ES2862412T3 - Modificación de enzimas relacionados con el ARN para producción mejorada - Google Patents

Modificación de enzimas relacionados con el ARN para producción mejorada Download PDF

Info

Publication number
ES2862412T3
ES2862412T3 ES16795177T ES16795177T ES2862412T3 ES 2862412 T3 ES2862412 T3 ES 2862412T3 ES 16795177 T ES16795177 T ES 16795177T ES 16795177 T ES16795177 T ES 16795177T ES 2862412 T3 ES2862412 T3 ES 2862412T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
protein
seq
sumo
guanylyl transferase
fusion protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16795177T
Other languages
English (en)
Inventor
Bettina Strack-Logue
Frank Derosa
Michael Heartlein
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Translate Bio Inc
Original Assignee
Translate Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Translate Bio Inc filed Critical Translate Bio Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2862412T3 publication Critical patent/ES2862412T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/0705—Nucleotidyltransferases (2.7.7) mRNA guanylyltransferase (2.7.7.50)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/95—Fusion polypeptide containing a motif/fusion for degradation (ubiquitin fusions, PEST sequence)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Un método para producir un oligonucleótido de ARNm o análogo de ARNm protegido, en donde un heterodímero que comprende una proteína de fusión facilita los pasos de transferir y metilar una molécula de guanililo al extremo ' del oligonucleótido de ARNm o análogo de ARNm, en donde la proteína de fusión comprende una guanilil transferasa. y una proteína de molécula pequeña similar a ubiquitina (SUMO), en donde la proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos idéntica por lo menos en un 90% a la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCIÓN
Modificación de enzimas relacionados con el ARN para producción mejorada
ANTECEDENTES
La terapia con ARN mensajero ("ARNm'') se está convirtiendo en un enfoque cada vez más importante para el tratamiento de una variedad de enfermedades. Una terapia de ARNm eficaz requiere la administración eficaz del ARNm al paciente y la producción eficiente de la proteína codificada por el ARNm dentro del cuerpo del paciente. Para optimizar la administración de ARNm y la producción de proteínas in vivo, típicamente se requiere una caperuza apropiada en el extremo 5' del constructo, que protege el ARNm de la degradación y facilita la traducción de proteínas con éxito. Por lo tanto, la producción a gran escala de enzimas capaces de cubrir el ARNm es particularmente importante para producir ARNm para aplicaciones terapéuticas.
La WO 02/090495 describe un sistema de expresión recombinante para la expresión de un poli aminoácido, péptido o proteína.
La WO 2014/028429 describe composiciones y métodos para el diseño, evolución, preparación, y/o fabricación de enzimas para su uso con polinucleótidos, transcritos primarios y moléculas de ARNmm
El "SUMOpro-3 Gene Fusion Technology - Manual de Producto" (2014) describe un vector de pE-SUMO3.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona un método para producir un oligonucleótido de ARNm o análogo de ARNm protegido, en donde un heterodímero que comprende una proteína de fusión facilita los pasos de transferir y metilar una molécula de guanililo al extremo 5' del oligonucleótido de ARNm o análogo de ARNm, en donde la proteína de fusión comprende una guanilil transferasa y una proteína de molécula pequeña similar a ubiquitina (SUMO), en donde la proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 6.
La invención proporciona además un método para producir una guanilil transferasa por fermentación, en donde la guanilil transferasa (i) comprende una proteína de fusión de guanilil transferasa que comprende una proteína de molécula pequeña similar a ubiquitina (SUMO) y (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 6 y SEQ iD NO: 7,
en donde el método comprende:
a) cultivar en un medio de fermentación un microorganismo que se transforma con por lo menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la guanilil transferasa, en donde la secuencia de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos de SUMO que codifica una secuencia de aminoácidos por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 1, en donde el cultivo se realiza usando un biorreactor de por lo menos 10 litros de volumen; y
b) recoger un producto producido a partir del paso de cultivo, en donde el producto es la guanilil transferasa que proporciona actividad de fosfatasa, actividad de guanilil transferasa y actividad de metilación y es para su uso en el método de la invención.
La presente invención proporciona métodos mejorados para la producción eficaz de enzimas capaces de proteger el ARNm, como se define en las reivindicaciones. La presente invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que modificar una guanilil transferasa (GT) con una etiqueta SUMO hace posible producir GT a gran escala necesaria para producir ARNm protegido para aplicaciones terapéuticas.
Por tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir un oligonucleótido de ARN o análogo de ARN protegido o, en donde una proteína de fusión facilita los pasos de transferir y metilar una molécula de guanililo al extremo 5' del oligonucleótido de ARN o análogo de ARN, como se define adicionalmente en las reivindicaciones.
La proteína de fusión comprende una guanilil transferasa y una proteína de molécula pequeña similar a ubiquitina (SUMO). En algunas realizaciones, la guanilil transferasa comprende la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7 y la proteína de SUMO comprende la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, el extremo del oligonucleótido de ARN o análogo del ARN es el extremo 5'. En algunas realizaciones, la proteína de fusión tiene actividad de fosfatasa, actividad de guanilil transferasa y actividad de metilación comparables con respecto a una proteína de guanilil transferasa de tipo salvaje.
La presente divulgación incluye proteínas de fusión, en donde una proteína de fusión comprende guanilil transferasa y una proteína de molécula pequeña similar a ubiquitina (SUMO).
En algunos casos, la guanilil transferasa comprende la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7 y la proteína de SUMO comprende la SEQ ID NO: 1. En algunos casos, la guanilil transferasa comprende una subunidad grande y una subunidad pequeña. En algunos casos, la proteína de SUMO se enlaza covalentemente y se coexpresa con la subunidad grande. En algunos casos, la proteína de fusión tiene actividad de fosfatasa, actividad de guanilil transferasa y actividad de metilación comparables a una proteína de guanilil transferasa de tipo salvaje.
En otro caso, la presente divulgación incluye vectores que codifican una proteína de fusión que comprende la proteína de guanilil transferasa y una proteína de molécula pequeña similar a ubiquitina (SUMO).
En algunos casos, el vector comprende la SEQ ID NO: 5 y la SEQ ID NO: 2. En algunos casos, el vector comprende la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3. En algunos casos, el vector comprende la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 3.
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir una guanilil transferasa por fermentación como se define adicionalmente en las reivindicaciones, que comprenden en parte: a) cultivar en un medio de fermentación un microorganismo que se transforma con por lo menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una guanilil transferasa que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7; y b) recoger un producto producido en el paso de cultivo.
La guanilil transferasa comprende una proteína de fusión de guanilil transferasa. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de guanilil transferasa tiene actividad de fosfatasa, actividad de guanilil transferasa y actividad de metilación comparables con respecto a una proteína de guanilil transferasa de tipo salvaje. La proteína de fusión de guanilil transferasa comprende una proteína de molécula pequeña similar a ubiquitina (SUMO). En algunas realizaciones, la proteína de fusión de la guanilil transferasa comprende la SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones, la proteína de SUMO se une a la guanilil transferasa mediante un enlace covalente. En algunas realizaciones, el enlace covalente es entre la proteína de SUMO y una subunidad grande de la guanilil transferasa.
En algunas realizaciones, el medio de fermentación se selecciona del grupo que consiste de Terrific Broth, Cinnabar, 2xYT y LB. En algunas realizaciones, el microorganismo es una bacteria.
En algunas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la guanilil transferasa es por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende además una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de molécula pequeña similar a ubiquitina (SUMO). En algunas realizaciones, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de molécula pequeña similar a ubiquitina (SUMO) es por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 1.
El producto es una guanilil transferasa que comprende una proteína de fusión de guanilil transferasa. La proteína de fusión de guanilil transferasa comprende además una proteína de molécula pequeña similar a ubiquitina (SUMO).
BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO
Los dibujos tienen propósito ilustrativo y no son limitativos.
La Figuras 1A y 1B son diagramas de estructuras protegidas de ARNm ejemplares presentes en varias realizaciones de la invención.
La Figura 2 demuestra un rendimiento ejemplar de proteína de SUMO-GT soluble producida por fermentación en comparación con la proteína GT producida mediante el método del matraz de agitación.
DEFINICIONES
Para que la presente invención se entienda más fácilmente, se definen primero ciertos términos. Las definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se establecen a lo largo de la especificación.
Aproximadamente: como se usa en la presente, el término "aproximadamente" o "alrededor de", según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un valor posible).
Cultivo por lotes: como se usa en la presente, el término "cultivo por lotes" se refiere a un método de cultivar células en el que todos los componentes que se usarán en última instancia en el cultivo de las células, incluyendo el medio (ver definición de "medio" a continuación) así como las propias células, se proporcionan al comienzo del proceso de cultivo. Por tanto, un cultivo por lotes se refiere típicamente a un cultivo al que se le permite progresar desde la inoculación hasta la conclusión sin realimentar las células cultivadas con medio nuevo. Un cultivo por lotes se detiene típicamente en algún momento y las células y/o componentes en el medio se recogen y opcionalmente se purifican.
Biológicamente activo: Como se usa en la presente, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier sustancia que tiene actividad en un sistema biológico (por ejemplo, cultivo celular, organismo, etc.). Por ejemplo, una sustancia que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera que es biológicamente activa. La actividad biológica también puede determinarse mediante ensayos in vitro (por ejemplo, ensayos enzimáticos in vitro como ensayos de liberación de sulfato). En realizaciones particulares, donde una proteína o polipéptido es biológicamente activo, a una porción de esa proteína o polipéptido que comparte por lo menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se hace referencia típicamente como porción "biológicamente activa". En algunas realizaciones, una proteína se produce y/o purifica a partir de un sistema de cultivo celular, que muestra actividad biológica cuando se administra a un sujeto. En algunas realizaciones, una proteína requiere procesamiento adicional para volverse biológicamente activa. En algunas realizaciones, una proteína requiere una modificación postraduccional como, pero no limitado a, glicosilación (por ejemplo, sialización), farnisilación, escisión, plegamiento, conversión de formilglicina y combinaciones de las mismas, para volverse biológicamente activa. En algunas realizaciones, una proteína producida como proforma (es decir, forma inmadura), puede requerir una modificación adicional para volverse biológicamente activa.
Biorreactor: Como se usa en la presente, el término "biorreactor" se refiere a un recipiente usado para el crecimiento de un cultivo de células huésped. Un biorreactor puede ser de cualquier tamaño siempre que sea útil para el cultivo de células de mamífero. Típicamente, un biorreactor tendrá por lo menos 1 litro y puede tener 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.0000 litros o más, o cualquier volumen intermedio. Las condiciones internas de un biorreactor, incluyendo, pero sin limitarse a, pH, osmolaridad, saturación de CO2, saturación de O2, temperatura y combinaciones de los mismos, se controlan típicamente durante el período de cultivo. Un biorreactor puede estar compuesto de cualquier material que sea adecuado para mantener las células en el medio en las condiciones de cultivo de la presente invención, incluyendo vidrio, plástico o metal. En algunas realizaciones, puede usarse un biorreactor para realizar un cultivo de células animales. En algunas realizaciones, puede usarse un biorreactor para realizar un cultivo de células de mamífero. En algunas realizaciones, puede usarse un biorreactor con células y/o líneas celulares derivadas de organismos como, pero no limitado a, células de mamífero, células de insectos, células bacterianas, células de levadura y células humanas. En algunas realizaciones, se usa un biorreactor para la producción de cultivos celulares a gran escala y tiene típicamente por lo menos 100 litros y puede tener de 200, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10.000, 12.0000 litros o más, o cualquier volumen intermedio. Un experto en la técnica conocerá y podrá elegir biorreactores adecuados para usar en la puesta en práctica de la presente invención.
Densidad celular: como se usa en la presente, el término "densidad celular" se refiere al número de células presentes en un volumen dado de medio.
Cultivo celular o cultivo: como se usa en la presente, estos términos se refieren a una población celular que ha crecido en un medio en condiciones adecuadas para la supervivencia y/o el crecimiento de la población celular. Como resultará evidente para los expertos en la técnica, estos términos, como se usan en la presente, pueden referirse a la combinación que comprende la población celular y el medio en el que se cultiva la población.
Cultivo: como se usa en la presente, el término "cultivo" o equivalentes gramaticales se refieren a un proceso de mantenimiento de las células en condiciones que favorecen el crecimiento o la supervivencia. En esta solicitud los términos "cultivo" y "cultivo celular" o cualquier sinónimo se usan indistintamente.
