PT1639029E - Poli (beta-aminoésteres) biodegradáveis e suas utilizações - Google Patents

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Daniel G Anderson
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David M Lynn
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Description

ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Poli(beta-aminoésteres) biodegradáveis e suas utilizações"
Apoio governamental 0 trabalho aqui descrito foi apoiado, em parte, por subsídios da National Science Foundation (Cooperative Agreement #ECC9843342 ao MIT Biotechnology Process Engineering Center), do National Institutes of Health (GM26698; NRSA Fellowship # 1 F32 GM20227-01), e do
Department of the Army (Cooperative Agreement # DAMD 17-99-2-9-001 ao Center for Innovative Minimally Invasive Therapy). O Governo dos E.U.A. pode ter certos direitos no invento.
Antecedentes do invento O tratamento de doenças humanas através da aplicação de fármacos baseados em nucleótidos tais como ADN e ARN tem potencial para revolucionar a medicina (Anderson, Nature 392(Supl.):25-30, 1996; Friedman, Nature Med. 2:144-147, 1996; Crystal, Science 270:404-410, 1995; Mulligan, Science 260:926-932, 1993.
Até agora, a utilização de vírus modificados como vectores de transferência de genes tem representado geralmente a abordagem clinicamente mais bem sucedida à terapia génica. Embora os vectores virais sejam actualmente os agentes de transferência de genes mais eficientes, as preocupações em torno da segurança global dos vectores virais, que incluem o potencial para respostas imunitárias não solicitadas, têm resultado em esforços em paralelo para desenvolver alternativas não virais (para referências principais, ver: Luo et al. Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Behr, Acc. Chem. Res. 26:274-278, 1993).
Alternativas actuais a vectores virais incluem sistemas de entrega poliméricos (Zauner et al., Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov et al., Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995), formulações lipossómicas (Miller, Angew. Chem. Int. Ed. 37:1768-1785, 1998; Hope et al., Molecular Membrane Technology 15:1-14, 1998; Deshmukh et al., New J. Chem. 21:113-124, 1997) e protocolos de injecção de ADN "nu" (Sanford, Trends Biotechnol. 6:288-302, 1988). 2 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Embora estas estratégias tenham ainda que atingir a eficácia clinica dos vectores virais, a segurança potencial, o processamento e os benefícios económicos oferecidos por estes métodos (Anderson, Nature 392(Supl.):25-30, 1996) têm desencadeado o interesse no desenvolvimento continuado de abordagens não virais à terapia génica (Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:7297-7301, 1995; Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Gonzalez et al., Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999; Kukowska-Latallo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:4897-4902, 1996; Tang et al., Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993). Têm sido amplamente utilizados polímeros catiónicos como vectores de transfecção devido à facilidade com que condensam e protegem cadeias de ADN carregadas negativamente. Polímeros contendo amina tais como poli(lisina) (Zauner et al., Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov et al., Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995), poli(etilenoimina) (PEI) (Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:7297-7301, 1995) e dendrímeros de poli(amidoamina) (Kukowska-Latallo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:4897-4902, 1996 ; Tang et al., Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993) estão carregados positivamente a pH fisiológico, formam pares de iões com ácidos nucleicos e medeiam a transfecção numa variedade de linhas de células. Apesar da sua utilização comum, porém, polímeros catiónicos tais como poli(lisina) e PEI podem ser significativamente citotóxicos (Zauner et al., Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Deshmukh et al., New J. Chem. 21:113-124, 1997; Choksakulnimitr et al., Controlled Release 34:233-241, 1995; Brazeau et al., Pharm. Res. 15:680-684, 1998). Como resultado, a escolha de um polímero catiónico para uma aplicação de transferência de genes requer geralmente um compromisso entre a eficiência de transfecção e a citotoxicidade a curto e longo prazo. Adicionalmente, a biocompatibilidade a longo prazo destes polímeros continua a ser um problema importante para utilização em aplicações terapêuticas in vivo, uma vez que vários destes polímeros não são facilmente biodegradáveis (Uhrich, Trends Polym. Sei. 5:388-393, 1997; Roberts et al., J. Biomed. Mater. Res. 30:53-65, 1996). 3 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Por forma a desenvolver alternativas seguras a vectores poliméricos existentes e biomateriais funcionalizados, têm sido desenvolvidos poliésteres degradáveis portadores de cadeias laterais catiónicas (Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Barrera et al., J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993; Kwon et al., Macromolecules 22:3250-3255, 1989; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Zhou et al., Macromolecules 23:3399-3406, 1990). Exemplos destes poliésteres incluem poli(L-láctido-co-L-lisina) (Barrera et al., J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993), poli(éster de serina) (Zhou et al., Macromolecules 23:3399-3406, 1990), poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999) e, mais recentemente, poli[ácido a-(4-aminobutil)-L-glicólico] . Foi recentemente demonstrado que o poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) e o poli[ácido a-(4-aminobutil)-L-glicólico] condensam ADN de plasmideo através de interacções electrostáticas, e que medeiam a transferência de genes (Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999).
Um aspecto importante é que estes novos polímeros são significativamente menos tóxicos do que poli(lisina) e PEI, e degradam-se em metabolitos não tóxicos. É claro a partir destas investigações que o desenho racional de poliésteres contendo amina pode ser um caminho produtivo para o desenvolvimento de vectores de transfecção eficazes, seguros. Infelizmente, porém, as sínteses actuais destes polímeros requerem quer a preparação independente de monómeros especializados (Barrera et al., J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993), quer a utilização de quantidades estequiométricas de reagentes de acoplamento caros (Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662, 1999). Adicionalmente, as funcionalidades de amina nos monómeros têm de ser protegidas antes da polimerização (Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Gonzalez et al., Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999; Barrera et al., J. Am. Chem. Soc. 115:11010-11011, 1993; Kwon et al., Macromolecules 22:3250-3255, 1989), necessitando de passos de desprotecção adicionais pós-polimerização antes dos polímeros poderem ser utilizados como agentes de transfecção. 4 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Em US 2002/0131951 revelam-se poli (β-aminoésteres) preparados a partir da adição conjugada de bis(aminas secundárias) ou de aminas primárias a um bis(éster de acrilato) e a sua utilização em sistemas de entrega de fármaco.
Existe uma necessidade continuada de polímeros biocompatíveis não tóxicos, biodegradáveis, que possam ser utilizados para transfectar ácidos nucleicos e que sejam facilmente preparados de modo eficiente e económico. Estes polímeros teriam várias utilizações, incluindo a entrega de ácidos nucleicos em terapia génica, bem como no empacotamento e/ou entrega de agentes de diagnóstico, terapêuticos e profilácticos.
Sumário do invento 0 presente invento proporciona polímeros úteis na preparação de dispositivos de entrega de fármaco e suas composições farmacêuticas. O invento proporciona também métodos de preparação dos polímeros e métodos de preparação de microsferas e outras composições farmacêuticas contendo os polímeros do invento.
Os polímeros do presente invento são ρο1ϊ(β-aminoésteres) e seus sais e derivados. Os polímeros preferidos são biodegradáveis e biocompatíveis. Tipicamente, os polímeros têm uma ou mais aminas terciárias no esqueleto do polímero. Polímeros preferidos possuem uma ou duas aminas terciárias por unidade de repetição do esqueleto. Os polímeros podem também ser co-polímeros nos quais um dos componentes é um poli(β-aminoéster). Os polímeros do invento podem ser facilmente preparados por condensação de bis(aminas secundárias) ou de aminas primárias com bis(ésteres de acrilato). Um polímero do presente invento é geralmente definido como se segue:
R1 R' O o 5 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ onde X é seleccionado de entre o grupo consistindo de alquilo inferior Ci-C6, alcoxi inferior Ci-C6, halogéneo, OR e NR2; mais preferivelmente, metilo, OH ou NH2; R é seleccionado de entre o grupo consistindo de hidrogénio, alquilo, alcenilo, alcinilo, cíclico, heterociclico, arilo e heteroarilo; cada R' é seleccionado independentemente de entre o grupo consistindo de hidrogénio, alquilo inferior Ci-Cê, alcoxi inferior Ci-C6, hidroxi, amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, tiol, heteroarilo, arilo, fenilo, heterociclico, carbociclico e halogéneo; preferivelmente, R' é hidrogénio, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, hidroxilo, amino, fluoro, cloro ou bromo; mais preferivelmente, R' é fluoro, hidrogénio ou metilo; n é um inteiro entre 3 e 10 000; x é um inteiro entre 1 e 10; preferivelmente, x é um inteiro entre 2 e 6; γ é um inteiro entre 1 e 10; preferivelmente, x é um inteiro entre 2 e 6; e seus derivados e sais. Polímeros alternativos que não são parte do invento são representados por qualquer das fórmulas seguintes: o o
onde A e B são ligadores que podem ser qualquer cadeia de átomos de carbono ou heteroátomos, substituída ou não substituída, ramificada ou não ramificada. Os pesos moleculares dos polímeros podem variar de 1 000 g/mol a 20 000 g/mol, preferivelmente de 5 000 g/mol a 15 000 g/mol. B pode ser uma cadeia alquilo de um a doze átomos de carbono. B pode ser uma cadeia heteroalifática contendo um total de um a doze átomos de carbono e heteroátomos. Os grupos Ri e R2 6 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ podem ser qualquer um de uma ampla variedade de substituintes. Ri e R2 podem conter aminas primárias, aminas secundárias, aminas terciárias, grupos hidroxilo e grupos alcoxi. Os polímeros podem ser terminados em amina; e os polímeros podem ser terminados em acrilato. Os grupos Ri e/ou R2 podem formar estruturas cíclicas com o ligador A (ver a secção Descrição detalhada, a seguir). Os polímeros contendo estas porções cíclicas têm a característica de serem mais solúveis a pH mais baixo. Polímeros especificamente preferidos são aqueles que são insolúveis em soluções aquosas a pH fisiológico (pH 7,2-7,4) e que são solúveis em soluções aquosas abaixo de pH fisiológico (pH < 7,2). Outros polímeros preferidos são aqueles que são solúveis em solução aquosa a pH fisiológico (pH 7,2-7,4) e inferiores. Os polímeros preferidos são úteis na transfecção de polinucleótidos em células. É proporcionado um método de preparação dos polímeros do invento. Monómeros comercialmente ou facilmente disponíveis, bis(aminas secundárias), aminas primárias e bis(ésteres de acrilato), podem ser submetidos a condições que conduzem à adição conjugada da amina ao bis(éster de acrilato). Numa concretização particularmente preferida, cada um dos monómeros é dissolvido num solvente orgânico (e.g., DMSO, DMF, THF, dietiléter, diclorometano, hexanos, etc.), e as soluções resultantes são combinadas e aquecidas durante um tempo suficiente para conduzir à polimerização dos monómeros. Noutras concretizações, a polimerização é realizada na ausência de solvente. 0 polímero resultante pode depois ser purificado e opcionalmente caracterizado utilizando técnicas conhecidas na especialidade.
Ainda noutro aspecto do invento, os polímeros são utilizados para formar complexos à escala nanométrica com ácidos nucleicos. Os complexos de polinucleótido/polímero podem ser formados por adição de uma solução de polinucleótido a uma solução do polímero agitada em vórtice numa concentração desejada de ADN/polímero. A razão peso/peso de polinucleótido para polímero pode estar na gama de 1:0,1 a 1:200, preferivelmente de 1:10 a 1:150, mais preferivelmente de 1:50 a 1:150. A razão de monómero de amina para polinucleótido fosfato pode ser aproximadamente 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, 120:1, 7 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ 130:1, 140:1, 150:1, 160:1, 170:1, 180:1, 190:1 e 200:1. Os polímeros catiónicos condensam o polinucleótido em partículas solúveis tipicamente com 50-500 nm de tamanho. Estes complexos de polinucleótido/polímero podem ser utilizados na entrega de polinucleótidos a células. Numa concretização particularmente preferida, estes complexos são combinados com excipientes farmacêuticos para formar composições farmacêuticas adequadas para entrega a animais, incluindo humanos. Em certas concretizações, é utilizado um polímero com uma elevada proporção de peso molecular para átomo de azoto (e.g., polilisina, polietilenoimina) para aumentar a eficiência de transfecção.
Noutro aspecto do invento, os polímeros são utilizados para encapsular agentes terapêuticos, de diagnóstico e/ou profilácticos, incluindo polinucleótidos, para formar micropartícuias. Tipicamente, estas micropartículas são uma ordem de grandeza maior do que os complexos de polinucleótido/polímero. As micropartículas estão na gama de 1 mícron a 500 mícron. Numa concretização particularmente preferida, estas micropartículas permitem a entrega de moléculas pequenas lábeis, proteínas, péptidos e/ou polinucleótidos a um indivíduo. As micropartículas podem ser preparadas utilizando qualquer uma das técnicas conhecidas na especialidade para preparar micropartículas, tais como, por exemplo, emulsão dupla, inversão de fase e secagem por pulverização. Numa concretização particularmente preferida, as micropartículas podem ser utilizadas para entrega desencadeada pelo pH do conteúdo encapsulado devido à natureza responsiva dos polímeros ao pH (i.e., sendo mais solúveis a pH mais baixo).
Ainda noutro aspecto, é proporcionado um sistema para síntese e rastreio de uma colecção de polímeros. Em certas concretizações, o sistema tira vantagem de técnicas conhecidas na especialidade do manuseamento automatizado de líquidos e da robótica. O sistema de síntese e rastreio pode ser utilizado com poli(beta-aminoésteres) bem como com outros tipos de polímeros incluindo poliamidas, poliésteres, poliéteres, policarbamatos, policarbonatos, poliureias, poliaminas, etc. A colecção de polímeros pode ser uma colecção de todo um tipo de polímero (e.g., todos poli(beta-aminoésteres) ) ou pode ser uma colecção diversificada de polímeros. Milhares de polímeros podem ser sintetizados e 8 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ rastreados em paralelo utilizando o sistema do invento. Em certas concretizações, os polímeros são rastreados quanto a propriedades úteis no campo da entrega de genes, transfecção ou terapia génica. Algumas destas propriedades incluem solubilidade a vários pH, capacidade para complexar polinucleótidos, capacidade para transfectar um polinucleótido para dentro de uma célula, etc. Certos poli(beta-aminoésteres) que se verifica serem úteis na transfecção de células incluem M17, KK89, C32, C36, JJ28, JJ32, JJ36, LL6 e D94 como descrito nos Exemplos 4 e 5.
Definições
Os termos seguintes são termos químicos utilizados no fascículo e reivindicações: 0 termo acilo como aqui utilizado refere-se a um grupo com a fórmula geral -C(=0)R, onde R é alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, carbocíclico, heterocíclico ou aromático heterocíclico. Um exemplo de um grupo acilo é o acetilo. 0 termo alquilo como aqui utilizado refere-se a radicais hidrocarboneto, de cadeia linear ou ramificada, saturados derivados de uma porção hidrocarboneto contendo entre um e vinte átomos de carbono por remoção de um único átomo de hidrogénio. Em algumas concretizações, o grupo alquilo utilizado no invento contém 1-10 átomos de carbono. Noutra concretização, o grupo alquilo utilizado contém 1-8 átomos de carbono. Ainda noutras concretizações, o grupo alquilo contém 1-6 átomos de carbono. Ainda em outras concretizações, o grupo alquilo contém 1-4 carbonos. Exemplos de radicais alquilo incluem, mas não estão limitados a, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, sec-pentilo, isopentilo, terc-butilo, n-pentilo, neopentilo, n-hexilo, sec-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-decilo, n-undecilo, dodecilo, e outros, que podem suportar um ou mais substituintes. O termo alcoxi como aqui utilizado refere-se a um grupo saturado (i.e., alquil-O-) ou insaturado (í.e., alcenil-O- e alcinil-O-) ligado à porção molecular pai através de um átomo de oxigénio. Em certas concretizações, o grupo alquilo contém 1-20 átomos de carbono alifáticos. Em certas concretizações, os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo utilizados no invento 9 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ contêm 1-8 átomos de carbono alifáticos. Ainda noutras concretizações, o grupo alquilo contém 1-6 átomos de carbono alifáticos. Ainda noutras concretizações, o grupo alquilo contém 1-4 átomos de carbono alifáticos. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, terc-butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, neopentoxi, n-hexoxi e outros. 0 termo alcenilo designa um grupo monovalente derivado de uma porção hidrocarboneto possuindo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono pela remoção de um único átomo de hidrogénio. Em certas concretizações, o grupo alcenilo utilizado no invento contém 1-20 átomos de carbono. Em algumas concretizações, o grupo alcenilo utilizado no invento contém 1-10 átomos de carbono. Noutra concretização, o grupo alcenilo utilizado contém 1-8 átomos de carbono. Ainda noutras concretizações, o grupo alcenilo contém 1-6 átomos de carbono. Ainda em outras concretizações, o grupo alcenilo contém 1-4 carbonos. Grupos alcenilo incluem, por exemplo, etenilo, propenilo, butenilo, l-metil-2-buten-l-ilo, e outros. O termo alcinílo como aqui utilizado refere-se a um grupo monovalente derivado de um hidrocarboneto possuindo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono pela remoção de um único átomo de hidrogénio. Em certas concretizações, o grupo alcinilo utilizado no invento contém 1-20 átomos de carbono. Em algumas concretizações, o grupo alcinilo utilizado no invento contém 1-10 átomos de carbono. Noutra concretização, o grupo alcinilo utilizado contém 1-8 átomos de carbono. Ainda noutras concretizações, o grupo alcinilo contém 1-6 átomos de carbono. Grupos alcinilo representativos incluem, mas não estão limitados a, etinilo, 2-propinilo (propargilo), 1-propinilo, e outros.
Os termos alquilamino, dialquilamino e trialquilamino como aqui utilizados referem-se a um, dois ou três, respectivamente, grupos alquilo, como anteriormente definidos, ligados à porção molecular pai através de um átomo de azoto. O termo alquilamino refere-se a um grupo possuindo a estrutura -NHR' onde R' é um grupo alquilo, como anteriormente definido; e o termo dialquilamino refere-se a um grupo possuindo a estrutura -NR'R", onde R' e R" são cada um seleccionados independentemente de entre o grupo 10 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ consistindo de grupos alquilo. O termo trialquilamino refere-se a um grupo possuindo a estrutura -NR'R"R"', onde R', R" e R"' são cada um seleccionados independentemente de entre o grupo consistindo de grupos alquilo. Em certas concretizações, o grupo alquilo contém 1-20 átomos de carbono alifáticos. Em certas concretizações, o grupo alquilo contém 1-10 átomos de carbono alifáticos. Ainda noutras concretizações, o grupo alquilo contém 1-8 átomos de carbono alifáticos. Ainda noutras concretizações, o grupo alquilo contém 1-6 átomos de carbono alifáticos. Ainda noutras concretizações, o grupo alquilo contém 1-4 átomos de carbono alifáticos. Adicionalmente, R', R" e/ou R"' considerados em conjunto podem ser opcionalmente -(CH2)k- onde k é um inteiro de 2 a 6. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, metilamino, dimetilamino, etilamino, dietilamino, dietilaminocarbonilo, metiletilamino, isopropilamino, piperidino, trimetilamino e propilamino.
Os termos alquiltioéter e tioalcoxilo referem-se a um grupo saturado (í.e., alquil-S-) ou insaturado (i.e., alcenil-S- e alcinil-S-) ligado à porção molecular pai através de um átomo de enxofre. Em certas concretizações, o grupo alquilo contém 1-20 átomos de carbono alifáticos. Em certas concretizações, o grupo alquilo contém 1-10 átomos de carbono alifáticos. Ainda noutras concretizações, os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo contêm 1-8 átomos de carbono alifáticos. Ainda noutras concretizações, os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo contêm 1-6 átomos de carbono alifáticos. Ainda noutras concretizações, os grupos alquilo, alcenilo e alcinilo contêm 1-4 átomos de carbono alifáticos. Exemplos de porções tioalcoxilo incluem, mas não estão limitados a, metiltio, etiltio, propiltio, isopropiltio, n-butiltio, e outros. O termo arilo como aqui utilizado refere-se a uma porção ciclica insaturada compreendendo pelo menos um anel aromático. Em certas concretizações, grupo arilo refere-se a um sistema de anel carbociclico, mono- ou biciclico, possuindo um ou dois anéis aromáticos incluindo, mas não limitado a, fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo, indanilo, indenilo e outros. Os grupos arilo podem estar não substituídos ou substituídos com substituintes seleccionados de entre o grupo consistindo de grupos lineares ou ramificados alquilo, alcenilo, alcinilo, haloalquilo, alcoxi, 11 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ tioalcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, acilamino, ciano, hidroxi, halo, mercapto, nitro, carboxaldeído, carboxi, alcoxicarbonilo e carboxamida. Adicionalmente, grupos arilo substituídos incluem tetrafluorofenilo e pentafluorofenilo. 0 termo ácido carboxilico como aqui utilizado refere-se a um grupo de fórmula -CO2H.
Os termos halo e halogéneo como aqui utilizados referem-se a um átomo seleccionado de entre flúor, cloro, bromo e iodo. 0 termo heterociclico, como aqui utilizado, refere-se a um sistema de anel de 3 a 10 membros, parcialmente insaturado ou totalmente saturado, aromático ou não aromático, que inclui anéis individuais de 3 a 8 átomos de tamanho e sistemas de anel bi- e tricíclicos que podem incluir grupos aromáticos de cinco ou seis membros arilo ou heterociclico aromático fundidos a um anel não aromático. Estes anéis heterociclicos incluem aqueles que possuem de um a três heteroátomos seleccionados independentemente de entre oxigénio, enxofre e azoto, em que os heteroátomos de azoto e enxofre podem estar opcionalmente oxidados e o heteroátomo de azoto pode estar opcionalmente quaternizado. Em certas concretizações, 0 termo heterociclico refere-se a um anel de 5, 6 ou 7 membros não aromático ou a um grupo policíclico onde pelo menos um átomo de anel é um heteroátomo seleccionado de entre O, S e N (onde os heteroátomos de azoto e enxofre podem estar opcionalmente oxidados), incluindo, mas não limitado a, um grupo bi- ou tricíclico, compreendendo anéis de seis membros fundidos possuindo entre um e três heteroátomos seleccionados independentemente de entre oxigénio, enxofre e azoto, onde (i) cada anel de 5 membros tem 0 a 2 ligações duplas, cada anel de 6 membros tem 0 a 2 ligações duplas, e cada anel de 7 membros tem 0 a 3 ligações duplas, (ii) os heteroátomos de azoto e enxofre podem estar opcionalmente oxidados, (iii) o heteroátomo de azoto pode estar opcionalmente quaternizado, e (iv) qualquer dos anéis heterociclicos anteriores pode estar fundido com um anel arilo ou heteroarilo. O termo heterociclico aromático, como aqui utilizado, refere-se a um radical cíclico aromático possuindo de cinco a 12 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ dez átomos de anel dos quais um átomo de anel é seleccionado de entre enxofre, oxigénio e azoto; zero, um ou dois átomos de anel são heteroátomos adicionais seleccionados independentemente de entre enxofre, oxigénio e azoto; e os restantes átomos de anel são carbono, o radical estando ligado ao resto da molécula através de qualquer dos átomos de anel, tal como, por exemplo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, e outros. Os grupos heterocíclicos aromáticos podem estar não substituídos ou substituídos com substituintes seleccionados de entre o grupo consistindo de grupos lineares e ramificados alquilo, alcenilo, alcinilo, haloalquilo, alcoxi, tioalcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, acilamino, ciano, hidroxi, halo, mercapto, nitro, carboxaldeído, carboxi, alcoxicarbonilo e carboxamida.
Grupos heterocíclicos e heterocíclicos aromáticos específicos que podem ser incluídos nos compostos do invento incluem: 3-metil-4-(3-metilfenil)piperazina, 3-metil-piperidina, 4-(bis-(4—fluorofenil)metil)piperazina, 4-(difenilmetil)piperazina, 4-(etoxicarbonil)piperazina, 4-(etoxicarbonilmetil)piperazina, 4-(fenilmetil)piperazina, 4-(l-feniletil)piperazina, 4-(1,1-dimetiletoxicarbonil)-piperazina, 4-(2-(bis-(2-propenil)amino)etil)piperazina, 4-(2-(dietilamino)etil)piperazina, 4-(2-clorofenil)piperazina, 4-(2-cianofenil)piperazina, 4-(2-etilfenil)piperazina, 4-(2-hidroxietil)piperazina, 4-(2-metoxifenil)piperazina, 4-(2-metiltiofenil)piperazina, 4-(2-nitrofenil)piperazina, 4-(2-etoxifenil)piperazina, 4-(2-fluorofenil)piperazina, 4-(2-metoxietil)piperazina, 4-(2-metilfenil)piperazina, 4-(2-nitrofenil)piperazina, 4-(2-feniletil)piperazina, 4-(2-piridil)piperazina, 4-(2-pirimidinil)piperazina, 4-(2,3-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,4-difluorofenil)piperazina, 4-(2,4-dimetoxifenil)piperazina, 4-(2,4-dimetilfenil)-piperazina, 4-(2,5-dimetilfenil)piperazina, 4-(2,6-dimetilfenil)piperazina, 4-(3-clorofenil)piperazina, 4 — (3 — metilfenil)piperazina, 4-(3-trifluorometilfenil)piperazina, 4-(3,4-diclorofenil)piperazina, 4-(3,4-dimetoxifenil)-piperazina, 4-(3,4-dimetilfenil)piperazina, 4-(3,4-metileno-dioxifenil)piperazina, 4-(3,4,5-trimetoxifenil)-piperazina, 4-(3,5-diclorofenil)piperazina, 4-(3,5-dimetoxifenil)-piperazina, 4-(4-(fenilmetoxi)fenil)piperazina, 4-(4-(3,1- 13 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ dimetiletil)fenilmetil)piperazina, 4-(4-cloro-3-trifluoro-metilfenil)piperazina, 4-(4-clorofenil)-3-metilpiperazina, 4-(4-clorofenil)piperazina, 4-(4-clorofenil)piperazina, 4 —(4 — clorofenilmetil)piperazina, 4-(4-fluorofenil)piperazina, 4-(4-metoxifenil)piperazina, 4-(4-metilfenil)piperazina, 4-(4-nitrofenil)piperazina, 4-(4-trifluorometilfenil)- piperazina, 4-ciclo-hexilpiperazina, 4-etilpiperazina, 4-hidroxi-4-(4-clorofenil)metilpiperidina, 4-hidroxi-4- fenilpiperidina, 4-hidroxipirrolidina, 4-metilpiperazina, 4-fenilpiperazina, 4-piperidinilpiperazina, 4-(2-furanil)-carbonil)piperazina, 4-((1,3-dioxolan-5-il)metil)piperazina, 6-fluoro-l,2,3,4-tetra-hidro-2-metilquinolina, 1,4-diaza-ciclo-heptano, 2,3-di-hidroindolilo, 3,3-dimetilpiperidina, 4.4- etilenodioxipiperidina, 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina, 1.2.3.4- tetra-hidroquinolina, azaciclo-octano, deca- hidroquinolina, piperazina, piperidina, pirrolidina, tiomorfolina e triazole. 0 termo carbamoilo, como aqui utilizado, refere-se a um grupo amida da fórmula -CONH2. 0 termo carbonildioxilo, como aqui utilizado, refere-se a um grupo carbonato da fórmula -O-CO-OR. O termo hidrocarboneto, como aqui utilizado, refere-se a qualquer grupo químico compreendendo hidrogénio e carbono. 0 hidrocarboneto pode estar substituído ou não substituído. 0 hidrocarboneto pode ser insaturado, saturado, ramificado, não ramificado, cíclico, policíclico ou heterocíclico. Hidrocarbonetos ilustrativos incluem, por exemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, ciclopropilo, alilo, vinilo, n-butilo, terc-butilo, etinilo, ciclo-hexilo, metoxi, dietilamino, e outros. Como será reconhecido por um perito nesta especialidade, todas as valências têm de ser satisfeitas quando se fazem quaisquer substituições.
Os termos substituído, precedido ou não pelo termo "opcionalmente", e substituinte, como aqui utilizados, referem-se à capacidade, como será apreciado por um perito nesta especialidade, para trocar um grupo funcional por outro grupo funcional desde que a valência de todos os átomos seja mantida. Quando mais do que uma posição numa qualquer estrutura pode estar substituída com mais do que um substituinte seleccionado de entre um grupo especificado, o 14 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ substituinte pode ser o mesmo ou diferente em cada posição. Os substituintes podem também estar adicionalmente substituídos (e.g., um grupo arilo substituinte pode ter um outro seu substituinte, tal como outro grupo arilo, que está adicionalmente substituído com flúor numa ou mais posições).
Os termos tio-hidroxilo ou tiol, como aqui utilizados, referem-se a um grupo da fórmula -SH. 0 termo ureido, como aqui utilizado, refere-se a um grupo ureia da fórmula: -NH-CO-NH2.
Os termos seguintes são termos mais gerais utilizados ao longo do presente fascículo: "Animal": 0 termo animal, como aqui utilizado, refere-se a humanos bem como a animais não humanos, incluindo, por exemplo, mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes. Preferivelmente, o animal não humano é um mamífero (e.g., um roedor, um ratinho, um rato, um coelho, um macaco, um cão, um gato, um primata ou um porco) . Um animal pode ser um animal doméstico. Um animal pode ser um animal transgénico. "Associado com": Quando duas entidades estão "associadas" uma "com" a outra como aqui descrito, elas estão ligadas por uma interacção covalente ou não covalente, directa ou indirecta. Preferivelmente, a associação é covalente. Interacções não covalentes desejáveis incluem ligações de hidrogénio, interacções de van der Waals, interacções hidrófobas, interacções magnéticas, interacções electrostáticas, etc. "Biocompatível": 0 termo "biocompatível", como aqui utilizado pretende descrever compostos que são não tóxicos para as células. Compostos são "biocompatíveis" se a sua adição a células in vitro resultar numa morte celular menor ou igual a 20%, e se a sua administração in vivo não induzir inflamação ou outros efeitos adversos similares. "Biodegradável": Como aqui utilizado, compostos "biodegradáveis" são aqueles que, quando introduzidos em células, são quebrados pela maquinaria celular ou por hidrólise em componentes que as células podem ou reutilizar ou descartar sem efeito tóxico significativo sobre as células 15 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ (i.e., menos do que cerca de 20% das células são mortas quando os componentes são adicionados a células in vitro) . Preferivelmente, os componentes não induzem inflamação ou outros efeitos adversos in vivo. Em certas concretizações preferidas, as reacções químicas utilizadas para quebrar os compostos biodeqradáveis são não catalisadas. "Quantidade eficaz": Em geral, a "quantidade eficaz" de um agente activo ou dispositivo de entrega de fármaco refere-se à quantidade necessária para induzir a resposta biológica desejada. Como será apreciado pelos vulgares peritos nesta especialidade, a quantidade eficaz de um agente ou dispositivo pode variar dependendo de factores tais como o fim biológico desejado, o agente a ser entregue, a composição da matriz de encapsulação, o tecido alvo, etc. Por exemplo, a quantidade eficaz de micropartículas contendo um antigénio a ser entregue para imunizar um indivíduo é a quantidade que resulta numa resposta imunitária suficiente para prevenir a infecção com um organismo possuindo o antigénio administrado. "Péptido" ou "proteína": De acordo com o presente invento, um "péptido" ou "proteína" compreende uma série de pelo menos três aminoácidos ligados em conjunto por ligações de péptido. Os termos "proteína" e "péptido" podem ser utilizados intermutavelmente. Péptido pode referir-se a um péptido individual ou a uma colecção de péptidos. Os péptidos do invento contêm preferivelmente apenas aminoácidos naturais, ainda que aminoácidos não naturais (i.e., compostos que não ocorrem na natureza mas que podem ser incorporados numa cadeia de polipéptido) e/ou análogos de aminoácido, como conhecido na especialidade, possam ser utilizados alternativamente. Também, um ou mais dos aminoácidos num péptido do invento podem estar modificados, por exemplo, pela adição de uma entidade química tal como um grupo carboidrato, um grupo fosfato, um grupo farnesilo, um grupo isofarnesilo, um grupo ácido gordo, um ligador para conjugação, funcionalização, ou outra modificação, etc. Numa concretização preferida, as modificações do péptido conduzem a um péptido mais estável (e.g., semivida mais longa in vivo) . Estas modificações podem incluir ciclização do péptido, a incorporação de D-aminoácidos, etc. Nenhuma das modificações deverá interferir substancialmente com a actividade biológica desejada do péptido. 16 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ "Polinucleótido" ou "oligonucleótido": Polinucleótido ou oligonucleótido refere-se a um polímero de nucleótidos. Tipicamente, um polinucleótido compreende pelo menos três nucleótidos. 0 polímero pode incluir nucleósidos naturais (i.e., adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina e desoxicitidina), análogos de nucleósido (e.g., 2-amino-adenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolopirimidina, 3-metiladenosina, C5-propinilcitidina, C5-propiniluridina, C5-bromouridina, C5-metilcitidina, 8-oxoadenosina, 2-tiocitidina), C5-fluorouridina, C5-iodouridina, 7-desaza-adenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoguanosina, 0(6)-metilguanina e bases modificadas quimicamente, bases modificadas biologicamente (e.g., bases metiladas), bases intercaladas, açúcares modificados (e.g., 2'-fluororribose, ribose, 2'-desoxirribose, arabinose e hexose), ou grupos fosfato modificados (e.g., fosforotioatos e elementos de ligação 5'-N-fosforamidito). "Molécula pequena": Como aqui utilizado, o termo "molécula pequena" refere-se a compostos orgânicos, de ocorrência natural ou criados artificialmente (e.g., através de síntese química), que têm um peso molecular relativamente baixo e que não são proteínas, polipéptidos ou ácidos nucleicos. Tipicamente, as moléculas pequenas têm um peso molecular inferior a cerca de 1500 g/mol. Também, as moléculas pequenas têm tipicamente múltiplas ligações carbono-carbono. Moléculas pequenas de ocorrência natural conhecidas incluem, mas não estão limitados a, penicilina, eritromicina, taxol, ciclosporina e rapamicina. Moléculas pequenas sintéticas conhecidas incluem, mas não estão limitados a, ampicilina, meticilina, sulfametoxazole e sulfonamidas.
