酸塩（テクネチウム酸塩（ＶＩＩ）、ＴｃＯ４ −として）、または放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数によって検出可能な他の放射性同位体が挙げられる。
上記の化合物または方法のある実施形態において、標的部分、小分子、ポリペプチド、またはポリマーは、造影剤である。さらに、造影剤、例えば、ＭＲＩまたはＮＭＲ、Ｘ線ＣＴ、ラマンイメージング、光干渉断層撮影、吸収イメージング、超音波イメージング、またはサーマルイメージング用の造影剤が使用され得る。例示的な造影剤としては、金（例えば、金ナノ粒子）、ガドリニウム（例えば、キレート化Ｇｄ）、酸化鉄（例えば、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ：ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ）、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ：ｍｏｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、および超微小超常磁性酸化鉄（ＵＳＰＩＯ：ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ））が挙げられ、マンガンキレート（例えば、Ｍｎ−ＤＰＤＰ）、硫酸バリウム、ヨウ素化造影剤（イオヘキソール）、マイクロバブル、またはパーフルオロカーボンも使用され得る。
上記の化合物または方法のある実施形態において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ペプチド、カチオン性ポリマー、または繰り返しモノマー単位で構成された任意の合成もしくは天然高分子である。
ある実施形態において、ポリマーは、任意に置換される直鎖状ポリアルキレン、ポリアルケニレン、またはポリオキシアルキレンポリマーである。ある実施形態において、ポリマーは、任意に置換される分枝鎖状ポリアルキレン、ポリアルケニレン、またはポリオキシアルキレンポリマーである。ある実施形態において、ポリマーは、任意に置換される分枝鎖状多糖である。ある実施形態において、ポリマーは、任意に置換される非分枝鎖状多糖である。ある実施形態において、ポリマーは、任意に置換されるポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリビニルアルコールまたはその誘導体である。ある実施形態において、ポリマーは、分枝鎖状ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリビニルアルコールまたはその誘導体である。
ある実施形態において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ある実施形態において、ポリマーは、ＰＥＧの誘導体化形態（例えば、プロピオン酸スクシンイミジル、ベンゾトリアゾール活性エステル、およびマレイミド、ビニルスルホン、またはチオール基で誘導体化されたＰＥＧなどの、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル）である。本発明に有用なＰＥＧポリマーは、直鎖状分子であってもよく、または分枝鎖状であってもよく、その際、複数のＰＥＧ部分が単一ポリマーに存在する。
上記の化合物または方法のある実施形態において、小分子は、ベンジル基（例えば、モルホリノを形成するための反応に使用されるヒドロキシルアミンは、ｏ−ベンジルヒドロキシルアミン、Ｏ−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）ヒドロキシルアミン、Ｏ−トリチルヒドロキシルアミン、Ｏ−（４−ニトロ−ベンジル）ヒドロキシルアミンである）を含み、上記の化合物または方法のある実施形態において、小分子は、アルキル基（例えば、モルホリノを形成するための反応に使用されるヒドロキシルアミンは、メトキシアミン、Ｏ−エチルヒドロキシルアミン、Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルヒドロキシルアミン、Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルヒドロキシルアミン、Ｏ−（カルボキシメチル）ヒドロキシルアミンである）を含む。上記の化合物または方法のある実施形態において、小分子は、複素環（例えば、モルホリノを形成するための反応に使用されるヒドロキシルアミンは、Ｏ−（テトラ−２Ｈ−ピラン−２−イルである）ヒドロキシルアミンまたは１０−［２−（アミノオキシ）エチル］−１０Ｈ−フェノチアジンを含む。ある実施形態において、小分子は、ヘテロ原子（例えば、モルホリノを形成するための反応に使用されるヒドロキシルアミンは、ヒドロキシルアミン−Ｏ−スルホン酸またはヒドロキシルアミンである）を含む。
ある実施形態において、化合物は、組成物の細胞内送達を促進する細胞透過性部分または薬剤であり得る標的部分も含み得る。例えば、組成物は、細胞内空間への送達を促進する細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポルタン、またはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドを含み得る（例えば、カロン（Ｃａｒｏｎ）ら著、２００１年、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．）、第３巻、３号、ｐ．３１０〜８；ランゲル（Ｌａｎｇｅｌ）著、「細胞透過性ペプチド：プロセスおよび適用（Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（ＣＲＣプレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、フロリダ州ボカラトン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ ＦＬ）、２００２年）；エル−アンダルッシ（Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ）ら著、２００５年、カレント・ファーマシューティカル・デザイン（Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．）、第１１巻、２８号、ｐ．３５９７〜６１１；およびデシャイエ（Ｄｅｓｈａｙｅｓ）ら著、２００５年、セルラー・アンド・モレキュラー・ライフ・サイエンシズ（Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．）、第６２巻、１６号、ｐ．１８３９〜４９を参照）。組成物はまた、細胞内空間への組成物の送達を促進する細胞透過性薬剤、例えば、リポソームを含むように製剤化され得る。
本明細書中に記載される化合物は、特定のリガンドが存在するかまたは生成され得る任意の生物学的標的に薬剤を送達するのに使用され得る。リガンドは、共有または非共有のいずれかで生物学的標的に結合し得る。例示的な生物学的標的としては、バイオポリマー、例えば、抗体、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの核酸、タンパク質、酵素が挙げられ；例示的なタンパク質としては、酵素、受容体、およびイオンチャネルが挙げられる。ある実施形態において、標的は、組織または細胞型特異的マーカ、例えば、選択された組織または細胞型に特異的に発現されるタンパク質である。ある実施形態において、標的は、限定はされないが、細胞膜受容体および核内受容体などの受容体であり；より具体的な例としては、Ｇタンパク質共役受容体、細胞細孔タンパク質、輸送タンパク質、表面発現抗体、ＨＬＡタンパク質、ＭＨＣタンパク質および成長因子受容体が挙げられる。
上記の化合物のいずれかのある実施形態において、ポリ−Ａ領域は、存在する場合、約２０〜約４００個のヌクレオシド（例えば、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、４５〜６５、５０〜７０、６０〜７０、６５〜８５、７０〜９０、８５〜１０５、９０〜１１０、１０５〜１３５、１２０〜１５０、１３０〜１７０、１５０〜２００または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００個）を含む。上記の化合物のいずれかのある実施形態において、ポリ−Ａ領域は、存在する場合、６４個のヌクレオシドを含む。上記の化合物のいずれかのある実施形態において、ポリ−Ａ領域は、存在する場合、ポリアデニル化シグナルを含む。
上記の化合物のいずれかのある実施形態において、第１のポリヌクレオチドは、ポリ−Ｃ領域をさらに含む。上記の化合物のいずれかのある実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、存在する場合、１〜５００個のヌクレオシド（例えば、１〜２００、１〜４００、１〜１０、５〜１５、１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３５〜４５、４０〜５０、４５〜６５、５０〜７０、６０〜７０、６５〜８５、７０〜９０、８５〜１０５、９０〜１１０、１０５〜１３５、１２０〜１５０、１３０〜１７０、１５０〜２００または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００個）を含む。上記の化合物のいずれかのある実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、存在する場合、３０個のヌクレオシドを含む。上記の化合物のいずれかのある実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、存在する場合、第１のポリヌクレオチドの３’末端に結合される。上記の化合物のいずれかのある実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、存在する場合、第１のポリヌクレオチドのポリ−Ａ領域の３’末端に結合される。
ある態様において、本発明は、上記のポリヌクレオチドまたは化合物のいずれかを含む脂質ナノ粒子組成物を提供する。ある実施形態における脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロールおよび非カチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、およびジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群から選択され得る。他の実施形態における脂質ナノ粒子は、約２０〜６０％のカチオン性脂質：約５〜２５％の非カチオン性脂質：約２５〜５５％のステロール；および約０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を有する。ある実施形態において、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ修飾脂質、約３８．５％のコレステロールおよび約１０％の非カチオン性脂質のモル比を含む。脂質ナノ粒子は、他の実施形態において、５０〜１５０ｎｍ、または８０〜１００ｎｍの平均直径を有する。
ある態様において、本発明は、式Ｉの構造を含むように修飾されたポリヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで、修飾ポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドと比較したとき、増加したポリペプチド発現をもたらす。ある態様において、本発明は、細胞内の目的の組み換えポリペプチドの発現を増加させる方法であって、細胞を、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、式Ｉの構造を含むように修飾されており、非修飾ポリヌクレオチドと比較したとき、発現が増加される方法を提供する。例えば、修飾ポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドと比較したとき、約０．１％〜約１００％（例えば、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または約１００％）増加された発現レベルをもたらす。ある実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドと比較したとき、約２倍〜約１００倍（例えば、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または約１００倍）増加された発現レベルをもたらす。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。ある実施形態において、目的のポリペプチドは、治療用ポリペプチドである。ある実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。ある実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
ある態様において、本発明は、式Ｉの構造を含むように修飾されたポリヌクレオチドを含む化合物を提供し、ここで、修飾ポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドと比較したとき、増加した半減期をもたらす。ある態様において、本発明は、細胞内のポリヌクレオチドの半減期を増加させる方法であって、細胞を、ポリヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、ポリヌクレオチドは、式Ｉの構造を含むように修飾されており、非修飾ポリヌクレオチドと比較したとき、半減期が増加される方法を提供する。例えば、修飾ポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドと比較したとき、約０．１％〜約１００％（例えば、約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または約１００％）増加された半減期測定値を有する。ある実施形態において、修飾ポリヌクレオチドは、非修飾ポリヌクレオチドと比較したとき、約２倍〜約１００倍（例えば、約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または約１００倍）増加された半減期測定値を有する。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、治療用ポリペプチドをコードする。ある実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。ある実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
０．０５ｍｇ／ｋｇにおけるｍＲＮＡのｈＥＰＯの発現の３日間にわたるＡＵＣを示すグラフ。 ０．０５ｍｇ／ｋｇにおけるｍＲＮＡのｈＥＰＯの発現の４日間にわたるＡＵＣを示すグラフ。 ０．５ｍｇ／ｋｇにおけるｍＲＮＡのｈＥＰＯの発現の４日間にわたるＡＵＣを示すグラフ。 オリゴヌクレオチドの脱アデニル化（ｄｅａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）の割合を示すグラフ。 ｍＲＮＡのｍＣｉｔｒｉｎｅの発現を示すグラフ。
本開示は、特に、限定はされないが、細胞集団に導入されるとき、向上した安定性、増加した発現、および／または減少した自然免疫応答を含む向上した治療特性を示すポリヌクレオチドを提供する。
特に、本発明者らは、３’−安定化領域（例えば、改変核酸塩基、糖、および／または骨格を含む３’−安定化領域）を含むｍＲＮＡが、実施例に示されるように（特に、高性能が、実施例６〜９のアッセイにわたって観察され得る）、向上した安定性、高い発現レベル、および自然免疫応答の限定された誘導、から利益を得られるため、治療用組成物に使用するのに特に有効であり得ることを確認した。
好ましくは、改変ポリヌクレオチドは、実質的に非毒性および非変異原性である。
本明細書に記載される組成物および方法は、インビボおよびインビトロで、細胞外および細胞内の両方で、ならびに無細胞アッセイなどのアッセイに使用され得る。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。ある実施形態において、組成物は反応混合物である。ある実施形態において、組成物は医薬組成物である。ある実施形態において、組成物は細胞培養物である。
明確にするために、別個の実施形態に関して説明される本開示の特定の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わされて提供され得ることがさらに理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態に関して説明される本開示の様々な特徴はまた、別個にまたは任意の好適な部分組合せで提供され得る。
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、典型的に、目的のポリペプチドをコードする連結ヌクレオシドの第１の領域（例えば、コード領域）、第１の領域の５’末端に位置する第１のフランキング領域（例えば、５’−ＵＴＲ）、第１の領域の３’末端に位置する第２のフランキング領域（例えば、３’−ＵＴＲ）、少なくとも１つの５’−キャップ領域、および３’−安定化領域を含む。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ポリ−Ａ領域をさらに含む。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの領域のいずれか１つが、少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０個）の改変ヌクレオシドを含む。例えば、３’−安定化領域は、Ｌ−ヌクレオシド、逆方向チミジン、または２’−Ｏ−メチルヌクレオシドなどの改変ヌクレオシドを含有してもよく、および／またはコード領域、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、またはキャップ領域は、５−置換ウリジン（例えば、５−メトキシウリジン）、１−置換プソイドウリジン（例えば、１−メチル−プソイドウリジン）、および／または５−置換シチジン（例えば、５−メチル−シチジン）などの改変ヌクレオシドを含み得る。
改変ポリヌクレオチド
本開示は、向上した安定性および／またはポリヌクレオチドが導入される細胞の自然免疫応答の実質的な誘導がないことを含む有用な特性を有する、（例えば、３’−安定化領域において）本明細書に記載される１つ以上の改変ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有するｍＲＮＡなどのＲＮＡを含むポリヌクレオチドを提供する。例えば、ある実施形態において、改変ポリヌクレオチドは、対応する非修飾ポリヌクレオチドと比べて、ポリヌクレオチドが導入される細胞における減少した分解を示す。これらの改変ポリヌクレオチドは、タンパク質産生の効率性、ポリヌクレオチドの細胞内貯留、および／または接触される細胞の生存率を向上させることができるだけでなく、減少した免疫原性を有する。
本明細書において使用される際の「ポリヌクレオチド」は、その最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖であるか、またはそれに組み込むことができる任意の化合物および／または物質を含む。本開示にしたがって使用するための例示的なポリヌクレオチドとしては、限定はされないが、本明細書に詳細に記載される、ＤＮＡ、メッセンジャーｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含むＲＮＡ、そのハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクターなどのうちの１つ以上が挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、分子の全長に沿って均一に改変されても、または均一に改変されなくてもよい。例えば、１つ以上または全てのタイプのヌクレオチド（例えば、プリンまたはピリミジン、またはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ以上または全て）は、本発明のポリヌクレオチドにおいて、またはその所与の所定の配列領域において均一に改変されても、または均一に改変されなくてもよい。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドにおいて（またはその所与の配列領域において）全てのヌクレオチドＸが改変され、ここで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのいずれか１つ、または組合せＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋ＣまたはＡ＋Ｇ＋Ｃのいずれか１つであり得る。
異なる糖改変および／またはヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、ポリヌクレオチドの様々な位置に存在し得る。ポリヌクレオチドの機能が実質的に低下されないように、ヌクレオチド類似体または他の改変が、ポリヌクレオチドの任意の位置に位置し得ることが、当業者に理解されよう。改変はまた、５’末端または３’末端改変であり得る。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、３’末端に改変を含む。ポリヌクレオチドは、約１％〜約１００％の改変ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量に対して、または１つ以上のタイプのヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣのいずれか１つ以上に対して）またはその間の任意のパーセンテージ（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、および９５％〜１００％）を含有し得る。Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在が任意の残りのパーセンテージを占めることが理解されよう。
ポリヌクレオチドは、最小で１％および最大で１００％の改変ヌクレオチド、またはその間の任意のパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の改変ヌクレオチド、少なくとも１０％の改変ヌクレオチド、少なくとも２５％の改変ヌクレオチド、少なくとも５０％の改変ヌクレオチド、少なくとも８０％の改変ヌクレオチド、または少なくとも９０％の改変ヌクレオチドを含有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、改変ピリミジン、例えば、改変ウラシルまたはシトシンを含有し得る。ある実施形態において、ポリヌクレオチド中のウラシルの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、改変ウラシル（例えば、５−置換ウラシル）で置換される。改変ウラシルは、単一の独自の構造を有する化合物で置換され得、または異なる構造（例えば、２、３、４またはそれ以上の独自の構造）を有する複数の化合物で置換され得る。ある実施形態において、ポリヌクレオチド中のシトシンの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％が、改変シトシン（例えば、５−置換シトシン）で置換される。改変シトシンは、単一の独自の構造を有する化合物で置換され得、または異なる構造（例えば、２、３、４またはそれ以上の独自の構造）を有する複数の化合物で置換され得る。
ポリヌクレオチドの他の成分は、任意選択であり、ある実施形態において有益である。例えば、５’−非翻訳領域（ＵＴＲ：ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）および／または３’−ＵＴＲが提供され、ここで、いずれかまたは両方が、独立して、１つ以上のヌクレオシド改変を含有し得る。ある実施形態において、ヌクレオシド改変は、翻訳可能領域にも存在し得る。（例えば、５’−ＵＴＲにおいて）コザック配列を含有するポリヌクレオチドも提供される。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ポリ−Ａ領域を含む。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの５’−キャップ構造を含む。
特定の実施形態において、例えば、タンパク質産生の正確なタイミングが所望される場合、細胞に導入される改変ポリヌクレオチドを細胞内で分解するのが望ましい。したがって、本開示は、細胞内で指定の方法で作用させることが可能な分解ドメインを含有する改変ポリヌクレオチドを提供する。
さらに、ポリヌクレオチドから切除されることが可能な１つ以上のイントロンヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドが提供される。
さらに、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）を含有するポリヌクレオチドが提供される。ＩＲＥＳは、単独のリボソーム結合部位として作用し得るか、またはｍＲＮＡの複数のリボソーム結合部位の１つとして作用し得る。２つ以上の機能性リボソーム結合部位を含有するポリヌクレオチドは、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る（例えば、多シストロン性ｍＲＮＡ）。ポリヌクレオチドがＩＲＥＳを備えている場合、任意に、第２の翻訳可能領域がさらに提供される。本開示にしたがって使用され得るＩＲＥＳ配列の例としては、限定はされないが、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ：ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、ペストウイルス（ＣＦＦＶ：ｐｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス（ＰＶ：ｐｏｌｉｏ ｖｉｒｕｓ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ：ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ：ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ：ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ：ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ：ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）またはコオロギ麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ：ｃｒｉｃｋｅｔ ｐａｒａｌｙｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）に由来するものが挙げられる。
一般に、本開示の改変ポリヌクレオチドの最も短い長さは、ジペプチドをコードするのに十分なポリヌクレオチド配列の長さであり得る。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、トリペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、テトラペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、ペンタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、ヘキサペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、ヘプタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、オクタペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、ノナペプチドをコードするのに十分である。別の実施形態において、ポリヌクレオチド配列の長さは、デカペプチドをコードするのに十分である。
改変ポリヌクレオチド配列がコードすることができるジペプチドの例としては、限定はされないが、カルノシンおよびアンセリンが挙げられる。
さらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、３０ヌクレオチドを超える長さである。別の実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、３５ヌクレオチドを超える長さである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５０００ヌクレオチド、または５０００ヌクレオチド超である。
５’−キャップ構造
ポリヌクレオチドの５’−キャップ構造は、核外輸送に関与し、ポリヌクレオチド安定性を高め、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ：Ｃａｐ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合し、これは、ＣＢＰとポリ−Ａ結合タンパク質との結合を介して、細胞内のポリヌクレオチド安定性および翻訳能力に関与して、成熟環状ｍＲＮＡ種を形成する。キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシング中の５’−近位イントロン除去の除去を補助する。
内因性ポリヌクレオチド分子は、５’末端にキャッピングされて、ポリヌクレオチドの末端グアノシンキャップ残基と５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−三リン酸結合を形成し得る。次に、この５’−グアニル酸キャップは、メチル化されて、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を生成し得る。ポリヌクレオチドの５’末端の末端および／または末端前（ａｎｔｅｔｅｒｍｉｎａｌ）の転写ヌクレオチドのリボース糖はまた、任意に２’−Ｏ−メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解および切断による５’−キャップ除去は、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチド分子の分解にターゲティングすることができる。
本発明のポリヌクレオチドに対する改変は、非加水分解性キャップ構造を生成して、キャップ除去を防止し、それによってポリヌクレオチド半減期を増加させ得る。キャップ構造加水分解は、５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、改変ヌクレオチドが、キャッピング反応中に使用され得る。例えば、ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））製のワクシニアキャッピング酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）が、製造業者の指示にしたがって、α−チオ−グアノシンヌクレオチドとともに使用されて、５’−ｐｐｐ−５’キャップ内にホスホロチオエート結合を形成し得る。α−メチル−ホスホネートおよびセレノ−リン酸ヌクレオチドなどのさらなる改変グアノシンヌクレオチドが使用され得る。
さらなる改変としては、限定はされないが、糖の２’−ヒドロキシ基におけるポリヌクレオチドの５’末端および／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の２’−Ｏ−メチル化（上述される）が挙げられる。複数の異なる５’−キャップ構造を用いて、ｍＲＮＡ分子などのポリヌクレオチドの５’−キャップを生成することができる。
５’−キャップ構造としては、国際特許公開番号国際公開第２００８／１２７６８８号パンフレット、国際公開第２００８／０１６４７３号パンフレット、および国際公開第２０１１／０１５３４７号パンフレットに記載されるものが挙げられ、これらのそれぞれのキャップ構造は、参照により本明細書に援用される。
本明細書において合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造的もしくは機能性キャップ類似体とも呼ばれるキャップ類似体は、キャップ機能を保持しながら、その化学構造が天然の（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）５’−キャップとは異なる。キャップ類似体は、化学的に（すなわち、非酵素的に）または酵素的に合成され／ポリヌクレオチドに連結され得る。
例えば、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ：Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）キャップは、５’−５’−三リン酸基によって連結された２つのグアノシンを含有することができ、ここで、１つのグアノシンは、Ｎ７−メチル基ならびに３’−Ｏ−メチル基（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ、同様に３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと呼ばれ得る）を含有する。他方の非改変グアノシンの３’−Ｏ原子が、キャッピングされたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’末端ヌクレオチドに連結される。Ｎ７−および３’−Ｏ−メチル化グアノシンは、キャッピングされたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の末端部分を提供する。
別の例示的なキャップは、ｍＣＡＰであり、これは、ＡＲＣＡと類似しているが、グアノシン上に２’−Ｏ−メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−三リン酸−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
一実施形態において、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例として、米国特許第８，５１９，１１０号明細書（そのキャップ構造は、参照により本明細書に援用される）に記載されるジヌクレオチドキャップ類似体などのジヌクレオチドキャップ類似体は、様々なリン酸位置で、ボラノリン酸基またはホスホロセレノエート基で修飾され得る。
別の実施形態において、キャップ類似体は、当該技術分野において公知の、および／または本明細書に記載されるＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドキャップ類似体である。Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチドキャップ類似体の非限定的な例としては、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧおよびＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−ｍ３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、コア（Ｋｏｒｅ）ら著、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０１３年、第２１巻、ｐ．４５７０〜４５７４（そのキャップ構造は、参照により本明細書に援用される）に記載される様々なキャップ類似体およびキャップ類似体の合成方法を参照）。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドに有用なキャップ類似体は、４−クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
キャップ類似体は、インビトロ転写反応においてポリヌクレオチドの同時キャッピングを可能にするが、転写物の最大２０％がキャッピングされないままである。これは、内因性の細胞転写機構によって産生されたポリヌクレオチドの内因性５’−キャップ構造とのキャップ類似体の構造差とともに、翻訳能力の低下および細胞安定性の低下をもたらし得る。
本発明の改変ポリヌクレオチドはまた、より真正な（ｍｏｒｅ ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）５’−キャップ構造を生成するために、酵素を用いて転写後にキャッピングされ得る。本明細書において使用される際、「より真正な」という語句は、内因性または野生型の特徴と構造的または機能的に酷似しているか、またはそれを模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正な」特徴は、先行技術の合成の特徴または類似体と比較して、内因性、野生型、天然または生理学的な細胞機能、および／または構造をより良好に示し、または１つ以上の点で対応する内因性、野生型、天然、または生理学的な特徴より性能が優れている。本発明のポリヌクレオチドに有用なより真正な５’−キャップ構造の非限定的な例は、中でも特に、当該技術分野において公知の合成５’−キャップ構造（または野生型、天然または生理学的な５’−キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の増大した結合、増加した半減期、５’−エンドヌクレアーゼに対する低下した感受性、および／または減少した５’−キャップ除去を有するものである。例えば、組み換えワクシニアウイルスキャッピング酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）および組み換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素が、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアノシンキャップヌクレオチドとの間に標準５’−５’−三リン酸結合を形成することができ、ここで、キャップグアノシンは、Ｎ７−メチル化を含み、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルを含む。このような構造は、キャップ１構造と呼ばれる。キャップ２構造も、５’末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドに２’−Ｏ−メチルを含む。これらのキャップは、例えば、当該技術分野において公知の他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳能力、細胞安定性、および細胞の炎症促進性サイトカインの活性化の低下をもたらす。例示的なキャップ構造としては、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）、およびｍ（７）Ｇｐｐｐｍ（３）（６，６，２’）Ａｐｍ（２’）Ａｐｍ（２’）Ｃｐｍ（２）（３，２’）Ｕｐ（キャップ４）が挙げられる。
改変ポリヌクレオチドは、転写後にキャッピングされ得るため、また、このプロセスはより効率的であるため、ほぼ１００％の改変ポリヌクレオチドがキャッピングされ得る。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程でポリヌクレオチドに連結される場合の約８０％と対照的である。
本発明によれば、５’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明によれば、５’末端キャップは、グアノシン類似体を含み得る。有用なグアノシン類似体としては、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、および２−アジド−グアノシンが挙げられる。
一実施形態において、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、修飾５’−キャップを含有し得る。５’−キャップにおける修飾は、ポリヌクレオチドの安定性を高め、ポリヌクレオチドの半減期を増加させることができ、ポリヌクレオチド翻訳効率を高め得る。修飾５’−キャップとしては、限定はされないが、以下の修飾の１つ以上が挙げられる：キャッピングされたグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）の２’位および／または３’位における修飾、メチレン部分（ＣＨ２）による糖環酸素の置換（これにより炭素環が生成された）、キャップ構造の三リン酸架橋部分における修飾、または核酸塩基（Ｇ）部分における修飾。
５’−ＵＴＲ
５’−ＵＴＲは、本発明の改変ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）とのフランキング領域として提供され得る。５’−ＵＴＲは、本発明の改変ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）に見られるコード領域に対して相同的または異種であり得る。複数の５’−ＵＴＲが、フランキング領域に含まれてもよく、同じかまたは異なる配列のものであり得る。フランキング領域の任意の部分（皆無を含む）は、コドン最適化されてもよく、独立して、コドン最適化の前および／または後に、１つ以上の異なる構造的または化学的改変を含有し得る。
米国仮特許出願第６１／７７５，５０９明細書の表２１、ならびに米国仮特許出願第６１／８２９，３７２号明細書の表２１および表２２（これらは、参照により本明細書に援用される）に示されるのは、本発明の改変ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の開始および終止部位の一覧である。表２１において、各５’−ＵＴＲ（５’−ＵＴＲ−００５〜５’−ＵＴＲ ６８５１１）は、その天然または野生型（相同性）転写物に対するその開始および終止部位によって同定される（ＥＮＳＴ；ＥＮＳＥＭＢデータベースに使用される識別番号）。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の１つ以上の特性を改変するために、本発明の改変ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のコード領域と異種の５’−ＵＴＲが、本発明の化合物に操作により組み込まれ得る。次に、改変ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、細胞、組織または生物に投与され得、タンパク質レベル、局在化、および／または半減期などの結果が、測定されて、異種５’−ＵＴＲが本発明の改変ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）に対して与え得る有益な効果を評価し得る。Ａ、Ｔ、ＣまたはＧを含む１つ以上のヌクレオチドが末端に付加されるかまたは除去された５’−ＵＴＲの変異体が用いられ得る。５’−ＵＴＲはまた、コドン最適化されてもよく、または本明細書に記載される任意の方法で改変され得る。
５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、および翻訳エンハンサーエレメント（ＴＥＥ：Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｅｌｅｍｅｎｔ）
一実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲは、少なくとも１つの翻訳エンハンサーエレメントを含み得る。「翻訳エンハンサーエレメント」という用語は、ポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる配列を指す。非限定的な例として、ＴＥＥは、転写プロモータと開始コドンとの間に位置し得る。５’−ＵＴＲにおける少なくとも１つのＴＥＥを有するポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’−ＵＴＲにおけるキャップを含み得る。さらに、少なくとも１つのＴＥＥは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに位置して、キャップ依存性またはキャップ非依存性の翻訳を行い得る。
一態様において、ＴＥＥは、限定はされないが、キャップ依存性またはキャップ非依存性の翻訳などのポリヌクレオチドの翻訳活性を促進し得るＵＴＲにおける保存エレメントである。これらの配列の保存は、ヒトを含む１４種についてパネック（Ｐａｎｅｋ）ら（ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２０１３年、ｐ．１〜１０）によって既に示されている。
１つの非限定的な例では、公知のＴＥＥは、Ｇｔｘホメオドメインタンパク質の５’−リーダにあり得る（チャペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０１巻、ｐ．９５９０〜９５９４、２００４年（そのＴＥＥは、参照により本明細書に援用される））。
別の非限定的な例では、ＴＥＥは、米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号明細書において配列番号１〜３５として、米国特許出願公開第２０１３／０１７７５８１号明細書において配列番号１〜３５として、国際特許公開番号国際公開第２００９／０７５８８６号パンフレットにおいて配列番号１〜３５として、国際特許公開番号国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレットにおいて配列番号１〜５、および７〜６４５として、国際特許公開番号国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレットにおいて配列番号１として、米国特許第６，３１０，１９７号明細書において配列番号１として、ならびに米国特許第６，８４９，４０５号明細書において配列番号１として開示されており、これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に援用される。
さらに別の非限定的な例では、ＴＥＥは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ＨＣＶ−ＩＲＥＳまたはＩＲＥＳエレメント、例えば、限定はされないが、米国特許第７，４６８，２７５号明細書、米国特許出願公開第２００７／００４８７７６号明細書および同第２０１１／０１２４１００号明細書および国際特許公開番号国際公開第２００７／０２５００８号パンフレットおよび国際公開第２００１／０５５３６９号パンフレット（これらのそれぞれのＩＲＥＳ配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されるものであり得る。ＩＲＥＳエレメントとしては、限定はされないが、チャペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）ら（米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０１巻、ｐ．９５９０〜９５９４、２００４年）によって、およびチョウ（Ｚｈｏｕ）ら（米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０２巻、ｐ．６２７３〜６２７８、２００５年）によって、ならびに米国特許出願公開第２００７／００４８７７６および２０１１／０１２４１００および国際特許公開番号国際公開第２００７／０２５００８号パンフレット（これらのそれぞれのＩＲＥＳ配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されるＧｔｘ配列（例えば、Ｇｔｘ９−ｎｔ、Ｇｔｘ８−ｎｔ、Ｇｔｘ７−ｎｔ）が挙げられる。
「翻訳エンハンサーポリヌクレオチド」は、本明細書に例示されるか、および／または当該技術分野において開示される（例えば、米国特許第６，３１０，１９７号明細書、同第６，８４９，４０５号明細書、同第７，４５６，２７３号明細書、同第７，１８３，３９５号明細書、米国特許出願公開第２００９０／２２６４７０号明細書、同第２００７／００４８７７６号明細書、同第２０１１／０１２４１００号明細書、同第２００９／００９３０４９号明細書、同第２０１３／０１７７５８１号明細書、国際特許公開番号国際公開第２００９／０７５８８６号パンフレット、国際公開第２００７／０２５００８号パンフレット、国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット、国際公開第２００１／０５５３７１号パンフレット、国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレット、ならびに欧州特許第２６１０３４１号明細書および同第２６１０３４０号明細書（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に援用される）を参照）特定のＴＥＥの１つ以上またはそれらの変異体、相同体または機能的誘導体を含むポリヌクレオチドである。特定のＴＥＥの１つまたは複数のコピーが、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）に存在し得る。翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおけるＴＥＥは、１つ以上の配列セグメントにおいて構成され得る。配列セグメントは、本明細書に例示される特定のＴＥＥの１つ以上を保有することができ、各ＴＥＥは、１つ以上のコピーに存在する。複数の配列セグメントが、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドに存在する場合、それらは、相同的または異種であり得る。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチドにおける複数の配列セグメントは、本明細書に例示される特定のＴＥＥの同一または異なるタイプ、特定のＴＥＥのそれぞれの同一または異なる数のコピー、および／または各配列セグメント内のＴＥＥの同一または異なる構成を保有し得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、国際特許公開番号国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレット、国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット、国際公開第２００９／０７５８８６号パンフレット、国際公開第２００７／０２５００８号パンフレット、国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレット、欧州特許出願公開第２６１０３４１号明細書および同第２６１０３４０号明細書、米国特許第６，３１０，１９７号明細書、同第６，８４９，４０５、７，４５６，２７３号明細書、同第７，１８３，３９５号明細書、および米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号明細書、同第２０１１／０１２４１００号明細書、同第２００７／００４８７７６号明細書、同第２００９／００９３０４９号明細書、および同第２０１３／０１７７５８１号明細書（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に援用される）に記載される少なくとも１つのＴＥＥを含み得る。ＴＥＥは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに位置し得る。
別の実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号明細書、同第２００７／００４８７７６号明細書、同第２０１３／０１７７５８１号明細書および同第２０１１／０１２４１００号明細書、国際特許公開番号国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレット、国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット、国際公開第２００９／０７５８８６号パンフレットおよび国際公開第２００７／０２５００８号パンフレット、欧州特許出願公開第２６１０３４１および２６１０３４０号明細書、米国特許第６，３１０，１９７号明細書、６，８４９，４０５号明細書、同第７，４５６，２７３号明細書、同第７，１８３，３９５号明細書（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されるＴＥＥと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＴＥＥを含み得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または６０超のＴＥＥ配列を含み得る。本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同じかまたは異なるＴＥＥ配列であり得る。ＴＥＥ配列は、１回、２回、または３回超反復される、ＡＢＡＢＡＢ、ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、もしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、またはその変形などのパターンであり得る。これらのパターンにおいて、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＴＥＥ配列を表す。
一実施形態において、５’−ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を隔てるスペーサを含み得る。非限定的な例として、スペーサは、１５ヌクレオチドスペーサおよび／または当該技術分野において公知の他のスペーサであり得る。別の非限定的な例として、５’−ＵＴＲは、５’−ＵＴＲにおいて少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または１０回以上反復されるＴＥＥ配列−スペーサモジュールを含み得る。
別の実施形態において、２つのＴＥＥ配列を隔てるスペーサは、限定はされないが、ｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位およびｍｉＲシード）などの、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を調節し得る、当該技術分野において公知の他の配列を含み得る。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を隔てるのに使用される各スペーサは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の成分（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおけるＴＥＥは、米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号明細書、同第２００７／００４８７７６号明細書、同第２０１３／０１７７５８１号明細書および同第２０１１／０１２４１００号明細書、国際特許公開番号国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレット、国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット、国際公開第２００９／０７５８８６号パンフレットおよび国際公開第２００７／０２５００８号パンフレット、欧州特許出願公開第２６１０３４１号明細書および同第２６１０３４０号明細書、および米国特許第６，３１０，１９７、同第６，８４９，４０５号明細書、同第７，４５６，２７３号明細書、および同第７，１８３，３９５号明細書（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に援用される）に開示されるＴＥＥ配列を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％また９９％超含み得る。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおけるＴＥＥは、米国特許出願公開第２００９／０２２６４７０号明細書、同第２００７／００４８７７６号明細書、同第２０１３／０１７７５８１号明細書および２０１１／０１２４１００号明細書、国際特許公開番号国際公開第１９９９／０２４５９５号パンフレット、国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット、国際公開第２００９／０７５８８６号パンフレットおよび国際公開第２００７／０２５００８号パンフレット、欧州特許出願公開第２６１０３４１号明細書および同第２６１０３４０号明細書、および米国特許第６，３１０，１９７、同第６，８４９，４０５号明細書、同第７，４５６，２７３号明細書、および同第７，１８３，３９５号明細書（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に援用される）に開示されるＴＥＥ配列の５〜３０ヌクレオチド断片、５〜２５ヌクレオチド断片、５〜２０ヌクレオチド断片、５〜１５ヌクレオチド断片、５〜１０ヌクレオチド断片を含み得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおけるＴＥＥは、チャペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）ら（米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０１巻、ｐ．９５９０〜９５９４、２００４年）およびチョウ（Ｚｈｏｕ）ら（米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０２巻、ｐ．６２７３〜６２７８、２００５年）、ウェレンシーク（Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋ）ら（「ヒトキャップ非依存性翻訳促進エレメントのゲノムワイドプロファイリング（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）」、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２０１３年；ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）によって開示される補足表１および補足表２（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に援用される）に開示されるＴＥＥ配列を、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または９９％超含み得る。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲにおけるＴＥＥは、チャペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ）ら（米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０１巻、ｐ．９５９０〜９５９４、２００４年）およびチョウ（Ｚｈｏｕ）ら（米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１０２巻、ｐ．６２７３〜６２７８、２００５年）、ウェレンシーク（Ｗｅｌｌｅｎｓｉｅｋ）ら（「ヒトキャップ非依存性翻訳促進エレメントのゲノムワイドプロファイリング（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）」、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２０１３年；ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．２５２２）によって開示される補足表１および補足表２（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に援用される）に開示されるＴＥＥ配列の５〜３０ヌクレオチド断片、５〜２５ヌクレオチド断片、５〜２０ヌクレオチド断片、５〜１５ヌクレオチド断片、５〜１０ヌクレオチド断片を含み得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに使用されるＴＥＥは、限定はされないが、米国特許第７，４６８，２７５号明細書および国際特許公開番号国際公開第２００１／０５５３６９号パンフレット（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されるものなどのＩＲＥＳ配列である。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに使用されるＴＥＥは、米国特許出願公開第２００７／００４８７７６号明細書および同第２０１１／０１２４１００号明細書および国際特許公開番号国際公開第２００７／０２５００８号パンフレットおよび国際公開第２０１２／００９６４４号パンフレット（これらのそれぞれの方法は、参照により本明細書に援用される）に記載される方法によって同定され得る。
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに使用されるＴＥＥは、米国特許第７，４５６，２７３号明細書および同第７，１８３，３９５号明細書、米国特許出願公開第２００９／００９３０４９号明細書、および国際公開番号国際公開第２００１／０５５３７１号パンフレット（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に援用される）に記載される転写調節エレメントであり得る。転写調節エレメントは、限定はされないが、米国特許第７，４５６，２７３号明細書および同第７，１８３，３９５号明細書、米国特許出願公開第２００９／００９３０４９号明細書、および国際公開番号国際公開第２００１／０５５３７１号パンフレット（これらのそれぞれの方法は、参照により本明細書に援用される）に記載される方法などの、当該技術分野において公知の方法によって同定され得る。
さらに別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲに使用されるＴＥＥは、米国特許第７，４５６，２７３号明細書および同第７，１８３，３９５号明細書、米国特許出願公開第２００９／００９３０４９号明細書、および国際公開番号国際公開第２００１／０５５３７１号パンフレット（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されるポリヌクレオチドまたはその部分である。
本明細書に記載される少なくとも１つのＴＥＥを含む５’−ＵＴＲは、限定はされないが、ベクター系またはポリヌクレオチドベクターなどの単シストロン性配列に組み込まれ得る。非限定的な例として、ベクター系およびポリヌクレオチドベクターは、米国特許第７，４５６，２７３号明細書および同第７，１８３，３９５号明細書、米国特許出願公開第２００７／００４８７７６号明細書、同第２００９／００９３０４９号明細書および同第２０１１／０１２４１００号明細書、および国際特許公開番号国際公開第２００７／０２５００８号パンフレットおよび国際公開第２００１／０５５３７１号パンフレット（これらのそれぞれのＴＥＥ配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されるものを含み得る。
一実施形態において、本明細書に記載されるＴＥＥは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲに位置し得る。３’−ＵＴＲに位置するＴＥＥは、５’−ＵＴＲに位置するか、および／または５’−ＵＴＲへの組み込みについて記載されるＴＥＥと同じかおよび／または異なり得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５または６０超のＴＥＥ配列を含み得る。本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲにおけるＴＥＥ配列は、同じかまたは異なるＴＥＥ配列であり得る。ＴＥＥ配列は、１回、２回、または３回超反復される、ＡＢＡＢＡＢ、ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ、もしくはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、またはその変形などのパターンであり得る。これらのパターンにおいて、各文字、Ａ、Ｂ、またはＣは、ヌクレオチドレベルで異なるＴＥＥ配列を表す。
一実施形態において、３’−ＵＴＲは、２つのＴＥＥ配列を隔てるスペーサを含み得る。非限定的な例として、スペーサは、１５ヌクレオチドスペーサおよび／または当該技術分野において公知の他のスペーサであり得る。別の非限定的な例として、３’−ＵＴＲは、３’−ＵＴＲにおいて少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または１０回以上反復されるＴＥＥ配列−スペーサモジュールを含み得る。
別の実施形態において、２つのＴＥＥ配列を隔てるスペーサは、限定はされないが、本明細書に記載されるｍｉＲ配列（例えば、ｍｉＲ結合部位およびｍｉＲシード）などの、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を調節し得る、当該技術分野において公知の他の配列を含み得る。非限定的な例として、２つのＴＥＥ配列を隔てるのに使用される各スペーサは、異なるｍｉＲ配列またはｍｉＲ配列の成分（例えば、ｍｉＲシード配列）を含み得る。
一実施形態において、ｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の組み込みは、ステムループ領域の形状を変化させ、これは、翻訳を増加および／または減少させ得る（例えば、ケデ（Ｋｅｄｄｅ）ら著、「ｐ２７−３’ＵＴＲにおけるプミリオ誘導のＲＮＡ構造スイッチは、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２接近性を制御する（Ａ Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ ｐ２７−３’ＵＴＲ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）」．ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．２０１０年を参照）。
センサー配列
一実施形態において、本発明の改変ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリペプチドだけでなく、センサー配列もコードし得る。センサー配列としては、例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列、および／またはモチーフ、または内因性ポリヌクレオチド結合分子の疑似受容体として作用するように操作された人工結合部位が挙げられる。少なくとも１つのセンサー配列を含むポリヌクレオチドの非限定的な例は、米国仮特許出願第６１／７５３，６６１号明細書、同第６１／７５４，１５９号明細書、同第６１／７８１，０９７号明細書、同第６１／８２９，３３４号明細書、同第６１／８３９，８９３号明細書、同第６１／８４２，７３３号明細書、および同第６１／８５７，３０４号明細書（これらのそれぞれのセンサー配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されている。
一実施形態において、標的細胞または組織のマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）プロファイリングが、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡの存在または非存在を決定するために行われる。
複数のｍｉＲＮＡ（または１つのｍｉＲＮＡ）は、１９〜２５ヌクレオチドの長さの非コードＲＮＡであり、これは、ポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに結合し、ポリヌクレオチド安定性を低下させるか、または翻訳を阻害することによって、遺伝子発現を下方制御する。本発明の改変ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列、ｍｉＲＮＡ配列、またはｍｉＲＮＡシードを含み得る。このような配列は、米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書および同第２００５／００５９００５号明細書（これらのｍｉＲＮＡ配列は、参照により本明細書に援用される）に教示されるものなどの任意の公知のｍｉＲＮＡに対応し得る。
ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位の領域にある配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソン−クリック相補性を有する。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２〜８位または２〜７位を含み得る。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、７ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含んでもよく、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補性部位は、ｍｉＲＮＡ１位と向かい合うアデノシン（Ａ）に隣接される。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡシードは、６ヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含んでもよく、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補性部位は、ｍｉＲＮＡ１位と向かい合うアデノシン（Ａ）に隣接される。例えば、グリムソンＡ（Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ）、ファーＫＫ（Ｆａｒｈ ＫＫ）、ジョンストンＷＫ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ）、ギャレット−エンジェレＰ（Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ）、リムＬＰ（Ｌｉｍ ＬＰ）、バーテルＤＰ（Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ）；モレキュラー・セル（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．）、２００７年７月６日；第２７巻、１号、ｐ．９１〜１０５を参照されたい。ｍｉＲＮＡシードの塩基は、標的配列との完全な相補性を有する。当該ｍｉＲＮＡが入手可能である場合、ｍｉＲＮＡ標的配列を、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲに操作により組み込むことによって、分解または減少した翻訳のために分子をターゲティングすることができる。このプロセスは、ポリヌクレオチド分子送達時のオフターゲット効果の危険性を低減するであろう。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ標的領域の同定、それらの発現パターン、および生物学におけるそれらの役割が報告されている（例えば、ボナウアー（Ｂｏｎａｕｅｒ）ら著、カレント・ドラッグ・ターゲット（Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ）、２０１０年、第１１巻、ｐ．９４３〜９４９；アナンド（Ａｎａｎｄ）およびチェレシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１７１〜１７６；コントレラス（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ）およびラオ（Ｒａｏ）著、リューケミア（Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、２０１２年、第２６巻、ｐ．４０４〜４１３（２０１１年１２月２０日．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）著、セル（Ｃｅｌｌ）、２００９年、第１３６巻、ｐ．２１５〜２３３；ランドグラフ（Ｌａｎｄｇｒａｆ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、２００７年、第１２９巻、ｐ．１４０１〜１４１４；ジェントナー（Ｇｅｎｔｎｅｒ）およびナルジニ（Ｎａｌｄｉｎｉ）著、ティシュー・アンチゲン（Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ）．２０１２年、第８０巻、ｐ．３９３〜４０３；およびその全ての参照文献を参照されたい）。
例えば、ポリヌクレオチドが、肝臓に送達されることは意図されないが、そこに到達する場合、肝臓に豊富なｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１２２は、ｍｉＲ−１２２の１つまたは複数の標的部位が改変ポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに操作により組み込まれる場合、目的のポリペプチドの発現を阻害することができる。様々なｍｉＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位の導入は、改変ポリヌクレオチドの寿命、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに減少させるように操作され得る。本明細書において使用される際、「ｍｉＲＮＡ部位」という用語は、ｍｉＲＮＡ標的部位またはｍｉＲＮＡ認識部位、またはｍｉＲＮＡが結合もしくは会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」は、伝統的なワトソン−クリックハイブリダイゼーション規則にしたがうか、またはｍｉＲＮＡ部位におけるまたはそれに隣接した標的配列とのｍｉＲＮＡの任意の安定した会合を反映し得ることが理解されるべきである。
逆に、本発明の改変ポリヌクレオチドのために、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特定の組織におけるタンパク質発現を増加させるために、それらが自然に存在する配列から操作により取り出す（すなわち、除去する）ことができる。例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位は、肝臓におけるタンパク質発現を向上させるために除去され得る。
一実施形態において、本発明の改変ポリヌクレオチドは、細胞傷害性または細胞保護性ポリヌクレオチド治療薬を、限定はされないが、正常なおよび／または癌性細胞（例えば、ＨＥＰ３ＢまたはＳＮＵ４４９）などの特定の細胞に向けるために、３’−ＵＴＲに少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−結合部位を含み得る。
別の実施形態において、本発明の改変ポリヌクレオチドは、細胞傷害性または細胞保護性ポリヌクレオチド治療薬を、限定はされないが、正常な、および／または癌性細胞（例えば、ＨＥＰ３ＢまたはＳＮＵ４４９）などの特定の細胞に向けるために、３’−ＵＴＲに３つのｍｉＲＮＡ−結合部位を含み得る。
複数の組織の発現の調節は、１つまたはいくつかのポリヌクレオチド結合部位の導入および／または除去によって行うことができる。ｍｉＲＮＡ結合部位の除去および／または挿入、または任意の組合せの決定は、疾患におけるｍｉＲＮＡ発現パターンおよびそれらのプロファイリングに左右される。
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡを調節し、それによってタンパク質発現を調節することが知られている組織の例としては、限定はされないが、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、および肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられる。
