KR20110138223A

KR20110138223A - 짧은 간섭 핵산 (ｓｉＮＡ)을 사용한 세포간 부착 분자 1 (ＩＣＡＭ-1) 유전자 발현의 ＲＮＡ 간섭 매개 억제

Info

Publication number: KR20110138223A
Application number: KR1020117022535A
Authority: KR
Inventors: 월터 스트랩스; 지오티 샤; 빅토리아 피커링
Original assignee: 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션
Priority date: 2009-03-27
Filing date: 2010-03-25
Publication date: 2011-12-26
Also published as: JP2012521765A; CN102439152A; MX2011010072A; WO2010111497A2; CA2756069A1; SG174581A1; EP2411517A2; AU2010229847A1; WO2010111497A3; US20120004282A1; EA201171175A1

Abstract

본 발명은 ICAM-1 유전자 발현 및/또는 활성의 조절에 반응하고/거나 ICAM-1 유전자 발현 경로를 매개하는 소질, 질환 및 상태의 연구, 진단 및 치료를 위한 화합물, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 ICAM-1 유전자 발현에 대항하여 RNA 간섭 (RNAi)을 매개할 수 있거나, 또는 이를 매개하는 이중-가닥 핵산 분자, 예를 들어 핵산 소분자, 예컨대 짧은 간섭 핵산 (siNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자에 관한 것이다.

Description

짧은 간섭 핵산 (ｓｉＮＡ)을 사용한 세포간 부착 분자 1 (ＩＣＡＭ-1) 유전자 발현의 ＲＮＡ 간섭 매개 억제 {RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF THE INTERCELLULAR ADHESION MOLECULE 1 (ICAM-1) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)}

서열 목록

본원은 2009년 3월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 61/164,314를 우선권 주장한다. 상기 언급된 출원은 도면을 포함한 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

37 CFR §1.52(e)(5)에 따라 EFS를 통해 제출된 서열 목록은 본원에 참조로 포함된다. EFS를 통해 제출된 서열 목록 텍스트 파일은 2010년 3월 19일에 생성된 113,421 바이트 크기의 파일 "SequenceListing84WPCT"를 포함한다.

세포간 부착 분자 1 (ICAM-1, CD54)은 백혈구 부착에 의해 매개되는 염증 기능에 관여한다. 이는 세포 부착 분자의 이뮤노글로불린 상위부류에 속한다. 인간 ICAM-1은 5개의 'Ig-유사' 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 짧은 C-말단 세포질 도메인 도메인을 갖는다. ICAM-1은 백혈구, 섬유모세포, 상피 세포 및 내피 세포의 표면 상에서 발현된다. ICAM-1 발현은 염증 부위에서 상향-조절된다.

림프구 기능 관련-1 (LFA-1, CD11a/CD18) 항원은 ICAM-1에 대한 리간드이다. LFA-1은 세포-표면 수용체의 인테그린 부류의 구성원이다. LFA-1은 모든 백혈구의 표면 상에서 발현되고, 그의 항원-특이적 반응 및 귀환(homing)에 있어서 결정적이다. LFA-1은 세포용해 접합체 형성의 기초가 되는 백혈구 부착 반응, 헬퍼 T-세포 상호작용, 및 천연 킬러 세포 및 과립구에 의한 항체-의존성 킬링을 매개한다. LFA-1/ICAM-1 상호작용은 정상적인 면역 반응의 일부로서의, 혈관 내피에 대한 림프구의 부착, 및 주위 조직 내로의 그의 후속적 혈관외유출에 있어서 필수적이다. LFA-1 및 ICAM-1의 상호작용은 또한 염증성 병리상태 및 자가면역 질환과 관련된다.

인간 결막 상피에서의 ICAM-1의 발현은 쇼그렌 증후군과 관련된 건성안을 갖는 환자에서 상향-조절된다.

천식 악화는 일반적이며, 천식과 관련된 두드러진 이환율, 사망률 및 건강 관리 비용이 악화와 관련된다. 대부분의 악화는 바이러스 감염과 관련되지만, 또한 악화는 비정형 박테리아 감염, 또는 알레르겐 또는 다른 환경적 자극에 대한 노출로 인한 것일 수도 있다. 악화는 원인이 일차 감염성인지 또는 알레르기성인지의 여부에 따라 유형이 달라질 수 있는 기도 염증을 특징으로 한다. 악화의 대략 80％는 기도 바이러스 감염과 관련되며, 모든 악화의 대략 50％가 리노바이러스 감염을 원인으로 한다.

세포간 부착 및 신호전달을 촉진하는 정상적인 기능 이외에도, ICAM-1은 또한 인간 병원체에 의해 이용되며, 이는 인간 리노바이러스 (HRV)의 주요 군에 대한 세포 수용체이다. HRV는 피코르나바이러스과의 리노바이러스 속의 대부분을 구성한다. 100가지가 넘는 HRV의 별개의 혈청형이 존재하며, 이는 효과적인 백신의 개발을 막아왔다. HRV 혈청형은 그들이 세포 진입을 위해 사용하는 세포 수용체를 기반으로 2개의 군으로 배속될 수 있다. HRV 혈청형의 대략 10％는 부 수용체 군을 구성하고, 세포 진입을 위해 저-밀도 지단백질 수용체 (LDLr)를 이용한다. HRV 혈청형의 나머지 90％는 주 수용체 군을 구성하고, 인간 세포내 부착 분자 1 (ICAM-1)를 이용한다. 인간 ICAM 1의 2개의 아미노-말단 Ig-유사 도메인은 바이러스 캡시드의 20면체 5-겹침 축을 둘러싸는 "협곡부(canyon)"에 결합한다.

인간 리노바이러스는 상기도 감염 (감기)의 대략 2/3를 유발한다. 보다 최근의 연구에서는 리노바이러스가 또한 하기도 (LRT)에서도 복제될 수 있음이 입증되었다. 천식 대상체는 비-천식 대상체보다 리노바이러스로 인한 훨씬 심한 LRT 질병 (기관지 과민반응의 상승 및 폐 기능 감소 수반)을 갖는다. HRV가 천식의 악화를 유발할 수 있는 정확한 메카니즘은 명확하지 않는다. 천식에서, ICAM-1의 발현은 상향-조절되고, 이는 상기도 및 하기도 모두에서 HRV 감염에 대한 천식 환자의 감수성을 증가시킬 수 있다. HRV에 감염된 천식 환자의 LRT 증상의 중증도는 또한 천식 환자에서의 TH2 우세성 및 증진된 TH2 헬퍼 반응에 기인하는 것으로 여겨진다.

HRV에 의한 상기도 내 상피 세포의 감염은 하기도 증상을 매개할 수 있는 다양한 염증유발성 시토카인의 생성을 초래한다.

가용성 ICAM-1을 갖는 표적화 ICAM-1, 또는 ICAM-1 특이적 항체는 시험관내 및 생체내 모델에서 HRV 감염을 억제하는 것으로 나타났다. 리노바이러스 감염과 천식 악화의 강한 연관성은 리노바이러스 감염의 예방 또는 치료가 천식 악화의 예방에 대한 효과적인 접근법일 수 있음을 시사한다. 따라서, 리노바이러스 감염의 치료를 위한 다른 치료제에 대한 요구가 존재한다.

RNA 간섭 (이하 "RNAi")을 통한 유전자 발현, 특히 ICAM-1 유전자 발현의 변경은 상기 요구를 충족시키기 위한 한가지 접근법이다. RNAi는 짧은 이중-가닥 RNA ("dsRNA") 분자에 의해 유도된다. "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA" 또는 "RNAi 억제제"로 불리는 짧은 dsRNA 분자는 siRNA에 대한 서열 상동성을 공유하는 메신저 RNA ("mRNA")의 발현을 침묵화시킨다. 이는, 일반적으로 RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC)로 언급되는 siRNA 함유 엔도뉴클레아제 복합체에 의해 매개되는 mRNA의 절단을 통해 발생할 수 있다. 표적 RNA의 절단은 전형적으로 siRNA 이중나선의 가이드 서열에 상보적인 영역의 중간에서 일어난다 (문헌 [Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188]). 게다가, RNA 간섭은 또한, 아마도 염색질 구조를 조절하여 표적 유전자 서열의 전사를 방지하는 세포 메카니즘을 통한, 소형 RNA (예를 들어, 마이크로-RNA 또는 miRNA) 매개 유전자 침묵화를 수반할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819]; [Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837]; [Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218]; 및 [Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237] 참조).

본 발명은 핵산 소분자를 사용하는 RNA 간섭 (RNAi)에 의해, ICAM-1 유전자, 특히 염증성 및/또는 호흡기 질환 및 상태의 발병 또는 유지와 관련된 ICAM-1 유전자의 발현을 조절하는 데 유용한 화합물, 조성물 및 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은 핵산 소분자, 즉 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자, 예를 들어 비제한적으로 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 및 원형 RNA 분자, 및 ICAM-1 유전자의 발현 및/또는 ICAM-1 유전자 발현 및/또는 활성 경로에 관여하는 다른 유전자의 발현을 조절하는 데 이용되는 방법을 특징으로 한다.

한 측면에서, 본 발명은, 서로 상보성을 갖는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하며, 여기서 적어도 1개의 가닥이

중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 뉴클레오티드 중 1개 이상이 임의로 화학적으로 변형된 것인, 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 제공한다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 모든 뉴클레오티드는 비변형된다. 다른 실시양태에서, siNA 분자의 1개 가닥에서 또는 2개 가닥 둘 다에서 뉴클레오티드 위치 중 1개 이상이 변형된다 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 변형된 뉴클레오티드). 변형에는 핵산 당 변형, 염기 변형, 주쇄 (뉴클레오티드간 연결부) 변형, 비-뉴클레오티드 변형 및/또는 그의 임의의 조합이 포함된다. 특정 경우에, 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드는 상이하게 변형된다. 예를 들어, 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-당 위치에서 상이하게 변형될 수 있다 (즉, 1개 이상의 퓨린이 2'-당 위치에서, 동일하거나 상이한 가닥 내의 1개 이상의 피리미딘과 상이한 변형을 가짐). 다른 예에서, 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 2'-O-알킬 뉴클레오티드이다.

특정 실시양태에서, siNA 분자는 1개 가닥에서 또는 2개 가닥 둘 다에서 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드(들)의 3' 오버행을 갖는다. 다른 실시양태에서, siNA는 오버행이 결여된다 (즉, 평활 말단을 가짐). 바람직하게는, siNA 분자는 센스 및 안티센스 가닥 둘 다에서 2개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 갖는다. 오버행은 변형되거나 또는 비변형된다. 오버행의 변형된 뉴클레오티드의 예에는 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드 또는 2'-데옥시 뉴클레오티드가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 안티센스 가닥의 오버행 뉴클레오티드는 ICAM-1 표적 서열의 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 센스 가닥의 오버행은 ICAM-1 표적 서열에 있는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 경우에, 본 발명의 siNA 분자는 2'-O-알킬 뉴클레오티드인 안티센스 가닥에 2개의 3' 오버행 뉴클레오티드를 갖고, 2'-데옥시 뉴클레오티드인 센스 가닥에 2개의 3' 오버행 뉴클레오티드를 갖는다.

일부 실시양태에서, siNA 분자는 캡 (본원에서 또한 "말단 캡"으로 지칭됨)을 갖는다. 캡은 5'-말단 (5'-캡)에 또는 3'-말단 (3'-캡)에 존재할 수 있거나, 또는 양쪽 말단, 예컨대 siNA의 센스 (가이드) 가닥의 5' 및 3' 말단에 존재할 수 있다.

특정 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가지며 하기 화학식 A를 포함하는, 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자가 제공된다.

<화학식 A>

상기 식에서, 상부 가닥은 이중-가닥 핵산 분자의 센스 가닥이고, 하부 가닥은 안티센스 가닥이고; 여기서 안티센스 가닥은 서열 143, 서열 144, 서열 145, 서열 146, 서열 147, 서열 148, 서열 149 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 상보성을 갖는 서열을 포함하고;

각각의 N은 독립적으로 비변형되거나 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이고;

각각의 B는 존재 또는 부재하는 말단 캡이고;

(N)은 오버행 뉴클레오티드를 나타내고, 이들 각각은 독립적으로 비변형되거나 또는 화학적으로 변형되고;

[N]은 리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드를 나타내고;

X1 및 X2는 독립적으로 0 내지 4의 정수이고;

X3은 17 내지 36의 정수이고;

X4는 11 내지 35의 정수이고;

X5는 1 내지 6의 정수이고, 단 X4 및 X5의 합은 17 내지 36이다.

한 실시양태에서, 본 발명은

(a) N_X4 위치의 1개 이상의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 그의 임의의 조합이고;

(b) N_X4 위치의 1개 이상의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 그의 임의의 조합이고;

(c) N_X3 위치의 1개 이상의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 그의 임의의 조합이고;

(d) N_X3 위치의 1개 이상의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 그의 임의의 조합인

화학식 A의 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA)을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 본 발명은

(a) N_X4 위치의 각각의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고;

(b) N_X4 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고;

(c) N_X3 위치의 각각의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고;

(d) N_X3 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인

한 실시양태에서, 본 발명은

(a) N_X4 위치의 각각의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드이고;

(b) N_X4 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-O-알킬 뉴클레오티드이고;

(c) N_X3 위치의 각각의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드이고;

(d) N_X3 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시 뉴클레오티드인

화학식 A의 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA)을 특징으로 한다

한 실시양태에서, 본 발명은

(d) N_X3 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 리보뉴클레오티드인

한 실시양태에서, 본 발명은

(b) N_X4 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 리보뉴클레오티드이고;

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 siNA가 하기의 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 제공한다.

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

G는 구아노신이고;

U는 우리딘이고;

A는 아데노신이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

뉴클레오티드간 연결부는 화학적으로 변형되거나 또는 비변형된다.

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

C는 시티딘이고;

U는 우리딘이고;

G는 구아노신이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

A는 아데노신이고;

U는 우리딘이고;

C는 시티딘이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

G는 구아노신이고;

U는 우리딘이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

A는 아데노신이고;

U는 우리딘이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

A는 아데노신이고;

U는 우리딘이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

C는 시티딘이고;

G는 구아노신이고;

U는 우리딘이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

추가 실시양태에서, 본 발명은 siNA가 하기의 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 제공한다.

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

A는 아데노신이고;

U는 우리딘이고;

G는 구아노신이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

본 발명은 본원에 기재된 이중-가닥 핵산 분자 및 임의로 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다.

제약 조성물의 투여는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 여기서 핵산은 시험관내 또는 생체내에서 목적 표적 세포 내로 도입된다.

세포, 조직 및 유기체로 본 발명의 핵산 분자를 도입시키기 위해 일반적으로 사용된 기술은 다양한 담체 시스템, 시약 및 벡터의 사용을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 이러한 담체 시스템의 비제한적 예에는 핵산-산-지질 입자, 지질 나노입자 (LNP), 리포좀, 리포플렉스, 미셀, 비로좀, 바이러스 유사 입자 (VLP), 핵산 복합체, 및 그의 혼합물이 포함된다.

제약 조성물은 에어로졸, 분산액, 용액 (예를 들어, 주사가능한 용액), 크림, 연고, 정제, 분말, 현탁액 등의 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 경구로, 설하로, 협측으로, 비경구로, 비내로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 에어로졸화되어 흡입을 통해 전달된다.

본 발명의 분자 및 제약 조성물은 치료 용도의 폭 넓은 범위에 걸쳐 유용성을 가지며, 따라서 본 발명의 또 다른 측면은 대상체의 치료에서의 본 발명의 화합물 및 제약 조성물의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 ICAM-1의 작용에 의해, 또는 그의 작용의 손실에 의해 매개되는 상태를 앓고 있는 대상체, 예컨대 인간에게 유효량의 본 발명의 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상태는 호흡기 질환, 예컨대 예를 들어, 비제한적으로 COPD, 낭성 섬유증, 천식, 호산구성 기침, 기관지염, 사르코이드증, 폐섬유증, 비염 및 부비동염이다.

본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면은 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조로 하여 명백해질 것이다. 이를 위해, 명세서 전반에 걸쳐 특허, 특허 출원 및 다른 문헌을 인용하여 본 발명의 다양한 측면을 기재하고, 보다 구체적으로 설명하였다. 본원에 인용된 각각의 이들 참고문헌은 그의 전문 (도면 포함)이 본원에 참조로 포함된다.

도 1은 RNAi에 관여하는 표적 RNA 분해의 비제한적인 제안된 메카니즘 표현을 나타낸다. 외래 단일-가닥 RNA, 예를 들어 바이러스, 트랜스포손 또는 다른 외인성 RNA로부터 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 (RdRP)에 의해 생성되는 이중-가닥 RNA (dsRNA)가 다이서(DICER) 효소를 활성화시키고, 이는 이어서 siNA 이중나선을 생성한다. 대안적으로, 합성 또는 발현된 siNA를 적절한 수단에 의해 세포 내로 직접 도입시킬 수 있다. 표적 RNA를 인식하는 활성 siNA 복합체가 형성되어, RISC 엔도뉴클레아제 복합체에 의해 표적 RNA가 분해되거나, 또는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 (RdRP)에 의해 추가적인 RNA가 합성되고, 이는 다이서를 활성화시켜 추가적인 siNA 분자를 생성함로써 RNAi 반응을 증폭시킬 수 있다.
도 2A-F는 본 발명의 화학적으로 변형된 siNA 구축물의 비제한적인 예를 보여준다. 도면에서, N은 임의의 뉴클레오티드 (아데노신, 구아노신, 시토신, 우리딘, 또는 임의로 티미딘)를 의미하고, 예를 들어 티미딘은 괄호 (N N)로 지정된 오버행 영역에서 치환될 수 있다. 다양한 변형이 siNA 구축물의 센스 및 안티센스 가닥에 대해 제시되어 있다. (N N) 뉴클레오티드 위치는 본원에 기재된 바와 같이 화학적으로 변형될 수 있고 (예컨대, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-2'-플루오로 등), 상응하는 표적 핵산 서열로부터 유래하거나 그렇지 않을 수 있다 (예컨대, 도 4c 참조). 또한, 도면에 나타내지 않더라도, 도 2에 제시된 서열은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 9번째 위치에, 또는 가이드 가닥의 5'-말단으로부터 11개의 뉴클레오티드 위치의 수를 세어 가이드 가닥의 5'-말단을 기준으로 11번째 위치에 리보뉴클레오티드를 임의로 포함할 수 있다 (도 4c 참조). 구축물 A-F의 안티센스 가닥은 본 발명의 임의의 표적 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 또한, 글리세릴 모이어티 (L)가 도 2A-F에 나타낸 임의의 구축물에 대해 안티센스 가닥의 3'-말단에 존재하는 경우, 변형된 뉴클레오티드간 연결부는 임의적이다.
도 2A: 센스 가닥은 21개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2개의 말단 3'-뉴클레오티드는 임의로 염기 쌍을 형성하고, 존재하는 모든 뉴클레오티드는 (N N) 뉴클레오티드를 제외하고는 리보뉴클레오티드이며, (N N) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 범용 염기 또는 본원에 기재된 다른 화학적 변형을 포함할 수 있다. 안티센스 가닥은 3'-말단 글리세릴 모이어티를 임의로 갖는 21개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2개의 말단 3'-뉴클레오티드는 표적 RNA 서열에 임의로 상보적이고, 존재하는 모든 뉴클레오티드는 (N N) 뉴클레오티드를 제외하고는 리보뉴클레오티드이며, (N N) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 범용 염기 또는 본원에 기재된 다른 화학적 변형을 포함할 수 있다. "s"로 나타낸, 변형된 뉴클레오티드간 연결부, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포노아세테이트, 티오포스포노아세테이트 또는 본원에 기재된 다른 변형된 뉴클레오티드간 연결부는 안티센스 가닥에서 (N N) 뉴클레오티드를 임의로 연결시킨다.
도 2B: 센스 가닥은 21개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2개의 말단 3'-뉴클레오티드는 임의로 염기 쌍을 형성하고, 존재할 수 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고, 존재할 수 있는 모든 퓨린 뉴클레오티드는 (N N) 뉴클레오티드를 제외하고는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이며, (N N) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 범용 염기 또는 본원에 기재된 다른 화학적 변형을 포함할 수 있다. 안티센스 가닥은 3'-말단 글리세릴 모이어티를 임의로 갖는 21개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2개의 말단 3'-뉴클레오티드는 표적 RNA 서열에 임의로 상보적이고, 존재할 수 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고, 존재할 수 있는 모든 퓨린 뉴클레오티드는 (N N) 뉴클레오티드를 제외하고는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이며, (N N) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 범용 염기 또는 본원에 기재된 다른 화학적 변형을 포함할 수 있다. "s"로 나타낸, 변형된 뉴클레오티드간 연결부, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 본원에 기재된 다른 변형된 뉴클레오티드간 연결부는 센스 및 안티센스 가닥에서 (N N) 뉴클레오티드를 임의로 연결시킨다.
도 2C: 센스 가닥은 5'- 및 3'-말단 캡을 갖는 21개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2개의 말단 3'-뉴클레오티드는 임의로 염기 쌍을 형성하고, 존재할 수 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 (N N) 뉴클레오티드를 제외하고는 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이며, (N N) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 범용 염기 또는 본원에 기재된 다른 화학적 변형을 포함할 수 있다. 안티센스 가닥은 3'-말단 글리세릴 모이어티를 임의로 갖는 21개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2개의 말단 3'-뉴클레오티드는 표적 RNA 서열에 임의로 상보적이고, 존재할 수 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 (N N) 뉴클레오티드를 제외하고는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이며, (N N) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 유니버설 염기 또는 본원에 기재된 다른 화학적 변형을 포함할 수 있다. "s"로 나타낸, 변형된 뉴클레오티드간 연결부, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 본원에 기재된 다른 변형된 뉴클레오티드간 연결부는 안티센스 가닥에서 (N N) 뉴클레오티드를 임의로 연결시킨다.
도 2D: 센스 가닥은 5'- 및 3'-말단 캡을 갖는 21개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2개의 말단 3'-뉴클레오티드는 임의로 염기 쌍을 형성하고, 존재할 수 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 (N N) 뉴클레오티드를 제외하고는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이며, (N N) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 범용 염기 또는 본원에 기재된 다른 화학적 변형을 포함할 수 있고, 존재할 수 있는 모든 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 뉴클레오티드이다. 안티센스 가닥은 3'-말단글리세릴 모이어티를 임의로 갖는 21개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2개의 말단 3'-뉴클레오티드는 표적 RNA 서열에 임의로 상보적이고, 존재할 수 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고, 존재할 수 있는 모든 퓨린 뉴클레오티드는 (N N) 뉴클레오티드를 제외하고는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이며, (N N) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 범용 염기 또는 본원에 기재된 다른 화학적 변형을 포함할 수 있다. "s"로 나타낸, 변형된 뉴클레오티드간 연결부, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 본원에 기재된 다른 변형된 뉴클레오티드간 연결부는 안티센스 가닥에서 (NN) 뉴클레오티드를 임의로 연결시킨다.
도 2E: 센스 가닥은 5'- 및 3'-말단 캡을 갖는 21개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2개의 말단 3'-뉴클레오티드는 임의로 염기 쌍을 형성하고, 존재할 수 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 (N N) 뉴클레오티드를 제외하고는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이며, (N N) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 범용 염기 또는 본원에 기재된 다른 화학적 변형을 포함할 수 있다. 안티센스 가닥은 3'-말단 글리세릴 모이어티를 임의로 갖는 21개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2개의 말단 3'-뉴클레오티드는 표적 RNA 서열에 임의로 상보적이고, 존재할 수 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고, 존재할 수 있는 모든 퓨린 뉴클레오티드는 (N N) 뉴클레오티드를 제외하고는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드이며, (N N) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 범용 염기 또는 본원에 기재된 다른 화학적 변형을 포함할 수 있다. "s"로 나타낸, 변형된 뉴클레오티드간 연결부, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 본원에 기재된 다른 변형된 뉴클레오티드간 연결부는 안티센스 가닥에서 (N N) 뉴클레오티드를 임의로 연결시킨다.
도 2F: 센스 가닥은 5'- 및 3'-말단 캡을 갖는 21개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2개의 말단 3'-뉴클레오티드는 임의로 염기 쌍을 형성하고, 존재할 수 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 (N N) 뉴클레오티드를 제외하고는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이며, (N N) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 범용 염기 또는 본원에 기재된 다른 화학적 변형을 포함할 수 있고, 존재할 수 있는 모든 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 뉴클레오티드이다. 안티센스 가닥은 3'-말단 글리세릴 모이어티를 임의로 갖는 21개의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 2개의 말단 3'-뉴클레오티드는 표적 RNA 서열에 임의로 상보적이고, 하나의 3'-말단 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결부를 갖고, 존재할 수 있는 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오티드이고, 존재할 수 있는 모든 퓨린 뉴클레오티드는 (N N) 뉴클레오티드를 제외하고는 2'-데옥시-뉴클레오티드이고, (N N) 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 범용 염기 또는 본원에 기재된 다른 화학적 변형을 포함할 수 있다. "s"로 나타낸, 변형된 뉴클레오티드간 연결부, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 본원에 기재된 다른 변형된 뉴클레오티드간 연결부는 안티센스 가닥에서 (N N) 뉴클레오티드를 임의로 연결시킨다.
도 3A-F는 본 발명의 특정한 화학적으로 변형된 siNA 서열의 비제한적 예를 보여준다. A-F는 도 2A-F에 기재된 화학적 변형을 예시적인 ICAM-1 siNA 서열에 적용한 것이다. 이러한 화학적 변형은 모든 ICAM-1 서열에 적용될 수 있다. 또한, 도 3에 도시되지 않더라도, 도 3에 제시된 서열은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 9번째 위치에, 또는 가이드 가닥의 5'-말단으로부터 11개의 뉴클레오티드 위치의 수를 세어 가이드 가닥의 5'-말단을 기준으로 11번째 위치에 리보뉴클레오티드를 임의로 포함할 수 있다 (도 4c 참조). 또한, 도 3에 제시된 서열은 안티센스 가닥의 5'-말단에서 최대 약 6개의 위치에 말단 리보뉴클레오티드 (예컨대, 안티센스 가닥의 5'-말단에 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 말단 리보뉴클레오티드)를 임의로 포함할 수 있다.
도 4a-c는 본 발명의 다양한 siNA 구축물의 비제한적인 예를 보여준다.
도 4a에 제시된 예 (구축물 1, 2 및 3)는 19개의 대표적인 염기 쌍을 갖지만; 본 발명의 다른 실시양태는 본원에 기재된 임의의 수의 염기 쌍을 포함한다. 괄호로 묶은 영역은, 예를 들어 약 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 약 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 오버행을 나타낸다. 구축물 1 및 2는 독립적으로 RNAi 활성을 위하여 사용될 수 있다. 구축물 2는 폴리뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 링커를 포함할 수 있고, 이는 임의로 생분해성 링커로서 설계될 수 있다. 한 실시양태에서, 구축물 2에 제시된 루프 구조는 생체내 및/또는 시험관내에서 구축물 1을 형성시키는 생분해성 링커를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 구축물 3은, 링커를 사용하여 생체내 및/또는 시험관내에서 활성 siNA 구축물 2를 생성시키는 동일한 원리 하에서 구축물 2를 생성하는데 사용될 수 있고, 이는 임의로 또 다른 생분해성 링커를 사용하여 생체내 및/또는 시험관내에서 활성 siNA 구축물 1을 생성시킬 수 있다. 이와 같이, siNA 구축물의 안정성 및/또는 활성은 생체내 또는 시험관내 및/또는 시험관내에서 사용하기 위한 siNA 구축물의 설계에 따라 조절될 수 있다.
도 4b에 제시된 예는 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자 (예컨대, 마이크로RNA)의 다양한 변형을 나타내고, 이는 부분적인 상보성으로부터 생성되는 오버행, 벌지, 루프 및 스템-루프를 포함할 수 있다. 벌지, 루프 및 스템-루프를 갖는 이러한 모티프는 일반적으로 miRNA의 특징이다. 벌지, 루프 및 스템-루프는, 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자의 1개 가닥에서 또는 2개 가닥 둘 다에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 뉴클레오티드의 미스매치 또는 벌지와 같은, 임의의 정도의 부분적인 상보성으로부터 생성될 수 있다.
도 4c에 제시된 예는 디뉴클레오티드 3'-오버행을 갖는 두 21개 뉴클레오티드 서열의 19 염기 쌍 이중나선을 포함하는 본 발명의 모델 이중-가닥 핵산 분자를 나타낸다. 상부 가닥 (1)은 센스 가닥 (패신저 가닥)를 나타내고, 중간 가닥 (2)는 안티센스 가닥 (가이드 가닥)를 나타내고, 하부 가닥 (3)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 디뉴클레오티드 오버행 (NN)은 표적 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 가닥 내의 3'-(NN) 서열은 표적 폴리뉴클레오티드의 5'-[NN] 서열에 상보적일 수 있다. 또한, 패신저 가닥의 5'-(NN) 서열은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 5'-[NN] 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 오버행 (NN)은 표적 폴리뉴클레오티드 서열로부터 유래하지 않으며, 예를 들어 가이드 가닥 내의 3'-(NN) 서열이 표적 폴리뉴클레오티드의 5'-[NN] 서열에 상보적이지 않고, 패신저 가닥의 5'-(NN) 서열이 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 5'-[NN] 서열과 상이한 서열을 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 임의의 (NN) 뉴클레오티드는, 예를 들어 2'-O-메틸, 2'-데옥시-2'-플루오로 및/또는 본원의 다른 변형으로 화학적으로 변형된다. 또한, 패신저 가닥은 패신저 가닥의 리보뉴클레오티드 위치 N을 포함할 수 있다. 제시된 대표적인 19 염기 쌍 21합체 이중나선의 경우, 위치 N은 패신저 가닥의 3' 말단으로부터 9번 뉴클레오티드일 수 있다. 그러나, 상이한 길이의 이중나선에서, 위치 N은 가이드 가닥의 5'-말단으로부터 11개의 뉴클레오티드 위치의 수를 세어, 패신저 가닥 내의 상응하는 염기 쌍 형성된 뉴클레오티드를 선택함으로써 가이드 가닥의 5'-말단을 기준으로 결정된다. Ago2에 의한 절단은 화살표로 표시한 바와 같이 위치 10번과 11번 사이에서 일어난다. 추가 실시양태에서, 2개의 리보뉴클레오티드 NN은, 가이드 가닥의 5'-말단으로부터 10 및 11개의 뉴클레오티드 위치의 수를 세어, 패신저 가닥 내의 상응하는 염기 쌍 형성된 뉴클레오티드를 선택함으로써 가이드 가닥의 5'-말단을 기준으로 위치 10번 및 11번에 존재한다.
도 5는, 예를 들어 본 발명의 siNA 서열의 5' 및/또는 3'-말단을 안정화시키는데 사용할 수 있는, 상이한 안정화 화학의 비제한적인 예 (1 내지 10)를 보여주며, 여기에는 (1) [3-3']-역전된 데옥시리보스; (2) 데옥시리보뉴클레오티드; (3) [5'-3']-3'-데옥시리보뉴클레오티드; (4) [5'-3']-리보뉴클레오티드; (5) [5'-3']-3'-O-메틸 리보뉴클레오티드; (6) 3'-글리세릴; (7) [3'-5']-3'-데옥시리보뉴클레오티드; (8) [3'-3']-데옥시리보뉴클레오티드; (9) [5'-2']-데옥시리보뉴클레오티드; 및 (10) [5-3']-디데옥시리보뉴클레오티드가 포함된다. 도면에 제시된 변형 및 비변형 주쇄 화학 이외에도, 이들 화학은 본원에 기재된 다양한 당 및 염기 뉴클레오티드 변형과 조합될 수 있다.
도 6은 RNAi 활성을 매개하는 능력을 보존하면서 뉴클레아제 내성인 본 발명의 화학적으로 변형된 siNA 구축물을 확인하는데 사용되는 전략의 비제한적인 예를 보여준다. 화학적 변형을 공지된 설계 파라미터에 따라 siNA 구축물 내로 도입시킨다 (예를 들어, 2'-변형, 염기 변형, 주쇄 변형, 말단 캡 변형 등을 도입시킴). 변형된 구축물을 적당한 시스템에서 (예를 들어, 뉴클레아제 내성의 경우 인간 혈청에서 (제시됨), 또는 PK/전달 파라미터의 경우 동물 모델에서) 시험한다. 동시에, siNA 구축물을, 예를 들어 세포 배양 시스템 (예컨대, 루시페라제 리포터 검정)에서, RNAi 활성에 대해 시험한다. 이어서, RNAi 활성을 유지하면서 특정한 성질을 갖는 리드(lead) siNA 구축물을 확인하고, 추가로 변형시켜 다시 한번 검정할 수 있다. 상기 동일한 접근법을 이용하여, 개선된 약동학적 프로파일, 전달 및 RNAi 활성을 갖는 siNA-접합 분자를 확인할 수 있다.
도 7은 선형 및 이중나선 구축물 및 그의 비대칭 유도체를 비롯한, 본 발명의 인산화된 siNA 분자의 비제한적인 예를 보여준다.
도 8은 본 발명의 화학적으로 변형된 말단 포스페이트 기의 비제한적 예를 보여준다.
도 9는 본 발명의 콜레스테롤 접합된 siNA 분자를 합성하는데 사용할 수 있는 콜레스테롤 연결된 포스포르아미다이트의 비제한적인 예를 보여준다. siNA 분자의 센스 가닥의 5'-말단에 콜레스테롤 모이어티가 연결된 것을 예로서 제시한다.
도 10은 핵산 가닥에 연결된 5' 및 3' 역전된 무염기성 캡의 실시양태를 도시한다.
도 11은 비히클 대조군 비교한, siNA 점적주입 후의 래트의 폐에서의 호중구 유입에 대한 ICAM-1 siNA의 효과를 보여준다.

