EA044790B1 - Клетки для получения рекомбинантной идуронат-2-сульфатазы - Google Patents
Клетки для получения рекомбинантной идуронат-2-сульфатазы Download PDFInfo
- Publication number
- EA044790B1 EA044790B1 EA202090805 EA044790B1 EA 044790 B1 EA044790 B1 EA 044790B1 EA 202090805 EA202090805 EA 202090805 EA 044790 B1 EA044790 B1 EA 044790B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cell
- protein
- seq
- fge
- cells
- Prior art date
Links
- 101710096421 Iduronate 2-sulfatase Proteins 0.000 title claims description 295
- 102100029199 Iduronate 2-sulfatase Human genes 0.000 title claims description 294
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 248
- 101710192607 Formylglycine-generating enzyme Proteins 0.000 claims description 91
- 102100028875 Formylglycine-generating enzyme Human genes 0.000 claims description 90
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 81
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 73
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 67
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 64
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 64
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 64
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 60
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 60
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 59
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 48
- UGJBHEZMOKVTIM-UHFFFAOYSA-N N-formylglycine Chemical compound OC(=O)CNC=O UGJBHEZMOKVTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 28
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 24
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 14
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 13
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 8
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 7
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 64
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 62
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 59
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 59
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 57
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 51
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 38
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 25
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 23
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 21
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 21
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 20
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 19
- 101000648611 Homo sapiens Formylglycine-generating enzyme Proteins 0.000 description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 18
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 18
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 18
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 18
- 102000050003 human SUMF1 Human genes 0.000 description 17
- 208000022018 mucopolysaccharidosis type 2 Diseases 0.000 description 16
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 14
- 201000002273 mucopolysaccharidosis II Diseases 0.000 description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 14
- PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-2h-chromen-2-one Chemical group C1=CC=CC2=C1OC(=O)C=C2C PSGQCCSGKGJLRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- -1 heparin disaccharide Chemical class 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N D-Mannose-6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 8
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 8
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 6
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 210000004705 lumbosacral region Anatomy 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 6
- FUYLLJCBCKRIAL-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone sulfate Chemical compound C1=C(OS(O)(=O)=O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C FUYLLJCBCKRIAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 5
- 102100037173 Mitochondrial-derived peptide MOTS-c Human genes 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 5
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 description 4
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 102000051631 human SERPINA1 Human genes 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZDTFMPXQUSBYRL-UUOKFMHZSA-N 2-Aminoadenosine Chemical compound C12=NC(N)=NC(N)=C2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O ZDTFMPXQUSBYRL-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102100037182 Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Human genes 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 3
- 101000840540 Homo sapiens Iduronate 2-sulfatase Proteins 0.000 description 3
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 3
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 3
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100027165 Alpha-2-macroglobulin receptor-associated protein Human genes 0.000 description 2
- 101710126837 Alpha-2-macroglobulin receptor-associated protein Proteins 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 101710145225 Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100032859 Protein AMBP Human genes 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 102000005262 Sulfatase Human genes 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 102100026145 Transitional endoplasmic reticulum ATPase Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000009593 lumbar puncture Methods 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Chemical group 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- RIFDKYBNWNPCQK-IOSLPCCCSA-N (2r,3s,4r,5r)-2-(hydroxymethyl)-5-(6-imino-3-methylpurin-9-yl)oxolane-3,4-diol Chemical compound C1=2N(C)C=NC(=N)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O RIFDKYBNWNPCQK-IOSLPCCCSA-N 0.000 description 1
- NODMSFUNHCUVST-REOHCLBHSA-N (2s)-2-nitrosopropanoic acid Chemical compound O=N[C@@H](C)C(O)=O NODMSFUNHCUVST-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- RKSLVDIXBGWPIS-UAKXSSHOSA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-iodopyrimidine-2,4-dione Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 RKSLVDIXBGWPIS-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- QLOCVMVCRJOTTM-TURQNECASA-N 1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-prop-1-ynylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C#CC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QLOCVMVCRJOTTM-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRYMOPZHXMVHTA-DAGMQNCNSA-N 2-amino-7-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-one Chemical compound C1=CC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O JRYMOPZHXMVHTA-DAGMQNCNSA-N 0.000 description 1
- RHFUOMFWUGWKKO-XVFCMESISA-N 2-thiocytidine Chemical compound S=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RHFUOMFWUGWKKO-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- XMTCKNXTTXDPJX-UHFFFAOYSA-N 3-oxoalanine Chemical compound O=CC(N)C(O)=O XMTCKNXTTXDPJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMMLLWZHCKCFQA-UGKPPGOTSA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-prop-1-ynyloxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound C1=CC(N)=NC(=O)N1[C@]1(C#CC)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O LMMLLWZHCKCFQA-UGKPPGOTSA-N 0.000 description 1
- XXSIICQLPUAUDF-TURQNECASA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-prop-1-ynylpyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C(C#CC)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 XXSIICQLPUAUDF-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 101710163881 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 5-bromouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 AGFIRQJZCNVMCW-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- FHIDNBAQOFJWCA-UAKXSSHOSA-N 5-fluorouridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(F)=C1 FHIDNBAQOFJWCA-UAKXSSHOSA-N 0.000 description 1
- KDOPAZIWBAHVJB-UHFFFAOYSA-N 5h-pyrrolo[3,2-d]pyrimidine Chemical compound C1=NC=C2NC=CC2=N1 KDOPAZIWBAHVJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BXJHWYVXLGLDMZ-UHFFFAOYSA-N 6-O-methylguanine Chemical compound COC1=NC(N)=NC2=C1NC=N2 BXJHWYVXLGLDMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEHOMUNTZPIBIL-UUOKFMHZSA-N 6-amino-9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-7h-purin-8-one Chemical compound O=C1NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O UEHOMUNTZPIBIL-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical group NC1=NC(N)=NC(Cl)=N1 FVFVNNKYKYZTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCAJQHYUCKICQH-VPENINKCSA-N 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2NC(=O)N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HCAJQHYUCKICQH-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 9beta-Ribofuranosyl-7-deazaadenin Natural products C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O HDZZVAMISRMYHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150020357 ADE8 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical group CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030981 Beta-alanine-activating enzyme Human genes 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101100327917 Caenorhabditis elegans chup-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000045 Dermatan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 206010012559 Developmental delay Diseases 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 101000930875 Drosophila melanogaster Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101710190709 Eukaryotic translation initiation factor 4 gamma 2 Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 101001035782 Gallus gallus Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 101710162677 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 101000773364 Homo sapiens Beta-alanine-activating enzyme Proteins 0.000 description 1
- 101001028831 Homo sapiens Cation-independent mannose-6-phosphate receptor Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000797623 Homo sapiens Protein AMBP Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 101800001691 Inter-alpha-trypsin inhibitor light chain Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255908 Manduca sexta Species 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 101000822667 Mus musculus Something about silencing protein 10 Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 241001452677 Ogataea methanolica Species 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 241001465803 Orgyia pseudotsugata Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001524178 Paenarthrobacter ureafaciens Species 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Chemical group 0.000 description 1
- 208000023109 Prominent forehead Diseases 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 101100085270 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) ade5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 101710132062 Transitional endoplasmic reticulum ATPase Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 208000024967 X-linked recessive disease Diseases 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 150000003938 benzyl alcohols Chemical class 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L dermatan sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](C([O-])=O)O1 AVJBPWGFOQAPRH-FWMKGIEWSA-L 0.000 description 1
- 229940051593 dermatan sulfate Drugs 0.000 description 1
- 108010040063 dermatan sulfate proteoglycan Proteins 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006126 farnesylation Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 1
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000000497 foam cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000017156 mRNA modification Effects 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 1
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 208000020470 nervous system symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- GJVFBWCTGUSGDD-UHFFFAOYSA-L pentamethonium bromide Chemical compound [Br-].[Br-].C[N+](C)(C)CCCCC[N+](C)(C)C GJVFBWCTGUSGDD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 1
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- RHFUOMFWUGWKKO-UHFFFAOYSA-N s2C Natural products S=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 RHFUOMFWUGWKKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 208000035736 spondylodysplastic type Ehlers-Danlos syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 101150003389 tdh2 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000002298 terpene group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000005029 transcription elongation Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- HDZZVAMISRMYHH-KCGFPETGSA-N tubercidin Chemical compound C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O HDZZVAMISRMYHH-KCGFPETGSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Description
Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США 61/666719, поданной 29 июня 2012 г., которая в полном объеме включена в данную заявку посредством ссылки.
Перечень последовательностей
Настоящее изобретение ссылается на Перечень последовательностей, поданный в электронной форме в виде файла ASCII .txt под названием 2006685-00340_SEQ_LIST 27 июня 2013 г. Файл .txt был создан 25 июня 2013 г., его размер составляет 25 КБ. Полное содержание Перечня последовательностей включено в данный документ посредством ссылки.
Уровень техники
Мукополисахаридоз II типа (МПС II, синдром Хантера) - это сцепленное с X-хромосомой рецессивное заболевание из группы лизосомных болезней накопления, причиной которого является дефицит фермента идуронат-2-сульфатазы (I2S). I2S отщепляет терминальные 2-О-сульфатные компоненты от глюкозаминогликанов (GAG) дерматансульфата и гепарансульфата. Вследствие отсутствия или дефективности фермента I2S у пациентов с синдромом Хантера GAG постепенно накапливается в лизосомах разных типов клеток, что приводит к клеточному переполнению, органомегалии, разрушению тканей и систематической дисфункции органов.
Обычно физические проявления синдрома Хантера у людей включают как соматические, так и нейрональные симптомы. Например, в некоторых случаях синдрома Хантера поражение центральной нервной системы приводит к задержке в развитии и проблемам нервной системы. Хотя при рождении симптомы синдрома Хантера, не связанные с нервной системой, обычно отсутствуют, со временем постоянное накопление GAG в клетках тела может оказывать сильное влияние на периферические ткани тела. Накопление GAG в периферической ткани приводит к характерной грубости черт лица пациента и обуславливает выдающийся лоб, уплощенную переносицу и увеличенный язык - отличительные признаки пациента с синдромом Хантера. Аналогично, накопление GAG может оказывать негативное воздействие на системы органов тела. Изначально проявляясь в виде утолщения стенок сердца, легких и дыхательных путей, а также патологического увеличения печени, селезенки и почек, эти кардинальные изменения могут, в конечном счете, привести к общей катастрофической органной недостаточности. Как следствие, синдром Хантера всегда является тяжелым, прогрессирующим и ограничивающим время жизни заболеванием.
Ферментозаместительная терапия (ФЗТ) является одобренной терапией для лечения синдрома Хантера (МПС II), которая включает введение экзогенного заместительного фермента I2S пациентам с синдромом Хантера.
Сущность изобретения
В изобретении, среди прочего, предложены усовершенствованные способы и составы для получения рекомбинантного белка I2S, который делает возможной более эффективную ферментозаместительную терапию при синдроме Хантера. Настоящее изобретение включает открытие, что более эффективный рекомбинантный белок I2S можно получить при помощи клеток млекопитающих, сконструированных таким образом, чтобы они коэкспрессировали рекомбинантный белок I2S и формилглицинобразующий фермент (FGE). Неожиданно рекомбинантный белок I2S, полученный при помощи таких сконструированных клеток, характеризуется необычно высоким уровнем процента конверсии в Саформилглицин (FGly) (например, более 70% и вплоть до 100%), что приводит к значительному улучшению ферментативной активности рекомбинантного белка I2S. Кроме того, клетки млекопитающих, коэкспрессирующие белки I2S и FGE в соответствии с настоящим изобретением, были успешно адаптированы для выращивания в суспензионной культуре в больших масштабах. Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает возможность более эффективного получения высокоактивного рекомбинантного белка I2S в больших масштабах.
Таким образом, в одном аспекте в настоящем изобретении предложена клетка, содержащая первую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазы (I2S), имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 50% (например, по меньшей мере приблизительно на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичную SEQ ID NO: 1; и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок формилглицин-образующего фермента (FGE), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 50% (например, по меньшей мере приблизительно на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичную SEQ ID NO: 5, при этом первая и/или вторая нуклеиновая кислота являются экзогенными, а клетка при культивировании в условиях клеточного культивирования (например, в суспензионной или адгезивной культуре) вырабатывает белок I2S, содержащий по меньшей мере около 70% (например, по меньшей мере около 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) остатков цистеина, соответствующих Cys59 из SEQ ID NO: 1, преобразованных в Са-формилглицин (FGly).
В другом аспекте в настоящем изобретении предложена клетка, содержащая первую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазы (I2S), имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 50% (например, по меньшей мере приблизительно на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичную SEQ ID NO:1; и вторую
- 1 044790 нуклеиновую кислоту, кодирующую белок формилглицин-образующего фермента (FGE), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 50% (например, по меньшей мере приблизительно на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичную SEQ ID NO: 5, при этом первая и/или вторая нуклеиновая кислота являются экзогенными, а клетка при культивировании в условиях клеточного культивирования вырабатывает белок I2S, содержащий по меньшей мере около 50% (например, по меньшей мере около 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) остатков цистеина, соответствующих Cys59 из SEQ ID NO: 1, преобразованных в Са-формилглицин (FGly), при уровне удельной продуктивности большем, чем около 10 пикограммов/клетку/день (например, большем, чем около 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 пг/клетку/день).
В некоторых вариантах реализации изобретения первая нуклеиновая кислота кодирует белок I2S, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая нуклеиновая кислота кодирует белок FGE, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO: 5.
В некоторых вариантах реализации изобретения первая и/или вторая нуклеиновая кислота функционально связана с промотором hCMV.
В некоторых вариантах реализации изобретения первая и/или вторая нуклеиновая кислота являются кодон-оптимизированными. В некоторых вариантах реализации изобретения первая нуклеиновая кислота содержит последовательность, по меньшей мере приблизительно на 50% (например, по меньшей мере приблизительно на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичную SEQ ID NO: 7. В конкретных вариантах реализации изобретения первая нуклеиновая кислота содержит последовательность SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах реализации изобретения вторая нуклеиновая кислота содержит последовательность, по меньшей мере приблизительно на 50% (например, по меньшей мере приблизительно на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичную SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах реализации изобретения вторая нуклеиновая кислота содержит последовательность, идентичную SEQ ID NO: 8.
В некоторых вариантах реализации изобретения и первая, и вторая нуклеиновые кислоты являются экзогенными (также называемыми рекомбинантными). В некоторых вариантах реализации изобретения первая и/или вторая нуклеиновые кислоты интегрированы (например, стабильно) в геном клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения первая и/или вторая нуклеиновые кислоты находятся в одной или более внехромосомных конструкций.
В некоторых вариантах реализации изобретения клетка согласно настоящему изобретению является клеткой млекопитающего. В определенных вариантах реализации изобретения подходящая клетка млекопитающего является клеткой человека. В конкретных вариантах реализации изобретения подходящая клетка млекопитающего является клеткой СНО.
В некоторых вариантах реализации изобретения клетка согласно изобретению является адаптируемой к суспензионной культуре. В других вариантах реализации изобретения клетка согласно изобретению является адгезивной.
В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предложен способ получения рекомбинантного белка идуронат-2-сульфатазы (I2S) путем культивирования клетки, описанной в различных приведенных в данном тексте вариантах реализации изобретения, в таких условиях, что рекомбинантные белки I2S и FGE коэкспрессируются в клетке. В некоторых вариантах реализации изобретения клетку культивируют в больших масштабах. В некоторых вариантах реализации изобретения большие масштабы, подходящие для настоящего изобретения, соответствуют процессу, проходящему в биореакторе. В некоторых вариантах реализации изобретения биореактор, подходящий для настоящего изобретения, имеет объем, выбранный из 10Л, 200Л, 500Л, 1000Л, 1500Л, 2000Л. В некоторых вариантах реализации изобретения процесс, соответствующий большим масштабам (например, в биореакторе), подходящий для настоящего изобретения, включает процесс перфузии. В некоторых вариантах реализации изобретения процесс, соответствующий большим масштабам (например, в биореакторе), подходящий для настоящего изобретения, включает использование периодической культуры. В некоторых вариантах реализации изобретения процесс, соответствующий большим масштабам, подходящий для настоящего изобретения, представляет собой процесс, проходящий в роллерном флаконе. В некоторых вариантах реализации изобретения клетку согласно настоящему изобретению культивируют в суспензии. В других вариантах реализации изобретения клетку согласно настоящему изобретению культивируют адгезивно.
В некоторых вариантах реализации изобретения клетку согласно настоящему изобретению культивируют в бессывороточной среде (например, в среде неживотного происхождения, химически определенной или безбелковой среде). В других вариантах реализации изобретения клетку согласно настоящему изобретению культивируют в содержащей сыворотку среде.
В различных вариантах реализации изобретения способ согласно изобретению дополнительно включает этап очистки рекомбинантного белка I2S.
В другом аспекте в настоящем изобретении предложен рекомбинантный белок идуронат-2- 2 044790 сульфатазы (I2S), полученный при помощи клетки или способа, описанных в приведенных в данной заявке различных вариантах реализации изобретения.
В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложен способ получения рекомбинантного белка идуронат-2-сульфатазы (I2S), в котором указанный рекомбинантный белок I2S имеет аминокислотную последовательность по меньшей мере приблизительно на 50% (например, по меньшей мере приблизительно на 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) идентичную SEQ ID NO: 1; и содержащий по меньшей мере около 70% (например, по меньшей мере около 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) остатков цистеина, соответствующих Cys59 из SEQ ID NO: 1, преобразованных в Са-формилглицин (FGly). В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок I2S имеет аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок I2S характеризуется специфической активностью, составляющей по меньшей мере около 20 Е/мг, 30 Е/мг, 40 Е/мг, 50 Е/мг, 60 Е/мг, 70 Е/мг, 80 Е/мг, 90 Е/мг или 100 Е/мг, которая определяется при помощи in vitro анализа активности выделения сульфата с применением в качестве субстрата гепарин дисахарида.
