JP5558154B2 - 生分解性ポリ（β−アミノエステル）およびその使用 - Google Patents

生分解性ポリ（β−アミノエステル）およびその使用 Download PDF

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Description

（政府援助）
本明細書中に記載される研究は、部分的に、国立科学財団（ＭＩＴ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒに対する協力協定＃ＥＣＣ９８４３３４２）、国立衛生研究所（ＧＭ２６６９８；ＮＲＳＡ奨学金＃１ Ｆ３２ ＧＭ２０２２７−０１）、および陸軍（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｔｈｅｒａｐｙに対する協力協定＃ＤＡＭＤ １７−９９−２−９−００１）からの助成金によって援助された。米国政府は、本発明における特定の権利を有し得る。
（発明の背景）
ＤＮＡおよびＲＮＡのようなヌクレオチドベースの薬物を介してのヒトの疾患の処置は、医学分野に革命を起こす可能性を有する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｎａｔｕｒｅ ３９２（Ｓｕｐｐｌ．）：２５〜３０、１９９６；Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１４４〜１４７、１９９６；Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４〜４１０、１９９５；Ｍｕｌｌｉｇａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６〜９３２、１９９３；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される）。これまで、遺伝子移入ベクターとしての改変されたウイルスの使用は、一般に、臨床的に最も首尾良い、遺伝子治療へのアプローチの代表となっている。ウイルスベクターは、現在最も有効な遺伝子移入剤であるが、ウイルスベクターの全般的な安全性を取り囲む懸念（これは、自発的な免疫応答の可能性を包含する）が、非ウイルス代替物を開発するための並行する努力を生じている（主な参考文献として、以下を参照のこと：Ｌｕｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３３〜３７、２０００；Ｂｅｈｒ Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：２７４〜２７８、１９９３；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される）。ウイルスベクターに対する現在の代替物としては、ポリマー性送達システム（Ｚａｕｎｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３０：９７〜１１３、１９９８；Ｋａｂａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：７〜２０、１９９５；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される）、リポソーム形成（Ｍｉｌｌｅｒ Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：１７６８〜１７８５、１９９８；Ｈｏｐｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１〜１４、１９９８；Ｄｅｓｈｍｕｋｈら、Ｎｅｗ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．２１：１１３〜１２４、１９９７；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される）、および「裸の（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡ注入プロトコル（Ｓａｎｆｏｒｄ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：２８８〜３０２、１９８８；参考として本明細書中で援用される）が挙げられる。これらのストラテジーは、ウイルスベクターの臨床的な有効性を今なお達成しているが、これらの方法（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｎａｔｕｒｅ ３９２（Ｓｕｐｐｌ．）：２５〜３０、１９９６；参考として本明細書中で援用される）によって与えられる潜在的な安全性、処理、および経済的利益のために、遺伝子治療に対する非ウイルスのアプローチの継続的な開発に関心が持たれ始めている（Ｂｏｕｓｓｉｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７２９７〜７３０１、１９９５；Ｐｕｔｎａｍら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：３６５８〜３６６２、１９９９；Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３〜５６３９、１９９９；Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：１０６８〜１０７４、１９９９；Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：４８９７〜４９０２、１９９６；Ｔａｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．７：７０３〜７１４、１９９６；Ｈａｅｎｓｌｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４：３７２〜３７９、１９９３；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される）。
カチオン性ポリマーは、負に荷電したＤＮＡの鎖をそれらが縮合（ｃｏｎｄｅｎｓｅ）および保護する容易性に起因して、トランスフェクションベクターとして広範に用いられている。アミン含有ポリマー（例えば、ポリ（リシン）（Ｚａｕｎｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３０：９７〜１１３、１９９８；Ｋａｂａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：７〜２０、１９９５；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）（Ｂｏｕｓｓｉｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７２９７〜７３０１、１９９５；参考として本明細書中で援用される）、およびポリ（アミドアミン）デンドリマー（Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：４８９７〜４９０２、１９９６；Ｔａｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．７：７０３〜７１４、１９９６；Ｈａｅｎｓｌｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４：３７２〜３７９、１９９３；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される））は、生理学的なｐＨで正に荷電し、核酸とイオン対を形成し、そして種々の細胞株においてトランスフェクションを媒介する。しかし、これらの一般的な使用にも関わらず、ポリ（リシン）およびＰＥＩのようなカチオン性ポリマーは、有意に細胞傷害性であり得る（Ｚａｕｎｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３０：９７〜１１３、１９９８；Ｄｅｓｈｍｕｋｈら、Ｎｅｗ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．２１：１１３〜１２４、１９９７；Ｃｈｏｋｓａｋｕｌｎｉｍｉｔｒら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ３４：２３３〜２４１、１９９５；Ｂｒａｚｅａｕら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１５：６８０〜６８４、１９９８；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される）。結果として、遺伝子移入用途のためのカチオン性ポリマーの選択は、一般に、トランスフェクション有効性と、短期細胞傷害性および長期細胞傷害性との間の折り合いを必要とする。さらに、これらのポリマーのいくつかは容易に生分解しない（Ｕｈｒｉｃｈ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．５：３８８〜３９３、１９９７；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．３０：５３〜６５、１９９６；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される）ので、これらのポリマーの長期生体適合性は、インビボでの治療用途における使用に対する重要な問題のままである。
既存のポリマー性ベクターおよび他の機能化された生体適合材料に対する安全な代替物を開発するために、カチオン性側鎖を有する分解性ポリエステルが開発されている（Ｐｕｔｎａｍら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：３６５８〜３６６２、１９９９；Ｂａｒｒｅｒａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：１１０１０〜１１０１１、１９９３；Ｋｗｏｎら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２２：３２５０〜３２５５、１９８９；Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３〜５６３９、１９９９；Ｚｈｏｕら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２３：３３９９〜３４０６、１９９０；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される）。これらのポリエステルの例としては、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リシン）（Ｂａｒｒｅｒａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：１１０１０〜１１０１１、１９９３；参考として本明細書中で援用される）、ポリ（セリンエステル）（Ｚｈｏｕら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２３：３３９９〜３４０６、１９９０；参考として本明細書中で援用される）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）（Ｐｕｔｎａｍら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：３６５８〜３６６２、１９９９；Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３〜５６３９、１９９９；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される）、およびより最近では、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］が挙げられる。ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）およびポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］は、最近、静電的相互作用を通じてプラスミドＤＮＡを縮合すること、および遺伝子移入を媒介することが実証された（Ｐｕｔｎａｍら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：３６５８〜３６６２、１９９９；Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３〜５６３９、１９９９；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される）。重要なことに、これらの新しいポリマーは、ポリ（リシン）およびＰＥＩよりも有意に毒性が低く、そして無毒な代謝物に分解する。これらの研究から、アミン含有ポリエステルの合理的な設計が、安全で有効なトランスフェクションベクターの開発のための生産的なルートであり得ることは明白である。しかし、不運なことに、これらのポリマーの現在の合成は、特殊化されたモノマーの独立な調製（Ｂａｒｒｅｒａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：１１０１０〜１１０１１、１９９３；参考として本明細書中で援用される）か、または化学量論的な量の高価なカップリング試薬の使用（Ｐｕｔｎａｍら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：３６５８〜３６６２、１９９９；参考として本明細書中で援用される）のいずれかを必要とする。さらに、このモノマーにおけるアミン官能性は、重合の前に保護されなければならず（Ｐｕｔｎａｍら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：３６５８〜３６６２、１９９９；Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３〜５６３９，１９９９；Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：１０６８〜１０７４、１９９９；Ｂａｒｒｅｒａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５；１１０１０〜１１０１１、１９９３；Ｋｗｏｎら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２２：３２５０〜３２５５、１９８９；これらの各々は、参考として本明細書中で援用される）、このポリマーがトランスフェクション薬剤として用いられ得る前には、さらに重合後の脱保護工程を必要とする。
核酸をトランスフェクトするために用いられ得、そして効率的かつ経済的に容易に調製される、無毒性で生分解性の生体適合性ポリマーに対する継続的な必要性が存在する。このようなポリマーは、遺伝子治療における核酸の送達、そして診断剤、治療剤、および予防剤の包装ならびに／または送達における核酸の送達を含む、いくつかの使用を有する。
本発明は、後述するとおりの特徴を達成することを課題とする。
（発明の要旨）
本発明は、薬剤送達デバイスの調製において有用なポリマーおよびその薬学的組成物を提供する。本発明はまた、このポリマーを調製する方法、ならびに本発明のポリマーを含有する微粒子および他の薬学的組成物を調製する方法を提供する。
本発明のポリマーは、ポリ（β−アミノエステル）およびその塩およびその誘導体である。好ましいポリマーは、生分解性かつ生体適合性である。代表的には、このポリマーは、このポリマーの骨格において１つ以上の第３級アミンを有する。好ましいポリマーは、繰り返し骨格単位当たり、１つまたは２つの第３級アミンを有する。このポリマーはまた、成分の１つがポリ（β−アミノエステル）であるコポリマーであってもよい。本発明のポリマーは、ビス（第２級アミン）または第１級アミンを、ビス（アクリル酸エステル）と縮合することによって、容易に調製され得る。本発明の代表的なポリマーは、以下のいずれかの式で表される：
ここで、ＡおよびＢはリンカーであり、このリンカーは、任意の、置換あるいは非置換の炭素原子もしくはヘテロ原子の分枝鎖または非分枝鎖であり得る。これらポリマーの分子量は、１０００ｇ／モル〜２０，０００ｇ／モル、好ましくは、５０００ｇ／モル〜１５，０００ｇ／モルの範囲であり得る。特定の実施形態では、Ｂは、１〜１２の炭素原子のアルキル鎖である。他の実施形態では、Ｂは、合計１〜１２の炭素原子およびヘテロ原子を含むヘテロ脂肪族鎖である。Ｒ１基およびＲ２基は、広範な種々の置換基のうちのいずれかであり得る。特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、一級アミン、二級アミン、三級アミン、ヒドロキシル基、およびアルコキシ基を含み得る。特定の実施形態では、上記ポリマーは末端がアミンであり；そして他の実施形態では、上記ポリマーは末端がアクリレートである。特に好ましい実施形態において、このＲ１基および／またはＲ２基は、リンカーＡと環状構造を形成する（以下の詳細な説明の項を参照のこと）。このような環状部分を含むポリマーは、より低いｐＨにおいてより可溶性であるという特性を有する。特に好ましいポリマーは、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．２〜７．４）において水溶液に不溶性であり、生理学的なｐＨ未満（ｐＨ＜７．２）の水溶液に可溶性であるポリマーである。他の好ましいポリマーは、生理学的ｐＨ（ｐＨ７．２〜７．４）以下の水溶液に可溶性であるポリマーである。好ましいポリマーは、細胞中へのポリヌクレオチドのトランスフェクションにおいて有用である。
別の局面において、本発明は、本発明のポリマーを調製する方法を提供する。好ましい実施形態において、商業的に入手可能かまたは容易に入手可能なモノマー（ビス（第２級アミン）、第１級アミン、およびビス（アクリル酸エステル））を、ビス（アクリル酸エステル）へのアミンの共役付加を導く条件に供する。特に好ましい実施形態において、このモノマーの各々を、有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジエチルエーテル、塩化メチレン、ヘキサンなど）に溶解し、そして得られる溶液を合わせ、そしてこのモノマーの重合を導くのに十分な時間の間、加熱する。他の実施形態では、重合は、溶媒の不在下で実施される。次いで、この得られるポリマーは、当該分野において公知の技術を用いて精製されそして必要に応じて特徴付けられ得る。
本発明のなお別の局面において、本ポリマーは核酸と共にナノメートル規模の複合体を形成するために使用される。そのポリヌクレオチド／ポリマー複合体は、所望されるＤＮＡ／ポリマー濃度で、ポリヌクレオチド溶液をボルテックス中のポリマー溶液に対して添加することにより形成され得る。ポリヌクレオチドの重量対ポリマーの重量の比は、１：０．１〜１：２００の範囲に渡り得、好ましくは１：１０〜１：１５０、より好ましくは１：５０〜１：１５０に渡り得る。アミンモノマーのリン酸ポリヌクレオチドに対する比は、約１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１１０：１、１２０：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、および２００：１であり得る。カチオン性ポリマーは、代表的に大きさ５０〜５００ｎｍの可溶性粒子サイズにポリヌクレオチドを凝縮させる。これらのポリヌクレオチド／ポリマー複合体は、細胞へのポリヌクレオチドの送達において使用され得る。特に好ましい実施形態において、これらの複合体は薬学的賦形剤と組み合わされ、ヒトを含む動物に対する送達に適した薬学的組成物を形成する。特定の実施形態では、分子量対窒素原子比が高いポリマー（例えば、ポリリジン、ポリエチレンイミン）がトランスフェクション効率を増加するために用いられる。
本発明の別の局面において、本ポリマーは、予防的な微粒子を形成するポリヌクレオチドを含む、治療的、診断的、および／または薬剤をカプセルに包むために使用され得る。代表的に、これらの微粒子は、ポリヌクレオチド／ポリマー複合体よりも1桁の規模で大きい。その微粒子は、１μｍ〜５００μｍの範囲に渡る。特に好ましい実施形態において、これらの微粒子は、不安定な小分子、タンパク質、ペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの、個体への送達を可能とする。その微粒子は、例えば二重エマルジョン、相反転および噴霧乾燥のような、微粒子作製のための当該分野で公知の任意の技術を使用して、調製され得る。特に好ましい実施形態において、その微粒子は、ポリマーのｐＨ応答性性質（つまり、低ｐＨにてより溶解性が高いこと）に起因して、カプセル化された内容物のｐＨ誘発性送達に使用され得る。
なお別の局面では、本発明は、ポリマーのコレクションを合成およびスクリーニングするためのシステムを提供する。特定の実施形態では、このシステムは、自動化液体取扱いおよびロボット工学の技術分野で公知の技法を利用する。この合成およびスクリーニングするシステムは、ポリ（β−アミノエステル）、およびポリアミド、ポリエステル、ポリエーテル、ポリカルバメート、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミンなどを含むその他のタイプのポリマーとともに用いられ得る。ポリマーのコレクションは、すべてが１つのタイプのポリマーのコレクションであり得るか（例えば、すべてがポリ（β−アミノエステル））、またはポリマーの多様なコレクションであり得る。数千のポリマーが、本発明のシステムを用いて並行して合成され、かつスクリーニングされ得る。特定の実施形態では、これらポリマーは、遺伝子送達、トランスフェクション、または遺伝子治療の分野で有用な性質についてスクリーニングされる。これら性質のいくつかは、種々のｐＨにおける溶解度、ポリヌクレオチドに複合体化する能力、細胞中にポリヌクレオチドをトランスフェクトする能力などを含む。細胞をトランスフェクトすることで有用であることが見出される特定のポリ（β−アミノエステル）は、実施例４および５に記載されるように、Ｍ１７、ＫＫ８９、Ｃ３２、Ｃ３６、ＪＪ２８、ＪＪ３２、ＪＪ３６、ＬＬ６、およびＤ９４を含む。
（定義）
以下は明細書および請求項において使用される化学用語である。
本明細書で用いられるとき、用語アシルは、一般式−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを有する基をいい、ここで、Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、炭素環式、複素環式、芳香族複素環式である。アシル基の例は、アセチルである。
用語アルキルとは、本明細書中で使用される場合、１つの水素原子を除いた、１〜２０の間の炭素原子を含む炭化水素部分に由来する、飽和した、直鎖または分枝鎖の炭化水素ラジカルを称する。いくつかの実施形態では、本発明で採用されるアルキル基は、１〜１０の炭素原子を含む。別の実施形態では、採用されるアルキル基は、１〜８の炭素原子を含む。なお別の実施形態では、このアルキル基は１〜６の炭素原子を含む。なお別の実施形態では、このアルキル基は１〜４の炭素原子を含む。アルキルラジカルの例としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｉｓｏ−ペンチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ネオフェニル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、およびドデシルなどであり、これらは、１つ以上の置換基を保持し得る。
用語、アルコキシとは、本明細書中で使用される場合、酸素原子を介して親分子部分に結合された、飽和（すなわち、アルキル−Ｏ−）または不飽和（すなわち、アルケニル−Ｏ−およびアルキニル−Ｏ−）をいう。特定の実施形態では、このアルキル基は、１〜２０の脂肪族炭素原子を含む。特定の他の実施形態では、本発明で採用されるアルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は、１〜８の脂肪族炭素原子を含む。なおその他の実施形態では、上記アルキル基は、１〜６の脂肪族炭素原子を含む。なおその他の実施形態では、上記アルキル基は、１〜４の脂肪族炭素原子を含む。例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキソキシなどが挙げられるが、それらに限定されない。
用語、アルケニルとは、１つの水素原子を除いた、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を有する炭化水素部分に由来する、１価の基を示す。特定の実施形態では、本発明で採用されるアルケニル基は、１〜２０の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、本発明で採用されるアルケニル基は、１〜１０の炭素原子を含む。別の実施形態では、採用されるアルケニル基は、１〜８の炭素原子を含む。なおその他の実施形態では、上記アルケニル基は、１〜６の炭素原子を含む。なお別の実施形態では、上記アルケニル基は、１〜４の炭素を含む。アルケニル基は、例えば、エチニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル、などが挙げられる。
用語、アルキニルとは、本明細書中で使用される場合、１つの水素原子を取り除いた、少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を有する炭化水素に由来する、１価の基を称する。特定の実施形態では、本発明で採用されるアルキニル基は、１〜２０の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、本発明で採用されるアルキニル基は、１〜１０の炭素原子を含む。別の実施形態では、採用されるアルキニル基は、１〜８の炭素原子を含む。なおその他の実施形態では、このアルキニル基は、１〜６の炭素原子を含む。代表的なアルキニル基としては、エチニル、２−プロピニル（プロパジル）、１−プロピニル、などが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
用語、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびトリアルキルアミノは、本明細書中で使用される場合、窒素原子を介して親分子部分に結合された、それぞれ１つ、２つ、３つの上記で規定されたアルキル基を称する。用語アルキルアミノとは、構造−ＮＨＲ’を有する基を称し、ここで、Ｒ’は上記で規定されたアルキル基である；そして用語ジアルキルアミノとは、構造−ＮＲ’Ｒ’’を有する基を称し、ここで、Ｒ’およびＲ’’はアルキル基からなる群より各々独立して選択される。用語トリアルキルアミノとは、構造−ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’を有する基を称し、ここで、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’はアルキル基からなる群より各々独立して選択される。特定の実施形態では、上記アルキル基は、１〜２０の脂肪族炭素原子を含む。特定のその他の実施形態では、上記アルキル基は、１〜１０の脂肪族炭素原子を含む。なおその他の実施形態では、上記アルキル基は、１〜８の脂肪族炭素原子を含む。なおその他の実施形態では、上記アルキル基は、１〜６の脂肪族炭素原子を含む。なおその他の実施形態では、上記アルキル基は、１〜４の脂肪族炭素原子を含む。さらに、Ｒ’、Ｒ’’および／またはＲ’’’は一緒になって、必要に応じて−（ＣＨ２）ｋ−であり得、ここでｋは２〜６までの整数である。例としては、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、ジエチルアミノカルボニル、メチルエチルアミノ、イソプロピルアミノ、ピペリジノ、トリメチルアミノ、およびプロピルアミノが挙げられるが、これらに限定されない。
用語、アルキルチオエーテル、およびチオアルコキシルとは、硫黄原子を介して親分子部分に結合した、飽和（すなわち、アルキル−Ｓ−）基または不飽和（すなわち、アルケニル−Ｓ−およびアルキニル−Ｓ−）をいう。特定の実施形態では、上記アルキル基は、１〜２０の脂肪族炭素原子を含む。特定のその他の実施形態では、上記アルキル基は、１〜１０の脂肪族炭素原子を含む。なおその他の実施形態では、上記アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は、１〜８の脂肪族炭素原子を含む。なおその他の実施形態では、上記アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は、１〜６の脂肪族炭素原子を含む。なおその他の実施形態では、上記アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基は、１〜４の脂肪族炭素原子を含む。チオアルコキシ部分の例は、制限されないで、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオなどを含む。
用語、アリールとは、本明細書中で使用される場合、少なくとも１つの芳香族環を含む不飽和環状部分をいう。特定の実施形態では、アリール基は、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどが挙げられるがそれらに限定されない芳香環を、２つ以上有する単環炭素環式または二環の環状炭素系を称する。アリール基は、置換され得ないか、または、分枝したもしくは分枝していない、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアミノ、アシルアミノ、シアノ、ヒドロキシ、ハロ、メルカプト、ニトロ、カルボキシアルデヒド、カルボキシ、アルコキシカルボニル、およびカルボキサミドからなる基より選択される置換基で置換され得る。さらに、置換されたアリール基としては、テトラフルオロフェニルおよびペンタフルオロフェニルが挙げられる。
用語、カルボン酸とは、本明細書中で使用される場合、式−ＣＯ２Ｈの基を称する。
用語、ハロ、およびハロゲンとは、本明細書中で使用される場合、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素から選択される原子を称する。
用語、複素環とは、本明細書中で使用される場合、芳香族または非芳香族で部分的に不飽和または完全飽和の、３員環〜１０員環系を称し、ここでそれは３〜８原子の単一の環の大きさ、そして、芳香族の５員環または６員環アリールまたは非芳香環に縮合した芳香族の複素環式基を含み得る、二環式および三環式の環系を含む。これらの複素環は、酸素、硫黄、および窒素から独立して選択される、１〜３個のヘテロ原子を有し、ここで、窒素および硫黄のヘテロ原子は、必要に応じて酸化され得、そして窒素ヘテロ原子は、必要に応じて還元され得る。特定の実施形態では、用語複素環式は、非芳香族の５−、６−、または７−員環、または多環基をいい、ここで、少なくとも１つの環原子が、Ｏ、Ｓ、およびＮから選択されるヘテロ原子であり（ここで、この窒素ヘテロ原子およびイオウヘテロ原子は必要に応じて酸化され得る）、制限されないで、酸素、イオウ、および窒素から独立に選択される１〜３のヘテロ原子を有する縮合６員環を含む二環基または三環基を含み、ここで、（ｉ）各５員環は、０〜２の二重結合を有し、各６員環は、０〜２の二重結合を有し、そして各７員環は、０〜３の二重結合を有し、（ｉｉ）上記窒素およびイオウヘテロ原子は、必要に応じて酸化されていてもよく、（ｉｉｉ）上記窒素ヘテロ原子は、必要に応じて、四級であってもよく、そして（ｉｖ）任意の上記の複素環は、アリール環またはヘテロアリール環に縮合され得る。
用語、芳香族複素環とは、本明細書中で使用される場合、５〜１０個の環原子を有し、その１つの環原子が硫黄、酸素および窒素から選択される環芳香族ラジカルを称し；０個、１個、または２個の環原子が硫黄、酸素および窒素から独立して選択される、さらなるヘテロ原子であり；そして残る環原子は炭素であり、そのラジカルが、以下の任意の環原子を介して残る分子に結合される：例えば、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなど。芳香族複素環基は、非置換、または、分岐および非分岐のアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアミノ、アシルアミノ、シアノ、ヒドロキシ、ハロ、メルカプト、ニトロ、カルボキシアルデヒド、カルボキシ、アルコキシカルボニル、およびカルボキシアミドからなる群か選択される置換基で置換され得る。
本発明の化合物において、特定の複素環基および芳香複素環基としては：
３−メチル−４−（３−メチルフェニル）ピペラジン、３−メチルピペラジン、４−（ビス−（４−フルオロフェニル）メチル）ピペラジン、４−（ジフェニルメチル）ピペラジン、４−（エトキシカルボニル）ピペラジン、４−（エトキシカルボニルメチル）ピペラジン、４−（フェニルメチル）ピペラジン、４−（１−フェニルエチル）ピペラジン、４−（１，１−ジメチルエトキシカルボニル）ピペラジン、４−（２−ビス−（２−プロペニル）アミノ）エチル）ピペラジン、４−（２−（ジエチルアミノ）エチル）ピペラジン、４−（２−クロロフェニル）ピペラジン、４−（２−シアノフェニル）ピペラジン、４−（２−エトキシフェニル）ピペラジン、４−（２−エチルフェニル）ピペラジン、４−（２−フルオロフェニル）ピペラジン、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン、４−（２−メトキシエチル）ピペラジン、４−（２−メトキシフェニル）ピペラジン、４−（２−メチルフェニル）ピペラジン、４−（２−メチルチオフェニル）ピペラジン、４−（２−ニトロフェニル）ピペラジン、４−（２−ニトロフェニル）ピペラジン、４−（２−フェニルエチル）ピペラジン、４−（２−ピリジル）ピペラジン、４−（２−ピリミジニル）ピペラジン、４−（２，３−ジメチルフェニル）ピペラジン、４−（２，４−ジフルオロフェニル）ピペラジン、４−（２，４−ジメトキシフェニル）ピペラジン、４−（２，４−ジメチルフェニル）ピペラジン、４−（２，５−ジメチルフェニル）ピペラジン、４−（２，６−ジメチルフェニル）ピペラジン、４−（３−クロロフェニル）ピペラジン、４−（３−メチルフェニル）ピペラジン、４−（３−トリフルオロメチルフェニル）ピペラジン、４−（３，４−ジクロロフェニル）ピペラジン、４−３，４−ジメトキシフェニル）ピペラジン、４−（３，４−ジメチルフェニル）ピペラジン、４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）ピペラジン、４−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ピペラジン、４−（３，５−ジクロロフェニル）ピペラジン、４−（３，５−ジメトキシフェニル）ピペラジン、４−（４−フェニルメトキシ）フェニル）ピペラジン、４−（４−（３，１−ジメチルエチル）フェニルメチル）ピペラジン、４−（４−クロロ−３−トリフルオロメチルフェニル）ピペラジン、４−（４−クロロフェニル）−３−メチルピペラジン、４−（４−クロロフェニル）ピペラジン、４−（４−クロロフェニル）ピペラジン、４−（４−クロロフェニルメチル）ピペラジン、４−（４−フルオロフェニル）ピペラジン、４−（４−メトキシフェニル）ピペラジン、４−（４−メチルフェニル）ピペラジン、４−（４−ニトロフェニル）ピペラジン、４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ピペラジン、４−シクロヘキシルピペラジン、４−エチルピペラジン、４−ヒドロキシ−４−（４−クロロフェニル）メチルピペラジン、４−ヒドロキシ−４−フェニルピペラジン、４−ヒドロキシピロリドン、４−メチルピペラジン、４−フェニルピペラジン、４−ピペリジニルピペラジン、４−（２−フラニル）カルボニル）ピペラジン、４−（（１，３−ジオキソラン−５−イル）メチル）ピペラジン、６−フルオロ−１、２、３，４−テトラヒドロ−２−メチルキノリン、１，４−ジアザジクロヘプタン（ｄｉａｚａｃｙｌｃｌｏｈｅｐｔａｎｅ）、２,３−ジヒドロインドリル、３、３−ジメチルピペラジン、４、４−エチレンジオキシピペラジン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、アザシクロオクタン、デカヒドロキノリン、ピペラジン、ピペリジン、ピロリジン、チオモルフォリンおよびトリアゾール、が挙げられる。
用語、カルバモイルとは、本明細書中で使用される場合、式−ＣＯＮＨ２のアミド基を称する。
用語、カルボニルジオキシルとは、本明細書中で使用される場合、式−Ｏ−ＣＯ−ＯＲの炭酸基を称する
用語、炭化水素とは、本明細書中で使用される場合、水素および炭素を含む任意の化学基を称する。炭化水素は、置換されてもまたは置換されなくてもよい。炭化水素は、不飽和、飽和、分枝、非分枝、環状、多環式または複素環式であり得る。炭化水素の例示としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、アリル、ビニル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、エチニル、シクロヘキシル、メトキシ、ジエチルアミノ、などが挙げられる。当業者にとって公知なように、全ての原子価は、任意の置換の作製において満たされなければならない。
用語、置換された（置換される）（「必要に応じて」という用語により先行されるかそうでないかのいずれにせよ）および置換基、とは、本明細書中で使用される場合、当業者に理解されるように、全ての原子の原子価が維持されることを条件として、１つの官能基を別の官能基に変更する能力を称する。任意の所定の構造における１つ以上の部位が、特定の基から選択された１つ以上の置換基により置換された場合、置換基はあらゆる位置で同一かまたは異なるかのどちらかであり得る。置換基はまた、さらに置換され得る（例えば、アリール基の置換は、それ以外の別の置換基（例えば、別のアリール基）を有し得、１つ以上の位置でフッ素にさらに置換される）。
用語、チオヒドロキシルまたはチオールとは、本明細書中で使用される場合、式−ＳＨ基を称する。
用語、ウレイドとは、本明細書中で使用される場合、式−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ２のウレア基を称する。
以下は、本明細書にわたって用いられる、より一般的な用語である：
「動物」：本明細書中で使用される場合、用語、動物とは、ヒトおよび非ヒト動物（例えば、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、および魚類を含む）をいう。好ましくは、その非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、霊長目、またはブタ）である。動物は、家畜動物であり得る。動物はトランスジェニック動物でもよい。
「会合する」：本明細書中に記載される場合、２つの実体が互いに「会合する」場合、それらは、直接的または間接的な共有結合相互作用または非共有結合相互作用によって連結される。好ましくは、その会合は、共有結合である。所望の非共有結合相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気相互作用、静電相互作用などが挙げられる。
「生体適合性」：本明細書中で用いられる場合、用語「生体適合性」は、細胞に対して毒性でない化合物を記載することが意図される。インビトロでの、細胞への化合物の添加が、２０％以下の細胞死を生じ、かつそれらの化合物のインビボでの投与が、炎症性または他の有害な影響を誘導しない場合、それらの化合物は、「生体適合性」である。
「生分解性」：本明細書中に用いられる場合、「生分解性」化合物とは細胞中に導入された場合、細胞性機構または加水分解によって、再利用または処理のいずれかをし得る成分へと、細胞がその細胞に有意な毒性の影響を有することなく（すなわち、その成分がインビトロで細胞に添加された場合、約２０％未満の細胞が死滅する）分解される化合物である。その成分は、好ましくは、インビボで炎症または他の有害な影響を誘導しない。特に、好ましい実施形態において、生分解性化合物の分解が依存する化学反応は、触媒されない。
「有効量」：一般的に、活性な薬剤または薬物送達デバイスの「有効量」とは、所望の生物学的応答を誘発するのに必要な量をいう。当業者に理解されるように、薬剤またはデバイスの有効量は、所望の生物学的終点、送達される薬剤、カプセル化するマトリクスの組成物、標的の組織、などの因子に依存して変化し得る。例えば、送達されて、個体を免疫する抗原を含む微粒子の有効量とは、投与された抗原を有する生物での、感染を予防するのに十分な免疫応答を生じる量である。
「ペプチド」または「タンパク質」：本発明に従い、「ペプチド」または「タンパク質」は、ペプチド結合によって一緒に連結された、少なくとも３アミノ酸のストリングを含む。用語「タンパク質」および「ペプチド」は、互換的に用いられ得る。ペプチドは、個々のペプチドまたはペプチドの集合物を示し得る。非天然のアミノ酸化合物（すなわち天然には存在しないがポリペプチド鎖に組み込まれ得る化合物）および／または当該分野において公知であるようなアミノ酸アナログは代替的に使用され得るが、本発明のペプチドは、好ましくは、天然のアミノ酸のみを含み得る。発明のペプチドにおける１分子以上のアミノ酸は、例えば、化学的実体（例えば、炭水化物基、ホスフェート基、ファネシル基、イソファネシル基、脂肪酸基、結合、機能化、または他の修飾のためのリンカーなど）の付加によって修飾されてもよい。好ましい実施形態において、このペプチドの修飾は、より安定なペプチド（例えば、インビボでのより長い半減期）を導く。それらの修飾としては、ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の組み込みなどが挙げられる。いずれの修飾も、ペプチドの所望の生物学的活性を実質的に干渉するべきではない。
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」：ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとは、ヌクレオチドのポリマーをいう。代表的には、ポリヌクレオチドは、少なくとも３分子のヌクレオチドを含む。そのポリマーとしては、天然のヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン（ｄｅａｚａａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、７−デアザグアノシン（ｄｅａｚａｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学的に改変された塩基、生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化された塩基）、介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｂａｓｅ）、改変された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、または改変されたホスフェート基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト（５’−Ｎ−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）連鎖）が挙げられ得る。
「低分子」：本明細書中に使用される場合、用語「低分子」とは、天然に存在するかまたは人工的に作製されたか（化学合成を介して）のいずれかの、有機化合物をいい、その有機化合物は、比較的低い分子量を有し、そしてその有機化合物は、タンパク質でも、ポリペプチドでも、核酸でもない。代表的には、低分子は、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有する。低分子はまた、代表的には、炭素−炭素の多重結合を有する。公知の天然に存在する低分子としては、ペニシリン、エリスロマイシン、タキソール、サイクロスポリン、およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。公知の合成低分子としては、アンピシリン、メチシリン、スルファメトキサゾール（ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ）、およびスルホンアミドが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明によれば、後述するとおりの効果が達成される。
図１は、ｐＨ５．１およびｐＨ７．４で、３７℃での、ポリマー１〜３の分解についてのタイムプロファイルを示す。分解は、ＧＰＣデータに基づく時間にわたり分解％として表された。 図２は、ポリマー１〜３およびＰＥＩの細胞毒性プロファイルを示す。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞の生存力は、ポリマー濃度の関数として表された。ポリマー１、２、および３の分子量は、各々５８００、１１３００、および２２５００であった。使用されたＰＥＩの分子量は、２５０００であった。 図３は、アガロースゲル電気泳動における、ポリマー１によるｐＣＭＶ−Ｌｕｃ ＤＮＡの遅延を示す。各々のレーンは、異なるＤＮＡ／ポリマー分子量の比率に対応する。この比率は、以下のようである：１）１：０（ＤＮＡのみ）； ２）１：０．５； ３）１：１； ４）１：２； ５）１：３； ６）１：４； ７）１：５； ８）１：６； ９）１：７；および１０）１：８。 図４は、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃプラスミドおよびポリマー３（Ｍｎ＝３１，０００）から形成されるＤＮＡ／ポリマー複合体の平均の有効な直径を、ポリマー濃度の関数として示す。 図５は、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃプラスミドおよびポリマー３（Ｍｎ＝３１，０００）から形成されるＤＮＡ／ポリマー複合体の平均のζ−ポテンシャルを、ポリマー濃度の関数として示す。各々の複合体の数は、図４の複合体数に対応する。 図６は、ポリマー１から製作されたローダミン／デキストランで充填された微小球体のＳＥＭイメージである。 図７は、種々のｐＨ値での、ポリマー１およびＰＬＧＡ微小球体からのローダミン／デキストランの放出プロファイルを示す。矢印は、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）が、酢酸緩衝液（ｐＨ５．１）に交換された点を示す。 図８は、ａ）ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に懸濁された、ローダミン／デキストランで充填されたポリマー１微小球体の代表的な蛍光顕微鏡イメージを示す。図８ｂは、ｐＨ７．４で充填されたポリマー１微小球体のサンプルの、酢酸緩衝液（ｐＨ５．１）添加後のものを示す。酸の拡散の方向は、イメージの右上から左下である（経過時間、約５秒）。 図９は、ＤＮＡ複合体ポリマーを同定するためのゲル電気泳動アッセイを示す。レーンの注釈は、スクリーニングライブラリーの７０種類の水溶性メンバーに対応する。各々のポリマーに関して、アッセイは、１：５（左のウェル）および１：２０（右のウェル）のＤＮＡ／ポリマー比率で実施された。Ｃ＊でマークされたレーンは、ＤＮＡ単独（ポリマーなし）を含み、そしてコントロールとして用いられた。 図１０は、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ（６００ｎｇ／ウェル、ＤＮＡ／ポリマー＝１：２０）を使用するアッセイについてのトランスフェクションデータを、構造の関数として示す。光の単位は、任意であり、そして総細胞タンパク質に対して標準化されていない；実験は、３連で実施された（エラーバーは、示さず）。黒四角は、非水溶性ポリマーを表すが、白四角は、図９においてＤＮＡと複合体化しなかった水溶性ポリマーを表す。右の欄（「＊」とマークされる）は、以下のコントロール実験についての値を表示する：ポリマーなし（緑）、ＰＥＩ（赤）、およびリポフェクタミン（淡青色）。 図１１は、ポリ（β−アミノエステル）の合成を示す。ポリ（β−アミノエステル）は、一級アミン（式１）またはビス（二級アミン）（式２）のジアクリレートへの共役付加により合成され得る。 図１２は、ポリマーライブラリーの合成において用いられる種々のアミン（Ａ）およびジアクリレート（Ｂ）を示す。 図１３は、ポリマートランスフェクション効率のヒストグラムである。第１のスクリーニングにおいて、全部で２３５０のポリマーが、ｐＣＭＶ−ｌｕｃＤＮＡを、４０：１、２０：１、および１０：１のＮ：Ｐ比でＣＯＳ−７細胞に送達するそれらの能力について試験された。トランスフェクション効率は、ウェルあたりのｎｇルシフェラーゼで提示される。参考として、ＰＥＩトランスフェクション効率が示される。ＣＯＳ−７細胞は、裸のＤＮＡを容易に取り込み、そして本発明者らの条件でウェルあたり０．１５±０．０５ｎｇを生成し、そして脂質試薬リポフェクタミン２０００は、ウェルあたり１３．５±１．９ｎｇを生成する。 図１４．Ａ）ＰＥＩおよびリポフェクタミン２０００に対するトップ５０のポリマーの最適化されたトランスフェクション効率。ポリマーは、方法に記載のように試験された。最初の広範なスクリーニングでは、ｎ＝１で、４０：１、２０：１、および１０：１のＮ：Ｐ比が試験された。トップ９３を、６つの異なるＮ：Ｐ比＝（最初のスクリーニングからの最適Ｎ：Ｐ）×１．７５、１．５、１．２５、１．０、０．７５、および０．５で三重に再スクリーニングした。コントロール反応は、赤で標識され、そしてゲル電気泳動アッセイでＤＮＡを結合しなかったポリマーは、黒で示される。Ｂ）アガロース電気泳動によって決定されるときのＤＮＡ結合ポリマー。データは、以下の様式で作表された：１）完全にシフトしたＤＮＡは（＋）によって表され、２）部分的にシフトしたＤＮＡは（＋／−）によって表され、３）非結合ＤＮＡは（−）によって表される。 図１５は、増大されたグリーン蛍光タンパク質プラスミドを用いるＣＯＳ−７細胞のトランスフェクションを示す。細胞は、６００ｎｇのＤＮＡとともに（広範なスクリーニングからの最適Ｎ：Ｐ）×１．２５のＮ：Ｐ比でトランスフェクトされた。高いトランスフェクションを示すウェルの領域は、以下のポリマーについて示されている：ａ）Ｃ３６．ｂ）Ｄ９４． 図１６は、反応混合物中のアミン／ジアクリレート比を変えることにより、ポリマー分子量および鎖末端基がどのように影響されるのかを示す。（ポリスチレン標準に対する）分子量（Ｍｗ）は、有機相ＧＰＣによって決定された。＞１のアミン／ジアクリレート比で合成されたポリマーは、アミン末端基を有し、そして＜１のアミン／ジアクリレート比で合成されたポリマーは、アクリレート末端基を有する。 図１７は、ポリマー分子量、ポリマー／ＤＮＡ比（ｗ／ｗ）、およびポリマー末端基の関数として、Ｐｏｌｙ−１についてのルシフェラーゼトランスフェクション結果を示す。（Ａ）アミン末端鎖；（Ｂ）アクリレート末端鎖。（ｎ＝４、誤差バーは示されていない）。 図１８は、ポリマー分子量、ポリマー／ＤＮＡ比（ｗ／ｗ）、およびポリマー末端基の関数として、Ｐｏｌｙ−２についてのルシフェラーゼトランスフェクション結果を示す。（Ａ）アミン末端鎖；（Ｂ）アクリレート末端鎖。（ｎ＝４、誤差バーは示されていない）。 図１９は、ポリマー分子量、ポリマー／ＤＮＡ比（ｗ／ｗ）、およびポリマー末端基の関数として、Ｐｏｌｙ−１／ＤＮＡ複合体の細胞障害性を示す。（Ａ）アミン末端鎖；（Ｂ）アクリレート末端鎖。（ｎ＝４、誤差バーは示されていない）。 図２０は、ポリマー分子量、ポリマー／ＤＮＡ比（ｗ／ｗ）、およびポリマー末端基の関数として、Ｐｏｌｙ−２／ＤＮＡ複合体の細胞障害性を示す。（Ａ）アミン末端鎖；（Ｂ）アクリレート末端鎖。（ｎ＝４、誤差バーは示されていない）。 図２１は、ポリマー分子量、ポリマー／ＤＮＡ比（ｗ／ｗ）、およびポリマー末端基の関数として、Ｐｏｌｙ−１／ＤＮＡ複合体の相対的細胞取り込みレベルを示す。（Ａ）アミン末端鎖；（Ｂ）アクリレート末端鎖。（ｎ＝４、誤差バーは示されていない）。 図２２は、ポリマー分子量、ポリマー／ＤＮＡ比（ｗ／ｗ）、およびポリマー末端基の関数として、Ｐｏｌｙ−２／ＤＮＡ複合体の相対的細胞取り込みレベルを示す。（Ａ）アミン末端鎖（空白の矩形は、これら複合体の細胞傷害性が細胞取り込みの確実な測定を妨げた条件を表す）；（Ｂ）アクリレート末端鎖。（ｎ＝４、誤差バーは示されていない）。 図２３は、同時複合体化剤の使用によりｐｏｌｙ−１（アミン末端鎖、Ｍｗ＝１３，１００）に基づく送達ベクターのトランスフェクション活性の増大を示す。（Ａ）ポリリジン（ＰＬＬ）；（Ｂ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）。（ｎ＝４、誤差バーは示されていない）。 図２４は、同時複合体化剤の使用によりｐｏｌｙ−２（アミン末端鎖、Ｍｗ＝１３，４００）に基づく送達ベクターのトランスフェクション活性の増大を示す。（Ａ）ポリリジン（ＰＬＬ）；（Ｂ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）。（ｎ＝４、誤差バーは示されていない）。 図２５は、Ｐｏｌｙ−１／ＰＬＬ（Ｐｏｌｙ−１：ＰＬＬ：ＤＮＡ＝６０：０．１：１（ｗ／ｗ／ｗ））、Ｐｏｌｙ−２／ＰＬＬ（Ｐｏｌｙ−２：ＰＬＬ：ＤＮＡ＝１５：０．４：１（ｗ／ｗ／ｗ））、リポフェクタミン２０００（μＬ試薬：μｇＤＮＡ＝１：１）、ＰＥＩ（ＰＥＩ：ＤＮＡ １：１（ｗ／ｗ）、Ｎ／Ｐ〜８）、および裸のＤＮＡを用いるＣＯＳ−７細胞中へのＧＦＰ遺伝子移入の比較である。細胞を６ウェルプレートに接種し、そして新たな集密度まで増殖させた。細胞を複合体と１時間インキュベート（５μｇＤＮＡ／ウェル）し、その時間の後、複合体を除去し、そして新鮮な増殖培地を添加した。２日後、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによってアッセイした。（ｎ＝３、誤差バーは、１つの標準偏差を示す）。 図２６は、Ｐｏｌｙ−１／ＰＬＬを用いてトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞中のＧＦＰ発現を示す。 図２７は、Ｐｏｌｙ−１／ＰＬＬ（Ｐｏｌｙ−１：ＰＬＬ：ＤＮＡ＝６０：０．１：１（ｗ／ｗ／ｗ））を用いて４つの異なる細胞株中へのＧＦＰ遺伝子移入を示す。細胞を６ウェルプレート上に接種し、そして集密近くまで増殖させる。次いで、細胞を複合体と１時間インキュベートし（５μｇＤＮＡ／ウェル）、その時間の後、複合体を除去し、そして新鮮な増殖培地を添加した。２日後、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによってアッセイした。（ｎ＝５、誤差バーは、１つの標準偏差を示す）。 図２８は、合成におけるアミン：ジアクリレートモノマーのモル比の関数として、ポリマーＧ５の分子量（ＭｗおよびＭｎ）を示す。 図２９は、ポリマー合成におけるアミン：ジアクリレートモノマーのモル比の関数として、ポリマーＢ１４の分子量（ＭｗおよびＭｎ）を示す。 図３０は、ポリマーＢ１４とＧ５について、アミン：ジアクリレートモル比に対する分子量の関数の比較である。
（発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、β−アミノエステルポリマーに基づく改善されたポリマーカプセル化および送達系を提供する。この系は、患者、組織、器官、細胞、などに、ポリヌクレオチド、タンパク質、低分子、ペプチド、抗原、薬物、などを送達するための薬学的／薬物送達技術において用いられ得る。本発明はまた、薬学的分野および薬物送達分野で有用である「ヒット」のためのポリマーの大きなコレクションの調製およびスクリーニングを提供する。