具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹枝状細胞およびマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、およびナチュラルキラー細胞において異なって発現されることが知られている。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染、炎症に対する免疫−応答、ならびに遺伝子療法および組織／臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与している。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡはまた、免疫細胞の発生、増殖、分化およびアポトーシスの多くの局面を調節する。例えば、ｍｉＲ−１４２およびｍｉＲ−１４６は、免疫細胞のみにおいて発現され、特に、骨髄樹枝状細胞に豊富である。外因性ポリヌクレオチドに対する免疫応答が、ｍｉＲ−１４２結合部位を、送達された遺伝子構築物の３’−ＵＴＲに加えることによって遮断され、組織および細胞におけるより安定した遺伝子導入を可能にすることが当該技術分野において実証された。ｍｉＲ−１４２は、抗原提示細胞における外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入された細胞の細胞傷害性除去を抑制する（例えば、アンノイＡ（Ａｎｎｏｎｉ Ａ）ら著、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２００９年、第１１４巻、ｐ．５１５２〜５１６１；ブラウンＢＤ（Ｂｒｏｗｎ ＢＤ）ら著、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ Ｍｅｄ．）、２００６年、第１２巻、５号、ｐ．５８５〜５９１；およびブラウンＢＤ（Ｂｒｏｗｎ ＢＤ）ら著、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、２００７年、第１１０巻、１３号、ｐ．４１４４〜４１５２を参照）。
抗原媒介性免疫応答は、外来抗原によって引き起こされる免疫応答を指すことができ、これは、生物に侵入すると、抗原提示細胞によってプロセシングされ、抗原提示細胞の表面に示される。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識し、抗原を発現する細胞の細胞傷害性除去を誘導することができる。
ｍｉＲ−１４２結合部位を、本発明のポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに導入することにより、ｍｉＲ−１４２媒介性ポリヌクレオチド分解によって、抗原提示細胞における遺伝子発現を選択的に抑制することができ、ＡＰＣ（例えば、樹枝状細胞）における抗原提示を制限し、それによって、ポリヌクレオチドの送達の後、抗原媒介性免疫応答を防ぐことができる。したがって、ポリヌクレオチドは、細胞傷害性除去を引き起こさずに、標的組織または細胞において安定して発現される。
一実施形態において、免疫細胞、特に、抗原提示細胞において発現されることが知られているｍｉＲＮＡ結合部位は、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現されない非免疫細胞においてポリヌクレオチドの発現を維持しながら、抗原媒介性免疫応答を抑制するよう、ｍｉＲＮＡ媒介性ポリヌクレオチド分解によって、ＡＰＣにおけるセンサー−シグナルポリヌクレオチドの発現を抑制するようにポリヌクレオチドに操作により組み込まれ得る。例えば、肝臓特異的タンパク質発現によって引き起こされる免疫原性反応を防ぐために、ｍｉＲ−１２２結合部位は、除去され得、ｍｉＲ−１４２（および／またはｍｉＲ−１４６）結合部位は、ポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに操作により組み込まれ得る。
ＡＰＣおよびマクロファージにおけるポリヌクレオチドの選択的分解および抑制をさらに駆動するために、ポリヌクレオチドは、３’−ＵＴＲに別の負の調節エレメントを、単独でまたはｍｉｒ−１４２および／またはｍｉｒ−１４６結合部位と組み合わせて含み得る。非限定的な例として、１つの調節エレメントは、構成的崩壊エレメント（ＣＤＥ：Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｄｅｃａｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）である。
一実施形態において、胚性幹細胞特異的ｍｉＲＮＡの結合部位は、ポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに含まれるかまたはそれから除去されて、胚性幹細胞の発生および／または分化を調節し、変性状態（例えば、変性疾患）の幹細胞の老化を抑制し、または病的状態の幹細胞（例えば、癌幹細胞）の老化およびアポトーシスを刺激することができる。
非限定的な例として、特定の癌および／または腫瘍細胞において過剰発現されるｍｉＲＮＡ部位は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲから除去されて、癌細胞における過剰発現ｍｉＲＮＡによって抑制される発現を回復し、それによって、対応する生物学的機能、例えば、転写刺激および／または抑制、細胞周期停止、アポトーシス、および細胞死を改善することができる。ｍｉＲＮＡ発現が上方制御されていない正常細胞および組織は、影響されないままになる。
ｍｉＲＮＡはまた、血管新生などの複雑な生物学的過程を制御することができる（ｍｉＲ−１３２）（アナンド（Ａｎａｎｄ）およびチェレシュ（Ｃｈｅｒｅｓｈ）著、カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ）、２０１１年、第１８巻、ｐ．１７１〜１７６）。本発明の改変ポリヌクレオチドにおいて、このようなプロセスに関与するｍｉＲＮＡのための結合部位は、改変ポリヌクレオチド発現の発現を、生物学的に関連する細胞型または関連する生物学的過程の状況に合わせるために、除去または導入され得る。これに関して、ポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドとして定義される。
ｍｉＲＮＡ遺伝子調節は、限定はされないが、周辺配列の種、配列の型（例えば、異種、相同性、または人工的）、周辺配列の調節エレメントおよび／または周辺配列の構造エレメントなどの、ｍｉＲＮＡの周辺の配列に影響され得る。ｍｉＲＮＡは、５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲに影響され得る。非限定的な例として、非ヒト３’−ＵＴＲは、同じ配列型のヒト３’−ＵＴＲと比較して、目的のポリペプチドの発現に対するｍｉＲＮＡ配列の調節効果を増加させ得る。
一実施形態において、５’−ＵＴＲの他の調節エレメントおよび／または構造エレメントが、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子調節に影響を与え得る。調節エレメントおよび／または構造エレメントの一例は、５’ＵＴＲにおける構造化ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）であり、これは、翻訳伸長因子の結合がタンパク質翻訳を開始させるのに必要である。５’−ＵＴＲにおけるこの二次構造化エレメントに結合するＥＩＦ４Ａ２は、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子発現に必要である（例えば、メイジャーＨＡ（Ｍｅｉｊｅｒ ＨＡ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１３年、第３４０巻、ｐ．８２〜８５を参照）。本発明の改変ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子調節を促進するために、この構造化５’−ＵＴＲを含むようにさらに改変され得る。
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ部位は、本発明の改変ポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに操作により組み込まれ得る。これに関して、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ部位が、本発明のポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに操作により組み込まれ得る。一実施形態において、改変ポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ部位は、同じであっても、または異なるｍｉＲＮＡ部位であってもよい。別の実施形態において、改変ポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ部位は、身体の同じかまたは異なる組織をターゲティングし得る。非限定的な例として、改変ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲへの組織型、細胞型、または疾患特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入によって、特定の細胞型（例えば、肝細胞、骨髄細胞、内皮細胞、癌細胞）における発現の程度は減少され得る。
一実施形態において、ｍｉＲＮＡ部位は、３’−ＵＴＲの５’末端付近、３’−ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間、および／または３’−ＵＴＲの３’末端付近に操作により配置され得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ部位は、３’−ＵＴＲの５’末端付近および３’−ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間に操作により配置され得る。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ部位は、３’−ＵＴＲの３’末端付近および３’−ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間に操作により配置され得る。さらに別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ部位は、３’−ＵＴＲの５’末端付近および３’−ＵＴＲの３’末端付近に操作により配置され得る。
別の実施形態において、３’−ＵＴＲは、４つのｍｉＲＮＡ部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ部位は、完全なｍｉＲＮＡ結合部位、ｍｉＲＮＡシード配列、および／またはシード配列なしのｍｉＲＮＡ結合部位配列であり得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、抗原提示細胞による抗原提示を弱めるために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含むように操作され得る。ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡシード配列、シードなしのｍｉＲＮＡ配列またはそれらの組合せであり得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例として、抗原提示を弱めるために本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐである。
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、対象の様々な組織において発現されるｍｉＲＮＡ部位を含むように操作され得る。非限定的な例として、本発明の改変ポリヌクレオチドは、対象の肝臓および腎臓における改変ポリヌクレオチドの発現を調節するために、ｍｉＲ−１９２およびｍｉＲ−１２２を含むように操作され得る。別の実施形態において、改変ポリヌクレオチドは、同じ組織に２つ以上のｍｉＲＮＡ部位を含むように操作され得る。例えば、本発明の改変ポリヌクレオチドは、対象の内皮細胞における改変ポリヌクレオチドの発現を調節するために、ｍｉＲ−１７−９２およびｍｉＲ−１２６を含むように操作され得る。
一実施形態において、本発明の、シグナルをコードする改変ポリヌクレオチド（本明細書においてポリヌクレオチドとも呼ばれる）によってコードされる標的ポリペプチドに関連する治療濃度域およびまたは差次的発現が改変され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、当該細胞のｍｉＲＮＡシグネチャによって、癌細胞において死シグナル（または正常細胞における生存シグナル）がより高度に発現されるように設計され得る。癌細胞がより低いレベルの特定のｍｉＲＮＡを発現する場合、そのｍｉＲＮＡ（または複数のｍｉＲＮＡ）の結合部位をコードするポリヌクレオチドは、より高度に発現され得る。したがって、ポリヌクレオチドによってコードされる標的ポリペプチドは、細胞死を引き起こすかまたは誘導するタンパク質として選択される。同じｍｉＲＮＡのより高度な発現を有する隣接する非癌細胞は、３’−ＵＴＲにおいてコードされた結合部位または「センサー」に結合するｍｉＲＮＡの作用によって、ポリヌクレオチドがより低いレベルで発現され得るため、コードされた死シグナルによる影響が少ない。逆に、細胞生存または細胞保護性シグナルは、癌細胞においてｍｉＲＮＡがより高度な発現を有する癌および非癌性細胞を含む組織に送達され得、その結果、癌細胞にはより低い生存シグナル、および正常細胞にはより大きい生存シグネチャになる。以前のパラダイムにしたがって様々なシグナルを有する複数のポリヌクレオチドが、設計され、投与され得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチドの発現は、少なくとも１つのセンサー配列をポリヌクレオチドに組み込み、ポリヌクレオチドを製剤化することによって制御され得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドにｍｉＲ−１２２結合部位を組み込み、カチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡを含む脂質ナノ粒子に製剤化することによって、同所性腫瘍にターゲティングされ得る。
本発明によれば、ポリヌクレオチドは、当該技術分野の他のポリペプチドコード分子の欠損を回避するように改変され得る。したがって、この実施形態において、ポリヌクレオチドは、改変ポリヌクレオチドと呼ばれる。
様々な細胞型におけるｍｉＲＮＡの発現パターンを理解することによって、改変ポリヌクレオチドは、特定の細胞型において、または特定の生物学的条件下のみにおいて、より標的化された発現のために操作され得る。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入によって、組織においてまたは生物学的条件下において、タンパク質発現に最適であり得る改変ポリヌクレオチドが設計され得る。
操作された改変ポリヌクレオチドおよびタンパク質産生を用いて、トランスフェクション実験を、関連する細胞株において行うことができ、トランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば、様々なｍｉＲＮＡ結合部位−操作ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）で細胞をトランスフェクトし、関連タンパク質にＥＬＩＳＡキットを用いて、トランスフェクションから６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日後に産生されたタンパク質をアッセイすることができる。製剤化された改変ポリヌクレオチドの組織特異的発現の変化を調べるために、ｍｉＲＮＡ−結合部位−操作分子を用いて、インビボ実験を行うこともできる。
ある実施形態において、改変ポリヌクレオチドは、公知のシード配列に対する１００％の同一性を有するかまたはシード配列に対する１００％未満の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合領域部位を組み込むように設計され得る。シード配列は、ｍｉＲＮＡ結合親和性を低減し、ひいてはそのポリヌクレオチド転写物の下方制御を低減するように部分的に突然変異され得る。本質的に、標的ポリヌクレオチドとｍｉＲＮＡシードとの間のマッチまたはミスマッチの程度が、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力をより細かく調整するレオスタットとして働き得る。さらに、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域の突然変異も、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力に影響を与え得る。
一実施形態において、ｍｉＲ配列は、ステムループのループに組み込まれ得る。
別の実施形態において、ｍｉＲシード配列は、ステムループのループに組み込まれ得、ｍｉＲ結合部位は、ステムループの５’−または３’−ステムに組み込まれ得る。
一実施形態において、ＴＥＥは、ステムループのステムの５’末端に組み込まれ得、ｍｉＲシードは、ステムループのステムに組み込まれ得る。別の実施形態において、ＴＥＥは、ステムループのステムの５’末端に組み込まれ得、ｍｉＲシードは、ステムループのステムに組み込まれ得、および／またはｍｉＲ結合部位は、ステムの３’末端またはステムループ後の配列に組み込まれ得る。ｍｉＲシードおよびｍｉＲ結合部位は、同じかおよび／または異なるｍｉＲ配列であり得る。
一実施形態において、ｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の組み込みは、ステムループ領域の形状を変化させ、これは、翻訳を増加および／または減少させ得る（例えば、ケデ（Ｋｅｄｄｅ）ら著、ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．２０１０年を参照）。
一実施形態において、ｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の組み込みは、ステムループ領域の形状を変化させ、これは、翻訳を増加および／または減少させ得る（例えば、ケデ（Ｋｅｄｄｅ）ら著、ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．２０１０年を参照）。
一実施形態において、５’−ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ配列は、限定はされないが、１９または２２ヌクレオチド配列および／またはシードなしのｍｉＲＮＡ配列であり得る。
一実施形態において、５’−ＵＴＲにおけるｍｉＲＮＡ配列は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を安定させるのに使用され得る。
別の実施形態において、５’−ＵＴＲにおけるｍｉＲＮＡ配列は、限定はされないが、開始コドンなどの翻訳開始部位の接近性を低減するのに使用され得る。マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）ら（プロス・ワン（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ）．２０１０年、第１１巻、５号、ｅ１５０５７）は、第１の開始コドン（ＡＵＧ）に対する接近性を低減するために、開始コドン（−４〜＋３７、ここで、ＡＵＧコドンのＡは＋１である）周辺のアンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）オリゴヌクレオチドおよびエキソン接合部複合体（ＥＪＣ：ｅｘｏｎ−ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）を使用した。マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）は、ＬＮＡまたはＥＪＣで開始コドン周辺の配列を改変することによって、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の効率性、長さ、および構造的安定性が影響されることを示した。本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、翻訳開始部位に対する接近性を低減するために、翻訳開始部位付近に、マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）らによって記載されるＬＮＡまたはＥＪＣ配列の代わりに、ｍｉＲＮＡ配列を含み得る。翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前、後またはその中にあり得る。非限定的な例として、翻訳開始部位は、シード配列または結合部位などのｍｉＲＮＡ配列内に位置し得る。別の非限定的な例として、翻訳開始部位は、シード配列またはｍｉｒ−１２２結合部位などのｍｉＲ−１２２配列内に位置し得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、抗原提示細胞による抗原提示を弱めるために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡシード配列、シードなしのｍｉＲＮＡ配列またはそれらの組合せであり得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれるｍｉＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例として、抗原提示を弱めるために本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐである。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、目的の細胞におけるコードされたポリペプチドの発現を弱めるために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、肝臓における目的のコードされたポリペプチドの発現を弱めるために、少なくとも１つのｍｉＲ−１２２結合部位を含み得る。別の非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−３ｐシード配列、シードなしのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐシード配列、シードなしのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４６結合部位、ｍｉＲ−１４６シード配列および／またはシード配列なしのｍｉＲ−１４６結合部位を含み得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、治療薬送達によって引き起こされる望ましくない免疫原性反応を抑制するために、免疫細胞内のポリヌクレオチド治療薬を選択的に分解するために、３’−ＵＴＲに少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、抗原提示細胞においてより不安定な改変ポリヌクレオチドであり得る。これらのｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、ｍｉｒ−１４２−５ｐ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４６ａ−５ｐおよびｍｉｒ−１４６−３ｐが挙げられる。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用し得るポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の領域に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ：ＲＮＡ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のためのＲＮＡモチーフ
ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）は、限定はされないが、ＲＮＡスプライシング、局在化、翻訳、ターンオーバ、ポリアデニル化、キャッピング、改変、輸送および局在化などの、同時転写および転写後遺伝子発現の多くの局面を調節することができる。限定はされないが、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲ）およびｈｎＲＮＰ Ｋ−相同性（ＫＨ：Ｋ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメインなどのＲＮＡ−結合ドメイン（ＲＢＤ：ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）は、典型的に、ＲＢＰおよびそれらのＲＮＡ標的の間の配列結合を調節する（レイ（Ｒａｙ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１３年、第４９９巻、ｐ．１７２〜１７７）。一実施形態において、標準ＲＢＤは、短いＲＮＡ配列に結合し得る。別の実施形態において、標準ＲＢＤは、構造ＲＮＡを認識し得る。
一実施形態において、目的のポリヌクレオチドの安定性を高めるために、ＨｕＲをコードするポリヌクレオチドが、目的のポリヌクレオチドと一緒に、細胞または組織に同時トランスフェクトまたは同時注入され得る。これらのタンパク質はまた、目的のポリヌクレオチドにインビトロで連結され、次に、一緒に細胞に投与され得る。ポリＡ結合タンパク質、ＰＡＢＰは、真核翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇと相互作用して、翻訳開始を刺激する。ポリヌクレオチド薬剤と一緒にこれらのＲＢＰをコードするポリヌクレオチドを同時投与し、および／またはこれらのタンパク質をポリヌクレオチド薬剤にインビトロで連結し、タンパク質結合ポリヌクレオチドを細胞に投与することによって、ポリヌクレオチドの翻訳効率を高めることができる。同じ考えが、様々な翻訳因子および促進因子をコードするポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチド安定性および／または翻訳効率に影響を与えるタンパク質自体とのポリヌクレオチドの同時投与に拡大され得る。
一実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、限定はされないが、ＲＮＡ−結合ドメイン（ＲＢＤ）などの少なくとも１つのＲＮＡ−結合モチーフを含み得る。
一実施形態において、ＲＢＤは、レイ（Ｒａｙ）ら（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１３年、第４９９巻、ｐ．１７２〜１７７（そのＲＢＤ配列は、参照により本明細書に援用される））によって記載されるＲＢＤ、その断片、または変異体のいずれかであり得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、少なくとも１つのＲＮＡ−結合ドメイン（ＲＢＤ）のための配列を含み得る。本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）が、２つ以上のＲＢＤを含む場合、ＲＢＤは、同じ種あるいは同じ構造クラスに由来する必要はない。
一実施形態において、少なくとも１つのフランキング領域（例えば、５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲ）は、少なくとも１つのＲＢＤを含み得る。別の実施形態において、第１のフランキング領域および第２のフランキング領域は両方とも、少なくとも１つのＲＢＤを含み得る。ＲＢＤは、同じであってもよく、またはＲＢＤのそれぞれが、他のＲＢＤに対する少なくとも６０％の配列同一性を有し得る。非限定的な例として、少なくとも１つのＲＢＤは、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’−ＵＴＲの前、後、および／またはその中に位置し得る。別の非限定的な例として、少なくとも１つのＲＢＤは、３’−ＵＴＲの最初の３００ヌクレオシドの前またはその中に位置し得る。
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、連結したヌクレオシドの第１の領域に少なくとも１つのＲＢＤを含み得る。ＲＢＤは、コード領域（例えば、ＯＲＦ）の前、後、またはその中に位置し得る。
さらに別の実施形態において、連結したヌクレオシドの第１の領域および／または少なくとも１つのフランキング領域は、少なくとも１つのＲＢＤを含み得る。非限定的な例として、連結したヌクレオシドの第１の領域は、スプライシング因子に関連するＲＢＤを含んでもよく、少なくとも１つのフランキング領域は、安定性のためのＲＢＤおよび／または翻訳因子を含み得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）のコードおよび／または非コード領域に位置する少なくとも１つのＲＢＤを含み得る。
一実施形態において、少なくとも１つのＲＢＤは、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の安定性を高めるために、少なくとも１つのフランキング領域に組み込まれ得る。
一実施形態において、ＲＮＡ結合タンパク質モチーフにおけるｍｉＲＮＡ配列は、限定はされないが、開始コドンなどの翻訳開始部位の接近性を低減するのに使用され得る。本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、翻訳開始部位に対する接近性を低減するために、翻訳開始部位付近に、マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）らによって記載されるＬＮＡまたはＥＪＣ配列の代わりに、ｍｉＲＮＡ配列を含み得る。翻訳開始部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前、後、またはその中にあり得る。非限定的な例として、翻訳開始部位は、シード配列または結合部位などのｍｉＲＮＡ配列内に位置し得る。別の非限定的な例として、翻訳開始部位は、シード配列またはｍｉｒ−１２２結合部位などのｍｉＲ−１２２配列内に位置し得る。
別の実施形態において、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチドおよびエキソン接合部複合体（ＥＪＣ）は、ＲＮＡ結合タンパク質モチーフに使用され得る。ＬＮＡおよびＥＪＣは、第１の開始コドン（ＡＵＧ）に対する接近性を低減するために、開始コドン（−４〜＋３７、ここで、ＡＵＧコドンのＡは＋１である）周辺に使用され得る。
３’−ＵＴＲおよび三重らせん
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、改変ポリヌクレオチドの３’末端に三重らせんを含み得る。本発明のポリヌクレオチドの３’末端は、三重らせんを、単独でまたはポリ−Ａ領域と組み合わせて含み得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも第１および第２のＵリッチ領域、第１および第２の領域の間の保存ステムループ領域、および／またはＡリッチ領域を含み得る。第１および第２のＵリッチ領域およびＡリッチ領域は、結合して、ポリヌクレオチドの３’末端に三重らせんを形成し得る。この三重らせんは、ポリヌクレオチドを安定させ、ポリヌクレオチドの翻訳効率を高め、および／または３’末端を分解から保護し得る。例示的な三重らせんは、限定はされないが、転移関連肺腺癌転写物１（ＭＡＬＡＴ１：ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ １）、ＭＥＮ−βおよびポリアデニル化核（ＰＡＮ：ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ）ＲＮＡの三重らせん配列を含む（ウィルツ（Ｗｉｌｕｓｚ）ら著、ジーン・アンド・ディベロップメント（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、２０１２年、第２６巻、ｐ．２３９２〜２４０７（その三重らせん配列は、参照により本明細書に援用される）を参照）。一実施形態において、本発明の改変ポリヌクレオチドの３’末端は、ＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴ（配列番号１）を含む第１のＵリッチ領域、ＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴ（配列番号２）またはＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴ（配列番号３）を含む第２のＵリッチ領域、および／またはＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡ（配列番号４）を含むＡリッチ領域を含む。別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの３’末端は、第１のＵリッチ領域、保存領域、第２のＵリッチ領域、およびＡリッチ領域を含む三重らせん形成構造を含む。
一実施形態において、三重らせんは、クローバ葉構造の前に、ＭＡＬＡＴ１配列の切断から形成され得る。理論に制約されることは意図しないが、ＭＡＬＡＴ１は、長い非コードＲＮＡであり、これは、切断されると、三重らせんおよびｔＲＮＡ様クローバ葉構造を形成する。その際、ＭＡＬＡＴ１転写物は、核スペックルに局在し、ｔＲＮＡ様クローバ葉は、細胞質に局在する（例えば、ウィルツ（Ｗｉｌｕｓｚ）ら著、セル（Ｃｅｌｌ）、２００８年、第１３５巻、５号、ｐ．９１９〜９３２を参照）。
非限定的な例として、その際、ＭＡＬＡＴ１配列を含む本発明のポリヌクレオチドの末端は、クローバ葉構造からのＲＮａｓｅＰ切断の後、三重らせん構造を形成することができ、これは、ポリヌクレオチドを安定させる（例えば、パート（Ｐｅａｒｔ）ら著、「非ｍＲＮＡ３’末端形成：いかに残りの半分が生存するか（Ｎｏｎ−ｍＲＮＡ ３’−ｅｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｈｏｗ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｈａｌｆ ｌｉｖｅｓ）」；ＷＩＲＥｓ ＲＮＡ ２０１３年を参照）。
一実施形態において、本明細書に記載されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＭＡＬＡＴ１配列を含む。別の実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリアデニル化され得る。さらに別の実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリアデニル化されていないが、非改変ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）と比較して、分解に対する増加した抵抗性を有する。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、第２のフランキング領域（例えば、３’−ＵＴＲ）にＭＡＬＡＴ１配列を含み得る。非限定的な例として、ＭＡＬＡＴ１配列は、ヒトまたはマウスであり得る。
別の実施形態において、ＭＡＬＡＴ１配列のクローバ葉構造はまた、ＲＮａｓｅＺおよびＣＣＡ付加酵素によるプロセシングを受けて、ｍａｓｃＲＮＡ（ＭＡＬＡＴ１関連低分子細胞質ＲＮＡ）と呼ばれるｔＲＮＡ様構造を形成し得る。非限定的な例として、ｍａｓｃＲＮＡは、タンパク質またはその断片をコードし、および／またはｍｉＲＮＡ配列を含み得る。ｍａｓｃＲＮＡは、本明細書に記載される少なくとも１つの化学改変を含み得る。
ステムループ
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、限定はされないが、ヒストンステムループなどのステムループを含み得る。ステムループは、約２５または約２６ヌクレオチド長のヌクレオチド配列、例えば、限定はされないが、国際特許公開番号国際公開第２０１３／１０３６５９号パンフレット（その配列番号７〜１７は、参照により本明細書に援用される）に記載される配列番号７〜１７であり得る。ヒストンステムループは、コード領域に対して３’側に（例えば、コード領域の３’末端に）位置し得る。非限定的な例として、ステムループは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの３’末端に位置し得る。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、２つ以上のステムループ（例えば、２つのステムループ）を含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、国際特許公開番号国際公開第２０１２／０１９７８０号パンフレットおよび国際公開第２０１５０２６６７号パンフレット（これらのステムループ配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されるステムループ配列のいずれかを含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、ステムループ配列ＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号５）を含む。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、ステムループ配列ＣＡＡＡＧＧＣＵＣＵＵＵＵＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ（配列番号６）を含む。
一実施形態において、ステムループは、第２の末端領域に位置し得る。非限定的な例として、ステムループは、第２の末端領域の非翻訳領域（例えば、３’−ＵＴＲ）に位置し得る。
一実施形態において、限定はされないが、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、３’−安定化領域（例えば、少なくとも１つの鎖終止ヌクレオシドを含む３’−安定化領域）の付加によって安定化され得る。理論に制約されることは意図しないが、少なくとも１つの鎖終止ヌクレオシドの付加は、ポリヌクレオチドの分解を減速させ得るため、ポリヌクレオチドの半減期を増加させることができる。
別の実施形態において、限定はされないが、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、オリゴ（Ｕ）の付加を防止および／または阻害することができるポリヌクレオチドの３’−領域に対する改変によって安定化され得る（例えば、国際特許公開番号国際公開第２０１３／１０３６５９号パンフレットを参照）。
さらに別の実施形態において、限定はされないが、ヒストンステムループを含むｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド３’−Ｏ−メチルヌクレオシド、３’−Ｏ−エチルヌクレオシド、３’−アラビノシド、および当該技術分野において公知であるか、および／または本明細書に記載される他の改変ヌクレオシドにおいて終端するオリゴヌクレオチドの付加によって安定化され得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンステムループ、ポリ−Ａ領域、および／または５’−キャップ構造を含み得る。ヒストンステムループは、ポリ−Ａ領域の前および／または後にあり得る。ヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域配列を含むポリヌクレオチドは、本明細書に記載される鎖終止ヌクレオシドを含み得る。
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンステムループおよび５’−キャップ構造を含み得る。５’−キャップ構造は、限定はされないが、本明細書に記載されるか、および／または当該技術分野において公知のものを含み得る。
一実施形態において、保存ステムループ領域は、本明細書に記載されるｍｉＲ配列を含み得る。非限定的な例として、ステムループ領域は、本明細書に記載されるｍｉＲ配列のシード配列を含み得る。別の非限定的な例では、ステムループ領域は、ｍｉＲ−１２２シード配列を含み得る。
別の実施形態において、保存ステムループ領域は、本明細書に記載されるｍｉＲ配列を含んでもよく、ＴＥＥ配列も含み得る。
一実施形態において、ｍｉＲ配列および／またはＴＥＥ配列の組み込みは、ステムループ領域の形状を変化させ、これは、翻訳を増加および／または減少させ得る（例えば、カデ（Ｋｅｄｄｅ）ら著、「ｐ２７−３’ＵＴＲにおけるプミリオ誘導のＲＮＡ構造スイッチは、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２接近性を制御する（Ａ Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ ｐ２７−３’ＵＴＲ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）」．ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．２０１０年（全体が参照により本明細書に援用される）を参照）。
一実施形態において、本明細書に記載される改変ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域またはポリアデニル化シグナルを含み得る。少なくとも１つのヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチド配列の非限定的な例は、国際特許公開番号国際公開第２０１３／１２０４９７号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０６２９号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０５００号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０６２７号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０４９８号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０６２６号パンフレット、国際公開第２０１３／１２０４９９号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１２０６２８号パンフレット（これらのそれぞれの配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されている。一実施形態において、ヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開番号国際公開第２０１３／１２０４９９号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１２０６２８号パンフレット（これらの両方の配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されるポリヌクレオチド配列などの病原体抗原またはその断片をコードし得る。別の実施形態において、ヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開番号国際公開第２０１３／１２０４９７号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１２０６２９号パンフレット（これらの両方の配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されるポリヌクレオチド配列などの治療用タンパク質をコードし得る。一実施形態において、ヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開番号国際公開第２０１３／１２０５００号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１２０６２７号パンフレット（これらの両方の配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されるポリヌクレオチド配列などの腫瘍抗原またはその断片をコードし得る。別の実施形態において、ヒストンステムループおよびポリ−Ａ領域またはポリアデニル化シグナルをコードするポリヌクレオチドは、国際特許公開番号国際公開第２０１３／１２０４９８号パンフレットおよび国際公開第２０１３／１２０６２６号パンフレット（これらの両方の配列は、参照により本明細書に援用される）に記載されるポリヌクレオチド配列などのアレルゲン性抗原または自己免疫自己抗原をコードし得る。
ポリ−Ａ領域
ＲＮＡプロセシングの間、アデノシンヌクレオチド（ポリ−Ａ領域）の長鎖は、通常、分子の安定性を高めるために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に加えられる。転写の直後、転写物の３’末端が切断されて、３’−ヒドロキシを解放する。次に、ポリ−Ａポリメラーゼが、アデノシンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに加える。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、長さが１００〜２５０残基であるポリ−Ａ領域を加える。
独自のポリ−Ａ領域の長さは、本発明の改変ポリヌクレオチドにいくつかの利点を与え得る。
一般に、本発明のポリ−Ａ領域の長さは、少なくとも３０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、ポリ−Ａ領域は、少なくとも３５ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも７０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１７００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１９００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。
一実施形態において、ポリ−Ａ領域は、本明細書に記載される改変ポリヌクレオチド分子において、８０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、１６０ヌクレオチド長であり得る。
別の実施形態において、ポリ−Ａ領域は、本明細書に記載される改変ポリヌクレオチド分子において、２０、４０、８０、１００、１２０、１４０または１６０ヌクレオチド長であり得る。
一実施形態において、ポリ−Ａ領域は、改変ポリヌクレオチド全体の長さに対して設計される。この設計は、改変ポリヌクレオチドのコード領域の長さ、改変ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡなど）の特定の特徴もしくは領域の長さに基づいて、または改変ポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づいて行われ得る。改変ポリヌクレオチドの任意の特徴（例えば、ポリ−Ａ領域を含むｍＲＮＡ部分以外）と比べて、ポリ−Ａ領域は、さらなる特徴より長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％長くなり得る。ポリ−Ａ領域はまた、それが属する改変ポリヌクレオチドの一部として設計され得る。これに関して、ポリ−Ａ領域は、構築物の全長または構築物の全長からポリ−Ａ領域を引いたものの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％以上であり得る。
一実施形態において、ポリ−Ａ結合タンパク質のためのポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の操作結合部位および／または共役が、発現を促進するのに使用され得る。操作結合部位は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の局所微小環境のリガンドの結合部位として動作し得るセンサー配列であり得る。非限定的な例として、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ−Ａ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）およびそれらの類似体の結合親和性を改変するために、少なくとも１つの操作結合部位を含み得る。少なくとも１つの操作結合部位の組み込みは、ＰＡＢＰおよびその類似体の結合親和性を増加させ得る。
さらに、複数の異なるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）が、ポリ−Ａ領域の３’末端における改変ヌクレオチドを用いて、３’末端を介してＰＡＢＰ（ポリ−Ａ結合タンパク質）に一緒に連結され得る。トランスフェクション実験は、関連する細胞株において行うことができ、タンパク質産生は、トランスフェクションから１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、および７日後にＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。非限定的な例として、トランスフェクション実験は、少なくとも１つの操作結合部位の付加の結果としての、ＰＡＢＰまたはその類似体に対する結合親和性の影響を評価するのに使用され得る。
一実施形態において、ポリ−Ａ領域は、翻訳開始を調節するのに使用され得る。理論に制約されることは意図しないが、ポリ−Ａ領域は、ＰＡＢＰを動員し、これは、次に、翻訳開始複合体と相互作用することができるため、タンパク質合成に不可欠であり得る。
別の実施形態において、ポリ−Ａ領域はまた、３’−５’−エキソヌクレアーゼ消化から保護するために、本発明において使用され得る。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリＡ−Ｇ四重鎖を含むように設計される。Ｇ−四重鎖は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方においてＧリッチ配列によって形成され得る４つのグアノシンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態において、Ｇ−四重鎖は、ポリ−Ａ領域の末端に組み込まれている。得られたポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、様々な時点で、安定性、タンパク質産生および半減期を含む他のパラメータについてアッセイされ得る。ポリＡ−Ｇ四重鎖が、１２０ヌクレオチドのポリ−Ａ領域のみを用いて見られるタンパク質産生の少なくとも７５％に相当するタンパク質産生をもたらすことが発見されている。
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ−Ａ領域を含んでもよく、３’−安定化領域の付加によって安定化され得る。ポリ−Ａ領域を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’−キャップ構造をさらに含み得る。
別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ポリ−Ａ−Ｇ四重鎖を含み得る。ポリ−Ａ−Ｇ四重鎖を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、５’−キャップ構造をさらに含み得る。
一実施形態において、ポリ−Ａ領域またはポリ−Ａ−Ｇ四重鎖を含むポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を安定させるのに使用され得る３’−安定化領域は、限定はされないが、国際特許公開番号国際公開第２０１３／１０３６５９号パンフレット（そのポリ−Ａ領域およびポリ−Ａ−Ｇ四重鎖は、参照により本明細書に援用される）に記載されるものであり得る。別の実施形態において、本発明に使用され得る３’−安定化領域としては、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−デオキシウリジン、３’−デオキシシトシン、３’−デオキシグアノシン、３’−デオキシチミン、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド、例えば、２’，３’−ジデオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシウリジン、２’，３’−ジデオキシシトシン、２’，３’−ジデオキシグアノシン、２’，３’−ジデオキシチミン、２’−デオキシヌクレオシド、またはＯ−メチルヌクレオシドなどの鎖終止ヌクレオシドが挙げられる。
別の実施形態において、限定はされないが、ポリＡ領域またはポリ−Ａ−Ｇ四重鎖を含むｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、オリゴ（Ｕ）の付加を防止および／または阻害することができるポリヌクレオチドの３’−領域に対する改変によって安定化され得る（例えば、国際特許公開番号国際公開第２０１３／１０３６５９号パンフレットを参照）。
さらに別の実施形態において、限定はされないが、ポリ−Ａ領域またはポリ−Ａ−Ｇ四重鎖を含むｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドは、３’−デオキシヌクレオシド、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド３’−Ｏ−メチルヌクレオシド、３’−Ｏ−エチルヌクレオシド、３’−アラビノシド、および当該技術分野において公知であるか、および／または本明細書に記載される他の改変ヌクレオシドにおいて終端するオリゴヌクレオチドの付加によって安定化され得る。
ポリ−Ｃ領域
ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ポリ−Ｃ領域を含む。
独自のポリ−Ｃ領域の長さは、本発明の改変ポリヌクレオチドにいくつかの利点を与え得る。
一般に、本発明のポリ−Ｃ領域の長さは、少なくとも１０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、少なくとも１５ヌクレオチド長である。別の実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、少なくとも２０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、少なくとも２５ヌクレオチド長である。別の実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、少なくとも３０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、少なくとも３５ヌクレオチド長である。別の実施形態において、長さは、少なくとも４０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４５ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５５ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも６０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも７０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも８０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも９０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１２０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１４０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１６０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１８０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも４５０ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも６００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも７００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも８００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも９００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１１００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１２００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１３００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１４００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１６００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１７００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１８００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも１９００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２０００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも２５００ヌクレオチドである。別の実施形態において、長さは、少なくとも３０００ヌクレオチドである。
一実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、本明細書に記載される改変ポリヌクレオチド分子において、８０ヌクレオチド、１２０ヌクレオチド、または１６０ヌクレオチド長であり得る。
別の実施形態において、ポリ−Ｃ領域は、本明細書に記載される改変ポリヌクレオチド分子において、２０、４０、８０、１００、１２０、１４０または１６０ヌクレオチド長であり得る。
一実施形態において、ポリ−Ｃ領域の長さは、改変ポリヌクレオチド全体の長さに対して設計される。この設計は、改変ポリヌクレオチドのコード領域の長さ、改変ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡなど）の特定の特徴もしくは領域の長さに基づいて、または改変ポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づいて行われ得る。改変ポリヌクレオチドの任意の特徴（例えば、ポリ−Ｃ領域を含むｍＲＮＡ部分以外）と比べて、ポリ−Ｃ領域は、さらなる特徴より長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％長くなり得る。ポリ−Ｃ領域はまた、それが属する改変ポリヌクレオチドの一部として設計され得る。これに関して、ポリ−Ｃ領域は、構築物の全長または構築物の全長からポリ−Ｃ領域を引いたものの１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％以上であり得る。
相補性安定化ポリヌクレオチド
ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上の相補性安定化ポリヌクレオチドをさらに含む。相補性安定化ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の両末端の１つにまたはその付近に相補的な５〜２０ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。ある実施形態において、相補性安定化ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの安定性（例えば、プラズマ安定性）および／または発現レベルを増加させる。ある実施形態において、相補性安定化ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの５’末端にまたはその付近に相補的である。ある実施形態において、相補性安定化ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド３’末端にまたはその付近に相補的である。ある実施形態において、１つ以上の相補性安定化ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの５’−領域および３’−領域の両方に相補的であり、本発明のポリヌクレオチドに結合されると、本発明のポリヌクレオチドとともに環状化構築物を形成する。ある態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドと、本発明のポリヌクレオチドに結合されると、環状化構築物を形成する１つ以上の相補性安定化ポリヌクレオチドとを含む組成物を提供する。
３’−安定化領域
真核生物において、大部分のポリヌクレオチドの３’末端は、ポリアデニル化されている。ポリ−Ａ尾部は、翻訳を促進し、エキソソームおよびエキソヌクレアーゼによるポリヌクレオチドの分解を阻害するために、３’末端に付加される。ポリアデニル化は、転写終結、核から細胞質ゾルへのポリヌクレオチドの輸送、および翻訳にも役割を果たす。ポリアデニル化は、ＲＮＡ安定性および翻訳効率を含む細胞内分子活性を調節する。
ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、翻訳機構へのポリヌクレオチドのより長い曝露により、より多く産生され得るため、真核細胞における特定のポリヌクレオチドの安定化が目的とされる。
本発明は、３’−安定化領域を含まない対応するポリヌクレオチドと比較して、ポリヌクレオチドの増加した安定性をもたらす３’−安定化領域を特徴とする。ある実施形態において、３’−安定化領域は、改変ヌクレオシドを含む。ある実施形態において、３’−安定化領域は、リンカー（例えば、クリックケミストリー反応対の間のクリックケミストリー反応によって形成され得るリンカー）を介して、ポリヌクレオチドの残りの部分に結合される。ある実施形態において、３’−安定化領域は、ポリヌクレオチドの３’末端を含む。ある実施形態において、３’−安定化領域は、ポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに結合される。ある実施形態において、３’−安定化領域は、ポリ−Ａ領域に結合される。
ある実施形態において、３’−安定化領域は、１つ以上の非ヌクレオシド（例えば、脱塩基リボース）を含む。ある実施形態において、１つ以上の非ヌクレオシドは、３’−安定化領域の５’末端、３’末端、および／または内部位置にある。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｉ）コード領域；ｉｉ）コザック配列を任意に含む５’−ＵＴＲ；ｉｉｉ）３’−ＵＴＲ；ｉｖ）少なくとも１つの５’−キャップ構造；ｖ）ポリ−Ａ領域；およびｖｉ）３’−安定化領域を含み、ここで、３’−安定化領域は、クリックケミストリー反応対の間のクリックケミストリー反応によって形成され得るリンカーを介して、ポリ−Ａ領域に結合される。ある実施形態において、３’−安定化領域は、Ｌ−ヌクレオシド（例えば、Ｌ−アデノシン）を含む。ある実施形態において、３’−安定化領域中のヌクレオシドの全てが、Ｌ−ヌクレオシド（例えば、Ｌ−アデノシン）である。ある実施形態において、３’−安定化領域は、少なくとも２つの異なる改変ヌクレオシド（例えば、２’−Ｏ−メチルアデノシンおよび逆方向チミジンまたはα−チオ−２’−Ｏ−メチルアデノシンおよび逆方向チミジン）を含む。ある実施形態において、３’−安定化領域は、少なくとも５ヌクレオシド（例えば、少なくとも１０ヌクレオシド、少なくとも２０ヌクレオシド、少なくとも３０ヌクレオシド、少なくとも４０ヌクレオシド、少なくとも５０ヌクレオシド）を有する。
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｉ）ポリペプチドをコードするコード領域；ｉｉ）コザック配列を含む５’−ＵＴＲ；ｉｉｉ）３’−ＵＴＲ；ｉｖ）キャップ０、キャップ１、キャップ２、またはＡＲＣＡキャップなどの少なくとも１つの５’−キャップ構造；ｖ）ポリ−Ａ領域（例えば、１００アデノシンを含むポリ−Ａ領域）；およびｖｉ）３’−安定化領域（例えば、１０個のＬ−アデノシンまたは７つのアデノシン、２つの２’−Ｏ−メチルアデノシン、および１つの逆方向チミジンなどの、１０個のヌクレオシドを含む３’−安定化領域を含み、ここで、前記３’−安定化領域は、リンカーを介してポリ−Ａ領域に結合され、リンカーは、クリックケミストリー対の間のクリックケミストリー反応によって形成され得、および／またはリンカーは、モルホリノ部分を含む。
ポリヌクレオチドに結合されたポリペプチド
ある実施形態において、ポリペプチドは、式ＸＩＩＩの構造を有するリンカーを介して、ポリヌクレオチドに結合される。例えば、ポリヌクレオチドは、酸化剤（例えば、過ヨウ素酸ナトリウム）と反応されて、３’末端における糖の酸化的開環によりジアルデヒドを生じさせた後、修飾リジンなどの、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部位置にアミノオキシ基を含むポリペプチドとの縮合が続く。本発明のポリヌクレオチドに結合され得るポリペプチドは、核局在化ペプチド、ＥＲ局在化ペプチド、エンドソーム脱出ペプチド、免疫刺激ペプチド、ゴルジ体局在化ペプチド、リソソーム局在化ペプチド、ミトコンドリア局在化ペプチド、および／またはアフィニティクロマトグラフィーに使用され得るペプチドを含む。本発明のポリヌクレオチドに結合されたポリペプチドは、細胞内の所望の位置へのポリヌクレオチドの局在化を追加し、および／またはポリヌクレオチドの精製を補助し得る。ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドに結合されたポリペプチドは、表１に列挙されるポリペプチドのいずれかである。
リンカー
３’−安定化領域は、直接（例えば、共有結合によって）またはリンカーを介して、ポリヌクレオチドの残りの部分に結合され得る。
３’−安定化領域およびポリヌクレオチドの残りの部分は、スルフヒドリル基（−ＳＨ）、アミノ基（アミン）、および／またはヒドロキシルまたは任意の適切な反応性基の反応によって結合され得る。ホモ二機能性およびヘテロ二機能性架橋剤（結合剤（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ））は、多くの商業的供給源から入手可能である。架橋に利用可能な領域が、本発明のポリヌクレオチドおよび３’−安定化領域に見られる。架橋剤は、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の炭素原子のフレキシブルアームを含み得る。例示的な架橋剤は、ＢＳ３（［ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート］；ＢＳ３は、接触可能な第一級アミンを標的とするホモ二機能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである）、ＮＨＳ／ＥＤＣ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＮＨＳ／ＥＤＣは、第一級アミン基とカルボキシル基との結合を可能にする）、スルホ−ＥＭＣＳ（［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロン酸］ヒドラジド；スルホ−ＥＭＣＳは、スルフヒドリルおよびアミノ基に対して反応性のヘテロ二機能性反応性基（マレイミドおよびＮＨＳ−エステル）である）、ヒドラジド、およびＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート；ＳＡＴＡは、アミンに対して反応性であり、保護されたスルフヒドリル基を付加する）を含む。
本発明の化合物は、分枝鎖状および／または非分枝鎖状リンカーを含み得る。本明細書において使用される際の「リンカー」という用語は、２つの隣接する分子または部分、例えば、モルホリノ基をポリヌクレオチドに連結する化学基または分子を指す。典型的に、非分枝鎖状リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に位置するか、またはそれらに隣接され、共有結合によってそれぞれの１つに連結され、したがって２つを連結する。あるいは、分枝鎖状リンカーは、３つ以上の基、分子、または他の部分を連結し、典型的に、３つ以上の基、分子、または他の部分の構造的集合点として働く。本明細書の化合物のいずれかのある実施形態において、リンカーは、天然のホスフェートリンカーまたはホスホロアミダイトリンカーではない。ある実施形態において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。
特定の実施形態において、リンカー基は、式：
（式中、ＲＬが、水素または置換もしくは非置換アルキルであり、ｍが、０または１〜１０（両端の値を含む）の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である）の１つ以上の基の組合せを含む。特定の実施形態において、ｍが、３または４である。
共有結合を形成するために、化学反応性基として、ヌクレオシドとの反応が可能な様々な活性カルボキシル基（例えば、エステル）を使用することができる。具体的な薬剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ：Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）、マレイミド−ベンゾイル−スクシンイミド（ＭＢＳ：ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｂｅｎｚｏｙｌ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）、γ−マレイミド−ブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ：ｇａｍｍａ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ−ｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ：ｍａｌｅｉｍｉｄｏ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）マレイミドヘキサン酸（ＭＨＡ：ｍａｌｅｉｍｉｄｏ ｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、およびマレイミドウンデカン酸（ＭＵＡ：ｍａｌｅｉｍｉｄｏ ｕｎｄｅｃａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）が挙げられる。
第一級アミンは、ＮＨＳエステルの主な標的である。ポリヌクレオチドまたは３’−安定化領域のＮ末端に存在する接触可能なα−アミン基は、ＮＨＳエステルと反応し得る。ＮＨＳエステルが第一級アミンと反応して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを放出すると、アミド結合が形成される。本発明の特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたは３’−安定化領域における官能基は、チオール基であり、化学反応性基は、γ−マレイミド−ブチルアミド（ＧＭＢＡまたはＭＰＡ）などのマレイミド含有基である。
反応混合物のｐＨが６．５〜７．４であるとき、マレイミド基は、スルフヒドリル基に対して最も選択的である。ｐＨ７．０で、スルフヒドリルとのマレイミド基の反応速度は、アミンとの反応速度より１０００倍速い。したがって、マレイミド基とスルフヒドリルとの間の安定したチオエーテル結合が形成され得る。
ある実施形態において、リンカーは、構造：
（式中、ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇがそれぞれ、独立して、０または１であり；
ｄが、０、１、２、または３であり；
Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１０、およびＲ１２のそれぞれが、独立して、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニレン、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリーレン、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＮＲ１３であり；
Ｒ７およびＲ１１がそれぞれ、独立して、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、またはホスホリルであり、ここで、Ｒ７がホスホリルであり、−（Ｒ９）ｄ−が結合であり、ｅ、ｆ、およびｇが０である場合、Ｒ６またはＲ８の少なくとも１つがＯではなく；Ｒ１１がホスホリルであり、−（Ｒ９）ｄ−が結合であり、ａ、ｂ、およびｃが０である場合、Ｒ１０またはＲ１２の少なくとも１つがＯではなく；
各Ｒ９が、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０ヘテロシクリレン、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、または（Ｒ６）ａ−（Ｒ７）ｂ−（Ｒ８）ｃを（Ｒ１０）ｅ−（Ｒ１１）ｆ−（Ｒ１２）ｇに連結する結合であり、ここで、−（Ｒ９）ｄ−が結合である場合、ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、またはｇの少なくとも１つが１であり；
Ｒ１３が、水素、任意に置換されるＣ１〜Ｃ４アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリール、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルである）を有する。
クリックケミストリーのリンカー
特定の実施形態において、リンカーは、クリックケミストリー反応対の間の反応によって形成される。「クリックケミストリー反応対」とは、高い収率および高い熱力学的利得でモジュール反応（ｍｏｄｕｌａｒ ｒｅａｃｔｉｏｎ）に関与し、それによって、クリックケミストリーのリンカーを生成する反応性基の対を意味する。この実施形態において、反応性基の１つが、３’−安定化領域に結合され、他の反応性基が、ポリヌクレオチドの残りの部分に結合される。例示的な反応およびクリックケミストリー対としては、トリアゾール含有リンカーを形成するためのアルキニル基とアジド基との間のヒュスゲン１，３−双極性付加環化反応；４π電子系を有するジエン（例えば、任意に置換される１，３−不飽和化合物、例えば、任意に置換される１，３−ブタジエン、１−メトキシ−３−トリメチルシリルオキシ−１，３−ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、またはフラン）と、２π電子系を有するジエノフィルまたはヘテロジエノフィル（例えば、任意に置換されるアルケニル基または任意に置換されるアルキニル基）との間のディールス・アルダー反応；求核試薬および歪みのあるヘテロシクリル求電子剤との開環反応；ホスホロチオエート基およびヨード基とのスプリントライゲーション反応；およびアルデヒド基およびアミノ基との還元的アミノ化反応が挙げられる（コルブ（Ｋｏｌｂ）ら著、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、第４０巻、ｐ．２００４〜２０２１、２００１年；ファン・デル・エイケン（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｙｃｋｅｎ）ら著、ＱＳＡＲアンド・コンビナトリアル・サイエンス（ＱＳＡＲ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．）、第２６巻、ｐ．１１１５〜１３２６、２００７年）。
本発明の特定の実施形態において、３’−安定化領域は、アルキニル基およびアジド基クリックケミストリー対の間の反応によって形成されるトリアゾール含有リンカーによって、ポリヌクレオチドの残りの部分に連結される。このような場合、アジド基は、ポリヌクレオチドの３’末端に結合され得、アルキニル基は、３’−安定化領域の５’末端に結合され得る。あるいは、アジド基は、３’−安定化領域の５’末端に結合され得、アルキニル基は、ポリヌクレオチドの３’末端に結合され得る。特定の実施形態において、アジド基とアルキニル基との間の反応は、無触媒であり、他の実施形態において、銅（Ｉ）触媒（例えば、ヨウ化銅（Ｉ））、還元剤（例えば、アスコルビン酸ナトリウムとともに硫酸銅（ＩＩ）または酢酸銅（ＩＩ））の存在下で銅（ＩＩ）触媒、またはルテニウム含有触媒（例えば、Ｃｐ＊ＲｕＣｌ（ＰＰｈ３）２またはＣｐ＊ＲｕＣｌ（ＣＯＤ））によって触媒される。