Среди прочего, в настоящем изобретении также предложен фармацевтический состав, содержащий рекомбинантный белок I2S, описанный в приведенных в данной заявке различных вариантах реализации изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель, а также способ лечения синдрома Хантера путем введения нуждающемуся в этом субъекту описанного в данном тексте рекомбинантного белка I2S или содержащего его фармацевтического состава.
Употребляемые в данном тексте термины белок I2S, I2S, фермент I2S или их грамматические эквиваленты относятся к получению молекул рекомбинантного белка I2S, если не указано иное.
Употребляемые в данном тексте термины около и приблизительно используются как эквивалентные. Подразумевается, что любые численные значения, приведенные в данном тексте с или без около/приблизительно, включают любые нормальные отклонения, очевидные для специалиста в соответствующей области техники.
Другие признаки, объекты и преимущества настоящего изобретения станут понятны из нижеприведенного подробного описания изобретения. При этом стоит понимать, что подробное описание, хотя и указывает варианты реализации настоящего изобретения, приведено исключительно в иллюстративных, но не ограничительных целях. Различные изменения и модификации, которые входят в объем изобретения, станут понятны для специалистов в данной области техники из подробного описания.
Краткое описание графических материалов
Описанные ниже фигуры, которые представляют собой графические материалы, приведены исключительно в иллюстративных, но не ограничительных целях.
На фиг. 1 проиллюстрирована аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1), кодирующая зрелую форму человеческого белка идуронат-2-сульфатазы (I2S), а в пределах белковой последовательности указаны потенциальные участки N-связанного гликозилирования и конверсии цистеина.
На фиг. 2 проиллюстрированы типовые конструкции для коэкспрессии I2S и FGE (т.е. SUMF1). (А) Экспрессионные единицы на отдельных векторах (для котрансфекции или последовательных трансфекций); (В) Экспрессионные единицы на одном векторе (одна трансфекция): (1) отдельные цистроны и (2) транскрипционно связанные цистроны.
На фиг. 3 проиллюстрированы типовые наблюдаемые уровни специфической активности I2S, скоррелированные относительно процента конверсии в формилглицин.
На фиг. 4 проиллюстрирован типовый профиль гликанов, соответствующий рекомбинантному ферменту I2S, полученному при использовании клеточных линий I2S-AF 2D и 4D, выращиваемых в условиях бессывороточного клеточного культивирования, в сравнении с контрольным рекомбинантным ферментом I2S.
Определения
Для лучшего понимания настоящего изобретения приведены определения некоторых терминов. Дополнительные определения для нижеприведенных терминов и других терминов приведены в продолжение всего описания изобретения.
Аминокислота
Употребляемый в данном тексте термин аминокислота в самом широком своем смысле обозначает любое соединение и/или вещество, которое может быть включено в полипептидную цепь. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота имеет следующую общую структуру: H2NC(H)(R)-COOH. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота является аминокислотой природного происхождения. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота является синтетической аминокислотой; в некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота является D-аминокислотой; в некоторых вариантах реализации изобретения аминокислота является Lаминокислотой. Стандартная аминокислота относится к любой из двадцати стандартных Lаминокислот, которые обычно входят в состав пептидов природного происхождения. Нестандартная аминокислота относится к любой аминокислоте, отличной от стандартных аминокислот, вне зависимости от того, получена ли она синтетически или из природного источника. Употребляемый в данном тек- 3 044790 сте термин синтетическая аминокислота включает в себя химически модифицированные аминокислоты, включая, но не ограничиваясь этим, соли, производные аминокислот (такие как амиды) и/или замещения. Аминокислоты, включая карбокси- и/или аминотерминальные аминокислоты в пептидах, можно модифицировать посредством метилирования, амидирования, ацетилирования, защитных групп и/или замещений другими химическими группами, которые могут изменить время полужизни циркуляции пептидов без существенного влияния на их активность. Аминокислоты могут участвовать в образовании дисульфидной связи. Аминокислоты могут содержать одну или более посттрансляционных модификаций, таких как ассоциация с одним или более химических компонентов (например, метальными группами, ацетатными группами, ацетильными группами, фосфатными группами, формильными компонентами, изопреноидными группами, сульфатными группами, полиэтиленгликольными компонентами, липидными компонентами, углеводными компонентами, биотиновыми компонентами и т.д.). В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислоты согласно настоящему изобретению можно включать или использовать в качестве добавки в среде для клеточных культур. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислоты, включенные или применяемые в качестве добавки в клеточной культуральной среде, могут быть представлены в виде солей или в гидратной форме.
Приблизительно
Употребляемый в данном тексте термин приблизительно или около, применяемый в отношении одной или более представляющих интерес величин, обозначает величину, которая является сходной с указанной заданной величиной. В определенных вариантах реализации изобретения термин приблизительно или около относится к диапазону величин, который попадает в пределы 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее в обе стороны (более чем или менее чем) от указанной заданной величины, если не указано иное либо иное не очевидно из контекста (за исключением случая, когда такое число превышало бы 100% от возможной величины).
Периодическая культура
Употребляемый в данном тексте термин периодическая культура относится к способу культивирования клеток, в котором все компоненты, которые, в конечном счете, будут применены в культивировании клеток, включая среду (смотрите определение среды ниже), а также сами клетки добавляют в начале процесса культивирования. Периодическую культуру обычно останавливают в определенной точке, а клетки и/или компоненты из среды собирают и в некоторых случаях очищают.
Биодоступность
Употребляемый в данном тексте термин биодоступность в общем случае относится к той процентной доле введенной дозы, которая достигает кровотока субъекта.
Биологически активный
Употребляемая в данном тексте фраза биологически активный относится к характеристике любого вещества, которое обладает активностью в биологической системе (например, клеточной культуре, организме и т.д.). Например, вещество, которое при введении в организм оказывает на этот организм биологический эффект, считается биологически активным. Биологическую активность также можно определить при помощи методов in vitro анализа (например, in vitro ферментного анализа, такого как анализ высвобождения сульфата). В конкретных вариантах реализации изобретения, если белок или полипептид является биологически активным, часть этого белка или полипептида, которая обладает по меньшей мере одним видом биологической активности белка или полипептида, обычно называют биологически активной частью. В некоторых вариантах реализации изобретения белок получают и/или очищают от клеточной культуральной системы, которая проявляет биологическую активность при введении субъекту. В некоторых вариантах реализации изобретения белок требует дополнительного процессинга для того, чтобы стать биологически активным. В некоторых вариантах реализации изобретения белок для того, чтобы стать биологически активным, требует посттрансляционных модификаций, таких как, без ограничений, гликозилирование (например, сиалирование), фарнезилирование, расщепление, фолдинг, конверсия в формилглицин и комбинации вышеперечисленного. В некоторых вариантах реализации изобретения белок, полученный в виде проформы (т.е. незрелой формы), может требовать дополнительной модификации для того, чтобы стать биологически активным.
Биореактор
Употребляемый в данном тексте термин биореактор относится к емкости, используемой для выращивания хозяйской клеточной культуры. Биореактор может иметь любой размер, подходящий для культивирования клеток млекопитающих. Как правило, объем биореактора составляет по меньшей мере 1 л и может составлять 10,100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 120000 л или более либо любое из промежуточных значений. Условия внутри биореактора, включая, но не ограничиваясь этим, уровень рН, осмолярность, насыщение CO2, насыщение O2, температуру и комбинации указанных параметров, обычно регулируют во время периода культивирования. Биореактор может быть выполнен из любого материала, который подходит для содержания клеток в среде в условиях культивирования согласно настоящему изобретению, включая стекло, пластик или металл. В некоторых вариантах реализации изобретения биореактор можно применять для выращивания культуры клеток животных. В некоторых вариантах
- 4 044790 реализации изобретения биореактор можно применять для выращивания культуры клеток млекопитающих. В некоторых вариантах реализации изобретения биореактор можно применять для клеток и/или клеточных линий, полученных из таких организмов, как, без ограничений, клетки млекопитающих, клетки насекомых, бактериальные клетки, дрожжевые клетки и человеческие клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения биореактор применяют для получения клеточных культур в больших масштабах, а его объем составляет по меньшей мере 100 л и может составлять 200, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 120000 л или более либо любое из промежуточных значений. Специалист в данной области техники обладает соответствующими знаниями и сможет выбрать подходящие биореакторы для практической реализации настоящего изобретения.
Клеточная культура
Этот термин при употреблении в данном тексте относится к клеточной популяции, которая выращивается в среде в условиях, подходящих для выживания и/или роста клеточной популяции. Для специалиста в данной области техники понятно, что указанные термины при употреблении в данном тексте могут относиться к комбинации, включающей клеточную популяцию и среду, в которой эта популяция выращивается.
Культивирование
Употребляемый в данном тексте термин культивирование или его грамматические эквиваленты относятся к процессу содержания клеток в условиях, способствующих росту и выживанию. Термины культивирование и клеточная культура либо любые другие синонимы используются в данном тексте взаимозаменяемо.
Емкость для культивирования
Употребляемый в данном тексте термин емкость для культивирования относится к любому контейнеру, который может обеспечить асептическую среду для культивирования клеток. Типовые емкости для культивирования включают, но не ограничиваются этим, стеклянные, пластиковые или металлические контейнеры.
Ферментозаместителъная терапия (ФЗТ)
Употребляемый в данном тексте термин ферментозаместительная терапия (ФЗТ) относится к любой терапевтической стратегии, которая ликвидирует дефицит ферментов путем введения необходимых ферментов. В некоторых вариантах реализации изобретения необходимый фермент вводят путем интратекального введения. В некоторых вариантах реализации изобретения необходимый фермент вводят путем инфузии в кровоток. После введения фермент захватывается клетками и транспортируется в лизосому, где фермент действует таким образом, чтобы уничтожить материал, который накопился в лизосомах вследствие дефицита ферментов. Как правило, для того, чтобы лизосомная ферментозаместительная терапия была эффективной, терапевтический фермент доставляют в лизосомы соответствующих клеток тканей-мишеней, в которых проявляется дефект накопления.
Экспрессия
При употреблении в данном тексте экспрессией нуклеотидной последовательности называют один или более из следующих процессов: (1) получение РНК-матрицы по последовательности ДНК (например, путем транскрипции); (2) процессинг РНК-транскрипта (например, путем сплайсинга, редактирования, образования 5' кэпа и/или образования 3' конца); (3) трансляцию РНК в полипептид или белок; и/или (4) посттрансляционную модификацию полипептида или белка.
Культура с подпиткой
Употребляемый в данном тексте термин культура с подпиткой относится к способу культивирования клеток, в котором в культуру добавляют дополнительные компоненты через какое-то время после начала процесса культивирования. Добавляемые компоненты обычно содержат питательные добавки для клеток, которые истощились во время процесса культивирования. Культуру с подпиткой обычно останавливают в определенной точке, а клетки и/или компоненты из среды собирают и в некоторых случаях очищают.
Фрагмент
Употребляемый в данном тексте термин фрагмент относится к полипептидам и определяется как любая дискретная часть данного полипептида, которая является уникальной или характерной для этого полипептида. Также при употреблении в данном тексте указанный термин относится к любой дискретной части данного полипептида, которая сохраняет по меньшей мере часть активности полноразмерного полипептида. Предпочтительно, чтобы часть активности, которая сохраняется, составляла по меньшей мере 10% активности полноразмерного полипептида. Более предпочтительно, чтобы часть активности, которая сохраняется, составляла по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% активности полноразмерного полипептида. Еще более предпочтительно, чтобы часть активности, которая сохраняется, составляла по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% активности полноразмерного полипептида. Наиболее предпочтительно, чтобы часть активности, которая сохраняется, составляла 100% активности полноразмерного полипептида. Также при употреблении в данном тексте указанный термин относится к любой части заданного полипептида, которая содержит по меньшей мере один установленный элемент последовательности, содержащийся в полноразмерном полипептиде. Предпочтительно,
- 5 044790 чтобы элемент последовательности совпадал с по меньшей мере 4-5, более предпочтительно по меньшей мере около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более аминокислот полноразмерного полипептида.
Ген
Употребляемый в данном тексте термин ген относится к любой нуклеотидной последовательности, ДНК или РНК, по меньшей мере часть которой кодирует конечный дискретный продукт, как правило, но не ограничиваясь этим, полипептид, который участвует в каком-либо аспекте клеточного процесса. Указанный термин относится не только к кодирующей последовательности, которая кодирует полипептид либо другой конечный дискретный продукт, но также может включать участки, предшествующие и следующие за кодирующей последовательностью, которые модулируют базовый уровень экспрессии, а также встроенные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами). В некоторых вариантах реализации изобретения ген может содержать регуляторные последовательности (например, промоторы, энхансеры, последовательности полиаденилирования, последовательности терминации, последовательности Козака, ТАТА-боксы и т.д.) и/или модификационные последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения ген может содержать привязки к нуклеиновым кислотам, которые не кодируют белки, но кодируют функциональные молекулы РНК, такие как тРНК, РНКи-индуцирующие вещества и т.д.
Генный продукт или продукт экспрессии
Употребляемый в данном тексте термин генный продукт или продукт экспрессии в общем случае относится к РНК, транскрибируемой с гена (до и/или после процессинга), или полипептиду (до и/или после модификации), кодируемому РНК, транскрибированной с гена.
Генетический регуляторный элемент
Употребляемый в данном тексте термин генетический регуляторный элемент относится к любому элементу последовательности, который модулирует экспрессию гена, с которым он функционально связан. Генетические регуляторные элементы могут действовать, как повышая, так и снижая уровни экспрессии, и могут располагаться до, в пределах или за кодирующей последовательностью. Генетические регуляторные элементы могут действовать на любом этапе генной экспрессии, регулируя, например, инициацию, элонгацию или терминацию транскрипции, сплайсинг мРНК, редактирование мРНК, стабильность мРНК, локализацию мРНК в клетке, инициацию, элонгацию или терминацию трансляции, или любой другой этап генной экспрессии. Генетические регуляторные элементы могут действовать по отдельности либо в комбинации друг с другом.
Гомология
Употребляемый в данном тексте термин гомология относится к полному сходству между полимерными молекулами, например, между молекулами нуклеиновых кислот (например, молекулами ДНК и/или молекулами РНК), и/или между полипептидными молекулами. В некоторых вариантах реализации изобретения полимерные молекулы считаются гомологичными по отношению друг к другу, если их последовательности идентичны по меньшей мере на 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%. В некоторых вариантах реализации изобретения полимерные молекулы считаются гомологичными по отношению друг к другу, если их последовательности одинаковы по меньшей мере на 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%.
Идентичность
Употребляемый в данном тексте термин идентичность относится к полному сходству между полимерными молекулами, например, между молекулами нуклеиновых кислот (например, молекулами ДНК и/или молекулами РНК), и/или между полипептидными молекулами. Расчет процентной идентичности двух нуклеотидных последовательностей, к примеру, можно проводить путем выравнивания двух последовательностей для оптимального сравнения (например, можно вносить гэпы в одну или обе - первую и вторую - нуклеотидные последовательности для оптимального выравнивания, а неидентичными последовательностями в целях сравнения можно пренебречь). В определенных вариантах реализации изобретения длина последовательности, выравниваемой для сравнения, составляет по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или практически 100% от длины контрольной последовательности. Затем проводят сравнение нуклеотидов в соответствующих нуклеотидных позициях. Если позицию в первой последовательности занимает такой же нуклеотид, что и соответствующую позицию во второй последовательности, молекулы считаются идентичными в указанной позиции. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных позиций в указанных последовательностях с учетом количества гэпов и длины каждого гэпа, который нужно внести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно осуществить при помощи математического алгоритма. Например, процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить при помощи алгоритма Майерса и Миллера (CABIOS, 1989, 4: 11-17), который используется в программе ALIGN (версия 2.0), с применением таблицы весов замен остатков РАМ 120, штрафа за длину гэпа 12 и штрафа за гэп 4. В альтернативном вариан- 6 044790 те процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определить при помощи программы GAP из пакета программного обеспечения GCG, используя матрицу NWSgapdna.CMP. Многие другие программы для выравнивания последовательностей, такие как Clustal, являются доступными и могут быть использованы для определения идентичности последовательностей.
Улучшаться, повышаться или снижаться
При употреблении в данном тексте при помощи терминов улучшаться, повышаться или снижаться или их грамматических эквивалентов оценивают величины относительно базового измерения, такого как измерение, проведенное для одной и той же особи до начала лечения, описанного в данном документе, или измерение, проведенное для контрольной особи (или нескольких контрольных особей) в отсутствие лечения, описанного в данном документе. Контрольной особью является особь, пораженная той же самой формой лизосомной болезни накопления, что и проходящая лечение особь, приблизительно того же возраста, что и проходящая лечение особь (для гарантии того, что стадии заболевания у проходящей лечение особи и контрольной(ых) особи(ей) сравнимы).