Recipiente de cultivo: como se usa en la presente, el término "recipiente de cultivo" se refiere a cualquier envase que pueda proporcionar un entorno aséptico para el cultivo de células. Los recipientes de cultivo ejemplares incluyen, entre otros, envases de vidrio, plástico o metal.
Expresión: como se usa en la presente, "expresión" de una secuencia de ácidos nucleicos se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de un plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, por transcripción); (2) procesamiento de una transcripción de ARN (por ejemplo, por corte y empalme, edición, formación de la caperuza 5' y/o formación del extremo 3'); (3) traducción de un ARN en un polipéptido o proteína; y/o (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína.
Cultivo por lotes alimentado: como se usa en la presente, el término "cultivo por lotes alimentado" se refiere a un método de cultivo de células en el que se proporcionan componentes adicionales al cultivo en algún momento posterior al comienzo del proceso de cultivo. Los componentes proporcionados típicamente comprenden suplementos nutricionales para las células que se han agotado durante el proceso de cultivo. Un cultivo por lotes alimentado se detiene típicamente en algún momento y las células y/o componentes en el medio se recogen y opcionalmente se purifican.
Homología: como se usa en la presente, el término "homología" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. En algunas realizaciones, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si sus secuencias son por lo menos un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idénticas. En algunas realizaciones, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si sus secuencias son por lo menos un 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% similares.
Identidad: Como se usa en la presente, el término "identidad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, puede realizarse alineando las dos secuencias con propósitos de comparación óptimos (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de ácidos nucleicos para un alineamiento óptimo y las secuencias no idénticas pueden descartarse con propósitos de comparación). En ciertas realizaciones, la longitud de una secuencia alineada con propósitos de comparación es por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 80%, por lo menos el 90%, por lo menos por lo menos el 95% o sustancialmente el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Luego se comparan los nucleótidos en las posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que debe introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4: 11-17), que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0) usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos pueden, alternativamente, determinarse usando el programa GAP en el paquete de software GCG usando una matriz NWSgapdna.CMP. Hay disponibles varios otros programas de alineación de secuencias y pueden usarse para determinar la identidad de secuencia como, por ejemplo, Clustal.
Densidad de células viables integradas: como se usa en la presente, el término "densidad de células viables integradas" se refiere a la densidad media de células viables en el transcurso del cultivo multiplicada por la cantidad de tiempo que ha transcurrido el cultivo. Suponiendo que la cantidad de polipéptido y/o proteína producida es proporcional al número de células viables presentes en el transcurso del cultivo, la densidad de células viables integradas es una herramienta útil para estimar la cantidad de polipéptido y/o proteína producida en el transcurso del cultivo.
Aislado: Como se usa en la presente, el término "aislado" se refiere a una sustancia y/o entidad que ha sido (1) separada de por lo menos algunos de los componentes con los que estaba asociada cuando se produjo inicialmente (ya sea en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) producida, preparada y/o fabricada por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden separarse de aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o más de aproximadamente el 99% de los otros componentes con los que se asociaron inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados tienen aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99%, o más de aproximadamente el 99% de pureza. Como se usa en la presente, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Como se usa en la presente, el cálculo del porcentaje de pureza de sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir excipientes (por ejemplo, tampón, solvente, agua, etc.)
Medio: Como se usa en la presente, el término "medio" se refiere a una solución que contiene nutrientes que nutren las células en crecimiento. Típicamente, estas soluciones proporcionan aminoácidos esenciales y no esenciales, vitaminas, fuentes de energía, lípidos y oligoelementos requeridos por la célula para un crecimiento y/o supervivencia mínimos. La solución también puede contener componentes que mejoran el crecimiento y/o la supervivencia por encima de la tasa mínima, incluyendo hormonas y factores de crecimiento. En algunas realizaciones, el medio se formula a un pH y una concentración de sal óptimos para la supervivencia y proliferación celular. En algunas realizaciones, el medio puede ser un "medio químicamente definido", un medio libre de suero que no contiene proteínas, hidrolizados o componentes de composición desconocida. En alguna realización, El medio químicamente definido está libre de componentes derivados de animales y todos los componentes del medio tienen una estructura química conocida. En algunas realizaciones, el medio puede ser un "medio a base de suero", un medio que ha sido suplementado con componentes derivados de animales como, pero no limitado a, suero de ternero fetal, suero de caballo, suero de cabra, suero de burro y/o combinaciones de los mismos.
Ácido nucleico: Como se usa en la presente, el término "ácido nucleico", en su sentido más amplio, se refiere a un compuesto y/o sustancia que es o puede incorporarse en una cadena de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que se incorpora o puede incorporarse en una cadena de oligonucleótidos mediante un enlace fosfodiéster. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a residuos de ácidos nucleicos individuales (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a una cadena de oligonucleótidos que comprende residuos de ácidos nucleicos individuales. Como se usa en la presente, los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" pueden usarse indistintamente. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" abarca ARN así como ADN y/o ADNc de cadena sencilla y/o doble. Además, los términos "ácido nucleico”, “ADN, “ARN”, y/o términos similares incluyen análogos de ácidos nucleicos, es decir análogos que tienen una estructura principal distinta de fosfodiéster. Por ejemplo, los denominados “ácidos nucleicos peptídicos”, que se conocen en la técnica y que tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster en la estructura principal, se consideran dentro del alcance de la presente invención. El término “secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos” incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas de cada uno y/o codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y/o ARN pueden incluir intrones. Los ácidos nucleicos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producirse usando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente purificarse, sintetizarse químicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moléculas sintetizadas químicamente, los ácidos nucleicos pueden comprender análogos de nucleósidos tales como análogos que tienen bases o azúcares modificados químicamente, modificaciones de la estructura principal, etc. Una secuencia de ácidos nucleicos se presenta en la dirección 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. El término "segmento de ácido nucleico" se usa en la presente para referirse a una secuencia de ácidos nucleicos que es una porción de una secuencia de ácidos nucleicos más larga. En muchas realizaciones, un segmento de ácido nucleico comprende por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es o comprende nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina); análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6) -metilguanina y 2-tiocitidina); bases modificadas químicamente; bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces de 5'-N-fosforamidita). En algunas realizaciones, la presente invención se dirige específicamente a "ácidos nucleicos no modificados", lo que significa ácidos nucleicos (por ejemplo, polinucleótidos y residuos, incluyendo nucleótidos y/o nucleósidos) que no han sido modificados químicamente para facilitar o lograr la administración.
Proceso de perfusión: Como se usa en la presente, el término "proceso de perfusión" se refiere a un método de cultivo de células en el que se proporcionan componentes adicionales de manera continua o semicontinua al cultivo después del comienzo del proceso de cultivo. Los componentes proporcionados comprenden típicamente suplementos nutricionales para las células que se han agotado durante el proceso de cultivo. Una parte de las células y/o componentes en el medio se recogen típicamente de manera continua o semicontinua y opcionalmente se purifican. Típicamente, a un proceso de cultivo celular que implica un proceso de perfusión se hace referencia como "cultivo de perfusión". Típicamente, los suplementos nutricionales se proporcionan en un medio nuevo durante un proceso de perfusión. En algunas realizaciones, un medio nuevo puede ser idéntico o similar al medio base usado en el proceso de cultivo celular. En algunas realizaciones, un medio nuevo puede ser diferente del medio base pero conteniendo los suplementos nutricionales deseados. En algunas realizaciones, un medio nuevo es un medio químicamente definido.
Siembra: como se usa en la presente, el término "siembra" se refiere al proceso de proporcionar un cultivo celular a un biorreactor u otro recipiente para la producción de cultivos celulares a gran escala. En algunas realizaciones se usa un "cultivo de siembra", en el que las células se han propagado en un recipiente de cultivo celular más pequeño, es decir, matraz de cultivo de tejidos, placa de cultivo de tejidos, frasco giratorio de cultivo de tejidos, etc., antes de la siembra. Alternativamente, en algunas realizaciones, las células pueden haber sido congeladas y descongeladas inmediatamente antes de proporcionarlas al biorreactor o recipiente. El término se refiere a cualquier número de células, incluyendo una única célula.
Sujeto: Como se usa en la presente, el término "sujeto" significa cualquier mamífero, incluyendo humanos. En ciertos casos de la presente divulgación, el sujeto es un adulto, un adolescente o un niño. En la presente divulgación también se contemplan la administración de las composiciones farmacéuticas y/o la realización de los métodos de tratamiento en el útero.
Vector, como se usa en la presente, "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que está asociada. En algunas realizaciones, los vectores son capaces de replicación extracromosómica y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están enlazados en una célula huésped, como una célula eucariota y/o procariota. A los vectores capaces de dirigir la expresión de genes enlazados operativamente se hace referencia en la presente como "vectores de expresión".
Densidad de células viables: como se usa en la presente, el término "densidad de células viables" se refiere al número de células vivas por unidad de volumen.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos y composiciones para la producción a gran escala de ARNm protegido usando la proteína de fusión SUMO-Guanilil Transferasa, como se define en las reivindicaciones.
Varios aspectos de la invención se describen con más detalle en las siguientes subsecciones. El uso de subsecciones no pretende limitar la invención. Cada subsección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario.
Proteína de fusión SUMO-guanilil transferasa
Modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO)
Como se usa en la presente, una etiqueta SUMO es cualquier proteína o una parte de una proteína que puede sustituir por lo menos la actividad parcial de una proteína de SUMO.
Las proteínas de SUMO son proteínas pequeñas que se une covalentemente n y se desprenden de otras proteínas para modificar las funciones de esas proteínas. La modificación de una proteína con una proteína de SUMO es una modificación postraduccional implicada en varios procesos celulares como el transporte nuclearcitosólico, regulación transcripcional, apoptosis, estabilidad proteica, respuesta al estrés y progresión a través del ciclo celular. Hay por lo menos 4 parálogos de SUMO en vertebrados, designados SUMO-1, SUMO-2, SUMO-3 y SUMO-4. SUMO-2 y SUMO-3 son estructural y funcionalmente muy similares y son distintos de SUMO-1. La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) abarca los aminoácidos 3-92 de una proteína de SUMO-3 de tipo salvaje o de origen natural típica y se muestra en la Tabla 1. Además, en la Tabla 1 también se proporciona una secuencia de ADN optimizada por codón que codifica la proteína se SUMO-3, como la SEQ ID NO: 5.
Tabla 1. Modificador pequeño similar a la ubiquitina
Figure imgf000007_0001
Por tanto, en algunas realizaciones, una proteína de SUMO es una proteína de SUMO-3 humana (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, la proteína de SUMO puede ser otro parámetro de SUMO, como SUMO-1, SUMO-2 o SUMO-4, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, una proteína de reemplazo adecuada puede ser un homólogo o un análogo de la proteína de SUMO-3 humana, como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, un homólogo o un análogo de la proteína de SUMO-3 puede ser una proteína de SUMO-3 modificada que contiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con una proteína de SUMO-3 de tipo salvaje o de origen natural (por ejemplo, SEQ ID NO: 1), mientras retiene una actividad sustancial de la proteína de SUMO-3. Por tanto, en algunas realizaciones, una enzima adecuada para la presente invención es sustancialmente homóloga a una proteína de SUMO-3 de tipo salvaje o de origen natural (SEQ ID NO: 1) como se define en las reivindicaciones. En algunos casos, una enzima adecuada para la presente divulgación tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una enzima adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a una proteína de SUMO-3 de tipo salvaje o de origen natural (SEQ ID NO: 1) como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, una proteína adecuada para la presente invención contiene un fragmento o una porción de una proteína de SUMO, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la proteína de SUMO comprende SUMO-1 humana, SUMO-2 humana, SUMO-3 humana, cualquiera de SUMO-1 a SUMO-8 de Arabidopsis Zhalania, SUMO de tomate, cualquiera de SUMO-1 a SUMO-3 de Xenopus laevis, Smt3 de Drosophila melanogasler, SMO-1 de Caenorhabdilis elegans, pMT3 de Schizosaccharomyces pombe, SUMO de parásito de malaria Plasmodium falciparum, SUMO de moho Aspergillus nidulans, un equivalente de las mismas, un homólogo de las mismas o una combinación de las mismas, como se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, la proteína de SUMO está codificada por un ácido nucleico derivado de un organismo seleccionado del grupo que consiste de humanos, ratones, insectos, plantas, levaduras y otros organismos eucariotas, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la proteína de SUMO está codificada por un ácido nucleico derivado de un organismo seleccionado del grupo que consiste de Homo sapiens, Arabidopsis Zhalania, tomate, Xenopus laevis, Drosophila melanogasler, Caenorhabdilis elegans, Schizosaccharomyces pombe, Plasmo diumfalciparum, o Aspergillus nidulans, como se define en las reivindicaciones. En algunos casos, un ácido nucleico adecuado para la presente divulgación tiene una secuencia por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, un ácido nucleico adecuado para la presente invención es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico que codifica una proteína de SUMO-3 de tipo salvaje o de origen natural (SEQ ID NO: 5), como se define en las reivindicaciones.