A. 용어 및 정의

하기 용어 및 정의를 본원에 사용환 바와 같이 적용한다.

용어 "무염기성"은 핵염기가 없거나, 또는 당 모이어티의 1' 위치에 있는 핵염기 대신에 수소 원자 (H) 또는 다른 비-핵염기 화학 기를 갖는 당 모이어티를 지칭하며, 예를 들어 미국 특허 번호 5,998,203 (Adamic et al.)을 참조한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 무염기성 모이어티는 리보스, 데옥시리보스 또는 디데옥시리보스 당이다.

본원에 사용된 용어 "비-시클릭 뉴클레오티드"는 비-시클릭 리보스 당 (예컨대, 임의의 리보스 탄소/탄소 또는 탄소/산소 결합이 독립적으로 또는 조합하여 뉴클레오티드로부터 부재하는 경우)을 갖는 임의의 뉴클레오티드를 지칭한다.

용어 "알킬"은 직쇄, 분지쇄, 알케닐, 알키닐 기 및 시클릭 기를 비롯한, 포화 또는 불포화 탄화수소 (방향족 기 제외)를 지칭한다. 상기와 같음에도 불구하고, 알킬은 또한 비-방향족 헤테로시클릭 기를 지칭한다. 바람직하게는, 알킬 기는 1 내지 12개의 탄소를 갖는다. 보다 바람직하게는, 이는 1 내지 7개의 탄소, 보다 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소의 저급 알킬이다. 알킬 기는 치환되거나, 또는 비치환될 수 있다. 치환되는 경우, 치환기(들)는 바람직하게는 히드록실, 시아노, C1-C4알콕시, =O, =S, NO₂, SH, NH₂ 또는 NR₁R₂ (여기서, R₁ 및 R₂는 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬임)이다.

용어 "아릴"은 공액 파이 전자계를 갖는 1개 이상의 고리를 가지며, 카르보시클릭 아릴, 헤테로시클릭 아릴 및 비아릴 기 (이들 모두 임의로 치환될 수 있음)를 포함하는 방향족 기를 지칭한다. 아릴 기의 바람직한 치환기(들)는 할로겐, 트리할로메틸, 히드록실, SH, OH, 시아노, C1-C4알콕시, C1-C4알킬, C2-C4알케닐, C2-C4알키닐, NH₂ 및 NR₁R₂ (여기서, R₁ 및 R₂는 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬임) 기이다.

용어 "알킬아릴"은 (상기 기재한 바와 같은) 아릴 기에 공유 결합된 (상기 기재한 바와 같은) 알킬 기를 지칭한다. 카르보시클릭 아릴 기는 방향족 고리 상의 고리 원자가 모두 탄소 원자인 기이다. 탄소 원자는 임의로 치환된다. 헤테로시클릭 아릴 기는 방향족 고리 내에 고리 원자로서 1 내지 3개의 헤테로원자를 가지며 고리 원자의 나머지는 탄소 원자인 기이다. 적합한 헤테로원자에는 산소, 황 및 질소가 포함되며, 이러한 헤테로원자를 갖는 헤테로시클릭 아릴 기의 예에는 푸라닐, 티에닐, 피리딜, 피롤릴, N-저급 알킬 피롤로, 피리미딜, 피라지닐, 이미다졸릴 등 (모두 임의로 치환됨)이 포함된다. 바람직하게는, 알킬 기는 C1-C4알킬 기이다.

용어 "아미드"는 -C(O)-NH-R (여기서, R은 알킬, 아릴, 알킬아릴 또는 수소임)을 지칭한다.

어구 "안티센스 영역"은 표적 핵산 서열에 상보성을 갖는 siNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 또한, siNA 분자의 안티센스 영역은 siNA 분자의 센스 영역에 상보성을 갖는 핵산 서열을 임의로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, siNA 분자의 안티센스 영역은 안티센스 가닥 또는 가이드 가닥으로 지칭된다.

어구 "비대칭 헤어핀"은 안티센스 영역, 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드를 포함할 수 있는 루프 부분, 및 센스 영역이 안티센스 영역과 염기 쌍을 형성하고 루프와 이중나선을 형성하기에 충분한 상보적 뉴클레오티드를 갖는 정도로 안티센스 영역보다 더 적은 수의 뉴클레오티드를 포함하는 센스 영역을 포함하는 선형 siNA 분자를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 비대칭 헤어핀 siNA 분자는 세포 또는 시험관내 시스템에서 RNAi를 매개하는데 충분한 길이 (예를 들어, 약 15 내지 약 30개, 또는 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 뉴클레오티드)를 갖는 안티센스 영역, 약 4 내지 약 12개 (예를 들어, 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개)의 뉴클레오티드를 포함하는 루프 영역, 및 안티센스 영역에 상보적이고 약 3 내지 약 25개 (예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개)의 뉴클레오티드를 갖는 센스 영역을 포함할 수 있다. 비대칭 헤어핀 siNA 분자는 또한 화학적으로 변형될 수 있는 5'-말단 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 비대칭 헤어핀 siNA 분자의 루프 부분은 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드, 링커 분자 또는 접합체 분자를 포함할 수 있다.

용어 "생분해성"은 생물학적 시스템에서의 분해, 예를 들어 효소적 분해 또는 화학적 분해를 지칭한다.

용어 "생분해성 링커"는 하나의 분자를 또 다른 분자에, 예를 들어 생물학적 활성 분자를 본 발명의 siNA 분자, 또는 본 발명의 siNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥에 연결시키도록 설계된, 생분해성의 핵산 또는 비-핵산 링커 분자를 지칭한다. 생분해성 링커는 그의 안정성이 특정 목적 (예컨대, 특정 조직 또는 세포 유형으로의 전달)을 위하여 조절될 수 있도록 설계된다. 핵산-기재 생분해성 링커 분자의 안정성은 다양한 화학, 예를 들어 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 및 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 (예컨대, 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 2'-아미노, 2'-O-아미노, 2'-C-알릴, 2'-O-알릴, 및 다른 2'-변형된 또는 염기 변형된 뉴클레오티드)의 조합을 사용하여 조절될 수 있다. 생분해성 핵산 링커 분자는 이량체, 삼량체, 사량체 또는 보다 긴 핵산 분자 (예컨대, 길이가 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드)일 수 있거나, 또는 인-계 연결부 (예컨대, 포스포르아미데이트 또는 포스포디에스테르 연결부)를 갖는 단일 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 생분해성 핵산 링커 분자는 또한 핵산 주쇄, 핵산 당 또는 핵산 염기 변형을 포함할 수 있다.

어구 "생물학적 활성 분자"는 시스템 내에서 생물학적 반응을 유발 또는 변형시킬 수 있고/거나 다른 생물학적 활성 분자의 약동학 및/또는 약력학을 조절할 수 있는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 생물학적 활성 분자의 비제한적 예에는, 단독의 또는 다른 분자 (치료 활성 분자, 예컨대 항체, 콜레스테롤, 호르몬, 항바이러스제, 펩티드, 단백질, 화학요법제, 소분자, 비타민, 보조인자, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 효소 핵산, 안티센스 핵산, 삼중나선 형성 올리고뉴클레오티드, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 다른 폴리에테르, 2-5A 키메라, siNA, dsRNA, 알로자임, 압타머, 디코이(decoy) 및 그의 유사체가 포함되나, 이에 제한되지는 않음)와 조합된 siNA 분자가 포함된다.

어구 "생물학적 시스템"은 인간 또는 동물을 비롯한 (이에 제한되지는 않음) 생물학적 공급원으로부터의 정제 또는 비정제 형태의 물질을 지칭하고, 여기서 상기 시스템은 RNAi 활성에 필요한 성분을 포함한다. 따라서, 상기 어구는, 예를 들어 세포, 조직, 대상체 또는 유기체, 또는 그의 추출물을 포함한다. 상기 용어는 또한 생물학적 공급원으로부터 재구성된 물질을 포함한다.

어구 "평활 말단"은 오버행 뉴클레오티드를 갖지 않는 이중-가닥 siNA 분자의 말단을 지칭한다. 이중-가닥 siNA 분자의 2개의 가닥은 말단에 오버행 뉴클레오티드 없이 서로 정렬된다.

본원에서 "말단 캡"으로도 지칭되는 용어 "캡"은 센스 또는 안티센스 가닥의 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 도입될 수 있는 화학적 변형을 지칭한다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 번호 5,998,203 (Adamic et al.) 참조). 이러한 말단 변형은 핵산 분자를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호하고, 세포 내에서 전달 및/또는 국소화를 보조할 수 있다. 캡은 5'-말단 (5'-캡)에 또는 3'-말단 (3'-캡)에 존재할 수 있거나, 또는 두 말단 모두에 존재할 수 있다. 비제한적 예에서, 5'-캡에는 글리세릴, 역전된 데옥시 무염기성 잔기 (모이어티); 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드, 4'-티오 뉴클레오티드; 카르보시클릭 뉴클레오티드; 1,5-안히드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트 연결부; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비-시클릭 3',4'-세코 뉴클레오티드; 비-시클릭 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드; 비-시클릭 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드, 3'-3'-역전된 뉴클레오티드 모이어티; 3'-3'-역전된 무염기성 모이어티; 3'-2'-역전된 뉴클레오티드 모이어티; 3'-2'-역전된 무염기성 모이어티; 1,4-부탄디올 포스페이트; 3'-포스포르아미데이트; 헥실포스페이트; 아미노헥실 포스페이트; 3'-포스페이트; 3'-포스포로티오에이트; 포스포로디티오에이트; 또는 가교 또는 비-가교 메틸포스포네이트 모이어티가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 3'-캡의 비제한적 예에는 글리세릴, 역전된 데옥시 무염기성 잔기 (모이어티), 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드; 4'-티오 뉴클레오티드, 카르보시클릭 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트; 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 1,2-아미노도데실 포스페이트; 히드록시프로필 포스페이트; 1,5-안히드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형된 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비-시클릭 3',4'-세코 뉴클레오티드; 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드, 5'-5'-역전된 뉴클레오티드 모이어티; 5'-5'-역전된 무염기성 모이어티; 5'-포스포르아미데이트; 5'-포스포로티오에이트; 1,4-부탄디올 포스페이트; 5'-아미노; 가교 및/또는 비-가교 5'-포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트 및/또는 포스포로디티오에이트, 가교 또는 비가교 메틸포스포네이트 및 5'-메르캅토 모이어티가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다 (보다 상세한 설명을 위해, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Beaucage and Iyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925] 참조). 도 5는 다양한 캡의 몇몇 비제한적 예를 보여준다.

용어 "세포"는 그의 통상적인 생물학적 의미로 사용되고, 전체 다세포 유기체를 지칭하지 않는다 (예를 들어, 특이적으로 인간을 지칭하지 않음). 세포는 유기체, 예를 들어 조류, 식물 및 포유동물 (예컨대, 인간, 소, 양, 유인원, 원숭이, 돼지, 개 및 고양이)에 존재할 수 있다. 세포는 원핵 (예컨대, 박테이라 세포) 또는 진핵 (예컨대, 포유동물 또는 식물 세포)일 수 있다. 세포는 체세포 또는 배선 기원, 분화전능 또는 분화만능, 분열 또는 비-분열 세포일 수 있다. 세포는 또한 생식자 또는 배아, 줄기 세포 또는 완전히 분화된 세포로부터 유래되거나 이들을 포함할 수 있다.

어구 "화학적 변형"은 천연 siRNA 또는 RNA의 뉴클레오티드와 상이한 뉴클레오티드의 화학 구조의 임의의 변형을 지칭한다. 용어 "화학적 변형"은 본원에 기재된 또는 다르게는 당업계에 공지된 바와 같은, 당, 염기 또는 뉴클레오티드간 연결부에서의 천연 siRNA 또는 RNA의 부가, 치환 또는 변형을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자와 상용적인 화학적 변형의 비제한적 예에 대해 USSN 12/064,014를 참조한다.

용어 "상보성"은 통상적인 왓슨-크릭(Watson-Crick) 또는 본원에 기재된 다른 비-통상적인 유형의 결합에 의한, 하나의 핵산 서열과 또 다른 핵산 서열 사이의 수소 결합(들)의 형성을 지칭한다. 본 발명의 핵산 분자와 관련하여, 핵산 분자와 그의 상보적 서열에 대한 결합 유리 에너지는 관련된 핵산의 기능 (예컨대, RNAi 활성)이 진행되게 하는데 충분하다. 핵산 분자의 결합 유리 에너지의 측정은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp.123-133]; [Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377]; [Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785] 참조). 완벽한 상보성은 핵산 서열의 모든 연속 잔기가 제2 핵산 서열 내의 동일한 수의 연속 잔기와 수소 결합할 것임을 의미한다. 부분적 상보성은 핵산 분자의 센스 가닥 또는 센스 영역과 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역 사이에, 또는 핵산 분자의 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역과 상응하는 표적 핵산 분자 사이에 생성되는 벌지, 루프 또는 오버행을 형성할 수 있는, 핵산 분자 내의 다양한 미스매치 또는 염기 쌍 비-형성된 뉴클레오티드 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 미스매치 또는 염기 쌍 비-형성된 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다.

용어 "유전자" 또는 어구 "표적 유전자"는 폴리펩티드의 생성에 필요한 부분 길이 또는 전체 길이의 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열을 지칭한다. 유전자 또는 표적 유전자는 또한 기능적 RNA (fRNA) 또는 비-코딩 RNA (ncRNA), 예컨대 소형 임시 RNA (stRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 소형 핵인 RNA (snRNA), 리보솜 RNA (rRNA), 전달 RNA (tRNA) 및 그의 전구체 RNA를 코딩할 수 있다. 이러한 비-코딩 RNA는 기능적 또는 조절 세포 과정에 관련된 fRNA 또는 ncRNA의 활성을 조절하는데 있어서 siNA 매개 RNA 간섭을 위한 표적 핵산 분자로서 역할을 할 수 있다. 따라서, 질환을 유발하는 이상 fRNA 또는 ncRNA 활성은 본 발명의 siNA 분자에 의해 조절될 수 있다. 또한, fRNA 및 ncRNA를 표적화하는 siNA 분자를 사용하여 유전자 각인, 전사, 번역 또는 핵산 프로세싱 (예를 들어, 아미노전이반응, 메틸화 등)과 같은 세포 과정에 개입함으로써, 대상체, 유기체 또는 세포의 유전자형 또는 표현형을 조작하거나 변경시킬 수 있다. 표적 유전자는 세포로부터 유래된 유전자, 내인성 유전자, 트랜스진, 또는 감염 후 세포에 존재하는 병원체 (예컨대, 바이러스)의 유전자와 같은 외인성 유전자일 수 있다. 표적 유전자를 함유하는 세포는 임의의 유기체 (예컨대, 식물, 동물, 원생동물, 바이러스, 박테리아 또는 진균)로부터 유래되거나, 또는 이들 내에 함유될 수 있다. 식물의 비제한적 예에는 외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물 또는 겉씨식물이 포함된다. 동물의 비제한적 예에는 척추동물 또는 무척추동물이 포함된다. 진균의 비제한적 예에는 곰팡이 또는 효모가 포함된다. 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Snyder and Gerstein, 2003, Science, 300, 258-260]을 참조한다.

어구 "상동성 서열"은 유전자, 유전자 전사체 및/또는 비-코딩 폴리뉴클레오티드와 같은 1개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 공유되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 상동성 서열은 관련되어 있지만 상이한 단백질, 예컨대 유전자 부류의 다른 구성원, 상이한 단백질 에피토프, 상이한 단백질 이소형 또는 완전히 상이한 유전자, 예컨대 시토카인 및 그의 상응하는 수용체를 코딩하는 2개 이상의 유전자에 의해 공유되는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상동성 서열은 비코딩 DNA 또는 RNA, 조절 서열, 인트론, 및 전사 제어 또는 조절 부위와 같은 2개 이상의 비-코딩 폴리뉴클레오티드에 의해 공유되는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상동성 서열에는 또한 1개 초과의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 공유되는 서열 영역이 포함될 수 있다. 부분적으로 상동성인 서열 (예를 들어, 적어도 95％, 94％, 93％, 92％, 91％, 90％, 89％, 88％, 87％, 86％, 85％, 84％, 83％, 82％, 81％, 80％ 등)도 또한 본 발명의 범주로 또는 그 내에 있는 것으로 고려되기 때문에, 상동성은 완벽한 동일성 (예컨대, 100％)일 필요는 없다. ％ 상동성은 2개의 서열 사이의 매칭 뉴클레오티드를 총 길이로 나누고 100을 곱하여 비교되는 수이다.

용어 "ICAM-1"은 세포간 부착 분자 1 유전자, 또는 ICAM-1 단백질, ICAM-1 펩티드, ICAM-1 폴리펩티드, ICAM-1 조절 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, ICAM-1 miRNA 및 siRNA), 돌연변이 ICAM-1 유전자, 및 ICAM-1 유전자의 스플라이스 변이체, 뿐만 아니라 유전자 발현 및/또는 활성의 ICAM-1 경로에 관여하는 다른 유전자를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 따라서, 용어 "ICAM-1"와 관련하여 본원에 기재된 각각의 실시양태는 본원에 정의된 바와 같은 용어 "ICAM-1"에 포함되는 모든 단백질, 펩티드, 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 분자에 적용가능하다. 포괄적으로, 이러한 유전자 표적은 또한 본원에서 "표적" 서열 (표 10 포함)로서 일반적으로 언급된다.

어구 "개선된 RNAi 활성"은 시험관내 및/또는 생체내에서 측정된 RNAi 활성에서의 증가를 지칭하며, 여기서 RNAi 활성은 RNAi를 매개하는 본 발명의 siNA의 능력 및 siNA의 안정성을 둘 다 반영한다. 본 발명에서, 이러한 활성의 생성은, 모두 RNA인 siRNA 또는 다수의 리보뉴클레오티드를 함유하는 siNA와 비교하여 시험관내 및/또는 생체내에서 증가될 수 있다. 일부 경우에, siNA 분자의 활성 또는 안정성은 감소 (즉, 10배 미만)될 수 있지만, 시험관내 및/또는 생체내에서 siNA 분자의 전반적인 활성은 증진된다.

"억제하다", "하향-조절하다" 또는 "감소시키다"는 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛을 코딩하는 RNA 분자 또는 동등한 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛의 활성이 본 발명의 핵산 분자 (예를 들어, siNA)의 부재하에 관찰된 것 미만으로 감소된 것을 지칭한다. 하향-조절은 또한 전사후 침묵화, 예컨대 RNAi 매개 절단, 또는 DNA 메틸화 패턴 또는 DNA 염색질 구조의 변경과 관련될 수 있다. siNA 분자를 사용한 억제, 하향-조절 또는 감소는 불활성 분자, 감쇠된 분자, 스크램블 서열을 갖는 siNA 분자 또는 미스매치를 갖는 siNA 분자와 관련될 수 있거나, 또는 다르게는 이는 핵산 부재의 시스템과 관련될 수 있다.

용어 "포유류" 또는 "포유동물"은 임의의 온혈 척추동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 햄스터, 기니아 피그, 토끼, 가축 등을 지칭한다.

어구 "계량 흡입기" 또는 MDI는 캔, 캔을 덮는 안전 캡 및 캡에 적합한 제제 계량 밸브를 포함하는 설비를 지칭한다. MDI 시스템은 적합한 채널링 장치를 포함한다. 적합한 채널링 장치에는, 예를 들어 의약이 충전된 캐니스터로부터 계량 밸브를 통해 환자의 코 또는 입으로 전달될 수 있는 밸브 작동기 및 원통형 또는 원뿔-유사 통로, 예컨대 마우스피스 작동기가 포함된다.

용어 "마이크로RNA" 또는 "miRNA"는 mRNA 절단, 번역 저해/억제 또는 이염색질 침묵화에 의해 표적 메신저 RNA의 발현을 조절하는 소형 이중-가닥 RNA를 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Ambros, 2004, Nature, 431, 350-355]; [Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297]; [Cullen, 2004, Virus Research., 102, 3-9]; [He et al., 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531]; [Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28]; 및 [Sethupathy et al., 2006, RNA, 12:192-197] 참조).

용어 "조절하다"는 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛을 코딩하는 RNA 분자 또는 동등한 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛의 활성이 상향 조절되거나 하향 조절되어 이러한 발현, 수준 또는 활성이 조절제의 부재하에 관찰되는 것보다 더 높거나 더 낮아지도록 하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "조절하다"는 "억제하다"를 의미할 수 있지만, 용어 "조절한다"의 사용은 이러한 정의로 제한되지 않는다.

어구 "변형된 뉴클레오티드"는 비변형된 (또는 천연의) 뉴클레오티드의 염기, 당 및/또는 포스페이트의 화학 구조에 변형을 함유하는 뉴클레오티를 지칭한다. 변형된 뉴클레오티드의 비제한적 예가 본원 및 USSN 12/064,014에 기재되어 있다.

어구 "염기 쌍 비-형성된"은 이중-가닥 siNA 분자의 센스 가닥 또는 센스 영역과 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역 사이에 염기 쌍이 형성되지 않은 뉴클레오티드를 지칭하고, 여기에는, 예를 들어 비제한적으로 미스매치, 오버행, 단일 가닥 루프 등이 포함된다.

용어 "비-뉴클레오티드"는 1개 이상의 뉴클레오티드 단위 대신에 핵산 쇄 내로 혼입될 수 있는 임의의 기 또는 화합물 (예컨대, 무염기성 모이어티)을 지칭한다. 상기 기 또는 화합물은, 통상적으로 인식되는 뉴클레오티드 염기 (예컨대, 아데노신, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민)를 함유하지 않아 1'-위치에 핵염기가 없다는 점에서 "무염기성"이다.

용어 "뉴클레오티드"는 당업계에 인지되어 있는 바와 같이 사용된다. 뉴클레오티드는 일반적으로 염기, 당 및 포스페이트 모이어티를 포함한다. 염기는 당업계에 널리 공지되어 있는 천연 염기 (표준) 또는 변형된 염기일 수 있다. 이러한 염기는 일반적으로 뉴클레오티드 당 모이어티의 1' 위치에 위치한다. 추가로, 뉴클레오티드는 비변형되거나, 또는 당, 포스페이트 및/또는 염기 모이어티에서 변형될 수 있으며 (상호교환적으로, 뉴클레오티드 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 비-천연 뉴클레오티드, 비-표준 뉴클레오티드 등으로도 지칭됨); 예를 들어 USSN 12/064,014를 참조한다.

용어 "오버행"은 이중-가닥 핵산 분자의 2개 가닥 사이에 염기 쌍이 형성되지 않은 뉴클레오티드 서열의 말단 부분을 지칭한다 (예를 들어, 도 4 참조).

용어 "비경구"는 소화관을 통하지 않는 방식으로 투여되는 것을 지칭하고, 여기에는 피내, 피하, 혈관내 (예를 들어, 정맥내), 근육내 또는 경막내 주사 또는 주입 기술 등이 포함된다.

어구 "경로 표적"은 유전자 발현 또는 활성의 경로에 관여하는 임의의 표적을 지칭한다. 예를 들어, 임의의 주어진 표적은 생물학적 경로에서 상류, 하류 또는 변형 유전자(modifier gene)를 포함할 수 있는 관련 경로 표적을 가질 수 있다. 이들 경로 표적 유전자는 본원의 질환, 상태 및 소질의 치료에서 부가 효과 또는 상승작용 효과를 제공할 수 있다.

"제약 조성물" 또는 "제약 제제"는 세포 또는 대상체 (인간 포함)로 투여 (예를 들어, 전신 또는 국소 투여)하기에 적합한 형태의 조성물 또는 제제를 지칭한다. 적합한 형태는, 부분적으로 용도 또는 진입 경로 (예를 들어, 경구, 경피, 흡입 또는 주사)에 따라 달라진다. 이러한 형태는 조성물 또는 제제가 표적 세포 (즉, 전달을 위해 음으로 대전된 핵산이 바람직한 세포)에 도달하는 것을 방해하지 않아야 한다. 예를 들어, 혈류 속으로 주사되는 제약 조성물은 가용성이어야 한다. 다른 인자는 당업계에 공지되어 있으며, 여기에는 조성물 또는 제제가 그의 효과를 발휘하는 것을 방해하는 형태 및 독성과 같은 고려사항이 포함된다. 본원에 사용된 제약 제제는 인간 및 수의학적 용도를 위한 제제를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 제제에 적합한 작용제의 비제한적 예에는 P-당단백질 억제제 (예컨대, 플루로닉 P85); 지속 방출 전달을 위한 생분해성 중합체, 예컨대 폴리 (DL-락티드-코글리콜리드) 미세구 (문헌 [Emerich, DF et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58]); 및 폴리부틸시아노아크릴레이트로 제조된 것과 같은 로딩된 나노입자가 포함된다. 본 발명의 핵산 분자를 위한 전달 전략의 기타 비제한적 예에는 문헌 [Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315]; [Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284]; [Pardridge et al., 1995, PNAS USA., 92, 5592-5596]; [Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107]; [Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916]; 및 [Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058]에 기재되어 있는 물질이 포함된다. "제약상 허용되는 조성물" 또는 "제약상 허용되는 제제"는 그의 목적 활성에 가장 적합한 물리적 위치에 본 발명의 핵산 분자가 효과적으로 분포되도록 하는 조성물 또는 제제를 지칭한다.

용어 "포스포로티오에이트"는 산소 원자 대신에 하나 이상의 황 원자를 포함하는 뉴클레오티드간 포스페이트 연결부를 지칭한다. 따라서, 용어 포스포로티오에이트는 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트 뉴클레오티드간 연결부를 둘 다 지칭한다.

용어 "리보뉴클레오티드"는 β-D-리보푸라노스 모이어티의 2' 위치에 히드록실 기를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다.

용어 "RNA"는 하나 이상의 리보푸라노시드 모이어티를 포함하는 분자를 지칭한다. 상기 용어에는 이중-가닥 RNA, 단일-가닥 RNA, 단리된 RNA, 예를 들어 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생산된 RNA, 뿐만 아니라 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의한 자연 발생 RNA와 상이한 변경된 RNA가 포함된다. 이러한 변경에는, 예를 들어 siNA의 말단(들)에 또는 내부적으로, 예컨대 RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에 비-뉴클레오티드 물질이 부가되는 것이 포함될 수 있다. 본 발명의 RNA 분자 내의 뉴클레오티드에는 또한 비-표준 뉴클레오티드, 예를 들어 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체 또는 자연 발생 RNA의 유사체로 지칭될 수 있다.