Интратекальное введение
Употребляемый в данном тексте термин интратекальное введение или интратекальная инъекция относится к инъекции в спинномозговой канал (интратекальное пространство, окружающее спинной мозг). Можно использовать разные методы, включая, но не ограничиваясь этим, латеральную церебровентрикулярную инъекцию через отверстие бора или цистернальную или поясничную пункцию и т.п. В некоторых вариантах реализации изобретения интратекальное введение или интратекальная доставка согласно настоящему изобретению относится к ИТ введению или доставке через поясничную область или участок, т.е. к поясничному ИТ введению или доставке. Употребляемый в данном тексте термин поясничная область или поясничный участок относится к области между третьим и четвертым поясничными (нижняя часть спины) позвонками и, более точно, к L2-S1 участку позвоночника.
Выделенный
Употребляемый в данном тексте термин выделенный относится к веществу и/или соединению, которое было (1) отделено от, по меньшей мере, некоторых компонентов, с которыми оно связано при исходном получении (в природе и/или экспериментальной установке), и/или (2) получено, изготовлено и/или произведено человеком. Выделенные вещества и/или соединения могут быть отделены от около 10%, около 20%, около 30%, около 40%, около 50%, около 60%, около 70%, около 80%, около 90%, около 91%, около 92%, около 93%, около 94%, около 95%, около 96%, около 97%, около 98%, около 99% или более чем около 99% других компонентов, с которыми они изначально были связаы. В некоторых вариантах реализации изобретения выделенные вещества являются очищенными приблизительно на 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более чем приблизительно 99%. При употреблении в данном тексте вещество является очищенным, если оно в значительной степени свободно от других компонентов. При использовании в данном тексте расчет процента очистки выделенных веществ и/или соединений не должен включать вспомогательные вещества (например, буфер, растворитель, воду и т.д.).
Среда
При употреблении в данном тексте этот термин обозначает раствор, содержащий питательные вещества, которые питают растущие клетки. Как правило, эти растворы содержат незаменимые и заменимые аминокислоты, витамины, источники энергии, липиды и следовые элементы, необходимые для минимального роста и/или выживания клеток. Раствор может также содержать компоненты, которые повышают рост и/или выживание относительно минимального уровня, включая гормоны и факторы роста. В некоторых вариантах реализации изобретения среду получают с оптимальными для выживания и пролиферации клеток уровнем рН и солевой концентрацией. В некоторых вариантах реализации изобретения среда может являться химически определенной средой - бессывороточной средой, которая не содержит белков, гидролизатов или компонентов с неизвестным составом. В некоторых вариантах реализации изобретения химически определенная среда не содержит компонентов животного происхождения, а все компоненты среды имеют известную химическую структуру. В некоторых вариантах реализации изобретения среда может являться средой на сывороточной основе - средой, которая была дополнена компонентами животного происхождения, такими как, без ограничений, фетальная телячья сыворотка, лошадиная сыворотка, козлиная сыворотка, ослиная сыворотка и/или их комбинации.
Нуклеиновая кислота
Употребляемый в данном тексте термин нуклеиновая кислота в самом широком своем смысле обозначает любое соединение и/или вещество, которое включено или может быть включено в олигонуклеотидную цепь. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота представляет собой соединение и/или вещество, которое включено или может быть включено в олигонуклеотидную цепь при помощи фосфодиэфирной связи. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота относится к отдельным остаткам нуклеиновых кислот (например, нуклеотидам и/или нуклеозидам). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота относится к олигонуклеотидной цепи, содержащей отдельные остатки нуклеиновых кислот. Употребляемые в данном тексте тер- 7 044790 мины олигонуклеотид и полинуклеотид можно использовать взаимозаменяемо. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота включает РНК, а также одно- и/или двухцепочечные ДНК и/или кДНК. Кроме того, термины нуклеиновая кислота, ДНК, РНК и/или подобные им термины включают аналоги нуклеиновых кислот, т.е., аналоги, содержащие скелет, отличный от фосфодиэфирного. Например, так называемые пептидные нуклеиновые кислоты, которые известны в данной области техники и содержат в скелете пептидные связи вместо фосфодиэфирных связей, считаются такими, которые входят в объем настоящего изобретения. Термин нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и/или кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки и/или РНК, могут содержать интроны. Нуклеиновые кислоты могут быть получены из природных источников и очищены, получены при помощи рекомбинантных экспрессионных систем и, необязательно, очищены, химически синтезированы и т.д. Когда это целесообразно, например, в случае химически синтезированных молекул, нуклеиновые кислоты могут содержать нуклеозидные аналоги, такие как аналоги, содержащие химически модифицированные основания или сахара, модификации скелета и т.д. Последовательность нуклеиновых кислот представляют в направлении от 5' к 3', если не указано иное. Термин сегмент нуклеиновой кислоты употребляется в данном тексте для обозначения нуклеотидной последовательности, которая является частью более длинной нуклеотидной последовательности. Во многих вариантах реализации изобретения сегмент нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более остатков. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота представляет собой или содержит природные нуклеозиды (например, аденозин, тимидин, гуанозин, цитидин, уридин, дезоксиаденозин, дезокситимидин, дезоксигуанозин и дезоксицитидин); нуклеозидные аналоги (например, 2аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирролопиримидин, 3-метиладенозин, 5-метилцитидин, С-5 пропинилцитидин, С-5 пропинилуридин, 2-аминоаденозин, С5-бромоуридин, С5-фторуридин, С5йодоуридин, С5-пропинилуридин, С5-пропинилцитидин, С5-метилцитидин, 2-аминоаденозин, 7деазааденозин, 7-деазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, О(6)-метилгуанин и 2-тиоцитидин); химически модифицированные основания; биологически модифицированные основания (например, метилированные основания); интеркалированные основания; модифицированные сахара (например, 2'фторрибозу, рибозу, 2'-дезоксирибозу, арабинозу и гексозу); и/или модифицированные фосфатные группы (например, тиофосфаты и 5'-N-фосфорαмидитные соединения). В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение непосредственно относится к немодифицированным нуклеиновым кислотам, под которыми подразумеваются те нуклеиновые кислоты (например, полинуклеотидам и остаткам, включая нуклеотиды и/или нуклеозиды), которые не были химически модифицированы с целью облегчения или осуществления доставки.
Процесс перфузии
Употребляемый в данном тексте термин процесс перфузии относится к способу культивирования клеток, в котором дополнительные компоненты добавляют в культуру непрерывно или полунепрерывно после начала процесса культивирования. Добавляемые компоненты обычно содержат питательные добавки для клеток, которые истощились во время процесса культивирования. Часть клеток и/или компонентов среды обычно собирают в непрерывном или полунепрерывном режиме и в некоторых случаях очищают. Обычно процесс клеточного культивирования, включающий процесс перфузии, называют перфузионной культурой. Как правило, питательные добавки добавляют в свежую среду во время процесса перфузии. В некоторых вариантах реализации изобретения свежая среда может быть идентичной или схожей с основной средой, применяемой в процессе клеточного культивирования. В некоторых вариантах реализации изобретения свежая среда может отличаться от основной среды, но при этом содержать необходимые питательные добавки. В некоторых вариантах реализации изобретения свежая среда является химически определенной средой.
Белок
Употребляемый в данном тексте термин белок относится к полипептиду (т.е. цепи из по меньшей мере двух аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями). Белки могут содержать отличные от аминокислот компоненты (например, они могут быть гликопротеинами, протеогликанами и т.д.) и/или могут быть процессированными или модифицированными любым другим способом. Специалистам в данной области техники понятно, что белок может являться полной полипептидной цепью, которая вырабатывается клеткой (с наличием или отсутствием сигнальной последовательности), либо может быть ее характеристической частью. В некоторых вариантах реализации изобретения белок иногда может содержать более одной полипептидной цепи, например, цепи, связанные одной или более дисульфидных связей или соединенные другими способами. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептиды могут содержать L-аминокислоты, D-аминокислоты либо и те, и другие, и могут содержать любые из множества известных в данной области техники аминокислотных модификаций или аналогов. Применимые модификации включают, например, терминальное ацетилирование, амидирование, метилирование и т.д. В некоторых вариантах реализации изобретения белки могут содержать аминокислоты природного происхождения, аминокислоты неприродного происхождения, синтетические
- 8 044790 аминокислоты и их комбинации. В общем случае термин пептид используется для обозначения полипептида, длина которого составляет менее чем около 100 аминокислот, менее чем около 50 аминокислот, менее чем около 20 аминокислот или менее чем около 10 аминокислот. В некоторых вариантах реализации изобретения белки представляют собой антитела, фрагменты антител, их биологически активные части и/или их характеристические части.
Рекомбинантный белок и рекомбинантный полипептид
Эти термины используются в данном тексте для обозначения полипептида, экспрессируемого клеткой-хозяином, которая была генетически сконструирована для экспрессии данного полипептида. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок может экспрессироваться в клеткехозяине, полученной от животного. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок может экспрессироваться в клетке-хозяине, полученной от насекомого. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок может экспрессироваться в клетке-хозяине, полученной из дрожжей. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок может экспрессироваться в клетке-хозяине, полученной из представителя прокариотов. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок может экспрессироваться в клетке-хозяине, полученной от млекопитающего. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок может экспрессироваться в клетке-хозяине, полученной от человека. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантно экспрессируемый полипептид может быть идентичным или схожим с полипептидом, который обычно экспрессируется в клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантно экспрессируемый полипептид может быть чужеродным клетке-хозяину, т.е. гетерологичным пептидам, которые обычно экспрессируются в клетке-хозяине. В альтернативном варианте в некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантно экспрессируемый полипептид может быть химерным, что означает, что части полипептида содержат аминокислотные последовательности, которые являются идентичными или схожими с полипептидами, обычно экспрессируемыми в клетке-хозяине, в то время как другие части являются чужеродными клетке-хозяину.
Заместительный фермент
Употребляемый в данном тексте термин заместительный фермент относится к любому ферменту, который может действовать таким образом, чтобы по меньшей мере частично заместить дефицитный или отсутствующий фермент при заболевании, лечение которого проводится. В некоторых вариантах реализации изобретения термин заместительный фермент относится к любому ферменту, который может действовать таким образом, чтобы по меньшей мере частично заместить дефицитный или отсутствующий лизосомный фермент при лизосомной болезни накопления, лечение которой проводится. В некоторых вариантах реализации изобретения заместительный фермент способен снижать количество накопленного материала в лизосомах млекопитающих или может снимать или облегчать один или более симптомов лизосомной болезни накопления. Заместительные ферменты, подходящие для изобретения, включают лизосомные ферменты как дикого типа, так и модифицированные, и могут быть получены при помощи рекомбинантных и синтетических способов либо очищены из природных источников. Заместительный фермент может быть рекомбинантным, синтетическим, генно-активируемым или природным ферментом.
Вектор
Употребляемый в данном тексте термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В некоторых вариантах реализации изобретения векторы способны к внехромосомной репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они связаны в клетке-хозяине, такой как эукариотическая и/или прокариотическая клетка. Векторы, способные управлять экспрессией функционально связанных генов, называются в данном тексте экспрессионными векторами.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении, среди прочего, предложены способы и композиции для получения рекомбинантного белка I2S с улучшенными эффективностью и активностью при помощи клеток, коэкспрессирующих белки I2S и FGE. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки согласно настоящему изобретению сконструированы так, чтобы одновременно сверхэкспрессировать рекомбинантные белки I2S и FGE. Клетки согласно изобретению адаптируемы ко многим условиям клеточного культивирования. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки согласно настоящему изобретению адаптируемы к суспензионному бессывороточному культивированию в больших масштабах.
Различные аспекты изобретения детально описаны в нижеприведенных подразделах. Использование подразделов не ограничивает изобретение. Каждый подраздел можно применять к любому аспекту изобретения. В настоящей заявке использование или обозначает и/или, если не указано иное.
Идуронат-2-сульфатаза (I2S)
При употреблении в данном тексте белок I2S представляет собой любой белок или часть белка, который может по меньшей мере частично заменить активность белка идуронат-2-сульфатазы (I2S) природного происхождения или снять одно или более клинических проявлений или симптомов, связанных с дефицитом I2S. Употребляемые в данном тексте термины фермент I2S и белок I2S и их грамматиче- 9 044790 ские эквиваленты используются взаимозаменяемо.
Как правило, человеческий белок I2S вырабатывается в форме предшественника. Форма предшественника человеческого I2S содержит сигнальный пептид (аминокислотные остатки 1-25 полноразмерного предшественника), пропептид (аминокислотные остатки 26-33 полноразмерного предшественника) и цепь (остатки 34-550 полноразмерного предшественника), которая может быть дополнительно процессирована в 42 кДа цепь (остатки 34-455 полноразмерного предшественника) и 14 кДа цепь (остатки 446-550 полноразмерного предшественника). Обычно форму предшественника называют также полноразмерным предшественником или полноразмерным белком I2S, который содержит 550 аминокислот. Аминокислотные последовательности зрелой формы (SEQ ID NO: 1) с удаленным сигнальным пептидом и полноразмерный предшественник (SEQ ID NO: 2) типового белка I2S дикого типа или природного происхождения приведены в табл. 1. Сигнальный пептид выделен подчеркиванием. Вдобавок, в табл. 1 также приведены аминокислотные последовательности изоформ а и b предшественника человеческого белка 12S, SEQ ID NO: 3 и 4 соответственно.
Таблица 1. Человеческая идуронат-2-сульфатаза
Зрелая форма | SETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQL ASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSY WRVHAGNF STIPQ YFKENGYVTMS VGKVFHPGIS SNHTDDS PYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLD VPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPF RYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQRE DVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLS ALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNFDVATH VPLIF YVPGRT ASLPE AGEKLFP YLDPFD S AS QLMEPGRQ SM DLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLK HFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLK DIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFV DSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP(SEQ Ш NO:1) |
Полноразмерный предшественник (изоформа а) | MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLL |
IIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAV CAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKE NGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYEN TKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLL EKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPD PEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQR KIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHG WALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKL FPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVP PRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIA YSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVG | |
FNPDEFL ANF SDIHAGELYF VD SDPLQDHNM YND SQGGDLF QLLMP(SEQ ID NO:2) | |
Предшественник, изоформа b | MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLL IIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAV CAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKE NGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYEN TKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLL EKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPD PEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQE DQSSTGFRLKTSSTRKYK (SEQ ID NO:3) |
Предшественник, изоформа с | MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLL IIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAV CAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKE NGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYEN TKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLL EKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPD PEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQR KIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGF LMRTNT(SEQ ID No:4) |
Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S представляет собой зрелый человеческий белок I2S (SEQ ID NO: 1). Как раскрыто в данном документе, SEQ ID NO: 1 представляет каноническую аминокислотную последовательность человеческого белка I2S. В некоторых вариантах реализации изобретения белок I2S может представлять собой сплайс-изоформу и/или вариант SEQ ID NO: 1, которые образуются в результате транскрипции на другом участке инициации в пределах 5' UTR гена I2S. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящий заместительный фермент может быть гомологом или аналогом зрелого человеческого белка I2S. Например, гомолог или аналог зрелого человеческого белка I2S может представлять собой модифицированный зрелый человеческий белок I2S, содержащий одну или более аминокислотных замен, делеций и/или инсерций по сравнению с
- 10 044790 белком I2S дикого типа или природного происхождения (например, SEQ ID NO: 1), и при этом сохранять значительную часть активности белка I2S. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения заместительный фермент, подходящий для целей настоящего изобретения, является в значительной степени гомологичным зрелому человеческому белку I2S (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения заместительный фермент, подходящий для целей настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичную SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения заместительный фермент, подходящий для целей настоящего изобретения, является в значительной степени идентичным зрелому человеческому белку I2S (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации изобретения заместительный фермент, подходящий для целей настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации изобретения заместительный фермент, подходящий для целей настоящего изобретения, содержит фрагмент или часть зрелого человеческого белка I2S.
В альтернативном варианте фермент I2S представляет собой полноразмерный белок I2S. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S может быть гомологом или аналогом полноразмерного человеческого белка I2S. Например, гомолог или аналог полноразмерного человеческого белка I2S может представлять собой модифицированный полноразмерный человеческий белок I2S, содержащий одну или более аминокислотных замен, делеций и/или инсерций по сравнению с полноразмерным белком I2S дикого типа или природного происхождения (например, SEQ ID NO: 2), и при этом сохранять значительную часть активности белка I2S. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S является в значительной степени гомологичным полноразмерному человеческому белку I2S (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S, подходящий для целей настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичную SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S, подходящий для целей настоящего изобретения, является в значительной степени идентичным SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S, подходящий для целей настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S, подходящий для целей настоящего изобретения, содержит фрагмент или часть полноразмерного человеческого белка I2S. В контексте данного документа полноразмерный белок I2S обычно содержит сигнальную пептидную последовательность.
В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S, подходящий для целей настоящего изобретения, представляет собой изоформу а человеческого белка I2S. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящий фермент I2S может быть гомологом или аналогом изоформы а человеческого белка I2S. Например, гомолог или аналог изоформы а человеческого белка I2S может представлять собой модифицированную изоформу а человеческого белка I2S, содержащую одну или более аминокислотных замен, делеций и/или инсерций по сравнению с изоформой а человеческого белка I2S дикого типа или природного происхождения (например, SEQ ID NO: 3), и при этом сохранять значительную часть активности белка I2S. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S является в значительной степени гомологичным изоформе а человеческого белка I2S (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичную SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S является в значительной степени идентичным SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S, подходящий для целей настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S, подходящий для целей настоящего изобретения, содержит фрагмент или часть изоформы а человеческого белка I2S. В контексте данного документа изоформа а человеческого белка I2S обычно содержит сигнальную пептидную последовательность.