Guanilil transferasa (GT)
Como se usa en la presente, una proteína de GT es cualquier proteína o porción de una proteína que pueda sustituir por lo menos la actividad parcial de la proteína de Guanilil Transferasa (GT) de origen natural. Como se usa en la presente, los términos "una proteína de GT" y "una enzima de GT" y equivalentes gramaticales se usan indistintamente.
La GT es una enzima derivada del sistema del virus Vaccinia que facilita la transferencia y metilación de una molécula de guanililo al extremo 5' de una molécula de ARN mensajero. Este proceso, conocido como protección de ARNm, está altamente regulado y es importante para la creación de ARNm estable y maduro capaz de someterse a traducción durante la síntesis de proteínas. La enzima GT comprende un heterodímero que incluye una "subunidad grande" (D1, aproximadamente 97 kDa) y una "subunidad pequeña (D12, aproximadamente 33 kDa). La GT proporciona tres funciones enzimáticas: actividad de fosfatasa (escisión del trifosfato 5' naciente de ARNm a difosfato), actividad de guanilil transferasa (incorporación de una molécula de GTP al extremo 5' de la fracción de ARNm) y actividad de metilación (incorporación de un grupo metilo en la posición N7 de la base de guanililo). En la Tabla 2 se muestran la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande (SEQ ID NO: 6) y la subunidad pequeña (SEQ ID NO: 7) de una proteína de GT típica de tipo salvaje o de origen natural. Además, en la Tabla 2 también se proporcionan las secuencias de ADN de optimizadas por codón que codifican las subunidades grande y pequeña de GT, como SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente.
Tabla 2. Guanilil transferasa
Figure imgf000009_0001
(continuación)
Figure imgf000010_0001
(continuación)
Figure imgf000011_0001
Por tanto, en algunas realizaciones, una enzima GT es un heterodímero que comprende subunidades grandes y pequeñas (SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7, respectivamente). En algunas realizaciones, la enzima GT de la invención puede ser un homólogo o análogo de una u otra de las subunidades grande y pequeña de GT, como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, un homólogo o análogo de la proteína de GT puede ser una proteína de GT modificada que contiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 6 y/o la SEQ ID NO: 7, mientras conserva una cantidad sustancial de actividad de la proteína de GT, como se define en las reivindicaciones. Por tanto, en algunas realizaciones, una enzima adecuada para la presente invención es sustancialmente homóloga a las subunidades grande y pequeña de la proteína GT (SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7), como se define en las reivindicaciones. En ciertos casos, una enzima adecuada para la presente divulgación tiene una secuencia de aminoácidos de por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 6. En algunos casos, una enzima adecuada para la presente divulgación tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, una enzima adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a las subunidades grande y pequeña de GT (SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7). En algunas realizaciones, una enzima adecuada para la presente invención contiene un fragmento o una porción de una proteína de GT, como se define en las reivindicaciones.
En algunas realizaciones, la proteína de GT está codificada por un ácido nucleico derivado de un virus seleccionado del grupo que consiste de virus Vaccinia, virus Rabbitpox, virus Cowpox, virus Taterapox, virus Monkeypox, virus de viruela principal, virus Camelpox, virus Ectromelia, virus de viruela menor, virus Orthopox, virus Raccoonpox, virus Skunkpox, virus Volepox, virus Yoka pox, virus Swinepox, virus de tumor de mono Yaba, virus Deerpox, virus Myxoma, virus Tanapox, virus Goatpox, virus de fibroma de conejo, virus de enfermedad de la piel de Lumpy, virus Sheeppox, virus Eptesipox, virus Squirrelpox, virus Molluscum contagiosum, virus Cotia, virus Orf, virus de estomatosis popular bovino, virus Pseudocowpox, virus Canarypox, virus Pidgeonpox, virus Penguinpox, y virus Fowlpoxs. En algunas realizaciones como se define en las reivindicaciones los ácidos nucleicos adecuados para la presente invención tienen una secuencia por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID No : 2. En algunas realizaciones como se define en las reivindicaciones los ácidos nucleicos adecuados para la presente invención tienen una secuencia por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones los ácidos nucleicos adecuados para la presente invención son sustancialmente idénticos a un ácido nucleico que codifica una proteína de GT (SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3).
Fusión SUMO-GT
Como se usa en la presente, una proteína de fusión SUMO-GT es cualquier proteína o porción de una proteína que comprende una proteína de SUMO enlazada covalentemente a una proteína de Guanilil Transferasa (GT), en donde la proteína de fusión puede sustituir por lo menos la actividad parcial de una proteína de Guanilil Transferasa (GT) de origen natural. Como se usa en la presente, los términos "una proteína de fusión SUMO-GT" y "una enzima de fusión SUMO-GT" y equivalentes gramaticales se usan indistintamente. En la Tabla 3 se muestra una secuencia de aminoácidos ejemplar de la fusión de SUMO y la subunidad grande de GT (SEQ ID NO: 8). Además, en la Tabla 3 también se proporciona una secuencia de ADN ejemplar que codifica la fusión de SUMO y la subunidad grande de GT, como SEQ ID NO: 4.
Tabla 3. Fusión SUMO-GT
Figure imgf000013_0001
continuación
Figure imgf000014_0001
(continuación)
Figure imgf000015_0001
En algunas realizaciones, la proteína de fusión SUMO-GT comprende la SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, la proteína de fusión SUMO-GT es un heterodímero que comprende la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 7, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la enzima de GT de la invención puede ser un homólogo o análogo de una u otra de las subunidades grande y pequeña de GT, como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, un homólogo o análogo de la proteína de fusión SUMO-GT puede ser una proteína de fusión SUMO-GT modificada que contiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 8 y/o la SEQ ID NO: 7, a la vez que mantiene una actividad sustancial de la proteína de GT, como se define en las reivindicaciones. Por tanto, en algunas realizaciones, una proteína de fusión SUMO-GT adecuada para la presente invención es sustancialmente homóloga al heterodímero que comprende la subunidad pequeña de GT (SEQ ID NO: 7) y la fusión de SUMO y la subunidad grande de GT (SEQ ID NO: 8). En algunos casos, una enzima adecuada para la presente divulgación tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, una enzima adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica al heterodímero que comprende la subunidad pequeña de GT (SEQ ID NO: 7) y la fusión de SUMO y la subunidad grande de GT (SEQ ID NO: 8), como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, una enzima adecuada para la presente invención contiene un fragmento o una porción de una proteína de GT covalentemente enlazada a una proteína de SUMO, como se define en las reivindicaciones.
Producción de proteína de fusión SUMO-GT
Células huésped
Como se usa en la presente, el término "células huésped" se refiere a células que pueden usarse para producir una proteína de fusión SUMO-GT. En particular, las células huésped son adecuadas para producir una proteína de fusión SUMO-GT a gran escala. En algunas realizaciones, las células huésped pueden producir la proteína de fusión SUMO-GT en una cantidad de o de más de aproximadamente 5 picogramos/célula/día (por ejemplo, más de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45)., 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 picogramos/celda/día). En algunas realizaciones, las células huésped pueden producir proteína de fusión SUMO-GT en una cantidad que varía entre aproximadamente 5-100 picogramos/célula/día (por ejemplo, aproximadamente 5-90 picogramos/célula/día, aproximadamente 5-80 picogramos/célula/día, aproximadamente 5-70 picogramos/célula/día, aproximadamente 5-60 picogramo/célula/día, aproximadamente 5-50 picogramo/célula/día, aproximadamente 5-40 picogramo/célula/día, aproximadamente 5-30 picogramo/célula/día, aproximadamente 10-90 picogramos/células/día, aproximadamente 10-80 picogramos/célula/día, aproximadamente 10-70 picogramos/célula/día, aproximadamente 10-60 picogramo/célula/día, aproximadamente 10-50 picogramo/célula/día, aproximadamente 10-40 picogramo/célula/día, aproximadamente 10-30 picogramo/célula/día, aproximadamente 20-90 picogramos/células/día, aproximadamente 20-80 picogramos/célula/día, aproximadamente 20-70 picogramos/célula/día, aproximadamente 20-60 picogramo/célula/día, aproximadamente 20-50 picogramo/célula/día, aproximadamente 20-40 picogramo/célula/día, aproximadamente 20-30 picogramo/célula/día).
Las células huésped adecuadas pueden derivarse de una variedad de organismos que incluyen, pero no se limitan a, bacterias, levaduras, insectos, plantas, aves (por ejemplo, sistemas aviares), anfibios y mamíferos. En algunas realizaciones, las células huésped no son células de mamífero. Los ejemplos no limitativos de células huésped no mamíferas adecuadas para la presente invención incluyen células y líneas celulares derivadas de Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Bacillus lichenifonnis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile para bacterias; Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosacccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, y Yarrowia lipolytica para levaduras; Sodoptera frugiperda, Trichoplusis ni, Drosophila melangostery Manduca sexta para insectos; y Xenopus Laevis para anfibios.
En algunas realizaciones, las células huésped son células de mamífero. Cualquier célula de mamífero susceptible de cultivo celular y de expresión de polipéptidos puede utilizarse de acuerdo con la presente invención como célula huésped. Los ejemplos no limitativos de células de mamífero que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen células 293 de riñón embrionario humano (HEK293), células HeLa; línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/l, ECACC N°: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Países Bajos)); línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea celular de fibrosarcoma humana (por ejemplo, HT-1080); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino /- DHFR (c Ho , Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma de cuello uterino humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; una línea de hepatoma humano (Hep G2), una línea celular humana CAP y AGE1.HN, y un panel de glicotopos.
Además, puede utilizarse cualquier número de líneas celulares de hibridoma disponibles de acuerdo con la presente invención. Un experto en la técnica apreciará que las líneas celulares de hibridoma pueden tener diferentes requisitos de nutrición y/o pueden requerir diferentes condiciones de cultivo para un crecimiento y expresión de polipéptidos o proteínas óptimos, y podrán modificar las condiciones según sea necesario.
Vectores de expresión
Pueden usarse varios constructos de ácidos nucleicos para expresar la proteína de fusión SUMO-GT descrita en la presente en células huésped. Un constructo de vector adecuado incluye típicamente, además de las secuencias que codifican la proteína de fusión SUMO-GT (también denominadas transgén de fusión SUMO-GT), secuencias reguladoras, secuencias de control de genes, promotores, secuencias no codificantes y/u otras secuencias apropiadas para expresión de la proteína y, opcionalmente, para la replicación del constructo. Típicamente, la región codificante está enlazada operativamente con uno o más de estos componentes de ácidos nucleicos.
Las "secuencias reguladoras" se refieren típicamente a secuencias de nucleótidos localizadas en sentido ascendente (secuencias no codificantes 5'), dentro o en sentido descendente (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, potenciadores, secuencias no traducidas 5', secuencias líder de traducción, intrones y secuencias no traducidas 3' como secuencias de reconocimiento de poliadenilación. A veces, a las "secuencias reguladoras" también se hace referencia como "secuencias de control de genes".
"Promotor" se refiere típicamente a una secuencia de nucleótidos capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. En general, una secuencia codificante se localiza en 3' con respecto a una secuencia promotora. La secuencia promotora consiste de elementos en sentido ascendente proximales y más distales, estos últimos elementos a menudo denominados potenciadores. Por consiguiente, un "potenciador" es una secuencia de nucleótidos que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel o la especificidad tisular de un promotor. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de nucleótidos sintéticos. Los expertos en la técnica entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tipos de tejidos o células, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales.