어구 "RNA 간섭" 또는 용어 "RNAi"는 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 짧은 간섭 핵산 분자에 의해 매개되는, 세포 내 유전자 발현을 억제하거나 하향 조절하는 생물학적 과정을 지칭하며, 예를 들어 문헌 [Zamore and Haley, 2005, Science, 309, 1519-1524]; [Vaughn and Martienssen, 2005, Science, 309, 1525-1526]; [Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33]; [Bass, 2001, Nature, 411, 428-429]; [Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498]; 및 국제 PCT 공보 번호 WO 00/44895 (Kreutzer et al.); 국제 PCT 공보 번호 WO 01/36646 (Zernicka-Goetz et al.); 국제 PCT 공보 번호 WO 99/32619 (Fire); 국제 PCT 공보 번호 WO 00/01846 (Plaetinck et al.); 국제 PCT 공보 번호 WO 01/29058 (Mello and Fire); 국제 PCT 공보 번호 WO 99/07409 (Deschamps-Depaillette); 및 국제 PCT 공보 번호 WO 00/44914 (Li et al.); 문헌 [Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819]; [Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837]; [Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218]; 및 [Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237]; [Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60]; [McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850]; [Reinhart et al., 2002, Gene ＆ Dev., 16, 1616-1626]; 및 [Reinhart ＆ Bartel, 2002, Science, 297, 1831]을 참조한다. 추가로, 용어 RNAi는 서열 특이적 RNA 간섭을 기재하는데 사용되는 다른 용어, 예컨대 전사후 유전자 침묵화, 번역 억제, 전사 억제, 또는 후성학(epigenetics)과 동등한 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 siNA 분자는 전사후 수준 또는 전사전 수준에서 유전자를 후성학적으로 침묵시키는데 사용될 수 있다. 비제한적 예에서, 본 발명의 siNA 분자에 의한 유전자 발현의 후성학적 조절은 유전자 발현을 변경시키기 위한 염색질 구조 또는 메틸화 패턴의 siNA 매개 변형으로 인한 것일 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676]; [Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672]; [Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819]; [Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837]; [Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218] 및 [Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237] 참조). 또 다른 비제한적 예에서, 본 발명의 siNA 분자에 의한 유전자 발현의 조절은 당업계에 공지된 바와 같이 RISC 또는 번역 억제를 통해 RNA (코딩 또는 비-코딩 RNA)의 siNA 매개 절단으로부터 야기될 수 있거나, 또는 조절은 전사 억제로부터 야기될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Janowski et al., 2005, Nature Chemical Biology, 1, 216-222] 참조).

어구 "RNAi 억제제"는 세포 또는 유기체에서 RNA 간섭 기능 또는 활성을 하향 조절, 감소 또는 억제시킬 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. RNAi 억제제는 RNAi 경로의 임의의 성분, 예를 들어 단백질 성분, 예컨대 RISC, 또는 핵산 성분, 예컨대 miRNA 또는 siRNA와 상호작용하거나 그의 기능을 간섭하여 RNAi를 하향 조절, 감소 또는 억제시킬 수 있다 (예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드의 RNAi 매개 절단, 번역 억제 또는 전사 침묵화). RNAi 억제제는 siNA 분자, 안티센스 분자, 압타머, 또는 세포 또는 유기체에서 RISC, miRNA 또는 siRNA, 또는 RNAi 경로 내의 임의의 다른 성분과 상호작용하거나 이를 간섭하는 소분자일 수 있다. RNAi를 억제 (예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드의 RNAi 매개 절단, 번역 억제 또는 전사 침묵화)함으로써, 본 발명의 RNAi 억제제는 표적 유전자의 발현을 조절 (예를 들어, 상향 조절 또는 하향 조절)하는데 사용될 수 있다.

어구 "센스 영역"은 siNA 분자의 안티센스 영역에 대해 상보성을 갖는 siNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 추가로, siNA 분자의 센스 영역은 표적 핵산 서열과 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. siNA 분자의 센스 영역은 또한 센스 가닥 또는 패신저 가닥으로 지칭될 수 있다.

어구 "짧은 간섭 핵산", "siNA", "짧은 간섭 RNA", "siRNA", "짧은 간섭 핵산 분자", "짧은 간섭 올리고뉴클레오티드 분자" 또는 "화학적으로 변형된 짧은 간섭 핵산 분자"는 RNA 간섭 "RNAi" 또는 유전자 침묵화를 서열-특이적 방식으로 매개하여 유전자 발현 또는 바이러스 복제를 억제하거나 하향 조절할 수 있는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 이들 용어는 개별 핵산 분자, 다수의 이러한 핵산 분자, 또는 이러한 핵산 분자의 풀 모두를 지칭할 수 있다. siNA는 자기-상보적인 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 이중-가닥 핵산 분자일 수 있고, 여기서 안티센스 가닥은 표적 핵산 분자 또는 그의 일부의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 가닥은 표적 핵산 서열 또는 그의 일부에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. siNA는 자기-상보적인 센스 및 안티센스 영역을 갖는 이중나선, 비대칭 이중나선, 헤어핀 또는 비대칭 헤어핀 2차 구조의 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 여기서 안티센스 영역은 별개의 표적 핵산 분자 또는 그의 일부의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 그의 일부에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. siNA는 자기-상보적인 센스 및 안티센스 영역을 포함하는 2개 이상의 루프 구조 및 스템을 갖는 원형 단일-가닥 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 여기서 안티센스 영역은 표적 핵산 분자 또는 그의 일부의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 센스 영역은 표적 핵산 서열 또는 그의 일부에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 원형 폴리뉴클레오티드는 생체내 또는 시험관내에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성 siNA 분자를 생성할 수 있다. siNA는 또한 표적 핵산 분자 또는 그의 일부의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고 (예를 들어, 이러한 siNA 분자가 표적 핵산 서열 또는 그의 일부에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 siNA 분자 내 존재를 필요로 하지 않는 경우), 여기서 단일-가닥 폴리뉴클레오티드는 말단 포스페이트기, 예컨대 5'-포스페이트 (예를 들어, 문헌 [Martinez et al., 2002, Cell., 110, 563-574] 및 [Schwarz et al., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568] 참조) 또는 5',3'-디포스페이트를 추가로 포함할 수 있다.

용어 "대상체"는 본 발명의 핵산 분자를 투여할 수 있는 유기체를 지칭한다. 대상체는 포유동물 또는 포유류 세포, 예를 들어 인간 또는 인간 세포일 수 있다. 상기 용어는 또한 체외이식 세포의 공여자 또는 수용자인 유기체, 또는 세포 그 자체를 지칭한다.

어구 "전신 투여"는 약물의 혈류 중 축적 또는 생체내 전신 흡수 후 전신으로 분포되는 것을 지칭한다.

용어 "표적" (ICAM-1로 지칭됨)은, 예를 들어 표 10에 나타낸 진뱅크(Genbank) 등록 번호에 의해 코딩된, 임의의 ICAM-1 표적 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 상기 용어는 또한 임의의 표적 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드, 예컨대 표 10에 나타낸 진뱅크 등록 번호를 갖는 서열에 의해 코딩되는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 관심의 대상이 되는 표적은 표적 DNA 또는 표적 RNA와 같은 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 용어 "표적"은 또한 상이한 이소형, 돌연변이체 표적 유전자, 표적 폴리뉴클레오티드의 스플라이스 변이체, 표적 다형성, 및 비-코딩 (예컨대, ncRNA, miRNA, stRNA, sRNA) 또는 본원에 기재된 다른 조절 폴리뉴클레오티드 서열과 같은 다른 서열도 포함하는 것으로 의도된다.

어구 "표적 부위"는 안티센스 영역 내에 표적 서열에 상보적인 서열을 함유하는 siNA 구축물에 의해 매개되는 절단에 대해 "표적화"된, 표적 RNA 내의 서열을 지칭한다.

어구 "치료 유효량"은 연구원, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 결정되는, 세포, 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 도출해 내는 화합물 또는 제약 조성물의 양을 지칭한다.

어구 "범용 염기"는, 차이가 거의 없이, 각각의 천연 DNA/RNA 염기와 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오티드 염기 유사체를 지칭한다. 범용 염기의 비제한적인 예에는 당업계에 공지된 바와 같은 C-페닐, C-나프틸 및 다른 방향족 유도체, 이노신, 아졸 카르복스아미드 및 니트로아졸 유도체, 예컨대 3-니트로피롤, 4-니트로인돌, 5-니트로인돌 및 6-니트로인돌이 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447] 참조).

어구 "비변형된 뉴클레오시드"는 β-D-리보-푸라노스의 1' 탄소에 연결된 염기, 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민 또는 우라실 염기 중 하나를 지칭한다.

용어 "상향-조절"은 유전자의 발현, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛을 코딩하는 RNA 분자 또는 동등한 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛의 활성이 본 발명의 핵산 분자 (예를 들어, siNA)의 부재하에 관찰된 것 초과로 증가한 것을 지칭한다. 특정 예에서, siNA 분자를 사용한 유전자 발현의 상향-조절 또는 촉진은 불활성 또는 감쇠된 분자의 존재하에 관찰된 수준 초과이다. 다른 예에서, siNA 분자를 사용한 유전자 발현의 상향-조절 또는 촉진은, 예를 들어 스크램블 서열 또는 미스매치를 갖는 siNA 분자의 존재하에 관찰된 수준 초과이다. 또 다른 예에서, 본 발명의 핵산 분자를 사용한 유전자 발현의 상향-조절 또는 촉진은 핵산 분자의 부재하에서 보다 그의 존재하에 더 크다. 일부 예에서, 유전자 발현의 상향-조절 또는 촉진은, RNA 매개 유전자 침묵화의 억제, 예컨대 상향 조절되는 관심의 대상이 되는 유전자의 발현을 하향 조절, 억제 또는 침묵화시키는 코딩 또는 비-코딩 RNA 표적의 RNAi 매개 절단 또는 침묵화의 억제와 관련된다. 유전자 발현의 하향 조절은, 예를 들어 코딩 RNA 또는 그의 코딩된 단백질에 의해, 예컨대 음성 피드백 또는 길항 효과를 통해 유도될 수 있다. 유전자 발현의 하향 조절은, 예를 들어 관심의 대상이 되는 유전자에 대한 조절 제어를 갖는 비-코딩 RNA에 의해, 예를 들어 번역 억제, 염색질 구조, 메틸화, RISC 매개 RNA 절단 또는 번역 억제를 통해 유전자의 발현을 침묵화시킴으로써, 유도될 수 있다. 이와 같이, 관심의 대상이 되는 유전자를 하향 조절하거나, 저해하거나, 침묵화시키는 표적의 억제 또는 하향조절을 이용하여, 치료 용도를 위하여 관심의 대상이 되는 유전자의 발현을 상향-조절하거나 촉진시킬 수 있다.

용어 "벡터"는 목적하는 핵산을 전달하는데 사용되는 임의의 핵산- 및/또는 바이러스-기반의 기술을 지칭한다.

B. 본 발명의 siNA 분자

본 발명은 ICAM-1과 관련된 질환 (예를 들어, 호흡기 질환 또는 염증성 질환)의 치료에 사용될 수 있는, ICAM-1에 대해 표적화된 siNA를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 구체적 측면 및 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 표 1a-1b 및/또는 도 2-3에 나타난 서열을 포함한다. siNA는 여러 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, siNA는 하나 이상의 siNA 화합물로서 단리될 수 있거나, 또는 이는 DNA 플라스미드에서 전사 카세트의 형태로 존재할 수 있다. siNA는 또한 화학적으로 합성될 수 있고, 변형을 포함할 수 있다. siNA는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 다른 siNA 분자 또는 ICAM-1 관련 질환 또는 상태의 치료에 통상적인 작용제와 함께 병용-투여될 수 있다.

본 발명의 siNA 분자는 유전자 (특히, ICAM-1) 침묵화를 매개할 수 있는데, 이는 RNA 전사체와의 상호작용을 통해, 또는 대안적으로 특정 유전자 서열과의 상호작용에 의해 (여기서 이러한 상호작용은 전사 수준 또는 전사후 수준에서 유전자 침묵화를 일으킴) (예컨대 예를 들어 비제한적으로, RNAi), 또는 표적의 염색질 구조 또는 메틸화 패턴을 조절하고 표적 유전자의 전사를 저해하는 세포 과정 (표적의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 침묵화를 매개함)을 통해 이루어진다. 보다 구체적으로, 표적은 ICAM-1 RNA, DNA, mRNA, miRNA, siRNA, 또는 그의 일부 중 임의의 것이다.

특정 실시양태에서 15개의 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 연속 스트레치를 형성한다.

다른 실시양태에서, siNA 분자는 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150에 대해 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 치환, 미스매치 및/또는 부가를 함유할 수 있으나, 단 siNA 분자는 예를 들어 RNAi를 조절하기 위한 그의 활성을 유지한다. 비제한적 예에서, 결실, 치환, 미스매치 및/또는 부가는 루프 또는 벌지, 또는 대안적으로 워블 또는 다른 대안적 (비 왓슨-크릭) 염기 쌍을 생성할 수 있다.

이들 siNA 분자는 RNA의 짧은 이중-가닥 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 이중 가닥 RNA 분자는, 대칭 또는 비대칭일 수 있으며 상보적인 2개의 분리된 개별 가닥 (즉, 2개의 단일-가닥 RNA 분자)을 포함할 수 있거나, 또는 2개의 상보적 부분, 예를 들어 센스 영역 및 안티센스 영역이 염기 쌍을 형성하고 하나 이상의 단일-가닥 "헤어핀" 영역 (즉, 루프)에 공유 결합되어, 예를 들어 단일-가닥 짧은-헤어핀 폴리뉴클레오티드 또는 원형 단일-가닥 폴리뉴클레오티드를 생성하는 1개의 단일-가닥 분자를 포함할 수 있다.

링커는 폴리뉴클레오티드 링커 또는 비-뉴클레오티드 링커일 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 비-뉴클레오티드 링커이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 헤어핀 또는 원형 siNA 분자는 1개 이상의 루프 모티프를 함유하고, 여기서 siNA 분자의 루프 부분 중 하나 이상은 생분해성이다. 예를 들어, 본 발명의 단일-가닥 헤어핀 siNA 분자는 siNA 분자의 루프 부분의 생체내 분해가 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 3'-말단 뉴클레오티드 오버행과 같은 3'-말단 오버행을 갖는 이중-가닥 siNA 분자를 생성할 수 있도록 설계된다. 또는 대안적으로, 본 발명의 원형 siNA 분자는 siNA 분자의 루프 부분의 생체내 분해가 약 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 3'-말단 뉴클레오티드 오버행과 같은 3'-말단 오버행을 갖는 이중-가닥 siNA 분자를 생성할 수 있도록 설계된다.

본 발명의 대칭 siNA 분자에서, 각각의 가닥인 센스 (패신저) 가닥 및 안티센스 (가이드) 가닥은 독립적으로 약 15 내지 약 40개 (예를 들어, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개)의 뉴클레오티드 길이이다.

비대칭 siNA 분자에서, 분자의 안티센스 영역 또는 가닥은 약 15 내지 약 30개 (예를 들어, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개)의 뉴클레오티드 길이이며, 여기서 센스 영역은 약 3 내지 약 25개 (예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개)의 뉴클레오티드 길이이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 단일 가닥 헤어핀 siNA 분자를 포함하며, 여기서 siNA 분자는 약 25 내지 약 70개 (예를 들어, 약 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70개)의 뉴클레오티드 길이이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 단일-가닥 원형 siNA 분자를 포함하며, 여기서 siNA 분자는 약 38 내지 약 70개 (예를 들어, 약 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70개)의 뉴클레오티드 길이이다.

다양한 대칭 실시양태에서, 본 발명의 siNA 이중나선은 독립적으로 약 15 내지 약 40개 (예를 들어, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개)의 염기 쌍을 포함한다.

본 발명의 siNA 분자가 비대칭인 또 다른 실시양태에서, siNA 분자는 약 3 내지 25개 (예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개)의 염기 쌍을 포함한다.

본 발명의 siNA 분자가 헤어핀 또는 원형 구조인 또 다른 실시양태에서, siNA 분자는 약 3 내지 약 30개 (예를 들어, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개)의 염기 쌍을 포함한다.

본 발명의 siNA 분자의 센스 가닥 및 안티센스 가닥, 또는 센스 영역 및 안티센스 영역은 상보적일 수 있다. 또한, 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역은 ICAM-1 표적 RNA의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부에 상보적일 수 있다. siNA가 ICAM-1 유전자 또는 그의 일부의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는 경우, 센스 가닥 또는 센스 영역. 특정 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 센스 영역 또는 센스 가닥은 ICAM-1 표적 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 예를 들어 표 10에 나타난 진뱅크 등록 번호로 표시된 서열 (이에 제한되지는 않음)에 상보적인 siNA 분자의 안티센스 영역 또는 안티센스 가닥의 부분에 상보적이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 siNA 분자의 센스 가닥 또는 센스 영역과 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역 사이에 완벽한 상보성을 갖는다. 다른 또는 동일 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 상응하는 표적 핵산 분자에 완벽하게 상보적이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 siNA 분자의 센스 가닥 또는 센스 영역과 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역 사이에, 또는 siNA 분자의 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역과 상응하는 표적 핵산 분자 사이에 부분적 상보성 (즉, 100% 미만의 상보성)을 갖는다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자는 다른 가닥의 뉴클레오티드에 상보적인 1개의 가닥 내에 약 15 내지 약 40개 (예를 들어, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개)의 뉴클레오티드를 갖는다. 다른 실시양태에서, 분자는 이중-가닥 핵산 분자의, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드에 상보적인 센스 영역 내에 약 15 내지 약 40개 (예를 들어, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개)의 뉴클레오티드를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자는 그의 상응하는 표적 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 안티센스 가닥 내에 약 15 내지 약 40개 (예를 들어, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개)의 뉴클레오티드를 갖는다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자는 다른 가닥 또는 영역과 염기 쌍을 형성하지 않거나 또는 미스매치인 1개의 가닥 또는 영역 내에 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 뉴클레오티드를 갖는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자는 다른 가닥 또는 영역과 염기 쌍을 형성하지 않거나 또는 미스매치인 각각의 가닥 또는 영역 내에 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 뉴클레오티드를 갖는다.

본 발명은 또한 상기 달리 기재된 바와 같은 이중-가닥 핵산 (siNA) 분자를 포함하며, 여기서 제1 가닥 및 제2 가닥은 서로에 상보적이고, 적어도 1개의 가닥은 고엄격도 조건하에 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150의 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화가능하고, 임의의 뉴클레오티드는 비변형되거나, 또는 화학적으로 변형된다.

혼성화 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] 참조). 바람직한 엄격한 혼성화 조건은 42℃에서 50％ 포름아미드, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5x 덴하르트(Denhardt's) 용액, 10％ 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎍/mL 변성된 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 밤새 인큐베이션하고 이어서 약 65℃에서 0.1xSSC 중에서 필터를 세척하는 것을 포함한다.

한 구체적 실시양태에서, 제1 가닥은 다른 가닥의 뉴클레오티드에 상보적인 약 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21개의 뉴클레오티드를 가지며, 적어도 1개의 가닥은 고엄격도 조건하에 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150의 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화 가능하고, 임의의 뉴클레오티드는 비변형되거나, 또는 화학적으로 변형된다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 약 1 내지 약 4개 (예를 들어, 약 1, 2, 3 또는 4개)의 뉴클레오티드의 오버행을 포함한다. 오버행의 뉴클레오티드는 동일하거나 상이한 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 오버행은 이중-가닥 핵산 분자의 1개 가닥에서 또는 2개 가닥 둘 다에서, 3'-말단에서 발생한다. 예를 들어, 본 발명의 이중-가닥 핵산 분자는, 이중-가닥 핵산 분자의 가이드 가닥 또는 안티센스 가닥/영역의 3'-말단, 패신저 가닥 또는 센스 가닥/영역의 3'-말단, 또는 가이드 가닥 또는 안티센스 가닥/영역과 패신저 가닥 또는 센스 가닥/영역 둘 다에 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 오버행 부분을 포함하는 뉴클레오티드는, 본 발명의 siNA 분자의 가이드 가닥 또는 안티센스 가닥/영역의 오버행 부분을 포함하는 뉴클레오티드가 ICAM-1 표적 폴리뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드에 상보적일 수 있고/거나 본 발명의 siNA 분자의 패신저 가닥 또는 센스 가닥/영역의 오버행 부분을 포함하는 뉴클레오티드가 ICAM-1 표적 폴리뉴클레오티드 서열 내의 뉴클레오티드를 포함할 수 있는, ICAM-1 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 기초로 하는 서열을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 오버행은 ICAM-1 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적인 2개의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 그러나, 다른 실시양태에서, 오버행은 ICAM-1 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적이지 않은 2개의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 특정 실시양태에서, 오버행은 ICAM-1 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 일부에 상보적이지 않은 3'-UU 오버행을 포함한다. 다른 실시양태에서, 오버행은 안티센스 가닥의 3'-말단의 UU 오버행 및 센스 가닥의 3'-말단의 TT 오버행을 포함한다.

3'-말단 뉴클레오티드 오버행을 갖는 본원에 기재된 siNA의 분자의 임의의 실시양태에서, 오버행은 하나 이상의 핵산 당, 염기 또는 주쇄 위치에서 임의로 화학적으로 변형된다. 본 발명의 이중-가닥 핵산 (siNA) 분자의 오버행 부분의 변형된 뉴클레오티드의 대표적인 예에는 2'-O-알킬 (예를 들어, 2'-O-메틸), 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노 (FANA), 4'-티오, 2'-O-트리플루오로메틸, 2'-O-에틸-트리플루오로메틸, 2'-O-디플루오로메톡시-에톡시, 범용 염기, 비-시클릭 또는 5-C-메틸 뉴클레오티드가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 보다 바람직한 실시양태에서, 오버행 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2-플루오로 뉴클레오티드 또는 2'-데옥시리보뉴클레오티드이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 평활 말단을 갖는 이중나선 핵산 분자를 포함하고 (즉, 어떠한 뉴클레오티드 오버행도 갖지 않음), 여기서 두 말단 모두가 평활이거나, 대안적으로는 말단 중 1개가 평활이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 1개의 평활 말단을 포함할 수 있고, 예를 들어 안티센스 가닥의 5'-말단 및 센스 가닥의 3'-말단은 어떠한 오버행 뉴클레오티드도 갖지 않는다. 또 다른 예에서, siNA 분자는 1개의 평활 말단을 포함하며, 예를 들어 안티센스 가닥의 3'-말단 및 센스 가닥의 5'-말단은 어떠한 오버행 뉴클레오티드도 갖지 않는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 2개의 평활 말단을 포함하며, 예를 들어 안티센스 가닥의 3'-말단 및 센스 가닥의 5'-말단, 뿐만 아니라 안티센스 가닥의 5'-말단 및 센스 가닥의 3'-말단은 어떠한 오버행 뉴클레오티드도 갖지 않는다.

본 발명의 siNA 분자의 임의의 실시양태 또는 측면에서, 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 3'과 5'-말단 둘 다에 캡 (본원에 기재되거나 당업계에 공지되어 있는 캡)을 추가로 가질 수 있다. 또는, 헤어핀 siNA 분자의 경우, 캡은 폴리뉴클레오티드의 말단 뉴클레오티드 중 하나 또는 둘 다에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 캡은 이중-가닥 siNA 분자의 센스 가닥의 말단 중 하나 또는 둘 다에 있다. 다른 실시양태에서, 캡은 안티센스 (가이드) 가닥의 5'-말단 및 3'-말단에 있다. 바람직한 실시양태에서, 캡은 센스 가닥의 3'-말단 및 센스 가닥의 5'-말단 있다.

이러한 말단 캡의 대표적인 비제한적 예에는 역전된 무염기성 뉴클레오티드, 역전된 데옥시 무염기성 뉴클레오티드, 역전된 뉴클레오티드 모이어티, 도 5에 나타낸 기, 글리세릴 변형, 알킬 또는 시클로알킬 기, 헤테로사이클, 또는 RNAi 활성을 방지하는 임의의 기가 포함된다.

본 발명의 siNA 분자의 임의의 실시양태는 5' 포스페이트 말단을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, siNA 분자는 말단 포스페이트가 결여된다.

본 발명의 임의의 siNA 분자 또는 구축물은 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 변형은 시험관내 또는 생체내 특성, 예컨대 안정성, 활성, 독성, 면역 반응을 개선 (예를 들어, 인터페론 반응, 염증성 또는 염증유발성 시토카인 반응 또는 톨-유사 수용체 (TlF) 반응의 자극 방지)하고/거나 생체이용률을 개선하는데 이용될 수 있다.

본 출원인은 상응하는 비변형되거나 최소 변형된 siRNA 분자에 비해 개선된 RNAi 활성을 갖는 화학적으로 변형된 siNA 분자를 본원에 기재한다. 본원에 개시된 화학적으로 변형된 siNA 모티프는 비변형되거나 최소 변형된 활성 siRNA와 실질적으로 유사한 RNAi 활성을 유지하는 능력 (예를 들어, 문헌 [Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20:6877-6888] 참조)을 제공하는 동시에 뉴클레아제 내성 및 치료 용도로 사용하기에 적합한 약동학 특성을 제공한다.

다양한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 변형을 포함하고, 여기서 센스 및/또는 안티센스 가닥에 존재하는 임의의 (예를 들어, 하나 이상의 또는 모든) 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다 (예를 들어, 1개의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이거나, 또는 모든 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이거나, 다르게는 다수의 (즉, 1개 초과의) 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드임). 일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 화학적 변형에 의해 부분적으로 변형된다 (예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80개의 뉴클레오티드가 변형됨). 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 화학적 변형에 의해 완전히 변형되는데 (예를 들어, 100% 변형됨), 즉 siNA 분자는 어떠한 리보뉴클레오티드도 함유하지 않는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 적어도 약 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78개의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 센스 가닥의 뉴클레오티드 중 1개 이상이 변형된다. 동일 또는 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 중 1개 이상이 변형된다.

단일 siNA 분자 내의 화학적 변형은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 가닥은 1개 이상의 화학적 변형을 갖는다. 다른 실시양태에서, 각각의 가닥은 동일하거나 상이할 수 있는 1개 이상의 화학적 변형, 예컨대 당, 염기 또는 주쇄 (즉, 뉴클레오티드간 연결부) 변형을 갖는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 적어도 2, 3, 4, 5개 이상의 다양한 화학적 변형을 함유한다.

본 발명에 사용하기에 적합한 화학적 변형의 비제한적 예가 USSN 10/444,853, USSN 10/981,966, USSN 12/064,014 및 여기에 인용된 참고문헌에 개시되어 있으며, 여기에는 당, 염기 및 포스페이트, 비-뉴클레오티드 변형 및/또는 그의 임의의 조합이 포함된다.

다양한 실시양태에서, 이중-가닥 siNA 분자에 존재하는 피리미딘 뉴클레오티드의 대부분은 당 변형을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이중-가닥 siNA 분자에 존재하는 퓨린 뉴클레오티드의 대부분은 당 변형을 포함한다. 특정 경우에, 퓨린 및 피리미딘은 2'-당 위치에서 상이하게 변형된다 (즉, 1개 이상의 퓨린이 2'-당 위치에서 동일하거나 상이한 가닥 내의 하나 이상의 피리미딘과 상이한 변형을 가짐).

본 발명의 이러한 측면의 특정 구체적 실시양태에서, 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 2'-O-알킬 (예를 들어, 2'-O-메틸) 뉴클레오티드이다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 뉴클레오티드는 리보-유사, 노던(Northern) 또는 A 형태 나선 구조를 갖는다 (예를 들어, 문헌 [Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984] 참조). 노던 구조를 갖는 뉴클레오티드의 비제한적 예에는 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드 (예를 들어, 2'-O, 4'-C-메틸렌-(D-리보푸라노실) 뉴클레오티드); 2'-메톡시에톡시 (MOE) 뉴클레오티드; 2'-메틸-티오-에틸 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-클로로 뉴클레오티드, 2'-아지도 뉴클레오티드, 2'-O-트리플루오로메틸 뉴클레오티드, 2'-O-에틸-트리플루오로메톡시 뉴클레오티드, 2'-O-디플루오로메톡시-에톡시 뉴클레오티드, 4'-티오 뉴클레오티드 및 2'-O-메틸 뉴클레오티드가 포함된다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 센스 가닥의 상보적 영역의 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥의 상보적 영역의 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥의 상보적 영역의 모든 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 가닥의 상보적 영역의 모든 퓨린은 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오티드이다. 특정 실시양태에서, 센스 가닥의 상보적 영역의 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이고; 안티센스 가닥의 상보적 영역의 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이고; 센스 가닥의 상보적 영역의 모든 퓨린 뉴클레오티드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드이고 안티센스 가닥의 상보적 영역의 모든 퓨린은 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오티드이다.

상기 기재된 변형 중 임의의 것 또는 그의 조합 (인용된 참고문헌에 있는 것들 포함)은 본 발명의 모든 siNA 분자에 적용될 수 있다.

