CN102439152A - 使用短干扰核酸（siNA）的RNA干扰介导的细胞间粘附分子1（ICAM-1）基因表达的抑制 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于研究、诊断和治疗响应ICAM-1基因表达和/或活性调节和/或调节ICAM-1基因表达途径的性状、疾病和病状的化合物、组合物和方法。具体而言，本发明涉及能够介导针对ICAM-1基因表达的RNA干扰（RNAi）或介导针对ICAM-1基因表达的RNA干扰（RNAi）的双链核酸分子，包括小核酸分子，例如短干扰核酸（siNA）、短干扰RNA（siRNA）、双链RNA（dsRNA）、微小RNA（miRNA）和短发夹RNA（shRNA）分子。
Description
序列表
本申请要求于2009年3月27日提交的美国临时申请号61/164,314的利益。上文列出的申请包括附图在此整体引入本文作为参考。
序列表
依照37 CFR §1.52（e）（5），经由EFS提交的序列表引入本文作为参考。经由EFS提交的序列表文本文件包含于2010年3月19日创建的文件"SequenceListing84WPCT"，其大小为113,421字节。
发明背景
细胞间粘附分子1（ICAM-1，CD54）参与白细胞粘附介导的炎性功能。它属于细胞粘附分子的免疫球蛋白超家族。人ICAM-1具有五个“Ig-样”胞外结构域，一个跨膜结构域和一个短C-末端胞质结构域。ICAM-1在白细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞的表面上表达。ICAM-1表达在炎症位点上调。
淋巴细胞功能相关-1（LFA-1，CD11a/CD18）抗原是ICAM-1的配体。LFA-1是细胞-表面受体整联蛋白家族的成员。LFA-1在所有白细胞的表面上表达并且对于它们的抗原-特定应答和归巢至关重要。LFA-1介导基于溶细胞偶联物形成的白细胞粘附反应、辅助T-细胞相互作用和由天然杀伤细胞和粒细胞导致的抗体-依赖性杀伤。LFA-1/ICAM-1相互作用对于淋巴细胞粘附到血管内皮以及作为正常免疫应答的一部分它们后续外渗到周围组织是重要的。LFA-1和ICAM-1的相互作用也涉及炎性病理学和自发免疫疾病。在与干燥综合征（Sjogren syndrome）相关具有干眼的患者中，在人结膜上皮中ICAM-1的表达上调。
哮喘恶化是常见的，并且与哮喘相关的主要发病率、死亡率和保健费用与恶化相关。大多数恶化与病毒感染相关，虽然恶化也可由非典型的细菌感染或暴露于过敏原或其它环境刺激引起。恶化的特征在于气道炎症，其可在类型上不同，取决于在来源上主要是感染性还是过敏性。大约80%的恶化与呼吸道病毒感染相关，其中鼻病毒感染引起所有恶化的大约50%。
除了它引发细胞间粘附和信号转导的正常功能，ICAM-1还被人病原体使用并且是人鼻病毒（HRV)主要组的细胞受体。HRV组成小核糖核酸病毒科（picornaviridae）鼻病毒属（rhinovirus）的大部分。存在超过100种独特血清型的HRV，并且这已阻碍了有效疫苗的发展。基于它们进入细胞使用的细胞受体，HRV血清型可分为两组。大约10%的 HRV血清型组成次要受体组并利用低密度脂蛋白受体（LDLr）进入细胞。其余90%的HRV血清型包含主要受体组并利用人细胞间粘附分子1（ICAM-1)。人ICAM 1的两个氨基-末端Ig-样结构域结合病毒衣壳的二十面体五倍轴周围的“峡谷”（“canyon”） 。
人鼻病毒引起大约三分之二的上呼吸道感染（常见感冒）。最近更多的研究已确立了鼻病毒也可在下呼吸道（LRT)中复制。哮喘受试者比非哮喘受试者具有严重得多的鼻病毒 LRT 疾病，具有增加的支气管超应答和降低的肺功能。HRV可引起哮喘恶化的确切机理不清楚。在哮喘患者中，ICAM-1的表达上调，并且这可能增加哮喘患者在上呼吸道和下呼吸道中对 HRV感染的易感性。感染HRV的哮喘患者的LRT症状的严重性已归因于哮喘患者中TH2的优势和增强的Th2辅助应答。
在上呼吸道中HRV感染的上皮细胞引起可介导下呼吸道症状的多种促炎细胞因子的产生。
用可溶ICAM-1或ICAM-1特异性抗体靶向ICAM-1已显示在体外和体内模型中抑制HRV感染。鼻病毒感染与哮喘恶化的强烈相关表明预防或治疗鼻病毒感染可能是预防哮喘恶化的有效途径。因此，存在对治疗鼻病毒感染的其他治疗法的需要。
通过RNA干扰（下文“RNAi”）改变基因表达具体而言ICAM-1基因表达是用于满足这个需要的一种方法。RNAi通过短双链RNA（“dsRNA”）分子诱导。短dsRNA分子称为“短干扰RNA”或“siRNA”或“RNAi抑制剂”，沉默与siRNA共享序列同源性的信使RNAs（“mRNAs”）的表达。这可以经由通过包含siRNA的内切核酸酶复合物，通常称为RNA诱导性沉默复合物（RISC）介导的mRNA切割发生。靶RNA的切割一般发生于与siRNA双链体的引导序列互补的区域中部（Elbashir等人，2001，Genes Dev.，15，188）。此外，RNA干扰还可以涉及小RNA（例如微小RNA或miRNA）介导的基因沉默，推测通过调节染色质结构且从而阻止靶基因序列的转录的细胞机制（参见例如，Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等人，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science，297，2232-2237）。
发明概述
本发明提供了使用小核酸分子通过RNA干扰（RNAi）用于调节ICAM-1基因表达的化合物、组合物和方法，所述ICAM-1基因特别是与炎性和/或呼吸性疾病或状况的发展或维持相关的那些ICAM-1基因。
特别地，本发明的特征在于小核酸分子，即短干扰核酸（siNA）分子，包括但不限于短干扰RNA（siRNA）、双链RNA（dsRNA）、微小RNA（miRNA）、短发夹RNA（shRNA）和环状RNA分子，以及用于调节ICAM-1基因和/或涉及ICAM-1基因表达和/或活性的途径的其他基因表达的方法。
在一个方面，本发明提供了包括彼此具有互补性的第一条链和第二条链的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中至少一条链包括下述的至少15个核苷酸：
其中一个或多个核苷酸是任选化学修饰的。
在本发明的一些实施方案中，所有核苷酸都是未修饰的。在其他实施方案中，siNA分子的一条或两条链中的一个或多个核苷酸位置（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个修饰的核苷酸）是修饰的。修饰包括核酸糖修饰、碱基修饰、主链（核苷酸间键）修饰、非核苷酸修饰和/或其任何组合。在一些情况下，嘌呤和嘧啶核苷酸是差别修饰的。例如，嘌呤和嘧啶核苷酸在2'-糖位置上可以是差别修饰的（即，至少一个嘌呤具有与在2'-糖位置上在相同或不同链中的至少一个嘧啶不同的修饰）。在其他情况下，至少一个修饰的核苷酸是2'-脱氧-2'-氟核苷酸、2'-脱氧核苷酸或2'-O-烷基核苷酸。
在一些实施方案中，siNA分子具有在一条或两条链上的1、2、3或4个核苷酸的3'突出端。在其他实施方案中，siNA缺乏突出端（即，具有平端）。优选地，siNA分子具有在有义和反义链上的2个核苷酸的3'突出端。突出端可以是修饰或未修饰的。在突出端中的修饰核苷酸的例子包括但不限于2'-O-烷基核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸或2'-脱氧核苷酸。反义链中的突出端核苷酸可以包括与ICAM-1靶序列中的核苷酸互补的核苷酸。同样地，有义链中的突出端可以包括在ICAM-1靶序列中的核苷酸。在某些情况下，本发明的siNA分子具有其为2'-O-烷基核苷酸的在反义链上的2个3'突出端核苷酸，和其为2'-脱氧核苷酸的在有义链上的2个3'突出端核苷酸。
在某些实施方案中，siNA分子具有帽（在本文中也称为“末端帽”）。帽可以存在于5'-末端（5'-帽）或3'-末端（3'-帽）处，或可以存在于2个末端上，例如在siNA的有义（引导）链的5'和3'末端处。
在某些实施方案中，提供了双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述分子具有有义链和反义链且包括式（A）：
其中，所述上部链是所述双链核酸分子的有义链，并且所述下部链是所述双链核酸分子的反义链；其中所述反义链包括SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO: 149或SEQ ID NO：150的至少15个核苷酸，并且所述有义链包括与所述反义链具有互补性的序列；
每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；
每个B是存在或不存在的末端帽；
（N）代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰或化学修饰的；
[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；
X1和X2独立地是0 – 4的整数；
X3是17 – 36的整数；
X4是11 – 35的整数；和
X5是1 – 6的整数，条件是X4和X5的总和是17-36。
在一个实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）；其中
（a）NX4位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；
（b）NX4位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；
（c）NX3位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；和
（d）NX3位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合。
在一个实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）；其中
（a）NX4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸或核糖核苷酸；
（b）NX4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸或核糖核苷酸；
（c）NX3位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸或核糖核苷酸；和
（d）NX3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸或核糖核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）；其中
（a）NX4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；
（b）NX4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-O-烷基核苷酸；
（c）NX3位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；和
（d）NX3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）；其中
（a）NX4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；
（b）NX4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-O-烷基核苷酸；
（c）NX3位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；和
（d）NX3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是核糖核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）；其中
（a）NX4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；
（b）NX4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是核糖核苷酸；
（c）NX3位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；和
（d）NX3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是核糖核苷酸。
在另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
G是鸟苷；
U是尿苷；
A是腺苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
C是胞苷；
U是尿苷；
G是鸟苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
A是腺苷；
U是尿苷；
C是胞苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
G是鸟苷；
U是尿苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
A是腺苷；
U是尿苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
A是腺苷；
U是尿苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在还另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
C是胞苷；
G是鸟苷；
U是尿苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在还另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
A是腺苷；
U是尿苷；
G是鸟苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
本发明进一步提供了药物组合物，其包括本文描述的双链核酸分子和任选地药学上可接受的载体。
药物组合物的施用可以通过已知方法执行，其中所述核酸在体外或体内引入所需靶细胞内。
用于将本发明的核酸分子引入细胞、组织和生物内的常用技术包括各种载体系统、试剂和载体的使用。适合于在本发明中使用的此类载体系统的非限制性例子包括核酸-脂质颗粒、脂质纳米颗粒（LNP）、脂质体、lipoplexes、胶粒、病毒体（virosomes）、病毒样颗粒（VLP）、核酸复合物及其混合物。
药物组合物可以以气溶胶、分散体、溶液（例如可注射溶液）、乳膏、软膏、片剂、粉末、悬浮液等的形式。这些组合物可以以任何合适的方式施用，例如经口、舌下、经颊、肠胃外、经鼻或局部。在一些实施方案中，组合物是喷雾化的且经由吸入递送。
本发明的分子和药物组合物具有在广泛范围的治疗应用上的效用，相应地本发明的另一个方面涉及本发明的化合物和药物组合物在治疗受试者中的用途。本发明从而提供了用于治疗患有状况的受试者例如人的方法，所述状况通过ICAM-1的作用或通过ICAM-1作用的丧失介导，其中所述方法包括给所述受试者施用有效量的本发明的双链短干扰核酸（siNA）分子。在某些实施方案中，状况是呼吸性疾病，例如但不限于COPD、囊性纤维化、哮喘、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、窦炎。
本发明的这些及其他方面在参考下述详述和附图后将是显而易见的。为此，说明书自始至终引用专利、专利申请及其他文件，以描述且更具体而言阐述本发明的各个方面。本文引用的这些参考文献各自包括附图在此整体引入作为参考。
附图简述
图1显示了涉及RNAi的靶RNA降解的非限制性被提议的机制代表。通过依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRP）由外来单链RNA产生的双链RNA（dsRNA）激活切酶（DICER），所述切酶依次产生siNA双链体，所述外来单链RNA例如病毒、转座子或其他外源RNA。可替代地，合成或表达的siNA可以通过合适的方法直接引入细胞内。形成识别靶RNA的活性siNA复合物，从而导致通过RISC内切核酸酶复合物降解靶RNA或导致通过依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRP）合成另外的RNA，其可以激活切酶且导致另外的siNA分子，从而扩大RNAi应答。
图2A - F显示了本发明的化学修饰的siNA构建体的非限制性例子。在该图中，N代表任何核苷酸（腺苷、鸟苷、胞嘧啶、尿苷或任选地胸苷，例如胸苷可以在由圆括号指定的突出端区域（N N）中被取代。显示了关于siNA构建体的有义和反义链的各种修饰。（N N）核苷酸位置可以如本文所描述的进行化学修饰（例如，2'-O-甲基，2'-脱氧-2'-氟等）且可以衍生自或不衍生自相应的靶核酸序列（参见例如图4C）。此外，尽管在图上未描绘，但图2中显示的序列可以任选包括在来自有义链的5'-末端的第9位，或通过从引导链的5'-末端计数11个核苷酸位置基于引导链的5'-末端的第11位处的核糖核苷酸（参见图4C）。构建体A-F的反义链包含与本发明的任何靶核酸序列互补的序列。此外，当对于图2 A-F中显示的任何构建体在反义链的3'-末端处存在甘油基部分（L）时，经修饰的核苷酸间键是任选的。
图2A：有义链包含21个核苷酸，其中2个末端3'-核苷酸任选是碱基配对的且其中存在的所有核苷酸都是核糖核苷酸，除了（N N）核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。反义链包含21个核苷酸，任选具有3'-末端甘油基部分，其中2个末端3'-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中存在的所有核苷酸都是核糖核苷酸，除了（N N）核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酰乙酸酯、硫代膦酰乙酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的（N N）核苷酸连接。
图2B：有义链包含21个核苷酸，其中2个末端3'-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2'脱氧-2'-氟经修饰的核苷酸，且可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2'-O-甲基经修饰的核苷酸，除了（N N）核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。反义链包含21个核苷酸，任选具有3'-末端甘油基部分且其中2个末端3'-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2'脱氧-2'-氟经修饰的核苷酸，且可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2'-O-甲基经修饰的核苷酸，除了（N N）核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使有义和反义链中的（N N）核苷酸连接。
图2C：有义链包含具有5'和3'-末端帽的21个核苷酸，其中2个末端3'-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2'-O-甲基或2'脱氧-2'-氟经修饰的核苷酸，除了（N N）核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。反义链包含21个核苷酸，任选具有3'-末端甘油基部分且其中2个末端3'-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2'脱氧-2'-氟经修饰的核苷酸，除了（N N）核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的（N N）核苷酸连接。
图2D：有义链包含具有5'和3'-末端帽的21个核苷酸，其中2个末端3'-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2'-脱氧-2'-氟经修饰的核苷酸，除了（N N）核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰，且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2'-脱氧核苷酸。反义链包含21个核苷酸，任选具有3'-末端甘油基部分且其中2个末端3'-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2'-脱氧-2'-氟经修饰的核苷酸且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2'-O-甲基经修饰的核苷酸，除了（N N）核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的（N N）核苷酸连接。
图2E：有义链包含具有5'和3'-末端帽的21个核苷酸，其中2个末端3'-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2’-脱氧-2'-氟经修饰的核苷酸，除了（N N）核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。反义链包含21个核苷酸，任选具有3'-末端甘油基部分且其中2个末端3'-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2’-脱氧-2'-氟经修饰的核苷酸且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2'-O-甲基经修饰的核苷酸，除了（N N）核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的（N N）核苷酸连接。
图2F：有义链包含具有5'和3'-末端帽的21个核苷酸，其中2个末端3'-核苷酸任选是碱基配对的且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2’-脱氧-2'-氟经修饰的核苷酸，除了（N N）核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰，且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2'-脱氧核苷酸。反义链包含21个核苷酸，任选具有3'-末端甘油基部分且其中2个末端3'-核苷酸任选与靶RNA序列互补，且具有1个3'-末端硫代磷酸酯核苷酸间键，且其中可能存在的所有嘧啶核苷酸都是2’-脱氧-2'-氟经修饰的核苷酸且其中可能存在的所有嘌呤核苷酸都是2'-脱氧核苷酸，除了（N N）核苷酸，其可以包含核糖核苷酸、脱氧核苷酸、通用碱基、或本文描述的其他化学修饰。显示为“s”的经修饰的核苷酸间键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或如本文所描述的其他经修饰的核苷酸间键，任选使反义链中的（N N）核苷酸连接。
图3A - F显示了本发明的具体化学修饰的siNA序列的非限制性例子。A - F将图2A - F中描述的化学修饰应用于示例性ICAM-1 siNA序列。此类化学修饰可以应用于任何ICAM-1序列。此外，尽管在图3上未描绘，但图3中显示的序列可以任选包括在来自有义链的5'-末端的第9位，或通过从引导链的5'-末端计数11个核苷酸位置基于引导链的5'-末端的第11位处的核糖核苷酸（参见图4C）。此外，图3中显示的序列可以任选包括在反义链的5'-末端处最高达约6个位置的末端核糖核苷酸（例如，在反义链的5'-末端处的约1个、2个、3个、4个、5个或6个末端核糖核苷酸）。
图4A - C显示了本发明的不同siNA构建体的非限制性例子。
图4A中显示的例子（构建体1、2和3）具有19个代表性碱基对；然而，本发明的不同实施方案包括本文描述的任何数目的碱基对。括弧区域代表核苷酸突出端，例如，包含长度为约1个、2个、3个或4个核苷酸，优选约2个核苷酸。构建体1和2可以独立地用于RNAi活性。构建体2可以包含多核苷酸或非核苷酸接头，其可以任选被设计为生物可降解的接头。在一个实施方案中，构建体2中显示的环结构可以包含生物可降解的接头，其导致在体内和/或体外形成构建体1。在另一个例子中，构建体3可以用于在相同原理下产生构建体2，其中接头用于在体内和/或体外产生活性siNA构建体2，其可以任选利用另一种生物可降解的接头以在体内和/或体外产生活性siNA构建体1。照这样，siNA构建体的稳定性和/或活性可以基于用于在体内或体外和/或体外使用的siNA构建体的设计进行调节。
图4B中显示的例子代表本发明的双链核酸分子的不同变化，例如微小RNA，其可以包括起因于部分互补性的突出端、凸起、环和茎-环。具有凸起、环和茎-环的此类基序一般是miRNA的特征。凸起、环和茎-环可以起因于任何程度的部分互补性，例如在本发明的双链核酸分子的1条或2条链中约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多核苷酸的错配或凸起。
图4C中显示的例子代表本发明的模型双链核酸分子，其包含具有2个21核苷酸序列、具有二核苷酸3'-突出端的19个碱基对双链体。顶部链（1）代表有义链（过客链），中间链（2）代表反义链（引导链），和下部链（3）代表靶多核苷酸序列。二核苷酸突出端（NN）可以包含衍生自靶多核苷酸的序列。例如，引导链中的3'-（NN）序列可以与靶多核苷酸的5'-[NN]序列互补。此外，过客链的5'-（NN）序列可以包含与靶多核苷酸序列的5'-[NN]序列相同的序列。在其他实施方案中，突出端（NN）不衍生自靶多核苷酸序列，例如其中引导链中的3'-（NN）序列与靶多核苷酸的5'-[NN]序列不互补，且过客链的5'-（NN）序列可以包含与靶多核苷酸序列的5'-[NN]序列不同的序列。在另外的实施方案中，任何（NN）核苷酸是化学修饰的，例如如2'-O-甲基、2'-脱氧-2'-氟和/或本文的其他修饰。此外，过客链可以包含过客链的核糖核苷酸位置N。对于显示的代表性19碱基对21聚体双链体，位置N可以是在来自过客链的3'末端中的9个核苷酸。然而，在具有不同长度的双链体中，位置N基于引导链的5'-末端进行确定，其通过从引导链的5'-末端计数11个核苷酸位置且挑选过客链中相应的碱基配对核苷酸实现。通过Ago2的切割在如箭标指出的位置10和11之间发生。在另外的实施方案中，在基于引导链的5'-末端的位置10和11处存在2个核糖核苷酸，NN，其通过从引导链的5'-末端计数10和11个核苷酸位置且挑选过客链中相应的碱基配对核苷酸实现。
图5显示了不同稳定化学物（1 - 10）的非限制性例子，所述稳定化学物可以例如用于稳定本发明的siNA序列的5'和/或3'-末端，包括（1）[3-3']-反向脱氧核糖；（2）脱氧核糖核苷酸；（3）[5'-3']-3'-脱氧核糖核苷酸；（4）[5'-3']-核糖核苷酸；（5）[5'-3']-3'-O-甲基核糖核苷酸；（6）3'-甘油基；（7）[3'-5']-3'-脱氧核糖核苷酸；（8）[3'-3']-脱氧核糖核苷酸；（9）[5'-2']-脱氧核糖核苷酸；和（10）[5-3']-二脱氧核糖核苷酸。除了该图中指出的经修饰的和未修饰的主链化学外，这些化学物可以与如本文所描述的不同糖和碱基核苷酸修饰组合。
图6显示了用于鉴定本发明化学修饰的siNA构建体的策略的非限制性例子，所述siNA构建体是核酸酶抗性的同时保留介导RNAi活性的能力。基于教导的设计参数将化学修饰引入siNA构建体内（例如，引入2'-修饰、碱基修饰、主链修饰、末端帽修饰等）。经修饰的构建体在合适的系统中进行测试（例如，关于核酸酶抗性的人血清，显示，或关于PK/递送参数的动物模型）。平行地，siNA构建体就RNAi活性例如在细胞培养系统例如萤光素酶报道分子测定）中进行测试。随后鉴定具有特定特征同时维持RNAi活性的引导siNA构建体，且其可以再一次进行进一步修饰和测定。相同方法可以用于鉴定具有改善的药物代谢动力学概况、递送和RNAi活性的siNA-缀合物分子。
图7显示了本发明的磷酸化siNA分子的非限制性例子，包括线性和双链体构建体及其不对称的衍生物。
图8显示了本发明的化学修饰的末端磷酸基的非限制性例子。
图9显示了胆固醇连接的亚磷酰胺的非限制性例子，其可以用于合成本发明的胆固醇缀合的siNA分子。显示了具有与siNA分子的有义链5'-末端连接的胆固醇部分的例子。
图10描述了与核酸链连接的5'和3'反向脱碱基帽的一个实施方案。
图11显示与媒介物（载体，vehicle）对照相比，在滴注siNA后，ICAM-1 siNA对大鼠肺中的嗜中性粒细胞流入的作用。
发明详述
A. 术语和定义
下述术语和定义如在本申请中使用的应用。
术语“脱碱基”指在糖部分的1'位置处缺乏核碱基（nucleobase）或具有氢原子（H）或其他非核碱基化学基团代替核碱基的糖部分，参见例如Adamic等人，美国专利号5,998,203。在一个实施方案中，本发明的脱碱基部分是核糖、脱氧核糖或双脱氧核糖。
如本文所使用的，术语“无环核苷酸”指具有无环核糖的任何核苷酸，例如其中核糖碳/碳或碳/氧键中任何一个独立地或组合地在核苷酸中不存在。
术语“烷基”指饱和或未饱和烃，包括直链、支链、链烯基、炔基基团和环状基团，但排除芳族基团。尽管如此，烷基还指非芳族杂环基团。优选地，烷基具有1个 - 12个碳。更优选地，它是1个 - 7个碳的低级烷基，更优选地1个 - 4个碳。烷基可以是取代或未取代的。当取代时，取代基团优选是羟基、氰基、C1-C4烷氧基、=O、=S、NO2、SH、NH2或NR1R2，其中R1和R2独立地是H或C1-C4烷基。
术语“芳基”指芳族基团，其具有含共轭π电子系统的至少一个环且包括碳环芳基、杂环芳基和联芳基，所有这些可以是任选取代的。芳基的优选取代基是卤素、三卤甲基、羟基、SH、OH、氰基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4炔基、NH2和NR1R2基团，其中R1和R2独立地是H或C1-C4烷基。
术语“烷芳基”指与芳基（如上所述）共价连接的烷基（如上所述）。碳环芳基是其中芳族环上的环原子都是碳原子的基团。碳原子是任选取代的。杂环芳基是在芳族环中具有1个 - 3个杂原子作为环原子和剩余环原子是碳原子的基团。合适的杂原子包括氧、硫和氮，且具有此类杂原子的杂环芳基的例子包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-低级烷基吡咯并、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基等，全部任选取代。优选地，烷基基团是C1-C4烷基基团。
术语“酰胺”指-C（O）-NH-R，其中R是烷基、芳基、烷芳基或氢。
短语“反义区”指与靶核酸序列具有互补性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的反义区可以任选包含与siNA分子的有义区具有互补性的核酸序列。在一个实施方案中，siNA分子的反义区称为反义链或引导链。
“不对称发夹”指包含反义区、可以包含核苷酸或非核苷酸的环部分、和有义区的线性siNA分子，所述有义区包含比反义区更少的核苷酸，其程度至有义区具有足够的互补核苷酸以与反义区碱基配对且形成具有环的双链体。例如，本发明的不对称的发夹siNA分子可以包含具有足够的长度以在细胞或体外系统中介导RNAi的反义区（例如约15个 - 约30个，或约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸）和包含约4个 - 约12个（例如，约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个）核苷酸的环区域、和具有与反义区互补的约3个 - 约25个（例如，约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个）核苷酸的有义区。不对称的发夹siNA分子还可以包含5'-末端磷酸基，其可以是化学修饰的。不对称的发夹siNA分子的环部分可以包含如本文所描述的核苷酸、非核苷酸、接头分子或缀合分子。
术语“生物可降解的”指生物系统中的降解，例如酶促降解或化学降解。