Breve descrição dos desenhos A Figura Comparativa 1 mostra o perfil temporal para a degradação de polímeros 1-3 a 37°C a pH 5,1 e pH 7,4. A degradação é expressa como a degradação percentual ao longo do tempo com base nos resultados de GPC. A Figura Comparativa 2 mostra perfis de citotoxicidade dos polímeros 1-3 e de PEI. A viabilidade de células NIH 3T3 é expressa em função da concentração de polímero. Os pesos 17 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ moleculares dos polímeros 1, 2 e 3 eram 5 800, 11 300 e 22 500, respectivamente. O peso molecular do PEI utilizado era 25 000. A Figura Comparativa 3 mostra a retardação de ADN pCMV-Luc pelo polímero 1 em electroforese em gel de agarose. Cada pista corresponde a uma razão em peso diferente de ADN/polímero. As razões são como se segue: 1) 1:0 (ADN apenas); 2) 1:0,5; 3) 1:1; 4) 1:2; 5) 1:3; 6) 1:4; 7) 1:5; 8) 1:6; 9) 1:7; e 10) 1:8. A Figura Comparativa 4 mostra os diâmetros efectivos médios de complexos de ADN/polímero formados a partir de plasmídeo pCMV-Luc e de polímero 3 (Mn = 31 000) em função da concentração de polímero. A Figura Comparativa 5 mostra os potenciais ζ médios de complexos de ADN/polímero formados a partir de plasmídeo pCMV-Luc e de polímero 3 (Mn = 31 000) em função da concentração de polímero. Os números para cada complexo correspondem aos números de complexo na Figura 4. A Figura Comparativa 6 é uma imagem de SEM de microsferas carregadas com rodamina/dextrano fabricadas a partir de polímero 1. A Figura Comparativa 7 mostra os perfis de libertação de rodamina/dextrano a partir de microsferas de polímero 1 e de PLGA para vários valores de pH. As setas indicam os pontos em que o tampão HEPES (pH 7,4) foi trocado por tampão acetato (pH 5,1). A Figura Comparativa 8 mostra a) uma imagem de microscopia de fluorescência representativa de microsferas de polímero 1 carregadas com rodamina/dextrano suspensas em tampão HEPES (pH 7,4). A Figura 8b mostra uma amostra de microsferas de polímero 1 carregadas a pH 7,4 após adição de tampão acetato (pH 5,1). O sentido da difusão de ácido é da direita em cima para a esquerda em baixo da imagem (tempo decorrido « 5 segundos). A Figura 9 demonstra o ensaio de electroforese em gel utilizado para identificar polímeros complexantes de ADN. As anotações na pista correspondem aos 70 membros solúveis da 18 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ biblioteca de rastreio. Para cada polímero, os ensaios foram realizados para razões de ADN/polímero de 1:5 (poço à esquerda) e 1:20 (poço à direita). As pistas marcadas com C° contêm ADN sozinho (sem polímero) e foram utilizadas como controlo. A Figura 10 mostra resultados de transfecção em função da estrutura para um ensaio utilizando pCMV-Luc (600 ng/poço, ADN/polímero = 1:20). As unidades de luz são arbitrárias e não normalizadas em relação à proteína celular total; as experiências foram realizadas em triplicado (barras de erro não mostradas). Os quadrados a preto representam polímeros insolúveis em água, os quadrados a branco representam polímeros solúveis em água que não complexaram ADN na Figura 9. A coluna à direita (assinalada com "*") apresenta valores para as experiências de controlo seguintes: sem polímero (verde), PEI (vermelho) e Lipofectamine (azul-claro). A Figura Comparativa 11 mostra uma síntese de poli(beta-aminoésteres). Os poli(beta-aminoésteres) podem ser sintetizados pela adição conjugada de aminas primárias (equação 1) ou de bis(aminas secundárias) (equação 2) a diacrilatos. A Figura 12 mostra uma variedade de monómeros de amina (A) e de diacrilato (B) utilizados na síntese da biblioteca de polímero. A Figura 13 é um histograma de eficiências de transfecção de polímero. No primeiro rastreio testaram-se 2350 polímeros quanto à sua capacidade para entregar ADN pCMV-Luc em razões N:P de 40:1, 20:1 e 10:1 a células COS-7. A eficiência de transfecção é apresentada em ng de luciferase por poço. Para referência, mostra-se a eficiência de transfecção de PEI. As células COS-7 assimilam rapidamente ADN nu, e nas nossas condições produzem 0,15 ± 0,05 ng por poço, e o reagente de lípido, Lipofectamine 2000, produz 13,5 ± 1,9 ng por poço.
Figura 14. A) Eficiência de transfecção optimizada dos melhores 50 polímeros em relação a PEI e Lipofectamine 2000. Os polímeros foram testados como descrito em Métodos. No primeiro rastreio geral, testaram-se razões N:P de 40:1, 20:1 e 10:1 com um n de 1. Os melhores 93 foram rastreados de novo 19 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ com seis razões diferentes N:P = (N:P óptimo a partir do primeiro rastreio) X 1, 75, 1, 5, 1,25, 1, 0, 0, 75 e 0,5, em triplicado. As reacções de controlo estão assinaladas a Vermelho, e os polímeros que não se ligaram a ADN num ensaio de electroforese em gel são mostrado a preto. B) Polímeros que se ligam a ADN como determinado por electroforese em gel de agarose. Os resultados foram tabelados do seguinte modo: 1) o ADN totalmente deslocado é representado por ( + ), 2) o ADN parcialmente deslocado é representado por (+/-), 3) o ADN não ligado é representado por (-). A Figura 15 mostra a transfecção de células COS-7 utilizando plasmídeo de Proteína Fluorescente Verde. As células foram transfectadas numa razão N:P de (N:P óptimo a partir do rastreio geral) X 1,25 com 600 ng de ADN. São mostradas as regiões do poço exibindo transfecção elevada para os polímeros seguintes: a) C36, b) D94. A Figura 16 mostra como o peso molecular de polímero e o grupo terminal da cadeia são afectados fazendo variar a razão amina/diacrilato na mistura reaccional. Os pesos moleculares (Mw) (em relação a padrões de poliestireno) foram determinados por GPC de fase orgânica. Polímeros sintetizados com razões amina/diacrilato de >1 têm grupos terminais amina, e polímeros sintetizados com razões amina/diacrilato de <1 têm grupos terminais acrilato. A Figura 17 mostra resultados de transfecção de luciferase para Poli-1 em função de peso molecular de polímero, razão polímero/ADN (p/p) e grupo terminal do polímero. (A) cadeias terminadas em amina; (B) cadeias terminadas em acrilato. (n=4, barras de erro não mostradas.) A Figura 18 mostra resultados de transfecção de luciferase para Poli-2 em função de peso molecular de polímero, razão polímero/ADN (p/p) e grupo terminal do polímero. (A) cadeias terminadas em amina; (B) cadeias terminadas em acrilato. (n=4, barras de erro não mostradas). A Figura 19 mostra a citotoxicidade de complexos de poli-l/ADN em função de peso molecular de polímero, razão polímero/ADN (p/p) e grupo terminal do polímero. (A) cadeias terminadas em amina; (B) cadeias terminadas em acrilato. (n=4, barras de erro não mostradas.) 20 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ A Figura 20 mostra a citotoxicidade de complexos de poli-2/ADN em função de peso molecular de polímero, razão polímero/ADN (p/p) e grupo terminal do polímero. (A) cadeias terminadas em amina; (B) cadeias terminadas em acrilato. (n=4, barras de erro não mostradas.) A Figura 21 mostra o nível de assimilação celular relativo de complexos de poli-l/ADN em função de peso molecular de polímero, razão polímero/ADN (p/p) e grupo terminal do polímero. (A) cadeias terminadas em amina; (B) cadeias terminadas em acrilato. (n=4, barras de erro não mostradas.) A Figura 22 mostra o nível de assimilação celular relativo de complexos de poli-2/ADN em função de peso molecular de polímero, razão polímero/ADN (p/p) e grupo terminal do polímero. (A) cadeias terminadas em amina (quadrados vazios representam condições onde a citotoxicidade dos complexos impediu uma medição fiável da assimilação celular); (B) cadeias terminadas em acrilato. (n=4, barras de erro não mostradas.) A Figura 23 mostra a melhoria da actividade de transfecção de vectores de entrega baseados em poli-1 (cadeias terminadas em amina, Mw = 13 100) através da utilização de agentes de co-complexação. (A) poli-lisina (PLL); (B) polietilenoimina (PEI) . (n=4, barras de erro não mostradas). A Figura 24 mostra a melhoria da actividade de transfecção de vectores de entrega baseados em poli-2 (cadeias terminadas em amina, Mw = 13 400) através da utilização de agentes de co-complexação. (A) poli-lisina (PLL); (B) polietilenoimina (PEI). (n=4, barras de erro não mostradas.) A Figura 25 é uma comparação da transferência de genes de GFP em células COS-7 utilizando Poli-l/PLL (Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 (p/p/p)), Poli-2/PLL (Poli-2:PLL:ADN = 15:0,4:1 (p/p/p)), Lipofectamine 2000 (μΐ de reagente:pg de ADN = 1:1), PEI (PEI:ADN 1:1 (p/p), N/P ~ 8), e ADN nu. As células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até nova confluência. As células foram então incubadas com complexos (5 pg de ADN/poço) durante 1 hora, tempo após o qual os 21 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ complexos foram removidos e se adicionaram meios de crescimento frescos. Dois dias mais tarde, a expressão de GFP foi ensaiada por citometria de fluxo. (n=3, barras de erro indicam um desvio padrão.) A Figura 26 mostra a expressão de GFP em células COS-7 transfectadas utilizando Poli-l/PLL.
A Figura 21 mostra a transferência de genes de GFP em quatro linhas de células diferentes utilizando Poli-l/PLL (Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 (p/p/p)). As células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até próximo da confluência. As células foram então incubadas com complexos (5 pg de ADN/poço) durante 1 hora, tempo após o qual os complexos foram removidos e se adicionaram meios de crescimento frescos. Dois dias mais tarde, a expressão de GFP foi ensaiada por citometria de fluxo. (n=5, barras de erro indicam um desvio padrão.) A Figura Comparativa 28 mostra os pesos moleculares (Mw e Mn) de polímero G5 em função da razão molar de monómeros amina:diacrilato na síntese. A Figura Comparativa 29 mostra os pesos moleculares (Mw e Mn) de polímero B14 em função da razão molar de monómeros amina:diacrilato na síntese de polímero. A Figura Comparativa 30 é uma comparação da função de peso molecular para razão molar amina:diacrilato para polímeros B14 e G5.
Descrição detalhada de certas concretizações preferidas do invento O presente invento proporciona a encapsulação polimérica melhorada e sistemas de entrega baseados na utilização de polímeros de β-aminoéster. Os sistemas podem ser utilizados nas especialidades da entrega de fármaco/droga para entregar polinucleótidos, proteínas, moléculas pequenas, péptidos, antigénios, fármacos, etc. a um paciente, tecido, órgão, célula, etc. O presente invento proporciona também a preparação e rastreio de grandes colecções de polímeros para identificação de "casos de sucesso" que são úteis nas especialidades da entrega de fármacos e de drogas. 22 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Os polímeros de β-aminoéster do presente invento proporcionam várias utilizações diferentes na especialidade da entrega de fármacos. Os polímeros com os seus esqueletos contendo amina terciária podem ser utilizados para complexar polinucleótidos e desse modo melhorar a entrega do polinucleótido e prevenir a sua degradação. Os polímeros podem também ser utilizados na formação de nanopartículas ou de micropartículas contendo agentes encapsulados. Devido às propriedades dos polímeros serem biocompatíveis e biodegradáveis, estas partículas formadas são também biodegradáveis e biocompatíveis e podem ser utilizadas para proporcionar uma libertação retardada, controlada, do agente encapsulado. Estas partículas podem também ser responsivas a alterações de pH considerando o facto de estes polímeros não serem tipicamente substancialmente solúveis em solução aquosa a pH fisiológico, mas serem mais solúveis a pH inferior.
Polímeros
Os polímeros do presente invento são ρο1ϊ(β-aminoésteres) contendo aminas terciárias nos seus esqueletos e seus sais. Os pesos moleculares dos polímeros do invento podem variar desde 5 000 g/mol a mais de 100 000 g/mol, mais preferivelmente de 4 000 g/mol a 50 000 g/mol. Numa concretização particularmente preferida, os polímeros do invento são relativamente não citotóxicos. Noutra concretização particularmente preferida, os polímeros do invento são biocompatíveis e biodegradáveis. Numa concretização particularmente preferida, os polímeros do presente invento têm pKa na gama de 5,5 a 7,5, mais preferivelmente entre 6,0 e 7,0. Noutra concretização particularmente preferida, o polímero pode ser concebido para ter um pKa desejado entre 3,0 e 9,0, mais preferivelmente entre 5,0 e 8,0. Os polímeros do invento são particularmente atractivos para entrega de fármacos por várias razões: 1) contêm grupos amino para interacção com ADN e outros agentes carregados negativamente, para tamponar o pH, para causar endossomólise, etc.; 2) contêm elementos de ligação poliéster degradáveis; 3) podem ser sintetizados a partir de materiais de partida disponíveis comercialmente; e 4) são responsivos ao pH e poderão ser concebidas por engenharia futuras gerações com um pKa desejado. No rastreio quanto à eficiência de transfecção, os polímeros com o melhor desempenho eram hidrófobos ou os monómeros de diacrilato eram hidrófobos, e 23 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ muitos tinham bis(aminas secundárias), com mono- ou di-hidroxilo lateral e/ou linear, como parte da sua estrutura.
Os polímeros do presente invento são geralmente definidos como se segue:
O R* R' O onde cada R' é seleccionado independentemente de entre o grupo consistindo de hidrogénio, alquilo inferior Ci-C6, alcoxi inferior Ci-Cê, hidroxi, amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, tiol, heteroarilo, arilo, fenilo, heterociclico, carbociclico e halogéneo; n é um inteiro entre 3 e 10 000; x é um inteiro entre 1 e 10; e quando X é metilo ou NR2; e R é seleccionado de entre o grupo consistindo de hidrogénio, alquilo, alcenilo, alcinilo, cíclico, heterociclico, arilo e heteroarilo; ou quando X é OR; e R é seleccionado de entre o grupo consistindo de alquilo, alcenilo, alcinilo, cíclico, heterociclico, arilo e heteroarilo; y é um inteiro entre 1 e 10; ou quando X é OR; e R é hidrogénio, y é 5 ou um inteiro entre 1 e 2 ou 6 e 10 e seus derivados e sais. y é um inteiro entre 1 e 10; preferivelmente, x é um inteiro entre 2 e 6.
Em certas concretizações, os polímeros do presente invento são geralmente definidos como se segue: 24 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Ο Ο onde X é seleccionado de entre o grupo consistindo de alquilo inferior Ci-C6, alcoxi inferior Ci-C6, halogéneo, OR e NR2; mais preferivelmente, metilo, OH ou NH2; R é seleccionado de entre o grupo consistindo de hidrogénio, alquilo, alcenilo, alcinilo, ciclico heterociclico, arilo e heteroarilo; cada R' é seleccionado independentemente de entre o grupo consistindo de hidrogénio, alquilo inferior Ci-C6, alcoxi inferior Οι-Οε, hidroxi, amino, alquilamino, dialquil-amino, ciano, tiol, heteroarilo, arilo, fenilo, heterociclico, carbociclico e halogéneo; preferivelmente, R' é hidrogénio, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, hidroxilo, amino, fluoro, cloro ou bromo; mais preferivelmente, R' é fluoro, hidrogénio ou metilo; n é um inteiro entre 3 e 10 000; x é um inteiro entre 1 e 10; preferivelmente, x é um inteiro entre 2 e 6; y é um inteiro entre 1 e 10; preferivelmente, y é um inteiro entre 2 e 6; z é um inteiro entre 1 e 10; preferivelmente, z é um inteiro entre 2 e 6; e seus derivados e sais.
Noutra concretização, a unidade bis(éster de acrilato) no polímero do invento é escolhida de entre o grupo seguinte de unidades bis(éster de acrilato)
Bis(ésteres de acrilato) particularmente preferidos neste grupo incluem B, C, E, F, II, JJ, KK e LL. 25 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Noutra concretização, a amina no polímero do invento é escolhida de entre o grupo seguinte de aminas (l'-20'):
Em certas concretizações o polímero compreende a amina 5'.
Noutra concretização, a amina no polímero do invento é escolhida de entre o grupo seguinte de aminas (1-94) :
20 21 22 23 24
Em certas concretizações, os polímeros incluem as aminas 6, 8, 20, 24, 25, 28, 32, 36, 75 ou 80.
Exemplos particulares dos polímeros do presente invento incluem: o
OH C36 26 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Outros poli (beta-aminoésteres) particularmente úteis incluem F32, F28, JJ36, JJ32, LL8, E36, E32, C80, C32, JJ28, C28, C36, E28.
Numa concretização particularmente preferida, um ou ambos os ligadores A e B são polímeros de polietileno. Noutra concretização particularmente preferida, um ou ambos os ligadores A e B são polímeros de polietilenoglicol. Como um ou ambos os ligadores A e B, podem ser utilizados outros polímeros biocompatíveis, biodegradáveis.
Os polímeros seguintes não são parte do presente invento e podem ser geralmente definidos pela fórmula (I):
Os ligadores A e B são cada um uma cadeia de átomos ligando covalentemente os grupos amino e os grupos éster, respectivamente. Estes ligadores podem conter átomos de carbono ou heteroátomos (e.g. azoto, oxigénio, enxofre, etc.). Tipicamente, estes ligadores têm 1 a 30 átomos de comprimento, mais preferivelmente 1-15 átomos de comprimento. Os ligadores podem estar substituídos com vários substituintes incluindo, mas não limitados a, átomos de hidrogénio, grupos alquilo, alcenilo, alcinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxilo, alcoxi, halogéneo, arilo, heterocíclico, heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoilo, ácido carboxílico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol e ureido. Como será de notar por um perito nesta especialidade, cada um destes grupos pode por sua vez estar substituído. Os grupos Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7 e R8 podem ser quaisquer grupos químicos incluindo, mas não limitados a, átomos de hidrogénio, grupos alquilo, alcenilo, alcinilo amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxilo, alcoxi, halogéneo, arilo, heterocíclico, heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoilo, ácido carboxílico, éster, alquiltioéter, tiol e ureido. Nos polímeros do invento, n é um inteiro na gama de 5 a 10 000, mais preferivelmente de 10 a 500. 27 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Numa concretização particularmente preferida, a bis(amina secundária) é uma estrutura ciclica, e o polímero é geralmente representado pela fórmula II:
Nesta concretização, Ri e R2 estão ligados directamente em conjunto como se mostra na fórmula II. Exemplos de polímeros do invento nesta concretização incluem, mas não estão limitados às fórmulas III e IV: o o
Como acima descrito no parágrafo precedente, qualquer grupo químico que satisfaça a valência de cada átomo pode substituir qualquer átomo de hidrogénio.
Noutra concretização particularmente preferida, os grupos Ri e/ou R2 estão ligados covalentemente ao ligador A para formar uma ou duas estruturas cíclicas. Os polímeros da presente concretização são geralmente representados pela fórmula V na qual Ri e R2 estão ambos ligados ao ligador A para formar duas estruturas cíclicas:
As estruturas cíclicas podem ser anéis de 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 membros ou maiores. Os anéis podem conter heteroátomos e podem estar insaturados. Exemplos de polímeros de fórmula V incluem as fórmulas VI, VII e VIII: 28 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Ο η (VI) Ο
(VII)
(VIII).
Como acima descrito, qualquer qrupo químico que satisfaça a valência de cada átomo na molécula pode substituir qualquer átomo de hidrogénio.
Noutra concretização, os polímeros podem ser geralmente definidos pela fórmula (IX):
(IX) 0 ligador B é uma cadeia de átomos ligando covalentemente os grupo éster. 0 ligador pode conter átomos de carbono ou heteroátomos (e.g., azoto, oxigénio, enxofre, etc.). Tipicamente, o ligador tem 1 a 30 átomos de comprimento, preferivelmente 1-15 átomos de comprimento, e mais preferivelmente 2-10 átomos de comprimento. Em certas concretizações, o ligador B é uma cadeia alquilo linear ou ramificada, substituída ou não substituída, preferivelmente com 3-10 átomos de carbono, mais preferivelmente com 3, 4, 5, 6 ou 7 átomos de carbono. Noutras concretizações, o ligador B é uma cadeia heteroalifática linear ou ramificada, substituída ou não substituída,, preferivelmente com 3-10 átomos, mais preferivelmente com 3, 4, 5, 6 ou 7 átomos. Em certas concretizações, o ligador B compreende unidades de repetição de átomos de oxigénio e carbono. O ligador pode estar substituído com vários substituintes incluindo, mas não 29 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ limitados a, átomos de hidrogénio, grupos alquilo, alcenilo, alcinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxilo, alcoxi, halogéneo, arilo, heterocíclico, heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoilo, ácido carboxilico, éster, tioéter, alquiltioéter, tiol, acilo, acetilo e ureido. Como será apreciado por um perito nesta especialidade, cada um destes grupos pode por sua vez estar substituído. Cada um de Ri, R3, R4, R5, Rê, R7 e Rg pode ser independentemente qualquer grupo químico incluindo, mas não limitado a, átomo de hidrogénio, grupos alquilo, alcenilo, alcinilo, amino, alquilamino, dialquilamino, trialquilamino, hidroxilo, alcoxi, halogéneo, arilo, heterocíclico, heterocíclico aromático, ciano, amida, carbamoilo, ácido carboxilico, éster, alquiltioéter, tiol, acilo, acetilo e ureido. Em certas concretizações, Ri inclui grupos hidroxilo. Noutras concretizações, Ri inclui grupos amino, alquilamino ou dialquilamino. No polímero do invento, n é um inteiro na gama de 5 a 10 000, mais preferivelmente de 10 a 500.
Noutra concretização, a unidade bis(éster de acrilato) no polímero do invento é escolhida de entre o grupo seguinte de unidades bis(éster de acrilato) (A'-G'):
30 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Em certas concretizações, o polímero compreende o bis (éster de acrilato) G'.
Noutra concretização, a unidade bis(éster de acrilato) no polímero é escolhida de entre o grupo seguinte de unidades bis (éster de acrilato) (A-PP): b -Vt *ϊϊ· p /SA^sAg\^
U O \ ° AA Ύ^'Υ' B8^ KKxYa^)f"0^' O f
LL
PP
Bis (ésteres de acrilato) particularmente preferidos neste grupo incluem B, C, D, E, F, M, O, U, AA, II, JJ, KK e LL.
Noutra concretização, a amina no polímero é escolhida de entre o grupo seguinte de aminas (l'-20'):
15’
MH,CK (X- / \ ir i«* 19«
H
Em certas concretizações, o polímero compreende a amina 31 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ 5' . Noutras concretizações, ο polímero compreende a amina 14' .
Noutra concretização, a amina no polímero é escolhida de entre o grupo seguinte de aminas (1-94): 67 Ύν'Ύ''ν'^γ' 68 69 \,
85 87 88 89 90 77 ζ^Η, 60 'ν'ν-Κ'ν
«cí-V 62 63 ύ^ύ 64 65 ^(T—'pr^ HH, NM. 'HH,
92 HX 93 r^y^^HM, 94
Em certas concretizações, os polímeros incluem as aminas 6, 8, 17, 20, 24, 25, 28, 32, 36, 60, 61, 70, 75, 80, 86, 87, 89, 93 ou 94.
Exemplos particulares dos polímeros incluem: o
ΒΊ4'
O 32 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ ο ο '0' Ν' G'5' Ο ΟΗ Ο
Ν' ΑΊ4’
G'10’ Ν
33 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Outros poli(beta-aminoésteres) particularmente úteis incluem OMe
MeO. r
O O M17 "•h
Outros poli (beta-aminoésteres) particularmente úteis incluem C86, D60, D61, U94, F32, F28, JJ36, JJ32, LL6, LL8, U28, E28, U36, E36, U32, E32, C94, F94, JJ94, U28, JJ86, C86, U86, E86, C80, E80, JJ80, U80, D24, E24, JJ24, B17, 1128, 1136, 1132, C20, JJ20, E20, C25, U25, D25, D70, D28, D32, D36, D93, U87, D87, C75, U75, 020, 028, C94, AA20, AA28, D86, F86, AA36, AA24, AA94, 024, ΑΑβΟ, A61, C32, JJ28, C28, JJ20, D94, U32, D24, C36, E28, D36, U94, E24, E32, D28, U36, E80, E36, JJ80, E94, D93, B17, M17, AA61, U93 e C25.
Numa concretização particularmente preferida, um ou ambos os ligadores A e B são polímeros de polietileno. Noutra concretização particularmente preferida, um ou ambos os ligadores A e B são polímeros de polietilenoglicol. Como um 34 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ ou ambos os ligadores A e B, podem ser utilizados outros polímeros biocompatíveis, biodegradáveis.
Em certas concretizações preferidas, os polímeros do presente invento são terminados em amina. Noutras concretizações, os polímeros do presente invento são terminados em acrilato. Em grande parte, a unidade de terminação do polímero é determinada pela razão de amina versus acrilato na reacção de síntese do polímero. Um excesso de monómero de amina produz um polímero terminado em amina. E um excesso de monómero de acrilato produz um polímero terminado em acrilato.
Em certas concretizações, o peso molecular médio dos polímeros do presente invento está na gama de 1 000 g/mol a 50 000 g/mol, preferivelmente de 2 000 g/mol a 40 000 g/mol, mais preferivelmente de 5 000 g/mol a 20 000 g/mol, e ainda mais preferivelmente de 10 000 g/mol a 17 000 g/mol. Uma vez que os polímeros do presente invento são preparados por um passo de polimerização, obtém-se tipicamente uma distribuição estatística ampla de comprimentos de cadeia. Em certas concretizações, a distribuição de pesos moleculares numa amostra de polímero é estreitada por passos de purificação e isolamento conhecidos na especialidade. Pode-se também fazer variar o peso molecular do polímero através da síntese do polímero, por exemplo, à medida que a quantidade de monómeros de amina aumenta, o peso molecular do polímero resultante diminui. Noutras concretizações, a mistura de polímero pode ser uma mistura de polímeros de pesos moleculares diferentes.
Noutra concretização particularmente preferida, o polímero do presente invento é um co-polímero onde uma das unidades de repetição é um poli(β-aminoéster) do presente invento. Outras unidades de repetição a utilizar no co-polímero incluem, mas não estão limitados a, polietileno, poli(glicólido-co-láctido) (PLGA), poli(ácido glicólico), polimetacrilato, etc. Síntese de Polímeros
Os polímeros do invento podem ser preparados por qualquer método conhecido na especialidade. Preferivelmente os polímeros são preparados a partir de materiais de partida disponíveis comercialmente. Noutra concretização preferida, 35 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ os polímeros são preparados a partir de materiais de partida preparados de modo fácil e/ou barato.
Numa concretização particularmente preferida, o polímero do invento é preparado através da adição conjugada de bis(aminas secundárias) a bis(ésteres de acrilato). Este esquema reaccional é a seguir apresentado: ^í—h.b . r'Α-'-'ί' no
Os monómeros de bis(amina secundária) que são úteis no presente método incluem, mas não estão limitados a, N,N'-dimetiletilenodiamina, piperazina, 2-metilpiperazina, 1,2-bis(N-etilamino)etileno e 4,4'-trimetilenodipiperidina. Monómeros de diacrilato que são úteis incluem, mas não estão limitados a, diacrilato de 1,4-butanodiol, dimetacrilato de 1.4- butanodiol, diacrilato de 1,2-etanodiol, diacrilato de 1,6-hexanodiol, diacrilato de 1,5-pentanodiol, diacrilato de 2.5- hexanodiol e diacrilato de 1,3-propanodiol. Cada um dos monómeros é dissolvido num solvente orgânico (e.g., THF, CH2C12, MeOH, EtOH, CHCI3, hexanos, tolueno, benzeno, CC14, glima, dietiléter, DMSO, DMF, etc.), preferivelmente DMSO. As soluções resultantes são combinadas, e a mistura reaccional é aquecida para dar o polímero desejado. Noutras concretizações, a reacção é realizada sem a utilização de um solvente (í.e., puro) obviando-se desse modo a necessidade de remoção do solvente após a síntese. A mistura reaccional é depois aquecida a uma temperatura na gama de 30°C a 200°C, preferivelmente 40°C a 150°C, mais preferivelmente 50°C a 100°C. Numa concretização particularmente preferida, a mistura reaccional é aquecida a aproximadamente 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C ou 90°C. Noutra concretização particularmente preferida, a mistura reaccional é aquecida a aproximadamente 75°C. Noutra concretização, a mistura reaccional é aquecida a aproximadamente 100°C. A reacção de polimerização pode também ser catalisada. 0 tempo de reacção pode variar de horas a dias, dependendo da reacção de polimerização e das condições de reacção. Como será apreciado por um perito na especialidade, o aquecimento da mistura reaccional tende a acelerar a velocidade de reacção requerendo um tempo de reacção mais curto. Em certas concretizações, a síntese do polímero é realizada em DMSO a 36 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ aproximadamente 60°C durante aproximadamente 2 dias. Noutras concretizações, a síntese do polímero é realizada sem solvente a 95°C durante 8-16 horas. Como será apreciado por um perito nesta especialidade, o peso molecular do polímero sintetizado pode ser determinado pelas condições de reacção (e.g., temperatura, materiais de partida, concentração, catalisador, solvente, tempo de reacção, etc.) utilizadas na síntese.
Noutra concretização particularmente preferida, os polímeros são preparados pela adição conjugada de uma amina primária a um bis(éster de acrilato). A utilização de aminas primárias em vez de bis(aminas secundárias) permite uma variedade muito mais ampla de materiais de partida disponíveis comercialmente. 0 esquema reaccional utilizando aminas primárias em vez de aminas secundárias é a seguir a apresentado: 0 0
Aminas primárias úteis neste método incluem, mas não estão limitados a, metilamina, etilamina, isopropilamina, anilina, anilinas substituídas e etanolamina. Os bis(ésteres de acrilato) úteis neste método incluem, mas não estão limitados a, diacrilato de 1,4-butanodiol, dimetacrilato de 1,4-butanodiol, diacrilato de 1,2-etanodiol, diacrilato 1,6-hexanodiol, diacrilato de 1,5-pentanodiol, diacrilato de 2,5-hexanodiol e diacrilato de 1,3-propanodiol. Cada um dos monómeros é dissolvido num solvente orgânico (e.g., THF, DMSO, DMF, CH2C12, MeOH, EtOH, CHC13, hexanos, CC14, glima, dietiléter, etc.). Preferem-se os solventes orgânicos devido à susceptibilidade dos poliésteres a hidrólise. Preferivelmente, o solvente orgânico utilizado é relativamente não tóxico em sistemas vivos. Em certas concretizações, utiliza-se DMSO como o solvente orgânico porque é relativamente não tóxico e é frequentemente utilizado como solvente em cultura de células e no armazenamento de células de reserva congeladas. Outros solventes preferidos incluem os solventes miscíveis com água tais como DMSO, etanol e metanol. Combinam-se as soluções resultantes de monómeros, que estão preferivelmente numa concentração entre 0,01 M e 5 M, entre aproximadamente 0,1 M 37 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ e 2 Μ, mais preferivelmente entre 0,5 M e 2 M, e muito preferivelmente entre 1,3 M e 1,8 M, e aquece-se a mistura reaccional para produzir o polímero desejado. Em certas concretizações, a reacção é realizada sem solvente. A realização da polimerização sem solvente pode diminuir a quantidade de produtos de ciclização, resultantes de reacções de adição conjugada intramoleculares. A polimerização pode ser realizada a uma temperatura na gama de 20°C a 200°C, preferivelmente de 40°C a 100°C, mais preferivelmente de 50°C a 75°C, ainda mais preferivelmente de 50°C a 60°C. Numa concretização particularmente preferida, a mistura reaccional é mantida a 20°C. Noutra concretização particularmente preferida, a mistura reaccional é aquecida a aproximadamente 50°C. Em algumas concretizações, a mistura reaccional é aquecida a aproximadamente 56°C. Ainda noutra concretização particularmente preferida, a mistura reaccional é aquecida a aproximadamente 75°C. A mistura reaccional pode também ser arrefecida a aproximadamente 0°C. A reacção de polimerização pode também ser catalisada tal como com um catalisador organometálico, ácido ou base. Noutra concretização preferida, na reacção de polimerização podem-se utilizar um ou mais tipos de monómeros de amina e/ou monómeros de diacrilato. Por exemplo, pode-se utilizar uma combinação de etanolamina e etilamina para preparar um polímero mais hidrófilo do que um preparado utilizando apenas etilamina, e também mais hidrófobo do que um preparado utilizando apenas etanolamina.
Na preparação dos polímeros do presente invento, os monómeros na mistura reaccional podem ser combinados em diferentes razões para proporcionar o peso molecular, rendimento, terminação da extremidade, etc. do polímero resultante. A razão de monómeros de amina para monómeros de diacrilato pode variar de 1,6 a 0,4, preferivelmente de 1,4 a 0,6, mais preferivelmente de 1,2 a 0,8, ainda mais preferivelmente de 1,1 a 0,9. Em certas concretizações, a proporção de monómeros de amina para monómeros de diacrilato é aproximadamente 1, 4, 1,3, 1,2, 1, 1, 1, 050, 1,025, 1, 0, 0,975, 0,950, 0,900, 0,800 e 0,600. Por exemplo, a combinação dos monómeros numa razão de 1:1 resulta tipicamente em polímeros de peso molecular mais elevado e em rendimentos globais mais elevados. Também, proporcionar um excesso de monómeros de amina (i.e., razão de amina para acrilato > 1) resulta em cadeias terminadas em amina enquanto que 38 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ proporcionar um excesso de monómero de acrilato (i.e., razão de amina para acrilato < 1) resulta em cadeias terminadas em acrilato. A razão de monómeros de amina para monómeros de acrilato na síntese do polimero pode afectar como as cadeias de polimero são terminadas, o peso molecular dos polímeros produzidos, a distribuição de pesos moleculares e a extensão da reticulação. 0 polimero sintetizado pode ser purificado por qualquer técnica conhecida na especialidade incluindo, mas não limitada a, precipitação, cristalização, extracção, cromatografia, etc. Numa concretização particularmente preferida, o polímero é purificado através de precipitações repetidas num solvente orgânico (e.g., dietiléter, hexano, etc.). Numa concretização particularmente preferida, o polimero é isolado como um cloridrato, fosfato, acetato ou outro sal. Preferivelmente, o sal é farmaceuticamente aceitável em certas concretizações. 0 polímero resultante pode também ser utilizado tal e qual sem mais purificação e isolamento; tornando desse modo vantajoso utilizar um solvente compatível com os ensaios a utilizar na avaliação dos polímeros. Por exemplo, os polímeros podem ser preparados num solvente não tóxico tal como DMSO, e a solução resultante de polímero pode depois ser utilizada em ensaios de culturas de células envolvendo transfecção de um ácido nucleico numa célula. Como será apreciado por um perito nesta especialidade, o peso molecular do polímero sintetizado e a extensão de reticulação podem ser determinados pelas condições de reacção (e.g., temperatura, materiais de partida, concentração, equivalentes de amina, equivalentes de acrilato, ordem de adição, solvente, etc.) utilizadas na síntese (Odian, Principies of Polymerization 3.a Ed., New York: John Wiley & Sons, 1991; Stevens, Polymer Chemistry: An Introduction 2.a Ed., New York: Oxford University Press, 1990) . A extensão de reticulação do polímero preparado pode ser minimizada para entre 1-20%, preferivelmente entre 1-10%, mais preferivelmente entre 1-5%, e muito preferivelmente menos do que 2%. Como será apreciado pelos peritos nesta especialidade, as aminas ou os bis(ésteres de acrilato) com grupos nucleófilos são mais susceptíveis a reticulação, e pode ser necessário tomar medidas para reduzir a reticulação tais como abaixamento da temperatura ou alteração da 39 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ concentração dos materiais de partida na mistura reaccional. Os acrilatos e outras porções com insaturação ou os halogéneos são também susceptiveis de polimerização radicalar que pode conduzir a reticulação. A extensão da polimerização radicalar e da reticulação pode ser reduzida, reduzindo a temperatura da mistura reaccional ou por outros meios conhecidos na especialidade.