본 발명의 변형된 siNA 분자는 siNA 분자 내 다양한 위치에 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 이중 가닥 siNA 분자는 siNA 이중나선 내 내부 염기 쌍 형성 위치에 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중 가닥 siNA 분자는 siNA 분자의 염기 쌍 비-형성 영역 또는 오버행 영역에 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중 가닥 siNA 분자는 siNA 분자의 말단 위치에 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 이러한 말단 영역에는 siNA 분자의 센스 및/또는 안티센스 가닥 또는 영역의 3'-위치 및/또는 5'-위치가 포함된다. 추가로, 본 발명의 변형된 siNA 분자 중 임의의 것은 siNA 이중나선의 올리고뉴클레오티드 가닥의 1개 또는 둘 다에, 예를 들어 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 두 가닥 모두에 변형을 가질 수 있다. 더욱이, 본 발명의 siNA 분자의 화학적 변형과 관련하여, 본 발명의 이중-가닥 siNA 분자의 각각의 가닥은, 각각의 가닥이 상이한 패턴의 화학적 변형을 포함하도록 하나 이상의 화학적 변형을 가질 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 이중-가닥 siNA 분자의 각 가닥은 상이한 패턴의 화학적 변형, 예컨대 본원에서의 임의의 "Stab 00" 내지 "Stab 36" 또는 "Stab 3F" 내지 "Stab 36F" (표 11) 변형 패턴 또는 그의 임의의 조합을 포함한다. 또한, 상이한 패턴의 변형을 생성할 수 있는 변형 방식의 비제한적인 예가 표 11에 제공된다. 표 11에서 Stab로 지칭된 안정화 화학은 센스/안티센스 화학의 임의의 조합, 예컨대 Stab 7/8, Stab 7/11, Stab 8/8, Stab 18/8, Stab 18/11, Stab 12/13, Stab 7/13, Stab 18/13, Stab 7/19, Stab 8/19, Stab 18/19, Stab 7/20, Stab 8/20, Stab 18/20, Stab 7/32, Stab 8/32 또는 Stab 18/32로 조합될 수 있다 (예를 들어, Stab 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20 또는 32개의 센스 또는 안티센스 가닥, 또는 그의 임의의 조합을 갖는 임의의 siNA). 본원에서, 번호를 매긴 Stab 화학은 표 11에 나타낸 화학의 2'-플루오로 및 2'-OCF3 버전 둘 다를 포함할 수 있다. 예를 들어, "Stab 7/8"은 Stab 7/8 및 Stab 7F/8F 등을 모두 지칭한다.

다른 실시양태에서, siNA 분자의 가이드 가닥 또는 가이드 영역 (또한, 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역으로도 공지됨)의 5'-말단의 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개)의 뉴클레오티드가 리보뉴클레오티드이다.

일부 실시양태에서, 안티센스 가닥 내의 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥에 존재하는 퓨린 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 뉴클레오티드 또는 2'-데옥시 뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 센스 가닥 내의 피리미딘 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피리미딘 뉴클레오티드이고, 센스 가닥에 존재하는 퓨린 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오티드이다.

다양한 변형 패턴을 갖는 이러한 siNA 분자의 센스 및 안티센스 가닥의 추가의 비제한적 예가 도 2 및 도 3에 나타나 있다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가지며 하기 화학식 A를 포함하는, 이중-가닥 siNA 분자가 제공된다.

<화학식 A>

상기 식에서, 상부 가닥은 이중-가닥 핵산 분자의 센스 가닥이고, 하부 가닥은 안티센스 가닥이고; 여기서 안티센스 가닥은 서열 143, 서열 144, 서열 145, 서열 146, 서열 147, 서열 148, 서열 149 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 대해 상보성을 갖는 서열을 포함하고;

각각의 B는 존재 또는 부재하는 말단 캡이고;

[N]은 리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드를 나타내고;

X1 및 X2는 독립적으로 0 내지 4의 정수이고;

X3은 17 내지 36의 정수이고;

X4는 11 내지 35의 정수이고;

X5는 1 내지 6의 정수이고, 단 X4 및 X5의 합은 17 내지 36이다.

특정 실시양태에서, 15개 이상의 뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 연속 스트레치를 형성한다.

다른 실시양태에서, siNA 분자는 서열 143, 서열 144, 서열 145, 서열 146, 서열 147, 서열 148, 서열 149 또는 서열 150에 대해 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 치환, 미스매치 및/또는 부가를 함유할 수 있으나, 단 siNA 분자는 예를 들어 RNAi를 조절하기 위한 그의 활성을 유지한다. 비제한적 예에서, 결실, 치환, 미스매치 및/또는 부가는 루프 또는 벌지, 또는 대안적으로 워블 또는 다른 대안적 (비 왓슨-크릭) 염기 쌍을 생성할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은

일부 실시양태에서, 화학식 A를 갖는 siNA 분자는 핵산 분자의 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역의 5'-말단에 말단 포스페이트 기를 포함한다.

다양한 실시양태에서, 화학식 A를 갖는 siNA 분자는 X5 = 1, 2 또는 3이고; 각각의 X1 및 X2 = 1 또는 2이고; X3 = 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30이고, X4 = 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30인 경우를 포함한다.

한 구체적 실시양태에서, 화학식 A를 갖는 siNA 분자는 X5 = 1이고; 각각의 X1 및 X2 = 2이고; X3 = 19이고; X4 = 18인 경우를 포함한다.

또 다른 구체적 실시양태에서, 화학식 A를 갖는 siNA 분자는 X5 = 2이고; 각각의 X1 및 X2 = 2이고; X3 = 19이고; X4 = 17인 경우를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 화학식 A를 갖는 siNA 분자는 X5 = 3이고; 각각의 X1 및 X2 = 2이고; X3 = 19이고; X4 = 16인 경우를 포함한다.

특정 실시양태에서, 화학식 A를 갖는 siNA 분자는 센스 가닥 또는 센스 영역의 3' 및 5' 말단에 캡 (B)를 포함한다.

특정 실시양태에서, 화학식 A를 갖는 siNA 분자는 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역의 3'-말단에 캡 (B)를 포함한다.

다양한 실시양태에서, 화학식 A를 갖는 siNA 분자는 센스 가닥 또는 센스 영역의 3' 및 5' 말단에 캡 (B)를 포함하고, 안티센스 가닥 또는 안티센스 영역의 3'-말단에 캡 (B)를 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 화학식 A를 갖는 siNA 분자는 이중-가닥 핵산 분자의 센스 (상부) 가닥의 5'-말단에만 캡 (B)를 포함한다.

한 실시양태에서, 화학식 A를 갖는 siNA 분자는 핵산 분자의 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 다의 3'-말단의 제1 말단 (N) 및 인접 뉴클레오티드 사이에 1개 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결부를 추가로 포함한다. 예를 들어, 이중 가닥 핵산 분자는 X1 및/또는 X2 = 2 (포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결부를 갖는 오버행 뉴클레오티드 위치를 가짐), 예를 들어 (NsN) (여기서, "s"는 포스포로티오에이트를 나타냄)인 경우를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 화학식 A를 갖는 siNA 분자는, 안티센스 (하부) 가닥의 N 및 [N] 뉴클레오티드에 대해서도 상보성을 갖는 ICAM-1 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 가닥 (하부 가닥)의 (N) 뉴클레오티드를 포함한다.

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

G는 구아노신이고;

U는 우리딘이고;

A는 아데노신이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 siNA가 하기의 것인 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 제공한다.

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

C는 시티딘이고;

U는 우리딘이고;

G는 구아노신이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

A는 아데노신이고;

U는 우리딘이고;

C는 시티딘이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

G는 구아노신이고;

U는 우리딘이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

A는 아데노신이고;

U는 우리딘이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

A는 아데노신이고;

U는 우리딘이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

C는 시티딘이고;

G는 구아노신이고;

U는 우리딘이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

추가 실시양태에서, 본 발명은 siNA가 하기의 것인 이중 가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 제공한다.

상기 식에서,

각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;

c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;

u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;

A는 2'-데옥시아데노신이고;

G는 2'-데옥시구아노신이고;

T는 티미딘이고;

A는 아데노신이고;

U는 우리딘이고;

G는 구아노신이고;

A는 2'-O-메틸-아데노신이고;

G는 2'-O-메틸-구아노신이고;

U는 2'-O-메틸-우리딘이고;

C. siNA 분자의 생성/합성

본 발명의 siNA는 당업자에게 공지된 수많은 기술을 이용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, siNA는 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 플라스미드로 코딩될 수 있다 (예를 들어, 자동적으로 헤어핀 루프를 갖는 이중나선으로 접힌 서열로서 전사됨). siNA는 또한 이. 콜라이(E. coli) RNase II 또는 다이서에 의한 더 긴 dsRNA (예를 들어, 길이가 약 25개 초과의 뉴클레오티드인 dsRNA)의 절단에 의해 생성될 수 있다. 이들 효소는 dsRNA를 생물학적 활성 siRNA로 프로세싱한다 (예를 들어, 문헌 [Yang et al., PNAS USA 99:9942-9947 (2002)]; [Calegari et al. PNAS USA 99:14236 (2002)]; [Byron et al. Ambion Tech Notes; 10 (1):4-6 (2009)]; [Kawaski et al., Nucleic Acids Res., 31:981-987 (2003)]; [Knight and Bass, Science, 293:2269-2271 (2001)] 및 [Roberston et al., J. Biol. Chem 243:82(1969)] 참조).

1. 화학적 합성

바람직하게는, 본 발명의 siNA는 화학적으로 합성된다. 올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 특정 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 결여 리보뉴클레오티드의 일부)는 당업계에 공지되어 있는 프로토콜을 이용하여, 예를 들어 문헌 [Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19], 국제 PCT 공보 번호 WO 99/54459 (Thompson et al.), 문헌 [Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684], [Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio., 74, 59], [Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45] 및 미국 특허 번호 6,001,311 (Brennan)에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 합성은 통상적인 핵산 보호기 및 커플링기, 예컨대 5'-말단에서의 디메톡시트리틸 및 3'-말단에서의 포스포르아미다이트를 사용한다.

변형을 갖지 않는 siNA 분자는 문헌 [Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845]; [Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433]에 기재된 바와 같은 절차를 이용하여 합성될 수 있다. 통상적인 핵산 보호기 및 커플링기, 예컨대 5'-말단에서의 디메톡시트리틸 및 3'-말단에서의 포스포르아미다이트를 사용하는 이들은, 본 발명의 특정 siNA 분자에 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 미국 특허 번호 6,995,259, 6,686,463, 6,673,918, 6,649,751, 6,989,442, 및 USSN 10/190,359에 기재된 방법에 따라 합성되고, 탈보호되고, 분석된다.

비제한적 합성 실시예에서, 소규모 합성은, 394 어플라이드 바이오시스템즈 인크(Applied Biosystems, Inc.) 합성기에서 0.2 μmol 규모의 프로토콜을 사용하여, 2'-O-메틸화 뉴클레오티드의 경우에는 2.5분의 커플링 단계로, 그리고 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드의 경우에는 45초의 커플링 단계로 수행된다. 표 12에 합성 사이클에 사용된 시약의 양 및 접촉 횟수가 요약되어 있다.

대안적으로, 본 발명의 siNA 분자는 개별적으로 합성하고, 합성 후에, 예를 들어 라이게이션에 의해 (문헌 [Moore et al., 1992, Science 256, 9923]; 국제 PCT 공보 번호 WO 93/23569 (Draper et al.); 문헌 [Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Research 19, 4247]; [Bellon et al., 1997, Nucleosides ＆ Nucleotides, 16, 951]; [Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204]), 또는 합성 및/또는 탈보호 후의 혼성화에 의해, 함께 연결시킬 수 있다.

본 발명의 다양한 siNA 분자는 또한 미국 특허 번호 5,889,136; 6,008,400 및 6,111,086 (Scaringe et al.)의 교시를 이용하여 합성될 수 있다.

2. 벡터 발현

대안적으로, 표적 ICAM-1 분자를 코딩하는 유전자와 상호작용하고 이를 하향-조절하는 본 발명의 siNA 분자는 DNA 또는 RNA 벡터 내로 삽입된 전사 단위로부터 발현되고 전달될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Couture et al., 1996, TIG., 12, 510] 참조). 재조합 벡터는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. siNA를 발현하는 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 알파바이러스 (이에 제한되지는 않음)를 기반으로 하여 구축될 수 있다.

일부 실시양태에서, pol III 기반 구축물이 본 발명의 핵산 분자를 발현하는데 사용되며, siNA 분자 서열의 전사는 진핵 RNA 폴리머라제 I (pol I), RNA 폴리머라제 II (pol II) 또는 RNA 폴리머라제 III (pol III)에 대한 프로모터로부터 구동될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,902,880 및 6,146,886 (Thompson)을 참조한다. 또한, 문헌 [Izant and Weintraub, 1985, Science, 229, 345]; [McGarry and Lindquist, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 399]; [Scanlon et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5]; [Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15]; [Dropulic et al., 1992, J. Virol., 66, 1432-41]; [Weerasinghe et al., 1991, J. Virol., 65, 5531-4]; [Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6]; [Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9]; [Sarver et al., 1990 Science, 247, 1222-1225]; [Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259]; [Good et al., 1997, Gene Therapy, 4, 45]를 참조한다. pol II 또는 pol III 프로모터로부터의 전사체는 모든 세포에서 높은 수준으로 발현되고, 주어진 세포 유형에서 주어진 pol II 프로모터의 수준은 근처에 존재하는 유전자 조절 서열 (인핸서, 사일렌서 등)의 특성에 따라 달라진다. 원핵 RNA 폴리머라제 효소가 적절한 세포에서 발현된다면 원핵 RNA 폴리머라제 프로모터 또한 사용된다 (문헌 [Elroy-Stein and Moss, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 87, 6743-7]; [Gao and Huang 1993, Nucleic Acids Res., 21, 2867-72]; [Lieber et al., 1993, Methods Enzymol., 217, 47-66]; [Zhou et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 10, 4529-37]). 몇몇 연구자들은 이러한 프로모터로부터 발현된 핵산 분자가 포유동물 세포에서 기능할 수 있음을 입증하였다 (예를 들어, 문헌 [Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15]; [Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 89, 10802-6]; [Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9]; [Yu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 90, 6340-4]; [L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 11, 4411-8]; [Lisziewicz et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 90, 8000-4]; [Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259]; [Sullenger ＆ Cech, 1993, Science, 262, 1566]). 보다 구체적으로, 전사 단위, 예컨대 U6 소형 핵 (snRNA), 전이 RNA (tRNA) 및 아데노바이러스 VA RNA를 코딩하는 유전자로부터 유래된 전사 단위가 세포에서 목적하는 RNA 분자, 예를 들어 siNA를 고 농도로 생성하는 데 유용하다 (상기 문헌 [Thompson et al.]; [Couture and Stinchcomb, 1996]; 문헌 [Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res., 22, 2830]; 미국 특허 번호 5,624,803 (Noonberg et al.); 문헌 [Good et al., 1997, Gene Ther., 4, 45]; 국제 PCT 공보 번호 WO 96/18736 (Beigelman et al.)). 상기 siNA 전사 단위는 포유동물 세포 내로의 도입을 위한 다양한 벡터, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, 플라스미드 DNA 벡터, 바이러스 DNA 벡터 (예컨대, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 벡터), 또는 바이러스 RNA 벡터 (예컨대, 레트로바이러스 또는 알파바이러스 벡터) 내로 도입시킬 수 있다 (검토를 위해, 상기 문헌 [Couture and Stinchcomb, 1996] 참조).

본 발명의 siNA 분자를 발현하는 데 사용되는 벡터는 siNA 이중나선의 1개 가닥 또는 2개 가닥 둘 다, 또는 siNA 이중나선으로 자가 혼성화되는 단일 자기-상보적 가닥을 코딩할 수 있다. 본 발명의 siNA 분자를 코딩하는 핵산 서열은 siNA 분자가 발현되도록 하는 방식으로 작동적으로 연결될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Paul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505]; [Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497]; [Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500]; 및 [Novina et al., 2002, Nature Medicine, advance online publication doi:10.1038/nm725] 참조).

D. 담체/전달 시스템

본 발명의 siNA 분자는 직접 첨가되거나, 또는 양이온성 지질과 복합체를 형성하거나, 리포좀 내에 패키징되거나, siNA 분자를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 존재하거나, 또는 다르게는 표적 세포 또는 조직으로 전달될 수 있다. 핵산 분자의 전달 방법은 문헌 [Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139]; [Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995]; [Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol., 16, 129-140]; [Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192]; 및 [Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192]에 기재되어 있다. 미국 특허 번호 6,395,713 (Beigelman et al.) 및 PCT WO 94/02595 (Sullivan et al.)에는 핵산 분자의 일반적인 전달 방법이 추가로 기재되어 있다. 이러한 프로토콜을 이용하여 사실상 임의의 핵산 분자를 전달할 수 있다. 핵산 분자는, 리포좀 내의 캡슐화, 이온영동법, 또는 생분해성 중합체, 히드로겔, 시클로덱스트린 (예를 들어, 문헌 [Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074]; 국제 PCT 공보 번호 WO 03/47518 및 WO 03/46185 (Wang et al.) 참조), 폴리(락트-코-글리콜)산 (PLGA) 및 PLCA 미세구 (예를 들어, 미국 특허 6,447,796 및 미국 특허 출원 공보 번호 US 2002130430 참조), 생분해성 나노캡슐 및 생체결합성 미세구와 같은 다른 비히클 내로의 혼입, 또는 단백질성 벡터 (국제 PCT 공보 번호 WO 00/53722 (O'Hare and Normand))를 비롯한 (이에 제한되지 않음) 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 세포에 투여될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 siNA 분자를 함유하는 담체 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 담체 시스템은 지질-기재 담체 시스템, 양이온성 지질, 또는 리포좀 핵산 복합체, 리포좀, 미셀, 비로좀, 지질 나노입자 또는 그의 혼합물이다. 다른 실시양태에서, 담체 시스템은 중합체-기재 담체 시스템, 예컨대 양이온성 중합체-핵산 복합체이다. 추가 실시양태에서, 담체 시스템은 시클로덱스트린-기재 담체 시스템, 예컨대 시클로덱스트린 중합체-핵산 복합체이다. 추가 실시양태에서, 담체 시스템은 단백질-기재 담체 시스템, 예컨대 양이온성 펩티드-핵산 복합체이다. 바람직하게는, 담체 시스템은 지질 나노입자 제제이다. 표 13에 기재된 지질 나노입자 ("LNP") 제제는 본원에서 임의의 siNA 분자 또는 siNA 분자의 조합물에 적용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 USSN 11/353,630 및 USSN 11/586,102에 기재된 바와 같은 지질 나노입자 조성물로 제제화된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 제제 LNP-051; LNP-053; LNP-054; LNP-069; LNP-073; LNP-077; LNP-080; LNP-082; LNP-083; LNP-060; LNP-061; LNP-086; LNP-097; LNP-098; LNP-099; LNP-100; LNP-101; LNP-102; LNP-103; 또는 LNP-104 (표 13 참조) 중 임의의 것으로 제제화된, siNA 분자를 포함하는 조성물을 특징으로 한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 siNA 분자의 접합체 및/또는 복합체를 특징으로 한다. 이러한 접합체 및/또는 복합체는 생물학적 시스템, 예컨대 세포 내로의 siNA 분자의 전달을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 접합체 및 복합체는 치료 화합물을 세포막을 통해 이동시키고/거나 본 발명의 핵산 분자의 약동학을 변경시키고/거나 국소화를 조절함으로써 치료 활성을 부여할 수 있다. 이러한 접합체의 비제한적 예가 USSN 10/427,160 및 USSN 10/201,394; 및 미국 특허 번호 6,528,631; 6,335,434; 6,235,886; 6,153,737; 5,214,136; 5,138,045에 기재되어 있다.

다양한 실시양태에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)는 본 발명의 siNA 화합물에 공유 결합될 수 있다. 부착된 PEG는 임의의 분자량, 바람직하게는 약 100 내지 약 50,000 달톤 (Da)일 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 폴리 (에틸렌 글리콜) 지질을 함유하는 표면 변형된 리포좀 (PEG-변형된, 또는 장기 순환 리포좀 또는 스텔스 리포좀) 및 본 발명의 siNA 분자를 포함하는 조성물 또는 제제를 특징으로 한다 (예를 들어, 국제 PCT 공보 번호 WO 96/10391; 국제 PCT 공보 번호 WO 96/10390 (Ansell et al.); 국제 PCT 공보 번호 WO 96/10392 (Holland et al.)에 개시된 바와 같음).

일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 또한 폴리에틸렌이민 및 그의 유도체, 예컨대 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸갈락토사민 (PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-N-아세틸갈락토사민 (PEI-PEG-triGAL) 유도체와 함께 제제화되거나, 또는 복합체를 형성한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 미국 특허 출원 공보 번호 20030077829에 기재된 바와 같이 제제화된다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 미국 특허 출원 공보 번호 20010007666에 기재된 것과 같은 막 파괴제와 복합체를 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 막 파괴제 (또는 파괴제들) 및 siNA 분자는, 또한 양이온성 지질 또는 헬퍼 지질 분자 (예컨대, 미국 특허 번호 6,235,310에 기재된 지질)와 복합체를 형성한다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 미국 특허 출원 공보 번호 2003077829; 20050287551; 20050164220; 20050191627; 20050118594; 20050153919; 20050085486 및 20030158133; 및 국제 PCT 공보 번호 WO 00/03683 및 WO 02/087541에 기재된 바와 같은 전달 시스템과 함께 복합체를 형성한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 리포좀 제제는 미국 특허 번호 6,858,224; 6,534,484; 6,287,591; 6,835,395; 6,586,410; 6,858,225; 6,815,432; 6,586,001; 6,120,798; 6,977,223; 6,998,115; 5,981,501; 5,976,567; 5,705,385; 및 미국 특허 출원 공보 번호 2006/0019912; 2006/0019258; 2006/0008909; 2005/0255153; 2005/0079212; 2005/0008689; 2003/0077829, 2005/0064595, 2005/0175682, 2005/0118253; 2004/0071654; 2005/0244504; 2005/0265961 및 2003/0077829에 기재된 화합물 및 조성물과 함께 제제화되거나, 또는 복합체를 형성하는 본 발명의 siNA 분자 (예를 들어, siNA)를 포함한다.

대안적으로, 본 발명의 siRNA를 발현하는, 상기 논의된 바와 같은 재조합 플라스미드 및 바이러스 벡터가 본 발명의 분자를 전달시키는데 사용될 수 있다. siNA 분자 발현 벡터의 전달은 전신으로, 예컨대 정맥내 또는 근육내 투여에 의해, 대상체로부터 체외이식된 표적 세포에 투여한 다음 대상체 내로 재도입함으로써, 또는 목적하는 표적 세포 내로의 도입을 허용하는 임의의 다른 수단에 의해 이루어질 수 있다 (검토를 위해, 문헌 [Couture et al., 1996, TIG., 12, 510] 참조). 이러한 재조합 플라스미드는 또한 직접적으로, 또는 적합한 전달 시약, 예를 들어 미루스 트랜짓(Mirus Transit) LT1 친유성 시약; 리포펙틴; 리포펙타민; 셀펙틴; 다가양이온 (예를 들어, 폴리리신) 또는 리포좀 지질-기재 담체 시스템, 양이온성 지질 또는 리포좀 핵산 복합체, 미셀, 비로좀, 지질 나노입자와 조합되어 투여될 수 있다.

E. 키트

본 발명은 또한 키트 형태의 핵산을 제공한다. 키트는 용기를 포함할 수 있다. 키트는 전형적으로 본 발명의 핵산과 함께 그의 투여를 위한 지침서를 포함한다. 특정 예에서, 핵산은 부착된 표적화 잔기를 가질 수 있다. 표적화 잔기 (예를 들어, 항체, 단백질)의 부착 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 특정 예에서, 핵산은 화학적으로 변형된다. 다른 실시양태에서, 키트는 하나 초과의 본 발명의 siNA 분자를 함유한다. 키트는 본 발명의 siNA 분자를 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함할 수 있다. 키트는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

F. 치료 용도/제약 조성물

ICAM-1 연구에서의 현재의 지식은 ICAM-1 활성의 검정 방법, 및 연구, 진단 및 치료 용도를 위해 ICAM-1 발현을 조절할 수 있는 화합물에 대한 필요성을 지적한다. 하기 기재된 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 ICAM-1 수준과 관련된 질환 상태의 진단을 위한 검정에 사용될 수 있다. 또한, 핵산 분자 및 제약 조성물은 ICAM-1 수준과 관련된 질환 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.

1. ICAM-1 관련 질환 상태

ICAM-1 발현 조절과 관련될 수 있는 특정 질환 상태에는 호흡기, 염증성 및 자가면역 질환, 소질, 상태 및 표현형이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 질환 상태 또는 적응증의 비제한적 예에는 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 천식, 호산구성 기침, 기관지염, 폐 동종이식편의 급성 및 만성 거부반응, 사르코이드증, 폐섬유증, 비염 및 부비동염이 포함된다. 각각의 염증성 호흡기 질환은 모두 증상을 유발하는 효소 또는 산소 라디칼을 방출하는 다양한 염증성 세포를 동원 및 활성화하는 매개자의 존재, 염증의 지속, 및 정상 조직의 만성적인 파괴 또는 붕괴를 특징으로 한다.

본 발명의 siNA 분자가 표적 ICAM-1 mRNA를 분해시킬 수 있음 (그리고, 이에 따라 상기 언급된 질환을 억제할 수 있음)이 이해된다. 질환의 억제는 대상체에서 질환의 진행을 직접 측정함으로써 평가할 수 있다. 이는 또한 질환과 관련된 상태에서의 변화 또는 역전의 관찰을 통해 추론될 수 있다. 추가로, 본 발명의 siNA 분자는 예방으로서 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자 및 제약 조성물의 용도는 이들 질환 및 ICAM-1의 조절과 관련된 다른 질환을 개선, 치료, 예방 및/또는 치유하는데 사용될 수 있다.

2. 제약 조성물

본 발명의 siNA 분자는 다양한 치료적, 예방적, 미용적, 수의학적, 진단적, 표적 검증, 게놈 발견, 유전 공학 및 약리유전학적 용도에 유용한 시약 및 방법을 제공한다.

a. 제제

따라서, 본 발명은, 한 측면에서, 또한 기재된 siNA 분자의 제약 조성물을 제공한다. 이들 제약 조성물은 상기 화합물의 염, 예를 들어, 산 부가염, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 아세트산 및 벤젠 술폰산의 염을 포함한다. 이들 제약 제제 또는 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 서열 2 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 143 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 4 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 144 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 5 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 145 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 6 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 146 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 7 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 147 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 37 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 148 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 11 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 149 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 서열 38 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 45 및 서열 46을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 49 및 서열 50을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 51 및 서열 52를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 53 및 서열 54를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 55 및 서열 56을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 115 및 서열 116을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 63 및 서열 164를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 117 및 서열 118을 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 화학식 A를 포함하는 siNA 분자를 포함하는 제약 조성물을 특징으로 한다.

본 발명의 siNA 분자는 바람직하게는 대상체에게 투여되기 전에 당업계에 공지되어 있는 기술에 따라 제약 조성물로서 제제화된다. 본 발명의 제약 조성물은 적어도 멸균되고 발열원이 없는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 제약 조성물의 제조 방법은, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 17^th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)]에 기재된 바와 같이 당업계의 기술내에 포함된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물 (예를 들어, siNA 및/또는 그의 LNP 제제)은 통상적인 제약 부형제 및/또는 첨가제를 추가로 포함한다. 적절한 제약 부형제에는 보존제, 향미제, 안정화제, 항산화제, 삼투질농도 조절제, 완충제 및 pH 조절제가 포함된다. 적합한 첨가제에는 생리학적 생체적합성 완충제 (예를 들어, 트리메틸아민 히드로클로라이드), 킬레이트화제 (예컨대, 예를 들어, DTPA 또는 DTPA-비스아미드) 또는 칼슘 킬레이트 복합체 (예를 들어, 칼슘 DTPA, CaNaDTPA-비스아미드)의 첨가, 또는 임의로 칼슘 또는 나트륨 염 (예를 들어, 염화칼슘, 칼슘 아스코르베이트, 칼슘 글루코네이트 또는 칼슘 락테이트)의 첨가가 포함된다. 또한 항산화제 및 현탁화제가 사용될 수 있다.

국소 투여를 위한 다양한 유형의 제제의 비제한적 예에는 연고, 로션, 크림, 겔, 폼, 경피 패치에 의한 전달을 위한 제제, 분말, 스프레이, 에어로졸, 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 캡슐 또는 카트리지, 또는 점적제 (예를 들어, 점안제 또는 점비제), 연무화를 위한 용액/현탁액, 좌제, 페사리, 정체 관장 및 씹을 수 있거나 빨아먹을 수 있는 정제 또는 펠릿 (예를 들어, 아프타성 궤양 치료용), 또는 리포좀 또는 미세캡슐화 제제가 포함된다.

연고, 크림 및 겔은, 예를 들어 적합한 증점제 및/또는 겔화제 및/또는 용매를 첨가하여 수성 또는 유성 베이스와 함께 제제화될 수 있다. 이에 따라, 이러한 베이스의 비제한적 예에는, 예를 들어 물 및/또는 오일, 예컨대 액상 파라핀 또는 식물성 오일, 예컨대 아라키스 오일 또는 피마자 오일, 또는 용매, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜이 포함한다. 베이스의 특성에 따라서, 증점제 및 겔화제가 사용될 수 있다. 이러한 작용제의 비제한적 예에는 연질 파라핀, 스테아르산알루미늄, 세토스테아릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 양모지방, 밀랍, 카르복시폴리메틸렌 및 셀룰로스 유도체, 및/또는 글리세릴 모노스테아레이트 및/또는 비-이온성 유화제가 포함된다.

한 실시양태에서 로션은 수성 또는 유성 베이스와 함께 제제화될 수 있고, 또한 일반적으로 하나 이상의 유화제, 안정화제, 분산제, 현탁화제 또는 증점제를 함유할 것이다.

한 실시양태에서, 외부 적용을 위한 분말은 임의의 적합한 분말 베이스, 예를 들어 활석, 락토스 또는 전분의 보조에 의해 형성될 수 있다. 점적제는 하나 이상의 분산제, 가용화제, 현탁화제 또는 보존제를 또한 포함하는 수성 또는 비-수성 베이스와 함께 제제화될 수 있다.

경구용으로 의도된 조성물은 제약 조성물의 제조에 대해 당업계에 공지된 모든 방법에 따라서 제조할 수 있고, 이러한 조성물은 하나 이상의 감미제, 향미제, 착색제 또는 보존제를 함유하여 제약상 우아하고 맞 우수한 제제를 제공할 수 있다. 정제는 정제의 제조에 적합한 무독성의 제약상 허용되는 부형제와 혼합된 활성 성분을 함유한다. 이러한 부형제는, 예를 들어 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 코팅되지 않을 수 있거나, 또는 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 몇몇 경우에, 이러한 코팅은 공지된 기술에 의해 제조되어, 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시킴으로써 보다 장시간에 걸쳐 지속적으로 작용하도록 해줄 수 있다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예를 들어 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 사용할 수 있다.