В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S представляет собой изоформу b человеческого белка I2S. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящий фермент I2S может быть гомологом или аналогом изоформы b человеческого белка I2S. Например, гомолог или аналог изоформы b человеческого белка I2S может представлять собой модифицированную изоформу b человеческого белка I2S, содержащую одну или более аминокислотных замен, делеций и/или инсерций по сравнению с изоформой b человеческого белка I2S дикого типа или природного происхождения (например, SEQ ID NO: 4), и при этом сохранять значительную часть активности белка I2S. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S является в значительной степени гомологичным изоформе b человеческого белка I2S (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах реализации изобретения
- 11 044790 фермент I2S содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичную SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S является в значительной степени идентичным SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент I2S, подходящий для целей настоящего изобретения, содержит фрагмент или часть изоформы b человеческого белка I2S. В контексте данного документа изоформа b человеческого белка I2S обычно содержит сигнальную пептидную последовательность.
Гомологи или аналоги человеческих белков I2S можно получить в соответствии с способами изменения полипептидной последовательности, известными специалисту в данной области техники, такими как те, которые можно найти в ссылках, которые описывают подобные способы. В некоторых вариантах реализации изобретения консервативные аминокислотные замены включают замены, проводимые для аминокислот в рамках следующих групп: (а) М, I, L, V; (b) F, Y, W; (с) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; и (g) E, D. В некоторых вариантах реализации изобретения консервативная аминокислотная замена относится к аминокислотной замене, которая не приводит к изменению относительного заряда или характерных размеров белка, в котором проводится аминокислотная замена.
В некоторых вариантах реализации изобретения ферменты I2S содержат компонент, который связывается с рецептором на поверхности клеток для того, чтобы облегчить клеточное поглощение и/или лизосомное нацеливание. Например, таким рецептором может быть катион-независимый маннозо-6фосфатный рецептор (CI-MPR), который связывает остатки маннозо-6-фосфата (М6Р). Вдобавок, CIMPR также связывает другие белки, включая IGF-II. Пригодным компонентом для лизосомного нацеливания может быть IGF-I, IGF-II, RAP, p97, а также их варианты, гомологи или фрагменты (например, включая те пептиды, которые содержат последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичную пептидным последовательностям зрелых человеческих IGF-I, IGF-II, RAP, p97 дикого типа). В некоторых вариантах реализации изобретения пригодный рецептор, с которым связываются остатки М6Р, может быть катион-зависимым.
Формилглицинобразующий фермент (FGE)
Как правило, на ферментативную активность I2S оказывает влияние посттрансляционная модификация консервативного цистеина (например, соответствующего аминокислоте 59 зрелого человеческого I2S (SEQ ID NO:1)) в формилглицин, который также называют 2-амино-3-оксопропионовой кислотой или оксо-аланином. Посттрансляционная модификация обычно происходит в эндоплазматическом ретикулуме во время синтеза белка и катализируется формилглицин-образующим ферментом (FGE). Специфическая ферментативная активность I2S обычно положительно коррелирует со степенью формилглициновой модификации I2S. Например, препарат белка I2S, который содержит относительно большое количество формилглициновых модификаций, обычно характеризуется относительно высокой специфической ферментативной активностью; а препарат белка I2S, который содержит относительно небольшое количество формилглициновых модификаций, обычно характеризуется относительно низкой специфической ферментативной активностью.
Таким образом, клетки, подходящие для получения рекомбинантного белка I2S согласно настоящему изобретению, обычно экспрессируют также белок FGE. В некоторых вариантах реализации изобретения пригодные клетки экспрессируют эндогенный белок FGE. В некоторых вариантах реализации изобретения пригодные клетки сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать экзогенный (также называемый рекомбинантным) формилглицин-образующий фермент (FGE) в комбинации с рекомбинантным I2S. В некоторых вариантах реализации изобретения пригодные клетки сконструированы таким образом, чтобы активировать эндогенный ген FGE так, чтобы повысить уровень экспрессии или активность белка FGE.
Как правило, человеческий белок FGE вырабатывается в форме предшественника. Форма предшественника человеческого FGE содержит сигнальный пептид (аминокислотные остатки 1-33 полноразмерного предшественника) и цепь (остатки 34-374 полноразмерного предшественника). Обычно форму предшественника называют также полноразмерным предшественником или полноразмерным белком FGE, который содержит 374 аминокислоты. Аминокислотные последовательности зрелой формы (SEQ ID NO: 5) с удаленным сигнальным пептидом и полноразмерный предшественник (SEQ ID NO: 6) типового белка FGE дикого типа или природного происхождения приведены в табл. 2.
Таблица 2. Человеческий формилглицинобразующий фермент (FGE)
Зрелая форма | SQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQRPGAHGSSAAAHRYSRE ANAPGPVPGERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDGEA PARRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSF VFEGMLSEQVKTNIQQAVAAAPWWLPVKGANWRHPEGPD STILHRPDHPVLHVSWNDAVAYCTWAGKRLPTEAEWEYSC RGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGF QGTAPVDAFPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEE |
- 12 044790
TLNPKGPPSGKDRVKKGGSYMCHRSYCYRYRCAARSQNTP DSSASNLGFRCAADRLPTMD (SEQ Ш NO:5) | |
Полноразмерный предшественник | MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGA GAGSLAGSCGCGTPQRPGAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPG ERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDGEAPARRVTIDA FYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSE QVKTNIQQAVAAAPWWLPVKGANWRHPEGPDSTILHRPDH PVLHVSWNDAVAYCTWAGKRLPTEAEWEYSCRGGLHNRL FPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGFQGTAPVDA FPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEETLNPKGPPS GKDRVKKGGSYMCHRSYCYRYRCAARSQNTPDSSASNLGF RCAADRLPTMD (SEQ Ш NO:6) |
Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения фермент FGE, пригодный для целей настоящего изобретения, представляет собой зрелый человеческий белок FGE (SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах реализации изобретения пригодный фермент FGE может быть гомологом или аналогом зрелого человеческого белка FGE. Например, гомолог или аналог зрелого человеческого белка FGE может представлять собой модифицированный зрелый человеческий белок FGE, содержащий одну или более аминокислотных замен, делеций и/или инсерций по сравнению с белком FGE дикого типа или природного происхождения (например, SEQ ID NO: 5), и при этом сохранять значительную часть активности белка FGE. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения фермент FGE, пригодный для целей настоящего изобретения, является в значительной степени гомологичным зрелому человеческому белку FGE (SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах реализации изобретения фермент FGE, пригодный для целей настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичную SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент FGE, пригодный для целей настоящего изобретения, является в значительной степени идентичным зрелому человеческому белку FGE (SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах реализации изобретения фермент FGE, пригодный для целей настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную SEQ ID NO:5. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент FGE, подходящий для целей настоящего изобретения, содержит фрагмент или часть зрелого человеческого белка FGE.
В альтернативном варианте фермент FGE, пригодный для целей настоящего изобретения, представляет собой полноразмерный человеческий белок FGE. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент FGE может быть гомологом или аналогом полноразмерного человеческого белка FGE. Например, гомолог или аналог полноразмерного человеческого белка FGE может представлять собой модифицированный полноразмерный человеческий белок FGE, содержащий одну или более аминокислотных замен, делеций и/или инсерций по сравнению с полноразмерным белком FGE дикого типа или природного происхождения (например, SEQ ID NO: 6), и при этом сохранять значительную часть активности белка FGE. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения фермент FGE, пригодный для целей настоящего изобретения, является в значительной степени гомологичным полноразмерному человеческому белку FGE (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах реализации изобретения фермент FGE, пригодный для целей настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более гомологичную SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент FGE, пригодный для целей настоящего изобретения, является в значительной степени идентичным SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент FGE, подходящий для целей настоящего изобретения, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную SEQ ID NO:6. В некоторых вариантах реализации изобретения фермент FGE, пригодный для целей настоящего изобретения, содержит фрагмент или часть полноразмерного человеческого белка FGE. В контексте данного документа полноразмерный белок FGE обычно содержит сигнальную пептидную последовательность.
Типовые нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности, кодирующие типовые белки FGE, раскрыты в публикации США № 20040229250, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
Клетки, коэкспрессирующие I2S и FGE
В настоящем изобретении указывается на необходимость коммерческого производства биологически активного I2S на высоком уровне при помощи системы клеточного культивирования. Так как большое количество производственных факторов могут влиять на выбор определенной клетки-хозяина, молекулы нуклеиновых кислот, раскрытые в настоящем изобретении, относятся к широкому спектру прокариотических и эукариотических клеток и/или клеточных линий, включая, без ограничений, клеточные
- 13 044790 линии, полученные из штаммов бактерий, штаммов дрожжей, клеток насекомых, клеток животных, клеток млекопитающих и клеток человека. В аспектах настоящего изобретения также предложены экспрессионные конструкции и генерация рекомбинантных стабильных клеточных линий, подходящих для экспрессии белков I2S и/или FGE, как природного происхождения, так и модифицированных, которые раскрыты в настоящем изобретении. Вдобавок, в аспектах настоящего изобретения также предложены способы для получения клеточных линий, которые экспрессируют I2S и FGE, при помощи раскрытых в настоящем изобретении нуклеотидных последовательностей.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки I2S и/или FGE
В некоторых вариантах реализации изобретения предложены молекулы нуклеиновых кислот, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие представляющий интерес рекомбинантный ген (называемый в данном тексте трансгеном), такой как белок I2S и/или FGE, описанный во многих приведенных в данном тексте вариантах реализации изобретения. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая трансген, может быть модифицирована для того, чтобы обеспечить повышенную экспрессию кодируемого белка I2S и/или FGE, что также называется кодонной оптимизацией. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая трансген, может быть модифицирована путем изменения открытой рамки считывания для кодирующей последовательности. Употребляемый в данном тексте термин открытая рамка считывания является синонимом ОРС и обозначает любую нуклеотидную последовательность, которая потенциально способна кодировать белок или часть белка. Открытая рамка считывания обычно начинается со стартового кодона (представленного в стандартном коде в виде, например, AUG для молекулы РНК и ATG в молекуле ДНК), состоит из кодонов-триплетов и заканчивается стоп-кодоном (представленным в стандартном коде в виде, например, UAA, UGA или UAG для молекулы РНК и ТАА, TGA или TAG в молекуле ДНК). Употребляемый в данном тексте термин кодон обозначает последовательность из трех нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты, которая определяет конкретную аминокислоту во время синтеза белка; также его называют триплетом или кодон-триплетом. Например, из 64 возможных кодонов в стандартном генетическом коде два кодона GAA и GAG - кодируют аминокислоту глутамин, а кодоны ААА и AAG соответствуют аминокислоте лизину. В стандартном генетическом коде три кодона являются стоп-кодонами, которые не соответствуют ни одной аминокислоте. Употребляемый в данном тексте термин синонимический кодон обозначает любой и любые кодоны, которые кодируют одну аминокислоту. За исключением метионина и триптофана, аминокислоты кодируют от двух до шести синонимических кодонов. Например, в стандартном генетическом коде четырьмя синонимическими кодонами, которые кодируют аминокислоту аланин, являются GCA, GCC, GCG и GCU, двумя синонимическими кодонами, которые определяют глутамин, являются GAA и GAG, a двумя синонимическими кодонами, которые кодируют лизин, являются ААА и AAG.
В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновую кислоту, кодирующую открытую рамку считывания белка I2S и/или FGE, можно модифицировать при помощи стандартных способов кодонной оптимизации. Для практической реализации настоящего изобретения доступны и могут применяться различные коммерческие алгоритмы кодонной оптимизации. Как правило, кодонная оптимизация не приводит к изменению кодируемых аминокислотных последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения результатом кодонной оптимизации могут быть такие аминокислотные изменения, как замены, делеции или инсерции. Как правило, такие аминокислотные изменения не оказывают существенного влияния на активность белка.
Типовые нуклеотидные последовательности, кодирующие белки I2S и FGE, соответственно, показаны ниже как SEQ ID NO: 7 и 8.
- 14 044790
SEQ ID NO: 7: Типовая нуклеотидная последовательность, кодирующая идуронат-2-сульфатазу (I2S) ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGC GTGTGCGTGGCCCTGGGCAGCGAGACCCAGGCCAACAGCACCACCGACGCCCTGAA CGTGCTGCTGATCATCGTGGACGACCTGCGCCCCAGCCTGGGCTGCTACGGCGACAA GCTGGTGCGCAGCCCCAACATCGACCAGCTGGCCAGCCACAGCCTGCTGTTCCAGA ACGCCTTCGCCCAGCAGGCCGTGTGCGCCCCCAGCCGCGTGAGCTTCCTGACCGGCC GCCGCCCCGACACCACCCGCCTGTACGACTTCAACAGCTACTGGCGCGTGCACGCCG GCAACTTCAGCACCATCCCCCAGTACTTCAAGGAGAACGGCTACGTGACCATGAGC GTGGGCAAGGTGTTCCACCCCGGCATCAGCAGCAACCACACCGACGACAGCCCCTA CAGCTGGAGCTTCCCCCCCTACCACCCCAGCAGCGAGAAGTACGAGAACACCAAGA CCTGCCGCGGCCCCGACGGCGAGCTGCACGCCAACCTGCTGTGCCCCGTGGACGTG CTGGACGTGCCCGAGGGCACCCTGCCCGACAAGCAGAGCACCGAGCAGGCCATCCA GCTGCTGGAGAAGATGAAGACCAGCGCCAGCCCCTTCTTCCTGGCCGTGGGCTACC ACAAGCCCCACATCCCCTTCCGCTACCCCAAGGAGTTCCAGAAGCTGTACCCCCTGG AGAACATCACCCTGGCCCCCGACCCCGAGGTGCCCGACGGCCTGCCCCCCGTGGCCT ACAACCCCTGGATGGACATCCGCCAGCGCGAGGACGTGCAGGCCCTGAACATCAGC GTGCCCTACGGCCCCATCCCCGTGGACTTCCAGCGCAAGATCCGCCAGAGCTACTTC GCCAGCGTGAGCTACCTGGACACCCAGGTGGGCCGCCTGCTGAGCGCCCTGGACGA CCTGCAGCTGGCCAACAGCACCATCATCGCCTTCACCAGCGACCACGGCTGGGCCCT GGGCGAGCACGGCGAGTGGGCCAAGTACAGCAACTTCGACGTGGCCACCCACGTGC CCCTGATCTTCTACGTGCCCGGCCGCACCGCCAGCCTGCCCGAGGCCGGCGAGAAG CTGTTCCCCTACCTGGACCCCTTCGACAGCGCCAGCCAGCTGATGGAGCCCGGCCGC CAGAGCATGGACCTGGTGGAGCTGGTGAGCCTGTTCCCCACCCTGGCCGGCCTGGCC GGCCTGCAGGTGCCCCCCCGCTGCCCCGTGCCCAGCTTCCACGTGGAGCTGTGCCGC GAGGGCAAGAACCTGCTGAAGCACTTCCGCTTCCGCGACCTGGAGGAGGACCCCTA CCTGCCCGGCAACCCCCGCGAGCTGATCGCCTACAGCCAGTACCCCCGCCCCAGCG ACATCCCCCAGTGGAACAGCGACAAGCCCAGCCTGAAGGACATCAAGATCATGGGC TACAGCATCCGCACCATCGACTACCGCTACACCGTGTGGGTGGGCTTCAACCCCGAC GAGTTCCTGGCCAACTTCAGCGACATCCACGCCGGCGAGCTGTACTTCGTGGACAGC GACCCCCTGCAGGACCACAACATGTACAACGACAGCCAGGGCGGCGACCTGTTCCA GCTGCTGATGCCCTAG
SEQ ID NO: 8: Типовая нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерный формилглицинобразующий фермент-предшественник (FGE)
ATGGCTGCGCCCGCACTAGGGCTGGTGTGTGGACGTTGCCCTGAGCTGGGTCTCGTC CTCTTGCTGCTGCTGCTCTCGCTGCTGTGTGGAGCGGCAGGGAGCCAGGAGGCCGGG ACCGGTGCGGGCGCGGGGTCCCTTGCGGGTTCTTGCGGCTGCGGCACGCCCCAGCG GCCTGGCGCCCATGGCAGTTCGGCAGCCGCTCACCGATACTCGCGGGAGGCTAACG CTCCGGGCCCCGTACCCGGAGAGCGGCAACTCGCGCACTCAAAGATGGTCCCCATC CCTGCTGGAGTATTTACAATGGGCACAGATGATCCTCAGATAAAGCAGGATGGGGA AGCACCTGCGAGGAGAGTTACTATTGATGCCTTTTACATGGATGCCTATGAAGTCAG TAATACTGAATTTGAGAAGTTTGTGAACTCAACTGGCTATTTGACAGAGGCTGAGAA GTTTGGCGACTCCTTTGTCTTTGAAGGCATGTTGAGTGAGCAAGTGAAGACCAATAT TCAACAGGCAGTTGCAGCTGCTCCCTGGTGGTTACCTGTGAAAGGCGCTAACTGGAG ACACCCAGAAGGGCCTGACTCTACTATTCTGCACAGGCCGGATCATCCAGTTCTCCA TGTGTCCTGGAATGATGCGGTTGCCTACTGCACTTGGGCAGGGAAGCGGCTGCCCAC GGAAGCTGAGTGGGAATACAGCTGTCGAGGAGGCCTGCATAATAGACTTTTCCCCT GGGGCAACAAACTGCAGCCCAAAGGCCAGCATTATGCCAACATTTGGCAGGGCGAG TTTCCGGTGACCAACACTGGTGAGGATGGCTTCCAAGGAACTGCGCCTGTTGATGCC TTCCCTCCCAATGGTTATGGCTTATACAACATAGTGGGGAACGCATGGGAATGGACT TCAGACTGGTGGACTGTTCATCATTCTGTTGAAGAAACGCTTAACCCAAAAGGTCCC CCTTCTGGGAAAGACCGAGTGAAGAAAGGTGGATCCTACATGTGCCATAGGTCTTA TTGTTACAGGTATCGCTGTGCTGCTCGGAGCCAGAACACACCTGATAGCTCTGCTTC GAATCTGGGATTCCGCTGTGCAGCCGACCGCCTGCCCACCATGGACTGA
В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидная замена может приводить к изменению синонимического кодона в открытой рамке считывания с целью согласования с частотой использования эндогенного кодона, который находится в конкретной гетерологичной клетке, выбранной для экспрессии I2S и/или FGE. В альтернативном или дополнительном варианте нуклеотидная замена может приводить к изменению содержания G+C в открытой рамке считывания для того, чтобы больше соответствовать среднему содержанию G+C открытых рамок считывания, которые находятся в эндогенных нуклеотидных последовательностях гетерологичной клетки-хозяина. Нуклеотидная замена также может приводить к изменению полимононуклеотидной области или внутреннего регуляторного или структурного участка, который присутствует в последовательности I2S или FGE. Таким образом, рассматривается большое количество модифицированных или оптимизированных нуклеотидных последовательностей, включая, без ограничений, нуклеотидные последовательности, обеспечивающие повышенную экспрессию белков I2S и/или FGE в прокариотической клетке; дрожжевой клетке; клетке насекомого; и в клетке млекопитающего.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая белок I2S, подходящий для целей настоящего изобретения, имеет нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
- 15 044790
98%, 99% или более идентичную SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая белок FGE, пригодный для целей настоящего изобретения, имеет нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную SEQ ID NO: 8. Как правило, модифицированная нуклеиновая кислота кодирует белок I2S и/или FGE с или без изменений в аминокислотной последовательности. В случае аминокислотных изменений, такие изменения обычно не приводят к значительному изменению активности белка I2S или FGE.