Las "secuencias no codificantes 3' " se refieren típicamente a secuencias de nucleótidos localizadas en sentido descendente de una secuencia codificante e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar al procesamiento del ARNm o la expresión génica. La señal de poliadenilación se caracteriza habitualmente por afectar a la adición de tractos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm.
La "secuencia líder de la traducción" o "secuencias no codificantes 5' " se refiere típicamente a una secuencia de nucleótidos localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificante. La secuencia líder de la traducción está presente en el ARNm completamente procesado en sentido ascendente de la secuencia de inicio de traducción. La secuencia líder de la traducción puede afectar al procesamiento de la transcripción primaria a ARNm, la estabilidad del ARNm o la eficiencia de la traducción.
Típicamente, el término "enlazado operativamente" se refiere a la asociación de dos o más fragmentos de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico de tal manera que la función de uno se ve afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor está enlazado operativamente con una secuencia codificante cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden enlazarse operativamente a secuencias reguladoras en orientación de sentido o antisentido.
La región codificante de un transgén puede incluir una o más mutaciones silenciosas para optimizar el uso de codones para un tipo de célula particular. Por ejemplo, los codones de un transgén de fusión SUMO-GT pueden optimizarse para la expresión en una célula bacteriana. En algunas realizaciones, los codones de un transgén de fusión SUMO-GT pueden optimizarse para la expresión en una célula de E. coli. En algunas realizaciones, los codones de un transgén de fusión SUMO-GT pueden optimizarse para la expresión en una célula de mamífero. En algunas realizaciones, los codones de un transgén de fusión SUMO-GT pueden optimizarse para la expresión en una célula humana.
Opcionalmente, un constructo puede contener componentes adicionales como uno o más de los siguientes: un sitio de corte y empalme, una secuencia potenciadora, un gen marcador seleccionable bajo el control de un promotor apropiado, un gen marcador amplificable bajo el control de un promotor apropiado, y una región de unión a la matriz (MAR) u otro elemento conocido en la técnica que mejora la expresión de la región donde se inserta.
Una vez transfectado o transducido en células huésped, un vector adecuado puede expresarse extracromosómicamente (episómicamente) o integrarse en el genoma de la célula huésped.
En algunas realizaciones, un constructo de ADN que se integra en el genoma de la célula, necesita incluir solo las secuencias de ácidos nucleicos transgénicos. En ese caso, la expresión del transgén está típicamente controlada por las secuencias reguladoras en el sitio de integración. Opcionalmente, puede incluir varias secuencias reguladoras adicionales descritas en la presente.
Medio y condiciones de cultivo
Los términos "medio" y "medio de cultivo" como se usan en la presente se refieren a una clase general de solución que contiene nutrientes adecuados para mantener y/o hacer crecer las células in vitro. Típicamente, las soluciones de medio proporcionan, sin limitación, aminoácidos esenciales y no esenciales, vitaminas, fuentes de energía, lípidos y oligoelementos requeridos por la célula para por lo menos un crecimiento y/o supervivencia mínimos. En otras realizaciones, el medio puede contener un aminoácido o aminoácidos derivados de cualquier fuente o método conocido en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, un aminoácido o aminoácidos derivados de la adición o adiciones de un solo aminoácido o de una adición o adiciones de peptona o hidrolizado de proteína (incluyendo fuentes animales o vegetales). Vitaminas como, pero no limitadas a, biotina, pantotenato, cloruro de colina, ácido fólico, mioinositol, niacinamida, piridoxina, riboflavina, vitamina B12, tiamina, putrescina y/o combinaciones de las mismas. Sales como, pero no limitadas a, CaCl2 , KCl, MgCl2, NaCl, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico, selenito de sodio, CuSO4, ZnCl2 y/o combinaciones de las mismas. Ácidos grasos como, pero no limitados a, ácido araquidónico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, así como metil-beta-ciclodextrina y/o combinaciones de los mismos). En algunas realizaciones, el medio comprende componentes adicionales como glucosa, glutamina, piruvato de sodio, insulina o etanolamina, un agente protector como Pluronic F68. En algunas realizaciones, el medio también puede contener componentes que mejoran el crecimiento y/o la supervivencia por encima de la tasa mínima, incluyendo hormonas y factores de crecimiento. El medio también puede comprender uno o más agentes de tamponamiento. Los agentes de tamponamiento pueden diseñarse y/o seleccionarse para mantener el cultivo a un pH particular (por ejemplo, un pH fisiológico (por ejemplo, pH 6,8 a pH 7,4)). En la técnica se conocen una variedad de tampones adecuados para cultivar células y pueden usarse en los métodos. Los tampones adecuados (por ejemplo, tampones de bicarbonato, tampón HEPES, tampones de Good, etc.) son aquellos que tienen la capacidad y eficiencia para mantener el pH fisiológico a pesar de los cambios en la concentración de dióxido de carbono asociados con la respiración celular. La solución se formula preferiblemente a un pH y una concentración de sal óptimos para la supervivencia y proliferación celular.
En algunas realizaciones, el medio puede ser un medio químicamente definido. Como se usa en la presente, el término "medio nutritivo químicamente definido " se refiere a un medio del cual se conocen sustancialmente todos los componentes químicos. En algunas realizaciones, un medio nutriente químicamente definido está libre de componentes derivados de animales. En algunos casos, un medio químicamente definido comprende una o más proteínas (por ejemplo, factores de crecimiento de proteínas o citoquinas). En algunos casos, un medio nutritivo químicamente definido comprende uno o más hidrolizados de proteínas. En otros casos, un medio nutritivo químicamente definido es un medio libre de proteínas, es decir, un medio libre de suero que no contiene proteínas, hidrolizados o componentes de composición desconocida.
Típicamente, puede prepararse un medio químicamente definido combinando varios componentes individuales como, por ejemplo, aminoácidos esenciales y no esenciales, vitaminas, fuentes de energía, lípidos, sales, agentes de tamponamiento y oligoelementos, en un peso o porcentajes o relaciones molares predeterminados. Medios libres de suero ejemplares, en particular, definidos químicamente se describen en la Publicación de Estados Unidos N° 2006/0148074.
En algunas realizaciones, un medio químicamente definido adecuado para la presente invención es un medio disponible comercialmente como, pero no limitado a, Terrific Broth, Cinnabar, 2xYT o LB. En algunas realizaciones, un medio químicamente definido adecuado para la presente invención es una mezcla de uno o más medios químicamente definidos disponibles comercialmente. En varias realizaciones, un medio adecuado es una mezcla de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más medios químicamente definidos disponibles comercialmente. En algunas realizaciones, cada medio individual químicamente definido disponible comercialmente (por ejemplo, como los descritos en la presente) constituye, en peso, un 1%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 12,5%, 15%, 20%, 25 %, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de la mezcla. Las proporciones entre cada medio componente individual pueden determinarse mediante el porcentaje en peso relativo presente en la mezcla. En algunas realizaciones, la expresión de proteínas aumenta con la adición de IPTG para reprimir el promotor.
En algunas realizaciones, un medio químicamente definido puede suplementarse con uno o más componentes derivados de animales. Tales componentes derivados de animales incluyen, pero no se limitan a, suero de ternero fetal, suero de caballo, suero de cabra, suero de burro, suero humano y proteínas derivadas de suero como albúmina (por ejemplo, albúmina de suero bovino o albúmina de suero humano).
La presente invención proporciona un método para producir proteína de fusión SUMO-GT a gran escala, como se define en las reivindicaciones. Los procedimientos a gran escala típicos para producir un polipéptido de fusión de interés incluyen cultivos por lotes y cultivos por lotes alimentados. Los procesos de cultivo por lotes comprenden tradicionalmente la inoculación de un cultivo de producción a gran escala con un cultivo de semillas de una densidad celular particular, hacer crecer las células en condiciones (por ejemplo, medio de cultivo, pH y temperatura adecuados) propicias para el crecimiento, la viabilidad y/o productividad celular, recoger el cultivo cuando las células alcanzan una densidad celular específica, y purificando el polipéptido expresado. Los procedimientos de cultivo por lotes alimentados incluyen un paso o pasos adicionales para suplementar el cultivo por lotes con nutrientes y otros componentes que se consumen durante el crecimiento de las células. En algunas realizaciones, un método de producción a gran escala de acuerdo con la presente invención usa un sistema de cultivo por lotes alimentado.
Purificación de la proteína de fusión SUMO-GT expresada
Pueden usarse varios métodos para purificar o aislar la proteína de fusión SUMO-GT producida de acuerdo con los varios métodos descritos en la presente. En algunas realizaciones, la proteína de fusión SUMO-GT expresada se secreta en el medio y, por tanto, las células y otros sólidos pueden eliminarse, por ejemplo, mediante centrifugación o filtración, como un primer paso en el proceso de purificación. Alternativa o adicionalmente, la proteína de fusión SUMO-GT expresada se une a la superficie de la célula huésped. En esta realización, las células huésped (por ejemplo, células bacterianas) que expresan el polipéptido o proteína se lisan para su purificación. La lisis de las células huésped (por ejemplo, células bacterianas) puede lograrse mediante cualquier número de medios bien conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo la alteración física por perlas de vidrio y la exposición a condiciones de pH alto.
La proteína de fusión SUMO-GT puede aislarse y purificarse mediante métodos estándar que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, por afinidad, de exclusión por tamaño, y de hidroxiapatita), filtración en gel, centrifugación o solubilidad diferencial, precipitación con etanol o por cualquier otra técnica disponible para la purificación de proteínas (ver, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2a Edición, Springer-Verlag, Nueva York, 1987; Higgins, S.J. y Hames, BD (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; y Deutscher, M. P., Simon, M. I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997). Para la cromatografía de inmunoafinidad en particular, la proteína puede aislarse uniéndola a una columna de afinidad que comprende anticuerpos que se generaron contra esa proteína y se fijaron a un soporte estacionario. Pueden añadirse inhibidores de proteasa como fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF), leupeptina, pepstatina o aprotinina en cualquiera o en todas las etapas para reducir o eliminar la degradación del polipéptido o proteína durante el proceso de purificación. Los inhibidores de proteasas son particularmente deseables cuando las células deben lisarse para aislar y purificar el polipéptido o proteína expresado.
Solubilidad
Pueden usarse varios métodos para determinar la solubilidad de una proteína en un sistema de expresión. En un método ejemplar, las bacterias se centrifugan y vuelven a suspender en un tampón de lisis suave que contiene IGEPAL al 1% e inhibidores de proteasa. La lisis se apoya en la congelación y descongelación repetidas de las bacterias. La fracción soluble y la insoluble se separan por centrifugación. Para determinar la cantidad total de proteína recombinante, se centrifuga el mismo volumen de cultivo bacteriano y se lisa en la misma cantidad de tampón de lisis que contiene IGEPAL al 1% y SDS al 0,1%. Las proteínas solubles y totales se analizan mediante SDS-PAGE, con transferencia western si es necesario. En algunas realizaciones, el sistema de expresión es E. coli. En algunas realizaciones, la solubilidad de GT mejora cuando se ha producido como una proteína de fusión. En algunas realizaciones, la proteína de fusión es una proteína de fusión SUMO-GT. En algunas realizaciones, la proteína de fusión SUMO-GT tiene una solubilidad aumentada en comparación con la proteína GT sin fusión. En algunas realizaciones, la solubilidad aumentada de la proteína de fusión SUMO-GT en comparación con la proteína GT sin fusión se observa durante la producción en matraz de agitación de la proteína de fusión SUMO-GT. En algunas realizaciones, la solubilidad aumentada de la proteína de fusión SUMO-GT en comparación con la proteína GT sin fusión se observa durante la producción de fermentación de la proteína de fusión SUMO-GT.