Numa concretização, é preparada em paralelo uma biblioteca de polímeros diferentes. A síntese de uma biblioteca de polímeros pode ser realizada utilizando qualquer um dos ensinamentos conhecidos na especialidade ou aqui descrito em relação à síntese de polímeros do invento. Numa concretização, adicionam-se uma amina e/ou um bis(éster de acrilato) diferentes, numa razão particular de amina para acrilato, a cada frasco num conjunto de frascos utilizado para preparar a biblioteca ou a cada poço numa placa de múltiplos poços (e.g., placa de 96 poços). Numa concretização, os monómeros são diluídos até entre 0,1 M e 5 M, mais preferivelmente 0,5 M a 2 M, e muito preferivelmente a aproximadamente 1,6 M, num solvente orgânico tal como DMSO. Os monómeros podem ser combinados em diferentes razões para proporcionar o peso molecular, rendimento, terminação da extremidade, etc. Por exemplo, a combinação dos monómeros numa razão de 1:1 resulta tipicamente em polímeros de peso molecular mais elevado e em rendimentos globais mais elevados. Proporcionar um excesso de monómero de amina resulta em cadeias terminadas em amina enquanto que proporcionar um excesso de monómero de acrilato resulta em cadeias terminadas em acrilato. Em algumas concretizações, não é utilizado qualquer solvente na síntese do polímero. O conjunto de frascos ou placa de múltiplos poços são incubados a uma temperatura e durante um tempo suficientes para permitir que a polimerização dos monómeros ocorra como aqui descrito. Em certas concretizações preferidas, o tempo e temperatura são escolhidos para efectuar a incorporação quase completa ( e.g., 50% de conversão, 75% de conversão , 80% de conversão, 90% de conversão, 95% de conversão, >95% de conversão, 98% de conversão, 99% de conversão ou >99% de conversão) de todo o monómero no polímero. A reacção de polimerização pode ser realizada a quaisquer temperaturas na gama de 0°C a 200°C. Numa concretização, as misturas reaccionais são incubadas a aproximadamente 45 °C durante aproximadamente 5 dias. Noutra concretização, as misturas 40 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ reaccionais são incubadas a aproximadamente 56°C durante aproximadamente 5 dias. Noutra concretização, as misturas reaccionais são incubadas a aproximadamente 100°C durante aproximadamente 5 horas. Os polímeros podem depois ser isolados e purificados utilizando técnicas conhecidas na especialidade, ou as soluções resultantes de polímeros podem ser utilizadas sem mais isolamento ou purificação. Em certas concretizações, são preparados em paralelo mais de 1000 polímeros diferentes. Noutras concretizações, são preparados em paralelo mais de 2000 polímeros diferentes. Ainda noutras concretizações, são preparados em paralelo mais de 3000 polimeros diferentes. Os polímeros podem depois ser rastreados por técnicas de elevado rendimento ("high throughput") para identificar polímeros com uma característica desejada (e.g., solubilidade em água, solubilidade a diferentes pH, solubilidade em vários solventes orgânicos, capacidade para se ligar polinucleótidos, capacidade para se ligar a heparina, capacidade para se ligar a moléculas pequenas, capacidade para formar micropartículas, capacidade para aumentar a eficiência de transfecção, etc.). Os polímeros do invento podem ser rastreados ou utilizados após síntese sem mais precipitação, purificação ou isolamento do polímero. A utilização de um solvente não tóxico tal como DMSO na síntese dos polímeros permite o fácil manuseamento e utilização dos polímeros após a síntese do polímero. Por exemplo, a solução de polímero em DMSO pode ser adicionada a uma cultura de células ou outro sistema vivo sem um efeito tóxico sobre as células. Em certas concretizações, os polímeros podem ser rastreados quanto a propriedades ou características úteis em terapia génica (e.g., capacidade para se ligarem a polinucleótidos, aumento em eficiência de transfecção, etc.). Noutras concretizações, os polímeros podem ser rastreados quanto a propriedades ou características úteis na especialidade da engenharia de tecidos (e.g., capacidade para suportar o crescimento de tecidos ou de células, capacidade para promover a ligação de células). Em certas concretizações, os polímeros são sintetizados e ensaiados utilizando técnicas semiautomatizadas e/ou sistemas robotizados de manuseamento de fluidos.
Complexos de polinucleótido E bem conhecida a capacidade de compostos catiónicos 41 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ para interactuarem com polinucleótidos carregados negativamente através de interacções electrostáticas. Polímeros catiónicos, tais como poli(lisina), têm sido preparados e estudados quanto à sua capacidade para complexar polinucleótidos. No entanto, os polímeros estudados até à data têm incorporado aminas nas extremidades terminais de cadeias laterais curtas, de conformação flexível (e.g., poli(lisina)) ou aminas acessíveis sobre a superfície de poliaminas esféricas ou globulares (e.g., dendrímeros de PEI e PAMAM). Pensa-se que a interacção do polímero com o polinucleótido impede, pelo menos parcialmente, a degradação do polinucleótido. Neutralizando a carga sobre o esqueleto do polinucleótido, o complexo neutro ou ligeiramente carregado positivamente é também capaz de passar mais facilmente através das membranas hidrófobas (e.g., citoplásmica, de lisossoma, de endossoma, nuclear) da célula. Numa concretização particularmente preferida, o complexo está ligeiramente carregado positivamente. Noutra concretização particularmente preferida, o complexo tem um potencial ζ positivo, mais preferivelmente o potencial ζ está entre +1 e +30. Em certas concretizações, podem-se utilizar agentes tais como poli(ácido acrílico) (pAA), poli(ácido aspártico), poli(ácido glutâmico) ou poli(ácido maleico) para prevenir a inibição do soro dos complexos de polinucleótido/polímero em células cultivadas em meios com soro (Trubetskoy et al., "Recharging cationic DNA complexes with highly charged polyanions for in vitro and in vivo gene delivery" Gene Therapy 10:261-271, 2003; aqui incorporada por referência).
Os poli(β-aminoésteres) do presente invento possuem aminas terciárias no esqueleto do polímero. Ainda que estas aminas estejam mais impedidas, estas estão disponíveis para interactuarem com um polinucleótido. Os polinucleótidos ou seus derivados são postos em contacto com os polímeros do invento sob condições adequadas para formar complexos de polinucleótido/polímero. Em certas concretizações, a razão de azoto no polímero (N) para fosfato no polinucleótido é 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1 ou 120:1. Em certas concretizações, a razão (p/p) de polímero para ADN é 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1, 100:1, 110:1, 120:1, 130:1, 140:1, 150:1 ou 200:1. O polímero está preferivelmente pelo menos parcialmente protonado de 42 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ modo a formar um complexo com o polinucleótido carregado negativamente. Numa concretização preferida, os complexos de polinucleótido/polímero formam nanopartículas que são úteis na entrega de polinucleótidos a células. Numa concretização particularmente preferida, o diâmetro das nanopartículas está na gama de 50-500 nm, mais preferivelmente o diâmetro das nanopartículas está na gama de 50-200 nm, e muito preferivelmente de 90-150 nm. As nanopartículas podem ser associadas com um agente de direccionamento como a seguir descrito.
Em certas concretizações, podem-se adicionar outros agentes aos complexos de polinucleótido:poli(beta-aminoéster). Em certas concretizações, utiliza-se um agente de co-complexação. É conhecido que agentes de co-complexação se ligam a polinucleótidos e/ou aumentam a eficiência de transfecção. Os agentes de co-complexação têm usualmente uma densidade de azoto elevada. A polilisina (pll) e a polietilenoimina (PEI) são dois exemplos de agentes poliméricos de co-complexação. A PLL tem uma razão de peso molecular para átomos de azoto de 65, e a PEI tem uma razão de peso molecular para átomos de azoto de 43. Qualquer polímero com uma razão de peso molecular para átomos de azoto na gama de 10-100, preferivelmente 25-75, mais preferivelmente 40-70, pode ser útil como um agente de co-complexação. A inclusão de um agente de co-complexação num complexo pode permitir reduzir a quantidade de poli(beta-aminoéster) no complexo. Isto torna-se particularmente importante se o poli(beta-aminoéster) for citotóxico para concentrações mais elevadas. Nos complexos resultantes com agentes de co-complexação, a razão de agente de co-complexação para polinucleótido (p/p) pode estar na gama de 0 a 2,0, preferivelmente de 0,1 a 1,2, mais preferivelmente de 0,1 a 0,6, e ainda mais preferivelmente de 0,1 a 0,4.
As propriedades de transfecção de vários complexos do invento podem ser determinadas por estudos de transfecção in vitro (e.g., transfecção de GFP em células cultivadas) ou em modelos animais. Em certas concretizações, o complexo utilizado para transfecção está optimizado para um tipo de células particulares, polinucleótido a ser entregue, poli(beta-aminoéster), agente de co-complexação (se utilizado), processo de doença, método de administração (e.g., inalação, oral, parentérico, IV, intratecal, etc.), 43 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ regime de dosagem, etc.
Polinucleótido 0 polinucleótido a ser complexado ou encapsulado pelos polímeros do invento pode ser qualquer ácido nucleico incluindo mas não limitado a ARN e ADN. Os polinucleótidos podem ser de qualquer tamanho ou sequência, e podem ser de cadeia simples ou dupla. Em certas concretizações preferidas, o polinucleótido tem mais do que 100 pares de bases de comprimento. Em certas outras concretizações preferidas, o polinucleótido tem mais do que 1000 pares de bases de comprimento e pode ter mais do que 10 000 pares de bases de comprimento. O polinucleótido está preferivelmente purificado e substancialmente puro. Preferivelmente, o polinucleótido é mais de 50% puro, mais preferivelmente mais de 75% puro, e muito preferivelmente mais de 95% puro. O polinucleótido pode ser proporcionado por quaisquer meios conhecidos na especialidade. Em certas concretizações preferidas, o polinucleótido foi construído por engenharia utilizando técnicas recombinantes (para uma descrição mais detalhada destas técnicas, ver por favor Ausubel et al.r Current Protocols in Molecular Bíology (John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a Ed., ed. por Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); cada uma das quais é aqui incorporada por referência). Os polinucleótidos podem também ser obtidos a partir de fontes naturais e purificados dos componentes contaminantes normalmente encontrados na natureza. O polinucleótido pode também ser sintetizado quimicamente em laboratório. Numa concretização preferida, o polinucleótido é sintetizado utilizando química padrão de fase sólida. O polinucleótido pode ser modificado por meios químicos ou biológicos. Em certas concretizações preferidas, estas modificações conduzem a estabilidade aumentada do polinucleótido. As modificações incluem metilação, fosforilação, terminação das extremidades, etc.
No presente invento, podem-se também utilizar derivados de polinucleótidos. Estes derivados incluem modificações nas bases, açúcares e/ou elementos de ligação de fosfato do polinucleótido. Bases modificadas incluem, mas não estão 44 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ limitadas a, as que se encontram nos análogos de nucleósido seguintes: 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-iodouridina, C5-propiniluridina, C5-propinilcitidina, C5-metilcitidina, 7-desaza-adenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, 0(6)-metilguanina e 2-tiocitidina. Açúcares modificados incluem, mas não estão limitados a, 2'-fluororribose, ribose, 2'-desoxirribose, 3'-azido-2',3'-didesoxirribose, 2',3'-didesoxirribose, arabinose (o epimero 2' de ribose), açúcares aciclicos e hexoses. Os nucleósidos são ligados em conjunto por outros elementos de ligação que não o elemento de ligação fosfodiéster encontrado em ADN e ARN de ocorrência natural. Elementos de ligação modificados incluem, mas não estão limitados a, elementos de ligação fosforotioato e 5'-N-fosforamidito. Podem-se utilizar combinações das várias modificações num único polinucleótido. Estes polinucleótidos modificados podem ser proporcionados por quaisquer meios conhecidos na especialidade; contudo, como será apreciado pelos peritos nesta especialidade, os polinucleótidos modificados são preparados preferivelmente utilizando quimica de síntese in vitro.
Os polinucleótidos a serem entregues podem estar em qualquer forma. Por exemplo, o polinucleótido pode ser um plasmídeo circular, um plasmídeo linearizado, um cosmídeo, um genoma virai, um genoma virai modificado, um cromossoma artificial, etc. 0 polinucleótido pode ser de qualquer sequência. Em certas concretizações preferidas, o polinucleótido codifica uma proteína ou péptido. As proteínas codificadas podem ser enzimas, proteínas estruturais, receptores, receptores solúveis, canais de iões, proteínas farmaceuticamente activas, citoquinas, interleucinas, anticorpos, fragmentos de anticorpo, antigénios, factores de coagulação, albumina, factores de crescimento, hormonas, insulina, etc. 0 polinucleótido pode também compreender regiões reguladoras para controlar a expressão de um gene. Estas regiões reguladoras podem incluir, mas não estão limitados a, promotores, elementos intensificadores, elementos repressores, caixa TATA, sítios de ligação de ribossomas, sítio de paragem de transcrição, etc. Noutras concretizações particularmente preferidas, não se pretende que o 45 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ polinucleótido codifique uma proteína. Por exemplo, o polinucleótido pode ser utilizado para reparar um erro no genoma da célula que está a ser transfectada. 0 polinucleótido pode também ser fornecido como um agente anti-sentido ou ARN de interferência (ARNi) (Fire et al., Nature 391:806-811, 1998; aqui incorporada por referência). A terapia anti-sentido pretende incluir, e.g., administração ou fornecimento in situ de oligonucleótidos de cadeia simples ou dupla ou seus derivados que especificamente se hibridam, e.g., se ligam, sob condições celulares, com ARNm celular e/ou ADN genómico, ou seus mutantes, de modo a inibir a expressão da proteína codificada, e.g., por inibição da transcrição e/ou tradução (Crooke, "Molecular mechanisms of action of antisense drugs" Biochim. Biophys. Acta 1489(1):31-44, 1999; Crooke "Evaluating the mechanism of action of antiproliferative antisense drugs" Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10(2):123-126, discussão 127, 2000;
Methods in Enzymology, volumes 313-314, 1999) . A ligação pode ser por complementaridade de pares de bases convencional, ou, por exemplo, no caso de ligação a duplexes de adn, através de interacções específicas na volta principal da hélice dupla (i.e., formação de hélice tripla) (Chan et al., J. Mol. Med. 75(4) :267-282, 1997) .
Numa concretização particularmente preferida, o polinucleótido a ser entregue compreende uma sequência codificando uma proteína ou péptido antigénico.
Nanopartículas contendo estes polinucleótidos podem ser entregues a um indivíduo para induzir uma resposta imunológica suficiente para diminuir a probabilidade de uma infecção subsequente e/ou aliviar os sintomas associados com uma tal infecção. O polinucleótido destas vacinas pode ser combinado com interleucinas, interferão, citoquinas e adjuvantes tais como toxina da cólera, alúmen, adjuvante de Freund, etc. É conhecido um grande número de compostos adjuvantes; um compêndio útil de muitos destes compostos é preparado pelo National Institutes of Health e pode ser encontrado na internet (http:/www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf, ver também Allison, Dev. Biol. Stand. 92:3-11, 1998; Unkeless et al., Annu. Rev. Immunol. 6:251-281, 1998; e Phillips et al., Vaccine 10:151-158,1992). 46 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Uma proteína ou péptidos antigénicos codificados pelo polinucleótido podem ser obtidos a partir de organismos bacterianos tais como Streptococccus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes, Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Leptospirosis interrogans, Borrelia burgdorferi, Camphylobacter jejuni, e outros; a partir de vírus tais como varíola, influenza A e B, vírus sincicial respiratório, parainfluenza, sarampo, HIV, varicela-zóster, herpes simplex 1 e 2, citomegalovírus, virus Epstein-Barr, rotavírus, rinovírus, adenovírus, papilomavírus, poliovírus, papeira, raiva, rubéola, vírus "coxsackie", encefalite equina, encefalite Japonesa, febre amarela, febre de Rift Valley, vírus de hepatite A, B, C, D e E, e outros; e a partir de organismos fúngicos, protozoários e parasitas, tais como Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Ríckettsía ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vagínalis, Schístosoma mansoni, e outros.
Micropartículas
Os poli(β-aminoésteres) do presente invento podem também ser utilizados para formar dispositivos de entrega de fármaco. Os polímeros do invento podem ser utilizados para encapsular agentes incluindo polinucleótidos, moléculas pequenas, proteínas, péptidos, metais, compostos organometálicos, etc. Os polímeros do invento têm varias propriedades que os tornam particularmente adequados na preparação de dispositivos de entrega de fármaco. Estas incluem 1) a capacidade do polímero para complexar e "proteger" agentes lábeis; 2) a capacidade para tamponar o pH no endossoma; 3) a capacidade para actuar como uma "esponja de protões" e causar endossomólise; e 4) a capacidade para neutralizar a carga em agentes carregados negativamente. Numa 47 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ concretização preferida, os polímeros são utilizados para formar micropartículas contendo o agente a ser entregue. Numa concretização particularmente preferida, o diâmetro das micropartículas está na gama entre 500 nm e 50 mícron, mais preferivelmente de 1 mícron a 20 mícron, e muito preferivelmente de 1 mícron a 10 mícron. Noutra concretização particularmente preferida, as micropartículas estão na gama de 1-5 mícron. O polímero de encapsulação do invento pode ser combinado com outros polímeros (e.g., PEG, PLGA) para formar as microsferas. Métodos de preparação de micropartículas
As micropartículas do invento podem ser preparadas utilizando qualquer método conhecido nesta especialidade. Estes incluem, mas não estão limitados a, secagem por pulverização, emulsão dupla e simples, evaporação de solvente, extracção de solvente, separação de fases, coacervação simples e complexa, e outros métodos bem conhecidos dos vulgares peritos na especialidade. Métodos de preparação das partículas particularmente preferidos são o processo de emulsão dupla e a secagem por pulverização. As condições utilizadas na preparação das micropartículas podem ser alteradas para proporcionar partículas com um tamanho ou propriedade desejados (e.g., hidrofobia, hidrofilia, morfologia externa, "adesividade", forma, etc.). O método de preparação das partículas e as condições (e.g., solvente, temperatura, concentração, caudal de ar, etc.) utilizados podem também depender do agente que está a ser encapsulado e/ou da composição da matriz de polímero. Métodos desenvolvidos para preparação das micropartículas para entrega de agentes encapsulados são descritos na literatura (por exemplo, ver por favor Doubrow, M., Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992; Matiowitz e Langer, J. Controlled Release 5:13-22, 1987; Matiowitz et al., Reactíve Polymers 6:275-283, 1987; Matiowitz et al., J. Appl. Polymer Sei. 35:755-774, 1988; cada uma das quais é aqui incorporada por referência).
Se as partículas preparadas por qualquer dos métodos anteriores tiverem uma gama de tamanhos fora da gama desejada, as partículas podem ser calibradas, por exemplo, 48 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ utilizando um peneiro.
Agente
Os agentes a serem entregues pelo sistema do presente invento podem ser agentes terapêuticos, de diagnóstico ou profilácticos. Qualquer composto químico a ser administrado a um indivíduo pode ser entregue utilizando as micropartículas do invento. 0 agente pode ser uma molécula pequena, composto organometálico, ácido nucleico, proteína, péptido, polinucleótido, metal, um composto químico marcado isotopicamente, fármaco, vacina, agente imunológico, etc.
Numa concretização preferida, os agentes são compostos orgânicos com actividade farmacêutica. Noutra concretização do invento, o agente é um fármaco utilizado clinicamente. Numa concretização particularmente preferida, o fármaco é um antibiótico, agente antiviral, anestésico, agente esteróide, agente anti-inflamatório, agente antineoplásico, antigénio, vacina, anticorpo, descongestionante, anti-hipertensor, sedativo, agente de controlo da gravidez, agente progestação, anticolinérgico, analgésico, antidepressivo, antipsicótico, agente bloqueador β-adrenérgico, diurético, agente activo cardiovascular, agente vasoactivo, agente anti-inflamatório não esteróide, agente nutricional, etc.
Numa concretização preferida do presente invento, o agente a ser entregue pode ser uma mistura de agentes. Por exemplo, um anestésico local pode ser entregue em combinação com um agente anti-inflamatório tal como um esteróide. Anestésicos locais podem também ser administrados com agentes vasoactivos tais como epinefrina. Para dar outro exemplo, um antibiótico pode ser combinado com um inibidor da enzima habitualmente produzida por bactérias para inactivar o antibiótico (e.g., penicilina e ácido clavulânico).
Agentes de diagnóstico incluem gases; metais; agentes de imagiologia disponíveis comercialmente utilizados em tomografia por emissão de positrões (PET), tomografia assistida por computador (CAT), tomografia computorizada por emissão de fotão simples, raios-x, fluoroscopia e imagiologia de ressonância magnética (MRI); e agentes de contraste. Exemplos de materiais adequados para utilização como agentes de contraste em MRI incluem quelatos de gadolínio, bem como 49 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ de ferro, magnésio, manganês, cobre e crómio. Exemplos de materiais úteis para imagiologia de CAT e raios x incluem materiais à base de iodo.
Agentes profilácticos incluem, mas não estão limitados a, antibióticos, suplementos nutricionais e vacinas. As vacinas podem compreender proteínas isoladas ou péptidos, organismos e vírus inactivados, organismos e vírus mortos, organismos ou vírus alterados geneticamente, e extractos de células. Os agentes profilácticos podem ser combinados com interleucinas, interferão, citoquinas e adjuvantes tais como toxina da cólera, alúmen, adjuvante de Freund, etc. Agentes profilácticos incluem antigénios de organismos bacterianos tais como Streptococccus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyrogenes, Corynebacterium diphtheriae, Listeria monocytogenes, Bacillus anthracis, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus mutans, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Legionella pneumophíla, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Leptospirosis interrogans, Borrelia burgdorferi, Camphylobacter jejuni e outros; antigénios de vírus tais como varíola, influenza A e B, vírus sincicial respiratório, parainfluenza, sarampo, HIV, varicela-zóster, herpes simplex 1 e 2, citomegalovírus, vírus Epstein-Barr, rotavírus, rinovírus, adenovírus, papilomavírus, poliovírus, papeira, raiva, rubéola, vírus "coxsackie", encefalite equina, encefalite Japonesa, febre amarela, febre de Rift Valley, vírus da hepatite A, B, C, D e E, e outros; antigénios de organismos fúngicos, protozoários e parasitas tais como Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis, Schistosoma mansoni, e outros. Estes antigénios podem estar na forma de organismos mortos inteiros, péptidos, proteínas, glicoproteínas, carboidratos ou suas combinações. 50 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Agentes de direccionamento
As micro- e nanopartículas do invento podem ser modificadas para incluir agentes de direccionamento uma vez que é frequentemente desejável alvejar uma célula, colecção de células ou tecido. São conhecidos na especialidade vários agentes de direccionamento que dirigem composições farmacêuticas para células particulares (ver, por exemplo, Cotten et al., Methods Enzym. 217:618, 1993; aqui incorporada por referência). Os agentes de direccionamento podem ser incluídos através da partícula ou podem estar apenas sobre a superfície. O agente de direccionamento pode ser uma proteína, péptido, carboidrato, glicoproteína, lípido, molécula pequena, etc. O agente de direccionamento pode ser utilizado para alvejar células ou tecidos específicos ou pode ser utilizado para promover a endocitose ou a fagocitose da partícula. Exemplos de agentes de direccionamento incluem, mas não estão limitados a, anticorpos, fragmentos de anticorpos, lipoproteínas de baixa densidade (LDL), transferrina, asialicoproteínas, proteína de envelope gp 120 do vírus da imunodeficiência de humano (HIV), carboidratos, ligandos de receptor, ácido siálico, etc. Se o agente de direccionamento estiver incluído em toda a partícula, o agente de direccionamento pode ser incluído na mistura que é utilizada para formar as partículas. Se o agente de direccionamento está apenas sobre a superfície, o agente de direccionamento pode ser associado (í.e., por interacções covalentes, hidrófobas, de ligação de hidrogénio, de van der Waals ou outras) com as partículas formadas utilizando técnicas químicas padrão.
Composições farmacêuticas
Após as micropartículas ou nanopartículas (polímero complexado com polinucleótido) terem sido preparadas, estas podem ser combinadas com um ou mais excipientes farmacêuticos para formar uma composição farmacêutica que é adequada para administração a animais incluindo humanos. Como será apreciado por um perito nesta especialidade, os excipientes podem ser escolhidos com base na via de administração como a seguir descrito, no agente que está a ser entregue, período de tempo de entrega do agente, etc.
As composiçoes farmacêuticas do presente invento e para 51 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ utilização de acordo com o presente invento podem incluir um excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizado, o termo "transportador farmaceuticamente aceitável" significa um enchimento, diluente, material de encapsulação ou auxiliar de qualquer tipo, não tóxico, inerte sólido, semi-sólido ou líquido. Alguns exemplos de materiais que podem servir como transportadores farmaceuticamente aceitáveis são açúcares tais como lactose, glucose e sacarose; amidos tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados tais como carboximetilcelulose sódica, etilcelulose e acetato de celulose; goma adragante em pó; malte; gelatina; talco; excipientes tais como manteiga de cacau e ceras para supositório; óleos tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão; óleo de açafroa; óleo de sésamo; azeite; óleo de milho e óleo de soja; glicóis tais como propilenoglicol; ésteres tais como oleato de etilo e laurato de etilo; ágar; detergentes tais como Tween 80; agentes tamponantes tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água isenta de pirogénio; solução salina isotónica; solução de Ringer; etanol; e soluções tampão de fosfato, bem como outros lubrificantes compatíveis não tóxicos tais como laurilsulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de libertação, agentes de revestimento, agentes edulcorantes, aromatizantes e perfumantes, conservantes e antioxidantes podem também estar presentes na composição, de acordo com o critério do formulador. As composições farmacêuticas deste invento podem ser administradas a humanos e/ou a animais, oralmente, rectalmente, parentericamente, intracisternalmente, intravaginalmente, intranasalmente, intraperitonealmente, topicamente (tal como por pós, cremes, pomadas ou gotas), bucalmente, ou como um pulverizador oral ou nasal.
As formas de dosagem líquidas para administração oral incluem emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Para além dos ingredientes activos (i.e., micropartícuias, nanopartícuias, complexos de polinucleótido/polímero), as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes vulgarmente utilizados na especialidade tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsionantes, tais como etanol, isopropanol, carbonato de etilo, acetato de etilo, álcool benzílico, benzoato de 52 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ benzilo, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, dimetilformamida, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, amendoim, milho, gérmen, azeite, rícino e sésamo), glicerol, álcool tetra-hidrofurfurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácidos gordos de sorbitano, e suas misturas. Para além de diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes tais como agentes molhantes, agentes emulsionantes e de suspensão, agentes edulcorantes, aromatizantes e perfumantes.
Preparações injectáveis, por exemplo, suspensões injectáveis estéreis, aquosas ou oleaginosas, podem ser formuladas de acordo com a especialidade conhecida utilizando agentes dispersantes ou molhantes adequados e agentes de suspensão. A preparação injectável estéril pode também ser uma solução, suspensão ou emulsão injectável estéril, num diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados incluem-se água, solução de Ringer, solução de cloreto de sódio U.S.P. e isotónica. Adicionalmente, óleos essenciais estéreis são convencionalmente utilizados como solvente ou meio de suspensão. Para este propósito pode ser utilizado qualquer óleo essencial suave incluindo mono- ou diglicéridos sintéticos. Adicionalmente, na preparação de injectáveis, utilizam-se ácidos gordos tais como ácido oleico. Numa concretização particularmente preferida, as partículas são suspensas num fluido transportador compreendendo 1% (p/v) de carboximetilcelulose sódica e 0,1 % (v/v) de Tween 80.
As formulações injectáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias, ou por incorporação de agentes de esterilização na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou noutro meio injectável estéril antes da utilização.
Composições para administração rectal ou vaginal são preferivelmente supositórios que podem ser preparados por mistura das partículas com excipientes ou transportadores não irritantes adequados tais como manteiga de cacau, polietilenoglicol ou uma cera para supositórios que são sólidos à temperatura ambiente mas líquidos à temperatura corporal e por conseguinte derretem no recto ou na cavidade 53 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ vaginal e libertam as microparticulas.
Formas de dosagem sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pilulas, pós e grânulos. Nestas formas de dosagem sólidas, as partículas são misturadas com pelo menos um excipiente ou transportador inerte, farmaceuticamente aceitável, tal como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio e/ou a) cargas ou extensores tais como amidos, lactose, sacarose, glucose, manitol e ácido silícico, b) ligantes tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinil-pirrolidinona, sacarose e goma-arábica, c) humectantes tais como glicerol, d) agentes desintegrantes tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicatos e carbonato de sódio, e) agentes retardantes de solução tais como parafina, f) aceleradores de absorção tais como compostos de amónio quaternário, g) agentes molhantes tais como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol, h) absorventes tais como caulino e argila de bentonite, e i) lubrificantes tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicóis sólidos, laurilsulfato de sódio e suas misturas. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, a forma de dosagem pode também compreender agentes tamponantes.
Composições sólidas de um tipo similar podem também ser utilizadas como materiais de enchimento em cápsulas cheias de gelatina mole e dura utilizando excipientes tais como lactose ou açúcar de leite, bem como polietilenoglicóis de peso molecular elevado e outros.
As formas de dosagem sólidas de comprimidos, drageias, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos, bem conhecidos na especialidade da formulação farmacêutica. Podem conter opcionalmente agentes opacificantes e podem também ter uma composição que libertam os ingredientes activos apenas, ou preferivelmente, numa certa parte do tracto intestinal, opcionalmente, de um modo retardado. Exemplos de composições de incrustação que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras.
Composições sólidas de um tipo similar podem também ser utilizadas como materiais de enchimento em cápsulas cheias de 54 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ gelatina mole e dura, utilizando excipientes tais como lactose ou açúcar de leite bem como polietilenoglicóis de peso molecular elevado e outros.
Formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de um composto deste invento incluem pomadas, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, pulverizações, inalantes ou pensos. As partículas são misturadas, sob condições estéreis, com um transportador farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes ou tampões necessários conforme possa ser requerido. Formulações oftálmicas, gotas para o ouvido e gotas para o olho são também contempladas como estando dentro do âmbito deste invento.
As pomadas, pastas, cremes e géis podem conter, para além das partículas deste invento, excipientes tais como gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, goma adragante, derivados de celulose, polietilenoglicóis, silicones, bentonites, ácido silicico, talco e óxido de zinco, ou suas misturas.
Os pós e pulverizações podem conter, para além das partículas deste invento, excipientes tais como lactose, talco, ácido silicico, hidróxido de alumínio, silicatos de cálcio e pó de poliamida, ou misturas destas substâncias. As pulverizações podem conter adicionalmente propulsores habituais tais como clorofluorocarbonetos.
Os pensos transdérmicos têm a vantagem acrescida de proporcionar a entrega controlada de um composto ao corpo. Estas formas de dosagem podem ser preparadas por dissolução ou entrega das micropartículas ou nanopartículas num meio apropriado. Podem-se também utilizar intensificadores de absorção para aumentar o fluxo do composto através da pele. A velocidade pode ser controlada, quer proporcionando uma membrana de controlo da velocidade, quer por dispersão das partículas numa matriz de polímero ou gel.
Estes e outros aspectos do presente invento serão adicionalmente apreciados tendo em consideração os Exemplos seguintes, que pretendem ilustrar certas concretizações particulares do invento mas que não pretendem limitar o seu âmbito, conforme definido pelas reivindicações. 55 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Exemplos
Exemplo 1 - Poli (β-aminoésteres) degradáveis: Síntese, caracterização e automontagem com ADN de plasmídeo
Secção experimental
Considerações gerais. Todas as manipulações envolvendo células vivas ou materiais estéreis foram realizadas num fluxo laminar utilizando uma técnica padrão. Os espectros de RMN 3Η (300,100 MHz) RMN 13C (75,467 MHz) foram registados num espectrómetro Varian Mercury. Todos os valores de desvio químico são dados em ppm e estão referenciados em relação ao sinal residual de protão ou carbono do solvente. A cromatografia de permeação em gel (GPC) de fase orgânica foi realizada utilizando uma bomba isocrática Hewlett Packard Série 1100, um injector Rheodyne Modelo 7125 com uma espiral de injecção de 100 pL, e duas colunas D mistas PL-Gel em série (5 pm, 300 x 7, 5 mm, Polymer Laboratories, Amherst, MA). Utilizou-se THF/piperidina 0,1 M como o eluente com um caudal de 1,0 mL/minuto. Os dados foram recolhidos utilizando um refractómetro interferométrico Optilab DSP (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) e processados utilizando o pacote de software TriSEC GPC (Viscotek Corporation, Houston, TX). Os pesos moleculares e polidispersividades dos polímeros são reportados em relação a padrões monodispersos de poliestireno. A GPC de fase aquosa foi realizada pela American Polymer Standards (Mentor, OH) utilizando colunas Ultrahidrogel L e 120A em série (Waters Corporation, Milford, MA). Utilizou-se água (1% de ácido acético, NaCl 0,3 M) como o eluente com um caudal de 1,0 mL/minuto. Os dados foram recolhidos utilizando um refractómetro diferencial Knauer e processados utilizando um pacote de software IBM/PC GPC-PRO 3.13 (Viscotek Corporation, Houston, TX). Os pesos moleculares e polidispersividades dos polímeros são reportados em relação a padrões de poli(2-vinilpiridina). Para os ensaios de citotoxicidade, a absorvância foi medida utilizando um leitor de microplacas Dynatech Laboratories MR5000 a 560 nm.