本発明のβ−アミノエステルポリマーは、薬物送達技術における、いくつかの異なる使用を提供する。三級アミン含有骨格を有するポリマーは、ポリヌクレオチドを複合体化するために用いられ得、それによってポリヌクレオチドの送達を増強し、そしてそれらの分解を回避する。このポリマーはまた、カプセル化された薬剤を含むナノ粒子またはマイクロ粒子の形成に用いられ得る。このポリマーの生体適合性および生分解性特性に起因して、これらの形成された粒子もまた、生分解性および生体適合性であり、そしてカプセル化された薬剤の、制御され、徐放性の放出を提供するために用いられ得る。これらのポリマーが、代表的に、生理学的ｐＨで水溶液中に実質的に溶解性ではないが、ｐＨが低くなるにつれてより溶解性となるという事実により、これらの粒子はまた、ｐＨ変化に対して応答性であり得る。
（ポリマー）
本発明のポリマーは、それらの骨格に第三級アミンを含有するポリ（β−アミノエステル）およびそれらの塩である。本発明のポリマーの分子量は、５，０００ｇ／ｍｏｌから１００，０００ｇ／ｍｏｌを越え、より好ましくは、４，０００ｇ／ｍｏｌから５０，０００ｇ／ｍｏｌまでの範囲であり得る。特に好ましい実施形態において、本発明のポリマーは、比較的非細胞傷害性である。別の特に好ましい実施形態において、本発明のポリマーは、生体適合性および生分解性である。特に好ましい実施形態において、本発明のポリマーは、５．５〜７．５の範囲、より好ましくは、６．０と７．０との間のｐＫａを有する。別の特に好ましい実施形態において、ポリマーを、３．０と９．０との間、より好ましくは、５．０と８．０との間の所望されるｐＫａを有するように設計し得る。本発明のポリマーは、いくつかの理由（１）これらは、ＤＮＡおよび他の負に荷電した因子と相互作用し、ｐＨを緩衝し、エンドソモリシス（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｓｉｓ）などを生じるためのアミノ基を含有する；２）これらは、分解可能なポリエステル結合を含有する；３）これらを、市販の出発材料から合成し得る；および４）これらは、ｐＨ応答性であり、そして次世代物質を、所望されるｐＫａで操作し得る）のため、特に薬物送達について特に魅力的である。トランスフェクション効率についてのスクリーニングでは、最良に機能するポリマーは疎水性であるか、または上記ジアクリレートモノマーは疎水性であり、そして多くは、それらの構造の一部としてモノ−ヒドロキシ、ジ−ヒドロキシ側鎖および／または直線状、ビス（二級アミン）を有する。
本発明のポリマーを、一般的に、式（Ｉ）
によって規定し得る。リンカーＡおよびリンカーＢは、それぞれアミノ基およびエステル基を共有結合的に結合する原子の鎖である。これらのリンカーは、炭素原子またはへテロ原子（例えば、窒素、酸素、硫黄、など）を含有し得る。典型的に、これらのリンカーは、１〜３０原子長、より好ましくは、１〜１５原子長である。このリンカーを、種々の置換基で置換し得、置換基の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアミノ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、ハロゲン基、アリール基、複素環式基、芳香族複素環式基、シアノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボン酸基、エステル基、チオエーテル基、アルキルチオエーテル基、チオール基、およびウレイド基。当業者によって理解されるように、これらの群のそれぞれを、次々に置換し得る。Ｒ１基、Ｒ２基、Ｒ３基、Ｒ４基、Ｒ５基、Ｒ６基、Ｒ７基、およびＲ８基は、任意の化学基であり得、化学基の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアミノ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、ハロゲン基、アリール基、複素環式基、芳香族複素環式基、シアノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボン酸基、エステル基、アルキルチオエーテル基、チオール基、およびウレイド基。本発明のポリマーにおいて、ｎは、５〜１０，０００、より好ましくは、１０〜５００までの範囲の整数である。
特に好ましい実施形態において、ビス（二級アミン）は、環状構造であり、そしてこのポリマーは、一般的に、式ＩＩ：
によって示される。この実施形態において、Ｒ１およびＲ２を、式ＩＩ中に示されるように、直接的に一緒に結合する。この実施形態における本発明のポリマーの例は、式ＩＩＩおよび式ＩＶ：
を包含するが、これらに限定されない。先行する段落において上述したように、各原子の原子価を満足させる任意の化学基を、いずれかの水素原子に対して置換し得る。
別の特に好ましい実施形態において、Ｒ１基および／またはＲ２基を、リンカーＡに共有結合的に結合し、１つまたは２つの環状構造を形成する。本実施形態のポリマーは、一般的に、式Ｖ：
によって示され、ここで、Ｒ１およびＲ２の両方を、リンカーＡに結合して、２つの環状構造を形成する。環状構造は、３員環、４員環、５員環、６員環、７員環、または８員環以上であり得る。環は、ヘテロ原子を含みかつ不飽和であり得る。式Ｖのポリマーの例は、式ＶＩ、式ＶＩＩ、および式ＶＩＩＩ：
を包含する。上述のように、分子内の各原子の原子価数を満足させる任意の化学基を、いずれかの水素原子に対して置換し得る。
別の実施形態において、本発明のポリマーを、一般的に、式（ＩＸ）：
によって、規定し得る。リンカーＢは、エステル基に共有結合的に結合する原子の鎖である。このリンカーは、炭素原子またはへテロ原子（例えば、窒素、酸素、硫黄、など）を含み得る。典型的に、リンカーは、１〜３０原子長、好ましくは、１〜１５原子長そしてより好ましくは、２〜１０原子長である。特定の実施形態において、上記リンカーＢは、置換されるか、または置換されない直線状または分岐したアルキル鎖であり、好ましくは３〜１０炭素原子をもち、より好ましくは３、４、５、６、または７炭素原子をもつ。その他の実施形態では、上記リンカーＢは、置換されるか、または置換されない直線状または分岐したヘテロ脂肪族鎖であり、好ましくは３〜１０炭素原子をもち、より好ましくは３、４、５、６、または７炭素原子をもつ。特定の実施形態では、上記リンカーＢは、酸素原子および炭素原子の繰り返し単位から構成される。リンカーを、種々の置換基と置換し得、置換基の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアミノ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、ハロゲン基、アリール基、複素環式基、芳香族複素環式基、シアノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボン酸基、エステル基、チオエーテル基、アルキルチオエーテル基、チオール基、アシル基、アセチル基、およびウレイド基。当業者によって理解されるように、これらの群のそれぞれを、次々に置換し得る。Ｒ１基、Ｒ３基、Ｒ４基、Ｒ５基、Ｒ６基、Ｒ７基、およびＲ８基のそれぞれは、独立して任意の化学基であり得、化学基の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、トリアルキルアミノ基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、ハロゲン基、アリール基、複素環式基、芳香族複素環式基、シアノ基、アミド基、カルバモイル基、カルボン酸基、エステル基、アルキルチオエーテル基、チオール基、アシル基、アセチル基、およびウレイド基。特定の実施形態では、Ｒ１はヒドロキシル基を含む。その他の実施形態では、Ｒ１はアミノ基、アルキルアミノ基、またはジアルキルアミノ基を含む。本発明のポリマーにおいて、ｎは、５〜１０，０００、より好ましくは、１０〜５００までの範囲の整数である。
特定の実施形態では、本発明のポリマーは、一般に、以下のように規定される：
ここで、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ６低級アルキル、Ｃ１〜Ｃ６低級アルコキシ、ハロゲン、ＯＲおよびＮＲ２；より好ましくは、メチル、ＯＨ、またはＮＨ２からなる群から選択され；
Ｒは、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、環状、複素環、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され；
各Ｒ’は、水素、Ｃ１〜Ｃ６低級アルキル、Ｃ１〜Ｃ６低級アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、チオール、ヘテロアリール、アリール、フェニル、ヘテロ環、炭素環、およびハロゲンからなる群から独立に選択され；好ましくは、Ｒ’は、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポシキ、ヒドロキシル、アミノ、フッ素、塩素、または臭素であり；より好ましくは、Ｒ’はフッ素、水素、またはメチルであり；
ｎは、３と１０，０００との間の整数であり；
ｘは、１と１０との間の整数であり；好ましくは、ｘは、２と６との間の整数であり；
ｙは、１と１０との間の整数であり；好ましくは、ｘは、２と６との間の整数であり；
およびその誘導体および塩。
特定の実施形態では、本発明のポリマーは、一般に、以下のように規定される：
ここで、Ｘは、Ｃ１〜Ｃ６低級アルキル、Ｃ１〜Ｃ６低級アルコキシ、ハロゲン、ＯＲおよびＮＲ２；より好ましくは、メチル、ＯＨ、またはＮＨ２からなる群から選択され；
Ｒは、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、環状、複素環、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され；
各Ｒ’は、水素、Ｃ１〜Ｃ６低級アルキル、Ｃ１〜Ｃ６低級アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、チオール、ヘテロアリール、アリール、フェニル、ヘテロ環、炭素環、およびハロゲンからなる群から独立に選択され；好ましくは、Ｒ’は、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポシキ、ヒドロキシル、アミノ、フッ素、塩素、または臭素であり；より好ましくは、Ｒ’はフッ素、水素、またはメチルであり；
ｎは、３と１０，０００との間の整数であり；
ｘは、１と１０との間の整数であり；好ましくは、ｘは、２と６との間の整数であり；
ｙは、１と１０との間の整数であり；好ましくは、ｙは、２と６との間の整数であり；
ｚは、１と１０との間の整数であり；好ましくは、ｚは、２と６との間の整数であり；
およびその誘導体および塩。
別の実施形態において、本発明のポリマー中のビス（アクリル酸エステル）単位を、ビス（アクリル酸エステル）単位（Ａ’〜Ｇ’）の以下の群：
から選択する。特定の実施形態において、このポリマーは、ビス（アクリル酸エステル）Ｇ’を含有する。
別の実施形態において、本発明のポリマー中のビス（アクリレートエステル）単位は、以下の群のビス（アクリレートエステル）単位（Ａ〜ＰＰ）から選択される：
この群において特に好ましいビス（アクリレートエステル）は、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｍ、Ｏ、Ｕ、ＡＡ、ＩＩ、ＪＪ、ＫＫ、およびＬＬを含む。
別の実施形態では、本発明のポリマー中のアミンを、アミン（１’〜２０’）の以下の群：
から選択する。特定の実施形態において、このポリマーは、アミン５’を含有する。他の実施形態において、このポリマーは、アミン１４’を含有する。
別の実施形態では、本発明のポリマー中のアミンは、以下の群のアミン（１〜９４）から選択される。
特定の実施形態では、これらポリマーは、アミン６、８、１７、２０、２４、２５、２８、３２、３６、６０、６１、７０、７５、８０、８６、８７、８９、９３、または９４を含む。
本発明のポリマーの特定の例は、以下：
を含有する。
その他の特に有用なポリ（β−アミノエステル）は以下を含む：
その他の特に有用なポリ（β−アミノエステル）は、Ｃ８６、Ｄ６０、Ｄ６１、Ｕ９４、Ｆ３２、Ｆ２８、ＪＪ３６、ＪＪ３２、ＬＬ６、ＬＬ８、Ｕ２８、Ｅ２８、Ｕ３６、Ｅ３６、Ｕ３２、Ｅ３２、Ｃ９４、Ｆ９４、ＪＪ９４、Ｕ２８、ＪＪ８６、Ｃ８６、Ｕ８６、Ｅ８６、Ｃ８０、Ｅ８０、ＪＪ８０、Ｕ８０、Ｄ２４、Ｅ２４、ＪＪ２４、Ｂ１７、ＩＩ２８、ＩＩ３６、ＩＩ３２、Ｃ２０、ＪＪ２０、Ｅ２０、Ｃ２５、Ｕ２５、Ｄ２５、Ｄ７０、Ｄ２８、Ｄ３２、Ｄ３６、Ｄ９３、Ｕ８７、Ｄ８７、Ｃ７５、Ｕ７５、Ｏ２０、Ｏ２８、Ｃ９４、ＡＡ２０、ＡＡ２８、Ｄ８６、Ｆ８６、ＡＡ３６、ＡＡ２４、ＡＡ９４、Ｏ２４、ＡＡ６０、Ａ６１、Ｃ３２、ＪＪ２８、Ｃ２８、ＪＪ２０、Ｄ９４、Ｕ３２、Ｄ２４、Ｃ３６、Ｅ２８、Ｄ３６、Ｕ９４、Ｅ２４、Ｅ３２、Ｄ２８、Ｕ３６、Ｅ８０、Ｅ３６、ＪＪ８０、Ｅ９４、Ｄ９３、Ｂ１７、Ｍ１７、ＡＡ６１、Ｕ９３、およびＣ２５を含む。
特に好ましい実施形態において、リンカーＡおよびリンカーＢの１つまたは両方は、ポリエチレンポリマーである。別の特に好ましい実施形態において、リンカーＡおよびリンカーＢの１つまたは両方は、ポリエチレングリコールポリマーである。他の生体適合性ポリマー、生分解性ポリマーを、リンカーＡおよびリンカーＢの１つまたは両方として使用し得る。
特定の好ましい実施形態では、本発明のポリマーは末端がアミンである。その他の実施形態では、本発明のポリマーは、末端がアクリレートである。主に、このポリマーの末端単位は、ポリマー合成反応におけるアミン対アクリレートの比によって決定される。過剰のアミンモノマーは、末端がアミンのポリマーを生じる。そして過剰のアクリレートモノマーは、末端がアクリレートのポリマーを生じる。
特定の実施形態では、本発明のポリマーの平均分子量は、１，０００ｇ／モル〜５０，０００ｇ／モル、好ましくは２，０００ｇ／モル〜４０，０００ｇ／モル、より好ましくは５，０００ｇ／モル〜２０，０００ｇ／モル、そしてなおより好ましくは１０，０００ｇ／モル〜１７，０００ｇ／モルの範囲である。本発明のポリマーは、ステップ重合により調製されるので、代表的には、広い統計的分布の鎖長さが得られる。特定の実施形態では、ポリマーサンプル中の分子量の分布は、当該技術分野で公知の精製および単離工程によって狭められる。ポリマーの分子量はまた、ポリマーの合成によって変動し、例えば、アミンモノマーの量が増加するとき、得られるポリマーの分子量は減少する。その他の実施形態では、上記ポリマー混合物は、異なる分子量のポリマーのブレンドであり得る。
別の特に好ましい実施形態において、本発明のポリマーは、共重合体であり、ここで、反復単位の１つが、本発明のポリ（β−アミノエステル）である。共重合体において使用されるべき他の反復単位は、ポリエチレン、ポリ（グリコリド−コ−ラクチド）（ＰＬＧＡ）、ポリグリコール酸、ポリメタクリレート、などを含むが、これらに限定されない。
（ポリマーの合成）
本発明のポリマーを、当該分野において公知の任意の方法によって調製し得る。好ましくは、ポリマーを、市販の出発材料から調製する。別の好ましい実施形態において、ポリマーを、容易および／または安価に調製された出発材料から調製する。
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリマーを、ビス（アクリル酸エステル）に対するビス（二級アミン）の共役付加によって調製する。この反応スキームを以下：
に示す。本発明の方法において有用であるビス（二級アミン）モノマーは、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、ピペラジン、２−メチルピペラジン、１，２−ビス（Ｎ−エチルアミノ）エチレン、および４，４’−トリメチレンジピペリジンを含むが、これらに限定されない。本発明において有用であるジアクリル酸モノマーは、１，４−ブタンジオールジアクリレート、１，４−ブタンジオールジメタクリレート、１，２−エタンジオールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、１，５−ペンタンジオールジアクリレート、２，５−ヘキサンジオールジアクリレート、および１，３−プロパンジオールジアクリレートを含むが、これらに限定されない。モノマーのそれぞれを、有機溶媒（例えば、ＴＨＦ、ＣＨ２Ｃｌ２、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、ＣＨＣｌ３、ヘキサン、トルエン、ベンゼン、ＣＣｌ４、グライム（ｇｌｙｍｅ）、ジエチルエーテル、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなど）、好ましくはＤＭＳＯ中に溶解する。得られた溶液を合わせ、そして反応混合物を加熱して、所望されるポリマーを得る。その他の実施形態では、上記反応は、溶媒の使用なくして実施され（すなわちニート）、それによって合成後に溶媒を除去する必要性を未然に防ぐ。次いで、この反応混合物は、３０℃〜２００℃、好ましくは４０℃〜１５０℃、より好ましくは５０℃〜１００℃の範囲の温度まで加熱される。特に好ましい実施形態において、反応混合物を、約４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、または９０℃まで加熱される。別の特に好ましい実施形態において、反応混合物を、約７５℃まで加熱される。別の実施形態では、上記反応混合物は、約１００℃まで加熱される。重合反応をまた、触媒し得る。反応時間は、重合反応および反応条件に依存して数時間〜数日の範囲であり得る。当業者によって認識され得るように、反応を加熱することは、反応の速度をスピードアップする傾向があり、より短い反応時間にする。特定の実施形態では、上記ポリマー合成は、約６０℃で約２日間の間ＤＭＳＯ中で実施される。その他の実施形態では、上記ポリマー合成は、溶媒なくして９５℃で８〜１６時間実施される。当業者によって理解されるように、合成ポリマーの分子量を、合成に用いる反応条件（例えば、温度、出発材料、濃度、触媒、溶媒、反応時間など）によって決定し得る。
別の特に好ましい実施形態において、本発明のポリマーを、ビス（アクリル酸エステル）への第一級アミンの共役付加によって調製する。ビス（第二級アミン）ではなく第一級アミンの使用は、非常に多種多様な市販の出発材料を可能にする。第二級アミンではなく第一級アミンを使用する反応スキームを、以下：
に示す。
この方法において有用な第一級アミンは、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、アニリン、置換アニリン、およびエタノールアミンを含むが、これらに限定されない。この方法において有用なビス（アクリル酸エステル）は、１，４−ブタンジオールジアクリレート、１，４−ブタンジオールジメタクリレート、１，２−エタンジオールジアクリレート、１，６−ヘキサンジオールジアクリレート、１、５−ペンタンジオールジアクリレート、２，５−ヘキサンジオールジアクリレート、および１，３−プロパンジオールジアクリレートを含むが、これらに限定されない。モノマーのそれぞれを、有機溶媒（例えば、ＴＨＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＣＨ２Ｃｌ２、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、ＣＨＣｌ３、ヘキサン、ＣＣｌ４、グライム、ジエチルエーテル、など）中に溶解する。有機溶媒は、加水分解へのポリエステルの感受性に起因して好まれる。好ましくは、用いられる有機溶媒は、生存システムでは比較的非毒性である。特定の実施形態では、ＤＭＳＯが有機溶媒として用いられる。なぜなら、それは比較的非毒性であり、かつ、しばしば細胞培養において、および細胞の凍結ストックを貯蔵することで溶媒として用いられているからである。その他の好ましい溶媒は、ＤＭＳＯ、エタノール、およびメタノールのような水と混和可能なような溶媒を含む。好ましくは０．０１Ｍと５Ｍとの間、約０．１Ｍと２Ｍとの間、より好ましくは０．５Ｍと２Ｍとの間、そして最も好ましくは１．３Ｍと１．８Ｍとの間の濃度であるモノマーの得られる溶液が合わせられ、そして反応混合物を加熱して、所望されるポリマーを得る。特定の実施形態では、この反応は、溶媒なしで行われる。溶媒なしで重合を行うことは、分子間共役付加反応から生じる結晶産物の量を減少し得る。この重合は、２０℃〜２００℃、好ましくは４０℃〜１００℃、より好ましくは５０℃〜７５℃、なおより好ましくは５０℃〜６０℃の範囲の温度で行われ得る。特に好ましい実施形態において、反応混合物を、２０℃で維持する。別の特に好ましい実施形態において、反応混合物を、約５０℃まで加熱する。いくつかの実施形態では、上記反応混合物は、約５６℃まで加熱される。なお別の特に好ましい実施形態において、反応混合物を、約７５℃まで加熱する。反応混合物をまた、約０℃まで冷却し得る。重合反応をまた、例えば、有機金属触媒、酸、または塩基を用いて触媒し得る。別の好ましい実施形態において、１つ以上のタイプのアミンモノマーおよび／またはジアクリレートモノマーを、重合反応において使用し得る。例えば、エタノールアミンおよびエチルアミンの組み合わせを使用して、エチルアミン単独を使用して調製したポリマーよりもより親水性で、さらにエタノールアミン単独を使用して調製したポリマーよりもより疎水性のポリマーを調製し得る。
本発明のポリマーを調製する際に、反応混合物中のモノマーは、異なる比で組み合わせられ得、得られるポリマーの分子量、収率、末端の終結などに影響する。アミンモノマーのジアクリレートモノマーに対する比は、１．６〜０．４、好ましくは１．４〜０．６、より好ましくは１．２〜０．８、なおより好ましくは１．１〜０．９の範囲であり得る。特定の実施形態では、アミンモノマーのジアクリレートモノマーに対する比は、約１．４、１．３、１．２、１．１、１．０５０、１．０２５、１．０、０．９７５、０．９５０、０．９００、０．８００、および０．６００である。例えば、１：１の比でモノマーを組み合わせることは、代表的には、より大きい分子量のポリマーおよびより高い全体の収率を生じる。また、過剰のアミンモノマーを提供すること（すなわち、アミン／アクリレート比＞１）は、末端がアミンの鎖を生じ、その一方、過剰のアクリレートモノマーを提供すること（すなわち、アミン／アクリレート比＜１）は、末端がアクリレートの鎖を生じる。ポリマー合成におけるアクリレートモノマーに対するアミンモノマーの比は、ポリマー鎖がどのように終結するか、生成されるポリマーの分子量、分子量の分布、および架橋の程度に影響し得る。
この合成されたポリマーは、当該分野において公知の、任意の技術（沈殿、結晶化、抽出、クロマトグラフィーなどが挙げられるが、これらに限定されない）によって精製され得る。特に好ましい実施形態において、このポリマーは、有機溶媒（例えば、ジエチルエーテル、ヘキサンなど）中で繰り返される沈殿によって精製される。特に好ましい実施形態において、このポリマーは、塩酸、リン酸塩、酢酸塩、またはその他の塩として単離される。好ましくは、この塩は、特定の実施形態では、薬学的に受容可能である。得られるポリマーはまた、さらなる精製および単離なしとして用いられ得：それによって、これらポリマーを評価することに用いられるアッセイと適合する溶媒を用いることを有利にする。例えば、これらポリマーは、ＤＭＳＯのような比毒性溶媒中で調製され得、そして得られるポリマーの溶液は、次いで、核酸を細胞中にトランスフェクトすることを含む細胞培養アッセイ中で用いられ得る。当業者により認識されるように、この合成されたポリマーの分子量および架橋度は、その合成で使用される反応条件（例えば、温度、開始物質、濃度、アミンの当量、アクリレートの当量、添加の順序、溶媒など）により決定され得る（Ｏｄｉａｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ 第３版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９１；Ｓｔｅｖｅｎｓ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 第２版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９０；これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。調製されたポリマーの架橋の程度は、１〜２０％、好ましくは１〜１０％、より好ましくは１〜５％、そして最も好ましくは２％未満まで最小にされ得る。当業者によって認識され得るように、求核基をもつアミンまたはビス（アクリレートエステル）は、架橋をより受け易く、そして温度を低くすること、または反応混合物中の出発物質の濃度を変化することのような、架橋を低減するための手段が取られることが必要であり得る。アクリレート、および不飽和またはハロゲンをもつその他の成分はまた、架橋に至り得るラジカル重合を受け易い。ラジカル重合および架橋の程度は、反応混合物の温度を低下することにより、または当該技術分野で公知のその他の手段により低減され得る。
１つの実施形態において、異なるポリマーのライブラリーが、並行して調製される。ポリマーのライブラリーの合成は、当該技術分野で公知であるか、または本発明のポリマーの合成に関して本明細書中に記載の任意の教示を用いて実施され得る。１つの実施形態では、特定のアミン／アクリレート比の１つの異なるアミンおよび／またはビス（アクリレートエステル）を、このライブラリーを調製するために用いられる、バイアル１セット中の各々のバイアルまたはマルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）中の各ウェルに添加する。１つの実施形態では、これらモノマーは、ＤＭＳＯのような有機溶媒中、０．１Ｍと５Ｍとの間、より好ましくは０．５Ｍと２Ｍとの間に、そして最も好ましくは約１．６Ｍに希釈される。これらモノマーは、異なる比で組み合わせられ得、分子量、収率、末端の終結に影響する。例えば、１：１の比でこれらモノマーを組み合わせることは、代表的には、より大きな分子量のポリマーおよびより高い全体収率を生じる。過剰のアミンモノマーを提供することは、末端がアミンの鎖を生じ、その一方、過剰のアクリレートモノマーを提供することは、末端がアクリレートの鎖を生じる。いくつかの実施形態では、ポリマーの合成で溶媒は用いられない。バイアルまたはマルチウェルプレートのアレイは、本明細書中に記載のように、このモノマーの重合が生じることを許容するために十分な温度および期間において、インキュベートする。特定の好ましい実施形態では、時間および温度は、すべてのモノマーのポリマーへのほぼ完全な取り込み（例えば、５０％変換、７５％変換、８０％変換、９０％変換、９５％変換、＞９５％変換、９８％変換、９９％変換、または＞９９％変換）を行うように選択される。この重合反応は、０℃〜２００℃の範囲の任意の温度で行われ得る。１つの実施形態において、この反応混合物を、約４５℃で約５日インキュベートする。別の実施形態では、反応混合物は、約５６℃で約５日間インキュベートされる。別の実施形態では、反応混合物は、約１００℃で約５時間の間インキュベートされる。次いで、このポリマーを単離し得、そして当該分野において公知の技術を用いて精製し得るか、または得られるポリマーの溶液は、さらなる単離または精製なくして用いられ得る。特定の実施形態では、１０００を超える異なるポリマーが並行して調製される。その他の実施形態では、２０００を超える異なるポリマーが並行して調製される。なおその他の実施形態では、３０００を超える異なるポリマーが並行して調製される。次いでこのポリマーを、所望された特性（例えば、水への溶解度、異なるｐＨにおける溶解度、種々の有機溶媒中の溶解度、ポリヌクレオチオドを結合する能力、ヘパリンを結合する能力、低分子を結合する能力、微粒子を形成する能力、トランスフェクション効率を増大させる能力など）を有するポリマーを同定するために、高処理技術を用いてスクリーニングし得る。本発明のポリマーは、合成後、ポリマーのさらなる沈殿、精製、または単離なくしてスクリーニングまたは用いられ得る。ポリマーの合成におけるＤＭＳＯのような非毒性溶媒の使用は、ポリマー合成後のポリマーの容易な取り扱いおよび使用を可能にする。例えば、ＤＭＳＯ中のポリマーの溶液は、細胞培養物またはその他の生存システムに細胞に対する毒性なしに添加され得る。特定の実施形態において、このポリマーを、遺伝子治療に有益な性質または特性（例えば、ポリヌクレオチドに結合する能力、トランスフェクション効率の増大など）について、スクリーニングされ得る。他の実施形態において、このポリマーは、スクリーニングされ得る。組織工学の分野において有益な性質または特性（例えば、組織または細胞増殖を支持する能力、細胞接着を促進させる能力）について、スクリーニングされ得る。特定の実施形態では、これらポリマーは、半自動化技法および／またはロボット工学流体取り扱いシステムを用いて合成かつアッセイされ得る。
（ポリヌクレオチド複合体）
カチオン性化合物が静電相互作用を介して、負に荷電したポリヌクレオチドと相互作用する能力は、周知である。ポリ（リジン）のようなカチオン性ポリマーが調製され、そしてポリヌクレオチドを複合体化する能力について研究がなされてきた。しかし、現在まで研究されたポリマーは、短く立体配置的にフレキシブルな側鎖（例えばポリ（リジン））の末端に組み込まれたアミン、または、球形または球状ポリアミン（例えば、ＰＥＩおよびＰＡＭＡＭデンドリマー）の表面上の接近可能なアミンを有する。ポリヌクレオチドとこのポリマーとの相互作用は、このポリヌクレオチドの分解を、少なくとも部分的に妨げると考えられる。ポリヌクレオチドの骨格上で電荷を中性にすることによって、中性の複合体またはわずかに正に荷電した複合体はまた、細胞の疎水性膜（例えば、細胞質膜、リソソーム膜、エンドソーム膜、核膜）を、より容易に通過し得る。特に好ましい実施形態において、この複合体は、わずかに正に荷電している。別の特に好ましい実施形態において、この複合体は、正のζ−ポテンシャルを有し、より好ましくは、ζ−ポテンシャルは＋１〜＋３０の間である。特定の実施形態では、ポリアクリル酸（ｐＡＡ）、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、またはポリマレイン酸のような試薬を用いて、血清をともなう培地中の培養された細胞中のポリヌクレチド／ポリマー複合体の血清阻害を防ぎ得る（Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら「インビトロおよびインビボ遺伝子送達のための高度に荷電したポリアニオンを用いたカチオン性ＤＮＡ複合体の再装填」Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：２６１〜２７１、２００３；本明細書中に参考として援用される）。
本発明のポリ（β−アミノエステル）は、ポリマーの骨格において３級アミンを所有する。これらのアミンは、より多く妨害されるが、ポリヌクレオチドと相互作用するのに利用可能である。ポリヌクレオチドまたはそれらの誘導体は、ポリヌクレオチド／ポリマー複合体を形成するのに適した条件下で、本発明のポリマーと接触される。特定の実施形態では、ポリマー中の窒素（Ｎ）のポリヌクレオチド中のリン酸に対する比は、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１１０：１、または１２０：１である。特定の実施形態では、ポリマー／ＤＮＡ（ｗ／ｗ）比は、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１１０：１、１２０：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１または２００：１である。このポリマーは、好ましくは、負に荷電したポリヌクレオチドと複合体を形成するために少なくとも部分的にプロトン化される。より好ましい実施形態としては、このポリヌクレオチド／ポリマー複合体は、細胞へのポリヌクレオチドの送達において有用である、ナノ粒子を形成する。特に好ましい実施形態としては、ナノ粒子の直径は、５０〜５００ｎｍの範囲であり、より好ましくは、ナノ粒子の直径は、５０〜２００ｎｍの範囲であり、および最も好ましくは、ナノ粒子の直径は、９０〜１５０ｎｍの範囲である。このナノ粒子は、下記に述べられるような標的化薬剤と結合され得る。
特定の実施形態では、その他の試薬がポリヌクレオチド：ポリ（β−アミノエステル）複合体に添加され得る。特定の実施形態では、同時複合体化剤が用いられる。同時複合体化剤は、ポリヌクレオチドに結合、そして／またはトランスフェクション効率を増加することが知られている。同時複合体化剤は、通常、高い窒素密度を有する。ポリリジン（ＰＬＬ）およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、ポリマー性同時複合体化剤の２つの例である。ＰＬＬは、６５の分子量／窒素原子の比を有し、そしてＰＥＩは、４３の分子量／窒素原子の比を有する。１０〜１００、好ましくは２５〜７５、より好ましくは４０〜７０の範囲の分子量／窒素原子の比をもつ任意のポリマーが同時複合体化剤として有用であり得る。複合体中に同時複合体化剤を含めることは、この複合体中にポリ（β−アミノエステル）の量を低減することを可能にし得る。これは、ポリ（β−アミノエステル）がより高い濃度で細胞傷害性である場合特に重要になる。同時複合体化剤とともに得られる複合体において、ポリヌクレオチドに対する同時複合体化剤の比（ｗ／ｗ）は、０〜２．０、好ましくは０．１〜１．２、より好ましくは０．１〜０．６、そしてなおより好ましくは０．１〜０．４の範囲であり得る。
本発明の種々の複合体のトランスフェクション性質は、インビトロトランスフェクション研究（例えば、培養細胞中のＧＦＰトランスフェクション）によって、または動物モデルで決定され得る。特定の実施形態では、トランスフェクションのために用いられる複合体は、特定の細胞タイプ、送達されるべきポリヌクレオチド、ポリ（β−アミノエステル）、同時複合体化剤（それが用いられる場合）、疾患プロセス、投与の方法（例えば、吸入、経口、非経口、ＩＶ、くも膜下内など）、投薬養生法などについて最適化される。
（ポリヌクレオチド）
本発明のポリマーにより複合体化またはカプセル化されるポリヌクレオチドは、任意の核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡが挙げられるが、これらに制限されない）であり得る。このポリヌクレオチドは、任意の大きさまたは配列であり得、これらは一本鎖または二本鎖であり得る。特定の好ましい実施形態においては、このポリヌクレオチドは、１００塩基対より長い。特定の他の好ましい実施形態においては、このポリヌクレオチドは、１０００塩基対より長く、１０，０００塩基対より長くあり得る。このポリヌクレオチドは、好ましくは精製され、そして実質的に純粋である。好ましくは、このポリヌクレオチドは、５０％より高く純粋であり、より好ましくは７５％より高く純粋であり、および最も好ましくは９５％より高く純粋である。このポリヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の手段において提供され得る。特定の好ましい実施形態においては、組換え技術（これらの技術のより詳細な記述については、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）を参照されたい；これら各々は、本明細書中で参考として援用される）を用いて、操作されている。このポリヌクレオチドはまた、天然供給源から得られ得、および天然で普通にみられる混入成分から精製され得る。このポリヌクレオチドはまた、実験室で化学的に合成され得る。好ましい実施形態としては、このポリヌクレオチドは、標準的な固相化学を用いて合成される。
このポリヌクレオチドは、化学的手段または生物学的手段により改変され得る。特定の好ましい実施形態としては、これらの改変は、このポリヌクレオチドの増大した安定性を導く。改変としては、メチル化、リン酸化、末端キャッピングなどが挙げられる。
ポリヌクレオチド誘導体もまた、本発明に使用され得る。これらの誘導体は、ポリヌクレオチドの塩基、糖、および／またはリン酸結合において改変を含む。改変された塩基としては、以下のヌクレオシドアナログ中に見出される塩基が挙げられるが、これらに限定されない：２−アミノアデノシン、２−チオシミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチル−ウリジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン。改変された糖としては、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、３’−アジド−２’，３’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、アラビノース（リボースの２’−エピマー）、非環式糖およびヘキソースが挙げられるが、これらに限定されない。このヌクレオシドは、天然に存在するＤＮＡおよびＲＮＡで見出されるリン酸ジエステル結合以外の結合によって共に一列になり得る。改変された結合としては、ホスホロチオネート結合および５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合が挙げられるが、これらに限定されない。種々の改変の組み合わせが、１つのポリヌクレオチド中で用いられ得る。これらの改変されたポリヌクレオチドは、当該分野において公知の任意の手段により提供され得る；しかし当業者により認識されるように、これらの改変されたポリヌクレオチドは、好ましくはインビトロでの合成化学を用いて調製される。
送達されるべきポリヌクレオチドは、任意の形態であり得る。例えば、このポリヌクレオチドは、環状プラスミド、線状プラスミド、コスミド、ウイルスゲノム、改変されたウイルスゲノム、人工染色体などであり得る。
このポリヌクレオチドは、任意の配列であり得る。特定の実施形態においては、このポリヌクレオチドは、タンパク質またはペプチドをコードする。このコードされるタンパク質は、酵素、構造タンパク質、レセプター、可溶性レセプター、イオンチャンネル、薬学的に活性なタンパク質、サイトカイン、インターロイキン、抗体、抗体フラグメント、抗原、凝固因子、アルブミン、成長因子、ホルモン、インシュリンなどであり得る。このポリヌクレオチドはまた、遺伝子の発現を制御するための調節領域を含み得る。これらの調節領域としては、プロモーター、エンハンサーエレメント、リプレッサーエレメント、ＴＡＴＡボックス、リボソーム結合部位、転写終結部位などが挙げられるが、これらに限定されない。他の好ましい実施形態においては、このポリヌクレオチドは、タンパク質をコードすることを意図されない。例えば、このポリヌクレオチドは、トランスフェクトされる細胞のゲノムにおいてエラーを修正するために用いられ得る。
このポリヌクレオチドはまた、アンチセンス因子またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６−８１１，１９９８；本明細書中で参考として援用する）として提供され得る。アンチセンス治療は、例えば、細胞ｍＲＮＡおよび／もしくはゲノムＤＮＡまたはこれらの変異体と、例えば細胞条件下で特異的にハイブリダイズ（例えば、結合）して、コードされたタンパク質の発現を、例えば、転写および／もしくは翻訳を阻害することにより、阻害する、一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチド、またはその誘導体を投与することあるいはインサイチュで提供することを包含する。（Ｃｒｏｏｋｅ「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇｓ」Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４８９（１）：３１−４４，１９９９；Ｃｒｏｏｋｅ「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｒｕｇｓ」Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１０（２）：１２３−１２６，ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ １２７，２０００；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ,３１３−３１４巻，１９９９；これら各
々と、本明細書中で参考として援用する）。この結合は、従来の塩基対相補性によってであり得、または例えば、ＤＮＡ２重鎖への結合の場合、２重らせんの主溝での特異的相互作用を介して（すなわち、三重らせん形成）であり得る（Ｃｈａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５（４）：２６７−２８２，１９９７；本明細書中で参考として援用する）が挙げられる。
特に好ましい実施形態においては、送達されるポリヌクレオチドは、抗原性ペプチドまたは抗原性タンパク質をコードする配列を含む。これらのポリヌクレオチドを含むナノ粒子は、その後の感染の機会を減少させ、そして／またはそのような感染に関連した症状を減少させるのに十分な、免疫学的応答を誘導するために、個体に送達され得る。これらのワクチンのポリヌクレオチドは、インターロイキン、インターフェロン、サイトカインおよびアジュバント（例えば、コレラ毒素、ミョウバン、フロイントアジュバントなど）と合わされ得る。多数のアジュバント化合物が公知である；このような多くの化合物の有用な概論は、米国国立衛生協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により作成されており、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ（ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｎｉａｉｄ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄａｉｄｓ／ｖａｃｃｉｎｅ／ｐｄｆ／ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ．ｐｄｆ，本明細書中で参考として援用される）上で見出され得る（Ａｌｌｉｓｏｎ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：３−１１，１９９８；Ｕｎｋｅｌｅｓｓら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２５１−２８１，１９９８；およびＰｈｉｌｌｉｐｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ １０：１５１−１５８，１９９２（これら各々は、本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと）。
ポリヌクレオチドによりコードされる抗原タンパク質または抗原ペプチドは、以下に由来し得る：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉなどの細菌生物；天然痘、Ａ型インフルエンザおよびＢ型インフルエンザ、ＲＳウイルス、パラインフルエンザ、はしか、ＨＩＶ、水痘帯状疱疹、１型単純疱疹および２型単純疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、ポリオウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、狂犬病、風疹、コクサッキーウイルス、ウマの脳脊髄炎、日本脳炎、黄熱病、リフトバレー熱、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、およびＥ型肝炎ウイルスなどのウイルス；ならびに真菌類、原生動物および寄生生物（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉなど）。
（微粒子）
本発明のポリ（β−アミノエステル）はまた、薬物送達デバイスを形成するために使用され得る。本発明のポリマーは、ポリヌクレオチド、低分子、タンパク質、ペプチド、金属、有機金属化合物などを含む薬剤をカプセル化するために使用され得る。本発明のポリマーは、それらを特に薬物送達デバイスの調製に適応させるいくつかの特性を有する。これらは、以下を含む：１）ポリマーを複合体化する能力、および不安定な薬剤を「保護する」能力；２）エンドソームにおいてｐＨを緩衝させる能力；３）「プロトンスポンジ」として作用し、そしてエンドソーム溶解を引き起こす能力；および４）負に荷電した薬剤における電荷を中和する能力。好ましい実施形態において、このポリマーは、送達されるべき薬剤を含む微粒子を形成するために使用される。特に好ましい実施形態において、微粒子の直径は５００ｎｍ〜５０μｍの間の範囲、より好ましくは１μｍ〜２０μｍ、そして最も好ましくは１μｍ〜１０μｍの範囲に及ぶ。別の特に好ましい実施形態において、この微粒子は、１〜５μｍの範囲に及ぶ。本発明のカプセル化ポリマーは、他のポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＰＬＧＡ）と組み合わされてミクロスフェアを形成し得る。
（微粒子の調製方法）
本発明の微粒子は、当該分野で公知の任意の方法を用いて調製され得る。これらの方法としては、噴霧乾燥、単回および２回のエマルジョン溶媒エバポレーション、溶媒抽出、相分離、単純および複雑なコアセルベーション、および当業者に周知の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。粒子を調製する特に好ましい方法は、２回のエマルジョンプロセスおよび噴霧乾燥である。微粒子調製に使用される条件は、所望のサイズまたは性質（例えば、疎水性、親水性、外部形態、「粘性」、形状など）の粒子を得るために変更され得る。使用される微粒子の調製方法およびその条件（例えば、溶媒、温度、濃度、空気循環速度など）はまた、カプセル化される薬剤および／またはポリマーマトリックスの組成物に依存し得る。
カプセル化された薬剤送達のための微粒子を製造するために開発された方法は、文献に記載されている（例えば、それぞれが本明細書中に参考として援用されている、Ｄｏｕｂｒｏｗ，Ｍ．、編、「Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ」ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、１９９２；ＭａｔｈｉｏｗｉｔｚおよびＬａｎｇｅｒ、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ５：１３−２２、１９８７；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ６：２７５−２８３、１９８７；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら．Ｊ．Ａｐｐｌ．ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．３５：７５５−７７４、１９８８；を参照のこと）。
上記の方法のいずれかにより調製される粒子が、所望の範囲外のサイズの範囲を有する場合、その粒子は、例えばふるいを用いて、サイズをそろえ得る。
（薬剤）
本発明の系により送達されるべき薬剤は、治療薬、診断剤、または予防薬であり得る。個体に投与されるべき任意の化学化合物は、本発明の微粒子を用いて送達され得る。この薬剤は、低分子、有機金属化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、金属、同位体標識化学化合物、薬物、ワクチン、免疫学的薬剤などであり得る。
好ましい実施形態において、その薬剤は、薬学的活性を有する有機化合物である。本発明の別の実施形態において、その薬剤は、臨床的に使用される薬物である。特に好ましい実施形態において、その薬物は、抗生物質、抗ウイルス剤、麻酔剤、ステロイド剤、抗炎症剤、抗新生物剤、抗原、ワクチン、抗体、うっ血除去剤、抗高血圧剤、鎮静剤（ｓｅｄａｔｉｖｅ）、避妊剤、プロゲステロン剤、抗コリン作動性剤、鎮痛剤（ａｎａｌｇｅｓｉｃ）、抗鬱剤、抗精神病剤、β−アドレナリン遮断剤、利尿剤、心臓血管活性剤、血管作用剤、非ステロイド系抗炎症薬剤、栄養剤などである。
本発明の好ましい実施形態において、送達されるべき薬剤は、薬剤の混合物であり得る。例えば、局所麻酔剤は、抗炎症剤（例えば、ステロイド）との組み合わせにより送達され得る。局所麻酔剤はまた、血管作用剤（例えば、エピネフリン）と一緒に投与され得る。別の例を示すと、抗生物質は、一般に抗性物質（例えば、ペニシリンおよびクラブラン酸）を不活化する細菌によって産生される酵素のインヒビターと組み合わされ得る。
診断剤としては、ガス；金属；ポジション放出断層撮影（ＰＥＴ）、コンピュータ補助断層撮影（ＣＡＴ）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影、Ｘ線、透視検査、および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に使用される市販の造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）；ならびに造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ ａｇｅｎｔ）が挙げられる。ＭＲＩにおける造影剤としての使用のための適切な物質の例としては、ガドリニウムキレート、ならびに鉄、マグネシウム、マンガン、銅、およびクロムが挙げられる。ＣＡＴおよびｘ線画像に有用な物質の例としては、ヨードベースの物質が挙げられる。
予防剤としては、抗生物質、栄養補充剤、およびワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。ワクチンは、単離されたタンパク質またはペプチド、不活化された生物およびウイルス、死んだ生物およびウイルス、遺伝的に変更された生物またはウイルス、ならびに細胞抽出物を含み得る。予防剤は、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、およびアジュバンド（例えば、コレラ毒素、ミョウバン、フロイントのアジュバンドなど）と組み合わされ得る。予防剤は、以下のような抗原を含む：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｃａｍｐｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉなどの細菌生物の抗原；天然痘、Ａ型インフルエンザおよびＢ型インフルエンザ、ＲＳウイルス、パラインフルエンザ、はしか、ＨＩＶ、水痘帯状疱疹、１型単純疱疹および２型単純疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、パピローマウイルス、ポリオウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、狂犬病、風疹、コクサッキーウイルス、ウマの脳脊髄炎、日本脳炎、黄熱病、リフトバレー熱、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、およびＥ型肝炎ウイルスなどのウイルスの抗原；真菌類、原生動物および寄生生物の抗原（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉなど）。これらの抗原は、完全な死滅生物、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、またはそれらの組み合わせの形態であり得る。
（標的化剤）
特定の細胞、細胞の塊または組織を標的とすることがしばしば所望されるので、本発明の微粒子およびナノ粒子は、標的化剤を含むように改変され得る。薬学的組成物を特定の細胞に指向させる種々の標的化剤は、当該分野で公知である（例えば、本明細書中で参考として援用されている、Ｃｏｔｔｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ．２１７：６１８、１９９３）。この標的化剤は、粒子を至る所に含み得るか、または表面上にのみ存在し得る。この標的化剤は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、脂質、低分子などであり得る。この標的化剤は、特定の細胞または組織を標的にするために使用され得るか、あるいは、粒子のエンドサイトーシスまたは貪食作用を促進するために使用され得る。標的化剤の例としては、抗体、抗体のフラグメント、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、トランスフェリン、アシアリコタンパク質（ａｓｉａｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇｐ１２０エンベロープタンパク質、炭水化物、レセプターリガンド、シアル酸などが挙げられるが、これらに限定されない。標的化剤が粒子の至る所に含まれる場合、その標的化剤は、粒子を形成するために使用される混合物中に含まれ得る。その標的化剤が表面上にのみ存在する場合、その標的化剤は、（すなわち、共有結合、疎水性、水素結合、ファンデルワールス、または他の相互作用による）標準的な化学技術を用いて形成された粒子と結合し得る。
（薬学的組成物）
一旦、微粒子またはナノ粒子（ポリヌクレオチドにより複合体化されたポリマー）が調製されると、それらは、ヒトを含む動物への投与に適する薬学的組成物を形成するために、１つ以上の薬学的賦形剤と組み合わされ得る。当業者によって理解されるように、その賦形剤は、以下に記載されるような投与経路、送達される薬剤、薬剤送達の時間経過などに基づいて選択され得る
本発明の薬学的組成物および本発明に従う使用のための薬学的組成物は、薬学的に受容可能な賦形薬またはキャリアを含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性で、不活性な固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化物質または任意の型の処方補助剤を意味する。薬学的に受容可能なキャリアとして役に立ち得る物質のいくつかの例は、ラクトース、グルコース、およびスクロースのような糖；コーンスターチおよびポテトスターチのようなデンプン；セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースのようなセルロース誘導体；粉末トラガカントゴム；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬ワックスのような賦形薬；ピーナツ油、綿花油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、コーン油および大豆油のような油；プロピレングリコールのようなグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルのようなエステル；寒天；Ｔｗｅｅｎ８０のような界面活性剤；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムのような緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質を含まない水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムのような他の非毒性適合性潤滑剤であり、そして、着色剤、放出剤、コーティング薬剤、甘味剤、香味剤および香料、保存剤および抗酸化剤もまた、調合者の判断に従って、この組成物中に存在し得る。本発明の薬学的組成物を、経口的、直腸的、非経口的、槽内的、膣内的、鼻孔内的、腹腔内的、局所的（粉末、クリーム、軟膏、または点滴による投与として）、頬粘膜的、または経口的スプレーまたは鼻腔的スプレーとして、ヒトおよび／または動物へ投与し得る。
経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルが挙げられる。活性成分（例えば、微小粒子、ナノ粒子、ポリヌクレオチド／ポリマー複合体）に加えて、液体投薬形態は、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿花油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物のような当該技術分野で一般に使用されている不活性な希釈剤を含み得る。不活性な希釈剤の他にも、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、ならびに香料のようなアジュバントもまた含み得る。