Экспрессионные векторы
Нуклеотидную последовательность, кодирующую белок I2S и/или FGE, как описано в настоящей заявке, можно молекулярно клонировать (вносить) в подходящий вектор для размножения или экспрессии в клетке-хозяине. Для практической реализации настоящего изобретения можно применять большое количество экспрессионных векторов, включая, без ограничений, прокариотический экспрессионный вектор; экспрессионный вектор дрожжей; экспрессионный вектор насекомых и экспрессионный вектор млекопитающих. Типовые векторы, пригодные для целей настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются этим, векторы на вирусной основе (например, векторы на основе ААВ, векторы на основе ретровирусов, векторы на основе плазмид). В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие, соответственно, белки I2S и FGE, могут быть внесены в отдельные векторы. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие, соответственно, белки I2S и FGE, могут быть внесены в один и тот же вектор. Как правило, нуклеиновая кислота, кодирующая белок I2S или FGE, функционально связана с различными регуляторными последовательностями или элементами.
Регуляторные последовательности или элементы
Различные регуляторные последовательности или элементы можно включать в экспрессионный вектор, пригодный для целей настоящего изобретения. Типовые регуляторные последовательности или элементы включают, но не ограничиваются этим, промоторы, энхансеры, репрессоры или суппрессоры, 5' нетранслируемые (или некодирующие) последовательности, интроны, 3' нетранслируемые (или некодирующие) последовательности.
При употреблении в данном тексте промотор или промоторная последовательность представляет собой регуляторную область ДНК, способную связывать РНК полимеразу в клетке (например, прямо или посредством других связанных с промотором белков или веществ) и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности. Промоторная последовательность в общем случае связана с 3' концом посредством сайта инициации транскрипции, простирается вверх (в направлении 5') и содержит минимальное количество оснований или элементов, необходимых для инициации транскрипции на любом уровне. Промотор может быть функционально ассоциирован или функционально связан с последовательностями, управляющими экспрессией, включая энхансерные или репрессорные последовательности, или с нуклеиновой кислотой, которая должна экспрессироваться. В некоторых вариантах реализации изобретения промотор может быть индуцибельным. В некоторых вариантах реализации изобретения индуцибельный промотор может быть однонаправленным или двунаправленным. В некоторых вариантах реализации изобретения промотор может быть конститутивным промотором. В некоторых вариантах реализации изобретения промотор может быть гибридным промотором, в котором последовательность, содержащая участок управления транскрипцией, получена из одного источника, а последовательность, содержащая участок инициации транскрипции, получена из второго источника. Системы для присоединения контрольных элементов к кодирующей последовательности в трансгене хорошо известны в данной области техники (общие методы молекулярной биологии и рекомбинантных ДНК описаны в Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, которая включена в данный документ посредством ссылки). Коммерческие векторы, пригодные для внесения трансгена для экспрессии в разных клетках-хозяевах в различных условиях роста и индуцирования, также хорошо известны в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации изобретения для регулирования экспрессии трансгена в клеткехозяине млекопитающего можно применить специфический промотор, такой как, без ограничений, промотор SRa (Takebe et al., Molec. and Cell. Bio. 8:466-472 (1988)), немедленно-ранний промотор CMV человека (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985); Foecking et al., Gene 45:101-105 (1986)), промотор CMV человека, промотор CMV5 человека, немедленно-ранний промотор CMV мышей, промотор EF1-a, гибридный промотор CMV для специфической экспрессии в печени (например, полученный путем конъюгации немедленно-раннего промотора CMV с транскрипционными элементами промотора α-1-антитрипсина (HAT) человека или промотора альбумина (HAL) человека) или промоторы для специфической экспрессии в гепатоме (например, такие, в которых транскрипционные элементы промотора альбумина человека (HAL; около 1000 п.о.) или α-1-антитрипсина человека (HAT, около 2000 п.о.) соединены с энхансерным элементом α-1-микроглобулина человека длиной 145 и геном предшественника бикунина (АМВР); HALАМВР и НАТ-АМВР); ранняя область промотора SV40 (Benoist at al., Nature 290:304-310 (1981)), немедленно-ранний промотор Orgyia pseudotsugata, промотор тимидинкиназы герпеса (Wagner at al., Proc. Natl.
- 16 044790
Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)); или регуляторные последовательности гена металлотионеина (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)). В некоторых вариантах реализации изобретения промотор млекопитающего является конститутивным промотором, таким как, без ограничений, промотор гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPTR), промотор аденозиндеаминазы, промотор пируваткиназы, промотор бета-актина, а также другие конститутивные промоторы, известные специалистам в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации изобретения для регулирования экспрессии трансгена в прокариотической клетке-хозяине можно применить специфический промотор, такой как, без ограничений, промотор β-лактамазы (Villa-Komaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731 (1978)); tacпромотор (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); промотор Т7, промотор Т3, промотор М13 или промотор М16; в дрожжевой клетке-хозяине можно применить, без ограничений, промотор GAL1, GAL4 или промотор GAL10, ADH-промотор (промотор алкогольдегидрогеназы), PGK-промотор (промотор фосфоглицеролкиназы), промотор алкалинфосфатазы, промотор глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы III (TDH3), промотор глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы II (TDH2), промотор глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы I (TDH1), промотор пируваткиназы (PYK), энолазы (ENO) или триозофосфатдегидрогеназы (TPI).
В некоторых вариантах реализации изобретения промотор может быть одним из вирусных промоторов, многие из которых способны регулировать экспрессию трансгена в нескольких типах клетокхозяев, включая клетки млекопитающих. Вирусные промоторы, которые оказались способными управлять конститутивной экспрессией кодирующих последовательностей в эукариотических клетка, включают, например, промоторы вируса обезьян, промоторы вируса простого герпеса, промоторы вируса папилломы, аденовирусные промоторы, промоторы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), промоторы вируса саркомы Рауса, промоторы цитомегаловируса (CMV) и длинные концевые повторы (ДКП) вируса мышиного лейкоза Молони и других ретровирусов, промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса, а также другие вирусные промоторы, известные специалистам в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации изобретения генные регуляторные элементы экспрессионного вектора могут также включать 5' нетранскрибируемые и 5' нетранслируемые последовательности, принимающие участие в инициации, соответственно, транскрипции и трансляции, такие как ТАТА-бокс, кэпирующая последовательность, последовательность СААТ, последовательность Козака и т.п. В некоторых случаях могут применять энхансерные элементы для повышения уровней экспрессии полипептида или белка. Примеры энхансерных элементов, которые продемонстрировали свою функциональность в клетках млекопитающих, включают энхансер раннего гена SV40, описанный в Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4: 761, и энхансер/промотор, полученный из длинного концевого повтора (ДКП) вируса саркомы Рауса (ВСР), описанный в Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79:6777, а также цитомегаловирус человека, описанный в Boshart et al., Cell (1985) 41:521. Генные регуляторные элементы экспрессионного вектора могут также включать 3' нетранскрибируемые и 3' нетранслируемые последовательности, принимающие участие в терминации, соответственно, транскрипции и трансляции, такие как сигнал полиаденилирования (поли А) для стабилизации и процессинга 3' конца мРНК, транскрибируемой с промотора. Поли А сигналы включают, например, поли А сигнал бета-глобина кролика, поли А сигнал бычьего гормона роста, терминаторный/поли А сигнал бета-глобина цыпленка или позднюю поли А область SV40.
Селектируемые маркеры
Экспрессионные векторы предпочтительно, но необязательно, содержат по меньшей мере один селектируемый маркер. В некоторых вариантах реализации изобретения селектируемый маркер представляет собой кодирующую ген устойчивости нуклеотидную последовательность, функционально связанную с одним или более генетических регуляторных элементов, что обеспечивает возможность клеткехозяину сохранять жизнеспособность в условиях роста в присутствии цитотоксичных химических веществ и/или лекарственных препаратов. В некоторых вариантах реализации изобретения селектируемый агент можно применить для удержания экспрессионного вектора внутри клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации изобретения селектируемый агент можно применить для предотвращения модификации (т.е. метилирования) и/или выключения трансгенной последовательности в экспрессионном векторе. В некоторых вариантах реализации изобретения селектируемый агент применяют для поддержания эписомной экспрессии вектора в клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации изобретения селектируемый агент применяют для того, чтобы обеспечить стабильную интеграцию трансгенной последовательности в геном клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации изобретения агент и/или ген устойчивости может включать, без ограничений, метотрексат (МТХ), дигидрофолатредуктазу (DHFR, патенты США №№ 4399216; 4634665; 4656134; 4956288; 5149636; 5179017), ампициллин, неомицин (G418), зеомицин, микофеноловую кислоту или глутаминсинтетазу (GS, патенты США № 5122464; 5770359; 5827739) для эукариотической клетки-хозяина; тетрациклин, ампициллин, канамицин или хлорамфеникол для прокариотической клетки-хозяина; и URA3, LEU2, HIS3, LYS2, HIS4, ADE8, CUP1 или TRP1 для дрожжевой клетки-хозяина.
Экспрессионные векторы могут быть трансфицированы, трансформированы и трансдуцированы в
- 17 044790 клетку-хозяина. Употребляемые в данном тексте термины трансфекция, трансформация и трансдукция относятся к внесению экзогенной нуклеотидной последовательности в клетку-хозяина. В некоторых вариантах реализации изобретения экспрессионные векторы, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие I2S и/или FGE трансфицируют, трансформируют и трансдуцируют в клетку-хозяина одновременно. В некоторых вариантах реализации изобретения экспрессионные векторы, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие I2S и/или FGE трансфицируют, трансформируют и трансдуцируют в клетку-хозяина последовательно. Например, сначала можно трансфицировать, трансформировать или трансдуцировать в клетку-хозяина вектор, кодирующий белок I2S, а затем трансфицировать, трансформировать или трансдуцировать вектор, кодирующий белок FGE, и наоборот. Примеры способов трансформации, трансфекции и трансдукции, которые хорошо известны в данной области техники, включают липосомную доставку, т.е. метод Хоули-Нельсона с применением липофектамина™ (Gibco BRL), Focus 15:73 (1193), электропорацию, способ доставки с применением СаРО4 Грэхэма и Ван дер Эба, Virology, 52:456-457 (1978), ДЭАЭ-декстран-опосредованную доставку, микроинъекцию, биолистическую доставку частиц, полибрен-опосредованную доставку, катионопосредованную липидную доставку, трансдукцию и инфицирование вирусами, такими как, например, ретровирус, лентивирус, аденовирус, адено-ассоциированный вирус и бакуловирус (в случае клеток насекомых). Основные аспекты трансформаций клеток-хозяев были описаны в данной области техники, например, у Axel в патенте США № 4399216; Sambrook, supra, главы 1-4 и 16-18; Ausubel, supra, главы 1, 9, 13, 15, и 16. Информацию о разных методах трансформации клеток млекопитающих смотрите в Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) и Mansour et al., Nature, 336:348352 (1988).
После внесения в клетки экспрессионные векторы могут стабильно интегрироваться в геном или существовать в виде внехромосомных конструкций. Также векторы могут быть амплифицированы, а их множественные копии могут существовать в клетке или интегрироваться в геном. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки согласно изобретению могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более копий нуклеиновых кислот, кодирующих белок I2S. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки согласно изобретению могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более копий нуклеиновых кислот, кодирующих белок FGE. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки согласно изобретению могут содержать множественные копии (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или более) нуклеиновых кислот, кодирующих оба белка - I2S и FGE.
Клетки-хозяева
Употребляемый в данном тексте термин клетки-хозяева относится к клеткам, которые можно применять для получения рекомбинантного фермента I2S. В частности, клетки-хозяева пригодны для получения рекомбинантного фермента I2S в больших масштабах. Пригодные клетки-хозяева могут быть получены из различных организмов, включая, но не ограничиваясь этим, млекопитающих, растения, птиц (например, птичьи системы), насекомых, дрожжи и бактерии. В некоторых вариантах реализации изобретения клетки-хозяева являются клетками млекопитающих. В некоторых вариантах реализации изобретения пригодная клетка-хозяин не является эндосомальной кислотно-дефицитной клеткой.
Клеточные линии млекопитающих
В соответствии с настоящим изобретением в качестве клетки-хозяина можно применить любую клетку или тип клеток млекопитающих, которые можно культивировать и которые могут экспрессировать полипептиды. Неограничивающие примеры клеток млекопитающих, которые можно применять в соответствии с настоящим изобретением, включают эмбриональные клетки почек человека 293 (НЕК293), клетки HeLa; линию миеломы мышей штамма BALB/c (NSO/l, ECACC No: 85110503); ретинобласты человека (PER.C6 (CruCell, Leiden, The Netherlands)); почечную линию обезьян CV1, трансформированную SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); эмбриональную почечную линию человека (клетки 293 или 293, субклонированные для выращивания в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); клетки почек новорожденного хомяка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичников китайского хомяка +/-DHFR (СНО, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (ТМ4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); клетки почек обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почек африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1 587); клетки карциномы шейки матки человека (HeLa, ATCC CCL 2); клетки почек собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени серой крысы (BRL 3А, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, НВ 8065); опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и линию гепатомы человека (Hep G2). В некоторых вариантах реализации изобретения пригодная клетка млекопитающего не является эндосомальной кислотно-дефицитной клеткой.
Вдобавок в соответствии с настоящим изобретением можно применить любое количество коммерчески и некоммерчески доступных гибридомных клеточных линий, которые экспрессируют полипептиды или белки. Для специалиста в данной области техники будет очевидно, что гибридомные клеточные линии могут требовать разных условий питания и/или могут требовать разных условий культивирования для оптимального роста и экспрессии полипептида или белка, и соответственно, он сможет при необхо
- 18 044790 димости модифицировать эти условия.
Клеточные линии, не принадлежащие млекопитающим
В соответствии с настоящим изобретением в качестве клетки-хозяина можно применить любую клетку или тип клеток, не принадлежащие млекопитающим, которые можно культивировать и которые могут экспрессировать полипептиды. Неограничивающие примеры клеток-хозяев и клеточных линий, не принадлежащих млекопитающим, которые можно применить в соответствии с настоящим изобретением, включают клетки и клеточные линии, полученные из Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosacccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae и Yarrowia lipolytica для дрожжей; Sodoptera frugiperda, Trichoplusis ni, Drosophila melangoster и Manduca sexta для насекомых; и Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Bacillus lichenifonnis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile для бактерий и Xenopus Laevis из амфибий.
Адаптация к адгезивному или суспензионному выращиванию
В определенных вариантах реализации изобретения клетку-хозяина для генерации клеточной линии выбирают на основании определенных предпочтительных характеристик или роста в конкретных условиях, выбранных для культивирования клеток. Для специалиста в данной области техники будет очевидно, что такие характеристики можно определить на основании известных характеристик и/или признаков устойчивой линии (т.е. коммерчески доступной клеточной линии с известными характеристиками) или путем эмпирической оценки. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточную линию можно выбирать по ее способности к росту на питающем слое клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточную линию можно выбирать по ее способности к росту в суспензии. В некоторых вариантах реализации изобретения клеточную линию можно выбирать по ее способности к росту в виде адгезивного монослоя клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения такие клетки можно применить с любой емкостью для тканевой культуры или любой емкостью, покрытой пригодным адгезионным субстратом. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящий адгезионный субстрат выбран из группы, состоящей из коллагена (например, коллагена I, II, II или IV), желатина, фибронектина, ламинина, витронектина, фибриногена, BD Матригеля™ , матрикса базальной мембраны, дерматансульфат протеогликана, поли-О-лизина и/или их комбинаций. В некоторых вариантах реализации изобретения адгезивную клетку-хозяина можно выбирать и модифицировать в определенных условиях роста для выращивания в суспензии. Такие способы модификации адгезивной клетки для выращивания в суспензии известны в данной области техники. Например, клетку можно кондиционировать для выращивания в суспензионной культуре путем постепенного удаления животной сыворотки из питательной среды в течение определенного времени.