术语“生物可降解的接头”指核酸或非核酸接头分子，其被设计为使一种分子与另一种分子例如生物活性分子与本发明的siNA分子或本发明的siNA分子的有义与反义链连接，并且是生物可降解的。生物可降解的接头被这样设计，使得它的稳定性可以就特定目的进行调节，例如递送给特定组织或细胞类型。基于核酸的生物可降解的接头分子的稳定性可以通过使用各种化学进行调节，例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和化学修饰的核苷酸的组合，所述化学修饰的核苷酸例如2'-O-甲基、2'-氟、2'-氨基、2'-O-氨基、2'-C-烯丙基、2'-O-烯丙基、和其他2'-修饰的或碱基修饰的核苷酸。生物可降解的核酸接头分子可以是二聚物、三聚物、四聚物或更长的核酸分子，例如长度为约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸的寡核苷酸，或可以包含具有基于磷的键例如氨基磷酸酯或磷酸二酯键的单个核苷酸。生物可降解的核酸接头分子还可以包含核酸主链、核酸糖、或核酸碱基修饰。
短语“生物活性分子”指能够在系统中引发或修饰生物应答的化合物或分子，和/或能够调节其他生物活性分子的药物代谢动力学和/或药物动力学的化合物或分子。单独或与其他分子组合的生物活性分子包括siNA分子包括但不限于治疗活性分子，例如抗体、胆固醇、激素、抗病毒剂、肽、蛋白质、化疗剂、小分子、维生素、辅因子、核苷、核苷酸、寡核苷酸、酶促核酸、反义核酸、三链体形成寡核苷酸、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、其他聚酯、.2-5 A嵌合体、siNA、dsRNA、同种异型酶、适体、诱饵及其类似物。
短语“生物系统”指来自生物源的纯化或未纯化形式的材料，所述生物源包括但不限于人或动物，其中所述系统包括对RNAi活性所需的组分。因此，该短语包括例如，细胞、组织、受试者或生物、或其提取物。该术语还包括可以由生物来源重构的材料。
短语“平端”指无突出端核苷酸的双链siNA分子的对称末端或末端。双链siNA分子的2条链在末端处不含突出端核苷酸彼此比对。
术语“帽”在本文中还称为“末端帽”，指化学修饰，其可以在有义或反义链的寡核苷酸的任一5'或3'末端处掺入（参见例如引入本文作为参考的Adamic等人，美国专利号5,998,203）。这些末端修饰保护核酸分子不受外切核酸酶降解，且可以帮助在细胞内的递送和/或定位。帽可以存在于5'-末端处（5'-帽）或3'-末端处（3'-帽），或可以存在于2个末端上。在非限制性例子中，5'-帽包括但不限于，甘油基，反向脱氧脱碱基残基（部分）；4',5'-亚甲基核苷酸；1-（β-D-呋喃型赤藓糖基）核苷酸，4'-硫代核苷酸；碳环核苷酸；1,5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；经修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯键；苏糖型-呋喃型戊糖基核苷酸；无环3',4'-断裂核苷酸；无环3,4-二羟丁基核苷酸；无环3,5-二羟戊基核苷酸；3'-3'-反向核苷酸部分；3'-3'-反向脱碱基部分；3'-2'-反向核苷酸部分；3'-2'-反向脱碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；3'-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨己基磷酸酯；3'-磷酸酯；3'-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥连或非桥连甲基膦酸酯部分。3'-帽的非限制性例子包括但不限于，甘油基，反向脱氧脱碱基残基（部分）；4',5'-亚甲基核苷酸；1-（β-D-呋喃型赤藓糖基）核苷酸，4'-硫代核苷酸；碳环核苷酸；5'-氨基-烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨丙基磷酸酯；6-氨己基磷酸酯；1,2-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1,5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；经修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏糖型-呋喃型戊糖基核苷酸；无环3',4'-断裂核苷酸；3,4-二羟丁基核苷酸；3,5-二羟戊基核苷酸；5'-5'-反向核苷酸部分；5'-5'-反向脱碱基部分；5'-氨基磷酸酯；5'-硫代磷酸酯；1,4-丁二醇磷酸酯；5'-氨基；桥连或非桥连5'-氨基磷酸酯，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，桥连或非桥连甲基膦酸酯和5'-巯基部分（关于更多细节参见Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925；引入本文作为参考）。图5显示了各种帽的某些非限制性例子。
使用“细胞”以其通常的生物学含义使用，并且不指完整多细胞生物，例如具体地不指人类。细胞可以存在于生物内，例如鸟类、植物和哺乳动物，例如人、牛、羊、猿、猴、猪、狗和猫。细胞可以是原核的（例如，细菌细胞）或真核的（例如，哺乳动物或植物细胞）。细胞可以具有体细胞或种系起源、全能或多能、分裂或非分裂。细胞还可以衍生自或可以包含配子或胚胎、干细胞、或完全分化的细胞。
短语“化学修饰”指与天然siRNA或RNA的核苷酸不同的核苷酸的化学结构的任何修饰。术语“化学修饰”包含在糖、碱基或核苷酸间键上的天然siRNA或RNA如本文所描述的或如本领域其他方面已知的添加、置换或修饰。关于与本发明的核酸分子相容的化学修饰的非限制性例子，参见例如USSN 12/064,014。
术语“互补性”指通过传统沃森-克里克或如本文所描述的其他非传统键合类型在一种核酸序列和另一种核酸序列之间形成一个或多个氢键。提及本发明的核酸分子，关于核酸分子与其互补序列的结合自由能足以允许核酸的相关功能得以进行，例如RNAi活性。关于核酸分子的结合自由能的测定是本领域众所周知的（参见，例如，Turner等人，1987，CSH Symp. Quant. Biol. LII第123-133页；Frier等人，1986，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83：9373-9377；Turner等人，1987，J. Am. Chem. Soc. 109：3783-3785）。完全互补意指核酸序列的所有邻接残基将与第二种核酸序列中相同数目的邻接残基氢键合。部分互补性可以包括在核酸分子内的各种错配或非碱基配对的核苷酸（例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多错配或非碱基配对的核苷酸），其可以导致在核酸分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间或在核酸分子的反义链或反义区和相应的靶核酸分子之间产生的凸起、环或突出端。
术语“基因”或短语“靶基因”指包括对于多肽生产必需的部分长度或整个长度的编码序列的核酸（例如DNA或RNA）序列。基因或靶基因还可以编码功能RNA（fRNA）或非编码RNA（ncRNA），例如小时序RNA（stRNA）、微小RNA（miRNA）、小核RNA（snRNA）、短干扰RNA（siRNA）、核仁小RNA（snRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转移RNA（tRNA）及其前体RNA。此类非编码RNA可以充当在调节涉及功能或调节性细胞过程的fRNA或ncRNA活性中siNA介导的RNA干扰的靶核酸分子。导致疾病的异常fRNA或ncRNA活性因此可以通过本发明的siNA分子进行调节。靶向fRNA和ncRNA的siNA分子也可以用于操作或改变受试者、生物或细胞的基因型或表型，其通过干预细胞过程例如遗传印记、转录、翻译或核酸加工（例如，转氨基作用、甲基化等）实现。靶基因可以是衍生自细胞、内源基因、转基因或外源基因的基因，所述外源基因例如在感染其后存在于细胞中的病原体例如病毒的基因。包含靶基因的细胞可以衍生自或包含在任何生物中，例如植物、动物、原生动物、病毒、细菌或真菌。植物的非限制性例子包括单子叶植物、双子叶植物或裸子植物。动物的非限制性例子包括脊椎动物或无脊椎动物。真菌的非限制性例子包括霉菌或酵母。关于综述，参见例如Snyder和Gerstein，2003，Science，300，258-260。
短语“同源序列”指由一个或多个多核苷酸序列例如基因、基因转录物和/或非编码多核苷酸共享的核苷酸序列。例如，同源序列可以是由编码相关但不同的蛋白质的2个或更多基因共享的核苷酸序列，例如基因家族的不同成员，不同的蛋白质表位、不同的蛋白质同工型或完全趋异的基因，例如细胞因子及其相应受体。同源序列可以是由2种或更多非编码多核苷酸共享的核苷酸序列，例如非编码DNA或RNA、调节序列、内含子、和转录控制或调节位点。同源序列还可以包括由超过一种多核苷酸序列共享的序列区。同源性无需是完全同一性（例如，100％），因为部分同源的序列也由本发明预期且在本发明的范围内（例如，至少95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％等）。同一性百分比是2个序列之间的匹配核苷酸数目除以待比较的总长乘以100。
术语“ICAM-1”指细胞间粘附分子基因，或编码ICAM-1蛋白质、ICAM-1肽、ICAM-1多肽、ICAM-1调节多核苷酸（例如ICAM-1 miRNA和siRNA）的基因，突变型ICAM-1基因和ICAM-1基因的剪接变体，以及涉及基因表达和/或活性的ICAM-1途径的其他基因。因此，本文就术语“ICAM-1”而言描述的每个实施方案可应用于由术语“ICAM-1”涵盖的所有蛋白质、肽、多肽和/或多核苷酸分子，如那个术语在本文中定义的。总之，此类基因靶在本文中一般也称为“靶”序列（包括表10）。
短语“改善的RNAi活性”指在体外和/或体内测量的RNAi活性中的增加，其中RNAi活性是siNA介导RNAi的能力和本发明siNA的稳定性的反映。在本发明中，与包含多个核糖核苷酸的全RNA siRNA或siNA相比较，这些活性的产物可以在体外和/或体内得到增加。在一些情况下，siNA分子的活性或稳定性可以是减少的（即，小于10倍），但siNA分子的总体活性在体外和/或体内得到增强。
术语“抑制”、“下调”或“减少”指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性中的减少，低于在不存在本发明的核酸分子（例如，siNA）的情况下观察到的那种。下调还可以与转录后沉默相关，例如RNAi介导的切割或通过DNA甲基化模式或DNA染色质结构中的改变。由siNA分子的抑制、下调或减少可以提及无活性分子、减弱的分子、具有杂乱序列的siNA分子或具有错配的siNA分子，或可替代地，它可以提及在不存在核酸的情况下的系统。
术语“哺乳动物”指任何温血脊椎动物物种，例如人、小鼠、大鼠、犬、猫、仓鼠、豚鼠、兔、家畜等。
短语“定量吸入器”或MDI指包括罐、覆盖罐的安全盖和位于盖中的制剂计量阀门的单元。MDI系统包括合适的开缝装置。本发明的合适开槽装置包括例如阀门传动装置和圆筒状或圆锥样通道，通过其药物可以从填满的滤毒罐经由计量阀门递送至患者的鼻或口例如口状物传动装置。
术语“微小RNA”或“miRNA”指通过mRNA切割、翻译阻抑/抑制或异染色质沉默调节靶信使RNA的表达的小双链RNA（参见例如Ambros，2004，Nature，431，350-355；Bartel，2004，Cell，116，281-297；Cullen，2004，Virus Research.，102，3-9；He等人，2004，Nat. Rev. Genet.，5，522-531；Ying等人，2004，Gene，342，25-28；和Sethupathy等人，2006，RNA，12：192-197）。
术语“调节”意指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性得到上调或下调，从而使得表达、水平或活性大于或小于在不存在调节剂的情况下观察到的那种。例如，术语“调节”可以意指“抑制”，但措辞“调节”的用途不限于这个定义。
短语“经修饰的核苷酸”指在未修饰的（或天然）核苷酸碱基、糖和/或磷酸的化学结构中包含修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸的非限制性例子在本文和USSN 12/064,014中描述。
短语“非碱基配对”指核苷酸在双链siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间不是碱基配对的；并且可以包括例如但不限于错配、突出端、单链环等。
术语“非核苷酸”指任何基团或化合物，其可以掺入核酸链内代替一个或多个核苷酸单位，例如脱碱基部分。基团或化合物是脱碱基的，因为它不包含通常公认的核苷酸碱基，例如腺苷、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶，且因此缺乏在C1位置处的核碱基。
术语“核苷酸”如本领域公认的使用。核苷酸一般包含碱基、糖和磷酸部分。碱基可以是天然碱基（标准）或如本领域众所周知的经修饰的碱基。此类碱基一般位于核苷酸糖部分的1’位置处。另外，核苷酸可以是未修饰的或在糖、磷酸和/或碱基部分处修饰的（也可互换地称为核苷酸类似物，经修饰的核苷酸，非天然核苷酸，非标准核苷酸等；参见例如，USSN 12/064,014。
术语“突出端”意指在双链核酸分子的2条链之间不是碱基配对的核苷酸序列的末端部分（参见例如图4）。
术语“肠胃外”指以除通过消化道外的方式施用，并且包括表皮、皮下、血管内（例如静脉内）、肌内、或鞘内注射或输注技术等。
短语“途径靶”指涉及基因表达或活性途径的任何靶。例如，任何给定靶都可以具有相关途径靶，其可以包括生物途径中的上游、下游或修饰基因。这些途径靶基因可以在本文的疾病、状况和性状治疗中提供附加或协同作用。
“药物组合物”或“药物制剂”指以适合于施用，例如全身或局部施用到细胞或受试者内的形式的组合物或制剂，所述受试者包括例如人。合适的形式部分依赖使用或进入途径，例如经口、经皮、吸入或通过注射。此类形式不应阻止组合物或制剂达到靶细胞（即，需要给其递送带负电荷核酸的细胞）。例如，注射到血流内的药物组合物应当是可溶的。其他因素是本领域已知的，且包括考虑，如阻止组合物或制剂发挥其作用的毒性和形式。如本文所使用的，药物制剂包括用于人和兽医学用途的制剂。适合于与本发明的核酸分子一起配制的试剂的非限制性例子包括：P-糖蛋白抑制剂（例如Pluronic P85）；生物可降解聚合物，例如用于持续释放递送的DL-丙交酯-乙交酯共聚物小球体（Emerich，DF等人，1999，Cell Transplant，8，47-58）；和装载的纳米颗粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯制成的那些。关于本发明的核酸分子的递送策略的其他非限制性例子包括在下述参考文献中描述的材料：Boado等人，1998，J. Pharm. Sci.，87，1308-1315；Tyler等人，1999，FEBS Lett.，421，280-284；Pardridge等人，1995，PNAS USA.，92，5592-5596；Boado，1995，Adv. Drug Delivery Rev.，15，73-107；Aldrian-Herrada等人，1998，Nucleic Acids Res.，26，4910-4916；和Tyler等人，1999，PNAS USA.，96，7053-7058。“药学上可接受的组合物”或“药学上可接受的制剂”指允许本发明的核酸分子在最适合于其所需活性的物理位置中有效分布的组合物或制剂。
术语“硫代磷酸酯”指包含一个或多个硫原子代替氧原子的核苷酸间磷酸键。因此，术语硫代磷酸酯指硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯核苷酸间键。
术语“核糖核苷酸”意指在β-D-呋喃核糖部分的2'位置处具有羟基的核苷酸。
术语“RNA”意指包含至少一种呋喃核糖核苷（ribofuranoside）部分的分子。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组产生的RNA、以及通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变不同于天然存在的RNA的改变的RNA。此类改变可以包括添加非核苷酸材料，例如向siNA的一个或多个末端或内部，例如在RNA的一个或多个核苷酸处。本发明的RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
短语“RNA干扰”或术语“RNAi”指如本领域一般已知的且由短干扰核酸分子介导的抑制或下调细胞中的基因表达的生物过程，参见例如Zamore和Haley，2005，Science，309，1519-1524；Vaughn和Martienssen，2005，Science，309，1525-1526；Zamore等人，2000，Cell，101，25-33；Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等人，2001，Nature，411，494-498；和Kreutzer等人，国际PCT公开号WO 00/44895；Zernicka-Goetz等人，国际PCT公开号WO 01/36646；Fire，国际PCT公开号WO 99/32619；Plaetinck等人，国际PCT公开号WO 00/01846；Mello和Fire，国际PCT公开号WO 01/29058；Deschamps-Depaillette，国际PCT公开号WO 99/07409；和Li等人，国际PCT公开号WO 00/44914；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等人，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science，297，2232-2237；Hutvagner和Zamore，2002，Science，297，2056-60；McManus等人，2002，RNA，8，842-850；Reinhart等人，2002，Gene & Dev.，16，1616-1626；和Reinhart & Bartel，2002，Science，297，1831）。此外，术语RNAi意欲等价于用于描述序列特异性RNA干扰的其他术语，例如转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传学（epigenetics）。例如，本发明的siNA分子可以用于在转录后水平或转录前水平上表观遗传地沉默基因。在非限制性例子中，基因表达经由本发明的siNA分子的表观遗传调节可以起因于siNA介导的染色质结构的修饰或甲基化模式以改变基因表达（参见，例如，Verdel等人，2004，Science，303，672-676；Pal-Bhadra等人，2004，Science，303，669-672；Allshire，2002，Science，297，1818-1819；Volpe等人，2002，Science，297，1833-1837；Jenuwein，2002，Science，297，2215-2218；和Hall等人，2002，Science，297，2232-2237）。在另一个非限制性例子中，基因表达经由本发明的siNA分子的调节可以起因于siNA经由RISC介导的RNA（编码或非编码RNA）切割，或如本领域已知的经由翻译抑制，或调节可以起因于转录抑制（参见例如Janowski等人，2005，Nature Chemical Biology，1，216-222）。
短语“RNAi抑制剂”指可以在细胞或生物中下调、减少或抑制RNA干扰功能或活性的任何分子。RNAi抑制剂可以下调、减少或抑制RNAi（例如RNAi介导的靶多核苷酸的切割、翻译抑制或转录沉默），其通过与RNAi途径的任何组分相互作用或干扰RNAi途径的任何组分的功能实现，所述组分包括蛋白质组分例如RISC、或核酸组分例如miRNA或siRNA。RNAi抑制剂可以是siNA分子，反义分子，适体，或者与RISC、miRNA、或siRNA或细胞或生物中的RNAi途径的任何其他组分相互作用、或干扰RISC、miRNA、或siRNA或细胞或生物中的RNAi途径的任何其他组分的功能的小分子。通过抑制RNAi（例如RNAi介导的靶多核苷酸的切割、翻译抑制或转录沉默），本发明的RNAi抑制剂可以用于调节（例如上调或下调）靶基因的表达。
短语“有义区”指与siNA分子的反义区具有互补性的siNA分子的核苷酸序列。此外，siNA分子的有义区可以包含与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。siNA分子的有义区还可以指有义链或过客链。
短语“短干扰核酸”、“siNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”、“短干扰寡核苷酸分子”或“化学修饰的短干扰核酸分子”指能够通过介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默以序列特异性方式抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子。这些术语可以指单个核酸分子、多个此类核酸分子、或此类核酸分子库。siNA可以是包含自互补的有义和反义链的双链核酸分子，其中所述反义链包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siNA可以是具有双链体、不对称的双链体、发夹或不对称的发夹二级结构、具有自互补的有义和反义区的多核苷酸，其中所述反义区包含与分开的靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义区包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。siNA可以是具有2个或更多环结构和包含自互补的有义和反义区的茎的环状单链多核苷酸，其中所述反义区包含与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，且有义区包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，且其中环状多核苷酸可以在体内或体外进行加工以产生能够介导RNAi的活性siNA分子。siNA还可以包含具有与靶核酸分子中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列的单链多核苷酸（例如，其中此类siNA分子不需要在siNA分子内存在对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列），其中所述单链多核苷酸可以进一步包含末端磷酸基，例如5'-磷酸（参见例如Martinez等人，2002，Cell.，110，563-574和Schwarz等人，2002，Molecular Cell，10，537-568）或5’,3’-二磷酸。
术语“受试者”指本发明的核酸分子可以施用于其的生物。受试者可以是哺乳动物或哺乳动物细胞，包括人或人细胞。该术语还指其是外植细胞的供体或受体或细胞自身的生物。
短语“全身施用”指药物在血流中的体内全身性吸收或积累随后分布遍及整个身体。
当其指ICAM-1时，术语“靶”指例如由表10中所示的GenBank登记号编码的任何ICAM-1蛋白质、肽或多肽的核酸。该术语还指编码任何靶蛋白、肽或多肽的核酸序列或靶多核苷酸序列，例如由具有表10中显示的Genbank登记号的序列编码的蛋白质、肽或多肽。目的靶可以包括靶多核苷酸序列，例如靶DNA或靶RNA。术语“靶”还意欲包括其他序列，例如相异同工型、突变靶基因、靶多核苷酸的剪接变体、靶多态和非编码（例如，ncRNA、miRNA、stRNA、sRNA）或如本文所描述的其他调节多核苷酸序列。
“靶位点”指靶RNA内对于由siNA构建体介导的切割“被靶向”的序列，所述siNA构建体在其反义区内包含与靶序列互补的序列。
短语“治疗有效量”指由研究者、兽医、医学博士或其他临床医生寻求的，将引发细胞、组织、系统、动物或人的生物学或医学应答的化合物或药物组合物的量。
短语“通用碱基”指与每个天然DNA/RNA碱基形成碱基对的核苷酸碱基类似物，而在它们之间只有很少的区别。通用碱基的非限制性例子包括C-苯基、C-萘基和其他芳族衍生物、肌苷、吡咯氨甲酰和硝基吡咯衍生物例如如本领域已知的3-硝基吡咯、4-硝基吲哚、5-硝基吲哚和6-硝基吲哚（参见例如Loakes，2001，Nucleic Acids Research，29，2437-2447）。
短语“未修饰的核苷”意与β-D-呋喃型核糖的1'碳连接的下述碱基之一：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
术语“上调”指基因表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性中的增加，高于在不存在本发明的核酸分子（例如，siNA）的情况下观察到的那种。在某些情况下，由siNA分子上调或促进基因表达高于在无活性或减弱的分子的存在下观察到的那种水平。在其他情况下，由siNA分子上调或促进基因表达高于在例如具有杂乱序列或具有错配的siNA分子的存在下观察到的那种水平。在另外其他的情况下，由本发明的核酸分子上调或促进基因表达在核酸分子的存在下大于在不存在其的情况下。在某些情况下，基因表达的上调或促进与RNA介导的基因沉默抑制相关，例如RNAi介导的编码或非编码RNA靶的切割或沉默，其下调、抑制或沉默待上调的目的基因的表达。基因表达的下调可以例如由编码RNA或其编码的蛋白质进行诱导，例如通过负反馈或拮抗作用。基因表达的下调可以例如由对目的基因具有调节控制的非编码RNA进行诱导，例如经由翻译抑制、染色质结构、甲基化、RISC介导的RNA切割或翻译抑制通过沉默基因表达。照这样，下调、抑制或沉默目的基因的靶的抑制或下调可以用于上调目的基因朝向治疗用途表达。
“载体”指用于递送所需核酸的任何基于核酸和/或病毒的技术。
B. 本发明的siNA分子
本发明提供了包括靶向ICAM-1的siNA的组合物和方法，所述siNA可以用于治疗与ICAM-1相关的疾病，例如呼吸性或炎性。在本发明的特定方面和实施方案中，本发明的核酸分子包括表1a-1b和/或图2-3中所示的序列。siNA可以以数种方式提供。例如，siNA可以作为一种或多种siNA化合物分离，或它可以以在DNA质粒中的转录盒的形式。siNA还可以是化学合成的或可以包括修饰。siNA可以单独施用或与其他siNA分子或治疗ICAM-1相关疾病或状况的常规试剂共施用。
本发明的siNA分子可以用于经由与RNA转录物相互作用或可替代地通过与特定基因序列相互作用来介导基因沉默，具体地ICAM-1，其中此类相互作用导致在转录水平或转录后水平上的基因沉默，例如但不限于用靶的核苷酸序列的RNAi或通过细胞过程，所述细胞过程调节染色质结构或靶的甲基化模式且阻止靶基因的转录，从而介导沉默。更具体而言，靶是ICAM-1 RNA、DNA、mRNA、miRNA、siRNA或其部分中的任何。
在一个方面，本发明提供了包括彼此具有互补性的第一条链和第二条链的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中至少一条链包括下述的至少15个核苷酸：
其中一个或多个核苷酸是任选化学修饰的。
在某些实施方案中，15个核苷酸形成连续核苷酸段。
在其他实施方案中，siNA分子可以包含对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150的一个或多个核苷酸缺失、置换、错配和/或添加；然而，条件是siNA分子维持其活性，例如以介导RNAi。在非限制性例子中，缺失、置换、错配和/或添加可以导致环或凸起，或可替代地摆动或其他可替代（非沃森-克里克）碱基对。
这些siNA分子可以包含RNA的短双链区。本发明的双链RNA分子可以包含2条不同且分离的链，其可以是对称或不对称的，并且是互补的，即2条单链RNA分子，或可以包含一个单链分子，其中2个互补部分例如有义区和反义区是碱基配对的，并且通过一个或多个单链“发夹”区域（即环）共价连接，导致例如单链短发夹多核苷酸或环状单链多核苷酸。
接头可以是多核苷酸接头或非核苷酸接头。在一些实施方案中，接头是非核苷酸接头。在一些实施方案中，本发明的发夹或环状siNA分子包含一个或多个环基序，其中siNA分子的至少一个环部分是生物可降解的。例如，这样设计本发明的单链发夹siNA分子，使得siNA分子的环部分在体内的降解可以生成具有3-'末端突出端的双链siNA分子，例如包含1个、2个、3个或4个核苷酸的3-'末端核苷酸突出端。或可替代地，这样设计本发明的环状siNA分子，使得siNA分子的环部分在体内的降解可以生成具有3-'末端突出端的双链siNA分子，例如包含约2个核苷酸的3-'末端核苷酸突出端。
在本发明的对称siNA分子中，每条链，有义（过客）链和反义（引导）链，长度独立地为约15个 – 约40个（例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个 或40个）核苷酸。
在不对称siNA分子中，分子的反义区或链长度为约15个 – 约30个（例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个）核苷酸，其中有义区长度为约3个 – 约25个（例如约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个 或25个）核苷酸。
在另外其他的实施方案中，本发明的siNA分子包含单链发夹siNA分子，其中所述siNA分子长度为约25个 – 约70个（例如约25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、40个、45个、50个、55个、60个、65个 或70个）核苷酸。
在另外其他的实施方案中，本发明的siNA分子包含单链环状siNA分子，其中所述siNA分子长度为约38个 – 约70个（例如约38个、40个、45个、50个、55个、60个、65个 或70个）核苷酸。
在各种对称实施方案中，本发明的siNA双链体独立地包含约15 – 约40个碱基对（例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个 或40个）。
在另外其他的实施方案中，其中本发明的siNA分子是不对称的，所述siNA分子包含约3个 – 约25个（例如约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个）碱基对）。
在另外其他的实施方案中，其中本发明的siNA分子是发夹或环状结构，所述siNA分子包含约3个 – 约30个（例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个）碱基对。
本发明的siNA分子的有义链和反义链或有义区和反义区可以是互补的。此外，反义链或反义区可以与ICAM-1靶RNA的核苷酸序列或其部分是互补的。如果siNA可以包含ICAM-1基因或其部分的核苷酸序列，那么是有义链或有义区。在某些实施方案中，本发明的siNA分子的有义区或有义链与siNA分子的反义区或反义链的那个部分是互补的，所述反义区或反义链与ICAM-1靶多核苷酸序列是互补的，例如但不限于表10中所示由GENBANK登记号表示的那些序列。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子在siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区之间具有完全互补性。在其他或相同实施方案中，本发明的siNA分子与相应靶核酸分子是完全互补的。
在另外其他的实施方案中，本发明的siNA分子在siNA分子的有义链或有义区和反义链或反义区或在siNA分子的反义链或反义区和相应靶核酸分子之间具有部分互补性（即，小于100％互补性）。因此，在一些实施方案中，本发明的双链核酸分子在一条链中具有与另一条链的核苷酸互补的约15个 – 约40个（例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个）核苷酸。在其他实施方案中，分子在有义区中具有与双链核酸分子的反义区的核苷酸互补的约15个 – 约40个（例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个）核苷酸。在另外其他的实施方案中，本发明的双链核酸分子在反义链中具有与其相应靶核酸分子的核苷酸序列互补的约15个 – 约40个（例如约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个）核苷酸。
在一些实施方案中，本发明的双链核酸分子在一条链或一个区中具有与另一条链或另一个区错配或非碱基配对的1个或更多（例如1个、2个、3个、4个、5个或6个）核苷酸。在其他实施方案中，本发明的双链核酸分子在每条链或每个区中具有与另一条链或另一个区错配或非碱基配对的1个或更多（例如1个、2个、3个、4个、5个或6个）核苷酸。