Materiais. Ν,Ν'-dimetiletilenodiamina, piperazina e 4,4'-trimetilenodipiperidina foram compradas na Aldrich Chemical Company (Milwaukee, wi). O diacrilato de 1,4-butanodiol foi comprado na Alfa Aesar Organics (Ward Hill, 56 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ ΜΑ). Ο brometo de (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5- difeniltetrazólio (MTT) foi comprado na Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). ADN de plasmideo (pCMV-Luc) foi produzido em E. coli (DH5a, uma oferta da Zycos, Inc., Cambridge, MA), isolado com um kit Qiagen, e purificado por precipitação por etanol. As células NIH 3T3 foram compradas na American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas a 37°C, 5% de CO2 em Meio de Eagle modificado por Dulbecco, 90%; soro fetal de bovino, 10%; penicilina, 100 unidades/mL; estreptomicina, 100 pg/mL. Todos os outros materiais e solventes foram utilizados tal como foram recebidos sem qualquer purificação adicional.
Procedimento geral de polimerização. Numa experiência tipica, pesaram-se diacrilato de 1,4-butanodiol (0,750 g, 0,714 mL, 3,78 mmol) e diamina (3,78 mmol) para dois frascos em separado e dissolveram-se em THF (5 mL). A solução contendo a diamina foi adicionada à solução de diacrilato através de pipeta. Adicionou-se uma barra de agitação revestida a Teflon, selou-se o frasco com uma tampa de enroscar revestida a Teflon, e aqueceu-se a mistura reaccional a 50°C. Após 48 horas, arrefeceu-se a mistura reaccional até à temperatura ambiente e adicionou-se lentamente gota a gota a dietiléter ou hexanos agitando vigorosamente. O polímero foi recolhido e seco sob vácuo antes da análise. Síntese do polímero comparativo 1. O polímero 1 foi preparado de acordo com o procedimento geral acima delineado. RMN XH δ (CDC13, 300 MHz) 4,11 (t largo, 4H), 2,75 (t largo, J = 7,05 Hz, 4H), 2,53 (s largo, 4H), 2,50 (t largo, (obsc), J = 7,20 Hz, 4H), 2,28 (s largo, 6H), 1,71, (m largo, 4H) . RMN 13C δ (CDC13, 75, 47 MHz) 172, 55, 64, 14, 55, 31, 53,39, 42,47, 32,54, 25,53. Síntese do polímero comparativo 2. O polímero 2 foi preparado de acordo com o procedimento geral acima delineado. RMN XH δ (CDC13, 300 MHz) 4,11 (t largo, 4H), 2,74 (t largo, J = 7,35, 4H), 2,56 (m largo, 12H), 1,71, (t largo, 4H), RMN 13C δ (CDC13, 75, 47 MHz) 172, 24, 64, 19, 53,55, 52, 75, 32,27, 25,52. Síntese do polímero comparativo 3. O polímero 3 foi preparado de acordo com o procedimento geral acima delineado. 57 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
RMN XH δ (CDCls, 300 MHz) 4,11 (t largo, 4H), 3,00 (m largo 4H), 2,79 (m largo, 4H), 2,65 (m largo, 4H), 2,11 (m largo 4H), 1,70 (m largo, 8H) , 1.25, (m largo, 12H) . RMN 13C (CDC13, 75, 47 ΜΗζ) 172,37, 64,13, 53, 89 (largo), 36,74, 35,58, 32,11 (largo), 25,45, 24,05.
Estudos de degradação de polímero. Os sais de cloridrato dos polímeros 1-3 foram dissolvidos em tampão acetato (1 M, pH = 5,1) ou tampão HEPES (1 M, pH = 7,4) numa concentração de 5 mg/mL (a utilização de concentrações milimolares de tampão resultou em redução substancial de pH durante a degradação devido à produção de produtos de degradação ácidos). Incubaram-se as amostras a 37°C sobre um rotor mecânico, e retiraram-se alíquotas (1 mL) a intervalos de tempo apropriados. As alíquotas foram congeladas imediatamente em azoto líquido e liofilizadas. O polímero foi extraído dos sais de tampão secos utilizando THF/piperidina 0,1 Μ (1 mL), e as amostras foram analisadas directamente por GPC.
Formação de complexos de ADN/pollmero e ensaios de retardação em gel de agarose. Os complexos de ADN/polímero foram formados por adição de 50 pL de uma solução de ADN de plasmídeo (pCMV-Luc, 2 pg/50 pL em água) a uma solução agitada suavemente em vórtice do sal de cloridrato dos polímeros 1-3 (50 pL em MES 25 mM, pH = 6,0, concentrações ajustadas para produzir as razões em peso desejadas de ADN/polímero). As amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos, após o que se ensaiaram 20 pL num gel de agarose a 1% (HEPES, 20 mM, pH = 7,2, 65 V, 30 minutos). As amostras foram carregadas no gel com um tampão de carga consistindo de 10% de Ficoll 400 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) em HEPES (25 mM, pH = 7,2). Não foi incluído azul de bromofenol como indicador visual no tampão de carga, uma vez que este pigmento carregado parece interferir com a complexação de polímero e ADN. As bandas de ADN foram visualizadas sob iluminação UV por coloração com brometo de etídio.
Dispersão de luz laser quasi-elástica (QELS "Quasi-elastic laser light scattering") e medição de potenciais ζ. As experiências de QELS e as medições de potencial ζ foram realizadas com um detector de dispersão de luz dinâmica ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, 58 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ laser de 15 mW, feixe incidente = 676 nm) . Os complexos de ADN/polímero foram formados como descrito acima para os ensaios de retardação em gel de agarose. As amostras foram diluídas com 900 pL de HEPES (20 mM, pH = 7,0), e adicionadas a uma amostra agitada suavemente em vórtice de complexo de ADN/polimero (volume total = 1 mL, pH = 7,0). Os tamanhos médios de partícula e os potenciais ζ foram determinados a 25°C. As funções de correlação foram recolhidas para um ângulo de dispersão de 90°, e os tamanhos de partícula foram calculados utilizando a opção MAS do software de cálculo de tamanho de partícula Bic (ver. 2.30) utilizando a viscosidade e o índice de refracção de água pura a 25°C. Os tamanhos de partícula são expressos como diâmetros efectivos assumindo uma distribuição lognormal. As mobilidades electroforéticas foram medidas a 25°C utilizando o software de análise do potencial zeta BIC PALS e os potenciais zeta foram calculados utilizando o modelo Smoluchowsky para suspensões aquosas. Foram feitas três medições para cada amostra, e os resultados são apresentados como potenciais zeta e diâmetros médios.
Ensaios de citotoxicidade. Cultivaram-se células NIH 3T3 imortalizadas em placas de 96 poços com uma densidade de sementeira inicial de 10 000 células/poço em 200 pL de meio de crescimento (90% de Meio de Eagle modificado por Dulbecco, 10% de soro fetal de bovino, penicilina 100 unidades/mL, estreptomicina 100 pg/mL). As células foram cultivadas durante 24 horas, após o que o meio de crescimento foi removido e substituído por 180 pL de meio isento de soro. Adicionaram-se quantidades apropriadas de polímero em alíquotas de 20 pL. As amostras foram incubadas a 37°C durante 5 horas, e a actividade metabólica de cada poço foi determinada utilizando um ensaio de MTT/azul de tiazolilo: a cada poço, adicionaram-se 25 pL de uma solução 5 mg/mL de solução de reserva de MTT em tampão PBS esterilizado. As amostras foram incubadas a 37°C durante 2 horas, e adicionaram-se a cada poço 100 pL de tampão de extracção (20% p/v de SDS em DMF/água (1:1), pH = 4,7). As amostras foram incubadas a 37°C durante 24 horas. A absorvância óptica foi medida a 560 nm com um leitor de microplacas e expressa em percentagem em relação a células de controlo. 59 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Resultados e discussão Síntese e caracterização de polímero A síntese de poli(amidoaminas) lineares contendo aminas terciárias nos seus esqueletos foi noticiada por Ferruti et al. em 1970 via a adição de aminas bifuncionais a bis-acrilamidas (Anderson, Nature 392(Supl.):25-30, 1996; Friedman, Nature Med. 2:144-147, 1996; Crystal, Science 270:404-410, 1995; Mulligan, Science 260:926-932, 1993). As poli(amidoaminas) lineares foram inicialmente investigadas como biomateriais de complexação de heparina e ferro (Ferruti et al., Advances in Polymer Science 58:55-92, 1984; Ferruti et al., Biomateriais 15:1235-1241, 1994; Ferruti et al., Macromol. Chem. Phys. 200:1644-1654, 1999; Ferruti et al., Biomateriais 15:1235-1241, 1994). As poli(amidoaminas) dendríticas (PAMAM) têm tido uma utilização crescente em aplicações de transferência de genes devido à sua capacidade para complexar ADN (Kukowska-Latallo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:4897-4902, 1996; Tang et al., Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993), e uma publicação recente descreve a aplicação de uma família de poli(amidoaminas) lineares a estudos de transfecção celular e citotoxicidade (Hill et al., Bíochim. Biophys. Acta 1427:161-174, 1999). Em contraste, poli(ésteraminas) análogas, formadas a partir da adição do tipo Michael de aminas bifuncionais a ésteres de diacrilato, têm recebido menor atenção (Danusso et al., Polymer 11:88— 113, 1970; Ferruti et al., Polymer 26:1336, 1985; Ferruti et al., Advances in Polymer Science 58:55-92, 1984; Ferruti et al., Biomateriais 15:1235-1241, 1994; Ferruti et al., Macromol. Chem. Phys. 200:1644-1654, .1999; Ferruti et al., Biomateriais 15:1235-1241, 1994; Kargina et al., Vysokomol. Soedin. Seriya A 28:1139-1144, 1986; Rao et al., J. Bioactive and Compatible Polymers 14:54-63, 1999). A abordagem do poli(aminoéster) é um ponto de partida particularmente atractivo para o desenvolvimento de novos vectores de transfecção poliméricos por várias razões: 1) os polímeros contêm as aminas requeridas e elementos de ligação facilmente degradáveis, 2) podem ser sintetizados potencialmente múltiplos análogos, directamente, a partir de materiais de partida disponíveis comercialmente, e 3) se os polímeros resultantes forem úteis como agentes de condensação 60 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ de ADN, futuras gerações de polímero podem ser facilmente produzidas por engenharia para possuírem valores de pKa de amina abrangendo a gama de pH fisiologicamente relevantes. Este último ponto foi particularmente intrigante, porque a capacidade de tamponamento das poliaminas tinha sido recentemente implicada como um factor que influenciava o escape de ADN a partir dos endossomas celulares após endocitose (Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:7297-7301, 1995; Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4:372-379, 1993; Behr, Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix et al., em Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, págs. 146-151; Kabanov et al., em Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinicai Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998) . Embora a complexação de ADN com um polímero catiónico seja requerida para compactar e proteger o ADN durante eventos precoces no processo de transfecção, ADN e polímero têm por fim de se descomplexar no núcleo para permitir uma transcrição eficiente (Luo et al., Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000). Considerando este requisito, policatiões degradáveis poderiam desempenhar um papel importante em eventos de "desempacotamento do vector" no núcleo (Luo et al., Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Schaffer et al., Biotechnol. Bioeng. 67:598-606, 2000; Kabanov, Pharm. Sei. Technol. Today 2:365-372, 1999). Finalmente, colocámos a hipótese de polímeros desta estrutura geral, e os derivados de β-aminoácido nos quais estes presumivelmente se degradam, serem significativamente menos tóxicos do que poli(lisina) e PEI. Como acima delineado, policatiões degradáveis (Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000) e polímeros lineares contendo aminas relativamente impedidas, localizadas próximo do esqueleto de polímero (Gonzalez et al., Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999), são menos tóxicos do que poli(lisina) e PEI.
Foi investigada a síntese de polímeros 1-3 via a adição das bis(aminas secundárias), Ν,Ν'-dimetiletilenodiamina, piperazina e 4,4'-trimetilenodipiperidina, a diacrilato de 1,4-butanodiol (Danusso et al., Polymer 11:88-113, 1970; Kargina et al., Vysokomol. Soedin. Seriya A 28:1139-1144, 1986) . 61 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ A polimerização destes monómeros decorreu em THF e CH2C12 a 50°C para produzir os polímeros correspondentes com rendimentos de até 86% (Tabela 1). Os polímeros foram purificados através de precipitação repetida em dietiléter ou hexano. 0 polímero 1 foi isolado como um líquido viscoso claro; os polímeros 2 e 3 foram obtidos como sólidos brancos após secagem sob vácuo elevado. Alternativamente, os polímeros 1-3 poderiam ser isolados como sais sólidos de cloridrato após adição de dietiléter/HCl a uma solução de polímero em THF ou CH2C12. Todos os três polímeros eram solúveis em solventes orgânicos tais como THF, CH2C12, CHC13 e MeOH, e eram também solúveis em água a pH reduzido. 0 polímero 1 e os sais de cloridrato dos polímeros 1-3 eram plenamente solúveis em água.
Poli-1
Poli-2
Poli-3
Os pesos moleculares dos polímeros 1-3 e dos seus sais de cloridrato correspondentes foram determinados por cromatografia de permeação em gel (GPC) em ambas as fases orgânica e aquosa. Os pesos moleculares (Mn) dos polímeros variaram de até 5 800 para o polímero 1 a até 32 000 para o polímero 3, em relação a padrões de poliestireno. As distribuições de peso molecular para estes polímeros eram monomodais com índices de polidispersividade (PDI) na gama de 1,55 a 2,55. Dados de peso molecular representativos são apresentados na Tabela 1. Embora a síntese de poli(amidoaminas) lineares seja geralmente realizada utilizando álcoois ou água como solventes (Danusso et al., Polymer 11:88-113, 1970; Ferruti et al., Polymer 26:1336, 1985; Ferruti et al., Advances in Polymer Science 58:55-92, 62 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ 1984; Ferruti et al., Biomaterials 15:1235-1241, 1994; Ferruti et al., Macromol. Chem. Phys. 200:1644-1654, 1999; Ferruti et al., Biomaterials 15:1235-1241, 1994), foram utilizados THF e CH2CI2 anidros na síntese de ρο1ϊ(β-aminoésteres), para minimizar reacções de hidrólise durante a síntese. Os rendimentos e pesos moleculares de polímeros sintetizados utilizando CH2CI2 como solvente foram em geral mais elevados do que os dos polímeros sintetizados em THF (Tabela 1) (O polímero 1 não pôde ser sintetizado em CH2C12. A cor da solução reaccional evoluiu de incolor até uma cor intensa cor-de-rosa quase imediatamente após a introdução de uma solução de Ν,Ν'-dimetiletilenodiamina em CH2C12 numa solução de diacrilato de 1,4-butanodiol em CH2C12 (ver Secção experimental acima). A cor evoluiu para cor-de-laranja-claro durante o curso da reacção, e isolou-se um polímero cor-de-laran ja após precipitação em hexano. O polímero isolado era insolúvel em CH2C12, THF e água a pH reduzido e não foi caracterizado estruturalmente. Este problema não foi encontrado para a reacção análoga em THF.).
Tabela 1. Dados de pesos moleculares representativos para os Polímeros 1-3.
Polímero Solvente M„c PDI Rendimento,% Ia THF — — d Ia CH2C12 — — 82% 2a THF 10 000 1,77 64% 2a CH2C12 17 500 2,15 75% 3a THF 24 400 1,55 58% 3a CH2C12 30 800 2,02 70% lb THF 5 800 2,83 55% 2b CH2C12 16 500 2,37 80%e 3b ch2ci2 31 200 2,55 86%e “ Condições: [diamina] = [diacrilato de 1,4-butanodiol = o, 38 M, 50 0C, 48 h. b Condições: [diamina] = [diacrilato de 1,4-butanodiol = 1, 08 M, 50 0 C, 48 h. c A análise de GPC foi realizada em THF/piperidina 0, 1 M e OS pesos moleculares são reportados versus padrões de poliestireno. d Nenhum polímero foi isolado sob estas condições. eA solução reaccional tornou-se muito viscosa e eventualmente solidificou sob estas condições.
As estruturas dos polímeros 1-3 foram confirmadas por espectroscopia de RMN XH e 13C. Estes dados indicam que os polímeros foram formados através da adição conjugada das aminas secundárias às porções acrilato do diacrilato de 1,4-butanodiol e não através da formação de elementos de ligação amida sob outras condições de reacção. Adicionalmente, as aminas terciárias acabadas de formar nos esqueletos de polímero não participam em reacções de adição subsequentes 63 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ com ο monómero de diacrilato, o que conduziria a ramificação ou reticulação do polímero. Este resultado favorável parece ser único para polímeros deste tipo produzidos a partir de monómeros de bis(amina secundária). A síntese de polímeros análogos utilizando aminas primárias bifuncionais como monómeros (tais como 1,4-diaminobutano) pode conduzir a ramificação do polímero e à formação de redes de polímero reticulado insolúvel se as condições não forem explicitamente controladas.
Em face da justaposição de aminas e ésteres dentro dos esqueletos dos polímeros 1-3, estávamos inicialmente preocupados que a hidrólise pudesse ocorrer de modo demasiado rápido para os polímeros serem de utilização prática. Por exemplo, o poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) e o poli[ácido a-(4-aminobutil)-L-glicólico] degradam-se muito rapidamente próximo de pH neutro, possuindo semividas de aproximadamente 2 h (Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999) e 30 minutos (Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000), respectivamente (Estes tempos de degradação rápidos não impediram a aplicação destes polímeros à entrega de genes (ver referências, Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000) . No entanto, velocidades de degradação extremamente rápidas introduzem geralmente preocupações adicionais em torno da manipulação, armazenamento e aplicação de polímeros degradáveis.). A análise dos polímeros 1 e 2 por GPC aquosa, utilizando 1% de ácido acético/água como eluente, porém, revelou que a degradação era suficientemente lenta em meios ácidos. Por exemplo, os sinais de GPC de polímeros 1 e 2 analisados sob estas condições durante um período de 4 - 5 horas não revelaram quaisquer alterações em pesos moleculares ou polidispersividades (O polímero 3 não pôde ser analisado por GPC aquoso.). Estávamos também preocupados que pudesse ocorrer hidrólise significativa do esqueleto durante o isolamento dos sais de cloridrato de polímeros 1-3. Para prevenir a hidrólise durante a protonação e isolamento destes polímeros, utilizaram-se solventes anidros e as reacções foram realizadas sob uma atmosfera de árgon. A análise dos polímeros antes e após protonação não revelou qualquer hidrólise observável. Por exemplo, o sinal de GPC de uma amostra de polímero 3 após precipitação a partir de CH2C12 com dietiléter 1,0 M/HC1 (Mn = 15 300; PDI = 1,90) era virtualmente idêntico ao peso molecular do polímero antes da 64 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ protonação (Μη = 15 700; PDI = 1,92) e não eram evidentes quaisquer espécies de peso molecular mais baixo (Dados comparativos de GPC foram recolhidos utilizando THF/piperidina 0,1 M como eluente (ver Secção Experimental acima). Os sais de HC1 dos polímeros eram insolúveis em THF, mas eram solúveis em THF/piperidina 0,1 M, concomitante com a produção de um precipitado branco fino que foi filtrado antes da injecção.). Amostras sólidas de polímeros 1-3 puderam ser armazenadas durante vários meses sem diminuições detectáveis em peso molecular.
Os polímeros 1-3 foram desenhados especificamente para se degradarem via hidrólise das ligações éster nos esqueletos de polímero. No entanto, uma preocupação adicional em torno da estabilidade global e da biocompatibilidade destes polímeros é o potencial para ocorrência de degradação indesejada através de uma retro-reacção de Michael sob condições fisiológicas. Porque estes polímeros foram sintetizados via a reacção do tipo Michael de uma amina secundária com um éster de acrilato, é possível que os polímeros pudessem sofrer retro-reacção de Michael para regenerar grupos acrilato livres, particularmente sob condições ácidas. Os ésteres de acrilato são potenciais agentes alquilantes de ADN e são deste modo carcinogénios suspeitos (para exemplos recentes, ver: Schweikl et al., Mutat. Res. 438:P71-P78, 1999; Yang et al., Carcinogenesis 19:P1117-P1125, 1998) .
Porque é de esperar que estes polímeros encontrem o ambiente de pH reduzido dentro das vesículas de endossoma da célula (pH = 5,0 - 5,5) durante a transfecção, abordámos o potencial para ocorrência da degradação destes polímeros através de um retro-percurso de Michael.
Sob condições extremamente ácidas (pH < 3) ou básicas (pH > 12), os polímeros 1-3 degradaram-se rapidamente e exclusivamente em 1,4-butanodiol e nos subprodutos previstos de bis(β-aminoácido) 4a-6a, como determinado por espectroscopia de RMN 1H. Não foi encontrada qualquer evidência espectroscópica para a retro-adição de Michael sob estas condições. Note-se que os produtos de degradação de bis(β-aminoácido) 4a-6a sofreriam menos provavelmente uma retro-reacção de Michael, uma vez que os ácidos acrílicos são geralmente parceiros de adição de Michael menos activados 65 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ (Perlmutter, Ρ., em Conjugate Addition Reactions in Organic Synthesis, Pergamon Press, New York, 1992) . Não foi observada qualquer degradação adicional dos compostos 4a-6a sob estas condições.
γβ o 0 Me 4a,R = H 5a. R = H 4b. R = Me 5b, R = Me RQ-^-^V W
OR 6a,R=H 6b, R s Me
As cinéticas da degradação de polímero foram investigadas sob a gama de condições que estes polímeros provavelmente encontrarão durante a transfecção. A degradação foi monitorizada a 37°C a valores de pH tamponado de 5,1 e
7.4, de modo a aproximar o pH dos ambientes dentro de vesículas de endossomas e do citoplasma, respectivamente. Os sais de cloridrato dos polímeros 1-3 foram adicionados ao tampão apropriado, incubaram-se a 37°C, e removeram-se alíquotas a tempos apropriados. Congelaram-se as alíquotas imediatamente, liofilizaram-se e extraiu-se o polímero para THF/piperidina 0,1 M para análise por GPC. A Figura 1 mostra os perfis de degradação dos polímeros 1-3 em função do tempo. Os polímeros degradaram-se mais lentamente a pH 5,1 do que a pH 7,4. Os polímeros 1-3 apresentaram perfis de degradação similares a pH 5,1, cada polímero possuindo uma semivida de aproximadamente 7-8 horas. Em contraste, os polímeros 1 e 3 foram completamente degradados em menos do que 5 horas a pH
7.4. Estes resultados são consistentes com os perfis de degradação-pH doutros poliésteres contendo amina, tais como poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina), nos quais se coloca a hipótese de funcionalidades de amina pendentes actuarem como catalisadores nucleófilos intramoleculares e contribuírem para uma degradação mais rápida a pH mais elevado (Lim et al.f J. Am. Chem. Soc. 121.:5633-5639, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000). Embora a possibilidade da assistência intramolecular não possa ser descartada, é menos provável para os polímeros 1-3 porque as aminas terciárias nestes polímeros deverão ser menos nucleófilas. A 66 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ degradação do polímero 2 ocorreu mais lentamente a pH 7,4 do que a pH 5,1 (Figura 1). Este comportamento anómalo é muito provavelmente devido à solubilidade incompleta do polímero 2 a pH 7,4 e à natureza heterogénea resultante do meio de degradação (Os polímeros 2 e 3 não são completamente solúveis em água a pH 7,4. Embora o polímero 3 se dissolvesse de modo relativamente rápido durante a experiência de degradação, foram visíveis partículas de polímero 2 durante vários dias.) .
Ensaios de citotoxicidade
Poli(lisina) e PEI têm sido amplamente estudadas como agentes de condensação de ADN e vectores de transfecção (Luo et ai., Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Behr, Acc. Chem. Res. 26:274-278, 1993; Zauner et ai., Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov et ai., Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; Boussif et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:7297-7301, 1995; Behr, Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix et ai., em Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Feigner et ai., Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, págs. 146-151; Kabanov et ai., em Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinicai Trial, John wiley and Sons, New York, 1998) e são os padrões com os quais novos vectores poliméricos são frequentemente comparados (Putnam et ai., Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et ai., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et ai., J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Gonzalez et ai., Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999). Infelizmente, como acima descrito, estes polímeros estão também associados a níveis significativos de citotoxicidade e níveis elevados de expressão génica são usualmente conseguidos apenas com um custo substancial para a viabilidade celular. Para determinar o perfil de toxicidade dos polímeros 1-3, foi conduzido um ensaio de redução de MTT/pigmento azul tiazolilo utilizando a linha de células NIH 3T3 e os sais de cloridrato dos polímeros 1-3 como indicadores iniciais. A linha de células 3T3 é habitualmente utilizada como uma população de rastreio de primeiro nível para novos vectores de transfecção, e o ensaio de MTT é geralmente utilizado como um indicador inicial de citotoxicidade, uma vez que este determina as influências de substâncias adicionadas sobre o crescimento e metabolismo celulares (Hansen et al., Immunol. Methods 119:203-210, 1989). 67 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
As células foram incubadas com polímero 1 (Mn = 5 800), polímero 2 (Mn = 11 300) e polímero 3 (Mn = 22 500) como descrito na Secção experimental. Como se mostra na Figura 2, as células incubadas com estes polímeros permaneceram 100% viáveis em relação a controlos, para concentrações de polímero até 100 pg/mL. Estes resultados são comparáveis de um modo impressionante com os dados obtidos para populações de células tratadas com PEI (Mn * 25 000), incluídas como um controlo positivo para o nosso ensaio, bem como para facilitar a comparação com este agente de transfecção bem conhecido. Menos do que 30% de células tratadas com PEI permaneceram viáveis para uma concentração de polímero de 25 pg/mL, e a viabilidade celular era tão baixa quanto 10% para concentrações mais elevadas de PEI, sob condições em tudo o mais idênticas. Um ensaio de MTT análogo foi realizado utilizando bis(β-aminoácidos) 4a-6a sintetizados independentemente para rastrear a citotoxicidade dos produtos de degradação hidrolítica destes polímeros (Os bis(p-aminoácidos 4a-6a deverão ou ser biologicamente inertes ou possuir toxicidades moderadas ou agudas que são inferiores às dos vectores de transfecção policatiónicos tradicionais. Em qualquer dos casos, a degradação destes materiais deverá facilitar a rápida depuração metabólica.). Os compostos 4a-6a e 1,4-butanodiol não perturbaram o crescimento ou o metabolismo celulares neste ensaio de rastreio inicial (dados não mostrados). Uma comparação mais directa baseada na estrutura/função entre os polímeros 1-3 e PEI não pode ser feita devido a diferenças em estrutura e peso molecular de polímero, que contribuem ambos para a toxicidade do policatião. Apesar disso, os excelentes perfis de citotoxicidade dos polímeros 1-3 sozinhos sugeriram que estes eram candidatos interessantes para estudo adicional como agentes de condensação de ADN.
Automontagem de polímeros 1-3 com ADN de plasmídeo É bem conhecida a tendência de poliaminas catiónicas para interactuar electrostaticamente com o esqueleto polianiónico de ADN em solução aquosa. Desde que os polímeros estejam suficientemente protonados a pH fisiológico, e que as aminas estejam estereoquimicamente acessíveis, estas interacções podem resultar num processo de automontagem no qual os polímeros carregados positivamente e negativamente 68 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ formam conjugados bem definidos (Kabanov et ai., em Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinicai Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998). A maioria das poliaminas investigadas como agentes de complexação de ADN e vectores de transfecção têm aminas incorporadas nas extremidades terminais de cadeias laterais curtas de conformação flexível (e.g., poli(lisina) e polímeros de metacrilato/metacrilamida) (Zauner et al., Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov et al., Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; van de Wetering et al., Bioconjugate Chem. 10:589-597, 1999), ou aminas acessíveis sobre as superfícies de poliaminas esféricas ou globulares (e.g., PEI e dendrímeros de PAMAM) (Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:7297-7301, 1995; Kukowska-Latallo et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:4897-4902, 1996; Tang et al., Bioconjugate Chem. 7:703-714, 1996; Haensler et al., Bioconjugate Chem. 4:372-379,1993).
Porque os polímeros 1-3 contêm aminas terciárias, e essas aminas terciárias estão localizadas num ambiente estereoquimicamente congestionado (flanqueadas dos dois lados pelos esqueletos de polímero), estávamos inicialmente preocupados que as aminas protonadas pudessem não ser suficientemente capazes de interactuar intimamente com ADN. A capacidade dos polímeros 1-3 para complexar ADN de plasmídeo foi demonstrada através de um ensaio de desvio em gel de agarose. A electroforese em gel de agarose separa macromoléculas com base na carga e no tamanho. Deste modo, a imobilização de ADN sobre um gel de agarose, na presença de concentrações crescentes de um policatião, tem sido amplamente utilizada como um ensaio para determinar o ponto a partir do qual é conseguida a neutralização completa da carga de ADN (Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Gonzalez et al., Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999).
Como mencionado acima, os sais de cloridrato dos polímeros 1-3 são solúveis em água. Contudo, os polímeros 2 e 3 não são completamente solúveis a pH 7,2 em toda a gama de concentrações desejadas de polímero. Deste modo, prepararam-se complexos de ADN/polímero em tampão MES (25 mM, pH = 6,0). 69 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Os complexos de ADN/polímero foram preparados por adição de uma solução aquosa de ADN a soluções agitadas em vórtice de polímero em MES, para as concentrações de ADN/polímero desejadas (ver Secção experimental). Os complexos resultantes de ADN/polímero permaneceram solúveis após diluição no tampão de ensaio de electroforese (HEPES 20 mM, pH = 7,2) e os dados foram obtidos a pH fisiológico. Como exemplo representativo, a Figura 3 ilustra a migração de ADN de plasmídeo (pCMV-Luc) sobre um gel de agarose na presença de concentrações crescentes de polímero 1.
Como se mostra na Figura 3, a retardação da migração de ADN inicia-se para razões de adn/1 tão baixas quanto 1:0,5 (p/p) e a migração é completamente retardada para razões de ADN/polímero acima de 1:1,0 (p/p) (São aqui reportadas razões de ADN/polímero em peso em vez de razões de ADN/polímero em carga. Ainda que ambas as convenções sejam utilizadas na literatura, verificamos que as razões em peso são mais práticas e universais, uma vez que a carga global sobre a poliamina está sujeita a variações ambientais em pH e temperatura. Embora as razões de ADN/polímero em carga sejam descritivas para polímeros tais como poli(lisina), são menos significantes para polímeros tais como PEI e 1-3 que incorporaram aminas menos básicas.). Os polímeros 2 e 3 inibem completamente a migração de ADN de plasmídeo para razões (p/p) de ADN/polímero acima de 1:10 e 1:1,5, respectivamente (dados não mostrados). Estes resultados variam acentuadamente em relação às experiências de retardação em gel conduzidas utilizando "monómeros" modelo. Uma vez que os verdadeiros monómeros e os produtos de degradação dos polímeros 1-3 não representam adequadamente as unidades de repetição dos polímeros, utilizámos bis(ésteres de metilo) 4b - 6b para examinar a extensão para a qual a polivalência e a ligação cooperativa de policatiões 1-3 são necessárias para conseguir a imobilização de ADN. Os "monómeros" 4b - 6b não inibiram a migração de ADN para razões (p/p) de ADN/"monómero" até 1:30 (dados não mostrados).
As razões para a complexação menos eficiente utilizando polímero 2 nos ensaios anteriores de electroforese em gel resultam muito provavelmente de diferenças nos valores de pKa das aminas nestes polímeros. A medição directa dos valores de pKa dos polímeros 1-3 é complicada pela sua degradabilidade. 70 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
No entanto, prevemos uma gama de valores de pKa das aminas nos polímeros 1 e 2 estendendo-se desde aproximadamente 4,5 e 8,0 para o polímero 1, até 3,0 e 7,0 para o polímero 2, com base em comparações com poli(β-aminoamidas) estruturalmente relacionadas (Têm sido noticiados os valores de pKa de poli(β-aminoamidas) estruturalmente relacionadas contendo unidades piperazina e dimetiletilenodiamina nos seus esqueletos. Barbucci et al., Polymer 21:81-85, 1980; Barbucci et al., Polymer 19:1329-1334, 1978; Barbucci et al., Macromolecules 14:1203-1209, 1981).
Como resultado, o polimero 2 deveria ser protonado numa menor extensão do que o polímero 1, a pH fisiológico ou próximo da neutralidade, e seria deste modo um agente de condensação de ADN menos eficaz. A gama de valores de pKa para o polimero 3 deveria ser mais elevada do que a gama para os polímeros 1 e 2 devido à distância aumentada entre os átomos de azoto. Por conseguinte, o polimero 3 forma complexos com ADN para concentrações substancialmente reduzidas em relação ao polimero 2.
Os ensaios de retardação em gel de agarose são úteis para determinar a extensão da interacção dos policatiões com ADN. Para serem agentes de transfecção úteis, porém, os policatiões têm também de ser capazes de automontarem ADN de plasmídeo em complexos de polímero/ADN, suficientemente pequenos para entrarem numa célula através de endocitose. Para a maioria dos tipos de células, este requisito de tamanho é da ordem de 200 nm ou menos (Zauner et al., Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998), ainda que partículas maiores possam também ser acomodadas (Demeneix et al., em Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, pp. 146-151; Kabanov et al., em Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinicai Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998) . A capacidade dos polímeros 1-3 para compactar ADN de plasmídeo em estruturas de tamanho nanométrico foi determinada por dispersão de luz laser quasi-elástica (QELS), e as cargas superficiais relativas dos complexos resultantes foram quantificadas através de medições do potencial ζ. As partículas de ADN/polímero utilizadas para calibração de partículas e medições do potencial ζ foram formadas como 71 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ descrito acima para os ensaios de electroforese em gel de agarose e diluídas em tampão HEPES 20 mM (pH = 7,0) para análise, como descrito na Secção experimental. O polímero 1 formou complexos com diâmetros na gama de 90-150 nm para razões de ADN/polímero acima de 1:2 (p/p), e o polímero 2 condensou ADN em partículas da ordem de 60-125 nm para razões de ADN/polímero acima de 1:10. Estes resultados são consistentes com os dados obtidos a partir das experiências anteriores de electroforese em gel de agarose. Contudo, nestas experiências, as partículas agregaram-se durante um período de horas para produzir complexos maiores com diâmetros na gama de 1-2 mícron. A tendência destas partículas para se agregarem pode ser racionalizada pelos baixos potenciais ζ das partículas de ADN/polímero observados sob estas condições. Por exemplo, complexos formados a partir de polímero 1 para razões de ADN/polímero acima de 1:10 tinham potenciais ζ médios de +4,51 (±0,50) mV. Os potenciais ζ de complexos formados a partir de polímero 2 para razões de ADN/polimero acima de 1:20 eram inferiores, atingindo um valor limite de +1,04 (±0,57) mV. Estas diferenças correlacionam-se com os valores de pKa estimados para estes polímeros, uma vez que será de esperar que as superfícies de partículas formadas a partir de polímero 1 estejam ligeiramente mais protonadas do que partículas formadas a partir de polímero 2 a pH = 7,0. O polímero 3 formou complexos com diâmetros na gama de 50-150 nm para razões de ADN/polímero acima de 1:2. Como exemplo representativo, a Figura 4 mostra os diâmetros efectivos médios de partículas formadas com polímero 3 em função da concentração de polímero. Os diâmetros das partículas variaram, de experiência para experiência, dentro da gama acima sob condições em tudo o mais idênticas, possivelmente devido a diferenças subtis durante a agitação ou adição de soluções de ADN durante a formação de complexo (A ordem de adição das soluções de polímero e ADN teve impacto considerável na natureza dos complexos de ADN/polímero resultantes. De modo a formar partículas pequenas, por exemplo, foi necessário adicionar a solução de ADN a uma solução de polímero agitada em vórtice. Para os casos em que as soluções de polímero foram adicionadas a ADN, apenas se observaram agregados grandes da dimensão dos mícron. Assim, é possível que diferenças subtis na agitação 72 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ ou na velocidade de adição possam ser responsáveis pela variação no tamanho de partícula). Os potenciais ζ para complexos formados a partir de polímero 3 eram da ordem de +10 a +15 mV para razões de ADN/polímero acima de 1:1, e os complexos não se agregaram extensivamente durante um período de 18 horas (pH = 7, 25°C). Os potenciais ζ positivos destes complexos podem estar significativamente para além do contexto da estabilidade da partícula, uma vez que um saldo de cargas positivas sobre as superfícies da partícula podem desempenhar um papel no despoletar da endocitose (Kabanov et al., Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Behr, Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix et al., em Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, págs. 146-151; Kabanov et al., em Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinicai Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998) .