Выбор и оценка клеточной линии
В соответствии с настоящим изобретением клетки, сконструированные для экспрессии рекомбинантного белка I2S, выбирают по их способности вырабатывать рекомбинантный белок I2S в коммерчески приемлемом масштабе. В частности, сконструированные клетки согласно настоящему изобретению способны вырабатывать рекомбинантный белок I2S на высоком уровне и/или с высокой ферментативной активностью. В некоторых вариантах реализации изобретения подходящие клетки при культивировании в условиях клеточного культивирования (например, в стандартных суспензионных или адгезивных условиях культивирования в больших масштабах) могут вырабатывать фермент I2S в количестве, равном или большем чем около 5 пикограммов/клетку/день (например, большем, чем около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 пг/клетку/день). В некоторых вариантах реализации изобретения подходящие клетки при культивировании в условиях клеточного культивирования (например, в стандартных суспензионных или адгезивных условиях культивирования в больших масштабах) способны вырабатывать фермент I2S в количестве, находящемся в диапазоне, составляющем около 5-100 пикограммов/клетку/день (например, около 5-90 пг/клетку/день, около 5-80 пг/клетку/день, около 5-70 пг/клетку/день, около 5-60 пг/клетку/день, около 5-50 пг/клетку/день, около 5-40 пг/клетку/день, около 530 пг/клетку/день, около 10-90 пг/клетку/день, около 10-80 пг/клетку/день, около 10-70 пг/клетку/день, около 10-60 пг/клетку/день, около 10-50 пг/клетку/день, около 10-40 пг/клетку/день, около 10-30 пг/клетку/день, около 20-90 пг/клетку/день, около 20-80 пг/клетку/день, около 20-70 пг/клетку/день, около 20-60 пг/клетку/день, около 20-50 пг/клетку/день, около 20-40 пг/клетку/день, около 20-30 пг/клетку/день).
Как обсуждалось выше, обычно на ферментативную активность I2S оказывает влияние посттрансляционная модификация консервативного цистеина (например, аминокислоты 59) в формилглицин. В общем случае эта посттрансляционная модификация происходит в эндоплазматическом ретикулуме во время синтеза белка и катализируется FGE. Ферментативная активность I2S обычно положительно коррелирует со степенью формилглициновой модификации I2S. Например, препарат I2S, который содержит относительно большое количество формилглициновых модификаций, обычно характеризуется относительно высокой специфической ферментативной активностью; а препарат I2S, который содержит относительно небольшое количество формилглициновых модификаций, обычно характеризуется относительно низкой специфической ферментативной активностью.
Дополнительно предполагается, что соотношение между белком I2S и FGE или мРНК также может
- 19 044790 влиять на формилглициновую модификацию полученного рекомбинантного белка I2S. В некоторых вариантах реализации изобретения I2S и FGE, экспрессируемые в подходящей клетке, характеризуются разными уровнями экспрессии белка и/или мРНК. В некоторых вариантах реализации изобретения уровень экспрессии белка или мРНК I2S по меньшей мере в 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8, 9 или 10 раз выше, чем уровень белка или мРНК для FGE. В некоторых вариантах реализации изобретения уровень экспрессии рекомбинантного белка или мРНК FGE по меньшей мере в 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8, 9 или 10 раз выше, чем уровень белка или мРНК для I2S.
В некоторых вариантах реализации изобретения подходящие клетки при культивировании в условиях клеточного культивирования (например, в стандартных суспензионных или адгезивных условиях культивирования в больших масштабах) могут вырабатывать белок I2S, содержащий по меньшей мере около 50% (например, по меньшей мере около 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) остатков цистеина, соответствующих Cys59 из SEQ ID NO:1, преобразованных в Са-формилглицин (FGly). В некоторых вариантах реализации изобретения подходящие клетки при культивировании в условиях клеточного культивирования (например, в стандартных суспензионных или адгезивных условиях культивирования в больших масштабах) могут вырабатывать фермент I2S, содержащий по меньшей мере около 50% (например, по меньшей мере около 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) остатков цистеина, соответствующих Cys59 из SEQ ID NO:1, преобразованных в Са-формилглицин (FGly), и в количестве, равном или большем чем около 5 пикограммов/клетку/день (например, большем чем около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 пикограммов/клетку/день).
Процент конверсии в FGly
Для определения процента конверсии в FGly известны и могут быть применены различные способы. В общем случае процент конверсии в формилглицин (%ФГ) можно рассчитать, используя следующую формулу:
Количество активных молекул 12S %ФГ (I2S) = ----------------------------------------- х10°
Общее количество (активных + неактивных) молекул 12S
Например, 50% ФГ означает то, что половина очищенного рекомбинантного I2S ферментативно неактивна и не оказывает терапевтического эффекта. Для расчета %ФГ можно применить различные способы. Например, можно применить пептидное картирование. Вкратце, белок I2S можно расщепить на короткие пептиды при помощи протеаз (например, трипсина или химотрипсина). Короткие пептиды можно разделить и получить их характеристики при помощи хроматографии (например, HPLC) так, чтобы можно было определить природу и количество каждого пептида (в частности, пептида, в состав которого входит позиция, соответствующая позиции 59 зрелого человеческого I2S) в сравнении с контролем (например, белком I2S без конверсии в FGly или белком I2S со 100% конверсией в FGly). Можно определить количество пептидов, содержащих FGly (соответствующее количеству активных молекул I2S), и общее количество пептидов, содержащих FGly и Cys (соответствующее общему количеству молекул I2S), и рассчитать соотношение, отображающее %ФГ.
Специфическая активность
Как обсуждалось выше, обычно на ферментативную активность I2S оказывает влияние посттрансляционная модификация консервативного цистеина (например, аминокислоты 59) в формилглицин. Таким образом, ферментативная активность I2S обычно положительно коррелирует со степенью формилглициновой модификации I2S. Например, препарат I2S, который содержит относительно большое количество формилглициновых модификаций, обычно характеризуется относительно высокой специфической ферментативной активностью; а препарат I2S, который содержит относительно небольшое количество формилглициновых модификаций, обычно характеризуется относительно низкой специфической ферментативной активностью.
Для специалиста в данной области техники очевидно, что ферментативную активность рекомбинантного белка I2S, вырабатываемого клетками согласно настоящему изобретению, можно измерить различными in vitro и in vivo методами. В некоторых вариантах реализации изобретения измеренная при помощи метода определения in vitro активности высвобождения сульфата с применением в качестве субстрата гепарин дисахарида подходящая ферментативная активность полученного рекомбинантного белка I2S составляет по меньшей мере около 20 Е/мг, 30 Е/мг, 40 Е/мг, 50 Е/мг, 60 Е/мг, 70 Е/мг, 80 Е/мг, 90 Е/мг или 100 Е/мг. В некоторых вариантах реализации изобретения измеренная при помощи метода определения in vitro активности высвобождения сульфата с применением в качестве субстрата гепарин дисахарида подходящая ферментативная активность полученного рекомбинантного белка I2S находится в диапазоне, составляющем около 20-100 Е/мг (например, около 20-90 Е/мг, около 20-80 Е/мг, около 20-70 Е/мг, около 20-60 Е/мг, около 20-50 Е/мг, около 20-40 Е/мг, около 20-30 Е/мг, около 30-100 Е/мг, около 30-90 Е/мг, около 30-80 Е/мг, около 30-70 Е/мг, около 30-60 Е/мг, около 30-50 Е/мг, около 30-40 Е/мг, около 40-100 Е/мг, около 40-90 Е/мг, около 40-80 Е/мг, около 40-70 Е/мг, около 40-60 Е/мг, около 40-50
- 20 044790
Е/мг). Типовые условия для проведения определения in vitro активности высвобождения сульфата с применением в качестве субстрата гепарин дисахарида приведены ниже. Как правило, в этом методе определяют способность I2S высвобождать сульфат-ионы из субстрата природного происхождения - гепарин дисахарида. Количество высвобожденного сульфата можно определить при помощи ионной хроматографии. В некоторых случаях ионная хроматография включает использование детектора по проводимости. В качестве неограничивающего примера можно привести схему, в которой образцам сначала заменяют буфер на 10 мМ ацетата Na, pH 6, для устранения подавления фосфат-ионами в буферной смеси. Затем образцы разводят до 0,075 мг/мл реакционным буфером (10 мМ ацетата Na, pH 4,4) и инкубируют на протяжении 2 ч при 37°С с гепарин дисахаридом при соотношении фермента и субстрата, соответствующем 0,3 мкг I2S/100 мкг субстрата в 30 мкЛ реакционном объеме. Затем реакцию останавливают путем нагревания образцов при 100°С на протяжении 3 мин. Анализ проводят, применяя аналитическую колонку Dionex IonPac AS18 с предколонкой IonPac AG18. Применяют изократический способ с 30 мМ гидроксида калия при 1,0 мЛ/мин на протяжении 15 мин. Количество сульфата, высвобожденного образцом I2S, рассчитывают, применяя линейно-регрессионный анализ сульфатных проб в диапазоне от 1,7 до 16,0 нмоль. Фиксируемую величину выражают в единицах на мг белка, где 1 единица соответствует 1 мкмолю сульфата, высвобождаемого в час, а концентрацию белка определяют при помощи измерений А280.
В некоторых вариантах реализации изобретения ферментативную активность рекомбинантного белка I2S, вырабатываемого клетками согласно настоящему изобретению, можно также определить при помощи многих других способов, известных в данной области техники, таких как, например, анализ с 4MUF, в котором оценивают гидролиз 4-метилумбеллиферил-сульфата на сульфат и природный флуоресцентный 4-метилумбеллиферил (4-MUF). В некоторых вариантах реализации изобретения определенная при помощи in vitro анализа с 4-MUF подходящая ферментативная активность полученного рекомбинантного белка I2S составляет по меньшей мере около 2 Е/мг, 4 Е/мг, 6 Е/мг, 8 Е/мг, 10 Е/мг, 12 Е/мг, 14 Е/мг, 16 Е/мг, 18 Е/мг или 20 Е/мг. В некоторых вариантах реализации изобретения определенная при помощи in vitro анализа с 4-MUF подходящая ферментативная активность полученного рекомбинантного белка I2S находится в диапазоне, составляющем около 0-50 Е/мг (например, около 0-40 Е/мг, около 0-30 Е/мг, около 0-20 Е/мг, около 0-10 Е/мг, около 2-50 Е/мг, около 2-40 Е/мг, около 2-30 Е/мг, около 2-20 Е/мг, около 2-10 Е/мг, около 4-50 Е/мг, около 4-40 Е/мг, около 4-30 Е/мг, около 4-20 Е/мг, около 4-10 Е/мг, около 6-50 Е/мг, около 6-40 Е/мг, около 6-30 Е/мг, около 6-20 Е/мг, около 6-10 Е/мг). Типовые условия для проведения in vitro анализа с 4-MUF приведены ниже. Как правило, при помощи анализа с 4MUF определяют способность белка I2S осуществлять гидролиз 4-метилумбеллиферил-сульфата (4MUF-SO4) на сульфат и природный флуоресцентный 4-метилумбеллиферил (4-MUF). Одна миллиединица активности соответствует количеству фермента, необходимого для превращения одного наномоля 4MUF-SO4 в 4-MUF за 1 мин при 37°С. Как правило, сгенерированные пробными образцами с известной активностью средние единицы флуоресценции (СЕФ) можно применить для построения стандартной кривой, которую можно применить для расчета ферментативной активности представляющего интерес образца.
Среды и условия для культивирования клеток
Для получения рекомбинантного белка I2S при помощи сконструированных клеток согласно настоящему изобретению можно применять различные среды и условия для культивирования клеток. Например, рекомбинантный белок I2S можно получить в содержащей сыворотку или бессывороточной среде. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок I2S получают в бессывороточной среде. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок I2S получают в неживотной среде, т.е. среде, в которой отсутствуют компоненты животного происхождения. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок I2S получают в химически определенной среде. Употребляемый в данном тексте термин химически определенная питательная среда относится к среде, практически все химические компоненты которой известны. В некоторых вариантах реализации изобретения химически определенная питательная среда не содержит компонентов животного происхождения, таких как сыворотка, сывороточные белки (например, альбумин или фетуин) и другие компоненты. В некоторых случаях химически определенная среда содержит один или более белков (например, белковые факторы роста или цитокины). В некоторых случаях химически определенная питательная среда содержит один или более белковых гидролизатов. В других случаях химически определенная питательная среда является безбелковой средой, т.е. бессывороточной средой, которая не содержит белков, гидролизатов или компонентов с неизвестным составом.
В некоторых вариантах реализации изобретения химически определенная питательная среда может быть дополнена одним или более компонентов животного происхождения. Такие компоненты животного происхождения включают, но не ограничиваются этим, фетальную телячью сыворотку, лошадиную сыворотку, козлиную сыворотку, ослиную сыворотку, человеческую сыворотку и сывороточные белки, такие как альбумины (например, бычий сывороточный альбумин или человеческий сывороточный альбумин).
- 21 044790
Для получения рекомбинантных белов I2S в больших масштабах можно применять различные условия клеточного культивирования, включая, но не ограничиваясь этим, культивирование в роллерных флаконах, периодическое культивирование в биореакторах и культивирование с подпиткой в биореакторах. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок I2S получают при помощи клеток, культивируемых в суспензии. В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный белок I2S получают при помощи адгезивных клеток.
Типовые среды для клеток и условия культивирования описаны в разделе Примеров. Дополнительные типовые способы и составы для получения рекомбинантного белка I2S описаны в предварительной заявке под названием Способы и составы для получения рекомбинантной идуронат-2-сульфатазы, поданной на регистрацию одновременно с настоящим документом, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
Очистка экспрессируемого белка I2S
Для очистки или выделения белка I2S, полученного в соответствии с различными описанными в данном тексте способами, можно применять различные способы реализации изобретения. В некоторых вариантах реализации изобретения экспрессируемый белок I2S секретируется в среду, и, следовательно, клетки и другие твердые частицы можно удалить путем, например, центрифугирования или фильтрования на первом этапе процесса очистки. В альтернативном или дополнительном варианте экспрессируемый белок I2S связан с поверхностью клетки-хозяина. В этом варианте реализации изобретения в целях очистки клетки-хозяева, экспрессирующие полипептид или белок, лизируют. Лизис клеток-хозяев млекопитающих можно осуществлять любым из многочисленных способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, включая физическое разрушение при помощи стеклянных гранул и создание условий с высоким уровнем рН.
Белок I2S можно выделять и очищать при помощи стандартных способов, включая, но не ограничиваясь этим, хроматографию (например, ионообменную, аффинную, эксклюзионную и гидроксиапатитовую хроматографию), гель-фильтрацию, центрифугирование или дифференциальную растворимость, преципитацию этанолом, или при помощи любого другого доступного способа очистки белков (смотрите, например, Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S. J. and Hames, B. D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; and Deutscher, M. P., Simon, M. I, Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997, которые все включены в данный документ посредством ссылки). В частности, в случае иммуноаффинной хроматографии белок можно выделить путем связывания его с аффинной колонкой, содержащей антитела, которые были получены против данного белка и зафиксированы на стационарной подложке. В альтернативном варианте при помощи стандартных рекомбинантных методов к белку можно присоединить аффинные метки, такие как последовательность наружной оболочки инфлюэнцы, поли-гистидин или глутатион-S-трансферазу, для того чтобы облегчить очистку при пропускании через соответствующую аффинную колонку. Для того чтобы снизить или исключить деградацию полипептида или белка во время процесса очистки, на любом его этапе можно добавлять ингибиторы протеаз, такие как фенилметилсульфонил фторид (ФМСФ), леупептин или апротинин. Ингибиторы протеаз в особенности необходимы в случае лизирования клеток с целью выделения и очистки экспрессируемого полипептида или белка.
Типовые способы очистки описаны в разделе Примеров. Дополнительные способы очистки описаны в предварительной заявке под названием Очистка рекомбинантного белка I2S, поданной на регистрацию одновременно с настоящим документом, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
Фармацевтический состав и введение
Очищенный рекомбинантный белок I2S можно вводить пациенту с синдромом Хантера в соответствии с известными способами. Например, очищенный рекомбинантный белок I2S может быть доставлен внутривенным, подкожным, внутримышечным, парентеральным, трансдермальным или трансмукозальным (например, оральным или назальным) путем.
В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный I2S или содержащий его фармацевтический состав вводят субъекту путем внутривенного введения.