本发明还包含如上文其他地方描述的双链核酸（siNA）分子，其中第一条链和第二条链彼此互补，并且其中在高严格条件下，至少一条链可与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150的多核苷酸序列杂交，并且其中任何核苷酸是未修饰或化学修饰的。
杂交技术是熟练专业人员众所周知的（参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.（1989））。优选严格杂交条件包括在包括下述的溶液中在4℃过夜孵育：50％甲酰胺、5xSSC（150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠）、50 mM磷酸钠（pH 7.6）、5x Denhardt's溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/ml变性剪切鲑精DNA；随后为在0.1x SSC中在约65℃洗涤滤器。
在一个具体实施方案中，第一条链具有与另一条链的核苷酸互补的约15 个、16 个、17 个、18 个、19 个、20个或21个核苷酸，并且在高严格条件下，至少一条链可与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150的多核苷酸序列杂交，并且其中任何核苷酸是未修饰或化学修饰的。
在某些实施方案中，本发明的siNA分子包含约1个 – 约4个（例如约1个、2个、3个或4个）核苷酸的突出端。突出端中的核苷酸可以是相同或不同的核苷酸。在一些实施方案中，突出端在双链核酸分子的一条或两条链的3'-末端处出现。例如，本发明的双链核酸分子可以包含在双链核酸分子的引导链或反义链/区的3'-末端、过客链或有义链/区的3'-末端、或引导链或反义链/区和过客链或有义链/区处的核苷酸或非核苷酸突出端。
在一些实施方案中，包含本发明siNA分子的突出端部分的核苷酸包含基于ICAM-1靶多核苷酸序列的序列，其中包含本发明siNA分子的引导链或反义链/区的突出端部分的核苷酸可以与ICAM-1靶多核苷酸序列中的核苷酸互补，和/或包含本发明siNA分子的过客链或有义链/区的突出端部分的核苷酸可以与ICAM-1靶多核苷酸序列中的核苷酸包含在ICAM-1靶多核苷酸序列中的核苷酸。因此，在一些实施方案中，突出端包含与ICAM-1靶多核苷酸序列的部分互补的二核苷酸突出端。然而，在其他实施方案中，突出端包含与ICAM-1靶多核苷酸序列的部分不互补的二核苷酸突出端。在某些实施方案中，突出端包含与ICAM-1靶多核苷酸序列的部分不互补的3’-UU突出端。在其他实施方案中，突出端包含在反义链的3'末端处的UU突出端和在有义链的3'末端处的TT突出端。
在具有3'-末端核苷酸突出端的本文描述的siNA分子的任何实施方案中，突出端在一个或多个核酸糖、碱基或主链位置处是任选化学修饰的。在本发明的双链核酸（siNA）分子的突出端部分中经修饰的核苷酸的代表性但非限制性例子包括2'-O-烷基（例如2'-O-甲基）、2'-脱氧、2'-脱氧-2'-氟、2'-脱氧-2'-氟阿拉伯糖基（FANA）、4'-硫代、2'-O-三氟甲基、2'-O-乙基-三氟甲氧基、2'-O-二氟甲氧基-乙氧基、通用碱基、无环或5-C-甲基核苷酸。在更优选的实施方案中，突出端核苷酸各自独立地是2'-O-烷基核苷酸、2'-O-甲基核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核苷酸或2'-脱氧核糖核苷酸。
在另外其他的实施方案中，本发明的siNA分子包含具有平端的双链体核酸分子（即不具有任何核苷酸突出端），其中2个末端都是平头的，或可替代地其中末端之一是平头的。在一些实施方案中，本发明的siNA分子可以包含一个平端，例如其中反义链的5'-末端和有义链的3'-末端不具有任何突出端核苷酸。在另一个例子中，siNA分子包含一个平端，例如其中反义链的3'-末端和有义链的5'-末端不具有任何突出端核苷酸。在其他例子中，本发明的siNA分子包含2个平端，例如其中反义链的3'-末端和有义链的5'-末端以及反义链的5'-末端和有义链的3'-末端不具有任何突出端核苷酸。
在本发明的siNA分子的任何实施方案或方面中，有义链和/或反义链可以在有义链和/或反义链的3'-末端、5'-末端、或3'和5'-末端处进一步具有帽，例如本文描述或如本领域已知的。或者如在发夹siNA分子的情况下，帽可以在多核苷酸的末端核苷酸之一或两者处。在一些实施方案中，帽在双链siNA分子的有义链的一个或两个末端处。在其他实施方案中，帽在反义（引导）链的5'-末端和3'-末端处。在优选实施方案中，帽在有义链的3'-末端和有义链的5'末端处。
此类末端帽的代表性但非限制性例子包括反向脱碱基核苷酸、反向脱氧脱碱基核苷酸、反向核苷酸部分、图5中显示的基团、甘油基修饰、烷基或环烷基、杂环、或阻止RNAi活性的任何其他基团。
本发明的siNA分子的任何实施方案可以具有5'磷酸末端。在一些实施方案中，siNA分子缺乏末端磷酸。
本发明的任何siNA分子或构建体可以包含一个或多个化学修饰。修饰可以用于改善体外或体内特征，例如稳定性、活性、毒性、免疫应答（例如预防干扰素应答、炎症或促炎细胞因子应答或Toll样受体（TlF）应答的刺激）和/或生物利用率。
申请人在本文中描述了与相应的未修饰或最低限度修饰的siNA分子相比较，具有改善的RNAi活性的化学修饰的siNA分子。本文公开的化学修饰的siNA基序提供了维持基本上类似于未修饰的或最低限度修饰的活性siNA 的RNAi活性（参见例如Elbashir等人，2001，EMBO J.，20：6877-6888），同时提供适合于在治疗应用中使用的核酸酶抗性和药物代谢动力学性质的能力。
在各种实施方案中，本发明的siNA分子包含修饰，其中有义和/或反义链中存在的任何（例如，一个或多个或所有）核苷酸是经修饰的核苷酸（例如，其中一个核苷酸是经修饰的，或所有核苷酸是经修饰的核苷酸，或可替代地多个（即，超过一个）核苷酸是经修饰的核苷酸。在一些实施方案中，本发明的siNA分子是被化学修饰部分修饰的（例如，约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个核苷酸是修饰的）。在其他实施方案中，本发明的siNA分子是被化学修饰完全修饰的（例如，约100％修饰的），即siNA分子不包含任何核糖核苷酸。在其他实施方案中，本发明的siNA分子包含其为经修饰的核苷酸的至少约8个、10个、12个、14个、16个、18个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、32个、34个、36个、38个、40个、42个、44个、46个、48个、50个、52个、54个、56个、58个、60个、62个、64个、66个、68个、70个、72个、74个、76个、78个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的siNA分子的有义链中的1个或多个核苷酸是经修饰的。在相同或其他实施方案中，本发明的siNA分子的反义链中的1个或多个核苷酸是经修饰的。
在单个siNA分子内的化学修饰可以是相同或不同的。在一些实施方案中，至少一条链具有至少一个化学修饰。在其他实施方案中，每条链具有至少一个化学修饰，这可以是相同或不同的，例如糖、碱基或主链（即，核苷酸间键）修饰。在其他实施方案中，本发明的siNA分子包含至少2个、3个、4个、5个或更多不同的化学修饰。
适合于在本发明中使用的化学修饰的非限制性例子公开于USSN 10/444,853、USSN 10/981,966、USSN 12/064,014和其中引用的参考文献中，并且包括糖、碱基和磷酸盐、非核苷酸修饰和/或其任何组合。
在各种实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数嘧啶核苷酸包含糖修饰。在另外其他的实施方案中，双链siNA分子中存在的大多数嘌呤核苷酸包含糖修饰。在某些情况下，嘌呤和嘧啶在2'-糖位置上是差别修饰的（即，至少一个嘌呤具有与在2'-糖位置上在相同或不同链中的至少一个嘧啶不同的修饰）。
在本发明的这个方面的某些具体实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2'-脱氧核苷酸或2'-O-烷基（例如，2'-O-甲基）核苷酸。
在本发明另外其他的实施方案中，至少一个核苷酸具有核糖样、Northern或A形螺旋构型（参见例如，Saenger，Principles of Nucleic Acid Structure，Springer-Verlag编辑，1984）。具有Northern构型的核苷酸的非限制性例子包括锁定核酸（LNA）核苷酸（例如，2'-O-，4'-C-亚甲基-（D-呋喃核糖基）核苷酸）；2'-甲氧基乙氧基（MOE）核苷酸；2'-甲基-硫代-乙基核苷酸，2'-脱氧-2'-氟核苷酸，2'-脱氧-2'-氯核苷酸，2'-叠氮核苷酸，2'-O-三氟甲基核苷酸，2'-O-乙基-三氟甲氧基核苷酸，2'-O-二氟甲氧基-乙氧基核苷酸，4'-硫代核苷酸和2'-O-甲基核苷酸。
在本发明的某些实施方案中，有义链上的互补区中的所有嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸。在某些实施方案中，反义链的互补区中的所有嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸。在某些实施方案中，有义链上的互补区中的所有嘌呤核苷酸是2'-脱氧嘌呤核苷酸。在某些实施方案中，反义链上的互补区中的所有嘌呤是2'-O-甲基嘌呤核苷酸。在某些实施方案中，有义链上的互补区中的所有嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸；反义链的互补区中的所有嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸；有义链上的互补区中的所有嘌呤核苷酸是2'-脱氧嘌呤核苷酸，并且反义链上的互补区中的所有嘌呤是2'-O-甲基嘌呤核苷酸。
任何上述修饰或其组合包括参考文献中引用的那些可以应用于本发明的任何siNA分子。
本发明的经修饰的siNA分子可以包含在siNA分子内的各个位置上的修饰。在某些实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在siNA双链体内的内部碱基配对位置上经修饰的核苷酸。在其他实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在siNA分子的非碱基配对或突出端区域上经修饰的核苷酸。在另外其他的实施方案中，本发明的双链siNA分子包含在siNA分子的末端位置上经修饰的核苷酸。例如，此类末端区域包括siNA分子的有义和/或反义链或区的3'-位置和/或5'-位置。另外，本发明的所有经修饰的siNA分子可以具有在siNA双链体的一条或两条寡核苷酸链中的修饰，例如在有义链、反义链或两条链中。此外，就本发明的siNA分子的化学修饰而言，本发明的双链siNA分子的每条链可以具有一个或多个化学修饰，从而使得每条链包含不同模式的化学修饰。
在一些实施方案中，本发明的双链siNA分子的每条链包含不同模式的化学修饰，例如本文的任何“Stab 00” - “Stab 36”或“Stab 3F” - “Stab 36F”（表11）修饰模式或其任何组合。进一步地，可以产生不同修饰模式的修饰方案的非限制性例子显示于表11中。稳定化学在表11中称为Stab，可以以有义/反义化学的任何组合，例如Stab 7/8、Stab 7/11、Stab 8/8、Stab 18/8、Stab 18/11、Stab 12/13、Stab 7/13、Stab 18/13、Stab 7/19、Stab 8/19、Stab 18/19、Stab 7/20、Stab 8/20、Stab 18/20、Stab 7/32、Stab 8/32或Stab 18/32（例如，具有Stab 7、8、11、12、13、14、15、17、18、19、20或32有义或反义链或其任何组合的任何siNA）。在本文中，数字Stab化学可以包括如表11中所示化学的2'-氟和2'-OCF3形式。例如，“Stab 7/8”指Stab 7/8和Stab 7F/8F等。
在其他实施方案中，siNA分子的引导链或引导区（也称为反义链或反义区）的5'-末端处的一个或多个（例如1个、2个、3个、4个或5个）核苷酸是核糖核苷酸。
在一些实施方案中，反义链中的嘧啶核苷酸是2'-O-甲基或2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸，且反义链中存在的嘌呤核苷酸是2'-O-甲基核苷酸或2'-脱氧核苷酸。在其他实施方案中，有义链中存在的嘧啶核苷酸是2'-脱氧-2'-氟嘧啶核苷酸，且有义链中存在的嘌呤核苷酸是2'-O-甲基或2'-脱氧嘌呤核苷酸。
具有各种修饰模式的此类siNA分子的有义和反义链的进一步非限制性例子显示于图2和3中。
在本发明的某些实施方案中，提供了双链siNA分子，其中所述分子具有有义链和反义链且包括下式（A）：
其中，所述上部链是所述双链核酸分子的有义链，并且所述下部链是所述双链核酸分子的反义链；其中所述反义链包括SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：150的至少15个核苷酸，并且所述有义链包括与所述反义链具有互补性的序列；
每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；
每个B是存在或不存在的末端帽；
（N）代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰或化学修饰的；
[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；
X1和X2独立地是0 – 4的整数；
X3是17 – 36的整数；
X4是11 – 35的整数；和
X5是1 – 6的整数，条件是X4和X5的总和是17-36。
在某些实施方案中，至少15个核苷酸形成连续核苷酸段。
在其他实施方案中，siNA分子可以包含对于SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：150的一个或多个核苷酸缺失、置换、错配和/或添加；然而，条件是siNA分子维持其活性，例如以介导RNAi。在非限制性例子中，缺失、置换、错配和/或添加可以导致环或凸起，或可替代地摆动或其他可替代（非沃森-克里克）碱基对。
在一个实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）；其中
（a）NX4位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；
（b）NX4位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；
（c）NX3位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；和
（d）NX3位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合。
在一个实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）；其中
（a）NX4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸或核糖核苷酸；
（b）NX4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸或核糖核苷酸；
（c）NX3位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸或核糖核苷酸；和
（d）NX3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸或核糖核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）；其中
（a）NX4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；
（b）NX4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-O-烷基核苷酸；
（c）NX3位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；和
（d）NX3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）；其中
（a）NX4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；
（b）NX4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-O-烷基核苷酸；
（c）NX3位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；和
（d）NX3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是核糖核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的特征在于式（A）的双链短干扰核酸（siNA）；其中
（a）NX4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；
（b）NX4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是核糖核苷酸；
（c）NX3位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；和
（d）NX3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是核糖核苷酸。
在一些实施方案中，具有式A的siNA分子包含在核酸分子的反义链或反义区的5'-末端处的末端磷酸基。
在各种实施方案中，具有式A的siNA分子包含X5 = 1、2或3；X1和X2各自= 1或2；X3 = 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和X4 = 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
在一个具体实施方案中，具有式A的siNA分子包含X5 = 1；X1和X2各自= 2；X3 = 19，和X4 = 18。
在另一个具体实施方案中，具有式A的siNA分子包含X5 = 2；X1和X2各自= 2；X3 = 19，和X4 = 17。
在另外一个实施方案中，具有式A的siNA分子包含X5 = 3；X1和X2各自= 2；X3 = 19，和X4 = 16。
在某些实施方案中，具有式A的siNA分子包含在有义链或有义区的3'和5'末端处的帽（B）。
在某些实施方案中，具有式A的siNA分子包含在反义链或反义区的3' -末端处的帽（B）。
在各种实施方案中，具有式A的siNA分子包含在有义链或有义区的3'和5'末端处的帽（B）和在反义链或反义区的3' -末端处的帽（B）。
在另外其他的实施方案中，具有式A的siNA分子包含仅在双链核酸分子的有义（上部）链的5'-末端处的帽（B）。
在一些实施方案中，具有式A的siNA分子进一步包含在核酸分子的有义链、反义链、或有义链和反义链的3'末端上的第一个末端（N）和邻近核苷酸之间的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。例如，双链核酸（siNA）分子可以包含具有含硫代磷酸酯核苷酸间键的突出端核苷酸位置的X1和/或X2 = 2，例如（NsN）其中“s”指示硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，具有式A的siNA分子包含在反义链（下部链）中的（N）核苷酸，其与ICAM-1靶多核苷酸序列中的核苷酸互补，所述ICAM-1靶多核苷酸序列中的核苷酸也与反义（下部）链的N和[N]核苷酸具有互补性。
在另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
G是鸟苷；
U是尿苷；
A是腺苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
C是胞苷；
U是尿苷；
G是鸟苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
A是腺苷；
U是尿苷；
C是胞苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在还另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
G是鸟苷；
U是尿苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在还另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
A是腺苷；
U是尿苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在还另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
A是腺苷；
U是尿苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在还另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
C是胞苷；
G是鸟苷；
U是尿苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
在还另外一个实施方案中，本发明提供了双链短干扰核酸（siNA）分子；其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
A是腺苷；
U是尿苷；
G是鸟苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
C. siNA分子的生成/合成
本发明的siNA可以使用本领域技术人员已知的许多技术获得。例如，siNA可以是化学合成的，或可以由质粒编码（例如转录为自动折叠成具有发夹环的双链体的序列）。siNA还可以通过较长dsRNA（例如，长度超过约25个核苷酸的dsRNA）经由大肠杆菌RNA酶II或切酶（Dicer）切割而生成。这些酶将dsRNA加工成生物活性的siRNA（参见例如，Yang等人，PNAS USA 99:9942-9947（2002）；Calegari等人PNAS USA 99:14236（2002）Byron等人Ambion Tech Notes；10（1）:4-6（2009）；Kawaski等人，Nucleic Acids Res.，31:981-987（2003），Knight和Bass，Science，293:2269-2271（2001）和Roberston等人，J. Biol. Chem 243:82（1969）。
1. 化学合成
优选地，本发明的siNA是化学合成的。寡核苷酸（例如，某些经修饰的寡核苷酸或缺乏核糖核苷酸的寡核苷酸的部分）使用本领域已知的规程合成，例如如下述参考文献中所述：Caruthers等人，1992，Methods in Enzymology 211，3-19，Thompson等人，国际PCT公开号WO 99/54459，Wincott等人，1995，Nucleic Acids Res. 23，2677-2684，Wincott等人，1997，Methods Mol. Bio.，74，59，Brennan等人，1998，Biotechnol Bioeng.，61，33-45，和Brennan，美国专利号6,001,311。寡核苷酸的合成利用常见的核酸保护和偶联基团，例如在5'-末端处的二甲氧三苯甲基，和在3'-末端处的亚磷酰胺。
不含修饰的siNA分子使用如Usman等人，1987，J. Am. Chem. Soc.，109，7845；Scaringe等人，1990，Nucleic Acids Res.，18，5433中描述的程序合成。利用常见的核酸保护和偶联基团的这些可以用于本发明的某些siNA分子，所述核酸保护和偶联基团例如在5'-末端处的二甲氧三苯甲基，和在3'-末端处的亚磷酰胺。
在某些实施方案中，本发明的siNA分子根据下述专利中描述的方法进行合成、脱保护和分析：美国专利号6,995,259、6,686,463、6,673,918、6,649,751、6,989,442和USSN 10/190,359。
在非限制性合成例子中，小规模的合成在394 Applied Biosystems，Inc.合成仪上进行，其使用0.2 μmol规模规程，对于2'-O-甲基化核苷酸使用2.5分钟的偶联步骤和对于2'-脱氧核苷酸或2'-脱氧-2'-氟核苷酸使用45秒的偶联步骤。表12概述了在合成循环中使用的试剂的量和接触时间。
可替代地，本发明的siNA分子可以分开合成且在合成后连接在一起，例如通过连接（Moore等人，1992，Science 256，9923；Draper等人，国际PCT公开号WO 93/23569；Shabarova等人，1991，Nucleic Acids Research 19，4247；Bellon等人，1997，Nucleosides & Nucleotides，16，951；Bellon等人， 1997，Bioconjugate Chem. 8，204），或通过在合成和/或脱保护后杂交。
本发明的各种siNA分子还可以使用Scaringe等人，美国专利号5,889,136；6,008,400；和6,111,086的教导合成。
2. 载体表达
可替代地，与编码ICAM-1分子的基因相互作用且下调其的本发明的siNA分子可以由插入到DNA或RNA载体内的转录单位（参见例如Couture等人，1996，TIG.，12，510）表达且递送。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。表达siNA的病毒载体可以基于但不限于下述进行构建：腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒或甲病毒。
在一些实施方案中，基于pol III的构建体用于表达本发明的核酸分子，siNA分子序列的转录可以由用于真核RNA聚合酶I（pol I）、RNA聚合酶II（pol II）、或RNA聚合酶III（pol III）的启动子驱动。（参见例如，Thompson,美国专利号5,902,880和6,146,886）。（还参见，Izant和Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry和Lindquist，1986，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 83，399；Scanlon等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88，10591-5；Kashani-Sabet等人，1992，Antisense Res. Dev.，2，3-15；Dropulic等人，1992，J. Virol.，66，1432-41； Weerasinghe等人，1991，J. Virol.，65，5531-4； Ojwang等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89，10802-6； Chen等人，1992， Nucleic Acids Res.，20，4581-9； Sarver等人，1990 Science，247，1222-1225；Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Good等人，1997，Gene Therapy，4，45。来自pol II或pol III启动子的转录物在所有细胞中以高水平表达；给定pol II启动子在给定细胞类型中的水平取决于附近存在的基因调节序列（增强子、沉默基因等）的性质。原核RNA聚合酶启动子也可以使用，只要原核RNA聚合酶在合适的细胞中表达（Elroy-Stein和Moss，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. U S A，87，6743-7；Gao和Huang 1993，Nucleic Acids Res.，21，2867-72； Lieber等人，1993，Methods Enzymol.， 217，47-66； Zhou等人，1990，Mol. Cell. Biol.，10，4529-37）。几个研究者已证实由此类启动子表达的核酸分子可以在哺乳动物细胞中起作用（例如，Kashani-Sabet等人，1992， Antisense Res. Dev.， 2，3-15； Ojwang 等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. U S A，89，10802-6； Chen等人，1992，Nucleic Acids Res.，20，4581-9； Yu等人，1993， Proc. Natl. Acad. Sci. U S A，90，6340-4； L'Huillier等人，1992，EMBO J.，11，4411-8； Lisziewicz等人，1993， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A，90，8000-4；Thompson等人，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Sullenger & Cech，1993，Science，262，1566）。更具体而言，转录单位例如衍生自编码U6小核（snRNA）、转移RNA（tRNA）和腺病毒VA RNA的基因的那些在细胞中产生高浓度的所需RNA分子例如siNA方面是有用的（Thompson等人，同上；Couture和Stinchcomb，1996,同上；Noonberg等人，1994，Nucleic Acid Res.，22，2830；Noonberg等人，美国专利号5,624,803；Good等人，1997，Gene Ther.，4，45；Beigelman等人，国际PCT公开号WO 96/18736。上述siNA转录单位可以掺入多种载体内用于引入哺乳动物细胞内，包括但不限于，质粒DNA载体、病毒DNA载体（例如，腺病毒或腺伴随病毒载体）、或病毒RNA载体（例如逆转录病毒或甲病毒载体）（关于综述参见Couture和Stinchcomb，1996，同上）。
用于表达本发明的siNA分子的载体可以编码siNA双链体的一条或两条链，或自我杂交成siNA双链体的单条自互补链。编码本发明的siNA分子的核酸序列可以以允许siNA分子表达的方式可操作地连接（参见例如Paul等人，2002，Nature Biotechnology，19，505；Miyagishi和Taira，2002，Nature Biotechnology，19，497；Lee等人，2002，Nature Biotechnology，19，500；和Novina等人，2002，Nature Medicine，预先在线公开doi:10.1038/nm725）。
D. 载体/递送系统
本发明的siNA分子可以直接加入，或可以与阳离子脂质复合，包装在脂质体内，或作为表达siNA分子的重组质粒或病毒载体，或以其他方式递送给靶细胞或组织。用于递送核酸分子的方法在下述参考文献中得到描述：Akhtar等人，1992，Trends Cell Bio.，2，139；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，Akhtar编辑，1995，Maurer等人，1999，Mol. Membr. Biol.，16，129-140；Hofland和Huang，1999，Handb. Exp. Pharmacol.，137，165-192；和Lee等人，2000，ACS Symp. Ser.，752，184-192。Beigelman等人，美国专利号6,395,713和Sullivan等人，PCT WO 94/02595进一步描述了用于递送核酸分子的一般方法。这些方法可以用于递送事实上任何核酸分子。核酸分子可以通过本领域技术人员已知的多种方法施用于细胞，包括但不限于，被囊化在脂质体中，通过离子电渗疗法，或通过掺入其他媒介物内，所述其他媒介物例如生物可降解聚合物、水凝胶、环糊精（参见例如Gonzalez等人，1999，Bioconjugate Chem.，10，1068-1074；Wang等人，国际PCR公开号WO 03/47518和WO 03/46185）、乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）和PLCA小球体（参见例如美国专利6,447,796和美国专利申请公开号US 2002130430）、生物可降解纳米胶囊（nanocapsule）和生物粘附小球体，或通过蛋白样载体（O'Hare和Normand，国际PCT公开号WO 00/53722）。