例示的なリンカーとしては、モノフルオロシクロオクチン（ＭＦＣＯ：ｍｏｎｏｆｌｕｏｒｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）、ジフルオロシクロオクチン（ＤＦＣＯ：ｄｉｆｌｕｏｒｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）、シクロオクチン（ＯＣＴ：ｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ：ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）、ビアリールアザシクロオクチン（ＢＡＲＡＣ：ｂｉａｒｙｌａｚａｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）、ジフルオロベンゾシクロオクチン（ＤＩＦＢＯ：ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ）、およびビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ：ｂｉｃｙｃｌｏ［６．１．０］ｎｏｎｙｎｅ）を含有するリンカーが挙げられる。
リンカーは、クリックケミストリーハンドル対を反応させることによって結合され得る。本明細書において使用される際の「クリックケミストリーハンドル」という用語は、クリックケミストリー反応に関与し得る、反応剤、または反応性基を指す。例えば、歪みアルキン、例えば、シクロオクチンは、歪み促進型付加環化に関与し得るため、クリックケミストリーハンドルである。一般に、クリックケミストリー反応は、互いに反応し得るクリックケミストリーハンドルを含む少なくとも２つの分子を必要とする。例えば、アジドは、シクロオクチンまたは任意の他のアルキンに対するパートナークリックケミストリーハンドルである。パートナークリックケミストリーハンドル対のさらなる例としては、ジエンおよびジエノフィル、アジドおよび末端アルキン、アジドおよび歪みアルキン、アジドおよび活性化アルキン、アジドおよび電子不足アルキン、アジドおよびアライン、テトラジンおよびアルケン、テトラゾールおよびアルケン、ジチオエステルおよびジエン、アントラセンおよびマレイミド、チオールおよびアルケン、チオールおよびエノン、チオールおよびマレイミド、チオールおよびパラ−フルオロ、ならびにアミンおよびパラ−フルオロが挙げられる。他の好適なクリックケミストリーハンドルは、当業者に公知である。
本明細書に記載される方法に使用するのに好適なさらなるクリックケミストリーハンドルは、当業者に周知であり、このようなクリックケミストリーハンドルとしては、限定はされないが、［１］Ｈ．Ｃ．コルブ（Ｈ．Ｃ．Ｋｏｌｂ）、Ｍ．Ｇ．フィン（Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ）、Ｋ．Ｂ．シャープレス（Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ）著、アンゲヴァンテ・ケミー（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．）、２００１年、第１１３巻、ｐ．２０５６〜２０７５；アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２００１年、第４０巻、ｐ．２００４〜２０２１。［２］ａ）Ｃ．Ｊ．ハーカー（Ｃ．Ｊ．Ｈａｗｋｅｒ）、Ｋ．Ｌ．ウーリー（Ｋ．Ｌ．Ｗｏｏｌｅｙ）著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００５年、第３０９巻、ｐ．１２００〜１２０５；ｂ）Ｄ．フルニエ（Ｄ．Ｆｏｕｒｎｉｅｒ）、Ｒ．フーゲンブーム（Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）、Ｕ．Ｓ．シューベルト（Ｕ．Ｓ．Ｓｃｈｕｂｅｒｔ）著、ケミカル・ソサエティ・レビューズ（Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．）、２００７年、第３６巻、ｐ．１３６９〜１３８０；ｃ）Ｗ．Ｈ．バインダー（Ｗ．Ｈ．Ｂｉｎｄｅｒ）、Ｒ．サッチセンホファー（Ｒ．Ｓａｃｈｓｅｎｈｏｆｅｒ）著、マクロモレキュラー・ラピッド・コミュニケーションズ（Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．）、２００７年、第２８巻、ｐ．１５〜５４；ｄ）Ｈ．Ｃ．コルブ（Ｈ．Ｃ．Ｋｏｌｂ）、Ｋ．Ｂ．シャープレス（Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ）著、ドラッグ・デリバリー・トゥデイ（Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ）、２００３年、第８巻、ｐ．１１２８〜１１３７；ｅ）Ｖ．Ｄ．ボック（Ｖ．Ｄ．Ｂｏｃｋ）、Ｈ．ヒエムストラ（Ｈ．Ｈｉｅｍｓｔｒａ）、Ｊ．Ｈ．ファン・マーセフェイン（Ｊ．Ｈ．ｖａｎ Ｍａａｒｓｅｖｅｅｎ）著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、２００６年、ｐ．５１〜６８。［３］ａ）Ｖ．Ｏ．ロディオノフ（Ｖ．Ｏ．Ｒｏｄｉｏｎｏｖ）、Ｖ．Ｖ．フォキン（Ｖ．Ｖ．Ｆｏｋｉｎ）、Ｍ．Ｇ．フィン（Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ）著、アンゲヴァンテ・ケミー（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．）、２００５年、第１１７巻、ｐ．２２５０〜２２５５；アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２００５年、第４４巻、ｐ．２２１０〜２２１５；ｂ）Ｐ．Ｌ．ゴラス（Ｐ．Ｌ．Ｇｏｌａｓ）、Ｎ．Ｖ．ツァレブスキー（Ｎ．Ｖ．Ｔｓａｒｅｖｓｋｙ）、Ｂ．Ｓ．スマーリン（Ｂ．Ｓ．Ｓｕｍｅｒｌｉｎ）、Ｋ．マテャシェフスキー（Ｋ．Ｍａｔｙｊａｓｚｅｗｓｋｉ）著、マクロモレキュール（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２００６年、第３９巻、ｐ．６４５１〜６４５７；ｃ）Ｃ．Ｎ．ウルバニ（Ｃ．Ｎ．Ｕｒｂａｎｉ）、Ｃ．Ａ．ベル（Ｃ．Ａ．Ｂｅｌｌ）、Ｍ．Ｒ．ウィテカー（Ｍ．Ｒ．Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）、Ｍ．Ｊ．モンテイロ（Ｍ．Ｊ．Ｍｏｎｔｅｉｒｏ）著、マクロモレキュール（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２００８年、第４１巻、ｐ．１０５７〜１０６０；ｄ）Ｓ．チャサイン（Ｓ．Ｃｈａｓｓａｉｎｇ）、Ａ．Ｓ．Ｓ．シド（Ａ．Ｓ．Ｓ．Ｓｉｄｏ）、Ａ．アリックス（Ａ．Ａｌｉｘ）、Ｍ．クマラジャ（Ｍ．Ｋｕｍａｒｒａｊａ）、Ｐ．ペイル（Ｐ．Ｐａｌｅ）、Ｊ．ソマー（Ｊ．Ｓｏｍｍｅｒ）著、ケミストリー・ア・ヨーロピアン・ジャーナル（Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．）、２００８年、第１４巻、ｐ．６７１３〜６７２１；ｅ）Ｂ．Ｃ．ボレン（Ｂ．Ｃ．Ｂｏｒｅｎ）、Ｓ．ナラヤン（Ｓ．Ｎａｒａｙａｎ）、Ｌ．Ｋ．ラスムッセン（Ｌ．Ｋ．Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）、Ｌ．チャン（Ｌ．Ｚｈａｎｇ）、Ｈ．チャオ（Ｈ．Ｚｈａｏ）、Ｚ．リン（Ｚ．Ｌｉｎ）、Ｇ．チア（Ｇ．Ｊｉａ）、Ｖ．Ｖ．フォキン（Ｖ．Ｖ．Ｆｏｋｉｎ）著、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００８年、第１３０巻、ｐ．８９２３〜８９３０；ｆ）Ｂ．サバ（Ｂ．Ｓａｂａ）、Ｓ．シャルマ（Ｓ．Ｓｈａｒｍａ）、Ｄ．サワント（Ｄ．Ｓａｗａｎｔ）、Ｂ．クンドゥ（Ｂ．Ｋｕｎｄｕ）著、シンレット（Ｓｙｎｌｅｔｔ）、２００７年、ｐ．１５９１〜１５９４。［４］Ｊ．Ｆ．ルッツ（Ｊ．Ｆ．Ｌｕｔｚ）著、アンゲヴァンテ・ケミー（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．）、２００８年、第１２０巻、ｐ．２２１２〜２２１４；アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２００８年、第４７巻、ｐ．２１８２〜２１８４。［５］ａ）Ｑ．ワン（Ｑ．Ｗａｎｇ）、Ｔ．Ｒ．チャン（Ｔ．Ｒ．Ｃｈａｎ）、Ｒ．ヒルグラフ（Ｒ．Ｈｉｌｇｒａｆ）、Ｖ．Ｖ．フォキン（Ｖ．Ｖ．Ｆｏｋｉｎ）、Ｋ．Ｂ．シャープレス（Ｋ．Ｂ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ）、Ｍ．Ｇ．フィン（Ｍ．Ｇ．Ｆｉｎｎ）著、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００３年、第１２５巻、ｐ．３１９２〜３１９３；ｂ）Ｊ．ギアーリッチ（Ｊ．Ｇｉｅｒｌｉｃｈ）、Ｇ．Ａ．バーリー（Ｇ．Ａ．Ｂｕｒｌｅｙ）、Ｐ．Ｍ．Ｅ．グラムリッチ（Ｐ．Ｍ．Ｅ．Ｇｒａｍｌｉｃｈ）、Ｄ．Ｍ．ハモンド（Ｄ．Ｍ．Ｈａｍｍｏｎｄ）、Ｔ．キャレル（Ｔ．Ｃａｒｅｌｌ）著、オーガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）、２００６年、第８巻、ｐ．３６３９〜３６４２。［６］ａ）Ｊ．Ｍ．バスキン（Ｊ．Ｍ．Ｂａｓｋｉｎ）、Ｊ．Ａ．プレスチャー（Ｊ．Ａ．Ｐｒｅｓｃｈｅｒ）、Ｓ．Ｔ．ラフリン（Ｓ．Ｔ．Ｌａｕｇｈｌｉｎ）、Ｎ．Ｊ．アガード（Ｎ．Ｊ．Ａｇａｒｄ）、Ｐ．Ｖ．チャン（Ｐ．Ｖ．Ｃｈａｎｇ）、Ｉ．Ａ．ミラー（Ｉ．Ａ．Ｍｉｌｌｅｒ）、Ａ．ロー（Ａ．Ｌｏ）、Ｊ．Ａ．コデリ（Ｊ．Ａ．Ｃｏｄｅｌｌｉ）、Ｃ．Ｒ．ベルトッツィ（Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、２００７年、第１０４巻、ｐ．１６７９３〜１６７９７；ｂ）Ｓ．Ｔ．ラフリン（Ｓ．Ｔ．Ｌａｕｇｈｌｉｎ）、Ｊ．Ｍ．バスキン（Ｊ．Ｍ．Ｂａｓｋｉｎ）、Ｓ．Ｌ．アマチャー（Ｓ．Ｌ．Ａｍａｃｈｅｒ）、Ｃ．Ｒ．ベルトッツィ（Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ）著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００８年、第３２０巻、ｐ．６６４〜６６７；ｃ）Ｊ．Ａ．ジョンストン（Ｊ．Ａ．Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｊ．Ｍ．バスキン（Ｊ．Ｍ．Ｂａｓｋｉｎ）、Ｃ．Ｒ．ベルトッツィ（Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ）、Ｊ．Ｆ．コベルシュタイン（Ｊ．Ｆ．Ｋｏｂｅｒｓｔｅｉｎ）、Ｎ．Ｊ．ターロ（Ｎ．Ｊ．Ｔｕｒｒｏ）著、ケミカル・コミュニケーションズ（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、２００８年、ｐ．３０６４〜３０６６；ｄ）Ｊ．Ａ．コデリ（Ｊ．Ａ．Ｃｏｄｅｌｌｉ）、Ｊ．Ｍ．バスキン（Ｊ．Ｍ．Ｂａｓｋｉｎ）、Ｎ．Ｊ．アガード（Ｎ．Ｊ．Ａｇａｒｄ）、Ｃ．Ｒ．ベルトッツィ（Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ）著、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００８年、第１３０巻、ｐ．１１４８６〜１１４９３；ｅ）Ｅ．Ｍ．スレッテン（Ｅ．Ｍ．Ｓｌｅｔｔｅｎ）、Ｃ．Ｒ．ベルトッツィ（Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ）著、オーガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）、２００８年、第１０巻、ｐ．３０９７〜３０９９；ｆ）Ｊ．Ｍ．バスキン（Ｊ．Ｍ．Ｂａｓｋｉｎ）、Ｃ．Ｒ．ベルトッツィ（Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ）著、ＱＳＡＲアンド・コンビナトリアル・サイエンス（ＱＳＡＲ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．）、２００７年、第２６巻、ｐ．１２１１〜１２１９。［７］ａ）Ｇ．ウィッティヒ（Ｇ．Ｗｉｔｔｉｇ）、Ａ．クレブス（Ａ．Ｋｒｅｂｓ）著、ヘミッシェ・ベリヒテ・レキュイル（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．Ｒｅｃｌ．）、１９６１年、第９４巻、ｐ．３２６０〜３２７５；ｂ）Ａ．Ｔ．ブロムクイスト（Ａ．Ｔ．Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ）、Ｌ．Ｈ．リウ（Ｌ．Ｈ．Ｌｉｕ）著、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９５３年、第７５巻、ｐ．２１５３〜２１５４。［８］Ｄ．Ｈ．エス（Ｄ．Ｈ．Ｅｓｓ）、Ｇ．Ｏ．ジョーンズ（Ｇ．Ｏ．Ｊｏｎｅｓ）、Ｋ．Ｎ．ハウク（Ｋ．Ｎ．Ｈｏｕｋ）、オーガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）、２００８年、第１０巻、ｐ．１６３３〜１６３６。［９］Ｗ．Ｄ．シャープレス（Ｗ．Ｄ．Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ）、Ｐ．ウー（Ｐ．Ｗｕ）、Ｔ．Ｖ．ハンセン（Ｔ．Ｖ．Ｈａｎｓｅｎ）、Ｊ．Ｇ．リンドバーグ（Ｊ．Ｇ．Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）著、ジャーナル・オブ・ケミカル・エデュケーション（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃ．）、２００５年、第８２巻、ｐ．１８３３〜１８３６。［１０］Ｙ．ツォウ（Ｙ．Ｚｏｕ）、Ｊ．イン（Ｊ．Ｙｉｎ）著、バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．）、２００８年、第１８巻、ｐ．５６６４〜５６６７。［１１］Ｘ．ニン（Ｘ．Ｎｉｎｇ）、Ｊ．クオ（Ｊ．Ｇｕｏ）、Ｍ．Ａ．ウルファート（Ｍ．Ａ．Ｗｏｌｆｅｒｔ）、Ｇ．Ｊ．ブーンズ（Ｇ．Ｊ．Ｂｏｏｎｓ）著、アンゲヴァンテ・ケミー（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．）、２００８年、第１２０巻、ｐ．２２８５〜２２８７；アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２００８年、第４７巻、ｐ．２２５３〜２２５５。［１２］Ｓ．サウォー（Ｓ．Ｓａｗｏｏ）、Ｐ．ダッタ（Ｐ．Ｄｕｔｔａ）、Ａ．チャクラバルティー（Ａ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ）、Ｒ．ムコッパッダーエ（Ｒ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ）、Ｏ．ボウロウサ（Ｏ．Ｂｏｕｌｏｕｓｓａ）、Ａ．サーカー（Ａ．Ｓａｒｋａｒ）著、ケミカル・コミュニケーションズ（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、２００８年、ｐ．５９５７〜５９５９。［１３］ａ）Ｚ．リー（Ｚ．Ｌｉ）、Ｔ．Ｓ．セオ（Ｔ．Ｓ．Ｓｅｏ）、Ｊ．ジュ（Ｊ．Ｊｕ）著、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、２００４年、第４５巻、ｐ．３１４３〜３１４６；ｂ）Ｓ．Ｓ．ファン・ベルケル（Ｓ．Ｓ．ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ）、Ａ．Ｊ．ダークス（Ａ．Ｊ．Ｄｉｒｋｅｓ）、Ｍ．Ｆ．デベッツ（Ｍ．Ｆ．Ｄｅｂｅｔｓ）、Ｆ．Ｌ．ファン・デルフト（Ｆ．Ｌ．ｖａｎ Ｄｅｌｆｔ）、Ｊ．Ｊ．Ｌ．コルネリセン（Ｊ．Ｊ．Ｌ．Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ）、Ｒ．Ｊ．Ｍ．ノルテ（Ｒ．Ｊ．Ｍ．Ｎｏｌｔｅ）、Ｆ．Ｐ．Ｊ．リューツ（Ｆ．Ｐ．Ｊ．Ｒｕｔｊｅｓ）著、ケムバイオケム（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）、２００７年、第８巻、ｐ．１５０４〜１５０８；ｃ）Ｓ．Ｓ．ファン・ベルケル（Ｓ．Ｓ．ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ）、Ａ．Ｊ．ダークス（Ａ．Ｊ．Ｄｉｒｋｓ）、Ｓ．Ａ．ミーウィッセン（Ｓ．Ａ．Ｍｅｅｕｗｉｓｓｅｎ）、Ｄ．Ｌ．Ｌ．ピンゲン（Ｄ．Ｌ．Ｌ．Ｐｉｎｇｅｎ）、Ｏ．Ｃ．ボーマン（Ｏ．Ｃ．Ｂｏｅｒｍａｎ）、Ｐ．ラバーマン（Ｐ．Ｌａｖｅｒｍａｎ）、Ｆ．Ｌ．ファン・デルフト（Ｆ．Ｌ．ｖａｎ Ｄｅｌｆｔ）、Ｊ．Ｊ．Ｌ．コルネリセン（Ｊ．Ｊ．Ｌ．Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ）、Ｆ．Ｐ．Ｊ．リューツ（Ｆ．Ｐ．Ｊ．Ｒｕｔｊｅｓ）著、ケムバイオケム（ＣｈｅｍＢｉｏ−Ｃｈｅｍ）、２００８年、第９巻、ｐ．１８０５〜１８１５。［１４］Ｆ．シー（Ｆ．Ｓｈｉ）、Ｊ．Ｐ．ワルド（Ｊ．Ｐ．Ｗａｌｄｏ）、Ｙ．チェン（Ｙ．Ｃｈｅｎ）、Ｒ．Ｃ．ラロック（Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ）著、オーガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）、２００８年、第１０巻、ｐ．２４０９〜２４１２。［１５］Ｌ．キャンベル−ベデュイン（Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｖｅｒｄｕｙｎ）、Ｐ．Ｈ．エルシンガ（Ｐ．Ｈ．Ｅｌｓｉｎｇａ）、Ｌ．ミルフェイチ（Ｌ．Ｍｉｒｆｅｉｚｉ）、Ｒ．Ａ．ディエルクス（Ｒ．Ａ．Ｄｉｅｒｃｋｘ）、Ｂ．Ｌ．フェリンガ（Ｂ．Ｌ．Ｆｅｒｉｎｇａ）著、オーガニック・アンド・バイオモレキュラー・ケミストリー（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２００８年、第６巻、ｐ．３４６１〜３４６３。［１６］ａ）「チオール基の化学（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｏｌ Ｇｒｏｕｐ）」（Ｓ．パタイ（Ｓ．Ｐａｔａｉ）編）、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９７４年；ｂ）Ａ．Ｆ．ジャコビン（Ａ．Ｆ．Ｊａｃｏｂｉｎｅ）著
、「高分子科学および技術における放射線硬化ＩＩＩ（Ｉｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｃｕｒｉｎｇ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩＩＩ）」（Ｊ．Ｄ．フアシエ（Ｊ．Ｄ．Ｆｏｕａｓｓｉｅｒ）、Ｊ．Ｆ．ラベック（Ｊ．Ｆ．Ｒａｂｅｋ）編）、エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ）、１９９３年、第７章、ｐ．２１９〜２６８。［１７］Ｃ．Ｅ．ホイル（Ｃ．Ｅ．Ｈｏｙｌｅ）、Ｔ．Ｙ．リー（Ｔ．Ｙ．Ｌｅｅ）、Ｔ．ロパー（Ｔ．Ｒｏｐｅｒ）著、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．）パートＡ ２００８年、第４２巻、ｐ．５３０１〜５３３８。［１８］Ｌ．Ｍ．カンポス（Ｌ．Ｍ．Ｃａｍｐｏｓ）、Ｋ．Ｌ．キロップス（Ｋ．Ｌ．Ｋｉｌｌｏｐｓ）、Ｒ．サカイ（Ｒ．Ｓａｋａｉ）、Ｊ．Ｍ．Ｊ．パウルッセ（Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｐａｕｌｕｓｓｅ）、Ｄ．ダミロン（Ｄ．Ｄａｍｉｒｏｎ）、Ｅ．ドロッケンミュラー（Ｅ．Ｄｒｏｃｋｅｎｍｕｌｌｅｒ）、Ｂ．Ｗ．メスモア（Ｂ．Ｗ．Ｍｅｓｓｍｏｒｅ）、Ｃ．Ｊ．ハーカー（Ｃ．Ｊ．Ｈａｗｋｅｒ）著、マクロモレキュール（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２００８年、第４１巻、ｐ．７０６３〜７０７０。［１９］ａ）Ｒ．Ｌ．Ａ．デイヴィッド（Ｒ．Ｌ．Ａ．Ｄａｖｉｄ）、Ｊ．Ａ．コーンフィールド（Ｊ．Ａ．Ｋｏｒｎｆｉｅｌｄ）著、マクロモレキュール（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２００８年、第４１巻、ｐ．１１５１〜１１６１；ｂ）Ｃ．ニルソン（Ｃ．Ｎｉｌｓｓｏｎ）、Ｎ．シンプソン（Ｎ．Ｓｉｍｐｓｏｎ）、Ｍ．マルコッチ（Ｍ．Ｍａｌｋｏｃｈ）、Ｍ．ヨハンソン（Ｍ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ）、Ｅ．マルムストーム（Ｅ．Ｍａｌｍｓｔｒｏｍ）著、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．）パートＡ ２００８年、第４６巻、ｐ．１３３９〜１３４８；ｃ）Ａ．ドンドニ（Ａ．Ｄｏｎｄｏｎｉ）著、アンゲヴァンテ・ケミー（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．）、２００８年、第１２０巻、ｐ．９１３３〜９１３５；アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２００８年、第４７巻、ｐ．８９９５〜８９９７；ｄ）Ｊ．Ｆ．ルッツ（Ｊ．Ｆ．Ｌｕｔｚ）、Ｈ．シュラード（Ｈ．Ｓｃｈｌａａｄ）、ポリマー（Ｐｏｌｙｍｅｒ）、２００８年、第４９巻、ｐ．８１７〜８２４。［２０］Ａ．グレス（Ａ．Ｇｒｅｓｓ）、Ａ．ヴォーケル（Ａ．Ｖｏｅｌｋｅｌ）、Ｈ．シュラード（Ｈ．Ｓｃｈｌａａｄ）著、マクロモレキュール（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２００７年、第４０巻、ｐ．７９２８〜７９３３。［２１］Ｎ．テン・ブルムメルフィス（Ｎ．ｔｅｎ Ｂｒｕｍｍｅｌｈｕｉｓ）、Ｃ．ディール（Ｃ．Ｄｉｅｈｌ）、Ｈ．シュラード（Ｈ．Ｓｃｈｌａａｄ）著、マクロモレキュール（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２００８年、第４１巻、ｐ．９９４６〜９９４７。［２２］Ｋ．Ｌ．キロップス（Ｋ．Ｌ．Ｋｉｌｌｏｐｓ）、Ｌ．Ｍ．カンポス（Ｌ．Ｍ．Ｃａｍｐｏｓ）、Ｃ．Ｊ．ハーカー（Ｃ．Ｊ．Ｈａｗｋｅｒ）著、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００８年、第１３０巻、ｐ．５０６２〜５０６４。［２３］Ｊ．Ｗ．チャン（Ｊ．Ｗ．Ｃｈａｎ）、Ｂ．ユー（Ｂ．Ｙｕ）、Ｃ．Ｅ．ホイル（Ｃ．Ｅ．Ｈｏｙｌｅ）、Ａ．Ｂ．ロウ（Ａ．Ｂ．Ｌｏｗｅ）著、ケミカル・コミュニケーションズ（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、２００８年、ｐ．４９５９〜４９６１。［２４］ａ）Ｇ．モアド（Ｇ．Ｍｏａｄ）、Ｅ．リザード（Ｅ．Ｒｉｚｚａｒｄｏ）、Ｓ．Ｈ．タン（Ｓ．Ｈ．Ｔｈａｎｇ）著、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．）、２００８年、第４１巻、ｐ．１１３３〜１１４２；ｂ）Ｃ．バーナー−コウォリク（Ｃ．Ｂａｒｎｅｒ−Ｋｏｗｏｌｌｉｋ）、Ｍ．ブバック（Ｍ．Ｂｕｂａｃｋ）、Ｂ．チャールークス（Ｂ．Ｃｈａｒｌｅｕｘ）、Ｍ．Ｌ．クート（Ｍ．Ｌ．Ｃｏｏｔｅ）、Ｍ．ドラチェ（Ｍ．Ｄｒａｃｈｅ）、Ｔ．フクダ（Ｔ．Ｆｕｋｕｄａ）、Ａ．ゴトウ（Ａ．Ｇｏｔｏ）、Ｂ．クランパーマン（Ｂ．Ｋｌｕｍｐｅｒｍａｎ）、Ａ．Ｂ．ロウ（Ａ．Ｂ．Ｌｏｗｅ）、Ｊ．Ｂ．マクリーリー（Ｊ．Ｂ．ＭｃＬｅａｒｙ）、Ｇ．モアド（Ｇ．Ｍｏａｄ）、Ｍ．Ｊ．モンテリオ（Ｍ．Ｊ．Ｍｏｎｔｅｒｉｏ）、Ｒ．Ｄ．サンダーソン（Ｒ．Ｄ．Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ）、Ｍ．Ｐ．トンゲ（Ｍ．Ｐ．Ｔｏｎｇｅ）、Ｐ．ヴァナ（Ｐ．Ｖａｎａ）著、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．）パートＡ ２００６年、第４４巻、ｐ．５８０９〜５８３１。［２５］ａ）Ｒ．Ｊ．ポンダー（Ｒ．Ｊ．Ｐｏｕｎｄｅｒ）、Ｍ．Ｊ．スタンフォード（Ｍ．Ｊ．Ｓｔａｎｆｏｒｄ）、Ｐ．ブルックス（Ｐ．Ｂｒｏｏｋｓ）、Ｓ．Ｐ．リチャーズ（Ｓ．Ｐ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ）、Ａ．Ｐ．ドーブ（Ａ．Ｐ．Ｄｏｖｅ）著、ケミカル・コミュニケーションズ（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、２００８年、ｐ．５１５８〜５１６０；ｂ）Ｍ．Ｊ．スタンフォード（Ｍ．Ｊ．Ｓｔａｎｆｏｒｄ）、Ａ．Ｐ．ドーブ（Ａ．Ｐ．Ｄｏｖｅ）著、マクロモレキュール（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２００９年、第４２巻、ｐ．１４１〜１４７。［２６］Ｍ．リー（Ｍ．Ｌｉ）、Ｐ．デ（Ｐ．Ｄｅ）、Ｓ．Ｒ．ゴンディ（Ｓ．Ｒ．Ｇｏｎｄｉ）、Ｂ．Ｓ．スマーリン（Ｂ．Ｓ．Ｓｕｍｅｒｌｉｎ）著、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．）パートＡ ２００８年、第４６巻、ｐ．５０９３〜５１００。［２７］Ｚ．Ｊ．ウィチャック（Ｚ．Ｊ．Ｗｉｔｃｚａｋ）、Ｄ．ローチャック（Ｄ．Ｌｏｒｃｈａｋ）、Ｎ．グエン（Ｎ．Ｎｇｕｙｅｎ）著、カルボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．）、２００７年、第３４２巻、ｐ．１９２９〜１９３３。［２８］ａ）Ｄ．サマルー（Ｄ．Ｓａｍａｒｏｏ）、Ｍ．ヴィノデュ（Ｍ．Ｖｉｎｏｄｕ）、Ｘ．チェン（Ｘ．Ｃｈｅｎ）、Ｃ．Ｍ．ドレイン（Ｃ．Ｍ．Ｄｒａｉｎ）著、ジャーナル・オブ・コンビナトリアル・ケミストリー（Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．）、２００７年、９、９９８〜１０１１；ｂ）Ｘ．チェン（Ｘ．Ｃｈｅｎ）、Ｄ．Ａ．フォスター（Ｄ．Ａ．Ｆｏｓｔｅｒ）、Ｃ．Ｍ．ドレイン（Ｃ．Ｍ．Ｄｒａｉｎ）著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００４年、第４３巻、ｐ．１０９１８〜１０９２９；ｃ）Ｄ．サマルー（Ｄ．Ｓａｍａｒｏｏ）、Ｃ．Ｅ．ソール（Ｃ．Ｅ．Ｓｏｌｌ）、Ｌ．Ｊ．トダロ（Ｌ．Ｊ．Ｔｏｄａｒｏ）、Ｃ．Ｍ．ドレイン（Ｃ．Ｍ．Ｄｒａｉｎ）著、オーガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．）、２００６年、第８巻、ｐ．４９８５〜４９８８。［２９］Ｐ．バチョニ（Ｐ．Ｂａｔｔｉｏｎｉ）、Ｏ．ブリガウド（Ｏ．Ｂｒｉｇａｕｄ）、Ｈ．デスヴァウクス（Ｈ．Ｄｅｓｖａｕｘ）、Ｄ．マンスイ（Ｄ．Ｍａｎｓｕｙ）、Ｔ．Ｇ．トレイラー（Ｔ．Ｇ．Ｔｒａｙｌｏｒ）著、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、１９９１年、第３２巻、ｐ．２８９３〜２８９６。［３０］Ｃ．オット（Ｃ．Ｏｔｔ）、Ｒ．フーゲンブーム（Ｒ．Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）、Ｕ．Ｓ．シューベルト（Ｕ．Ｓ．Ｓｃｈｕｂｅｒｔ）著、ケミカル・コミュニケーションズ（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、２００８年、ｐ．３５１６〜３５１８。［３１］ａ）Ｖ．ラドミラル（Ｖ．Ｌａｄｍｉｒａｌ）、Ｇ．マントヴァニ（Ｇ．Ｍａｎｔｏｖａｎｉ）、Ｇ．Ｊ．クラークソン（Ｇ．Ｊ．Ｃｌａｒｋｓｏｎ）、Ｓ．カウエト（Ｓ．Ｃａｕｅｔ）、Ｊ．Ｌ．イルウィン（Ｊ．Ｌ．Ｉｒｗｉｎ）、Ｄ．Ｍ．ハドルトン（Ｄ．Ｍ．Ｈａｄｄｌｅｔｏｎ）著、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００６年、第１２８巻、ｐ．４８２３〜４８３０；ｂ）Ｓ．Ｇ．スパイン（Ｓ．Ｇ．Ｓｐａｉｎ）、Ｍ．Ｉ．ギブソン（Ｍ．Ｉ．Ｇｉｂｓｏｎ）、Ｎ．Ｒ．キャメロン（Ｎ．Ｒ．Ｃａｍｅｒｏｎ）著、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．）パートＡ ２００７年、第４５巻、ｐ．２０５９〜２０７２。［３２］Ｃ．Ｒ．ベサー（Ｃ．Ｒ．Ｂｅｃｅｒ）、Ｋ．バビウチ（Ｋ．Ｂａｂｉｕｃｈ）、Ｋ．ピルツ（Ｋ．Ｐｉｌｚ）、Ｓ．ホーニグ（Ｓ．Ｈｏｒｎｉｇ）、Ｔ．ヘインセ（Ｔ．Ｈｅｉｎｚｅ）、Ｍ．ゴッチャルト（Ｍ．Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｄｔ）、Ｕ．Ｓ．シューベルト（Ｕ．Ｓ．Ｓｃｈｕｂｅｒｔ）著、マクロモレキュール（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２００９年、第４２巻、ｐ．２３８７〜２３９４。［３３］「オットー・パウル・ヘルマン・ディールスおよびクルト・アルダーが、１９２８年に最初にこの反応を実証した。彼らは、その名前に由来する反応に関する研究において１９５０年にノーベル化学賞を受賞した（Ｏｔｔｏ Ｐａｕｌ Ｈｅｒｍａｎｎ Ｄｉｅｌｓ ａｎｄ Ｋｕｒｔ Ａｌｄｅｒ ｆｉｒｓｔ ｄｏｃｕｍｅｎｔｅｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ １９２８． Ｔｈｅｙ ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｔｈｅ Ｎｏｂｅｌ Ｐｒｉｚｅ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ １９５０ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｗｏｒｋ ｏｎ ｔｈｅ ｅｐｏｎｙｍｏｕｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」。［３４］ａ）Ｈ．Ｌ．ホルムス（Ｈ．Ｌ．Ｈｏｌｍｅｓ）、Ｒ．Ｍ．ハスバンド（Ｒ．Ｍ．Ｈｕｓｂａｎｄ）、Ｃ．Ｃ．リー（Ｃ．Ｃ．Ｌｅｅ）、Ｐ．カウルカ（Ｐ．Ｋａｗｕｌｋａ）著、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９４８年、第７０巻、ｐ．１４１〜１４２；ｂ）Ｍ．ラウテンス（Ｍ．Ｌａｕｔｅｎｓ）、Ｗ．クルテ（Ｗ．Ｋｌｕｔｅ）、Ｗ．タム（Ｗ．Ｔａｍ）著、ケミカル・レビューズ（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．）、１９９６年、第９６巻、ｐ．４９〜９２；ｃ）Ｋ．Ｃ．ニコラウ（Ｋ．Ｃ．Ｎｉｃｏｌａｏｕ）、Ｓ．Ａ．スナイダー（Ｓ．Ａ．Ｓｎｙｄｅｒ）、Ｔ．モンタグノン（Ｔ．Ｍｏｎｔａｇｎｏｎ）、Ｇ．ヴァシリコギアナキス（Ｇ．Ｖａｓｓｉｌｉｋｏｇｉａｎｎａｋｉｓ）著、アンゲヴァンテ・ケミー（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．）、２００２年、第１１４巻、ｐ．１７４２〜１７７３；アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２００２年、第４１巻、ｐ．１６６８〜１６９８；ｄ）Ｅ．Ｊ．コレイ（Ｅ．Ｊ．Ｃｏｒｅｙ）著、アンゲヴァンテ・ケミー（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．）、２００２年、第１１４巻、ｐ．１７２４〜１７４１；アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２００２年、第４１巻、ｐ．１６５０〜１６６７。［３５］ａ）Ｈ．ドゥルマズ（Ｈ．Ｄｕｒｍａｚ）、Ａ．ダグ（Ａ．Ｄａｇ）、Ｏ．アルティンタス（Ｏ．Ａｌｔｉｎｔａｓ）、Ｔ．エルドガン（Ｔ．Ｅｒｄｏｇａｎ）、Ｇ．ヒザル（Ｇ．Ｈｉｚａｌ）、Ｕ．ツンカ（Ｕ．Ｔｕｎｃａ）著、マクロモレキュール（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２００７年、第４０巻、ｐ．１９１〜１９８；ｂ）Ｈ．ドゥルマズ（Ｈ．Ｄｕｒｍａｚ）、Ａ．ダグ（Ａ．Ｄａｇ）、Ａ．ヒザル（Ａ．Ｈｉｚａｌ）、Ｇ．ヒザル（Ｇ．Ｈｉｚａｌ）、Ｕ．ツンカ（Ｕ．Ｔｕｎｃａ）著、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．）パートＡ ２００８年、第４６巻、ｐ．７０９１〜７１００；ｃ）Ａ．ダグ（Ａ．Ｄａｇ）、Ｈ．ドゥルマズ（Ｈ．Ｄｕｒｍａｚ）、Ｅ．デミル（Ｅ．Ｄｅｍｉｒ）、Ｇ．ヒザル（Ｇ．Ｈｉｚａｌ）、Ｕ．ツンカ（Ｕ．Ｔｕｎｃａ）著、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．）パートＡ ２００８年、第４６巻、ｐ．６９６９〜６９７７；ｄ）Ｂ．ガカル（Ｂ．Ｇａｃａｌ）、Ｈ．アカット（Ｈ．Ａｋａｔ）、Ｄ．Ｋ．バルタ（Ｄ．Ｋ．Ｂａｌｔａ）、Ｎ．アルス（Ｎ．Ａｒｓｕ）、Ｙ．ヤグシ（Ｙ．Ｙａｇｃｉ）著、マクロモレキュール（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２００８年、第４１巻、ｐ．２４０１〜２４０５；ｅ）Ａ．ダグ（Ａ．Ｄａｇ）、Ｈ．ドゥルマズ（Ｈ．Ｄｕｒｍａｚ）、Ｕ．ツンカ（Ｕ．Ｔｕｎｃａ）、Ｇ．ヒザル（Ｇ．Ｈｉｚａｌ）、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃ
ｉ．）パートＡ ２００９年、第４７巻、ｐ．１７８〜１８７。［３６］Ｍ．Ｌ．ブラックマン（Ｍ．Ｌ．Ｂｌａｃｋｍａｎ）、Ｍ．ロイゼン（Ｍ．Ｒｏｙｚｅｎ）、Ｊ．Ｍ．フォックス（Ｊ．Ｍ．Ｆｏｘ）著、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００８年、第１３０巻、ｐ．１３５１８〜１３５１９。［３８］Ｎ．Ｋ．デヴァラジ（Ｎ．Ｋ．Ｄｅｖａｒａｊ）、Ｒ．ウェイスレダー（Ｒ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ）、Ｓ．Ａ．ハイデルブランド（Ｓ．Ａ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ）、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、２００８年、第１９巻、ｐ．２２９７〜２２９９。［３９］Ｗ．ソン（Ｗ．Ｓｏｎｇ）、Ｙ．ワン（Ｙ．Ｗａｎｇ）、Ｊ．クー（Ｊ．Ｑｕ）、Ｑ．リン（Ｑ．Ｌｉｎ）著、米国化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、２００８年、第１３０巻、ｐ．９６５４〜９６５５。［４０］Ｗ．ソン（Ｗ．Ｓｏｎｇ）、Ｙ．ワン（Ｙ．Ｗａｎｇ）、Ｊ．クー（Ｊ．Ｑｕ）、Ｍ．Ｍ．マデン（Ｍ．Ｍ．Ｍａｄｄｅｎ）、Ｑ．リン（Ｑ．Ｌｉｎ）著、アンゲヴァンテ・ケミー（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．）、２００８年、第１２０巻、ｐ．２８７４〜２８７７；アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２００８年、第４７巻、ｐ．２８３２〜２８３５。［４１］Ａ．ダグ（Ａ．Ｄａｇ）、Ｈ．ドゥルマズ（Ｈ．Ｄｕｒｍａｚ）、Ｇ．ヒザル（Ｇ．Ｈｉｚａｌ）、Ｕ．ツンカ（Ｕ．Ｔｕｎｃａ）著、ジャーナル・オブ・ポリマー・サイエンス（Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．）パートＡ ２００８年、第４６巻、ｐ．３０２〜３１３。［４２］ａ）Ａ．Ｊ．イングリス（Ａ．Ｊ．Ｉｎｇｌｉｓ）、Ｓ．シンウェル（Ｓ．Ｓｉｎｎｗｅｌｌ）、Ｔ．Ｐ．デイヴィス（Ｔ．Ｐ．Ｄａｖｉｓ）、Ｃ．バーナー−コウォリク（Ｃ．Ｂａｒｎｅｒ−Ｋｏｗｏｌｌｉｋ）、Ｍ．Ｈ．シュテンツェル（Ｍ．Ｈ．Ｓｔｅｎｚｅｌ）著、マクロモレキュール（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、２００８年、第４１巻、ｐ．４１２０〜４１２６；ｂ）Ｓ．シンウェル（Ｓ．Ｓｉｎｎｗｅｌｌ）、Ａ．Ｊ．イングリス（Ａ．Ｊ．Ｉｎｇｌｉｓ）、Ｔ．Ｐ．デイヴィス（Ｔ．Ｐ．Ｄａｖｉｓ）、Ｍ．Ｈ．シュテンツェル（Ｍ．Ｈ．Ｓｔｅｎｚｅｌ）、Ｃ．バーナー−コウォリク（Ｃ．Ｂａｒｎｅｒ−Ｋｏｗｏｌｌｉｋ）著、ケミカル・コミュニケーションズ（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、２００８年、ｐ．２０５２〜２０５４。［４３］Ａ．Ｊ．イングリス（Ａ．Ｊ．Ｉｎｇｌｉｓ）、Ｓ．シンウェル（Ｓ．Ｓｉｎｗｅｌｌ）、Ｍ．Ｈ．シュテンツェル（Ｍ．Ｈ．Ｓｔｅｎｚｅｌ）、Ｃ．バーナー−コウォリク（Ｃ．Ｂａｒｎｅｒ−Ｋｏｗｏｌｌｉｋ）著、アンゲヴァンテ・ケミー（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．）、２００９年、第１２１巻、ｐ．２４４７〜２４５０；アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２００９年、第４８巻、ｐ．２４１１〜２４１４に記載されるクリックケミストリー反応パートナー、基、およびハンドルが挙げられる。上に引用される全ての参照文献は、本明細書において提供される本発明の概念および方法にしたがって導入するのに好適なクリックケミストリーハンドルの開示について、参照により本明細書に援用される。
モルホリノリンカー
特定の実施形態において、リンカーは、モルホリノ部分を含み得る。モルホリノリンカーは、ポリヌクレオチドにおける３’末端ヌクレオシドなどのヌクレオシドの糖のシス−ジオールの酸化（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによる処理による）、続いて、得られたジアルデヒドの、以下に示されるアルコキシアミノ部分などの反応性アミノ部分との縮合によって形成され得る。
ある実施形態において、リンカーは、構造：
（式中、Ｂ１が、核酸塩基、水素、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意に置換されるアミノ、アジド、任意に置換されるＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリール、任意に置換されるＣ２〜Ｃ９複素環であり；
Ｒ１４およびＲ１５がそれぞれ、独立して、水素またはヒドロキシである）を含む。
ある実施形態において、リンカーは、構造：
（式中、ｏが、０、１、２、または３であり；
Ｙ６が、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり；
各Ｙ７およびＹ８が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
各Ｙ９が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ハロ、チオール、ボラニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、または任意に置換されるアミノであり；
Ｙ１０が、Ｏ、結合、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０ヘテロシクリレン、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレンである）を含む。
ある実施形態において、Ｙ１０が、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレンである。
ある実施形態において、反応性アミノ部分は、ＰＥＧ−アルコキシアミンであり、リンカーは、構造：
（式中、ｐが、０、１、２、３、４、または５である）を含む。
ある実施形態において、Ｒ１４およびＲ１５が両方ともヒドロキシである。ある実施形態において、ｏが１であり、Ｙ６がメチレンであり、Ｙ７およびＹ８が両方ともＯであり、Ｙ９がヒドロキシである。ある実施形態において、ｐが３である。
ある実施形態において、ＰＥＧ−アルコキシアミンは、アルキンとのクリックケミストリー反応においてさらに反応されるアジドを含み、リンカーは、構造：
を含む。
ある実施形態において、Ｙ１０が、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレンである。ある実施形態において、反応性アミノ部分は、カルバミドアルコキシアミンであり、リンカーは、構造：
（式中、ｑおよびｒがそれぞれ、独立して、１、２、３、４、または５である）を含む。
ある実施形態において、Ｒ１４およびＲ１５が両方ともヒドロキシである。ある実施形態において、ｑが５であり、Ｙ６がメチレンであり、Ｙ７およびＹ８が両方ともＯであり、Ｙ９がヒドロキシである。ある実施形態において、ｒが３である。
ある実施形態において、リンカーは、構造：
を含む。
当業者によって理解されるように、構造
は、以下に示される他の構造と平衡して存在し得る。
本発明は、モルホリノ構造と平衡して可能な構造の全てを包含することが意図される。
ホスフェート結合
ある実施形態において、３’−安定化尾部は、例えば、ホスフェート結合を介して、３’−ＵＴＲまたはポリ−Ａ領域の３’末端において、ポリヌクレオチドの残りの部分に結合される。ある実施形態において、ホスフェート結合は、天然のホスフェート結合である。ある実施形態において、３’−安定化尾部およびポリヌクレオチドの残りの部分の結合は、酵素的またはスプリントライゲーションによって形成される。
コドン最適化
本発明のポリヌクレオチド、それらの領域、部分、または部分領域は、コドン最適化され得る。コドン最適化方法は、当該技術分野において公知であり、いくつかの目的の１つ以上を達成するために有用であり得る。これらの目的は、標的生物および宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適正なフォールディングを確実にし、ＧＣ含量を偏らせてｍＲＮＡ安定性を高めるか、または二次構造を減少させ、遺伝子構築もしくは発現を損ない得るタンデム反復コドンまたは塩基ランを最小限に抑え、転写および翻訳制御領域をカスタマイズし、タンパク質輸送配列を挿入または除去し、コードされたタンパク質（例えば、グリコシル化部位）における翻訳後修飾部位を除去／付加し、タンパク質ドメインを、付加、除去またはシャッフルし、制限部位を挿入または欠失させ、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡ分解部位を修飾すること、タンパク質の様々なドメインが適切にフォールディングすることが可能であるように翻訳速度を調節すること、またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を減少させるかもしくはなくすことを含む。コドン最適化手段、アルゴリズムおよびサービスは、当該技術分野において公知であり、非限定的な例としては、ジーンアート（ＧｅｎｅＡｒｔ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、ＤＮＡ２．０（カリフォルニア州メンローパーク（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ））からのサービスおよび／または専有の方法が挙げられる。一実施形態において、ＯＲＦ配列は、最適化アルゴリズムを用いて最適化される。各アミノ酸についてのコドン選択肢が表２に示される。
「コドン最適化」は、（例えば、インビボ発現を増加させるために）開始ヌクレオチド配列の少なくとも１つのコドンを、同じアミノ酸をコードする別のコドンで置換することによる、開始ヌクレオチド配列の修飾を指す。表３は、ヒトについてのコドン使用頻度を含む（コドン使用データベース：［［ｗｗｗ．］］ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｈｏｗｃｏｄｏｎ．ｃｇｉ？ｓｐｅｃｉｅｓ＝９６０６＆ａａ＝１＆ｓｔｙｌｅ＝Ｎ）。
表３において、一文字アミノ酸表記の後の括弧内の数字は、同じアミノ酸をコードする他のコドンに対する当該コドンの頻度を示し、ここで、「１」は、最も高い頻度であり、整数が大きいほど、より低頻度のコドンを示す。
グアニン最大化コドンは、特定のアミノ酸について可能な最も多い数のグアニンを有するコドンである。シトシン最大化コドンは、特定のアミノ酸について可能な最も多い数のシトシンを有するコドンである。グアニン最大化コドンおよび／またはシトシン最大化コドンは、特定のアミノ酸について最も多い数のグアニン、シトシン、またはグアニンおよびシトシンの組合せを有するコドンを指す。２つ以上のコドンが、特定のアミノ酸について同じ数のグアニン、シトシン、またはそれらの組合せを有する場合、低頻度の最大化コドンは、表３において別の最大化コドンより大きい整数値を有するコドンである。
一実施形態において、ヌクレオチド配列がコドン最適化された後、それは、制限部位を含む領域についてさらに評価され得る。配列から制限部位を除去するために、制限部位領域内の少なくとも１つのヌクレオチドが、別のヌクレオチドで置換され得るが、ヌクレオチドの置換は、コドン最適化ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を改変する。
本発明のある実施形態において有益であると考えられる特徴は、ポリヌクレオチドの領域によってコードされてもよく、このような領域は、ポリペプチドをコードする領域の上流（５’）または下流（３’）であり得る。これらの領域は、タンパク質コード領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のコドン最適化の前および／または後に、ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。ポリヌクレオチドは、５’−および３’−フランキング領域の両方を含有する必要はない。このような特徴の例としては、限定はされないが、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、オリゴ（ｄＴ）配列、および検出可能タグが挙げられ、ＸｂａＩ認識を有し得る多重クローニング部位を含み得る。
ある実施形態において、５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲ領域は、フランキング領域として提供され得る。複数の５’−または３’−ＵＴＲが、フランキング領域に含まれてもよく、同じかまたは異なる配列のものであり得る。フランキング領域の任意の部分（皆無を含む）は、コドン最適化されてもよく、独立して、コドン最適化の前および／または後に、１つ以上の異なる構造的または化学的改変を含有し得る。
最適化（必要に応じて）の後、ポリヌクレオチド成分は、再構成され、限定はされないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、および人工染色体などのベクターに形質転換される。例えば、最適化ポリヌクレオチドは、再構成され、ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、アカパンカビ属（ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、トウモロコシ、ショウジョウバエなどに形質転換され得、ここで、本明細書に記載される方法によって、高コピープラスミド様または染色体構造が生じる。
本発明の改変ヌクレオチド、ヌクレオシドおよびポリヌクレオチド
本明細書において、ヌクレオチド、ヌクレオシド、またはポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ分子など）において、「改変（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」または、適切な場合、「改変（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）」という用語は、Ａ、Ｇ、ＵまたはＣリボヌクレオチドに対する改変を指す。一般に、本明細書において、これらの用語は、天然の５’末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド改変を指すことは意図されていない。
改変は、様々な異なる改変であり得る。ある実施形態において、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである場合、コード領域、フランキング領域および／または末端領域（例えば、３’−安定化領域）は、１つ、２つ、またはそれ以上の（任意に異なる）ヌクレオシドまたはヌクレオチド改変を含有し得る。ある実施形態において、細胞に導入される改変ポリヌクレオチドは、非改変ポリヌクレオチドと比較して、細胞内の減少した分解を示し得る。
本発明のポリヌクレオチドは、核酸塩基、糖、またはヌクレオシド間結合（例えば、連結ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格）に対するものなどの、任意の有用な改変を含み得る。特定の実施形態において、改変（例えば、１つ以上の改変）は、核酸塩基、糖、およびヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。本発明に係る改変は、リボ核酸（ＲＮＡ）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（例えば、リボフラノシル環の２’−ＯＨの２’−Ｈへの置換）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはそのハイブリッドへの改変であり得る。さらなる改変が、本明細書に記載される。
本明細書に記載されるように、ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）が導入された細胞の自然免疫応答を実質的に誘導しない。誘導される自然免疫応答の特徴としては、１）炎症促進性サイトカインの発現の増加、２）細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５などの活性化、および／または３）タンパク質翻訳の終結または低減が挙げられる。
ポリヌクレオチドは、他の薬剤（例えば、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、アプタマー、ベクター）を任意に含み得る。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオシドまたはヌクレオチド（すなわち、改変ｍＲＮＡ分子）を有する１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含み得る。これらのポリヌクレオチドについての詳細が以下に続く。
核酸塩基改変
改変ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、改変核酸塩基を含み得る。ＲＮＡに見られる核酸塩基の例としては、限定はされないが、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルが挙げられる。ＤＮＡに見られる核酸塩基の例としては、限定はされないが、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンが挙げられる。これらの核酸塩基は、向上した特性、例えば、ヌクレアーゼに対する耐性などの向上した安定性を有するポリヌクレオチド分子を提供するように、改変または完全に置換され得る。
改変ヌクレオチド塩基対形成は、標準アデニン−チミン、アデニン−ウラシル、またはグアニン−シトシン塩基対だけでなく、ヌクレオチドおよび／または非標準または改変塩基を含む改変ヌクレオチド間で形成される塩基対も包含し、ここで、水素結合供与体および水素結合受容体の構成が、非標準塩基と標準塩基との間、または２つの相補的非標準塩基構造間の水素結合を可能にする。このような非標準塩基対形成の一例は、改変ヌクレオチドイノシンおよびアデニン、シトシン、またはウラシル間の塩基対形成である。
ある実施形態において、核酸塩基は、改変ウラシルである。改変ウラシルを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウラシル、６−アザ−ウラシル、２−チオ−５−アザ−ウラシル、２−チオ−ウラシル（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウラシル（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウラシル（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウラシル、５−ハロ−ウラシル（例えば、５−ヨード−ウラシルまたは５−ブロモ−ウラシル）、３−メチル−ウラシル（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウラシル（ｍｏ５Ｕ）、ウラシル５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウラシル５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウラシル（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウラシル（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウラシルメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウラシル（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウラシル（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウラシル（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウラシル（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウラシル（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウラシル（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウラシル、１−プロピニル−プソイドウラシル、５−タウリノメチル−ウラシル（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウラシル（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−ウラシル（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウラシル（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウラシル（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチル−ジヒドロウラシル（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウラシル、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウラシル、２−メトキシ−４−チオ−ウラシル、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３ ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウラシル（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウラシル（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２−チオ−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、および５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウラシル、デオキシチミジン、５−（２−カルボメトキシビニル）−ウラシル、５−（カルバモイルヒドロキシメチル）−ウラシル、５−カルバモイルメチル−２−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチル−２−チオ−ウラシル、５−シアノメチル−ウラシル、５−メトキシ−２−チオ−ウラシル、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）］ウラシルが挙げられる。
ある実施形態において、核酸塩基は、改変シトシンである。改変シトシンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、５−アザ−シトシン、６−アザ−シトシン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シトシン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シトシン（ａｃ４Ｃ）、５−ホルミル−シトシン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シトシン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シトシン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シトシン（例えば、５−ヨード−シトシン）、５−ヒドロキシメチル−シトシン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シトシン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シトシン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シトシン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シトシン、２−メトキシ−５−メチル−シトシン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、５，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−Ｏ−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−（３−アジドプロピル）−シトシン、および５−（２−アジドエチル）−シトシンが挙げられる。
ある実施形態において、核酸塩基は、改変アデニンである。改変アデニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデニン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデニン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデニン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデニン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデニン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデニン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデニン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデニン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイル−アデニン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデニン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデニン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデニン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデニン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−アデノシン（ｍ１Ａｍ）、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデニン、８−アジド−アデニン、Ｎ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル（ｐｅｎｔａｏｘａｎｏｎａｄｅｃｙｌ））−アデニン、２，８−ジメチル−アデニン、Ｎ６−ホルミル−アデニン、およびＮ６−ヒドロキシメチル−アデニンが挙げられる。
ある実施形態において、核酸塩基は、改変グアニンである。改変グアニンを有する例示的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、非修飾ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアニン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−キューオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアニン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアニン（ｐｒｅＱ１）、アルカエオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアニン、６−チオ−グアニン、６−チオ−７−デアザ−グアニン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアニン、７−メチル−グアニン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアニン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアニン、１−メチル−グアニン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアニン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアニン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアニン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２、Ｎ２，７−ジメチル−グアニン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアニン、７−メチル−８−オキソ−グアニン、１−メチル−６−チオ−グアニン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアニン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアニン、Ｎ２−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−Ｏ−メチル−イノシン（Ｉｍ）、１，２’−Ｏ−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、１−チオ−グアニン、およびＯ−６−メチル−グアニンが挙げられる。
ヌクレオチドの改変核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジン類似体であり得る。例えば、核酸塩基は、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル、またはヒポキサンチンの改変であり得る。別の実施形態において、核酸塩基は、例えば、塩基の天然および合成誘導体も含むことができ、このような誘導体は、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ（例えば、８−ブロモ）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５−ａ］１，３，５トリアジノン、９−デアザプリン、イミダゾ［４，５−ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン、ピラジン−２−オン、１，２，４−トリアジン、ピリダジン；または１，３，５トリアジンを含む。ヌクレオチドが、略語Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵを用いて示される場合、各文字は、代表的な塩基および／またはその誘導体を指す。例えば、Ａは、アデニンまたはアデニン類似体、例えば、７−デアザアデニン）を含む。
糖における改変
本発明のポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるように、ＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み込まれ得る改変ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの糖において改変され得る。ある実施形態において、改変ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、構造：
を含む。
ある実施形態において、２’−ヒドロキシ基（ＯＨ）は、いくつかの異なる置換基で修飾または置換され得る。２’−位における例示的な置換としては、限定はされないが、Ｈ、アジド、ハロ（例えば、フルオロ）、任意に置換されるＣ１〜６アルキル（例えば、メチル）；任意に置換されるＣ１〜６アルコキシ（例えば、メトキシまたはエトキシ）；任意に置換されるＣ６〜１０アリールオキシ；任意に置換されるＣ３〜８シクロアルキル；任意に置換されるＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ、任意に置換されるＣ１〜１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載されるいずれか）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（ここで、Ｒは、Ｈまたは任意に置換されるアルキルであり、ｎが、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数である）；「ロックド」核酸（ＬＮＡ）（ここで、２’−ヒドロキシが、Ｃ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって、同じリボース糖の４’−炭素に連結され、例示的な架橋は、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋を含んでいた）；本明細書に定義されるアミノアルキル；本明細書に定義されるアミノアルコキシ；本明細書に定義されるアミノ；および本明細書に定義されるアミノ酸が挙げられる。
一般に、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖基リボースを含む。例示的な非限定的な改変ヌクレオチドとしては、リボース中の酸素の置換（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはメチレンもしくはエチレンなどのアルキレンによる）；二重結合の付加（例えば、リボースを、シクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換するために）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成するために）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびモルホリノ（ホスホロアミデート骨格も有する）などの、さらなる炭素またはヘテロ原子を有する６員または７員環を形成するために）；多環式形態（例えば、トリシクロおよび「ロックされていない（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）」形態、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ、ここで、リボースは、ホスホジエステル結合に結合されたグリコール単位で置換される）、トレオース核酸（ＴＮＡ、ここで、リボースは、α−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置換される）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ、ここで、２−アミノ−エチル−グリシン結合が、リボースおよびホスホジエステル骨格を置換する）が挙げられる。
ある実施形態において、糖基は、リボース中に対応する炭素と反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素を含有する。したがって、ポリヌクレオチド分子は、糖として、例えば、アラビノースまたはＬ−リボースを含有するヌクレオチドを含み得る。
ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシドを含み、ここで、糖は、Ｌ−リボース、２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−フルオロ−リボース、アラビノース、ヘキシトール、ＬＮＡ、またはＰＮＡである。
ヌクレオシド間結合における改変
本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る改変ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、ホスフェート骨格）において改変され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格に関して、「ホスフェート」および「ホスホジエステル」という語句は、同義的に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ以上を、異なる置換基で置換することによって改変され得る。
改変ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような別のヌクレオシド間結合による非改変ホスフェート部分の大規模な（ｗｈｏｌｅｓａｌｅ）置換を含み得る。改変リン酸基の例としては、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、ホスホン酸アルキルまたはアリール、およびホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、硫黄によって置換される両方の非結合酸素を有する。ホスフェートリンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレン−ホスホネート）による結合酸素の置換によって改変され得る。
改変ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、ボラン部分（ＢＨ３）、硫黄（チオ）、メチル、エチル、および／またはメトキシによる非架橋酸素の１つ以上の置換を含み得る。非限定的な例として、同じ位置（例えば、アルファ（α）、ベータ（β）またはガンマ（γ）位置）における２つの非架橋酸素が、硫黄（チオ）およびメトキシで置換され得る。
ホスフェート部分（例えば、α−チオリン酸）のα位置における酸素原子の１つ以上の置換は、非天然ホスホロチオエート骨格結合によってＲＮＡおよびＤＮＡに安定性（例えば、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対して）を与えるために提供される。ホスホロチオエートＤＮＡおよびＲＮＡは、増加したヌクレアーゼ耐性を有するため、細胞環境においてより長い半減期を有する。
リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を含む、本発明にしたがって用いられ得る他のヌクレオシド間結合が、本明細書に記載される。
ポリヌクレオチド分子の合成
本発明にしたがって使用するためのポリヌクレオチド分子は、当該技術分野において公知の任意の有用な技術にしたがって調製され得る。本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子の合成に使用される改変ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の一般的な方法および手順を用いて、容易に入手可能な出発材料から調製され得る。典型的なまたは好ましいプロセス条件（例えば、反応温度、時間、反応剤のモル比、溶媒、圧力など）が提供される場合、当業者は、さらなるプロセス条件を最適化し、発展させることができるであろう。最適な反応条件は、使用される具体的な反応剤または溶媒によって変化し得るが、このような条件は、日常的な最適化手順によって、当業者によって決定され得る。
本明細書に記載されるプロセスは、当該技術分野において公知の任意の好適な方法にしたがって監視され得る。例えば、生成物形成は、核磁気共鳴分光法（例えば、１Ｈもしくは１３Ｃ）、赤外分光法、分光測光法（例えば、ＵＶ−可視光）、もしくは質量分析法などの分光手段によって、または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）もしくは薄層クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって監視され得る。
本発明のポリヌクレオチド分子の調製は、様々な化学基の保護および脱保護を含み得る。保護および脱保護の必要性、ならびに適切な保護基の選択は、当業者によって容易に決定され得る。保護基の化学は、例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）ら著、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第２版、ワイリー・アンド・サンズ（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、１９９１年に見られる。
本明細書に記載されるプロセスの反応は、有機合成の当業者によって容易に選択され得る好適な溶媒中で行われ得る。好適な溶媒は、反応が行われる温度、すなわち、溶媒の凍結温度から溶媒の沸騰温度までの範囲であり得る温度で、出発材料（反応剤）、中間体、または生成物と実質的に非反応性であり得る。所与の反応が、１種の溶媒または２種以上の溶媒の混合物中で行われ得る。特定の反応工程に応じて、特定の反応工程に好適な溶媒が選択され得る。
改変ポリヌクレオチド（例えば、改変ｍＲＮＡ分子）のラセミ混合物の分割が、当該技術分野において公知の多くの方法のいずれかによって行われ得る。方法の例としては、光学的に活性な塩形成有機酸である「キラル分割酸」を用いた分別再結晶化が挙げられる。分別再結晶化法に好適な分割剤は、例えば、酒石酸、ジアセチル酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、マンデル酸、リンゴ酸、乳酸、または様々な学活性カンファースルホン酸のＤおよびＬ型などの光学活性酸である。ラセミ混合物の分割は、光学的に活性な分割剤（例えば、ジニトロベンゾイルフェニルグリシン）が充填されたカラムにおける溶離によって行うこともできる。好適な溶離溶媒組成物は、当業者によって決定され得る。
改変ポリヌクレオチドの合成
本開示にしたがって使用するためのポリヌクレオチドは、限定はされないが、化学合成、酵素合成（一般にインビトロ転写と呼ばれる）、より長い前駆体の酵素または化学切断を含む任意の利用可能な技術にしたがって調製され得る。改変ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、当該技術分野において公知の方法によって、例えば、オガタ（Ｏｇａｔａ）ら著、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、第７４巻、ｐ．２５８５〜２５８８、２００９年；パーマル（Ｐｕｒｍａｌ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、第２２巻、１号、ｐ．７２〜７８、１９９４年；フクハラ（Ｆｕｋｕｈａｒａ）ら著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１巻、４号、ｐ．５６３〜５６８、１９６２年；およびシュー（Ｘｕ）ら著、テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、第４８巻、９号、ｐ．１７２９〜１７４０、１９９２年に記載される合成方法にしたがって調製され得る。ＲＮＡを合成するさらなる方法が、当該技術分野において公知である（例えば、ゲイトＭ．Ｊ．（Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．）（編）「オリゴヌクレオチド合成：実用的アプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）」、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）［オックスフォードシャー（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ）］、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）：ＩＲＬプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、１９８４年；およびヘルデウィジンＰ．（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．）（編）「オリゴヌクレオチド合成：方法および適用（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２８８巻（ニュージャージー州クリフトン（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．））ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）：ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、２００５年を参照）。