Uso de fusión SUMO-GT en la protección de ARNm
Producción de ARNm protegidos
De acuerdo con la presente invención, una proteína de fusión SUMO-GT descrita en la presente puede usarse para producir ARNm protegidos mediante transcripción in vitro, como se define en las reivindicaciones. En la técnica se encuentran disponibles varios ensayos de transcripción in vitro y pueden usarse para poner en práctica la presente invención. Por ejemplo, la transcripción in vitro fue desarrollada originalmente por Krieg y Melton (METHODS ENZYMOL., 1987, 155: 397-415) para la síntesis de ARN usando una polimerasa de fago de ARN. Típicamente, estas reacciones incluyen por lo menos una ARN polimerasa de fagos (T7, T3 o SP6), una plantilla de ADN que contiene un promotor de la polimerasa de fagos, nucleótidos (ATP, CTP, GTP y UTP) y un tampón que contiene una sal de magnesio. Los rendimientos de la síntesis de ARN pueden optimizarse aumentando las concentraciones de nucleótidos, ajustando las concentraciones de magnesio e incluyendo pirofosfatasa inorgánica (Patente de Estados Unidos N° 5.256.555; Gurevich et al., ANAL. BIOCHEM. 195: 207-213 (1991); Sampson, J.R. y Uhlenbeck, O.C., PROC. NATL. ACAD. SCI. ESTADOS UNIDOS. 85, 1033-1037 (1988); Wyatt, J.R. et al., BIOTECHNIQUES, 11: 764-769 (1991)). El ARN sintetizado en estas reacciones se caracteriza habitualmente por un nucleótido 5' terminal que tiene un trifosfato en la posición 5' de la ribosa. Típicamente, dependiendo de la combinación de ARN polimerasa y promotor usada, este nucleótido es una guanosina, aunque puede ser una adenosina (ver, por ejemplo, Coleman, T.M., et al., NUCLEIC ACIDS RES., 32: e14 (2004)). En estas reacciones, los cuatro nucleótidos se incluyen típicamente en concentraciones equimolares y ninguno de ellos es limitativo.
Algunas realizaciones de la invención son reacciones por lotes, es decir, todos los componentes se combinan y luego se incuban a aproximadamente 37° C para promover la polimerización del ARN hasta que termina la reacción. Típicamente, se usa una reacción por lotes por conveniencia y para obtener tanto ARN como sea necesario de tales reacciones para sus experimentos. En algunas realizaciones, se usa un sistema de "lotes alimentado" (ver, por ejemplo, JEFFREY A. KERN, BATCH AND FED-BATCH STRATEGIES FOR LARGE-SCALE PRODUCTION OF RNA BY IN VITRO TRANSACTION (Universidad de Colorado) (1997)) para aumentar la eficiencia de la reacción de transcripción in vitro. Todos los componentes se combinan, pero luego se añaden cantidades adicionales de algunos de los reactivos a lo largo del tiempo, como los nucleótidos y el magnesio, para tratar de mantener las condiciones de reacción constantes. Además, en algunas realizaciones, el pH de la reacción puede mantenerse a 7,4 monitorizándolo a lo largo del tiempo y añadiendo KOH como sea necesario.
Para sintetizar un ARN protegido por transcripción in vitro, se incluye un análogo de caperuza (por ejemplo, N-7 metil GpppG; es decir, m7GpppG) en la reacción de transcripción. En algunas realizaciones, el análogo de caperuza se incorporará en el extremo terminal 5' por la enzima guanilil transferasa. La guanilil transferasa es una proteína de fusión. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de guanilil transferasa se forma cuando una guanilil transferasa se enlaza covalentemente con una proteína de SUMO. En algunas realizaciones, el análogo de caperuza se incorporará solo en el extremo terminal 5' porque no tiene un trifosfato 5'. En algunas realizaciones que usan una ARN polimerasa T7, T3 y SP6, el nucleótido 1 de sus promotores respectivos suele ser un residuo G y si tanto GTP como m7GpppG están presentes en concentraciones iguales en la reacción de transcripción, entonces cada uno tiene la misma probabilidad de incorporarse en la posición 1. En algunas realizaciones, m7GpppG está presente en estas reacciones a concentraciones varias veces más altas que GTP para aumentar las posibilidades de que una transcripción tenga una caperuza 5'. En algunas realizaciones, se usa un kit mMESSAGE mMACHINE® (N° de Cat.1344, Ambion, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, donde se recomienda que la proporción de caperuza a GTP sea de 4:1 (6 mM: 1,5 mM). En algunas realizaciones, a medida que aumenta la proporción del análogo de caperuza a GTP en la reacción, la proporción de ARN protegido o no protegido aumenta proporcionalmente. Las consideraciones de la eficiencia de la protección deben equilibrarse con las consideraciones de rendimiento. Aumentar la proporción de análogo de caperuza a GTP en la reacción de transcripción produce rendimientos más bajos de ARN total porque la concentración de GTP se vuelve limitante cuando se mantiene constante la concentración total de caperuza y GTP. Por tanto, el rendimiento final de ARN depende de la concentración de GTP, que es necesaria para el alargamiento de la transcripción. Los otros nucleótidos (ATP, CTP, UTP) están presentes en exceso.
En realizaciones particulares, los ARNm se sintetizan mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN plasmídico que codifica un gen de elección. En algunas realizaciones, la transcripción in vitro incluye la adición de una estructura de caperuza 5', Cap1 (FIG. 1B), que tiene un residuo de 2'-O-metilo en el grupo 2' OH del anillo de ribosa de la base 1, mediante conjugación enzimática de GTP mediante una guanilil transferasa. En algunas realizaciones, la transcripción in vitro incluye la adición de una estructura de caperuza 5', CapO (FIG. 1A), que carece del residuo de 2'-O-metilo, por conjugación enzimática de GTP mediante una guanilil transferasa. En algunas realizaciones, la transcripción in vitro incluye la adición de una caperuza 5' de cualquiera de las estructuras de caperuza divulgadas en la presente mediante conjugación enzimática de GTP mediante una guanilil transferasa.
Eficiencia de la protección
La presente invención aumenta significativamente la eficacia de la protección. En algunas realizaciones, el uso de una proteína de fusión SUMO-GT en un ensayo de protección in vitro da como resultado por lo menos aproximadamente un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de ARNm protegido. En algunas realizaciones, el uso de una proteína de fusión SUMO-GT en un ensayo de protección in vitro da como resultado un sustancialmente un 100% de ARNm protegido. En algunas realizaciones, el uso de una proteína de fusión SUMO-GT en un ensayo de protección in vitro da como resultado un aumento de la eficacia de protección del ARNm en por lo menos aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 1 vez, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces o 5 veces en comparación con un ensayo de control usando una proteína GT sin fusión pero en condiciones por lo demás idénticas.
Además, la presente invención permite la producción a gran escala de ARNm protegido con alta eficacia. En algunas realizaciones, el ARNm protegido se produce a una escala de o más de 1 gramo, 5 gramos, 10 gramos, 15 gramos, 20 gramos, 25 gramos, 30 gramos, 35 gramos, 40 gramos, 45 gramos, 50 gramos, 75 gramos, 100 gramos, 150 gramos, 200 gramos, 250 gramos, 300 gramos, 350 gramos, 400 gramos, 450 gramos, 500 gramos, 550 gramos, 600 gramos, 650 gramos, 700 gramos, 750 gramos, 800 gramos, 850 gramos, 900 gramos, 950 gramos, 1 kg, 2,5 kg, 5 kg, 7,5 kg, 10 kg, 25 kg, 50 kg, 75 kg o 100 kg por lote.
En la técnica se conocen métodos para estimar la eficacia de la protección. Por ejemplo, la ARN polimerasa T7 puede incubarse con un dinucleótido de caperuza, los cuatro trifosfatos de ribonucleótidos, [a-32P] GTP y una plantilla de ADN corta en la que G es el primer ribonucleótido especificado después del promotor (ver Grudzien, E. et al., "Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNA with high translation efficiency", RNA, 10: 1479-1487 (2004)). Cualquier nucleótido en el lado 5' de un residuo G adquiere un grupo fosfato 3’ marcado con 32P después de la digestión con RNasa T2 por transferencia al vecino más cercano. Luego se usa cromatografía de intercambio aniónico para resolver los nucleósidos 3'-monofosfatos marcados, que resultan de las posiciones internas en el ARN, de los productos del extremo 5' terminal. Los productos del del extremo 5’ terminal son de dos tipos. Los ARN sin proteger producen guanosina 5'-trifosfato 3'-monofosfato marcado (p3Gp*; en el que * indica el grupo fosfato marcado). Los ARN protegidos producen varias estructuras 5’ terminales, dependiendo de la naturaleza del análogo de caperuza usado (m7Gp3Gp* y Gp3m7Gp* cuando el análogo de caperuza es m7Gp3G).
En la WO 2014/152673 se proporcionan métodos mejorados para cuantificar directamente la eficiencia de protección de ARNm en una muestra (por ejemplo, una muestra alícuota representativa de una reacción de síntesis in vitro). Algunas realizaciones comprenden el uso de una sustancia de unión específica de la caperuza en condiciones que permiten la formación de un complejo entre la sustancia de unión específica de la caperuza y el ARNm protegido. La formación de un complejo entre la sustancia de unión específica de la caperuza y el ARNm protegido permite la determinación cuantitativa de la cantidad del complejo (es decir, ARNm protegidos) con respecto a un control positivo de productos protegidos o un control negativo de productos no protegidos. En otras palabras, la unión indica la cantidad de objetivos de ARNm protegidos en la muestra y la eficacia de la protección en una reacción de la que se deriva la muestra. Por tanto, en algunas realizaciones, el paso de determinar cuantitativamente la cantidad del complejo comprende realizar un ensayo de tipo ELISA en donde la sustancia de unión específica de caperuza es un anticuerpo u otra proteína que se une específicamente a una caperuza de ARNm. La formación de complejos puede cuantificarse mediante la adición de un agente de detección específico para la sustancia de unión específica de la caperuza (por ejemplo, un anticuerpo anti-ratón de cabra que se une a un anticuerpo anti-m7G de ratón) y que produce una señal directamente proporcional a la cantidad de ARNm protegido.
Pueden usarse realizaciones de la invención para cuantificar la eficacia de protección de una amplia variedad de especies de ARN, incluyendo ARNm transcrito in vitro, ARNm eucariota aislado y ARN viral.
En la WO 2014/152659 se proporcionan métodos mejorados adicionales para cuantificar directamente la eficiencia de protección de ARNm en una muestra (por ejemplo, una muestra alícuota representativa de una reacción de síntesis in vitro). Algunas realizaciones de la invención comprenden métodos cromatográficos de cuantificación de la eficacia de protección del ARNm. Estos métodos se basan en parte en la idea de que la versatilidad de la manipulación enzimática puede usarse para aumentar la resolución de la separación cromatográfica de polinucleótidos. Por tanto, amplificando la potencia de la separación cromatográfica mediante la manipulación enzimática, las realizaciones de la invención aumentan la eficacia, la calidad y el rendimiento de la cuantificación. Por ejemplo, los métodos cromatográficos descritos en la presente no solo pueden cuantificar la eficacia de la caperuza, también pueden proporcionar información sobre la modificación de la caperuza (por ejemplo, el estado de metilación en posiciones particulares de la caperuza). Por tanto, las realizaciones de la invención pueden cuantificar simultáneamente la eficacia de la protección y la eficacia de la modificación de la caperuza (por ejemplo, la eficacia de la metilación). Esta cuantificación proporciona una caracterización importante del producto de fármaco de ARNm que tiene un impacto significativo sobre la producción de proteínas.
La invención se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Diseño de constructo de SUMO-GT
Se sintetizó un nuevo constructo que incorpora una etiqueta modificadora pequeña similar a ubiquitina (SUMO) enlazada covalentemente y coexpresada con la fracción de subunidades grandes de un heterodímero de guanilil transferasa (GT).