在一个方面，本发明提供了包含本文描述的siNA分子的载体系统。在一些实施方案中，载体系统是基于脂质的载体系统、阳离子脂质、或脂质体核酸复合物、脂质体、胶粒、病毒体、脂质纳米颗粒或其混合物。在其他实施方案中，载体系统是基于聚合物的载体系统，例如阳离子聚合物-核酸复合物。在另外的实施方案中，载体系统是基于环糊精的载体系统，例如环糊精聚合物-核酸复合物。在进一步的实施方案中，载体系统是基于蛋白质的载体系统，例如阳离子肽-核酸复合物。优选地，脂质纳米颗粒制剂中的载体系统。表13中指出的脂质纳米颗粒（“LNP”）制剂可以应用于本文的任何siNA分子或siNA分子的组合。
在某些实施方案中，本发明的siNA分子配制为例如USSN 11/353,630和USSN 11/586,102中所述的脂质纳米颗粒组合物。
在一些实施方案中，本发明的特征在于包含配制为下述制剂中的任何的siNA分子的组合物，例如LNP-051；LNP-053；LNP-054；LNP-069； LNP-073；LNP-077；LNP-080；LNP-082；LNP-083；LNP-060；LNP-061；LNP-086；LNP-097；LNP-098；LNP-099；LNP-100；LNP-101；LNP-102；LNP-103；或LNP-104（参见表13）。
在其他实施方案中，本发明的特征在于本发明的siNA分子的缀合物和/或复合物。此类缀合物和/或复合物可以用于促进siNA分子递送到生物系统例如细胞内。由本发明提供的缀合物和复合物可以给予治疗活性，其通过将治疗化合物转移经过细胞膜，改变药物代谢动力学和/或调节本发明的核酸分子的定位实现。此类缀合物的非限制性例子在USSN 10/427,160和USSN 10/201,394；以及美国专利号6,528,631；6,335,434；6,235,886；6,153,737；5,214,136；5,138,045中描述。
在各种实施方案中，聚乙二醇（PEG）可以与本发明的siNA化合物共价附着。附着的PEG可以是任何分子量，优选约100 - 约50,000道尔顿（Da）。
在另外其他的实施方案中，本发明的特征在于包含表面修饰的脂质体的组合物或制剂，所述表面修饰的脂质体包含聚乙二醇脂质（PEG修饰的，或长循环脂质体或隐形（stealth）脂质体）和本发明的siNA分子，如在例如国际PCT公开号WO 96/10391；Ansell等人，国际PCT公开号WO 96/10390；Holland等人，国际PCT公开号WO 96/10392）中所公开的。
在一些实施方案中，本发明的siNA分子还可以用聚乙烯亚胺及其衍生物配制或与聚乙烯亚胺及其衍生物复合，例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺（PEI-PEG-GAL）或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺（PEI-PEG-triGAL）衍生物。在一个实施方案中，本发明的核酸分子如美国专利申请公开号20030077829中所述进行配制。
在其他实施方案中，本发明的siNA分子与膜破裂试剂例如美国专利申请公开号20010007666中描述的那些复合。在还其他的实施方案中，一种或多种膜破裂试剂和siNA分子还与阳离子脂质或辅助脂质分子例如美国专利号6,235,310中描述的那些脂质复合。
在某些实施方案中，本发明的siNA分子与如下述专利中描述的递送系统复合：美国专利申请公开号2003077829；20050287551；20050164220；20050191627；20050118594；20050153919；20050085486；和20030158133；以及国际PCT公开号WO 00/03683和WO 02/087541。
在一些实施方案中，本发明的脂质体制剂包含用下述专利中描述的化合物和组合物配制，或与下述专利中描述的化合物和组合物复合的本发明的siNA分子（例如，siNA）：美国专利号6,858,224；6,534,484；6,287,591；6,835,395；6,586,410；6,858,225；6,815,432；6,586,001；6,120,798；6,977,223；6,998,115；5,981,501；5,976,567；5,705,385；以及美国专利申请公开号2006/0019912；2006/0019258；2006/0008909；2005/0255153；2005/0079212；2005/0008689；2003/0077829，2005/0064595，2005/0175682，2005/0118253； 2004/0071654；2005/0244504；2005/0265961和2003/0077829。
可替代地，表达本发明的siRNA的如上文讨论的重组质粒和病毒载体可以用于递送本发明的分子。siNA分子表达载体的递送可以是全身性的，例如通过静脉内或肌内施用，通过施用于从受试者外植的靶细胞随后重新引入受试者内，或通过将允许引入所需靶细胞内的任何其他方式（关于综述参见Couture等人，1996，TIG.，12，510）。此类重组质粒还可以间接或与合适的递送试剂结合施用，所述合适的递送试剂包括例如Mirus Transit LT1亲脂试剂；lipofectin；lipofectamine；cellfectin；聚阳离子（例如聚赖氨酸）或基于脂质体脂质的载体系统、阳离子脂质、或脂质体核酸复合物、胶粒、病毒体、脂质纳米颗粒。
E. 试剂盒
本发明还提供了以试剂盒形式的核酸。试剂盒可以包含容器。试剂盒一般包含本发明的核酸连同关于其施用的说明书。在某些情况下，核酸可以具有附着的靶向部分。附着靶向部分（例如抗体、蛋白质）的方法是本领域技术人员已知的。在某些情况下，核酸是化学修饰的。在其他实施方案中，试剂盒包含超过一种本发明的siNA分子。试剂盒可以包含本发明的siNA分子连同药学上可接受的载体或稀释剂。试剂盒可以进一步包含赋形剂。
F. 治疗用途/药物组合物
ICAM-1研究中现有的大量知识指出需要用于研究、诊断和治疗用途的测定ICAM-1活性的方法和可以调节ICAM-1表达的化合物。如下文所描述的，本发明的核酸分子可以在测定中用于诊断与ICAM-1水平有关的疾病状态。此外，核酸分子和药物组合物可以用于治疗与ICAM-1水平有关的疾病状态。
1. 与ICAM-1相关的疾病状态
可以与ICAM-1表达调节相关的特定疾病状态包括但不限于呼吸性、炎性和自身免疫疾病、性状、状况和表型。此类疾病状态或指示的非限制性例子包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肺同种异体移植物的急性和慢性排斥、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎和窦炎。炎性呼吸性疾病各自的特征都在于召募且激活不同炎症细胞的介质的存在，所述炎症细胞释放酶或氧自由基，引起症状、炎症持续，并且当慢性时，正常组织的损坏或破坏。
应当理解本发明的siNA分子可以降解靶标ICAM-1 mRNA（且从而抑制上述疾病）。疾病的抑制可以通过直接测量受试者中的疾病进展进行评估。它还可以通过观察与疾病相关的状况中的改变或逆转进行推断。另外，本发明的siNA分子可以用作预防。因此，本发明的核酸分子和药物组合物的使用可以用于改善、治疗、预防和/或治愈与ICAM-1的调节相关的这些疾病及其他。
2. 药物组合物
本发明的siNA分子提供了用于多种治疗、预防、化妆品、兽医、诊断、靶确认、基因组发现、基因工程和药物基因组学（pharmacogenomic）应用的有用试剂和方法。
a. 制剂
因此，在一个方面，本发明还提供了所述siNA分子的药物组合物。这些药物组合物包括上述化合物的盐，例如酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、乙酸和苯磺酸的盐。这些药物制剂或药物组合物可以包含药学上可接受的载体或稀释剂。
在一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:2的至少15个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:143的至少15个核苷酸。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:4的至少15个核苷酸。在还另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:144的至少15个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:5的至少15个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:145的至少15个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:6的至少15个核苷酸。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:146的至少15个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:7的至少15个核苷酸。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:147的至少15个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:37的至少15个核苷酸。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:148的至少15个核苷酸。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:11的至少15个核苷酸。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO:149的至少15个核苷酸。在还另外的实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：38的至少15个核苷酸。在还另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：150的至少15个核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。在还另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50。在还另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52。在还另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54。在还另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56。在还另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116。在另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：164。在还另一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118。在另外一个实施方案中，本发明的特征在于包含siNA分子的药物组合物，所述siNA分子包含式（A）。
根据本领域已知的技术，本发明的siNA分子优选在施用于受试者之前配制为药物组合物。本发明的药物组合物表征为至少无菌和无热原的。用于制备本发明的药物组合物的方法在本领域的技术内，例如如Remington's Pharmaceutical Science，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.（1985）中所述。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物（例如siNA和/或其LNP制剂）进一步包含常规药学赋形剂和/或添加剂。合适的药学赋形剂包括防腐剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、摩尔渗透压浓度调节剂、缓冲剂和pH调节剂。合适的添加剂包括生理学生物相容性缓冲剂（例如三甲胺盐酸盐），螯合剂（例如DTPA或DTPA-双酰胺）或钙螯合物复合物（例如钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺）的添加，或任选地，钙或钠盐（例如氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙）的添加。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
用于局部施用的各种类型制剂的非限制性例子包括软膏、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、泡沫剂、用于通过经皮贴剂递送的制剂、粉末、喷雾剂、气溶胶、用于在吸入器或吹入器中使用的胶囊或药液筒或滴剂（例如眼或鼻滴剂）、用于喷雾化的溶液/悬浮液、栓剂、子宫托、保留灌肠剂和可咀嚼或可吮吸片剂或丸剂（例如用于治疗口疮性溃疡）或脂质体或微胶囊制剂。
软膏、乳膏剂和凝胶剂可以例如用水或油基质配制，伴随合适增稠剂和/或胶凝剂和/或溶剂的添加。此类基质的非限制性例子因此可以例如包括水和/或油例如液体石蜡或植物油例如花生油或蓖麻油、或溶剂例如聚乙二醇。增稠剂和胶凝剂可以根据基质的性质使用。此类试剂的非限制性例子包括软石蜡、硬脂酸铝、鲸蜡硬脂醇、聚乙二醇、羊毛脂、蜂蜡、羧聚乙烯和纤维素衍生物、和/或单硬脂酸甘油酯和/或非离子型乳化剂。
在一个实施方案中，洗剂可以用水或油基质配制，并且一般而言还将包含一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂或增稠剂。
在一个实施方案中，用于外敷的粉末可以借助于任何合适的粉末基质例如滑石、乳糖或淀粉形成。滴剂可以用水或非水基质配制，还包括一种或多种分散剂、增溶剂、悬浮剂或防腐剂。
预期用于经口使用的组合物可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法进行制备，并且此类组合物可以包含一种或多种此类甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂以便提供药学上精致和可口的制剂。片剂包含与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的活性成分，所述赋形剂适合于制备片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂；例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如玉米淀粉、或藻酸；粘合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是无包被的，或它们可以通过已知技术进行包被。在某些情况下此类包被可以通过已知技术进行制备，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收且因此提供经过较长时间段的持续作用。例如，可以使用时间延迟材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于经口使用的制剂也可以呈现为其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合的硬明胶胶囊，或呈现为其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软明胶胶囊。
水性悬浮液包含与适合于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性材料。此类赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散或湿润剂可以是天然存在的磷脂例如卵磷脂，或烯化氧与脂肪酸的缩合产物例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物例如十七乙烯氧基鲸蜡醇（heptadecaethyleneoxycetanol），或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物例如聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。水性悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂例如蔗糖或糖精。
油性悬浮液可以通过使活性成分悬浮于植物油或矿物油例如液体石蜡中来制备，所述植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油。油性悬浮液可以包含增稠剂例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以添加甜味剂和调味剂以提供可口的经口制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸进行防腐。
本发明的药物组合物也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶例如阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然存在的磷脂例如大豆、卵磷脂，以及衍生自脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯（partial ester），例如山梨糖醇酐单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。
糖浆和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖进行配制。此类制剂还可以包含缓和剂、防腐剂以及调味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌可注射的水性或含油悬浮液的形式。这种悬浮液可以根据已知技术进行配制，其中使用上文已提及的那些合适的分散或湿润剂和悬浮剂。无菌可注射的制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为溶于1,3-丁二醇的溶液。在可以使用的可接受的媒介物和溶剂中有水、林格液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的、固定油照惯例用作溶剂或悬浮介质。为了这个目的，可以使用任何温和的固定油包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸在可注射物的制备中找到用途。
本发明的核酸分子也可以以栓剂的形式施用，例如用于药物的直肠施用。这些组合物可以通过将药物与合适的非刺激性赋形剂混合进行制备，所述赋形剂在常温下是固体的但在直肠温度下是液体的，并且因此在直肠中将熔化以释放药物。此类材料包括可可脂和聚乙二醇。
本发明的核酸分子可以在无菌介质中肠胃外施用。取决于使用的媒介物和浓度，药物可以悬浮于或溶解于媒介物中。有利地，佐剂例如局部麻醉药、防腐剂和缓冲剂可以溶解于媒介物中。
在其他实施方案中，本文提供的用于在肺递送中使用的siNA和LNP组合物和制剂进一步包含一种或多种表面活性剂。用于增强本发明的组合物摄取的合适表面活性剂或表面活性剂组分包括合成和天然以及完整和截短形式的表面活性蛋白A，表面活性蛋白B，表面活性蛋白C，表面活性蛋白D和表面活性蛋白E，二饱和磷脂酰胆碱（除二棕榈酰外），二棕榈酰磷脂酰胆碱，磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸；磷脂酸，泛醌，溶血磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰胆碱，棕榈酰-溶血磷脂酰胆碱，脱氢表雄酮，多萜醇，sulfatidic acid，甘油-3-磷酸，二羟丙酮磷酸，甘油，甘油-3-磷酸胆碱，二羟丙酮，棕榈酸盐，胞苷二磷酸（CDP）二酰甘油，CDP胆碱，胆碱，磷酸胆碱；以及天然和人造片层体，其是关于表面活性剂组分的天然载体媒介物，ω-3脂肪酸，聚烯酸（polyenic acid），多烯酸，卵磷脂，棕榈酸，氧化乙烯或丙烯的非离子嵌段共聚物，聚氧丙烯、单体和聚合的，聚氧乙烯、单体和聚合的，具有葡聚糖和/或烷酰基侧链的聚乙烯胺，Brij 35，Triton X-100和合成表面活性剂ALEC，Exosurf，Survan和Atovaquone，等等。这些表面活性剂可以在制剂中作为单个表面活性剂或多组分表面活性剂的部分使用，或作为与本文的药物组合物的核酸组分的5'和/或3'末端共价结合的附加物使用。
b. 组合
根据本发明的化合物和药物制剂可以单独施用于受试者，或与一种或多种其他治疗剂组合使用，或包括一种或多种其他治疗剂，所述治疗剂例如选自抗炎剂、抗胆碱能剂（特别是M1/M2/M3受体拮抗剂）、β2-肾上腺素受体激动剂、抗感染剂例如抗生素、抗病毒剂或抗组织胺药。在一个进一步的实施方案中，本发明因此提供了这样的组合，其包括本发明的siNA分子或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物，连同一种或多种其他治疗活性剂，例如选自抗炎剂例如皮质类固醇或NSAID、抗胆碱能剂、β2-肾上腺素受体激动剂、抗感染剂例如抗生素、抗病毒剂或抗组织胺药，所述siNA分子例如但不限于包含下述的至少15个核苷酸的siNA分子：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。本发明的其他实施方案包含这样的组合，其包括本发明的siNA分子或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物，连同β2-肾上腺素受体激动剂、和/或抗胆碱能剂、和/或ICAM-1抑制剂、和/或抗组织胺药，所述siNA分子包含下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。
在一个实施方案中，本发明包含包括本发明的siNA分子连同β2-肾上腺素受体激动剂的组合。β2-肾上腺素受体激动剂的非限制性例子包括沙美特罗（这可以是外消旋物或单一对映体例如R-对映体）、舒喘灵（这可以是外消旋物或单一对映体例如R-对映体）、福莫特罗（这可以是外消旋物或单一非对映体例如R,R-非对映体）、沙甲胺醇、非诺特罗、卡莫特罗、依坦特罗、那明特罗、克仑特罗、吡布特罗、flerbuterol、瑞普特罗、班布特罗、茚达特罗、特步他林及其盐，例如沙美特罗的昔萘酸盐（1-羟基-2-萘羧酸盐）、舒喘灵的硫酸盐或游离碱、或福莫特罗的延胡索酸盐。在一个实施方案中，β2-肾上腺素受体激动剂是长效β2-肾上腺素受体激动剂，例如提供约12小时或更久的有效支气管扩张的化合物。
其他β2-肾上腺素受体激动剂包括下述中所述的那些：WO 02/066422、WO 02/070490、WO 02/076933、WO 03/024439、WO 03/072539、WO 03/091204、WO 04/016578、WO 2004/022547、WO 2004/037807、WO 2004/037773、WO 2004/037768、WO 2004/039762、WO 2004/039766、WO01/42193和WO03/042160。
β2-肾上腺素受体激动剂的进一步例子包括3-（4-{[6-（{（2R）-2-羟基-2-[4-羟基-3-（羟甲基）苯基]乙基}氨基）己基]氧基}丁基）苯磺酰胺；3-（3-{[7-（{（2R）-2-羟基-2-[4-羟基-3-羟甲基）苯基]乙基}-氨基）庚基]氧基}丙基）苯磺酰胺；4-{（1R）-2-[（6-{2-[（2，6-二氯苄基）氧基]乙氧基}己基）氨基]-1-羟基乙基}-2-（羟甲基）苯酚；4-{（1R）-2-[（6-{4-[3-（环戊基磺酰基）苯基]丁氧基}己基）氨基]-1-羟基乙基}-2-（羟甲基）苯酚；N-[2-羟基l-5-[（1R）-1-羟基-2-[[2-4-[[（2R）-2-羟基-2苯基乙基]氨基]苯基]乙基]氨基]乙基]苯基]甲酰胺；N-2{2-[4-（3-苯基-4-甲氧基苯基）氨基苯基]乙基}-2-羟基-2-（8-羟基-2（1H）-喹啉酮-5-基）乙胺；和5-[（R）-2-（2-{4-[4-（2-氨基-2-甲基-丙氧基）-苯基氨基]-苯基}-乙基氨基）-1-羟基-乙基]-8-羟基-1H-喹啉-2-酮。
在一个实施方案中，β2-肾上腺素受体激动剂可以以由药学上可接受的酸形成的盐的形式，所述药学上可接受的酸选自硫酸、盐酸、延胡索酸、羟萘甲酸（例如1-或3-羟基-2-萘甲酸）、肉桂酸、取代肉桂酸、三苯基乙酸、氨基磺酸、萘基丙烯酸、苯甲酸、4-甲氧基苯甲酸、2-或4-羟基苯甲酸、4-氯苯甲酸和4-苯基苯甲酸。
合适的抗炎剂还包括皮质类固醇。可以与本发明的化合物组合使用的皮质类固醇的例子是那些经口和吸入皮质类固醇及其具有抗炎活性的药物前体。非限制性例子包括甲基泼尼松龙、泼尼松龙、地塞米松、丙酸氟替卡松、6α,9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-[（4-甲基-1,3-噻唑-5-羰基）氧基]-3-氧代-雄甾-1,4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯、6α,9α-二氟-17α-[（2-呋喃甲酰）氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1,4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯（氟替卡松糠酸盐）、6α,9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-丙酰氧基-雄甾-1,4-二烯-17β-硫代羟酸S-（2-氧代-四氢-呋喃-3S-基）酯、6α,9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-（2,2,3,3-四甲基环丙基羰基）氧基-雄甾-1,4-二烯-17β-硫代羟酸S-氰基甲酯和6α,9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-（1-甲基环丙基羰基）氧基-3-氧代-雄甾-1,4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯、倍氯米松酯（例如17-丙酸酯或17,21-二丙酸酯）、布地奈德、氟尼缩松、莫米松酯（例如莫米松糠酸酯）、曲安奈德、罗氟奈德、环索奈德（16α,17-[[（R）-环己基亚甲基]二（氧基）]-11β,21-二羟基-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮）、布替可特丙酸酯、RPR--106541和ST-126。在一个实施方案中，皮质类固醇包括氟替卡松丙酸酯、6α,9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-[（4-甲基-1,3-噻唑-5-羰基）氧基]-3-氧代-雄甾-1,4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯、6α,9α-二氟-17α-[（2-呋喃甲酰）氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1,4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯、6α,9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-17α-（2,2,3,3-四甲基环丙基羰基）氧基-雄甾-1,4-二烯-17β-硫代羟酸S-氰基甲酯和6α,9α-二氟-11β-羟基-16α-甲基-17α-（1-甲基环丙基羰基）氧基-3-氧代-雄甾-1,4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯。在一个实施方案中，皮质类固醇是6α,9α-二氟-17α-[（2-呋喃甲酰）氧基]-11β-羟基-16α-甲基-3-氧代-雄甾-1,4-二烯-17β-硫代羟酸S-氟甲酯。皮质类固醇的非限制性例子包括在下述公开专利申请和专利中所述的那些：WO02/088167、WO02/100879、WO02/12265、WO02/12266、WO05/005451、WO05/005452、WO06/072599和WO06/072600。
在一个实施方案中，是包含本发明的siNA分子和具有糖皮质激素激动的非类固醇化合物的组合，所述非类固醇化合物可以具有对反式阻抑超过反式激活的选择性，例如下述公开专利申请和专利中涵盖的非类固醇化合物：WO03/082827、WO98/54159、WO04/005229、WO04/009017、WO04/018429、WO03/104195、WO03/082787、WO03/082280、WO03/059899、WO03/101932、WO02/02565、WO01/16128、WO00/66590、WO03/086294、WO04/026248、WO03/061651、WO03/08277、WO06/000401、WO06/000398和WO06/015870。
可以与本发明的siNA分子组合使用的其他抗炎剂的非限制性例子包括非类固醇抗炎药（NSAID’s）。
NSAID’s的非限制性例子包括色甘酸钠、奈多罗米钠、磷酸二酯酶（PDE）抑制剂（例如茶碱、PDE4抑制剂或混合PDE3/ PDE4抑制剂）、白三烯拮抗剂、白三烯合成抑制剂（例如孟鲁司特）、iNOS抑制剂、类胰蛋白酶和弹性蛋白酶抑制剂、β-2整联蛋白拮抗剂和腺苷受体激动剂或拮抗剂（例如腺苷2a激动剂）、细胞因子拮抗剂（例如趋化因子拮抗剂例如CCR3拮抗剂）或细胞因子合成抑制剂、或5-脂氧合酶抑制剂。在一个实施方案中，本发明包含用于经口施用的iNOS（诱导型一氧化氮合酶）抑制剂。iNOS抑制剂的例子包括下述公开国际专利和专利申请中公开的那些：WO93/13055、WO98/30537、WO02/50021、WO95/34534和WO99/62875。CCR3抑制剂的例子包括WO02/26722中公开的那些。
化合物包括顺式-4-氰基-4-（3-环戊氧基-4-甲氧基苯基）环己-1-羧酸、2-甲酯基-4-氰基-4-（3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基）环己-1-酮和顺式-[4-氰基-4-（3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基）环己-1-醇]。此外，顺式-4-氰基-4-[3-（环戊氧基）-4-甲氧基苯基]环己-1-羧酸（也称为西洛司特）及其盐、酯、药物前体或物理形式，这在美国专利5,552,438中描述。
其他化合物包括来自Elbion的AWD-12-281（Hofgen，N.等人15th EFMC Int Symp Med Chem（Sept 6-10，Edinburgh）1998，Abst P.98；CAS参考号247584020-9）；命名NCS-613（INSERM）的9-苄基腺嘌呤衍生物；来自Chiroscience和Schering-Plough的D-4418；鉴定为CI-1018（PD-168787）且归于Pfizer的苯并二氮卓PDE4抑制剂；由Kyowa Hakko在WO99/16766中公开的苯并间二氧杂环戊烯衍生物；来自Kyowa Hakko的K-34；来自Napp的V-11294A（Landells，L.J.等人Eur Resp J [Annu Cong Eur Resp Soc（Sept 19-23，Geneva）1998]1998，12（Suppl. 28）：Abst P2393）；来自Byk-Gulden的罗氟司特（CAS参考号162401-32-3）和酞嗪酮（pthalazinone）（WO99/47505，其公开内容在此引入作为参考）；普马芬群，（-）-p-[（4aR*,10bS*）-9-乙氧基-1,2,3,4,4a,10b-六氢-8-甲氧基-2-甲基苯并[c][1,6]萘啶-6-基]-N,N-二异丙基苯甲酰胺，其是已由Byk-Gulden现在的Altana制备且公开的混合PDE3/PDE4抑制剂；由Almirall-Prodesfarma开发的阿罗茶碱；来自Vernalis的VM554/UM565；或T-440（Tanabe Seiyaku；Fuji，K.等人J Pharmacol Exp Ther,1998，284（1）：162）和T2585。进一步的化合物在公开的国际专利申请WO04/024728（Glaxo Group Ltd）、WO04/056823（Glaxo Group Ltd）和WO04/103998（Glaxo Group Ltd）中公开。