特定の実施形態において、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成するための方法は、ヌクレオチド三リン酸ミックスの存在下で、目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼと接触させることを含み、例えば、ウラシルの少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％または１００％）が、５−メトキシウラシルである。本発明は、このような方法によって生成されるポリヌクレオチドも提供する。本方法は、キャッピング（例えば、５’キャップ構造の付加）、ポリ−Ａ領域の付加、および／または医薬組成物への製剤化などのさらなる工程を含み得る。ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼであり得る。インビトロ転写反応混合物は、転写緩衝液（４００ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、または同等物など）を含んでもよく、ＭｇＣｌ２、ＤＴＴ、および／またはスペルミジンまたは同等物を含み得る。ＲＮａｓｅ阻害剤が含まれ得る。残りの反応体積は、一般に、ｄＨ２Ｏで構成される。反応物は、約３７℃（３０〜４０℃など）でインキュベートされ得、３時間〜５時間（３ １／２時間〜４ １／２時間、または約４時間など）インキュベートされ得る。次に、ポリヌクレオチドは、ＤＮａｓｅおよび精製キットを用いて精製され得る。
例えば、本明細書に記載される改変ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成の当業者に公知の方法を用いて調製され得る。
ある実施形態において、本開示は、医薬品ポリヌクレオチドを合成する方法であって、
ａ）目的の医薬品タンパク質をコードする相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を提供する工程と；
ｂ）ヌクレオチドを選択する工程と、
ｃ）医薬品ポリヌクレオチドが合成されるような条件下で、提供されたｃＤＮＡおよび選択されたヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼと接触させる工程とを含む方法を提供する。
さらなる実施形態において、医薬品ポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）である。
本開示のさらに他の態様において、改変ポリヌクレオチドは、固相合成方法を用いて調製され得る。
ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ａ）ｉ）コード領域；ｉｉ）コザック配列を任意に含む５’−ＵＴＲ；ｉｉｉ）３’−ＵＴＲ；ｉｖ）少なくとも１つの５’−キャップ構造；およびｖ）ポリ−Ａ領域を含むポリヌクレオチドを合成すること；ｂ）３’−アジド含有ヌクレオシドの組み込み；およびｃ）５’末端におけるアルキン官能基（例えば、シクロオクチン含有官能基）を含有する３’−安定化領域の結合によって生成される。
自然細胞免疫応答の防止または低減
「自然免疫応答」という用語は、一般にウイルスまたは細菌由来の外因性一本鎖ポリヌクレオチドに対する細胞の応答を含み、これは、サイトカイン発現および放出、特に、インターフェロン、および細胞死の誘導を含む。タンパク質合成はまた、自然細胞免疫応答の際に低減される。外因性ポリヌクレオチドの導入によって引き起こされる細胞内の自然免疫応答をなくすことは有利であるが、本開示は、このような応答を完全になくすことなく、インターフェロンシグナル伝達を含む免疫応答を実質的に低減する、ｍＲＮＡなどの改変ポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態において、免疫応答は、対応する非改変ポリヌクレオチドによって誘導される免疫応答と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％超、低減される。このような低減は、１型インターフェロンの発現もしくは活性レベルまたはインターフェロン調節遺伝子、例えばトール様受容体（例えば、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）の発現によって測定され得る。自然免疫応答の誘導の低減または欠如は、細胞集団への改変ＲＮＡの１回以上の投与後の細胞死の減少によって測定することもでき；例えば、細胞死は、対応する非改変ポリヌクレオチドで観察される細胞死頻度より１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％超少ない。さらに、細胞死は、改変ポリヌクレオチドと接触された細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％未満または０．０１％未満に影響し得る。
ある実施形態において、ｍＲＮＡ分子を含む改変ポリヌクレオチドは、レシピエント細胞または生物による免疫応答を誘導しないか、または最小限しか誘導しないように改変される。免疫応答の誘発または活性化のこのような回避または防止は、本発明の改変ポリヌクレオチドの新規な特徴である。
本開示は、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの、標的細胞集団への改変ポリヌクレオチドの反復導入（例えば、トランスフェクション）を提供する。細胞集団を接触させる工程は、１回以上（２回、３回、４回、５回または６回以上など）反復され得る。ある実施形態において、細胞集団を改変ポリヌクレオチドと接触させる工程は、細胞集団内のタンパク質翻訳の所定の効率が達成されるのに十分な回数反復される。ヌクレオチド改変によって提供される標的細胞集団の細胞傷害性の低減を考えると、このような反復トランスフェクションは、多種多様な細胞型において、インビトロおよび／またはインビボで達成可能である。
野生型と比較して、改変ポリヌクレオチドの有効性を決定する方法は、本発明の外因性ポリヌクレオチドの投与によって発現が引き起こされる１つ以上のサイトカインの測定および分析を含み得る。これらの値は、非改変ポリヌクレオチドの投与、またはサイトカイン応答、またはポリＩＣ（ＰｏｌｙＩＣ）、Ｒ−８４８などの標準的測定基準と比較される。標準的測定基準の一例は、細胞、組織または生物において生成されるコードされたポリペプチド（タンパク質）のレベルまたは量と、改変ポリヌクレオチドの投与またはそれとの接触の結果として細胞、組織または生物において発現が引き起こされるサイトカインの１つ以上（または群）のレベルまたは量の比率の測定である。このような比率は、本明細書においてタンパク質：サイトカイン比または「ＰＣ」比と呼ばれる。ＰＣ比が高いほど、改変ポリヌクレオチド（測定されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド）はより有効である。本発明のサイトカインによる好ましいＰＣ比は、１超、１０超、１００超、１０００超、１０，０００超またはそれ以上であり得る。異なるまたは非改変構築物の改変ポリヌクレオチドより高いＰＣ比を有する改変ポリヌクレオチドが好ましい。ＰＣ比はさらに、ポリヌクレオチドに存在する改変パーセントによって特定され得る。例えば、１００％の改変ポリヌクレオチドに正規化して、サイトカイン（またはリスク）またはサイトカインプロファイルの関数としてのタンパク質産生を決定することができる。
ポリペプチド
本発明のポリヌクレオチドによって発現される目的のポリペプチドは、当該技術分野において公知の任意のポリペプチド、例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２５９９２４号明細書および同第２０１３／０２５９９２３号明細書、国際公開番号国際公開第２０１３／１５１６６３号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６９号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６７０号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６４号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６５号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１７３６号パンフレット、米国仮特許出願第６１／６１８，８６２号明細書、同第６１／６８１，６４５、同第６１／６１８，８７３号明細書、同第６１／６８１，６５０号明細書、同第６１／６１８，８７８号明細書、同第６１／６８１，６５４号明細書、同第６１／６１８，８８５号明細書、同第６１／６８１，６５８号明細書、同第６１／６１８，９１１号明細書、同第６１／６８１，６６７号明細書、同第６１／６１８，９２２号明細書、同第６１／６８１，６７５号明細書、同第６１／６１８，９３５号明細書、同第６１／６８１，６８７号明細書、同第６１／６１８，９４５号明細書、同第６１／６８１，６９６号明細書、同第６１／６１８，９５３号明細書、および同第６１／６８１，７０４号明細書（これらのそれぞれのポリペプチドは、参照により本明細書に援用される）に開示されるものから選択され得る。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）および顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）が、例示的なポリペプチドである。
ポリペプチド変異体
参照ポリペプチド配列と特定の同一性を有する変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供される。当該技術分野において公知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のペプチドの配列間の関係を指す。当該技術分野において、「同一性」は、２つ以上のアミノ酸残基の鎖間のマッチの数によって決定される、ペプチド間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処されるギャップアラインメント（もしあれば）を含む２つ以上の配列のより小さい配列間の同一マッチのパーセントが尺度となる。関連するペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に計算され得る。このような方法としては、限定はされないが、「分子計算生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、レスクＡ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８８年；「バイオコンピューティング：インフォーマティックスおよびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミスＤ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９３年；「配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ）」、パート１、グリフィンＡ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）、およびグリフィンＨ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、１９９４年；「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、フォン・ハインチェＧ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）著、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリブスコフＭ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデブローＪ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍ．ストックトン・プレス（Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９１年；およびカリロ（Ｃａｒｉｌｌｏ）ら著、ＳＩＡＭジャーナル・オン・アプライド・マセマティクス（ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．）、第４８巻、ｐ．１０７３、１９８８年に記載されるものが挙げられる。
ある実施形態において、ポリペプチド変異体は、参照ポリペプチドと同じかまたは類似の活性を有する。あるいは、変異体は、参照ポリペプチドと比べて改変された活性（例えば、増加または減少した）を有する。一般に、本開示の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、本明細書に記載され、当業者に公知の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定した際に、該当する特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。
当業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能性タンパク質ドメイン、および相同タンパク質も、本開示の範囲内であると考えられる。例えば、長さが１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１００超のアミノ酸の、参照タンパク質の任意のタンパク質断片（参照ポリペプチド配列より少なくとも１アミノ酸残基短いが、それ以外は同一のポリペプチド配列を意味する）が本明細書において提供される。別の例では、本明細書に記載される配列のいずれかと約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約１００％同一である約２０、約３０、約４０、約５０、または約１００アミノ酸の区間を含む任意のタンパク質が、本開示にしたがって用いられ得る。特定の実施形態において、本開示にしたがって用いられるタンパク質配列は、本明細書において提供または参照される配列のいずれかに示されるように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の突然変異を含む。
ポリヌクレオチドライブラリー
ヌクレオシド改変を含むポリヌクレオチドライブラリーも提供され、ここで、ポリヌクレオチドは、個別に、抗体、タンパク質結合パートナー、足場タンパク質、および当該技術分野において公知の他のポリペプチドなどのポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列を含有する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、標的細胞宿主への直接導入に好適な形態のｍＲＮＡであり、これは、次に、コードされたポリペプチドを合成する。
特定の実施形態において、異なるアミノ酸改変をそれぞれ含むタンパク質の複数の変異体が、生成され、薬物動態、安定性、生体適合性、および／または生物学的活性、または発現レベルなどの生物物理的特性に関して最良の変異体を決定するために試験される。このようなライブラリーは、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０９超の考えられる変異体（１つ以上の残基の置換、欠失、および１つ以上の残基の挿入を含む）を含有し得る。
ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体
適切なタンパク質翻訳は、ｍＲＮＡと結合されたいくつかのポリペプチドおよびポリヌクレオチドの物理学的凝集を含む。本開示によって提供されるのは、１つ以上のヌクレオシド改変（例えば、少なくとも２つの異なるヌクレオシド改変）を有する翻訳可能なｍＲＮＡと、ｍＲＮＡに結合された１つ以上のポリペプチドとを含有するタンパク質−ポリヌクレオチド複合体である。一般に、タンパク質は、複合体が導入される細胞の自然免疫応答を防止または低減するのに有効な量で提供される。
改変ポリヌクレオチドの使用
治療剤
本明細書に記載される改変ポリヌクレオチドは、治療剤として使用され得る。例えば、本明細書に記載される改変ポリヌクレオチドは、動物または対象に投与され得、ここで、改変ポリヌクレオチドは、インビボで翻訳されて、動物または対象において治療用ペプチドを産生する。したがって、ヒトおよび他の哺乳動物における疾患または病態の治療または予防のためのｍＲＮＡ、組成物（医薬組成物など）、方法、キット、および試薬が本明細書において提供される。本開示の活性治療剤は、改変ポリヌクレオチド、改変ポリヌクレオチドまたは改変ポリヌクレオチドから翻訳されたポリペプチドを含有する細胞、改変ポリヌクレオチドから翻訳されたポリペプチド、改変ポリヌクレオチドまたは改変ポリヌクレオチドから翻訳されたポリペプチドを含有する細胞と接触された細胞、改変ポリヌクレオチドを含有する細胞を含有する組織、および改変ポリヌクレオチドを含有する細胞を含有する組織を含有する器官を含む。
本明細書に記載される改変ポリヌクレオチドを用いて、細胞集団においてポリペプチドを産生するように、合成または組み換えポリヌクレオチドの翻訳を誘導する方法が提供される。このような翻訳は、インビボ、エクスビボ、培養下、またはインビトロで行われ得る。細胞集団は、少なくとも１つのヌクレオシド改変を有するポリヌクレオチドと、ポリペプチドをコードする翻訳可能領域とを含有する有効量の組成物と接触される。この集団は、ポリヌクレオチドが、細胞集団の１つ以上の細胞に局在化されて、組み換えポリペプチドが、ポリヌクレオチドから細胞に翻訳されるような条件下で接触される。
組成物の有効量は、少なくとも部分的に、標的組織、標的細胞型、投与手段、ポリヌクレオチドの物理的特性（例えば、改変ヌクレオシドのサイズ、および程度）、および他の決定因子に基づいて提供される。一般に、組成物の有効量は、細胞内の効率的なタンパク質産生、好ましくは、対応する非改変ポリヌクレオチドを含有する組成物より効率的な産生をもたらす。増加した効率は、増加した細胞トランスフェクション（すなわち、ポリヌクレオチドで形質転換された細胞のパーセンテージ）、ポリヌクレオチドからの増加したタンパク質翻訳、減少したポリヌクレオチド分解（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の増加した持続時間によって実証される）、または宿主細胞の減少した自然免疫応答または向上した治療的有用性によって実証され得る。
本開示の態様は、それを必要とする哺乳動物対象において組み換えポリペプチドのインビボ翻訳を誘導する方法に関する。この方法では、少なくとも１つのヌクレオシド改変を有するポリヌクレオチドと、ポリペプチドをコードする翻訳可能領域とを含有する有効量の組成物が、本明細書に記載される送達方法を用いて、対象に投与される。ポリヌクレオチドが、対象の１つまたは複数の細胞に局在化され、組み換えポリペプチドが、ポリヌクレオチドから細胞に翻訳されるような量でおよび他の条件下で、ポリヌクレオチドは提供される。ポリヌクレオチドが局在化される細胞、または細胞が存在する組織は、１回または２回以上のポリヌクレオチド投与によりターゲティングされ得る。
本開示の他の態様は、改変ポリヌクレオチドを含有する細胞の、哺乳動物対象への移植に関する。薬学的に許容できる担体中での細胞の製剤化と同様に、局所移植（例えば、局所または皮下投与）、器官送達または全身注射（例えば、静脈注射または吸入）などの、哺乳動物対象への細胞の投与が、当業者に周知である。改変ポリヌクレオチドを含有する組成物は、筋内内、動脈内、腹腔内、静脈内、鼻内、皮下、内視鏡、経皮、または髄腔内投与のために製剤化される。ある実施形態において、組成物は、徐放のために製剤化される。
ある実施形態において、治療剤が投与される対象は、疾患、障害、または有害な状態に罹患しているか、またはそれらを発症するリスクがある。臨床診断、バイオマーカレベル、ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ：ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｙ）、および当該技術分野において公知の他の方法を含み得る、対象を特定、診断、および分類する方法が提供される。
特定の実施形態において、投与された改変ポリヌクレオチドは、組み換えポリペプチドが翻訳される細胞に実質的に存在しない機能活性を与える１つ以上の組み換えポリペプチドの産生を指令する。例えば、欠落した機能活性は、天然での酵素、構造、または遺伝子調節活性であり得る。
他の実施形態において、投与された改変ポリヌクレオチドは、組み換えポリペプチドが翻訳される細胞に実質的に存在しないポリペプチド（または複数のポリペプチド）を置換する１つ以上の組み換えポリペプチドの産生を指令する。このような非存在は、コード遺伝子またはその調節経路の遺伝子突然変異に起因し得る。他の実施形態において、投与された改変ポリヌクレオチドは、組み換えポリペプチドが翻訳される細胞中に存在するポリペプチド（または複数のポリペプチド）の量を補足するように、１つ以上の組み換えポリペプチドの産生を指令する。あるいは、組み換えポリペプチドは、細胞の表面に存在するか、または細胞から分泌される内因性タンパク質の活性に拮抗するように機能する。通常、内因性タンパク質活性は、例えば、改変された活性または局在化をもたらす内因性タンパク質の突然変異のため、対象にとって有害である。さらに、組み換えポリペプチドは、細胞の表面に存在するか、または細胞から分泌される生物学的部分の活性に直接もしくは間接的に拮抗する。拮抗される生物学的部分の例としては、脂質（例えば、コレステロール）、リポタンパク質（例えば、低比重リポタンパク質）、ポリヌクレオチド、炭水化物、または小分子毒素が挙げられる。
本明細書に記載される組み換えタンパク質は、細胞内、おそらく核などの特定のコンパートメント内での局在化のために操作されるか、または細胞からの分泌または細胞の細胞膜への転位のために操作される。
本明細書に記載されるように、本開示の改変ポリヌクレオチドの有用な特徴は、外因性ポリヌクレオチドに対する細胞の自然免疫応答を低減、回避、防止するかまたはなくす能力である。細胞または細胞の集団における免疫応答の滴定、低減または排除を行う方法が提供される。ある実施形態において、翻訳可能領域および少なくとも１つのヌクレオシド改変を含む第１の用量の第１の外因性ポリヌクレオチドを含有する第１の組成物と細胞を接触させ、第１外因性ポリヌクレオチドに対する細胞の自然免疫応答のレベルを決定する。続いて、第２の用量の第１の外因性ポリヌクレオチドを含む第２の組成物と細胞を接触させるが、第２の用量は、第１の用量と比較して、少ない量の第１の外因性ポリヌクレオチドを含有する。あるいは、第１の用量の第２の外因性ポリヌクレオチドと細胞を接触させる。第２の外因性ポリヌクレオチドは、１つ以上の改変ヌクレオシドを含有してもよく、これは、第１の外因性ポリヌクレオチドと同じかまたは異なり得、あるいは、第２の外因性ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオシドを含有しなくてもよい。細胞を第１の組成物および／または第２の組成物と接触させる工程は、１回以上反復され得る。さらに、細胞内のタンパク質産生（例えば、タンパク質翻訳）の効率が、任意に決定され、目標のタンパク質産生効率が達成されるまで、細胞は、第１および／または第２の組成物で再度トランスフェクトされ得る。
疾患および病態の治療薬
欠失タンパク質活性を置換するか、または異常タンパク質活性を解消することによって、欠失または異常タンパク質活性によって特徴付けられる疾患の症状を治療または予防するための方法が提供される。ウイルスＤＮＡベクターと比較して、改変ｍＲＮＡの導入後のタンパク質産生の開始が急速であるため、本開示の化合物は、敗血症、脳卒中、および心筋梗塞などの急性疾患を治療する際に特に有利である。さらに、本開示の改変ｍＲＮＡの転写調節が欠如していることは、タンパク質産生の正確な滴定が達成可能である点で有利である。多くの疾患は、欠失した（または適切なタンパク質機能が起こらないほど実質的に減少した）タンパク質活性によって特徴付けられる。このようなタンパク質は、存在しないことがあるか、非常に少ない量で存在し、または本質的に非機能性である。本開示は、本明細書において提供される改変ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドまたは細胞ベースの治療薬を導入することによって、対象におけるこのような病態または疾患を治療するための方法を提供し、ここで、改変ポリヌクレオチドは、対象の標的細胞から欠失したタンパク質活性に代わるタンパク質をコードする。
機能不全または異常タンパク質活性によって特徴付けられる疾患としては、限定はされないが、癌および他の増殖性疾患、遺伝性疾患（例えば、嚢胞性線維症）、自己免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心血管疾患、および代謝性疾患が挙げられる。本開示は、本明細書において提供される改変ポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドまたは細胞ベースの治療薬を導入することによって、対象におけるこのような病態または疾患を治療するための方法を提供し、ここで、改変ポリヌクレオチドは、対象の細胞中に存在する異常タンパク質活性に拮抗するか、またはこれを解消するタンパク質をコードする。
機能不全タンパク質の具体例としては、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ：ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）遺伝子のミスセンスまたはナンセンス突然変異体であり、これらは、それぞれ、ＣＦＴＲタンパク質の機能不全または非機能性タンパク質変異体を産生し、これが嚢胞性線維症を引き起こす。
したがって、有効量のＣＴＦＲポリペプチドが細胞中に存在するような条件下で、機能性ＣＦＴＲポリペプチドをコードする翻訳可能領域を有する改変ポリヌクレオチドと対象の細胞を接触させることによって、哺乳動物対象の嚢胞性線維症を治療する方法が提供される。好ましい標的細胞は、肺などの上皮細胞であり、投与方法は、標的組織を考慮して決定され；すなわち、肺送達の場合、ポリヌクレオチドは、吸入による投与のために製剤化される。したがって、特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる目的のポリペプチドは、ＣＴＦＲポリペプチドであり、本発明のポリヌクレオチドまたは医薬組成物は、嚢胞性線維症を治療するのに使用するためのものである。
別の実施形態において、本開示は、対象の細胞集団に、ソルチリン（ゲノム研究により最近特性決定されたタンパク質）をコードする改変ポリヌクレオチド分子を導入し、それによって、対象の脂質異常症を改善することによって、対象の脂質異常症を治療するための方法を提供する。ＳＯＲＴ１遺伝子は、トランス・ゴルジ網（ＴＧＮ：ｔｒａｎｓ−Ｇｏｌｇｉ ｎｅｔｗｏｒｋ）膜貫通タンパク（ソルチリンと呼ばれる）をコードする。遺伝学研究により、５人の個体のうち１人が、ＳＯＲＴ１遺伝子の１ｐ１３遺伝子座に一塩基ヌクレオチド多型、ｒｓ１２７４０３７４を有し、これにより、個体は、低レベルの低比重リポタンパク（ＬＤＬ：ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）および超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ：ｖｅｒｙ−ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）を有しやすくなることが示された。約３０％の人に存在するマイナー対立遺伝子の各コピーは、ＬＤＬコレステロールを８ｍｇ／ｄＬ改変する一方、集団の約５％に存在するマイナー対立遺伝子の２コピーは、ＬＤＬコレステロールを１６ｍｇ／ｄＬ減少させる。マイナー対立遺伝子の保有者は、心筋梗塞のリスクが４０％低いことも示された。マウスにおける機能性インビボ研究により、マウス肝臓組織におけるＳＯＲＴ１の過剰発現が有意に低いＬＤＬ−コレステロールレベル（８０％も低い）をもたらしたこと、およびＳＯＲＴ１のサイレンシングにより、ＬＤＬコレステロールが約２００％増加したことが示される（ムスヌルＫ（Ｍｕｓｕｎｕｒｕ Ｋ）ら著、「非コード変異体から１ｐ１３コレステロール遺伝子座でのＳＯＲＴ１を介した表現型へ（Ｆｒｏｍ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔ ｔｏ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｖｉａ ＳＯＲＴ１ ａｔ ｔｈｅ １ｐ１３ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｌｏｃｕｓ）」、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１０年、第４６６巻、ｐ．７１４〜７２１）。したがって、特定の実施形態において、本発明のｍＲＮＡによってコードされる目的のポリペプチドは、ソルチリンであり、本発明のポリヌクレオチドまたは医薬組成物は、脂質異常症を治療するのに使用するためのものである。
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる目的のポリペプチドは、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）であり、本発明のポリヌクレオチドまたは医薬組成物は、脳虚血などの神経疾患を治療する、または好中球減少症を治療するのに使用するため、または（例えば、造血幹細胞移植に使用するための白血球除去輸血による収集の前に）血液中の造血幹細胞の数を増加させるのに使用するためのものである。
特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる目的のポリペプチドは、エリスロポエチン（ＥＰＯ：ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）であり、本発明のポリヌクレオチドまたは医薬組成物は、貧血、炎症性腸疾患（クローン病および／または潰瘍性大腸炎など）、または骨髄異形成を治療するのに使用するためのものである。
細胞ポリヌクレオチド送達の方法
本開示の方法は、インビボ、エクスビボ、または培養下での細胞集団へのポリヌクレオチド送達を促進する。例えば、複数の宿主細胞（例えば、酵母または哺乳類細胞などの真核細胞）を含有する細胞培養物が、少なくとも１つのヌクレオシド改変を有する改変ポリヌクレオチドと、任意に翻訳可能領域とを含有する組成物と接触される。この組成物は、一般に、トランスフェクション試薬または宿主細胞への改変ポリヌクレオチド取り込みの効率を高める他の化合物も含有する。改変ポリヌクレオチドは、対応する非改変ポリヌクレオチドと比べて、細胞集団における向上した保持を示す。改変ポリヌクレオチドの保持は、非改変ポリヌクレオチドの保持より高い。ある実施形態において、それは、非改変ポリヌクレオチドの保持より少なくとも約５０％、７５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％、または２００％超高い。このような保持の利点は、改変ポリヌクレオチドを用いた１回のトランスフェクションによって達成され得るか、または反復回数のトランスフェクション後に得られる。
ある実施形態において、改変ポリヌクレオチドは、１つ以上のさらなるポリヌクレオチドとともに標的細胞集団に送達される。このような送達は、同時であってもよく、または改変ポリヌクレオチドは、１つ以上のさらなるポリヌクレオチドの送達の前に送達される。さらなる１つ以上のポリヌクレオチドは、改変ポリヌクレオチドまたは非改変ポリヌクレオチドであり得る。改変ポリヌクレオチドの最初の存在が、細胞集団の自然免疫応答を実質的に誘導しないこと、さらに、自然免疫応答が、非改変ポリヌクレオチドのその後の存在によって活性化されないことが理解される。これに関して、標的細胞集団に存在することが所望されるタンパク質が、非改変ポリヌクレオチドから翻訳される場合、改変ポリヌクレオチド自体は、翻訳可能領域を含有しなくてもよい。
ターゲティング部分
本開示の実施形態において、改変ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロのいずれかで、細胞を特定の組織空間にターゲティングするか、または特定の部分と相互作用するように機能するタンパク質結合パートナーまたは細胞の表面上の受容体を発現するために提供される。好適なタンパク質結合パートナーとしては、抗体およびその機能性断片、足場タンパク質、またはペプチドが挙げられる。さらに、改変ポリヌクレオチドは、脂質、炭水化物、または他の生物学的部分の合成および細胞外局在化を指令するのに用いられ得る。
永久遺伝子発現サイレンシング
哺乳動物対象において遺伝子発現を後成的にサイレンシングするための方法であって、ヘテロクロマチン形成を開始させ、遺伝子のサイレンシングのために特定の遺伝子周辺の遺伝子転写を低減するように、配列特異的ヒストンＨ３メチル化に指令することが可能な１つまたは複数のポリペプチドを翻訳可能領域がコードするポリヌクレオチドを含む方法。例えば、ヤヌスキナーゼ２遺伝子の機能獲得型突然変異は、骨髄増殖性疾患のファミリーに関与する。
脂質ナノ粒子
ある実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に封入される。したがって、ある態様において、本発明は、脂質ナノ粒子に封入された本発明のポリヌクレオチドを含むナノ粒子組成物を提供する。ナノ粒子組成物は、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、リポソーム、脂質小胞、およびリポプレックスを含む。ある実施形態において、ナノ粒子組成物は、１つ以上の脂質二重層を含む小胞である。特定の実施形態において、ナノ粒子組成物は、水性のコンパートメントで隔てられた２つ以上の同心の二重層を含む。脂質二重層は、機能化され、および／または互いに架橋され得る。脂質二重層は、１つ以上のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含み得る。
カチオン性／イオン性脂質
本発明のナノ粒子組成物は、本発明のポリヌクレオチドに加えて、脂質成分を含む。ナノ粒子組成物の脂質成分は、１つ以上の脂質を含み得る。例えば、ナノ粒子組成物は、１つ以上のカチオン性および／またはイオン性脂質を含み得る。カチオン性および／またはイオン性脂質は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ），１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、および（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスタ−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる非限定的な群から選択され得る。これらに加えて、カチオン性脂質はまた、環状アミンを含む脂質であり得る。
ＰＥＧ脂質
本発明のナノ粒子組成物の脂質成分は、１つ以上のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含み得る。このような種は、あるいは、ＰＥＧ化脂質と呼ばれる。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。
脂質成分は、１つ以上のＰＥＧ脂質を含み得る。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
構造脂質
ナノ粒子組成物の脂質成分は、１つ以上の構造脂質（例えば、コレステロールフェコステロール、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、またはα−トコフェロール）を含み得る。
リン脂質
ナノ粒子組成物の脂質成分は、１つ以上の（ポリ）不飽和脂質などの１つ以上のリン脂質を含み得る。一般に、このような脂質は、リン脂質部分および１つ以上の脂肪酸部分を含み得る。例えば、リン脂質は、式：
（式中、Ｒｐが、リン脂質部分を表し、Ｒ１ｐおよびＲ２ｐが、同じかまたは異なり得る飽和を含むかまたは含まない脂肪酸部分を表す）で表される脂質であり得る。リン脂質部分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２−リゾホスファチジルコリン、およびスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。脂肪酸部分は、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸酸、α−リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。分枝、酸化、環化、およびアルキンを含む、修飾および置換を含む天然種を含む非天然種も考えられる。
ある実施形態において、ナノ粒子組成物は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ：１，２−ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ：１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、またはＤＳＰＣおよびＤＯＰＥの両方を含み得る。本発明の組成物および方法に有用なリン脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＥ、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ：１，２−ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ：１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ：１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ：１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ：１，２−ｄｉｕｎｄｅｃａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ：１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセリン）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、およびスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
他の成分
ナノ粒子組成物は、前の部分に記載されるものに加えて、１つ以上の成分を含み得る。例えば、ナノ粒子組成物は、ビタミン（例えば、ビタミンＡもしくはビタミンＥ）またはステロールなどの１つ以上の疎水性小分子を含み得る。
ナノ粒子組成物は、１つ以上の透過性促進剤（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ）分子、炭水化物、ポリマー、治療剤、表面改質剤（ｓｕｒｆａｃｅ ａｌｔｅｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、または他の成分も含み得る。透過性促進剤分子は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号明細書に記載される分子であり得る。炭水化物は、単糖類（例えば、グルコース）および多糖類（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体および類似体）を含み得る。
ポリマーが、ナノ粒子組成物に含まれてもよく、および／またはナノ粒子組成物を封入または部分的に封入するのに使用され得る。ポリマーは、生分解性および／または生体適合性であり得る。ポリマーとしては、限定はされないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、およびポリアリレートから選択され得る。例えば、ポリマーは、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＥＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−ＰＰＯ−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリシアノアクリル酸アルキル、ポリウレタン、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｌ−グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えば、ポリエチレンおよびポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアルキレンテレフタレート、例えば、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えば、ポリ（酢酸ビニル）、ポリハロゲン化ビニル、例えば、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）ならびにそれらのコポリマーおよび混合物、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリオキサミン、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）、および炭酸トリメチレンが挙げられる。
治療剤としては、限定はされないが、細胞毒性剤、化学療法剤、および他の治療剤が挙げられる。細胞毒性剤としては、例えば、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、マイタンシノイド、ラケルマイシン、およびそれらの類似体が挙げられる。放射性イオンはまた、治療剤として使用されてもよく、例えば、放射性ヨウ素、ストロンチウム、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、コバルト、イットリウム、サマリウム、およびプラセオジムを含み得る。他の治療剤は、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、および５−フルオロウラシル、およびダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、ラケルマイシン、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、およびシスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシンおよびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン）、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、タキソール、およびマイタンシノイド）を含み得る。
表面改質剤としては、限定はされないが、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロミドなどのカチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、およびポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、アセチルシステイン、オオヨモギ、ブロメライン、パパイン、クサギ属の木（ｃｌｅｒｏｄｅｎｄｒｕｍ）、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、およびエルドステイン）、およびＤＮａｓｅ（例えば、ｒｈＤＮａｓｅ）が挙げられる。表面改質剤は、ナノ粒子内に、および／またはナノ粒子組成物の表面に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによって）配置され得る。
これらの成分に加えて、本発明のナノ粒子組成物は、医薬組成物に有用な任意の物質を含み得る。例えば、ナノ粒子組成物は、１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤または補助成分、例えば、限定はされないが、１つ以上の溶媒、分散媒、希釈剤、分散助剤、懸濁助剤、造粒助剤、崩壊剤、充填剤、滑剤、液体ビヒクル、結合剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、緩衝剤、滑沢剤、油、防腐剤、および他の種を含み得る。ワックス、バター、着色剤、コーティング剤、香味料、および芳香剤などの賦形剤も含まれ得る。薬学的に許容できる賦形剤は、当該技術分野において周知である（例えば、「レミントンの薬学の科学および実施（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）著；リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州バルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）、２００６年を参照）。
希釈剤の例としては、限定はされないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉砂糖、および／またはそれらの組合せが挙げられる。造粒剤および分散剤は、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木製品、天然海綿、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、ナトリウムカルボキシメチルデンプン（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファデンプン（スターチ１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物、および／またはそれらの組合せからなる非限定的な一覧から選択され得る。
表面活性剤および／または乳化剤としては、限定はされないが、天然の乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド性粘土（例えばベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、モノステアリン酸グリセリル、およびプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えばカルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［トゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、ソルビタンモノオレエート［スパン（ＳＰＡＮ）（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えばポリオキシエチレンモノステアレート［ミルジ（ＭＹＲＪ）（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、およびソルトール（ＳＯＬＵＴＯＬ）（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、クレモフォール（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル［ブリジ（ＢＲＩＪ）（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）（登録商標）Ｆ ６８、ポロキサマー（ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ）（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
結合剤は、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプンペースト）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然および合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワルガム、ガティガム、イサポール皮（ｉｓａｐｏｌ ｈｕｓｋ）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ビーガム（ＶＥＥＧＵＭ）（登録商標））、およびカラマツアラビノガラクタン）；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコール；およびそれらの組合せ、または任意の他の好適な結合剤であり得る。
防腐剤としては、限定はされないが、酸化防止剤、キレート剤、抗菌防腐剤、抗真菌防腐剤、アルコール性防腐剤、酸性防腐剤、および／または他の防腐剤が挙げられる。酸化防止剤としては、限定はされないが、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または亜硫酸ナトリウムが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。抗菌防腐剤としては、限定はされないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが挙げられる。抗真菌防腐剤としては、限定はされないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が挙げられる。アルコール性防腐剤の例としては、限定はされないが、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、ベンジルアルコール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、および／またはフェニルエチルアルコールが挙げられる。酸性防腐剤の例としては、限定はされないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が挙げられる。他の防腐剤としては、限定はされないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシムメシレート、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、グリダント・プラス（ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ）（登録商標）、フェノニップ（ＰＨＥＮＯＮＩＰ）（登録商標）、メチルパラベン、ジャーマル（ＧＥＲＭＡＬＬ）（登録商標）１１５、ジャーマベン（ＧＥＲＭＡＢＥＮ）（登録商標）ＩＩ、ネオロン（ＮＥＯＬＯＮＥ）（商標）、カトン（ＫＡＴＨＯＮ）（商標）、および／またはユーキシル（ＥＵＸＹＬ）（登録商標）が挙げられる。
緩衝剤の例としては、限定はされないが、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、リン酸水酸化カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、アミノ−スルホン酸緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質除去蒸留水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、および／またはそれらの組合せが挙げられる。滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの組合せからなる非限定的な群から選択され得る。
油の例としては、限定はされないが、アーモンド、杏仁、アボカド、ババス、ベルガモット、クロスグリの種子、ルリヂサ、ケード、カモミール、キャノーラ、キャラウェイ、カルナウバ、ヒマシ、シナモン、カカオ脂、ココナッツ、タラの肝臓、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、月見草、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ヒョウタン、ブドウの種子、ハシバミの実、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイの実、ラバンジン、ラベンダー、レモン、リツェアクベバ、マカデミアナッツ、マロー、マンゴーの種子、メドウフォームの種子、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、桃仁、ピーナッツ、ケシの実、カボチャの種子、ナタネ、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、サンダルウッド、サスクアナ（ｓａｓｑｕａｎａ）、セイボリー、サジー、ゴマ、シアバター、シリコーン、ダイズ、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチバー、クルミ、および小麦胚芽油ならびにステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、シメチコン、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
組成物
ナノ粒子組成物は、以下のように、本発明のポリヌクレオチド、カチオン性／イオン性脂質、リン脂質（不飽和脂質、例えば、ＤＯＰＥなど）、ＰＥＧ脂質、および構造脂質を含み得る。
ある実施形態において、脂質成分は、カチオン性／イオン性脂質、リン脂質、ＰＥＧ脂質、および構造脂質を含む。脂質成分は、約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％のカチオン性／イオン性脂質、約１０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％〜約４８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含み得るが、ただし、総ｍｏｌ％は、１００％を超えない。例えば、脂質成分は、約４０ｍｏｌ％のカチオン性／イオン性脂質、約２０ｍｏｌ％のリン脂質、約３８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含み得る。ある実施形態において、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得、および／または構造脂質は、コレステロールであり得る。
ある実施形態において、脂質成分は、約４０ｍｏｌ％のカチオン性／イオン性脂質、約１５ｍｏｌ％のリン脂質、約４３．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含み得る。ある場合、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。他の実施形態において、脂質は、ＤＳＰＣであり得る。特定の実施形態において、構造脂質は、コレステロールであり得る。
他の実施形態において、脂質成分は、約４５ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％のカチオン性／イオン性脂質、約１５ｍｏｌ％〜約２５ｍｏｌ％のリン脂質、約２３．５ｍｏｌ％〜約３３．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含み得るが、ただし、総ｍｏｌ％は、１００％を超えない。例えば、脂質成分は、約５０ｍｏｌ％のカチオン性／イオン性脂質、約２０ｍｏｌ％のリン脂質、約２８．５ｍｏｌ％の構造脂質、および約１．５ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含み得る。ある実施形態において、リン脂質は、ＤＯＰＥであり得る。他の場合、リン脂質は、ＤＳＰＣであり得る。特定の実施形態において、構造脂質は、コレステロールであり得る。
ナノ粒子組成物は、１つ以上の特定の用途または標的のために設計され得る。例えば、ナノ粒子組成物は、本発明のポリヌクレオチドを、特定の細胞、組織、器官、または哺乳動物の身体におけるそれらの系もしくは群（腎臓系など）に送達するように設計され得る。ナノ粒子組成物の生理化学的特性は、特定の身体上の標的に対する選択性を高めるために改変され得る。例えば、粒径が、様々な器官の開窓（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ）のサイズに基づいて調節され得る。ナノ粒子組成物に含まれる本発明のポリヌクレオチドはまた、１つまたは複数の所望の送達標的に左右され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、特定の適応症、病態、疾患、または障害のために、および／または特定の細胞、組織、器官、またはそれらの系もしくは群（例えば、局所的または特異的送達）のために選択され得る。ナノ粒子組成物は、目的の１つ以上のポリペプチドをコードする本発明の１つ以上のポリヌクレオチドを含み得る。
ナノ粒子組成物中の本発明のポリヌクレオチドの量は、本発明のポリヌクレオチドのサイズ、配列、および他の特性に左右され得る。ナノ粒子組成物中の本発明のポリヌクレオチドの量はまた、ナノ粒子組成物のサイズ、組成、所望の標的、および他の特性に左右され得る。本発明のポリヌクレオチドおよび他の要素（例えば、脂質）の相対量も変化し得る。ある実施形態において、ナノ粒子組成物中の本発明のポリヌクレオチドに対する脂質成分のｗｔ／ｗｔ比は、約５：１〜約５０：１、例えば、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、および５０：１であり得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドに対する脂質成分のｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１〜約４０：１であり得る。ナノ粒子組成物中の本発明のポリヌクレオチドの量は、例えば、吸収分光法（例えば、紫外−可視分光法）を用いて測定され得る。
ある実施形態において、本発明の１つ以上のポリヌクレオチド、脂質、およびそれらの量は、特定のＮ：Ｐ比をもたらすように選択され得る。組成物のＮ：Ｐ比は、本発明のポリヌクレオチド中のリン酸基の数に対する１つ以上の脂質中の窒素原子のモル比を指す。一般に、より低いＮ：Ｐ比が好ましい。本発明の１つ以上のポリヌクレオチド、脂質、およびそれらの量は、約２：１〜約８：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、および８：１のＮ：Ｐ比をもたらすように選択され得る。特定の実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約２：１〜約５：１であり得る。好ましい実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約４：１であり得る。他の実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約５：１〜約８：１である。例えば、Ｎ：Ｐ比は、約５．０：１、約５．５：１、約５．６７：１、約６．０：１、約６．５：１、または約７．０：１であり得る。
物理的特性
ナノ粒子組成物の特性は、その成分に左右される。特性はまた、ナノ粒子組成物の調製の方法および条件に応じて変化し得る。
本発明のナノ粒子組成物の平均サイズは、数１０ｎｍ〜数１００ｎｍであり得る。例えば、平均サイズは、約４０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、または１５０ｎｍであり得る。ある実施形態において、ナノ粒子組成物の平均サイズは、約８０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１００ｎｍ〜約１２０ｎｍ、または約１１０ｎｍ〜約１２０ｎｍであり得る。特定の実施形態において、平均サイズは、約９０ｎｍであり得る。別の特定の実施形態において、平均サイズは、約１００ｎｍであり得る。
本発明のナノ粒子組成物は、比較的均一であり得る。多分散指数は、ナノ粒子組成物の均一性、例えば、ナノ粒子組成物の粒径分布を示すのに使用され得る。小さい（例えば、０．３未満）多分散指数は、一般に、狭い粒径分布を示す。本発明のナノ粒子組成物は、約０〜約０．１８、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、または０．１８の多分散指数を有し得る。ある実施形態において、ナノ粒子組成物の多分散指数は、約０．１３〜約０．１７であり得る。
ナノ粒子組成物のゼータ電位は、組成物の運動電位を示すのに使用され得る。比較的低い電荷（正電荷か負電荷かにかかわらず）を有するナノ粒子組成物が一般に望ましいが、これは、より高度に帯電した種は、細胞、組織、および体内の他の要素と不必要に相互作用し得るためである。ある実施形態において、本発明のナノ粒子組成物のゼータ電位は、約−１０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約０ｍＶ、約−１０ｍＶ〜約−５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約−５ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約−５ｍＶ〜約０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ〜約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ〜約＋１５ｍＶ、または約＋５ｍＶ〜約＋１０ｍＶであり得る。
本発明のポリヌクレオチドの封入の効率は、提供される初期の量と比べた、調製後に封入されるかまたは他の形でナノ粒子組成物と結合された本発明のポリヌクレオチドの量を表す。封入効率は、高いのが望ましい（例えば、ほぼ１００％）。本発明のナノ粒子組成物では、本発明のポリヌクレオチドの封入効率は、少なくとも５０％、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。ある実施形態において、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。特定の実施形態において、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。
本発明のナノ粒子組成物は、任意に、１つ以上のコーティングを含み得る。例えば、ナノ粒子組成物は、コーティングを有するカプセル、フィルム、または錠剤において製剤化され得る。本発明の組成物を含むカプセル、フィルム、または錠剤は、任意の有用なサイズ、引張り強さ、硬度、または密度を有し得る。
医薬組成物
本開示は、タンパク質を発現することが可能な改変ポリヌクレオチドを提供する。医薬組成物は、任意に、１つ以上のさらなる治療活性物質を含み得る。ある実施形態によれば、それを必要とする対象に送達される１つ以上のタンパク質をコードする改変ポリヌクレオチドを含む医薬組成物を投与する方法が提供される。ある実施形態において、組成物は、ヒトに投与される。本開示の趣旨では、「活性成分」という語句は、一般に、本明細書に記載されるタンパク質、タンパク質コードまたはタンパク質含有複合体を指す。本発明のナノ粒子組成物はまた、医薬組成物として全体的にまたは部分的に製剤化され得る。本発明の医薬組成物は、１つ以上のナノ粒子組成物を含み得る。例えば、医薬組成物は、１つ以上の異なるポリヌクレオチドを含む１つ以上のナノ粒子組成物を含み得る。
本明細書において提供される医薬組成物の説明は、主に、ヒトへの投与に好適な医薬組成物に関するが、このような組成物は、一般に、あらゆる種類の動物への投与に好適であることが当業者によって理解されよう。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の改変は、十分に理解されており、通常の獣医学薬理学者は、もしあれば単なる通常の実験を用いて、このような改変を設計および／または実施することができる。医薬組成物の投与が想定される対象としては、限定はされないが、ヒトおよび／または他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／またはラットなどの商業的に価値のある哺乳動物を含む哺乳動物；および／またはニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／または七面鳥などの商業的に価値のある鳥類を含む鳥類が挙げられる。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学分野において公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、このような調製方法は、活性成分を、賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と結合させる工程と、次に、必要に応じておよび／または望ましい場合、生成物を、所望の単回または複数回投与単位に成形および／または包装する工程とを含む。
本開示に係る医薬組成物は、単一単位用量、および／または複数の単一単位用量として、調製、包装、および／または大量販売され得る。本明細書において使用される際、「単位用量」は、所定の量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量である。活性成分の量は、一般に、対象に投与され得る活性成分の投与量、および／またはこのような投与量の好都合な割合、例えば、このような投与量の２分の１もしくは３分の１に等しい。
本開示に係る医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容できる賦形剤、および／または任意のさらなる成分の相対量は、治療対象のアイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、サイズ、および／または状態に応じて、さらには、組成物が投与される経路に応じて変化する。例として、組成物は、０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
医薬製剤は、薬学的に許容できる賦形剤をさらに含んでもよく、このような賦形剤は、本明細書において使用される際、所望の特定の剤形に合わせて、あらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散もしくは懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、固体結合剤、および潤滑剤を含む。「レミントンの薬学の科学および実施（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）（リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州バルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）、２００６年）には、医薬組成物を製剤化するのに使用される様々な賦形剤およびその公知の調製技術が開示されている。任意の従来の賦形剤媒体が、何らかの望ましくない生物学的作用を生み出すか、または医薬組成物のいずれかの他の成分と有害な形で相互作用することなどによって、物質またはその誘導体と不適合である場合を除いて、その使用は、本開示の範囲内であると考えられる。
ある実施形態において、薬学的に許容できる賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。ある実施形態において、賦形剤は、ヒトへの使用および獣医学用途のために承認されている。ある実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認されている。ある実施形態において、賦形剤は、医薬品グレードである。ある実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ：Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、欧州薬局方（ＥＰ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、英国薬局方（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）、および／または国際薬局方（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）の基準を満たしている。
医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容できる賦形剤としては、限定はされないが、不活性希釈剤、分散剤および／または造粒剤、表面活性剤および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、および／または油が挙げられる。このような賦形剤は、任意に、医薬製剤に含まれ得る。カカオ脂および坐薬ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味料、香味料、および／または芳香剤などの賦形剤は、製剤者の判断にしたがって、組成物中に存在し得る。
例示的な希釈剤としては、限定はされないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉砂糖など、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
例示的な造粒剤および／または分散剤としては、限定はされないが、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木製品、天然海綿、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、ナトリウムカルボキシメチルデンプン（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファデンプン（スターチ１５００）、微結晶性デンプン、水不溶性デンプン、カルシウムカルボキシメチルセルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ビーガム（Ｖｅｅｇｕｍ））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物など、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
例示的な表面活性剤および／または乳化剤としては、限定はされないが、天然の乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド性粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびビーガム（Ｖｅｅｇｕｍ）（登録商標）［ケイ酸アルミニウムマグネシウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、モノステアリン酸グリセリル、およびプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）６０］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［スパン（Ｓｐａｎ）（登録商標）４０］、ソルビタンモノステアレート［スパン（Ｓｐａｎ）（登録商標）６０］、ソルビタントリステアレート［スパン（Ｓｐａｎ）（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、ソルビタンモノオレエート［スパン（Ｓｐａｎ）（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンモノステアレート［ミルジ（Ｍｙｒｊ）（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、およびソルトール（Ｓｏｌｕｔｏｌ）（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル、（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ブリジ（Ｂｒｉｊ）（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標）Ｆ ６８、ポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドキュセートナトリウム、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
例示的な結合剤としては、限定はされないが、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプンペースト）；ゼラチン；糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然および合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワルガム、ガティガム、イサポール皮の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ビーガム（Ｖｅｅｇｕｍ）（登録商標））、およびカラマツアラビノガラクタン）；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート；ワックス；水；アルコールなど；およびそれらの組合せが挙げられる。
例示的な防腐剤としては、限定はされないが、酸化防止剤、キレート剤、抗菌防腐剤、抗真菌防腐剤、アルコール性防腐剤、酸性防腐剤、および／または他の防腐剤が挙げられる。例示的な酸化防止剤としては、限定はされないが、αトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および／または亜硫酸ナトリウムが挙げられる。例示的なキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。例示的な抗菌防腐剤としては、限定はされないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが挙げられる。例示的な抗真菌防腐剤としては、限定はされないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が挙げられる。例示的なアルコール性防腐剤としては、限定はされないが、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシ安息香酸塩、および／またはフェニルエチルアルコールが挙げられる。例示的な酸性防腐剤としては、限定はされないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が挙げられる。他の防腐剤としては、限定はされないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシムメシレート、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、グリダント・プラス（Ｇｌｙｄａｎｔ Ｐｌｕｓ）（登録商標）、フェノニップ（Ｐｈｅｎｏｎｉｐ）（登録商標）、メチルパラベン、ジャーマル（Ｇｅｒｍａｌｌ）（登録商標）１１５、ジャーマベン（Ｇｅｒｍａｂｅｎ）（登録商標）ＩＩ、ネオロン（Ｎｅｏｌｏｎｅ）（商標）、カトン（Ｋａｔｈｏｎ）（商標）、および／またはユーキシル（Ｅｕｘｙｌ）（登録商標）が挙げられる。
例示的な緩衝剤としては、限定はされないが、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、リン酸水酸化カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、第二リン酸ナトリウム、第一リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質除去蒸留水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコールなど、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
例示的な滑沢剤としては、限定はされないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、およびそれらの組合せが挙げられる。