注射可能調製物（例えば、滅菌注射可能水性懸濁液または油性懸濁液）を、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用する既知の技術に従って、処方し得る。滅菌注射可能調製物はまた、非毒性の経口的に受容可能な希釈液または溶媒中の、滅菌注射可能溶液、懸濁液、またはエマルジョン（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）であり得る。受容可能なビヒクルおよび溶媒の中で、使用され得るのは、水、リンゲル溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として通常使用される。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意のブランドの不揮発性油を、使用し得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸を、注射可能物の調製で使用する。特に好ましい実施形態において、粒子を１％（ｗ／ｖ）のカルボキシメチルセルロースナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０を含むキャリア流体中に懸濁する。
注射可能な処方物を、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、または使用前に、滅菌水もしくは他の滅菌注射可能媒体中に溶解もしくは分散され得る滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、滅菌し得る。
直腸投与または膣投与のための組成物は、好ましくは坐剤であり、これは、粒子を、周囲温度では固体であるが体温では液体であり、従って、直腸腔または膣腔中で融解し、そして微粒子を放出する安定な非刺激性の賦形剤またはキャリア（例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックス）と混合することによって調製され得る。
経口投与のための固体投薬形態としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が挙げられる。そのような固体投薬形態において、粒子を、少なくとも一つの不活性な薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリア（例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム）、および／またはａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および珪酸のような充填剤または増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシアのような結合剤、ｃ）グリセロールのような湿潤剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモでん粉またはタピオカでん粉、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤、ｅ）パラフィンのような溶液遅延剤、ｆ）四級アンモニウム化合物のような吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイトクレーのような吸収剤、ならびにｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物のような潤滑剤と混合する。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合において、投薬形態はまた緩衝剤も含み得る。
類似した型の固体組成物を、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、軟質充填ゼラチンカプセルおよび硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤としても使用し得る。
錠剤、糖衣剤、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体投薬形態を、腸溶性コーティングおよび薬学的処方物の技術分野で周知である他のコーティングのようなコーティングおよび殻と共に調製し得る。これらは必要に応じて、不透明化剤を含み得、これらはまた、活性成分のみを、すなわち優先的に、腸管の特定の部位で、必要に応じて、遅延した様式で放出する組成物であり得る。使用され得る包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
類似した型の固体組成物を、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、軟質充填ゼラチンカプセルおよび硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤としても使用し得る。
発明の薬学的組成物の局所的投与または経皮的投与のための投薬形態としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、散剤、溶液、スプレー、吸入剤、またはパッチが挙げられる。滅菌条件下で、粒子を薬学的に受容可能なキャリアおよび必要とされ得る場合、任意の必要な保存剤または緩衝液と混合する。眼用調製物、点耳剤、および点眼剤はまた、本発明の範囲内にあることが企図される。
軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、本発明の粒子に加えて、動物脂肪および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、珪酸、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物のような賦形剤を含み得る。
散剤およびスプレーは、本発明の粉末に加えて、ラクトース、タルク、珪酸、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含み得る。スプレーは、さらにクロロフルオロ炭化水素のような通常の噴霧剤を含み得る。
経皮的パッチは、身体への化合物の制御された送達を提供するさらなる利点を有する。そのような投薬形態を、微小粒子またはナノ粒子を適切な媒体へ溶解または分散することによって、作製し得る。吸収促進剤を、皮膚を通した化合物の流れを増加するのにもまた使用し得る。この速度を、速度制御膜を提供することによってか、または粒子をポリマーマトリクスもしくはゲルに分散することによってのどちらかで制御し得る。
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の実施例の考慮によってさらに理解される。これら実施例は、本発明のある特定の実施形態を例示することを意図され、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を制限することを意図されない。
（実施例）
（実施例１−分解可能なポリ（β−アミノエステル）：合成、特徴付け、およびプラスミドＤＮＡとの自己会合）
（実験の項）
（一般的考察）
生存細胞または滅菌物質を含む全ての操作を、標準的な滅菌技術を使用して、層流中で行った。１Ｈ ＮＭＲ（３００．１００ＭＨｚ）および１３Ｃ ＮＭＲ（７５．４６７ＭＨｚ）スペクトルを、Ｖａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ分光光度計で、記録した。全ての化学シフト値を、ｐｐｍで表し、溶媒由来の残余プロトンシグナルまたは炭素シグナルと照会する。有機相ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ イソクラチックポンプ、１００μＬインジェクションループを有するＲｈｅｏｄｙｎｅ Ｍｏｄｅｌ ７１２５インジェクター、および直列に連結した二つのＰＬ−Ｇｅｌ混合Ｄカラム（５μｍ，３００×７．５ｍｍ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）を使用して、実行した。ＴＨＦ／０．１Ｍピペリジンを、溶出液として１．０ｍＬ／分の流速で使用した。データをＯｐｔｉｌａｂ ＤＳＰ干渉屈折計（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用して収集し、そして、ＴｒｉＳＥＣ ＧＰＣソフトウェアパッケージ（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して処理した。ポリマーの分子量および多分散性を、単分散性ポリスチレン標準と相対的に報告する。水相ＧＰＣを、Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｌおよび直列に連結した１２０Ａカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ）によって、実行した。水（１％酢酸、０．３Ｍ ＮａＣｌ）を、１．０ｍＬ／分の流速で、溶出液として使用した。データをＫｎａｕｅｒ差動屈折計を用いて収集し、ＩＢＭ／ＰＣ ＧＰＣ−ＰＲＯ ３．１３ソフトウェアパッケージ（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して処理した。ポリマーの分子量および多分散性を、ポリ（２−ビニルピリジン）標準と相対的に報告する。細胞毒性アッセイについて、吸光度を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを５６０ｎｍで使用して、測定した。
（材料）
Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、ピペラジン、および４，４’−トリメチレンジピペリジンを、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。１，４−ブタンジオールジアクリレートを、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）から購入した。（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。プラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５α，Ｚｙｃｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡからの好意による贈与物）において産生し、Ｑｉａｇｅｎキットを使用して単離し、そして、エタノール沈殿によって精製した。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、そして、ダルベッコの改変イーグル培地、９０％；ウシ血清アルブミン、１０％；ペニシリン、１００単位／ｍｌ；ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ中で、３７℃、５％ＣＯ２で増殖した。他の全ての材料および溶媒をさらなる精製をせずに入手したままで使用した。
（一般的重合手順） 代表的実験では、１，４−ブタンジオールジアクリレート（０．７５０ｇ、０．７１４ｍＬ、３．７８ｍｍｏｌ）およびジアミン（３．７８ｍｍｏｌ）を２つの別個のバイアルに量りとり、そしてＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解した。ジアミンを含む溶液を、ピペットを介してジアクリレート溶液に添加した。Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）でコーティングした攪拌バーを添加し、そしてこのバイアルを、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）で裏打ちしたスクリューキャップでシールし、そして反応物を５０℃で加熱した。４８時間後、反応物を室温まで冷まし、そして激しく攪拌しているジエチルエーテルまたはヘキサン中にゆっくりと滴下した。ポリマーを収集し、そして分析の前に減圧下で乾燥させた。
（ポリマー１の合成） ポリマー１を、上記で概説した一般的手順に従って調製した。１Ｈ ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）４．１１（ｂｒ ｔ，４Ｈ）、２．７５（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．０５Ｈｚ，４Ｈ）、２．５３（ｂｒ ｓ，４Ｈ）、２．５０（ｂｒ ｔ，（実測値）、Ｊ＝７．２０Ｈｚ，４Ｈ）、２．２８（ｂｒ ｓ，６Ｈ）、１．７１（ｂｒ ｍ，４Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３，７５．４７ＭＨｚ）１７２．５５、６４．１４、５５．３１、５３．３９、４２．４７、３２．５４、２５．５３。
（ポリマー２の合成） ポリマー２を、上記で概説した一般的手順に従って調製した。１Ｈ ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）４．１１（ｂｒ ｔ，４Ｈ）、２．７４（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．３５，４Ｈ）、２．５６（ｂｒ ｍ，１２Ｈ）、１．７１（ｂｒ ｔ，４Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３，７５．４７ＭＨｚ）１７２．２４、６４．１９、５３．５５、５２．７５、３２．２７、２５．５２。
（ポリマー３の合成） ポリマー３を、上記で概説した一般的手順に従って調製した。１Ｈ ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）４．１１（ｂｒ ｔ，４Ｈ）、３．００（ｂｒ ｍ，４Ｈ）、２．７９（ｂｒ ｍ，４Ｈ）、２．６５（ｂｒ ｍ，４Ｈ）、２．１１（ｂｒ ｍ，４Ｈ）、１．７０（ｂｒ ｍ，８Ｈ）、１．２５（ｂｒ ｍ，１２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ δ（ＣＤＣｌ３，７５．４７ＭＨｚ）１７２．３７、６４．１３、５３．８９（ｂｒ）、３６．７４、３５．５８、３２．１１（ｂｒ）、２５．４５、２４．０５。
（ポリマー分解研究） ポリマー１〜３の塩酸塩を、酢酸緩衝液（１Ｍ、ｐＨ＝５．１）またはＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中に、５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した（ミリモル濃度の緩衝液の使用は、酸性分解産物の生成に起因して、分解の間のｐＨの実質的低下をもたらした）。サンプルを、機械的ローテータで３７℃でインキュベートし、そしてアリコート（１ｍＬ）を適切な時間間隔で取り出した。アリコートを、液体窒素中で直ちに凍結し、そして凍結乾燥した。ポリマーを、乾燥した緩衝塩から、ＴＨＦ／０．１Ｍピペリジン（１ｍＬ）を用いて抽出し、そしてサンプルをＧＰＣによって直接分析した。
（ＤＮＡ／ポリマー複合体の形成およびアガロースゲル遅延アッセイ） ＤＮＡ／ポリマー複合体を、ポリマー１〜３の塩酸塩の穏やかにボルテックスしている溶液に、５０μＬのプラスミドＤＮＡ溶液（ｐＣＭＶ Ｌｕｃ、水中で２μｇ／５０μＬ）（２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ＝６．０）中５０μＬ、濃度を調整して、所望のＤＮＡ／ポリマー重量比を生じた）を添加することによって形成した。サンプルを室温で３０分間インキュベートし、その後、２０μＬを１％アガロースゲル（ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ、ｐＨ＝７．２、６５Ｖ、３０分間）に泳動した。サンプルを、ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ、ｐＨ＝７．２）中の１０％ Ｆｉｃｏｌｌ ４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）からなるローディング緩衝液とともにゲルにロードした。ブロモフェノールブルーを、視覚的指示薬としてローディング緩衝液中に含めなかった。なぜなら、この荷電した染料は、ポリマーとＤＮＡとの複合体化を妨害するようであるからである。ＤＮＡバンドを、臭化エチジウム染色によってＵＶ照明下で可視化した。
（準弾性レーザ光散乱（ＱＥＬＳ）およびζ電位の測定） ＱＥＬＳ実験およびζ電位の測定を、ＺｅｔａＰＡＬＳ動的光散乱検出器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｙ．、１５ｍＷレーザ、入射ビーム＝６７６ｎｍ）を用いて行った。ＤＮＡ／ポリマー複合体を、アガロースゲル遅延アッセイについて上記のとおりに形成させた。ＤＮＡ／ポリマー複合体の穏やかにボルテックスしているサンプルに添加して、サンプルを９００μＬのＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ、ｐＨ＝７．０）で希釈した（総容量＝１ｍＬ、ｐＨ＝７．０）。平均粒径およびζ電位を、２５℃で決定した。相関関数を、９０°の散乱角で収集し、そして粒径を、２５℃での純水の粘度および屈折率を用い、ＢＩＣの粒子分粒ソフトウェア（ｖｅｒ．２．３０）のＭＡＳオプションを用いて計算した。粒径を、対数正規分布とみなした有効直径として表す。平均電気泳動移動度を、ＢＩＣ ＰＡＬＳ ζ電位分析ソフトウェアを用いて２５℃で測定し、そしてζ電位を、水性懸濁物に関するＳｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｙモデルを用いて計算した。３回の測定を各サンプルについて行った。そして結果を平均直径およびζ電位として報告する。
（細胞傷害性アッセイ） 不死化したＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、９６ウェルプレートにおいて１０，０００細胞／ウェルの初期播種密度で、２００μＬ増殖培地（９０％ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）中で増殖させた。細胞を２４時間にわたって増殖させ、その後、増殖培地を除去し、そして１８０μＬの無血清培地と交換した。適切な量のポリマーを、２０μＬアリコートにおいて添加した。サンプルを３７℃で５時間にわたってインキュベートし、そして各ウェルの代謝活性を、ＭＴＴ／チアゾリルブルーアッセイを用いて決定した：各ウェルに、ＭＴＴストック溶液の無菌ＰＢＳ緩衝液中５ｍｇ／ｍＬ溶液（２５μＬ）を添加した。サンプルを３７℃で２時間にわたってインキュベートし、そして１００μＬの抽出緩衝液（ＤＭＦ／水（１：１）中２０％ ｗ／ｖ ＳＤＳ、ｐＨ＝４．７）を各ウェルに添加した。サンプルを３７℃で２４時間インキュベートした。光学吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて５６０ｎｍで測定し、そしてコントロール細胞に対するパーセントとして表現した。
（結果および考察）
（ポリマー合成および特徴付け）
骨格に三級アミンを含む直鎖状ポリ（アミドアミン）の合成は、Ｆｅｒｒｕｔｉらによって、１９７０年に、ビスアクリルアミドへの二官能性アミンの添加（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｎａｔｕｒｅ ３９２（補遺）：２５−３０，１９９６；Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１４４−１４７，１９９６；Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０，１９９５；Ｍｕｌｌｉｇａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２，１９９３；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を介して報告された。直鎖状ポリ（アミドアミン）は、ヘパリンおよびイオン錯体化生体物質として最初に調査された（Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５８：５５−９２，１９８４；Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １５：１２３５−１２４１，１９９４；Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００：１６４４−１６５４，１９９９；Ｆｅｒｒｕｔｉら Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １５：１２３５−１２４１，１９９４；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。樹状ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）は、ＤＮＡと複合体化する能力に起因して遺伝子移入適用における使用の増加が見られた（Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：４８９７−４９０２，１９９６；Ｔａｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．７：７０３−７１４，１９９６；Ｈａｅｎｓｌｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４：３７２−３７９，１９９３；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。そして、近年の報告には、細胞のトランスフェクションおよび細胞傷害性研究への、直鎖状ポリ（アミドアミン）のファミリーの適用が記載されている（Ｈｉｌｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４２７：１６１−１７４，１９９９；本明細書中に参考として援用される）。対照的に、ジアクリレートエステルへの二官能性アミンのＭｉｃｈａｅｌ型付加から形成された類似のポリ（エステルアミン）は、それほど注目されていない（Ｄａｎｕｓｓｏら、Ｐｏｌｙｍｅｒ １１：８８−１１３，１９７０；Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ｐｏｌｙｍｅｒ ２６：１３３６，１９８５；Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５８：５５−９２，１９８４；Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １５：１２３５−１２４１，１９９４；Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００：１６４４−１６５４，１９９９；Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １５：１２３５−１２４１，１９９４；Ｋａｒｇｉｎａら、Ｖｙｓｏｋｏｍｏｌ．Ｓｏｅｄｉｎ．Ｓｅｒｉｙａ Ａ ２８：１１３９−１１４４，１９８６；Ｒａｏら、Ｊ．Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ １４：５４−６３，１９９９；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。
ポリ（アミノエステル）アプローチは、いくつかの理由に関して、新たなポリマートランスフェクションベクターの開発についての特に魅力的な基礎を表す：１）ポリマーは、必要なアミンおよび容易に分解可能な結合を含む、２）複数のアナログは、市販の出発物質から直接、潜在的に合成され得る、そして３）得られるポリマーがＤＮＡ縮合剤として有用である場合、将来の世代のポリマーを容易に操作して、生理学的に適切なｐＨの範囲に及ぶアミンｐＫａ値を保有するようにし得る。この最後の点は、特に興味をそそった。なぜなら、ポリアミンの緩衝化能力は、エンドサイトーシス後に細胞のエンドソームからのＤＮＡの逸脱に影響を与える要因として近年示されたからである（Ｂｏｕｓｓｉｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７２９７−７３０１，１９９５；Ｈａｅｎｓｌｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４：３７２−３７９，１９９３；Ｂｅｈｒ、Ｃｈｉｍｉａ ５１：３４−３６，１９９７；Ｄｅｍｅｎｅｉｘら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｆｅｌｇｎｅｒら編），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６，１４６−１５１頁；Ｋａｂａｎｏｖら、Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｆｒｏｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。カチオン性ポリマーとのＤＮＡの複合体化は、トランスフェクションプロセスにおける最初の事象の間にＤＮＡをコンパクトにして保護するために必要とされるが、ＤＮＡおよびポリマーは、核において最終的に脱複合体化（ｄｅｃｏｍｐｌｅｘ）されて、効率的な転写を可能にしなければならない（Ｌｕｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３３−３７，２０００；本明細書中に参考として援用される）。この必要要件を考慮すると、分解性ポリカチオンは、核における「ベクターの脱パッケージング（ｕｎｐａｃｋａｇｉｎｇ）」事象において重要な役割を果たし得る（Ｌｕｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３３−３７，２０００；Ｓｃｈａｆｆｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６７：５９８−６０６，２０００；Ｋａｂａｎｏｖ、Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２：３６５−３７２，１９９９；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。最終的に、本発明者らは、この一般構造のポリマーおよびそれらがおそらく分解して得られるβ−アミノ酸誘導体は、ポリ（リジン）およびＰＥＩよりも毒性が有意に低いと仮定した。上記で概説したように、分解性ポリカチオン（Ｐｕｔｎａｍら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：３６５８−３６６２，１９９９；Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３−５６３９，１９９９；Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：６５２４−６５２５，２０００；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）およびポリマー骨格付近に位置する比較的隠れたアミンを含む直鎖状ポリマー（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：１０６８−１０７４，１９９９；本明細書中に参考として援用される）は、ポリ（リジン）およびＰＥＩよりも毒性が低い。
ビス（２級アミン）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、ピペラジン、および４，４’−トリメチレンジピペリジンの１，４−ブタンジオールジアクリレートへの付加を介するポリマー１〜３の合成を、調査した（Ｄａｎｕｓｓｏら、Ｐｏｌｙｍｅｒ １１：８８−１１３、１９７０；Ｋａｒｇｉｎａら、Ｖｙｓｏｋｏｍｏｌ．Ｓｏｅｄｉｎ．Ｓｅｒｉｙａ Ａ ２８：１１３９−１１４４、１９８６；これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。これらのモノマーの重合は、５０℃でのＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２中で行い、８６％までの収率で対応するポリマーを得た（表１）。ジエチルエーテルまたはヘキサンの中で沈殿を繰り返し、ポリマーを、精製した。ポリマー１を、清浄な粘稠性の液体として単離した；ポリマー２およびポリマー３を、高減圧下での乾燥後、白い固形物として得た。あるいは、ポリマー１〜３を、ＴＨＦまたはＣＨ２Ｃｌ２中のポリマー溶液に対しジエチルエーテル／塩酸を添加する際の固体の塩酸塩として単離し得る。３つのポリマーは全て、ＴＨＦ、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨＣｌ３およびＭｅＯＨのような有機溶媒に可溶性であり、これらのポリマーはまた、ｐＨの低下した水にも可溶性であった。ポリマー１およびポリマー１〜３の塩酸塩は、水に溶けやすかった。
ポリマー１〜３の分子量およびそれらの対応する塩酸塩の分子量を、有機相ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）および水相ゲル透過クロマトグラフィーの両方によって決定した。ポリスチレン標準と比較して、ポリマーの分子量（Ｍｎ）は、ポリマー１について５，８００まで、ポリマー３について３２，０００までにわたった。これらのポリマーの分子量分布は、１．５５〜２．５５にわたる多分散性指標（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｉｃｅ）（ＰＤＩ）を有する単一様式（ｍｏｎｏｍｏｄａｌ）であった。代表的な分子量データを、表１に示す。線状ポリ（アミドアミン）の合成は、通常溶媒としてアルコールまたは水を使用して行われる（Ｄａｎｕｓｓｏら、Ｐｏｌｙｍｅｒ １１：８８−１１３、１９７０；Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ｐｏｌｙｍｅｒ ２６：１３３６、１９８５；Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５８：５５−９２、１９８４；Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １５：１２３５−１２４１、１９９４；Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００：１６４４−１６５４、１９９９；Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １５：１２３５−１２４１、１９９４；これらの各々は本明細書中に参考として援用される）が、合成の間の加水分解反応を最小化するため、無水のＴＨＦおよびＣＨ２Ｃｌ２を、ポリ（β−アミノエステル）の合成において使用した。ＣＨ２Ｃｌ２を溶媒として使用して合成されたポリマーの収量および分子量は、概してＴＨＦ中で合成されたこれらのポリマーのものより高かった（表１）（ポリマ−１を、ＣＨ２Ｃｌ２中で合成し得なかった。反応溶液の呈色は、ＣＨ２Ｃｌ２中のＮ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンを溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２中の１，４−ブタンジオールジアクリル酸溶液への導入のほぼ直後に無色から強いピンク色になった（上記の実験項を参照のこと）。呈色は、反応過程を通して明るいオレンジへと変わり、オレンジ色のポリマーを、ヘキサン中での沈殿の後に単離した。単離したポリマーは、ＣＨ２Ｃｌ２中、ＴＨＦ中、および低下したｐＨの水中で不溶性であり、そして構造的に特徴付けられなかった。この問題は、ＴＨＦ中での類似の反応については起こらなかった。）。
ポリマー１〜３の構造を、１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲ分光法によって確認した。これらのデータは、２級アミンの、１，４−ブタンジオールジアクリル酸のアクリル酸部分への共役付加を介するが、本発明者らの条件下ではアミド結合の形成を介さずに、これらのポリマーが形成されることを示す。さらに、ポリマーの骨格において新らたに形成される３級アミンは、分岐形成またはポリマーの架橋を導く、その後のジアクリレートモノマーとの付加反応には関与しない。この好都合な結果は、ビス（２級アミン）モノマーから産生されるこの型のポリマーに独特のようである。モノマーとして二官能性の１級アミン（例えば、１，４−ジアミノブタン）を使用する類似のポリマーの合成は、条件が明確に制御されない場合、分岐形成ポリマーおよび不溶性の架橋型ポリマーネットワークの形成を導き得る。
ポリマー１〜３の骨格内のアミンおよびエステルの近接の観点から、本発明者らは、加水分解がポリマーに対し急速に起こるので実際に用い得ないことを最初に懸念した。例えば、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）およびポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］は、それぞれおよそ２時間（Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３−５６３９、１９９９；本明細書中に参考として援用される）および３０分（Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：６５２４−６５２５、２０００；本明細書中に参考として援用される）の半減期を有し、中性付近のｐＨにおいてかなり迅速に分解する（このような迅速な分解時間は、これらのポリマーの遺伝子送達のための適用を不可能にはしない。（参考文献として、Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３−５６３９、１９９９；Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：６５２４−６５２５、２０００を参照のこと；これらの各々は本明細書中に参考として援用される）しかし、極端に迅速な分解速度は、通常、分解性ポリマーの操作、保存、および適用に関するさらなる懸念をもたらす。）。しかし、溶出剤として１％酢酸／水を用いる水性ＧＰＣによるポリマー１およびポリマー２の分析は、酸性の媒体中では、分解が十分に遅いことを明らかにした。例えば、これらの条件下で４〜５時間にわたってサンプル化されたポリマー１およびポリマー２のＧＰＣトレースは、分子量または多分散性において変化がないことを明らかにした（ポリマー３は、水性ＧＰＣによって分析し得なかった）。本発明者らはまた、ポリマー１〜３の塩酸塩の単離の間に、骨格の有意な加水分解が起こり得ることを懸念した。これらのポリマーのプロトン付加および単離の間における加水分解を防止するために、無水溶媒を使用し、そして反応を、アルゴン雰囲気の下で行った。プロトン付加の前および後でのポリマーの分析は、観測可能な加水分解がないことを明らかにした。例えば、１．０Ｍジエチルエーテル／ＨＣｌを用いたＣＨ２Ｃｌ２からの沈殿後のポリマー３のサンプルのＧＰＣトレース（Ｍｎ＝１５，３００；ＰＤＩ＝１．９０）は、プロトン付加の前のポリマー（Ｍｎ＝１５，７００；ＰＤＩ＝１．９２）と見かけ上同一の分子量であり、そしてより低分子量種が存在しなかった（ＴＨＦ／０．１Ｍピペリジンを溶出剤として使用し、比較のためのＧＰＣデータを、収集した（上記の実験項を参照のこと）。ポリマーのＨＣｌ塩は、ＴＨＦ中で不溶性であったが、ＴＨＦ／０．１Ｍピペリジン中では、注入の前に濾過された微細な白色沈殿生成物を伴い可溶性であった。ポリマー１〜３の固体サンプルを、検出可能な分子量の減少なしに数ヶ月間貯蔵し得た。
ポリマー１〜３を、ポリマー骨格中のエステル結合の加水分解によって分解するように特に設計した。しかし、これらのポリマーの総合的な安定性および生体適合性に関するさらなる懸念は、生理学的条件下で逆マイケル反応を介して起こる望ましくない分解についての可能性である。これらのポリマーが、アクリレートエステルに対する２級アミンのマイケル型反応を経て合成されるので、特に酸性条件下において、これらポリマーが逆マイケル反応により遊離のアクリレート基を再生し得る可能性がある。アクリレートエステルは、潜在的なＤＮＡ−アルキル化剤であり、従って、発癌物質として疑われる（最近の例として、Ｓｃｈｗｅｉｋｌら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．４３８：Ｐ７１−Ｐ７８、１９９９；Ｙａｎｇら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １９：Ｐ１１１７−Ｐ１１２５、１９９８を参照のこと；これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。これらのポリマーが、トランスフェクションの間に、細胞のエンドソーム小胞の中でのｐＨの低下した環境（ｐＨ＝５．０〜５．５）に遭遇することが予期されるので、本発明者らは、逆マイケル経路を介して生じる、これらのポリマーが分解する可能性に対処した。
極端な酸性条件下（ｐＨ＜３）または極端な塩基性条件下（ｐＨ＞１２）において、ポリマー１〜３は、迅速かつ専ら１，４−ブタンジオール、および１Ｈ ＮＭＲ分光法により決定されるような予期されるビス（β−アミノ酸）副生成物４ａ〜６ａに分解した。これらの条件下における逆マイケル付加についての分光学的な証拠は、検出されなかった。ビス（β−アミノ酸）分解産物４ａ〜６ａは、アクリレートが通常、より低く活性化されたマイケル付加のパートナーであるようには、逆マイケル反応を受けそうにはない（Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ，Ｐ．、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ａｄｄｉｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ
ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９２；本明細書中に参考として援用される）。これらの条件下において化合物４ａ〜６ａのさらなる分解は、観測されなかった。
ポリマー分解の速度論を、トランスフェクションの間にこれらのポリマーによって遭遇しそうな条件の範囲において調査した。エンドソーム小胞および細胞質の中の環境のｐＨに近づけるために、分解を、それぞれｐＨ５．１およびｐＨ７．４の値で緩衝して、３７℃でモニターした。ポリマー１〜３の塩酸塩を、適切な緩衝液に添加し、３７℃でインキュベートし、そしてアリコートを、適切な時期に回収した。アリコートを直ちに凍結し、凍結乾燥し、そしてＧＰＣによる分析のためにポリマーをＴＨＦ／０．１Ｍピペリジン中に抽出した。図１は、時間の関数としてのポリマー１〜３の分解プロフィールを示す。ポリマーは、ｐＨ７．４でよりもｐＨ５．１においてより穏やかに分解した。ポリマー１〜３は、ｐＨ５．１において類似の分解プロフィールを示し、各ポリマーは、およそ７〜８時間の半減期を有した。対照的に、ポリマー１および３は、ｐＨ７．４において５時間未満で完全に分解した。これらの結果は、他のアミン含有ポリエステル（例えば、ポリ（４−ヒドロキシＬ−プロリンエステル））のｐＨ分解プロフィールと一致し、ここで片方のアミンの官能基が、分子内求核性触媒として作用し、高いｐＨにおいてより迅速な分解に寄与すると仮定される（Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３−５６３９、１９９９；Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：６５２４−６５２５、２０００；これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。分子内補助の可能性は除外し得ないが、ポリマー１〜３において第３級アミンはより求核性が低くあるべきで、これらのポリマーに対して分子内補助の可能性はなさそうである。ポリマー２の分解は、ｐＨ５．１よりｐＨ７．４でより穏やかに生じた（図１）。この異常な挙動は、おそらくｐＨ７．４におけるポリマー２の不完全な溶解性および生じた分解環境の不均一な性質に起因する（ポリマー２および３は、ｐＨ７．４では水に対し完全には可溶性ではない）。ポリマー３は、分解実験の間に比較的迅速に溶解したが、ポリマー２の固体粒子は、数日間にわたって認識可能であった。
（細胞傷害性アッセイ）
ポリ（リジン）およびＰＥＩは、ＤＮＡ凝縮剤およびトランスフェクションベクターとして広く研究され（Ｌｕｏら Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３３−３７，２０００；Ｂｅｈｒ Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：２７４−２７８，１９９３； Ｚａｕｎｅｒら Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３０：９７−１１３，１９９８；Ｋａｂａｎｏｖら Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：７−２０，１９９５；Ｂｏｕｓｓｉｆら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７２９７−７３０１，１９９５；Ｂｅｈｒ Ｃｈｉｍｉａ ５１：３４−３６，１９９７；Ｄｅｍｅｎｅｉｘ ら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、編），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６，ｐｐ．１４６−１５１；Ｋａｂａｎｏｖら、Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｆｒｏｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８；それぞれは、本明細書中に参考として援用される）、そしてしばしばポリマーベクターと比べられる標準物質である（Ｐｕｔｎａｍら Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：３６５８−３６６２，１９９９；Ｌｉｍら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３−５６３９，１９９９；Ｌｉｍら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：６５２４−６５２５，２０００；Ｇｏｎｚａｌｅｚら Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：１０６８−１０７４，１９９９；それぞれは、本明細書中に参考として援用される）。あいにく、上記に概説したように、これらポリマーはまた、有意なレベルの細胞傷害性と関連し、そして高レベルの遺伝子発現は、細胞活性力のかなりの損失によってのみ通常実現される。ポリマー１〜３の毒性プロファイルを測定するために、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞株およびポリマー１〜３の塩酸塩を用いるＭＴＴ／チアゾリル青色染料還元アッセイは、最初の指標として実行された。３Ｔ３細胞株は、新規トランスフェクションベクターについての、集合の最初のレベルのスクリーニングとして、一般に利用され、そしてＭＴＴアッセイは、細胞増殖および細胞の代謝に対する、加えられる物質の影響を測定するときに、細胞傷害性の最初の指標として一般的に使用される（Ｈａｎｓｅｎら Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１９：２０３−２１０，１９８９；本明細書中で参考として援用される）。
細胞を、実験の部に記載されるように、ポリマー１（Ｍｎ＝５８００）、ポリマー２（Ｍｎ＝１１３００）およびポリマー３（Ｍｎ＝２２５００）と共にインキュベートした。図２に示されるように、これらのポリマーと共にインキュベートした細胞は、１００μｇ／ｍＬまでのポリマー濃度で、コントロールに対して１００％生存可能なままであった。それらの結果を、ＰＥＩ
で処理された細胞集団について得られたデータと明瞭に匹敵し、このＰＥＩは、本発明者らのアッセイのためおよびこの周知のトランスフェクション試薬との比較を容易にするためのポジティブコントロールとして含まれる。ＰＥＩで処理された細胞の３０％未満は、２５μｇ／ｍＬのポリマー濃度において生存可能なままであり、細胞の生存度は、その他は同一条件下でＰＥＩのより高い濃度において、１０％程度の低いものであった。類似のＭＴＴアッセイを、これらのポリマーの加水分解産物の細胞傷害性をスクリーニングするために、独立して合成されたビス（β−アミノ酸）４ａ〜６ａを用いて行った。（ビス（β−アミノ酸）４ａ〜６ａは、生物学的に不活性であるか、または伝統的なポリカチオンのトランスフェクションベクターよりも低い、温和なまたは急性の毒性を持っているかのいずれかである。いずれにしても、これらの材料の分解は、急速な代謝クリアランスを容易にする。）。化合物４ａ〜６ａおよび１，４−ブタンジオールは、この最初のスクリーニングアッセイにおいて、細胞増殖または細胞の代謝を混乱させなかった（データは示さない）。より直接的な構造／機能に基づく、ポリマー１〜３とＰＥＩとの間の比較は、ポリマー構造および分子量（これらの両方は、ポリカチオンの毒性に寄与する）における差異に起因して行うことができなかった。それにかかわらず、ポリマー１〜３のみの素晴らしい細胞傷害性プロフィールは、ポリマー１〜３が、ＤＮＡ濃縮剤としてのさらなる研究のための興味深い候補であることを示唆した。
（プラスミドＤＮＡでのポリマー１〜３を含むセルフアセンブリ）
水溶液中のＤＮＡのポリアニオン性骨格と静電的に相互作用するカチオン性ポリアミンの傾向は、周知である。ポリマーが、生理学的ｐＨにて十分にプロトン化され、そしてアミンが、立体的にアクセス可能であれば、このような相互作用は、正に電荷したポリマーおよび負に電荷したポリマーが、明確な結合体を形成する、セルフアセンブリプロセスを生じ得る（Ｋａｂａｎｏｖら、Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｆｒｏｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８；それぞれは、本明細書中に参考として援用される）。ＤＮＡ複合体化剤およびトランスフェクションベクターとして研究される大多数のポリアミンは、コンホメーションの柔軟な側鎖の末端においてアミンを組み込んでいるか（例えば、ポリ（リジン）およびメタクリレート／メタクリルアミドポリマー）（Ｚａｕｎｅｒら Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３０：９７−１１３，１９９８；Ｋａｂａｎｏｖら Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：７−２０，１９９５；ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｔｅｒｉｎｇら Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：５８９−５９７，１９９９；それぞれは、本明細書中に参考として援用される）、または球状の（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ）ポリアミンもしくは球状の（ｇｌｏｂｕｌａｒ）ポリアミン（例えば、ＰＥＩおよびＰＡＭＡＭデンドリマー）の表面上にアクセス可能なアミンを組み込んでいる（Ｂｏｕｓｓｉｆら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７２９７−７３０１，１９９５；Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：４８９７−４９０２，１９９６；Ｔａｎｇら Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．７：７０３−７１４，１９９６；Ｈａｅｎｓｌｅｒら Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．４：３７２−３７９，１９９３；それぞれは、本明細書中に参考として援用される）。ポリマー１〜３は３級アミンを含み、そしてそれらの３級アミンは、立体的に混雑した環境において配置される（ポリマー骨格によって２つの側に位置する）ので、発明者は、プロトン化したアミンが、ＤＮＡと十分に密に相互作用することができないということに、最初に関心を持った。
プラスミドＤＮＡを複合体化するポリマー１〜３の能力は、アガロースゲルシフトアッセイにより実証された。アガロースゲル電気泳動は、電荷および大きさの両方に基づいて、高分子を分離する。従って、増加していく濃度のポリカチオンの存在下で、アガロースゲル上にＤＮＡを固定化することは、完全なＤＮＡ電荷中和を達成する点を決定するためのアッセイとして、広く使用されてきた。（Ｐｕｔｎａｍら Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：３６５８−３６６２，１９９９；Ｌｉｍら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３−５６３９，１９９９；Ｌｉｍら Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：６５２４−６５２５，２０００；Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：１０６８−１０７４，１９９９；それぞれは、本明細書中に参考として援用される）。以上のように、ポリマー１〜３の塩酸塩は、水に可溶である。しかし、ポリマー２およびポリマー３は、所望のポリマー濃度の全範囲にわたってｐＨ７．２では完全に溶けない。従って、ＤＮＡ／ポリマー複合体を、ＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝６．０）中で調製した。ＤＮＡ／ポリマー複合体を、ＤＮＡの水溶液に添加することによって調製し、所望のＤＮＡ／ポリマー濃度にてＭＥＳ中のポリマーの溶液をボルテックスした（実験の部を参照のこと）。得られたＤＮＡ／ポリマー複合体は、電気泳動のランニングバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．２）中に希釈して溶解したままであり、そしてデータを、生理学的ｐＨにて得た。代表的な例として、図３は、上昇する濃度のポリマー１の存在下で、アガロースゲル上でプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）の移動を示す。
図３に示されるように、ＤＮＡ移動の遅延は、ＤＮＡ／１の比が１：０．５（ｗ／ｗ）の程度から始まり、そして移動は、ＤＮＡ／ポリマーの比が１：１．０（ｗ／ｗ）より上の比で完全に遅延する（ＤＮＡ／ポリマー電荷比ではなくＤＮＡ／ポリマー重量比で、本明細書中に報告される。両方の取り決めは、文献中に使用されるが、発明者らは、ポリアミン上の全体の電荷は、ｐＨおよび温度において環境の変化の影響を受けるので、重量比が、より実際的およびより普遍的であることを、見出す。ＤＮＡ／ポリマー電荷比は、ポリ（リジン）のようなポリマーに対して説明的である一方、それらは、塩基性アミンをより少なく取り込むＰＥＩおよび１〜３のようなポリマーに対して重要性がより少ない）。ポリマー２および３は、プラスミドＤＮＡの移動を完全に阻害する。ＤＮＡ／ポリマー比（ｗ／ｗ）は、それぞれ、１：１０および１：１．５以上である（データは示さない）。これらの結果は、モデル「モノマー」を用いて行なわれる、ゲル遅延実験から明らかにはずれる。真のモノマーおよびポリマー１〜３の分解産物は、ポリマーの繰り返し単位を適切に表さないので、発明者らは、ビス（メチルエステル）４ｂ〜６ｂを用いて、ＤＮＡ固定化を達成するために必要である、ポリカチオン１〜３の多価的および協同的な結合の程度を試験する。「モノマー」４ｂ〜６ｂは、１：３０までのＤＮＡ／「モノマー」比（ｗ／ｗ）でＤＮＡの移動を阻害しなかった（データは示さない）。
上記のゲル電気泳動アッセイにおいてポリマー２を利用する低い効率の複合体生成のための理由は、これらのポリマー中のアミンのｐＫａ値における差異から生じているようである。ポリマー１〜３のｐＫａ値の直接測定は、それらの分解性によって複雑化される。しかし、発明者らは、構造的に関連するポリ（β−アミノ酸）との比較に基づいて、ポリマー１および２中のアミンのｐＫａ値の範囲が、ポリマー１に対して約４．５および約８．０からポリマー２に対して約３．０および約７．０までに及ぶことを予測する（それらの骨格中にピペラジンおよびジメチルエチレンジアミン単位を含む、構造的に関連するポリ（β−アミノ酸）のｐＫａ値は、報告されている。Ｂａｒｂｕｃｃｉら Ｐｏｌｙｍｅｒ ２１：８１−８５，１９８０；Ｂａｒｂｕｃｃｉら Ｐｏｌｙｍｅｒ １９：１３２９−１３３４，１９７８；Ｂａｒｂｕｃｃｉら Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １４：１２０３−１２０９，１９８１；それぞれは、本明細書中に参考として援用される）。結果として、ポリマー２を、生理学的ｐＨまたは中性に近いｐＨにて、ポリマー１よりより低い程度でプロトン化し、そしてそれゆえに低い有効性のＤＮＡ濃縮剤である。ポリマー３に対するｐＫａ値の範囲は、窒素原子の間の広がった距離に起因して、ポリマー１およびポリマー２に対する範囲よりも高い。従って、ポリマー３は、ポリマー２に比べて、実質的に減少した濃度において、ＤＮＡと複合体を形成する。
アガロースゲル遅延アッセイは、ＤＮＡと相互作用するポリカチオンの程度を測定する際に有用である。しかし、有用なトランスフェクション試薬であるために、ポリカチオンはまた、エンドサイトーシスを介して細胞に入るために十分小さいポリマー／ＤＮＡ複合体にプラスミドＤＮＡをセルフアセンブリすることができなければならない。多くの細胞型に対して、この大きさの要件は、およそ２００ｎｍ以下のオーダーであるが（Ｚａｕｎｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３０：９７−１１３，１９９８；本明細書に参考として援用される）、より大きい粒子も適応し得る（Ｄｅｍｅｎｅｉｘら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、編），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９６，ｐｐ．１４６−１５１；Ｋａｂａｎｏｖら、Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｆｒｏｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８；それぞれは、本明細書中に参考として援用される）。ナノメーターサイズの構造へプラスミドＤＮＡを詰めるためのポリマー１〜３の能力を、準弾性レーザー光散乱（ＱＥＬＳ）によって測定し、そして、得られた複合体の相対的な表面電荷を、ζポテンシャル測定により定量化した。粒子サイジングおよびζポテンシャル測定のために使用したＤＮＡ／ポリマー粒子を、アガロースゲル電気泳動アッセイのために上記に記載されるように形成し、実験の部に記載されるように、そして分析のために２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．０）で希釈した。