可以与本发明的化合物组合使用的囊性纤维性试剂的例子包括但不限于化合物，例如Tobi?和Pulmozyme?。
可以与本发明的化合物组合使用的抗胆碱能剂的例子是充当针对毒蕈碱受体的拮抗剂的那些化合物，特别是其为M1或M3受体的拮抗剂、M1/M3或M2/M3的双重拮抗剂、受体或M1/M2/M3受体的泛拮抗剂的那些化合物。用于经由吸入施用的示例性化合物包括异丙托铵（例如作为溴化物，CAS 22254-24-6，在名称爱全乐下销售）、氧托品（例如作为溴化物，CAS 30286-75-0）和噻托溴铵（例如作为溴化物，CAS 136310-93-5，在名称Spiriva下销售）。还有利的是瑞伐托酯（例如作为氢溴化物，CAS 262586-79-8）和WO01/04118中公开的LAS-34273。用于经口施用的示例性化合物包括哌仑西平（CAS 28797-61-7）、达非那新（CAS 133099-04-4或CAS 133099-07-7用于在名称替尼达普下销售的氢溴化物）、奥昔布宁（CAS 5633-20-5，在名称Ditropan下销售）、特罗地林（CAS 15793-40-5）、托特罗定（CAS 124937-51-5或CAS 124937-52-6用于在名称Detrol下销售的酒石酸盐）、奥替溴铵（例如作为溴化物，CAS 26095-59-0，在名称斯巴敏下销售）、曲司氯铵（CAS 10405-02-4）和索利那辛（CAS 242478-37-1或CAS 242478-38-2用于也称为YM-905且在名称Vesicare下销售的琥珀酸盐）。
其他抗胆碱能剂包括式（XXI）的化合物，其公开于美国专利申请60/487981中：
其中与托品烷环附着的烷基链的优选方向是内；R31和R32独立地选自具有优选1 - 6个碳原子的直链或支链低级烷基基团、具有5 - 6个碳原子的环烷基基团、具有6 – 10个碳原子的环烷基-烷基、2-噻吩基、2-吡啶基、苯基、由具有不超过4个碳原子的烷基基团取代的苯基、和由具有不超过4个碳原子的烷氧基基团取代的苯基；X-代表与N原子的正电荷相关的阳离子。X-可以是但不限于氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、苯磺酸盐和甲苯磺酸盐。式XXI的例子包括但不限于：（3-内）-3-（2,2-二-2-噻吩基乙烯基）-8,8-二甲基-8-氮
双环[3.2.1]辛烷溴化物；（3-内）-3-（2,2-二苯基乙烯基）-8,8-二甲基-8-氮
双环[3.2.1]辛烷溴化物；（3-内）-3-（2,2-二苯基乙烯基）-8,8-二甲基-8-氮
双环[3.2.1]辛烷4-甲基苯磺酸盐；（3-内）-8,8-二甲基-3-[2-苯基-2-（2-噻吩基）乙烯基]-8-氮
双环[3.2.1]辛烷溴化物；和/或（3-内）-8,8-二甲基-3-[2-苯基-2-（2-吡啶基）乙烯基]-8-氮
双环[3.2.1]辛烷溴化物。
进一步的抗胆碱能剂包括式（XXII）或（XXIII）的化合物，其公开于美国专利申请60/511009中：
其中：指示的H原子在外位置中；R41代表与N原子的正电荷相关的阳离子。R41可以是但不限于氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、苯磺酸盐和甲苯磺酸盐；R42和R43独立地选自直链或支链低级烷基基团（具有优选1 - 6个碳原子）、环烷基基团（具有5 - 6个碳原子）、环烷基-烷基（具有6 - 10个碳原子）、杂环烷基（具有5 - 6个碳原子）和N或O作为杂原子、杂环烷基-烷基（具有6 - 10个碳原子）和N或O作为杂原子、芳基、任选取代的芳基、杂芳基和任选取代的杂芳基；R44选自（C1-C6）烷基、（C3-C12）环烷基、（C3-C7）杂环烷基、（C1-C6）烷基（C3-C12）环烷基、（C1-C6）烷基（C3-C7）杂环烷基、芳基、杂芳基、（C1-C6）烷基-芳基、（C1-C6）烷基-杂芳基、-OR45、-CH2OR45、-CH2OH、-CN、-CF3、-CH2O（CO）R46、-CO2R47、-CH2NH2、-CH2N（R47）SO2R45、-SO2N（R47）（R48）、-CON（R47）（R48）、-CH2N（R48）CO（R46）、-CH2N（R48）SO2（R46）、-CH2N（R48）CO2（R45）、-CH2N（R48）CONH（R47）；R45选自（C1-C6）烷基、（C1-C6）烷基（C3-C12）环烷基、（C1-C6）烷基（C3-C7）杂环烷基、（C1-C6）烷基-芳基、（C1-C6）烷基-杂芳基；R46选自（C1-C6）烷基、（C3-C12）环烷基、（C3-C7）杂环烷基、（C1-C6）烷基（C3-C12）环烷基、（C1-C6）烷基（C3-C7）杂环烷基、芳基、杂芳基、（C1-C6）烷基-芳基、（C1-C6）烷基-杂芳基；R47和R48独立地选自H、（C1-C6）烷基、（C3-C12）环烷基、（C3-C7）杂环烷基、（C1-C6）烷基（C3-C12）环烷基、（C1-C6）烷基（C3-C7）杂环烷基、（C1-C6）烷基-芳基和（C1-C6）烷基-杂芳基，包括例如：（内）-3-（2-甲氧基-2,2-二-噻吩-2-基-乙基）-8,8-二甲基-8-氮
-双环[3.2.1]辛烷碘化物；3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二苯基-丙腈；（内）-8-甲基-3-（2,2,2-三苯基-乙基）-8-氮杂-双环[3.2.1]辛烷；3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二苯基-丙酰胺；3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二苯基-丙酸；（内）-3-（2-氰基-2,2-二苯基-乙基）-8,8-二甲基-8-氮
-双环[3.2.1]辛烷碘化物；（内）-3-（2-氰基-2,2-二苯基-乙基）-8,8-二甲基-8-氮
-双环[3.2.1]辛烷溴化物；3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二苯基-丙-1-醇；N-苄基-3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二苯基-丙酰胺；（内）-3-（2-氨基甲酰基-2,2-二苯基-乙基）-8,8-二甲基-8-氮
-双环[3.2.1]辛烷碘化物；1-苄基-3-[3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二苯基-丙基]-脲；1-乙基-3-[3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二苯基-丙基]-脲；N-[3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二苯基-丙基]-乙酰胺；N-[3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二苯基-丙基]-苯甲酰胺；3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二-噻吩-2-基-丙腈；（内）-3-（2-氰基-2,2-二-噻吩-2-基-乙基）-8,8-二甲基-8-氮
-双环[3.2.1]辛烷碘化物；N-[3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二苯基-丙基]-苯磺酰胺；[3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二苯基-丙基]-脲；N-[3-（（内）-8-甲基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-基）-2,2-二苯基-丙基]-甲基磺酰胺；和/或（内）-3-{2,2-二苯基-3-[（1-苯基-甲酰氧基）-氨基]-丙基}-8,8-二甲基-8-氮
-双环[3.2.1]辛烷溴化物。
进一步的化合物包括（内）-3-（2-甲氧基-2,2-二-噻吩-2-基-乙基）-8,8-二甲基-8-氮
-双环[3.2.1]辛烷碘化物；（内）-3-（2-氰基-2,2-二苯基-乙基）-8,8-二甲基-8-氮
-双环[3.2.1]辛烷碘化物；（内）-3-（2-氰基-2,2-二苯基-乙基）-8,8-二甲基-8-氮
-双环[3.2.1]辛烷溴化物；（内）-3-（2-氨基甲酰基-2,2-二苯基-乙基）-8,8-二甲基-8-氮
-双环[3.2.1]辛烷碘化物；（内）-3-（2-氰基-2,2-二-噻吩-2-基-乙基）-8,8-二甲基-8-氮
-双环[3.2.1]辛烷碘化物；和/或（内）-3-{2,2-二苯基-3-[（1-苯基-甲酰氧基）-氨基]-丙基}-8,8-二甲基-8-氮-双环[3.2.1]辛烷溴化物。
在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明的siNA分子或其药学上可接受的盐连同H1拮抗剂的组合，所述siNA分子包含下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。H1拮抗剂的例子包括但不限于氨来呫诺（amelexanox）、阿司咪唑、阿扎他定、氮卓斯汀、阿伐斯汀、溴苯那敏、西替利嗪、左西替利嗪、乙氟利嗪、氟苯那敏、氯马斯汀、赛克力嗪、卡瑞斯汀、赛庚啶、卡比沙明、去羧乙氧基氯雷他定、多西拉敏、二甲茚定、依巴斯汀、依匹斯汀、乙氟利嗪、非索非那定、羟嗪、酮替芬、氯雷他定、左卡巴斯汀、咪唑斯汀、美喹他嗪、米安色林、诺柏斯汀、美克洛嗪、去甲阿司咪唑、奥洛他定、哌香豆司特、吡拉明、异丙嗪、特非那定、曲吡那敏、替美斯汀、三甲泼拉嗪和曲普利啶，特别是西替利嗪、左西替利嗪、乙氟利嗪和非索非那定。
在其他实施方案中，本发明提供了包含本发明的siNA分子或其药学上可接受的盐连同H3拮抗剂（和/或反激动剂）的组合，所述siNA分子包含下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。H3拮抗剂的例子包括例如WO2004/035556和WO2006/045416中公开的那些化合物。可以与本发明的化合物组合使用的其他组胺受体拮抗剂包括H4受体的拮抗剂（和/或反激动剂），例如Jablonowski等人，J. Med. Chem. 46:3957-3960（2003）中公开的化合物。
本发明因此提供了含本发明的siNA分子和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同ICAM-1抑制剂的组合，所述siNA分子包含下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。
在一个进一步的实施方案中，本发明还提供了包含本发明的siNA分子和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同β2-肾上腺素受体激动剂的组合，所述siNA分子包含下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。
在一个进一步的实施方案中，本发明还提供了包含本发明的siNA分子和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同皮质类固醇的组合，所述siNA分子包含下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。
在一个进一步的实施方案中，本发明还提供了包含本发明的siNA分子和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同抗胆碱能剂的组合，所述siNA分子包含下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。
在一个进一步的方面，本发明提供了包含本发明的siNA分子和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同抗组胺药的组合，所述siNA分子包含下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。
在再一个进一步的方面，本发明提供了包含本发明的siNA分子和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同ICAM-1抑制剂和β2-肾上腺素受体激动剂的组合，所述siNA分子包含下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。
在一个进一步的方面，本发明因此提供了包含本发明的siNA分子和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物或生理学功能衍生物连同抗胆碱能剂和ICAM-1抑制剂的组合，所述siNA分子包含下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。
上文提及的组合可以方便地呈现用于以药物制剂的形式使用，并且因此包括如上定义的组合连同药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物代表本发明的一个进一步方面。
此类组合的个别化合物可以在分开或组合药物制剂中顺次或同时施用。在一个实施方案中，个别化合物将在组合药物制剂中同时施用。
在进一步的实施方案中，siNA分子可以与其他已知治疗组合用于预防或治疗受试者或生物中的呼吸性疾病、病症或状况。例如，本发明的siNa分子可以与另外的气道水合疗法一起使用，例如高张生理盐水、地纽福索、甘露醇（bronchitol）；CFTR基因治疗；蛋白质辅助/修复例如CFTR校准物，例如VX-809（Vertex），CFTR增强剂例如VX-770（Vertex）；粘液处理例如阿法链道酶；抗炎处理例如经口N-乙酰半胱氨酸、西地那非、吸入谷胱甘肽、吡格列酮、羟氯喹、辛伐他汀；抗感染治疗例如阿奇霉素，arikace；移植药物例如吸入环孢素；和营养补充剂例如aquADEKs，胰脂肪酶产物trizytek。因此，所描述的分子可以与一种或多种已知化合物、治疗或操作组合用于预防或治疗如本领域已知的受试者或生物中疾病、病症、状况和性状，例如其他ICAM-1抑制剂。
3. 治疗应用
ICAM-1研究中现有的大量知识指出需要可以调节ICAM-1表达用于治疗用途的方法。
因此，本发明的一个方面包括治疗受试者包括但不限于患有状况的人的方法，所述状况通过ICAM-1的作用或通过ICAM-1作用的丧失介导，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本发明的双链siNA分子。在这个方面的一个实施方案中，siNA分子包括下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。在这个方面的另一个实施方案中，状况是呼吸性疾病或由呼吸性疾病引起。可根据本发明的这个方面治疗的呼吸性疾病包括COPD、哮喘、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、窦炎。在一个特定实施方案中，用途是用于治疗选自COPD、囊性纤维化和哮喘的呼吸性疾病。在某些实施方案中，siNA分子的施用是经由局部施用或全身施用。在其他实施方案中，本发明的特征在于例如经由肺递送经由给相关组织或细胞例如肺细胞和组织的局部施用，使受试者或生物与本发明的siNA分子接触。在另外其他的实施方案中，本发明的特征在于经由给相关组织或细胞的全身施用（例如经由siNA的静脉内或皮下施用）使受试者或生物与本发明的siNA分子接触，所述组织或细胞例如涉及受试者或生物中的炎性疾病、性状或状况的维持或发展的组织或细胞。
本发明的siNA分子还用作先体外后体内应用中的试剂。例如，为了疗效将siNA试剂引入移植到受试者内的组织或细胞内。细胞和/或组织可以得自随后接受外植体的生物或受试者，或可以得自移植前的另一种生物或受试者。siNA分子可以用于调节细胞或组织中的一种或多种基因的表达，从而使得细胞或组织获得所需表型或当体内移植时能够执行功能。在一个实施方案中，从患者中提取某些ICAM-1靶细胞。在适合于经由这些细胞摄取siNA的条件下（例如，使用递送试剂例如阳离子脂质、脂质体等，或使用技术例如电穿孔以促进siNA递送到细胞内），使这些提取的细胞与靶向细胞内的特定核苷酸序列的ICAM-1 siNA接触。随后将细胞再引回到相同患者或其他患者内。
对于治疗应用，给受试者施用药学有效剂量的本发明的siNA分子或药物组合物。药学有效剂量是预防、抑制发生、或治疗（使症状减轻至某一程度，优选所有症状）疾病状态所需的那种剂量。本领域技术人员可以容易地决定待施用于给定受试者的治疗有效剂量的本发明的siNA，通过考虑下述因素，例如受试者的大小和重量，疾病进展或穿透的程度，受试者的年龄、健康和性别，施用途径和施用是局部还是全身的。一般地，取决于带负电荷聚合物的效力，施用0.1 mg/kg - 100 mg/kg体重/天的活性成分量。本发明的siNA分子可以在单次剂量或多次剂量中施用。
G. 施用
组合物或制剂可以以多种方式施用。本发明的施用方法的非限制性例子包括经口、经颊、舌下、肠胃外（即关节内、静脉内、腹膜内、皮下或肌内）、局部直肠施用或其他局部施用。在一个实施方案中，本发明的组合物可以通过吹入和吸入施用。施用可以经由单次或分份剂量完成。在一些实施方案中，药物组合物通过弹丸注射进行静脉内或腹膜内施用（参见例如，美国专利号5,286,634）。脂质核酸颗粒可以通过直接注射在疾病部位或通过注射在远离疾病部位的部位进行施用（参见例如，Culver，HUMAN GENE THERAPY，MaryAnn Liebert，Inc.，Publishers，New York. 第70-71页（1994））。在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如本文描述和如本领域一般已知的施用于细胞、受试者或生物。
1. 体内施用
在本发明的任何一种治疗方法中，siNA可以如本文所描述的或本领域其他方面已知的全身性地给受试者施用，单独作为单一疗法或与本文描述的或本领域已知的另外疗法组合。全身施用可以包括例如，如本领域一般已知的肺（吸入、喷雾法等）静脉内、皮下、肌内、导管插入、鼻咽、经皮和/或经口/胃肠施用。
在一个实施方案中，在本发明的任何一种治疗或预防方法中，siNA可以如本文描述的或本领域其他方面已知的局部地施用于受试者或施用于局部组织，单独作为单一疗法或与本领域已知的另外疗法组合。局部施用可以包括例如，如本领域一般已知的吸入、喷雾法、导管插入、植入、直接注射、皮肤/经皮应用、贴剂、支架、滴耳剂/滴眼剂、或门静脉施用于相关组织，或任何其他局部施用技术、方法或操作。
本发明的化合物一般而言可以通过内部施用给予，在其中指出全身性糖皮质激素受体激动剂疗法的情况下。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如本领域一般已知的施用于肝（参见例如Wen等人，2004，World J Gastroenterol.，10，244-9；Murao等人，2002，Pharm Res.，19，1808-14；Liu等人，2003，gene Ther.，10，180-7；Hong等人，2003，J Pharm Pharmacol.，54，51-8；Herrmann等人，2004，Arch Virol.，149，1611-7；和Matsuno等人，2003，gene Ther.，10，1559-66）。
在一个实施方案中，本发明的特征在于将本发明的核酸分子递送给造血细胞，包括单核细胞和淋巴细胞的方法的用途。这些方法由Hartmann等人，1998，J. Phamacol. Exp. Ther.，285（2），920-928；Kronenwett等人，1998，Blood，91（3），852-862；Filion和Phillips，1997，Biochim. Biophys. Acta.，1329（2），345-356；Ma和Wei，1996，Leuk. Res.，20（11/12），925-930；和Bongartz等人，1994，Nucleic Acids Research，22（22），4681-8详细描述。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如本领域一般已知的直接或地方性地（例如，局部地）施用于真皮或滤泡（参见例如Brand，2001，Curr. Opin. Mol. Ther.，3，244-8；Regnier等人，1998，J. Drug Target，5，275-89； Kanikkannan，2002，BioDrugs，16，339-47；Wraight等人，2001，Pharmacol. Ther.，90，89-104；和Preat和Dujardin，2001，STP PharmaSciences，11，57-68）。在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物直接或地方性地施用，其中使用包含醇（例如，乙醇或异丙醇）、水且任选包括另外试剂例如肉豆蔻酸异丙酯和卡波姆980的含水醇凝胶制剂。在其他实施方案中，siNA配制为局部施用于鼻腔。局部制剂可以通过每天一次或多次应用施用于受累区域；在皮肤区域上可以有利地使用封闭敷料。连续或延长递送可以通过粘着储库系统达到。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子离子电渗地例如施用于特定器官或区室（例如，眼、眼后、心脏、肝、肾、膀胱、前列腺、肿瘤、CNS等）。离子电渗疗法递送的非限制性例子在例如WO 03/043689和WO 03/030989中得到描述，所述专利整体引入本文作为参考。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如本文描述和如本领域一般已知的施用于肺。在另一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂或组合物如美国专利公开号 2006/0062758；2006/0014289；和2004/0077540中所述施用于肺组织和细胞。
2. 气溶胶和递送装置
a. 气溶胶制剂
单独或与其他合适组分组合的本发明的组合物可以制备成气溶胶制剂（即，它们可以“喷雾化”），以经由吸入（例如，鼻内或气管内）施用（参见，Brigham等人，Am. J. Sci.，298:278（1989））。气溶胶制剂可以放置到增压可接受的推进剂内，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子及其制剂经由肺递送施用，例如通过经由吸入设备或喷雾器施用的气溶胶或喷雾干燥制剂的吸入，从而提供核酸分子快速的局部摄取进入相关肺组织内。包含微粉化核酸组合物的可吸收干燥颗粒的固体微粒组合物可以通过下述制备：将干燥或冻干的核酸组合物研磨，且随后使微粉化组合物通过例如400目筛以破碎或分出大附聚物。包含本发明的siNA组合物的固体微粒组合物可以任选包含分散剂，所述分散剂用于促进气溶胶以及其他治疗化合物的形成。合适的分散剂是乳糖，其可以与核酸化合物以任何合适的比值例如按重量计的1：1比值掺合。
包含本发明的siNA分子或组合物的喷雾组合物可以例如配制为水溶液或悬浮液，或配制为由增压包例如计量吸入器递送的气溶胶，使用合适的液化推进剂。在一个实施方案中，适合于吸入的本发明的气溶胶组合物可以是悬浮液或溶液，并且一般包含siNA分子和合适的推进剂，例如碳氟化合物或含氢含氯氟烃或其混合物，特别是氢氟烷，特别是1,1,1,2-四氟乙烷、1,1,1,2,3,3,3-六氟正丙烷或其混合物，所述siNA分子包含下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。气溶胶组合物可以任选包含本领域众所周知的另外配制赋形剂，例如表面活性剂。非限制性例子包括油酸、卵磷脂或寡聚乳酸或衍生物例如WO94/21229和WO98/34596中所述的那些、和共溶剂例如乙醇。在一个实施方案中，本发明的药物气溶胶制剂包括本发明的化合物和碳氟化合物或含烃含氯氟烃或其混合物作为推进剂，任选与表面活性剂和/或共溶剂组合。
本发明的气溶胶制剂可以通过加入合适缓冲剂进行缓冲。
气溶胶制剂可以包括任选的添加剂，包括防腐剂，如果制剂未制成无菌的。非限制性例子包括羟苯甲酯、抗氧化剂、调味剂、挥发性油、缓冲剂和乳化剂及其他制剂表面活性剂。在一个实施方案中，碳氟化合物或全氟化碳载体用于减少降解且提供本发明的组合物（例如siNA和/或其LNP制剂）更安全的生物相容性非液体微粒悬浮液。在另一个实施方案中，包括喷雾器的装置递送包括含氟化合物的本发明的组合物（例如siNA和/或其LNP制剂），所述含氟化合物是抑菌的，从而减少在相容装置中的微生物生长可能性。
可以配制用于在例如胶质的吸入器或吹入器中使用的包括本发明组合物的胶囊和药液筒，其包含用于吸入本发明的化合物和合适粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。在一个实施方案中，每个胶囊或药液筒一般可以包含siNA分子和一种或多种赋形剂，所述siNA分子包含下述的至少15个核苷酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：150；或包含SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46、或SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50、或SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52、或SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54、或SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116、或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64、或SEQ ID NO：117和SEQ ID NO：118，或式（A）。在另一个实施方案中，本发明的化合物可以不含赋形剂例如乳糖呈现。
本发明的气溶胶组合物可以作为包括可吸收大小的颗粒的制剂施用到呼吸系统内，例如大小足够小的颗粒以在吸入后经过鼻、口和喉以及通过肺的支气管和肺泡。一般而言，可吸收颗粒大小为约0.5 - 10微米。在一个实施方案中，颗粒范围可以是1 - 5微米。在另一个实施方案中，颗粒范围可以是2 - 3微米。包括在气溶胶中的不可吸收大小的颗粒倾向于沉积在喉中且被吞咽，并且气溶胶中不可吸收颗粒的量因此降到最低。对于鼻施用，10 - 500 um的粒度是优选的，以确保保留在鼻腔中。
在一些实施方案中，本发明的siNA组合物局部施用于鼻例如用于治疗鼻炎，经由增压气溶胶制剂，通过增压泵或通过喷雾化施用于鼻的水性制剂。合适的制剂包含水作为稀释剂或载体用于这个目的。在某些实施方案中，用于将本发明的组合物施用于肺或鼻的水性制剂可以与常规赋形剂例如缓冲试剂、张度修饰剂等一起提供。
b. 装置
本发明的siNA分子可以如上文讨论的作为颗粒和/或气溶胶进行配制且递送，并且通过本领域技术人员已知的多种气溶胶化（aerosolization）装置进行分配。
包含本发明的siNA分子或制剂的液体或非液体颗粒的气溶胶可以通过任何合适的方法产生，例如用包括喷雾器的装置（参见例如US 4,501,729），例如超声或空气喷射喷雾器。在一个实施方案中，用于施用本发明的siNA分子的喷雾器依赖于振荡信号以驱动压电陶瓷振荡器用于产生高能超声波，这机械地搅拌本发明的组合物（例如siNA和/或其LNP制剂），生成药物气溶胶云雾。（参见例如美国专利号7,129，619 B2和7,131,439 B2）。在另一个实施方案中，喷雾器依赖于压缩空气与本发明的组合物（例如siNA和/或其LNP制剂）的空气喷射混合，以形成在气溶胶云雾中的小滴。
与本发明的siNA分子或制剂一起使用的喷雾器装置可以使用载体，一般为包含本发明的siNA分子的水或稀释水或非水溶液。本发明的一个实施方案是包括使用醇溶液的喷雾器的装置，所述醇溶液优选通过添加例如包括本发明的siNA分子或制剂的氯化钠或其他合适的盐制成与体液等渗。在另一个实施方案中，喷雾器装置包括包含本发明的siNA分子或制剂的一种或多种非水含氟化合物载体。
包含本发明的siNA分子或制剂和表面活性剂的固体颗粒气溶胶可以用任何固体微粒气溶胶发生器来生产。在一个实施方案中，气溶胶发生器用于给受试者施用固体微粒试剂。这些发生器产生可吸收的颗粒，如下文说明的，作为组合物的预定测定剂量。本发明的某些实施方案包括包括微粒组合的气溶胶，其具有本发明的至少一种siNA分子或制剂与预定体积的悬浮介质或表面活性剂，以提供呼吸掺和物。本发明的其他实施方案包括包含本发明的siNA分子或制剂的气溶胶发生器。
与本发明的siNA分子一起使用的一类固体微粒气溶胶发生器是吹入器。用于通过吹入法施用的合适制剂包括精细捣碎的粉末，其可以借助于吹入器进行递送。在吹入器中，粉末例如有效执行本文描述的治疗的其计量剂量包含在一般由明胶或塑料制成的胶囊或药液筒中，其穿入或原位打开并且经由在吸入后通过设备吸取的空气或借助于手工操作的泵递送粉末。吹入器中使用的粉末单独由活性成分组成，或由包含活性成分、合适的粉末稀释剂例如乳糖和任选的表面活性剂的粉末掺合物组成。第二种类型的举例说明性气溶胶发生器包含计量剂量吸入器（"MDI"）。
MDI是增压气溶胶分配器，一般包含活性成分在液化推进剂的悬浮液或溶液制剂。在使用期间，这些设备通过适合于递送计量容积的阀排出制剂，以产生包含活性成分的细颗粒喷雾。合适的推进剂包括某些含氯氟烃，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。制剂可以另外包含一种或多种助溶剂例如乙醇，乳化剂和其他制剂表面活性剂例如油酸或失水山梨醇三油酸酯，抗氧化剂和合适的调味剂。用于肺递送的其他方法在例如美国专利申请号20040037780以及美国专利号6,592,904；6,582,728；6,565,885中得到描述。
MDI的滤毒罐一般包括能够经得住所使用推进剂的蒸气压力的容器，例如塑料或塑料包被的玻璃瓶或优选金属罐，例如铝或其合金，其可以任选是阳极氧化的、漆包被和/或塑料包被的（例如引入本文作为参考的WO96/32099，其中部分或全部内表面由任选与一种或多种非氟碳聚合物组合的一种或多种氟碳聚合物包被，例如但不限于聚四氟乙烯（PTFE）和聚苯醚砜（PES）的聚合物掺和物），所述容器由计量阀门关闭。计量阀门设计为每次启动递送测定量的制剂，且掺入垫圈以防止推进剂通过阀门渗漏。垫圈可以包括任何合适的弹性体材料，例如低密度聚乙烯、氯化丁基、溴化丁基、EPDM、黑色和白色丁二烯-丙烯腈橡胶、丁基橡胶和氯丁橡胶。合适的阀门是从气溶胶工业中众所周知的制造商中商购可得的，所述制造商例如Valois，法国（例如DF10、DF30、DF60），Bespak plc，UK（例如BK300、BK357）和3M-Neotechnic Ltd，UK（例如SpraymiserTM）。
包含本文教导的siNA分子或制剂的MDI可以通过本领域方法进行制备（例如参见Byron上文和WO96/32099）。
与本发明的siNA分子一起使用的MDI也可以与其他结构结合使用，所述其他结构例如但不限于用于贮存且包含MDI的外包装包裹，包括美国专利号6,119,853；6,179,118；6,315,112；6,352,152；6,390,291；和6,679,374中所述的那些，以及剂量计数单元例如但不限于美国专利号6,360,739和6,431,168中所述的那些。
siNA分子还可以配制为液态制剂用于从液体分配器中递送，例如具有分配喷嘴或分配孔口的液体分配器，在使用者施加的力应用于液体分配器的注入机制后，通过所述分配喷嘴或分配孔口分配测定剂量的液体制剂。在本发明的一个实施方案中，提供了液体分配器，其使用液体制剂的多个测定剂量的储库，剂量可在连续泵启动后分配，并且其包含本发明的siNA分子或制剂。在某些实施方案中，分配器的分配喷嘴或孔口可以配置用于插入使用者的鼻孔内，用于包括本发明的siNA分子或制剂的液体制剂的喷雾分配到鼻腔内。上述类型的液体分配器在WO05/044354中描述且举例说明。分配器具有外壳，其容纳具有固定在用于包含液体制剂的容器上的压气泵的液体排放装置。在各种实施方案中，分配器的外壳具有至少一个手指可操作侧杆，其可就外壳而言在内部移动，以使容器在外壳中向上用凸轮带动（cam），以引起泵压缩且注入测定剂量的制剂通过外壳的鼻喷嘴离开泵柄。在另一个实施方案中，液体分配器是在WO05/044354的图30-40中举例说明的一般类型。