例示的な油としては、限定はされないが、アーモンド、杏仁、アボカド、ババス、ベルガモット、クロスグリの種子、ルリヂサ、ケード、カモミール、キャノーラ、キャラウェイ、カルナウバ、ヒマシ、シナモン、カカオ脂、ココナッツ、タラの肝臓、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、月見草、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ヒョウタン、ブドウの種子、ハシバミの実、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイの実、ラバンジン、ラベンダー、レモン、リツェアクベバ、マカデミアナッツ、マロー、マンゴーの種子、メドウフォームの種子、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、桃仁、ピーナッツ、ケシの実、カボチャの種子、ナタネ、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、サンダルウッド、サスクアナ、セイボリー、サジー、ゴマ、シアバター、シリコーン、ダイズ、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチバー、クルミ、および小麦胚芽油が挙げられる。例示的な油としては、限定はされないが、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
経口および非経口投与のための液体剤形としては、限定はされないが、薬学的に許容できる乳剤、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野において一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物を含み得る。不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、香味料、および／または芳香剤などの補助剤を含み得る。非経口投与のための特定の実施形態において、組成物は、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはそれらの組合せなどの可溶化剤と混合される。
注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁液が、好適な分散剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を用いて、公知の技術にしたがって製剤化され得る。滅菌注射用製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤および／または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁液、および／または乳剤であり得る。用いられ得る許容可能なビヒクルおよび溶媒の中でも、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。滅菌固定油は、通常、溶媒または懸濁媒体として用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性固定油が用いられ得る。オレイン酸などの脂肪酸が、注射薬の調製に使用され得る。
注射用製剤は、例えば、細菌捕捉フィルタを介したろ過によって、および／または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散され得る滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。
活性成分の効果を長く持続させるために、多くの場合、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅らせるのが望ましい。これは、難水溶性の結晶性または非結質材料の液体懸濁液の使用によって達成することができる。その際、薬剤の吸収速度は、その溶解速度に左右されるが、この溶解速度は、今度は、結晶サイズおよび結晶形態に左右され得る。あるいは、非経口投与された薬剤形態の吸収の遅延は、薬剤を油媒体に溶解または懸濁させることによって達成される。注入可能なデポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で薬剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬剤対ポリマーの比率および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬剤放出の速度が制御され得る。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注入可能製剤は、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に薬剤を閉じ込めることによって調製される。
直腸または膣投与のための組成物は、典型的に、坐薬であり、これは、周囲温度では固体であるが、体温は液体であるため、直腸または膣腔において溶解し、活性成分を放出する、カカオ脂、ポリエチレングリコールまたは坐薬ワックスなどの好適な無刺激の賦形剤と組成物を混合することによって調製され得る。
経口投与用の固体剤形としては、カプセル、錠剤、丸剤、粉剤、および顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形では、活性成分は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容できる賦形剤、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムおよび／または充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシア）、保湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸収剤（例えば、カオリンおよびベントナイト粘土）、および潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、およびそれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を含み得る。
類似のタイプの固体組成物が、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、軟質および硬質の充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティングおよび医薬製剤分野で公知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製され得る。それらは、任意に、乳白剤を含んでもよく、活性成分のみを、または、任意に遅延して、腸管の特定の部分において優先的に放出する組成物のものであり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。類似のタイプの固体組成物が、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、軟質および硬質の充填ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。
組成物の局所および／または経皮投与のための剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉剤、溶液、スプレー、吸入剤および／またはパッチ剤が挙げられる。一般に、活性成分は、必要に応じて、滅菌条件下で、薬学的に許容できる賦形剤および／または任意の必要な防腐剤および／または緩衝剤と混合される。さらに、本開示は、経皮パッチ剤の使用も想定し、経皮パッチ剤は、多くの場合、身体への化合物の制御送達をもたらすという追加の利点を有する。このような剤形は、例えば、化合物を適切な媒体に溶解および／または分散させることによって調製され得る。その代わりにまたはそれに加えて、速度制御膜を提供するか、および／または化合物をポリマーマトリックスおよび／またはゲルに分散させるかのいずれかによって、速度が制御され得る。
本明細書に記載される皮内医薬組成物を送達するのに使用するための好適なデバイスとしては、米国特許第４，８８６，４９９号明細書；同第５，１９０，５２１号明細書；同第５，３２８，４８３号明細書；同第５，５２７，２８８号明細書；同第４，２７０，５３７号明細書；同第５，０１５，２３５号明細書；同第５，１４１，４９６号明細書；および同第５，４１７，６６２号明細書に記載されるものなどの短針デバイスが挙げられる。皮内組成物は、ＰＣＴ公開国際公開第９９／３４８５０号パンフレットに記載されるものなどの、皮膚への針の有効貫入長さを制限するデバイスおよびその機能的同等物によって投与され得る。液体ジェット式注射器および／または角質層を貫通し、真皮に到達する噴流を生成する針を介して液体組成物を真皮に送達するジェット式注射デバイスが好適である。ジェット式注射デバイスは、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号明細書；同第５，５９９，３０２号明細書；同第５，３３４，１４４号明細書；同第５，９９３，４１２号明細書；同第５，６４９，９１２号明細書；同第５，５６９，１８９号明細書；同第５，７０４，９１１号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；同第５，８９３，３９７号明細書；同第５，４６６，２２０号明細書；同第５，３３９，１６３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，５０３，６２７号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，５２０，６３９号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第４，９４０，４６０号明細書；およびＰＣＴ公開番号国際公開第９７／３７７０５号パンフレットおよび国際公開第９７／１３５３７号パンフレットに記載されている。圧縮ガスを用いて、粉末状のワクチンを皮膚の外層から真皮へと加速させる弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）粉末／粒子送達デバイスが好適である。その代わりにまたはそれに加えて、従来の注射器が、皮内投与の古典的なマントー（ｍａｎｔｏｕｘ）法に使用され得る。
局所投与に好適な製剤としては、限定はされないが、塗布剤、ローション、クリーム、軟膏および／またはペーストなどの水中油型および／または油中水型エマルジョン、および／または溶液および／または懸濁液などの液体および／または半液体製剤が挙げられる。局所投与可能な製剤は、例えば、約１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得るが、活性成分の濃度は、溶媒への活性成分の溶解限度と同程度に高くてもよい。局所投与用の製剤は、本明細書に記載されるさらなる成分の１つ以上をさらに含み得る。
医薬組成物は、口腔を介した経肺投与に好適な製剤として調製、包装、および／または販売され得る。このような製剤は、活性成分を含み、かつ約０．５ｎｍ〜約７ｎｍまたは約１ｎｍ〜約６ｎｍの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。このような組成物は、好都合には、推進剤の流れを誘導して、粉末を分散させ得る乾燥粉末リザーバを含むデバイスを用いた、および／または密閉容器内で低沸点推進剤に溶解および／または懸濁された活性成分を含むデバイスなどの自己推進溶媒／粉末分配容器を用いた投与のための乾燥粉末の形態である。このような粉末は、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ｎｍを超える直径を有し、粒子の少なくとも９５数量％が７ｎｍ未満の直径を有する粒子を含む。あるいは、粒子の少なくとも９５重量％が１ｎｍを超える直径を有し、粒子の少なくとも９０数量％が６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖などの固体微粉希釈剤を含んでもよく、好都合には、単位剤形で提供される。
低沸点推進剤は、一般に、大気圧で１８．３℃（６５°Ｆ）未満の沸点を有する液体推進剤を含む。一般に、推進剤は、組成物の５０％〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成してもよく、活性成分は、組成物の０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）を構成してもよい。推進剤は、液体の非イオン性および／または固体のアニオン性界面活性剤および／または固体の希釈剤（活性成分を含む粒子と同程度の粒径を有し得る）などのさらなる成分をさらに含み得る。
肺送達のために製剤化される医薬組成物は、溶液および／または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供し得る。このような製剤は、活性成分を含む、任意に滅菌した水性および／または希アルコール性溶液および／または懸濁液として調製、包装、および／または販売され得、好都合には、任意の噴霧および／または霧化デバイスを用いて投与され得る。このような製剤は、限定はされないが、サッカリンナトリウムなどの香味料、揮発性油、緩衝剤、表面活性剤、および／またはメチルヒドロキシ安息香酸塩などの防腐剤を含む１つ以上のさらなる成分をさらに含み得る。この投与経路によって提供される液滴は、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
肺送達に有用であることが本明細書に記載される製剤は、医薬組成物の鼻内送達に有用である。鼻内投与に好適な別の製剤は、活性成分を含み、かつ約０．２μｍ〜５００μｍの平均粒子を有する粗粉末である。このような製剤は、鼻から吸い込む方法で、すなわち、鼻の近くに保持した粉末の容器から鼻腔を介した高速吸入によって投与される。
経鼻投与に好適な製剤は、例えば、わずか約０．１％（ｗ／ｗ）程度から１００％（ｗ／ｗ）もの活性成分を含んでもよく、本明細書に記載されるさらなる成分の１つ以上を含み得る。医薬組成物は、口腔投与に好適な製剤として調製、包装、および／または販売され得る。このような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製される錠剤および／またはトローチ剤の形態であってもよく、例えば、０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）活性成分を含んでもよく、残りが、経口溶解性および／または分解性組成物ならびに、任意に、本明細書に記載されるさらなる成分の１つ以上を含む。あるいは、口腔投与に好適な製剤は、活性成分を含む、粉末および／またはエアロゾル化および／または霧化溶液および／または懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散されると、約０．１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均粒径および／または液滴径を有してもよく、本明細書に記載される任意のさらなる成分１つ以上をさらに含み得る。
医薬組成物は、眼投与に好適な製剤として調製、包装、および／または販売され得る。このような製剤は、例えば、水性または油性液体賦形剤中の活性成分の０．１／１．０％（ｗ／ｗ）の溶液および／または懸濁液を含む点眼薬の形態であり得る。このような点眼薬は、緩衝剤、塩、および／または本明細書に記載される任意のさらなる他の成分の１つ以上をさらに含み得る。有用である他の眼投与可能な製剤としては、微結晶形態および／またはリポソーム製剤として活性成分を含むものが挙げられる。点耳薬および／または点眼薬は、本開示の範囲内であると考えられる。
薬剤の製剤化および／または製造における一般的考慮事項は、例えば、「レミントンの薬学の科学および実施（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）（リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州バルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）、２００６年に見出すことができる。
投与
本開示は、それを必要とする対象に本開示に係るポリヌクレオチドを投与することを含む方法を提供する。ポリヌクレオチド、またはその医薬、イメージング、診断、もしくは予防用組成物は、疾患、障害、および／または病態（例えば、作業記憶障害に関する疾患、障害、および／または病態）を予防、治療、診断、またはイメージングするのに有効な任意の量および任意の投与経路を用いて、対象に投与され得る。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全般的な状態、疾患の重症度、具体的な組成物、その投与方法、およびその活性様式に応じて、対象毎に変化する。本開示に係る組成物は、典型的に、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与単位形態で製剤化される。しかしながら、本開示の組成物の１日総使用量が、担当医によって適切な医学的判断の範囲内で決定されることが理解されよう。任意の特定の患者についての具体的な治療有効、予防有効、または適切なイメージング用量レベルは、治療される障害および障害の重症度；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食習慣；投与時間、投与経路、および用いられる具体的な化合物の排せつ速度；治療の継続期間；用いられる具体的な化合物と組み合わせて、またはそれと同時に使用される薬剤；および医療分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に左右される。
送達されるポリヌクレオチドおよび／またはその医薬、予防、診断、もしくはイメージング組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト、家畜、ネコ、イヌ、マウス、ラットなど）などの動物に投与され得る。ある実施形態において、その医薬、予防、診断、もしくはイメージング組成物は、ヒトに投与される。
本開示に係る、送達されるポリヌクレオチドおよび／またはその医薬、予防、診断、もしくはイメージング組成物は、任意の経路で投与され得る。ある実施形態において、ポリヌクレオチドおよび／またはその医薬、予防、診断、もしくはイメージング組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、心室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所（例えば、粉剤、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、および／または液滴による）、粘膜、経鼻、口腔、経腸、硝子体、腫瘍内、舌下を含む、様々な経路の１つ以上によって；気管内注入、気管支注入、および／または吸入によって；経口スプレー、経鼻スプレー、および／またはエアロゾルとして、および／または門脈カテーテルを介して投与される。ある実施形態において、ポリヌクレオチド、および／またはその医薬、予防、診断、もしくはイメージング組成物は、全身静脈注射によって投与される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドおよび／またはその医薬、予防、診断、もしくはイメージング組成物は、静脈内および／または経口投与され得る。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド、および／またはその医薬、予防、診断、もしくはイメージング組成物は、ポリヌクレオチドが、血液脳関門、血管関門、または他の上皮関門を通過することを可能にする方法で投与され得る。
しかしながら、本開示は、薬剤送達の科学の起こり得る進歩を考慮に入れて、任意の適切な経路による、ポリヌクレオチド、および／またはその医薬、予防、診断、もしくはイメージング組成物の送達を包含する。
一般に、最も適切な投与経路は、送達される少なくとも１つの薬剤と結合されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの性質（例えば、胃腸管、血流などの環境内でのその安定性）、患者の状態（例えば、患者が特定の投与経路に耐えられるかどうか）などを含む様々な要因に左右される。本開示は、薬剤送達の科学の起こり得る進歩を考慮に入れて、任意の適切な経路による、医薬、予防、診断、またはイメージング組成物の送達を包含する。
特定の実施形態において、本開示に係る組成物は、所望の治療、診断、予防、またはイメージング効果を得るために、１日１回以上、１日当たり対象体重の約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な投与量レベルで投与され得る。所望の投与量が、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日毎、毎週、隔週、３週間毎、または４週間毎に送達され得る。特定の実施形態において、所望の投与量が、複数回の投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、またはそれ以上の投与）を用いて送達され得る。
ポリヌクレオチドは、１つ以上の他の治療、予防、診断、またはイメージング薬剤と組み合わせて使用され得る。「と組み合わせて」とは、複数の薬剤が同時に投与されるか、および／または一緒に送達するために製剤化されなければならないことを意味することを意図しないが、これらの送達方法は、本開示の範囲内である。組成物は、１つ以上の他の所望の治療薬または医療手順と同時に、またはその前に、またはその後に投与され得る。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量および／または時間スケジュールで投与される。ある実施形態において、本開示は、それらの生物学的利用能を向上させ、それらの代謝を抑制および／または調節し、それらの排泄を阻害し、および／または体内でのそれらの分布を調節する薬剤と組み合わされた、医薬、予防、診断、またはイメージング組成物の送達を包含する。
組み合わせて用いられる治療、予防、診断、またはイメージング活性剤は、単一の組成物として一緒に投与されるか、または異なる組成物として別個に投与され得ることがさらに理解されよう。一般に、組み合わせて使用される薬剤は、それらが個々に用いられるレベルを超えないレベルで用いられることが予測される。ある実施形態において、組み合わせて用いられるレベルは、個々に用いられるレベルより少ない。
併用レジメンに用いるための治療法（治療薬または手順）の特定の組合せは、所望の治療薬および／または手順の適合性ならびに達成しようとする所望の治療効果を考慮に入れる。用いられる治療法は、同じ障害について所望の効果を達成することができ（例えば、本開示にしたがって癌を治療するのに有用な組成物は、化学療法剤と同時に投与され得る）、またはそれらは、異なる効果（例えば、何らかの有害な作用の制御）を達成することができることも理解されよう。
キット
本開示は、本開示の方法を好都合におよび／または有効に行うための様々なキットを提供する。典型的に、キットは、ユーザが、対象の複数の治療を行うか、および／または複数の実験を行うことを可能にするのに十分な量および／または数の成分を含む。
一態様において、本開示は、タンパク質産生のためのキットを提供し、これは、翻訳可能領域とヌクレオチド改変とを含む第１の単離ポリヌクレオチド（ここで、ポリヌクレオチドは、第１の単離ポリヌクレオチドが導入された細胞の自然免疫応答の誘導を回避または防止することができる）、ならびに包装および指示書を含む。
一態様において、本開示は、タンパク質産生のためのキットを提供し、これは、標的細胞に導入されると、翻訳可能領域によってコードされる所望の量のタンパク質を産生するのに有効な量で提供される、翻訳可能領域を含む第１の単離改変ポリヌクレオチド；細胞の自然免疫応答を実質的に阻害するのに有効な量で提供される、阻害ポリヌクレオチドを含む第２のポリヌクレオチド；ならびに包装および指示書を含む。
一態様において、本開示は、タンパク質産生のためのキットを提供し、これは、翻訳可能領域およびヌクレオシド改変とを含む第１の単離ポリヌクレオチド（ここで、ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を示す）、ならびに包装および指示書を含む。
一態様において、本開示は、タンパク質産生のためのキットを提供し、これは、翻訳可能領域と少なくとも２つの異なるヌクレオシド改変とを含む第１の単離ポリヌクレオチド（ここで、ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を示す）、ならびに包装および指示書を含む。
一態様において、本開示は、タンパク質産生のためのキットを提供し、これは、翻訳可能領域と少なくとも１つのヌクレオシド改変とを含む第１の単離ポリヌクレオチド（ここで、ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を示す）；阻害ポリヌクレオチドを含む第２のポリヌクレオチド；ならびに包装および指示書を含む。
別の態様において、本開示は、タンパク質産生のための組成物を提供し、これは、翻訳可能領域とヌクレオシド改変とを含む第１の単離ポリヌクレオチド（ここで、ポリヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解の低減を示す）、および第１のポリヌクレオチドの翻訳可能領域の翻訳に好適な哺乳動物細胞を含む。
定義
化学用語：以下に、「アシル」から「チオール」までの様々な化学用語の定義を提供する。
本明細書において使用される際の「アシル」という用語は、本明細書に定義されるカルボニル基を介して親分子基に結合された、本明細書に定義される水素またはアルキル基（例えば、ハロアルキル基）を表し、ホルミル（すなわち、カルボキシアルデヒド基）、アセチル、トリフルオロアセチル、プロピオニル、およびブタノイルによって例示される。例示的な非置換アシル基は、１〜７、１〜１１、または１〜２１個の炭素を含む。ある実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換される。
本明細書において使用される際の「アシルアミノ」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基を介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるアシル基（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、ここで、Ｒは、Ｈまたは任意に置換されるＣ１〜６、Ｃ１〜１０、またはＣ１〜２０アルキル基（例えば、ハロアルキル）であり、ＲＮ１は本明細書に定義されるとおりである）を表す。例示的な非置換アシルアミノ基は、１〜４１個の炭素（例えば、１〜７、１〜１３、１〜２１、２〜７、２〜１３、２〜２１、または２〜４１個の炭素）を含む。ある実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され、および／またはアミノ基は、−ＮＨ２または−ＮＨＲＮ１であり、ここで、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２ ２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、アリール、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、または本明細書に記載されるその他）、またはアルコキシカルボニルアルキルであり、各ＲＮ２は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり得る。
本明細書において使用される際の「アシルアミノアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアルキル基を介して親分子基に結合されたアミノ基に結合された、本明細書に定義されるアシル基（すなわち、−アルキル−Ｎ（ＲＮ１）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、ここで、Ｒは、Ｈまたは任意に置換されるＣ１〜６、Ｃ１〜１０、またはＣ１〜２０アルキル基（例えば、ハロアルキル）であり、ＲＮ１は本明細書に定義されるとおりである）を表す。例示的な非置換アシルアミノ基は、１〜４１個の炭素（例えば、１〜７、１〜１３、１〜２１、２〜７、２〜１３、２〜２１、または２〜４１個の炭素）を含む。ある実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され、および／またはアミノ基は、−ＮＨ２または−ＮＨＲＮ１であり、ここで、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２ ２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、アリール、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、または本明細書に記載されるその他）、またはアルコキシカルボニルアルキルであり、各ＲＮ２は、Ｈ、アルキル、またはアリールであり得る。
本明細書において使用される際の「アシルオキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるアシル基（すなわち、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、ここで、Ｒは、Ｈまたは任意に置換されるＣ１〜６、Ｃ１〜１０、またはＣ１〜２０アルキル基である）を表す。例示的な非置換アシルオキシ基は、１〜２１個の炭素（例えば、１〜７または１〜１１個の炭素）を含む。ある実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換される。
本明細書において使用される際の「アシルオキシアルキル」という用語は、アルキル基を介して親分子基に結合された酸素原子に結合された、本明細書に定義されるアシル基（すなわち、−アルキル−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ、ここで、Ｒは、Ｈまたは任意に置換されるＣ１〜６、Ｃ１〜１０、またはＣ１〜２０アルキル基である）を表す。例示的な非置換アシルオキシアルキル基は、１〜２１個の炭素（例えば、１〜７または１〜１１個の炭素）を含む。ある実施形態において、アルキル基は、独立して、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換される。
本明細書において使用される際の「アルカリール」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるアリール基を表す。例示的な非置換アルカリール基は、７〜３０個の炭素（例えば、７〜１６または７〜２０個の炭素、例えば、Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、Ｃ６〜１０アリールＣ１〜１０アルキル、またはＣ６〜１０アリールＣ１〜２０アルキル）である。ある実施形態において、アルキレンおよびアリールはそれぞれ、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
「アルクシクロアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるシクロアルキル基（例えば、１〜４、１〜６、１〜１０、または１〜２０個の炭素のアルキレン基）を表す。ある実施形態において、アルキレンおよびシクロアルキルはそれぞれ、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アルケニル」という用語は、特に指定されない限り、１つ以上の炭素−炭素二重結合を含む、２〜２０個の炭素（例えば、２〜６または２〜１０個の炭素）の一価直鎖状または分枝鎖状基を表し、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、および２−ブテニルによって例示される。アルケニルは、シスおよびトランス異性体の両方を含む。アルケニル基は、本明細書に定義されるアミノ、アリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、または本明細書に記載される例示的なアルキル置換基のいずれかから独立して選択される１、２、３、または４つの置換基で任意に置換され得る。
「アルケニレン」という用語は、２個の水素原子の除去によって得られる二価アルケニル基を表し、エテニレン、およびイソプロペニレンによって例示される。「Ｃｘ〜ｙアルケニレン」という用語は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するアルケニレン基を表す。ｘの例示的な値は、２、３、４、５、および６であり、ｙの例示的な値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０である（例えば、Ｃ２〜６、Ｃ２〜１０、またはＣ２〜２０アルケニレン）。ある実施形態において、アルケニレンは、アルケニル基について本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。本明細書において使用される際の「分枝鎖状アルケニレン」という用語は、３個以上の水素原子の除去によって得られる多価アルケニル基を指す。
「アルケニルオキシ」という用語は、特に指定されない限り、式−ＯＲ（式中、Ｒは、Ｃ２〜２０アルケニル基（例えば、Ｃ２〜６またはＣ２〜１０アルケニル）である）の化学置換基を表す。例示的なアルケニルオキシ基としては、エテニルオキシ、およびプロペニルオキシが挙げられる。ある実施形態において、アルケニル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換され得る。
「アルクヘテロアリール」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるヘテロアリール基を指す。例示的な非置換アルクヘテロアリール基は、２〜３２個の炭素（例えば、２〜２２、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜１５、２〜１４、２〜１３、または２〜１２個の炭素、例えば、Ｃ１〜１２ヘテロアリールＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜１２ヘテロアリールＣ１〜１０アルキル、またはＣ１〜１２ヘテロアリールＣ１〜２０アルキル）である。ある実施形態において、アルキレンおよびヘテロアリールはそれぞれ、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。アルクヘテロアリール基は、アルクヘテロシクリル基のサブセットである。
「アルクヘテロシクリル」という用語は、本明細書に定義されるアルキレン基を介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。例示的な非置換アルクヘテロシクリル基は、２〜３２個の炭素（例えば、２〜２２、２〜１８、２〜１７、２〜１６、３〜１５、２〜１４、２〜１３、または２〜１２個の炭素、例えば、Ｃ１〜１２ヘテロシクリルＣ１〜６アルキル、Ｃ１〜１２ヘテロシクリルＣ１〜１０アルキル、またはＣ１〜１２ヘテロシクリルＣ１〜２０アルキル）である。ある実施形態において、アルキレンおよびヘテロシクリルはそれぞれ、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
「アルコキシ」という用語は、特に指定されない限り、式−ＯＲ（式中、Ｒは、Ｃ１〜２０アルキル基（例えば、Ｃ１〜６またはＣ１〜１０アルキル）である）の化学置換基を表す。例示的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ（例えば、ｎ−プロポキシおよびイソプロポキシ）、およびｔ−ブトキシが挙げられる。ある実施形態において、アルキル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ヒドロキシまたはアルコキシ）でさらに置換され得る。
「アルコキシアルコキシ」という用語は、アルコキシ基で置換されたアルコキシ基を表す。例示的な非置換アルコキシアルコキシ基は、２〜４０個の炭素（例えば、２〜１２または２〜２０個の炭素、例えば、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜１０アルコキシ−Ｃ１〜１０アルコキシ、またはＣ１〜２０アルコキシ−Ｃ１〜２０アルコキシ）を含む。ある実施形態において、各アルコキシ基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
「アルコキシアルキル」という用語は、アルコキシ基で置換されたアルキル基を表す。例示的な非置換アルコキシアルキル基は、２〜４０個の炭素（例えば、２〜１２または２〜２０個の炭素、例えば、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜１０アルコキシ−Ｃ１〜１０アルキル、またはＣ１〜２０アルコキシ−Ｃ１〜２０アルキル）を含む。ある実施形態において、アルキルおよびアルコキシはそれぞれ、それぞれの基について本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アルコキシカルボニル」という用語は、カルボニル原子を介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるアルコキシ（例えば、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、Ｈまたは任意に置換されるＣ１〜６、Ｃ１〜１０、またはＣ１〜２０アルキル基である）を表す。例示的な非置換アルコキシカルボニルは、１〜２１個の炭素（例えば、１〜１１または１〜７個の炭素）を含む。ある実施形態において、アルコキシ基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換される。
本明細書において使用される際の「アルコキシカルボニルアシル」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書に定義されるアシル基（例えば、−Ｃ（Ｏ）−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意に置換されるＣ１〜６、Ｃ１〜１０、またはＣ１〜２０アルキル基である）を表す。例示的な非置換アルコキシカルボニルアシルは、３〜４１個の炭素（例えば、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、または３〜３１個の炭素、例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ１〜６アシル、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜１０アシル、またはＣ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜２０アシル）を含む。ある実施形態において、各アルコキシおよびアルキル基はさらに、独立して、各基について本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）で置換される。
本明細書において使用される際の「アルコキシカルボニルアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基（例えば、−Ｏ−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意に置換されるＣ１〜６、Ｃ１〜１０、またはＣ１〜２０アルキル基である）を表す。例示的な非置換アルコキシカルボニルアルコキシは、３〜４１個の炭素（例えば、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、または３〜３１個の炭素、例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜１０アルコキシ、またはＣ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜２０アルコキシ）を含む。ある実施形態において、各アルコキシ基はさらに、独立して、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）で置換される。
本明細書において使用される際の「アルコキシカルボニルアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書に定義されるアルキル基（例えば、−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意に置換されるＣ１〜２０、Ｃ１〜１０、またはＣ１〜６アルキル基である）を表す。例示的な非置換アルコキシカルボニルアルキルは、３〜４１個の炭素（例えば、３〜１０、３〜１３、３〜１７、３〜２１、または３〜３１個の炭素、例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜１０アルキル、またはＣ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ１〜２０アルキル）を含む。ある実施形態において、各アルキルおよびアルコキシ基はさらに、独立して、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）で置換される。
本明細書において使用される際の「アルコキシカルボニルアルケニル」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書に定義されるアルケニル基（例えば、−アルケニル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意に置換されるＣ１〜２０、Ｃ１〜１０、またはＣ１〜６アルキル基である）を表す。例示的な非置換アルコキシカルボニルアルケニルは、４〜４１個の炭素（例えば、４〜１０、４〜１３、４〜１７、４〜２１、または４〜３１個の炭素、例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ２〜１０アルケニル、またはＣ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ２〜２０アルケニル）を含む。ある実施形態において、各アルキル、アルケニル、およびアルコキシ基はさらに、独立して、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）で置換される。
本明細書において使用される際の「アルコキシカルボニルアルキニル」という用語は、本明細書に定義されるアルコキシカルボニル基で置換された、本明細書に定義されるアルキニル基（例えば、−アルキニル−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ、ここで、Ｒは、任意に置換されるＣ１〜２０、Ｃ１〜１０、またはＣ１〜６アルキル基である）を表す。例示的な非置換アルコキシカルボニルアルキニルは、４〜４１個の炭素（例えば、４〜１０、４〜１３、４〜１７、４〜２１、または４〜３１個の炭素、例えば、Ｃ１〜６アルコキシカルボニル−Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜１０アルコキシカルボニル−Ｃ２〜１０アルキニル、またはＣ１〜２０アルコキシカルボニル−Ｃ２〜２０アルキニル）を含む。ある実施形態において、各アルキル、アルキニル、およびアルコキシ基はさらに、独立して、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）で置換される。
本明細書において使用される際の「アルキル」という用語は、特に指定されない限り、１〜２０個の炭素（例えば、１〜１０または１〜６個）の直鎖状および分枝鎖状飽和基の両方を包含する。アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−およびイソ−プロピル、ｎ−、ｓｅｃ−、イソ−およびｔｅｒｔ−ブチル、およびネオペンチルによって例示され、以下のものからなる群から独立して選択される１、２、３つ、または２個以上の炭素のアルキル基の場合には、４つの置換基で任意に置換され得る：（１）Ｃ１〜６アルコキシ；（２）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（３）本明細書に定義されるアミノ（例えば、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２、ここで、ＲＮ１は、アミノについて定義されるとおりである）；（４）Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２〜９ヘテロシクリル）オキシ；（８）Ｏ−保護基で任意に置換されたヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）；（１１）Ｃ１〜７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）Ｏ−保護基で任意に置換された−ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、（ｆ）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜２０アルキルである）のポリエチレングリコール、および（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意に置換されるＣ１〜６アルキルである）のアミノ−ポリエチレングリコールからなる群から選択される；（１５）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ＲＢ’およびＲＣ’のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（１６）−ＳＯ２ＲＤ’、ここで、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、および（ｄ）ヒドロキシからなる群から選択される；（１７）−ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ＲＥ’およびＲＦ’のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリールおよび（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＲＧ’、ここで、ＲＧ’は、（ａ）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、（ｆ）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜２０アルキルである）のポリエチレングリコール、および（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意に置換されるＣ１〜６アルキルである）のアミノ−ポリエチレングリコールからなる群から選択される；（１９）−ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’、ここで、ＲＨ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ’は、（ａ２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、（ｆ２）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜２０アルキルである）のポリエチレングリコール、および（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意に置換されるＣ１〜６アルキルである）のアミノ−ポリエチレングリコールからなる群から選択される；（２０）−ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ’、ここで、ＲＪ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ’は、（ａ２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、（ｆ２）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜２０アルキルである）のポリエチレングリコール、および（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意に置換されるＣ１〜６アルキルである）のアミノ−ポリエチレングリコールからなる群から選択される；および（２１）アミジン。ある実施形態において、これらの基のそれぞれは、本明細書に記載されるように、さらに置換され得る。例えば、Ｃ１−アルカリールのアルキレン基は、それぞれのアリーロイル置換基を付与するオキソ基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アルキレン」という用語は、２個の水素原子の除去によって直鎖状または分枝鎖状飽和炭化水素から得られる飽和二価炭化水素基を表し、メチレン、エチレン、およびイソプロピレンによって例示される。「Ｃｘ〜ｙアルキレン」という用語は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するアルキレン基を表す。ｘの例示的な値は、１、２、３、４、５、および６であり、ｙの例示的な値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０である（例えば、Ｃ１〜６、Ｃ１〜１０、Ｃ２〜２０、Ｃ２〜６、Ｃ２〜１０、またはＣ２〜２０アルキレン）。ある実施形態において、アルキレンは、アルキル基について本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アルキニレン」という用語は、２個の水素原子の除去によって得られる二価アルキニル基を表す。「Ｃｘ〜ｙアルキニレン」という用語は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するアルキニレン基を表す。ｘの例示的な値は、２、３、４、５、および６であり、ｙの例示的な値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０である（例えば、Ｃ２〜６、Ｃ２〜１０、またはＣ２〜２０アルキニレン）。ある実施形態において、アルキニレンは、アルキニル基について本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。本明細書において使用される際の「分枝鎖状アルキニレン」という用語は、３個以上の水素原子の除去によって得られる多価アルキニル基を指す。
本明細書において使用される際の「アルキルスルフィニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）−基を介して親分子基に結合されたアルキル基を表す。例示的な非置換アルキルスルフィニル基は、１〜６、１〜１０、または１〜２０個の炭素である。ある実施形態において、アルキル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アルキルスルフィニルアルキル」という用語は、アルキルスルフィニル基で置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。例示的な非置換アルキルスルフィニルアルキル基は、２〜１２、２〜２０、または２〜４０個の炭素である。ある実施形態において、各アルキル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アルキニル」という用語は、炭素−炭素三重結合を含む、２〜２０個の炭素原子（例えば、２〜４、２〜６、または２〜１０個の炭素）の一価直鎖状または分枝鎖状基を表し、エチニルおよび１−プロピニルによって例示される。アルキニル基は、本明細書に定義されるアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、または本明細書に記載される例示的なアルキル置換基のいずれかから独立して選択される１、２、３、または４つの置換基で任意に置換され得る。
「アルキニルオキシ」という用語は、特に指定されない限り、式−ＯＲ（式中、Ｒは、Ｃ２〜２０アルキニル基（例えば、Ｃ２〜６またはＣ２〜１０アルキニル）である）の化学置換基を表す。例示的なアルキニルオキシ基としては、エチニルオキシおよびプロピニルオキシが挙げられる。ある実施形態において、アルキニル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ヒドロキシ基）でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アミジン」という用語は、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２基を表す。
本明細書において使用される際の「アミノ」という用語は、−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、ここで、各ＲＮ１は、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＯ２、Ｎ（ＲＮ２）２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、Ｎ−保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アルカリール、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、カルボキシアルキル（例えば、Ｏ−保護基で任意に置換されるもの、例えば、任意に置換されるアリールアルコキシカルボニル基または本明細書に記載されるいずれか）、スルホアルキル、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、または本明細書に記載されるその他）、アルコキシカルボニルアルキル（例えば、Ｏ−保護基で任意に置換されるもの、例えば、任意に置換されるアリールアルコキシカルボニル基または本明細書に記載されるいずれか）、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、またはアルクヘテロシクリル（例えば、アルクヘテロアリール）であり、これらの記載されるＲＮ１基のそれぞれは、各基について本明細書に定義されるように、任意に置換され得；または２つのＲＮ１は、結合して、ヘテロシクリルまたはＮ−保護基を形成し、各ＲＮ２は、独立して、Ｈ、アルキル、またはアリールである。本発明のアミノ基は、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２）であり得る。好ましい実施形態において、アミノは、−ＮＨ２または−ＮＨＲＮ１であり、ここで、ＲＮ１は、独立して、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＲＮ２ ２、ＳＯ２ＯＲＮ２、ＳＯ２ＲＮ２、ＳＯＲＮ２、アルキル、カルボキシアルキル、スルホアルキル、アシル（例えば、アセチル、トリフルオロアセチル、または本明細書に記載されるその他）、アルコキシカルボニルアルキル（例えば、ｔ−ブトキシカルボニルアルキル）またはアリールであり、各ＲＮ２は、Ｈ、Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、またはＣ６〜１０アリールであり得る。
本明細書に記載される「アミノ酸」という用語は、側鎖、アミノ基、および酸基（例えば、−ＣＯ２Ｈのカルボキシ基または−ＳＯ３Ｈのスルホ基）を有する分子を指し、ここで、アミノ酸は、側鎖、アミノ基、または酸基（例えば、側鎖）によって親分子基に結合される。ある実施形態において、アミノ酸は、カルボニル基によって親分子基に結合され、ここで、側鎖またはアミノ基は、カルボニル基に結合される。例示的な側鎖としては、任意に置換されるアルキル、アリール、ヘテロシクリル、アルカリール、アルクヘテロシクリル、アミノアルキル、カルバモイルアルキル、およびカルボキシアルキルが挙げられる。例示的なアミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシノルバリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、プロリン、ピロリシン、セレノシステイン、セリン、タウリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。アミノ酸基は、以下のものからなる群から独立して選択される１、２、３つ、または２個以上の炭素のアミノ酸基の場合には、４つの置換基で任意に置換され得る：（１）Ｃ１〜６アルコキシ；（２）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（３）本明細書に定義されるアミノ（例えば、非置換アミノ（すなわち、−ＮＨ２）または置換アミノ（すなわち、−Ｎ（ＲＮ１）２、ここで、ＲＮ１は、アミノについて定義されるとおりである）；（４）Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；（５）アジド；（６）ハロ；（７）（Ｃ２〜９ヘテロシクリル）オキシ；（８）ヒドロキシ；（９）ニトロ；（１０）オキソ（例えば、カルボキシアルデヒドまたはアシル）；（１１）Ｃ１〜７スピロシクリル；（１２）チオアルコキシ；（１３）チオール；（１４）−ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、（ｆ）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜２０アルキルである）のポリエチレングリコール、および（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意に置換されるＣ１〜６アルキルである）のアミノ−ポリエチレングリコールからなる群から選択される；（１５）−Ｃ（Ｏ）ＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ＲＢ’およびＲＣ’のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（１６）−ＳＯ２ＲＤ’、ここで、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、および（ｄ）ヒドロキシからなる群から選択される；（１７）−ＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ＲＥ’およびＲＦ’のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリールおよび（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（１８）−Ｃ（Ｏ）ＲＧ’、ここで、ＲＧ’は、（ａ）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ）水素、（ｅ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、（ｆ）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜２０アルキルである）のポリエチレングリコール、および（ｈ）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意に置換されるＣ１〜６アルキルである）のアミノ−ポリエチレングリコールからなる群から選択される；（１９）−ＮＲＨ’Ｃ（Ｏ）ＲＩ’、ここで、ＲＨ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ＲＩ’は、（ａ２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、（ｆ２）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜２０アルキルである）のポリエチレングリコール、および（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意に置換されるＣ１〜６アルキルである）のアミノ−ポリエチレングリコールからなる群から選択される；（２０）−ＮＲＪ’Ｃ（Ｏ）ＯＲＫ’、ここで、ＲＪ’は、（ａ１）水素および（ｂ１）Ｃ１〜６アルキルからなる群から選択され、ＲＫ’は、（ａ２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル）、（ｂ２）Ｃ２〜２０アルケニル（例えば、Ｃ２〜６アルケニル）、（ｃ２）Ｃ６〜１０アリール、（ｄ２）水素、（ｅ２）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、（ｆ２）アミノ−Ｃ１〜２０アルキル、（ｇ２）−（ＣＨ２）ｓ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＯＲ’（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、Ｒ’は、ＨまたはＣ１〜２０アルキルである）のポリエチレングリコール、および（ｈ２）−ＮＲＮ１（ＣＨ２）ｓ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓ１（ＣＨ２）ｓ３ＮＲＮ１（ここで、ｓ１は、１〜１０（例えば、１〜６または１〜４）の整数であり、ｓ２およびｓ３のそれぞれは、独立して、０〜１０（例えば、０〜４、０〜６、１〜４、１〜６、または１〜１０）の整数であり、各ＲＮ１は、独立して、水素または任意に置換されるＣ１〜６アルキルである）のアミノ−ポリエチレングリコールからなる群から選択される；および（２１）アミジン。ある実施形態において、これらの基のそれぞれは、本明細書に記載されるように、さらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アミノアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基で置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。アルキルおよびアミノはそれぞれ、それぞれの基について本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、例えば、カルボキシからなる群から選択される）でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アミノアルキル」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基で置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキルおよびアミノはそれぞれ、それぞれの基について本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、例えば、カルボキシ、および／またはＮ−保護基からなる群から選択される）でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アミノアルケニル」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基で置換された、本明細書に定義されるアルケニル基を表す。アルケニルおよびアミノはそれぞれ、それぞれの基について本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、例えば、カルボキシ、および／またはＮ−保護基からなる群から選択される）でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アミノアルキニル」という用語は、本明細書に定義されるアミノ基で置換された、本明細書に定義されるアルキニル基を表す。アルキニルおよびアミノはそれぞれ、それぞれの基について本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、例えば、カルボキシ、および／またはＮ−保護基からなる群から選択される）でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アリール」という用語は、１つ以上の芳香環を有する単環式、二環式、または多環式炭素環系を表し、フェニル、ナフチル、１，２−ジヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、フルオレニル、インダニル、およびインデニルによって例示され、以下のものからなる群から独立して選択される１、２、３、４、または５つの置換基で任意に選択され得る：（１）Ｃ１〜７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル−Ｃ１〜６アルキル、アミノ−Ｃ１〜６アルキル、アジド−Ｃ１〜６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１〜６アルキル、ハロ−Ｃ１〜６アルキル（例えば、パーフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１〜６アルキル、ニトロ−Ｃ１〜６アルキル、またはＣ１〜６チオアルコキシ−Ｃ１〜６アルキル）；（３）Ｃ１〜２０アルコキシ（例えば、Ｃ１〜６アルコキシ、例えば、パーフルオロアルコキシ）；（４）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６〜１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル；（８）アジド；（９）Ｃ３〜８シクロアルキル；（１０）Ｃ３〜８シクロアルキルＣ１〜６アルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１〜１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１〜１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１〜２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１〜６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’およびＲＣ’は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、および（ｃ）Ｃ６〜１０アリールアルキルからなる群から選択される；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’およびＲＦ’のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（２１）チオール；（２２）Ｃ６〜１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３〜８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；（２５）Ｃ１〜１２ヘテロシクリルＣ１〜６アルキル（例えば、Ｃ１〜１２ヘテロアリールＣ１〜６アルキル）；（２６）Ｃ２〜２０アルケニル；および（２７）Ｃ２〜２０アルキニル。ある実施形態において、これらの基のそれぞれは、本明細書に記載されるように、さらに置換され得る。例えば、Ｃ１−アルカリールまたはＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、それぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基を付与するオキソ基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「アリールアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるアルカリール基を表す。例示的な非置換アリールアルコキシ基は、７〜３０個の炭素（例えば、７〜１６または７〜２０個の炭素、例えば、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜１０アルコキシ、またはＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜２０アルコキシ）を含む。ある実施形態において、アリールアルコキシ基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基で置換され得る。
本明細書において使用される際の「アリールアルコキシカルボニル」という用語は、カルボニルを介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるアリールアルコキシ基（例えば、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル−アリール）を表す。例示的な非置換アリールアルコキシ基は、８〜３１個の炭素（例えば、８〜１７または８〜２１個の炭素、例えば、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ−カルボニル、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜１０アルコキシ−カルボニル、またはＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜２０アルコキシ−カルボニル）を含む。ある実施形態において、アリールアルコキシカルボニル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基で置換され得る。
本明細書において使用される際の「アリーレン」という用語は、２個の水素原子の除去によって得られる二価アリール基を表す。「Ｃｘ〜ｙアリーレン」という用語は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するアリーレン基を表す。ｘの例示的な値は、６および１０であり、ｙの例示的な値は、１０、１２、１４、１６、１８、または２０である（例えば、Ｃ６〜１０またはＣ６〜２０アリーレン）。ある実施形態において、アリーレンは、アリール基について本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。本明細書において使用される際の「分枝鎖状アリーレン」という用語は、３個以上の水素原子の除去によって得られる多価アリール基を指す。
「アリールオキシ」という用語は、特に指定されない限り、式−ＯＲ’（式中、Ｒ’は、６〜１８個の炭素のアリール基である）の化学置換基を表す。ある実施形態において、アリール基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基で置換され得る。
本明細書において使用される際の「アリーロイル」という用語は、カルボニル基を介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるアリール基を表す。例示的な非置換アリーロイル基は、７〜１１個の炭素のものである。ある実施形態において、アリール基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基で置換され得る。
「アジド」という用語は、−Ｎ３基を表し、これは−Ｎ＝Ｎ＝Ｎとしても表され得る。
本明細書において使用される際の「二環式」という用語は、芳香族または非芳香族であり得る、２つの環を有する構造を指す。二環式構造は、本明細書に定義されるスピロシクリル基、および１つ以上の架橋を共有する２つの環を含み、このような架橋は、１個の原子、または２、３、もしくはそれ以上の原子を含む鎖を含み得る。例示的な二環式基としては、二環式カルボシクリル基（ここで、第１および第２の環は、本明細書に定義されるカルボシクリル基である）；二環式アリール基（ここで、第１および第２の環は、本明細書に定義されるアリール基である）；二環式ヘテロシクリル基（ここで、第１の環は、ヘテロシクリル基であり、第２の環は、カルボシクリル（例えば、アリール）またはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）基である）；および二環式ヘテロアリール基（ここで、第１の環は、ヘテロアリール基であり、第２の環は、カルボシクリル（例えば、アリール）またはヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）基である）が挙げられる。ある実施形態において、二環式基は、シクロアルキル、ヘテロシクリル、およびアリール基について本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基で置換され得る。
本明細書において使用される際の「ボラニル」という用語は、−Ｂ（ＲＢ１）３を表し、ここで、各ＲＢ１は、独立して、Ｈおよび任意に置換されるアルキルからなる群から選択される。ある実施形態において、ボラニル基は、アルキルについて本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基で置換され得る。
本明細書において使用される際の「炭素環式」および「カルボシクリル」という用語は、任意に置換されるＣ３〜１２単環式、二環式、または三環式構造を指し、この構造において、芳香族または非芳香族であり得る環が、炭素原子によって形成される。炭素環式構造としては、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびアリール基が挙げられる。
本明細書において使用される際の「カルバモイル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＲＮ１）２を表し、ここで、各ＲＮ１の意味は、本明細書において提供される「アミノ」の定義に見出される。
本明細書において使用される際の「カルバモイルアルキル」という用語は、本明細書に定義されるカルバモイル基で置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「カルバミル」という用語は、構造−ＮＲＮ１Ｃ（＝Ｏ）ＯＲまたは−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＮ１）２を有するカルバメート基を指し、ここで、各ＲＮ１の意味は、本明細書において提供される「アミノ」の定義に見出され、Ｒは、本明細書に定義されるように、アルキル、シクロアルキル、アルクシクロアルキル、アリール、アルカリール、ヘテロシクリル（例えば、ヘテロアリール）、またはアルクヘテロシクリル（例えば、アルクヘテロアリール）である。
本明細書において使用される際の「カルボニル」という用語は、Ｃ（Ｏ）基を表し、これは、Ｃ＝Ｏとしても表され得る。
「カルボキシアルデヒド」という用語は、構造−ＣＨＯを有するアシル基を表す。
本明細書において使用される際の「カルボキシ」という用語は、−ＣＯ２Ｈを意味する。
本明細書において使用される際の「カルボキシアルコキシ」という用語は、本明細書に定義されるカルボキシ基で置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。アルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得、カルボキシ基は、１つ以上のＯ−保護基で任意に置換され得る。
本明細書において使用される際の「カルボキシアルキル」という用語は、本明細書に定義されるカルボキシ基で置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。アルキル基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得、カルボキシ基は、１つ以上のＯ−保護基で任意に置換され得る。
本明細書において使用される際の「カルボキシアミノアルキル」という用語は、本明細書に定義されるカルボキシで置換された、本明細書に定義されるアミノアルキル基を表す。カルボキシ、アルキル、およびアミノはそれぞれ、それぞれの基について本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基（例えば、ＣＯ２ＲＡ’、ここで、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル、例えば、カルボキシ、および／またはＮ−保護基、および／またはＯ−保護基からなる群から選択される）でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「シアノ」という用語は、−ＣＮ基を表す。