ポリマー１は、１：２（ｗ／ｗ）を超えるＤＮＡ／ポリマー比で９０〜１５０ｎｍの範囲の直径を備えた複合体を形成し、そしてポリマー２は、１：１０を超えるＤＮＡ／ポリマー比で６０〜１２５ｎｍのオーダーの粒子中にＤＮＡを濃縮した。これらの結果は、上記のアガロース電気泳動実験から得られたデータと一致する。しかし、これら実験における粒子は、数時間の期間に亘って凝集し、１〜２ミクロンの範囲の直径を有するより大きな複合体を生じた。これら粒子が凝集する傾向は、これら条件下で観察されたＤＮＡ／ポリマー粒子の低ζ電位により説明され得る。例えば、１：１０を超えるＤＮＡ／ポリマー比でポリマー１から形成された複合体は、＋４．５１（±０．５０）ｍＶの平均ζ電位を有していた。１：２０を超えるＤＮＡ／ポリマー比でポリマー２から形成された複合体のζ電位はより低く、＋１．４０（±０．５７）ｍＶの限界値に到達した。これらの差異は、これらポリマーに対する推定されたｐＫａ値と相関する。なぜなら、ポリマー１から形成された粒子の表面は、ｐＨ＝７．０でポリマー２から形成された粒子より、わずかによりプロトン化されていると予期されるからである。
ポリマー３は、１：２を超えるＤＮＡ／ポリマー比で５０〜１５０ｎｍの範囲の直径をもつ複合体を形成した。代表的な例として、図４は、ポリマー濃度の関数として、ポリマー３で形成された粒子の平均有効直径を示す。その他は同一の条件下で、粒子の直径は、上記の範囲内で実験により変動した。これは、恐らくは、複合体形成の間のＤＮＡ溶液の攪拌または添加の間のわずかな差異に起因する（ポリマーおよびＤＮＡ溶液の添加の順序は、得られるＤＮＡ／ポリマー複合体の性質にかなりの影響を有していた。例えば、小粒子を形成するために、ＤＮＡ溶液をボルテックス処理しているポリマー溶液に添加する必要があった。ＤＮＡにポリマー溶液が添加された場合には、大きなミクロンサイズの凝集物のみが観察された。従って、攪拌または添加の速度におけるわずかな差異が、粒子サイズにおける変動の原因であり得る可能性がある）。ポリマー３から形成された複合体のζ電位は、１：１を超えるＤＮＡ／ポリマー比で＋１０〜＋１５ｍＶのオーダーであり、そして複合体は、１８時間の間に亘って大規模に凝集しなかった（ｐＨ＝７、２５℃）。これらの複合体の正のζ電位は、粒子安定性の文脈を超えて有意であり得る。なぜなら、粒子表面上の正味の正の電荷はエンドサイトーシスの開始に役割を演じ得るからである（Ｋａｂａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：７−２０、１９９５；Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：６５２４−６５２５、２０００；Ｂｅｈｒ Ｃｈｉｍｉａ ５１：３４−３６、１９９７；Ｄｅｍｅｎｅｉｘら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９９６、１４６−１５１頁；Ｋｏｂａｎｏｖら、Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｆｏｒｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８；各々は参考として本明細書に援用される）。
ポリマー３から形成された粒子もまた、３７℃で比較的安定であった。例えば、ＤＮＡ／３のサンプル（ＤＮＡ／３＝１：５、平均直径＝８３ｎｍ）を３７℃で４時間インキュベートした。４時間後、平均７８ｎｍのフラクション（数で９８％、容量で７０％より多い）および約２．６ミクロンの平均直径をもつより大きな凝集物のフラクションからなる二峰性分布が観察された。これらの結果は、ポリマー３から形成された複合体の分解が溶液中のポリマーの分解より遅く起こるか、または部分分解が粒子の安定性に顕著に影響しなかったことを示唆する。溶液中のポリマーの分解に対し、分解可能なポリカチオンから形成されたＤＮＡ／ポリマー複合体の見かけ上増加した安定性は、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）から形成されたＤＮＡ／ポリマー複合体についても観察されている（Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３−５６３９、１９９９；本明細書に参考として援用される）。
図４および５中の粒子サイズおよびζポテンシャルデータは、他のポリカチオンで観察されたＤＮＡ濃縮のモデルと一致する（Ｋａｂａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：７−２０、１９９５；Ｐｕｔｎａｍら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：３６５８−３６６２、１９９９；Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５６３３−５６３９、１９９９；Ｌｉｍら、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：６５２４−６５２５、２０００；Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：１０６８−１０７４、１９９９；各々は本明細書に参考として援用される）。ＤＮＡは非常に低いポリマー濃度で小さな負荷電粒子に詰められ、そして粒子サイズはポリマー濃度が増加するとともに増加する（正確な光散乱データは、ＤＮＡ単独について、または１：０．５より低いＤＮＡ／ポリマー比におけるＤＮＡ／ポリマー会合種について得られなかった、なぜなら、可撓性の非濃縮ＤＮＡは、詰まったＤＮＡほど広く光を散乱しないからである（Ｋａｂａｎｏｖら、ｉｎ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｆｒｏｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１９９８：本明細書に参考として援用される））。複合体は、電気的中性が達成されるとき最大直径に到達し、そして凝集が起こる。粒子サイズは、ＤＮＡ／ポリマー濃度が電気的中性を超えて、さらなるポリマーが粒子直径の減少に寄与しない比まで鋭く減少する。このモデルは、これらポリマーから形成された複合体についてなされたζ電位測定により確認される。図５に示されるように、ポリマー３から形成されたポリマー／ＤＮＡ粒子比のζ電位は、低ポリマー濃度では負であり、そして電気的中性は、ＤＮＡ／ポリマー比が１：０．７５の近傍で達成され、大規模な凝集を生じた。粒子のζ電位は、１：２を超えるＤＮＡ／ポリマー比で＋１０〜＋１５ｍＶの範囲の限界値に接近した。
上記の複合体の平均直径は、細胞エンドサイトーシスのための一般サイズ要件内に入る。本発明者らは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株およびルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）を採用するトランスフェクション実験を開始した。これまで、ポリマー１および２は、初期スクリーニングアッセイでトランスフェクション活性を示さなかった。対照的に、ポリマー３は、特定の条件下でＰＥＩのそれを超えるトランスフェクション効率を示した。トランスフェクション実験は、以下の一般プロトコルに従って実施した：細胞を、６ウェルプレート中、２ｍＬの増殖培地において、１００，０００細胞／ウェルの初期接種密度で増殖させた。細胞を２４時間増殖させ、その後、増殖培地を取り除き、そして２ｍＬの無血清培地で置き換えた。ＤＮＡ／ポリマー複合体を、実験の節に記載のように形成し（２μｇＤＮＡ、ＤＮＡ／３＝１：２（ｗ／ｗ）、ＭＥＳ（ｐＨ＝６．０）中１００μＬ）、そして各ウェルに添加した。ＤＮＡ／ＰＥＩ複合体を、本発明者らの実験室でＰＥＩトランスフェクションのために最適であることがほぼ見出された比である、１：０．７５の重量比で形成した。トランスフェクションは、無血清培地で４時間実施し、その後、培地を、さらに２０時間にわたって増殖培地で置き換えた。相対トランスフェクション効率は、ルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）および細胞タンパ質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）キットを用いて測定した。結果は、総細胞タンパク質ｍｇあたりの相対光ユニット（ＲＬＵ）として表し：ポリマー３の複合体について、１．０７（±０．４３）×１０６ＲＬＵ／ｍｇ；ＰＥＩ複合体について、８．０７（±０．１６）×１０５ＲＬＵ／ｍｇである。裸のＤＮＡを採用するか、またはＤＮＡの不在下で実施したコントロール実験でルシフェラーゼ発現は検出されなかった。これらのトランスフェクションデータは、初期スクリーニング実験の結果である。これらのデータは、この一般構造のポリマーが、遺伝子送達のための合成ベクターとして見込みがあり、そしてさらなる研究のための興味深い候補であることを示唆する。ＰＥＩに対するポリマー３の相対的効力は興味深い、なぜなら、本発明者らの初期スクリーニング実験は、クロロキノンの不在下で実施され、そしてポリマー３は、エンドソーム脱出を促進する明らかな手段を現在取り込んでいないからである。しかし、これらポリマー中のアミンのｐＫａ値は、このモジュール合成アプローチを用いて、生理学的に適切なｐＨの範囲内に、より直接的に入るように「調整」され得ることに注目すべきである。従って、これらポリマーの「プロトンスポンジ」特徴（Ｂｅｈｒ Ｃｈｉｍｉａ ５１：３４−３６、１９９７；Ｄｅｍｅｎｅｉｘら、Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９９６、１４６−１５１頁；Ｋａｂａｎｏｖら、Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｆｒｏｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８；各々は本明細書に参考として援用される）をさらに操作し得、そしてそれ故、異なるジアミンモノマーの取り込み、またはそれらとの共重合により直接、それらのトランスフェクション効力を増大する。
（要約）
新たな分解可能なポリマー性ＤＮＡトランスフェクションベクターの調製のための一般的戦略が報告されている。ポリ（β−アミノエステル）１〜３を、１，４−ブタンジオールジアクリレートへの、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン、ピペラジン、および４，４’−トリメチレンジピペリジンの共役付加により合成した。ビス（第２級アミン）モノマー中のアミンが、重合の間の結合形成プロセスに活動的に参加し、他のポリ（アミノエステル）の合成を特徴付けるアミン保護／脱保護プロセスの必要性をなくす。従って、このアプローチは、市販の出発物質から単一ステップで、それらの骨格に第三級アミンを含む種々の構造的に多様なポリエステルの生成を可能にする。ポリマー１〜３は、酸性およびアルカリ性の媒体中で加水分解により分解し、１，４−ブタンジオールおよびβ−アミノ酸４ａ〜６ａを生成し、そして分解反応速度論をｐＨ５．１および７．４で調査した。これらのポリマーは、ｐＨ５．１でよりｐＨ７．４でよりも、迅速に分解し、他のポリ（アミノエステル）について報告されたｐＨ／分解プロフィールと一致した。細胞増殖および代謝に対するポリマー１〜３の影響を決定するために設計された初期スクリーニングアッセイは、これらのポリマーおよびそれらの加水分解分解産物が、トランスフェクションベクターとして従来採用される分解可能でないカチオン性ポリマーであるＰＥＩと比較して非細胞傷害性であったことを示唆した。
ポリマー１〜３は、生理学的ｐＨでプラスミドＤＮＡと静電的に相互作用し、ナノメータースケールのＤＮＡ／ポリマー複合体を生じる自己アセンブリプロセスを開始する。アガロースゲル電気泳動、準弾性（ｑｕａｓｉ−ｅｌａｓｔｉｃ）動力学光散乱（ＱＥＬＳ）、およびζ電位測定を用い、反対に荷電したポリ電解質間の相互作用の程度を決定した。すべてのこれらのポリマーは、５０〜２００ｎｍのオーダーの可溶性ＤＮＡ／ポリマー粒子中にＤＮＡを濃縮することが見出された。ポリマー１と２とから形成された粒子は広く凝集し、その一方、ポリマー３から形成された粒子は、正のζ電位（例えば、＋１０〜＋１５ｍＶ）を示し、そして１８時間までの間凝集しなかった。これらＤＮＡ／ポリマー複合体のナノメーターサイズの寸法および低下した細胞傷害性は、ポリマー１〜３が、分解可能なポリマー性遺伝子トランスフェクションベクターとして有用であり得ることを示唆する。このクラスのポリマーについて存在する構造／活性関係の完全な理解は、遺伝子治療のためのウイルストランスベクターに対するより安全なポリマーを基礎とする代替物の設計を促進する。
（実施例２ 細胞内ｐＨのレンジャー内の生分解可能なポリ（β−アミノエステル）ミクロスフェアからの迅速なｐＨ誘発放出）
（実験の項）
小球体の製造。小球体の製造について最適化された手段を、以下の一般的様式において実施した：ローダミン結合体化デキストランの水溶液（２００μＬの１０μｇ／μＬ溶液、Ｍｎは約７０ｋＤ）を、ＣＨ２Ｃｌ２におけるポリ１の溶液（４ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２における２００ｍｇのポリ１、Ｍｎは約１０ｋＤ）中に懸濁し、そして混合物を、１０秒間超音波処理して１次乳濁液を形成した。混濁したピンクの乳濁液を、迅速に均質化された（５，０００ｒｐｍ）ポリ（ビニルアルコール）の溶液［５０ｍＬ、１％ＰＶＡ（ｗ／ｗ）］に直接添加し、２次乳濁液を形成した。２次乳濁液を、第２のＰＶＡ水溶液［１００ｍＬ、０．５％ＰＶＡ（ｗ／ｗ）］に添加する前に、３０秒間均質化した。Ｃｏｕｌｔｅｒ微粒子分析器を用いる小球体懸濁物の直接的な分析により、約５μｍの平均粒子サイズであることが明らかとなった。２次乳濁液を、室温で２．５時間攪拌し、低温室（４℃）に移し、そしてさらに３０分間攪拌した。小球体を、遠心分離を介して４℃で単離し、冷水に再懸濁し、そして再度遠心分離して過剰のＰＶＡを除去した。この球体を、水（１５ｍＬ）に再懸濁し、凍結乾燥してピンクのフワフワした粉末を生成した。凍結乾燥された小球体の特徴づけを、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、および記載された走査型電子顕微鏡によって、実行した。ゼータ電位を、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＺｅｔａＰＡＬＳ分析器を用いて測定した。
（考察）
生分解性ポリマーから形成される小球体は、送達デバイスとしての使用について魅力的であり、そして種々のポリマーベースの小球体は、治療化合物の持続放出のために用いられてきた（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｎａｔｕｒｅ ３９２（補遺）：２５−３０、１９９６；Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：１４４−１４７、１９９６；Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０、１９９５；Ｍｕｌｌｉｎｇａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２、１９９３；Ｌｕｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３３−３７、２０００；Ｂｅｈｒ Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：２７４−２７８、１９９３；これらはそれぞれ、本明細書中で参考として援用される）。しかし、細胞内投与および細胞質への輸送を必要とする低分子ベース、タンパク質ベース、およびＤＮＡベースの治療について、ｐＨのような環境の刺激に応答して誘発される放出を容易にする新材料についての需要が増加している（Ｚａｕｎｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３０：９７−１１３、１９９８；本明細書中で参考として援用される）。エンドサイトーシスに続いて、細胞内のエンドソーム区分内のｐＨは、低下され、そして外来性物質は、リソソームの小胞と融合して分解される（Ｋａｂａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：７−２０、１９９５；本明細書中で参考として援用される）。細胞内範囲内でのｐＨにおける変化に基づいて分子の荷重（ｐａｙｌｏａｄ）を放出し、そして厳しい細胞内環境からの逸脱を容易にする新材料は、加水分解に不安定な薬剤および／または酵素的に不安定な薬剤の投与に、根本的および広範に及ぶ影響を有し得た（Ｚａｕｎｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．３０：９７−１１３、１９９８；Ｋａｂａｎｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．６：７−２０、１９９５；これらはそれぞれ、本明細書中で参考として援用される）。本明細書中で、カプセル化された成分を、細胞内範囲内でのｐＨにおける変化に従って定量的かつ本質的に即座に放出するｐＨ応答性ポリマー小球体の製造が、報告される。
ポリ（β−アミノエステル）１の合成は、上記の実施例１に記載されている（Ｍｉｌｌｅｒ Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：１７６８−１７８５、１９９８；Ｈｏｐｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１−１４、１９９８；Ｄｅｓｈｍｕｋｈら、Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ．２１：１１３−１２４、１９９７；これらはそれぞれ、本明細書中で参考として援用される）。ポリ１は、加水分解で分解可能であり、最初のスクリーニングアッセイにおいて非細胞毒性であり、そして現在、遺伝子治療適用におけるＤＮＡ送達のための合成ベクターとして研究中である。水性の媒体におけるポリマーの溶解度は、溶液のｐＨによって直接的に影響される。詳細には、固体のプロトン化していないポリマーは、７．０〜７．４のｐＨ範囲において水性の媒体に不溶性であり、そして溶解性と非溶解性との間の遷移が、ｐＨ６．５前後で生じる。細胞外ｐＨとエンドソームｐＨ（それぞれ７．４および５．０〜６．５）との間の相違に基づいて、本発明者らは、ポリ１から形成される小球体が、細胞内ｐＨの範囲内での化合物のカプセル化および誘発された放出について有用であり得ると仮定した。
ポリマー小球体内の治療化合物のカプセル化は、しばしば二重乳化プロセスを使用して果たされる（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２８：２５−４２、１９９７；本明細書中で参考として援用される）。この二重乳化プロセスは、疎水性ポリマー（例えば、薬剤送達デバイスの開発において従来から用いられる生分解性ポリマーである、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ））からの小球体の製造について十分に確立されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２８：５−２４、１９９７；Ｏｋａｄａ Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２８：４３−７０、１９９７；これらはそれぞれ、本明細書中で参考として援用される）。予備実験により、ポリ１を用いる水溶性化合物のカプセル化に関する二重乳化プロセスの実行可能性が実証された。ローダミン結合体化デキストランを、後のカプセル化のためのモデルとして選択し、そしていくつかの理由について放出を研究した：１）ローダミンは、蛍光性であるので、負荷および放出のプロフィールは、蛍光顕微鏡による測定が可能であり、２）負荷された小球体は、蛍光顕微鏡によって直接的に画像化され得、そして３）ローダミンの蛍光強度は、生理学的範囲内のｐＨによって比較的影響されない（Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、１９９６、ｐ．２９；本明細書中で参考として援用される）。
標識デキストランをカプセル化する小球体を、ポリ１から製造し、そしてＰＬＧＡから形成されたコントロールと比較した。ポリ１から形成された小球体のサイズ分布は、５〜３０μｍの範囲内のＰＬＧＡ小球体の分布とよく相関した。平均粒子サイズを、実験的パラメータ（例えば、均質化速度および水溶性／有機性溶媒の割合）における変動によって制御し得た（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２８：２５−４２、１９９７；本明細書中で参考として援用される）。しかし、ＰＬＧＡ小球体と対照的に、ポリ１から形成された球体は、遠心分離工程および洗浄工程の間、広範にわたって凝集した（上記の実験の項を参照のこと）。ｐＨ７．４で再懸濁された小球体は、主に大きな凝集物からなり、そして走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像により、物理学的に結合されるか、または「結合される（ｗｅｌｄｅｄ）」と思われる球体の塊が明らかになった（データは示されていない）。
遠心分離および洗浄が、低下した温度（４℃）で行われた場合、凝集が除去され得ることが見出され、これはおそらくこの低温でのポリマー球体の硬化に起因する。８〜１０μｍの範囲において調製されたデキストラン負荷ポリ１小球体のＳＥＭ画像により、有意な破砕およびこれらの表面上の大きな穴の形成が明らかになった。しかし、４〜６μｍの範囲において標的化された小球体は、本質的に、亀裂、穴および他の欠損がなかった（図６）。後の放出実験のために処方された小球体を、より小さい（＜６μｍ）範囲において製造した。ｐＨ５．１で球体を溶解し、そして蛍光強度を測定することによって決定された負荷ポリ１小球体についてのカプセル化効率は、５３％程度の高さであった。
乾燥されたポリ１小球体の懸濁液（ｐＨ＝７．４）は、主に、光学顕微鏡および蛍光顕微鏡によって測定されたような単一の、単離された小球体から構成された（図８ａ）。ｐＨ７でのポリ１小球体の微粒子懸濁物のゼータ電位（ζ）は、＋３．７５（±０．６２）ｍＶであり、小球体の表面が、生理学的ｐＨで全体的に正電荷を有することを示唆する。これは、細胞内取り込みについてのこれらの小球体の標的化に関連し得、これは、なぜならば、粒子表面上の正味の正電荷が、エンドサイト−シスの誘発において役割を果たし得るからである（Ｚａｕｎｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．３０：９７−１１３、１９９８；本明細書中で参考として援用される）。
ｐＨ７．４で懸濁されたポリ１小球体は、凝集および分解に関して、数週間の間安定なままであった（目視検査による）が、小球体は、懸濁媒体のｐＨが、５．１と６．５との間に低下された場合、即座に溶解された。
ポリ１小球体からの標識デキストランの放出を、蛍光顕微鏡によって定量的に測定した（図７）。ｐＨ７．４での放出のプロフィールを、蛍光における小さい最初の破裂（７〜８％）によって特徴づけ、蛍光は、４８時間後に約１５％の限界値に到達した。この実験は、ポリ１の分解が、これらの条件下で比較的遅いこと、および９０％より多くのカプセル化材料が、生理学的ｐＨで、安定に長期間ポリマーマトリクス中に保持され得ることを実証した。
エンドソームのｐＨ範囲におけるカプセル化薬物の誘発された放出へのポリ１小球体の適用を試験するために、本発明者らは、類似の実験を行い、ここで懸濁媒体のｐＨを、実験過程の間に７．４から５．１に変更した。図７に示されるように、懸濁緩衝液を酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝５．１）に変更した場合、小球体は、迅速に溶解し、ポリマーマトリクス中に残存する標識デキストランの本質的に瞬間的かつ定量的な放出を生じた。著しく対照的に、デキストラン負荷ＰＬＧＡ小球体からの放出は、懸濁媒体のｐＨが低下された２４時間後まで増加しなかった（図７）。図８は、以下の蛍光顕微鏡画像を示す：（ａ）ｐＨ７．４でのデキストラン負荷小球体のサンプル；および（ｂ）顕微鏡カバーガラスの上右端に１滴の酢酸緩衝液が添加されたサンプル。ローダミン結合体化デキストランの迅速な放出を、添加された酸の拡散の方向において溶解している小球体からの伸長線およびバックグラウンドの蛍光（経過時間は約５秒間）における全体の増加として可視化した。
エンドサイトーシスまたは食細胞活動を介する細胞内送達のための治療的化合物を標的化する場合、リソソームの小胞へ送られる前に、薬物がそのキャリアから放出され得る手段だけでなく、薬物が、エンドソームの区分を逸脱し得る手段もまた考えることが重要である（Ｌｕｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３３−３７、２０００；Ｚａｕｎｅｒら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．３０：９７−１１３、１９９８；これらはそれぞれ、本明細書中で参考として援用される）。エンドソームの逸脱を容易にするための１つのストラテジーは、弱塩基、または「プロトン吸収体」の組込みがあり、これらは、小胞内の内部浸透圧を増加することによって、エンドソームの酸性環境を緩衝し、そしてエンドソームの膜を崩壊すると考えられている（Ｄｅｍｅｎｅｉｘら、ｉｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９９６、ｐｐ．１４６−１５１；本明細書中で参考として援用される）。ポリ１小球体は、ポリマーマトリクスにおけるアミンのプロトン化を含む機構（溶解）を介して、エンドソームのｐＨ範囲において、カプセル化材料を放出し得る。従って、薬物の迅速な放出に加えて、ポリ１小球体はまた、エンドソームの逸脱の膜崩壊手段を提供し得、ポリマーマトリクス中に含まれる加水分解に不安定な薬物の寿命を延長することによって有効性を高める。
ポリ−１から製造されたミクロスフェアは、細胞内薬物送達のために適用されるｐＨ応答性物質（例えば、ｐＨ応答性ポリマー／リポソーム処方物）の蓄積への重要な追加を表し得る（Ｇｅｒａｓｉｍｏｖら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．３８：３１７〜３３８、１９９９；Ｌｉｎｈａｒｔら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １６：１２２〜１２７、２０００；Ｌｉｎｈａｒｄｔら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：４４５７〜４４５９、１９９９；各々、本明細書中に参考として援用される）。多くのリポソーム処方物とは対照的に、ポリマーミクロスフェアは、物理的に強固であり、そして、変形も、腐敗も分解もすることなしに、長期間にわたり乾燥保存され得る（Ｏｋａｄａ Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２８：４３〜７０、１９９７；本明細書中に参考として援用される）−新しい治療送達系の処方および包装についての重要な検討材料である。本研究において調査されたミクロスフェアは、マクロファージへの送達を標的化するために通常使用される粒子の大きさの範囲内である（Ｈａｎｅｓら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２８：９７〜１１９、１９９７;本明細書中に参考として援用される）。ゆえに、上記されたポリ−１ミクロスフェアについての迅速なｐＨ放出プロフィールは、近年ＰＬＧＡをカプセル化材料として使用する、ＤＮＡに基づいた新しいワクチンの設計において、有用であり得る（Ｓｉｎｇｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：８１１〜８１６、２０００；Ａｎｄｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８：１２６〜１３０、１９９９；Ｈｅｄｌｅｙら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：３６５〜３６８、１９９８；各々本明細書中に参考として援用される）。
（実施例３−合成トランスフェクションベクターの加速的な発見：分解可能なポリマーライブラリーの並行合成およびスクリーニング）
（序論）
細胞への治療的ＤＮＡの安全かつ効率的な送達は、遺伝子治療の臨床的成功への、基本的な障害を示す（Ｌｕｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３３〜３７、２０００；Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｎａｔｕｒｅ ３９２補遺：２５〜３０、１９９６；各々、本明細書中に参考として援用される）。合成送達ベクターに直面する挑戦は特に明確である。なぜなら、陽イオン性のポリマーおよびリポソームは両方とも、遺伝子導入の媒介において、ウイルスベクターよりも有効でなかったからである。新しい設計基準を組み込むことによって、機能的な送達系に対する近年の進展が導かれた（Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：２４６０〜２４６１、２００１；Ｌｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：６５２４〜６５２５、２０００；Ｈｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１２：２８０〜２９０、２００１；Ｐｕｔｎａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１２００〜１２０５、２００１；Ｂｅｎｎｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１１：６３７〜６４５、２０００；Ｍｉｄｏｕｘら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：４０６〜４１１、１９９９；各々、本明細書中に参考として援用される）。しかし、ポリマーの遺伝子送達ベクターの開発のためのパラダイムは、依然として、反復的な線形プロセスの一部として、材料にこれらの設計要素を合わせること（新しいベクターの発見に対する、ゆっくりではあるが効果的なアプローチ）のままである。ここで、本発明者らは、分解性陽イオン性のポリマーおよびオリゴマーの大規模ライブラリーの合成、ならびに、細胞に基づく迅速なスクリーニングアッセイを介した新しい合成ベクターファミリーの発見に適した並行アプローチを報告する（組織操作のための分解性ポリマーの並行合成およびスクリーニングについての報告として、Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：４５５３〜４５５４、１９９７を参照のこと；本明細書中に参考として援用される）。
（実験の項）
（一般的考慮事項）生存する細胞または滅菌材料に関する全ての操作を、標準的な滅菌技術を使用する層流フードにおいて実施した。ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ １１００ Ｓｅｒｉｅｓアイソクラチックポンプ、１００μＬの注入ループを備えたＲｈｅｏｄｙｎｅ Ｍｏｄｅｌ ７１２５インジェクター、および直列した２つのＰＬ−Ｇｅｌ混合Ｄカラム（５μｍ、３００×７．５ｍｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）を使用して、実施した。ＴＨＦ／０．１Ｍピペリジンを、１．０ｍＬ／分の流速にて、溶離剤として使用した。データを、Ｏｐｔｉｌａｂ ＤＳＰ干渉屈折計（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用して回収し、そして、ＴｒｉＳＥＣ ＧＰＣソフトウェアパッケージ（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を使用して加工した。ポリマーの分子量および多分散性を、単分散性ポリスチレン標準と比較して報告する。
（材料）第１級アミンおよび第２級アミンモノマー１〜２０を、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ（Ｌａｎｃａｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）、およびＦｌｕｋａ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から、購入した。ジアクリレートモノマーＡ〜ＧをＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、およびＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｏｎｔａｒｉｏ，ＮＹ）から、購入した。全モノマーを、入手可能な最高純度（９７％〜９９＋％）において購入し、そして、さらなる精製なしに、受け取ったままで使用した。ホタルのルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）を、Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から購入し、そしてさらなる精製なしに使用した。（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。トランスフェクションアッセイにおいて使用したサル腎臓線維芽細胞（ＣＯＳ−７細胞）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、そして、ダルベッコ改変イーグル培地中に５％のＣＯ２を９０％；胎仔ウシ血清を１０％；ペニシリンを１００ユニット／ｍＬ；ストレプトマイシンを１００μｇ／ｍＬで、３７℃にて、増殖させた。ハイスループットのトランスフェクションアッセイにおいて使用するルシフェラーゼ検出キットを、Ｔｒｏｐｉｘ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した。他の全ての材料および溶媒を、さらなる精製なしに、受け取ったままで使用した。
（ポリマーライブラリーの合成）１４０の重合反応全てを、以下の一般的なプロトコルに従った、個々の標識バイアルのアレイとして、一斉に実施した。個々の例外を、必要に応じて記載した。アミンモノマー１〜２０（２．５２ｍｍｏｌ）を、適切な標識バイアルに充填した（以下に示すように）：液体モノマーを測定し、そしてマイクロリットルピペットを使用して、定量的に移動した；固体モノマーを、各バイアルの中で、直接重量を測定した。無水ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）を、各バイアルへ添加した。液体ジアクリレートＡ〜Ｆの１等量（２．５２ｍｍｏｌ）を、マイクロリットルピペットを使用して、適切な各反応バイアルに添加し、そして、このバイアルに、Ｔｅｆｌｏｎ−ｌｉｎｅｄキャップを用いて、きつく蓋をかぶせた。半固体のジアクリレートＧの１等量を、ＣＨ２Ｃｌ２中の溶液（２．５２ｍｍｏｌ、ＣＨ２Ｃｌ２中の２．５２Ｍ溶液、１ｍＬ）として、適切なバイアルに添加し、そして、このバイアルに、きつく蓋をかぶせた。ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）のさらなるアリコートを、１９および２０を含む反応バイアルに添加し、これらのモノマーの溶解性に役立たせた。きつく蓋をかぶせたバイアルを、２つのプラスチック試験管立てに配列し、そして、４５℃のオーブン内の回転式振盪器に固定した（注意：蓋をかぶせられたバイアルの加熱は、起こり得る爆発の危険性を示す。オーブンの温度を、信頼性のある温度の安定性を確実にするために、実験前の１週間、定期的に測定した。温度が、この期間、＋／−１℃の範囲内で変化することを見出した。種々の試験バイアルを、より大規模な実験を実施する前に、測定した。）。この反応バイアルを、５日間、４５℃で激しく振盪し、そして、室温まで冷却させた。バイアルを、大規模なデシケーターに設置し、そして、吸引真空下に１日間、および溶媒の完全な除去を確実にするために、高い真空下にさらに５日間、設置した。取得されたサンプル（全ライブラリーの５５％、表２参照）を、ＧＰＣによって分析し、そして、続く全てのスクリーニング実験において、直接使用した。
（水溶解性の決定）全サンプルの溶解性を、以下の一般的な様式において、２ｍｇ／ｍＬの濃度にて、一斉に決定した。各ポリマーサンプル（５ｍｇ）を、１２ｍＬのシンチレーションバイアル中で重量を測定し、そして、２．５ｍＬの酢酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝５．０）を、ピペッターを使用して、各サンプルに添加した。サンプルを、１時間、室温で激しく振盪した。各サンプルを、溶解性を決定するために、可視的に観察した。
（アガロースゲル電気泳動アッセイ）ＤＮＡとの複合体を形成するポリマーの能力を決定するために使用されるアガロースゲル電気泳動アッセイを、以下の様式において、実施した。上記の溶解性アッセイにおいて調製した溶液（２５ｍＭ、ｐＨ＝５．０の酢酸緩衝液中に２ｍｇ／ｍＬ）を使用して、７０の水溶解性ポリマーのストック溶液を、９６ウェルの細胞培養プレート中に配列した。ＤＮＡ／ポリマー複合体を、マルチチャンネルピペッタを使用して、ストックプレートから新しいプレートへ、１０μＬの各ポリマー溶液を移すことによって、１：５（ｗ／ｗ）の比率にて、形成させた。各ポリマーを、さらに、９０μＬの酢酸緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝５．０、全量＝１００μＬ）を用いて希釈し、そして、このプレートを、機械の振盪器上で、３０秒間振盪した。プラスミドＤＮＡの水溶液（１００μＬの０．０４μｇ／μＬ溶液）を、プレート中の各ウェルに添加し、そして、この溶液を、マルチチャンネルピペッタおよび機械の振盪器を使用して、激しく混合した。ＤＮＡ／ポリマー複合体を、以下の例外を除いては、同じ形式において、１：２０（ｗ／ｗ）の比率で形成させた：４０μＬのポリマーストック溶液を新しいプレートへ移し、そして、水性ＤＮＡ溶液（１００μＬ）を添加する前に、６０μＬの酢酸緩衝液を用いて希釈した（全量＝１００μＬ）。ＤＮＡ／ポリマー複合体を、３０分間、室温でインキュベートし、その後、各溶液のサンプル（１５μＬ）を、マルチチャンネルピペッタを使用して、１％アガロースゲル（ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭ、ｐＨ＝７．２、５００ｎｇ／ｍＬ臭化エチジウム）中にロードした。注意：サンプルを、ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ、ｐＨ＝７．２）中の１０％ Ｆｉｃｏｌｌ ４００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）からなるローディング緩衝液を用いて、ゲルにロードした。ブロモフェノールブルーを、ローディング緩衝液中に、可視の指示薬として含まなかった。なぜなら、この荷電した色素は、ポリマーおよびＤＮＡの複合体化を阻害すると思われるからである。サンプルを、図９中に示すパターンに従ってロードし、その結果、１：５および１：２０の比率のＤＮＡ／ポリマーに対応するサンプルを、ゲル上の隣接した位置において、アッセイした。このゲルを、３０分間、９０Ｖにて流し、そして、ＤＮＡバンドを、臭化エチジウム染色によって、可視化した。
（細胞トランスフェクションアッセイに関する一般的なプロトコル）
トランスフェクションアッセイを、以下の一般的な様式で３連で実施した。ＣＯＳ−７細胞を、フェノールレッドを含まない増殖培地（２００μｌ）（９０％Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地、１０％のウシ胎仔血清、ペニシリン１００単位／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ）内に１５，０００細胞／ウェルの初期播種密度で、９６ウェルプレート内で増殖させた。細胞を、インキュベーターで２４時間増殖させ、その後増殖培地を取り除き、そしてＨＥＰＥＳを補充した２００μＬのＯｐｔｉｍｅｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と交換した（総濃度＝２５ｍＭ）。以前に同定された５６個の水溶性／ＤＮＡ複合体形成ポリマーから調製されたポリマー／ＤＮＡ複合体を、１：２０（ｗ／ｗ）の比率でホタルのルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）を含む市販のプラスミドを使用して、上記に記載されたように調製した。各々のサンプルの適切な量を、マルチチャンネルのピペッタを使用して細胞に添加した（例えば、１５μＬからは３００ｎｇＤＮＡ／ウェルを得た；３０μＬからは６００ｎｇＤＮＡ／ウェルを得た）。１：１のＤＮＡ／ポリマーの比率で調製されたポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）およびポリリジンを使用するコントロールを、同様の様式で調製し、そしてＤＮＡおよび非ＤＮＡのコントロールを含ませた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）を使用するコントロールを、この産物についての技術マニュアル（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ）に記載されるようないくつかの濃度（０．１、０．２、０．４および０．６μＬ）で実施した。細胞を４時間インキュベートし、その後無血清増殖培地を取り除き、そして１００μｌのフェノールレッドを含まない増殖培地と交換した。細胞を、さらなる期間（代表的に３６時間〜６０時間の間で変動する）インキュベートし、そしてルシフェラーゼ発現を市販のアッセイキット（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して決定した。発光を、９６ウェルの生物発光プレートリーダーを使用する白色のソリッドボトム（ｓｏｌｉｄ−ｂｏｔｔｏｍ）ポリプロピレン９６ウェルプレートで定量した。発光を、相対光単位で表し、そしてこのアッセイにおいて全細胞タンパク質に対する正規化をしなかった。
（結果および考察）
ポリ（β−アミノエステル）は加水分解性であり、生理的なｐＨでプラスミドＤＮＡを濃縮する、そしてジアクリレート（Ｅｑ．１および２）に対する１級アミンまたは２級アミンの共役付加を経て容易に合成される（Ｌｙｎｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：１０７６１−１０７６８，２０００；本明細書中で参考として援用される）。モデルポリマーの初期のスクリーニングは、強力な遺伝子キャリアのような物質を同定し、そして構造変化がＤＮＡ結合およびトランスフェクション効率に対する有意な影響を有し得ることを測定した（Ｌｙｎｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：１０７６１−１０７６８，２０００；本明細書中で参考として援用される）。本発明者らは、このアプローチが、以下いくつかの理由のために、構造的に独特なポリマーの大きなライブラリーの合成のための魅力的なフレームワークを提供すると判断した：１）ジアミンモノマーおよびジアクリレートモノマーは、安価な市販の出発原料である、２）重合は、単一の合成工程で直接的に実施され得る、および３）精製工程は、副生物が重合の間に生成されないので、一般的には不必要である。
市販のビス（２級アミン）の不足は、上記の合成アプローチを使用して達成され得る構造多様性の程度を限定する。しかし、有用な市販のモノマーのプールは、１級アミンが可能性のあるライブラリーの基礎的要素として考慮される場合に、有意に拡大される。アクリレート基に対するアミンの共役付加は一般的に、官能基（例えば、アルコール、エーテル、および３級アミン）の耐性があるので（Ｆｅｒｒｕｔｉら、Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．５８：５５−９２，１９８４；本明細書中で参考として援用される）、本研究者らは、本発明者らの合成ストラテジーへの官能化された１級アミンモノマーの組み込みが、構造的な多様性を広げるのに役立つと考えた。ジアクリレートモノマーＡ〜Ｇおよびアミンモノマー１〜２０を、初期のスクリーニングライブラリーの合成のために選択した。
このモノマーのセット（７個のジアクリレート×２０個のアミン＝１４０の構造的に独特なポリマー）から構築されたライブラリーのサイズは、十分な多様性を組み込むのに十分に大きく、さらに、本発明者らの初期の研究において自動化を必要とせずに実施するのに十分に小さいサイズが選択された。始めの時点で、ポリマー（例えば、Ｇ１６（疎水性で、立体的でかさ高いモノマーＧおよび１６から形成される））が、生理学的なｐＨで水溶性であるのか、または十分にＤＮＡを濃縮することができるのかは不明確であった。しかし、このタイプのモノマーは、ゆっくりと取り込まれて、多様な空間を完全に探索し、そしてこのライブラリーが遺伝子送達以外の用途についての物質の発見のためのスクリーニング集団として最終的に有用であり得ることを予想した（パラレル合成および組織工学についての分解性ポリマーのスクリーニングに関する報告については、以下を参照のこと：Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：４５５３−４５５４，１９９７，本明細書中で参考として援用される；Ｌｙｎｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０：１７０７−１７１０，２００１；本明細書中で参考として援用される）。
重合反応は、個々に標識されたバイアルのアレイとして同時に行なわれた。反応を、５日間、４５℃で塩化メチレン中で実施し、そしてポリマーを、溶媒の除去によって単離されて６００〜８００ｍｇのそれぞれの物質を得た。このスケールで実施した反応は、ＧＰＣアッセイおよび全ての引き続いてのＤＮＡ結合アッセイ、毒性アッセイ、およびトランスフェクションアッセイによる慣用的なアッセイに十分な各々の物質の量を提供する。ＧＰＣによるライブラリーの５５％のサーベイは、（ポリスチレン標準に対して）２０００から５００００までの範囲の分子量を示した。高分子量は、ＤＮＡ複合体形成およびトランスフェクションを必要としないので（下記に示される）（Ｋａｂａｎｏｖら、Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｆｒｏｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９８；本明細書中で参考として援用される）、このライブラリーは、引き続いてのスクリーニングアッセイに適切なポリマーおよびオリゴマーの収集物を提供する。
スクリーニングライブラリーの１４０個メンバーの内、７０個のサンプルは、電気泳動ＤＮＡ結合アッセイに含まれるのに十分な水溶性（２ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ＝５．０）であった（図９）。このアッセイをできるかぎり迅速かつ効率的に実施するために、サンプルを、９６ウェルプレート内に１：５および１：２０（ＤＮＡ／ポリマー、ｗ／ｗ）の比率でプラスミドＤＮＡと混合し、そしてマルチチャンネルピペッタを使用して、５００サンプルまでアッセイできるアガロースゲルのスラブにロードした。７０個の水溶性ポリマーサンプルの全てを、３０分未満で２つの異なるＤＮＡ／ポリマーの比率で同時にアッセイした。図９で示されるように、７０個の水溶性ポリマーサンプルのうち５６個は、ＤＮＡと十分に相互作用して、ゲルマトリクスを通る移動を遅らせた（例えば、Ａ４またはＡ５）（排徐規準として１：２０のＤＮＡ／ポリマーの比率を使用する）。１４個のポリマーは、これらのポリマーがＤＮＡを十分に複合体化しないので、これ以上の考察をやめた（例えば、Ａ７およびＡ８）。
上記のアッセイで同定されたＤＮＡ複合体形成物質を、プラスミドＤＮＡおよびＣＯＳ−７細胞株を使用するトランスフェクションアッセイでさらに調査した。全てのアッセイを、ホタルのルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）を用いて同時に実施し、そして発現されたタンパク質のレベルを、市販のアッセイキットおよび９６ウェル発光プレートリーダーを使用して決定した。図１０は、１：２０（ｗ／ｗ）のＤＮＡ／ポリの比率でｐＣＭＶ−Ｌｕｃ（６００ｎｇ／ウェル）を使用するアッセイから作成したデータを示す。スクリーニングされたポリマーの大部分は、これらの条件下で、「裸の」ＤＮＡ（ポリマーなし）コントロールの代表的なレベルより上でトランスフェクションを媒介しない。しかし、より高レベルのタンパク質および対応するポリマーを示した、いくつかのウェルを、このアッセイで「ヒット」として同定した。ポリマーＢ１４（Ｍｗ＝３１８０）およびポリマーＧ５（Ｍｗ＝９１７０）は、例えば、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）（合成トランスフェクションベクターとして従来使用されているポリマー）（Ｂｏｕｓｓｉｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７２９７−７３０１，１９９５；本明細書中で参考として援用される）を使用するコントロール実験よりも、４〜８倍高いトランスフェクションレベルを生じ、そしてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手可能）主要な市販の脂質ベースのトランスフェクションベクター系）を使用して発現されたタンパク質の範囲内またはこれを上回る範囲のトランスフェクションレベルを生じた。ポリマーＡ１４、Ｃ５、Ｇ７、Ｇ１０、およびＧ１２はまた、上記の実験において正の「ヒット」として同定されたが、遺伝死発現のレベルは、Ｂ１４およびＧ５より低かった。
合成ポリマーの間の構造の差異は、代表的に、最適なトランスフェクション条件の一般的な設定を不可能にする。例えば、ポリマーＣ５、Ｃ１４およびＧ１４は、上記で使用された高濃度では毒性である（目視検査で観察したときの、これらのポリマーを含むウェル内の細胞の欠如によって決定した）。これらのポリマーは、毒性が低く、そしてより低い濃度でトランスフェクションを媒介するが、より低いＤＮＡ濃度およびポリマー濃度でトランスフェクションを媒介する（データは示さず）。上記のアッセイ系は、ＤＮＡ濃度、ＤＮＡ／ポリマーの比率、細胞播種密度、またはインキュベーション時間の関数としてポリマーを評価するために容易に改変され得る。さらなる調査では、このスクリーニングライブラリーの可能性をさらに十分に評価する必要があり、そしてこの目的ための実験は現在進行中である。
この上記のアッセイは、クロロキン（インビトロでのトランスフェクションを増強するために一般に加えられる弱塩基）の非存在下において実施され（Ｐｕｔｎａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１２００−１２０５，２００１；Ｂｅｎｎｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１１：６３７−６４５，２０００；Ｍｉｄｏｕｘら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：４０６−４１１，１９９９；Ｋａｂａｎｏｖら、Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｆｒｏｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）、従って、この結果はトランスフェクションを媒介する物質の本来の能力を反映する。モノマー１４を含むポリマーは、「水素のスポンジ」ポリマーを含む他のヒスチジンと構造的に類似しており（Ｐｕｔｎａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１２００−１２０５，２００１；Ｂｅｎｎｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１１：６３７−６４５，２０００；Ｍｉｄｏｕｘら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：４０６−４１１，１９９９；これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）、そして酸性の細胞内区画を緩衝化し、そしてエンドソームエスケープ（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）を媒介することにより、トランスフェクションを増強し得る（Ｐｕｔｎａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１２００−１２０５，２００１；Ｂｅｎｎｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１１：６３７−６４５，２０００；Ｍｉｄｏｕｘら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１０：４０６−４１１，１９９９；Ｂｏｕｓｓｉｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７２９７−７３０１，１９９５；これらの各々は、本明細書中で参考として援用される）。モノマー５を含むポリマーの効力は、この状況において驚くべきことである。なぜならば、これらの物質はエンドソームエスケープを促進する明らかな手段を組込まないからである。これらの後者のポリマーの効力は、まだ理解されていないが、これらのポリマーは、ａｄ ｈｏｃ基礎において発見され得ていないので、それらの発見は、本発明者らの並行アプローチを確証する手助けとなり、そして、構造多様性を組込む価値を強調する。これまで、親水性ジアクリレートＤおよびＥを組込むポリマーは、構造／活性の関係の解明に有用なより焦点を合わせたライブラリーの開発のための、可能な基礎を提供する、任意の条件下で「ヒット」を生じていない。
本発明者らは、１４０個の分解性ポリマーのライブラリーおよび新しいＤＮＡ複合体形成物質ならびに遺伝子送達ベクターの発見に有用なオリゴマーを作製した。これらの物質のいくつかは、細胞によって内部移行され、そして転写活性形態でＤＮＡを放出するのに十分に小さな構造にＤＮＡを濃縮し得る。ライブラリーの設計、合成、および初期のスクリーニングアッセイに、現在必要とされる全時間は、約２週間である。しかし、ロボット利用およびさらなるモノマーの取り込みは、新しいＤＮＡ複合体形成物質およびコンピテントトランスフェクションベクターが同定されるペースを有意に加速し得る。
（実施例４−遺伝子送達のための分解可能なカチオン性ポリマーの大ライブラリーの半自動化合成およびスクリーニング）
臨床における遺伝子治療の成功に対する主要な障壁の１つは、核酸を送達する安全かつ効率的な方法の欠如である。現在、大部分の臨床試行は、送達ビヒクルとして改変ウイルスを用い、これは、ＤＮＡを細胞に移入することで効率的であるが、潜在的に重篤な毒性および生産問題を受け易い（Ｓｏｍｉａら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．１：９１（２０００）；本明細書中に参考として援用される）。対照的に、非ウイルスシステムは、多くの可能な利点を提供し、これには、生産の容易さ、安定性、低免疫原性および毒性、ならびに減少したベクターサイズ制限が含まれる（Ｌｅｄｌｅｙ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１１２９（１９９５）；本明細書中に参考として援用される）。しかし、これらの利点にかかわらず、現存する非ウイルス送達システムは、ウイルスベクターよりもはるかに効率的でない（Ｌｕｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３３（２０００）；本明細書中に参考として援用される）。