在本发明的某些实施方案中，喷雾器装置在用于有意识、自主呼吸的受试者和用于所有年龄的控制换气（ventilated）受试者的应用中使用。喷雾器装置可以用于对于肺的靶向局部和全身性药物递送。在一个实施方案中，包括喷雾器的装置用于将本发明的siNA分子或制剂局部递送至肺或肺组织。在另一个实施方案中，包括喷雾器的装置用于全身地递送本发明的siNA分子或制剂。
在其他实施方案中，喷雾器装置用于递送至少一种活性剂的呼吸分散体，包括乳状液、微乳液或亚微米和纳米微粒悬浮液。（参见例如美国专利号7128,897和7,090,830 B2）。
喷雾器装置可以用于连续或定期地施用包括本发明的siNA分子或制剂的气溶胶，并且可以手动、自动或依照患者的呼吸调控。（参见美国专利号3,812,854，WO 92/11050）。例如，定期施用本发明的siNA分子可以经由微通道挤出室或经由循环增压作为快速灌注剂给予。施用可以是每天一次或每天数次，例如2、3、4或8次，每次给出例如1、2或3个剂量。通过吸入器或吹入器中的胶囊和药液筒递送的日总剂量和测定剂量将一般是由气溶胶制剂递送的那种的加倍。
H. 本发明的siNA分子的其他应用/用途
本发明的siNA分子还可以用于诊断应用、研究应用和/或药剂制备。
在一个方面，本发明的特征在于用于诊断受试者中的疾病、性状或状况的方法，其包括在适合于诊断受试者中的疾病、性状或状况的条件下，给受试者施用本发明的组合物。
在一个实施方案中，本发明的siNA分子用于下调或抑制起于单元型多态性的ICAM-1蛋白质的表达，所述单元型多态性与受试者或生物中的性状、疾病或状况相关。ICAM-1基因、或ICAM-1蛋白质或RNA水平的分析可以用于鉴定具有此类多态性的受试者或处于发展本文描述的性状、状况或疾病的危险中的那些受试者。这些受试者顺应这样的治疗，例如用本发明的siNA分子和在治疗与靶基因表达相关的疾病中有用的任何其他组合物的治疗。照这样，ICAM-1蛋白质或RNA水平的分析可以直接或间接地用于确定受试者治疗中的治疗类型和疗程。ICAM-1蛋白质或RNA水平的监控可以用于预测治疗结果和测定化合物和组合物的效力，所述化合物和组合物调节与性状、病症、状况或疾病相关的某些ICAM-1蛋白质的水平和/或活性。
在另一个实施方案中，本发明包括根据本发明的双链核酸用于在药物制备中使用的用途。在一个实施方案中，药物用于在治疗通过ICAM-1的作用或通过ICAM-1作用的丧失介导的状况中使用。在一个实施方案中，药物用于治疗呼吸性疾病的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗选自下述的呼吸性疾病的用途：COPD、囊性纤维化、哮喘、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎、窦炎。在一个特定实施方案中，用途是用于治疗选自COPD、囊性纤维化和哮喘的呼吸性疾病。
在某些实施方案中，siNAs 29282-DC、29284-DC、29285-DC、29286-DC、29288-DC、29292-DC、48722-DC和48723-DC，以及其中至少一条链包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145；SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149或SEQ ID NO：150的至少15个核苷酸的siNA，和包含式（A）的siNA用于在用于治疗呼吸性疾病的方法中使用，所述呼吸性疾病例如但不限于COPD、囊性纤维化、哮喘、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎和窦炎。
I. 实施例
本发明现在将由下述非限制性实施例进行举例说明。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修饰的多种非关键参数，以产生基本相同的结果。
实施例1：针对ICAM-1有活性的siNA的设计、合成和鉴定
ICAM-1 siNA合成
设计、合成一系列42种siNA分子且就针对ICAM-1的功效评估。关于用于人siNA的ICAM-1设计的主要标准是（i）与人种的同源性，和（ii）如通过有专利权的（proprietary）算法测定的高功效得分。还考察了用于在动物模型中使用的小鼠序列。还检查了siNA对ICAM-1 RNA水平的作用。设计、合成且就针对ICAM-1的功效评估的siNA序列在表1a（靶序列）和表1b（修饰序列）中描述。
表1a： ICAM-1 靶序列，注明靶位点。同源性列指出siNA与人转录物（h）、或小鼠转录物（m）的完全同源性。
| 双链体ID | 靶序列 | 靶位点 | 同源性 | SEQ ID NO: |
| 29281-DC | CAGUGACUGUCACUCGAGA | 1650 | h | 1 |
| 29282-DC | CGCAUCUGAUCUGUAGUCA | 2113 | h | 2 |
| 29283-DC | CUCAGCACGUACCUCUAUA | 1811 | h | 3 |
| 29284-DC | CUCAGUCAGUGUGACCGCA | 1141 | h | 4 |
| 29285-DC | GGAACAACCGGAAGGUGUA | 537 | h | 5 |
| 29286-DC | CGGAAGAUCAAGAAAUACA | 1838 | h | 6 |
| 29288-DC | CAUUGUCCUCAGUCAGAUA | 2046 | h | 7 |
| 29289-DC | GGAGCAAGACUCAAGACAU | 2152 | h | 8 |
| 29290-DC | CAGACAGUGACCAUCUACA | 1226 | h | 9 |
| 29291-DC | GAUCUGUAGUCACAUGACU | 2120 | h | 10 |
| 29292-DC | GCCAAUUUCUCGUGCCGCA | 863 | h | 11 |
| 48697-DC | GCUCAGGAGGAGGCCAUAA | 1641 | m | 12 |
| 48698-DC | AGAAAGAUCAGGAUAUACA | 1611 | m | 13 |
| 48699-DC | GCUGGCAUUGUUCUCUAAU | 668 | m | 14 |
| 48700-DC | UGCCAGUACUGCUGGUCAU | 1549 | m | 15 |
| 48701-DC | AGUACUGUACCACUCUCAA | 1505 | m | 16 |
| 48702-DC | ACCUUAACAGUCUACAACU | 990 | m | 17 |
| 48703-DC | CCGUGUAUUCGUUUCCGGA | 394 | m | 18 |
| 48704-DC | CGUGUAUUCGUUUCCGGAG | 395 | m | 19 |
| 48705-DC | AGGACCUUAACAGUCUACA | 987 | m | 20 |
| 48706-DC | GCUUGGAGACUCAGUGGCU | 250 | m | 21 |
| 48707-DC | ACUCAGUGGCUGAAAGAUG | 258 | m | 22 |
| 48708-DC | ACAGCAUUUACCCUCAGCC | 1762 | m | 23 |
| 48709-DC | GGACCUUAACAGUCUACAA | 988 | m | 24 |
| 48710-DC | CCUCGUGAUGGCAGCCUCU | 1574 | m | 25 |
| 48711-DC | CGUGAUGGCAGCCUCUUAU | 1577 | m | 26 |
| 48712-DC | UGAUGGCAGCCUCUUAUGU | 1579 | m | 27 |
| 48713-DC | GGACUUUCGAUCUUCCAGC | 709 | m | 28 |
| 48714-DC | GGGUCGAAGGUGGUUCUUC | 1089 | m | 29 |
| 48715-DC | ACUUGUAGCCUCAGAGCUA | 1828 | m | 30 |
| 48716-DC | GCAGUCGUCCGCUUCCGCU | 368 | m | 31 |
| 48717-DC | GGUGACUGAGGAGUUCGAC | 911 | m | 32 |
| 48718-DC | CUCUUCCUCGGCCUUCCCA | 1938 | h | 33 |
| 48719-DC | CAGUGACCAUCUACAGCUU | 1230 | h | 34 |
| 48720-DC | GUGUCUAAAGGAUGGCACU | 1609 | h | 35 |
| 48721-DC | GUUGCUCCUGCCUGGGAAC | 523 | h | 36 |
| 48722-DC | GACAUACAACUGGGAAAUA | 2240 | h | 37 |
| 48723-DC | CUGGCAAUGCCCAGACAUC | 390 | h | 38 |
| 48724-DC | CUGAGCAAUGUGCAAGAAG | 560 | h | 39 |
| 48725-DC | CAGUCAGUGUGACCGCAGA | 1143 | h | 40 |
| 48726-DC | GAGACACUGCAGACAGUGA | 1217 | h | 41 |
| 48727-DC | GGGAUUGUCCGGGAAACUG | 1521 | h | 42 |
对于靶序列的每种寡核苷酸，使用固相合成分开合成siNA的2条单个的、互补链，随后通过反相固相萃取（SPE）分开进行纯化。使互补链退火以形成双链（双链体），且以所需浓度和在选择的缓冲剂中进行递送。
简言之，使用亚磷酰胺化学法在如本领域一般已知的自动化固相合成仪（参见例如USSN 12/064,014）上合成单链寡核苷酸。将可调节的合成柱装满由第一个核苷残基衍生的固体支持体。通过酸不稳定的5'-O-二甲氧三苯甲基的脱三苯甲基作用以释放5'-羟基来起始合成。将溶于乙腈的亚磷酰胺和合适的活化剂同时递送给合成柱，从而导致亚磷酰胺（amidite）与5'-羟基的偶联。随后用乙腈洗涤柱。将碘溶液泵过柱以使亚磷酸三酯键P（III）氧化成其磷酸三酯P（V）类似物。在2,6-二甲基吡啶和N-甲基咪唑的存在下，未反应的5'-羟基使用试剂例如乙酸酐进行加帽。对于下一个亚磷酰胺掺入，延伸循环由脱三苯甲基作用步骤重新开始。重复这个过程直至所需序列合成。通过最后的5'-末端保护基团（三苯甲基或5’-O-二甲氧三苯甲基）终止合成。
合成一结束，就使固体支持体和结合的寡核苷酸在氩压力或真空下干燥。添加水基且使混合物加热，以实现琥珀酰键的切割，氰乙基磷酸保护基团的去除和环外胺保护的脱保护。
对不包含核糖核苷酸的单链执行下述过程。用水基处理固体支持体后，过滤混合物以使固体支持体和脱保护的粗合成材料分开。随后用水漂洗固体支持体，将其与滤液组合。所得到的碱性溶液允许保有5’-O-二甲氧三苯甲基基团，以保留在5'末端位置上（三甲苯基依赖）。
对包含核糖核苷酸的单链执行下述过程。用水基处理固体支持体后，过滤混合物以使固体支持体和脱保护的粗合成材料分开。随后用二甲基亚砜（DMSO）漂洗固体支持体，将其与滤液组合。将氟化物试剂例如三氢氟酸三乙胺加入混合物中，并使溶液加热。用合适的缓冲液猝灭反应，以提供在最后的5'末端位置上具有5’-O-二甲氧三苯甲基基团的粗制单链的溶液。
每种粗制单链的三苯甲基依赖溶液使用层析纯化例如SPE RPC纯化进行纯化。三苯甲基基团的疏水性质允许所需全长寡核苷酸而不是非三苯甲基化的截短的失败序列的更强保留。失败序列用合适溶剂例如低百分比的乙腈从树脂中选择性洗涤。保留的寡核苷酸随后在具有三氟乙酸的柱上进行脱三苯甲基，以去除酸不稳定的三苯甲基基团。从柱中洗涤残留酸，执行盐交换，并且开始材料的最后脱盐。全长寡核苷酸用水性-有机溶剂以纯化的形式回收。最终产物随后就纯度（HPLC）、同一性（Maldi-TOF MS）和得率（UV A260）进行分析。寡核苷酸经由冻干或真空缩合进行干燥。
退火：基于产物的分析，将干燥的寡核苷酸溶解于合适的缓冲液中，随后混合等摩尔量的（使用理论消光系数计算的）有义和反义寡核苷酸链。溶液随后通过层析法就双链体的纯度和所需终浓度进行分析。如果分析指出任一链的过量，那么滴定另外的非过量链直至双链体形成完成。当分析指出已达到希望的产物纯度时，材料进行递送且准备使用。
下文是显示使用这种规程合成的各种siNA的表。
表1b. 合成的ICAM-1 siNA链
其中：
A、C、G和U = 核糖 A、C、G或U
c和u = 2'-脱氧-2'-氟C或U
A、U和G = 2'-O-甲基（2'-OMe）A、U或G
A和G = 脱氧 A或G
B = 反向脱碱基的
T = 胸苷。
用于商业制备的进一步合成步骤
当分析指出在退火步骤后已达到所需产物纯度时，就将材料转移至切向流过滤（TFF）系统用于浓缩和脱盐，与在退火步骤之前完成这点成对比。
超滤：退火的产物溶液使用包含合适的分子量截止膜的TFF系统进行浓缩。浓缩后，产物溶液经由渗滤使用Milli-Q水进行脱盐，直至滤液的传导性是水的那种。
冻干：将浓缩的溶液转移至瓶，速冻且与冷冻干燥机附着。随后将产物冷冻干燥成粉末。从冷冻干燥机中取出瓶且现在准备使用。
起始筛选规程（96孔板转染）
细胞培养制备：
除非另有说明，否则所有细胞得自ATCC（Manassas，VA）。细胞在标准条件下进行生长且转染，所述标准方法在下文详细描述。
Calu-1（人；ATCC目录#HTB-54）：细胞在37℃在5％CO2的存在下培养，并且在McCoy's 5a培养基中生长，所述培养基补充有以10％终浓度的胎牛血清以及100μg/mL链霉素和100U/mL青霉素。
转染和筛选
所用转染使用RNAiMax (Invitrogen Cat# 13778-150) 按照制造商说明书进行。
Calu-1细胞以在100μL合适培养基中5,000个细胞/孔的最终计数在组织培养处理的、96孔板的所有孔中铺平板。细胞在铺平板后在5％CO2的存在下在37℃培养24小时。
在24小时后，如下产生包含siNA和RNAiMax的复合物：制备在OPTI-MEM中稀释33倍的RNAiMax溶液。平行地，在OPTI-MEM中制备终浓度120 nM的siNA溶液用于测试。在RNAiMax/OPTI-MEM溶液于室温孵育5分钟后，对于每种siNA一起加入等体积的siNA溶液和RNAiMax溶液。混合导致其中siNA浓度为60 nM的siNA/RNAiMax溶液。这种溶液在室温孵育20分钟。在孵育后，将20 uL溶液加入每个相关孔中。每个孔中siNA的终浓度是10 nM，并且每个孔中RNAiMax的终体积是0.3uL。
与RNAiMax-siNA复合物的孵育时间是24小时，除非另有说明。在细胞的转染和收集之间在培养基中不存在改变，除非另有说明。
在96孔板中以类似方式进行剂量应答曲线，同时在各个转染中维持恒定量的RNAiMax。
RNA分离和逆转录（96孔板）
使用TaqMan? Gene Expression Cells-to-CT? Kit（Cat# 4399002）用修饰规程从96孔板中提取RNA。简言之，将60uL（1块板）或110uL（2块板）具有DNA酶I的裂解液分配到裂解缓冲液板（twin.tec全裙边板（full skirt plate））的每个孔内。裂解缓冲液和终止板贮存于4℃直至洗涤细胞时。
板以1100 rpm旋转5分钟。抽吸培养基且从培养板的孔中弃去。使用BioMek FX仪器和方法自动执行裂解。在BioMek法完成后，使裂解板在室温孵育2分钟。裂解板可以在4℃贮存2小时，或在-20℃或-80℃贮存2个月。
逆转录板的每个孔需要10uL 2X逆转录酶缓冲液、1uL 20X逆转录酶和2uL无核酸酶水。通过使2X逆转录酶缓冲液、20X逆转录酶混合物和无核酸酶水混合制备逆转录主要混合物（master mix）。将13uL逆转录主要混合物分配到逆转录板（半裙边（semi-skirted））的每个孔内。对于每块细胞板制备分开的逆转录板。将板装载到Biomek NX或Biomek FX Dual -96上，并且运行Biomek法。程序进行编程，以将来自上述细胞裂解规程的7uL裂解物自动加入逆转录板的每个孔中。使板密封且在离心机（1000rpm共30秒）上旋转，以使内容物沉降至逆转录板的底部。将板置于热循环仪中于37℃60分钟，95℃5分钟和4℃直至板从热循环仪中取出时。在取出后，如果不立即使用，使板在-20℃冷冻。
定量RT-PCR（Taqman）
一系列探针和引物用于检测在人细胞系中的ICAM-1和ICAM-2基因的各种miRNA转录物（参见表2）。本文所述的用于实验的所有Taqman探针和引物由Applied Biosystems, Inc.以预先确认的设置提供（参见表2）。根据制造商的说明书，在ABI 7900仪器上执行测定。
表2: 用于执行ICAM-1和ICAM-2 mRNA分析的实时RT/PCR (Taqman)反应的探针和引物
| 物种 | 基因 | 探针/引物 |
| 人 | ICAM-1 | ABI Cat. # Hs00164932_m1 |
| 人 | ICAM-2 | ABI Cat. # Hs00168384_m1 |
使用TaqMan Gene Expression Master Mix（在Cells-to-CT?，Applied Biosystems，Cat # 4399002中提供）。PCR反应如下执行：50℃2分钟、95℃20分钟，随后为在95℃15秒和60℃1分钟的40个循环。
在每次实验内，基线设置在扩增曲线的指数期，并且基于基线与扩增曲线的交叉点，由仪器指定Ct(cythle阈)值。
ICAM-1 ELISA
在96孔板中，5,000 Calu-1个细胞/孔接种在100 uL的完全生长培养基中，并在37℃和5% CO2下过夜孵育。使用RNAiMax (Invitrogen, Cat# 13778-150)用siNA转染细胞，siRNA终浓度为10 nM – 0.0000097 nM。在每个孔中RNAiMax的量是0.3 uL。将siNA孵育6小时。用95 uL的新鲜完全生长培养基替换培养基，并且添加5uL/孔的10 ng/ml 终浓度的INF-γ/TNF-α。孵育细胞24、48和72小时。
表面ICAM-1的原位ELISA如下进行。细胞在PBS中洗涤两次。孔用超级封闭缓冲液(Pierce, Cat # 37535)在37℃预封闭1.5小时。用PBS洗涤细胞三次。一级单克隆抗体(Abcam, 克隆MEM-111, Cat ab2213)以1:3000在超级封闭缓冲液中稀释。每孔加入50μl一级抗体 。在室温缓慢振荡孔1小时。用PBS洗涤细胞三次。兔多克隆二级抗体(Abcam, Cat ab6728)以1:1000在超级封闭缓冲液中稀释。每孔加入50μl二级抗体 。混合物在37℃孵育1小时。用PBS洗涤细胞三次。每孔加入50μl的TMB溶液(Sigma, Cat# T-8665)并在暗处孵育10分钟。加入50μl终止溶液。在450nM读出吸光值。
计算
使用比较Ct法计算目的基因的表达水平和击倒（knock-down）％：
ΔCt = Ct 靶 – Ct GAPDH
ΔΔCt = ΔCt（靶siRNA）– ΔCt（NTC）
相对表达水平= 2-ΔΔCt
％KD = 100 x（1 - 2-ΔΔCt） 。
除非另有说明，否则选择非靶向对照siNA作为针对其计算击倒％的值，因为它是最相关的对照。
另外，仅检查反映细胞的一般健康和RNA提取的质量的标准化数据。这通过考察处理细胞中2种不同mRNA的水平来完成，第一种是靶mRNA，并且第二种是标准物mRNA。这允许消除对于细胞潜在毒性而不是仅仅击倒目的基因的siNA。这通过相对于关于整块板的Ct比较在每个孔中关于GAPDH的Ct来完成。
使用SigmaPlot 10.0软件执行IC50的所有计算。使用用于简单配体结合的S形剂量应答（变量斜度）等式分析数据。在击倒％的所有计算中，相对于用非靶向对照（Ctrl siNA）处理的样品中的目的基因表达的标准化水平进行计算，除非另有说明。
将siNA对ICAM-1蛋白水平的作用相互比较，并且与通用对照的作用比较，使用多比较ANOVA测试以获得 95%置信区间。按照标准解释，不包括0的95%置信区间被认为在5%显著性水平上是显著的。
结果：
如前所述设计且合成42种siNA。在Calu-1细胞中筛选siNA。在人细胞中来自ICAM-1 siNA筛选的数据显示于表3中。
表3. 人Calu-1细胞中的筛选数据概括。％KD表示为平均值± S.D。筛选在转染后24小时时执行。
| 双链体ID | % KD人 | 同源性 | 位点 |
| 29281-DC | 45 ± 21 | h | 1650 |
| 29282-DC | 95 ± 2 | h | 2113 |
| 29283-DC | 63 ± 8 | h | 1811 |
| 29284-DC | 85 ± 1 | h | 1141 |
| 29285-DC | 85 ± 6 | h | 537 |
| 29286-DC | 89 ± 3 | h | 1838 |
| 29288-DC | 86 ± 3 | h | 2046 |
| 29289-DC | 78 ± 15 | h | 2152 |
| 29290-DC | 47 ± 18 | h | 1226 |
| 29291-DC | 84 ± 7 | h | 2120 |
| 29292-DC | 76 ± 3 | h | 863 |
| 48697-DC | 14 ± 11 | m | 1641 |
| 48698-DC | 34 ± 6 | m | 1611 |
| 48699-DC | 25 ± 9 | m | 668 |
| 48700-DC | 13 ± 5 | m | 1549 |
| 48701-DC | 3 ± 17 | m | 1505 |
| 48702-DC | 19 ± 6 | m | 990 |
| 48703-DC | 30 ± 15 | m | 394 |
| 48704-DC | 33 ± 22 | m | 395 |
| 48705-DC | 5 ± 51 | m | 987 |
| 48706-DC | 23 ± 31 | m | 250 |
| 48707-DC | 46 ± 17 | m | 258 |
| 48708-DC | 22 ± 9 | m | 1762 |
| 48709-DC | 32 ± 14 | m | 988 |
| 48710-DC | 25 ± 5 | m | 1574 |
| 48711-DC | 42 ± 13 | m | 1577 |
| 48712-DC | 34 ± 27 | m | 1579 |
| 48713-DC | 36 ± 17 | m | 709 |
| 48714-DC | 48 ± 22 | m | 1089 |
| 48715-DC | 14 ± 12 | m | 1828 |
| 48716-DC | 22 ± 6 | m | 368 |
| 48717-DC | -9 ± 17 | m | 911 |
| 48718-DC | 19 ± 11 | h | 1938 |
| 48719-DC | 71 ± 9 | h | 1230 |
| 48720-DC | 48 ± 20 | h | 1609 |
| 48721-DC | 56 ± 16 | h | 523 |
| 48722-DC | 92 ± 1 | h | 2240 |
| 48723-DC | 68 ± 12 | h | 390 |
| 48724-DC | 34 ± 8 | h | 560 |
| 48725-DC | 53 ± 19 | h | 1143 |
| 48726-DC | 64 ± 16 | h | 1217 |
| 48727-DC | 23 ± 6 | h | 1521 |
关于某些siNA在人细胞中的ICAM-1 mRNA击倒的效力和功效的概括数据在表4中呈现。用范围为0.083fM - 30nM的12个浓度的siNA处理用于实验的细胞。所有数据呈现为针对GAPDH mRNA表达水平的表达标准化的ICAM-1的击倒％。随后数据测定为相对于非靶向对照siNA的击倒％。
表4. 在人细胞中通过某种siNA引起的ICAM-1 mRNA击倒的功效（％KD）和效力（IC50）概括。数据来自3次分开的实验。％KD表示为平均值± S.D。
| 双链体ID | 同源性 | 在10 nM的% KD | 在DRC中的最大% KD | IC50 (pM) |
| 29282-DC | h | 95 ± 2 | 88 ± 4 | 86 ± 47 |
| 29284-DC | h | 85 ± 1 | 73 ± 4 | 281 ± 233 |
| 29285-DC | h | 85 ± 6 | 70 ± 15 | 394 |
| 29286-DC | h | 89 ± 3 | 81 ± 6 | 433 ± 468 |
| 29288-DC | h | 86 ± 3 | 78 ± 5 | 215 ± 129 |
| 48722-DC | h | 92 ± 1 | 85 ± 1 | 98 ± 50 |
还评估了表4这六种siNA的特异性。siNA以1 nM浓度进行测试，以测定ICAM-1 siNA对人ICAM-2的mRNA转录物的作用。特异性数据显示于表5中。
表5. ICAM-1 mRNA筛选数据和ICAM-2特异性筛选的概括。该数据来自3次独立实验。值为平均值± S.D。
这些siNA显示在高于它们对于ICAM-1的IC50至少90倍的浓度对ICAM-2 mRNA转录物的显著降低。
使用ELISA测定还评估了各种siNA击倒ICAM-1蛋白的潜能。在ICAM-1 ELISA中，贯穿一系列的siNA浓度，测试六种siNA。将每种样品的吸光值标准化为获自未用INF-γ/TNF-α刺激的孔的平均吸光值（n=6）。这些孔用作背景对照（参见表6）。
表6. 在24、48和72小时ICAM-1蛋白水平的概括。数据表示为相对于UC3的% KD。
在所有六种情况中，siNA显示杂所有测试时间点的ICAM-1蛋白的剂量依赖性降低。48小时孵育在每个独立实验 (n = 3) 中产生在技术重复 (n = 3)之间最小的变化，并与可信赖的信号强度组合。由于这些原因，48小时时间点被选为最适孵育时间。
实施例2：在人支气管上皮细胞中的siNA的体外评估
如下在人支气管上皮细胞中就最大限度ICAM-1 mRNA击倒和效力(EC50)测试对应于29961-DC、29964-DC、29984-DC、29988-DC、29957-DC、29947-DC和29956-DC的双链体ID编号的siNA。
细胞培养制备：
得自Lonza的人支气管上皮细胞（NHBE细胞）（目录号CC-2540）在5％CO2的存在下在37℃生长，并且在BEBM基本培养基（Lonza，目录号CC-3171）中在Biocoat胶原1包被的培养瓶（Becton Dickinson）上培养。
人肺上皮癌（Calu-1）细胞在5％CO2的存在下在37℃生长，并且在添加10%胎牛血清、谷氨酰胺和抗生素的DMEM培养基中培养。
转染：
NHBE细胞在胶原1包被的板中铺平板，并且在合适培养基中培养。细胞在铺平板后在5％CO2的存在下在37℃培养24小时。siNA和转染试剂在OptiMEM 1中稀释至需要浓度。对于siNA制剂，使相等体积的稀释siNA和递送脂质组合，并且在室温孵育20分钟。向96孔板的每个孔加入10ul配制的siNA和90ul BEBM培养基（6次重复/数据点/siNA浓度），以便给出siNA的6点剂量范围（100nM、30nM、10nM、3nM、1nM、0.3nM）。在转染后18小时，更换培养基。ICAM-1 mRNA的基本表达在NHBE细胞中较低，因此用重组人TNF-α（R&D systems）以终浓度10 ng/ml刺激细胞6小时以诱导ICAM-1表达。在转染后24小时，裂解细胞。
RNA分离96孔板：
根据制造商的说明书，使用Automated SV96 Total RNA Isolation System（Promega），从96孔板形式中的细胞中分离总RNA。Biomek 2000 Laboratory Automation Workstation（Beckman Coulter）用于将转染细胞溶解产物应用于硅胶膜。将无RNA酶的DNA酶I随后直接应用于硅胶模，以消化污染性基因组DNA。通过简单洗涤步骤，使结合的总RNA进一步纯化以去除污染性盐、蛋白质和细胞杂质。最后，通过加入无核酸酶的水从膜中洗脱总RNA。
定量RT-PCR（TaqMan）：
一系列探针和引物用于检测在人细胞系中的ICAM-1、OAS1和GAPDH（作为对照/标准化）的mRNA转录物。根据制造商的说明书，在ABI 7900HT仪器上执行测定。使用的引物探针组如下表7所述。
表7：引物探针组
| 人靶 | 引物探针序列 | SEQ ID NO: |
| GAPDH | 正向5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3 | 152 |
| GAPDH | ’反向 5’-GGGCCATCCACAGTCTTCT-3’ | 153 |
| GAPDH | 探针 5’d FAM-ACCACAgTCCATgCCATCACTgCCA-TAMRA 3’ | 154 |
| ICAM-1 | 正向5’- GCTCTGCAACCCTGGAGGT -3’ | 155 |
| ICAM-1 | 反向 5’- GGCCATACAGGACACGAAGC -3’ | 156 |
| ICAM-1 | 5’d FAM- CCAGCTTATACACAAGAACCAGACCCGG-TAMRA 3’ | 157 |
| OAS1 | 正向5’-ACCTAACCCCCAAATCTATGTCAA-3’ | 158 |
| OAS1 | 反向 5’-TGGAGAACTCGCCCTCTTTC-3’ | 159 |
| OAS1 | 探针 5’d FAM-CTCATCgAggAgTgCACCgACCTg-TAMRA 3’ | 160 |
TAMRA（四甲基-6-羧基罗丹明）是猝灭剂染料
FAM（羧基荧光素）是报道染料。
计算：
用TaqMan数据将临界阈值（Ct）转换为对应于在384孔板的每个孔中分析的特定基因的拷贝数。对于给定处理在每块板中制备6个等同孔。因此，计算平均基因拷贝数和标准差。变异系数（CV）百分比（％C.V.=[标准差/平均值]*100）的测定允许省略其值为离群值的孔（从而使得％C.V.<25）。通过用其在那个特定样品中的GAPDH配对物除那种基因的平均拷贝数测定基因的相对丰度（aka相对表达）。
数据的统计分析：
EC50值使用sigma图由数据进行计算。siNA的功效和效力的所有计算相对于非靶向对照siNA完成。
结果：
siNA 29282-DC、29288-DC、48721-DC、29286-DC和29284-DC（分别为靶位点2113、2046、2240、1838和1141）在人正常支气管上皮细胞（NHBE）中显示ICAM-1 mRNA的最大限度以及剂量依赖性击倒（KD），证明高功效和效力。表8显示在转染后48小时用靶向ICAM-1的siNA在来自NHBE的3个单独供体中的平均数据。
表8：人ICAM-1 mRNA的功效(%KD) 和效力 (EC50) 。与非靶向对照siNA相比，TNF-α的击倒诱导ICAM-1 mRNA（每个数据为3个供体的平均值）。
| 靶位点 | 最大限度mRNA击倒NHBE | ICAM-1 mRNA击倒NHBE 细胞 |
| 537 | 42% | >100nM |
| 1141 | 56% | 30nM |
| 1838 | 73.4% | 17.5nM |
| 2046 | 69% | 11.3nM |
| 2113 | 74% | 6.1nM |
| 2240 | 67% | 13.3nM |
实施例3：siNA关于TLR3介导的免疫刺激的测试
Calu-1或NHBE细胞如上文实施例2中所述进行处理且用于测量胞内体TLR3介导的免疫刺激，包括聚I:C作为关于OAS1 mRNA上调的阳性对照。对于膜结合的TLR3介导的免疫刺激的测量，Calu 1细胞以12000个细胞/96孔培养，并且在不存在递送媒介物的情况下以100nM、30nM、10nM、3nM、1nM、0.3nM施用在PBS中的siRNA。
当用已用递送媒介物(Gemini表面活性剂GSC170 Dab – WO03/82809中实施例37 ) 配制的siNA转染的NHBE细胞时，通过记录OAS1 mRNA水平的百分比增加，还测量了内涵体TLR3介导的免疫刺激 (相对于Gemini递送媒介物的OAS1 mRNA水平的百分比增加)。TLR3激动剂Poly I: C用作OAS1 mRNA诱导的阳性对照。
上述的免疫刺激测试的结果显示于表9。
表9：siNA的TLR3免疫刺激活性的概括
实施例4：在雄性CD大鼠的气道中的免疫刺激测试
siNA/媒介物预处理