As partículas formadas a partir de polímero 3 eram também relativamente estáveis a 37°C. Por exemplo, incubou-se uma amostra de ADN/3 (ADN/3 = 1:5, diâmetro médio = 83 nm) a 37°C durante 4 horas. Após 4 horas, observou-se uma distribuição bimodal consistindo de uma fracção com um diâmetro médio de 78 nm (>98% em número, 70% em volume) e uma fracção de agregados maiores com diâmetros médios de aproximadamente 2,6 mícron. Estes resultados sugerem que a degradação de complexos formados a partir de polímero 3 ocorreu mais lentamente do que a degradação de polímero em solução, ou que a degradação parcial não afectou significativamente a estabilidade das partículas. A estabilidade aparentemente aumentada de complexos de ADN/polímero formados a partir de policatiões degradáveis, em relação à degradação dos polímeros em solução, tinha também sido observada para complexos de ADN/polímero formados a partir de poli(éster de 4-hidroxi-L-prolina) (Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999).
Os dados de tamanho de partícula e de potencial ζ nas Figuras 4 e 5 são consistentes com modelos de condensação de ADN observados com outros policatiões (Kabanov et al., Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995; Putnam et al., Macromolecules 32:3658-3662, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 121:5633-5639, 1999; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 73 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ 122:6524-6525, 2000; Gonzalez et al., Bioconjugate Chem. 10:1068-1074, 1999) . O ADN é compactado em pequenas partículas carregadas negativamente para concentrações de polímero muito baixas e os tamanhos de partícula aumentam com o aumento da concentração de polímero (Não puderam ser obtidos dados exactos de dispersão de luz para ADN sozinho ou para espécies associadas a ADN/polímero para razões de ADN/polímero inferiores a 1:0,5, uma vez que o ADN não condensado, flexível, não dispersa a luz tão extensivamente quanto o ADN compactado (Kabanov et al., em Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinicai Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998).).
Os complexos atingem um diâmetro máximo à medida que a neutralidade de carga é atingida e a agregação ocorre. Os tamanhos de partícula diminuem subitamente para concentrações de ADN/polímero acima da neutralidade de carga até razões para as quais polímero adicional não contribui para uma redução no diâmetro de partícula. Este modelo é confirmado por medições do potencial ζ efectuadas em complexos formados a partir destes polímeros. Como se mostra na Figura 5, os potenciais ζ de partículas de polímero/ADN, formadas a partir de polímero 3, eram negativos para baixas concentrações de polímero e a neutralidade de carga foi conseguida para razões de ADN/polímero próximas de 1:0,75, resultando em extensa agregação. Os potenciais ζ das partículas aproximaram-se de um valor limite na gama de +10 a +15 mV para razões de ADN/polímero acima de 1:2.
Os diâmetros médios dos complexos acima descritos caem dentro dos requisitos gerais de tamanho para a endocitose celular. Iniciámos as experiências de transfecção utilizando a linha de células NIH 3T3 e o gene repórter de luciferase (pCMV-Luc). Até agora, os polímeros 1 e 2 não mostraram qualquer actividade de transfecção em ensaios de rastreio iniciais. Por contraste, o polímero 3 demonstrou eficiências de transfecção que excedem as da PEI sob certas condições. As experiências de transfecção foram realizadas de acordo com o protocolo geral seguintes: As células foram cultivadas em placas de 6 poços com uma densidade de sementeira inicial de 100 000 células/poço em 2 mL de meio de crescimento. As células foram cultivadas durante 24 horas após o que o meio 74 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ de crescimento foi removido e substituído por 2 mL de meio isento de soro. Os complexos de ADN/polímero foram formados como descrito na Secção experimental [2 pg ADN, ADN/3 = 1:2 (p/p), 100 pL em MES (pH = 6,0)] e adicionados a cada poço. Os complexos de ADN/PEI foram formados para uma razão em peso de 1:0,75, uma razão que no nosso laboratório se verificou ser em geral óptima para transfecções de PEI. As transfecções foram realizadas em meio isento de soro durante 4 horas, após o que o meio foi substituído por meio de crescimento durante 20 horas adicionais. As eficiências de transfecção relativas foram determinadas utilizando kits de ensaio de luciferase (Promega) e de proteína celular (Pierce). Os resultados são expressos como unidades de luz relativas (RLU) por mg de proteína celular total: para complexos de polímero 3, 1,07 (±0,43) X 106 RLU/mg; para complexos de PEI, 8,07 (±0,16) x 105 RLU/mg). Não foi detectada qualquer expressão de luciferase para experiências de controlo utilizando ADN nu ou realizadas na ausência de ADN. Estes dados de transfecção são os dados de experiências de rastreio iniciais. Estes dados sugerem que polímeros desta estrutura geral são promissores como vectores sintéticos para entrega de genes e são candidatos interessantes para mais estudos. A eficácia relativa do polímero 3 em relação a PEI é interessante, uma vez que as nossas experiências de rastreio iniciais foram realizadas na ausência de cloroquina e o polímero 3 não incorpora presentemente meios óptimos para facilitar o escape dos endossomas. Será de notar, porém, que os valores de pKa das aminas nestes polímeros podem ser "afinados" para se situarem mais directamente dentro da gama de pH fisiologicamente relevantes, utilizando esta abordagem de síntese modular. Deste modo, será possível construir por engenharia o carácter de "esponja de protões" (Behr, Chimia 51:34-36, 1997; Demeneix et al., em Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, pp. 146-151; Kabanov et al., em Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinicai Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998) destes polímeros, e assim melhorar as suas eficiências de transfecção, directamente através da incorporação de, ou da co-polimerização com, diferentes monómeros e diamina. 75 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Sumário É noticiada uma estratégia geral para a preparação de novos vectores poliméricos degradáveis de transfecção de ADN. Os poli(β-aminoésteres) 1-3 foram sintetizados via a adição conjugada de N,N'-dimetiletilenodiamina, piperazina e 4,4'-trimetilenodipiperidina a diacrilato de 1,4-butanodiol. As aminas nos monómeros de bis(aminas secundárias) participam activamente nos processos de formação de ligações durante a polimerização, obviando a necessidade de processos de protecção/desprotecção de aminas que caracterizam a sintese doutros poli(aminoésteres) . Por conseguinte, esta abordagem permite a geração de uma variedade de poliésteres estruturalmente diversos, contendo aminas terciárias nos seus esqueletos, num único passo a partir de materiais de partida disponíveis comercialmente. Os polímeros 1-3 degradaram-se hidroliticamente em meios ácidos e alcalinos para produzir 1,4-butanodiol e β-aminoácidos 4a-6a e as cinéticas de degradação foram investigadas a pH 5,1 e 7,4. Os polímeros degradaram-se mais rapidamente a pH 7,4 do que a pH 5,1, consistente com os perfis de degradação/pH reportados para outros poli(aminoésteres). Um ensaio de rastreio inicial concebido para determinar os efeitos dos polímeros 1-3 sobre o crescimento e metabolismo celulares sugeriu que estes polímeros e os seus produtos de degradação hidrolítica eram não citotóxicos em relação a PEI, um polímero catiónico não degradável convencionalmente utilizado como vector de transfecção.
Os polímeros 1-3 interactuaram electrostaticamente com ADN de plasmídeo a pH fisiológico, iniciando processos de automontagem que resultaram em complexos de ADN/polímero à escala nanométrica. Utilizaram-se electroforese em gel de agarose, dispersão de luz dinâmica quasi-elástica (QELS) e medições do potencial zeta para determinar a extensão das interacções entre os polielectrólitos de cargas opostas. Verificou-se que todos os três polímeros condensaram ADN em partículas solúveis de ADN/polímero na ordem de 50-200 nm. As partículas formadas a partir dos polímeros 1 e 2 agregaram-se extensivamente, enquanto que partículas formadas a partir do polímero 3 exibiram potenciais ζ positivos (e.g., +10 a +15 mV) e não se agregaram durante até 18 horas. As dimensões do tamanho nanométrico e as citotoxicidades reduzidas destes complexos de ADN/polímero sugerem que os polímeros 1-3 podem 76 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ ser úteis como vectores de transfecção de genes poliméricos degradáveis. Uma compreensão exaustiva das relações estrutura/actividade, existentes para esta classe de polímero, tornará mais rápida a concepção de alternativas baseadas em polímero mais seguras aos vectores virais de transfecção para terapia génica.
Exemplo 2 - Libertação rápida despoletada pelo pH a partir de microsferas biodegradáveis de poli(β-amino-éster) dentro da gama de pH intracelular
Secção experimental
Fabricação de microsferas. 0 procedimento optimizado para a fabricação de microsferas foi conduzido do seguinte modo geral: Suspendeu-se uma solução aquosa de dextrano conjugado com rodamina (200 pL de uma solução 10 pg/pL, Mn * 70 kD) numa solução de poli-1 em CH2CI2 (200 mg de poli-1 em 4 mL CH2C12, Mn ~ 10 kD), e tratou-se a mistura com ultra-sons durante 10 segundos para formar uma emulsão primária. A emulsão turva cor-de-rosa foi adicionada directamente a uma solução rapidamente homogeneizada (5 000 rpm) de poli(álcool vinílico) [50 mL, 1% de PVA (p/p)] para formar a emulsão secundária. A emulsão secundária foi homogeneizada durante 30 segundos antes de ser adicionada a uma segunda solução aquosa de PVA [100 mL, 0,5% de PVA (p/p)]. A análise directa da suspensão de microsferas utilizando um analisador de micropartículas Coulter revelou um tamanho médio de partícula de aproximadamente 5 mícron. Agitou-se a emulsão secundária durante 2,5 horas à temperatura ambiente, transferiu-se para uma sala fria (4°C) e agitou-se durante mais 30 minutos. As microsferas foram isolados a 4°C via centrifugação, ressuspenderam-se em água fria e centrifugaram-se de novo para remover o PVA em excesso. Ressuspenderam-se as esferas em água (15 mL) e liofilizaram-se para dar um pó fofo, cor-de-rosa. A caracterização das microsferas liofilizadas foi realizada por microscopias óptica, de fluorescência e electrónica de varrimento como descrito. O potencial zeta foi determinado utilizando um analisador Brookhaven Instruments ZetaPALS.
Discussão
As micropartículas formadas a partir de biopolímeros 77 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ degradáveis são atractivas para utilização como dispositivos de entrega, e uma variedade de microsferas à base de polímero tem sido utilizada para a libertação retardada de compostos terapêuticos (Anderson, Nature 392(Supl.):25-30, 1996; Friedman, Nature Med. 2:144-147, 1996; Crystal, Science 270:404-410, 1995; Mulligan, Science 260:926-932, 1993; Luo et al., Nat. Biotechnol. 18:33-37,2000; Behr, Acc. Chem. Res. 26:274-278, 1993). No entanto, para terapêuticas à base de moléculas pequenas, proteínas e ADN, que requerem administração intracelular e trânsito para o citoplasma, existe uma necessidade crescente de novos materiais que facilitem a libertação despoletada em resposta a estímulos ambientais tais como o pH (Zauner et al., Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998).
Após endocitose, o pH dentro dos compartimentos de endossomas celulares é diminuído, e o material estranho é degradado por fusão com vesículas de lisossomas (Kabanov et al., Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995).
Novos materiais que libertam cargas moleculares por alterações no pH dentro da gama intracelular e que facilitam o escape dos ambientes intracelulares hostis podem ter um impacto fundamental e um vasto alcance na administração de fármacos lábeis hidroliticamente e/ou enzimaticamente (Zauner et al., Adv. Drug Del. Rev. 30:97-113, 1998; Kabanov et al., Bioconjugate Chem. 6:7-20, 1995). É aqui noticiada a fabricação de microsferas de polímero responsivas ao pH que libertam conteúdos encapsulados quantitativamente e essencialmente de um modo instantâneo por alterações no pH dentro da gama intracelular. A síntese do poli(β-aminoéster) 1 foi acima descrita no Exemplo 1 (Miller, Angew. Chem. Int. Ed 37:1768-1785, 1998; Hope et al., Molecular Membrane Technology 15:1-14, 1998; Deshmukh et al., New j. Chem. 21:113-124, 1997). O poli-1 é hidroliticamente degradável, era não citotóxico em ensaios de rastreio iniciais, e está actualmente sob investigação como um vector sintético para entrega de ADN em aplicações de terapia génica. A solubilidade do polímero em meios aquosos é directamente influenciada pelo pH da solução. Especificamente, o polímero 78 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ não protonado, sólido, é insolúvel em meios aquosos na gama de pH 7,0 a 7,4, e a transição entre solubilidade e insolubilidade ocorre a um pH à volta de 6,5. Com base nas diferenças entre o pH extracelular e o dos endossomas (7,4 e 5,0 - 6,5, respectivamente), colocámos a hipótese de microsferas formadas a partir de poli-1 poderem ser úteis para a encapsulação e libertação despoletada de compostos dentro da gama de pH intracelular. A encapsulação de compostos terapêuticos dentro de microsferas de polímero é frequentemente conseguida utilizando um processo de emulsão dupla (0'Donnell et al., Adv. Drug Delivery Rev. 28:25-42, 1997). O processo de emulsão dupla está bem estabelecido para fabricação de microsferas a partir de polímeros hidrófobos tais como poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), um polímero biodegradável convencionalmente utilizado no desenvolvimento de dispositivos de entrega de fármacos (Anderson et al., Adv. Drug Delivery Rev. 28:5-24, 1997; Okada Adv. Drug Delivery Rev. 28:43-70, 1997). Experiências preliminares demonstraram a exequibilidade do processo de emulsão dupla para a encapsulação de compostos solúveis em água utilizando poli-1. Foi escolhido dextrano conjugado com rodamina, como modelo para estudos subsequentes de encapsulação e libertação, por várias razões: 1) a rodamina é fluorescente, permitindo a determinação dos perfis de carga e de libertação por espectroscopia de fluorescência, 2) as microsferas carregadas podem ser visualizadas directamente por microscopia de fluorescência, e 3) a intensidade de fluorescência da rodamina é relativamente não afectada pelo pH dentro da gama fisiológica (Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6.a ed., Molecular Probes, Inc., 1996, pág. 29).
As microsferas encapsulando dextrano marcado foram fabricadas a partir de poli-1 e comparadas com controlos formados a partir de PLGA. As distribuições de tamanhos de microsferas formadas a partir de poli-1 correlacionavam-se bem com as distribuições de microsferas de PLGA dentro da gama de 5-30 pm. Os tamanhos médios de partícula podiam ser controladas por variações nos parâmetros experimentais, tais como velocidades de homogeneização e proporções de solvente aquoso/orgânico (0'Donnell et al., Adv. Drug Delivery Rev. 28:25-42, 1997). 79 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Em contraste com as microsferas de PLGA, porém, as esferas formadas a partir de poli-1 agregaram-se extensivamente durante os passos de centrifugação e lavagem (ver Secção experimental acima). As microsferas ressuspendidas a pH 7,4 consistiam principalmente de grandes agregados, e as imagens de microscopia electrónica de varrimento (SEM) revelaram aglomerações de esferas que pareciam estar fisicamente unidas ou "soldadas" (dados não mostrados) .
Constatou-se que a agregação podia ser eliminada se centrifugação e lavagem fossem conduzidas a temperaturas reduzidas (4°C), presumivelmente devido ao endurecimento das esferas de polímero a esta temperatura mais baixa. As imagens de SEM de microsferas de poli-1 carregadas com dextrano, preparadas na gama de 8-10 pm, revelaram fracturação significativa e a formação de grandes buracos sobre as suas superfícies. Microsferas situadas na gama de 4-6 pm, porém, estavam essencialmente isentas de fissuras, buracos e outros defeitos (Figura 6). As microsferas formuladas para experiências de libertação subsequentes foram fabricadas na gama mais pequena (< 6 pm) . As eficiências de encapsulação para microsferas de poli-1 carregadas, determinadas por dissolução das esferas a pH 5,1 e medição da intensidade de fluorescência, eram tão elevadas quanto 53%.
As suspensões de microsferas secas de poli-1 a pH = 7,4 consistiam principalmente de microsferas individuais, isoladas como determinado por microscopia óptica e de fluorescência (Figura 8a). 0 potencial zeta (ζ) de suspensões de micropartículas de microsferas de poli-1 a pH 7 era +3,75 (± 0,62) mV, sugerindo que as superfícies das microsferas transportam uma carga global positiva a pH fisiológico. Isto poderá ser relevante para o direccionamento destas microsferas para incorporação celular, porque um saldo de carga positiva sobre a superfície das partículas pode desempenhar um papel no despoletar da endocitose (Zauner et al., Adv. Drug Delivery Rev. 30:97-113, 1998).
As microsferas de poli-1 suspensas a pH 7,4 permaneceram estáveis, em relação a agregação e degradação, durante várias semanas (por inspecção visual), mas as microsferas dissolveram-se instantaneamente quando o pH do meio de suspensão foi diminuído para entre 5,1 e 6,5. 80 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
ρΗ < 6.5 A libertação de dextrano marcado a partir de microsferas de poli-1 foi determinada quantitativamente por microscopia de fluorescência (Figura 7). O perfil de libertação a pH 7,4 era caracterizado por uma pequena descarga inicial em fluorescência (7-8%), que atingia um valor limite de cerca de 15% após 48 horas. Esta experiência demonstrou que a degradação de poli-1 era relativamente lenta sob estas condições e que mais de 90% do material encapsulado podiam ser mantidos na matriz de polímero durante períodos de tempo adequadamente longos a pH fisiológico.
Para examinar a aplicação de microsferas de poli-1 à libertação despoletada de fármacos encapsulados na gama de pH dos endossomas conduzimos uma experiência similar na qual o pH do meio de suspensão foi alterado de 7,4 para 5,1 durante o decorrer da experiência. Como se mostra na Figura 7, as microsferas dissolveram-se rapidamente quando o tampão de suspensão foi trocado por tampão acetato (0,1 M, pH = 5,1), resultando na libertação essencialmente instantânea e quantitativa do dextrano marcado remanescente nas matrizes de polímero. Em contraste nítido, a libertação a partir de microsferas de PLGA carregadas com dextrano não aumentou durante até 24 horas após o pH do meio de suspensão ser diminuído (Figura 7) . A Figura 8 mostra imagens de microscopia de fluorescência de: (a) uma amostra de microsferas carregadas com dextrano a pH 7,4; e (b) uma amostra à qual se adicionou uma gota de tampão acetato na extremidade direita superior da lamela de microscópio. A rápida libertação de dextrano conjugado com rodamina foi visualizada como uma risca prolongando-se a partir das microsferas em dissolução, no sentido da difusão do ácido adicionado, e um aumento global na fluorescência de fundo (tempo decorrido » 5 segundos).
Quando se direccionam compostos terapêuticos para entrega intracelular via endocitose ou fagocitose, é importante considerar não apenas os meios pelos quais o fármaco pode ser 81 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ libertado a partir do seu transportador, mas também meios pelos quais o fármaco se pode escapar dos compartimentos de endossomas, antes de ser encaminhado para vesículas de lisossomas (Luo et al., Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Zauner et al., Adv. Drug Delivery Rev. 30:97-113, 1998).
Uma estratégia para facilitar o escape dos endossomas é a incorporação de bases fracas, ou "esponjas de protões", que se pensa que tamponam o ambiente ácido dentro de um endossoma e rompem as membranas do endossoma aumentando a pressão osmótica interna dentro da vesícula (Demeneix et al., em Artificial Self-Assembling Systems for Gene Delivery (Felgner et al., Eds.), American Chemical Society, Washington, D.C., 1996, pág. 146-151).
As microsferas de poli-1 são capazes de libertarem material encapsulado na gama de pH dos endossomas via um mecanismo (dissolução) que envolve a protonação de aminas na matriz de polímero. Assim, para além da rápida libertação de fármaco, as microsferas de poli-1 podem também proporcionar meios de escape dos endossomas por ruptura da membrana, melhorando a eficácia e prolongando os tempos de vida de fármacos instáveis hidroliticamente contidos na matriz de polímero.
As microsferas fabricadas a partir de poli-1 poderão representar uma importante mais-valia para o arsenal de materiais responsivos ao pH aplicados para entrega de fármaco intracelular, tais como formulações de polímero/lipossoma responsivas ao pH (Gerasimov et al., Adv. Drug Delivery Rev. 38:317-338, 1999; Linhart et al., Langmuir 16:122-127, 2000; Linhardt et al., Macromolecules 32:4457-4459, 1999).
Em contraste com muitas formulações lipossómicas, as microsferas de polímero são fisicamente robustas e podem ser armazenadas secas durante períodos prolongados, sem deformação, decomposição ou degradação (Okada, Adv. Drug Delivery Rev. 28:43-70, 1997; aqui incorporada por referência) - um aspecto importante para a formulação e empacotamento de novos sistemas terapêuticos de entrega. As microsferas investigadas neste estudo corrente caem dentro da gama de tamanhos de partículas habitualmente utilizada para direccionar a entrega a macrófagos (Hanes et al., Adv. Drug Delivery Rev. 28:97-119, 1997). 82 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Os rápidos perfis de libertação-pH para as microsferas de poli-1 acima descritas podem deste modo ser úteis na concepção de novas vacinas baseadas em ADN que utilizam actualmente PLGA como material de encapsulação (Singh et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:811-816, 2000; Ando et al., J. Pharm. Sei. 88:126-130, 1999; Hedley et ai., Nat. Med. 4:365-368, 1998) .
Exemplo 3 - Identificação acelerada de novos vectores sintéticos: sintese em paralelo e rastreio de uma biblioteca de polímeros degradáveis
Introdução A entrega segura e eficiente de ADN terapêutico a células representa um obstáculo fundamental ao sucesso clinico da terapia génica (Luo et al., Nat. Biotechnol. 18:33-37, 2000; Anderson, Nature 392(Supl.):25-30, 1996; cada uma das quais é aqui incorporada por referência). Os desafios enfrentados pelos vectores de entrega sintéticos são particularmente claros, na medida em que tanto polímeros catiónicos como lipossomas são menos eficazes na mediação da transferência de genes do que os vectores virais. A incorporação de novos critérios de concepção tem conduzido a avanços recentes no sentido de sistemas de entrega funcionais (Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 123:2460-2461, 2001; Lim et al., J. Am. Chem. Soc. 122:6524-6525, 2000; Hwang et al., Bioconjugate Chem. 12:280-290, 2001; Putnam et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:1200-1205, 2001; Benns et al., Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux et al., Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999).
No entanto, o paradigma para o desenvolvimento de vectores poliméricos de entrega de genes permanece a incorporação destes elementos de concepção em materiais como parte de um processo linear iterativo - uma abordagem eficaz, ainda que lenta, à identificação de novos vectores. Apresentamos aqui, uma abordagem em paralelo adequada para a síntese de grandes bibliotecas de oligómeros e de polímeros degradáveis catiónicos e para a identificação de novas famílias de vectores sintéticos através de ensaios rápidos de rastreio baseados em células (para um relato sobre a síntese em paralelo e rastreio de polímeros degradáveis para engenharia de tecidos, ver: Brocchini et al., J. Am. Chem. 83 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Soc. 119:4553-4554, 1997) . Secção experimental
Considerações gerais. Todas as manipulações envolvendo células vivas ou materiais estéreis foram realizadas numa câmara de fluxo laminar utilizando uma técnica de esterilização padrão. A cromatografia de permeação em gel (GPC) foi realizada utilizando uma bomba isocrática Hewlett Packard Série 1100, um injector Rheodyne Modelo 7125 com uma espiral de injecção de 100 pL, e duas colunas D mistas PL-Gel em série (5 pm, 300 X 7, 5 mm, Polymer Laboratories, Amherst, MA). Utilizou-se THF/piperidina 0,1 M como o eluente, com um caudal de 1,0 mL/minuto. Os dados foram recolhidos utilizando um refractómetro interferométrico Optilab DSP (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) e processados utilizando o pacote de software TriSEC GPC (Viscotek Corporation, Houston, TX). Os pesos moleculares e polidispersividades dos polímeros são reportados em relação a padrões monodispersos de poliestireno.
Materiais. Os monómeros de amina primária e de amina secundária 1-20 foram comprados na Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Lancaster (Lancashire, UK), Alfa Aesar Organics (Ward Hill, MA) e Fluka (Milwaukee, WI) . Os monómeros de diacrilato A-G foram comprados na PolySciences, Inc. (Warrington, PA), Alfa Aesar e Scientific Polymer Products, Inc. (Ontario, NY). Todos os monómeros foram comprados na pureza mais elevada disponível (de 97% a 99+%) e foram utilizados conforme recebidos sem qualquer purificação adicional. O ADN de plasmídeo contendo o gene repórter de luciferase de pirilampo (pCMV-Luc) foi comprado na Elim Biopharmaceuticals, Inc. (San Francisco, CA) e utilizado sem qualquer purificação adicional. O brometo de 3 —[4,5— dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT) foi comprado na Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Os fibroblastos de rim de macaco (células COS-7) utilizados nos ensaios de transfecção foram comprados na American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivados a 37°C, 5% de C02, em Meio de Eagle modificado por Dulbecco, 90%; soro fetal de bovino, 10%; penicilina, 100 unidades/mL; estreptomicina, 100 pg/mL. Os kits de detecção de luciferase utilizados em ensaios de transfecção de elevado rendimento foram comprados na Tropix (Bedford, MA). Todos os outros materiais e 84 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ solventes foram utilizados conforme recebidos sem qualquer purificação adicional. Síntese da biblioteca de polímero. Todas as 140 reacções de polimerização foram conduzidas simultaneamente como um arranjo de frascos rotulados individualmente, de acordo com o protocolo geral seguinte. As excepções individuais são assinaladas onde apropriado. Os monómeros de amina 1-20 (2,52 mmol) foram carregados em frascos rotulados apropriadamente (como a seguir se mostra): os monómeros líquidos foram medidos e transferidos quantitativamente utilizando pipetas de microlitro; os monómeros sólidos foram pesados directamente para dentro de cada frasco. Adicionou-se CH2C12 anidro (1 mL) a cada frasco. Adicionou-se um equivalente de diacrilatos A-F líquidos (2,52 mmol) a cada frasco de reacção apropriado utilizando uma pipeta de microlitro, e o frasco foi muito bem tapado com uma tampa revestida a Teflon. Um equivalente do diacrilato G semi-sólido foi adicionado aos frascos apropriados como uma solução em CH2C12 (2,52 mmol, 1 mL de uma solução 2,52 M em CH2C12) e os frascos foram muito bem tapados. Adicionou-se uma alíquota adicional de CH2C12 (2 mL) aos frascos reaccionais contendo 19 e 20 para ajudar na solubilidade destes monómeros. Os frascos muito bem tapados foram dispostos em tabuleiros de tubos de ensaio de plástico e fixos a um agitador orbital numa estufa a 45°C. (ATENÇÃO: o aquecimento de frascos tapados representa um possível perigo de explosão. A temperatura da estufa foi monitorada periodicamente durante uma semana antes da experiência para assegurar uma estabilidade térmica fiável. Verificou-se que as temperaturas variavam entre +/- 1°C durante este período de tempo. Vários frascos de ensaio foram monitorizados antes de conduzir a experiência maior). Os frascos reaccionais foram agitados vigorosamente a 45°C durante 5 dias e deixados arrefecer até à temperatura ambiente. Os frascos foram colocados num exsicador grande, e colocados sob vácuo de aspirador durante 1 dia e sob vácuo elevado durante mais 5 dias para assegurar a remoção completa de solvente. As amostras obtidas foram analisadas por GPC (55% da biblioteca total, ver Tabela 2) e utilizadas directamente em todas as experiências de rastreio subsequentes. 85 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Tabela 2: Pesquisa por GPC de 55% da biblioteca de rastreio mostrando pesos moleculares (Mw) e polidispersividades (mostradas entre parêntesis) A B C D E F G 1 5900 (1,93) 4725 (1,89) 5220 (1,95) 1690 (1,74) 2 6920 (1,87) 6050 (1,78) 5640 (1,85) 3 6690 (1, 79) 6050 (1,78) 2060 (1,76) 4 7810 (2,49) 5720 (2,20) 9720 (2,49) 7960 (4,08) 7940 (3,25) 5 10800 (2, 75) 5000 (2,50) 15 300 (3,17) 17 200 (6,91) 15 300 (3,92) Insol. 9170 (2,50) 6 21000 (3, 70) 10 200 (3,4) 18 000 (6,06) 7 14300 (3,25) 11 880 (3,3) 20200 (3,44) 10300 (4,26) 15 500 (4,89) 22500 (3,92) 8 2310 (1,62) 11520 (3,60) 2230 (1,73) 9 1010 (1,33) 2505 (1,67) 1240 (1,16) Insol. 10 <1000 Insol. 11 6800 (1,91) Insol. 9440 (1, 79) 5550 (2,23) 6830 (1,93) 1990 (1,43) 6420 (1,75) 12 9310 (2,06) 9100 (2,53) 11900 (2,18) 5810 (1,77) 12300 (1,85) 13 2990 (1,64) 3180 (2,12) 3680 (1,64) 2550 (1,82) 3230 (1,82) 3580 (1,64) 14 1350 (1,35) 3180 (2,12) 2110 (1,69) 1400 (1,4) 1752 (1,46) 2025 (1,62) 15 1550 (1,51) 16 16380 (2,60) 17 8520 (2,13) 7290 (1,94) 18 <1000 19 12 400 (2,28) 18445 (2,17) 39700 (1,90) 17400 (1,93) 14800 (1,98) 13900 (1,86) 20 16900 (2,40) 46060 (3,29) 49600 (2,25) 30700 (2,72) 18 700 (2,72) 17100 (2,22)
Determinação da solubilidade em água. As solubilidades de todas as amostras foram determinadas simultaneamente numa concentração de 2 mg/mL do modo geral seguinte. Cada amostra de polímero (5 mg) foi pesada para um frasco de cintilação de 12 mL e adicionaram-se 2,5 mL de tampão acetato (25 mM, pH = 5,0) a cada amostra utilizado um pipetador. As amostras foram agitadas vigorosamente à temperatura ambiente durante 1 hora. Cada amostra foi observada visualmente para determinar a solubilidade. 86 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Ensaio de electroforese em gel de agarose. 0 ensaio de electroforese em gel de agarose, utilizado para determinar a capacidade de polímeros para formar complexos com ADN, foi realizado do seguinte modo. Utilizando as soluções preparadas no ensaio de solubilidade anterior (2 mg/mL em tampão acetato, 25 mM, pH = 5,0), soluções de reserva dos 70 polímeros solúveis em água foram dispostas numa placa de cultura de células de 96 poços. Os complexos de ADN/polímero foram formados para uma razão de 1:5 (p/p) transferindo 10 pL de cada solução de polímero da placa de reserva para uma nova placa utilizando um pipetador multicanal. Cada polímero foi diluído adicionalmente com 90 pL de tampão acetato (25 mM, pH = 5,0, total volume = 100 pL) e a placa foi agitada durante 30 segundos num agitador mecânico. Adicionou-se uma solução aquosa de ADN de plasmídeo (100 pL de uma solução 0,04 pg/pL) a cada poço na placa e misturaram-se as soluções vigorosamente utilizando um pipetador multicanal e um agitador mecânico. Os complexos de ADN/polímero foram formados para uma razão 1:20 (p/p) do mesmo modo, com as excepções seguintes: 40 pL de solução de reserva de polímero foram transferidos para uma nova placa e diluídos com 60 pL de tampão acetato (volume total = 100 pL) antes de adicionar a solução aquosa de ADN (100 pL) . Os complexos de ADN/polímero foram incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos, após o que amostras de cada solução (15 pL) foram carregadas num gel de agarose a 1% (HEPES, 20 mM, pH = 7,2, 500 ng/mL brometo de etídio) utilizando um pipetador multicanal. NOTA: As amostras foram carregadas no gel com um tampão de carga consistindo de 10% de Ficoll 400 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) em HEPES (25 mM, pH = 7,2). Não foi incluído azul de bromofenol como indicador visual no tampão de carga, uma vez que este pigmento carregado pareceu interferir com a complexação de polímero e ADN. As amostras foram carregadas de acordo com o padrão apresentado na Figura 9, tal que amostras correspondendo a razões de ADN/polímero de 1:5 e 1:20 fossem ensaiadas em posições adjacentes no gel. O gel foi operado a 90 V durante 30 minutos e as bandas de ADN foram visualizadas por coloração de brometo de etídio.