非ウイルス送達化合物の１つの有望なグループは、カチオン性ポリマーであり、これは、ＤＮＡに自然に結合かつ縮合する。インビトロでトランスフェクトする広範な種類のカチオン性ポリマーが特徴付けられ、両方が天然であるたんぱく質（Ｆｏｍｉｎａｙａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７１：１０５６０（１９９６）；本明細書中に参考として援用される）およびペプチドシステム（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２：１６２（２０００）；本明細書中に参考として援用される）、ならびにポリ（エチレンイミン）のような合成ポリマー（Ｂｏｕｓｓｉｆら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ９２：７２９７（１９９５）：本明細書中に参考として援用される）およびデンドリマー（Ｋａｂａｎｏｖら、Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｆｒｏｍ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ、Ｗｉｌｅｙ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９８；本明細書中に参考として援用される）がある。ポリマー性遺伝子送達における最近の発展は、毒性を低減するためにこれらポリマーをより生分解可能にすることに一部焦点をあてている。代表的には、これらポリマーは、核酸の負に荷電したリン酸骨格とのイオン的相互作用を可能にする荷電可能なアミノ基、および加水分解可能な結合のような生分解可能な結合の両方を含む。これらのいくつかの例は、ポリ（α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸）（Ｌｉｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２２：６５２４（２０００）；本明細書中に参考として援用される）、ネットワークポリ（アミノエステル）（Ｌｉｍら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３；９５２（２００２）；本明細書中に参考として援用される）、およびポリ（β−アミノエステル）類（Ｌｉｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２２：１０７６１（２０００）；Ｌｙｎｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２３：８１５５（２００１）；これらの各々は本明細書中に参考として援用される）を含む。ポリ（β−アミノエステル）類は、特に重要である。なぜなら、それらは低細胞傷害性を示し、そして一級アミンまたはビス（二級アミン）のジアクリレートへの共役付加を経由して容易に合成されるからである（図１１）（Ｌｙｎｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２２：１０７６１（２０００）；Ｌｙｎｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２３：８１５５（２００１）；これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。
新規な生体医療ポリマーの伝統的な開発は反復プロセスである。ポリマーは、代表的には、一度に設計されたポリマーであり、そして次にそれらの性質について個々に試験された。より最近には、ポリマー性生体材料の構造的に多様なライブラリーの生成を容易にする並行コンビナトリアルアプローチの開発に注意が集中されている（Ｂｒｏｃｃｈｉｎｉ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５３：１２３（２００１）；本明細書中に参考として援用される）。このコンビナトリアルアプローチはまた、遺伝子送達ポリマーの発見に応用されている。例えば、Ｍｕｒｐｈｙら、固相合成による６７ペプトイドの生成された標的コンビナトリアルライブラリー、および新規な遺伝子送達剤を同定するためのそれらのスクリーニング（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９５：１５１７（１９９８）；本明細書中に参考として援用される）。
この実施例では、高スループットな並行コンビナトリアル合成および２３５０の構造的に多様なポリ（β−アミノエステル）類の大ライブラリーの細胞を基礎にしたスクリーニングのための新規なツールが記載される。このアプローチは、合成の後、そもそも溶液相を去るポリマー類のない細胞を基礎にしたアッセイ中でポリマー類のスクリーニングを可能にする。ロボット工学流体取り扱いシステムの使用と組み合わせたこのアプローチは、比較的短時間に細胞を基礎にしたアッセイで数千の合成ポリマーの生成と試験を可能にする。このアプローチを用いることは、ポリ（エチレンイミン）のような従来の非ウイルス送達システム同様またはそれより良好に挙動する４６の新規なポリマーが同定された。
（結果および討論）
（高スループットポリマー合成） ポリ（β−アミノエステル）合成および試験のスループットおよび自動化を制限する主要な因子は、モノマーおよびポリマー溶液の粘度、ならびに固体ポリマー産物の操作にともなう困難性であった。液体取り扱いの自動化は、従来のロボット工学を用いて簡単であるが、小スケールの固体および粘性液体の操作はそうではない。従って、ポリマーが合成され、そしてこの溶液相を去ることなく細胞を基礎にしたアッセイ中でスクリーニングされ得るシステムが開発された。これは、この細胞アッセイ中に残存する溶媒の存在を必要とするであろうため、比較的非毒性の溶媒ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が選択された。ＤＭＳＯは、細胞培養で一般に用いられる溶媒であり、そして細胞の凍結ストックを貯蔵することで慣用的に用いられている。ＤＭＳＯは、水と混和可能であり、そして生存システム中で一般に良好に寛容される。
高スループット合成を準備するための最初のステップは、取り扱い可能な粘度をなお所有するポリマーの生成を可能にし得る条件を識別することであった。小スケールのパイロット実験は、重合が、ＤＭＳＯ中１．６Ｍ、５６℃、５日間で効率的に実行され得ることを示した。これらの実験に基づき、ポリマー合成および試験のための一般的戦略が開発された。すべてのモノマー（図１２）はＤＭＳＯ中で１．６Ｍに希釈され、そして次に、流体取り扱いロボットおよび１２チャネルのマイクロピペッターの両方を用い、本発明者らは、１５０マイクロリットルの各アミンおよびジアクリレートモノマーをポリプロピレンのディープウェルプレート中に添加し、そして次にそれをアルミニウムホイルでシールした。これらプレートを回転式シェーカー上に置き、そして５６℃で５日間インキュベートした。ポリマー溶液の増加した粘度を補償するために、１ｍｌのＤＭＳＯをプレートの各ウェルに添加し、そしてプレートをさらなる使用まで４℃で貯蔵した。これらの方法は一日に２３５０反応を可能にした。さらに、９６ウェルフォーマット中のポリマーの生成および貯蔵は、ポリマートランスフェクション効率の９６ウェルフォーマットの細胞を基礎にした試験への容易な移行を可能にした。
（高スループットポリマー試験） 一旦合成されると、すべてのポリマーは、ルシフェラーゼ発現プラスミドｐＣＭＶ−ｌｕｃをサル腎臓線維芽細胞株ＣＯＳ−７中に送達するそれらの能力について試験された。ポリマーライブラリーの大きなサイズに起因して、トランスフェクション効率の細胞を基礎にしたスクリーニングのための高スループット方法が開発された。ポリマーは９６ウェルプレート中に貯蔵されていたので、すべてのポリマー希釈、ＤＮＡ複合体化、および細胞トランスフェクションは、液体取り扱いロボットを用いてプレートからプレートにポリマーを直接移すことにより平行して実施した。すべてのポリマーは、同じ濃度のアミンモノマーを用いて合成され、それ故、固定されたアミンモノマー：ＤＮＡリン酸比（Ｎ：Ｐ比）のポリマー間の比較は簡単であった。アミンモノマーは、モノマーあたり１つ、２つ、または３ついずれかのアミンを含む一方、トランスフェクション効率に対する初期の広範な基礎としたスクリーニングは、単一プレートのすべてのウェルにおいて一定であるモノマー濃度、そしてそれ故、反応あたりのポリマー溶液の一定容量を維持することにより大いに単純化された（以下の方法を参照のこと）。
ポリ（エチレンイミン）のようなカチオン性ポリマーを用いるインビトロトランスフェクションの効率は、複合体形成の間に存在するＤＮＡに対するポリマーの比に非常に感受性である（Ｇｅｂｈａｒｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ７３：４０１（２００１）；本明細書中に参考として援用される）。１０：１、２０：１、および４０：１のＮ：Ｐ比を、これらタイプのポリマーを用いた先の実験に基づく本発明者らの初期スクリーニングのために選択した。本発明者らの高スループットシステムを用い、本発明者らは、すべての２３５０のポリマーをこれら３つの比でスクリーニングした。各ポリマーについて最良の条件におけるトランスフェクション値をヒストグラムに表した（図１３）。これらの結果は、３つのコントロール：裸のＤＮＡ（トランスフェクション剤なし）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、およびリポフェクタミン２０００と比較した。トランスフェクション溶液中に存在する低残存レベルのＤＭＳＯは、裸のＤＮＡまたはＰＥＩいずれかのトランスフェクション効率に影響しなかった。２３５０のポリマーの３３は、この最適化されていないシステムでＰＥＩと同じかまたはより良好であることが見出された。
カチオン性ポリマートランスフェクションは、ポリマー：ＤＮＡ比に感受性である傾向にあるので、本発明者らは、本発明者らの予備スクリーニングから最良のポリマーを用いてトランスフェクション条件を最適化することを決定した。上記の結果を荒い指針として用い、最良の９３のポリマーに対するトランスフェクション条件を、広範な基礎としたスクリーニングにおいて同定された最適トランスフェクション条件の上または下のＮ：Ｐ比でそれらを試験することにより最適化した。高スループット最適化システムを開発するために、Ｎ：Ｐ比倍率器システムを用いて試験し、同時試験およびプレートからプレートへの移行を単純にした。予備スクリーニングで同定された最良のＮ：Ｐ比で開始して、これらポリマーは、最良比の０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５および１．７５倍に等しい６つのＮ：Ｐ比で三重に再試験した。例えば、所定のポリマーに対するスクリーニングで識別された最適比が２０：１である場合、そのときは、このポリマーは、１０：１、１５：１．２０：１、２５：１、３０：１、および３５：１のＮ：Ｐ比で三重に再スクリーニングした。最良の５０のポリマーに対する平均トランスフェクション効率が、最良条件からの標準偏差とともに、図１４にコントロールデータとともに示される。この実験では、ＰＥＩと同程度またはそれより良好にトランスフェクトする４６のポリマーが、同定された。すべての９３のこれらポリマーもまた、ＤＮＡを結合するそれらの能力についてアガロースゲル電気泳動を用いて試験した（図１５）。興味深いことに、予期されるように、ほぼすべてのポリマーがＤＮＡを結合するが、高レベルでトランスフェクトする２つのポリマー：Ｍ１７およびＫＫ８９はそうではなかった（図１４）。
これらポリマーのトランスフェクション性質をさらに調査するために、１０の高トランスフェクションポリマーを、グリーン蛍光タンパク質プラスミドｐＣＭＶ−ｅＧＦＰを送達するそれらの能力について試験した。ｐＣＭＶ−ｌｕｃとは異なり、ｐＣＭＶ−ｅＧＦＰは、何％の細胞がトランスフェクトされているかに関する情報を提供する。高レベルのトランスフェクションが１０のすべてのポリマーについて観察され、そして最良の２つが図１６中に示される。
上記のアッセイで同定された「ヒット物」は、驚くべきことに多様かつ予期せぬコレクションのポリマーを示した。特に驚くべきことは、疎水性のＤ−モノマーベースのポリマーの大きなコレクションである。事実、最良に機能する５０のポリマーを作製するために用いたジアクリレートモノマーは、大部分いつも疎水性である。さらなる分析は、効率的なポリマーの２つのより共通な特徴を示した：１）最良の従来試薬リポフェクタミン２０００より良好である、２６のポリマーのうち１２は、モノアルコール基およびジアルコール基を有し、そして２）直線状のビス（二級アミン）もまたヒット物構造において一般的である。また驚くべきことに、高レベルでトランスフェクトするがＤＮＡを結合するようには見えない２つのポリマー（ＫＫ８９およびＭ１７）の同定である。両者はまた、ｐＨ５およびｐＨ７で不溶性である。ＤＮＡ取り込みを容易にするそれらの能力は、細胞膜の透過化処理に起因し得る。
遺伝子送達ポリマーの機能にとってまた重要なのは長さである（Ｒｅｍｙら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３０：８５（１９９８）；Ｓｃｈａｆｆｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ６７：５９８（２０００）；これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。これらの結果をフレームワークとして用い、各ヒット物ポリマーに対する所定範囲のポリマー長さを、相対的モノマー濃度を注意深く変えることにより調製し得る。証拠は、（１）ＰＥＩのように、ポリ（β−アミノエステル）長さは、これらポリマーの遺伝子送達の熟達において重要であること、そして（２）本明細書で同定されたヒット物は、従来法を用いて再合成され得、そしてなおＤＮＡを効率的に送達することを示す。
（実験プロトコール）
（ポリマー合成） モノマーは、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＴＣＩ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）、Ｐｆａｌｔｚ＆Ｂａｕｅｒ（Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ、ＣＴ）、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＳＣ）、Ａｃｒｏｓ−Ｆｉｓｈｅｒ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｏｎｔａｒｉｏ、ＮＹ）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）、およびＤａｊａｃ ｍｏｎｏｍｅｒ−ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｆｅａｓｔｅｒｖｉｌｌｅ、ＰＡ）から購入した。これらは、ＤＭＳＯ（Ａｌｄｒｉｃｈ）中に１．６Ｍの最終濃度に溶解された。すべての可能な対様の組み合わせのアミンおよびジアクリレートモノマーを１５０μｌのアリコート中で、２ｍｌの９６ウェルポリプロピレンマスターブロックディープウェルプレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｌｏｎｇｗｏｏｄ、ＦＬ）の各ウェルに添加した。これらプレートをアルミニウムホイールでシールし、そして回転シェーカー上で回転しながら５６℃でインキュベートした。５日後、１ｍｌのＤＭＳＯを各ウェルに添加し、そしてこれらプレートは、再シールし、そして使用されるまで４℃で貯蔵した。
（トランスフェクション実験） １，４０００のｃｏｓ−７細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を単色の白または透明な９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ、ＭＥ）の各ウェル中に接種し、そして５００ｍｌのフェノールレッドマイナスＤＭＥＭ、５０ｍｌの熱不活性化ＦＢＳ、５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から構成される増殖培地中で一晩付着させた。マスターブロック９６ウェルプレートの各ウェルを、１ｍｌの２５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５で充填した。これに、４０μｌ、２０μｌ、または１０μｌのポリマー／ＤＭＳＯ溶液を添加した。２５μｌの希釈ポリマーを、２５μｌの６０μｇ／ｍｌのｐＣＭＶ−ｌｕｃＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）またはｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、半分容量の９６ウェルプレート中で添加した。これらを１０分間インキュベートし、そして次に３０μｌのポリマー−ＤＮＡ溶液を、２００μｌのＯｐｔｉｍｅｍに、９６ウェルポリスチレンプレート中、重炭酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに添加した。培地を、１２チャネルワンド（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて細胞から除去し、その後、１５０μｌのｏｐｔｉｍｅｍ−ポリマー−ＤＮＡ溶液をすぐに添加した。複合体を細胞と１時間インキュベートし、そして次に１２チャネルのワンドを用いて除去し、そして１０５μｌの増殖培地で置き換えた。細胞を、３日間３７℃、５％ＣＯ２で増殖させ、そして次いで、発光（ｐＣＭＶ−ｌｕｃ）または蛍光（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１）について分析した。コントロール実験は、上記に記載のように実施されたが、合成されたポリマーを置換してポリ（エチレンイミン）ＭＷ２５，０００（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、そして０．５：１、０．７５：１、１：１、１．２５：１、１．５：１、および２：１のポリマー：ＤＮＡ重量比で実施した。リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクションは、複合体を１時間後に除去したことを除いて、供給元によって記載されるように実施した。
発光は、ｂｒｉｇｈｔ−ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて分析した。要約すれば、１００μｌのｂｒｉｇｈｔ−ｇｌｏ溶液を、培地および細胞を含むマイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。発光は、Ｍｉｔｈｒａｓ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）を用いて測定した。いくつかの場合では、ニュートラル密度フィルター（Ｃｈｒｏｍａ、Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ、ＶＴ）を用いて、ルミノメーターの飽和を防いだ。ルシフェラーゼの標準曲線は、白色マイクロタイタープレート中の増殖培地中へのルシフェラーゼ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）の滴定によって生成した。ｅＧＦＰ発現は、Ｚｅｉｓｓ Ａｃｉｏｖｅｒｔ ２００倒立顕微鏡を用いて調べた。
アガロースゲル電気泳動ＤＮＡ−結合アッセイは、先に記載のように（Ｌｙｎｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２３：８１５５（２００１）；本明細書中に参考として援用される）、４０：１のＮ：Ｐ比で行った。すべての液体取り扱いは、層流フード中で、ＥＤＲ３８４Ｓ／９６Ｓロボット（Ｌａｂｃｙｔｅ、Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）または１２チャネルのマイクロピペッター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｎｔａａ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて実施された。
（実施例５−高度に効率的な遺伝子送達のために最適化されたポリ（β−アミノエステル）の合成）
２つの特有のポリ（β−アミノエステル）構造のトランスフェクション性質に対する分子量、ポリマー／ＤＮＡ比、および鎖末端基の影響が決定された。これらの因子は、遺伝子送達機能に劇的な影響を有し得る。高スループットスクリーニング方法を用い、ＰＥＩおよびリポフェクタンミン２０００（２つの最良の市販され利用可能なトランシフェクション試薬）より良好にトランスフェクトするポリ（β−アミノエステル）が発見された。
（材料および方法）
（ポリマー合成） Ｐｏｌｙ−１およびＰｏｌｙ−２ポリマーを、１−アミノブタノール（９８％）に、１，４−ブタンジオールジアクリレート（９９＋％）および１，６−ヘキサンジオールジアクリレート（９９％）をそれぞれ添加することにより合成した。これらのモノマーは、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ、ＭＡ）から購入された。Ｐｏｌｙ−１およびＰｏｌｙ−２の各々１２のバージョンを、アミン／ジアクリレート化学量論比を変えることにより生成した。２４の特有のポリマーの各々を合成するために、４００ｍｇの１−アミノブタノールを、Ｔｅｆｌｏｎ裏打ちスクリューキャップを備えた８ｍＬのサンプルバイアル中に秤量した。次いで、適切な量のジアクリレートをこのバイアルに添加し、１．４と０．６との間の化学量論比を得た。小Ｔｅｆｌｏｎ被覆撹拌バーを次いで各バイアル中に置いた。これらバイアルを固くキャップし、そして１００℃で維持されたオーブン中にある複数位置磁性撹拌プレート上に配置した。５時間の反応時間の後、これらバイアルをオーブンから取り出し、そして４℃で貯蔵した。すべてのポリマーは、ＧＰＣによって分析した。
（ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）） ＧＰＣは、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ １１００シリーズのアイソクラティックポンプ、１００μＬインジェクションループをもつＲｈｅｏｄｙｎｅ Ｍｏｄｅｌ ７１２５インジェクター、およびＰｈｅｎｏｇｅｌ ＭＸＬカラム（５μ混合、３００×７．５ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を用いて実施した。７０％ＴＨＦ／３０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）＋０．１Ｍピペリジンを、１．０ｍＬ／分の流速で溶出剤として用いた。データは、Ｏｐｔｉｌａｂ ＤＳＰ干渉屈折計（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を用いて回収し、そしてＴｒｉＳＥＣ ＧＰＣソフトウェアパッケージ（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）を用いて処理した。これらポリマーの分子量および多分散は、単分散ポリスチレン標準に対して決定された。
（ルシフェラーゼトランスフェクションアッセイ） ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を、不透明の白色９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ、ＭＥ）の各ウェル中に接種し（１４，０００細胞／ウェル）、そして増殖培地中で一晩付着させた。増殖培地は、９０％フェノールレッドフリーＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から構成された。取り扱いを容易にするために、ポリマーストック溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）は、ＤＭＳＯ溶媒中で調製された。トランスフェクション混合物中の小残存量のＤＭＳＯは、トランスフェクション効率に影響せず、そして任意の観察可能な細胞傷害性を生じなかった。各ポリマーの作業希釈物は、２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）中で（異なるポリマー／ＤＮＡ重量比を生じるために必要な濃度で）調製された。２５μｌの希釈ポリマーを、９６ウェルプレートのウェル中の２５μｌの６０μｇ／ｍｌのｐＣＭＶ−ＬｕｃＤＮＡ（Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）に添加した。これら混合物を１０分間インキュベートし、複合体形成させ、そして次に、３０μｌのポリマー−ＤＮＡ溶液の各々を、９６ウェルポリスチレンプレート中に、重炭酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに添加した。増殖培地を、１２チャネル吸引ワンド（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて細胞から取り除き、その後、１５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ−ポリマー−ＤＮＡ溶液を直ちに添加した。複合体を、細胞とともに１時間インキュベートし、そして次に１２チャネルワンドを用いて除去し、そして１０５μｌの増殖培地で置換した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３日間増殖させ、そして次にルシフェラーゼ発現について分析した。コントロール実験がまた、ＰＥＩ（ＭＷ＝２５，０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施された。ＰＥＩトランスフェクションは、上記に記載のように実施されたが、１：１のポリマー：ＤＮＡ重量比を用いた。リポフェクタミン２０００トランスフェクションは、複合体が１時間後に除去されたことを除いて、供給元によって記載のように実施された。
ルシフェラーゼ発現は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて分析された。要約すれば、１００μｌのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ溶液を、培地および細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。蛍光は、Ｍｉｔｈｒａｓ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）を用いて測定した。１％のニュートラル密度フィルター（Ｃｈｒｏｍａ、Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ、ＶＴ）を用いて照度計の飽和を防いだ。ルシフェラーゼの標準曲線は、不透明白色９６ウェルプレート中の増殖培地中のルシフェラーゼ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）の滴定により生成した。
（細胞傷害性の測定） 細胞傷害性アッセイは、以下の例外を除いて、ルシフェラーゼトランスフェクション実験と同じ様式で実施された。３日後にルシフェラーゼ発現についてアッセイする代わりに、細胞を、１日後、ＭＴＴ細胞増殖アッセイキット（ＡＴＣＣ）を用いて代謝活性についてアッセイした。１０μＬのＭＴＴ試薬を各ウェルに添加した。３７℃で２時間のインキュベーションの後、１００μＬの界面活性剤試薬を各ウェルに添加した。次いで、プレートを室温で４時間暗所に置いた。吸光度を、ＳｐｅｃｔａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて５７０ｎｍで測定し、そしてコントロール（未処理）細胞に対する生存率％に変換した。
（細胞取り込み実験） 取り込み実験は、１２ウェルプレートフォーマットを６ウェルフォーマットの代わりに用いたことを除いて先に記載のように行った（Ａｋｉｎｃ、Ａら、遺伝子送達の分解可能なポリマーライブラリーの平行合成および生物物理学的特徴付け、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００３；本明細書中に参考として援用される）。ＣＯＳ−７細胞は、１．５×１０５細胞／ウェルの濃度で接種し、そして取り込み実験を実施する前に２４時間増殖させた。ポリマー／ＤＮＡ複合体の調製は、ルシフェラーゼトランスフェクション実験中におけるのと同様の様式で行われ、唯一の違いはスケールにおける増加（９６ウェルプレートのウェルあたり６００ｎｇのＤＮＡに対し、１２ウェルプレートのウェルあたり２．５μｇのＤＮＡ）、およびｐＣＭＶ−Ｌｕｃに代わるＣｙ５−標識プラスミドの使用である（Ａｋｉｎｃ、Ａ．およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ、非ウイルスベクターを用いて送達されたＤＮＡのｐＨ環境を測定すること：リソソーム輸送に対する関係、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、２００２、７８（５）；５０３〜８頁；本明細書中に参考として援用される）。トランスフェクション実験におけるように、複合体は、細胞と１時間インキュベートされ、エンドサイトーシスによる細胞取り込みを可能にした。細胞取り込みの相対的レベルを、Ｃｙ５−標識プラスミドで負荷した細胞の蛍光を測定するためにフローサイトメーターを用いて定量した。
（ＧＦＰトランスフェクション） ＧＦＰトランスフェクションを、ＣＯＳ−７（ミドリザル腎臓）、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓癌）、およびＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株中で実施した。すべての細胞株は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得、そして１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で維持した。細胞を、６ウェルプレート上に接種し、そしてトランスフェクション実験を実施するまえにほぼ８０〜９０％の集密まで増殖させた。ポリマー／ＤＮＡ複合体を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）（５μｇ／ウェル）を用いて上記のように調製した。複合体は、１ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に希釈し、そしてウェルに１時間添加した。これら複合体を次いで取り出し、そして新鮮増殖培地をこれらウェルに添加した。２日後、細胞を収穫し、そしてフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現について分析した。ヨウ化プロピジウム染色を用いて分析から死滅細胞を排除した。
（フローサイトメトリー） フローサイトメトリーは、ＧＦＰを励起し得る（４８８ｎｍ励起）アルゴンイオンレーザー、およびＣｙ５を励起し得る（６３５ｎｍ励起）赤色ダイオードレーザーを装備したＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実施した。ＧＦＰの放射は５３０ｎｍのバンドパスフィルターを用いてフィルターにかけ、そしてＣｙ５の放射は６５０ロングパスフィルターを用いてフィルターにかけた。細胞は、前方および側方散乱により適切にゲートに入れ、そしてサンプルあたり３０，０００事象が回収された。
（結果および討論）
（ポリマー合成） 先に記載のように（Ｌｙｎｎ、Ｄ．Ｍ．およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ、分解性ポリ（β−アミノエステル）：合成、特徴付け、およびプラスミドＤＮＡとの自己アセンブリ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００、１２２（４４）：１０７６１〜１０７６８頁；本明細書中に参考として援用される）、ポリ（β−アミノエステル）の合成は、アミンのアクリレート基への共役付加を経由して進行する。この反応は、ステップ重合であるので、広く統計的に分布した鎖長さが得られ、モノマーの化学量論よって制御される平均分子量および鎖末端基を有する（Ｆｌｏｒｙ、Ｐ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９５３、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｉｔｈａｃａ、Ｎ．Ｙ．４０〜４６頁、３１８〜３２３；Ｏｄｉａｎ、Ｇ．、Ｓｔｅｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、１９９１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、７３〜８９頁；これらの各々は本明細書中に参考として援用される）。分子量は、モノマーの比が化学量論当量に近づくにつれて増加し、そして過剰のアミンまたはジアクリレートモノマーは、それぞれ、アミン末端またはアクリレート末端鎖を生じる。このクラスのポリマーについて、化学量論の正確な制御が、ポリマー分子量を制御するために必須である。モノマー化学量論は、鎖長さに影響する最も重要な因子であるが、ポリマー産物の分子量および構造に衝撃を与え得る競合副反応に考慮がまた与えられるべきである。特に、成長するポリマー鎖の１つの端部上のアミンが他方の端部上のアクリレートと反応する場合、分子内環化反応が、得られる分子量を制限し得る（Ｏｄｉａｎ、Ｇ．、Ｓｔｅｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、１９９１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．：Ｙｅｗ Ｙｏｒｋ、７３〜８９頁；本明細書中に参考として援用される）。これらの環状鎖はまた、それらの直線状相当物の性質とは異なる性質を有し得る。
この研究では、本発明者らは、モノマー化学量論をより良好に制御するため、そして環化反応を最小にするために、先に報告された重合手順を改変した。第１に、合成のスケールを、ほぼ０．５ｇから１ｇに増加し、１％以内の化学量論の制御を可能にした。正確さにおけるさらなる改良は、用いられる市販され利用可能なモノマーの純度（９８〜９９％）によって制限される。第２に、すべてのモノマーは、容量測定で分与される代わりに、バイアル中に秤量された。実際のモノマー密度と報告されたモノマー密度と間の不一致は、いくつかの場合には、無視できないことが見出され、分与された塊における不正確さに至る。第３に、重合は、溶媒の不在化で実施され、モノマー濃度を最大にし、それ故、分子内環化反応に対し分子内付加反応を嗜好する。溶媒をなくすることはまた、反応速度を増加すること、および溶媒除去ステップをなくすることの付加された利点を提供する。最後に、先に採用されたメチレンクロライド溶媒を用いなかったので、反応温度は、４５℃から１００℃まで増加され得る。増加する温度は、増加した反応速度および反応混合物の粘度における減少をもたらし、溶媒のないシステムのより高い粘度をずらすことを支援する。増加したモノマー濃度と反応温度の組み合わされた効果は、反応時間においてほぼ５日から５時間の減少を生じた。
本発明者らは、１−アミノブタノールに、１、４−ブタンジオールジアクリレートおよび１，６−ヘキサンジオールジアクリレートを添加することにより、ポリマーＰｏｌｙ−１およびＰｏｌｙ−２をそれぞれ合成した。各ポリマーの１２の特有のバージョンを、０．６と１．４との間でアミン／ジアクリレートのモル比を変えることによって合成した。
両方のセットのポリマー（Ｐｏｌｙ−１およびＰｏｌｙ−２）について、１２のうちの７は、＞１のアミン／ジアクリレート比を有し、アミン末端ポリマーを生じ、そして１２のうち５は、＜１のアミン／ジアクリレート比を有し、アクリレート末端ポリマーを生じた。１００℃における５時間の反応の後、ポリマーは、透明なわずかに黄色がかった粘性の液体として得られた。これらポリマーは、分子量における差異に対応して粘度における観察可能な差異を有していた。ポリマーは、７０％ＴＨＦ／３０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）＋０．１Ｍピペリジン溶出剤を採用する有機相ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により分析された。ポリマー分子量（Ｍｗ）は、ポリスチレン標準物に対して３３５０（Ｐｏｌｙ−１、アミン／ジアクリレート＝１．３８）〜１８，０００（Ｐｏｌｙ−１、アミン／ジアクリレート＝０．９５）の範囲であった（図１６）。分子量分布は、１．５５〜２．２０の範囲の多分散性指数（ＰＤＩ）をもつ単様態であった。
（ルシフェラーゼトランスフェクション結果） トランスフェクション実験は、すべての２４の合成されたポリマーを用い（Ｐｏｌｙ−１およびＰｏｌｙ−２の各々１２）、９の異なるポリマー／ＤＮＡ比で実施され、トランスフェクション効率に対する、分子量、ポリマー／ＤＮＡ比、および鎖末端基の影響を決定した（図１７および１８）。モデルシステムとして、本発明者らは、ＣＯＳ−７細胞株およびホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミド（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）（６００ｎｇ／ウェル）を用いた。ほぼ１０００のトランスフェクションの挙動を容易にするために（データは四重で得た）、実験は、９６ウェルプレートフォーマットで行った。レポータータンパク質発現レベルは、市販され入手可能なルシフェラーゼアッセイキット、および９６ウェルの発光プレートリーダーを用いて決定された。
図１７および１８に示されるデータは、ポリマー分子量、ポリマー／ＤＮＡ比、および鎖末端基が、Ｐｏｌｙ−１およびＰｏｌｙ−２ポリマー両方のトランスフェクション性質に影響することを示す。１つの顕著でかついくぶん予期されない結果は、アクリレート末端のポリマーのいずれもが、評価された条件のいずれの下においても認知可能なレベルのトランスフェクションを媒介しなかったことである。この結果は、ポリ（β−アミノエステル）に対してより広範に適用可能であり得る。なぜなら、本発明者らは、本発明者らが採用したポリマー／ＤＮＡ比のいずれにおいても、過剰のジアクリレートモノマーを用いて、認知可能なレポーター遺伝子発現を媒介するポリマーをなお合成しなければならないからである。これらの知見は、おそらく、アミン末端ポリ（β−アミノエステル）のみが、遺伝子送達ビヒクルとしての使用のために適切であることを示唆する。対照的に、Ｐｏｌｙ−１およびＰｏｌｙ−２両方のアミン末端バージョンについてＭＷ−ポリマー／ＤＮＡスペース中にトランスフェクション活性の別個の領域が存在した（図１７−Ａおよび１８−Ａ）。６０ｎｇ ｌｕｃ／ウェルおよび２６ｎｇ ｌｕｃ／ウェルの最大レポーター遺伝子発現レベルが、Ｐｏｌｙ−１（Ｍｗ＝１３，１００）およびＰｏｌｙ−２（Ｍｗ＝１３，４００）を用いて、それぞれ達成された。これらの結果は、同じ条件下で６ｎｇ ｌｕｃ／ウェルの発現レベルを媒介した（データは示さず）、ＰＥＩ（ポリマー／ＤＮＡ＝１：１ｗ／ｗ）と極めて有利に匹敵する。
両方のポリマー構造のより大きな分子量バージョンを用いて最高のレベルのトランスフェクションが生じるけれども、これらポリマーの最適ポリマー／ＤＮＡ比は顕著に異なった（Ｐｏｌｙ−１についてはポリマー／ＤＮＡ＝１５０、Ｐｏｌｙ−２についてはポリマー／ＤＮＡ＝３０）。Ｐｏｌｙ−１およびＰｏｌｙ−２について本発明者らが得たトランスフェクション結果は、ポリマー分子量およびポリマー／ＤＮＡ比を最適化することの重要性、ならびに鎖末端基を制御する重要性を強調する。さらに、繰り返し単位におけるたった２つの炭素によって異なる、２つのこのような類似のポリマー構造が、このような異なる最適トランスフェクションパラメーターを有するという事実は、各特有のポリマー構造についてこれらの最適化を実施する必要性を強調する。この得られたトランスフェクション結果の理解を改善するために、本発明者らは、移入遺伝子発現に直接影響する２つの重要な送達特徴、細胞傷害性おびエンドサイトーシスを経由して細胞に侵入する能力を調査することを選択した（Ｗｉｅｔｈｏｆｆ、Ｃ．Ｍ．およびＣ．Ｒ．Ｍｉｄｄａｕｇｈ、非ウイルス遺伝子送達に対する障壁、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００３、９２（２）：２０３〜２１７頁、本明細書中に参考として援用される）。
（細胞傷害性） 本発明者らは、標準的なＭＴＴ／チアゾリルブルー色素還元アッセイを用いて種々のポリマー／ＤＮＡ複合体の細胞傷害性を評価した。これらの実験は、３日目にレポーター遺伝子発現についてアッセイする代わりに、１日後にＭＴＴアッセイを実施したことを除いて、正確に上に記載のトランスフェクション実験のように実施した（材料および方法を参照のこと）。本発明者らは、最初、アクリレート末端ポリマーについて観察されたトランスフェクション活性の欠如は、アクリレート末端基の細胞傷害性に起因していたであろうと仮定した。図１９−Ｂおよび２０−Ｂは、高濃度のアクリレートは細胞傷害性であることをまさに示す。なぜなら、生存率は、ポリマー／ＤＮＡ比が増加し、そしてポリマーＭｗが減少するとともに減少することが観察されるからである（より低いＭｗは、より高い濃度の末端基に対応する）。しかし、アクリレートの細胞傷害性は、より低いポリマー／ＤＮＡ比、またはより大きな分子量におけるトランスフェクション活性を十分には説明しない。図１９−Ａに示されるデータは、細胞傷害性は、Ｐｏｌｙ−１ベクターにとって制限因子ではないことを示す。なぜなら、細胞は、最高のポリマー／ＤＮＡ比でさえ、生存したままであるからである。その一方、図２０−Ａに示されるデータは、細胞傷害性が、特により小さな分子量ポリマーについて、Ｐｏｌｙ−２ベクターのトランスフェクション効率を制限する主要な因子であることを示唆している。この結果は、ポリマー／ＤＮＡ＞３０において、Ｐｏｌｙ−２ベクターについてなぜトランスフェクション活性が存在しないか、または減少するのかを説明し得る（図１８−Ａを参照のこと）。
（細胞の取り込み） 細胞によって取り込まれるべきポリマー／ＤＮＡ複合体の能力は先に記載のフローサイトメトリーを基礎にした技法を用いて評価され、ベクターで送達されたＤＮＡの蛍光を測定した（Ａｋｉｎｃ、Ａ．、ら、遺伝子送達の分解性ポリマーライブラリーの平行合成および生物物理学的特徴、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００３；本明細書中に参考として援用される）。簡単に述べれば、ポリマー／ＤＮＡ複合体は、蛍光色素Ｃｙ５で共有結合より標識されたプラスミドＤＮＡを用いて調製された。細胞取り込みデータの上記で概説した遺伝子発現データとの比較を可能にするために、複合体を同じポリマー／ＤＮＡ比で、かつ上記トランスフェクション実験におけるのと同じ様式で形成した。標識された複合体を、ＣＯＳ−７細胞と３７℃で１時間インキュベートし、取り込みを可能にした。粒子取り込みの相対レベルを、次いで、Ｃｙ５−標識ＤＮＡを負荷された細胞の蛍光を測定することにより定量した。これらの取り込み実験の結果を図２１および２２に要約する。図２１−Ｂおよび２２−Ｂに示されるデータは、アクリレート末端ポリマーについてのトランスフェクション活性の欠如は、最初考えられたように、細胞傷害性に起因するのではなく、むしろ細胞に侵入する能力のないことであることを示唆している。同様に、Ｐｏｌｙ−１複合体は、厳しく全く取り込みが制限されるが、最高のポリマー／ＤＮＡ比ではそうではない（図２１−Ａ）。このデータは、Ｐｏｌｙ−１について得られたトランスフェクション結果とは正確に相関していないが、非常に高いポリマー／ＤＮＡ比が採用されるまで、トランスフェクション活性が観察されないという事実と一致している。Ｐｏｌｙ−２複合体は、＜３０のポリマー／ＤＮＡ比で認知し得る細胞取り込みを示さず、そしてポリマー／ＤＮＡ比が３０を超えて増加するとき、取り込みのレベルが増加する（図２２−Ａ）。この結果は、上記の細胞傷害性結果と組み合わせ、Ｐｏｌｙ−２複合体のトランスフェクション活性を説明することを支援する。３０より少ないポリマー／ＤＮＡ比で、複合体は、細胞に効率的に侵入しないが、ポリマー／ＤＮＡ比が３０を超えてかなり増加するとき、細胞傷害性は、トランスフェクション効率を制限し始め、ポリマー／ＤＮＡ＝３０の近傍で最適トランスフェクション活性を生じる。
エンドサイトーシスが細胞侵入の主要な経路である場合、ナノメートル−スケールのポリマー／ＤＮＡ複合体の効率的な形成が、高レベルの細胞取り込みを達成するための１つの条件である（Ｄｅ Ｓｍｅｄｔ、Ｓ．Ｃ．、Ｊ．Ｄｅｍｅｅｓｔｅｒ、およびＷ．Ｅ．Ｈｅｎｎｉｎｋ、カチオン性ポリマーを基礎にした遺伝子送達システム、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００、１７（２）；１１３〜１２６頁；Ｐｒａｂｈａ、Ｓ．、ら、ナノ粒子媒介遺伝子トランスフェクションのサイズ依存性；分画ナノ粒子を用いた研究、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２００２、２４４（１〜２）；１０５〜１１５頁；これらの各々は参考として本明細書中に援用される）。多くのポリマー／ＤＮＡ複合体について観察される乏しい取り込みレベルは、安定なナノスケール複合体の形成の失敗に起因していたかも知れない。不幸なことに、上記ポリマーの乏しい中性ｐＨ溶解度は、希釈剤として、トランスフェクション培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ還元血清培地、ｐＨ７．２）を用いる複合体サイズの動的光散乱測定を行うことを妨げた。得られた読み取り値は、いくつかの場合にＯｐｔｉ−ＭＥＭ中でポリマーの溶液中で濁度として目で見えたポリマー沈殿物に起因した。しかし、本発明者らは、サンプル希釈剤として２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を用いて複合体の有効直径を測定し得た。このデータは、トランスフェション培地中の複合体のサイズまたは安定性を明らかにすることはできないが、それは、複合体が、トランスフェクション培地への添加の前に首尾よく形成されたか否かを示し得る。詳細には、本発明者らは、Ｐｏｌｙ−１の低分子量バージョン（Ｍｗ＜１０，７００）が、酢酸緩衝液中でさえ、ナノスケール複合体を形成し得ないことを見出した。すべてのその他の場合において、本発明者らは、ナノメートルサイズのポリマー／ＤＮＡ複合体が形成されたことを見出した。これらの結果は、Ｐｏｌｙ−１の低分子量バージョンにともなう乏しい取り込みレベルを説明し得るが、それらは、アクリレート末端ポリマーの低取り込み活性、または細胞取り込みに対するポリマー／ＤＮＡ比の依存性を満足に説明しない。粒子サイズおよび安定性は、細胞取り込みに影響する重要な因子であるが、その他のなお未同定の因子がまた、得られた細胞取り込み結果のより完全な説明を提供するために考慮されなければならないようである。
（同時複合体化剤を用いるトランスフェクションの増大） Ｐｏｌｙ−１およびＰｏｌｙ−２の両方は、高レベルの遺伝子移入を達成するために比較的高いポリマー／ＤＮＡ重量比を必要とする。１つの説明は、ＤＮＡをコンパクトにするためにしばしば用いられるその他のポリマー（例えば、ポリリジン（ＰＬＬ）およびＰＥＩ）と比較して、これらのポリマーは比較的低い窒素密度を有することであり得る。Ｐｏｌｙ−１は、３０１の窒素原子あたりの分子量（ＭＷ／Ｎ）を有し、そしてＰｏｌｙ−２は３２９のＭＷ／Ｎを有する。比較として、ＰＬＬおよびＰＥＩは、これらの形態は、ほぼそれぞれ６５および４３である。小量の同時複合体化剤を取り込むことにより、高レベルのトランスフェクションを達成するために必要なＰｏｌｙ−１またはＰｏｌｙ−２の量を低減することが可能であり得る。このアプローチは、Ｐｏｌｙ−２ベクターについて特に有利であり得る。なぜなら、細胞傷害性がこれらのベクターにとって重要な制限であるようだからである。この仮説を試験するために、ＰＬＬおよびＰＥＩをモデル同時複合体化剤として用いた。本発明者らは、ポリマーのＰｏｌｙ−１（アミン−末端、Ｍｗ＝１３，１００）セットおよびＰｏｌｙ−２（アミン末端、Ｍｗ＝１３，４００）セットの各々中の最も有望なメンバーに本発明者らの注意を集中した。図２３および２４に示されたデータは、ＰＬＬまたはＰＥＩの同時複合体化剤としての使用を通じて、高レベルのトランスフェクション効率を維持しながら、ポリマーの有意な減少が達成され得ることを示す。いくつかの場合には、トランスフェクション活性の有意な増大が実現された。予期されるように、この同時複合体化アプローチは、Ｐｏｌｙ−２ベクターについて特に有益であった。この研究、および先の研究（Ｗａｇｎｅｒ、Ｅ．、ら、インフルエンザウイルス血球凝集素ＨＡ−２Ｎ末端融合誘発ペプチドは、トランスフェリン−ポリリジン−ＤＮＡ複合体により遺伝子移入を増強する：合成ウイルス様遺伝子移入ビヒクルに向けて、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９２、８９（１７）；７９３４〜８頁；Ｆｒｉｔｚ、Ｊ．Ｄ．、ら、ヒストン縮合プラスミドＤＮＡを用いる哺乳動物中への遺伝子移入、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１９９６、７（１２）；１３９５〜４０４頁；Ｐａｃｋ、Ｄ．Ｗ．、Ｄ．Ｐｕｔｎａｍ、およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ、遺伝子送達のためのイミダゾール含有エンドソーム溶解性生体ポリマー、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、２０００、６７（２）；２１７〜２３頁；Ｌｉｍ、Ｙ．Ｂ．、ら、自己アセンブルされた、カチオン性Ｄｅｎｔｒｉｍｅｒ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔｕｒｉｌ、およびＤＮＡの三元複合体；遺伝子送達キャリアを開発する際の非共有結合戦略、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ、２００２、１３（６）；１１８１〜５；これらの各々は本明細書中に参考として援用される）は、相補的遺伝子移入特徴をもつポリマーをブレンドすることは、いくつかの場合には、より効率的な遺伝子送達試薬を生成し得ることを示す。
（ＧＦＰトランスフェクション）
Ｐｏｌｙ−１／ＰＬＬおよびＰｏｌｙ−２／ＰＬＬがブレンドされた試薬のトランスフェクション性質をさらに評価するため、本発明者らは、グリーン蛍光タンパク質をコードするレポータープラスミド（ｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）を用いるトランスフェクション実験を実施した。ルシフェラーゼおよびＧＦＰトランスフェクションアッセイシステムは、両方がトランスフェクション活性を測定するが、それらは、異なるタイプの情報を提供する。ルシフェラーゼシステムは、所定のウェル中のすべての細胞より産生される外来ルシフェラーゼタンパク質の合計量を定量し、蓄積トランスフェクション活性の尺度を提供する。対照的に、ＧＦＰシステムは、トランスフェクトされた細胞の％を定量するために用いられ得、トランスフェクト活性の細胞毎の尺度を提供する。両方のシステムは、有用であり、そして所定の遺伝子送達システムのトランスフェクション性質に関する相補的な情報を提供する。
ＧＦＰトランスフェクションは、ルシフェラーゼ実験と類似の様式で実施されたが、６ウェルプレートフォーマット（５μｇプラスミド／ウェル）までスケールアップされた。ＣＯＳ−７細胞は、Ｐｏｌｙ−１／ＰＬＬ（Ｐｏｌｙ−１：ＰＬＬ：ＤＮＡ＝６０：０．１：１ｗ／ｗ／ｗ）およびＰｏｌｙ−２／ＰＬＬ（Ｐｏｌｙ−２：ＰＬＬ：ＤＮＡ＝１５：０．４：１ｗ／ｗ／ｗ）を用いてトランスフェクトした。リポフェクタミン２０００（μＬ試薬：μｇＤＮＡ＝１：１）、ＰＥＩ（ＰＥＩ：ＤＮＡ＝１：１ｗ／ｗ、Ｎ／Ｐ〜８）、および裸のＤＮＡをこの実験におけるコントールとして用いた。細胞との１時間のインキュベーションの後、ベクターを除去し、そして新鮮増殖培地を添加した。２日後、ＧＦＰ発現を、フローサイトメーターを用いてアッセイした。Ｐｏｌｙ−１／ＰＬＬでトランスフェクトしたほぼすべての細胞は、ＧＦＰ発現について陽性であった（図２５および２６）。実験は、Ｐｏｌｙ−２／ＰＬＬベクターがより効率的でなく、ほぼ２５％の陽性細胞を生じたことを示した。ポジティブコントロールのリポフェクタミン２０００およびＰＥＩはまた、採用された条件下でＣＯＳ−７細胞の効率的なトランスフェクションを媒介し得た。リポフェクタミン２０００トランスフェクションおよびＰＥＩトランスフェクションは、Ｐｏｌｙ−１／ＰＬＬとほぼ同じ％のＧＦＰ−陽性細胞を生じたが、ＧＦＰ−陽性細胞の蛍光レベルは、Ｐｏｌｙ−１／ＰＬＬについて（平均蛍光＝６０３３）、リポフェクタミン２０００（平均蛍光＝５４３３）およびＰＥＩ（平均蛍光＝２８８２）の両方のそれより高かった。陽性細胞の％を陽性細胞の平均蛍光レベルによって乗じることは、サンプルに対する統合発現の尺度を提供し、そして、理論では、ルシフェラーゼ遺伝子発現実験の結果とより良好に相関する。このように合計ＧＦＰ発現を定量することは、最高の発現レベルがＰｏｌｙ−１／ＰＬＬによって達成され、次いでリポフェクタミン２０００およびＰＥＩであることを示す。この結果は、ルシフェラーゼ発現結果とほぼ一致する。
実験は、Ｐｏｌｙ−１／ＰＬＬ（Ｐｏｌｙ−１：ＰＬＬ：ＤＮＡ＝６０：０．１：１ｗ／ｗ／ｗ）が、ＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトするための高度に有効なベクターであることを示した。このベクターの３つのその他の一般に用いられる細胞株（ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＨｅｐＧ２）におけるトランスフェクションを媒介する能力もまた調査された。これら細胞株の各々は、ＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトするために用いられる条件とは異なる最適トランスフェクション条件を有する可能性が高い；しかし、複数の細胞株をトランスフェクトする能力の予備評価として、トランスフェクションは、ＣＯＳ−７トランスフェクションと同じ様式および同じ条件下で実施された。結果は、Ｐｏｌｙ−１／ＰＬＬ（Ｐｏｌｙ−１：ＰＬＬ：ＤＮＡ＝６０：０．１：１ｗ／ｗ／ｗ）が、ＣＯＳ−７細胞ほど効率的ではないが、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＨｅｐＧ２細胞を首尾よくトランスフェクトし得ることを示す。これらは驚く必要はない。なぜなら、用いたベクターは、ＣＯＳ−７細胞における遺伝子移入についてスクリーニングによって最適化されたからである。各細胞タイプに特異的なベクター組成物およびトランスフェクション条件の最適化が、より高いトランスフェクションレベルを生ずることが予期され得る。
（要約）
この研究では、多くの重要な遺伝子移入性質に対するポリマー分子量、ポリマー鎖末端基、およびポリマー／ＤＮＡ比の役割が調査された。すべて３つの因子が、遺伝子移入に対する有意な影響を有することが見出され、これらパラメーターを注意深く制御および最適化する利益を強調した。さらに、複合体化を支援するために用いられた小量のＰＬＬの取り込みが、遺伝子移入をさらに増強する。これらのアプローチにより、インビトロ遺伝子移入のための最良の利用可能な非ウイルスベクターのいくつかに匹敵する分解性ポリ（β−アミノエステル）を基礎にしたベクター。
（実施例６−選択されたポリ（β−アミノエステル）のさらなる研究）
先のスクリーニングで同定されたポリ（β−アミノエステル）のいくつかをさらに特徴付けおよび合成するために、２１のポリマーを、アクリレートモノマーに対するアミンモノマーの種々の比で再合成した。得られるポリマーは、ゲル透過クロマトグラフィーにより特徴付け、各ポリマーの分子量および多分散性を決定した。ポリマーの各々は、次いで、細胞をトランスフェクトするその能力について試験した。
（ポリマー合成） ポリマーは、実施例５に記載のように合成された。各ポリマーのいくつかのバージョンを、アミン／ジアクリレート化学量論比を変えることにより生成した。例えば、Ｃ３６−１は、１．４の化学量論比に、Ｃ３６−１２は０．６に対応し、すべての中間体は以下の表で与えられる；