雄性CD大鼠(150-250g)用异氟烷 (5%, 2L/min O2, 1L/min NO)麻醉并使动物仰卧且以约35o的角度置于给药桌上，在它们门牙下放置金属棒以保持它们的位置。光线与喉外侧具有一定角度以照亮气管。将嘴打开以使气道的上口显现并且将portex套管经由平头的给药针引入气管。然后将200ul的媒介物、通用对照、Poly IC或4种ICAM-1 siNA制剂(siNA 29282-DC、 29288-DC、29286-DC和20284-DC)注射到气道。给药后，在麻醉后恢复过程中，将动物置于仰卧位置。
洗胃方法
肺部攻击后24小时，腹膜内给药过量的戊巴比妥钠来挑选动物。暴露气管并切开小口，将管从中向肺部插入。然后用5ml肝素化(10U/ml) PBS洗涤3次。取出肺实质的小切片并冷冻用于炎性基因表达的转录组分析。
样品处理
支气管肺泡灌洗液(BALF)样品在1300 rpm离心7分钟。取出上清液并用于细胞因子分析。剩余的细胞沉淀重悬于0.5ml PBS中。通过将75ul重悬的BALF液置于细胞离心涂片器支持台来制备重悬液的细胞载片并在500 rpm离心5分钟。使载片空气干燥，然后用Leishmans染料染色(20分钟)以允许差异细胞计数。也使用Sysmex计数器对重悬液进行总细胞计数。从这两次计数，确定BALF中嗜中性粒细胞的总数。
结果
与媒介物对照相比，在滴注siNA后，在大鼠肺中没有观察到嗜中性粒细胞流入的显著增加。上述体内免疫刺激测试的结果显示于图11。
实施例5：局部施用于气道的siNA作用的体内评估
在体外鉴定活性siNA构建体后，使用下文概述的方法，在局部施用于气道后siNA的活性可以在各种实验室物种 – 一般的例子是大鼠中进行评估。siNA、合适的杂乱（scrambled）对照或媒介物在200μl体积中注射到气管内，经由经口放置的插管，而使用异氟烷（在氧中的4.5％）和一氧化二氮（以1:3的比值递送的麻醉药）短暂麻醉动物。为了促进材料的施用，动物仰卧且以约45o的角度置于给药桌上，以经由置于喉上的冷光源便于气道的显现。可替代地，被麻醉的动物经由移液管（给药体积25 μl/鼻孔）进行鼻内给药。在其他研究中，将有意识的啮齿类动物置于圆形Perspex室中，并且暴露于喷雾化的测试材料的气溶胶至少20分钟。当每个给药程序完成时，将动物送回标准容纳笼，并且允许自由接近食物和水。随后在剂量后的设定间隔时，通过戊巴比妥的i.p.注射对动物组（一般为n=4-6）实施人道安乐死。立即取出气道细胞和组织的样品，且置于Trizol或RNAlater中用于后续mRNA提取和分析。在某些研究中，气道组织在4％多聚甲醛中固定用于后续组织学分析。在其他实验中，气道进行灌洗用于分析浸润白细胞群体和/或细胞因子/介质含量。使用标准方法执行RNA提取，并且QRT-PCR用于定量在用活性和对照siRNA处理的动物之间的目的靶mRNA的表达，且测定是否已达到靶击倒。在一些情况下，mRNA表达水平相对于持家基因GAPDH或上皮特异性标记E-钙粘蛋白进行标准化。
材料的制备
在磷酸盐缓冲盐水中制备未配制的siNA和杂乱对照的溶液。还可以使用一系列配制的材料 – 在每种情况下，siNA的作用与相等体积的杂乱对照的作用比较。
实施例6：纳米颗粒封装的siNA/载体制剂的制备
一般的 LNP制剂
siNA纳米颗粒溶液通过将siNA和/或载体分子以0.9 mg/mL的浓度溶解于25 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 4.0）中进行制备。脂质溶液通过将阳离子脂质（例如CLinDMA或DOBMA，参见表13中关于制剂的结构和比值）、DSPC、胆固醇和PEG-DMG（表13中所示的比值）的混合物以约15 mg/mL的浓度溶解于无水乙醇中进行制备。氮与磷酸盐比值是接近3:1。
相等体积的siNA/载体和脂质溶液用2个FPLC泵以相同流速递送至混合T形连接器。背压阀用于调整至所需粒度大小。所得到的乳状混合物收集在无菌玻璃瓶中。随后用相等体积的柠檬酸盐缓冲液缓慢稀释这种混合物，并且通过离子交换膜过滤，以去除混合物中的任何游离siNA/载体。用柠檬酸盐缓冲液（pH 4.0）进行超滤用于去除乙醇（来自ALCO筛选的测试条），且用PBS（pH 7.4）进行超滤以更换缓冲液。最终LNP通过浓缩至所需体积获得，并且通过0.2 μm滤器无菌过滤。所获得的LNP就粒度大小、ζ电势、含醇量、总脂肪含量、封装的核酸和总核酸浓度而言进行表征。
LNP制备过程
在一个非限制性例子中，LNP-086 siNA/载体制剂如下批量制备。过程由下述组成：（1）制备脂质溶液；（b）制备siNA/载体溶液；（3）混合/粒子形成；（4）孵育；（5）稀释；（6）超滤和浓缩。
1. 脂质溶液的制备
使3颈2L圆底烧瓶、冷凝器、量筒和2个10L圆锥形玻璃容器去热原。使脂质加温至室温。用移液管将50.44g CLinDMA转移到3颈圆底烧瓶内，并且加入43.32g DSPC、5.32g胆固醇、6.96g PEG-DMG和2.64g亚油醇。向混合物中加入1L乙醇。使置于加热罩中的圆底烧瓶与J-CHEM过程控制器连接。用搅拌棒和在顶上的冷凝器在氩气下搅拌液体悬浮液。通过具有密封适配器的圆底烧瓶的一个颈将热电偶探头放到悬浮液内。使悬浮液在30℃加热直至它变得澄清。允许溶液冷却至室温，并且转移至圆锥形玻璃容器并且用盖密封。
2. siNA/载体溶液的制备
将称重3.6 g乘以水校正因子（约1.2）的siNA-1粉末加入到无菌容器例如Corning贮存瓶内。将siNA转移至去热原的5 L玻璃容器。用柠檬酸盐缓冲液（25mM，pH 4.0和100 mM NaCl）将称重容器冲洗3x，并且将冲洗液置于5 L容器中，用柠檬酸盐缓冲液QS至4 L。使用下述程序，用UV分光计测定siNA溶液的浓度。从溶液中取出20 μL，稀释50倍至1000 μL，并且在用柠檬酸盐缓冲液确定空白后，记录在A260 nm的UV读数。重复这点。如果关于2个样品的读数是一致的，那么获得平均值且基于siNA的消光系数计算浓度。如果终浓度超出0.90 ± 0.01 mg/mL的范围，那么通过加入更多siNA/载体粉末或加入更多柠檬酸盐缓冲液调整浓度。这个过程对于第二种siNA，siNA-2进行重复。 向去热原的10L玻璃容器中，转移4 L每种0.9 mg/mL siNA溶液。
可替代地，如果siNA/载体溶液包括单一siNA双链体和或载体而不是2种或更多种siNA双链体和/或载体的混合物，那么使siNA/载体溶解于25 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 4.0，100 mM NaCl）中，以获得0.9 mg/mL的终浓度。
使用Master Flex Peristaltic Pump Model 7520-40，脂质/乙醇溶液随后通过Pall Acropak 20 0.8/0.2 μm无菌滤器PN 12203无菌/过滤到去热原的玻璃容器内，以提供用于封装过程的无菌原材料。过滤过程以80 mL规模用20 cm2膜面积运行。流速是280 mL/分钟。这个过程可通过增加管道直径和过滤面积扩大规模。
3. 粒子形成– 混合步骤
打开AKTA P900泵，并且通过将1000 mL 1 N NaOH置于1 L玻璃容器内和将1000 mL 70 ％乙醇置于1 L玻璃容器内，并且使带有压力盖泵与每个容器连接进行消毒。将2000 mL玻璃容器置于泵出口下，以10 psi用氩气冲刷系统将流速设为40 mL/分钟共40分钟时间段。当消毒完成时，关闭气体，并且使泵贮存在溶液中直至准备使用。在使用前，通过使用200 mL乙醇和200 mL无菌柠檬酸盐缓冲液验证泵流动。
使无菌脂质/乙醇溶液、无菌siNA/载体或siNA/载体混合物/柠檬酸盐缓冲溶液与AKTA泵附着，并且使去热原的接受容器（2x批次大小）与盖附着。打开气体并且在混合过程中维持压力在5 - 10 psi之间。
4. 孵育
在混合后使溶液保持进行22 ± 2小时孵育。孵育在室温（20 – 25℃）完成并且加工中溶液避光。
5. 稀释
用相等体积的柠檬酸盐缓冲液稀释脂质siNA溶液，使用双头蠕动泵，Master Flex Peristaltic Pump，Model 7520-40，其设置为具有相等长度的管道和T形连接和360 mL/分钟的流速。
6. 超滤和浓缩
超滤过程是定时过程，并且必须小心地监控流速。这是2步过程；第一步是浓缩步骤，获得从32升到3600 mL和浓度约2 mg/mL的稀释材料。
在第一个步骤中，使具有安装的超滤膜GE PN UFP-100-C-35A的Flexstand与quatroflow泵附着。将200 mL WFI加入储库中，随后为3升0.5 N氢氧化钠，其随后冲刷，通过渗余物至废物。这个过程重复3次。随后3 L WFI冲刷通过系统2次，随后为3 L柠檬酸盐缓冲液。随后排干泵。
将稀释的LNP溶液置于储库内至4升标记。启动泵，并且调整泵速度，使得渗透物流速是300 mL/分钟，并且使得液体水平在储库中恒定在4L。当所有稀释的LNP溶液已转移至储库时，停止泵。通过根据需要调整泵速度，在240分钟内使稀释的LNP溶液浓缩至3600 mL。
第二个步骤是渗滤步骤，将乙醇柠檬酸盐缓冲液更换为磷酸盐缓冲盐水。渗滤步骤花费3小时，并且再次必须小心地监控流速。在这个步骤过程中，通过顶空GC监控乙醇浓度。在3小时（20倍渗滤体积）后，采取第二次浓缩，以使溶液浓缩至约6 mg/mL或1.2升的体积。将这个材料收集到去热原的玻璃容器内。系统用400 mL PBS以高流速冲洗，并且关闭渗透物线路。收集这种材料并且加入第一个收集中。在这个点时的预期浓度是4.5 mg/mL。测定浓度和体积。
将蠕动泵的进料管道置于包含72 L PBS（0.05 μm过滤）的容器内，并且最初调整流速，以维持在储库中3600 mL的定容，且随后增至400 mL/分钟。LNP溶液用PBS（20倍体积）渗滤180分钟。
使LNP溶液浓缩至1.2升标记（mark），并且收集到去热原的2 L刻度量筒内。将400 mL PBS加入储库中，并且再循环2分钟。收集冲洗液，并且加入在刻度量筒中的收集LNP溶液中。
所获得的LNP就粒度大小、ζ电势、含醇量、总脂肪含量、装入胶囊的核酸和总核酸浓度而言进行表征。
本领域技术人员应当理解本发明非常适合于执行目标且获得提及的目标和优点，以及其中固有的那些。作为优选实施方案的目前代表的本文描述的方法和组合物是示例性的且不意欲作为对本发明范围的限制。其中的改变和其他用途对于本领域技术人员将是显而易见的，其包含在本发明的精神内，且由权利要求的范围限定。
表10：ICAM-1登记号
NM_000201 SEQ ID NO: 151
智人细胞间粘附分子1 (ICAM-1), mRNA
gi|167466197|ref|NM_000201.2|[167466197]
NM_010493
小鼠细胞间粘附分子1 (Icam1), mRNA
gi|30172560|ref|NM_010493.2|[30172560]
NM_012967
大鼠细胞间粘附分子1 (Icam1), mRNA
gi|6981067|ref|NM_012967.1|[6981067] 。
表11
关于化学修饰的siNA构建体的稳定化学物（chemistry）的非限制性例子
CAP = 任何末端帽，参见例如图5
所有Stab 00-34化学物可以包含3'-末端胸苷（TT）残基
所有Stab 00-34化学物一般包含约21个核苷酸，但可以如本文所描述的改变
所有Stab 00-36化学物还可以包括如从反义或引导链的5'-末端测定的，在双链核酸双链体的第11个碱基配对位置处在有义或过客链中的单个核糖核苷酸（参见图4C）
S = 有义链
AS = 反义链
*Stab 23具有与3'-帽邻近的单个核糖核苷酸
*Stab 24和Stab 28具有在5'-末端处的单个核糖核苷酸
*Stab 25、Stab 26、Stab 27、Stab 35和Stab 36具有的在5'-末端处3个核糖核苷酸
*Stab 29、Stab 30、Stab 31、Stab 33和Stab 34在5'-末端的前3个核苷酸位置处的任何嘌呤是核糖核苷酸
p = 硫代磷酸酯键
?Stab 35具有在3'-突出端处的2'-O-甲基 U和在5'-末端处的3个核糖核苷酸
?Stab 36具有与靶序列互补的2'-O-甲基突出端（天然存在的突出端）和在5'-末端处的3个核糖核苷酸。
表12
A. 2.5 μmol合成循环ABI 394仪器
· 等待时间不包含递送期间的接触时间
· 串联合成使用接头分子的双重偶联。
表13
脂质纳米颗粒（LNP）制剂
N/P比值 = 阳离子脂质和核酸之间的氮:磷比值
使用的2KPEG是PEG2000，一般可以从～1500到～3000 Da不等的多分散剂（即，其中PEG（n）为约33 - 约67，或平均～45）。
表14
序列表
<110> Shah, Jyoti
Strapps, Walter
Pickering, Victoria
<120> 使用短干扰核酸（siNA）的RNA干扰介导的细胞间粘附分子1（ICAM-1）基因表达的抑制
<130> SIRMIS84WPCT
<160> 160
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
cagugacugu cacucgaga 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
cgcaucugau cuguaguca 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
cucagcacgu accucuaua 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
cucagucagu gugaccgca 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
ggaacaaccg gaaggugua 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
cggaagauca agaaauaca 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
cauuguccuc agucagaua 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
ggagcaagac ucaagacau 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
cagacaguga ccaucuaca 19
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
gaucuguagu cacaugacu 19
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
gccaauuucu cgugccgca 19
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
gcucaggagg aggccauaa 19
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
agaaagauca ggauauaca 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
gcuggcauug uucucuaau 19
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
gcuggcauug uucucuaau 19
<210> 16
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
aguacuguac cacucucaa 19
<210> 17
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
aguacuguac cacucucaa 19
<210> 18
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
ccguguauuc guuuccgga 19
<210> 19
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
cguguauucg uuuccggag 19
<210> 20
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
aggaccuuaa cagucuaca 19
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
gcuuggagac ucaguggcu 19
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
acucaguggc ugaaagaug 19
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
acagcauuua cccucagcc 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
ggaccuuaac agucuacaa 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
ccucgugaug gcagccucu 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
cgugauggca gccucuuau 19
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
ugauggcagc cucuuaugu 19
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
ggacuuucga ucuuccagc 19
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
gggucgaagg ugguucuuc 19
<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
acuuguagcc ucagagcua 19
<210> 31
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
gcagucgucc gcuuccgcu 19
<210> 32
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
ggugacugag gaguucgac 19
<210> 33
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
cucuuccucg gccuuccca 19
<210> 34
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
cagugaccau cuacagcuu 19
<210> 35
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
gugucuaaag gauggcacu 19
<210> 36
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
guugcuccug ccugggaac 19
<210> 37
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
gacauacaac ugggaaaua 19
<210> 38
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
cuggcaaugc ccagacauc 19
<210> 39
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
cugagcaaug ugcaagaag 19
<210> 40
<211> 19
<212> RNA
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<220>
<223> 合成的
<400> 40
cagucagugu gaccgcaga 19
<210> 41
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
gagacacugc agacaguga 19
<210> 42
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
gggauugucc gggaaacug 19
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基帽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 反向脱碱基帽
<400> 43
cagugacugu cacucgagat t 21
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 2'-O-甲基
<400> 44
ucucgaguga cagucacugu u 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基帽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 反向脱碱基帽
<400> 45
cgcaucugau cuguagucat t 21
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 2'-O-甲基
<220>
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<222> (16)..(16)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
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<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
<223> 2'-O-甲基
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ugacuacaga ucagaugcgu u 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基帽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
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<220>
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<222> (7)..(7)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> 2'-脱氧-2'-氟
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cuucuugcac auugcucacu u 21
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<220>
<223> 合成的
<220>
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<222> (1)..(19)
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<220>
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<222> (1)..(1)
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<220>
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<222> (1)..(1)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> 反向脱碱基帽
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<210> 122
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(21)
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ucugcgguca cacugacugu u 21
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<220>
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<220>
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<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> 反向脱碱基帽
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<210> 124
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(9)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
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<220>
<221> misc_feature
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<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
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<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
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<220>
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<220>
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<222> (1)..(19)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<220>
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<222> (1)..(4)
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<220>
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<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(16)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
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<400> 125
gggauugucc gggaaacugt t 21
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(19)
<223> 2'-脱氧-2'-氟
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 2'-O-甲基
<400> 126
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<210> 127
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述的未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 任选的脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他
末端帽
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
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末端帽
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的硫代磷酸酯连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
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脱碱基, 反向脱碱基, 反向nucleotide或other terminal
cap
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> ribonucleotide wherein any pyrimidine is 2'-脱氧-2'-氟或
2'-O-三氟甲基 and any purine is 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的硫代磷酸酯连接
<400> 129
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 21
<210> 130
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> ribonucleotide wherein any pyrimidine is 2'-脱氧-2'-氟或
2'-O-三氟甲基 and any purine is 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的硫代磷酸酯连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 任选的3'-3 attached terminal glyceryl moiety或任选的
脱碱基, 反向脱碱基, 反向nucleotide或other terminal
cap
<400> 130
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 21
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> ribonucleotide wherein any pyrimidine is 2'-脱氧-2'-氟或
2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 任选的脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他
末端帽
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 任选的脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他
末端帽
<400> 131
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 21
<210> 132
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> ribonucleotide wherein any pyrimidine is 2'-脱氧-2'-氟或
2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的硫代磷酸酯连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 任选的3'-3连接末端甘油基部分或任选的
脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他末端
帽
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<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
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2'-O-三氟甲基以及任意嘌呤是2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 任选的脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他