Protocolo geral para ensaios de transfecção de células. Os ensaios de transfecção foram realizados em triplicado do seguinte modo geral. Células COS-7 foram cultivadas em placas de 96 poços com uma densidade de sementeira inicial de 15 000 87 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ células/poço em 200 pL de meio de crescimento isento de vermelho de fenol (90% Meio de Eagle modificado por Dulbecco, 10% de soro fetal de bovino, penicilina 100 unidades/mL, estreptomicina 100 pg/mL). As células foram cultivadas durante 24 horas numa incubadora, após o que o meio de crescimento foi removido e substituído por 200 pL de meio Opti-MEM (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) suplementado com HEPES (concentração total = 25 mM) . Os complexos de polimero/ADN, preparados a partir dos 56 polímeros complexantes de ADN solúveis em água anteriormente identificados, foram preparados como descrito acima para uma razão de 1:20 (p/p), utilizando um plasmideo disponível
comercialmente contendo o gene repórter de luciferase de pirilampo (pCMV-Luc). Um volume apropriado de cada amostra foi adicionado às células utilizando um pipetador multicanal (e.g., 15 pL proporcionaram 300 ng de ADN/poço; 30 pL proporcionaram 600 ng de ADN/poço). Controlos utilizando poli(etilenoimina) (PEI) e polilisina, preparados para razões de ADN/polimero de 1:1, foram preparados de um modo similar e incluídos com ADN e em controlos sem ADN. Controlos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corp.) foram realizados para várias concentrações (0,1, 0,2, 0,4 e 0,6 pL) como descrito no manual técnico para este produto (http://lifetechnologies.com). As células foram incubadas durante 4 horas, após o que o meio de crescimento isento de soro foi removido e substituído por 100 pL de meio de crescimento isento de vermelho de fenol. As células foram incubadas durante um período de tempo adicional (tipicamente variável entre 36 e 60 horas) e a expressão de luciferase foi determinada utilizando um kit de ensaio disponível comercialmente (Tropix, Inc., Bedford, MA). A luminescência foi quantificada em placas brancas de 96 poços de polipropileno, de fundo opaco, utilizando um leitor de placas de bioluminescência de 96 poços. A luminescência foi expressa em unidades de luz relativas e não foi normalizada em relação à proteina celular total neste ensaio.
Resultados e discussão
Os poli(β-aminoésteres) são degradáveis hidroliticamente, condensam ADN de plasmideo a pH fisiológico, e são facilmente sintetizados via a adição conjugada de aminas primárias ou secundárias a diacrilatos (Eq. 1 e 2) (Lynn et al., J. Am. Chem. Soc. 122:10761-10768, 88 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ 2000) . Um rastreio inicial de polímeros modelo identificou estes materiais como potenciais transportadores de genes e demonstrou que variações estruturais podiam ter um impacto significativo nas eficácias de ligação de ADN e de transfecção (Lynn et al., J. Am. Chem. Soc. 122:10761-10768, 2000) .
Racionalmente, esta abordagem proporcionou um contexto atractivo para a elaboração de grandes bibliotecas de polímeros estruturalmente únicos por várias razões: 1) os monómeros de diamina e diacrilato são materiais de partida baratos, disponíveis comercialmente, 2) a polimerização pode ser realizada directamente num único passo de síntese, e 3) são geralmente desnecessários passos de purificação uma vez que não são gerados quaisquer subprodutos durante polimerização. nA>—4 <&>«) Λ (Λ^ * Γ* -f°^—<Efl3 A escassez de bis(aminas secundárias) disponíveis comercialmente limita o grau de diversidade estrutural que pode ser conseguido utilizando a abordagem de síntese anterior. No entanto, o conjunto de monómeros úteis, disponíveis comercialmente é significativamente alargado quando se consideram aminas primárias como blocos de construção potenciais para a biblioteca. Porque a adição conjugada de aminas a grupos acrilato tolera geralmente funcionalidades tais como álcoois, éteres e aminas terciárias (Ferruti et al., Adv. Polym. Sei. 58:55-92, 1984), pensámos que a incorporação de monómeros de amina primária funcionalizados na nossa estratégia de síntese serviria para alargar a diversidade estrutural. Os monómeros de diacrilato A-G e os monómeros de amina 1-20 foram seleccionados para a síntese de uma biblioteca de rastreio inicial. ΕΡ 1 639 029/ΡΤ 89 N^NH, 1 Τ' O-'"·» b >--“b · O*» Jijr—e vOvWj j to Çk»l| 17 4 u ----------- $ 11 P^i. 13 ••O*1 1* •'Λι'Ό'Όo ----- 14 «o—o Ο tamanho da biblioteca construída a partir monómeros (7 diacrilatos X 20 aminas = 140 polímeros estruturalmente únicos) foi escolhido para ser suficientemente grande para incorporar bastante diversidade, mas ainda assim pequeno o bastante para ser prático sem a necessidade de automação nos nossos estudos iniciais. Não era claro ao princípio se um polímero tal como o G16 (formado a partir dos monómeros hidrófobo e estereoquimicamente volumoso G e 16) seria ou não solúvel em água a pH fisiológico ou capaz de condensar ADN suficientemente. No entanto, incorporaram-se deliberadamente monómeros deste tipo para explorar plenamente o espaço de diversidade, e antecipando que esta biblioteca pudesse, em última análise, ser útil como uma população de rastreio para a identificação de materiais para outras aplicações que não a entrega de genes (Para uma publicação sobre a síntese e rastreio em paralelo de polímeros degradáveis para engenharia de tecidos, ver: Brocchini et al., J. Am. Chem. Soc. 119:4553-4554, 1997, Lynn et al., Angew. Chem. Int. Ed. 40:1707-1710, 2001),
As reacções de polimerização foram conduzidas simultaneamente como uma série de frascos marcados individualmente. As reacções foram realizadas em diclorometano a 45°C durante 5 dias, e os polímeros foram isolados por remoção do solvente para produzir 600-800 mg de cada material. As reacções realizadas a esta escala proporcionaram quantidades de cada material suficientes para análise de rotina por GPC e para todos os ensaios subsequentes de ligação de ADN, toxicidade e transfecção. Uma pesquisa de 55% da biblioteca por GPC indicou pesos moleculares na gama de 2 000 a 50 000 (em relação a padrões de poliestireno). Uma vez que pesos moleculares elevados não são requeridos para complexação de ADN e transfecção (como a seguir mostrado) (Kabanov et al., em Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinicai Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998), esta biblioteca 90 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ proporcionou uma colecção de polímeros e oligómeros adequada para ensaios de rastreio subsequentes.
Dos 140 membros da biblioteca de rastreio, 70 amostras eram suficientemente solúveis em água (2 mg/mL, tampão acetato 25 mM, pH = 5,0) para serem incluídas num ensaio electroforético de ligação de ADN (Figura 9). Para realizar este ensaio tão rapida e eficientemente quanto possível, as amostras foram misturadas com ADN de plasmídeo para razões de 1:5 e 1:20 (ADN/polímero, p/p) em placas de 96 poços e carregadas numa placa de gel de agarose, capaz de ensaiar até 500 amostras, utilizando um pipetador multicanal. Todas as 70 amostras de polímero solúveis em água foram ensaiadas simultaneamente para duas razões de ADN/polímero em menos de 30 minutos. Como se mostra na Figura 9, 56 das 70 amostras de polímero solúvel em água interactuaram suficientemente com ADN para retardar a migração através da matriz de gel (e.g., A4 ou A5), utilizando a razão de ADN/polímero de 1:20, como critério de exclusão. Catorze polímeros não foram mais considerados (e.g., A7 e A8), uma vez que estes polímeros não complexaram ADN suficientemente.
Os materiais complexantes de ADN identificados no ensaio acima foram adicionalmente investigados em ensaios de transfecção utilizando ADN de plasmídeo e a linha de células COS-7. Todos os ensaios foram realizados simultaneamente com o gene repórter de luciferase de pirilampo (pCMV-Luc) e os níveis de proteína expressa foram determinados utilizando um kit de ensaio disponível comercialmente e um leitor de placas de luminescência de 96 poços. A Figura 10 mostra os dados gerados a partir de um ensaio utilizando pCMV-Luc (600 ng/poço) para razões de ADN/poli de 1:20 (p/p). A maioria dos polímeros rastreados não mediou a transfecção acima de um nível típico dos controlos de ADN "nu" (sem polímero) sob estas condições. Contudo, vários poços exprimiram níveis mais elevados de proteína e os polímeros correspondentes foram identificados como "sucessos" neste ensaio. Os polímeros B14 (Mw = 3180) e G5 (Mw = 9170), por exemplo, produziram níveis de transfecção 4-8 vezes mais elevados do que experiências de controlo utilizando poli(etilenoimina) (PEI), um polímero convencionalmente utilizado como um vector de transfecção sintético (Boussif et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:7297-7301, 1995), e níveis de transfecção dentro ou excedendo a gama de proteína expressa utilizando 91 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Lipofectamine 2000 (disponível na Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) ), um sistema líder de vector de transfecção baseado em lípido disponível comercialmente. Os polímeros A14, C5, G7, G10 e G12 foram também identificados como "sucessos" positivos na experiência anterior, mas os níveis de expressão génica eram inferiores aos de B14 e G5.
Diferenças estruturais entre polímeros sintéticos excluem tipicamente um conjunto geral de condições de transfecção óptimas. Por exemplo, os polímeros C5, C14 e G14 eram tóxicos às concentrações mais elevadas utilizadas acima (Determinado pela ausência de células em poços contendo estes polímeros, conforme observado por inspecção visual. Estes polímeros eram menos tóxicos e mediaram a transfecção a concentração mais baixa.), mas mediaram a transfecção para concentrações inferiores de ADN e de polímero (dados não mostrados). O sistema de ensaio acima descrito pode ser facilmente modificado para avaliar polímeros em função de concentração de ADN, razão ADN/polímero, densidade de sementeira de células ou tempos de incubação. Será requerida investigação adicional para avaliar mais completamente o potencial desta biblioteca de rastreio, e experiências com este fim estão actualmente em curso.
Os ensaios anteriores foram realizadas na ausência de cloroquina, uma base fraca habitualmente adicionada para melhorar a transfecção in vitro (Putnam et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:1200-1205, 2001; Benns et al., Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux et al., Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999; Kabanov et al., em Self-Assembling Complexes for Gene Delivery: From Laboratory to Clinicai Trial, John Wiley and Sons, New York, 1998), e os resultados reflectem deste modo as capacidades intrínsecas daqueles materiais para mediar a transfecção. Os polímeros contendo o monómero 14 são estruturalmente similares a outros polímeros "esponja de protões" contendo histidina (Putnam et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:1200-1205, 2001; Benns et al., Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux et al., Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999), e poderiam melhorar a transfecção por tamponamento de compartimentos intracelulares ácidos e mediação do escape dos endossomas (Putnam et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98:1200-1205, 2001; Benns et al., Bioconjugate Chem. 11:637-645, 2000; Midoux et al., Bioconjugate Chem. 10:406-411, 1999; Boussif et al., Proc. 92 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Natl. Acad. Sei. USA 92:7297-7301, 1995). A eficácia dos polímeros contendo o monómero 5 é surpreendente neste contexto, uma vez que estes materiais não incorporam um meio óbvio para facilitar o escape dos endossomas. Embora a eficácia destes últimos polímeros não seja ainda compreendida, a sua identificação ajuda a validar a nossa abordagem em paralelo e salienta o valor de se incorporar diversidade estrutural, uma vez que estes polímeros podem não ter sido identificados numa base ad hoc. Polímeros incorporando diacrilatos hidrófilos D e E não produziram até agora "sucessos" sob quaisquer condições, fornecendo uma base possível para o desenvolvimento de bibliotecas mais focalizadas, úteis para a elucidação de relações estrutura/actividade.
Gerámos uma biblioteca de 140 polímeros e oligómeros degradáveis úteis para a identificação de novos materiais complexantes de ADN e vectores de entrega de genes. Vários destes materiais são capazes de condensar ADN em estruturas suficientemente pequenas para serem internalizadas por células e libertarem ADN numa forma activa em termos de transcrição. O tempo total actualmente requerido para desenho da biblioteca, síntese e ensaios de rastreio iniciais é aproximadamente de duas semanas. Contudo, a incorporação de robótica e de monómeros adicionais poderá acelerar significativamente o ritmo a que são identificados novos materiais complexantes de ADN e vectores de transfecção competentes.
Exemplo 4 - Síntese e rastreio semiautomatizados de uma grande biblioteca de polímeros catiónicos degradáveis para entrega de genes
Uma das principais barreiras ao sucesso da terapia génica em clínica é a falta de métodos seguros e eficientes para entregar ácidos nucleicos. Presentemente, a maioria dos ensaios clínicos utilizam vírus modificados como veículos de entrega que, embora eficazes na transferência de ADN para as células, sofrem de problemas de toxicidade potencialmente graves e de problemas de produção (Somia et al. Nat Rev Genet. 1:91 (2060)). Em contraste, os sistemas não virais oferecem inúmeras vantagens potenciais, incluindo facilidade de produção, estabilidade, imunogenicidade e toxicidade baixas, e reduzidas limitações no tamanho do vector (Ledley, 93 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Human Gene Therapy 6:1129 (1995)).
Apesar destas vantagens, porém, os sistemas de entrega não virais existentes são muito menos eficientes do que os vectores virais (Luo et al., Nature Biotechnology 18:33 (2000)).
Um grupo promissor de compostos de entrega não virais são os polímeros catiónicos, que espontaneamente se ligam e condensam o ADN. Tem sido caracterizada uma ampla variedade de polímeros catiónicos que se transfectam in vitro, tanto naturais, tais como sistemas de proteina (Fominaya et al. Journal of Biological Chemlstry 271:10560 (1996)) e de péptido (Schwartz et al. Curr. Opin. Mol. Ther. 2:162 (2000)), como polímeros sintéticos tais como poli(etilenoimina) (Boussif et al. Proceedlngs of the National Academy of Sciences of the United States of America 92:7297 (1995)) e dendrimeros (Kabanov et al. Self-assembling complexes gene delivery: from laboratory to clinicai trial, Wiley, Chichester; New York, 1998.). Avanços recentes na entrega polimérica de genes têm-se concentrado em parte em tornar os polímeros mais biodegradáveis para diminuir a toxicidade. Tipicamente, estes polímeros contêm grupos amino carregáveis, para permitir interacções iónicas com o esqueleto de fosfato carregado negativamente de ácidos nucleicos, e um elemento de ligação biodegradável tal como um elemento de ligação éster hidrolisável. Vários exemplos destes incluem poli(ácido alfa-(4-aminobutil)-L-glicólico) (Lim et al. Journal of the American Chemical Society 122:6524 (2000)), poli(aminoéster) reticulado (Lim et al. Bioconjugate Chemistry 13:952 (2002)) e poli(beta-aminoésteres) (Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 122:10761 (2000) ; Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 123:8155 (2001)). Os poli(beta-aminoésteres) são particularmente interessantes porque exibem baixa citotoxicidade e são facilmente sintetizados através da adição conjugada de uma amina primária ou de uma bis(amina secundária) a um diacrilato (Figura 11) (Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 122:10761 (2000); Lynn et al. Journal of the American Chemical Society 123:8155 (2001) ) . O desenvolvimento de novos polímeros biomédicos tem sido um processo iterativo. Tipicamente, os polímeros foram 94 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ concebidos um de cada vez e depois testados individualmente quanto às suas propriedades. Mais recentemente, a atenção tem estado centrada no desenvolvimento de abordagens combinatórias em paralelo, que facilitem a geração de bibliotecas estruturalmente diversas de biomateriais poliméricos (Brocchini, Advanced Drug Delivery Reviews 53:123 (2001)). Esta abordagem combinatória tem também sido aplicada à identificação de polímeros de entrega de genes. Por exemplo, Murphy et al. geraram uma biblioteca combinatória direccionada de 6 7 peptóides através de síntese de fase sólida e rastrearam-nos para identificar novos agentes de entrega de genes (Murphy et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95:1517 (1998) ) .
Neste Exemplo são descritas novas ferramentas de elevado rendimento em paralelo para síntese combinatória e rastreio baseado em células de uma grande biblioteca de 2350 poli(beta-aminoésteres) estruturalmente diversos. Esta abordagem permite o rastreio de polímeros em ensaios baseados em células, sem os polímeros nunca deixarem a fase de solução após a síntese. Esta abordagem combinada com a utilização de sistemas robotizados de manuseamento de fluidos permite a geração e o ensaio de milhares de polímeros em ensaios baseados em células numa quantidade de tempo relativamente curta. Utilizando esta abordagem, foram identificados 46 novos polímeros que têm um desempenho tão bom ou melhor do que os sistemas de entrega não virais convencionais tais como poli(etilenoimina).
Resultados e discussão Síntese de polímero de elevado rendimento. Os principais factores que limitam a produção e a automação da síntese e do ensaio de poli(beta-aminoésteres) eram a viscosidade das soluções de monómero e de polímero, e a dificuldade com a manipulação dos produtos de polímero sólidos. Embora a automação do manuseamento de líquidos seja simples utilizando robótica convencional, a manipulação de sólidos e de líquidos viscosos a uma escala pequena não o é. Consequentemente, foi desenvolvido um sistema no qual puderam ser sintetizados e rastreados polímeros em ensaios baseados em células sem deixar a fase de solução. Uma vez que isto requeria a presença de solvente residual nos ensaios de células, foi 95 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ escolhido ο solvente relativamente não tóxico, dimetilsulfóxido (DMSO). 0 DMSO é um solvente habitualmente utilizado em cultura de células e é rotineiramente utilizado no armazenamento de reservas congeladas de células. 0 DMSO é miscivel com água e é geralmente bem tolerado em sistemas vivos. 0 primeiro passo na preparação para a síntese de elevado rendimento foi identificar as condições que permitiriam a produção de polímero possuindo ainda uma viscosidade manuseável. Experiências piloto em pequena escala mostraram que a polimerização podia ser realizada eficazmente a 1,6 M em DMSO a 56°C durante 5 dias. Com base nestas experiências, foi desenvolvida uma estratégia geral para síntese e ensaio de polímeros. Todos os monómeros (Figura 12) foram diluídos até 1,6 M em DMSO, e depois, utilizando um robot de manuseamento de fluidos e um micropipetador de 12 canais, adicionámos 150 microlitros de cada um dos monómeros de amina e de diacrilato numa placa de polipropileno de poços fundos e depois selou-se esta com película de alumínio. Colocaram-se as placas sobre um agitador orbital e incubaram-se a 56°C durante 5 dias. Para compensar a viscosidade aumentada das soluções poliméricas, adicionou-se 1 ml de DMSO a cada poço da placa, e as placas foram depois armazenadas a 4°C até posterior utilização. Estes métodos permitem 2350 reacções num único dia. Para além disso, a produção e armazenamento de polímeros num formato de 96 poços permitiu uma transição fácil para o formato de 96 poços para ensaio, baseado em células, da eficiência de transfecção do polímero.
Ensaio de polímeros de elevado rendimento. Uma vez sintetizados, todos os polímeros foram testados quanto à sua capacidade para entregar o plasmídeo exprimindo luciferase, pCMV-Luc, à linha de células de fibroblasto de rim de macaco COS-7. Devido ao grande tamanho da biblioteca de polímeros, foi desenvolvido um método de elevado rendimento para o rastreio, baseado em células, da eficiência de transfecção. Uma vez que os polímeros estavam armazenados em placas de 96 poços, todas as diluições de polímero, complexações de ADN e transfecções de células foram realizadas em paralelo transferindo directamente os polímeros de placa para placa utilizando um robot de manuseamento de líquidos. Todos os polímeros foram sintetizados utilizando a mesma concentração de monómero de amina, e assim foi directa a comparação entre 96 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ polímeros para uma razão fixa de monómero de amina:fosfato de ADN (razão N:P). Embora os monómeros de amina contenham uma, duas ou três aminas por monómero, os rastreios iniciais de uma base ampla, em relação à eficiência de transfecção, foram grandemente simplificados mantendo uma concentração de monómero constante em todos os poços de uma placa individual, e deste modo um volume constante de solução de polímero por reacção (ver métodos a seguir). A eficiência de transfecção in vitro, utilizando polímeros catiónicos tais como poli(etilenoimina), é muito sensível à razão de polímero para ADN presente durante a formação do complexo (Gebhart et al., Journal of Controlled Release 73:401 (2001)). Para os nossos ensaios iniciais, foram seleccionadas razões N:P de 10:1, 20:1 e 40:1, com base na experiência anterior com estes tipos de polímeros. Utilizando o nosso sistema de elevado rendimento, rastreámos todos os 2350 polímeros para estas três razões. Os valores de transfecção na melhor condição para cada polímero foram representados num histograma (Figura 13) . Estes resultados foram comparados com três controlos: ADN nu (sem agente de transfecção), poli(etilenoimina) (PEI) e Lipofectamine 2000. Os níveis residuais baixos de DMSO, presentes nas soluções de transfecção, não afectaram a eficiência de transfecção quer de ADN nu quer de PEI. Constatou-se que trinta e três dos 2350 polímeros eram tão bons ou melhores do que a PEI neste sistema não optimizado.
Uma vez que as transfecções com polímero catiónico tendem a ser sensíveis à razão polímero:ADN, decidimos optimizar as condições de transfecção com os melhores polímeros do nosso rastreio inicial. Utilizando os resultados anteriores como uma orientação grosseira, as condições de transfecção para os melhores 93 polímeros foram optimizadas ensaiando estes para as razões N:P acima e abaixo das condições de transfecção óptimas, identificadas no rastreio de base ampla. De modo a desenvolver um sistema de optimização de elevado rendimento, estes foram testados utilizando um sistema multiplicador da razão N:P para simplificar o ensaio simultâneo e a transferência de placa para placa. Começando com a melhor razão N:P identificada no rastreio preliminar, os polímeros foram de novo testados para seis razões N:P iguais à melhor razão vezes 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5 e 1,75, em triplicado. Por exemplo, se a razão 97 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ óptima identificada no rastreio para um dado polímero era 20:1, então esse polímero foi de novo rastreado em triplicado para razões N:P de 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1 e 35:1. As eficiências de transfecção médias com desvio padrão, a partir da melhor condição, para os melhores 50 polímeros, são apresentadas na Figura 14, em conjunto com dados de controlo. Nesta experiência, foram identificados 46 polímeros que se transfectaram tão bem ou melhor do que a PEI. Todos estes 93 polímeros foram também testados quanto à sua capacidade para se ligarem a ADN utilizando electroforese em gel de agarose (Figura 15) . Interessantemente, embora quase todos os polímeros se ligassem a ADN como esperado, dois polímeros que se transfectaram com níveis elevados não o fizeram: Ml7 e KK89 (Figura 14).
Para examinar adicionalmente as propriedades de transfecção destes polímeros, testaram-se dez polímeros altamente transfectantes quanto à sua capacidade para entregar o plasmídeo de proteína fluorescente verde, pCMV-eGFP. Contrariamente ao pCMV-luc, o pCMV-eGFP proporciona informação referente à percentagem de células que é transfectada. Foram observados níveis elevados de transfecção para todos os 10 polímeros, e na Figura 16 mostram-se dois dos melhores.
Os "sucessos" identificados nos ensaios anteriores revelam uma colecção surpreendentemente diversa e inesperada de polímeros. Particularmente surpreendente é a grande colecção de polímeros hidrófobos, baseados em monómero D. De facto, os monómeros de diacrilato utilizados para preparar os 50 polímeros com o melhor desempenho são quase sempre hidrófobos. Análise adicional revela duas particularidades mais comuns dos polímeros eficazes: 1) doze dos 26 polímeros que são melhores do que o melhor reagente convencional, Lipofectamine 2000, têm grupos laterais mono- e di-álcool, e 2) as bis(aminas secundárias) lineares são também predominantes nas estruturas de sucesso. Também surpreendente foi a identificação de dois polímeros que se transfectaram com níveis elevados mas que pareceram não se ligar a ADN (KK89 e M17) . São ambos também insolúveis a pH 5 e pH 7. A sua capacidade para facilitar a incorporação de ADN pode ser devida a permeabilização da membrana celular. O comprimento é também importante para a função dos 98 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ polímeros de entrega de genes (Remy et al.r Advanced Drug Delivery Reviews 30:85 (1998); Schaffer et al., Biotechnol.
Bioeng. 67:598 (2000)). Utilizado estes resultados como base, pode-se preparar uma gama de comprimentos de polímero para cada polímero de sucesso variando cuidadosamente as concentrações relativas de monómero. A evidência mostra que (1) tal como na PEI, o comprimento do poli(beta-aminoéster) é importante para a competência destes polímeros na entrega de genes, e que (2) os sucessos aqui identificados podem ser outra vez sintetizados utilizando métodos convencionais e ainda entregar ADN eficazmente.
Protocolos experimentais Síntese de polímero. Os monómeros foram comprados na Aldrich (Milwaukee, WI), TCI (Portland, OR), Pfaltz & Bauer (Waterbury, CT), Matrix Scientific (Columbia, SC), Acros-Fisher (Pittsburg, PA), Scientific Polymer (Ontario, NY), Polysciences (Warrington, PA), e Dajac monomer-polymer (Feasterville, PA) . Dissolveram-se estes em DMSO (Aldrich) até uma concentração final de 1,6 M. Todos os pares de combinações possíveis de monómeros de amina e diacrilato foram adicionados em alíquotas de 150 μΐ a cada poço de 2 ml de placas de poço fundo Masterblock de polipropileno de 96 poços (Griener America, Longwood, FL). As placas foram seladas com película de alumínio e incubadas a 56°C enquanto rodavam num agitador orbital. Após 5 dias, adicionou-se 1 ml de DMSO a cada poço, e as placas foram de novo seladas e armazenadas congeladas a 4°C até serem utilizadas.
Experiências de transfecção. Semearam-se 14 000 células cos-7 (ATCC, Manassas, VA) em cada poço de uma placa de 96 poços branca opaca ou transparente (Corning-Costar, Kennebunk, ME) e deixaram-se fixar de um dia para o outro em meio de crescimento, composto de: 500 ml de DMEM isento de vermelho de fenol, 50 ml de FBS inactivado por calor, 5 ml penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cada poço de uma placa Masterblock de 96 poços foi cheio com 1 ml de acetato de sódio 25 mM pH 5. Adicionaram-se 40 μΐ, 20 μΐ ou 10 μΐ da solução de polimero/DMSO. Adicionaram-se 25 μΐ do polímero diluido a 25 μΐ de ADN 60 pg/ml pCMV-luc (Promega, Madison, WI) ou pEGFP-Nl (Invitrogen) numa placa de 96 poços de metade do volume. Incubou-se durante 10 minutos, e depois adicionaram-se 30 μΐ da solução de polímero-ADN a 200 μΐ de 99 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Opti-MEM com bicarbonato de sódio (Invitrogen) em placas de poliestireno de 96 poços. 0 meio foi removido das células utilizando um pipetador de 12 canais (V & P Scientific, San Diego, CA) após o que se adicionaram de imediato 150 μΐ da solução Opti-MEM-polimero-ADN. Os complexos foram incubados com as células durante 1 hora e depois removidos utilizando um pipetador de 12 canais e substituídos por 105 μΐ de meio de crescimento. Deixaram-se as células crescer durante três dias a 37°C, 5% de C02 e depois analisaram-se quanto à luminescência (pCMV-luc) ou fluorescência (pEGFP-Nl). As experiências de controlo foram realizadas como descrito acima, mas utilizando poli(etilenoimina) MW 25 000 (Aldrich) em substituição do polímero sintetizado, e para razões em peso de polímero:ADN de 0,5:1, 0,75:1, 1:1, 1,25:1, 1,5:1 e 2:1. As transfecções com Lipofectamine 2000 (Invitrogen) foram realizadas como descrito pelo fornecedor, excepto que os complexos foram removidos após 1 hora. A luminescência foi analisada utilizando kits de ensaio Bright-Glo (Promega). Resumidamente, adicionaram-se 100 μΐ da solução Bright-Glo a cada poço da placa de microtitulação contendo meios e células. A luminescência foi medida utilizando um luminómetro Mithras (Berthold, Oak Ridge, TN). Nalguns casos, utilizou-se um filtro de densidade neutra (Chroma, Brattleboro, VT) para prevenir a saturação do luminómetro. Foi gerada uma curva de calibração para a luciferase por titulação da enzima luciferase (Promega) em meios de crescimento em placas de microtitulação brancas. A expressão de eGFP foi examinada utilizando um microscópio invertido Zeiss Aciovert 200.
Os ensaios de ligação de ADN de electroforese em gel de agarose foram realizados para uma razão N:P de 40:1, como anteriormente descrito (Lynn et al., Journal of the American Chemical Society 123:8155 (2001)). Todo o manuseamento de líquidos foi realizado utilizando um robot EDR384S/96S (Labcyte, Union City, CA) ou um micropipetador de 12 canais (Thermo Labsystems, Vantaa, Finlândia) numa câmara de fluxo laminar.
Exemplo 5 - Síntese de poli(beta-aminoésteres) optimizada para entrega de genes altamente eficaz razao
Determinou-se o efeito de peso molecular, 100 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ polímero/ADN e grupo terminal da cadeia nas propriedades de transfecção de duas estruturas de poli(β-aminoéster) únicas. Estes factores podem ter um efeito dramático na função de entrega de genes. Utilizando métodos de rastreio de elevado rendimento, foram identificados poli(β-aminoésteres) que se transfectam melhor do que PEI e Lipofectamine 2000 (dois dos melhores reagentes de transfecção disponíveis comercialmente).
Materiais e métodos Síntese de polímeros. Os polímeros Poli-1 e Poli-2 foram sintetizados por adição de diacrilato de 1,4-butanodiol (99+%) e de diacrilato de 1,6-hexanodiol (99%), respectivamente, a 1-aminobutanol (98%). Estes monómeros foram comprados na Alfa Aesar (Ward Hill, MA) . Foram geradas doze versões de cada um dos polímeros Poli-1 e Poli-2 fazendo variar a razão estequiométrica de aminas/diacrilato. Para sintetizar cada um dos 24 polímeros únicos, pesaram-se 400 mg de 1-aminobutanol para um frasco de amostra de 8 mL com uma tampa de enroscar revestida a Teflon. Em seguida, a quantidade apropriada de diacrilato foi adicionada ao frasco para dar uma razão estequiométrica entre 1,4 e 0,6. Colocou-se depois em cada frasco uma pequena barra de agitação revestida a Teflon. Os frascos foram muito bem tapados e colocados sobre uma placa de agitação magnética com múltiplas posições dentro de uma estufa mantida a 100°C. Após um tempo de reacção de 5 horas, os frascos foram removidos da estufa e armazenados a 4°C. Todos os polímeros foram analisados por GPC.
Cromatografia de permeação em gel (GPC) . A GPC foi realizada utilizando uma bomba isocrática Hewlett Packard Série 1100, um injector Rheodyne Modelo 7125 com uma espiral de injecção de 100 pL, e uma coluna Phenogel MXL (5μ mista, 300 x 7,5 mm, Phenomenex, Torrance, CA). Utilizou-se como eluente 70% de THF/30% de DMSO (v/v) + piperidina 0,1 M com um caudal de 1,0 mL/minuto. Os dados foram recolhidos utilizando um refractómetro interferométrico Optilab DSP (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) e processados utilizando o pacote de software TriSEC GPC (Viscotek Corporation, Houston, TX) . Os pesos moleculares e as polidispersividades dos polímeros foram determinados em relação a padrões monodispersos de poliestireno. 101 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Ensaios de transfecção de luciferase. As células COS-7 (ATCC, Manassas, VA) foram semeadas (14 000 células/poço) em cada poço de uma placa branca opaca que 96 poços (Corning-Costar, Kennebunk, ME) e deixaram-se fixar de um dia para o outro em meio de crescimento. O meio de crescimento era composto de 90% DMEM isento de vermelho de fenol, 10% de soro fetal de bovino, 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para facilitar o manuseamento, prepararam-se soluções de reserva dos polímeros (100 mg/mL) em solvente DMSO. Uma pequena quantidade residual de DMSO na mistura de transfecção não afecta a eficiência de transfecção e não resulta em qualquer citotoxicidade observável. Prepararam-se diluições de trabalho de cada polímero (nas concentrações necessárias para proporcionar as diferentes razões em peso de polímero/ADN) em tampão acetato de sódio 25 mM (pH 5). Adicionaram-se 25 μΐ do polímero diluído a 25 μΐ de ADN pCMV-Luc 60 pg/ml (Elim Biopharmaceuticals, South San Francisco, CA) num poço de uma placa de 96 poços. As misturas foram incubadas durante 10 minutos para permitir a formação de complexos, e depois adicionaram-se 30 μΐ de cada uma das soluções de polímero-ADN a 200 μΐ de Opti-MEM com bicarbonato de sódio (Invitrogen) em placas de poliestireno de 96 poços. O meio de crescimento foi removido das células utilizando um pipetador de aspiração de 12 canais (V&P Scientific, San Diego, CA) após o que se adicionaram de imediato 150 μΐ da solução Opti-MEM-polímero-ADN. Os complexos foram incubados com as células durante 1 h e depois removidos utilizando o pipetador de 12 canais e substituídos por 105 μΐ de meio de crescimento. Deixaram-se as células crescer durante três dias a 37°C, 5% de C02 e depois analisaram-se quanto à expressão de luciferase. Foram também realizadas experiências de controlo com PEI (MW = 25 000, Sigma-Aldrich) e Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As transfecções de PEI foram realizadas como descrito acima, mas utilizando razões em peso de polímero:ADN de 1:1. As transfecções de Lipofectamine 2000 foram realizadas como descrito pelo fornecedor, excepto que os complexos foram removidos após 1 hora. A expressão de luciferase foi analisada utilizando kits de ensaio Bright-Glo (Promega). Resumidamente, adicionaram-se 100 μΐ de solução Bright-Glo a cada poço da placa de 96 poços contendo meios e células. A luminescência foi medida utilizando um luminómetro Mithras (Berthold, Oak Ridge, TN). 102 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Utilizou-se um filtro de densidade neutra a 1% (Chroma, Brattleboro, VT) para prevenir a saturação do luminómetro. Foi gerada uma curva de calibração para a luciferase por titulação da enzima luciferase (Promega) em meios de crescimento numa placa de 96 poços branca opaca.
Medição de citotoxicidade. Os ensaios de citotoxicidade foram realizados do mesmo modo que as experiências de transfecção de luciferase com a excepção seguinte. Em vez de se ensaiar a expressão de luciferase após 3 dias, as células foram ensaias quanto à actividade metabólica utilizando o kit de ensaio de proliferação celular MTT (ATCC) após 1 dia. Adicionaram-se 10 pL de reagente MTT a cada poço. Após 2 h de incubação a 37°C, adicionaram-se a cada poço 100 pL de reagente Detergent. A placa foi depois deixada no escuro à temperatura ambiente durante 4 h. A absorvância óptica foi medida a 570 nm utilizando um leitor de microplacas SpectaMax 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) e convertida em % de viabilidade em relação a células de controlo não tratadas.
Experiências de incorporação celular. As experiências de incorporação foram realizadas como anteriormente descrito, com a excepção de se utilizar um formato em placa de 12 poços em vez de um formato em placa de 6 poços (Akinc, A., et al., "Parallel synthesis and biophysical characterization of a degradable polymer library of gene delivery". J. Am. Chem. Soc., 2003) .
As células COS-7 foram semeadas numa concentração de 1,5 X 105 células/poço e cultivadas durante 24 horas antes da realização das experiências de incorporação. A preparação de complexos de polimero/ADN foi realizada do mesmo modo que nas experiências de transfecção de luciferase, sendo as únicas diferenças um aumento em escala (2,5 pg de ADN por poço de placa de 12 poços contra 600 ng de ADN por poço de placa de 96 poços) e a utilização de plasmideo marcado com Cy5 em vez de pCMV-Luc (Akinc, A. e R. Langer, "Measuring the pH environment of DNA delivered using non-viral vectors: Implications for lysosomal trafficking". Biotechnol. Bioeng., 2002. 78(5): págs. 503-8).