これらポリマーは、代表的には、溶媒なしで、ガラスバイアル中、１００℃５時間で調製された。いくつかの合成では、１００℃における重合は、アミン９４のような特定のモノマーが用いられたとき高度に架橋されたポリマーを生じた；それ故、この重合反応は、架橋を避けるために添加された２ｍＬのＤＭＳＯとともに５０℃で繰り返した。
得られるポリマーは、実施例５に記載のようにＧＰＣによって分析した。これらポリマーの各々の分子量および多分散性を以下の表中に示す。
（ルシフェラーゼトランスフェクションアッセイ） 実施例５に記載されるように、ＣＯＳ−７細胞を、１０：１〜１００：１（重量：重量）の範囲のＤＮＡに対するポリマー比で各ポリマーを用いて、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ ＤＮＡでトランスフェクトした。ルシフェラーゼ発現を、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて分析した。実施例５に記載されるように、発光を各トランスフェクションについて測定し、そして発光を用いてルシフェラーゼ酵素（ｎｇ）を見積もった。実験を、四重で実施した。以下の表に示される値は、４回の実験の平均値である。これらのデータは、各合成されたポリマーについて以下に示される。
以下の表は、上に記載される１．４〜０．６の範囲の、アクリレートモノマーに対するアミンモノマーの比率を用いる、右に列挙されたポリマーの合成を示す。次いで、このポリマーの各合成を、ＤＮＡに対する６つの異なるポリマー比（各実験を四重で実施した）を用いてルシフェラーゼトランスフェクションについて試験した。表中のデータは、最良のＤＮＡに対するポリマー比率でのルシフェラーゼ活性を示す。
本発明の好ましい実施形態によれば、以下の化合物などが提供される。
（項１）
以下の式で表される化合物：