경구용 제제는 또한, 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합된 경질 젤라틴 캡슐로서, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들어 땅콩 오일, 액상 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐로서 제공될 수 있다.

수성 현탁액은 활성 물질을, 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와의 혼합물로 함유한다. 이러한 부형제에는 현탁화제, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드로프로필-메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검; 분산제 또는 습윤제 (천연-발생 포스파티드일 수 있음), 예를 들어 레시틴, 또는 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물, 예를 들어 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트가 있다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어 에틸, 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제, 및 하나 이상의 감미제, 예를 들어 수크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.

유성 현탁액은 식물성 오일, 예를 들어 아라키스 오일, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일 중에, 또는 미네랄 오일, 예컨대 액상 파라핀 중에 활성 성분을 현탁시킴으로써 제제화될 수 있다. 유성 현탁액은 증점제, 예를 들어 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 감미제 및 향미제를 첨가하여 입에 맞는 경구 제제를 제공할 수 있다. 이들 조성물은 항산화제 (예컨대, 아스코르브산)을 첨가함으로써 보존시킬 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 또한 수중유 에멀젼 형태일 수 있다. 유성 상은 식물성 오일 또는 미네랄 오일, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 천연-발생 검, 예를 들어 아카시아 검 또는 트라가칸트 검, 천연-발생 포스파티드, 예를 들어 대두, 레시틴, 및 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르, 예를 들어 소르비탄 모노올레에이트, 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥시드의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 에멀젼은 또한 감미제 및 향미제를 함유할 수 있다.

시럽 및 엘릭시르는 감미제, 예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 글루코스 또는 수크로스와 함께 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 또한 완화제, 보존제, 향미제 및 착색제를 함유할 수 있다. 제약 조성물은 주사가능한 수성 또는 유성 멸균 현탁액의 형태일 수 있다. 상기 현탁액은 상기 언급된 이들 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 이용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 주사가능한 멸균 제제는 또한 무독성의 비경구로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 주사가능한 멸균 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정유가 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위하여, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 비롯한 임의의 순한 고정유를 사용할 수 있다. 또한, 지방산, 예컨대 올레산은 주사제의 제조에서의 용도를 갖는다.

본 발명의 핵산은 또한, 예를 들어 약물을 직장 투여하기 위하여 좌제 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 상온에서는 고체지만 직장 온도에서는 액체이므로 직장에서 용융되어 약물을 방출시켜 주는 적합한 비-자극성 부형제를 약물과 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다.

본 발명의 핵산은 멸균 매질 중에서 비경구적으로 투여될 수 있다. 사용된 비히클 및 농도에 따라 약물을 상기 비히클에 현탁 또는 분산시킬 수 있다. 유리하게는, 보조제, 예컨대 국소 마취제, 보존제 및 완충제를 상기 비히클에 용해시킬 수 있다.

다른 실시양태에서, 폐 전달에 사용하기 위한 본원에 제공된 siNA 및 LNP 조성물 및 제제는 하나 이상의 계면활성제를 추가로 포함한다. 본 발명의 조성물의 흡수를 개선시키기에 적합한 계면활성제 또는 계면활성제 성분에는 특히 합성 및 천연, 뿐만 아니라 완전한 및 말단절단 형태의 계면활성제 단백질 A, 계면활성제 단백질 B, 계면활성제 단백질 C, 계면활성제 단백질 D 및 계면활성제 단백질 E, 디-포화 포스파티딜콜린 (디팔미토일 제외), 디팔미토일포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린; 포스파티드산, 유비퀴논, 리소포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜콜린, 팔미토일-리소포스파티딜콜린, 데히드로에피안드로스테론, 돌리콜, 술파티드산, 글리세롤-3-포스페이트, 디히드록시아세톤 포스페이트, 글리세롤, 글리세로-3-포스포콜린, 디히드록시아세톤, 팔미테이트, 시티딘 디포스페이트 (CDP) 디아실글리세롤, CDP 콜린, 콜린, 콜린 포스페이트; 뿐만 아니라 계면활성제의 성분에 대한 천연 담체 비히클인 천연 및 인공 박막층체, 오메가-3 지방산, 폴리엔산, 폴리에노산, 레시틴, 팔미틴산, 에틸렌 또는 프로필렌 옥시드의 비-이온성 블록 공중합체, 폴리옥시프로필렌, 단량체성 및 중합체성 폴리옥시에틸렌, 덱스트란 및/또는 알카노일 측쇄를 갖는 단량체성 및 중합체성 폴리 (비닐 아민), Brij 35, 트리톤(Triton) X-100 및 합성 계면활성제 ALEC, 엑소술프(Exosurf), 설반(Survan) 및 아토바쿠온(Atovaquone)이 포함된다. 이러한 계면활성제는 제제 중에 단독으로 또는 다중 성분 계면활성제의 일부으로서, 또는 본원의 제약 조성물의 핵산 성분의 5' 및/또는 3' 말단에 공유결합된 부가물로서 사용될 수 있다.

b. 조합물

본 발명에 따른 화합물 및 제약 제제는 대상체에게 단독으로 투여될 수 있거나, 예를 들어 항염증제, 항콜린제 (특히 M₁/M₂/M₃ 수용체 길항제), β₂-아드레날린성 수용체 효능제, 항감염제, 예컨대 항생제, 항바이러스 또는 항히스타민제로부터 선택된 하나 이상의 다른 치료제와 조합되어 사용될 수 있거나, 또는 이를 포함할 수 있다. 따라서, 추가 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 siNA 분자, 예를 들어 비제한적으로, 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 siNA 분자, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학상 기능적 유도체를, 예를 들어 항염증제, 예컨대 코르티코스테로이드 또는 NSAID, 항콜린제, β₂-아드레날린성 수용체 효능제, 항감염제, 예컨대 항생제 또는 항바이러스제 또는, 항히스타민제로부터 선택된 하나 이상의 다른 치료 활성제와 함께 포함하는 조합물을 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태는 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 본 발명의 siNA 분자, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학상 기능적 유도체를 β₂-아드레날린성 수용체 효능제 및/또는 항콜린제 및/또는 ICAM-1 억제제 및/또는 항히스타민제와 함께 포함하는 조합물을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 siNA 분자를 β₂-아드레날린성 수용체 효능제와 함께 포함하는 조합물을 포함한다. β₂-아드레날린성 수용체 효능제의 비제한적 예에는 살메테롤 (라세미체 또는 단일 거울상이성질체, 예컨대 R-거울상이성질체일 수 있음), 살부타몰 (라세미체 또는 단일 거울상이성질체, 예컨대 R-거울상이성질체일 수 있음), 포르모테롤 (라세미체 또는 단일 부분입체이성질체, 예컨대 R,R-부분입체이성질체일 수 있음), 살메파몰, 페노테롤, 카르모테롤, 에탄테롤, 나민테롤, 클렌부테롤, 피르부테롤, 플레르부테롤, 레프로테롤, 밤부테롤, 인다카테롤, 테르부탈린 및 그의 염, 예를 들어 살메테롤의 크시나포에이트 (1-히드록시-2-나프탈렌카르복실레이트) 염, 살부타몰의 술페이트 염 또는 유리 염기, 또는 포르모테롤의 푸마레이트 염이 포함된다. 한 실시양태에서 β₂-아드레날린성 수용체 효능제는 지속형 β₂-아드레날린성 수용체 효능제, 예를 들어 약 12시간 이상 동안의 효과적인 기관지확장을 제공하는 화합물이다.

다른 β₂-아드레날린성 수용체 효능제에는 WO 02/066422, WO 02/070490, WO 02/076933, WO 03/024439, WO 03/072539, WO 03/091204, WO 04/016578, WO 2004/022547, WO 2004/037807, WO 2004/037773, WO 2004/037768, WO 2004/039762, WO 2004/039766, WO01/42193 및 WO03/042160에 기재된 것들이 포함된다.

β₂-아드레날린성 수용체 효능제의 추가의 예에는 3-(4-{[6-({(2R)-2-히드록시-2-[4-히드록시-3-(히드록시메틸)페닐]에틸}아미노)헥실]옥시}부틸)벤젠술폰아미드; 3-(3-{[7-({(2R)-2-히드록시-2-[4-히드록시-3-히드록시메틸)페닐]에틸}-아미노)헵틸]옥시}프로필)벤젠술폰아미드; 4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2,6-디클로로벤질)옥시]에톡시}헥실)아미노]-1-히드록시에틸}-2-(히드록시메틸)페놀; 4-{(1R)-2-[(6-{4-[3-(시클로펜틸술포닐)페닐]부톡시}헥실)아미노]-1-히드록시에틸}-2-(히드록시메틸)페놀; N-[2-히드록실-5-[(1R)-1-히드록시-2-[[2-4-[[(2R)-2-히드록시-2-페닐에틸]아미노]페닐]에틸]아미노]에틸]페닐]포름아미드; N-2{2-[4-(3-페닐-4-메톡시페닐)아미노페닐]에틸}-2-히드록시-2-(8-히드록시-2(1H)-퀴놀리논-5-일)에틸아민; 및 5-[(R)-2-(2-{4-[4-(2-아미노-2-메틸-프로폭시)-페닐아미노]-페닐}-에틸아미노)-1-히드록시-에틸]-8-히드록시-1H-퀴놀린-2-온이 포함된다.

한 실시양태에서, β₂-아드레날린성 수용체 효능제는 황산, 염산, 푸마르산, 히드록시나프토산 (예를 들어 1- 또는 3-히드록시-2-나프토산), 신남산, 치환된 신남산, 트리페닐아세트산, 술팜산, 나프탈렌아크릴산, 벤조산, 4-메톡시벤조산, 2- 또는 4-히드록시벤조산, 4-클로로벤조산 및 4-페닐벤조산으로부터 선택된 제약상 허용되는 산과 함께 형성된 염의 형태일 수 있다.

적절한 항염증제에는 또한 코르티코스테로이드가 포함된다. 본 발명의 화합물과 조합되어 사용될 수 있는 코르티코스테로이드의 예에는 항염증 활성을 갖는 경구 및 흡입용 코르티코스테로이드 및 그의 전구약물이 있다. 비제한적인 예에는 메틸 프레드니솔론, 프레드니솔론, 덱사메타손, 플루티카손 프로피오네이트, 6α,9α-디플루오로-11β-히드록시-16α-메틸-17α-[(4-메틸-1,3-티아졸-5-카르보닐)옥시]-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르, 6α,9α-디플루오로-17α-[(2-푸라닐카르보닐)옥시]-11β-히드록시-16α-메틸-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르 (플루티카손 푸로에이트), 6α,9α-디플루오로-11β-히드록시-16α-메틸-3-옥소-17α-프로피오닐옥시-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-(2-옥소-테트라히드로-푸란-3S-일)에스테르, 6α,9α-디플루오로-11β-히드록시-16α-메틸-3-옥소-17α-(2,2,3,3-테트라메틸시클로프로필-카르보닐)옥시-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-시아노메틸 에스테르 및 6α,9α-디플루오로-11β-히드록시-16α-메틸-17α-(1-메틸시클로프로필카르보닐)옥시-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르, 베클로메타손 에스테르 (예를 들어, 17-프로피오네이트 에스테르 또는 17,21-디프로피오네이트 에스테르), 부데소니드, 플루니솔리드, 모메타손 에스테르 (예를 들어, 모메타손 푸로에이트), 트리암시놀론 아세토니드, 로플레포니드, 시클레소니드 (16α,17-[[(R)-시클로헥실메틸렌]비스(옥시)]-11β,21-디히드록시-프레그나-1,4-디엔-3,20-디온), 부틱소코르트 프로피오네이트, RPR-106541, 및 ST-126이 포함된다. 한 실시양태에서, 코르티코스테로이드에는 플루티카손 프로피오네이트, 6α,9α-디플루오로-11β-히드록시-16α-메틸-17α-[(4-메틸-1,3-티아졸-5-카르보닐)옥시]-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르, 6α,9α-디플루오로-17α-[(2-푸라닐카르보닐)옥시]-11β-히드록시-16α-메틸-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르, 6α,9α-디플루오로-11β-히드록시-16α-메틸-3-옥소-17α-(2,2,3,3-테트라메틸시클로프로필카르보닐)옥시-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-시아노메틸 에스테르 및 6α,9α-디플루오로-11β-히드록시-16α-메틸-17α-(1-메틸시클로-프로필카르보닐)옥시-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르가 포함된다. 한 실시양태에서, 코르티코스테로이드는 6α,9α-디플루오로-17α-[(2-푸라닐카르보닐)옥시]-11β-히드록시-16α-메틸-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르이다. 코르티코스테로이드의 비제한적 예에는 다음의 공개 특허 출원 및 특허: WO02/088167, WO02/100879, WO02/12265, WO02/12266, WO05/005451, WO05/005452, WO06/072599 및 WO06/072600에 기재된 것들이 포함된다.

한 실시양태는, 본 발명의 siNA 분자, 및 전사활성화(transactivation)에 비하여 전사억제(transrepression)에 대한 선택성을 가질 수 있는 글루코코르티코이드 효능작용을 갖는 비-스테로이드성 화합물, 예컨대 다음의 공개 특허 출원 및 특허: WO03/082827, WO98/54159, WO04/005229, WO04/009017, WO04/018429, WO03/104195, WO03/082787, WO03/082280, WO03/059899, WO03/101932, WO02/02565, WO01/16128, WO00/66590, WO03/086294, WO04/026248, WO03/061651, WO03/08277, WO06/000401, WO06/000398 및 WO06/015870에 개시된 비-스테로이드성 화합물을 포함하는 조합물이다.

본 발명의 siNA 분자와 조합하여 사용할 수 있는 다른 항염증제의 비제한적 예에는 비-스테로이드성 항-염증성 약물 (NSAID)이 포함된다.

NSAID의 비제한적 예에는 나트륨 크로모글리케이트, 네도크로밀 나트륨, 포스포디에스테라제 (PDE) 억제제 (예를 들어, 테오필린, PDE4 억제제 또는 혼합 PDE3/PDE4 억제제), 류코트리엔 길항제, 류코트리엔 합성 억제제 (예를 들어, 몬테루카스트), iNOS 억제제, 트립타제 및 엘라스타제 억제제, 베타-2 인테그린 길항제 및 아데노신 수용체 효능제 또는 길항제 (예를 들어, 아데노신 2a 효능제), 시토카인 길항제 (예를 들어, CCR3 길항제와 같은 케모카인 길항제) 또는 시토카인 합성 억제제, 또는 5-리폭시게나제 억제제가 포함된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 경구 투여용 iNOS (유도가능한 산화질소 신타제) 억제제를 포함한다. iNOS 억제제의 예에는 다음의 공개 국제 특허 및 특허 출원: WO93/13055, WO98/30537, WO02/50021, WO95/34534 및 WO99/62875에 개시되어 있는 것들이 포함된다. CCR3 억제제의 예에는 WO02/26722에 개시되어 있는 것들이 포함된다.

화합물에는 시스-4-시아노-4-(3-시클로펜틸옥시-4-메톡시페닐)시클로헥산-1-카르복실산, 2-카르보메톡시-4-시아노-4-(3-시클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)시클로헥산-1-온 및 시스-[4-시아노-4-(3-시클로프로필메톡시-4-디플루오로메톡시-페닐)시클로헥산-1-올]이 포함된다. 또한, 미국 특허 5,552,438에서 기재되어 있는 시스-4-시아노-4-[3-(시클로펜틸옥시)-4-메톡시페닐]시클로-헥산-1-카르복실산 (또한 실로밀라스트로 공지되어 있음), 및 그의 염, 에스테르, 전구약물 또는 물리적 형태.

다른 화합물에는 엘비온(Elbion)의 AWD-12-281 (문헌 [Hofgen, N. et al. 15th EFMC Int Symp Med Chem (Sept 6-10, Edinburgh) 1998, Abst P.98], CAS 참조 번호 247584020-9), NCS-613 (인세름(INSERM))이라 지칭되는 9-벤질아데닌 유도체, 키로사이언스(Chiroscience) 및 쉐링-플라우(Schering-Plough)의 D-4418, CI-1018 (PD-168787)로 확인되는 화이자(Pfizer)의 벤조디아제핀 PDE4 억제제, 교와 하꼬(Kyowa Hakko)에 의한 WO99/16766에 개시되어 있는 벤조디옥솔 유도체, 교와 하꼬의 K-34, 나프(Napp)의 V-11294A (문헌 [Landells, L.J. et al. Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc (Sept 19-23, Geneva) 1998] 1998, 12 (Suppl. 28): Abst P2393]), 로플루밀라스트 (CAS 참조 번호 162401-32-3) 및 프탈라지논 (WO99/47505, 상기 문헌의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨) (빅-굴덴(Byk-Gulden)), 빅-굴덴 (현재, 알타나(Altana))가 제조하고 공개한 혼합 PDE3/PDE4 억제제인 푸마펜트린 ((-)-p-[(4aR^*,10bS^*)-9-에톡시-1,2,3,4,4a,10b-헥사히드로-8-메톡시-2-메틸벤조[c][1,6]나프티리딘-6-일]-N,N-디이소프로필-벤즈아미드), 알미랄-프로데스파마(Almirall-Prodesfarma)에서 개발 중인 아로필린, 베르날리스(Vernalis)의 VM554/UM565, 또는 T-440 (다나베 세이야꾸(Tanabe Seiyaku), 문헌 [Fuji, K. et al. J Pharmacol Exp Ther, 1998, 284(1): 162]), 및 T2585가 포함된다. 추가의 화합물은 국제 특허 출원 공개 WO04/024728 (글락소 그룹 리미티드(Glaxo Group Ltd.)), WO04/056823 (글락소 그룹 리미티드) 및 WO04/103998 (글락소 그룹 리미티드)에 개시되어 있다.

본 발명의 화합물 조합하여 사용할 수 있는 낭성 섬유증 작용제의 예에는 토비(Tobi)^® 및 풀모자임(Pulmozyme)^®과 같은 화합물이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 화합물과 조합하여 사용할 수 있는 항콜린제의 예에는 무스카린성 수용체에서 길항제로서 작용하는 화합물, 특히 M1 또는 M3 수용체의 길항제, M1/M3 또는 M2/M3 수용체의 이중 길항제, 또는 M1/M2/M3 수용체의 범(pan)-길항제인 화합물이 있다. 흡입을 통한 투여를 위한 예시적인 화합물에는 이프라트로퓸 (예를 들어, 브로마이드, CAS 22254-24-6, 아트로벤트(Atrovent)라는 명칭으로 시판), 옥시트로퓸 (예를 들어, 브로마이드, CAS 30286-75-0) 및 티오트로퓸 (예를 들어, 브로마이드, CAS 136310-93-5, 스피리바(Spiriva)라는 명칭으로 시판)이 포함된다. 또한, 관심의 대상이 되는 것은 레바트로페이트 (예를 들어, 히드로브로마이드, CAS 262586-79-8) 및 LAS-34273 (WO01/04118에 개시됨)이다. 경구 투여용의 예시적인 화합물에는 피렌제핀 (CAS 28797-61-7), 다리페나신 (CAS 133099-04-4 또는 CAS 133099-07-7 (에나블렉스(Enablex)라는 명칭으로 시판되는 히드로브로마이드)), 옥시부티닌 (CAS 5633-20-5, 디트로판(Ditropan)이라는 명칭으로 시판), 테로딜린 (CAS 15793-40-5), 톨테로딘 (CAS 124937-51-5 또는 CAS 124937-52-6 (데트롤(Detrol)이라는 명칭으로 시판되는 타르트레이트)), 오틸로늄 (예를 들어, 브로마이드로서의 CAS 26095-59-0, 스파스모멘(Spasmomen)이라는 명칭으로 시판), 트로스퓸 클로라이드 (CAS 10405-02-4) 및 솔리페나신 (CAS 242478-37-1 또는 CAS 242478-38-2 (YM-905라고도 공지되어 있고 베시카레(Vesicare)라는 명칭으로 시판되는 숙시네이트))가 포함된다.

다른 항콜린제에는 미국 특허 출원 60/487981에 개시되어 있는 하기 화학식 XXI의 화합물이 포함된다.

<화학식 XXI>

상기 식에서, 트로판 고리에 부착된 알킬 쇄의 바람직한 배향은 엔도이고, R³¹ 및 R³²는 독립적으로, 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 저급 알킬 기, 5 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 시클로알킬 기, 6개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 시클로알킬-알킬, 2-티에닐, 2-피리딜, 페닐, 4개 이하의 탄소 원자를 갖는 알킬기로 치환된 페닐, 및 4개 이하의 탄소 원자를 갖는 알콕시기로 치환된 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고; X^-는 N 원자의 양전하와 결합된 음이온을 나타낸다. X^-는 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 술페이트, 벤젠 술포네이트 및 톨루엔 술포네이트 (이에 제한되지는 않음)일 수 있다. 화학식 XXI의 예에는 (3-엔도)-3-(2,2-디-2-티에닐에테닐)-8,8-디메틸-8-아조니아비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드, (3-엔도)-3-(2,2-디페닐에테닐)-8,8-디메틸-8-아조니아비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드, (3-엔도)-3-(2,2-디페닐에테닐)-8,8-디메틸-8-아조니아비시클로[3.2.1]옥탄 4-메틸벤젠-술포네이트, (3-엔도)-8,8-디메틸-3-[2-페닐-2-(2-티에닐)에테닐]-8-아조니아비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드 및/또는 (3-엔도)-8,8-디메틸-3-[2-페닐-2-(2-피리디닐)에테닐]-8-아조니아비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

추가의 항콜린제에는 미국 특허 출원 60/511009에 개시되어 있는 하기 화학식 XXII 또는 XXIII의 화합물이 포함 된다.

<화학식 XXII>

<화학식 XXIII>

상기 식에서, 표시된 H 원자는 엑소 위치에 있고, R⁴¹은 N 원자의 양전하와 결합된 음이온을 나타낸다. R⁴¹은 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 술페이트, 벤젠 술포네이트 및 톨루엔 술포네이트일 수 있지만 이에 제한되지 않고, R⁴² 및 R⁴³은 독립적으로 직쇄 또는 분지쇄 저급 알킬기 (바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 가짐), 시클로알킬기 (5 내지 6개의 탄소 원자를 가짐), 시클로알킬-알킬 (6 내지 10개의 탄소 원자를 가짐), 헤테로시클로알킬 (5 내지 6개의 탄소 원자 및 헤테로원자로서의 N 또는 O를 가짐), 헤테로시클로알킬-알킬 (6개 내지 10개의 탄소 원자 및 헤테로원자로서의 N 또는 O를 가짐), 아릴, 임의로 치환된 아릴, 헤테로아릴, 및 임의로 치환된 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, R⁴⁴는 (C₁-C₆)알킬, (C₃-C₁₂)시클로알킬, (C₃-C₇)헤테로시클로알킬, (C₁-C₆)알킬(C₃-C₁₂)시클로알킬, (C₁-C₆)알킬(C₃-C₇)헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, (C₁-C₆)알킬-아릴, (C₁-C₆)알킬-헤테로아릴, -OR⁴⁵, -CH₂OR⁴⁵, -CH₂OH, -CN, -CF₃, -CH₂O(CO)R⁴⁶, -CO₂R⁴⁷, -CH₂NH₂, -CH₂N(R⁴⁷)SO₂R⁴⁵, -SO₂N(R⁴⁷)(R⁴⁸), -CON(R⁴⁷)(R⁴⁸), -CH₂N(R⁴⁸)CO(R⁴⁶), -CH₂N(R⁴⁸)SO₂(R⁴⁶), -CH₂N(R⁴⁸)CO₂(R⁴⁵), -CH₂N(R⁴⁸)CONH(R⁴⁷)로 이루어진 군으로부터 선택되고, R⁴⁵는 (C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)알킬(C₃-C₁₂)시클로알킬, (C₁-C₆)알킬(C₃-C₇)헤테로시클로알킬, (C₁-C₆)알킬-아릴, (C₁-C₆)알킬-헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, R⁴⁶은 (C₁-C₆)알킬, (C₃-C₁₂)시클로알킬, (C₃-C₇)헤테로시클로알킬, (C₁-C₆)알킬(C₃-C₁₂)시클로알킬, (C₁-C₆)알킬(C₃-C₇)헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, (C₁-C₆)알킬-아릴, (C₁-C₆)알킬-헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, R⁴⁷ 및 R⁴⁸은 독립적으로 H, (C₁-C₆)알킬, (C₃-C₁₂)시클로알킬, (C₃-C₇)헤테로시클로알킬, (C₁-C₆)알킬(C₃-C₁₂)시클로알킬, (C₁-C₆)알킬(C₃-C₇)헤테로시클로알킬, (C₁-C₆)알킬-아릴 및 (C₁-C₆)알킬-헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 대표적인 예에는 (엔도)-3-(2-메톡시-2,2-디-티오펜-2-일-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드, 3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로피오니트릴, (엔도)-8-메틸-3-(2,2,2-트리페닐-에틸)-8-아자-비시클로[3.2.1]옥탄, 3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐프로피온아미드, 3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로피온산, (엔도)-3-(2-시아노-2,2-디페닐-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드, (엔도)-3-(2-시아노-2,2-디페닐 1-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드, 3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로판-1-올, N-벤질-3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로피온아미드, (엔도)-3-(2-카르바모일-2,2-디페닐-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드, 1-벤질-3-[3-((엔도)-8-메틸-8-아자비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-우레아, 1-에틸-3-[3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-우레아, N-[3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-아세트아미드, N-[3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-벤즈아미드, 3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디-티오펜-2-일-프로피오니트릴, (엔도)-3-(2-시아노-2,2-디-티오펜-2-일-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄요오다이드, N-[3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-벤젠술폰아미드, [3-((엔도)-8-메틸-8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-우레아, N-[3-((엔도)-8-메틸 8-아자-비시클로[3.2.1]옥트-3-일)-2,2-디페닐-프로필]-메탄술폰아미드 및/또는 (엔도)-3-{2,2-디페닐-3-[(1-페닐-메타노일)-아미노]-프로필}-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

추가의 화합물에는 (엔도)-3-(2-메톡시-2,2-디-티오펜-2-일-에틸)-8,8-디-메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드, (엔도)-3-(2-시아노-2,2-디페닐-에틸)-8,8-디-메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드, (엔도)-3-(2-시아노-2,2-디페닐-에틸)-8,8-디-메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드, (엔도)-3-(2-카르바모일-2,2-디페닐-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드, (엔도)-3-(2-시아노-2,2-디-티오펜-2-일-에틸)-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 요오다이드 및/또는 (엔도)-3-{2,2-디페닐-3-[(1-페닐-메타노일)-아미노]-프로필}-8,8-디메틸-8-아조니아-비시클로[3.2.1]옥탄 브로마이드가 포함된다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 본 발명의 siNA분자 또는 그의 제약상 허용되는 염을, H1 길항제와 함께 포함하는 조합물을 제공한다. H1 길항제의 예에는 비제한적으로 아멜렉사녹스, 아스테미졸, 아자타딘, 아젤라스틴, 아크리바스틴, 브롬페니라민, 세티리진, 레보세티리진, 에플레티리진, 클로르페니라민, 클레마스틴, 시클리진, 카레바스틴, 시프로헵타딘, 카르비녹사민, 데스카르보에톡시로라타딘, 독실아민, 디메틴덴, 에바스틴, 에피나스틴, 에플레티리진, 펙소페나딘, 히드록시진, 케토티펜, 로라타딘, 레보카바스틴, 미졸라스틴, 메퀴타진, 미안세린, 노베라스틴, 메클리진, 노라스테미졸, 올로파타딘, 피쿠마스트, 피릴아민, 프로메타진, 테르페나딘, 트리펠렌아민, 테멜라스틴, 트리메프라진 및 트리프롤리딘, 특히 세티리진, 레보세티리진, 에플레티리진 및 펙소페나딘이 포함된다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 본 발명의 siNA 분자 또는 그의 제약상 허용되는 염을, H3 길항제 (및/또는 역 효능제)와 함께 포함하는 조합물을 제공한다. H3 길항제의 예에는, 예를 들어 WO2004/035556 및 WO2006/045416에 개시되어 있는 화합물이 포함된다. 본 발명의 화합물과 조합하여 사용할 수 있는 다른 히스타민 수용체 길항제에는 H4 수용체의 길항제 (및/또는 역 효능제), 예를 들어 문헌 [Jablonowski et al., J. Med. Chem. 46:3957-3960 (2003)]에 개시되어 있는 화합물이 포함된다.

이에 따라, 본 발명은 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 본 발명의 siNA 분자, 및/또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학상 기능적 유도체를 ICAM-1 억제제와 함께 포함하는 조합물을 제공한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 또한 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 본 발명의 siNA 분자, 및/또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학상 기능적 유도체를 β₂-아드레날린성 수용체 효능제와 함께 포함하는 조합물을 제공한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 또한 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 본 발명의 siNA 분자, 및/또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학상 기능적 유도체를 코르티코스테로이드와 함께 포함하는 조합물을 제공한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 또한 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 본 발명의 siNA 분자, 및/또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학상 기능적 유도체를 항콜린제와 함께 포함하는 조합물을 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 본 발명의 siNA 분자, 및/또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학상 기능적 유도체를 항히스타민제와 함께 포함하는 조합물을 제공한다.

추가 측면에서, 본 발명은 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 본 발명의 siNA 분자, 및/또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학상 기능적 유도체를 ICAM-1 억제제 및 β2-아드레날린성 수용체 효능제와 함께 포함하는 조합물을 제공한다.

이에 따라, 추가 측면에서, 본 발명은 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 본 발명의 siNA 분자, 및/또는 그의 제약상 허용되는 염, 용매화물 또는 생리학상 기능적 유도체를 항콜린제 및 ICAM-1 억제제와 함께 포함하는 조합물을 제공한다.

상기 언급된 조합물은 편리하게는 제약 조성물의 형태로 사용하기 위해 제공될 수 있으며, 따라서 상기 정의된 조합물을 제약상 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 제약 조성물은 본 발명의 추가의 측면을 나타낸다.

상기 조합물의 개별 화합물은 별도로 또는 조합된 제약 제제로 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 개별 화합은 조합된 제약 제제로 동시에 투여될 것이다.