Tal como nas experiências de transfecção, os complexos foram incubados com células durante 1 h para permitir a incorporação celular por endocitose. O nivel relativo de 103 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ incorporação celular foi quantificado utilizando um citómetro de fluxo para medir a fluorescência de células carregadas com o plasmideo marcado com Cy5.
Transfecções de GFP. As transfecções de GFP foram realizadas em linhas de células COS-7 (rim de macaco verde), NIH 3T3 (fibroblasto murino), HepG2 (hepatocarcinoma de humano) e CHO (Ovário de Hamster Chinês). Todas as linhas de células foram obtidas na ATCC (Manassas, VA) e mantidas em DMEM contendo 10% de soro fetal de bovino, 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, a 37°C numa atmosfera de 5% de CO2. As células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até aproximadamente 80-90% de confluência antes da realização das experiências de transfecção. Os complexos de polimero/ADN foram preparados como descrito acima utilizando o plasmideo pEGFP-Nl (Clontech, Paio Alto, CA) (5 pg/poço). Diluiram-se os complexos em 1 mL de Opti-MEM e adicionaram-se aos poços durante 1 h. Removeram-se depois os complexos e adicionaram-se meios de crescimento frescos aos poços. Após 2 dias, colheram-se as células e analisaram-se quanto à expressão de GFP por citometria de fluxo. Utilizou-se coloração com iodeto de propidio para excluir as células mortas da análise.
Citometria de fluxo. A citometria de fluxo foi realizada com um FACSCalibur (Becton Dickinson) equipado com um laser de iões de árgon capaz de excitar GFP (excitação a 488 nm) e um laser de diodo vermelho capaz de excitar Cy5 (excitação a 635 nm) . A emissão de GFP foi filtrada utilizando um filtro de passagem de banda de 530 nm e a emissão de Cy5 foi filtrada utilizando filtro de passagem longo de 650. As células foram apropriadamente atravessadas por dispersão frontal e lateral e recolheram-se 30 000 eventos por amostra.
Resultados e discussão Síntese de polímero. Como anteriormente descrito (Lynn, D.M. e R. Langer, "Degradable poly(p-amino esters): synthesis. characterization, and self-assembly plasmid DNA". J. Am. Chem. Soc., 2000. 122(44): págs. 10761-10768), a síntese de poli(β-aminoésteres) decorre via a adição conjugada de aminas a grupos acrilato. Porque a reacção é um passo de polimerização, obtém-se uma distribuição estatística larga de comprimentos de cadeia, com o peso molecular médio e 104 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ ο grupo terminal das cadeias controlados pela estequiometria dos monómeros (Flory, P., em Principies of Polymer Chemistry. 1953, Cornell University Press: Ithaca, NY. págs. 40-46, 318-323; Odian, G., Step Polymerizaton, em Principies of Polymerization. 1991, John Wiley & Sons, Inc.: New York. págs. 73-89). 0 peso molecular aumenta à medida que a razão de monómeros se aproxima da equivalência estequiométrica, e um excesso de monómero amina ou diacrilato resulta em cadeias terminadas em amina ou em acrilato, respectivamente. Para esta classe de polímeros, o controlo preciso da estequiometria é essencial para controlar o peso molecular do polímero. Embora a estequiometria dos monómeros seja o factor mais importante que afecta o comprimento da cadeia, deverão também ser tidas em consideração reacções secundárias competitivas, que podem ter impacto no peso molecular e na estrutura de produtos poliméricos. Em particular, reacções de ciclização intramoleculares, onde uma amina numa extremidade da cadeia de polímero em crescimento reage com um acrilato na outra extremidade, podem limitar os pesos moleculares obtidos (Odian, G., Step Polymerizaton, em Principies of Polymerization. 1991, John Wiley & Sons, Inc.: New York. pág. 73-89).
Estas cadeias cíclicas podem também ter propriedades diferentes das dos seus correspondentes lineares.
Neste trabalho, modificámos o procedimento de polimerização anteriormente noticiado de modo a melhorar o controlo da estequiometria do monómero e a minimizar as reacções de ciclização. Em primeiro lugar, a escala de síntese foi aumentada de aproximadamente 0,5 g até 1 g para permitir o controlo da estequiometria dentro de 1%. A melhoria adicional em exactidão está limitada pela pureza (98-99%) dos monómeros utilizados disponíveis comercialmente. Em segundo lugar, todos os monómeros foram pesados para dentro de frascos em vez de serem dispensados volumetricamente. Verificou-se que as discrepâncias entre as densidades de monómero reais e publicadas não são desprezáveis nalguns casos, conduzindo a inexactidões na massa dispensada. Em terceiro lugar, foram realizadas polimerizações na ausência de solvente para maximizar a concentração de monómero, favorecendo assim a reacção de 105 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ adição intermolecular em detrimento da reacção de ciclização intramolecular. A eliminação do solvente proporciona também os benefícios acrescidos de aumentar a velocidade de reacção e de evitar o passo de remoção do solvente. Finalmente, uma vez que não se utilizou o solvente diclorometano anteriormente utilizado, a temperatura de reacção pôde ser aumentada de 45°C para 100°C. O aumento da temperatura resultou numa velocidade de reacção aumentada e numa diminuição da viscosidade da mistura reaccional, ajudando a compensar a viscosidade mais elevada do sistema isento de solvente. O efeito combinado da concentração de monómero aumentada e da temperatura de reacção aumentada resultou numa diminuição no tempo de reacção de cerca de 5 dias para 5 horas.
Sintetizámos os polímeros Poli-1 e Poli-2 por adição de diacrilato de 1,4-butanodiol e de diacrilato de 1,6-hexanodiol, respectivamente, a 1-aminobutanol. Foram sintetizadas doze versões únicas de cada polímero fazendo variar as razões molares de amina/diacrilato entre 0,6 e 1,4.
/0 O V
Poli-1
OH
OH
H,N
Poli-2
OH
OH
Para ambos os conjuntos de polímeros (Poli-1 e Poli-2), 7 dos 12 tenham razões de amina/diacrilato > 1, resultando em polímeros terminados em amina, e 5 dos 12 tinham razões amina/diacrilato < 1, resultando em polímeros terminados em acrilato. Após 5 h de reacção a 100°C, os polímeros foram obtidos como líquidos viscosos claros, liqeiramente amarelados. Os polímeros tinham diferenças observáveis em viscosidade, correspondendo a diferenças em peso molecular. Os polímeros foram analisados por cromatografia de permeação em gel (GPC) de fase orgânica utilizando 70% de THF/30% de DMSO (v/v) + piperidina 0,1 M como eluente. Os pesos 106 ΕΡ 1 639 029/PT moleculares (Mw) dos polímeros variaram de 3 350 (Poli-1, aminas/ diacrilato = 1,38) até 18 000 (Poli-1, aminas/diacrilato = 0,95), em relação a padrões de poliestireno (Figura 16). As distribuições de peso molecular eram monomodais com índices de polidispersividade (PDI) na gama de 1,55 a 2,20.
Resultados de transfecção de luclferase. As experiências de transfecção foram realizadas com todos os 24 polímeros sintetizados (12 de cada um dos polímeros Poli-1 e Poli-2) para 9 razões diferentes de polímero/ADN para determinar o impacto de peso molecular, razão polímero/ADN e grupo terminal da cadeia na eficiência de transfecção (Figuras 17 e 18) . Como modelo do sistema, utilizámos a linha de células COS-7 e um plasmídeo codificando o gene repórter de luciferase de pirilampo (pCMV-Luc) (600 ng/poço). Para facilitar o desempenho das quase 1000 transfecções (dados obtidos em quadruplicado), as experiências foram realizadas no formato de placa de 96 poços. Os níveis de expressão de proteína repórter foram determinados utilizando um kit de ensaio de luciferase disponível comercialmente e um leitor de placas de luminescência de 96 poços.
Os dados apresentados nas Figuras 17 e 18 demonstram que peso molecular de polímero, razão polímero/ADN e grupo terminal da cadeia têm impacto nas propriedades de transfecção de ambos os polímeros Poli-1 e Poli-2. Um resultado impressionante, e algo inesperado, foi que nenhum dos polímeros terminados em acrilato mediou níveis apreciáveis de transfecção sob qualquer das condições avaliadas. Este resultado pode ser mais amplamente aplicável para poli(β-aminoésteres), uma vez que temos ainda que sintetizar um polímero, utilizando um excesso de monómero de diacrilato, que medeie uma expressão de gene repórter apreciável para quaisquer das razões de polímero/ADN que utilizámos. Estas constatações sugerem que talvez apenas os poli(β-aminoésteres) terminados em amina sejam adequados para utilização como veículos de entrega de genes. Em contraste, existiam regiões distintas de actividade de transfecção no espaço MW de polímero/ADN para versões terminadas em amina de ambos os polímeros Poli-1 e Poli-2 (Figuras 17-A e 18-A). Conseguiram-se níveis máximos de expressão de gene repórter de 60 ng de luc/poço e de 26 ng de luc/poço utilizando Poli-1 (Mw = 13 100) e Poli-2 (Mw = 13 400), respectivamente. Estes 107 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ resultados compararam-se muito favoravelmente com PEI (polímero/ADN = 1:1 p/p), que mediou um nível de expressão de 6 ng de luc/poço (dados não mostrados) sob as mesmas condições.
Embora os níveis mais elevados de transfecção tenham ocorrido utilizando as versões de peso molecular mais elevado de ambas as estruturas de polímero, as razões óptimas de polímero/ADN para estes polímeros eram acentuadamente diferentes (polímero/ADN = 150 para Poli-1, polímero/ADN = 30 para Poli-2). Os resultados de transfecção que obtivemos para Poli-1 e Poli-2 salientam a importância da optimização do peso molecular de polímero e da razão polímero/ADN, e a importância do controlo dos grupos terminais da cadeia. Adicionalmente, o facto de duas destas cadeias de estruturas de polímero similares, diferindo apenas de dois carbonos na unidade de repetição, terem parâmetros de transfecção óptimos tão diferentes enfatiza a necessidade de realizar estas optimizações para cada estrutura de polímero única. Para melhorar a nossa compreensão dos resultados de transfecção obtidos, escolhemos estudar duas características de entrega importantes que têm impacto directo na expressão do transgene, na citotoxicidade e na capacidade para entrar nas células via endocitose (Wiethoff, C.M. e C.R. Middaugh, "Barriers to nonviral gene delivery". Journal of Pharmaceutical Sciences, 2003. 92(2): págs. 203-217).
Citotoxicidade. Avaliámos as citotoxicidades dos vários complexos de polímero/ADN utilizando um ensaio padrão de redução de MTT/pigmento azul de tiazolilo. As experiências foram realizadas exactamente como nas experiências de transfecção acima descritas, excepto que, em vez do ensaio quanto à expressão de gene repórter no dia 3, o ensaio de MTT foi realizado após o dia 1 (ver Materiais e Métodos) . Colocámos inicialmente a hipótese de a falta de actividade de transfecção observada, para polímeros terminados em acrilato, poder ter sido devida à citotoxicidade dos grupos terminais acrilato. As Figuras 19-B e 20-B indicam de facto que concentrações elevadas de acrilato são citotóxicas, uma vez que se observa que a viabilidade diminui com o aumento da razão polímero/ADN e com a diminuição do Mw do polímero (um Mw inferior corresponde a uma concentração mais elevada de grupos terminais). Contudo, a citotoxicidade de acrilatos não explica suficientemente a falta de actividade de transfecção 108 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ para razões de polímero/ADN mais baixas ou para pesos moleculares mais elevados. Os dados apresentados na Figura 19-A demonstram que a citotoxicidade não é um factor limitante para vectores Poli-1, uma vez que as células permanecem viáveis mesmo para as razões polímero/ADN mais elevadas. Por outro lado, os dados apresentados na Figura 20-A sugerem que a citotoxicidade é um factor importante limitando a eficiência de transfecção de vectores Poli-2, especialmente para os polímeros de peso molecular mais baixo. Este resultado pode explicar porque a actividade de transfecção é inexistente ou decrescente para vectores Poli-2 para polímero/ADN > 30 (ver Figura 18-A).
Incorporação celular. A capacidade de complexos de polímero/ADN serem incorporados por células foi avaliada utilizando uma técnica baseada em citometria de fluxo, anteriormente descrita para medir a fluorescência de ADN entregue por vector (Akinc, A., et ai., "Parallel synthesis and biophysical characterization of a degradable polymer library of gene delivery". J. Am. Chem. Soc., 2003). Resumidamente, prepararam-se complexos de polímero/ADN utilizando ADN de plasmídeo marcado covalentemente com o pigmento fluorescente Cy5. Para permitir uma comparação dos dados de incorporação celular com os dados de expressão de gene acima indicados, os complexos foram formadas para as mesmas razões de polímero/ADN e do mesmo modo como nas experiências de transfecção. Os complexos marcados foram incubados com células COS-7 durante lha 37°C para permitir a incorporação. O nível relativo de incorporação de partículas foi depois quantificado por medição da fluorescência de células carregadas com ADN marcado com Cy5. Os dados destas experiências de incorporação estão resumidos nas Figuras 21 e 22. Os dados apresentados nas Figuras 21-B e 22-B sugerem que a falta de actividade de transfecção para os polímeros terminados em acrilato não é devida a citotoxicidade, como inicialmente se pensava, mas sim a uma incapacidade para entrar na célula. Similarmente, os complexos de Poli-1 têm uma incorporação seriamente limitada para todas as razões polímero/ADN excepto para a mais elevada (Figura 21-A). Embora estes dados não se correlacionem exactamente com os resultados de transfecção obtidos para o Poli-1, são consistentes com o facto de não se observar actividade de transfecção até se utilizarem razões de polímero/ADN muito elevadas. Os complexos de Poli-2 não 109 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ mostram qualquer incorporação celular apreciável para razões de polímero/ADN < 30 e mostram níveis crescentes de incorporação à medida que as razões de polímero/ADN aumentam para além de 30 (Figura 22-A). Este resultado, combinado com os resultados de citotoxicidade anteriores, ajuda a explicar a actividade de transfecção de complexos de Poli-2. Para razões de polímero/ADN inferiores a 30, os complexos não entram eficazmente na célula mas, à medida que as razões de polímero/ADN aumentam muito para além de 30, a citotoxicidade começa a limitar a eficiência de transfecção, resultando numa actividade de transfecção óptima próxima de polímero/ADN = 30.
Quando a endocitose é a principal via de entrada celular, a formação eficaz de complexos de polímero/ADN à escala nanométrica é um requisito para conseguir níveis elevados de incorporação celular (De Smedt, S.C., J. Demeester, e W.E. Hennink, "Cationic polymer based gene delivery Systems". Pharmaceutical Research, 2000. 17(2): págs. 113-126; Prabha, S., et al., Size-dependency of nanoparticule-mediated gene transfection: studies with fractionated nanoparticules. International Journal of Pharmaceutics, 2002. 244(1-2): págs. 105-115). Os fracos níveis de incorporação observados para muitos dos complexos de polímero/ADN podem ser atribuíveis à formação mal sucedida de complexos estáveis, à escala nanométrica. Infelizmente, a fraca solubilidade dos polímeros a pH neutro impediu a realização de medições de dispersão de luz dinâmica do tamanho do complexo, utilizando o meio de transfecção (meio de soro reduzido Opti-MEM, pH 7,2) como o diluente. As leituras obtidas são atribuíveis a precipitados de polímero, que eram nalguns casos visíveis como turvação em soluções de polímero em Opti-MEM. Contudo, fomos capazes de medir os diâmetros efectivos de complexos utilizando acetato de sódio 25 mM (pH 5) como o diluente da amostra. Embora estes dados não possam fazer luz sobre o tamanho ou estabilidade de complexos no meio de transfecção, podem indicar se se formaram ou não com sucesso complexos antes da adição ao meio de transfecção. Especificamente, constatámos que as versões de peso molecular inferior (Mw < 10 700) de Poli-1 eram incapazes de formar complexos à escala nanométrica, mesmo em tampão acetato. Em todos os outros casos, verificámos que foram formados complexos de polímero/ADN à escala nanométrica. Embora estes resultados possam explicar os 110 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ fracos níveis de incorporação associados com versões de baixo peso molecular de Poli-1, não explicam satisfatoriamente a baixa actividade de incorporação dos polímeros terminados em acrilato ou a dependência da razão polímero/ADN sobre a incorporação celular. Ainda que tamanho de partícula e estabilidade sejam factores importantes com impacto na incorporação celular, é provável que outros factores, ainda não identificados, tenham também de ser considerados de modo a fornecer uma explicação mais completa dos resultados obtidos de incorporação celular.
Melhoria da transfecção utilizando um agente de co-complexação. Ambos os polímeros Poli-1 e Poli-2 requerem razões em peso de polímero/ADN relativamente elevadas para conseguir níveis elevados de transferência de genes. Uma explicação pode ser que, em comparação com outros polímeros frequentemente utilizados para compactar ADN (e.g., poli-lisina (PLL) e PEI), estes polímeros têm densidades de azoto relativamente baixas. 0 Poli-1 tem um peso molecular por átomo de azoto (MW/N) de 301, e o Poli-2 tem um MW/N de 329. Por comparação, para PLL e PEI, estes números são aproximadamente 65 e 43, respectivamente. Pode ser possível reduzir a quantidade de Poli-1 ou Poli-2 necessária para conseguir níveis elevados de transfecção por incorporação de uma pequena quantidade de agente de co-complexação. Esta abordagem pode ser especialmente benéfica para vectores de Poli-2, uma vez que a citotoxicidade parece ser uma limitação importante para estes vectores. Para testar esta hipótese, utilizaram-se PLL e PEI como agentes modelo de co-complexação. Centrámos a nossa atenção no membro mais promissor de cada um dos conjuntos de polímeros Poli-1 (terminados em amina, Mw = 13 100) e Poli-2 (terminados em amina, Mw = 13 400) . Os dados apresentados nas Figuras 23 e 24 indicam que se pode conseguir uma redução significativa em polímero, mantendo ao mesmo tempo níveis elevados de eficiência de transfecção, através da utilização de PLL ou PEI como agentes de co-complexação. Nalguns casos, foi conseguida uma melhoria significativa da actividade de transfecção. Como era de esperar, esta abordagem de co-complexação foi particularmente benéfica para os vectores Poli-2. Este trabalho, e trabalhos anteriores (Wagner, E., et al., "Influenza virus hemagglutinin HA-2 N-terminal fusogenic peptides augment gene transfer by transferrin-poly-lisin-DNA complexes: toward a synthetic virus-like gene-transfer 111 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ vehicle". Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1992. 89(17): págs. 7934-8; Fritz, J.D., et al., "Gene transfer into mammalian cells using histone-condensed plasmid DNA". Hum. Gene Ther., 1996. 7(12): págs. 1395-404; Pack, D.W., D. Putnam, e R.
Langer, "Design of imidazole-containing endosomolytic biopolymers for gene delivery". Biotechnol. Bioeng., 2000. 67(2): págs. 217-23; Lim, Y.B., et al., "Self-Assembled Ternary Complex of Cationic Dendrimer, Cucurbituril, and DNA: Noncovalent Strategy in Developing a Gene Delivery Carrier". Bioconjug. Chem., 2002. 13(6): págs. 1181-5), demonstram que a mistura de polímeros com características de transferência de genes complementares pode nalguns casos produzir reagentes de entrega de genes mais eficazes.
Transfecções de GFP
Para avaliar adicionalmente as propriedades de transfecção dos reagentes mistos Poli-l/PLL e Poli-2/PLL, realizámos experiências de transfecção utilizando um plasmideo repórter codificando proteína fluorescente verde (pCMV-EGFP). Ainda que os sistemas de ensaio de transfecção de luciferase e GFP meçam ambos a actividade de transfecção, proporcionam diferente tipos de informação. O sistema de luciferase quantifica a quantidade total de proteína luciferase exógena produzida por todas as células num dado poço, fornecendo uma medida da actividade de transfecção cumulativa. Em contraste, o sistema de GFP pode ser utilizado para quantificar a percentagem de células que foram transfectadas, fornecendo uma medida célula a célula da actividade de transfecção. Ambos os sistemas são úteis e oferecem informação complementar referente às propriedades de transfecção de um dado sistema de entrega de genes.
As transfecções de GFP foram realizadas de um modo similar às experiências de luciferase, mas foram realizadas em maior escala em placa no formato de 6 poços (5 pg plasmídeo/poço) . As células COS-7 foram transfectadas usando Poli-l/PLL (Poli-l:PLL:ADN = 60:0,1:1 p/p/p) e Poli-2/PLL (Poli-2:PLL:ADN = 15:0,4:1 p/p/p). Lipofectamine 2000 (pL de reagente :pg de ADN = 1:1), PEI (PEI:ADN = 1:1 ρ/ρ, N/P ~ 8), e ADN nu foram utilizados como controlos na experiência. Após 1 h de incubação com células, os vectores foram removidos e adicionaram-se meios de crescimento frescos. Dois dias mais tarde, a expressão de GFP foi testada utilizando um citómetro 112 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ de fluxo. Quase todas as células transfectadas com Poli-l/PLL eram positivas em relação à expressão de GFP (Figuras 25 e 26). As experiências indicaram que os vectores de Poli-2/PLL eram menos eficazes, resultando em aproximadamente 25% de células positivas. Os controlos positivos Lipofectamine 2000 e PEI foram também capazes de mediar a transfecção eficaz de células COS-7 sob as condições utilizadas. Ainda que as transfecções de Lipofectamine 2000 e PEI resultassem em praticamente na mesma percentagem de células GFP-positivas que o Poli-l/PLL, o nivel de fluorescência de células GFP-positivas foi mais elevado para Poli-l/PLL (fluorescência média = 6033) do que para Lipofectamine 2000 (fluorescência média = 5453) e PEI (fluorescência média = 2882). A multiplicação da percentagem de células positivas pelo nível de fluorescência média de células positivas proporciona uma medida da expressão agregada para a amostra e deverá, em teoria, correlacionar-se melhor com os resultados das experiências de expressão do gene de luciferase. A quantificação da expressão total de GFP indica deste modo que o nível de expressão mais elevado é conseguido por Poli-l/PLL, seguido de Lipofectamine 2000 e PEI. Este resultado está em concordância geral com os resultados da expressão de luciferase.
As experiências mostraram que Poli-l/PLL (Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 p/p/p) é um vector altamente eficaz para transfectar células COS-7. Foi também investigada a capacidade deste vector para mediar a transfecção em três outras linhas de células habitualmente utilizadas (CHO, NIH 3T3 e HepG2). É muito provável que cada uma destas linhas de células tenha condições de transfecção óptimas diferentes das utilizadas para transfectar células COS-7; no entanto, como uma avaliação preliminar da capacidade para transfectar múltiplas linhas de células, as transfecções foram realizadas do mesmo modo e sob as mesmas condições que as transfecções de COS-7. Os resultados indicam que Poli-l/PLL (Poli-1:PLL:ADN = 60:0,1:1 p/p/p) é capaz de transfectar com sucesso células CHO, NIH 3T3 e HepG2, ainda que não tão eficazmente como as células COS-7 (Figura 27) . Isto não é assim tão surpreendente uma vez que o vector utilizado estava optimizado por rastreio em relação à transferência de genes in células COS-7. Seria de esperar que a optimização da composição de vector e das condições de transfecção especificas para cada tipo de células resultasse em níveis de 113 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ transfecção ainda mais elevados. Sumário
Neste trabalho, foram investigados o papel de peso molecular de polimero, grupo terminal da cadeia de polímero e razão polímero/ADN num certo número de propriedades importantes de transferência de genes. Verificou-se que todos os três factores têm um impacto significativo na transferência de genes, salientando o benefício do controlo cuidadoso e da optimização destes parâmetros. Adicionalmente, a incorporação de uma pequena quantidade de PLL, utilizada para auxiliar a complexação, melhora adicionalmente a transferência de genes. Através destas abordagens obtiveram-se vectores degradáveis baseados em poli(beta-aminoésteres) que rivalizam com alguns dos melhores vectores não virais disponíveis para transferência de genes in vitro.
Exemplo 6 - Estudos adicionais de poli(beta- aminoésteres) seleccionados
Para caracterizar adicionalmente e sintetizar alguns dos poli(beta-aminoésteres) identificados em rastreios anteriores, sintetizaram-se de novo vinte e um polímeros para várias razões de monómero de amina para monómero de acrilato. Os polímeros resultantes foram caracterizados por cromatografia de permeação em gel para determinar o peso molecular e a polidispersividade de cada polímero. Cada um dos polímeros foi depois testado quanto à sua capacidade para transfectar células. Síntese de polímeros. Os polímeros foram sintetizados como descrito no Exemplo 5. Criaram-se várias versões de cada polímero fazendo variar a razão estequiométrica de amina/diacrilato. Por exemplo, C36-1 corresponde à razão estequiométrica de 1,4, e C36-12 a 0,6, com todos os intermediários apresentados na tabela seguinte:
Versão de C36 Razão estequiométrica de amina:acrilato C36-1 1 1,4 j C36-2 ) 1,3 j ij C36-3 1 1,2 í C36-4 ! 1,1 : 114 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Versão de C36 Razão estequiométrica de amina:acrilato C36-5 1,05 ! C36-6 1,025 j C36-7 1,0 | C36-8 0,975 ; C36-9 0,950 ! C36-10 0, 9 : C36-11 0, 8 i C36-12 0, 6 !
Os polímeros foram preparados tipicamente em frascos de vidro sem qualquer solvente a 100°C durante 5 horas. Em algumas sínteses, a polimerização a 100°C produziu polímeros altamente reticulados quando se utilizaram certos monómeros tais como amina 94; deste modo, as reacções de polimerização foram repetidas a 50°C com 2 mL de DMSO adicionados para evitar reticulação.