ADN modificador pequeño similar a ubiquitina (SUMO):
GAAGAGAAACCGAAAGAGGGCGTTAAGACCGAGAATGACCACATTAACCTGAA
GGTCGCTGGTCAAGATGGCAGCGTGGTGCAGTTTAAGATCAAGCGTCACACGCC
GTTGAGCAAGCTGATGAAGGCTTACTGCGAGCGTCAGGGTCTGAGCATGCGTCA
GATCCGCTTTCGTTTCGATGGCCAGCCGATCAATGAGACTGACACCCCAGCGCAA
CTGG (SEQ ID NO: 5)
ADN de subunidad grande de guanilil transferasa (GT):
AGATGGAAGATGAAGATACCATCGACGTCTTTCAGCAACAGACCGGTGGTATGG ATGCTAACGTCGTTAGCAGCAGCACCATTGCGACTTACATTGATGCACTGGCCAA AAACGCATCTGAGCTTGAGCAGCGCAGCACCGCCTACGAGATCAATAACGAATT GGAGCTGGTTTTCATTAAACCGCCGCTGATCACGCTGACGAACGTCGTGAACATT AGCACGATTCAAGAGAGCTTTATTCGTTTCACCGTTACCAATAAAGAAGGCGTGA AGATCCGTACCAAGATTCCGCTGAGCAAAGTGCATGGTCTGGACGTGAAAAATG TGCAGCTGGTTGATGCGATCGATAACATCGTGTGGGAGAAGAAATCTTTGGTCAC GGAAAATCGTCTGCACAAGGAATGTCTGCTGCGTCTGTCAACCGAAGAACGCCA CATCTTCCTGGACTACAAGAAGTATGGTTCCAGCATCCGTCTGGAACTGGTGAAC CTGATTCAGGCAAAGACCAAGAACTTCACCATTGACTTCAAACTGAAGTATTTCC TGGGCTCTGGTGCACAGAGCAAATCCAGCTTGTTGCACGCGATTAACCATCCGAA GAGCCGTCCGAATACGAGCCTGGAGATCGAATTCACGCCGCGTGATAACGAAAC CGTTCCGTACGATGAGCTGATTAAAGAACTGACGACGTTGAGCCGCCACATCTTT ATGGCCAGCCCGGAAAACGTGATCCTTAGCCCGCCTATCAATGCGCCGATTAAA ACCTTTATGTTACCGAAACAAGACATTGTGGGTCTGGACCTGGAAAACCTGTACG CGGTCACCAAAACGGACGGCATTCCGATCACGATTCGTGTTACCAGCAATGGTCT GTACTGCTATTTCACTCATTTGGGCTATATCATTCGTTATCCGGTGAAACGCATCA TTGATTCTGAGGTTGTCGTTTTCGGCGAAGCAGTCAAGGACAAGAATTGGACTGT GTACCTGATCAAATTGATTGAACCGGTTAACGCCATCAATGACCGCCTGGAAGA GTCGAAATATGTTGAAAGCAAACTGGTGGATATTTGTGATCGTATCGTGTTCAAG AGCAAGAAATATGAAGGCCCGTTCACCACGACCAGCGAAGTTGTTGACATGCTG AGCACCTATCTGCCGAAACAACCTGAGGGTGTGATTCTGTTTTACTCCAAGGGTC CGAAGAGC AAC ATTGATTTC AAAAT C AAGA AAGAGAAT ACC ATT GAT C AGACCG CCAACGTTGTGTTCCGCTATATGTCCAGCGAGCCTATCATTTTCGGTGAGTCGAG CATCTTTGTTGAATACAAAAAGTTTAGCAACGATAAGGGTTTTCCGAAAGAATAC GGTTCCGGTAAGATTGTGTTGTACAACGGCGTCAATTATCTGAACAACATCTACT GTCTGGAGTACATCAATACCCATAACGAAGTTGGCATTAAGTCTGTTGTCGTCCC GATCAAATTCATCGCGGAGTTCCTGGTTAACGGTGAGATTCTGAAGCCGCGTATT GATAAAACTATGAAATACATTAACTCCGAAGATTACTACGGTAATCAGCATAAC ATCATCGTCGAGCACTTGCGTGATCAAAGCATTAAGATCGGTGACATCTTTAACG AAGATAAGCTGAGCGATGTAGGCCACCAGTATGCGAACAATGACAAATTTCGCC TGAATCCGGAAGTCAGCTACTTTACGAATAAGCGCACCCGTGGTCCACTGGGTAT CCTGAGCAATTATGTTAAAACCCTGTTGATTTCCATGTACTGCTCCAAAACGTTCC TGGACGACAGCAACAAGCGCAAAGTTCTGGCGATCGACTTCGGTAATGGTGCCG ATCTGGAGAAGTACTTTTATGGTGAGATCGCATTGCTGGTTGCTACCGACCCGGA TGCAGATGCGATCGCCCGTGGCAACGAGCGTTACAATAAGCTGAATAGCGGTAT CAAGACCAAATACTACAAATTCGACTATATTCAAGAGACGATCCGCTCGGACAC CTTTGTATCCAGCGTGCGTGAGGTGTTTTACTTCGGTAAATTCAACATCATTGACT GGCAATTCGCCATTCACTATAGCTTTCACCCACGCCACTATGCGACGGTCATGAA CAACCTGTCTGAGCTGACCGCGAGCGGCGGTAAAGTTCTGATCACCACGATGGA CGGTGACAAGCTGTCTAAACTGACCGACAAAAAGACCTTCATTATTCACAAAAA TCTCCCGTCGAGCGAGAATTACATGTCCGTCGAAAAGATTGCGGACGACCGTATT GTTGTCTACAACCCGAGCACTATGTCGACCCCAATGACCGAGTATATCATCAAAA AGAATGACATTGTGCGTGTCTTTAATGAATACGGTTTTGTGCTGGTCGACAACGT CGATTTTGCGACCATCATCGAGAGAAGCAAGAAATTCATTAATGGCGCTTCTACG ATGGAAGATCGCCCGAGCACGCGTAACTTCTTTGAGCTGAATCGTGGCGCGATTA AGTGCGAGGGCCTGGACGTCGAGGATCTGCTGTCGTATTACGTGGTTTATGTGTT TAGCAAACGTTAATGA (SEQ ID NO: 2)
ADN de subunidad pequeña de guanilil transferasa (GT):
ATGGACGAAATTGTCAAGAATATCCGTGAAGGTACCCACGTTTTACTGCCATTCT ACGAGACGCTGCCGGAACTGAACCTGAGCCTGGGTAAAAGCCCTCTGCCGAGCC TGGAGTATGGTGCGAACTATTTTCTGCAGATTTCCCGTGTAAACGATTTGAACCG CATGCCGACGGACATGCTGAAACTGTTCACCCACGACATCATGCTGCCGGAATCT GATCTGGAT A A AGTTT AC GAGAT C TT GA A A AT C A ATT C AGT GA AGT ACT AT GGC C GTAGCACCAAGGCCGATGCGGTGGTCGCAGACCTGAGCGCGCGTAACAAACTGT TTAAACGTGAACGTGACGCAATTAAGAGCAATAACCATCTGACCGAGAACAATT TGTACATCAGCGACTACAAGATGTTGACTTTTGACGTGTTTCGTCCGCTGTTCGAC TTTGTTAATGAGAAATACTGCATTATCAAGCTGCCGACGTTGTTTGGTCGCGGCG TCATTGATACGATGCGCATTTACTGCTCTCTCTTCAAGAATGTGCGCCTGCTGAA GTGTGTCTCCGACAGCTGGCTGAAAGATAGCGCTATTATGGTTGCGAGCGACGTG TGTAAAAAGAACCTGGATCTGTTCATGAGCCACGTGAAGAGCGTTACCAAAAGC AGCAGCTGGAAAGACGTTAACAGCGTCCAGTTCTCCATTCTGAATAACCCGGTCG ATACCGAGTTTATCAACAAGTTCCTTGAATTCAGCAATCGCGTTTATGAGGCCCT GTATTACGTTCATAGCCTGCTGTATAGCTCCATGACCTCTGATAGCAAATCGATC GAGAATAAACACCAACGTCGTCTGGTGAAACTGCTGCTGTAATGA (SEQ ID NO:
3)
Constructo de ADN de subunidad grande de SUMO-GT con etiqueta His y conectar.
ATGGGCCATCATCATCACCATCACGGCAGCCTGCAAGAAGAGAAACCGAAAGAG GGCGTTAAGACCGAGAATGACCACATTAACCTGAAGGTCGCTGGTCAAGATGGC AGCGTGGTGCAGTTTAAGATCAAGCGTCACACGCCGTTGAGCAAGCTGATGAAG GCTTACTGCGAGCGTCAGGGTCTGAGCATGCGTCAGATCCGCTTTCGTTTCGATG GCCAGCCGATCAATGAGACTGACACCCCAGCGCAACTGGAGATGGAAGATGAAG ATACCATCGACGTCTTTCAGCAACAGACCGGTGGTATGGATGCTAACGTCGTTAG CAGCAGCACCATTGCGACTTACATTGATGCACTGGCCAAAAACGCATCTGAGCTT GAGCAGCGCAGCACCGCCTACGAGATCAATAACGAATTGGAGCTGGTTTTCATT AAACCGCCGCTGATCACGCTGACGAACGTCGTGAACATTAGCACGATTCAAGAG AGCTTTATTCGTTTCACCGTTACCAATAAAGAAGGCGTGAAGATCCGTACCAAGA TTCCGCTGAGCAAAGTGCATGGTCTGGACGTGAAAAATGTGCAGCTGGTTGATGC GATCGATAACATCGTGTGGGAGAAGAAATCTTTGGTCACGGAAAATCGTCTGCA CAAGGAATGTCTGCTGCGTCTGTCAACCGAAGAACGCCACATCTTCCTGGACTAC AAGAAGTATGGTTCCAGCATCCGTCTGGAACTGGTGAACCTGATTCAGGCAAAG ACCAAGAACTTCACCATTGACTTCAAACTGAAGTATTTCCTGGGCTCTGGTGCAC AGAGCAAATCCAGCTTGTTGCACGCGATTAACCATCCGAAGAGCCGTCCGAATA CGAGCCTGGAGATCGAATTCACGCCGCGTGATAACGAAACCGTTCCGTACGATG AGCTGATTAAAGAACTGACGACGTTGAGCCGCCACATCTTTATGGCCAGCCCGG AAAACGTGATCCTTAGCCCGCCTATCAATGCGCCGATTAAAACCTTTATGTTACC GAAACAAGACATTGTGGGTCTGGACCTGGAAAACCTGTACGCGGTCACCAAAAC GGACGGCATTCCGATCACGATTCGTGTTACCAGCAATGGTCTGTACTGCTATTTC ACTCATTTGGGCTATATCATTCGTTATCCGGTGAAACGCATCATTGATTCTGAGGT TGTCGTTTTCGGCGAAGCAGTCAAGGACAAGAATTGGACTGTGTACCTGATCAAA TTGATTGAACCGGTTAACGCCATCAATGACCGCCTGGAAGAGTCGAAATATGTTG AAAGCAAACTGGTGGATATTTGTGATCGTATCGTGTTCAAGAGCAAGAAATATG AAGGCCCGTTCACCACGACCAGCGAAGTTGTTGACATGCTGAGCACCTATCTGCC GAAAC AACCTGAGGGT GT GATTCTGTTTT ACTCC AAGGGTCCGAAGAGC AAC ATT GATTTCAAAATCAAGAAAGAGAATACCATTGATCAGACCGCCAACGTTGTGTTCC GCTATATGTCCAGCGAGCCTATCATTTTCGGTGAGTCGAGCATCTTTGTTGAATA CAAAAAGTTTAGCAACGATAAGGGTTTTCCGAAAGAATACGGTTCCGGTAAGAT TGTGTTGTACAACGGCGTCAATTATCTGAACAACATCTACTGTCTGGAGTACATC AATACCCATAACGAAGTTGGCATTAAGTCTGTTGTCGTCCCGATCAAATTCATCG CGGAGTTCCTGGTTAACGGTGAGATTCTGAAGCCGCGTATTGATAAAACTATGAA ATACATTAACTCCGAAGATTACTACGGTAATCAGCATAACATCATCGTCGAGCAC TTGCGTGATCAAAGCATTAAGATCGGTGACATCTTTAACGAAGATAAGCTGAGC GATGTAGGCCACCAGTATGCGAACAATGACAAATTTCGCCTGAATCCGGAAGTC AGCTACTTTACGAATAAGCGCACCCGTGGTCCACTGGGTATCCTGAGCAATTATG TTAAAACCCTGTTGATTTCCATGTACTGCTCCAAAACGTTCCTGGACGACAGCAA CAAGCGCAAAGTTCTGGCGATCGACTTCGGTAATGGTGCCGATCTGGAGAAGTA CTTTTATGGTGAGATCGCATTGCTGGTTGCTACCGACCCGGATGCAGATGCGATC GCCCGT GGC AACGAGCGTT AC AAT AAGCTGAAT AGCGGT AT C AAGACC A AAT AC TACAAATTCGACTATATTCAAGAGACGATCCGCTCGGACACCTTTGTATCCAGCG TGCGTGAGGTGTTTTACTTCGGTAAATTCAACATCATTGACTGGCAATTCGCCATT CACTATAGCTTTCACCCACGCCACTATGCGACGGTCATGAACAACCTGTCTGAGC TGACCGCGAGCGGCGGTAAAGTTCTGATCACCACGATGGACGGTGACAAGCTGT CTAAACTGACCGACAAAAAGACCTTCATTATTCACAAAAATCTCCCGTCGAGCGA GAATTACATGTCCGTCGAAAAGATTGCGGACGACCGTATTGTTGTCTACAACCCG AGCACTATGTCGACCCCAATGACCGAGTATATCATCAAAAAGAATGACATTGTG CGTGTCTTTAATGAATACGGTTTTGTGCTGGTCGACAACGTCGATTTTGCGACCAT CATCGAGAGAAGCAAGAAATTCATTAATGGCGCTTCTACGATGGAAGATCGCCC GAGCACGCGTAACTTCTTTGAGCTGAATCGTGGCGCGATTAAGTGCGAGGGCCTG GACGTCGAGGATCTGCTGTCGTATTACGTGGTTTATGTGTTTAGCAAACGTTAAT GA (SEQ ID NO: 4)
Proteína modificadora pequeña similar a ubiquitina (SUMO):
EEKPKEGVKTENDHINLKVAGQDGSVVQFKIKRHTPLSKLMKAYCERQGLSMRQIR FRFDGQPINETDTPAQLEMEDEDTIDVFQQQTGG (SEQ ID NO: 1)
Proteína de subunidad grande de guanilil transferasa (GT):
MDANVVSSSTIATYIDALAKNASELEQRSTAYEINNELELVFIKPPLITLTNVVNISTIQ ESFIRFTVTNKEGVKIRTKIPLSKYHGLDYKNYQLVDAIDNIYWEKKSLYTENRLHKE CLLRL S TEERHIFLD YKK Y GS SIRLEL VNLIQ AKTKNF TIDFKLK YFLGSG AQ SK S SLL H AINHPK SRPNT SLEIEF TPRDNET VP YDELIKELT TL SRHIFM ASPEN VIL SPPINAPIK TFMLPKQDIVGLDLENLYAVTKTDGIPITIRVTSNGLYCYFTHLGYIIRYPVKRIIDSEV VVFGEAVKDKNWTVYLIKLIEPVNAINDRLEESKYVESKLVDICDRIVFKSKKYEGPF TTT SE V VDML S T YLPKQPEG VILF Y SKGPK SNIDFKIKKENTIDQT AN V VFRYM S SEPI IFGESSIFVEYKKFSNDKGFPKEYGSGKIVLYNGVNYLNNIYCLEYINTHNEVGIKSVV VPDCFIAEFLVNGEILKPRIDKTMKYINSEDYYGNQHNIIVEHLRDQSIKIGDIFNEDKL SD VGHQ Y ANNDKFRLNPE V S YFTNKRTRGPLGIL SNYVKTLLISMY C SKTFLDD SNK RKVL AIDF GNGADLEKYF Y GEIALLVATDPD AD AIARGNERYNKLNSGIKTKYYKFD YIQETIRSDTF V S S VREVF YF GKFNIIDW QF A1HY SFHPRHY AT VMNNL SELT ASGGK VEITTMDGDKLSKLTDKKTFIIEtKNLPSSENYMSVEKIADDRIVVYNPSTMSTPMTEY IIKKNDIVRVFNEY GF VL VDNVDF ATIIERSKKFINGAS TMEDRP STRNFFELNRGAIK CEGLDVEDLLSYYVVYVFSKR (SEQ ID NO: 6)