추가 실시양태에서, siNA 분자는 대상체 또는 유기체에서 호흡기 질환, 장애 또는 상태를 예방 또는 치료하기 위해 다른 공지된 치료와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 siNA 분자는 추가의 기도 수화 요법제, 예컨대 고장성 염수, 데누포솔, 브론키톨; CFTR 유전자 요법제; 단백질 보조제/복구제, 예컨대 CFTR 중화제, 예를 들어 VX-809 (버텍스(Vertex)), CFTR 강화제, 예를 들어 VX-770 (버텍스); 점액 치료제, 예컨대 풀모자임; 항-염증 치료제, 예컨대 경구 N-아세틸시스테인, 실데나필, 흡입용 글루타티온, 피오글리타존, 히드록시클로로퀸, 심바스타틴; 항-감염 요법제, 예컨대 아지트로마이신, 아리케이스(arikace); 이식 약물, 예컨대 흡입용 시클로스포린; 및 영양 보충제, 예컨대 아쿠아데크(aquADEK), 판크레리파제 생성물, 트리지텍와 함께 사용될 수 있다. 따라서, 기재된 분자는 당업계에 공지되어 있는 바와 같은, 대상체 또는 유기체에서의 본원에 기재된 질환, 장애, 상태 및 소질의 예방 또는 치료를 위한 하나 이상의 공지된 화합물, 치료 또는 절차 (예컨대, 다른 ICAM-1 억제제)와 조합되어 사용될 수 있다.

3. 치료 용도

ICAM-1 연구에서 현 지식의 실체는 치료 용도를 위한 ICAM-1 발현을 조절할 수 있는 방법에 대한 필요를 나타낸다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 ICAM-1의 작용에 의해 또는 작용의 소실에 의해 매개되는 상태로 고통받는 인간을 비롯한 이로 제한되지 않는 대상체에게 유효량의 본 발명의 이중-가닥 siNA 분자를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 이러한 측면의 한 실시양태에서, siNA 분자는 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함한다. 상기 측면의 또 다른 실시양태에서, 상기 상태는 호흡기 질환이거나 또는 그에 의해 기인한다. 본 발명의 이 측면에 따른 치료가능한 호흡기 질환에는 COPD, 천식, 호산구성 기침, 기관지염, 사르코이드증, 폐섬유증, 비염, 부비동염이 포함된다. 특정한 실시양태에서, COPD, 낭성 섬유증, 및 천식으로 이루어진 군으로부터 선택된 호흡기 질환의 치료를 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, siNA 분자는 국부 투여 또는 전신 투여를 통해 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 관련 조직 또는 세포에 국부 투여를 통해, 예컨대 폐 세포 및 조직에 예컨대 폐 전달을 통해 본 발명의 siNA 분자와 대상체 또는 유기체를 접촉시키는 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 관련 조직 또는 세포, 예컨대 대상체 또는 유기체에서 염증성 질환, 질병 또는 상태의 유지 또는 진행과 관련된 조직 또는 세포에 전신 투여를 통해 (예컨대 siNA의 정맥내 또는 피하 투여를 통해) 본 발명의 siNA 분자와 대상체 또는 유기체를 접촉시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 siNA 분자는 또한 생체외 적용에서 시약으로서 사용된다. 예를 들어, siNA 시약은 치료 효과를 위해서 대상체에게 이식되는 조직 또는 세포로 도입된다. 상기 세포 및/또는 조직은 이후에 체외이식편을 수용받을 유기체 또는 대상체로부터 유래된 것일 수 있거나, 또는 이식 전에 또 다른 유기체 또는 대상체로부터 유래된 것일 수 있다. siNA 분자는 세포 또는 조직이 원하는 표현형을 획득하거나 생체내 이식시 기능을 수행할 수 있도록 세포 또는 조직에서 하나 이상의 유전자의 발현을 조정하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 환자로부터의 특정 ICAM-1 표적 세포가 추출된다. 이들 추출된 세포를 세포 내에서 이들 세포에 의한 siNA의 흡수에 적합한 조건하에 특정 뉴클레오티드 서열을 표적으로 하는 ICAM-1 siNA와 접촉시킨다 (예를 들어, 전달 시약, 예컨대 양이온성 지질, 리포좀 등을 사용하거나, 전기천공과 같이 siNA를 세포로 전달하는 것을 용이하게 하는 기술을 이용함). 이후, 상기 세포를 동일한 환자 또는 다른 환자에게 다시 재도입한다.

치료 적용의 경우, 제약상 유효 용량의 본 발명의 siNA 분자 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여한다. 제약상 유효 용량은 질환 상태의 발생을 예방, 억제하거나, 또는 그를 치료하는데 (증상을 어느 정도까지, 바람직하게는 모든 증상을 경감시키는데) 요구되는 용량이다. 당업자는 대상체의 크기 및 체중, 질환 진행 또는 침투의 정도, 대상체의 연령, 건강 및 성별, 투여 경로, 및 국부 또는 전신 투여 여부와 같은 인자를 고려하여 주어진 대상체에게 투여될 본 발명의 siNA의 치료 유효 용량을 용이하게 결정할 수 있다. 일반적으로, 0.1 mg/kg(체중)/일 내지 100 mg/kg(체중)/일의 활성 성분의 양을 음으로 하전된 중합체의 효능에 따라 투여한다. 본 발명의 siNA 분자는 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.

G. 투여

조성물 또는 제제는 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 투여 방법의 비제한적인 예는 경구, 협측, 설하, 비경구 (즉, 관절내, 정맥내, 복강내, 피하 또는 근육내), 국부 직장 투여 또는 다른 국부 투여를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 취입 및 흡입에 의해 투여될 수 있다. 투여는 단일 용량 또는 나누어진 용량을 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 볼루스 주사에 의해 정맥내로 또는 복강내로 투여된다 (예를 들어 미국 특허 번호 5,286,634 참조). 지질 핵산 입자는 질환 부위에서의 직접 주사 또는 질환 부위로부터 멀리 떨어진 부위에서의 주사에 의해 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Culver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp. 70-71(1994)] 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제 또는 조성물은 본원에 기재되고 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 세포, 대상체 또는 유기체에 투여된다.

1. 생체내 투여

본 발명의 임의의 치료 방법에서, siNA는 단독요법으로서 단독으로 또는 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 추가의 요법과 조합하여 본원에 기재되거나 당업계에 달리 공지된 것과 같이 대상체에게 전신 투여될 수 있다. 전신 투여는 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 예를 들어 폐 (흡입, 연무화 등), 정맥내, 피하, 근육내, 카테터삽입, 비인두, 경피 또는 경구/위장 투여를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 임의의 치료 또는 예방 방법에서, siNA는 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 바와 같이 대상체에게 단일요법으로서 단독으로 또는 당업계에 공지된 바와 같은 추가의 요법과 조합하여 국부 투여되거나 국부 조직으로 투여될 수 있다. 국부 투여는 예를 들어 흡입, 연무화, 카테터삽입, 이식, 직접 주사, 피부/경피 적용, 패치, 스텐트설치, 점이제/점안제, 또는 관련 조직으로의 문맥 투여, 또는 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 임의의 다른 국부 투여 기술, 방법 또는 절차를 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물은 일반적으로 전신 글루코코르티코이드 수용체 효능제 요법이 지시되는 경우에 내부 투여에 의해 제공될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제 또는 조성물은 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 간으로 투여된다 (예를 들어, 문헌 [Wen et al., 2004, World J Gastroenterol., 10, 244-9]; [Murao et al., 2002, Pharm Res., 19, 1808-14]; [Liu et al., 2003, gene Ther., 10, 180-7]; [Hong et al., 2003, J Pharm Pharmacol., 54, 51-8]; [Herrmann et al., 2004, Arch Virol., 149, 1611-7]; 및 [Matsuno et al., 2003, gene Ther., 10, 1559-66] 참조).

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 siNA 분자를 단핵구 및 림프구를 비롯한 조혈 세포로 전달하는 방벙의 이용을 특징으로 한다. 이러한 방법은 문헌 [Hartmann et al., 1998, J. Phamacol. Exp. Ther., 285(2), 920-928]; [Kronenwett et al., 1998, Blood, 91(3), 852-862]; [Filion and Phillips, 1997, Biochim. Biophys. Acta., 1329(2), 345-356]; [Ma and Wei, 1996, Leuk. Res., 20(11/12), 925-930]; 및 [Bongartz et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22(22), 4681-8]에 상세하게 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제 또는 조성물은 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 진피 및 여포에 직접적으로 또는 국소적으로 (예를 들어, 국부적으로) 투여된다 (예를 들어, 문헌 [Brand, 2001, Curr. Opin. Mol. Ther., 3, 244-8]; [Regnier et al., 1998, J. Drug Target, 5, 275-89]; [Kanikkannan, 2002, BioDrugs, 16, 339-47]; [Wraight et al., 2001, Pharmacol. Ther., 90, 89-104]; 및 [Preat and Dujardin, 2001, STP PharmaSciences, 11, 57-68] 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제 또는 조성물은 알콜 (예를 들어, 에탄올 또는 이소프로판올), 물을 포함하고, 이소프로필 미리스테이트 및 카르보머 980과 같은 추가의 작용제를 임의로 포함하는 히드로알콜성 겔 제제를 사용하여 직접적으로 또는 국소적으로 투여된다. 다른 실시양태에서, siNA는 비강으로 국소적으로 투여되도록 제제화된다. 국소 제제는 발병 영역에 1일당 1회 이상의 적용에 의해 투여될 수 있고, 유리하게는 피부 영역 상에 밀봉 붕대를 사용할 수 있다. 연속적 또는 장기간 전달은 점착성 저장소 시스템에 의해 이루어질 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는, 예를 들어 특정 기관 또는 구획 (예를 들어, 눈, 눈 뒷부분, 심장, 간, 신장, 방광, 전립선, 종양, CNS 등)에 이온영동적으로 투여된다. 이온영동 전달의 비-제한적인 예가, 예를 들어 WO 03/043689 및 WO 03/030989 (그의 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제 또는 조성물은 본원에 기재되고 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 폐로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제 또는 조성물은 미국 특허 공보 번호 2006/0062758; 2006/0014289; 및 2004/0077540에 기재된 바와 같이 폐 조직 및 세포로 투여된다.

2. 에어로졸 및 전달 장치

a. 에어로졸 제제

본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 조합되어 흡입 (예를 들어, 비강내 또는 기관내)에 의해 투여되는 에어로졸 제제 (즉, 이들은 "연무화"될 수 있음)로 제조될 수 있다 (문헌 [Brigham et al., Am. J. Sci., 298:278 (1989)] 참조). 에어로졸 제제는 가압식의 허용가능한 추진제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등 내에 위치할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자 및 그의 제제는 흡입 장치 또는 연무기에 의해 투여되는 에어로졸 또는 분무 건조된 제제의 흡입과 같은 폐 전달을 통해 투여되어, 관련 폐 조직으로의 핵산 분자의 신속한 국부 흡수를 제공한다. 미분화된 핵산 조성물의 호흡가능한 건조 입자를 함유하는 고체 미립자 조성물은, 건조되거나 동결건조된 핵산 조성물을 분쇄한 후에 미분화된 조성물을 예를 들어 400 메쉬 스크린을 통해 통과시켜 큰 덩어리를 파쇄하거나 분리해내어 제조할 수 있다. 본 발명의 siNA 조성물을 포함하는 고체 미립자 조성물은, 에어로졸 뿐만 아니라 다른 치료 화합물의 형성을 용이하게 하는 역할을 하는 분산제를 임의로 함유할 수 있다. 적합한 분산제는 락토스이고, 이는 1:1 중량비와 같은 임의의 적당한 비율로 핵산 화합물과 블렌딩될 수 있다.

본 발명의 siNA 분자 또는 조성물을 포함하는 분무 조성물은 예를 들어 수용액 또는 현탁액으로서, 또는 가압식 팩, 예컨대 계량 흡입기로부터 적합한 액화 추진제의 사용에 의해 전달되는 에어로졸로서 제제화될 수 있다. 한 실시양태에서, 흡입에 적합한 본 발명의 에어로졸 조성물은 현탁액 또는 용액일 수 있고, 일반적으로 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 siNA 분자, 및 적합한 추진제, 예컨대 플루오로카본 또는 수소-함유 클로로플루오로카본 또는 이들의 혼합물, 특히 히드로플루오로알칸, 특히 1,1,1,2-테트라플루오로에탄, 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로-n-프로판 또는 이들의 혼합물을 함유한다. 에어로졸 조성물은 당업계에 널리 공지된 추가의 제제 부형제, 예컨대 계면활성제를 임의로 함유할 수 있다. 비-제한적인 예는 올레산, 레시틴 또는 올리고락트산 또는 유도체, 예컨대 WO94/21229 및 WO98/34596에 기재된 것들 및 공용매, 예를 들어 에탄올을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 에어로졸 제제는 본 발명의 화합물 및 추진제로서의 플루오로카본 또는 수소-함유 클로로플루오로카본 또는 이들의 혼합물을 임의로는 계면활성제 및/또는 공용매와 조합하여 포함한다.

본 발명의 에어로졸 제제는 적합한 완충제의 첨가에 의해 완충시킬 수 있다.

에어로졸 제제는, 제제가 멸균 제조되지 않은 경우 보존제를 비롯한 임의의 첨가제를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예에는 메틸 히드록시벤조에이트, 항산화제, 향미제, 휘발성 오일, 완충제 및 유화제, 및 다른 제제 계면활성제가 포함된다. 한 실시양태에서, 플루오로카본 또는 퍼플루오로카본 담체는 분해를 감소시키는데 사용되며, 보다 안전한 본 발명의 생체적합성 비-액체 미립자 현탁액 조성물 (예를 들어, siNA 및/또는 그의 LNP 제제)을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 연무기를 포함하는 장치는 플루오로화학물질을 포함하는 본 발명의 조성물 (예를 들어, siNA 및/또는 그의 LNP 제제)을 전달하며, 이로써 적합성 장치에서의 미생물 성장의 잠재성을 정균적으로 감소시킨다.

예를 들어 젤라틴의 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 본 발명의 조성물을 포함하는 캡슐 및 카트리지는 본 발명의 화합물 및 적절한 분말 베이스, 예컨대 락토스 또는 전분의 흡입을 위한 분말 믹스를 함유하도록 제제화될 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 캡슐 또는 카트리지는 서열 2, 서열 143, 서열 4, 서열 144, 서열 5, 서열 145, 서열 6, 서열 146, 서열 7, 서열 147, 서열 37, 서열 148, 서열 11, 서열 149, 서열 38 또는 서열 150 중 15개의 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는 서열 45 및 서열 46, 또는 서열 49 및 서열 50, 또는 서열 51 및 서열 52, 또는 서열 53 및 서열 54, 또는 서열 55 및 서열 56, 또는 서열 115 및 서열 116, 또는 서열 63 및 서열 64, 또는 서열 117 및 서열 118, 또는 화학식 A를 포함하는 siNA 분자, 및 하나 이상의 부형제를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 부형제, 예컨대 락토스 없이 제공될 수 있다.

본 발명의 에어로졸 조성물은 호흡가능한 크기의 입자 (예컨대, 흡입시 코, 입 및 후두를 통과하고 폐의 기관지 및 폐포를 통과하기에 충분히 작은 크기의 입자)를 포함하는 제제로서 호흡기계로 투여될 수 있다. 일반적으로, 호흡가능한 입자는 크기가 약 0.5 내지 10 마이크로미터의 범위이다. 한 실시양태에서, 상기 미립자 범위는 1 내지 5 마이크로미터일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 미립자 범위는 2 내지 3 마이크로미터일 수 있다. 에어로졸 중에 포함되는 호흡불가능한 크기의 입자는 인후에 침착되어 삼켜지는 경향이 있으므로, 에어로졸 중의 호흡불가능한 입자의 양을 최소화시킨다. 비강 투여의 경우, 비강에서 유지되도록 10 내지 500 um 범위의 입자 크기가 바람직하다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 siNA 조성물은 예를 들어 비염 치료를 위해서 가압식 펌프에 의해 또는 연무화에 의해 코에 투여되는 가압식 에어로졸 제제, 수성 제제를 통해 코에 국소 투여된다. 적합한 제제는 이러한 목적을 위한 희석제 또는 담체로서 물을 함유한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물을 폐 또는 코에 투여하기 위한 수성 제제는 통상적인 부형제, 예컨대 완충제, 장성 개질제 등과 함께 제공될 수 있다.

b. 장치

본 발명의 siNA 분자는 상기 논의된 바와 같이 입자 및/또는 에어로졸로서 제제화 및 전달되고, 당업자에게 공지된 다양한 에어로졸화 장치로부터 분배된다.

본 발명의 siNA 분자 또는 제제를 포함하는 액체 또는 비-액체 입자의 에어로졸은 임의의 적합한 수단, 예컨대 연무기를 포함하는 장치 (예를 들어, US 4,501,729 참조), 예컨대 초음파 또는 공기 제트 연무기에 의해 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자의 투여를 위한 연무기는 고 에너지 초음파 생성용 압전 세라믹 발진기를 구동하는 발진 신호에 의존하며, 이는 본 발명의 조성물 (예를 들어, siNA 및/또는 그의 LNP 제제)을 기계적으로 교반하여 의약 에어로졸 혼탁물을 생성한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,129,619 B2 및 7,131,439 B2 참조). 또 다른 실시양태에서, 연무기는 압축 공기와 본 발명의 조성물 (예를 들어, siNA 및/또는 그의 LNP 제제)의 공기 제트 혼합에 의존하여 에어로졸 혼탁물 중의 액적을 형성한다.

본 발명의 siNA 분자 또는 제제에 사용되는 연무기 장치는 본 발명의 siNA 분자를 포함하는 담체, 전형적으로 물, 또는 묽은 수성 또는 비-수성 용액을 사용할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태는 본 발명의 siNA 분자 또는 제제를 포함하는 알콜성 용액, 바람직하게는 예를 들어 염화나트륨 또는 다른 적합한 염을 첨가하여 체액과 등장성으로 만들어진 알콜성 용액을 사용하는 연무기를 포함하는 장치이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 연무기 장치는 본 발명의 siNA 분자 또는 제제를 포함하는 하나 이상의 비-수성 플루오로화학물질 담체를 포함한다.

본 발명의 siNA 분자 또는 제제 및 계면활성제를 포함하는 고체 입자 에어로졸은 임의의 고체 미립자 에어로졸 발생기에 의해 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 에어로졸 발생기는 고체 미립자 작용제를 대상체에게 투여하기 위해 사용된다. 이들 발생기는 하기 설명된 바와 같이 조성물의 사전 결정된 계측량으로 호흡가능한 입자를 생산한다. 본 발명의 특정 실시양태는 본 발명의 하나 이상의 siNA 분자 또는 제제를 갖는 미립자의 조합물을 사전 결정된 부피의 현탁액 매질 또는 계면활성제와 함께 포함하는 에어로졸을 포함하여 호흡 블렌드를 제공한다. 본 발명의 다른 실시양태는 본 발명의 siNA 분자 또는 제제를 포함하는 에어로졸 발생기를 포함한다.

본 발명의 siNA 분자와 함께 사용되는 고체 입자 에어로졸 발생기의 한 유형은 취입기이다. 취입에 의한 투여에 적합한 제제는 취입기에 의하여 전달될 수 있는 미세 분쇄된 분말을 포함한다. 취입기에서, 분말, 예를 들어 본원에 기재된 치료를 수행하는데 효과적인 그의 계측량은 전형적으로 젤라틴 또는 플라스틱으로 제조된 캡슐 또는 카트리지에 함유되고, 이는 계내에서 관통되거나 개방되며, 분말은 흡입시 장치를 통해 구동되는 공기에 의해 또는 수동으로 작동되는 펌프에 의해 전달된다. 취입기에 사용되는 분말은 활성 성분 단독으로 이루어지거나, 또는 활성 성분, 적합한 분말 희석제, 예컨대 락토스 및 임의적인 계면활성제를 포함하는 분말 블렌드로 이루어진다. 예시된 에어로졸 발생기의 두번째 유형은 계량 흡입기 ("MDI")를 포함한다

MDI는 전형적으로 액화 추진제 내에 활성 성분의 현탁액 또는 용액 제제를 함유하는 가압식 에어로졸 분배기이다. 사용하는 동안에, 이들 장치는 계측된 부피를 전달하도록 적합화된 밸브를 통하여 제제를 방출시켜 활성 성분을 함유하는 미세 입자 분무를 생성시킨다. 적합한 추진제는 특정 클로로플루오로탄소 화합물, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 및 이들의 혼합물을 포함한다. 제제는 하나 이상의 공용매, 예를 들어 에탄올, 유화제 및 다른 제제 계면활성제, 예를 들어 올레산 또는 소르비탄 트리올레에이트, 항산화제 및 적합한 향미제를 추가로 함유할 수 있다. 폐 전달을 위한 다른 방법이, 예를 들어 미국 특허 출원 번호 20040037780 및 미국 특허 번호 6,592,904; 6,582,728; 6,565,885에 기재되어 있다.

전형적으로 본 발명의 MDI 캐니스터는 사용되는 추진제의 증기압을 견딜 수 있는 용기, 예컨대 플라스틱 또는 플라스틱-코팅된 유리 병 또는 바람직하게는 금속 캔, 예를 들어 알루미늄 또는 그의 합금 (임의로 양극산화처리, 래커-코팅 및/또는 플라스틱-코팅될 수 있음) (예를 들어, WO96/32099 (본원에 참고로 포함됨) (여기서는 일부 또는 모든 내부 표면이 1종 이상의 비-플루오로카본 중합체와 임의로 조합된 1종 이상의 플루오로카본 중합체, 예컨대 이로 제한되지 않지만, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 및 폴리에테르술폰 (PES)의 중합체 블렌드로 코팅됨) 참조)을 포함하고, 상기 용기는 계량 밸브를 사용하여 밀폐된다. 계량 밸브는 1회 작동마다 계량된 양의 제제를 전달하고 밸브를 통해 추진제가 누출되는 것을 방지하기 위한 가스켓이 도입되도록 설계된다. 가스켓은 임의의 적합한 엘라스토머성 물질, 예를 들어 저밀도 폴리에틸렌, 클로로부틸, 브로모부틸, EPDM, 흑색 및 백색의 부타디엔-아크릴로니트릴 고무, 부틸 고무 및 네오프렌을 포함할 수 있다. 적합한 밸브는 에어로졸 산업에 널리 공지된 제조업체, 예를 들어 프랑스 발로이스(Valois) (예를 들어, DF10, DF30, DF60), 영국 베스파크 피엘씨(Bespak plc) (예를 들어, BK300, BK357) 및 영국 쓰리엠-네오테크닉 리미티드(3M-Neotechnic Ltd.) (예를 들어, 스프레이마이저(Spraymiser™))가 시판한다.

본원에 교시된 siNA 분자 또는 제제를 함유하는 MDI는 당업계의 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 상기 바이론(Byron) 및 WO96/32099 참조).

본 발명의 siNA 분자와 함께 사용되는 MDI는 또한 다른 구조, 예컨대 이로 제한되지 않지만, MDI를 저장하고 함유하는 외장 패키지, 예를 들어 미국 특허 번호 6,119,853; 6,179,118; 6,315,112; 6,352,152; 6,390,291; 및 6,679,374에 기재된 것들, 뿐만 아니라 용량 계수 장치, 예컨대 이로 제한되지 않지만, 미국 특허 번호 6,360,739 및 6,431,168에 기재된 것들과 함께 사용될 수 있다.

siNA 분자는 또한 유체 분배기, 예를 들어 분배 노즐 또는 분배 오리피스를 갖는 유체 분배기 (유체 분배기의 펌프 메카니즘에 사용자가 힘을 인가할 때, 이것을 통해 계량된 용량의 유체 제제가 분배됨)로부터 전달되는 유체 제제로서 제제화될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 순차적인 펌프 작동시에 분배가능한, 유체 제제의 여러 계량된 용량의 저장소를 이용하며, 본 발명의 siNA 분자 또는 제제를 포함하는 유체 분배기를 제공한다. 특정 실시양태에서, 분배기의 분배 노즐 또는 오리피스는 비강 내로 siNA 분자 또는 제제를 포함하는 유체 제제가 분무 분배되도록 하기 위해서 사용자의 콧구멍 안으로 삽입되는 형상을 가질 수 있다. 상기 언급된 유형의 유체 분배기는 WO05/044354에 기재되고 예시되어 있다. 상기 분배기는 유체 제제를 함유하기 위한 용기에 탑재된 압축 펌프를 갖는 유체 배출 장치를 포함하는 하우징을 갖는다. 다양한 실시양태에서, 상기 하우징은 손가락으로 작동가능한 적어도 1개의 측부 레버를 가지며, 이것은 하우징에 대하여 안쪽으로 이동가능하여 용기가 하우징 내에서 위쪽으로 이동하여 펌프가 압축되도록 하고 계량된 용량의 제제가 하우징의 비측 노즐을 통해 펌프 장치 밖으로 펌핑되도록 한다. 또 다른 실시양태에서, 유체 분배기는 WO05/044354의 도 30-40에 예시된 일반적인 유형이다.

본 발명의 특정 실시양태에서, 연무기 장치는 모든 연령의 의식이 있는 자발적으로 호흡하는 대상체 및 제어 환기되는 대상체에 대한 적용에 이용된다. 연무기 장치는 폐로의 표적화 국소 및 전신 약물 전달에 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 연무기를 포함하는 장치는 본 발명의 siNA 분자 또는 제제를 폐 또는 폐 조직으로 국부 전달하는데 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 연무기를 포함하는 장치는 본 발명의 siNA 분자 또는 제제를 전신 전달하는데 사용된다.

다른 실시양태에서, 연무기 장치는 하나 이상의 활성제의 에멀젼, 마이크로에멀젼, 또는 서브마이크론 및 나노미립자 현탁액을 포함하는 호흡 분산액을 전달하는데 사용된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7128,897 및 7,090,830 B2 참조).

연무기 장치는 본 발명의 siNA 분자 또는 제제를 포함하는 에어로졸을 지속적으로 또는 주기적으로 투여하는데 사용될 수 있고, 수동적으로, 자동적으로 또는 환자의 호흡과 공동으로 조절될 수 있다 (미국 특허 번호 3,812,854, WO 92/11050 참조). 예를 들어, 본 발명의 siNA 분자의 주기적 투여는 마이크로채널 압출 챔버 또는 고리형 가압을 통해 단일-볼루스로서 제공될 수 있다. 1일 1회 또는 1일 수회, 예를 들어 2, 3, 4 또는 8회 (매회 1, 2 또는 3 용량이 주어짐) 투여될 수 있다. 흡입기 또는 취입기의 캡슐 및 카트리지에 의해 전달되는 전체 1일 용량 및 계측량은 일반적으로 에어로졸 제제에 의해 전달되는 것의 2배일 것이다.

H. 본 발명의 siNA 분자의 다른 적용/용도

본 발명의 siNA 분자는 또한 진단 적용, 연구 적용 및/또는 의약 제조에 사용될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 대상체에서의 질환, 질병 또는 상태의 진단에 적합한 조건 하에 대상체에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환, 질병 또는 상태를 진단하는 방법을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 대상체 또는 유기체에서의 질병, 질환 또는 상태와 관련이 있는 반수체형 다형성으로 인한 ICAM-1 단백질의 발현을 하향 조절하거나 억제하는데 사용된다. ICAM-1 유전자 또는 ICAM-1 단백질 또는 RNA 수준의 분석은 이러한 다형성을 갖는 대상체 또는 본원에 기재된 질병, 상태 또는 질환이 발생할 위험이 있는 대상체를 확인하는데 사용될 수 있다. 이들 대상체는 예를 들어 본 발명의 siNA 분자 및 표적 유전자 발현과 관련이 있는 질환을 치료하는데 유용한 임의의 다른 조성물로 치료하기 용이하다. 이와 같이, ICAM-1 단백질 또는 RNA 수준의 분석은 대상체 치료시의 치료 유형 및 요법의 기간을 결정하는데 직접적으로 또는 간접적으로 사용될 수 있다. ICAM-1 단백질 또는 RNA 수준의 모니터링은 치료 결과를 예측하고 질병, 장애, 상태 또는 질환과 관련이 있는 특정 ICAM-1 단백질의 수준 및/또는 활성을 조정하는 화합물 및 조성물의 효능을 결정하는데 사용될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 의약의 제조에 사용하기 위한 본 발명에 따른 이중 가닥 핵산의 용도를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 의약은 ICAM-1의 작용에 의해 또는 작용 소실에 의해 매개되는 상태의 치료에 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 의약은 호흡기 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 의약은 COPD, 낭성 섬유증, 천식, 호산구성 기침, 기관지염, 사르코이드증, 폐섬유증, 비염 및 부비동염으로 이루어진 군으로부터 선택된 호흡기 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, COPD, 낭성 섬유증 및 천식으로 이루어진 군으로부터 선택된 호흡기 질환 치료를 위해 사용된다.

특정 실시양태에서, siNA 29282-DC, 29284-DC, 29285-DC, 29286-DC, 29288-DC, 29292-DC, 48722-DC 및 48723-DC, 및 하나 이상의 가닥이 서열 2, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 11, 서열 37, 서열 38, 서열 143, 서열 144, 서열 145, 서열 146, 서열 147, 서열 148, 서열 149 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 siNA, 및 화학식 A를 포함하는 siNA는 호흡기 질환, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만, COPD, 낭성 섬유증, 천식, 호산구성 기침, 기관지염, 사르코이드증, 폐섬유증, 비염 및 부비동염의 치료 방법에 사용된다.

I. 실시예

본 발명은 이제 하기 비제한적 실시예와 관련하여 설명될 것이다. 당업자라면 본질적으로 동일한 결과를 수득하도록 변경 또는 변형될 수 있는 광범위한 비임계적 변수들을 잘 알 것이다.