Os polímeros resultantes foram analisados por GPC como descrito no Exemplo 5. Os pesos moleculares e as polidispersividades de cada um dos polímeros são apresentados na tabela a seguir:
Polímero Mn Polidispersividade F28-1 5540 2210 2,50678733 j F28-2 6150 2460 2,5 ! F28-3 8310 2920 2,845890411 F28-4 11600 3660 3,169398907 j F28-5 16800 4360 3,853211009 j F28-6 16100 4850 3,319587629 F28-7 18000 5040 3,571428571 F28-8 18200 5710 3, 187390543 ij F28-9 22300 7880 2,829949239 j F28-10 23700 8780 2,699316629 F28-11 12100 5660 2,137809187 F28-12 4850 2920 1,660958904 C36-1 í 7080 3270 2,165137615 i C36-2 5100 2640 1,931818182 1 C36-3 21200 8090 2,620519159 C36-4 20500 6710 3,05514158 115 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Polímero Μ* Μη Polidispersividade C36-5 112200 33200 3,379518072 C36-6 21700 6890 3,149492017 C36-7 36800 15700 2,343949045 C36-8 35700 12600 2,833333333 C36-9 35200 15100 2,331125828 C36-10 22500 9890 2,275025278 C36-11 26000 6060 4,290429043 D60-1 1890 1400 1,35 D60-2 2050 1520 1,348684211 D60-3 2670 1720 1,552325581 D60-4 3930 2210 1,778280543 D60-5 5130 2710 1,89298893 D60-6 5260 2800 1,878571429 D60-7 1130 1090 1,036697248 D60-8 1840 1510 1,218543046 D60-9 6680 3440 1,941860465 D60-10 8710 4410 1,975056689 D60-11 9680 4410 2,195011338 D60-12 7450 3470 2,146974063 D61-1 1710 1410 1,212765957 D61-2 2600 1790 1,452513966 D61-3 3680 2280 1,614035088 D61-4 4630 2550 1,815686275 D61-5 ΝΑ ΝΑ ΝΑ D61-6 ΝΑ ΝΑ ΝΑ D61-7 6110 3250 CO CO τ—1 D61-8 6410 3190 2,009404389 D61-9 6790 3440 1,973837209 D 61 — 10 8900 4350 2,045977011 D 61 — 11 10700 4600 2,326086957 D61-12 6760 2900 2,331034483 F32-1 10300 3260 3,159509202 F32-2 11100 3490 3,180515759 F32-3 16600 4820 3,443983402 F32-4 17300 5390 3,209647495 F32-5 18600 5830 3,190394511 F32-6 26200 8290 3,160434258 116 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Polímero Μ* Mn Polidispersividade C32-1 6670 2810 2,37366548 C32-2 18100 5680 3,186619718 C32-3 19300 6060 3,184818482 C32-4 25600 9100 2,813186813 C32-5 25000 7860 3,180661578 C32-6 25700 8440 3,045023697 C86-1 14200 2900 4,896551724 C86-2 21000 2900 7,24137931 C86-3 27500 4590 5,991285403 U94-1 10700 3530 3,031161473 U94-2 ΝΑ NA NA U94-3 ΝΑ NA NA F32-1 10300 3260 3,159509202 F32-2 11100 3490 3,180515759 F32-3 16600 4820 3,443983402 F32-4 17300 5390 3,209647495 F32-5 25000 7860 3,180661578 F32-6 26200 8290 3,160434258 C32-1 6670 2810 2,37366548 C32-2 18100 5680 3,186619718 C32-3 19300 6060 3,184818482 C32-4 25600 9100 2,813186813 C32-5 25000 7860 3,180661578 C32-6 25700 8440 3,045023697 U86-1 Invulgar NA NA U86-2 Invulgar NA NA U86-3 Invulgar NA NA U86-4 Invulgar NA NA U85-5 Invulgar NA NA JJ32-1 9730 4010 2,426433915 JJ32-2 12100 4580 2,641921397 JJ32-3 19400 6510 2,980030722 JJ32-4 27900 10000 2,79 JJ32-5 32600 9720 3,353909465 JJ32-6 28900 9870 2,928064843 JJ36-1 7540 3550 2,123943662 JJ36-2 143500 59600 2,407718121 117 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
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Polímero Μ* Mn Polidispersividade U36-4 21500 8550 2,514619883 U36-5 24700 9430 2,619300106 U36-6 31700 10700 2,962616822 Ε36-1 6030 3130 1,926517572 Ε36-2 8510 4040 2,106435644 Ε36-3 12800 5730 2,233856894 Ε36-4 18200 7620 2,388451444 Ε36-5 20100 8050 2,49689441 Ε36-6 32900 10900 3,018348624 U32-1 9830 3790 2,593667546 U32-2 12000 4460 2,69058296 U32-3 18200 6780 2,684365782 U32-4 25200 11100 2,27027027 U32-5 26500 9360 2,831196581 U32-6 26200 10600 2,471698113 Ε32-1 7070 3310 2,135951662 Ε32-2 9920 4180 2,373205742 Ε32-3 14700 6080 2,417763158 Ε32-4 23500 9160 2,565502183 Ε32-5 28800 10000 2,88 Ε32-6 26900 10300 2,611650485 C94-1 6760 3110 2,173633441 C94-2 10800 4190 2,577565632 C94-3 18000 5330 3,377110694 C94-4 38900 6660 5,840840841 C94-5 Não se dissolveu NA NA C94-6 Não se dissolveu NA NA D94-1 6030 2980 2,023489933 D94-2 6620 3370 1,964391691 D94-3 9680 3950 2,450632911 D94-4 11500 4510 2,549889135 D94-5 13700 4940 2,773279352 D94-6 18800 5650 3,327433628 F94-1 5570 2740 2,032846715 F94-2 7670 3180 2,411949686 F94-3 12600 4230 2,978723404 F94-4 20300 5160 3,934108527 119 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Polímero Μ* Mn Polidispersividade F94-5 21500 5390 3,988868275 F94-6 27300 6310 4,326465927 JJ94-1 7750 3360 2,306547619 JJ94-2 12700 4590 2,766884532 JJ94-3 30500 7280 4,18956044 JJ94-4 Não se dissolveu NA NA JJ94-5 Não se dissolveu NA NA JJ94-6 Não se dissolveu NA NA F86-1 3940 2630 1,498098859 F86-2 5300 3190 1,661442006 F86-3 7790 4040 1,928217822 F86-4 11000 5410 2,033271719 F86-5 10600 5650 1,876106195 F86-6 13300 6440 2,065217391 D86-1 4610 2830 1,628975265 D86-2 5570 3290 1,693009119 D86-3 7120 3770 1,888594164 D86-4 8310 4440 1,871621622 D86-5 8950 4710 1,900212314 D86-6 10400 5010 2,075848303 U86-1 5940 3500 1,697142857 U86-2 7780 4430 1,756207675 U86-3 11900 6540 1,819571865 U86-4 15100 7630 1,979030144 U86-5 16300 8950 1,82122905 U86-6 18100 9810 1,845056065 Ε86-1 4880 3140 1,554140127 Ε86-2 6300 3790 1,662269129 Ε86-3 9780 5140 1,902723735 Ε86-4 12500 6350 1,968503937 Ε86-5 13400 6820 1,964809384 Ε86-6 15500 7280 2,129120879 JJ86-1 5460 3370 1,620178042 JJ86-2 6880 4080 1,68627451 JJ86-3 11900 6180 1,925566343 JJ86-4 14200 7000 2,028571429 JJ86-5 20500 9090 2,255225523 120 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Polímero Mn Polidispersividade JJ86-6 16300 I 7770 2,097812098 | C86-1 4870 j 3030 1,607260726 C86-2 : 5720 1 3460 1,653179191 C86-3 i 9970 : 5060 l 1, 970355731 |: i C86-4 ; 14200 1 7000 2,028571429 | C86-5 17700 = 8500 2,082352941 C86-6 | 17800 : 8500 2,094117647 C80-1 I 2450 : 1790 l 1,368715084 : C80-2 : 3770 \ 2370 \ 1,5907173 |i C80-3 || 6080 \ 3370 l 1,804154303 I C80-4 | 7960 \ 4310 1,846867749 C80-5 i 9030 ; 4660 1,93776824 C80-6 : 12600 1 6050 \ 2,082644628 | i E80-1 l 2840 \ 2010 l 1,412935323 | E80-2 3720 \ 2420 l 1,537190083 i E80-3 || 6080 \ 3650 1,665753425 E80-4 ! 7210 I 4240 i 1,700471698 i E80-5 7640 : 4290 l 1,780885781 E80-6 | 9000 \ 5310 1,694915254 ! JJ80-1 3410 1 2180 í 1,564220183 JJ80-2 | 4590 i 2890 1,588235294 JJ80-3 |i 8430 i 4750 1,774736842 s JJ80-4 | 11300 I 6560 1,722560976 i JJ80-5 13200 1 7160 i 1,843575419 S JJ80-6 | 11600 i 6540 1, 773700306 ;í U80-1 | 4300 i 2680 1,604477612 i U80-2 | 5130 I 3020 1,698675497 i U80-3 | 8320 j 4700 1,770212766 5 U80-4 | 9130 i 4880 1 1,870901639 ; U80-5 | 11300 i 5750 1,965217391 í U80-6 | 11200 ; 5920 1,891891892 Ensaio de transfecção Exemplo 5, as células COS-7 Luc utilizando cada um polímero/ADN na gama de 10: de luciferase foi analisada Glo (Promega). Mediu-se de luciferase. Como descrito no foram transfectadas com ADN pCMV-dos polímeros para razões de 1 a 100:1 (peso/peso). A expressão utilizando kits de ensaio Bright-a luminescência para cada 121 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ transfecção, e utilizou-se a luminescência para calcular nanogramas de enzima luciferase como descrito no Exemplo 5. As experiências foram realizadas em quadruplicado, e os valores apresentados nas tabelas a seguir são os valores médios a partir das quatro experiências. Estes dados são a seguir mostrados para cada polímero sintetizado. C36-1 C36-2 C36-3 C36-4 C36-5 C36-6 i Razão 0, 168527 : 0,345149 0,627992 j 0,152258 0,068355 : 0,094073 10 3,58467 j 0,12639 21,27867 í 2,145388 0,163042 : 0,184298 1 20 4, 295966 j 0,927605 18, 84046 4,750661 0,287989 i 1,063834 i 30 7,150343 i 1,137242 17, 04771 ;! 7,529555 0,080757 i 0,332789 40 3,74705 ! 1,180274 6,875879 l 9,710764 0,582186 ; 1,963895 í 60 0,705683 j 0,212297 0,560245 ;j 7,221382 5,003849 : 5,813189 ! íoo C36-7 C36-8 C36-9 C36-10 C36-11 C-36-12 i Razão 0,164373 i 0,085336 0, 116502 0,042173 0,062905 : 0,18877 ! ío 0,134132 j 0,096043 0,091152 :j 0,032851 0,032115 ; 0,383965 1 20 0,020768 j 0,021203 0,0665 í 0,021953 0,017807 : 0,288102 i 30 0,05027 j 0,060731 0,017768 :! 0,011885 0,008923 ; 0,128469 40 0,031233 1 0,048807 0,025626 í 0,012516 0,002606 : 0,213173 i 60 0, 116587 i 0,129504 0,332497 í 0,123413 0,058442 i 0,250708 | 100 C86 -1 C86-2 C86-3 Razão 0,157713 i 0,475708 1,093272 10 0,242481 i 0,616621 1,439904 20 0,396888 ; 0,992601 1,758045 30 0,300173 \ 1,276707 1,901677 40 D60-1 D60-2 D60-3 D60-4 D60-5 D60-6 | Razão 0,604984 0,443875 0,363271 0,260475 0,498462 0,466087 10 0,115174 0,174976 0,250613 0,40783 0,587186 0,89381 1 20 0,138372 0,45915 0,81101 0,773161 1,264634 1,438474 1 30 0, 135287 0,506303 2,344053 1,695591 2,302305 2,959638 40 0,203804 0,679718 3,908348 2,216808 3,129304 4,335511 60 0,233546 0,640246 0,251146 3,112999 7,65786 6,759895 100 122 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ D60-7 D60-8 D60-9 D60-10 D60-11 D60-12 0,299777 0,333863 0,434027 0,46862 0,387458 0,211083 0,23747" 0,266398 1,211246 1,385232 1,034892 0,215027 0,339709 0,665539 2,958346 5,607664 3,514454 0,485295 0,499842 1,216181 4,406196 6,736276 5,121445 0,444359 1,297394 1,009228 5,951785 9,565956 7, 193687 0,35831 5,399266 0,135852 5,725666 10,45568 5,414051 0,245279 D61-1 D61-2 D61-3 D61-4 D61-5 D61-6 0,329886 0,29803 0,190101 0,142813 0,114565 0,227593 0,299409 0,710035 0,295508 0,288845 0,247909 0,32839 0, 155568 0,680763 0,618022 0,651633 0,402721 1,831437 0,085824 0,620294 3,722971 4,572264 3,010274 11,69027 0, 188357 0,187979 3,970054 7,147033 10,85674 9,238981 0,019321 0,001369 0,034958 0,033062 0,202601 0,131544 D61-7 D61-8 D61-9 D61-10 D61-11 D61-12 0,153122 0,180646 0,1073 0,244713 0,231561 0,18571 0,203312 0,217288 0,191108 0,185759 0,270723 0,119897 0,539455 0,239807 0,140418 0,174014 0,320869 0,094186 1,679507 1,020126 0,584908 0,229946 0,474142 0,154025 12,69543 5,9829 7,008946 1,308281 0,301803 0,067526 1,271189 2,402989 3,186707 5,576734 1,343239 0,115366
Razão 10 20 30 40 60 100
Razão 10 20 30 40 60 100
Razão 10 20 30 40 60 100 U94-1 U94-2 U94-3 Razão 0,233894 0, 127165 0,804911 10 0,179855 1,35532 13,53974 20 0,275078 16,26098 20,65427 30 1,161574 19,93922 13,08098 40 1,961067 18,39299 9,319949 60 13,0485 7,591092 1,647718 100 C32-1 C32-2 C32-3 C32-4 C32-5 C32-6 t Razão í 0,137436 0,544141 0,138034 0,112832 0,087552 0 ,131699 10 i 0, 159782 28,93062 14,3276 0,316178 0, 125792 0 ,242881 ! 20 ; 0,166661 53,90695 24,83791 0,67551 0,193545 0 ,181321 ! 30 ! 0,392402 90,62006 49,11244 2,271509 0,563168 0 ,632798 ! 40 i 6,034825 73,59378 46,31 2,490156 0,111248 0 ,273411 i 60 j 38,17463 60,21433 51,86994 16,43407 2,01284 2 ,619288 100 i 123 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ F32-1 F32-2 F32-3 F32-4 F32-5 F32-6 Razão 0,746563 2,446604 1,288067 0,210478 0,202798 0,112283 10 20,84138 20,94165 11,46963 1,780569 10,90572 0,100889 20 23,8042 23,7095 13,34488 5, 01115 9,510119 0,255589 30 17,47681 17,35353 14,74619 8,361793 6,436393 0,599084 40 10,54807 11,78762 13,58168 7,499322 4,865577 0,322946 60 0,072034 0,090408 0,332458 2,300951 2,434663 1,644695 100 F28-1 F28-2 F28-3 F28-4 F28-5 F28-6 ί Razão 0 ,245612 0,247492 0,140455 0, 203674 0,09426 0,131075 ! 10 0 ,464885 0, 192584 0,217777 0, 213391 0, 171565 0,397716 ί 20 0 ,290643 0,19239 0,396845 0, 433955 0,361789 2,02073 30 0 ,325066 0, 189405 1,048323 2, 088649 3,888705 19,95507 I 40 0 , 108766 0,164709 13,95859 0, 411927 7, 851029 21,77709 60 0 ,163978 6,619239 6,832291 8, 409421 6,682506 2,958283 ί 100 F28-7 F28-8 F28-9 F28-10 F28-11 F28-12 : Razão 0 ,094505 0,043474 0,05224 0, 050384 0, 104016 0,149513 10 0 , 173987 0,098512 0,069287 0, 057704 0, 131067 0,028219 20 0 ,705917 0,254424 0,083005 0 04454 0,133842 0,001619 I 30 2 ,860034 0,928959 0,226468 0, 076503 0,095093 0,003896 40 7 ,786755 1,932506 0,42898 0, 028744 0,063298 0,001342 60 8 ,655579 12,729 1,396803 0, 281853 0,115513 0,001145 100 JJ28-1 JJ28-2 JJ28-3 JJ28-4 JJ28-5 JJ28-6 ; Razão 0,122351 0,056864 0,030798 | 0,041065 0,02373 0,051849 10 0,060598 0,059073 22,46575 : 2,229717 0,076134 0,053754 20 0,174243 0,211589 21,92396 ί 4,089533 0,121043 0,115906 30 0, 133603 36,42899 69,60415 ; 19,16868 0,292215 0,337099 40 1,011778 64,69601 71,50927 ί 47,49171 0,755335 0,654333 60 60,46546 56,7025 53,44758 ί 39,13032 25,81403 3,936471 100 JJ36-1 JJ36-2 JJ36-3 JJ36-4 JJ36-5 JJ36-6 : Razão 0,506359 1,634649 0,146132 ί 0,053268 0,035023 0,033605 | ίο 2,185596 4,332834 0,677853 ί 0,017846 0,010687 0,004264 j 20 2,339652 5,039758 0,773873 ; 0,024164 0,06932 0,009318 ! 30 0,681878 1,871844 1,539743 ί 0,087428 0,017886 0,009752 j 40 0,521703 1,592328 2,000554 ί! 0,201203 0,027165 0,004975 ί 60 0,003277 0,067895 1,031285 : 0,284902 0,159879 0,008844 ί 100 124 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ JJ32-1 JJ32-2 JJ32-3 JJ32-4 JJ32-5 JJ32-6 Razão 0,392821 1,158486 0,191533 0,127891 0,099083 0,076569 10 17,51289 21,24103 1,803172 0,065286 0,160362 0,108887 20 38,08705 43,77517 24,76927 0,09612 0,063692 0,044659 30 25,9567 34,88211 26,36994 0,201907 0,015214 0,026165 40 11,37519 17,48944 29,59326 0,175101 0,052321 0,098545 60 1,3311 1,288845 6,86144 0,70071 0,178921 0,70361 100 LL6-1 LL6-2 LL6-3 LL6-4 LL6-5 LL6-6 ί Razão 0,405305 0,583416 0,520853 0,50183 0,656802 1,060478 ! 10 0,411758 0,747731 0,460075 0,287671 0,382454 1,099616 i 20 0,809416 0,377302 1,253481 1,099976 2,59164 1,138122 30 0,475903 0,854576 1,812577 2,018906 2,837056 0,69298 ί 40 0,139647 0,29034 0,939013 1,992525 2,250511 3,059824 60 0,00154 0,002408 0,223682 2,932931 3,939451 6,879564 i 100 LL8-1 LL8-2 LL8-3 LL8-4 LL8-5 LL8-6 : Razão 0,533009 1, 180815 1,581011 2,254195 1,73015 1,76882 10 1,174539 1,228513 1,002632 2,369943 1,958308 2,928439 20 1, 182611 1,620962 3,771897 3,988759 3,936124 0,000474 I 30 1,366191 1,875091 4,594308 4,253834 4,07168 0,000948 40 0, 120086 0,866135 1,925861 4,423822 4, 081074 5,083137 60 0,003316 0,029499 0,336777 4,077347 4,416413 4,241522 100 U28-1 U28-2 U28-3 U28-4 U28-5 U28-6 ; Razão 0,049477 0,044465 0,045254 0,034669 0,031628 0,025942 10 0,111915 0,050661 0,03988 0,015399 0,049004 0,020729 20 0,041895 0,050582 0,048212 0,064917 0,069067 0,02756 30 0,122271 0,078429 1,647405 0,488561 1,036216 0,058913 40 0,059982 0,051095 18,03734 5,718868 1,991446 0,176516 60 0,059585 44,91463 51,17075 34,01612 32,39362 3,488256 100 Ε28-1 Ε28-2 Ε28-3 Ε28-4 Ε28-5 Ε28-6 : Razão 0, 109892 0,150078 0,630192 0,187585 0,311968 0,168724 | io 0,088189 0,509429 0,589377 0,106743 0,70723 0,144608 j 20 1,672278 12,4166 21,41889 3,405963 8,337341 1,32881 ! 30 5,658186 12,17055 13,3351 7,272109 17,92266 5,089686 j 40 6,016333 5,424512 5,549474 5,185252 15,62457 8,706483 | 60 1,146098 0,804227 0,592348 0,529551 1,752402 5,438448 j 100 125 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ U36-1 U36-2 U36-3 U36-4 U36-5 U36-6 Razão 0,158334 0,388325 0,255439 0,139618 0,069735 0,054654 10 0,281155 2,119615 0,34803 0,196109 0,111805 0,067406 20 0,968904 2,501669 3,74982 0,370814 0,103744 0,077397 30 0,559332 1,595139 4,650123 0,65127 0,078343 0,029797 40 0,565322 0,540675 4, 182981 1,59494 0,250723 0,029297 60 0,238507 0,008686 1,052448 2,269889 1,310025 0,23654 100 Ε36-1 Ε36-2 Ε36-3 Ε36-4 Ε36-5 Ε36-6 Razão 0,130066 2,940734 0,350723 0,077836 0,051293 0,018123 10 0,496911 1,866482 2,236257 0,135236 0,063655 0,020018 20 1,044698 0,617286 4,27308 0,882725 0, 187495 0,01532 30 0,342085 0,025849 1,935655 1,170393 0,23494 0,004896 40 0,112427 0,211108 1,068847 1,362371 0,628612 0,070175 60 0,002566 0,003672 0,131476 1,367514 1, 194649 0,11883 100 U32-1 U32-2 U32-3 U32-4 U32-5 U32-6 Razão 0,202681 0,107654 0,035536 0,037195 0,041027 0,047701 10 0,106511 0,084192 0,067327 0,012951 0,028982 0,012003 20 1,497135 2,867785 1,828273 0,056586 0,033682 0,010305 30 4,411592 13,8534 0,272404 0,056588 0,029377 0,021045 40 17,28347 38,37457 3,026925 0,017452 0,015556 0,060968 60 11,81885 13,6584 15,23297 0,673546 0,121004 0,15261 100 Ε32-1 Ε32-2 Ε32-3 Ε32-4 Ε32-5 Ε32-6 Razão 0,481414 0,898699 0,149685 0,093788 0,086886 0,046001 10 5,170892 6,057429 1,52106 0,054373 0,099557 0,01378 20 0,965091 2,279423 4, 380769 0,112159 0,027166 0,038894 30 0,848062 1,086906 3,971834 0,13767 0,068236 0,090555 40 0,225141 0,688091 2,653561 0,570809 0,080796 0,01603 60 0,046762 0,176583 0,897883 1,365759 0,845009 0,111133 100 C94-1 C94-2 C94-3 C94-4 Razão 0,289113 i 0,086166 0,151651 0,203119 10 0,133487 j 0,045908 0,067867 7,650297 20 0,293536 i 0,086328 0,853319 10,31612 30 0,198737 : 0,170611 1,955433 9,745005 40 0,312808 0,908991 3,536115 3,580573 60 0,32801 0,853063 2,414853 1,731594 100 126 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ D94-1 D94-2 D94-3 D94-4 D94-5 D94-6 Razão i; 0, 223798 l 0,091225 9,083876 ;! 0,272732 0,46751 5,545365 10 l 9,682036 í 15,16589 24,65534 j 25,45656 27,30727 25,52283 20 l| 14,53736 ! 22,28715 29,68042 \ 38,12112 42,28773 33,35092 30 |j 9,804481 i 14,97104 18,63768 ! 28,87773 35,67401 28,4263 40 1 6,36291 i 11,60176 16,02556 ; 27,2195 29,006 16,62105 60 |j 2,681942 j 2,585502 3,03267 li 9,218975 I 12,48001 9,63693 100 A tabela seguinte mostra a síntese dos polímeros listados à direita utilizado razões de monómero de amina para monómero de acrilato na gama de 1 ,4 a 0,6 como descrito acima. Cada polímero sintetizado foi depois testado quanto à transfecção de luciferase utilizando seis razões diferentes de polímero para ADN (cada experiência foi realizada em quadruplicado). Os dados na tabela representam a actividade de luciferase para a melhor razão polímero para ADN.
Razão molar de monómero de amlna para monómero de acrilato
Polímero 1,400 1,300 1,200 1,100 1,050 1,025 1,000 ;j 0,975 0,950 0,900 5 0,800 10,600 C36 1,18 7, 150343 21,27867 9,710764 5,003849 5,813189 0,164373 0,129504 :0,332497 0,123413 :jo, 062905 : 0,383965 j C66.1 0,396888 1,276707 1,901677 D6O-N0DMS 0,604984 0,679718 3,908348 3,112999 :7,65786 6,759895 5,399266 1,216181 i 5,951785 10,45568 7,193687 : 0,485295 : D6I-N0EMSO 0,329886 0,710035 3,970054 7,147033 : 10, 85674 11,69027 12,69543 5,9829 :7,008946 5,576734 1,343239 :0, 18571 : U94-1 13,0485 19,93922 20,65427 ·: í F32 23,8042 23,7095 14,74619 j8,361793 10,90572 1,644695 F28 0,464885 6,619239 13,95859 8,409421 :7,851029 21,77709 8,655579 12,729 : 1,396803 0,281853 0, 133842 : 0, 149513 : JJ36 2,339652 5,039758 2,000554 0,284902 0, 159879 0,033605 JJ32 j38,08705 43,77517 29,59326 0,70071 0, 178921 0,70361 LL6 :0,809416 0,854576 1,812577 :2,932931 3,939451 6,879564 LL8 :1,366191 1,875091 4,594308 : 4,423822 4,416413 5,083137 U28 i 0,122271 44,91463 51,17075 i 34,01612 32,39362 3,488256 E28 6,016333 12,4166 21,41889 1 7,272109 17,92266 8,706483 U36 ........... " 2,501669 4,650123 2,269889 1,310025 0,23654 E36 1,044698 2,940734 4,27308 1,367514 1,194649 0,11883 U32 17,28347 38,37457 15,23297 0,673546 0, 121004 0,15261 E32 5,170892 6,057429 4,380769 1,365759 0,845009 0,111133 C94 0,32801 0,908991 3,536115 10,31612 D94 14,53736 22,28715 29,68042 38,12112 42,28773 33,35092 F94 0,490553 4,108079 3,530146 8,596197 8,200005 9,892867 JJ94 1,906203 3,87783 11,99391 0,422621 0,590515 0,787162 E28 :j ; 8, 572344 20,89276 14,67007 U28 ij :0,221192 0,515945 0,290904 0,237264 JJ86 0,503544 0,775429 0,794641 0,537706 1,491694 0,707425 C86 0,159044 0,279389 0,637804 1,055779 1,025192 1,422756 U86 0,435638 0,196901 0,124174 0,304979 0,193936 0,189116 E86 0,27629 0,248666 3,633516 6,288459 9,202082 8,484492 C80 0,578045 0,102763 0,111304 0,528832 0,887811 0,961981 E80 1,697744 2,624376 3,868368 ----- 4,412999 1,895016 127 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ :Polímero |1,400 i1,300 1,200 1,100 1,050 1,025 1,000 0,975 0,950 0,900 0,800 0,600 : JJ80 j 0,5771 0,4786 2,199535 3,226941 3,173297 2,653163 ' U80 j 0,119897 0,514079 2,658899 3,552453 4,456214 9,776965 : D24 : 0,526541 2,021508 0,324894 36,64054 0,244347 0,365902 : Ε24 : 0,098517 0,057019 7,404745 1,12791 0,329197 0,326384 ; JJ24 : 0,199154 0,188046 0,090045 0,064921 0,085969 0,032536 1 Β17 i 0,72135 0,44715 0,996508 1,067002 1,098275 2,197846 : 6117 : 0,433646 0,515332 0,672973 0,763891 1,360645 2,580579 2,016952 7,131925 2,21044 0,743141 : M17-DMS0 :j 0, 550188 j 0,409299 0,304933 0,35066 0,404506 0,356775 0,392121 0,376042 0,34777 0,315241 0,468629 0,705352 : Β17 D 0,614141 0,505597 0,339801 0,319609 0,399828 0,406147 : 1128 : 0,334806 0,137402 0,079535 0,165612 0,097702 0,126852 ! 1136 j 0,331156 0,344857 0,209068 0,107622 0,151587 0,170145 : 1132 : 0,046949 0,026455 0,070335 0,047503 0,033368 0,0261 : C20 : 0,126573 0,098883 0,088576 1,003372 0,11883 0,138726 ' JJ20 j 0,085338 40,19751 47,297 5,655104 0,142257 0,099295 : Ε20 i 18,94919 36,04742 31,97179 24,49526 21,63777 10,55303 : C25 : 0,11105 0,044342 0,06737 0,031668 0,088061 : U25 j 0,055718 0,056074 0,069147 0,047859 0,04537 0,088747 1 D25 j 0,105104 0,352229 3,212175 6,167455 1,617246 1,792186 : 070 j 8,351581 5,601802 9,168348 14,68248 6,364419 0,469952 : D60 j 7,304436 11,02975 23,49095 28,06659 33,97336 37,83182 : D61 i 1,380167 4, 035848 11,99391 13,699 17,53849 13,43072 : D28 : 0,413278 0,514204 3,603404 3,728115 4,341368 5, 0 08521 : U94 j 0,221982 1,599895 8,333159 7,73556 4, 522964 ' D32 j 1,575371 3,507692 5, 129846 4, 854435 4,354122 1,223865 1 D36 :1,223865 3,236725 10,5529 ' 16,39008 10,61988 : D93 : 0,431042 1,393065 2,759499 1,938168 2,074542 1,899193 ' U93 j 0,378613 0,265617 0,269287 0,265163 0,469461 0,234903 1 D87 :3,470383 5, 898457 6,532941 4,89156 6,953566 8,573921 : U87 : 0,508655 4,4262 1,069028 2,533226 3,684956 11,63637 i C75 i 1,30574 0,85262 0,67639 1,163913 0,657287 0,424571 : U75 1, 14537 U . 'ihn ) ·> i 1,593702 1,795307 1,200891 0,996441 : 020 j 12,02047 30,23826 24,32419 ! 028 j 4,713009 18,89861 18,38595 5,343957 3,177194 : C94 • 2,131856 -- 2,383634 3,570587 LL6 : :j : i; : : DMSO j 1,085814 1 . Ί 1 MVI 2,079375 3,927835 3,569052 1,05464 : LL8 : 7,580783 3,919499 2,288471 1,802625 1,78288 2,567781 AA20 : 9,741539 25,79155 49,99779 35, 07 19,7298 29,80328 : AA28 j 12,25819 21,71281 45,51628 21,78183 19,18808 0,728069 I E94 j 2,628722 3,159991 1,967481 2,126174 : D86 j 1,921027 1,570262 1,432655 3,219622 2,415026 8,751029 ' F86 j 0,17035 0,215518 0,282999 U. , , M, 0,484268 U. / 1 1 1 AA36 i 4,711737 21,29782 1,774264 10,77378 5,006065 : AA24 : 40,22306 0,044737 0,017176 0,009595 0,044026 0,013425 ' AA94 j 3, 146781 0,013148 ! AA24 j 37, 20033 50,33195 31,79067 7,632073 4, 029 482 0,311914 : 024 :21,68262 21,08162 18,4584 ' " " 0,401993 0,014254 : AA60 j3,475337 14,91753 0,695475 1 AA61 • 0,656416 0,329589 0,543264 0,257434 0,577986 0,307582 : C32 :38,17463 90,62006 51,86994 16,43407 2,01284 2,619288 : JJ28 :60,46546 64,69601 71,50927 25,81403 ' ' - i C28 j 0,310004 0,760135 55,91046 60,63145 57,30086 6,495379 128 ΕΡ 1 639 029/ΡΤ :Polímero : AA2S 1,400 j:lf300 1,200 1,100 1,050 1,025 1,000 :=0,975 i 0,950 0, 900 = 0,800 :0,600 : Ϊ50,34727 55,18143 ; U28 :· 0,122271 44,91463 51,17075 34,01612 32,39362 3,488256 : ΑΑ24* : 37,20033 50,33195 31,79067 7,632073 4,029482 0,311914 : ΑΑ20* j: 9, 741539 25,79155 49,99779 35,07 19,7298 29,80328 : jj2o := 0, 085338 40,19751 47,297 5,655104 0, 142257 0,099295 : ΑΑ28* : 12,25819 21,71281 45,51628 21,78183 19,18808 0,728069 : JJ32 38, 08705 43,77517 29,59326 0,70071 0, 178921 0,70361 : D94* 14, 53736 22,28715 29,68042 38,12112 42,28773 33,35092 : ΑΑ24 l :-40,22306 0,044737 0,017176 0,009595 0,044026 0,013425 : U32 =: j 17,28347 38,37457 15,23297 0,673546 0,121004 0,15261 ’ D60* :=7,304436 11,02975 23,49095 28,06659 33,97336 37,83182 : D24* j: :-0,526541 2,021508 0,324894 36,64054 0,244347 0,365902 : Ε20 =: :-18, 94919 36,04742 31,97179 24,49526 21,63777 10,55303 ' 020 j ij 12, 02047 30,23826 24,32419 ; F32 l 23, 8042 23,7095 14,74619 8,361793 10,90572 1,644695 : F28 \ 0, 464885 íj 6,619239 13,95859 8,409421 7,851029 21,77709 8,655579 12,729 :1,396803 0,281853 = 0,133842 0,149513 ! : 024* =: :=21,68262 21,08162 18,4584 6,134765 0,401993 0,014254 | ΑΑ36* ] :=4,711737 21,29782 1,774264 10,77378 5,006065 : C36 \ 7, 150343 % 1, 180274 21,27867 9, 710764 5,003849 5,813189 0,164373 0,129504 :0,332497 0,123413 j 0, 062905 : 0,383965 = ' Ε28 8,572344 20,89276 14,67007 I U94 i := 13,0485 19,93922 20,65427 : 028 \ :4, 713009 18,89861 18,38595 5,343957 3,177194 : D61* ; ;! 1,380167 4,035848 11,99391 13,699 17,53849 13,43072 ' D36* i :=1,223865 3,236725 10,5529 13,66078 16,39008 10,61988 : ΑΑβΟ* =: ::3, 475337 14,91753 0,695475 : D70* i : i'> l v: l 5,601802 9,168348 14,68248 6,364419 0,469952 ' D61 I 0,329886 :j 0, 710035 3,970054 7,147033 10,85674 11,69027 12,69543 5,9829 = 7,008946 5,576734 : 1,343239 :0,18571 i 1 JJ94 :=1, 906203 3,87783 11,99391 0,422621 0,590515 0,787162 : U87* =: : 0.508655 4,4262 1,069028 2,533226 3,684956 '1 '1 .67677 i D60 :j 0,604984 := 0,679718 3,908348 3,112999 7,65786 6,759895 5,399266 1,216181 = 5,951785 10,45568 i 7,193687 i 0, 485295 : : C94* := := 0,32801 0,908991 3,536115 10,31612 : F94* ;: : 0. 49055 3 4,108079 . . _ 8,596197 8,200005 9,892867 : U80* í = 0. 1 1 9 8 9 7 0,514079 2,658899 3,552453 4,456214 9,776965 : E86* j: :=0,27629 0,248666 3,633516 6,288459 9,202082 8,484492 D86* ; :j 1, 921027 1,570262 1,432655 3,219622 2,415026 8,751029 : D87* :: = i. 970 i:: i 5,898457 6,532941 4,89156 6,953566 8,573921 : U94* í := 0,221982 1,599895 8,333159 7,73556 4, 522964 LL8 =: · 7. 580787 3,919499 2,288471 1,802625 1,78288 2,567781 : E24 í >0.0')86I7 0,057019 7,404745 1,12791 0,329197 0,326384 : Ml 7 0, 580405 := 0, 433646 0,484853 0,515332 0,672973 0,763891 1,360645 2,580579 2,016952 7,131925 2,21044 0, 743141 : : LL6 = j 0,809416 0,854576 1,812577 2,932931 3,939451 6,879564 : D25* : \ 0,105104 0,352229 3,212175 6,167455 1,617246 1,792186 i E32 := 5, 170892 6,057429 4,380769 1,365759 0,845009 0,111133 : D32* =: : 1, 575371 3,507692 5, 129846 4, 854435 4,354122 1,223865 : LL8* =: j: 1,366191 1,875091 4,594308 4,423822 4,416413 5,083137 : jj36 I :=2,339652 5, 039758 2,000554 0,284902 0,159879 0,033605 : D28* Ϊ |j 0, 413278 0,514204 3,603404 3,728115 ' ' " 5,008521 : U36 = íj 0, 968904 2,501669 4,650123 2,269889 1,310025 0,23654 ' E80 i := 1,697744 2,624376 3,868368 3,757709 4,412999 1,895016 : E36 = :1, 044698 2,940734 4,27308 _ . 1,194649 0,11883 : LL6* =: 1=1, 085814 1,91664 2,079375 3,927835 3,569052 1,05464 : C94* := :=2,131856 -- 2,383634 3,570587 129ΕΡ 1 639 029/ΡΤ
Polímero 1,400 1,300 1,200 1,100 1,050 1,025 1,000 0,975 0,950 0,900 0,800 0,600 JJ80 0,5771 0,4786 2,199535 3,226941 3,173297 2,653163 E94* 2,628722 3,159991 1,967481 2,126174 AA94* 3,146781 0,013148 D93* 0,431042 1,393065 2,759499 1,938168 2,074542 1,899193 B17 0,72135 0,44715 0,996508 1,067002 1,098275 2,197846 C86 0,159044 0,279389 0,637804 1,055779 1,025192 1,422756 U75* 1,14537 0,966531 1,593702 1 .795 307 1,200891 0,996441 JJ86 0,503544 0,775429 0,794641 0,537706 1,491694 0,707425 C86 0,159044 0,279389 0,637804 1,055779 1,025192 1,422756 C75* 1,30574 0,85262 0,67639 1,163913 0,657287 0,424571 C20 0,126573 0,098883 0,088576 1,003372 0,11883 0,138726 C80* 0,578045 0,102763 0,111304 0,528832 0,887811 0,961981 F86* 0,17035 0,215518 0,282999 0,337696 0,484268 0,711768 M17* 0,550188 0,409299 0,304933 0,35066 0,404506 0,356775 0,392121 0,376042 0,34777 0,315241 0,468629 0,705352 AA61* 0,656416 0,329589 0,543264 0,257434 0,577986 0,307582 B17* 0,614141 0.505597 0,339801 0,319609 0,399828 0,406147 U28 0,221192 0,515945 0,290904 0,237264 U93* 0,378613 0,265617 0,269287 0,265163 0,469461 0,234903 U86* 0,435638 0,196901 0,124174 0,304979 0,193936 0,189116 1136 0,331156 0,344857 0,209068 0,107622 0,151587 0,170145 1128 0,334806 0,137402 0,079535 0,165612 0,097702 0,126852 JJ24 0,199154 0,188046 0,090045 0,064921 0,085969 0,032536 C25* 0,11105 0,044342 0,06737 0,031668 0,088061 0,05876 U25 0,055718 0,056074 0,069147 0,047859 0,04537 0,088747 1132 0,046949 0,026455 0,070335 0. 04750 3 0,033368 0,0261 * Os polímeros com um asterisco foram sintetizados com DMSO (2 mL) adicionado a mistura reaccional. ULILIO,.'· lOIUIU SinLiJLlZ^Li.LO;.· ,01.111 SOlVi.lLLi.'
Lisboa

Claims (14)

  1. ΕΡ 1 639 029/ΡΙ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Composto da fórmula:
    em que cada R' é seleccionado independentemente de entre o grupo consistindo de hidrogénio, alquilo inferior Ci-C6, alcoxi inferior C1-C6, hidroxi, amino, alquilamino, dialquilamino, ciano, tiol, heteroarilo, arilo, fenilo, heterociclico, carbociclico e halogéneo; n é um inteiro entre 3 e 10 000; x é um inteiro entre 1 e 10; e quando X é metilo ou NR2; e R é seleccionado de entre o grupo consistindo de hidrogénio, alquilo, alcenilo, alcinilo, cíclico, heterociclico, arilo e heteroarilo; ou quando X é OR; e R é seleccionado de entre o grupo consistindo de alquilo, alcenilo, alcinilo, cíclico, heterociclico, arilo e heteroarilo; y é um inteiro entre 1 e 10; ou quando X é OR; e R é hidrogénio, y é 5 ou um inteiro entre 1 e 2 ou 6 e 10 e seus derivados e sais.
  2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, onde o composto é terminado em amina, ou onde o composto é terminado em acrilato.
  3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1, onde x é um inteiro entre 2 e 7, preferivelmente onde x é 4, 5 ou 6.
  4. 4. Composto de acordo com a reivindicação 1, onde y é um inteiro entre 2 e 7, preferivelmente onde y é 4, 5 ou 6.
  5. 5. Composto de acordo com a reivindicação 1, onde R é hidrogénio, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo e hexilo. ΕΡ 1 639 029/ΡΤ 2/5 , onde a
  6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 1 estrutura do composto é
    onde R é hidrogénio, x é 4, e y é 4; ou
    t ou
    onde R é hidrogénio, x é 4, e y é 5; ou OH
    O jjjg o ΕΡ 1 639 029/ΡΤ ΕΡ 1 639 029/ΡΤ onde R ou 3/5 é hidrogénio, x é 5, e y é 4; onde R ou
    "t- * n
    JÍ36 OH
    * Π onde R 7 é hidrogénio, x é 5, e y é 6. . Composto de acordo com a reivindicação 1 da fórmula: onde sais.
    ΕΡ 1 639 029/ΡΤ 4/5
  7. 8. Composto de acordo com a reivindicação 1 compreende acrilatos da fórmula: , que
    E F
    llpp —' e aminas da fórmula: 1 2 3 4 5
    8 9 25 Hí—v — 10 -'“-'•'Wh 11 26 VL*. «a ^-0« 12 27 )/·ΗΒ, 13 28 —0 V—> 29 30 no taij
    48 Ύγ“"· 49 50 — 52 54 55 56 57
    V i> p· >Λ>\ 78 79 80 SI 85 75
    HO ΕΡ 1 639 029/ΡΤ 5/5
  8. 9. Composto de acordo com a reivindicação 8, seleccionado de entre o grupo consistindo de: C80, E32, E36, F28, F32 e LL8.
  9. 10. Composto de acordo com a reivindicação 1, onde o composto tem um peso molecular entre 1 000 e 100 000 g/mol, preferivelmente onde o composto tem um peso molecular entre 2 000 e 40 000 g/mol.
  10. 11. Composição farmacêutica que compreende um polinucleótido e um composto de acordo com a reivindicação 1.
  11. 12. Composição farmacêutica que compreende nanoparticulas contendo um polinucleótido ou um agente farmacêutico e um composto de acordo com a reivindicação 1.
  12. 13. Composição farmacêutica que compreende microparticulas contendo um agente encapsulado numa matriz de um composto de acordo com a reivindicação 1.
  13. 14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, onde as microparticulas têm um diâmetro médio de 1-10 micron, ou onde as microparticulas têm um diâmetro médio inferior a 5 micron, preferivelmente onde as microparticulas têm um diâmetro médio inferior a 1 micron.
  14. 15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, onde o agente é uma molécula pequena, um péptido, uma proteína ou um polinucleótido, preferivelmente onde o polinucleótido é ADN, ARN ou ARNi. Lisboa
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