ここで、Ｘは、メチル、ＯＲまたはＮＲ ２ であり；
Ｒは、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、環、ヘテロ環、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され；
各Ｒ’は、水素、Ｃ １ −Ｃ ６ 低級アルキル、Ｃ １ −Ｃ ６ 低級アルコキシ、ヒドロキシ、アミン、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、シアノ、チオール、ヘテロアリール、アリール、フェニル、ヘテロ環、炭素環式、およびハロゲンからなる群から独立に選択され；
ｎは、３と１０，０００との間の整数であり；
ｘは、１と１０との間の整数であり；
ｙは、１と１０との間の整数である；ならびにその誘導体およびその塩。
（項２）
前記化合物がアミン末端である、請求項１に記載の化合物。
（項３）
前記化合物がアクリレート末端である、請求項１に記載の化合物。
（項４）
ｘが、２と７との間の整数である、請求項１に記載の化合物。
（項５）
ｘが４である、請求項１に記載の化合物。
（項６）
ｘが５である、請求項１に記載の化合物。
（項７）
ｘが６である、請求項１に記載の化合物。
（項８）
ｙが、２と７との間の整数である、請求項１に記載の化合物。
（項９）
ｙが４である、請求項１に記載の化合物。
（項１０）
ｙが５である、請求項１に記載の化合物。
（項１１）
ｙが６である、請求項１に記載の化合物。
（項１２）
Ｒが水素である、請求項１に記載の化合物。
（項１３）
Ｒが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、およびヘキシルである、請求項１に記載の化合物。
（項１４）
前記化合物の構造が、