「シクロアルコキシ」という用語は、特に指定されない限り、式−ＯＲ（式中、Ｒは、本明細書に定義されるＣ３〜８シクロアルキル基である）の化学置換基を表す。シクロアルキル基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。例示的な非置換シクロアルコキシ基は、３〜８個の炭素である。ある実施形態において、シクロアルキル基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「シクロアルキル」という用語は、特に指定されない限り、３〜８個の炭素の一価飽和または不飽和非芳香族環状炭化水素基を表し、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびビシクロヘプチルによって例示される。シクロアルキル基が、１つの炭素−炭素二重結合を含む場合、シクロアルキル基は、「シクロアルケニル」基と呼ぶことができる。例示的なシクロアルケニル基としては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルが挙げられる。本発明のシクロアルキル基は、以下のもので任意に置換され得る：（１）Ｃ１〜７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル−Ｃ１〜６アルキル、アミノ−Ｃ１〜６アルキル、アジド−Ｃ１〜６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１〜６アルキル、ハロ−Ｃ１〜６アルキル（例えば、パーフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１〜６アルキル、ニトロ−Ｃ１〜６アルキル、またはＣ１〜６チオアルコキシ−Ｃ１〜６アルキル）；（３）Ｃ１〜２０アルコキシ（例えば、Ｃ１〜６アルコキシ、例えば、パーフルオロアルコキシ）；（４）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６〜１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル；（８）アジド；（９）Ｃ３〜８シクロアルキル；（１０）Ｃ３〜８シクロアルキルＣ１〜６アルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ１〜１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１〜１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１〜２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１〜６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’およびＲＣ’は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６〜１０アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ６〜１０アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、および（ｃ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’およびＲＦ’のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ６〜１０アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（２１）チオール；（２２）Ｃ６〜１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３〜８シクロアルコキシ；（２４）Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルコキシ；（２５）Ｃ１〜１２ヘテロシクリルＣ１〜６アルキル（例えば、Ｃ１〜１２ヘテロアリールＣ１〜６アルキル）；（２６）オキソ；（２７）Ｃ２〜２０アルケニル；および（２８）Ｃ２〜２０アルキニル。ある実施形態において、これらの基のそれぞれは、本明細書に記載されるように、さらに置換され得る。例えば、Ｃ１−アルカリールまたはＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、それぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基を付与するオキソ基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「ジアステレオマー」という用語は、互いの鏡像ではなく、互いに重なり合わない立体異性体を意味する。
本明細書において使用される際の薬剤の「有効量」という用語は、有益または所望の結果、例えば、臨床結果をもたらすのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用される状況に左右される。例えば、癌を治療する薬剤を投与する状況では、薬剤の有効量は、例えば、薬剤の投与なしで得られる応答と比較して、本明細書に定義されるような癌の治療を達成するのに十分な量である。
本明細書において使用される際の「鏡像異性体」という用語は、本発明の化合物のそれぞれ個別の光学活性形態を意味し、少なくとも８０％（すなわち、一方の鏡像異性体が少なくとも９０％、および他方の鏡像異性体が多くとも１０％）、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９８％の光学純度または鏡像体過剰率（当該技術分野において標準的な方法によって決定される）を有する。
本明細書において使用される際の「ハロ」という用語は、臭素、塩素、ヨウ素、またはフッ素から選択されるハロゲンを表す。
本明細書において使用される際の「ハロアルコキシ」という用語は、ハロゲン基（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）で置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。ハロアルコキシは、１、２、３個、または２個以上の炭素のアルキル基の場合には、４個のハロゲンで置換され得る。ハロアルコキシ基としては、パーフルオロアルコキシ（例えば、−ＯＣＦ３）、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＣｌ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、および−ＯＣＨＩＣＨ３が挙げられる。ある実施形態において、ハロアルコキシ基は、アルキル基について本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「ハロアルキル」という用語は、ハロゲン基（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）で置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。ハロアルキルは、１、２、３個、または２個以上の炭素のアルキル基の場合には、４個のハロゲンで置換され得る。ハロアルキル基としては、パーフルオロアルキル（例えば、−ＣＦ３）、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＣｌ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｂｒ）ＣＨ３、および−ＣＨＩＣＨ３が挙げられる。ある実施形態において、ハロアルキル基は、アルキル基について本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「ヘテロアルキレン」という用語は、構成炭素原子の１つまたは２つがそれぞれ、窒素、酸素、または硫黄で置換された、本明細書に定義されるアルキレン基を指す。ある実施形態において、ヘテロアルキレン基は、アルキレン基について本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「ヘテロアリール」という用語は、本明細書に定義されるヘテロシクリルのサブセットを表し、これらは、芳香族である：すなわち、それらは、単環式または多環式環系内に４ｎ＋２π個の電子を含有する。例示的な非置換ヘテロアリール基は、１〜１２個（例えば、１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、または２〜９個）の炭素のものである。ある実施形態において、ヘテロアリールは、ヘテロシクリル基について定義される１、２、３、または４つの置換基で置換される。
本明細書において使用される際の「ヘテロシクリル」という用語は、特に指定されない限り、窒素、酸素、および硫黄からなる群から独立して選択される１、２、３、または４個のヘテロ原子を含有する５員、６員、または７員環を表す。５員環は、０〜２つの二重結合を有し、６員および７員環は、０〜３つの二重結合を有する。例示的な非置換ヘテロシクリル基は、１〜１２個（例えば、１〜１１、１〜１０、１〜９、２〜１２、２〜１１、２〜１０、または２〜９個）の炭素のものである。「ヘテロシクリル」という用語は、１つ以上の炭素および／またはヘテロ原子が、単環式環、例えば、キヌクリジニル基の２つの非隣接メンバーを架橋する架橋多環式構造を有する複素環化合物も表す。「ヘテロシクリル」という用語は、上記の複素環のいずれかが、１、２、または３つの炭素環、例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環、または別の単環式複素環、例えば、インドリル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、ベンゾフリル、およびベンゾチエニルに縮合された、二環式、三環式、および四環式基を含む。縮合ヘテロシクリルの例としては、トロパンおよび１，２，３，５，８，８ａ−ヘキサヒドロインドリジンが挙げられる。複素環式基としては、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピリジル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、イソチアゾリジニル、インドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、ジヒドロキノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアジアゾリル、フリル、チエニル、チアゾリジニル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル（例えば、１，２，３−オキサジアゾリル）、プリニル、チアジアゾリル（例えば、１，２，３−チアジアゾリル）、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、ジヒドロキノリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ジヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、およびベンゾチエニルなどが挙げられ、１つ以上の二重結合が水素で還元または置換された、それらのジヒドロおよびテトラヒドロ形態を含む。さらに他の例示的なヘテロシクリルとしては、２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−オキサゾリル；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−イミダゾリル；２，３，４，５−テトラヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル（例えば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２−フェニル−５−オキソ−１Ｈ−ピラゾリル）；２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−１Ｈ−イミダゾリル（例えば、２，３，４，５−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−５−メチル−５−フェニル−１Ｈ−イミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−１，３，４−オキサジアゾリル（例えば、２，３−ジヒドロ−２−チオキソ−５−フェニル−１，３，４−オキサジアゾリル）；４，５−ジヒドロ−５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル（例えば、４，５−ジヒドロ−３−メチル−４−アミノ５−オキソ−１Ｈ−トリアゾリル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリジニル（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３，３−ジエチルピリジニル）；２，６−ジオキソ−ピペリジニル（例えば、２，６−ジオキソ−３−エチル−３−フェニルピペリジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソピリジミニル；１，６−ジヒドロ−４−オキソピリミジニル（例えば、２−（メチルチオ）−１，６−ジヒドロ−４−オキソ−５−メチルピリミジン−１−イル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソピリミジニル（例えば、１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３−エチルピリミジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−ピリダジニル（例えば、１，６−ジヒドロ−６−オキソ−３−エチルピリダジニル）；１，６−ジヒドロ−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル（例えば、１，６−ジヒドロ−５−イソプロピル−６−オキソ−１，２，４−トリアジニル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリル（例えば、３，３−ジメチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−インドリルおよび２，３−ジヒドロ−２−オキソ−３，３’−スピロプロパン−１Ｈ−インドール−１−イル）；１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ−イソ−インドリル；１，３−ジヒドロ−１，３−ジオキソ−２Ｈ−イソ−インドリル；１Ｈ−ベンゾピラゾリル（例えば、１−（エトキシカルボニル）−１Ｈ−ベンゾピラゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル（例えば、３−エチル−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−ベンズイミダゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾオキサゾリル（例えば、５−クロロ−２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾオキサゾリル）；２，３−ジヒドロ−２−オキソ−ベンゾオキサゾリル；２−オキソ−２Ｈ−ベンゾピラニル；１，４−ベンゾジオキサニル；１，３−ベンゾジオキサニル；２，３−ジヒドロ−３−オキソ，４Ｈ−１，３−ベンゾチアジニル；３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル（例えば、２−メチル−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−キナゾリニル）；１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル（例えば、１−エチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−２，４−ジオキソ−３Ｈ−キナゾリル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル（例えば、１，２，３，６−テトラヒドロ−１，３−ジメチル−２，６−ジオキソ−７Ｈ−プリニル）；１，２，３，６−テトラヒドロ−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル（例えば、１，２，３，６−テトラヒドロ−３，７−ジメチル−２，６−ジオキソ−１Ｈ−プリニル）；２−オキソベンズ［ｃ，ｄ］インドリル；１，１−ジオキソ−２Ｈ−ナフト［１，８−ｃ，ｄ］イソチアゾリル；および１，８−ナフチレンジカルボキサミドが挙げられる。さらなる複素環式基としては、３，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロ−ピロロ［３，４−ｂ］ピロール−（２Ｈ）−イル、および２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル、ホモピペラジニル（またはジアゼパニル）、テトラヒドロピラニル、ジチアゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、オキセパニル、チエパニル、アゾカニル、オキセカニル、およびチオカニルが挙げられる。複素環式基は、式
の基も含み、式中、
Ｅ’は、−Ｎ−および−ＣＨ−からなる群から選択され；Ｆ’は、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−Ｏ−、および−Ｓ−からなる群から選択され；Ｇ’は、−ＣＨ−および−Ｎ−からなる群から選択される。本明細書に記載されるヘテロシクリル基のいずれも、以下のものからなる群から独立して選択される１、２、３、４もしくは５つの置換基で任意に置換され得る：（１）Ｃ１〜７アシル（例えば、カルボキシアルデヒド）；（２）Ｃ１〜２０アルキル（例えば、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルコキシ−Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル−Ｃ１〜６アルキル、アミノ−Ｃ１〜６アルキル、アジド−Ｃ１〜６アルキル、（カルボキシアルデヒド）−Ｃ１〜６アルキル、ハロ−Ｃ１〜６アルキル（例えば、パーフルオロアルキル）、ヒドロキシ−Ｃ１〜６アルキル、ニトロ−Ｃ１〜６アルキル、またはＣ１〜６チオアルコキシ−Ｃ１〜６アルキル）；（３）Ｃ１〜２０アルコキシ（例えば、Ｃ１〜６アルコキシ、例えば、パーフルオロアルコキシ）；（４）Ｃ１〜６アルキルスルフィニル；（５）Ｃ６〜１０アリール；（６）アミノ；（７）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキル；（８）アジド；（９）Ｃ３〜８シクロアルキル；（１０）Ｃ３〜８シクロアルキルＣ１〜６アルキル；（１１）ハロ；（１２）Ｃ１〜１２ヘテロシクリル（例えば、Ｃ２〜１２ヘテロアリール）；（１３）（Ｃ１〜１２ヘテロシクリル）オキシ；（１４）ヒドロキシ；（１５）ニトロ；（１６）Ｃ１〜２０チオアルコキシ（例えば、Ｃ１〜６チオアルコキシ）；（１７）−（ＣＨ２）ｑＣＯ２ＲＡ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＡ’は、（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、（ｃ）水素、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（１８）−（ＣＨ２）ｑＣＯＮＲＢ’ＲＣ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＢ’およびＲＣ’は、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（１９）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＲＤ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＤ’は、（ａ）Ｃ１〜６アルキル、（ｂ）Ｃ６〜１０アリール、および（ｃ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（２０）−（ＣＨ２）ｑＳＯ２ＮＲＥ’ＲＦ’、ここで、ｑは、０〜４の整数であり、ＲＥ’およびＲＦ’のそれぞれは、独立して、（ａ）水素、（ｂ）Ｃ１〜６アルキル、（ｃ）Ｃ６〜１０アリール、および（ｄ）Ｃ６〜１０アリールＣ１〜６アルキルからなる群から選択される；（２１）チオール；（２２）Ｃ６〜１０アリールオキシ；（２３）Ｃ３〜８シクロアルコキシ；（２４）アリールアルコキシ；（２５）Ｃ１〜１２ヘテロシクリルＣ１〜６アルキル（例えば、Ｃ１〜１２ヘテロアリールＣ１〜６アルキル）；（２６）オキソ；（２７）（Ｃ１〜１２ヘテロシクリル）イミノ；（２８）Ｃ２〜２０アルケニル；および（２９）Ｃ２〜２０アルキニル。ある実施形態において、これらの基のそれぞれは、本明細書に記載されるように、さらに置換され得る。例えば、Ｃ１−アルカリールまたはＣ１−アルクヘテロシクリルのアルキレン基は、それぞれのアリーロイルおよび（ヘテロシクリル）オイル置換基を付与するオキソ基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「ヘテロシクリレン」という用語は、２個の水素原子の除去によって得られる二価ヘテロシクリル基を表す。「Ｃｘ〜ｙヘテロシクリレン」という用語は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するヘテロシクリレン基を表す。ｘの例示的な値は、１、２、３、４、５、および６であり、ｙの例示的な値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、または２０である（例えば、Ｃ１〜６、Ｃ１〜１０、Ｃ２〜２０、Ｃ２〜６、Ｃ２〜１０、またはＣ２〜２０アルキレン）。ある実施形態において、ヘテロシクリレンは、アルキル基について本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。本明細書において使用される際の「分枝鎖状「ヘテロシクリレン」という用語は、３個以上の水素原子の除去によって得られる多価ヘテロシクリレン基を指す。
本明細書において使用される際の「（ヘテロシクリル）イミノ」という用語は、イミノ基を介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。ある実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基で置換され得る。
本明細書において使用される際の「（ヘテロシクリル）オキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。ある実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基で置換され得る。
本明細書において使用される際の「（ヘテロシクリル）オイル」という用語は、カルボニル基を介して親分子基に結合された、本明細書に定義されるヘテロシクリル基を表す。ある実施形態において、ヘテロシクリル基は、本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基で置換され得る。
本明細書において使用される際の「炭化水素」という用語は、炭素および水素原子のみからなる基を表す。
本明細書において使用される際の「ヒドロキシ」という用語は、−ＯＨ基を表す。ある実施形態において、ヒドロキシ基は、アルキルについて本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基（例えば、Ｏ−保護基）で置換され得る。
本明細書において使用される際の「ヒドロキシアルケニル」という用語は、１つ以下のヒドロキシ基がアルキル基の単一の炭素原子に結合され得るという条件で、１〜３つのヒドロキシ基で置換された、本明細書に定義されるアルケニル基を表し、ジヒドロキシプロペニルおよびヒドロキシイソペンテニルによって例示される。ある実施形態において、ヒドロキシアルケニル基は、アルキルについて本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基（例えば、Ｏ−保護基）で置換され得る。
本明細書において使用される際の「ヒドロキシアルキル」という用語は、１つ以下のヒドロキシ基がアルキル基の単一の炭素原子に結合され得るという条件で、１〜３つのヒドロキシ基で置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表し、ヒドロキシメチルおよびジヒドロキシプロピルによって例示される。ある実施形態において、ヒドロキシアルキル基は、アルキルについて本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基（例えば、Ｏ−保護基）で置換され得る。
本明細書において使用される際の「ヒドロキシアルキニル」という用語は、１つ以下のヒドロキシ基がアルキル基の単一の炭素原子に結合され得るという条件で、１〜３つのヒドロキシ基で置換された、本明細書に定義されるアルキニル基を表す。ある実施形態において、ヒドロキシアルキニル基は、アルキルについて本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基（例えば、Ｏ−保護基）で置換され得る。
本明細書において使用される際の「異性体」という用語は、本発明の任意の化合物の任意の互変異性体、立体異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本発明の化合物は、１つ以上のキラル中心および／または二重結合を有してもよく、したがって、立体異性体、例えば、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、鏡像異性体（すなわち、（＋）もしくは（−））またはシス／トランス異性体）として存在することが認識される。本発明によれば、本明細書に示される化学構造、したがって本発明の化合物は、対応する立体異性体の全て、すなわち、立体異性体的に純粋な形態（例えば、幾何的に純粋、鏡像異性的に純粋、またはジアステレオマーとして純粋な）ならびに鏡像異性体および立体異性体混合物、例えば、ラセミ混合物の両方を包含する。本発明の化合物の鏡像異性体および立体異性体混合物は、典型的に、周知の方法、例えば、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高性能液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中での化合物の結晶化によって、それらの成分鏡像異性体または立体異性体に分割することができる。鏡像異性体および立体異性体は、周知の不斉合成方法によって、立体異性体的または鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、および触媒から得ることもできる。
本明細書において使用される際の「Ｎ−保護アミノ」という用語は、本明細書に定義される１つまたは２つのＮ−保護基に結合された、本明細書に定義されるアミノ基を指す。
本明細書において使用される際の「Ｎ−保護基」という用語は、合成手順中の望ましくない反応からアミノ基を保護することを意図された基を表す。一般に使用されるＮ−保護基は、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）著、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第３版（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９９年）に開示されており、これは、参照により本明細書に援用される。Ｎ−保護基としては、アシル、アリーロイル、またはカルバミル基、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイル、ならびに保護もしくは非保護Ｄ，ＬまたはＤ，Ｌ−アミノ酸などのキラル補助基、例えば、アラニン、ロイシン、およびフェニルアラニン；スルホニル含有基、例えば、ベンゼンスルホニルおよびｐ−トルエンスルホニル；カルバメート形成基、例えば、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニリル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドロキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２，−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、およびシクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニル、アルカリール基、例えば、ベンジル、トリフェニルメチル、およびベンジルオキシメチルおよびシリル基、例えば、トリメチルシリル挙げられる。好ましいＮ−保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。
本明細書において使用される際の「ニトロ」という用語は、−ＮＯ２基を表す。
本明細書において使用される際の「Ｏ−保護基」という用語は、合成手順中の望ましくない反応から酸素含有（例えば、フェノール、ヒドロキシ、またはカルボニル）基を保護することを意図された基を表す。一般に使用されるＯ−保護基は、グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）著、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、第３版（ジョン・ワイリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９９年）に開示されており、これは、参照により本明細書に援用される。例示的なＯ−保護基としては、アシル、アリーロイル、またはカルバミル基、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル、４，４’−ジメトキシトリチル、イソブチリル、フェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジノ、および４−ニトロベンゾイル；アルキルカルボニル基、例えば、アシル、アセチル、プロピオニル、およびピバロイル；任意に置換されるアリールカルボニル基、例えば、ベンゾイル；シリル基、例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ：ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ：ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ：ｔｒｉ−ｉｓｏ−ｐｒｏｐｙｌｓｉｌｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）、およびトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ：ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌｙｌ）；ヒドロキシとのエーテル形成基、例えば、メチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、およびトリチル；アルコキシカルボニル、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｎ−イソプロポキシカルボニル、ｎ−ブチルオキシカルボニル、イソブチルオキシカルボニル、ｓｅｃ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、２−エチルヘキシルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、およびメチルオキシカルボニル；アルコキシアルコキシカルボニル基、例えば、メトキシメトキシカルボニル、エトキシメトキシカルボニル、２−メトキシエトキシカルボニル、２−エトキシエトキシカルボニル、２−ブトキシエトキシカルボニル、２−メトキシエトキシメトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、プロパルギルオキシカルボニル、２−ブテンオキシカルボニル、および３−メチル−２−ブテンオキシカルボニル；ハロアルコキシカルボニル、例えば、２−クロロエトキシカルボニル、２−クロロエトキシカルボニル、および２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル；任意に置換されるアリールアルコキシカルボニル基、例えば、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−メチルベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジニトロベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメチルベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシ−カルボニル、およびフルオレニルメチルオキシカルボニル；および任意に置換されるアリールオキシカルボニル基、例えば、フェノキシカルボニル、ｐ−ニトロフェノキシカルボニル、ｏ−ニトロフェノキシカルボニル、２，４−ジニトロフェノキシカルボニル、ｐ−メチル−フェノキシカルボニル、ｍ−メチルフェノキシカルボニル、ｏ−ブロモフェノキシカルボニル、３，５−ジメチルフェノキシカルボニル、ｐ−クロロフェノキシカルボニル、および２−クロロ−４−ニトロフェノキシ−カルボニル）；置換アルキル、アリール、およびアルカリールエーテル（例えば、トリチル；メチルチオメチル；メトキシメチル；ベンジルオキシメチル；シロキシメチル；２，２，２，−トリクロロエトキシメチル；テトラヒドロピラニル；テトラヒドロフラニル；エトキシエチル；１−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］エチル；２−トリメチルシリルエチル；ｔ−ブチルエーテル；ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ニトロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、およびニトロベンジル）；シリルエーテル（例えば、トリメチルシリル；トリエチルシリル；トリイソプロピルシリル；ジメチルイソプロピルシリル；ｔ−ブチルジメチルシリル；ｔ−ブチルジフェニルシリル；トリベンジルシリル；トリフェニルシリル；およびジフェニルメチルシリル）；炭酸塩（例えば、メチル、メトキシメチル、９−フルオレニルメチル；エチル；２，２，２−トリクロロエチル；２−（トリメチルシリル）エチル；ビニル、アリル、ニトロフェニル；ベンジル；メトキシベンジル；３，４−ジメトキシベンジル；およびニトロベンジル）；カルボニル−保護基（例えば、アセタールおよびケタール基、例えば、ジメチルアセタールおよび１，３−ジオキソラン；アシラール基；およびジチアン基、例えば、１，３−ジチアンおよび１，３−ジチオラン）；カルボン酸−保護基（例えば、エステル基、例えば、メチルエステル、ベンジルエステル、ｔ−ブチルエステル、およびオルトエステル；およびオキサゾリン基が挙げられる。
本明細書において使用される際の「オキソ」という用語は、＝Ｏを表す。
本明細書において使用される際の「パーフルオロアルキル」という用語は、アルキル基に結合された各水素ラジカルが、フッ化物ラジカルで置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。パーフルオロアルキル基は、トリフルオロメチルおよびペンタフルオロエチルによって例示される。
本明細書において使用される際の「パーフルオロアルコキシ」という用語は、アルコキシ基に結合された各水素ラジカルが、フッ化物ラジカルで置換された、本明細書に定義されるアルコキシ基を表す。パーフルオロアルコキシ基は、トリフルオロメトキシおよびペンタフルオロエトキシによって例示される。
本明細書において使用される際の「ホスホリル」という用語は、二価基：
を指し、式中、ＲＰ１は、任意の好適な置換基、例えば、Ｈ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ハロ、チオール、ボラニル、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるアルケニル、任意に置換されるアルキニル、任意に置換されるヘテロアルキル、任意に置換されるヘテロアルケニル、任意に置換されるヘテロアルキニル、または任意に置換されるアミノ、またはその塩であり；ＲＰ２は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されるアルキレン、または任意に置換されるヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１は、Ｈ、任意に置換されるアルキル、任意に置換されるアルケニル、任意に置換されるアルキニレン、または任意に置換されるアリーレンである。
本明細書において使用される際の「ポリエチレングリコレン」という用語は、２個の水素原子の除去によって得られる二価ポリエチレングリコール基を表す。「Ｃ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン」という用語は、ｘ〜ｙ個の炭素を有するポリエチレングリコレン基を表す。ｘの例示的な値は、２、４、６、８、１０、および２０であり、ｙの例示的な値は、１０、２０、４０、６０、または８０である（例えば、Ｃ２〜１０またはＣ６〜２０ポリエチレングリコレン）。ある実施形態において、ポリエチレングリコレンのモノマー単位は、ヘテロアルキレン基について本明細書に定義される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。本明細書において使用される際の「分枝鎖状ポリエチレングリコレン」という用語は、３個以上の水素原子の除去によって得られる多価ポリエチレングリコール基を指す。
本明細書において使用される際の「スピロシクリル」という用語は、その両端が、親基の同じ炭素原子に結合されて、スピロ環式基を形成するＣ２〜７アルキレンジラジカル、およびさらにその両端が同じ原子に結合されたＣ１〜６ヘテロアルキレンジラジカルを表す。スピロシクリル基を形成するヘテロアルキレンラジカルは、窒素、酸素、および硫黄からなる群から独立して選択される１、２、３、または４個のヘテロ原子を含有することができる。ある実施形態において、スピロシクリル基は、ジラジカルが結合された炭素原子を除いて、１〜７個の炭素を含む。本発明のスピロシクリル基は、シクロアルキルおよび／またはヘテロシクリル基について任意選択の置換基として本明細書において提供される１、２、３、または４つの置換基で任意に置換され得る。
本明細書において使用される際の「立体異性体」という用語は、化合物（例えば、本明細書に記載されるいずれかの式の化合物）が有し得る考えられるあらゆる異なる異性体ならびに配座異性体形態、特に、基本的分子構造の考えられるあらゆる立体化学および配座異性体、あらゆるジアステレオマー、鏡像異性体および／または配座異性体を指す。本発明のいくつかの化合物は、異なる互変異性体で存在し得るが、その全てが、本発明の範囲に含まれる。
本明細書において使用される際の「スルホアルキル」という用語は、−ＳＯ３Ｈのスルホ基で置換された、本明細書に定義されるアルキル基を表す。ある実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得、スルホ基は、１つ以上のＯ−保護基（例えば、本明細書に記載されるもの）でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「スルホニル」という用語は、−Ｓ（Ｏ）２−基を表す。
本明細書において使用される際の「チオアルカリール」という用語は、式−ＳＲ（式中、Ｒは、アルカリール基である）の化学置換基を表す。ある実施形態において、アルカリール基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「チオアルクヘテロシクリル」という用語は、式−ＳＲ（式中、Ｒは、アルクヘテロシクリル基である）の化学置換基を表す。ある実施形態において、アルクヘテロシクリル基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書において使用される際の「チオアルコキシ」という用語は、式−ＳＲ（式中、Ｒは、本明細書に定義されるアルキル基である）の化学置換基を表す。ある実施形態において、アルキル基は、本明細書に記載される１、２、３、または４つの置換基でさらに置換され得る。
本明細書における様々な箇所で、本開示の化合物の置換基は、群または範囲で開示される。本開示が、このような群および範囲のメンバーのあらゆる個別の部分組合せを含むことが具体的に意図される。例えば、「Ｃ１〜６アルキル」という用語は、メチル、エチル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、およびＣ６アルキルを個別に開示することが具体的に意図される。
約：本明細書において使用される際、「約」という用語は、ポリヌクレオチドにおける改変核酸塩基またはヌクレオシドの量に関して使用されるとき、記載される値の＋／−１０％を意味する。例えば、約２５％の改変ウラシルを含むポリヌクレオチドは、２２．５〜２７．５％の改変ウラシルを含む。
組み合わせて投与される：本明細書において使用される際、「組み合わせて投与される」または「併用投与」という用語は、２種以上の薬剤が対象に同時に投与されるか、または患者に対する各薬剤の作用の重複が存在しうるような間隔で投与されることを意味する。ある実施形態において、薬剤は、互いに約６０、３０、１５、１０、５、または１分以内に投与される。ある実施形態において、薬剤の投与は、組合せ（例えば、相乗）効果が達成されるように、互いに十分に近い間隔で行われる。
改変：本明細書において使用される際、「改変」は、本発明の分子の変化された状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的方法を含む多くの方法で改変され得る。一実施形態において、本発明のｍＲＮＡ分子は、例えば、天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣに関する場合、非天然ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの導入によって改変される。キャップ構造などの非標準ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造と異なるが、「改変」されたとは見なされない。
動物：本明細書において使用される際、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。ある実施形態において、「動物」は、あらゆる発達段階のヒトを指す。ある実施形態において、「動物」は、あらゆる発達段階の非ヒト動物を指す。特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、またはブタ）である。ある実施形態において、動物としては、限定はされないが、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、および蠕虫が挙げられる。ある実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組み換え動物、またはクローンである。
目的の抗原または所望の抗原：本明細書において使用される際、「目的の抗原」または「所望の抗原」という用語は、本明細書に記載される抗体および断片、突然変異体、変異体、およびそれらの改変物によって免疫特異的に結合される、本明細書において提供されるタンパク質および他の生体分子を含む。目的の抗原の例としては、限定はされないが、インスリン、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮ β、ＩＦＮ γ、ＩＦＮωまたはＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えば、ＴＮＦ αおよびＴＮＦ β、ＴＮＦ γ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１およびＶＥＧＦが挙げられる。
およそ：本明細書において使用される際、「およそ」または「約」という用語は、ポリヌクレオチドにおける改変核酸塩基またはヌクレオシドの量以外の１つ以上の対象の値に適用されるとき、記載される参照値と類似の値を指す。特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、特に記載しない限りまたは文脈から別の解釈が明らかでない限り（ただし、このような数値が考えられる値の１００％を超える場合を除く）、記載される参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下の値の両方向（超または未満）の範囲を指す。
と会合（結合）した：本明細書において使用される際、「と会合（結合）した」、「共役した」、「連結した」、「結合した（ａｔｔａｃｈｅｄ）」、および「結合した（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）」という用語は、２つ以上の部分に関して使用されるとき、これらの部分が、直接、または連結物質として働く１つ以上のさらなる部分を介して、互いに物理的に結合または連結されて、当該構造が使用される条件（例えば、生理学的条件）下で、その部分が物理的に結合した状態を保つのに十分に安定した構造を形成することを意味する。「会合（結合）」は、厳密に、直接の共有化学結合によるものである必要はない。それはまた、「会合（結合）した」実体が物理的に結合した状態を保つのに十分に安定したイオンもしくは水素結合またはハイブリダイゼーションベースの結合も示唆し得る。
生体適合性：本明細書において使用される際、「生体適合性」という用語は、免疫系による傷害、毒性または拒絶反応のリスクをほとんどないし全くもたらさずに生体細胞、組織、器官または系と適合性であることを意味する。
生分解性：本明細書において使用される際、「生分解性」という用語は、生物の作用により無害の産物に分解することが可能であることを意味する。
生物活性：本明細書において使用される際、「生物活性」という語句は、生体系および／または生物において活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に投与されると、生物に生物学的作用を及ぼす物質は、生物活性であると考えられる。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの一部でも、生物活性であるか、または生物学的に関連していると見なされる活性を模倣する場合、生物活性であると考えられ得る。
化合物：本明細書において使用される際、「化合物」という用語は、示される構造のあらゆる立体異性体、幾何異性体、互変異性体、および同位体を含むことを意味する。
本明細書中に記載される化合物は、非対称（例えば、１つ以上の立体中心を有する）であり得る。特に記載されていない限り、鏡像異性体およびジアステレオマーなどのあらゆる立体異性体が意図される。非対称に置換された炭素原子を含有する本開示の化合物は、光学活性またはラセミ形態で単離され得る。光学活性出発材料から光学活性形態を調製する方法は、ラセミ混合物の分割または立体選択的合成によるものなど、当該技術分野において公知である。オレフィンおよびＣ＝Ｎ二重結合の多くの幾何異性体も、本明細書に記載される化合物に存在することがあり、全てのこのような安定した異性体が、本開示において考えられる。本開示の化合物のシスおよびトランス幾何異性体が、記載され、異性体の混合物または分離された異性体として単離され得る。
本開示の化合物は、互変異性体も含む。互変異性体は、プロトンの同時転位を伴う、単結合と隣接する二重結合との交換（ｓｗａｐｐｉｎｇ）から生じる。互変異性体は、同じ実験式および総電荷を有する異性体プロトン化状態であるプロトン互変異性体を含む。プロトン互変異性体の例としては、ケトン−エノール対、アミド−イミド酸対、ラクタム−ラクチム対、アミド−イミド酸対、エナミン−イミン対、ならびにプロトンが複素環系の２つ以上の位置を占有し得る環状形態、例えば、１Ｈ−および３Ｈ−イミダゾール、１Ｈ−、２Ｈ−および４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、１Ｈ−および２Ｈ−イソインドール、および１Ｈ−および２Ｈ−ピラゾールが挙げられる。互変異性体は、平衡状態にあるか、または適切な置換によって１つの形態へと立体的に固定され得る。
本開示の化合物は、中間体または最終化合物において生じる原子の同位体の全ても含む。「同位体」は、同じ原子番号を有するが、核内の異なる中性子数のために、異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体としては、トリチウムおよび重水素が挙げられる。
本開示の化合物および塩は、常法によって、溶媒和物および水和物を形成するために、溶媒または水分子と組み合わせて調製され得る。
保存された：本明細書において使用される際、「保存された」という用語は、比較される２つ以上の配列の同じ位置において改変されない状態で存在するものである、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列それぞれのヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。相対的に保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸は、配列の他の箇所に出現するヌクレオチドまたはアミノ酸に比して、より関連した配列間で保存されているものである。
ある実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに１００％同一である場合、「完全に保存されている」とされる。ある実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「高度に保存されている」とされる。ある実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％、約９８％、または約９９％同一である場合、「高度に保存されている」とされる。ある実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに少なくとも３０％同一、少なくとも４０％同一、少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、または少なくとも９５％同一である場合、「保存されている」とされる。ある実施形態において、２つ以上の配列は、それらが互いに約３０％同一、約４０％同一、約５０％同一、約６０％同一、約７０％同一、約８０％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、または約９９％同一である場合、「保存されている」とされる。配列の保存は、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドの全長に適用してもよく、またはその一部、領域もしくは特徴に適用してもよい。
環状または環状化：本明細書において使用される際、「環状」という用語は、連続的ループの存在を指す。環状分子は、環状である必要はなく、連結して、サブユニットの非破断鎖を形成するだけでよい。本発明のｍＲＮＡなどの環状分子は、単一の単位または多量体であってもよく、または複合体もしくはより高次構造の１つ以上の成分を含み得る。
静細胞性：本明細書において使用される際、「静細胞性」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組合せの成長、分裂、または増殖を阻害、低減、抑制することを指す。
細胞傷害性：本明細書において使用される際、「細胞傷害性」は、細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞））、細菌、ウイルス、真菌、原生動物、寄生生物、プリオン、またはそれらの組合せを殺滅するか、またはこれらに対して傷害、有毒、もしくは致死的作用を引き起こすことを指す。
送達：本明細書において使用される際、「送達」は、化合物、物質、実体、部分、カーゴまたはペイロードを送達する行為またはその方法を指す。
送達剤：本明細書において使用される際、「送達剤」は、標的細胞に対するポリヌクレオチドのインビボ送達を少なくとも部分的に促進する任意の物質を指す。
不安定化された：本明細書において使用される際、「不安定な」、「不安定化する」、または「不安定化領域」という用語は、同じ領域または分子の出発、野生型または天然形態より不安定な領域または分子を意味する。
検出可能な標識：本明細書において使用される際、「検出可能な標識」は、Ｘ線撮影法、蛍光、化学発光、酵素活性、および吸光を含む、当該技術分野において公知の方法によって容易に検出される別の実体と結合されるか、それと組み込まれるか、またはそれと結合された１つ以上のマーカ、シグナル、または部分を指す。検出可能な標識としては、放射性同位体、蛍光色素、発色団、酵素、色素、金属イオン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびハプテンなどのリガンド、および量子ドットが挙げられる。検出可能な標識は、本明細書に開示されるペプチドまたはタンパク質の任意の位置に配置され得る。それらは、アミノ酸、ペプチド、もしくはタンパク質内であってもよく、またはＮ末端もしくはＣ末端に位置してもよい。
消化：本明細書において使用される際、「消化」という用語は、より小さな細片または成分に分解することを意味する。ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、消化はペプチドの産生をもたらす。
遠位：本明細書において使用される際、「遠位」という用語は、中心から、または目的の地点もしくは領域から離れて位置することを意味する。
コードされたタンパク質切断シグナル：本明細書において使用される際、「コードされたタンパク質切断シグナル」は、タンパク質切断シグナルをコードするヌクレオチド配列を指す。
操作された：本明細書において使用される際、本発明の実施形態は、出発点、野生型または天然分子から変化した特徴または特性（構造的かもしくは化学的かにかかわらず）を有するように設計される場合、「操作されている」。
発現：本明細書において使用される際、ポリヌクレオチド配列の「発現」は、以下の事象の１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端プロセシングによる）；（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳；および（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
特徴：本明細書において使用される際、「特徴」は、特徴、特性、または独特の要素を指す。
製剤：本明細書において使用される際、「製剤」は、少なくともポリヌクレオチドおよび送達剤を含む。
断片：本明細書において使用される際の「断片」は、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された完全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドを含み得る。
機能性：本明細書において使用される際、「機能性」生体分子は、それが特徴とする特性および／または活性を示す形態での生体分子である。
相同性：本明細書において使用される際、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的関連性を指す。ある実施形態において、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるか、または類似している場合、互いに「相同的」であると考えられる。「相同的」という用語は、必然的に、少なくとも２つの配列（ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列）間の比較を指す。本発明によれば、２つのポリヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの区間について、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％である場合、相同的であると考えられる。ある実施形態において、相同的ポリヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５の一意的に指定されたアミノ酸の区間をコードする能力によって特徴付けられる。６０ヌクレオチド長未満のポリヌクレオチド配列では、相同性は、少なくとも４〜５の一意的に指定されたアミノ酸の区間をコードする能力によって決定される。本発明によれば、２つのタンパク質配列は、タンパク質が、少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも１つの区間について、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である場合、相同的であると考えられる。
同一性：本明細書において使用される際、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、オリゴヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的関連性を指す。２つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセントの計算は、例えば、最適な比較の目的のために２つの配列をアラインメントすることによって行われ得る（例えば、最適アラインメントのために、第１および第２のポリヌクレオチド配列の一方または両方にギャップを導入し、比較のために、非同一配列を無視することができる）。特定の実施形態において、比較のためにアラインメントする配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められる場合、分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アラインメントのために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れて、配列が共有する同一位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて行うことができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、「分子計算生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、レスクＡ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９８８年；「バイオコンピューティング：インフォーマティックスおよびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、スミスＤ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９３年；「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、フォン・ハインチェＧ．（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年；「配列データのコンピュータ解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ」、パートＩ、グリフィンＡ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）、およびグリフィンＨ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、１９９４年；ならびに「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ）」、グリブスコフＭ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデブローＪ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編、Ｍストックトン・プレス（Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９１年（これらのそれぞれは、参照により本明細書に援用される）に記載されるものなどの方法を用いて決定され得る。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを用いてアライン（ＡＬＩＧＮ）プログラム（バージョン２．０）に組み込まれた、メイヤー（Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９年、第４巻、ｐ．１１〜１７）を用いて決定することができる。あるいは、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて決定され得る。配列間の同一性パーセントを決定するのに一般的に用いられる方法としては、限定はされないが、カリロＨ．（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．）、およびリップマンＤ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．）著、ＳＩＡＭジャーナル・オン・アプライド・マセマティクス（ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．）、第４８巻、ｐ．１０７３、１９８８年（参照により本明細書に援用される）に開示されるものが挙げられる。同一性を決定するための技術は、一般に入手可能なコンピュータプログラムに集成されている。２つの配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアとしては、限定はされないが、ＧＣＧプログラムパッケージ、デブローＪ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１２巻、１号、ｐ．３８７、１９８４年）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡｎ、アルトシュルＳ．Ｆ．（ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら著、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．）、第２１５巻、ｐ．４０３、１９９０年）が挙げられる。
遺伝子の発現を阻害する：本明細書において使用される際、「遺伝子の発現を阻害する」という語句は、遺伝子の発現産物の量の低減を引き起こすことを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的に、ｍＲＮＡのレベルの低下は、それから翻訳されるポリペプチドのレベルの低下をもたらす。発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはタンパク質を測定するための標準的な技術を用いて決定され得る。
インビトロ：本明細書において使用される際、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養物、ペトリ皿などで起こる事象を指す。
インビボ：本明細書において使用される際、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物またはそれらの細胞もしくは組織）内で起こる事象を指す。
単離された：本明細書において使用される際、「単離された」という用語は、物質または実体が結合された（天然環境かまたは実験環境にかかわらず）複数の成分の少なくともいくつかから分離された物質または実体を指す。単離された物質は、それらが結合されていた物質に対して様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質および／または実体は、それらが最初に結合されていた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離され得る。ある実施形態において、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書において使用される際、物質は、それが他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、化合物が、それが形成または検出された環境から実質的に分離されることを意味する。部分的分離は、例えば、本開示の化合物が富化された組成物を含み得る。実質的分離は、本開示の化合物、またはそれらの塩の少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％を含有する組成物を含み得る。化合物およびそれらの塩を単離するための方法は、当該技術分野において常用的である。
Ｌ−ヌクレオシド：本明細書において使用される際、Ｌ−ヌクレオシドは、Ｌ−リボースを含むヌクレオシドを指す。
最大化コドン：本明細書において使用される際、「最大化コドン」という用語は、最も多い数のヌクレオチドを有するコドンを指す。例えば、「グアニン最大化コドン」は、最も多い数のグアニンを有する特定のアミノ酸のためのコドンである。
天然に存在する：本明細書において使用される際、「天然に存在する」は、人工的な補助なしに自然界に存在することを意味する。
非ヒト脊椎動物：本明細書において使用される際、「非ヒト脊椎動物」は、野生種および家畜化された種を含む、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を除く全ての脊椎動物を含む。非ヒト脊椎動物の例としては、限定はされないが、哺乳動物、例えば、アルパカ、バンテン、バイソン、ラクダ、ネコ、ウシ、シカ、イヌ、ロバ、ガヤル、ヤギ、モルモット、ウマ、ラマ、ラバ、ブタ、ウサギ、トナカイ、ヒツジ、スイギュウ、およびヤクが挙げられる。
オフターゲット：本明細書において使用される際、「オフターゲット」は、いずれかの１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物に対して意図されないあらゆる作用を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書において使用される際、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、所与のリーディングフレーム内に終止コドンを含まない配列を指す。
作動可能に連結された：本明細書において使用される際、「作動可能に連結された」という語句は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分などの間の機能性連結を指す。
パラトープ：本明細書において使用される際、「パラトープ」は、抗体の抗原−結合部位を指す。
患者：本明細書において使用される際、「患者」は、治療を求めるまたは治療が必要となり得る、治療を必要とする、治療を受けている、治療を受ける予定の対象、または特定の疾患または病態について専門家による医療を受けている対象を指す。
任意に置換される：本明細書において、「任意に置換されるＸ」（例えば、任意に置換されるアルキル）という形態の語句は、「Ｘ（ここで、Ｘは、任意に置換される）」（例えば、「アルキル（ここで、アルキルは、任意に置換される）」）と同等であることが意図される。特徴「Ｘ」（例えば、アルキル）自体が任意選択であることを意味することは意図されない。
ペプチド：本明細書において使用される際、「ペプチド」は、長さが５０アミノ酸以下、例えば、長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸である。
薬学的に許容できる：「薬学的に許容できる」という語句は、本明細書において、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適であり、妥当なリスク・ベネフィット比に見合う、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
薬学的に許容できる賦形剤：本明細書において使用される際の「薬学的に許容できる賦形剤」という語句は、本明細書に記載される化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁または溶解させることができるビヒクル）であって、患者において実質的に非毒性かつ非炎症性である特性を有する成分を指す。賦形剤としては、例えば：固結防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング、圧縮補助剤、崩壊剤、染料（色素）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、膜形成剤またはコーティング、香味料、香料、滑剤（流動促進剤）、潤滑剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤もしくは分散剤、甘味料、および水和水が挙げられる。例示的な賦形剤としては、限定はされないが：ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドンヨード、アルファデンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、およびキシリトールが挙げられる。
薬学的に許容できる塩：本開示は、本明細書に記載される化合物の薬学的に許容できる塩も含む。本明細書において使用される際、「薬学的に許容できる塩」は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによって）親化合物が改変された、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容できる塩の例としては、限定はされないが、アミンなどの塩基性残基の無機または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機塩が挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンホラート、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチネート、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、および吉草酸塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウム、ならびに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオン（限定はされないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、およびエチルアミンを含む）が挙げられる。本開示の薬学的に許容できる塩は、例えば、非毒性無機または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩を含む。本開示の薬学的に許容できる塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成され得る。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水もしくは有機溶媒中、または両者の混合物中で、化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製され得；一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩の一覧は、「レミントンの薬学の科学および実施（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ．Ｒ．ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）（リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州バルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）、２００６年、「製剤用塩：特性、選択、および使用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ）」、Ｐ．Ｈ．スタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）およびＣ．Ｇ．ワームス（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）（編）、ワイリー−ＶＣＨ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年、ならびにバージ（Ｂｅｒｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第６６巻、ｐ．１〜１９、１９７７年（これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に援用される）に見出される。
薬物動態学的：本明細書において使用される際、「薬物動態学的」は、それが、生きた生物に投与される物質の運命の決定に関する場合、分子または化合物のいずれか１つ以上の特性を指す。薬物動態学は、吸収、分布、代謝および排泄の範囲および速度を含むいくつかの分野に分けられる。これは、一般的にＡＤＭＥと呼ばれ、ここで：（Ａ）吸収は、物質が血液循環に進入するプロセスであり；（Ｄ）分布は、身体の体液および組織全体にわたる物質の分散または播種であり；（Ｍ）代謝（または生体内変化）は、親化合物から娘の代謝産物への不可逆的変換であり；（Ｅ）排泄（または排除）は、身体からの物質の排除を指す。稀な事例では、一部の薬剤は、身体組織中に不可逆的に蓄積する。
薬学的に許容できる溶媒和物：本明細書において使用される際の「薬学的に許容できる溶媒和物」という用語は、好適な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれた本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投与量で生理学的に耐容可能である。例えば、溶媒は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液から、結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製され得る。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一−、二−、および三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ：Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ：Ｎ，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ：１，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ：１，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−３，４，５，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２−（１Ｈ）−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｏｎｅ）、アセトニトリル（ＡＣＮ：ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、および安息香酸ベンジルである。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と呼ばれる。
物理化学的：本明細書において使用される際、「物理化学的」は、物理的および／または化学的特性、またはそれに関するものを意味する。
ポリマー：本明細書において使用される際、「ポリマー」は、２つ以上の異なるモノマー単位を有する分子または化合物であり、２つのモノマー単位を有するコポリマー、３つのモノマー単位を有するターポリマー、４つのモノマー単位を有するテトラポリマー、５つのモノマー単位を有するペンタポリマーなどを含む。コポリマーが、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、交互コポリマー、または２つ以上のこれらのモチーフを含む組合せであり得ることも理解されよう。ポリマーはまた、組成勾配を有し得る。
予防：本明細書において使用される際、「予防」という用語は、感染症、疾患、障害および／または病態の開始を部分的にまたは完全に遅延させる；特定の感染症、疾患、障害、および／または病態の１つ以上の症状、特徴、もしくは臨床的発現を部分的にまたは完全に遅延させる；特定の感染症、疾患、障害、および／または病態の１つ以上の症状、特徴、もしくは発現の開始を部分的にまたは完全に遅延させる；感染症、特定の疾患、障害および／または病態からの進行を部分的にまたは完全に遅延させる；および／または感染症、疾患、障害、および／または病態に関連する病変を発生するリスクを低減することを指す。