В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный I2S или содержащий его фармацевтический состав вводят субъекту путем интратекального введения. Употребляемый в данном тексте термин интратекальное введение или интратекальная инъекция относится к инъекции в спинномозговой канал (интратекальное пространство, окружающее спинной мозг). Можно применять разные методы, включая, без ограничений, латеральную церебровентрикулярную инъекцию через отверстие бора или цистернальную или поясничную пункцию и т.д. В некоторых вариантах реализации изобретения интратекальное введение или интратекальная доставка согласно настоящему изобретению относится к ИТ введению или доставке через поясничную область или участок, т.е. поясничному ИТ введению или доставке. Употребляемый в данном тексте термин поясничная область или поясничный участок относится к области между третьим и четвертым поясничными (нижняя часть спины) позвонками и, более точно, к L2-S1 участку позвоночника.
- 22 044790
В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный I2S или содержащий его фармацевтический состав вводят субъекту путем подкожного (т.е. под кожный покров) введения. В данном случае препарат можно инжектировать при помощи шприца. При этом доступны и другие устройства для введения препарата, такие как устройства для инъекции (например, устройства Inject-ease™ и Genject™ ); ручки-инъекторы (такие как GenPen™ ); безыгольные устройства (например, MediJector™ и BioJector™ ); и подкожные системы доставки на основе пластыря.
В некоторых вариантах реализации изобретения можно применять интратекальное введение совместно с другими способами введения (например, внутривенным, подкожным, внутримышечным, парентеральным, трансдермальным или трансмукозальным (например, оральным или назальным)).
В настоящем изобретении предполагается как одноразовое, так и многоразовое введение терапевтически эффективного количества рекомбинантного I2S или содержащего его фармацевтического состава, описанного в данном документе. Рекомбинантный I2S или содержащий его фармацевтический состав можно вводить через регулярные интервалы в зависимости от природы, тяжести и продолжительности болезненного состояния субъекта (например, лизосомной болезни накопления). В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантный I2S или содержащий его фармацевтический состав можно вводить периодически через регулярные интервалы (например, раз в год, раз в шесть месяцев, раз в пять месяцев, раз в три месяца, каждые два месяца (раз в два месяца), ежемесячно (раз в месяц), каждые две недели (раз в две недели), каждую неделю, ежедневно или постоянно).
Рекомбинантный I2S или содержащий его фармацевтический состав можно смешивать с физиологически приемлемым носителем или вспомогательным веществом для получения фармацевтического состава. Носитель и терапевтическое вещество могут быть стерильными. Препарат должен соответствовать способу введения.
Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются этим, солевые растворы (например, NaCl), физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, спирты, глицерол, этанол, гуммиарабик, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, желатин, углеводы, такие как лактозу, амилозу или крахмал, сахара, такие как маннит, цукрозу или другие, декстрозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вазелин, парфюмерное масло, эфиры жирных кислот, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпиролидон и т.д., а также их комбинации. Фармацевтические препараты при необходимости можно смешивать со вспомогательными веществами (например, лубрикантами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими агентами, эмульсификаторами, солями для изменения осмотического давления, буферами, красителями, ароматизаторами и/или ароматическими веществами и т.д.), которые не вступают в нежелательные реакции с активными компонентами или не влияют на их активность. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют водорастворимый носитель, подходящий для внутривенного введения.
Состав или лекарственный препарат при необходимости может также содержать небольшие количества смачивающих и эмульсифицирующих агентов либо буферных агентов для изменения рН. Состав может представлять собой жидкий раствор, суспензию, эмульсию, таблетку, пилюлю, капсулу, препарат замедленного высвобождения или порошок. Также состав может быть изготовлен в виде суппозитория с традиционными связывающими веществами и носителями, такими как триглицериды. Препарат для перорального применения может содержать стандартные носители, такие как фармацевтической степени чистоты маннит, лактоза, крохмал, стеарат магния, поливинилпироллидон, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и т.д.
Состав или лекарственный препарат можно изготовить в соответствии со стандартными процедурами в виде фармацевтического состава, подходящего для введения людям. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения состав для внутривенного введения обычно представляет собой раствор в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости состав также может содержать растворитель и местный анестетик для снижения болевых ощущений в месте инъекции. В общем случае ингредиенты либо добавляют отдельно, либо смешивают вместе в единичной дозировочной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или пакет с указанием количества активного вещества. Если состав предназначен для инфузионного введения, его можно развести в инфузионном флаконе, содержащем стерильную фармацевтической степени чистоты воду, солевой раствор или декстрозу/воду. Если состав предназначен для инъекционного введения, к нему может прилагаться ампула со стерильной водой для инъекции или солевым раствором так, что ингредиенты можно смешивать перед введением.
Употребляемый в данном тексте термин терапевтически эффективное количество определяется, главным образом, на основании общего количества терапевтического вещества, содержащегося в фармацевтических составах согласно настоящему изобретению. В общем случае терапевтически эффективного количества достаточно, чтобы достичь заметного положительного эффекта для пациента (например, лечения, модуляции, исцеления, предотвращения и/или облегчения первопричинного заболевания или болезненного состояния). Например, терапевтически эффективное количество может представлять собой количество, достаточное для достижения требуемого терапевтического и/или профилактического эффек
- 23 044790 та, такое как количество, достаточное для модуляции лизосомных ферментных рецепторов или их активности, которая приводит к лечению лизосомной болезни накопления или ее симптомов (например, снижению или исключению появления пенистых клеток или клеточной вакуолизации после введения субъекту составов согласно настоящему изобретению). В общем случае количество терапевтического вещества (т.е. рекомбинантного лизосомного фермента), водимого нуждающемуся в этом субъекту, зависит от характеристик субъекта. Такие характеристики включают болезненное состояние, тяжесть заболевания, общее состояние здоровья, возраст, пол и массу тела субъекта. Для специалиста в данной области техники не составит труда определить соответствующие дозировки в зависимости от этих и других факторов. Вдобавок, для определения оптимальных диапазонов дозировок можно применять как объективный, так и субъективный анализ.
Терапевтически эффективное количество обычно вводят в режиме дозирования, который может включать множественное дозирование. Терапевтически эффективное количество (и/или соответствующая единичная дозировка в рамках эффективного режима дозирования) может варьироваться для каждого конкретного терапевтического белка, например, в зависимости от способа введения или от комбинирования с другими фармацевтическими веществами. Также определенное терапевтически эффективное количество (и/или единичная дозировка) в случае каждого конкретного пациента может зависеть от множества факторов, включая нарушение, лечение которого проводится, и степень тяжести этого нарушения; активность определенного применяемого фармацевтического вещества; определенный применяемый состав; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и образ питания пациента; время введения, способ введения и/или скорость выведения или метаболизма определенного применяемого слитого белка; продолжительность лечения; и тому подобные факторы, что хорошо известно в областях техники медицины.
Дополнительные типовые фармацевтические составы и способы введения описаны в публикации согласно РСТ WO 2011/163649 под названием Способы и составы для ЦНС доставки идуронат-2сульфатазы и предварительной заявке № 61/618638 под названием Подкожное введение идуронат-2сульфатазы, поданной на регистрацию 30 марта 2012 г., полное содержание которых включено в данный текст посредством ссылки.
Также стоит понимать, что в случае каждого конкретного субъекта соответствующие режимы дозирования должны быть со временем согласованы в соответствии с индивидуальными требованиями и профессиональной оценкой специалиста, осуществляющего применение или контролирующего применение ферментозаместительной терапии, а приведенные в данном тексте диапазоны дозировок являются только примерами и не ограничивают объема или практической реализации заявляемого изобретения.
Примеры
Пример 1. Генерация оптимизированной клеточной линии, коэкспрессирующей рекомбинантные I2S и FGE
В этом примере проиллюстрирована типовая оптимизированная клеточная линия, коэкспрессирующая рекомбинантные I2S и FGE, которую можно применять для получения рекомбинантного белка I2S. Для специалиста в данной области техники очевидно, что существует большое количество альтернативных подходов, экспрессионных векторов и методов клонирования.
Типичной зрелой формой человеческого фермента идуронат-2-сульфатазы (I2S) является 525аминокислотный гликопротеин, который для ферментативной активации подвергается активному процессингу и посттрансляционной модификации, такой как гликозилирование или конверсия цистеина в формилглицин (фиг. 1). В клетках млекопитающих консервативные остатки цистеина в ферменте I2S (т.е. в аминокислоте 59) преобразуются в формилглицин при помощи формилглицин-образующего фермента (FGE). Конверсия цистеина в формилглицин на активном участке фермента I2S является важным этапом образования активной формы человеческого фермента сульфатазы. Целью данного эксперимента было создание оптимизированной клеточной линии, коэкспрессирующей I2S и FGE, для получения активного рекомбинантного I2S.
На фиг. 2 приведены типовые конструкции для коэкспрессии I2S и FGE. Например, экспрессионные единицы I2S и FGE могут находиться на отдельных векторах, а отдельные векторы можно трансфицировать совместно или отдельно (фиг. 2А). В альтернативном варианте экспрессионные единицы I2S и FGE могут находиться на одном и том же векторе (фиг. 2В). В одной конфигурации I2S и FGE могут находиться на одном и том же векторе, но регулироваться отдельными промоторами, и называться отдельными цистронами (фиг. 2В(1)). В альтернативном варианте I2S и FGE могут быть сконструированы в виде транскрипционно связанных цистронов, что означает, что I2S и FGE сконструированы в виде открытой рамки считывания под управлением одного промотора (фиг. 2В(2)). Как правило, участок внутренней посадки рибосомы (IRES) сконструирован таким образом, чтобы сделать возможной кэп-независимую инициацию трансляции матричной РНК (фиг. 2В(2)).
Человеческую клеточную линию сконструировали для коэкспрессии человеческого белка I2S с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2, и человеческого формилглицинобразующего фермента (FGE) с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 6.
- 24 044790
SEQ ID NO: 2: Полноразмерный предшественник идур_онат-2-сульфатазы
MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLUVDDLRPSLGCYGDKLV RSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTI PQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGEL HANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEF QKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQ SYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNFDVATH VPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGL QVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWN SDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMY NDSQGGDLFQLLMP
SEQ ID NO: 6: Полноразмерный предшественник человеческого FGE:
MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQRP GAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPGERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDGEAPA RRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSEQVKTNIQQAVA AAPWWLPVKGANWRHPEGPDSTILHRPDHPVLHVSWNDAVAYCTWAGKRLPTEAEW EYSCRGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGFQGTAPVDAFPPNGV GLYNIVGNAWEWT SDWWTVHHS VEETLNPKGPP SGKDRVKKGGS YMCHRS YC YRYR CAARSQNTPDSSASNLGFRCAADRLPTMD
Для генерации экспрессирующей I2S клеточной линии клетки стабильно трансфицировали кодоноптимизированной нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO: 7), кодирующей белок I2S с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 2, и нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO: 8), кодирующей человеческий фермент FGE, приведенный в SEQ ID NO: 6.
SEQ ID NO: 7: Кодоноптимизированная идуронат-2-сульфатаза (I2S) Homo sapiens, вариант транскрипта 1, мРНК
ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGC GTGTGCGTGGCCCTGGGCAGCGAGACCCAGGCCAACAGCACCACCGACGCCCTGAA CGTGCTGCTGATCATCGTGGACGACCTGCGCCCCAGCCTGGGCTGCTACGGCGACAA GCTGGTGCGCAGCCCCAACATCGACCAGCTGGCCAGCCACAGCCTGCTGTTCCAGA ACGCCTTCGCCCAGCAGGCCGTGTGCGCCCCCAGCCGCGTGAGCTTCCTGACCGGCC GCCGCCCCGACACCACCCGCCTGTACGACTTCAACAGCTACTGGCGCGTGCACGCCG GCAACTTCAGCACCATCCCCCAGTACTTCAAGGAGAACGGCTACGTGACCATGAGC GTGGGCAAGGTGTTCCACCCCGGCATCAGCAGCAACCACACCGACGACAGCCCCTA CAGCTGGAGCTTCCCCCCCTACCACCCCAGCAGCGAGAAGTACGAGAACACCAAGA CCTGCCGCGGCCCCGACGGCGAGCTGCACGCCAACCTGCTGTGCCCCGTGGACGTG
CTGGACGTGCCCGAGGGCACCCTGCCCGACAAGCAGAGCACCGAGCAGGCCATCCA GCTGCTGGAGAAGATGAAGACCAGCGCCAGCCCCTTCTTCCTGGCCGTGGGCTACC ACAAGCCCCACATCCCCTTCCGCTACCCCAAGGAGTTCCAGAAGCTGTACCCCCTGG AGAACATCACCCTGGCCCCCGACCCCGAGGTGCCCGACGGCCTGCCCCCCGTGGCCT ACAACCCCTGGATGGACATCCGCCAGCGCGAGGACGTGCAGGCCCTGAACATCAGC GTGCCCTACGGCCCCATCCCCGTGGACTTCCAGCGCAAGATCCGCCAGAGCTACTTC GCCAGCGTGAGCTACCTGGACACCCAGGTGGGCCGCCTGCTGAGCGCCCTGGACGA CCTGCAGCTGGCCAACAGCACCATCATCGCCTTCACCAGCGACCACGGCTGGGCCCT GGGCGAGCACGGCGAGTGGGCCAAGTACAGCAACTTCGACGTGGCCACCCACGTGC CCCTGATCTTCTACGTGCCCGGCCGCACCGCCAGCCTGCCCGAGGCCGGCGAGAAG CTGTTCCCCTACCTGGACCCCTTCGACAGCGCCAGCCAGCTGATGGAGCCCGGCCGC CAGAGCATGGACCTGGTGGAGCTGGTGAGCCTGTTCCCCACCCTGGCCGGCCTGGCC GGCCTGCAGGTGCCCCCCCGCTGCCCCGTGCCCAGCTTCCACGTGGAGCTGTGCCGC GAGGGCAAGAACCTGCTGAAGCACTTCCGCTTCCGCGACCTGGAGGAGGACCCCTA CCTGCCCGGCAACCCCCGCGAGCTGATCGCCTACAGCCAGTACCCCCGCCCCAGCG ACATCCCCCAGTGGAACAGCGACAAGCCCAGCCTGAAGGACATCAAGATCATGGGC TACAGCATCCGCACCATCGACTACCGCTACACCGTGTGGGTGGGCTTCAACCCCGAC GAGTTCCTGGCCAACTTCAGCGACATCCACGCCGGCGAGCTGTACTTCGTGGACAGC GACCCCCTGCAGGACCACAACATGTACAACGACAGCCAGGGCGGCGACCTGTTCCA GCTGCTGATGCCCTAG
- 25 044790
SEQ ID NO: 8: > Полноразмерный предшественник формилглицинобразующего фермента (FGE)
Homo sapiens, мРНК
ATGGCTGCGCCCGCACTAGGGCTGGTGTGTGGACGTTGCCCTGAGCTGGGTCTCGTC CTCTTGCTGCTGCTGCTCTCGCTGCTGTGTGGAGCGGCAGGGAGCCAGGAGGCCGGG ACCGGTGCGGGCGCGGGGTCCCTTGCGGGTTCTTGCGGCTGCGGCACGCCCCAGCG GCCTGGCGCCCATGGCAGTTCGGCAGCCGCTCACCGATACTCGCGGGAGGCTAACG CTCCGGGCCCCGTACCCGGAGAGCGGCAACTCGCGCACTCAAAGATGGTCCCCATC CCTGCTGGAGTATTTACAATGGGCACAGATGATCCTCAGATAAAGCAGGATGGGGA AGCACCTGCGAGGAGAGTTACTATTGATGCCTTTTACATGGATGCCTATGAAGTCAG TAATACTGAATTTGAGAAGTTTGTGAACTCAACTGGCTATTTGACAGAGGCTGAGAA GTTTGGCGACTCCTTTGTCTTTGAAGGCATGTTGAGTGAGCAAGTGAAGACCAATAT TCAACAGGCAGTTGCAGCTGCTCCCTGGTGGTTACCTGTGAAAGGCGCTAACTGGAG ACACCCAGAAGGGCCTGACTCTACTATTCTGCACAGGCCGGATCATCCAGTTCTCCA TGTGTCCTGGAATGATGCGGTTGCCTACTGCACTTGGGCAGGGAAGCGGCTGCCCAC GGAAGCTGAGTGGGAATACAGCTGTCGAGGAGGCCTGCATAATAGACTTTTCCCCT GGGGCAACAAACTGCAGCCCAAAGGCCAGCATTATGCCAACATTTGGCAGGGCGAG TTTCCGGTGACCAACACTGGTGAGGATGGCTTCCAAGGAACTGCGCCTGTTGATGCC TTCCCTCCCAATGGTTATGGCTTATACAACATAGTGGGGAACGCATGGGAATGGACT TCAGACTGGTGGACTGTTCATCATTCTGTTGAAGAAACGCTTAACCCAAAAGGTCCC CCTTCTGGGAAAGACCGAGTGAAGAAAGGTGGATCCTACATGTGCCATAGGTCTTA TTGTTACAGGTATCGCTGTGCTGCTCGGAGCCAGAACACACCTGATAGCTCTGCTTC GAATCTGGGATTCCGCTGTGCAGCCGACCGCCTGCCCACCATGGACTGA
Обе нуклеотидные последовательности, кодирующие I2S и FGE, регулируются промотором CMV человека. Трансляция I2S мРНК приводит к синтезу 550-аминокислотного полноразмерного белка I2S (SEQ ID NO:2), который содержит 25-аминокислотный сигнальный пептид. Сигнальный пептид удаляется, и растворимый фермент секретируется из клетки.