실시예 1: ICAM-1에 대한 siNA 활성의 설계, 합성 및 확인

ICAM -1 siNA 합성

ICAM-1에 대한 효능을 위해 일련의 42개의 siNA 분자를 설계, 합성 및 평가하였다. 인간 siNA를 위한 ICAM-1 설계의 주요 기준은 (i) 인간 종과의 상동성 및 (ii) 독점적인 알고리즘에 의해 측정된 높은 효능 점수이었다. 마우스 서열 또한 동물 모델에 사용하기 위해 확인되었다. ICAM-1 RNA 수준에 대한 siNA의 효과 또한 조사하였다. ICAM-1에 대한 효능을 위해 설계, 합성 및 평가된 siNA의 서열을 표 1a (표적 서열) 및 표 1b (변형된 서열)에 기재하였다.

<표 1a>

표적 서열의 각각의 올리고뉴클레오티드를 위해, siNA의 2개의 개별적인 상보적 가닥을 고체상 합성을 이용하여 별도로 합성된 다음, 역상 고체상 추출 (SPE)에 의해 별도로 정제하였다. 상보적 가닥을 어닐링하여 이중 가닥 (이중나선)을 형성하고, 원하는 농도 및 선택된 완충제로 제공하였다.

간략하게, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 당업계에 공지된 바와 같이 자동화된 고체상 합성기에서 포스포르아미다이트 화학을 이용하여 합성되었다 (예를 들어 USSN 12/064,014 참조). 합성 칼럼을 제1 뉴클레오시드 잔기로 유도체화된 고체 지지체로 팩킹하였다. 산 불안정성 5'-O-디메톡시트리틸 기의 탈트리틸화에 의해 합성을 개시하여, 5'-히드록실을 방출시켰다. 포스포르아미다이트, 및 아세토니트릴 중 적합한 활성화제를 합성 칼럼에 동시에 전달하여, 아미다이트와 5'-히드록실의 커플링을 일으켰다. 이어서, 칼럼을 아세토니트릴로 세척하였다. 요오드 용액을 칼럼을 통해 펌핑하여, 포스파이트 트리에스테르 연결기 P(III)를 그의 포스포트리에스테르 P(V) 유사체로 산화시켰다. 미반응 5'-히드록실 기를 2,6-루티딘 및 N-메틸이미다졸의 존재 하에 아세트산 무수물과 같은 시약을 이용하여 캡핑하였다. 신장 주기는 다음 포스포르아미다이트 도입을 위한 탈트리틸화 단계로 재개되었다. 이 공정은 원하는 서열이 합성될 때까지 반복하였다. 합성은 최종 5'-말단 보호기 (트리틸 또는 5'-O-디메톡시트리틸)에 의해 종료되었다.

합성 완료시, 고체-지지체 및 회합된 올리고뉴클레오티드를 아르곤 압력 또는 진공 하에 건조시켰다. 수성 염기를 첨가하고, 혼합물을 가열하여, 숙시닐 연결기의 절단, 시아노에틸 포스페이트 보호기의 제거 및 고리외 아민 보호의 탈보호를 달성하였다.

하기 공정은 리보뉴클레오티드를 함유하지 않은 단일 가닥에서 수행되었다. 고체 지지체를 수성 염기로 처리한 후, 혼합물을 여과하여, 보호되지 않는 조 합성 물질로부터 고체 지지체를 분리하였다. 이어서, 고체 지지체를 물로 세정하고, 이를 여과물과 합하였다. 생성된 염기성 용액이 5'-O-디메톡시트리틸 기를 보유하도록 하여, 5' 말단 위치에 (트리틸-온) 잔류시켰다.

리보뉴클레오티드를 함유하는 단일 가닥을 위해, 하기 공정을 수행하였다. 고체 지지체를 수성 염기로 처리한 후, 혼합물을 여과하여, 보호되지 않은 조 합성 물질로부터 고체 지지체를 분리하였다. 이어서, 고체 지지체를 디메틸술폭시드 (DMSO)로 세정하고, 이를 여과물과 합하였다. 플루오라이드 시약, 예컨대 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드를 혼합물에 첨가하고, 용액을 가열하였다. 적합한 완충액에 의해 반응을 켄칭시켜, 최종 5' 말단 위치 상에 5'-O-디메톡시트리틸 기를 갖는 조 단일 가닥의 용액을 제공하였다.

각각의 조 단일 가닥의 트리틸-온 용액을 크로마토그래피 정제, 예컨대 SPE RPC 정제를 이용하여 정제하였다. 트리틸 기의 소수성 성질은 비-트리틸화 말단절단된 실패 서열에 비해 원하는 전장 올리고의 더 강력한 보유를 허용하였다. 상기 실패 서열을 적합한 용매, 예컨대 낮은 백분율의 아세토니트릴을 갖는 수지로부터 선택적으로 세척하였다. 이어서, 보유된 올리고뉴클레오티드를 트리플루오로아세트산에 의해 칼럼 상에서 탈트리틸화시켜, 산-불안정성 트리틸 기를 제거하였다. 나머지 산을 칼럼으로부터 세척하고, 염 교환을 수행하고, 물질의 최종 탈염을 개시하였다. 전장 올리고는 수성-유기 용매를 갖는 정제된 형태로 회수되었다. 이어서, 최종 생성물을 순도 (HPLC), 동일성 (Maldi-TOF MS) 및 수율 (UV A₂₆₀)에 대해 분석하였다. 올리고를 동결건조 또는 진공 축합을 통해 건조시켰다.

어닐링: 생성물의 분석을 기준으로, 건조된 올리고를 적절한 완충액에 용해시킨 후, 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 가닥을 동량으로 (이론적 소광 계수를 이용하여 계산됨) 혼합시켰다. 이어서, 상기 용액을 크로마토그래피 방법 및 원하는 최종 농도에 의해 이중나선의 순도에 대해 분석하였다. 분석에 의해 어느 한 가닥이 과잉인 것으로 나타나는 경우, 추가의 비-과잉 가닥을 이중나선화가 완료될 때까지 적정하였다. 분석에 의해 원하는 생성물 순도가 달성되었을 때, 물질을 전달하고, 즉시 사용하게 하였다.

하기는 상기 프로토콜을 사용하여 합성된 다양한 siNA를 보여주는 표이다.

<표 1b>

상업적 제조를 위한 추가의 합성 단계

분석이 원하는 생성물 순도가 어닐링 단계 후에 달성되었음을 나타내면, 어닐링 단계 전에 수행하는 것과는 대조적으로, 물질을 농축 및 염 제거를 위해 접선 흐름 여과 (TFF) 시스템으로 전달하였다.

한외여과: 어닐링된 생성물 용액을 적절한 분자량 컷오프 막을 함유하는 TFF 시스템을 사용하여 농축시켰다. 농축 후에, 여과물의 전도성이 물의 전도성이 될 때까지 밀리-Q(Milli-Q) 수를 사용하여 정용여과를 통해 생성물 용액의 염을 제거하였다.

동결건조: 농축된 용액을 순간 냉각되고 동결건조기에 부착된 병으로 전달하였다. 이어서, 생성물을 분말로 냉동-건조시켰다. 병을 동결건조기로부터 분리하고, 이제 사용 준비되었다.

초기 스크리닝 프로토콜 (96-웰 플레이트 형질감염)

세포 배양물 제조:

달리 나타내지 않는 한 모든 세포를 ATCC (미국 버지니아주 매나사스)로부터 수득하였다. 세포를 표준 조건하에 성장시키고, 형질감염시켰으며, 이는 아래 상세하게 기재되어 있다.

Calu-1 (인간; ATCC cat# HTB-54): 세포를 5％ CO₂의 존재하에 37℃에서 배양하고, 10％ 최종 농도의 태아 소 혈청이 보충된 맥코이(McCoy) 5a 배지 및 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신 및 100 U/mL 페니실린에서 성장시켰다.

형질감염 및 스크리닝

모든 형질감염은 제조업체의 지시에 따라 RNAiMax (인비트로젠 Cat# 13778-150)를 사용하여 수행하였다.

Calu-1 세포를 조직-배양물 처치된, 96-웰 플레이트의 모든 웰에 100 ㎕의 적절한 배양 배지 중 5,000개 세포/웰의 최종 계수로 플레이팅하였다. 세포를 5％ CO₂의 존재하에 37℃에서 플레이팅한 후에 24시간 동안 배양하였다.

24시간 후에, siNA 및 RNAiMax를 함유하는 복합체를 다음과 같이 생성하였다. OPTI-MEM 중에 33-배 희석된 RNAiMax의 용액을 제조하였다. 이와 병행하여, 시험용 siNA의 용액을 OPTI-MEM 중 120 nM의 최종 농도로 제조하였다. 5분 동안 실온에서 RNAiMax/OPTI-MEM 용액을 인큐베이션한 후에, 동일한 부피의 siNA 용액 및 RNAiMax 용액을 각각의 siNA에 대해 함께 첨가하였다. 혼합하여 siNA의 농도가 60 nM인 siNA/RNAiMax의 용액을 생성하였다. 이 용액을 20분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 용액 20 ㎕를 각각의 적절한 웰에 첨가하였다. 각 웰에서 siNA의 최종 농도는 10 nM였고, 각 웰에서 RNAiMax의 최종 부피는 0.3 ㎕였다.

달리 나타내지 않는 한 RNAiMax-siNA 복합체와의 인큐베이션의 시간은 24시간이었다. 달리 나타내지 않는 한 형질감염과 세포 수확 사이에 배지에는 변화가 없었다.

각각의 형질감염에서 RNAiMax의 일정한 양을 유지하면서, 용량 반응 곡선을 96-웰 플레이트에서 유사한 방식으로 실시하였다.

RNA 단리 및 역전사 (96-웰 플레이트)

택맨(TaqMan)® 유전자 발현 세포-대-CT^TM 키트 (Cat# 4399002)를 변형된 프로토콜로 사용하여 96-웰 플레이트로부터 RNA를 추출하였다. 간략하게, DNase I이 포함된 60 ㎕ (1 플레이트) 또는 110 ㎕ (2 플레이트)의 용해 용액을 용해 완충액 플레이트 (트윈.텍 풀 스커트(twin.tec full skirt) 플레이트)의 각각의 웰로 분배하였다. 세포를 세척할 때까지 용해 완충액 및 정지 플레이트를 4℃에 보관하였다.

플레이트를 5분 동안 1100 rpm에서 회전시켰다. 배양 배지를 배양 플레이트의 웰로부터 흡인하여 폐기하였다. 바이오멕(BioMek) FX 기기 및 방법을 이용하여 자동으로 용해를 수행하였다. 바이오멕 방법이 완료된 후, 용해 플레이트를 실온에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 용해 플레이트를 4℃에서 2시간 동안, 또는 -20℃ 또는 -80℃에서 2개월 동안 보관할 수 있다.

역전사 플레이트의 각각의 웰은 2X 역전사효소 완충액 10 ㎕, 20X 역전사 효소 1 ㎕ 및 뉴클레아제-비함유 물 2 ㎕를 필요로 하였다. 2X 역전사 완충액, 20X 역전사 효소 믹스 및 뉴클레아제-비함유 물을 혼합하여 역전사 마스터 믹스를 제조하였다. 역전사 마스터 믹스 13 ㎕를 역전사 플레이트 (세미-스커티드(skirted))의 각각의 웰에 분배하였다. 별도의 역전사 플레이트를 각각의 세포 플레이트에 대해 제조하였다. 플레이트를 바이오멕 NX 또는 바이오멕 FX 이중 -96 상에 로딩하고, 바이오멕 방법을 시행하였다. 프로그램은 상기 기재된 세포 용해 절차로부터의 용해물 7 ㎕가 역전사 플레이트의 각각의 웰로 자동으로 첨가되도록 프로그램된다. 플레이트는 밀폐시키고, 원심분리기 상에서 회전시켜 (30초 동안 1000 rpm) 내용물을 역전사 플레이트의 바닥에 침강시켰다. 플레이트를 37℃에서 60분 동안, 95℃에서 5분 동안, 및 4℃에서 플레이트를 써모사이클러에서 분리할 때까지 써모사이클러에 넣었다. 분리시, 바로 사용하지 않는다면, 플레이트를 -20℃에서 동결시켰다.

정량적 RT-PCR (택맨)

일련의 프로브 및 프라이머를 사용하여 인간 세포주에서 ICAM-1 및 ICAM-2의 유전자의 다양한 mRNA 전사체를 검출하였다 (표 2 참조). 본원에 기재된 실험을 위한 모든 택맨 프로브 및 프라이머는 어플라이드 바이오시스템즈, 인크. (Applied Biosystems, Inc.)에 의해 사전 승인된 세트로 공급되었다 (표 2 참조). 제조업체의 지시에 따라 ABI 7900 기기 상에서 검정을 수행하였다.

택맨 유전자 발현 마스터 믹스 (세포-대-CT^TM, 어플라이드 바이오시스템즈, Cat # 4399002에 제공됨)를 사용하였다. PCR 반응을 50℃에서 2분 동안, 95℃에서 20분 동안, 이어서 95℃에서 15초 동안 및 60℃에서 1분 동안 (40 사이클) 수행하였다.

각각의 실험 내에서, 기준선은 증폭 곡선의 지수기에서 증폭 곡선과 기준선의 교점에 기초하여 설정하고, Ct (사이틀(cythle) 임계) 값을 기기에 의해 배정하였다.

ICAM-1 ELISA

96-웰 플레이트에서, 5,000개 Calu-1 세포/웰을 완전 성장 배지 100 ㎕에 시딩하고, 밤새 5％ CO₂와 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포를 RNAiMax (인비트로젠, Cat# 13778-150)를 사용하여 siNA로 형질감염시켰으며; siRNA의 최종 농도는 10 nM 내지 0.0000097 nM였다. 각각의 웰에서 RNAiMax의 양은 0.3 ㎕였다. siNA는 6시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 새로운 완전 성장 배지 95 ㎕로 교체하고, INF-γ/TNF-α 5 ㎕/웰을 10 ng/ml 최종 농도로 첨가하였다. 세포를 24, 48 및 72시간 동안 인큐베이션하였다.

표면 ICAM-1을 위한 계내 ELISA를 다음과 같이 수행하였다. 세포를 PBS 중에서 2회 세척하였다. 웰을 37℃에서 1.5시간 동안 수퍼 차단 완충액 (피어스(Pierce), Cat # 37535)으로 미리 차단하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 일차 모노클로날 항체 (아브캄(Abcam), 클론 MEM-111, Cat ab2213)를 수퍼 차단 완충액에서 3000 중 1로 희석하였다. 웰 하나 당 일차 항체 50 ㎕를 첨가하였다. 웰을 1시간 동안 실온에서 부드럽게 진탕시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 토끼 폴리클로날 2차 항체 (아브캄, Cat ab6728)를 수퍼 차단 완충액에서 1:1000 희석하였다. 웰 하나 당 2차 항체 50 ㎕를 첨가하였다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 웰 하나 당 TMB 용액 (시그마(Sigma), Cat# T-8665) 50 ㎕를 첨가하고, 10분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 정지 용액 50 ㎕를 첨가하였다. 흡광도를 450 nM에서 판독하였다.

연산

관심 유전자의 발현 수준 및 녹-다운(％)을 비교 Ct 방법을 이용하여 계산하였다:

비-표적화 대조군 siNA를 달리 나타내지 않는 한 녹-다운(％)을 계산하는 것에 대한 값으로 선택하였으며, 이는 이것이 가장 적절한 대조군이기 때문이다.

추가로, 세포의 일반적인 건강 및 RNA 추출의 품질을 반영하는 정상화된 데이터만을 조사하였다. 이는 처치된 세포에서 두가지 상이한 mRNA의 수준을 관찰하여 수행하였으며, 첫번째는 표적 mRNA이고, 두번째는 정상화군 mRNA이다. 이는 단독으로 관심 유전자를 녹다운시키는 것 보다 오히려 세포에 잠재적으로 독성일 수 있는 siNA 제거를 허용한다. 이는 전체 플레이트에 대한 Ct에 관하여 각각의 웰에서 GAPDH에 대한 Ct를 비교하여 수행하였다.

IC₅₀의 모든 연산은 시그마플롯(SigmaPlot) 10.0 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 데이터는 단순 리간드 결합을 위한 S자형 용량-반응 (가변 경사) 방정식을 사용하여 분석하였다. 녹-다운(％)의 모든 연산에서, 연산은 달리 나타내지 않는 한 비-표적화 대조군 (Ctrl siNA)으로 처치한 샘플에서 관심 유전자의 발현의 정상화 수준에 관하여 이루어졌다.

ICAM-1 단백질 수준에 대한 siNA의 효과를 다중 비교 ANOVA 시험을 사용하여 서로에 대해 및 보편적인 대조군의 효과와 비교하여 95％ 신뢰 구간을 수득하였다. 표준 해석에 따라, 0을 포함하지 않는 95％ 신뢰 구간을 5％ 유의 수준에서 유의한 것으로 간주하였다.

결과:

이전에 기재된 바와 같이 42개 siNA를 설계하고 합성하였다. siNA를 인간 Calu-1 세포에서 스크리닝하였다. 인간 세포에서의 ICAM-1 siNA의 스크리닝으로부터의 데이터를 표 3에 나타내었다.

특정 siNA 분자에 대한 인간 세포에서의 ICAM-1 mRNA 녹-다운에 대한 효능 및 잠재성에 관한 요약 데이터를 표 4에 나타낸다. 실험용 세포를 0.083 fM 내지 30 nM 범위의 siNA의 12가지 농도로 처치하였다. 모든 데이터를 GAPDH mRNA 발현 수준의 표현에 대해 정상화된 ICAM-1의 녹다운(％)으로 나타낸다. 이어서, 데이터를 비-표적화 대조군 siNA에 관하여 녹다운(％)으로 결정하였다.

표 4의 6가지 siNA의 특이성을 또한 평가하였다. siNA를 1 nM 농도에서 시험하여 인간 ICAM-2의 mRNA 전사체에 대한 ICAM-1 siNA의 효과를 결정하였다. 특이성 데이터를 표 5에 나타낸다.

이들 siNA는 ICAM-1에 대한 이들의 IC₅₀보다 적어도 90-배 더 높은 농도에서 ICAM-2 mRNA 전사체의 유의한 감소를 나타내지 않았다.

다양한 siNA를 또한 ELISA 검정을 이용하여 녹-다운 ICAM-1 단백질에 대한 이들의 잠재성을 평가하였다. 6가지 siNA를 siNA의 농도 범위에 걸쳐 ICAM-1 ELISA 검정에서 시험하였다. 각각의 샘플의 흡광도를 INF-γ/TNF-α로 자극하지 않은 웰로부터 수득한 평균 흡광도에 대해 정상화하였다 (n = 6). 이들 웰을 백그라운드 대조군으로 제공하였다 (표 6 참조).

6가지 모든 경우에서, siNA는 모든 시험된 시점에서 ICAM-1 단백질의 용량 의존성 감소를 나타내었다. 48시간 인큐베이션은 신뢰성 신호 강도와 함께 각각의 독립적인 실험 (n = 3) 내에서 기술적 반복 (n = 3) 사이에 가장 작은 변화를 생성하였다. 이러한 이유로, 48시간 시점이 최적 인큐베이션 시간으로 선택되었다.

실시예 2: 인간 기관지 상피 세포의 siNA의 시험관내 평가

29961-DC, 29964-DC, 29984-DC, 29988-DC, 29957-DC, 29947-DC 및 29956-DC에 해당하는 이중나선 ID 번호를 갖는 siNA를 다음과 같이 인간 기관지 상피 세포에서 최대 ICAM-1 mRNA 녹다운 및 효능 (EC50)에 대해 시험하였다.

세포 배양물 제조

론자(Lonza) (Cat. No. CC-2540)로부터 수득한 인간 기관지 상피 세포 (NHBE 세포)를 5％ CO₂의 존재하에 37℃에서 성장시키고, 바이오코트 콜라겐1(Biocoat Collagen1) 코팅된 플라스크 (벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)) 상에서 BEBM 기본 배지 (론자, Cat. No. CC-3171)에서 배양하였다.

인간 폐 상피 암종 (Calu-1) 세포를 5％ CO₂의 존재하에 37℃에서 성장시키고, 10％ 태아 소 혈청, 글루타민 및 항생제가 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다.

형질감염

NHBE 세포를 콜라겐 1 코팅된 플레이트에 플레이팅하고, 적절한 배양 배지에서 배양하였다. 세포를 5％ CO₂의 존재하에 37℃에서 플레이팅한 후에 24시간 동안 배양하였다. siNA 및 형질감염제를 필요한 농도로 OptiMEM 1에서 희석하였다. siNA 제제화를 위해, 동일한 부피의 희석된 siNA 및 전달 지질을 합하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 96 웰 플레이트의 웰 하나 당 제제화된 siNA 10 ㎕ 및 BEBM 배지 90 ㎕를 첨가하여 (6개 복제물/데이터 지점/siNA 농도) siNA의 6개 지점 용량 범위 (100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM, 0.3 nM)를 제공하였다. 형질감염 18시간 후에, 배지를 교체하였다. ICAM-1 mRNA의 기본 발현이 NHBE 세포에서 낮아서 세포를 6시간 동안 최종 농도 10 ng/ml로 재조합 인간 TNF-알파 (R＆D 시스템즈(R＆D systems))로 자극하여 ICAM-1 발현을 유도하였다. 형질감염 24시간 후에 세포를 용해시켰다.

RNA 단리 96 웰 플레이트

제조업체의 지시에 따라 자동화된 SV96 총 RNA 단리 시스템 (프로메가(Promega))을 사용하여 96-웰 플레이트 포맷으로 세포로부터 총 RNA를 단리하였다. 바이오멕 2000 실험실 자동화 워크스테이션 (베크만 코울터(Beckman Coulter))을 사용하여 형질감염된 세포 용해물을 실리카 막에 적용하였다. 이어서, RNAse-비함유 DNAse I을 실리카 막에 직접 적용하여 오염 게놈 DNA를 분해시켰다. 결합된 총 RNA를 단순 세척 단계에 의해 오염 염, 단백질 및 세포 불순물로부터 추가로 정제하였다. 최종적으로, 총 RNA를 뉴클레아제-비함유 물의 첨가에 의해 막으로부터 용리하였다.

정량적 RT-PCR (택맨)

일련의 프로브 및 프라이머를 인간 세포주에서 ICAM-1, OAS1 및 GAPDH (대조군으로/정상화)의 mRNA 전사체를 검출하는데 사용하였다. 제조업체의 지시에 따라 ABI 7900HT 기기 상에서 검정을 수행하였다. 사용된 프라이머 프로브 세트는 아래 표 7에 열거한다.

연산

택맨 데이터로, 중요한 임계값 (Ct)을 384 웰 플레이트의 각각의 웰에서 분석된 특정 유전자에 해당하는 카피 수로 전환시켰다. 6개 동일한 웰을 주어진 처치를 위해 각각의 플레이트에서 제조하였다. 따라서, 평균 유전자 카피 수 및 표준 편차를 계산하였다. 가변 계수 (CV) 백분율 (％ C.V. = [표준 편차/평균]*100)의 결정은 그의 값이 (％C.V.<25이도록) 이상값인 웰의 생략을 허용하였다. 유전자의 상대적 존재비 (즉, 상대적 발현)는 그 유전자의 평균 카피 수를 그 특정 샘플에서의 그의 GAPDH 대응부로 나누어 결정하였다.

데이터의 통계적 분석

EC50 값을 시그마 플롯을 사용하여 데이터로부터 계산하였다. siNA의 효능 및 잠재성의 모든 연산은 비-표적화 대조군 siNA에 관하여 수행하였다.

결과

siNA 29282-DC, 29288-DC, 48721-DC, 29286-DC 및 29284-DC (각각 표적 부위 2113, 2046, 2240, 1838 및 1141)는 높은 효능 및 잠재성을 증명하는, 인간 정상 기관지 상피 세포 (NHBE)에서 ICAM-1 mRNA의 최대 및 용량 의존성 녹-다운 (KD)을 나타내었다. 표 8은 형질감염 48시간 후에 ICAM-1을 표적화하는 siNA를 갖는 NHBE의 3개의 개별 공여자로부터의 평균 데이터를 나타낸다.

실시예 3: TLR3에 대한 siNA의 시험, 매개된 면역자극

Calu-1 또는 NHBE 세포를 실시예 2에서 상기와 같이 처치하고, OAS1 mRNA 상향조절에 대한 양성 대조군으로서 폴리I:C의 도입과 함께, 엔도솜 TLR3 매개 면역자극 측정에 사용하였다. 막 결합된 TLR3 매개 면역자극의 측정을 위해, Calu 1 세포를 96 웰 당 12000개 세포로 배양하고, siNA를 100 nM, 30 nM, 10 nM, 3 nM, 1 nM 및 0.3 nM의 농도로 전달 비히클의 부재하에 PBS 중에서 투여하였다.

엔도솜 TLR3 매개 면역자극을 또한 NHBE 세포가 전달 비히클 (게미니(Gemini) 계면활성제 GSC170 Dab - WO03/82809의 실시예 37)로 제제화된 siNA로 감염되었을 때 OAS1 mRNA 수준의 증가율(％) (게미니 전달 비히클 대조군에 관한 OAS1 mRNA 수준의 증가율(％))을 기록하여 측정하였다. TLR3 효능제 폴리I:C를 OAS1 mRNA 유도에 대한 양성 대조군으로 사용하였다.

상기 기재된 면역자극 시험의 결과를 표 9에 나타낸다.

실시예 4: 수컷 CD 래트의 기도에서의 면역자극 시험

siNA/비히클 예비-처치

수컷 CD 래트 (150-250 g)를 이소플루란 (5％, 2L/분 O₂, 1L/분 NO)으로 마취시키고, 35도 각도의 투약 테이블 상에 이들의 등이 닿도록 위치시키고, 금속 막대를 이들의 앞니 아래 놓아 이들을 그 자리에 유지시켰다. 인후의 외부에 대해 빛을 기울여 기관을 밝혔다. 구강은 기도의 상부 개구를 가시화하기 위해 개방하고, 포르텍스 캐뉼라를 블런트 투약 바늘을 통해 기관으로 도입하였다. 이어서, 비히클, 보편적인 대조군, 폴리 IC 또는 4가지 ICAM-1 siNA 제제 (siNA 29282-DC, 29288-DC, 29286-DC 및 20284-DC) 200 ㎕를 기도에 주사하였다. 투약 후에, 동물을 마취로부터 회복하는 동안 앙와위에 위치시켰다.

폐 세척 프로토콜

폐 챌린지(lung challenge) 24시간 후에, 복강내 주어진 나트륨 펜토바르비톤의 과다투여로 도태시켰다. 기관을 노출시키고, 작은 절개부를 만들어 여기에 튜브를 폐를 향하도록 삽입하였다. 이어서, 폐를 5 ml 헤파린화 (10 U/ml) PBS로 3회 세척하였다. 폐 유조직의 작은 부분을 분리하여, 염증성 유전자 발현의 전사체 분석을 위해 동결시켰다.

샘플 처리

기관지폐포 세척 유체 (BALF) 샘플을 7분 동안 1300 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 분리하여, 시토카인 분석에 사용하였다. 남아있는 세포 펠릿을 0.5 ml PBS에 다시 현탁시켰다. 재현탁 유체의 세포 슬라이드를 재현탁된 BALF 유체 75 ㎕를 사이토스핀 홀더에 넣어 제조하고, 이어서 5분 동안 500 rpm에 회전시켰다. 슬라이드를 공기 건조시킨 후에, 라이쉬만스(Leishmans) 염색 (20분)으로 염색하여 차별적인 세포 계수를 허용하였다. 또한, 전체 세포를 시스멕스(Sysmex) 계수기를 사용하여 재현탁액으로부터 계수하였다. 이들 2 카운트로부터, BALF에서의 호중구의 전체 개수를 결정하였다.

결과

siNA의 점적 주입 후에 래트의 폐에서 비히클 대조군에 비해 어떠한 유의한 호중구 유입의 증가도 관찰되지 않았다. 상기 기재된 생체내 면역자극 시험의 결과를 도 11에 나타낸다.

실시예 5: 기도에 국소 투여된 siNA의 작용의 생체내 평가

활성 siNA 구축물의 시험관내 확인 후에, 기도로의 국소 투여 후의 siNA 활성을 다양한 실험실 종에서 평가할 수 있으며, 전형적 예는 아래 요약된 방법을 이용하는 래트이다. 이소플루란 (산소 중 4.5％) 및 아산화질소 (1:3의 비로 전달된 마취제)를 사용하여 간단하게 동물을 마취시키는 동안, siNA, 적절한 다각화(scrambled) 대조군 또는 비히클을 경구를 통과하여 위치한 캐뉼라를 통해 기관에 200 ㎕ 부피로 주사하였다. 물질의 투여를 용이하게 하기 위해, 동물을 반듯이 눕히고, 인후 위에 위치한 냉각된 광원을 통한 기도의 가시화를 용이하게 하기 위해 대략 45도 각도로 투약 테이블 상에 위치시켰다. 다르게는, 마취된 동물에게 피펫을 통해 비강내 투여하였다 (콧구멍 하나 당 투여 부피 25). 다른 연구에서, 의식있는 설치류를 원형 퍼스펙스(Perspex) 챔버에 위치시키고, 20분 이상 동안 분무된 시험 물질의 에어로졸에 노출시켰다. 각각의 투약 절차가 완료되었을 때, 동물을 표준 보유용 케이지로 돌려보내고, 음식 및 물에 자유로운 접근을 허용하였다. 이어서, 동물 군 (전형적으로, n = 4-6)을 투여후 설정된 간격에서 펜토바르비탈의 복강내 주사에 의해 인도적으로 안락사시켰다. 기도 세포 및 조직의 샘플을 바로 분리하여, 후속 mRNA 추출 및 분석을 위해 트리졸 또는 RNAlater에 위치시켰다. 일부 연구에서, 기도 조직을 후속 조직학 분석을 위해 4％ 파라포름알데히드에 고정하였다. 다른 실험에서, 기도는 침윤 백혈구 집단 및/또는 시토카인/매개자 내용물의 분석을 위해 세척하였다. RNA 추출을 표준 방법을 이용하여 수행하고, QRT-PCR을 이용하여 활성 siRNA 및 대조군 siRNA로 처치된 동물 사이에 관심 표적 mRNA의 발현을 정량하고, 표적 녹다운이 달성되는지 여부를 결정하였다. 일부 경우에, mRNA 발현 수준을 하우스키핑 유전자, GAPDH 또는 상피 특이적 마커, E-카드헤린에 관하여 정상화하였다.