Proteína de subunidad pequeña de guanilil transferasa (GT):
MDEIVKNIREGTHVLLPFYETLPELNLSLGKSPLPSLEYGANYFLQISRVNDLNRMPT DMLKLFTHDIMLPE SDLDK V YEILKIN S VK Y Y GRS TK AD A V V ADL S ARNKLFKRERD AIKSNNHLTENNL YISDYKMLTFD VFRPLFDF VNEKY CIIKLPTLF GRGVIDTMRIY C S LFKN VRLLKC V SD S WLKD S AIM V ASD V CKKNLDLFM SH VK S VTK S S S WKD VN S VQ F SILNNP VDTEFINKFLEF SNRVYEAL YYVHSLL YS SMT SD SK SIENKHQRRLVKLLL
(SEQ ID NO: 7)
Proteína de subunidad grande de SUMO-GT con etiqueta His y conector:
MGHHHHHHGSLQEEKPKEGVKTENDHINLKVAGQDGSVVQFKIKRHTPLSKLMKA YCERQGL SMRQIRFRFDGQPINETDTP AQLEMEDEDTID YFQQQTGGMD ANVVS S ST IATYIDALAKNASELEQRSTAYEINNELELVFIKPPLITLTNVVNISTIQESFIRFTVTNK EGVKIRTKIPL SK VHGLD VKN Y QL VD AIDNIVWEKK SL VTENRLHKECLLRL S TEER HIFLD YKK Y GS SIRLEL VNLIQ AKTKNFTIDFKLK YFL GS GAQ SK S SLLH AFNHPK SRP NTSLEIEFTPRDNETVPYDELIKELTTLSRHIFMASPENVILSPPINAPIKTFMLPKQDIV GLDLENL Y AVTKTDGIPITIRVT SNGL Y C YFTHLGYIIRYP VKRIID SE VVYF GE AVKD KNWT VYLIKLIEP VN AINDRLEE SK Y VE SKL VDICDRIVFK SKK YEGPF TTT SE V VDM LSTYLPKQPEGVILF YSKGPKSNIDFKIKKENTIDQTANVVFRYMS SEPIIFGES SIF VEY KKF SNDKGFPKE YGSGKIVL YNGVNYLNNIY CLE YINTHNE V GIKS VVVPIKFIAEFL VN GEILKPRIDKTMK YIN SED YY GNQHNIIVEHLRDQ SIKIGDIFNEDKL SD VGHQ Y A NNDKFRLNPEV SYFTNKRTRGPLGILSNYVKTLLISMYCSKTFLDDSNKRKVLAIDF G NGADLEKYFYGEIALLVATDPDADAIARGNERYNKLNSGIKTKYYKFDYIQETIRSDT FVSSVREVFYFGKFNIIDWQFA1HYSFHPRHYATVMNNLSELTASGGKVLITTMDGD KLSKLTDKKTFI1HKNLPSSENYMSVEKIADDRIVVYNPSTMSTPMTEYIIKKNDIVRV FNEYGFVLVDNVDFATIIERSKKFINGASTMEDRPSTRNFFELNRGAIKCEGLDVEDL LSYYVVYVFSKR (SEQ ID NO: 8)
Ejemplo 2: Producción de proteína de SUMO-GT
Matraz de agitación
La producción de la proteína de fusión SUMO-GT puede realizarse de acuerdo con métodos y procedimientos estándar. Por ejemplo, para probar y comparar la expresión de las proteínas de GT y de fusión SUMO-GT, se inoculó una sola colonia de la cepa E. coli Rosetta (Novagen) que contiene cada uno de los plásmidos SUMO-eGFP en 5 ml de medio Luria-Bertani (LB) que contiene 100 pg/ml de kanamicina y 30 pg/ml de cloranfenicol. Esta cepa se deriva de la cepa de lisógeno lambda DE3 y lleva una copia cromosómica de la ARN polimerasa T7 inducible por IPTG junto con ARNt en un plásmido a base de pACYC. Las células se cultivaron a 37° C durante la noche con agitación a 250 rpm. A la mañana siguiente, el cultivo de la noche se transfirió a 100 ml de medio nuevo para permitir un crecimiento exponencial. Cuando el valor de DO600 alcanzó -0,6-0,7, la expresión de proteínas se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM (isopropil-p-D-tiogalactopiranósido), seguido de un cultivo prolongado a 37° C durante 3 horas o 20° C durante la noche (unas 15 horas).
Después de que se hubiesen recogido las células de E. coli del medio LB (100 ml) mediante centrifugación (8.000xg durante 10 min a 4° C), los sedimentos celulares se suspendieron en 6 ml de tampón de lisis (PBS que contenía NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, Triton XI00 y PMSF 1 mM, pH 8,0). Las células se lisaron mediante sonicación (al 50% de salida para pulsos de 5x30 segundos). La sonicación se realizó con el tubo enfundado en hielo húmedo e intervalos de 1 minuto entre los ciclos del pulso para evitar el calentamiento. Después de que los lisados se hubiesen incubado con DNasa y RNasa (cada una a 40 pg/ml) durante 15 min para digerir los ácidos nucleicos, se centrifugaron a 20.000 g durante 30 min a 4° C y se recogió el sobrenadante (fracciones de proteína soluble). Los sedimentos se lavaron una vez con 6 ml del tampón de lisis para extraer más la fracción soluble; el lavado (6 ml) se combinó con el extracto anterior (6 ml) para hacer un volumen final de 12 ml para la muestra de proteínas soluble.
Se prepararon muestras de proteína insoluble a partir de cuerpos de inclusión de E. coli. Brevemente, después de que se eliminó el extracto que contenía proteínas solubles, los sedimentos que contenían cuerpos de inclusión se suspendieron en el tampón de solubilización desnaturalizante (Novagen) que contenía CAPS 50 mM (pH 11,0), N-laurilsarcosina al 0,3% y DTT 1 mM y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente con agitación. El extracto (fracción proteica insoluble) se obtuvo mediante centrifugación a alta velocidad (80.000xg durante 20 min a 4° C).
Para la detección de proteínas expresadas usando SDS-PAGE, se mezclaron 5 pl de las muestras preparadas anteriormente con 3 pl de tampón de muestra SDSPAGE que contenía SDS y p-mercaptoetanol y se calentaron a 95° C durante 5 min para facilitar la desnaturalización y reducción de proteínas. Las proteínas se visualizaron usando geles de poliacrilamida-SDS al 15% con tampón de ejecución de Tris-Glicina y tinción con azul

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir un oligonucleótido de ARNm o análogo de ARNm protegido, en donde un heterodímero que comprende una proteína de fusión facilita los pasos de transferir y metilar una molécula de guanililo al extremo 5' del oligonucleótido de ARNm o análogo de ARNm, en donde la proteína de fusión comprende una guanilil transferasa. y una proteína de molécula pequeña similar a ubiquitina (SUMO), en donde la proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos idéntica por lo menos en un 90% a la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 6.
2. El método de la reivindicación 1, en donde las secuencias de aminoácidos del heterodímero son por lo menos un 90% idénticas a la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8.
3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el ARNm protegido se produce a una escala igual o mayor de 1 g por lote.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la proteína de fusión tiene actividad de fosfatasa, actividad de guanilil transferasa y actividad de metilación comparables con respecto a una proteína de guanilil transferasa de tipo salvaje.
5. Un método para producir una guanilil transferasa por fermentación,
en donde la guanilil transferasa (i) comprende una proteína de fusión de guanilil transferasa que comprende una proteína de molécula pequeña similar a ubiquitina (SUMO) y (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7,
en donde el método comprende:
a) cultivar en un medio de fermentación un microorganismo que se transforma con por lo menos una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la guanilil transferasa, en donde la secuencia de ácidos nucleicos comprende una secuencia de nucleótidos de SUMO que codifica una secuencia de aminoácidos por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 1, en donde el cultivo se realiza usando un biorreactor de por lo menos 10 litros de volumen; y
b) recoger un producto producido en el paso de cultivo, en donde el producto es la guanilil transferasa que proporciona actividad de fosfatasa, actividad de guanilil transferasa y actividad de metilación y se usa en el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. El método de la reivindicación 5, en donde el cultivo se realiza usando un biorreactor de por lo menos 100 litros de volumen.
7. El método de la reivindicación 5, en donde la proteína de fusión de guanilil transferasa:
(a) tiene actividad de fosfatasa, actividad de guanilil transferasa y actividad de metilación comparables con respecto a una proteína de guanilil transferasa de tipo salvaje; o
(b) la proteína de fusión de guanilil transferasa comprende la SEQ ID NO: 8.
8. El método de la reivindicación 5, en donde el medio de fermentación se selecciona del grupo que consiste de Terrific Broth, Cinnabar, 2xYT y LB.