プロドラッグ：本開示は、本明細書に記載される化合物のプロドラッグも含む。本明細書において使用される際、「プロドラッグ」は、物質、分子または実体が、化学的もしくは物理的改変時に治療薬として作用することを決定付ける（ｐｒｅｄｉｃａｔｅ）形態の任意の物質、分子または実体を指す。プロドラッグは、任意の方法で共有結合または隔離されてもよく、これらは、哺乳動物対象への投与前、投与時、または投与後に活性薬剤部分を放出するか、または活性薬剤部分に変換される。プロドラッグは、修飾物が、日常的な操作またはインビボのいずれかで、親化合物に切断されるように、化合物中に存在する官能基を修飾することによって調製され得る。プロドラッグは、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基が、任意の基に結合され、これが、哺乳動物対象に投与されると、切断されて、それぞれ遊離ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、またはカルボキシル基を形成する化合物を含む。プロドラッグの調製および使用は、Ｔ．ヒグチ（Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ）およびＶ．ステラ（Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ）、「新規送達系としてのプロドラッグ（Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ａ．Ｃ．Ｓ．シンポジウムシリーズ（Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ）の第１４巻、ならびに「薬剤設計における生体可逆的担体（Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）」、エドワードＢ．ロシェ（Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ）編、アメリカン・ファーマシューティカル・アソシエーション・アンド・パーガモン・プレス（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびＰｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、１９８７年（これらの両方は、全体が参照により本明細書に援用される）に説明されている。
増殖する：本明細書において使用される際、「増殖する」という用語は、成長、拡大、もしくは増加する、または急速な成長、拡大、もしくは増加を引き起こすことを意味する。「増殖性」は、増殖する能力を有することを意味する。「抗増殖性」は、増殖性に対抗するか、または増殖に不適切な特性を有することを意味する。
タンパク質切断部位：本明細書において使用される際、「タンパク質切断部位」は、アミノ酸鎖の制御された切断が、化学的、酵素的または光化学的手段によって達成され得る部位を指す。
タンパク質切断シグナル：本明細書において使用される際、「タンパク質切断シグナル」は、切断部位のためのポリペプチドをフラグ標識またはマークする少なくとも１つのアミノ酸を指す。
目的のタンパク質：本明細書において使用される際、「目的のタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語は、本明細書において提供されるものならびにそれらの断片、突然変異体、変異体、および改変物を含む。
近位：本明細書において使用される際、「近位」という用語は、中心、または目的の地点もしくは領域のより近くに位置することを意味する。
精製された：本明細書において使用される際、「精製する」、「精製された」、「精製」は、実質的に純粋にするか、または不要な成分、材料汚染、混合物もしくは不純物を取り除くことを意味する。
試料：本明細書において使用される際、「試料」または「生物学的試料」という用語は、その組織、細胞または構成部分（例えば、限定はされないが、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、臍帯血、尿、膣液および精液を含む体液）のサブセットを指す。試料は、全生物から調製されたホモジネート、溶解物もしくは抽出液、またはその組織、細胞もしくは構成部分のサブセット、またはそれらの画分もしくは部分をさらに含み得るが、これらとしては、限定はされないが、例えば、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、皮膚の外側切片、呼吸、腸、および尿生殖器管、涙、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官が挙げられる。試料はさらに、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの細胞成分を含有し得る、栄養ブロスもしくはゲルなどの媒体を指す。
シグナル配列：本明細書において使用される際、「シグナル配列」という語句は、タンパク質の輸送または局在化を指令することができる配列を指す。
有意または有意に：本明細書において使用される際、「有意」または「有意に」という用語は、「実質的に」という用語と同義的に使用される。
単一単位用量：本明細書において使用される際、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一接触点、すなわち、単回の投与イベントで投与される任意の治療薬の用量である。
類似性：本明細書において使用される際、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的関連性を指す。ポリマー分子同士の類似性パーセントの計算は、当該技術分野において理解されるように、類似性パーセントの計算が保存的置換を考慮に入れること以外は、同一性パーセントの計算と同じ方法で行われ得る。
小分子：本明細書において使用される際、「小分子」は、実験室で合成されるかまたは自然界に見られる非ペプチド性、非オリゴマー性有機化合物を指す。本明細書において使用される際の小分子は、「天然産物のような」化合物を指し得るが、「小分子」という用語は、「天然産物のような」化合物に限定されない。むしろ、小分子は、典型的に、いくつかの炭素−炭素結合を有する、複数の立体中心を有する、複数の官能基を有する、少なくとも２つの異なるタイプの官能基を有する、および１５００Ｄａ未満の分子量を有するなどの特徴の１つ以上を有することを特徴とするが、この特徴は、本開示の趣旨では、限定的であることは意図されない。
分割用量：本明細書において使用される際、「分割用量」は、単一単位用量または１日総用量を２つ以上の用量に分割することである。
安定した：本明細書において使用される際、「安定した」は、反応混合物からの有用な程度の純度までの単離に耐えるのに十分に堅固であり、好ましくは、有効な治療剤への製剤化が可能な化合物を指す。
安定化された：本明細書において使用される際、「安定させる」、「安定化された」、「安定化領域」という用語は、安定にする、または安定することを意味する。
対象：本明細書において使用される際、「対象」または「患者」という用語は、例えば、実験、診断、予防、および／または治療目的で、本発明に係る組成物が投与され得るいずれかの生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、およびヒトなどの哺乳動物）および／または植物が挙げられる。
実質的に：本明細書において使用される際、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全範囲もしくは程度またはほぼ全範囲もしくは程度を示す定性的状態を指す。生物学分野の当業者は、生物学および化学的現象が、完了に到達する、および／または完全性まで進行する、または絶対的な結果を達成または回避することは、あったとしても、稀であることを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書において、多くの生物学および化学的現象に固有の完全性の起こり得る欠如を表すために用いられる。
実質的に等しい：本明細書において使用される際、これが、用量間の時間差に関するとき、この用語は、プラス／マイナス２％を意味する。
実質的に同時に：本明細書において使用される際、かつ、これが、複数の用量に関するとき、この用語は、２秒以内を意味する。
に罹患している：疾患、障害、および／または病態「に罹患している」個体は、疾患、障害、および／または病態を有すると診断されているか、またはその１つ以上の症状を示す。
に罹患しやすい：疾患、障害、および／または病態「に罹患しやすい」個体は、疾患、障害、および／または病態を有すると診断されていないか、および／またはその症状を示していないと考えられるが、疾患またはその症状を発症する傾向を有する。ある実施形態において、疾患、障害、および／または病態（例えば、癌）に罹患しやすい個体は、以下のものの１つ以上を特徴とし得る：（１）疾患、障害、および／または病態の発症に関連する遺伝子突然変異；（２）疾患、障害、および／または病態の発症に関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、および／または病態に関連するタンパク質および／またはポリヌクレオチドの発現および／または活性の増大および／または低減；（４）疾患、障害、および／または病態の発症に関連する習慣および／または生活様式；（５）疾患、障害、および／または病態の家族の病歴；ならびに（６）疾患、障害、および／または病態の発症に関連する微生物への曝露および／または感染。ある実施形態において、疾患、障害、および／または病態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または病態を発症する。ある実施形態において、疾患、障害、および／または病態に罹患しやすい個体は、疾患、障害、および／または病態を発症しない。
合成：「合成」という用語は、人の手で生産、調製、および／または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は、化学的または酵素的であり得る。
標的細胞：本明細書において使用される際、「標的細胞」は、１つ以上の目的の細胞を指す。細胞は、インビトロ、インビボ、インサイチュ、または生物の組織もしくは器官において見出され得る。生物は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、最も好ましくは患者であり得る。
理論的最小値：「理論的最小値」という用語は、オープンリーディングフレーム中のコドンの全てが、配列中のウラシルの数を最小にするように置換されたヌクレオチド配列を指す。
治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与されると、治療、診断、および／または予防効果を有する、および／または所望の生物学的および／または薬理学的効果を引き起こす任意の薬剤を指す。
治療有効量：本明細書において使用される際、「治療有効量」という用語は、感染症、疾患、障害、および／または病態に罹患しているか、または罹患しやすい対象に投与されると、感染症、疾患、障害、および／または病態を治療する、その症状を改善する、診断する、予防する、および／またはその開始を遅延させるのに十分な送達される薬剤（例えば、ポリヌクレオチド、薬剤、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。
治療有効結果：本明細書において使用される際、「治療有効結果」という用語は、感染症、疾患、障害、および／または病態に罹患しているか、または罹患しやすい対象において、感染症、疾患、障害、および／または病態を治療する、その症状を改善する、診断する、予防する、および／またはその開始を遅延させるのに十分な結果を意味する。
１日総用量：本明細書において使用される際、「１日総用量」は、２４時間の期間に投与または処方される量である。それは、単一単位用量として投与され得る。
転写因子：本明細書において使用される際、「転写因子」という用語は、例えば、転写の活性化または抑制によって、ＲＮＡへのＤＮＡの転写を調節するＤＮＡ−結合タンパク質を指す。転写の調節だけを実施する転写因子もあれば、他のタンパク質と共同で作用するものもある。一部の転写因子は、特定の条件下で、転写の活性化および抑制の両方を実施することができる。一般に、転写因子は、特定の標的配列、または標的遺伝子の調節領域内の特定の共通配列と高度に類似する配列に結合する。転写因子は、標的遺伝子の転写だけ、または他の分子との複合体における転写を調節し得る。
治療：本明細書において使用される際、「治療」という用語は、特定の感染症、疾患、障害、および／または病態の１つ以上の症状または特徴の部分的もしくは完全な緩和、回復、改善、軽減、その開始の遅延、その進行の阻害、その重症度の軽減、および／またはその発生率の低下を指す。例えば、癌を「治療」することは、腫瘍の生存、成長、および／または広がりの阻害を指し得る。治療は、疾患、障害、および／または病態に関連する病変を発症するリスクを低減する目的で、疾患、障害、および／または病態の兆候を示していない対象および／または疾患、障害、および／または病態の初期兆候しか示していない対象に投与され得る。
非改変：本明細書において使用される際、「非改変」は、任意の方法で変化させる前の任意の物質、化合物または分子を指す。非改変は、必ずしもではないが、生体分子の野生型または天然型を指し得る。分子は、連続した改変を受けてもよく、それによって、各改変分子は、後の改変のための「非改変」出発分子として役立ち得る。
野生型配列：本明細書において使用される際、「野生型配列」は、目的のポリペプチドをコードする天然のｍＲＮＡの配列である。
（実施例）
本開示は、以下の実施例においてさらに説明され、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本開示の範囲を限定するものではない。
実施例１：ｃＤＮＡ生成のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡの調製のためのＰＣＲ手順は、カパ・バイオシステムズ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（マサチューセッツ州ウーバン（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ））による２×カパ・ハイファイ（２×ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ）（商標）ホットスタート・レディミックス（ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ）を用いて行った。このシステムは、２×カパ・レディミックス（２×ＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘ）１２．５μｌ；フォワードプライマ（１０μＭ）０．７５μｌ；リバースプライマ（１０μＭ）０．７５μｌ；鋳型ｃＤＮＡ １００ｎｇ；および２５．０μｌまで希釈されたｄＨ２Ｏを含む。反応条件は、９５℃で５分間、および９８℃で２０秒間を２５サイクル、次に５８℃で１５秒間、次に７２℃で４５秒間、次に７２℃で５分間、次に終了まで４℃であった。
本発明のリバースプライマは、ポリ−Ａ１２０のためのポリ−Ｔ１２０を、ｍＲＮＡに組み込んだ。より長いまたはより短いポリ−Ｔトラクトを有する他のリバースプライマが、ｍＲＮＡ中のポリ−Ａ尾部の長さを調節するのに使用され得る。
反応物は、製造業者の指示（最大５μｇ）にしたがって、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いて精製した。精製の後、ｃＤＮＡは、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて定量し、アガロースゲル電気泳動によって分析して、ｃＤＮＡが予測されたサイズであることを確認した。次に、ｃＤＮＡは、配列決定分析に供してから、インビトロ転写反応を開始させた。
実施例２．インビトロ転写（ＩＶＴ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）
Ａ．材料および方法
本発明に係る改変ｍＲＮＡは、ヌクレオチドミックスが改変ヌクレオチドを含有することを除いて、インビトロ転写のための標準的な実験方法および材料を用いて作製する。目的の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ：ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）は、強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）、およびアデノシン類似体を組み込まないｍＲＮＡのポリＡ尾部の鋳型付加（ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ）のためのオリゴ（ｄＴ）配列で終端するα−グロビン３’−ＵＴＲによって隣接され得る。アデノシン含有ｍＲＮＡは、転写後ポリ（Ａ）ポリメラーゼポリ−（Ａ）尾部付加を可能にするためにオリゴ（ｄＴ）配列なしで合成する。
ＯＲＦは、様々な上流または下流の付加（限定はされないが、β−グロビン、タグなど）も含んでもよく、これらは、限定はされないが、ＤＮＡ２．０（カリフォルニア州メンローパーク（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ））などの最適化サービスから注文することができ、ＸｂａＩ認識を有し得る多重クローニング部位を含有し得る。構築物を受け取った直後に、それを再構成し、ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換してもよい。
本発明のために、ＮＥＢ ＤＨ５−αコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が使用され得る。形質転換は、１００ｎｇのプラスミドを用いて、ＮＥＢの指示にしたがって行う。プロトコルは以下のとおりである：
ＮＥＢ ５−αコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のチューブを氷上で１０分間解凍する。
１ｐｇ〜１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを含有する１〜５μｌを細胞混合物に加える。チューブを４〜５回注意深く振って、細胞とＤＮＡを混合する。渦を発生させないこと。
混合物を氷上に３０分間置く。混合しないこと。
４２℃でちょうど３０秒間熱ショックを与える。混合しないこと。
氷上に５分間置く。混合しないこと。
９５０μｌの室温ＳＯＣをピペットで混合物に入れる。
３７℃で６０分間置く。激しく（２５０ｒｐｍ）振とうまたは回転させる。
選択プレートを３７℃に温める。
チューブを振り、反転させることによって、細胞を十分に混合する。
５０〜１００μｌの各希釈物を選択プレートに塗布し、３７℃で一晩インキュベートする。あるいは、３０℃で２４〜３６時間または２５℃で４８時間インキュベートする。
次に、単一のコロニーを用いて、適切な抗生物質を用いた５ｍｌのＬＢ増殖培地を接種し、次に、５時間増殖させる（２５０ＲＰＭ、３７℃）。次に、これを用いて、２００ｍｌの培地を接種し、同じ条件下で一晩増殖させる。
プラスミド（最大８５０μｇ）を単離するために、製造業者の指示にしたがって、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ハイピュア・マキシプレップ・キット（ＨｉＰｕｒｅ Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いて、マキシプレップを行う。
インビトロ転写（ＩＶＴ）のためのｃＤＮＡを生成するために、まず、ＸｂａＩなどの制限酵素を用いて、プラスミドを線状化する。ＸｂａＩを用いた典型的な制限消化は、以下を含む：プラスミド１．０μｇ；１０×緩衝液１．０μｌ；ＸｂａＩ １．５μｌ；ｄＨ２Ｏ最大１０μｌ；３７℃で１時間インキュベート。実験室規模（＜５μｇ）で実施する場合、反応物は、製造業者の指示にしたがって、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲマイクロキット（ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いて精製する。より大きい規模の精製は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲキット（ＰＣＲ Ｋｉｔ）（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））などのより大きい負荷容量を有する製品を用いて行う必要があり得る。精製の後、線状化されたベクターは、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて定量し、アガロースゲル電気泳動を用いて線状化を確認するために分析する。
ＩＶＴ反応
インビトロ転写反応により、改変ヌクレオチドまたは改変ＲＮＡを含有するｍＲＮＡが生成される。投入ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ミックスは、天然および非天然ＮＴＰを用いて、実験室内で作製する。
典型的なインビトロ転写反応は、以下を含む：
鋳型ｃＤＮＡ：１．０μｇ
１０×転写緩衝液（４００ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１９０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのスペルミジン）：２．０μｌ
カスタムＮＴＰ（それぞれ２５ｍＭ：７．２μｌ
ＲＮａｓｅ阻害剤：２０Ｕ
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ：３０００Ｕ
ｄＨ２Ｏ：最大２０．０μｌ
３７℃で３時間〜５時間インキュベートする。
粗ＩＶＴミックスは、翌日の精製のために４℃で一晩貯蔵し得る。次に、１ＵのＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅを用いて、オリジナルの鋳型を消化する。３７℃で１５分間のインキュベーションの後、ｍＲＮＡは、製造業者の指示にしたがって、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））を用いて精製する。このキットは、最大５００μｇのＲＮＡを精製することができる。精製の後、ＲＮＡは、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて定量し、ＲＮＡが適切なサイズであることおよびＲＮＡの分解が起こっていないことを確認するために、アガロースゲル電気泳動によって分析する。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼおよび変異体ポリメラーゼ、例えば、限定はされないが、改変ＮＴＰを組み込むことができる新規なポリメラーゼ、ならびに別のプロモータを認識するリウ（Ｌｉｕ）（エスベルト（Ｅｓｖｅｌｔ）ら著（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２０１１年、第４７２巻、７３４４号、ｐ．４９９〜５０３および米国特許出願公開第２０１１０１７７４９５号明細書）、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを転写するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ変異体を記載しているエリントン（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ）（チェリセリーカッティル（Ｃｈｅｌｌｉｓｅｒｒｙｋａｔｔｉｌ）およびエリントン（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ）著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２００４年、第２２巻、９号、ｐ．１１５５〜１１６０）、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ二重突然変異体を記載しているソーサ（Ｓｏｕｓａ）（パディラ（Ｐａｄｉｌｌａ）およびソーサ（Ｓｏｕｓａ）著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００２年、第３０巻、２４号、ｅ１２８）（これらは、全体が参照により本明細書に援用される）によって記載されるポリメラーゼから選択され得る。
Ｂ．改変ｍＲＮＡのアガロースゲル電気泳動
個別の改変ｍＲＮＡｓ（２０μｌの体積中２００〜４００ｎｇ）は、ウェル中、非変性の１．２％のアガロースＥ−ゲル（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））に充填し、製造業者のプロトコルにしたがって、１２〜１５分間泳動させる。
Ｃ．ＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動
個別の逆転写ＰＣＲ産物（２００〜４００ｎｇ）は、非変性の１．２％のアガロースＥ−ゲル（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））のウェル中に充填し、製造業者のプロトコルにしたがって、１２〜１５分間泳動させる。
Ｄ．ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）改変ｍＲＮＡ定量およびＵＶスペクトルデータ
ＴＥ緩衝液（１μｌ）中の改変ｍＲＮＡは、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）ＵＶ吸光読み取りに用いて、インビトロ転写反応からの各改変ｍＲＮＡの収率を定量する（ＵＶ吸光トレースは示されていない）。
実施例３．ｍＲＮＡの酵素的キャッピング
ｍＲＮＡのキャッピングは、以下のとおりに行い、ここで、混合物は、ＩＶＴ ＲＮＡ ６０μｇ〜１８０μｇおよびｄＨ２Ｏ最大７２μｌを含む。混合物は、６５℃で５分間インキュベートして、ＲＮＡを変性させ、次に、直ちに氷上に移す。
次に、プロトコルは、１０×キャッピング緩衝液（０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭのＫＣｌ、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２）（１０．０μｌ）；２０ｍＭのＧＴＰ（５．０μｌ）；２０ｍＭのＳ−アデノシルメチオニン（２．５μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（１００Ｕ）；２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４００Ｕ）；ワクシニアキャッピング酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ ｃａｐｐｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）（グアニリルトランスフェラーゼ）（４０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ（最大２８μｌ）の混合；および６０μｇのＲＮＡの場合３７℃で３０分間または１８０μｇのＲＮＡの場合最大２時間のインキュベーションを含む。
次に、ｍＲＮＡは、製造業者の指示にしたがって、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））を用いて精製する。精製の後、ＲＮＡは、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（商標）（サーモフィッシャー、マサチューセッツ州ウォルサム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））を用いて定量し、ＲＮＡが適切なサイズであることおよびＲＮＡの分解が起こっていないことを確認するために、アガロースゲル電気泳動によって分析する。ＲＮＡ産物はまた、配列決定用のｃＤＮＡを生成するために逆転写ＰＣＲを実施することによって配列決定され得る。
実施例４．５’−グアノシンキャッピング
Ａ．材料および方法
クローニング、遺伝子合成およびベクター配列決定は、ＤＮＡ２．０インコーポレーテッド（ＤＮＡ２．０ Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州メンローパーク（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ））によって行われ得る。ＯＲＦは、ＸｂａＩを用いて制限消化し、テイルＰＣＲまたはテイルなしＰＣＲを用いたｃＤＮＡ合成に使用する。テイルＰＣＲ ｃＤＮＡ産物は、それぞれ２５ｍＭの改変ヌクレオチドミックス（全ての改変ヌクレオチドは、カスタム合成されるか、またはグレン・リサーチ、バージニア州スターリング（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ ＶＡ）から購入され得るピロロ−Ｃ三リン酸を除いて、トリリンク・バイオテック、カリフォルニア州サンディエゴ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入され得；非修飾ヌクレオチドは、エピセンター・バイオテクノロジー、ウィスコンシン州マディソン（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入される）を用いた改変ｍＲＮＡ合成反応のための鋳型として使用し、セルスクリプト・メガスクリプト（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ）（商標）（エピセンター・バイオテクノロジー、ウィスコンシン州マディソン（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））が、ｍＲＮＡ合成キットを補完する。
インビトロ転写反応は、３７℃で４時間実施する。アデノシン類似体を組み込んだ改変ｍＲＮＡは、酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（アフィメトリクス、カリフォルニア州サンタ・クララ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））を用いてポリ（Ａ）尾部付加する。ＰＣＲ反応は、ハイファイＰＣＲ ２Ｘマスター・ミックス（ＨｉＦｉ ＰＣＲ ２Ｘ ＭＡＳＴＥＲ ＭＩＸ）（商標）（カパ・バイオシステムズ、マサチューセッツ州ウーバン（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ））を使用する。改変ｍＲＮＡは、組み換えワクシニアウイルスキャッピング酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）（ニューイングランドバイオラボ、マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））および組み換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（エピセンター・バイオテクノロジー、ウィスコンシン州マディソン（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を用いて転写後キャッピングして、５’−グアノシンキャップ１構造を生成する。キャップ２構造およびキャップ２構造は、さらなる２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを用いて生成され得る。インビトロ転写ｍＲＮＡ産物は、アガロースゲル上で泳動させ、視覚化する。改変ｍＲＮＡは、アンビオン／アプライド・バイオシステムズ（Ａｍｂｉｏｎ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））メガクリアＲＮＡ（ＭＥＧＡＣｌｅａｒ ＲＮＡ）（商標）精製キットを用いて精製され得る。ＰＣＲは、ピュアリンク（ＰＵＲＥＬＩＮＫ）（商標）ＰＣＲ精製キット（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用する。産物は、ナノドロップ（ＮＡＮＯＤＲＯＰ）（商標）ＵＶアブソーバンス（ＵＶ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）（サーモフィッシャー、マサチューセッツ州ウォルサム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））において定量する。産物の品質、ＵＶ吸光品質および視覚化は、１．２％のアガロースゲル上で行った。産物は、ＴＥ緩衝液中で再懸濁させる。
Ｂ．５’キャッピング改変ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ）構造
改変ｍＲＮＡの５’−キャッピングは、製造業者のプロトコルにしたがって、５’−グアノシンキャップ構造を生成する以下の化学ＲＮＡキャップ類似体を用いて、インビトロ転写反応中に同時に完了させることができる：３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ＡＲＣＡキャップ）；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニューイングランドバイオラボ、マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））。改変ｍＲＮＡの５’−キャッピングは、「キャップ０」構造：ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ニューイングランドバイオラボ、マサチューセッツ州イプスウィッチ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））を生成するワクシニアウイルスキャッピング酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）を用いて転写後に完了され得る。キャップ１構造は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ−２’−Ｏ−メチルを生成するワクシニアウイルスキャッピング酵素（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）および２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼの両方を用いて生成され得る。キャップ２構造は、キャップ１構造から、その後の２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いた５’末端から３番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化によって生成され得る。キャップ３構造は、キャップ２構造から、その後の２’−Ｏメチル−トランスフェラーゼを用いた５’末端から４番目のヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル化によって生成され得る。酵素は、好ましくは、組み換え体起源に由来する。
哺乳類細胞にトランスフェクトされると、改変ｍＲＮＡは、１２〜１８時間または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２、もしくは７２時間超の安定性を有する。
実施例５．ポリ−Ａ領域付加反応
ｃＤＮＡ中にポリ−Ｔがない場合、ポリ−Ａ領域付加反応は、最終生成物を精製する前に行わなければならない。これは、キャップ付ＩＶＴ ＲＮＡ（１００μｌ）；ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ）；１０×テイリング緩衝液（０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２）（１２．０μｌ）；２０ｍＭのＡＴＰ（６．０μｌ）；ポリ−Ａポリメラーゼ（２０Ｕ）；ｄＨ２Ｏ最大１２３．５μｌを混合し、３７℃で３０分間のインキュベーションによって行われる。ポリ−Ａ尾部が、転写物中に既に存在する場合、尾部付加反応を省略し、アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）のメガクリア（ＭＥＧＡＣＬＥＡＲ）（商標）キット（テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））（最大５００μｇ）を用いた精製に直接進んでもよい。ポリ−Ａポリメラーゼは、好ましくは、酵母中で発現された組み換え酵素である。
本明細書において行われ、記載される試験について、ポリ−Ａ領域は、１６０ヌクレオチド長を含むようにＩＶＴ鋳型にコードされる。しかしながら、ポリ−Ａ尾部付加反応の処理性または完全性は、必ずしもちょうど１６０ヌクレオチドをもたらすわけではないことが理解されるべきである。したがって、約１６０ヌクレオチド、酸約１５０〜１６５、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４または１６５のポリ−Ａ領域は、本発明の範囲内である。
実施例６．タンパク質発現のためのスクリーニング方法
Ａ．エレクトロスプレーイオン化
対象に投与される改変ＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有し得る生物学的試料を調製し、１、２、３または４つの質量分析器を用いて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）のための製造業者のプロトコルにしたがって分析する。生物学的試料はまた、タンデムＥＳＩ質量分析法システムを用いて分析され得る。
タンパク質断片、または全タンパク質のパターンは、所与のタンパク質の公知の対照と比較し、比較によって同一性を決定する。
Ｂ．マトリックス支援レーザ脱離／イオン化
対象に投与される改変ＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有し得る生物学的試料を調製し、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ：ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）のための製造業者のプロトコルにしたがって分析する。
タンパク質断片、または全タンパク質のパターンは、所与のタンパク質の公知の対照と比較し、比較によって同一性を決定する。
Ｃ．液体クロマトグラフィー−質量分析法−質量分析法
改変ＲＮＡによってコードされるタンパク質を含有し得る生物学的試料は、それに含まれるタンパク質を消化するために、トリプシン酵素で処理され得る。得られるペプチドは、液体クロマトグラフィー−質量分析法−質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって分析する。ペプチドは、質量分析計において断片化して、診断パターンを取得し、これは、コンピュータアルゴリズムによってタンパク質配列データベースにマッチさせることができる。消化された試料は、希釈されて、所与のタンパク質のための１ｎｇ以下の出発材料を得ることができる。単純な緩衝液バックグラウンド（例えば、水または揮発性塩）を含有する生物学的試料が、直接溶液中消化に適しており；より複雑なバックグラウンド（例えば、洗浄剤、非揮発性塩、グリセロール）は、試料分析を容易にするために、さらなる精製工程を必要とする。
タンパク質断片、または全タンパク質のパターンは、所与のタンパク質の公知の対照と比較し、比較によって同一性を決定する。
実施例７．トランスフェクション
Ａ．リバーストランスフェクション
２４ウェルのコラーゲンで被覆された組織培養プレートにおいて行われる実験の場合、角化細胞（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）または他の細胞は、１×１０５の細胞密度で播種する。９６ウェルのコラーゲンで被覆された組織培養プレートで行われる実験の場合、角化細胞は、０．５×１０５の細胞密度で播種する。トランスフェクトされる各改変ｍＲＮＡについて、改変ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩマックス（ＲＮＡＩＭＡＸ）（商標）は、記載されるように調製し、細胞が組織培養プレートに付着してしまう前に、細胞播種から６時間以内にマルチウェルプレート内の細胞と混合する。
Ｂ．フォワードトランスフェクション
２４ウェルのコラーゲンで被覆された組織培養プレートにおいて、細胞は、０．７×１０５の細胞密度で播種する。９６ウェルのコラーゲンで被覆された組織培養プレートで行われる実験の場合、角化細胞は、使用される場合、０．３×１０５の細胞密度で播種する。次に、細胞は、２４時間にわたって７０％超の密集度になるまで増殖させる。トランスフェクトされる各改変ｍＲＮＡについて、改変ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩマックス（ＲＮＡＩＭＡＸ）（商標）は、記載されるように調製し、細胞播種および組織培養プレートへの付着後、２４時間にわたってマルチウェルプレート内の細胞にトランスフェクトする。
Ｃ．翻訳スクリーン：ＥＬＩＳＡ
細胞は、７０％超の密集度で、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のサプリメントＳ７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｓ７）を含むエピライフ（ＥｐｉＬｉｆｅ）培地中で増殖させる。インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のＲＮＡＩマックス（ＲＮＡＩＭＡＸ）（商標）と複合体化された３００ｎｇの指示化学改変ｍＲＮＡで細胞をリバーストランスフェクトする。あるいは、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のＲＮＡＩマックス（ＲＮＡＩＭＡＸ）（商標）と複合体化された３００ｎｇの改変ｍＲＮＡで細胞をフォワードトランスフェクトする。ＲＮＡ：ＲＮＡＩマックス（ＲＮＡＩＭＡＸ）（商標）複合体は、まず、室温で１０分間にわたって、５×体積の希釈物中で、サプリメント非含有エピライフ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−ｆｒｅｅ ＥＰＩＬＩＦＥ）（登録商標）培地とともにＲＮＡをインキュベートすることによって形成される。
第２のバイアル中で、ＲＮＡＩマックス（ＲＮＡＩＭＡＸ）（商標）試薬は、室温で１０分間にわたって１０×体積の希釈物中のサプリメント非含有エピライフ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ−ｆｒｅｅ ＥＰＩＬＩＦＥ）（登録商標）培地とともにインキュベートする。次に、ＲＮＡバイアルは、ＲＮＡＩマックス（ＲＮＡＩＭＡＸ）（商標）バイアルと混合し、室温で２０〜３０インキュベートしてから、細胞に滴下して加える。培地中の分泌されたポリペプチド濃度は、化学改変ｍＲＮＡのそれぞれについて、トランスフェクションから１８時間後に３回反復して測定する。トランスフェクトされたヒト細胞からの目的のポリペプチドの分泌は、製造業者の推奨する指示にしたがって、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））製のＥＬＩＳＡキットを用いて定量する。
Ｄ．用量および継続時間：ＥＬＩＳＡ
細胞は、７０％超の密集度で、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のサプリメントＳ７（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｓ７）を含むエピライフ（ＥＰＩＬＩＦＥ）（登録商標）培地中で増殖させる。インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のＲＮＡＩマックス（ＲＮＡＩＭＡＸ）（商標）と複合体化された０ｎｇ、４６．８７５ｎｇ、９３．７５ｎｇ、１８７．５ｎｇ、３７５ｎｇ、７５０ｎｇ、または１５００ｎｇの改変ｍＲＮＡで細胞をリバーストランスフェクトする。改変ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩマックス（ＲＮＡＩＭＡＸ）（商標）複合体は、記載されるように形成される。培地中の分泌されたポリペプチド濃度は、各改変ｍＲＮＡのそれぞれの濃度について、トランスフェクションから０、６、１２、２４、および４８時間後に３回反復して測定する。トランスフェクトされたヒト細胞からの目的のポリペプチドの分泌は、製造業者の推奨する指示にしたがって、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）製のＥＬＩＳＡキットを用いて定量する。
実施例８．細胞自然免疫応答：ＩＦＮ−β ＥＬＩＳＡおよびＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡ
インビトロトランスフェクトされたヒト角化細胞から分泌されたヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ヒトインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）およびヒト顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）についての酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を、細胞自然免疫応答の検出のために試験する。
細胞は、７０％超の密集度で、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のヒドロコルチゾン非存在ヒト増殖サプリメント（Ｈｕｍａｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を含むエピライフ（ＥＰＩＬＩＦＥ）（登録商標）培地中で増殖させる。記載されるようにインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のＲＮＡＩマックス（ＲＮＡＩＭＡＸ）（商標）と複合体化された０ｎｇ、９３．７５ｎｇ、１８７．５ｎｇ、３７５ｎｇ、７５０ｎｇ、１５００ｎｇまたは３０００ｎｇの指示化学改変ｍＲＮＡで細胞を３回反復してリバーストランスフェクトする。培地中の分泌されたＴＮＦ−αは、製造業者のプロトコルにしたがって、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のＥＬＩＳＡキットを用いて、化学改変ｍＲＮＡのそれぞれについて、トランスフェクションから２４時間後に測定する。
分泌されたＩＦＮ−βは、製造業者のプロトコルにしたがって、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のＥＬＩＳＡキットを用いて、改変ｍＲＮＡのそれぞれについて、トランスフェクションから２４時間後に測定する。分泌されたｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ濃度は、改変ｍＲＮＡのそれぞれについて、トランスフェクションから２４時間後に測定する。トランスフェクトされたヒト細胞からの目的のポリペプチドの分泌は、製造業者の推奨する指示にしたがって、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））製のＥＬＩＳＡキットを用いて定量する。これらのデータは、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−βなどの例示的な１型サイトカインを測定することによって、天然および他の改変ポリヌクレオチドまたは参照化合物と比較して、どの改変ｍＲＮＡが細胞自然免疫応答の減少を引き起こすことができるかを示す。
実施例９．細胞傷害性およびアポトーシス
この実験では、異なる改変ｍＲＮＡ−インビトロトランスフェクトされたヒト角化細胞について、細胞の生存性、細胞傷害性およびアポトーシスを実証する。角化細胞は、７０％超の密集度で、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のヒドロコルチゾン非存在ヒト角化細胞増殖サプリメント（Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を含むエピライフ（ＥＰＩＬＩＦＥ）（登録商標）培地中で増殖させる。インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製のＲＮＡＩマックス（ＲＮＡＩＭＡＸ）（商標）と複合体化された０ｎｇ、４６．８７５ｎｇ、９３．７５ｎｇ、１８７．５ｎｇ、３７５ｎｇ、７５０ｎｇ、１５００ｎｇ、３０００ｎｇ、または６０００ｎｇの改変ｍＲＮＡで角化細胞をリバーストランスフェクトする。改変ｍＲＮＡ：ＲＮＡＩマックス（ＲＮＡＩＭＡＸ）（商標）複合体を形成する。培地中の分泌されたｈｕＧ−ＣＳＦ濃度は、各改変ｍＲＮＡの各濃度について、トランスフェクションから０、６、１２、２４、および４８時間後に３回反復して測定する。トランスフェクトされたヒト角化細胞からの目的のポリペプチドの分泌は、製造業者の推奨する指示にしたがって、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＲ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）製のＥＬＩＳＡキットを用いて定量する。細胞の生存性、細胞傷害性およびアポトーシスは、製造業者の指示にしたがって、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））製のアポトックス−グロ（ＡＰＯＴＯＸ−ＧＬＯ）（商標）キットを用いて、トランスフェクションから０、１２、４８、９６、および１９２時間後に測定する。
実施例１０．改変ヌクレオチドを含有するヒトＥＰＯを用いたインビボアッセイ
製剤化
改変ｈＥＰＯ ｍＲＮＡは、それぞれ５０：１０：３８．５：１．５ｍｏｌ％で、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ−ＤＭＧを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化した（表４）。ｐＨ４．０ ５０ｍＭクエン酸ｍＲＮＡ溶液中へのエタノール可溶化脂質のナノ析出（ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を用いた直接注入によってＬＮＰを作製した。ＥＰＯ ＬＮＰ粒径分布は、ＤＬＳによって特性決定した。封入効率（ＥＥ：ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、核酸の検出および定量のためのリボグリーン（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ）（商標）蛍光ベースアッセイを用いて決定した。
方法およびデータ
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝５）に、ヒトＥＰＯ ｍＲＮＡを０．０５ｍｇ／ｋｇ筋肉内（ＩＭ）（大腿四頭筋中に５０μｌ）または静脈内（ＩＶ）（尾静脈中に１００ｕｌ）投与した。注入から８時間後の時点で、マウスを安楽死させ、血液を血清分離チューブ中に採取した。試料を回転させ、次に、キットプロトコル（ステム・セル・テクノロジーズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）カタログ番号０１６３０）にしたがって、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡ上で血清試料を泳動させた。
実施例１１．３’−アジド−２’，３’−ジデオキシアデノシン−５’−三リン酸（３’−アジド−ｄｄＡＴＰ）の組み込み
３’−アジド−ｄｄＡＴＰは、スキーム１に示されるように、酵母ポリ−Ａポリメラーゼを用いてテイルなしＲＮＡ１〜３（表４）の３’末端に組み込んだ。１００μＬの反応物中、ＲＮＡ転写物（０．２μＭ）、３’−アジド−ｄｄＡＴＰ（５００μＭ）、マウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）（１Ｕ／μＬ）、１×反応緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．６ｍＭのＭｎＣｌ２、２０μＭのＥＤＴＡ、０．２ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍＬのアセチル化ＢＳＡ、１０％のグリセロール）、および酵母ポリ−Ａポリメラーゼ（２４００Ｕ、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））を３７℃で１時間インキュベートした後、エタノール沈殿を行った。ＲＮＡは、１００μＬのＤＥＰＣ処理されたＨ２Ｏに溶解させ、イラストラ・ニック（ｉｌｌｕｓｔｒａ ＮＩＣＫ）カラムまたはイラストラ・マイクロスピンＧ−２５（ｉｌｌｕｓｔｒａ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−２５）カラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いたゲルろ過によってさらに精製した。ＲＮＡは、必要に応じて、アミコン・ウルトラ−０．５（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５）遠心分離装置（１００Ｋ ＮＭＷＬ）を用いた限外ろ過によって濃縮し、ＵＶ吸光によって定量し、キャピラリー電気泳動（ＣＥ：ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（アジレント２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））によって分析した。この時点で得られたＲＮＡは、非修飾ＲＮＡと３’−アジドＲＮＡとの混合物（これは、ＣＥによって区別することができない）であり、この混合物をさらに精製せずにその後の反応に使用した。
５’−ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）ポリ−Ａ尾部１〜６は、歪み促進型アジド−アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ：ｓｔｒａｉｎ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ ａｚｉｄｅ−ａｌｋｙｎｅ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）化学を用いてＲＮＡ−ポリ−Ａ尾部コンジュゲートを生成するために合成した。尾部１および４は、固相ホスホロアミダイトオリゴマー化技術によって直接合成され得るが、尾部２、３、５、および６は、まず、５’−アミノ誘導体（尾部２ａ、３ａ、５ａ、および６ａ）として合成し、次に、それをＮＨＳ化学によって反応性ＢＣＮ基に結合した（スキーム２）。
尾部１、２ａ、３ａ、４、５ａ、および６ａは、固相ホスホロアミダイトオリゴマー化技術を用いるエクスペダイト８９０９（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９）ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置（パーセプティブ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ））において組み立てた。３’末端において３’−３’−結合を形成する３１μｍｏｌ／ｇの充填量の固定化３’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン（プライム・シンセシス、米国ペンシルバニア州アストン（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）から入手した）、または３２μｍｏｌ／ｇで充填される固定化５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−アデノシン（ケムジーンズ、米国マサチューセッツ州ウィルミントン（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ；ＵＳＡ））のいずれかとともに制御された多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ、１０００Å）で作製された固体支持体において、合成を開始させた。目的の配列の合成のために、以下のホスホロアミダイト：（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−（ベンゾイル）−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト、（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−（ベンゾイル）−２’−Ｏ−メチル−アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホロアミダイト（ＳＡＦＣプロリゴ、独国ハンブルク（ＳＡＦＣ Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））および５’−クリック−イージー（５’−Ｃｌｉｃｋ−ｅａｓｙ）（登録商標）ＢＣＮ ＣＥＰ ＩＩ（ベリー・アンド・アソシエーツ・インコーポレーテッド、米国ミシガン州デクスター（Ｂｅｒｒｙ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｘｔｅｒ；ＭＩ，ＵＳＡ））を使用した。５’末端にアミノリンカーを導入するために、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）保護されたアミノヘキシルホスホロアミダイト（ＳＡＦＣプロリゴ、独国ハンブルク（ＳＡＦＣ Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））またはグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（米国バージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ））製の対応するプロピル誘導体のいずれかを用いた。全てのアミダイトは、無水アセトニトリル（１００ｍＭ）に溶解させ、分子篩（３Å）を加えた。５−エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中５００ｍＭ）は、アクチベータ溶液として使用した。カップリング時間は、ヌクレオシドホスホロアミダイトについては５分間、およびリンカーアミダイトについては１２分間であった。ＲＮＡ合成のための補助試薬は、ＳＡＦＣプロリゴ（ＳＡＦＣ Ｐｒｏｌｉｇｏ）（独国ハンブルク（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））から購入した。固相合成の完了の後、乾燥した固体支持体は、１５ｍＬのポリプロピレンチューブに移し、ＲＮＡは、固体支持体から切断し、当該技術分野において公知の方法によって脱保護した（ウィンコットＦ（Ｗｉｎｃｏｔｔ Ｆ．）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．）、１９９５年、第２３巻、ｐ．２６７７〜８４）。粗オリゴマーは、ＡＫＴＡエクスプローラ（ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ）システム（ＧＥヘルスケア、独国フライブルク（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））においてＸブリッジ Ｃ１８（ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８）１９×５０ｍｍカラム（ウォーターズ、独国エシュボルン（Ｗａｔｅｒｓ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を用いたＲＰ ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液Ａは、１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム（バイオソルブ、オランダファルケンスワールト（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ，Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））であり、緩衝液Ｂは、緩衝液Ａ中９５％のアセトニトリルを含有していた。１５ｍＬ／分の流量を用いた。２６０および２８０におけるＵＶトレースを記録した。５７カラム容積以内で５％のＢから４５％のＢの勾配を用いた。適切な画分をプールし、３ＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ＝５．２および７０％のエタノールで沈殿させた。ペレットは、遠心分離によって単離し、水に溶解させ、溶液の濃度は、ＵＶ光度計（独国、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ））において２６０ｎｍにおける吸光測定によって測定した。
スキーム２に示されるようなＮＨＳ化学によって尾部２、３、５、および６を生成するためのカップリング工程では、それぞれのアミン修飾オリゴリボヌクレオチドは、１００ｍＭのホウ酸ナトリウム／ＫＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解させて、５００μＭの濃度を得た。クリック−イージー（Ｃｌｉｃｋ−ｅａｓｙ）（登録商標）ＢＣＮ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＩ（５ｍｇ、ベリー・アンド・アソシエーツ・インコーポレーテッド、米国ミシガン州デクスター（Ｂｅｒｒｙ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｘｔｅｒ；ＭＩ，ＵＳＡ））は、５０μＬのＤＭＳＯに溶解させた。ＲＮＡ溶液への約３当量のＢＣＮ誘導体の添加によって、反応を開始させた。反応の進行は、アニオン交換ＨＰＬＣカラム（ダイオネクスＤＮＡパックＰＡ２００（Ｄｉｏｎｅｘ ＤＮＡ Ｐａｃ ＰＡ２００）、４×２５０ｍｍ、ダイオネクス、独国イドシュタイン（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｉｄｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））における保持時間の変化によって監視した。反応の完了後、オリゴリボヌクレオチドコンジュゲートは、３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）／ＥｔＯＨを用いて沈殿させ、Ｃ１８ Ｘブリッジ（Ｃ１８ ＸＢｒｉｄｇｅ）逆相ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ、独国エシュボルン（Ｗａｔｅｒｓ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））において精製した。全てのオリゴリボヌクレオチドの分析が、表５に示される。
実施例１２．歪み促進型アジド−アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）を用いたポリ−Ａ領域共役
３’−アジド−ｄｄＡＴＰで３’末端を修飾されたＲＮＡ転写物は、ＳＰＡＡＣを用いて８０ｎｔの５’−ＢＣＮポリ−Ａ尾部に結合して、スキーム３に示される一般的な形態のＲＮＡ−ポリ−Ａ尾部コンジュゲートを得た。３’−アジドＲＮＡ１〜３および尾部１は、水中でそれぞれ少なくとも１：５０のモル比で混合し、７０％のエタノールの最終濃度になるまでエタノールで希釈した。一般に、３’−アジドＲＮＡの濃度は、反応混合物中１５０〜４００ｎＭであった。反応物は、室温で１時間振とうし、必要に応じて２００μＬになるまで水で希釈し、エタノール沈殿させ、ＤＥＰＣ処理された水に溶解させた。あるいは、反応物は、メガクリア（ＭＥＧＡｃｌｅａｒ）キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））によって精製し、水に溶離させた。ＲＮＡ反応混合物は、ＣＥ（アジレント２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））によって分析した。レーン３、５、および７におけるシフトされたバンドは、それぞれ、スキーム３に示される形態のコンジュゲートＲＮＡ１−尾部１、ＲＮＡ２−尾部１、およびＲＮＡ３−尾部１を表す。ＣＥから決定されるＲＮＡ−尾部１コンジュゲートの転化収率は、ＲＮＡ１については７１％、ＲＮＡ２については８０％、およびＲＮＡ３については７５％であった。
コンジュゲートはまた、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる転写によってポリ−Ａ尾部、および尾部１および４を既に含有するＲＮＡ４およびＲＮＡ５を用いてこのように作製した。これらの反応（ＣＥ）についての転化収率は、ＲＮＡ４−尾部１については９２％、ＲＮＡ４−尾部４については９１％、ＲＮＡ５−尾部１については９９％、およびＲＮＡ５−尾部４については９７％であった。過剰な非反応５’−ＢＣＮ尾部を除去するために、反応混合物は、室温で１時間振とうすることによって、１０％のＤＭＳＯ中のビオチンアジド（５００μＭ）と反応させた後、メガクリア（ＭＥＧＡｃｌｅａｒ）精製を行った。次に、反応混合物は、Ｍ−２８０ストレプトアビジンダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いたストレプトアビジン捕捉に供した。ビーズ（２００μＬ、２ｍｇ）は、高塩濃度緩衝液（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５ＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＥＤＴＡ）で３回洗浄し、２００μＬの高塩濃度緩衝液中で再懸濁させた。約１．３ｎｍｏｌの５’−ＢＣＮ尾部を含有する反応混合物は、１×高塩濃度緩衝液の最終濃度について２００μＬになるように希釈し、ビーズに加えた。試料およびビーズは、室温で１５分間混合した。この上清を保存し、エタノール沈殿させた。ＣＥを用いて、５’−ビオチン−尾部が反応混合物から除去されたことを確認した。この手順の後のクリック構築物の純度は、ＲＮＡ４−尾部１については８２％、ＲＮＡ５−尾部１については７６％、ＲＮＡ４−尾部４については９２％、およびＲＮＡ５−尾部４については８７％であった。
実施例１３．ＳＰＡＡＣを用いたＤＮＡスプリント鋳型ポリ−Ａ領域共役
ＲＮＡ１〜３（表６）の３’末端およびポリ−Ａ尾部に相補的なＤＮＡスプリント（５’−ＴＧＣＣＧＣＣＣＡＣＴＣＡＧＡＣＴＴＴＡＴ−３’）を用いて、ＳＰＡＡＣ反応物を鋳型化した。ＲＮＡ−ポリ−Ａ尾部コンジュゲートは、１ＭのＮａＣｌを含有する１００μＬの反応物中で、３’−アジドＲＮＡ、５’−ＢＣＮポリ−Ａ尾部、およびスプリントを、それぞれ１００ｎＭ：３００ｎＭ：３００ｎＭの最終濃度となるように、１：３：３のモル比で混合することによって合成した。ＲＮＡおよびＤＮＡスプリント混合物は、５分間にわたって７０℃に加熱し、２５℃に達するまで１℃／分で冷却し、２５℃で一晩維持した。塩は、限外ろ過（アミコン・ウルトラ−０．５（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５）遠心分離装置１００Ｋ ＮＭＷＬ）によって除去した。ＤＮＡスプリントは、２００ｎｇ／μＬ以下の反応混合物、１×反応緩衝液、およびターボＤＮａｓｅ（ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ）（２Ｕ）を含有する５０μＬの反応物中でのターボＤＮａｓｅ（ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ）（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））による消化によって除去した。これらの反応物は、３７℃で３０分間インキュベートし、２μＬの０．５ＭのＥＤＴＡの添加によって停止させた。緩衝液成分は、限外ろ過によって再度除去した。ＲＮＡ−ポリ−Ａ尾部コンジュゲートは、オリゴ（Ｔ）ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））を用いて、非修飾および非反応３’−アジドＲＮＡから精製した。オリゴ（Ｔ）精製は、製造業者のプロトコルによって指示されるように行ったが、ただし、ビーズを洗浄し、ＲＮＡ試料は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．５ＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＥＤＴＡを含有する高塩濃度緩衝液中で調製し、ビーズは、結合後に、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１ＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＥＤＴＡを含有する低塩濃度緩衝液で洗浄し、ＲＮＡ−ポリ−Ａ尾部コンジュゲートは、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、および１ｍＭのＥＤＴＡに溶離させた。クリック反応および精製の全ての工程は、ＣＥ（アジレント２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））によって分析し、尾部１によるＲＮＡ１の反応および精製により、ＲＮＡ１−尾部１コンジュゲートが得られた。これらのコンジュゲートの収率および純度のパーセントが、表７に示される。
実施例１４．３’−アジド−ｄｄＡＴＰ組み込みの分析
７０％のエタノール中でのＳＰＡＡＣ反応の後、非修飾ＲＮＡ、非反応３’−アジドＲＮＡ、および所望のＲＮＡ−尾部１コンジュゲートをおそらく含む、ＲＮＡ種の混合物が生成される。しかしながら、非修飾ＲＮＡおよび３’−アジドＲＮＡは区別することができないため、これは、ＣＥ電気泳動図における２つの異なるピークに対応するに過ぎない。３’−アジドＲＮＡおよびＲＮＡ−尾部１コンジュゲートは、ポリ−Ａポリメラーゼによるポリ−Ａ伸長のために３’末端においてブロックされるため、非修飾ＲＮＡのみが、酵素的尾部付加のための基質である。非修飾ＲＮＡ、したがって３’−アジドＲＮＡのパーセンテージは、非修飾ＲＮＡの除去およびＲＮＡ−尾部１コンジュゲートピークの面積への正規化の後の、非修飾ＲＮＡおよび３’−アジドＲＮＡ混合物に対応するピークの面積の差％を計算することによって決定することができる。多くの場合、クリック反応は、記載される条件下で完了に到達して、単にＲＮＡ−尾部１コンジュゲートの収率％を決定することによってアジド組み込みの決定を可能にする。
１０μＬにおいて、７０％のエタノール中でのＳＰＡＡＣ反応後のＲＮＡ混合物は、ＲＮＡ反応混合物（３００〜４００ｎｇ／μＬ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）、および１×反応緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２）を含有する反応物中で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ−Ａポリメラーゼ（ＮＥＢ）（５Ｕ）で処理した。酵素を含有しない反応物も、比較対照のために使用した。非修飾ＲＮＡを尾部１と混合しポリ−Ａポリメラーゼで処理した対照を実施して、全ての非修飾ＲＮＡが尾部付加され得ることを確認することもできる。塩は、限外ろ過によって反応物から除去し、反応物は、ＣＥによって分析した。対照反応物では、全ての非修飾ＲＮＡは、ＰＡＰによる処理によって延伸した。全てのこれらの場合、ＳＰＡＡＣ反応およびＰＡＰによる処理の後、非修飾ＲＮＡと３’−アジドＲＮＡとの推定混合物を表すピーク中にＲＮＡは残っておらず、これは、クリック反応が完了し、アジド組み込みが、ＲＮＡ−尾部コンジュゲートの収率％から決定され得ることを示す。これらの実施例では、アジド組み込みは、ＲＮＡ１については６０％、ＲＮＡ２については６０％、およびＲＮＡ３については７５％であった。
実施例１５．ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の曲線下総面積（Ｔｏｔａｌ Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ）
指示ｍＲＮＡ（５０ｎｇ）は、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）（商標）を用いて、ヒーラ細胞にトランスフェクトした。細胞は、インキュサイト（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ）キネティックイメージングシステム（エッセン・バイオサイエンス（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））に入れ、そこで、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光は、１４２時間にわたって２時間毎に測定した。各トランスフェクションは３回反復して行った。曲線下総面積は、グラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を用いて積分した。表７および８は、ＲＮＡ１−尾部コンジュゲートおよび適切な対照のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のＡＵＣを示し、ここで、ＲＮＡ４およびＲＮＡ５は、それぞれ、８０量体および１４０量体ポリ−Ａ尾部を含有するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写構築物である。表１０は、ＲＮＡ４−尾部およびＲＮＡ５−尾部コンジュゲートについてのＡＵＣを示す。
実施例１６．ヒーラ細胞におけるナノルシフェラーゼ（ＮａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性
指示ｍＲＮＡ（２５ｎｇ）は、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）（商標）を用いて、ヒーラ細胞に３回反復してトランスフェクトした。一晩のインキュベーションの後、細胞は、ＧＬＯ溶解緩衝液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））に溶解させた。ナノグロ（ＮａｎｏＧｌｏ）基質を加え、シナジー・マイクロプレート・リーダ（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ）（バイオテク（ＢｉｏＴｅｋ））を用いて発光シグナルを定量した。表１１は、ＲＮＡ２−尾部コンジュゲートおよび適切な対照についてのナノルシフェラーゼ（ｎａｎｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性を示し、ここで、ＲＮＡ６は、１４０量体ポリ−Ａ尾部を含有するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写構築物である。
実施例１７．ヒーラ細胞におけるヒトＧＣＳＦ発現
指示ｍＲＮＡ（２５０ｎｇ）は、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）（商標）を用いて、ヒーラ細胞に３回反復してトランスフェクトした。一晩のインキュベーションの後、上清を回収し、これを用いて、ヒトＧＣＳＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））のレベルを測定した。表１２は、ＲＮＡ３−尾部コンジュゲートおよび適切な対照についてのＧＣＳＦの発現レベルを示し、ここで、ＲＮＡ７は、１４０量体ポリ−Ａ尾部を含有するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写構築物である。
実施例１８．ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ線維芽細胞の上清におけるＩＦＮβレベル
指示ｍＲＮＡ（５００ｎｇ）は、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）（商標）を用いて、ＢＪ線維芽細胞に３回反復してトランスフェクトした。４８時間のインキュベーション後、上清を回収し、これを用いて、ヒトインターフェロン−β（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））のレベルを測定した。表１３は、ＲＮＡ２−尾部コンジュゲートおよび適切な対照について検出されたＩＦＮβの量を示し、ここで、ＲＮＡ６は、１４０量体ポリ−Ａ尾部を含有するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写構築物であり、野生型ＲＮＡ６は、非修飾ヌクレオチドで転写される。
実施例１９．１０量体３’−安定化領域を含むｍＲＮＡの合成