末端帽
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
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末端帽
<400> 133
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 21
<210> 134
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 核糖核苷酸，其中任意嘧啶是2'-脱氧-2'-氟或
2'-O-三氟甲基以及任意嘌呤是2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的硫代磷酸酯连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 任选的3'-3连接末端甘油基部分或任选的
脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他末端
帽
<400> 134
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 任选的脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他
末端帽
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 任选的脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他
末端帽
<400> 135
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<210> 136
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的硫代磷酸酯连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 任选的3'-3连接末端甘油基部分或任选的
脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他末端
帽
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ugacuacaga ucagaugcgn n 21
<210> 137
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
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<222> (1)..(1)
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<220>
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<220>
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<222> (6)..(6)
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
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<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 2'-O-甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的硫代磷酸酯连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 任选的3'-3连接末端甘油基部分或任选的
脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他末端
帽
<400> 138
ugacuacaga ucagaugcgn n 21
<210> 139
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 任选的脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他
末端帽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 任选的脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他
末端帽
<400> 139
cgcaucugau cuguagucan n 21
<210> 140
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的硫代磷酸酯连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 任选的3'-3连接末端甘油基部分或任选的
脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他末端
帽
<400> 140
ugacuacaga ucagaugcgn n 21
<210> 141
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 任选的脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他
末端帽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(7)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(12)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 任选的脱碱基、反向脱碱基、反向核苷酸或其他
末端帽
<400> 141
cgcaucugau cuguagucan n 21
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 如该序列所述未修饰的或修饰的核糖核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(10)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(15)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 2'-脱氧-2'-氟或2'-O-三氟甲基
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 2'-脱氧
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n代表任意核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的硫代磷酸酯连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 任选的3'-3连接末端甘油基部分或任选的
脱碱基, 反向脱碱基, 反向核苷酸或其他末端
帽
<400> 142
ugacuacaga ucagaugcgn n 21
<210> 143
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 143
ugacuacaga ucagaugcg 19
<210> 144
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 144
ugcggucaca cugacugag 19
<210> 145
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 145
uacaccuucc gguuguucc 19
<210> 146
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 146
uguauuucuu gaucuuccg 19
<210> 147
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 147
uaucugacug aggacaaug 19
<210> 148
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 148
uauuucccag uuguauguc 19
<210> 149
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 149
ugcggcacga gaaauuggc 19
<210> 150
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 150
gaugucuggg cauugccag 19
<210> 151
<211> 3249
<212> RNA
<213> 智人
<400> 151
caagcuuagc cuggccggga aacgggaggc guggaggccg ggagcagccc ccggggucau 60
cgcccugcca ccgccgcccg auugcuuuag cuuggaaauu ccggagcuga agcggccagc 120
gagggaggau gacccucucg gcccgggcac ccugucaguc cggaaauaac ugcagcauuu 180
guuccggagg ggaaggcgcg agguuuccgg gaaagcagca ccgccccuug gcccccaggu 240
ggcuagcgcu auaaaggauc acgcgcccca gucgacgcug agcuccucug cuacucagag 300
uugcaaccuc agccucgcua uggcucccag cagcccccgg cccgcgcugc ccgcacuccu 360
gguccugcuc ggggcucugu ucccaggacc uggcaaugcc cagacaucug ugucccccuc 420
aaaagucauc cugccccggg gaggcuccgu gcuggugaca ugcagcaccu ccugugacca 480
gcccaaguug uugggcauag agaccccguu gccuaaaaag gaguugcucc ugccugggaa 540
caaccggaag guguaugaac ugagcaaugu gcaagaagau agccaaccaa ugugcuauuc 600
aaacugcccu gaugggcagu caacagcuaa aaccuuccuc accguguacu ggacuccaga 660
acggguggaa cuggcacccc uccccucuug gcagccagug ggcaagaacc uuacccuacg 720
cugccaggug gagggugggg caccccgggc caaccucacc guggugcugc uccgugggga 780
gaaggagcug aaacgggagc cagcuguggg ggagcccgcu gaggucacga ccacggugcu 840
ggugaggaga gaucaccaug gagccaauuu cucgugccgc acugaacugg accugcggcc 900
ccaagggcug gagcuguuug agaacaccuc ggcccccuac cagcuccaga ccuuuguccu 960
gccagcgacu cccccacaac uugucagccc ccggguccua gagguggaca cgcaggggac 1020
cguggucugu ucccuggacg ggcuguuccc agucucggag gcccaggucc accuggcacu 1080
gggggaccag agguugaacc ccacagucac cuauggcaac gacuccuucu cggccaaggc 1140
cucagucagu gugaccgcag aggacgaggg cacccagcgg cugacgugug caguaauacu 1200
ggggaaccag agccaggaga cacugcagac agugaccauc uacagcuuuc cggcgcccaa 1260
cgugauucug acgaagccag aggucucaga agggaccgag gugacaguga agugugaggc 1320
ccacccuaga gccaagguga cgcugaaugg gguuccagcc cagccacugg gcccgagggc 1380
ccagcuccug cugaaggcca ccccagagga caacgggcgc agcuucuccu gcucugcaac 1440
ccuggaggug gccggccagc uuauacacaa gaaccagacc cgggagcuuc guguccugua 1500
uggcccccga cuggacgaga gggauugucc gggaaacugg acguggccag aaaauuccca 1560
gcagacucca augugccagg cuugggggaa cccauugccc gagcucaagu gucuaaagga 1620
uggcacuuuc ccacugccca ucggggaauc agugacuguc acucgagauc uugagggcac 1680
cuaccucugu cgggccagga gcacucaagg ggaggucacc cgcaagguga ccgugaaugu 1740
gcucuccccc cgguaugaga uugucaucau cacuguggua gcagccgcag ucauaauggg 1800
cacugcaggc cucagcacgu accucuauaa ccgccagcgg aagaucaaga aauacagacu 1860
acaacaggcc caaaaaggga cccccaugaa accgaacaca caagccacgc cucccugaac 1920
cuaucccggg acagggccuc uuccucggcc uucccauauu gguggcagug gugccacacu 1980
gaacagagug gaagacauau gccaugcagc uacaccuacc ggcccuggga cgccggagga 2040
cagggcauug uccucaguca gauacaacag cauuuggggc caugguaccu gcacaccuaa 2100
aacacuaggc cacgcaucug aucuguaguc acaugacuaa gccaagagga aggagcaaga 2160
cucaagacau gauugaugga uguuaaaguc uagccugaug agaggggaag ugguggggga 2220
gacauagccc caccaugagg acauacaacu gggaaauacu gaaacuugcu gccuauuggg 2280
uaugcugagg ccccacagac uuacagaaga aguggcccuc cauagacaug uguagcauca 2340
aaacacaaag gcccacacuu ccugacggau gccagcuugg gcacugcugu cuacugaccc 2400
caacccuuga ugauauguau uuauucauuu guuauuuuac cagcuauuua uugagugucu 2460
uuuauguagg cuaaaugaac auaggucucu ggccucacgg agcucccagu ccuaaucaca 2520
uucaagguca ccagguacag uuguacaggu uguacacugc aggagagugc cuggcaaaaa 2580
gaucaaaugg ggcugggacu ucucauuggc caaccugccu uuccccagaa ggagugauuu 2640
uucuaucggc acaaaagcac uauauggacu gguaaugguu acagguucag agauuaccca 2700
gugaggccuu auuccucccu uccccccaaa acugacaccu uuguuagcca ccuccccacc 2760
cacauacauu ucugccagug uucacaauga cacucagcgg ucaugucugg acaugagugc 2820
ccagggaaua ugcccaagcu augccuuguc cucuuguccu guuugcauuu cacugggagc 2880
uugcacuaug cagcuccagu uuccugcagu gaucaggguc cugcaagcag uggggaaggg 2940
ggccaaggua uuggaggacu cccucccagc uuuggaagcc ucauccgcgu gugugugugu 3000
guguaugugu agacaagcuc ucgcucuguc acccaggcug gagugcagug gugcaaucau 3060
gguucacugc agucuugacc uuuugggcuc aagugauccu cccaccucag ccuccugagu 3120
agcugggacc auaggcucac aacaccacac cuggcaaauu ugauuuuuuu uuuuuuucca 3180
gagacggggu cucgcaacau ugcccagacu uccuuugugu uaguuaauaa agcuuucuca 3240
acugccaaa 3249
<210> 152
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 152
caaggtcatc catgacaact ttg 23
<210> 153
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 153
gggccatcca cagtcttct 19
<210> 154
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 154
accacagtcc atgccatcac tgcca 25
<210> 155
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 155
gctctgcaac cctggaggt 19
<210> 156
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 156
ggccatacag gacacgaagc 20
<210> 157
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 157
ccagcttata cacaagaacc agacccgg 28
<210> 158
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 158
acctaacccc caaatctatg tcaa 24
<210> 159
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 159
tggagaactc gccctctttc 20
<210> 160
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 160
ctcatcgagg agtgcaccga cctg 24
Claims (43)
1.一种包括彼此具有互补性的第一条链和第二条链的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中至少一条链包括下述的至少15个核苷酸：
其中一个或多个核苷酸是任选化学修饰的。
2.权利要求1的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所有所述核苷酸是未修饰的。
3.权利要求1的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中至少一个核苷酸是化学修饰的核苷酸。
4.权利要求3的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述化学修饰的核苷酸是2'-脱氧-2'-氟核苷酸。
5.权利要求3的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述化学修饰的核苷酸是2'-脱氧核苷酸。
6.权利要求3的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述化学修饰的核苷酸是2'-O-烷基核苷酸。
7.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其包括具有有义链和反义链的式（A）：
其中，所述上部链是所述双链核酸分子的有义链，并且所述下部链是所述双链核酸分子的反义链；其中所述反义链包括SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、或SEQ ID NO：150的至少15个核苷酸，并且所述有义链包括与所述反义链具有互补性的序列；
每个N独立地是未修饰或化学修饰的核苷酸；
每个B是存在或不存在的末端帽；
（N）代表突出端核苷酸，其各自独立地是未修饰或化学修饰的；
[N]代表其为核糖核苷酸的核苷酸；
X1和X2独立地是0 – 4的整数；
X3是17 – 36的整数；
X4是11 – 35的整数；和
X5是1 – 6的整数，条件是X4和X5的总和是17-36。
8.根据权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子；其中
（a）NX4位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；
（b）NX4位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；
（c）NX3位置中的一个或多个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合；和
（d）NX3位置中的一个或多个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、核糖核苷酸或其任何组合。
9.根据权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子；其中
（a）NX4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸或核糖核苷酸；
（b）NX4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸或核糖核苷酸；
（c）NX3位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸或核糖核苷酸；和
（d）NX3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-烷基核苷酸、2’-脱氧核苷酸或核糖核苷酸。
10.根据权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子；其中
（a）NX4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；
（b）NX4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-O-烷基核苷酸；
（c）NX3位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；和
（d）NX3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-脱氧核苷酸。
11.根据权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子；其中
（a）NX4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；
（b）NX4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是2’-O-烷基核苷酸；
（c）NX3位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；和
（d）NX3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是核糖核苷酸。
12.根据权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子；其中
（a）NX4位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；
（b）NX4位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是核糖核苷酸；
（c）NX3位置中的每个嘧啶核苷酸独立地是2’-脱氧-2’-氟核苷酸；和
（d）NX3位置中的每个嘌呤核苷酸独立地是核糖核苷酸。
13.根据权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中X5是3。
14.根据权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中X1是2，并且X2是2。
15.根据权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中X5是3，X1是2，并且X2是2。
16.根据权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中X5 = 1、2或3；X1和X2各自= 1或2；X3 = 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和X4 = 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。
17.根据权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中X5 = 1；X1和X2各自= 2；X3 = 19，和X4 = 18。
18.根据权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中X5 = 2；X1和X2各自= 2；X3 = 19，和X4 = 17。
19.根据权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中X5是3，X1是2，X2是2，X3是19，并且X4是16。
20.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
G是鸟苷；
U是尿苷；
A是腺苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
21.根据权利要求20的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述核苷酸间键合是未修饰的。
22.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其中siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
C是胞苷；
U是尿苷；
G是鸟苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
23.根据权利要求22的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述核苷酸间键合是未修饰的。
24.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
A是腺苷；
U是尿苷；
C是胞苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
25.根据权利要求24的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述核苷酸间键合是未修饰的。
26.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
G是鸟苷；
U是尿苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
27.根据权利要求26的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述核苷酸间键合是未修饰的。
28.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
A是腺苷；
U是尿苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
29.根据权利要求28的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述核苷酸间键合是未修饰的。
30.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
A是腺苷；
U是尿苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
31.根据权利要求30的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述核苷酸间键合是未修饰的。
32.一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
C是胞苷；
G是鸟苷；
U是尿苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
33.根据权利要求32的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述核苷酸间键合是未修饰的。
34. 一种双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述siNA是：
其中：
每个B是反向脱碱基帽部分；
c是2’-脱氧-2’-氟胞苷；
u是2’-脱氧-2’-氟尿苷；
A是2’-脱氧腺苷；
G是2’-脱氧鸟苷；
T是胸苷；
A是腺苷；
U是尿苷；
G是鸟苷；
A是2’-O-甲基-腺苷；
G是2’-O-甲基-鸟苷；
U是2’-O-甲基-尿苷；和
核苷酸间键合是化学修饰或未修饰的。
35.根据权利要求34的双链短干扰核酸（siNA）分子，其中所述核苷酸间键合是未修饰的。
36.一种药物组合物，其包括在药学上可接受的载体或稀释剂中的权利要求1、7、20、22、24、26、28、30、32或34中任一项的双链短干扰核酸（siNA）。
37.一种药物组合物，其包括在气溶胶制剂中的权利要求1、7、20、22、24、26、28、30、32或34的双链短干扰核酸（siNA）分子。
38.一种治疗患有状况的人受试者的方法，所述状况通过ICAM-1的作用或通过ICAM-1作用的丧失介导，所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求7的双链短干扰核酸（siNA）分子。
39.一种治疗患有状况的人受试者的方法，所述状况通过ICAM-1的作用或通过ICAM-1作用的丧失介导，所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求20、22、24、26、28、30、32或34的双链短干扰核酸（siNA）分子。
40.根据权利要求38的方法，其中所述状况是呼吸性疾病。
41.根据权利要求39的方法，其中所述状况是呼吸性疾病。
42.根据权利要求40的方法，其中所述呼吸性疾病选自COPD、囊性纤维化、哮喘、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎和窦炎。
43.根据权利要求41的方法，其中所述呼吸性疾病选自COPD、囊性纤维化、哮喘、嗜酸粒细胞性咳嗽、支气管炎、肉瘤样病、肺纤维化、鼻炎和窦炎。
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