であり、ここで、Ｒが水素、ｘが４、およびｙが４である、請求項１に記載の化合物。
（項１５）
前記化合物の構造が、

であり、ここで、Ｒが水素、ｘが６、およびｙが４である、請求項１に記載の化合物。
（項１６）
前記化合物の構造が、

であり、ここで、Ｒが水素、ｘが４、およびｙが５である、請求項１に記載の化合物。
（項１７）
前記化合物の構造が、

であり、ここで、Ｒが水素、ｘが５、およびｙが４である、請求項１に記載の化合物。
（項１８）
前記化合物の構造が、

であり、ここで、Ｒが水素、ｘが５、およびｙが５である、請求項１に記載の化合物。
（項１９）
前記化合物の構造が、

であり、ここで、Ｒが水素、ｘが５、およびｙが６である、請求項１に記載の化合物。
（項２０）
以下の式で表される化合物：

ここで、ｎは、３と１０，０００との間の整数である；ならびにその誘導体およびその塩。
（項２１）
以下の式で表される化合物：

ここで、ｎは、３と１０，０００との間の整数である；ならびにその誘導体およびその塩。
（項２２）
以下の式で表される化合物：

ここで、ｎは、３と１０，０００との間の整数である；ならびにその誘導体およびその塩。
（項２３）
以下の式で表される化合物：

ここで、ｎは、３と１０，１０００との間の整数である；ならびにその誘導体およびその塩。
（項２４）
Ｃ８６、Ｄ６０、Ｂ１４、Ｇ５、Ｄ６１、Ｕ９４、Ｆ３２、Ｆ２８、ＪＪ３６、ＪＪ３２、ＬＬ６、ＬＬ８、Ｕ２８、Ｅ２８、Ｕ３６、Ｅ３６、Ｕ３２、Ｅ３２、Ｃ９４、Ｆ９４、ＪＪ９４、Ｕ２８、ＪＪ８６、Ｃ８６、Ｕ８６、Ｅ８６、Ｃ８０、Ｅ８０、ＪＪ８０、Ｕ８０、Ｄ２４、Ｅ２４、ＪＪ２４、Ｂ１７、ＩＩ２８、ＩＩ３６、ＩＩ３２、Ｃ２０、ＪＪ２０、Ｅ２０、Ｃ２５、Ｕ２５、Ｄ２５、Ｄ７０、Ｄ２８、Ｄ３２、Ｄ３６、Ｄ９３、Ｕ８７、Ｄ８７、Ｃ７５、Ｕ７５、Ｏ２０、Ｏ２８、Ｃ９４、ＡＡ２０、ＡＡ２８、Ｄ８６、Ｆ８６、ＡＡ３６、ＡＡ２４、ＡＡ９４、Ｏ２４、ＡＡ６０、Ａ６１、Ｃ３２、ＪＪ２８、Ｃ２８、ＪＪ２０、Ｄ９４、Ｕ３２、Ｄ２４、Ｃ３６、Ｅ２８、Ｄ３６、Ｕ９４、Ｅ２４、Ｅ３２、Ｄ２８、Ｕ３６、Ｅ８０、Ｅ３６、ＪＪ８０、Ｅ９４、Ｄ９３、Ｂ１７、Ｍ１７、ＡＡ６１、Ｕ９３、およびＣ２５からなる群から選択される、ポリマーであって、
ここで、該アクリレートＡ−ＰＰは、以下の式であり：

そして、アミン１−９４は、以下の式である：

。
（項２５）
以下の式Ａ−ＰＰからなる群から選択されるビス（アクリレートエステル）を含む、ポリ（β−アミノエステル）：
。
（項２６）
以下の式のビス（アクリレートエステル）を含む、請求項２５に記載のポリ（β−アミノエステル）：
。
（項２７）
以下の式のビス（アクリレートエステル）を含む、請求項２５に記載のポリ（β−アミノエステル）：
。
（項２８）
以下の式のビス（アクリレートエステル）を含む、請求項２５に記載のポリ（β−アミノエステル）：
。
（項２９）
以下の式のビス（アクリレートエステル）を含む、請求項２５に記載のポリ（β−アミノエステル）：
。
（項３０）
以下の式のビス（アクリレートエステル）を含む、請求項２５に記載のポリ（β−アミノエステル）：

。
（項３１）
以下の式のビス（アクリレートエステル）を含む、請求項２５に記載のポリ（β−アミノエステル）：

。
（項３２）
以下の式のビス（アクリレートエステル）を含む、請求項２５に記載のポリ（β−アミノエステル）：

。
（項３３）
以下の式のビス（アクリレートエステル）を含む、請求項２５に記載のポリ（β−アミノエステル）：

。
（項３４）
以下の式のビス（アクリレートエステル）を含む、請求項２５に記載のポリ（β−アミノエステル）：

。
（項３５）
以下の式のビス（アクリレートエステル）を含む、請求項２５に記載のポリ（β−アミノエステル）：

。
（項３６）
以下の式のビス（アクリレートエステル）を含む、請求項２５に記載のポリ（β−アミノエステル）：

。
（項３７）
以下の式１−９４からなる群から選択されるアミンを含む、ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項３８）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項３９）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項４０）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項４１）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項４２）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項４３）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項４４）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項４５）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項４６）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項４７）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項４８）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項４９）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項５０）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項５１）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項５２）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項５３）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項５４）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項５５）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項５６）
以下の式を含む、請求項３７に記載の
ポリ（β−アミノエステル）：

。
（項５７）
前記化合物が、１，０００ｇ／モルと１００，０００ｇ／モルとの間の分子量を有する、
請求項１に記載の化合物。
（項５８）
前記化合物が、２，０００ｇ／モルと４０，０００ｇ／モルとの間の分子量を有する、請求項１に記載の化合物。
（項５９）
ポリヌクレオチドおよび請求項１に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
（項６０）
ポリヌクレオチドおよび請求項１に記載の化合物を含むナノ粒子を含む、薬学的組成物。
（項６１）
薬学的試薬および請求項１に記載の化合物を含むナノ粒子を含む、薬学的組成物。
（項６２）
請求項１に記載の化合物の、マトリックス中にカプセル化された試薬を含むマイクロ粒子を含む、薬学的組成物。
（項６３）
前記マイクロ粒子が、１〜１０マイクロメートルの平均直径を有する、請求項６２に記載の薬学的組成物。
（項６４）
前記マイクロ粒子が、５マイクロメートルより小さい平均直径を有する、請求項６２に記載の薬学的組成物。
（項６５）
前記マイクロ粒子が、１マイクロメートルより小さい平均直径を有する、請求項６２に記載の薬学的組成物。
（項６６）
前記試薬が、ポリヌクレオチドである、請求項６２に記載の薬学的組成物。
（項６７）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項６２に記載の薬学的組成物。
（項６８）
前記ポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項６２に記載の薬学的組成物。
（項６９）
前記ポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡである、請求項６２に記載の薬学的組成物。
（項７０）
前記試薬が、小分子である、請求項６２に記載の薬学的組成物。
（項７１）
前記試薬が、ペプチドである、請求項６２に記載の薬学的組成物。
（項７２）
前記試薬が、タンパク質である、請求項６２に記載の薬学的組成物。
（項７３）
ポリ（β−アミノエステル）、
ポリヌクレオチド、および
カチオン性ポリマー、カチオン性タンパク質、ＰＬＧＡ、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、およびポリリジン（ＰＬＬ）からなる群から選択される同時複合体化剤、を含む、組成物。
（項７４）
前記同時複合体化剤のポリヌクレオチドに対する比が、０．１〜１．２（ｗ／ｗ／ｗ）の範囲にある、請求項７３に記載の組成物。
（項７５）
ポリ（β−アミノエステル）のポリヌクレオチドに対する比が、１０〜１２０の範囲である、請求項７３に記載の組成物。
（項７６）
ポリ（β−アミノエステル）を合成する方法であって：
一級アミンまたはビス（二級アミン）を提供する工程；
ビス（アクリレートエステル）を提供する工程；および
該アミンおよび該ビス（アクリレートエステル）を、ポリ（β−アミノエステル）を形成するに適切な条件下で反応させる工程、を包含する、方法。
（項７７）
所望の特徴についてポリマーをスクリーニングする工程をさらに包含し、ここで、該スクリーニングする工程の前に、前記ポリ（β−アミノエステル）が沈殿、精製、または単離されない、請求項７６に記載の方法。
（項７８）
前記反応させる工程が、前記アミンおよび前記ビス（アクリレートエステル）を有機溶媒中で反応させることを包含する、請求項７６に記載の方法。
（項７９）
前記反応させる工程が、前記アミンおよび前記ビス（アクリレートエステル）を、溶媒の不在下で反応させることを包含する、請求項７６に記載の方法。
（項８０）
前記有機溶媒が、ＴＨＦ、ジエチルエーテル、グライム、ヘキサン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、メチレンクロライド、クロロホルム、四塩化炭素、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ベンゼン、ＤＭＳＯ、およびトルエンからなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。
（項８１）
前記有機溶媒が、ＤＭＳＯである、請求項７６に記載の方法。
（項８２）
前記アミンの濃度が、ほぼ０．０１〜５Ｍの間である、請求項７６に記載の方法。
（項８３）
前記アミンの濃度が、ほぼ０．１〜２Ｍの間である、請求項７６に記載の方法。
（項８４）
前記アミンの濃度が、ほぼ１〜２Ｍの間である、請求項７６に記載の方法。
（項８５）
前記ビス（アクリレートエステル）の濃度が、ほぼ０．０１〜５Ｍの間である、請求項７６に記載の方法。
（項８６）
前記ビス（アクリレートエステル）の濃度が、ほぼ０．１〜２Ｍの間である、請求項７６に記載の方法。
（項８７）
前記ビス（アクリレートエステル）の濃度が、ほぼ１〜２Ｍの間である、請求項７６に記載の方法。
（項８８）
前記反応させる工程が、前記アミンおよび前記ビス（アクリレートエステル）を、０〜７５℃の間の温度で反応させることを包含する、請求項７６に記載の方法。
（項８９）
前記反応させる工程が、前記アミンおよび前記ビス（アクリレートエステル）を、２０〜５０℃の間の温度で反応させることを含む、請求項７６に記載の方法。
（項９０）
前記反応させる工程が、前記アミンおよび前記ビス（アクリレートエステル）を、３０〜６０℃の間の温度で反応させることを含む、請求項７６に記載の方法。
（項９１）
マイクロ粒子を形成するためにポリ（β−アミノエステル）のマトリックス中に試薬をカプセル化する方法であって：
試薬を提供する工程；
ポリ（β−アミノエステル）を提供する工程；および
該薬剤および該ポリ（β−アミノエステル）を、マイクロ粒子を形成するために適切な条件下で接触させる工程を、包含する、方法。
（項９２）
前記試薬が、ポリヌクレオチドである、請求項９１に記載の方法。
（項９３）
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項９２に記載の方法。
（項９４）
前記ポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項９２に記載の方法。
（項９５）
前記試薬が、小分子である、請求項９１に記載の方法。
（項９６）
前記試薬が、タンパク質である、請求項９１に記載の方法。
（項９７）
前記ポリ（β−アミノエステル）が、請求項１に記載の化合物である、請求項９１に記載の方法。
（項９８）
前記接触させる工程が、前記試薬および前記ポリ（β−アミノエステル）の混合物をスプレー乾燥することを包含する、請求項９１に記載の方法。
（項９９）
前記接触させる工程が、二重エマルジョン溶媒蒸発技法を包含する、請求項９１に記載の方法。
（項１００）
前記接触させる工程が、相反転技法を包含する、請求項９１に記載の方法。
（項１０１）
ポリマーのライブラリーをスクリーニングする方法であって：
複数のポリマーを提供する工程であって、該ポリマーがポリヌクレオチドまたはタンパク質ではない、工程；および
遺伝子治療で有用な所望の性質について該ポリマーをスクリーニングする工程、を包含する方法。
（項１０２）
ポリマーのライブラリーをスクリーニングする方法であって：
複数のポリ（β−アミノエステル）を提供する工程；および
所望の性質について該ポリマーをスクリーニングする工程、を包含する方法。
（項１０３）
前記提供する工程が、前記ポリマーを平行に合成することを包含する、請求項１０１に記載の方法。
（項１０４）
前記合成する工程が、ＤＭＳＯ中で前記ポリマーを合成することを包含する、請求項１０３に記載の方法。
（項１０５）
前記合成する工程が、前記スクリーニングする工程の前に、前記ポリマーを沈殿すること、精製すること、また単離することを含まない、請求項１０３に記載の方法。
（項１０６）
前記複数のポリ（β−アミノエステル）が、少なくとも５００のポリ（β−アミノエステル）を含む、請求項１０１に記載の方法。
（項１０７）
前記複数のポリ（β−アミノエステル）が、少なくとも１０００のポリ（β−アミノエステル）を含む、請求項１０１に記載の方法。
（項１０８）
前記複数のポリ（β−アミノエステル）が、少なくとも１５００のポリ（β−アミノエステル）を含む、請求項１０１に記載の方法。
（項１０９）
前記複数のポリ（β−アミノエステル）が、少なくとも２０００のポリ（β−アミノエステル）を含む、請求項１０１に記載の方法。
（項１１０）
前記所望の性質が、ポリヌクレオチドを結合する能力である、請求項１０１に記載の方法。
（項１１１）
前記所望の性質が、水性液中の溶解度である、請求項１０１に記載の方法。
（項１１２）
前記所望の性質が、７より低いｐＨにおける水性液中の溶解度である、請求項１０１に記載の方法。
（項１１３）
前記所望の性質が、ｐＨ５における水性液中の溶解度であって、かつｐＨ７における水溶液に可溶性でない、請求項１０１に記載の方法。
（項１１４）
前記所望の性質が、ヘパリンを結合する能力である、請求項１０１に記載の方法。
（項１１５）
前記所望の性質が、トランスフェクション効率を増加する能力である、請求項１０１に記載の方法。
（項１１６）
前記所望の性質が、組織工学で有用である、請求項１０１に記載の方法。
（項１１７）
前記所望の性質が、細胞成長を支持する能力である、請求項１１８に記載の方法。
（項１１８）
前記所望の性質が、細胞付着を支持する能力である、請求項１０１に記載の方法。
（項１１９）
前記所望の性質が、組織成長を支持する能力である、請求項１０１に記載の方法。
（項１２０）
ポリマーのコレクションをスクリーニングする方法であって：
複数のポリマーを提供する工程；
レポーター遺伝子を含むポリヌクレオチドを提供する工程；
細胞を提供する工程；
該ポリマーの各々を、該ポリヌクレオチドと接触させる工程であって、ポリヌクレオチド：ポリマー混合物を生じる工程；
該細胞を該ポリヌクレオチド：ポリマー混合物と接触させる工程；および
細胞が、該レポーター遺伝子を発現するか否かを決定する工程、を包含する、方法。
（項１２１）
前記複数のポリマーを提供する工程が、該ポリマーを平行して合成することを含む、請求項１２０に記載の方法。
（項１２２）
前記ポリマーが、ポリ（β−アミノエステル）である、請求項１２０に記載の方法。
（項１２３）
前記ポリマーが、ポリエステルである、請求項１２０に記載の方法。
（項１２４）
前記ポリマーが、ポリアミドである、請求項１２０に記載の方法。
（項１２５）
前記複数のポリマーが、少なくとも５００の異なるポリマーを含む、請求項１２０に記載の方法。
（項１２６）
前記複数のポリマーが、少なくとも１０００の異なるポリマーを含む、請求項１２０に記載の方法。
（項１２７）
前記レポーター遺伝子が、グリーン蛍光タンパク質をコードする、請求項１２０に記載の方法。
（項１２８）
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１２０に記載の方法。
（項１２９）
前記細胞が、細菌細胞である、請求項１２０に記載の方法。
（項１３０）
前記細胞が、ＣＯＳ−７細胞である、請求項１２０に記載の方法。
（項１３１）
前記ポリマーのポリヌクレオチドに対する比が、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１０５：１、１１０：１、１２０：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１および２００：１である、請求項１２０に記載の方法。
（項１３２）
前記決定する工程が、レポーター遺伝子発現の量を定量することを含む、請求項１２０に記載の方法。

Claims (12)

  1. 以下の式の化合物であって：

    ここで、ｎは、３と１０，０００との間の整数である、
    化合物；およびその塩。
  2. 前記化合物が、１，０００ｇ／モルと１００，０００ｇ／モルとの間の分子量を有する、請求項１に記載の化合物。
  3. 前記化合物が、２，０００ｇ／モルと４０，０００ｇ／モルとの間の分子量を有する、請求項１に記載の化合物。
  4. ポリヌクレオチドおよび請求項１に記載の化合物を含む、薬学的組成物。
  5. 試薬および請求項１に記載の化合物を含むナノ粒子を含む、薬学的組成物。
  6. 試薬および請求項１に記載の化合物を含むマイクロ粒子を含む、薬学的組成物。
  7. 前記試薬が、ポリヌクレオチド、小分子、ペプチド、およびタンパク質から選択される、請求項５または６に記載の薬学的組成物。
  8. 前記試薬が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項７に記載の薬学的組成物。
  9. 前記試薬が、ペプチドまたはタンパク質をコードする、請求項７に記載の薬学的組成物。
  10. 前記試薬が、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉである、請求項７に記載の薬学的組成物。
  11. 前記試薬が、アンチセンス因子である、請求項７に記載の薬学的組成物。
  12. 組成物であって、
    請求項１に記載の化合物、
    ポリヌクレオチド、および
    カチオン性ポリマー、カチオン性タンパク質、ＰＬＧＡ、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、およびポリリジン（ＰＬＬ）からなる群から選択される同時複合体化剤
    を含む、組成物。
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