Кодирующую последовательность неомицин фосфотрансферазы (neo) бактерий и/или ген бластидицин S деаминазы (BSD) применили для того, чтобы сделать возможной селекцию трансфицированных клеток, применив аналог неомицина G418 и/или бластидицин, соответственно. Вдобавок, применили ген мышиной дигидрофолатредуктазы (DHFR) в I2S- и/или РОЕ-кодирующем(их) векторе(ах) для того, чтобы сделать возможным выделение клеточных линий, содержащих повышенное количество копий I2Sи/или FGE-кодирующих последовательностей при помощи селекции с помощью метотрексата (МТХ).
Клетки, вырабатывающие I2S, выделяли и проводили отбор по чувствительности к лекарственному препарату для того, чтобы выделить клетки с повышенным количеством копий трансфицированных генов I2S и/или FGE. Количественный анализ I2S проводили при помощи ELISA.
Клеточную популяцию также подвергали процедуре пошагового отбора в метотрексате (МТХ) для того, чтобы выделить клетки с повышенной выработкой I2S. Выработку I2S отслеживали во время селекции с применением МТХ при помощи ELISA.
После нескольких циклов культивирования несколько вырабатывающих I2S клонов подвергали суспензионной адаптации в бессывороточной среде с пошаговым снижением от DMEM, содержащей 10% телячью сыворотку, до бессывороточной химически определенной среды. При клонировании методом серийного разведения были получены несколько отдельных популяций клонов. Колонии отбирали по результатам анализа ферментативной активности I2S и ELISA. Две стабильные клеточные линии 2D и 4D демонстрировали высокий процент выживаемости и повышенную экспрессию I2S и были отобраны для дополнительного исследования.
Пример 2. Оценка стабильных клеточных линий, коэкспрессирующих рекомбинантные I2S и FGE
Проводили дополнительные эксперименты для получения характеристик двух клеточных линий 2D и 4D, коэкспрессирующих I2S и FGE.
Специфическая активность
Сначала оценивали специфическую активность фермента I2S. Анализ специфической активности фермента I2S, вырабатываемого клеточными линиями 2D и 4D, проводили при помощи флуоресцентного анализа с 4-MUF. Вкратце, в данном анализе оценивают гидролиз субстрата I2S - 4-метилумбеллиферилсульфата (4-MUF-SO4). После расщепления субстрата 4-MUF-SO4 I2S молекула преобразуется в сульфат и природный флуоресцентный 4-метилумбеллиферил (4-MUF). В результате ферментативную активность I2S можно определить, оценивая общее изменение флуоресцентного сигнала со временем. В этом эксперименте очищенный белок I2S, полученный из человеческих клеточных линий I2S-AF 2D и 4D, инкубировали с раствором 4-метилумбеллиферил-сульфата (4-MUF-SO4), солью калия, Sigma Cat. # М7133). Калибровку в данном анализе проводили, применяя группы контрольных образцов, содержащих коммерчески доступный фермент I2S, разведенный в маточном растворе в соотношении 1:100, 1:200 и 1:20000. Ферментный анализ проводили при 37°С при помощи откалиброванного флуорометра. Применяя значения флуоресценции, полученные для каждого эталонного образца, процентный коэффициент вариации определяли при помощи следующего выражения:
ο/ορτβ -Стандартное отклонение исходного значения флуоресценции (N = 3) γ jqq% Среднее значение флуоресценции
Затем процентные значения KB применяли для расчета скорректированной средней флуоресценции
- 26 044790 для каждого образца, для того чтобы определить регистрируемую ферментативную активность, выраженную в мЕ/мЛ, при помощи следующей формулы:
мЕ ( 10ЕФ Д10 мЯД 0,60 минД нмольJ
СЕФ - отрицательная скорректированная средняя флуоресценция;
КР - кратность разведения
Одна милиединица активности соответствует количеству фермента, необходимого для превращения одного наномоля 4-метилумбеллиферил-сульфата в 4-метилумбеллиферил за 1 мин при 37°С.
Процент конверсии в формилглицин
Для определения процента FGly-конверсии можно применять пептидное картирование. Для активации I2S необходима конверсия цистеина (соответствующего позиции 59 зрелого человеческого I2S) в формилглицин при помощи формилглицин-образующего фермента (FGE), как показано ниже:
(НО)
HS,
СК ,Η | Формилглицин- |
XxxXxxCysXxxProXxxArgXxxXxx ---------------► XxxXxxFGlyXxxProXxxArgXxxXxx (Ser) (Ala) образующий фермент (Ala)
Следовательно, процент конверсии в формилглицин (%ФГ) можно рассчитать, используя следующую формулу:
Количество активных молекул 12S %ФГ (I2S) = ----------------------------------------- х10°
Общее количество (активных + неактивных) молекул 12S
Например, 50% ФГ означает то, что половина очищенного рекомбинантного I2S ферментативно неактивна и не оказывает терапевтического эффекта.
Для расчета %ФГ применяли пептидное картирование. Вкратце, рекомбинантный белок I2S расщепляли на короткие пептиды при помощи протеаз (например, трипсина или химотрипсина). Короткие пептиды разделяли и получали их характеристики при помощи HPLC. Пептид, в состав которого входит позиция, соответствующая позиции 59 зрелого человеческого I2S, выбирали, чтобы определить, был ли Cys в позиции 59 преобразован в FGly, по сравнению с контролем (например, белком I2S без конверсии в FGly или белком I2S со 100% конверсией в FGly). На основании соответствующих пиковых площадей можно определить количество пептидов, содержащих FGly (соответствующее количеству активных молекул I2S), и общее количество пептидов, содержащих FGly и Cys (соответствующее общему количеству молекул I2S), и рассчитать соотношение, отображающее %ФГ.
Корреляция между процентом конверсии в FGly и специфической активностью
Типовая корреляция между процентом конверсии в FGly и специфической активностью проиллюстрирована на фиг. 3. Как видно, данные показывают, что более высокий процент конверсии в FGly приводит к более высокой ферментативной активности I2S.
Карта гликанов
Проводили определение состава гликанов рекомбинантного белка I2S, вырабатываемого клеточными линиями 2D и 4D. Количественную оценку состава гликанов проводили при помощи анионообменной хроматографии. Как описано ниже, карта гликанов рекомбинантного I2S, полученная в этих условиях, состоит из семи пиковых групп, элюирующихся в соответствии с возрастанием количества отрицательных зарядов, по меньшей мере частично принадлежащих гликоформам сиаловой кислоты и маннозо-6фосфата, полученных в результате ферментного расщепления. Вкратце очищенный рекомбинантный I2S, полученный при применении бессывороточного способа клеточного культивирования (бессывороточная I2S-AF 2D и бессывороточная I2S-AF 4D), и контрольный рекомбинантный I2S обрабатывали (1) очищенным ферментом нейраминидазой (выделенной из Arthrobacter Ureafaciens (10 мЕ/мкЛ), Roche Biochemical (Индианаполис, Индиана), Cat. # 269 611 (1 Е/100 мкЛ)) для удаления остатков сиаловой кислоты, (2) алкалинфосфатазой на протяжении 2 ч при 37±1°С для полного высвобождения остатков маннозо6-фосфата, (3) алкалинфосфатазой + нейраминидазой или (4) не проводили обработку. Каждое ферментативное расщепление анализировали при помощи высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (HPAE-PAD), используя аналитическую колонку CarboPac PA1 Analytical Column с предколонкой Dionex CarboPac PAL В каждом анализе применяли эталонные группы сиаловой кислоты и маннозо-6-фосфата в диапазоне, составляющем от 4,0 до 2,0 нмоль. Применяли изократический способ с использованием 48 мМ ацетата натрия в 100 мМ гидроксида натрия на протяжении как минимум 15 мин при скорости потока 1,0 мл/мин при внешней температуре колонки для элюирования каждого пика. Данные, полученные для каждого отдельного этапа для образцов I2S-AF и контрольного I2S, объединяли на одной хроматограмме, чтобы получить карту гликанов для каждого соответствующего рекомбинантного белка. Как проиллюстрировано на фиг. 4, на типовой карте гликанов для I2S, вырабатываемого клеточными линиями 2D и 4D, представлены типичные элюционные пики (в порядке элюирования), соответствующие нейтральным, моно-, дисиалированным, монофосфорилиро- 27 044790 ванным, трисиалированным и гибридным (моносиалированным и кэпированному маннозо-6-фосфату), тетрасиалированным и гибридным (дисиалированным и кэпированному маннозо-6-фосфату) и дифосфорилированным гликанам.
Пример 3. Бессывороточное суспензионное клеточное культивирование
Этот пример демонстрирует, что можно разработать способ бессывороточного суспензионного культивирования в больших масштабах для культивирования оптимизированной клеточной линии для получения рекомбинантного I2S.
Система для бессывороточного суспензионного культивирования
Вкратце, культуру для посева получали, применяя клеточную линию 2D или 4D из примера 1. Клетки переносили в 250 мл качалку для тканевого культивирования, содержащую бессывороточную химически определенную среду для размножения с добавлением МТХ для селекции, доводили бикарбонатом натрия до рН 7,3 и выращивали при 37°С при 5% СО2 на протяжении нескольких дней. Когда культура достигала достаточной клеточной плотности и жизнеспособности, исходную культуру для посева применяли для инокуляции первой группы для поэтапной экспансии клеточной культуры в 500 мЛ качалках для тканевого культивирования, а затем - в 1 Л качалках для тканевого культивирования.
Экспансию периодической культуры проводили путем перенесения каждой из 1 Л культур в 10 Л Cellbag bioreactor® (Wave Europe) и добавления среды для экспансии. После достижения достаточной клеточной плотности добавляли новую среду для экспансии и выращивали клетки до достаточной плотности. 10 Л Cellbag переносили в систему Wave bioreactor® (Wave Europe) и модифицировали условия культивирования, чтобы обеспечить возможность роста при непрерывной перфузии среды. Проводили доставку среды для роста и экспансии, а образцы собирали для анализа рН, глутамина, глутамата, глюкозы, аммония, лактата, рСО2 и осмолярности в отсутствие метаболитов.
После достижения достаточной клеточной плотности всю 10 Л клеточную культуру переносили в 50 Л Wave Cellbag bioreactor®, содержащий свежую среду для экспансии, и выращивали до достаточной плотности, применяя систему Wave bioreactor®.
Затем проводили экспансию клеток, применяя 200 Л одноразовый биореактор и центрифужное перфузионное устройство (Centritech® CELL II unit, Pneumatic Scale Corporation), которое было сконструировано для концентрации клеток и очистки среды для повторного цикла во время перфузионноопосредованного клеточного культивирования. Среду для экспансии (доведенную до рН 7,10) инокулировали частью 50 Л культуры и выращивали до достаточной клеточной плотности.
Далее часть 200 Л культуры применяли для посева в 2000 Л одноразовый биореактор и центрифужное перфузионное устройство (Centritech® CELL II unit, Pneumatic Scale Corporation) в среду для серийного производства (доведенную до рН 7,20). Клетки выращивали в условиях для периодического роста. После двух дней выращивания условия корректировали с учетом непрерывной перфузии до достижения переходной фазы. Клетки выращивали в условиях для перфузионного роста на протяжении 24-часовой переходной фазы.
Для производственной фазы применяли два юнита Centritech CELL II. Производственную фазу начинали приблизительно через 24 часа после начала переходной фазы и продолжали на протяжении необходимого периода времени, регулируя скорость течения.
Хотя определенные компоненты, составы и способы, описанные в данном документе, были описаны в соответствии с определенными вариантами реализации изобретения, данные примеры служат исключительно для иллюстрирования компонентов изобретения и не ограничивают его.
Употребляемое в данном тексте в описании изобретения и в формуле изобретения единственное число, если четко не указано иное, подразумевает и множественные объекты. Пункты формулы изобретения или описания, которые содержат или между одним или более членов группы, считаются удовлетворительными, если один, более чем один или все члены группы присутствуют, задействованы или каким-либо другим способом связаны с данным продуктом или процессом, если не указано обратное или иное не очевидно из контекста. Изобретение включает варианты реализации, в которых только один член из группы присутствует, задействован или каким-либо другим способом связан с данным продуктом или процессом. Изобретение также включает варианты реализации, в которых более одного или все члены группы присутствуют, задействованы или каким-либо другим способом связаны с данным продуктом или процессом. Кроме того, стоит понимать, что изобретение включает все вариации, комбинации и перестановки, в которых одно или более ограничений, элементов, пунктов, описательных терминов и т.д. из одного или более перечисленных пунктов формулы изобретения вставлены в другой пункт, зависимый от того же основного пункта (или, в зависимости от содержания, от любого другого пункта), если не указано иное или если для специалиста в данной области техники очевидно, что может возникнуть противоречие или несогласованность. Там, где элементы представлены в виде списка (например, в виде группы Маркуша или в подобном формате), стоит понимать, что каждая подгруппа элементов также раскрывается, а любой(ые) элемент(ы) можно удалить из группы. Стоит понимать, что, в общем случае, там, где говорится, что изобретение или аспекты изобретения содержит/содержат конкретные элементы, признаки и т.д., определенные варианты реализации изобретения или аспекты изобретения состоят или пре- 28 044790 имущественно состоят из таких элементов, признаков и т.д. Для упрощения в данном тексте такие варианты реализации изобретения не были отдельно подробно описаны в каждом из случаев. Также стоит понимать, что любой вариант реализации или аспект изобретения может быть полностью исключен из формулы изобретения вне зависимости от того, присутствует ли это конкретное исключение в описании изобретения или нет. Публикации, вебсайты и другие ссылочные материалы, упоминаемые в данном тексте для описания уровня техники изобретения и дополнительных подробностей в отношении его практической реализации, включены в данный текст посредством ссылки.
Claims (21)
1. Клетка для получения идуронат-2-сульфатазы (I2S), содержащая первую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок идуронат-2-сульфатазы (I2S), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 1, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок формилглицинобразующего фермента (FGE);
при этом первая и/или вторая нуклеиновая кислота являются экзогенными, а клетка при культивировании в условиях клеточного культивирования экспрессирует мРНК I2S на уровне, который в от 0,1 до 10 раз выше, чем уровень мРНК FGE, экспрессируемой клеткой, и при этом клетка вырабатывает белок I2S, содержащий по меньшей мере около 70% остатков цистеина, соответствующих Cys59 из SEQ ID NO: 1, преобразованных в Са-формилглицин (FGly).
2. Клетка по п.1, отличающаяся тем, что клетка при культивировании в условиях клеточного культивирования вырабатывает белок I2S, содержащий по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97% остатков цистеина, соответствующих Cys59 из SEQ ID NO: 1, преобразованных в FGly.
3. Клетка по п.1 или 2, отличающаяся тем, что первая и/или вторая нуклеиновая кислота функционально связана с промотором hCMV.
4. Клетка по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что первая нуклеиновая кислота содержит последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную SEQ ID NO: 7.
5. Клетка по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что белок формилглицинобразующего фермента (FGE) содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 5
6. Клетка по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что вторая нуклеиновая кислота содержит последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную SEQ ID NO: 8.
7. Клетка по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что как первая, так и вторая нуклеиновые кислоты являются экзогенными.
8. Клетка по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что первая и/или вторая нуклеиновые кислоты интегрированы в геном клетки.
9. Клетка по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что первая и/или вторая нуклеиновые кислоты находятся в одной или более внехромосомных конструкциях.
10. Клетка по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что клетка является клеткой млекопитающего.
11. Клетка по п.10, отличающаяся тем, что клетка млекопитающего является клеткой человека или клеткой СНО.
12. Клетка по любому из пп.1-11, характеризующаяся тем, что первая нуклеиновая кислота кодирует белок идуронат-2-сульфатазы (I2S), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере 95% идентичную или полностью идентичную SEQ ID NO: 1.
13. Клетка по любому из пп.1-12, характеризующаяся тем, что вторая нуклеиновая кислота кодирует белок формилглицинобразующего фермента (FGE), содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или полностью идентичную SEQ ID NO: 5.
14. Клетка по любому из пп.1-13, характеризующаяся тем, что клетка вырабатывает I2S при уровне удельной продуктивности большем, чем 5 пг/клетку/день.
15. Способ получения рекомбинантного белка идуронат-2-сульфатазы (I2S), включающий культивирование клетки по любому из пп.1-14 в таких условиях, в которых рекомбинантные белки I2S и FGE коэкспрессируются в клетке.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что клетку культивируют в процессе, проходящем в биореакторе.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что объем биореактора выбран из 10, 200, 500, 1000, 1500 или 2000 л.
18. Способ по любому из пп.15-17, отличающийся тем, что культивирование является перфузионным процессом или процессом, проходящим в роллерном флаконе.
19. Способ по любому из пп.15-18, отличающийся тем, что клетки культивируют в бессывороточной среде.
20. Способ по любому из пп.15-19, отличающийся тем, что клетки культивируют в суспензии.
- 29 044790
21. Способ по любому из пп.15-20, отличающийся тем, что способ очистки рекомбинантного белка I2S.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61/666,719 | 2012-06-29 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044790B1 true EA044790B1 (ru) | 2023-09-29 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2018200710B2 (en) | Cells for producing recombinant iduronate-2-sulfatase | |
JP2015523074A (ja) | 組換えイズロン酸2スルファターゼの製造方法 | |
JP7119181B2 (ja) | 生産性向上のためのrna関連酵素の修飾 | |
EP3377093B1 (en) | Recombinant human c1 esterase inhibitor and uses thereof | |
EP3220958A1 (en) | Lysosomal targeting of enzymes, and uses thereof | |
WO2016025523A1 (en) | Lysosomal targeting and uses thereof | |
EP3357489A1 (en) | Mutated arylsulfatase a | |
EA044790B1 (ru) | Клетки для получения рекомбинантной идуронат-2-сульфатазы |