물질의 제조

제제화되지 않은 siNA 및 다각화 대조군의 용액을 포스페이트-완충 염수에서 제조하였다. 소정 범위의 제제화된 물질을 또한 사용할 수 있으며, 각각의 경우에 siNA의 효과는 동등한 부피의 다각화 대조군의 효과와 비교하였다.

실시예 6: 나노입자 캡슐화된 siNA/담체 제제의 제조

일반적인 LNP 제조

0.9 mg/mL의 농도로 siNA 및/또는 담체 분자를 25 mM 시트레이트 완충액 (pH 4.0)에 용해시켜 siNA 나노입자 용액을 제조하였다. 지질 용액은 약 15 mg/mL의 농도로 무수 에탄올에 양이온성 지질 (예를 들어, CLinDMA 또는 DOBMA, 표 13의 제제에 대한 구조 및 비율 참조), DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-DMG (표 13에 나타낸 비율)의 혼합물을 용해시켜 제조하였다. 질소 대 포스페이트 비율은 대략 3:1이다.

동일한 부피의 siNA/담체 및 지질 용액을 동일한 유속의 두 FPLC 펌프로 혼합 T 커넥터에 전달하였다. 백 압력 밸브를 사용하여 원하는 입자 크기로 조정하였다. 생성된 우유빛 혼합물을 멸균 유리 병에 수집하였다. 이어서, 이 혼합물을 동일한 부피의 시트레이트 완충액으로 서서히 희석하고, 이온-교환 막을 통해 여과하여 혼합물에서 임의의 유리 siNA/담체를 제거하였다. 시트레이트 완충액 (pH 4.0)에 대한 한외여과를 이용하여 에탄올을 제거하고 (ALCO 스크리닝으로부터의 시험 스틱), PBS (pH 7.4)에 대한 한외여과를 이용하여 완충액을 교체하였다. 최종 LNP는 원하는 부피로 농축하여 수득하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과하였다. 수득한 LNP는 입자 크기, 제타 전위, 알콜 내용물, 전체 지질 내용물, 캡슐화된 핵산, 및 전체 핵산 농도로 특성화된다.

LNP 제조 과정

비-제한적 예에서, LNP-086 siNA/담체 제제를 다음과 같이 대량으로 제조하였다. 과정은 (1) 지질 용액을 제조하는 것; (2) siNA/담체 용액을 제조하는 것; (3) 혼합/입자 형성; (4) 인큐베이션; (5) 희석; (6) 한외여과 및 농축으로 이루어진다.

1. 지질 용액의 제조

3-목 2 L 둥근 바닥 플라스크, 콘덴서, 측정 실린더 및 2개의 10 L 원추형 유리 용기를 탈피로겐화하였다. 지질을 실온으로 가온하였다. 3-목 둥근 바닥 플라스크에 피펫으로 CLinDMA 50.44 g을 전달하고, DSPC 43.32 g, 콜레스테롤 5.32 g, PEG-DMG 6.96 g 및 리놀레일 알콜 2.64 g을 첨가하였다. 혼합물에 에탄올 1 L를 첨가하였다. 둥근 바닥 플라스크를 J-CHEM 공정 제어기에 연결된 가열 맨틀에 위치시켰다. 지질 현탁액을 교반 막대 및 상부 콘덴서로 아르곤하에 교반하였다. 열전대 프로브를 실링된 어댑터를 갖는 둥근 바닥 플라스크의 하나의 목을 통해 현탁액에 유입하였다. 현탁액을 맑아질 때까지 30℃에서 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 원추형 유리 용기에 전달하고, 마개로 실링하였다.

2. siNA/담체 용액의 제조

멸균 용기, 예컨대 코닝(Corning) 보관용 병으로 3.6 g을 siNA-1 분말의 물 보정 인자 (대략 1.2)와 곱하여 칭량하였다. siNA를 탈피로겐화 5 L 유리 용기에 전달하였다. 칭량 용기를 시트레이트 완충액 (25 mM, pH 4.0, 및 100 mM NaCl)으로 3회 세정하고, 세정물을 5 L 용기에 넣고, QS를 시트레이트 완충액으로 세정하고 4 L 용기에 넣었다. siNA 용액의 농도는 하기 절차를 이용하여 UV 분광계로 결정하였다. 20 ㎕를 용액에서 분리하고, 1000 ㎕로 50배 희석하고, 시트레이트 완충액으로 블랭킹한 후에 A260 nm에서 UV 판독을 기록하였다. 이를 반복하였다. 2가지 샘플에 대한 판독값이 일정하면, 평균을 구하고, 농도를 siNA의 소광 계수에 기초하여 계산하였다. 최종 농도가 0.90 ± 0.01 mg/mL 범위 밖에 있다면, 보다 많은 siNA/담체 분말을 첨가하거나 또는 보다 많은 시트레이트 완충액을 첨가하여 농도를 조정하였다. 이 과정을 제2 siNA, siNA-2에 대해 반복하였다. 탈피로겐화 10 L 유리 용기로, 각각의 0.9 mg/mL siNA 용액 4 L를 전달하였다.

다르게는, siNA/담체 용액이 둘 이상의 siNA 이중나선 및/또는 담체의 칵테일 대신 단일 siNA 이중나선 또는 담체를 포함한다면, siNA/담체를 25 mM 시트레이트 완충액 (pH 4.0, 100 mM NaCl)에 용해시켜 0.9 mg/mL의 최종 농도를 수득하였다.

이어서, 지질/에탄올 용액을 마스터 플렉스(Master Flex) 연동 펌프 모델 7520-40을 사용하여 팔 아크로팩(Pall Acropak) 20 0.8/0.2 ㎛ 멸균 필터 PN 12203을 통해 탈피로겐화 유리 용기로 멸균/여과하여 캡슐화 과정을 위해 멸균 출발 물질을 제공하였다. 여과 과정은 20 cm²의 막 구역을 갖는 80 mL 스케일에서 진행하였다. 유속은 280 mL/분이다. 이 과정은 튜빙 직경 및 여과 구역을 증가시켜 측량할 수 있다.

3. 입자 형성 - 혼합 단계

AKTA P900 펌프를 켜고, 1 L 유리 용기로 1 N NaOH 1000 mL를 넣고 1 L 유리 용기로 70％ 에탄올 1000 mL를 넣고, 각각의 용기에 가압 덮개가 있는 펌프를 부착시켜 위생처리하였다. 2000 mL 유리 용기를 펌프 출구 아래에 위치시키고, 시스템을 10 psi에서 아르곤 플러슁하면서 40분 시간 기간 동안 유속을 40 mL/분으로 설정하였다. 위생처리가 완료되었을 때, 가스를 끄고, 펌프를 사용 준비될 때까지 용액에 보관하였다. 사용 전에, 에탄올 200 mL 및 멸균 시트레이트 완충액 200 mL를 사용하여 펌프 흐름을 검증하였다.

AKTA 펌프에 멸균 지질/에탄올 용액, 멸균 siNA/담체 또는 siNA/담체 칵테일/시트레이트 완충액 용액 및 탈피로겐화 수용 용기 (2x 배치 크기) (덮개 포함)를 부착시켰다. 가스를 켜고, 압력을 혼합 동안 5 내지 10 psi에서 유지시켰다.

4. 인큐베이션

22 ± 2시간 인큐베이션 동안 혼합한 후에 용액을 유지시켰다. 인큐베이션을 실온 (20 내지 25℃)에서 수행하고, 제조 중인 용액을 빛으로부터 보호하였다.

5. 희석

지질 siNA 용액을 이중 헤드 연동 펌프, 마스터 플렉스 연동 펌프, 모델 7520-40 (동일한 길이의 튜빙 및 티형 접속 및 360 mL/분의 유속으로 설정됨)을 사용하여 동일한 부피의 시트레이트 완충액으로 희석하였다.

6. 한외여과 및 농축

한외여과 과정은 정기 과정이고, 유속을 주의깊게 모니터링하여야 한다. 이는 두 단계 과정으로; 첫번째는 희석 물질을 32 리터로부터 3600 mL로 및 대략 2 mg/mL의 농도로 만드는 농축 단계이다.

제1 단계에서, 설치된 한외여과 막 GE PN UFP-100-C-35A를 갖는 플렉스스탠드(Flexstand)를 콰트로플로우(quatroflow) 펌프에 부착시켰다. WFI 200 mL를 저장소에 첨가한 후에 0.5 N 수산화나트륨 3 리터를 첨가하고, 이를 이어서 농축물을 통해 플러슁하여 폐기시켰다. 이 과정을 3회 반복하였다. 이어서, WFI 3 L를 시스템을 통해 2회 플러슁한 후에 시트레이트 완충액 3 L를 플러슁하였다. 이어서, 펌프를 배수시켰다.

희석된 LNP 용액을 4 리터 마크로 저장소에 넣었다. 펌프를 켜고, 펌프 속도를 투과 유속이 300 mL/분이 되도록 조정하고, 액체 수준은 저장소에서 4 L로 일정하였다. 모든 희석된 LNP 용액이 저장소에 전달되었을 때 펌프를 멈추었다. 희석된 LNP 용액을 필요에 따라 펌프 속도를 조정함으로써 240분 내에 3600 mL로 농축시켰다.

제2 단계는 에탄올 시트레이트 완충액을 인산염 완충 염수로 교체하는 정용여과 단계이다. 정용여과 단계는 3시간이 소요되고, 다시 유속을 주의깊게 모니터링하여야 한다. 이 단계 동안, 에탄올 농도를 헤드 공간 GC에 의해 모니터링하였다. 3시간 후에 (20 정용여과 부피), 제2 농축을 수행하여 용액을 대략 6 mg/mL로 또는 1.2 리터의 부피로 농축시켰다. 이 물질을 탈피로겐화 유리 용기에 수집하였다. 시스템을 높은 유속에서 PBS 400 mL로 세정하고, 투과 라인을 닫았다. 이 물질을 수집하고, 제1 수집물에 첨가하였다. 이 지점에서 예상되는 농도는 4.5 mg/mL이다. 농도 및 부피를 결정하였다.

연동 펌프의 공급 튜빙을 PBS (0.05 ㎛ 여과) 72 L를 함유하는 용기에 넣고, 유속을 처음에 저장소에 3600 mL의 등체적이 유지되도록 조정하고, 이어서 400 mL/분으로 증가시켰다. LNP 용액을 180분 동안 PBS (20 부피)로 정용여과하였다.

LNP 용액을 1.2 L 마크로 농축시키고, 탈피로겐화 2 L 눈금 실린더에 수집하였다. PBS 400 mL를 저장소에 첨가하고, 펌프를 2분 동안 재순환시켰다. 세정물을 수집하고, 눈금 실린더에서 수집된 LNP 용액에 첨가하였다.

수득한 LNP는 입자 크기, 제타 전위, 알콜 내용물, 전체 지질 내용물, 캡슐화된 핵산, 및 전체 핵산 농도로 특성화하였다.

당업자는 본 발명이 목적을 수행하고 언급된 목표 및 장점 뿐만 아니라 그의 고유의 것을 수득하기 위해 잘 변경된다는 것을 쉽게 알 것이다. 현재 바람직한 실시양태를 대표하는 것으로서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 예시적이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 취지 내에 포함되는 본 발명의 변화 및 다른 용도가 당업자에게 발생할 것이고, 이들은 특허청구범위에 의해 규정된다.

SEQUENCE LISTING <110> Shah, Jyoti Strapps, Walter Pickering, Victoria <120> RNA Interference Mediated Inhibition of the Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA) <130> SIRMIS84WPCT <160> 160 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 cagugacugu cacucgaga 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 cgcaucugau cuguaguca 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 cucagcacgu accucuaua 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 cucagucagu gugaccgca 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 ggaacaaccg gaaggugua 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 cggaagauca agaaauaca 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 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described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (5)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (10)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stands for any nucleotide 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2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stands for any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> optional phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> optional 3'-3 attached terminal glyceryl moiety or optional abasic, inverted abasic, inverted nucleotide or other terminal cap <400> 138 ugacuacaga ucagaugcgn n 21 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide unmodified or modified as described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> optional abasic, inverted abasic, inverted nucleotide or other terminal cap <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (5)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (10)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stands for any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> optional abasic, inverted abasic, inverted nucleotide or other terminal cap <400> 139 cgcaucugau cuguagucan n 21 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide unmodified or modified as described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stands for any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> optional phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> optional 3'-3 attached terminal glyceryl moiety or optional abasic, inverted abasic, inverted nucleotide or other terminal cap <400> 140 ugacuacaga ucagaugcgn n 21 <210> 141 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide unmodified or modified as described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> optional abasic, inverted abasic, inverted nucleotide or other terminal cap <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (5)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (10)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (17)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stands for any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stands for any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> optional abasic, inverted abasic, inverted nucleotide or other terminal cap <400> 141 cgcaucugau cuguagucan n 21 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> ribonucleotide unmodified or modified as described for this sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> 2'-deoxy-2'-fluoro or 2'-O-trifluoromethyl <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> 2'-deoxy <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> n stands for any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> optional phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> optional 3'-3 attached terminal glyceryl moiety or optional abasic, inverted abasic, inverted nucleotide or other terminal cap <400> 142 ugacuacaga ucagaugcgn n 21 <210> 143 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 143 ugacuacaga ucagaugcg 19 <210> 144 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 144 ugcggucaca cugacugag 19 <210> 145 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 145 uacaccuucc gguuguucc 19 <210> 146 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 146 uguauuucuu gaucuuccg 19 <210> 147 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 147 uaucugacug aggacaaug 19 <210> 148 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 148 uauuucccag uuguauguc 19 <210> 149 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 149 ugcggcacga gaaauuggc 19 <210> 150 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 150 gaugucuggg cauugccag 19 <210> 151 <211> 3249 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 151 caagcuuagc cuggccggga aacgggaggc guggaggccg ggagcagccc ccggggucau 60 cgcccugcca ccgccgcccg auugcuuuag cuuggaaauu ccggagcuga agcggccagc 120 gagggaggau gacccucucg gcccgggcac ccugucaguc cggaaauaac ugcagcauuu 180 guuccggagg ggaaggcgcg agguuuccgg gaaagcagca ccgccccuug gcccccaggu 240 ggcuagcgcu auaaaggauc acgcgcccca gucgacgcug agcuccucug cuacucagag 300 uugcaaccuc agccucgcua uggcucccag cagcccccgg cccgcgcugc ccgcacuccu 360 gguccugcuc ggggcucugu ucccaggacc uggcaaugcc cagacaucug ugucccccuc 420 aaaagucauc cugccccggg gaggcuccgu gcuggugaca ugcagcaccu ccugugacca 480 gcccaaguug uugggcauag agaccccguu gccuaaaaag gaguugcucc ugccugggaa 540 caaccggaag guguaugaac ugagcaaugu gcaagaagau agccaaccaa ugugcuauuc 600 aaacugcccu gaugggcagu caacagcuaa aaccuuccuc accguguacu ggacuccaga 660 acggguggaa cuggcacccc uccccucuug gcagccagug ggcaagaacc uuacccuacg 720 cugccaggug gagggugggg caccccgggc caaccucacc guggugcugc uccgugggga 780 gaaggagcug aaacgggagc cagcuguggg ggagcccgcu gaggucacga ccacggugcu 840 ggugaggaga gaucaccaug gagccaauuu cucgugccgc acugaacugg accugcggcc 900 ccaagggcug gagcuguuug agaacaccuc ggcccccuac cagcuccaga ccuuuguccu 960 gccagcgacu cccccacaac uugucagccc ccggguccua gagguggaca cgcaggggac 1020 cguggucugu ucccuggacg ggcuguuccc agucucggag gcccaggucc accuggcacu 1080 gggggaccag agguugaacc ccacagucac cuauggcaac gacuccuucu cggccaaggc 1140 cucagucagu gugaccgcag aggacgaggg cacccagcgg cugacgugug caguaauacu 1200 ggggaaccag agccaggaga cacugcagac agugaccauc uacagcuuuc cggcgcccaa 1260 cgugauucug acgaagccag aggucucaga agggaccgag gugacaguga agugugaggc 1320 ccacccuaga gccaagguga cgcugaaugg gguuccagcc cagccacugg gcccgagggc 1380 ccagcuccug cugaaggcca ccccagagga caacgggcgc agcuucuccu gcucugcaac 1440 ccuggaggug gccggccagc uuauacacaa gaaccagacc cgggagcuuc guguccugua 1500 uggcccccga cuggacgaga gggauugucc gggaaacugg acguggccag aaaauuccca 1560 gcagacucca augugccagg cuugggggaa cccauugccc gagcucaagu gucuaaagga 1620 uggcacuuuc ccacugccca ucggggaauc agugacuguc acucgagauc uugagggcac 1680 cuaccucugu cgggccagga gcacucaagg ggaggucacc cgcaagguga ccgugaaugu 1740 gcucuccccc cgguaugaga uugucaucau cacuguggua gcagccgcag ucauaauggg 1800 cacugcaggc cucagcacgu accucuauaa ccgccagcgg aagaucaaga aauacagacu 1860 acaacaggcc caaaaaggga cccccaugaa accgaacaca caagccacgc cucccugaac 1920 cuaucccggg acagggccuc uuccucggcc uucccauauu gguggcagug gugccacacu 1980 gaacagagug gaagacauau gccaugcagc uacaccuacc ggcccuggga cgccggagga 2040 cagggcauug uccucaguca gauacaacag cauuuggggc caugguaccu gcacaccuaa 2100 aacacuaggc cacgcaucug aucuguaguc acaugacuaa gccaagagga aggagcaaga 2160 cucaagacau gauugaugga uguuaaaguc uagccugaug agaggggaag ugguggggga 2220 gacauagccc caccaugagg acauacaacu gggaaauacu gaaacuugcu gccuauuggg 2280 uaugcugagg ccccacagac uuacagaaga aguggcccuc cauagacaug uguagcauca 2340 aaacacaaag gcccacacuu ccugacggau gccagcuugg gcacugcugu cuacugaccc 2400 caacccuuga ugauauguau uuauucauuu guuauuuuac cagcuauuua uugagugucu 2460 uuuauguagg cuaaaugaac auaggucucu ggccucacgg agcucccagu ccuaaucaca 2520 uucaagguca ccagguacag uuguacaggu uguacacugc aggagagugc cuggcaaaaa 2580 gaucaaaugg ggcugggacu ucucauuggc caaccugccu uuccccagaa ggagugauuu 2640 uucuaucggc acaaaagcac uauauggacu gguaaugguu acagguucag agauuaccca 2700 gugaggccuu auuccucccu uccccccaaa acugacaccu uuguuagcca ccuccccacc 2760 cacauacauu ucugccagug uucacaauga cacucagcgg ucaugucugg acaugagugc 2820 ccagggaaua ugcccaagcu augccuuguc cucuuguccu guuugcauuu cacugggagc 2880 uugcacuaug cagcuccagu uuccugcagu gaucaggguc cugcaagcag uggggaaggg 2940 ggccaaggua uuggaggacu cccucccagc uuuggaagcc ucauccgcgu gugugugugu 3000 guguaugugu agacaagcuc ucgcucuguc acccaggcug gagugcagug gugcaaucau 3060 gguucacugc agucuugacc uuuugggcuc aagugauccu cccaccucag ccuccugagu 3120 agcugggacc auaggcucac aacaccacac cuggcaaauu ugauuuuuuu uuuuuuucca 3180 gagacggggu cucgcaacau ugcccagacu uccuuugugu uaguuaauaa agcuuucuca 3240 acugccaaa 3249 <210> 152 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 152 caaggtcatc catgacaact ttg 23 <210> 153 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 153 gggccatcca cagtcttct 19 <210> 154 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 154 accacagtcc atgccatcac tgcca 25 <210> 155 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 155 gctctgcaac cctggaggt 19 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 156 ggccatacag gacacgaagc 20 <210> 157 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 157 ccagcttata cacaagaacc agacccgg 28 <210> 158 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 158 acctaacccc caaatctatg tcaa 24 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 159 tggagaactc gccctctttc 20 <210> 160 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 160 ctcatcgagg agtgcaccga cctg 24

Claims

서로 상보성을 갖는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하며, 여기서 적어도 1개의 가닥이

중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 뉴클레오티드 중 1개 이상이 임의로 화학적으로 변형된 것인, 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제1항에 있어서, 모든 뉴클레오티드가 비변형되는 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제1항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오티드가 화학적으로 변형된 뉴클레오티드인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제3항에 있어서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드가 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제3항에 있어서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드가 2'-데옥시뉴클레오티드인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제3항에 있어서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-알킬 뉴클레오티드인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖는 하기 화학식 A를 포함하는, 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
<화학식 A>

상기 식에서, 상부 가닥은 이중-가닥 핵산 분자의 센스 가닥이고, 하부 가닥은 안티센스 가닥이고; 여기서 안티센스 가닥은 서열 143, 서열 144, 서열 145, 서열 146, 서열 147, 서열 148, 서열 149 또는 서열 150 중 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함하고, 센스 가닥은 안티센스 가닥에 상보성을 갖는 서열을 포함하고;
각각의 N은 독립적으로 비변형되거나 또는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이고;
각각의 B는 존재 또는 부재하는 말단 캡이고;
(N)은 오버행 뉴클레오티드를 나타내고, 이들 각각은 독립적으로 비변형되거나 또는 화학적으로 변형되고;
[N]은 리보뉴클레오티드인 뉴클레오티드를 나타내고;
X1 및 X2는 독립적으로 0 내지 4의 정수이고;
X3은 17 내지 36의 정수이고;
X4는 11 내지 35의 정수이고;
X5는 1 내지 6의 정수이고, 단 X4 및 X5의 합은 17 내지 36이다.
제7항에 있어서,
(a) N_X4 위치의 1개 이상의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 그의 임의의 조합이고;
(b) N_X4 위치의 1개 이상의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 그의 임의의 조합이고;
(c) N_X3 위치의 1개 이상의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 그의 임의의 조합이고;
(d) N_X3 위치의 1개 이상의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 또는 그의 임의의 조합인
이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제7항에 있어서,
(a) N_X4 위치의 각각의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고;
(b) N_X4 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고;
(c) N_X3 위치의 각각의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이고;
(d) N_X3 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드인
이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제7항에 있어서,
(a) N_X4 위치의 각각의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드이고;
(b) N_X4 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-O-알킬 뉴클레오티드이고;
(c) N_X3 위치의 각각의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드이고;
(d) N_X3 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시 뉴클레오티드인
이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제7항에 있어서,
(a) N_X4 위치의 각각의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드이고;
(b) N_X4 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-O-알킬 뉴클레오티드이고;
(c) N_X3 위치의 각각의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드이고;
(d) N_X3 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 리보뉴클레오티드인
이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제7항에 있어서,
(a) N_X4 위치의 각각의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드이고;
(b) N_X4 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 리보뉴클레오티드이고;
(c) N_X3 위치의 각각의 피리미딘 뉴클레오티드가 독립적으로 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드이고;
(d) N_X3 위치의 각각의 퓨린 뉴클레오티드가 독립적으로 리보뉴클레오티드인
이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제7항에 있어서, X5가 3인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제7항에 있어서, X1이 2이고, X2가 2인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제7항에 있어서, X5가 3이고, X1이 2이고, X2가 2인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제7항에 있어서, X5 = 1, 2 또는 3이고; 각각의 X1 및 X2 = 1 또는 2이고; X3 = 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30이고; X4 = 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제7항에 있어서, X5 = 1이고; 각각의 X1 및 X2 = 2이고; X3 = 19이고; X4 = 18인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제7항에 있어서, X5 = 2이고; 각각의 X1 및 X2 = 2이고; X3 = 19이고; X4 = 17인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제7항에 있어서, X5가 3이고, X1이 2이고, X2가 2이고, X3이 19이고, X4가 16인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
siNA가 하기의 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.

상기 식에서,
각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;
c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;
u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;
A는 2'-데옥시아데노신이고;
G는 2'-데옥시구아노신이고;
T는 티미딘이고;
G는 구아노신이고;
U는 우리딘이고;
A는 아데노신이고;
A는 2'-O-메틸-아데노신이고;
G는 2'-O-메틸-구아노신이고;
U는 2'-O-메틸-우리딘이고;
뉴클레오티드간 연결부는 화학적으로 변형되거나 또는 비변형된다.
제20항에 있어서, 뉴클레오티드간 연결부가 비변형되는 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
siNA가 하기의 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.

상기 식에서,
각각의 B는 역전된 무염기성 캡이고;
c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;
u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;
A는 2'-데옥시아데노신이고;
G는 2'-데옥시구아노신이고;
T는 티미딘이고;
C는 시티딘이고;
U는 우리딘이고;
G는 구아노신이고;
A는 2'-O-메틸-아데노신이고;
G는 2'-O-메틸-구아노신이고;
U는 2'-O-메틸-우리딘이고;
뉴클레오티드간 연결부는 화학적으로 변형되거나 또는 비변형된다.
제22항에 있어서, 뉴클레오티드간 연결부가 비변형되는 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
siNA가 하기의 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.

상기 식에서,
각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;
c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;
u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;
A는 2'-데옥시아데노신이고;
G는 2'-데옥시구아노신이고;
T는 티미딘이고;
A는 아데노신이고;
U는 우리딘이고;
C는 시티딘이고;
A는 2'-O-메틸-아데노신이고;
G는 2'-O-메틸-구아노신이고;
U는 2'-O-메틸-우리딘이고;
뉴클레오티드간 연결부는 화학적으로 변형되거나 또는 비변형된다.
제24항에 있어서, 뉴클레오티드간 연결부가 비변형되는 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
siNA가 하기의 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.

상기 식에서,
각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;
c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;
u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;
A는 2'-데옥시아데노신이고;
G는 2'-데옥시구아노신이고;
T는 티미딘이고;
G는 구아노신이고;
U는 우리딘이고;
A는 2'-O-메틸-아데노신이고;
G는 2'-O-메틸-구아노신이고;
U는 2'-O-메틸-우리딘이고;
뉴클레오티드간 연결부는 화학적으로 변형되거나 또는 비변형된다.
제26항에 있어서, 뉴클레오티드간 연결부가 비변형되는 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
siNA가 하기의 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.

상기 식에서,
각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;
c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;
u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;
A는 2'-데옥시아데노신이고;
G는 2'-데옥시구아노신이고;
T는 티미딘이고;
A는 아데노신이고;
U는 우리딘이고;
A는 2'-O-메틸-아데노신이고;
G는 2'-O-메틸-구아노신이고;
U는 2'-O-메틸-우리딘이고;
뉴클레오티드간 연결부는 화학적으로 변형되거나 또는 비변형된다.
제28항에 있어서, 뉴클레오티드간 연결부가 비변형되는 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
siNA가 하기의 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.

상기 식에서,
각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;
c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;
u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;
A는 2'-데옥시아데노신이고;
G는 2'-데옥시구아노신이고;
T는 티미딘이고;
A는 아데노신이고;
U는 우리딘이고;
A는 2'-O-메틸-아데노신이고;
G는 2'-O-메틸-구아노신이고;
U는 2'-O-메틸-우리딘이고;
뉴클레오티드간 연결부는 화학적으로 변형되거나 또는 비변형된다.
제30항에 있어서, 뉴클레오티드간 연결부가 비변형되는 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
siNA가 하기의 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.

상기 식에서,
각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;
c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;
u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;
A는 2'-데옥시아데노신이고;
G는 2'-데옥시구아노신이고;
T는 티미딘이고;
C는 시티딘이고;
G는 구아노신이고;
U는 우리딘이고;
A는 2'-O-메틸-아데노신이고;
G는 2'-O-메틸-구아노신이고;
U는 2'-O-메틸-우리딘이고;
뉴클레오티드간 연결부는 화학적으로 변형되거나 또는 비변형된다.
제32항에 있어서, 뉴클레오티드간 연결부가 비변형되는 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
siNA가 하기의 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.

상기 식에서,
각각의 B는 역전된 무염기성 캡 모이어티이고;
c는 2'-데옥시-2'플루오로시티딘이고;
u는 2'-데옥시-2'플루오로우리딘이고;
A는 2'-데옥시아데노신이고;
G는 2'-데옥시구아노신이고;
T는 티미딘이고;
A는 아데노신이고;
U는 우리딘이고;
G는 구아노신이고;
A는 2'-O-메틸-아데노신이고;
G는 2'-O-메틸-구아노신이고;
U는 2'-O-메틸-우리딘이고;
뉴클레오티드간 연결부는 화학적으로 변형되거나 또는 비변형된다.
제34항에 있어서, 뉴클레오티드간 연결부가 비변형되는 것인 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자.
제1항, 제7항, 제20항, 제22항, 제24항, 제26항, 제28항, 제30항, 제32항 및 제34항 중 어느 한 항의 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA)을 제약상 허용되는 담체 또는 희석제 중에 포함하는 제약 조성물.
제1항, 제7항, 제20항, 제22항, 제24항, 제26항, 제28항, 제30항, 제32항 및 제34항 중 어느 한 항의 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 에어로졸 제제 중에 포함하는 제약 조성물.
ICAM-1의 작용에 의해, 또는 그의 작용의 손실에 의해 매개되는 상태를 앓고 있는 인간 대상체에게 유효량의 제7항의 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 치료 방법.
ICAM-1의 작용에 의해, 또는 그의 작용의 손실에 의해 매개되는 상태를 앓고 있는 인간 대상체에게 유효량의 제20항, 제22항, 제24항, 제26항, 제28항, 제30항, 제32항 및 제34항 중 어느 한 항의 이중-가닥 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체의 치료 방법.
제38항에 있어서, 상태가 호흡기 질환인 방법.
제39항에 있어서, 상태가 호흡기 질환인 방법.
제40항에 있어서, 호흡기 질환이 COPD, 낭성 섬유증, 천식, 호산구성 기침, 기관지염, 사르코이드증, 폐섬유증, 비염 및 부비동염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제41항에 있어서, 호흡기 질환이 COPD, 낭성 섬유증, 천식, 호산구성 기침, 기관지염, 사르코이드증, 폐섬유증, 비염 및 부비동염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.