9. El método de la reivindicación 5, en donde el microorganismo es una bacteria.
10. El método de la reivindicación 5, en donde la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la guanilil transferasa es por lo menos un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3.
ES16795177T 2015-10-14 2016-10-14 Modificación de enzimas relacionados con el ARN para producción mejorada Active ES2862412T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562241350P 2015-10-14 2015-10-14
PCT/US2016/057044 WO2017066573A1 (en) 2015-10-14 2016-10-14 Modification of rna-related enzymes for enhanced production

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2862412T3 true ES2862412T3 (es) 2021-10-07

Family

ID=57288485

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16795177T Active ES2862412T3 (es) 2015-10-14 2016-10-14 Modificación de enzimas relacionados con el ARN para producción mejorada

Country Status (9)

Country Link
US (4) US10144942B2 (es)
EP (2) EP3878955A1 (es)
JP (2) JP6997704B2 (es)
CN (2) CN114686548A (es)
AU (1) AU2016338559B2 (es)
CA (1) CA3001852A1 (es)
ES (1) ES2862412T3 (es)
MA (1) MA56219A (es)
WO (1) WO2017066573A1 (es)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103748078B (zh) 2011-06-08 2016-11-09 夏尔人类遗传性治疗公司 可裂解脂质
CN111212905A (zh) 2017-08-18 2020-05-29 摩登纳特斯有限公司 Rna聚合酶变体
JP2022521094A (ja) 2019-02-20 2022-04-05 モデルナティエックス インコーポレイテッド 共転写キャッピング用ｒｎａポリメラーゼバリアント
CN112714795A (zh) * 2019-08-23 2021-04-27 新英格兰生物实验室公司 酶促rna加帽方法
CN116286562A (zh) * 2021-12-10 2023-06-23 虹摹生物科技(上海)有限公司 一种基因工程菌及其制备方法和应用
CN114369587B (zh) * 2021-12-25 2024-03-15 苏州瀚源新酶生物科技有限公司 牛痘病毒加帽酶突变体、重组载体、重组工程菌及其应用
CN114480346B (zh) * 2022-02-18 2023-07-21 嘉兴维亚生物科技有限公司 一种dna水解酶及其制备方法

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5256555A (en) 1991-12-20 1993-10-26 Ambion, Inc. Compositions and methods for increasing the yields of in vitro RNA transcription and other polynucleotide synthetic reactions
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
ES2231819T3 (es) 1995-06-07 2005-05-16 Inex Pharmaceuticals Corp Particulas de lipido-acido nucleico preparadas a traves de un intermedio complejo de lipido-acido nucleico hidrofobo y uso para transferir genes.
US5705385A (en) 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
EP1482031B1 (en) 1996-08-30 2015-10-28 Life Technologies Corporation Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
CA2445049A1 (en) * 2001-05-04 2002-11-14 Cornell Research Foundation, Inc. Rapidly cleavable sumo fusion protein expression system for difficult to express proteins
DK1519714T3 (da) 2002-06-28 2011-01-31 Protiva Biotherapeutics Inc Fremgangsmåde og apparat til fremstilling af liposomer
US7655413B2 (en) * 2003-06-26 2010-02-02 Lifesensors, Inc. Methods and compositions for enhanced protein expression and purification
EP1664316B1 (en) 2003-09-15 2012-08-29 Protiva Biotherapeutics Inc. Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof
ATE536418T1 (de) 2004-06-07 2011-12-15 Protiva Biotherapeutics Inc Lipidverkapselte interferenz-rna
EP1781593B1 (en) 2004-06-07 2011-12-14 Protiva Biotherapeutics Inc. Cationic lipids and methods of use
WO2006073976A2 (en) * 2004-12-30 2006-07-13 Lifesensors, Inc. Compositions, methods, and kits for enhancing protein expression, solubility and isolation
CA2628300C (en) 2005-11-02 2018-04-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified sirna molecules and uses thereof
CA2674304C (en) * 2006-12-29 2016-02-23 Lifesensors, Inc. Methods and compositions for enhanced protein expression and purification
US20090247608A1 (en) 2007-12-04 2009-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting Lipids
WO2009082817A1 (en) 2007-12-27 2009-07-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
WO2009088891A1 (en) 2008-01-02 2009-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Screening method for selected amino lipid-containing compositions
JP5788312B2 (ja) 2008-04-11 2015-09-30 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 標的リガンドをエンドソーム分解性成分と組み合わせることによる核酸の部位特異的送達
PL2279254T3 (pl) 2008-04-15 2017-11-30 Protiva Biotherapeutics Inc. Nowe preparaty lipidowe do dostarczania kwasów nukleinowych
EP2350043B9 (en) 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
KR102264822B1 (ko) 2008-11-10 2021-06-14 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
CA2750561C (en) 2009-01-26 2017-10-10 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein c-iii expression
CA3042927C (en) 2009-05-05 2022-05-17 Arbutus Biopharma Corporation Lipid compositions for the delivery of therapeutic agents
EA028860B1 (ru) 2009-06-10 2018-01-31 Арбутус Биофарма Корпорэйшн Улучшенная липидная композиция
WO2010147992A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for increasing efficacy of lipid formulated sirna
WO2011000108A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein b
US9018187B2 (en) 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US8716464B2 (en) 2009-07-20 2014-05-06 Thomas W. Geisbert Compositions and methods for silencing Ebola virus gene expression
RS58405B1 (sr) 2009-12-01 2019-04-30 Translate Bio Inc Stereoidni derivati za isporuku irnk u humanim genetskim oboljenjima
AU2010330814B2 (en) 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
EP2569276B1 (en) 2010-05-12 2021-02-24 Arbutus Biopharma Corporation Novel cationic lipids and methods of use thereof
US9006417B2 (en) 2010-06-30 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
WO2012016184A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
HUE058896T2 (hu) 2010-10-01 2022-09-28 Modernatx Inc N1-metil-pszeudo-uracilt tartalmazó ribonukleinsavak és azok felhasználásai
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
AU2012255913A1 (en) 2011-05-17 2013-11-21 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof for non-human vertebrates
RS59037B1 (sr) 2011-06-08 2019-08-30 Translate Bio Inc Kompozicije lipidnih nanočestica i postupci za isporuku irnk
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2013039857A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof
JP2014530602A (ja) 2011-10-05 2014-11-20 プロティバ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド アルデヒドデヒドロゲナーゼをサイレンシングするための組成物および方法
US20140343129A1 (en) 2011-12-14 2014-11-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acids, and acute care uses thereof
EP2791364A4 (en) 2011-12-14 2015-11-11 Moderna Therapeutics Inc METHODS OF RESPONSE TO A BIOLOGICAL THREAT
EP2791160B1 (en) 2011-12-16 2022-03-02 ModernaTX, Inc. Modified mrna compositions
US20130165504A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 modeRNA Therapeutics Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant
US20140371302A1 (en) 2011-12-29 2014-12-18 Modema Therapeutics, Inc. Modified mrnas encoding cell-penetrating polypeptides
WO2013126803A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Protiva Biotherapeutics Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
US20140275229A1 (en) 2012-04-02 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding udp glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide a1
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
WO2013151666A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
AU2013243951A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of secreted proteins
US20150050354A1 (en) 2012-04-02 2015-02-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US9512456B2 (en) * 2012-08-14 2016-12-06 Modernatx, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of RNA
EP2922554B1 (en) 2012-11-26 2022-02-23 ModernaTX, Inc. Terminally modified rna
ES2968649T3 (es) 2012-12-07 2024-05-13 Translate Bio Inc Nanopartículas lipídicas para la administración de ARNm en los pulmones
US20150315541A1 (en) 2012-12-13 2015-11-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for altering cell phenotype
EP3434774A1 (en) 2013-01-17 2019-01-30 ModernaTX, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
WO2014158795A1 (en) 2013-03-12 2014-10-02 Moderna Therapeutics, Inc. Diagnosis and treatment of fibrosis
WO2014159813A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
EP2971098B1 (en) 2013-03-14 2018-11-21 Translate Bio, Inc. Quantitative assessment for cap efficiency of messenger rna
CN105051213A (zh) 2013-03-14 2015-11-11 夏尔人类遗传性治疗公司 信使rna加帽效率的定量评估
EP3578663A1 (en) 2013-03-15 2019-12-11 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
EP2971161B1 (en) 2013-03-15 2018-12-26 ModernaTX, Inc. Ribonucleic acid purification
WO2014144039A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
EP2983804A4 (en) 2013-03-15 2017-03-01 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
WO2014152030A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Removal of dna fragments in mrna production process
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US20160017313A1 (en) 2013-03-15 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
EP3971287A1 (en) 2013-07-11 2022-03-23 ModernaTX, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
WO2015011633A1 (en) 2013-07-23 2015-01-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
WO2015034928A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US20160264614A1 (en) 2013-10-02 2016-09-15 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
US10385088B2 (en) 2013-10-02 2019-08-20 Modernatx, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
CA2927393A1 (en) 2013-10-18 2015-04-23 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods for tolerizing cellular systems
EP3077406B1 (en) * 2013-12-05 2019-07-10 New England Biolabs, Inc. Compositions and methods for capping rna
WO2015085318A2 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Moderna Therapeutics, Inc. Targeted adaptive vaccines
US20150167017A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
PT3134131T (pt) 2014-04-23 2022-03-24 Modernatx Inc Vacinas de ácidos nucleicos
EP3201338B1 (en) 2014-10-02 2021-11-03 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
WO2016071857A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus expression
EP3218508A4 (en) 2014-11-10 2018-04-18 Modernatx, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
EP3041948B1 (en) 2014-11-10 2019-01-09 Modernatx, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
WO2016118724A1 (en) 2015-01-21 2016-07-28 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
EP3247398A4 (en) 2015-01-23 2018-09-26 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2016154127A2 (en) 2015-03-20 2016-09-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia
WO2016164762A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same

Also Published As

Publication number Publication date
JP7119181B2 (ja) 2022-08-16
US20220010347A1 (en) 2022-01-13
MA56219A (fr) 2022-04-20
US20190136283A1 (en) 2019-05-09
CN114686548A (zh) 2022-07-01
JP2018531017A (ja) 2018-10-25
JP2021155447A (ja) 2021-10-07
JP7119181B6 (ja) 2022-11-11
US10144942B2 (en) 2018-12-04
US20170159093A1 (en) 2017-06-08
CN108473969B (zh) 2022-09-13
EP3362555A1 (en) 2018-08-22
EP3362555B1 (en) 2021-01-13
US20240175065A1 (en) 2024-05-30
WO2017066573A1 (en) 2017-04-20
CN108473969A (zh) 2018-08-31
CA3001852A1 (en) 2017-04-20
US10995354B2 (en) 2021-05-04
AU2016338559B2 (en) 2022-11-24
JP6997704B2 (ja) 2022-02-04
AU2016338559A1 (en) 2018-05-10
EP3878955A1 (en) 2021-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2862412T3 (es) Modificación de enzimas relacionados con el ARN para producción mejorada
ES2753201T3 (es) Secuencias UTR 3' para la estabilización del ARN
JP2018531017A6 (ja) 生産性向上のためのｒｎａ関連酵素の修飾
US8822180B2 (en) Method of synthesizing a suppressor tRNA, DNA construct and use thereof for producing a non-natural amino acid-incorporated protein
ES2732774T3 (es) UTR que aumentan la eficacia de la traducción de las moléculas de ARN
JP6959654B2 (ja) 新規の最小ｕｔｒ配列
BR112014032560B1 (pt) Método para produzir a proteína iduronato-2-sulfatase (i2s) recombinante
US10034951B1 (en) Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity
JP2021504343A (ja) 尿素サイクル異常症の治療のためのオルニチントランスカルバミラーゼをコードするポリヌクレオチド
JP2015523074A (ja) 組換えイズロン酸２スルファターゼの製造方法
TW202102529A (zh) 用於多肽表現之多核苷酸、組合物及方法
US20230183769A1 (en) In vitro transcription technologies
Mala et al. Alteration in H-bond strength affects the stability of codon-anticodon interaction at in-frame UAG stop codon during in vitro translation
CN115667509A (zh) 用于rna合成的组合物和方法
EA044790B1 (ru) Клетки для получения рекомбинантной идуронат-2-сульфатазы