上記の実施例１１と同様に、３’−アジド−ｄｄＡＴＰは、スキーム４に示されるように、酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて、１００ｎｔポリ（Ａ）尾部を既に含有するｍＲＮＡの３’末端に組み込んだ。反応の前に、ｍＲＮＡは、６５℃で１５分間加熱した後、氷上で冷却することによって変性させた。反応を以下のように行った：ＲＮＡ転写物（１μＭ）、３’−アジド−ｄｄＡＴＰ（１００μＭ）、マウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）（１Ｕ／μＬ）、１×反応緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．６ｍＭのＭｎＣｌ２、２０μＭのＥＤＴＡ、０．２ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍＬのアセチル化ＢＳＡ、１０％のグリセロール）、および酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（７５Ｕ／ｕＬ、アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））を混合し、３７℃で１時間インキュベートした。ＲＮＡは、シリカメンブレン・スピンカラム（エコノスピン（ＥｃｏｎｏＳｐｉｎ）、エポック・ライフ・サイエンス（ＥＰＯＣＨ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて単離し、水に溶離させ、ＲＮＡ溶液は、限外ろ過（３０Ｋ ＮＭＷＬ、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））によってさらに脱塩した。ＲＮＡは、ＵＶ吸光によって定量し、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）（アジレント２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））およびＨＰＬＣ（図１および２）によって分析した。この時点で得られたＲＮＡは、非修飾ＲＮＡと３’−アジドＲＮＡとの混合物であり、この混合物をさらに精製せずにその後の反応に使用した。
次に、３’−安定化尾部を有する様々なｍＲＮＡは、実施例１２と同様に、歪み促進型アジド−アルキン付加環化を用いて合成した。３’−アジド−ｄｄＡＴＰで３’末端を修飾されたＲＮＡ転写物は、歪み促進型アジド−アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）を用いて５’−ＢＣＮオリゴに結合して、スキーム５に示される一般的な形態のＲＮＡコンジュゲートを得た。３’−アジドＲＮＡおよび５’−ＢＣＮオリゴ１は、水中でそれぞれ少なくとも１：５０のモル比で混合し、１／１０の体積のＮａＯＡｃ（３Ｍ、ｐＨ５．５）および３倍の体積の１００％の冷ＥｔＯＨを加えることによって、エタノール沈殿させた。一般に、３’−アジドＲＮＡの濃度は、反応混合物中１〜１２５ｎｇ／ｕＬであった。反応物を十分に混合し、１５分間または−２０°で一晩ドライアイス上に置き、１３．２ｒｐｍで２５分間回転させて、ＲＮＡをペレット化した。上清を除去し、ペレットは、７０％の冷ＥｔＯＨで洗浄した。乾燥されたペレットは、水に溶解させた。ＲＮＡ反応物は、メガクリア（ＭＥＧＡｃｌｅａｒ）キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ））によって精製して、過剰な５’−ＢＣＮオリゴを除去し、水に溶離させ、ＲＮＡ溶液は、限外ろ過（３０Ｋ ＮＭＷＬ、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ））によってさらに脱塩した。ＲＮＡは、ＵＶ吸光によって定量し、ＣＥ（アジレント２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ））およびＨＰＬＣ（ウォーター・アクイティＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒ Ａｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ））によって分析した。
使用される５’−ＢＣＮ修飾オリゴの一例は、以下に示される１０のＬ−アデノシンを含むオリゴである。
上記の方法を用いて合成された安定化尾部を有する改変ｍＲＮＡが、表１４に示される。
ｈＥＰＯ発現実験のための開始ｍＲＮＡ配列は、
であり、ここで、各Ｕは、５−メトキシ−ウリジンである。
実施例１９．安定化ｈＥＰＯ ｍＲＮＡのインビトロ発現
ｍＲＮＡは、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）（商標）を用いて、ヒーラ細胞に３回反復してトランスフェクトした。一晩のインキュベーションの後、上清を回収し、これを用いて、ヒトＧＣＳＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））のレベルを測定した。３’−安定化尾部を有するｍＲＮＡは、３’−安定化尾部を有さない対照ｍＲＮＡと比較して、ヒーラ細胞におけるｈＥＰＯの同等の発現を有することが分かった。
実施例２０．ＢＪ線維芽細胞におけるインビトロＩＮＦβ誘導
ｍＲＮＡは、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）（商標）を用いて、ＢＪ線維芽細胞に３回反復してトランスフェクトした。４８時間のインキュベーション後、上清を回収し、これを用いて、ヒトインターフェロン−β（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））のレベルを測定した。３’−安定化尾部を有するｍＲＮＡは、３’−安定化尾部を有さない対照ｍＲＮＡと比較して、ＢＪ線維芽細胞におけるＩＮＦβの同等の誘導を有することが分かった。
実施例２１．ＣＤ−１マウスにおける安定化ｈＥＰＯ ｍＲＮＡのインビボ発現（１日試験）
実施例６に記載される方法を用いて、実施例２４の改変ｍＲＮＡの発現は、３’−安定化尾部を含まない対照ｍＲＮＡと比較した。５匹の雌ＣＤ−１マウスに、０．０５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを静脈内投与した。以下の表１５に示されるように、２４時間の時点で、３’−安定化尾部を含有するｍＲＮＡは、対照ｍＲＮＡより高い発現を有していた。
実施例２２．ＣＤ−１マウスにおける安定化ｈＥＰＯ ｍＲＮＡのインビボ発現（３日試験）
実施例６に記載される方法を用いて、実施例２４の改変ｍＲＮＡの発現は、３’−安定化尾部を含まない対照ｍＲＮＡと比較した。５匹の雌ＣＤ−１マウスに、０．０５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを静脈内投与した。以下の表１６に示されるように、７２時間の時点で、３’−安定化尾部を含有するｍＲＮＡは、対照ｍＲＮＡより高い発現を有していた。図１に示されるように、３’−安定化尾部を有するｍＲＮＡは、３’−安定化尾部を含まない対照と比較して、７２時間にわたってより高いＡＵＣを有する。
実施例２３．ＣＤ−１マウスにおける安定化ｈＥＰＯ ｍＲＮＡのインビボ発現（４日試験）
実施例６に記載される方法を用いて、実施例２４の改変ｍＲＮＡの発現は、３’−安定化尾部を含まない対照ｍＲＮＡと比較した。５匹の雌ＣＤ−１マウスに、０．０５ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを静脈内投与した。以下の表１６および１７に示されるように、９６時間の時点で、３’−安定化尾部を含有するｍＲＮＡは、０．０５ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇの両方で、対照ｍＲＮＡより高い発現を有していた。図２および３に示されるように、３’−安定化尾部を有するｍＲＮＡは、３’−安定化尾部を含まない対照と比較して、７２時間にわたってより高いＡＵＣを有する。
実施例２４．モルホリノリンカーを介して結合された３’−安定化尾部を有する改変ｍＲＮＡの合成
Ａ１００尾部を有するｍＲＮＡは、３３％のＤＭＳＯを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ８）に溶解させ、１０００倍モル過剰のアルデヒド反応性分子の存在下で、１０００倍モル過剰のＮａＩＯ４とともにインキュベートした。この場合、反応性基は、アミノオキシであったが、ヒドラジド、チオセミカルバジド、およびアミン、それに続くシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元を用いて、ｍＲＮＡの３’末端に基を共有結合することもできる。
反応は、氷上で３０分間にわたって暗所で行う。反応を行った後、クエンチとしてグリセロールを１００倍モル過剰でＮａＩＯ４に加え、十分に混合する。生成物による反応からの修飾ｍＲＮＡの精製は、サイズ排除、アニオン交換、逆相、疎水性相互作用、およびリガンド捕捉を含むいくつかの方法のいずれかによって行うことができる。
ＢＣＮ−ＬＡ１０尾部の結合では、アミノオキシ−ＴＥＧ−アジドは、まず、スキーム６に示されるようにｍＲＮＡに結合し、非反応ｍＲＮＡは、高純度になるまで逆相ＨＰＬＣによって反応ｍＲＮＡから精製した。
過ヨウ素酸塩処理の後、は、ワクシニア（ｖａｃｃｉｎｉａ）、２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、ＧＴＰ、およびＳＡＭを用いてｍＲＮＡにおいてキャッピング反応を行って、ｍＲＮＡをキャップキャップ１でキャッピングした。
次に、１０倍モル過剰のＢＣＮ−ＬＡ１０をｍＲＮＡに加え、反応物は、穏やかに加熱しながら減圧下で乾燥させた。過剰なＢＣＮ−ＬＡ１０は、サイズ排除クロマトグラフィーによって修飾ｍＲＮＡから除去して、以下のスキーム７に示されるように、３’末端に１０Ｌ−リボースアデノシンが結合されたｍＲＮＡ（３’−ＡＴＡ−ＢＣＮＬＡ１０）を得た。
ｈＥＰＯ発現実験の開始ｍＲＮＡ配列は、
であり、ここで、各Ｕは、５−メトキシ−ウリジンである。
実施例２５．モルホリノリンカーを介して結合された３’−安定化尾部を有する改変ｍＲＮＡを用いた、ＢＪ線維芽細胞におけるｈＥＰＯのインビトロ発現
実施例６に記載される方法を用いて、実施例２４の改変ｍＲＮＡの発現は、３’−安定化尾部を含まない対照ｍＲＮＡと比較した。以下の表１９に示されるように、４８時間の時点で、３’−安定化尾部を含有するｍＲＮＡは、対照ｍＲＮＡより高い発現を有する。
実施例２６．ＢＪ線維芽細胞におけるインビトロＩＮＦβ誘導
指示ｍＲＮＡは、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）（商標）を用いて、ＢＪ線維芽細胞に３回反復してトランスフェクトした。４８時間のインキュベーション後、上清を回収し、これを用いて、ヒトインターフェロン−β（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））のレベルを測定した。表２０は、コンジュゲートおよび適切な対照について検出されたＩＦＮβの量を示す。
実施例２７．３’−安定化尾部を有する２５量体オリゴヌクレオチドおよびｍＲＮＡのインビトロ安定性
いくつかの２５量体オリゴヌクレオチド（表２１）の安定性について試験した。
各反応物は、以下の濃度を含有していた：（ａ）０．２μＭのオリゴヌクレオチド；（ｂ）サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製の１ステップヒト結合型ＤＮＡ ＩＶＴキット（１−ｓｔｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ ＤＮＡ ＩＶＴ Ｋｉｔ）（８８８８２）（その混合物は、反応に使用される溶解物の最終的な量を３００倍希釈にしたことを除いて、製造業者の指示にしたがって組み立てた）；（ｃ）５０ｍＭのＮａＣｌの最終濃度；（ｄ）２ｍＭのＭｇＣｌ２の最終濃度；（ｅ）２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の最終濃度；および（ｆ）１ｍＭのＢＭＥの最終濃度。次に、反応物は、３７℃でインキュベートし、反応物を、１５％／７Ｍの尿素ＴＢＥゲル上で分解した。バンドを評価し、バイオ・ラッド（ＢｉｏＲａｄ）のケミ・ドック（ＣｈｅｍｉＤｏｃ）およびイメージ・ラボ・ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて定量した。
図４に示されるように、３’末端に２つの２’−Ｏ−メトキシ−アデノシンおよび逆方向チミジンを有するオリゴヌクレオチド（２６４−４０−２、２６４−４０−３、および２６４−４０−５）は、３’末端にアデノシンのみを有する（非修飾）オリゴヌクレオチドより向上した安定性を有していた。
実施例２８．ヒーラ細胞におけるｍＣｉｔｒｉｎｅのインビトロ発現
上述されるように、末端においてクリックされた１０量体ポリＡオリゴヌクレオチドによるＴ７転写によって、Ｔ８０尾部を含有するＲＮＡを含むいくつかの構築物（表２２）を調製した。
各構築物は、構造：
を有し、ここで、各構築物の「尾部」は、以下の表２２に列挙される。
プロトコル：
ヒーラ細胞は、９６ウェルプレートにおいて７５００個の細胞／ウェルで播種した。翌日、ｍＲＮＡは、ウェル当たり５０ｎｇの最終濃度でリポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）を用いてトランスフェクトした。培地は、トランスフェクションから４時間後に新鮮な培地と交換した。プレートからの蛍光は、インキュサイト・ズーム（ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭ）プレートリーダにおいて３７℃で７２時間にわたって１時間毎に読み取った。
結果：
図５に示されるように、３’−安定化尾部を有する構築物は、インビトロで非修飾構築物と同様の発現を有する。
実施例２９．３’−安定化尾部を有するｍＲＮＡおよび有さないｍＲＮＡによるＩＬ−６誘導のインビボ分析
プロトコル：
ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）ケモカイン／サイトカインマルチプレックスアッセイ（ｅバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；ｃａｔ＃ ＥＰＸ３６０−２６０９２−９０１）は、製造業者の指示にしたがって使用したが、ただし、１０μＬの血清を使用し、キュリオックス・ドロップアレイ（Ｃｕｒｉｏｘ ＤｒｏｐＡｒｒａｙ）９６ウェルプレート上にスポットし、０．０１％のＴＢＳＴで洗浄を行った。バイオラッド・バイオプレックス・リザルト・ジェネレータ（Ｂｉｏｒａｄ ＢｉｏＰｌｅｘ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）ソフトウェアを用いて蛍光強度の分析を行い、示される全ての濃度は、各分析物についての標準曲線に基づいて得られる。
結果：
表２３に示されるように、非修飾ｍＲＮＡと比較して、３’−安定化尾部を有するｍＲＮＡによるＩＬ−６誘導の有意差はなかった。各ｍＲＮＡ構築物は、ｍＲＮＡ ｈＥＰＯ配列（Ｔ７ Ｔ１００）：
を含み、ここで、各Ｕは、５−メトキシ−ウリジンである。
Ｔ１００＋２６４−１０−１０およびＴ１００＋２６４−１０−７は、上述されるように、３’末端におけるヌクレオシドを含有するアジドの付加およびクリック反応によって修飾されており、構造：
を有し、ここで、「尾部」は、Ｔ１００＋２６４−１０−１０については１０個の連続Ｌ−アデノシンであり、Ｔ１００＋２６４−１０−７については７個の連続アデノシン、続いて２つの２’−Ｏ−メトキシ−アデノシンおよび逆方向チミジンである。プロセス対照Ｔ１００ ｈＥＰＯは、Ｔ７ Ｔ１００と同じ構築物であるが、アジド−ヌクレオシドを除いて修飾構築物と同じ条件に供されており；したがって、クリックケミストリー反応は起こらなかった。
実施例３０．３’−安定化尾部を有するｍＲＮＡおよび有さないｍＲＮＡによるｈＥＰＯのインビボ発現
実施例６に記載される方法を用いて、選択された改変ｍＲＮＡの発現は、３’−安定化尾部を含まない対照ｍＲＮＡと比較した。５匹の雌ＣＤ−１マウスに、０．０５ｍｇ／ｋｇのｍＲＮＡを静脈内投与した。以下の表２３および２４に示されるように、３’−安定化尾部を含有するｍＲＮＡは、対照ｍＲＮＡより高い発現を有していた。
試験される構築物は、Ｔ７ Ｔ１００ ｈＥＰＯ、Ｔ１００ ２６４−１０−１０、Ｔ１００ ２６４−１０−７、３’−ＡＴＡ−ＢＣＮＬＡ−１０、および上述されるプロセス対照を含む。
１０ ＬＡ ＢＣＮ１およびＣ６および１０ ＬＡ ＢＣＮ１およびＣ３は、Ｔ１００ ２６４−１０−１０、Ｔ１００ ２６４−１０−７について記載されるように調製し、ここで、クリックケミストリー反応におけるＢＣＮリンカーは、構造：
を有する。
Ｔ１００＋２６４−１０−１０、Ｔ１００＋２６４−１０−７（７ｒＡ−２、２’ＯＭｅ Ａ、ｉｎｖｄ Ｔ）、５ｒＡ−５ ＬＡ、８ｒＡ−２ ＬＡ、９ｒＡ−１ ＬＡ、２０ ＬＡ、および５ ＬＡのそれぞれは、構造：
を有し、ここで、各構築物の「尾部」は、以下の表２６に列挙される。
５ｒＡ−５ ＬＡ、８ｒＡ−２ ＬＡ、および９ｒＡ−１ ＬＡは、上述されるＴ１００＋２６４−１０−１０の調製と同様の手順で調製した。
チオ−ＰＥＧ−ビオチンｉｎｔ．は、実施例２４に記載される３’−ＡＴＡ−ＢＣＮＬＡ−１０を調製するための手順を用いて調製したが、アルコキシアミン−ＰＥＧ４−ＳＳ−ＰＥＧ４−ビオチンを、アミノオキシ−ＴＥＧ−アジドの代わりに使用した。
Ｍａｌ−チオＬＡ１０は、以下に記載される手順を用いて作製した：
Ａ１００尾部を有するｍＲＮＡは、３３％のＤＭＳＯを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ８）に溶解させ、ジスルフィド結合を含む５００倍モル過剰のアルデヒド反応性分子の存在下で、１０００倍モル過剰のＮａＩＯ４とともにインキュベートした。この場合、反応性基は、アミノオキシであったが、ヒドラジド、チオセミカルバジド、およびアミン、それに続くシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元を用いて、ｍＲＮＡの３’末端に基を共有結合することもできる。
反応は、氷上で１時間にわたって暗所で行う。反応を行った後、クエンチとしてグリセロールを１００倍モル過剰でＮａＩＯ４に加え、十分に混合する。生成物による反応からの修飾ｍＲＮＡの精製は、サイズ排除、アニオン交換、逆相、疎水性相互作用、リガンド捕捉などを含むいくつかの方法のいずれかによって行うことができる。
ＬＡ１０尾部の結合では、アミノオキシ−ＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＰＥＧ−ビオチン（ＡＰＳＳＰＢ）をｍＲＮＡに結合し、オリゴアフィニティーキャプチャ精製を行って、ｍＲＮＡから過剰なＡＰＳＳＰＢを除去した。３０分間にわたってベンチにおいてＰＢＳ中で、５’アミノ末端ＬＡ１０を、Ｎ−γ−マレイミドブチリル−オキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）と反応させることによって、反応性オリゴを調製してから、限外ろ過を用いて、過剰なスルホ−ＧＭＢＳを除去した。ＡＰＳＳＰＢ末端ｍＲＮＡは、１時間にわたってベンチにおいて５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ６．５）中で、５０００倍モル過剰のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）と反応させることによってジスルフィド結合を切断することによって行った。遊離チオ含有ＰＥＧビオチンは、限外ろ過によってｍＲＮＡから除去した。
遊離３’チオールを含有するｍＲＮＡは、５’マレイミドを含有する１２倍モル過剰のＬＡ１０オリゴと混合し、穏やかに加熱しながら減圧下で乾燥させた。過剰なマレイミド−ＬＡ１０は、オリゴアフィニティーキャプチャ精製によって、修飾ｍＲＮＡから除去した。
Ｍａｌ−チオ−ＬＡ１０の構造は、
であり、ここで、「尾部」は、１０個の連続Ｌ−アデノシンである。
他の実施形態
本開示は、その詳細な説明とともに説明されてきたが、上記の説明は、本開示を例示するものであり、本開示の範囲を限定することは意図されず、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定されることが理解されるべきである。他の態様、利点、および変形が、以下の特許請求の範囲に含まれる。
当業者は、本明細書に記載される本発明に係る特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または単なる日常的な実験を用いて、それを確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることは意図されず、添付の特許請求の範囲に記載されるとおりである。
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、矛盾する記載がない限り、または文脈上他の意味であることが明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。群の１つ以上の構成要素間に「または」を含む特許請求の範囲または本明細書の記載は、矛盾する記載がない限り、または文脈上他の意味であることが明らかでない限り、群の構成要素の１つ、２つ以上、または全てが、所与のプロダクトまたはプロセスに存在するか、それに用いられるか、またはそれに関連している場合、満たされると考えられる。本発明は、群のちょうど１つの構成要素が、所与のプロダクトまたはプロセスに存在するか、それに用いられるか、またはそれに関連している実施形態を含む。本発明は、群の構成要素の２つ以上、または全てが、所与のプロダクトまたはプロセスに存在するか、それに用いられるか、またはそれに関連している実施形態を含む。
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意図され、追加の要素または工程の包含を許容するが、それを必要とするわけではないことも留意される。したがって、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本明細書において使用されるとき、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語も、包含され、開示される。
範囲が示される場合、両端の値が含まれる。さらに、矛盾する記載がない限り、または文脈および当業者の理解から他の意味であることが明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈上特に明記されない限り、当該範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の様々な実施形態における記載範囲内のあらゆる特定の値または部分範囲を想定し得ることが理解されるべきである。
さらに、先行技術に含まれる本発明のいずれかの特定の実施形態が、請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。このような実施形態は、当業者に公知であると見なされるため、それらは、除外が本明細書に明示されていない場合であっても、除外され得る。本発明の組成物のいずれかの特定の実施形態（例えば、いずれかのポリヌクレオチドまたはそれによってコードされるタンパク質；いずれかの生成方法；いずれかの使用方法）は、先行技術の存在に関連しているか否かにかかわらず、あらゆる理由で、いずれか１つ以上の請求項から除外され得る。

Claims (69)

  1. ポリペプチドをコードし、式Ｉ：
    Ａ’−Ｌ−Ｂ’
    式Ｉ
    （式中、Ａ’が、
    （ａ）少なくとも１つの５’−キャップ構造；
    （ｂ）５’−ＵＴＲ；
    （ｃ）コード領域；および
    （ｄ）３’−ＵＴＲ
    を含み；
    Ｂ’が、１〜５００個のヌクレオシドを含む３’−安定化領域を含み；
    Ｌがリンカーである）の構造を含むポリヌクレオチド。
  2. Ａ’が、（ｅ）ポリ−Ａ領域をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記３’−安定化領域中の１つ以上のヌクレオシドが、構造：
    （式中、Ｂ１が核酸塩基であり；
    各ＵおよびＵ’が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここで、ｎｕが、１〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
    Ｒ１、Ｒ１”、Ｒ２、Ｒ２”、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれが、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意に置換されるアミノ、アジド、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；またはＲ３および／またはＲ５が、Ｒ１、Ｒ１”、Ｒ２、またはＲ２”のうちの１つと結合して、それらが結合される炭素と一緒に、任意に置換されるＣ３〜Ｃ１０炭素環または任意に置換されるＣ３〜Ｃ９ヘテロシクリルを形成することができ；
    ｍおよびｎのそれぞれが、独立して、０〜５の整数であり；
    Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３のそれぞれが、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
    各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ハロ、チオール、ボラニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、または任意に置換されるアミノであり；
    Ｙ５が、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンである）を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記３’−安定化領域が、複数のアデノシンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記３’−安定化領域のヌクレオシドの全てが、アデノシンである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記３’−安定化領域が、少なくとも１つの改変ヌクレオシドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記改変ヌクレオシドが、Ｌ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン、α−チオ−２’−Ｏ−メチル−アデノシン、２’−フルオロ−アデノシン、アラビノ−アデノシン、ヘキシトール−アデノシン、ＬＮＡ−アデノシン、ＰＮＡ−アデノシン、または逆方向チミジンである、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記改変ヌクレオシドが、Ｌ−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−アデノシン、または逆方向チミジンである、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記安定化領域が、複数の改変ヌクレオシドを含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記安定化領域が、少なくとも２つの異なる改変ヌクレオシドを含む、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
  11. 少なくとも１つの改変ヌクレオシドが、２’−Ｏ−メチル−アデノシンであり、少なくとも１つの改変ヌクレオシドが、逆方向チミジンである、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. 前記安定化領域が、構造：
    （式中、各Ｘが、独立して、ＯまたはＳであり；
    Ａがアデニンを表し、Ｔがチミンを表す）、
    またはその塩を含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
  13. 前記複数の改変ヌクレオシドの全てが同じである、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記改変ヌクレオシドが、Ｌ−アデノシンである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
  15. 前記安定化領域が、１０個のヌクレオシドを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  16. 前記リンカーが、構造：
    （式中、ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、およびｇがそれぞれ、独立して、０または１であり；
    ｄが、０、１、２、または３であり；
    Ｒ６、Ｒ８、Ｒ１０、およびＲ１２のそれぞれが、独立して、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレン、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、およびＮＲ１３から選択され；
    Ｒ７およびＲ１１がそれぞれ、独立して、カルボニル、チオカルボニル、スルホニル、またはホスホリルであり、ここで、Ｒ７がホスホリルであり、−（Ｒ９）ｄ−が結合であり、ｅ、ｆ、およびｇが０である場合、Ｒ６またはＲ８の少なくとも１つがＯではなく；Ｒ１１がホスホリルであり、−（Ｒ９）ｄ−が結合であり、ａ、ｂ、およびｃが０である場合、Ｒ１０またはＲ１２の少なくとも１つがＯではなく；
    各Ｒ９が、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０ヘテロシクリレン、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレン、または（Ｒ６）ａ−（Ｒ７）ｂ−（Ｒ８）ｃを（Ｒ１０）ｅ−（Ｒ１１）ｆ−（Ｒ１２）ｇに連結する結合であり、ここで、−（Ｒ９）ｄ−が結合である場合、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、またはｆの少なくとも１つが１であり；
    Ｒ１３が、水素、任意に置換されるＣ１〜Ｃ４アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ４アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ４アルキニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロシクリル、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリール、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ７ヘテロアルキルである）を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  17. 前記リンカーが、
    （式中、Ｂ１が核酸塩基であり；
    Ｒ１４およびＲ１５がそれぞれ、独立して、水素またはヒドロキシである）を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  18. 前記リンカーが、
    （式中、ｏが、０、１、２、または３であり；
    Ｙ６が、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり；
    各Ｙ７およびＹ８が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
    各Ｙ９が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ハロ、チオール、ボラニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、または任意に置換されるアミノであり；
    Ｙ１０が、Ｏ、結合、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０アルキレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルケニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０アルキニレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１０ヘテロシクリレン、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１２アリーレン、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレンである）を含む、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  19. Ｙ１０が、任意に置換されるＣ２〜Ｃ１００ポリエチレングリコレンである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
  20. 前記リンカーが、
    （式中、ｐが、０、１、２、３、４、または５である）を含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  21. Ｒ１４およびＲ１５が両方ともヒドロキシである、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  22. ｏが１であり、Ｙ６がメチレンであり、Ｙ７およびＹ８が両方ともＯであり、Ｙ９がヒドロキシである、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  23. ｐが３である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  24. Ｙ１０が、任意に置換されるＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキレンである、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
  25. 前記リンカーが、
    （式中、ｑおよびｒがそれぞれ、独立して、１、２、３、４、または５である）を含む、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
  26. Ｒ１４およびＲ１５が両方ともヒドロキシである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  27. ｑが５であり、Ｙ６がメチレンであり、Ｙ７およびＹ８が両方ともＯであり、Ｙ９がヒドロキシである、請求項２５または２６に記載のポリヌクレオチド。
  28. ｒが３である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  29. 前記リンカーが、クリックケミストリー反応対の間のクリックケミストリー反応によって形成され得る、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  30. 前記リンカーが、
    、またはアミド結合を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  31. 前記リンカーが、構造：
    を含む、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。
  32. 前記リンカーが、構造：
    を含む、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
  33. 前記リンカーが、Ａ’の３’末端およびＢ’の５’末端に結合される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  34. ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、
    （ａ）少なくとも１つの５’−キャップ構造；
    （ｂ）５’−ＵＴＲ；
    （ｃ）コード領域；
    （ｄ）３’−ＵＴＲ；および
    （ｅ）１〜５００個のヌクレオシドを含む３’−安定化領域
    を含み、ここで、前記ヌクレオシドの１つ以上が、Ｌ−ヌクレオシド、α−チオ−２’−Ｏ−メチル−アデノシン、２’−フルオロ−アデノシン、アラビノ−アデノシン、ヘキシトール−アデノシン、ＬＮＡ−アデノシン、ＰＮＡ−アデノシン、逆方向チミジン、または３’−アジド−２’，３’−ジデオキシアデノシンであるポリヌクレオチド。
  35. 前記ポリヌクレオチドが、（ｆ）ポリ−Ａ領域をさらに含む、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
  36. 前記Ｌ−ヌクレオシドが、構造：
    （式中、Ｂ１が核酸塩基であり；
    Ｕが、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここで、ｎｕが、１〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ５のそれぞれが、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意に置換されるアミノ、アジド、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；またはＲ３またはＲ５が、Ｒ１またはＲ２のうちの１つと結合して、それらが結合される炭素と一緒に、任意に置換されるＣ３〜Ｃ１０炭素環または任意に置換されるＣ３〜Ｃ９ヘテロシクリルを形成することができ；
    ｍおよびｎのそれぞれが、独立して、０〜５の整数であり；
    Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３のそれぞれが、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
    各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ハロ、チオール、ボラニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、または任意に置換されるアミノであり；
    Ｙ５が、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンである）を有する、請求項３４または３５に記載のポリヌクレオチド。
  37. 前記Ｌ−ヌクレオシドが、Ｌ−アデノシンである、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
  38. 前記安定化領域が、複数の改変ヌクレオシドを含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  39. 前記複数の改変ヌクレオシドの全てが同じである、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
  40. 前記安定化領域が、１０個のヌクレオシドを含む、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  41. 前記３’−安定化領域の５’末端が、前記３’−ＵＴＲの３’末端に結合される、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  42. 前記３’−安定化領域の５’末端が、前記ポリ−Ａ領域の３’末端に結合される、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  43. ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、
    （ａ）少なくとも１つの５’−キャップ構造；
    （ｂ）５’−ＵＴＲ；
    （ｃ）コード領域；
    （ｄ）３’−ＵＴＲ；および
    （ｅ）１〜５００個のヌクレオシドを含む３’−安定化領域
    を含み、前記３’−安定化領域が、複数の改変ヌクレオシドを含むポリヌクレオチド。
  44. 前記ポリヌクレオチドが、（ｆ）ポリ−Ａ領域をさらに含む、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。
  45. 前記１つ以上の改変ヌクレオシドが、構造：
    （式中、Ｂ１が核酸塩基であり；
    各ＵおよびＵ’が、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（ＲＵ）ｎｕ、またはＣ（ＲＵ）ｎｕであり、ここで、ｎｕが、１〜２の整数であり、各ＲＵが、独立して、Ｈ、ハロ、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
    Ｒ１、Ｒ１”、Ｒ２、Ｒ２”、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のそれぞれが、独立して、Ｈ、ハロ、ヒドロキシ、チオール、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、任意に置換されるアミノ、アジド、任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；またはＲ３および／またはＲ５が、Ｒ１、Ｒ１”、Ｒ２、またはＲ２”のうちの１つと結合して、それらが結合される炭素と一緒に、任意に置換されるＣ３〜Ｃ１０炭素環または任意に置換されるＣ３〜Ｃ９ヘテロシクリルを形成することができ；
    ｍおよびｎのそれぞれが、独立して、０〜５の整数であり；
    Ｙ１、Ｙ２、およびＹ３のそれぞれが、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、−ＮＲＮ１−、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンであり、ここで、ＲＮ１が、Ｈ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、または任意に置換されるＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
    各Ｙ４が、独立して、Ｈ、ヒドロキシ、保護ヒドロキシ、ハロ、チオール、ボラニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６アルキニル、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルケニル、任意に置換されるＣ２〜Ｃ６ヘテロアルキニル、または任意に置換されるアミノであり；
    Ｙ５が、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、任意に置換されるＣ１〜Ｃ６アルキレン、または任意に置換されるＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキレンである）を含む、請求項３８または３９に記載のポリヌクレオチド。
  46. 前記改変ヌクレオシドが、２’−Ｏ−メチル−アデノシンである、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
  47. 前記ポリヌクレオチドが、３’末端に複数の改変ヌクレオシドを含む、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  48. 前記複数の改変ヌクレオシドが、少なくとも２つの異なるヌクレオシドを含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  49. 前記複数の改変ヌクレオシドが全て、同じヌクレオシドである、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  50. 前記３’−安定化領域中の前記ヌクレオシドの全てが改変ヌクレオシドである、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  51. 前記安定化領域が、１０個のヌクレオシドを含む、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  52. 前記３’−安定化領域の５’末端が、前記３’−ＵＴＲの３’末端に結合される、請求項４３〜５１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  53. 前記３’−安定化領域の５’末端が、前記ポリ−Ａ領域の３’末端に結合される、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  54. 前記５’−ＵＴＲが、コザック配列を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  55. 前記３’−安定化領域が、前記ポリヌクレオチドの３’末端を含む、請求項１〜５４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  56. 前記コード領域、前記５’−ＵＴＲ、前記３’−ＵＴＲ、および／または前記５’−キャップ構造の少なくとも１つが、少なくとも１つの改変ヌクレオシドを含む、請求項１〜５５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  57. 前記改変ヌクレオシドが、５−置換ウリジン、１−置換プソイドウリジン、または５−置換シチジンである、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
  58. 前記改変ヌクレオシドが、５−メトキシ−ウリジンまたは５−メチル−シチジンである、請求項５７に記載のポリヌクレオチド。
  59. 前記ポリ−Ａ領域が、少なくとも１つの改変ヌクレオシドを含む、請求項２〜３３、３５〜４２、または４４〜５８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  60. 細胞内の目的の組み換えポリペプチドの発現を増加させる方法であって、前記細胞を、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、前記ポリヌクレオチドが、式Ｉの構造を含むように修飾されており、非修飾ポリヌクレオチドと比較したとき、発現が増加される方法。
  61. 前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、請求項６０に記載の方法。
  62. 目的の前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチドである、請求項６０〜６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項６３に記載の方法。
  65. 細胞内のポリヌクレオチドの半減期を増加させる方法であって、前記細胞を、前記ポリヌクレオチドと接触させることを含み、ここで、前記ポリヌクレオチドが、式Ｉの構造を含むように修飾されており、非修飾ポリヌクレオチドと比較したとき、半減期が増加される方法。
  66. 前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記ｍＲＮＡが、治療用ポリペプチドをコードする、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記哺乳動物細胞が、ヒト細胞である、請求項６８に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR201910686T4 (tr) 2011-06-08 2019-08-21 Translate Bio Inc Mrna iletimine yönelik lipit nanopartikül bileşimleri ve yöntemler.
PL2968586T3 (pl) 2013-03-14 2019-01-31 Translate Bio, Inc. Kompozycje mrna cftr i związne z nimi sposoby i zastosowania
LT2970456T (lt) 2013-03-14 2021-08-10 Translate Bio, Inc. Būdai ir kompozicijos, skirti mrnr koduojamų antikūnų pristatymui
ES2967701T3 (es) 2013-03-15 2024-05-03 Translate Bio Inc Mejora sinergística de la entrega de ácidos nucleicos mediante formulaciones mezcladas
US10266843B2 (en) 2016-04-08 2019-04-23 Translate Bio, Inc. Multimeric coding nucleic acid and uses thereof
WO2017218524A1 (en) 2016-06-13 2017-12-21 Rana Therapeutics, Inc. Messenger rna therapy for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
AU2018224318A1 (en) * 2017-02-27 2019-09-19 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
MA47603A (fr) 2017-02-27 2020-01-01 Translate Bio Inc Nouvel arnm cftr à codons optimisés
WO2018213476A1 (en) 2017-05-16 2018-11-22 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr
GB201710973D0 (en) 2017-07-07 2017-08-23 Avacta Life Sciences Ltd Scaffold proteins
CA3084061A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Translate Bio, Inc. Improved composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
CN112673106A (zh) * 2017-12-21 2021-04-16 贝瑟克里科有限公司 点击修饰的mRNA
EP3773745A1 (en) 2018-04-11 2021-02-17 ModernaTX, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements
WO2020263883A1 (en) 2019-06-24 2020-12-30 Modernatx, Inc. Endonuclease-resistant messenger rna and uses thereof
EP3986480A1 (en) 2019-06-24 2022-04-27 ModernaTX, Inc. Messenger rna comprising functional rna elements and uses thereof
EP4031521A1 (en) 2019-09-19 2022-07-27 ModernaTX, Inc. Carbonate containing lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2021055849A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Headgroup lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
AR120080A1 (es) 2019-09-19 2022-02-02 Modernatx Inc Compuestos lipídicos de cola ramificada y composiciones para la administración intracelular de agentes terapéuticos
WO2021074695A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 Avacta Life Sciences Limited PD-L1 INHIBITOR - TGFβ INHIBITOR BISPECIFIC DRUG MOIETIES.
KR20220133957A (ko) 2020-01-31 2022-10-05 모더나티엑스, 인크. 지질 나노입자의 제조 방법
GB2594365B (en) 2020-04-22 2023-07-05 BioNTech SE Coronavirus vaccine
US20230235298A1 (en) 2020-06-01 2023-07-27 Modernatx, Inc. Phenylalanine hydroxylase variants and uses thereof
GB202101299D0 (en) 2020-06-09 2021-03-17 Avacta Life Sciences Ltd Diagnostic polypetides and methods
CA3190790A1 (en) 2020-08-06 2022-02-10 Modernatx, Inc. Methods of preparing lipid nanoparticles
AU2022245247A1 (en) 2021-03-24 2023-10-05 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2022234003A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Avacta Life Sciences Limited Cd33 binding polypeptides with stefin a protein
TW202334196A (zh) 2021-10-07 2023-09-01 英商阿法克塔生命科學有限公司 Pd-l1結合多肽
WO2023057946A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Avacta Life Sciences Limited Serum half-life extended pd-l1 binding polypeptides
AR127892A1 (es) 2021-12-10 2024-03-06 Modernatx Inc Compuestos y composiciones para la administración de agentes terapéuticos
TW202333654A (zh) 2021-12-16 2023-09-01 美商現代公司 用於製備脂質奈米顆粒之方法
WO2023193002A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Modernatx, Inc. Cross mixers for lipid nanoparticle production, and methods of operating the same
WO2023218243A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Avacta Life Sciences Limited Lag-3/pd-l1 binding fusion proteins
WO2023230578A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating circulating factors
WO2023230566A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating cytokines
WO2023230549A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of tumor suppressors and oncogenes
WO2023230570A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating genetic drivers
WO2023230573A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of immune responses
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024026475A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Modernatx, Inc. Compositions for delivery to hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) and related uses
WO2024026487A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions comprising phospholipid derivatives and related uses
WO2024026482A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions comprising surface lipid derivatives and related uses
WO2024091918A2 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Modernatx, Inc. Methods of lipid nanoparticle production in cross-mixers

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001501614A (ja) * 1996-09-26 2001-02-06 オリゴス イーティーシー．インク． 三つの構成成分からなるキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド
JP2002508299A (ja) * 1997-09-19 2002-03-19 セクイター， インク． センスｍＲＮＡ治療
WO2013036748A1 (en) * 2011-09-09 2013-03-14 Berry, Lana, L. Bicyclo[6.1.0]non-4-yne reagents for chemical modification of oligonucleotides
WO2013103659A1 (en) * 2012-01-04 2013-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Stabilizing rna by incorporating chain-terminating nucleosides at the 3'-terminus
US20140200261A1 (en) * 2013-01-17 2014-07-17 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
JP2015513912A (ja) * 2012-04-02 2015-05-18 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド
WO2015089511A2 (en) * 2013-12-13 2015-06-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
WO2015101414A2 (en) * 2013-12-30 2015-07-09 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4270537A (en) 1979-11-19 1981-06-02 Romaine Richard A Automatic hypodermic syringe
GB8311228D0 (en) * 1983-04-25 1983-06-02 Fujisawa Pharmaceutical Co Morpholine derivatives
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
CA1283827C (en) 1986-12-18 1991-05-07 Giorgio Cirelli Appliance for injection of liquid formulations
GB8704027D0 (en) 1987-02-20 1987-03-25 Owen Mumford Ltd Syringe needle combination
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4940460A (en) 1987-06-19 1990-07-10 Bioject, Inc. Patient-fillable and non-invasive hypodermic injection device assembly
US5339163A (en) 1988-03-16 1994-08-16 Canon Kabushiki Kaisha Automatic exposure control device using plural image plane detection areas
FR2638359A1 (fr) 1988-11-03 1990-05-04 Tino Dalto Guide de seringue avec reglage de la profondeur de penetration de l'aiguille dans la peau
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5190521A (en) 1990-08-22 1993-03-02 Tecnol Medical Products, Inc. Apparatus and method for raising a skin wheal and anesthetizing skin
US5527288A (en) 1990-12-13 1996-06-18 Elan Medical Technologies Limited Intradermal drug delivery device and method for intradermal delivery of drugs
GB9118204D0 (en) 1991-08-23 1991-10-09 Weston Terence E Needle-less injector
SE9102652D0 (sv) 1991-09-13 1991-09-13 Kabi Pharmacia Ab Injection needle arrangement
US5328483A (en) 1992-02-27 1994-07-12 Jacoby Richard M Intradermal injection device with medication and needle guard
CA2076465C (en) 1992-03-25 2002-11-26 Ravi V. J. Chari Cell binding agent conjugates of analogues and derivatives of cc-1065
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5569189A (en) 1992-09-28 1996-10-29 Equidyne Systems, Inc. hypodermic jet injector
US5334144A (en) 1992-10-30 1994-08-02 Becton, Dickinson And Company Single use disposable needleless injector
WO1995024176A1 (en) 1994-03-07 1995-09-14 Bioject, Inc. Ampule filling device
US5466220A (en) 1994-03-08 1995-11-14 Bioject, Inc. Drug vial mixing and transfer device
US5599302A (en) 1995-01-09 1997-02-04 Medi-Ject Corporation Medical injection system and method, gas spring thereof and launching device using gas spring
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
US5893397A (en) 1996-01-12 1999-04-13 Bioject Inc. Medication vial/syringe liquid-transfer apparatus
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
GB9607549D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Weston Medical Ltd Spring-powered dispensing device
US5993412A (en) 1997-05-19 1999-11-30 Bioject, Inc. Injection apparatus
CA2309535A1 (en) 1997-11-12 1999-05-20 Brigham And Women's Hospital, Inc. The translation enhancer element of the human amyloid precursor protein gene
IT1298087B1 (it) 1998-01-08 1999-12-20 Fiderm S R L Dispositivo per il controllo della profondita' di penetrazione di un ago, in particolare applicabile ad una siringa per iniezioni
US5955310A (en) * 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
US7468275B2 (en) 2000-01-28 2008-12-23 The Scripps Research Institute Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
AU2001231171B2 (en) 2000-01-28 2007-01-04 The Scripps Research Institute Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
EP2386637B1 (en) 2001-09-28 2018-05-16 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Microrna molecules
US20050222064A1 (en) 2002-02-20 2005-10-06 Sirna Therapeutics, Inc. Polycationic compositions for cellular delivery of polynucleotides
EP1430157B1 (en) 2002-02-20 2011-08-10 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HEPATITIS C VIRUS (HCV) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US8853376B2 (en) * 2002-11-21 2014-10-07 Archemix Llc Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
CA2533701A1 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
WO2007025008A2 (en) 2005-08-24 2007-03-01 The Scripps Research Institute Translation enhancer-element dependent vector systems
CA2659301A1 (en) 2006-07-28 2008-02-07 Applera Corporation Dinucleotide mrna cap analogs
DE102006051516A1 (de) * 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
WO2008127688A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Hart Communication Foundation Synchronizing timeslots in a wireless communication protocol
WO2008134077A1 (en) 2007-04-30 2008-11-06 Archemix Corp. Metabolic profile directed aptamer medicinal chemistry
CA2904904A1 (en) 2007-12-11 2009-06-18 The Scripps Research Institute Compositions and methods related to mrna translational enhancer elements
PL215513B1 (pl) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka
CA3073384A1 (en) 2008-09-05 2010-03-11 President And Fellows Of Harvard College Continuous directed evolution of proteins and nucleic acids
EP2281579A1 (en) 2009-08-05 2011-02-09 BioNTech AG Vaccine composition comprising 5'-Cap modified RNA
WO2011084193A1 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs
WO2012009644A2 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Arizona Board Of Regents Methods to identify synthetic and natural rna elements that enhance protein translation
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
WO2013120499A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
WO2013120498A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
EP4074834A1 (en) 2012-11-26 2022-10-19 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
WO2015002667A1 (en) 2013-07-01 2015-01-08 Myq, Inc. A location regulated point-of-sale system and enhancements
CA2955250A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
AU2015289656A1 (en) 2014-07-16 2017-02-16 Modernatx, Inc. Circular polynucleotides

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001501614A (ja) * 1996-09-26 2001-02-06 オリゴス イーティーシー．インク． 三つの構成成分からなるキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド
JP2002508299A (ja) * 1997-09-19 2002-03-19 セクイター， インク． センスｍＲＮＡ治療
WO2013036748A1 (en) * 2011-09-09 2013-03-14 Berry, Lana, L. Bicyclo[6.1.0]non-4-yne reagents for chemical modification of oligonucleotides
WO2013103659A1 (en) * 2012-01-04 2013-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Stabilizing rna by incorporating chain-terminating nucleosides at the 3'-terminus
JP2015513912A (ja) * 2012-04-02 2015-05-18 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． タンパク質の産生のための修飾ポリヌクレオチド
US20140200261A1 (en) * 2013-01-17 2014-07-17 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
WO2015089511A2 (en) * 2013-12-13 2015-06-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
WO2015101414A2 (en) * 2013-12-30 2015-07-09 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, 2004, VOL.14, 2004, PP.2677-2680, JPN6021016812, ISSN: 0004726762 *
CURRENT MEDICINAL CHEMISTRY, 2011, VOL.18, PP.4126-4138, JPN6021016815, ISSN: 0004726761 *
PNAS, 2005, VOL.102, PP.18902-18907, JPN6022010126, ISSN: 0004726763 *
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2000, VOL.275, NO.37, PP.28555-28561, JPN6022010124, ISSN: 0004726765 *
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 2001, VOL.276, NO.52, PP.48644-48654, JPN6022010125, ISSN: 0004726764 *

Also Published As

Publication number Publication date
DK3350333T3 (da) 2022-01-31
JP2022160454A (ja) 2022-10-19
AU2023200136A1 (en) 2023-02-09
PT3350333T (pt) 2022-03-02
CY1124934T1 (el) 2023-01-05
EP3350333A2 (en) 2018-07-25
ES2908449T3 (es) 2022-04-29
US20180256750A1 (en) 2018-09-13
WO2017049275A3 (en) 2017-05-11
AU2016324463A1 (en) 2018-03-29
CA2998370A1 (en) 2017-03-23
WO2017049275A2 (en) 2017-03-23
AU2016324463B2 (en) 2022-10-27
EP4101930A1 (en) 2022-12-14
HK1256703A1 (zh) 2019-10-04
EP3350333B1 (en) 2021-10-27
EP3350333A4 (en) 2019-09-04
PL3350333T3 (pl) 2022-03-07
SI3350333T1 (sl) 2022-04-29

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